KR20200103246A - 소변의 대사체 분석을 위한 소변 샘플 처리 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 소변 시료의 대사체를 변화 없이 가능한 많은 양을 재현성있게 추출하기 위한 대사체 샘플링 및 분석 방법에 관한 것으로, 소변 시료 내 대사체 샘플링을 위한 최적 조건을 확립하고, 또한 이에 기반한 서로 다른 그룹 간의 대사물질 비교 분석법을 제시함으로써, 질병 등의 바이오마커 검출법을 제시하는 효과가 있다.

Description

소변의 대사체 분석을 위한 소변 샘플 처리 방법{Metabolome sample preparation methods for metabolite profiling of human urine samples}
본 발명은 소변의 대사체 분석을 위한 소변 샘플 처리 방법에 관한 것이다.
소변은 건강 검진에 가장 유용하게 사용되는 생체 시료이다. 소변 시료는 비침투적으로 편리하게 채취할 수 있으며 다양한 대사 물질을 많이 함유하고 있으므로 질병 진단에 일상적으로 이용될 수 있다. 당뇨, 통풍, 단백뇨 등의 질병이나 임신과 같은 특이적인 생리학적 변화는 생체 내 대사물질의 분비를 변화시키고 소변에 함유된 대사물질의 조성을 바꾼다. 따라서 질병 및 생리학적 변화에 특이적으로 변화하는 소변 내 대사물질을 찾고 정량하여 바이오마커를 제시하는 연구는 예로부터 많이 진행되어왔다. 이러한 특이적 상태 변화에 따른 대사물질들의 변화를 찾는 연구를 대사체학이라고 한다.
대사체학 연구는 시료 내 대사물질의 변화를 막고 가능한 많은 물질을 변화없이 재현성 있게 추출하는 것이 매우 중요하다. 소변 대사체학의 경우, 표준화된 소변 대사체 추출법이 nature protocol에 제시된 바 있다 (비특허문헌 1). 그러나 이 추출 방법은 실험적 연구에 기반하지 않고, 기존에 사용해왔던 방법을 차용 및 정리한 것이라 최적의 소변 대사체 추출법이라고 할 수 없다. 표준화 소변 대사체 추출법은 소변 내 우레아(urea)를 제거하기 위하여 우레아제(urease)를 처리하고, 메탄올을 투여하여 소변 내 단백질 침전 및 대사체 추출을 시행한다. 그러나 우레아제의 처리는 37℃에서 1 시간 동안 반응시키므로 소변 내 효소 등의 활성에 의해 대사물질의 변화를 일으킬 수 있으며, 메탄올은 그 추출 효율 및 재현성이 다른 추출 용매와 비교, 분석된 바가 없어서 최적의 추출 용매라고 할 수 없다. 따라서 기존의 표준화 방법에서 우레아제 처리가 미치는 영향을 살펴봄과 동시에 다양한 추출 용매를 비교 분석함으로써, 소변 시료의 대사체를 변화 없이 원 상태로, 가능한 많이 재현성 있게 추출하는 최적화된 추출법을 제시하는 것이 필요하다.
Chan EC et al., 2011, Nat. Protoc. vol. 6, pp. 1483-1499.
이에, 본 발명자들은 소변 시료의 대사체를 변화 없이 가능한 많은 양을 재현성 있게 추출하기 위하여, 우레아제 처리 없이 최적의 추출 용매를 사용한 소변 대사체 추출법 및 이에 기반한 서로 다른 그룹(예, 성별, 질병 등) 간의 대사체 분석법을 확립함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명은 소변 시료 내 대사체 추출에 의한 성별 구별용 키트를 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 소변 시료 내 서로 다른 그룹 간의 대사체 차별성을 분석하는 방법을 제공하는데 목적이 있다.
본 발명은 숙신산 (succinate), 푸마르산 (fumarate), 아스파라진 디하이드레이티드 (asparagine dehydrated), 팔미트산 (palmitic acid), 베타-알라닌 (β-alanine), L-시스테인 (L-cysteine), 젖산 (lactate), 티로신 (tyrosine), 글라이신 (glycine) 및 스테아르산 (stearic acid)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 대사체에 대한 정량 장치를 포함하는 성별 구별용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은
소변 시료 내 서로 다른 그룹 간의 대사체 차별성을 분석하는 방법으로서,
소변에 우레아제(urease) 처리 없이, 순수 메탄올 또는 포름산과 메탄올의 혼합 용매를 사용하여 대사체를 추출하는 대사체 샘플링 단계를 포함하는, 소변 시료 내 서로 다른 그룹 간의 대사체 차별성을 분석하는 방법을 제공한다.
본 발명은 소변 시료의 대사체를 변화 없이 가능한 많은 양을 재현성있게 추출하기 위하여 소변 시료에서 우레아제 비처리, 다양한 추출 용매 간 추출 효율 및 추출 재현성 비교를 통해 최적화된 소변 시료의 대사체 추출법을 제시하는 효과가 있다. 또한, 이에 기반한 서로 다른 그룹 간의 대사물질 비교 분석법을 제시함으로써, 성별, 질병 등의 바이오마커 검출법을 제시하는 효과가 있다.
본 발명은 소변 시료의 대사체 분석을 통한 다양한 병리학 및 바이오마커 제시 연구에 이용될 것으로 기대된다.
도 1은 PLS-DA를 이용한 우레아제 의 처리 및 37 ℃에서 1시간 정치배양군(UI), 우레아제 비처리 및 37 ℃에서 1시간 정치 배양군(WI), 우레아제 및 정치 배양 비처리군(DE) 간의 대사체 프로파일 (A: score plot; B: loading plot)을 나타낸 것이다.
도 2는 PLS-DA를 이용한 우레아제 및 정치 배양 비처리군(DE)에서 남성 (DE_Male) 과 여성 (DE_Female) 간의 대사체 프로파일 (A: score plot; B: loading plot)을 나타낸 것이다.
도 3은 남성과 여성을 구분 짓는 10개의 대사체의 양을 박스 플롯으로 나타내어 비교한 것이다.
도 4는 소변의 순수 메탄올 (MeOH), 순수 에탄올 (EtOH), 아세토니트릴:물 혼합물 (50ACN; 1:1, v/v), 물:2-프로판올:메탄올 혼합물 (WiPM; 2:2:5, v/v/v), 포름산:메탄올 혼합물 (AM; 0.125:99.875, v/v) 기반 대사체 추출 시의 추출율 비교 박스 플롯을 나타낸 것이다.
도 5는 소변의 순수 메탄올 (MeOH), 순수 에탄올 (EtOH), 아세토니트릴:물 혼합물 (50ACN; 1:1, v/v), 물:2-프로판올:메탄올 혼합물 (WiPM; 2:2:5, v/v/v), 포름산:메탄올 혼합물 (AM; 0.125:99.875, v/v) 기반 대사체 추출 시의 변동 계수 (%CV) 비교 박스 플롯을 나타낸 것이다.
도 6은 소변의 순수 메탄올 (MeOH), 순수 에탄올 (EtOH), 아세토니트릴:물 혼합물 (50ACN; 1:1, v/v), 물:2-프로판올:메탄올 혼합물 (WiPM; 2:2:5, v/v/v), 포름산:메탄올 혼합물 (AM; 0.125:99.875, v/v) 기반 대사체 추출 시의 단백질 침전율 비교 박스 플롯 (A) 및 사진 (B)을 나타낸 것이다.
본 발명은 소변의 대사체 분석을 위한 소변 샘플 처리 방법에 관한 것이다.
본 발명의 일 구현예에서, 소변 시료의 대사체를 변화 없이 가능한 많은 양을 재현성있게 추출하기 위하여 소변 시료에서 우레아제 처리 없이 대사체를 바로 추출한다.
또한, 본 발명의 일 구현예에서, 소변 시료의 대사체를 기반으로 서로 다른 그룹을 구별하고, 바이오마커를 찾을 수 있는 연구 방법을 제시하기 위하여 소변 시료에서 우레아제 처리 없이 정치 배양하여 추출된 대사체를 기반으로 서로 다른 그룹 간의 비교 분석한다.
상기 정치 배양은 30~45 ℃에서 0.5~2시간 동안 수행하는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 구현예에서, 소변의 대사체를 가능한 많은 양을 재현성있게 추출하고, 단백질을 적절히 침전시킬 수 있는 추출 용매로는 순수 메탄올 또는 포름산과 메탄올의 혼합 용매를 사용한다.
본 발명자들은 소변 시료 내 두 생체시료군 간의 대사체 차별성을 구별하는 바이오마커를 찾기 위해 소변에 우레아제(urease) 처리 없이 포름산과 메탄올의 혼합 용매를 사용하여 대사체를 추출하고 GC/TOF MS를 이용하여 소변 대사체 전처리 방법 및 성별에 따른 대사체 프로파일 차이를 비교 분석하고, 이 차이를 이용하여 대사체에 기반하여 성별을 구별할 수 있는 바이오마커 발굴 연구를 수행하였다.
그 결과, 아민류, 아미노산류, 당 및 당 알코올류, 지방산류, 인산류, 유기산류 등을 포함한 107개 및/또는 113개의 대사체가 동정되었다.
소변 시료에서 서로 다른 전처리 방법 기반으로 샘플링하여 생체 시료를 비교하였을 때, 부분최소자승판별분석(PLS-DA)을 통해 서로 다른 전처리 방법으로 추출했을 시의 대사체 프로파일의 명확한 차이를 확인하였으며 (도 1), 성별에 따른 대사체 프로파일의 명확한 차이도 확인하였다 (도 2). 이 중 성별을 구분하는 모델은, 각각의 대사물질에 대해 PLS-DA 모델의 VIP 값을 기준으로 상위 10종의 대사체를 선별하고 성별 구분의 신규 바이오마커 후보 물질로 선정하였다(표 4).
따라서, 본 발명은 숙신산 (succinate), 푸마르산 (fumarate), 아스파라진 디하이드레이티드 (asparagine dehydrated), 팔미트산 (palmitic acid), 베타-알라닌 (β-alanine), L-시스테인 (L-cysteine), 젖산 (lactate), 티로신 (tyrosine), 글라이신 (glycine) 및 스테아르산 (stearic acid)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 대사체에 대한 정량 장치를 포함하는 성별 구별용 키트를 포함한다.
또한, 남성은 대사체 중에서 푸마르산 (fumarate), 아스파라진 디하이드레이티드 (asparagine dehydrated), 베타-알라닌 (β-alanine), L-시스테인 (L-cysteine), 및 티로신 (tyrosine)은 증가하는 경향을, 스테아르산 (stearic acid), 숙신산 (succinate), 팔미트산 (palmitic acid), 젖산 (lactate) 및 글라이신 (glycine)은 감소하는 경향을 나타낸다.
여성은 대사체 중에서 숙신산 (succinate), 팔미트산 (palmitic acid), 젖산 (lactate), 스테아르산 (stearic acid) 및 글라이신 (glycine)은 증가하는 경향을, 푸마르산 (fumarate), 아스파라진 디하이드레이티드 (asparagine dehydrated), 베타-알라닌 (β-alanine), L-시스테인 (L-cysteine), 및 티로신 (tyrosine)은 감소하는 경향을 나타낸다.
상기 증가 또는 감소 경향이란 대사체 농도의 증가 또는 감소를 의미하는 것으로, 용어 “대사체 농도의 증가”는 남성 대비 여성 소변 대사체 농도가, 혹은 여성 대비 남성 소변 대사체 농도가 측정 가능할 정도로 유의하게 증가된 것을 의미하며, 본 명세서에서, 용어 “대사체 농도의 감소”는 남성 대비 여성 소변 대사체 농도가, 혹은 여성 대비 남성 소변 대사체 농도가 대비 대사체 농도가 측정 가능할 정도로 유의하게 감소된 것을 뜻한다.
본 발명의 키트에 포함된 정량 장치는 크로마토그래피/질량분석기일 수 있다.
본 발명에서 이용되는 크로마토그래피는 가스 크로마토그래피(Gas Chromatography), 액체-고체 크로마토그래피(Liquid-Solid Chromatography, LSC), 종이 크로마토그래피(Paper Chromatography, PC), 박층 크로마토그래피(Thin-Layer Chromatography, TLC), 기체-고체 크로마토그래피(Gas-Solid Chromatography, GSC), 액체-액체 크로마토그래피(Liquid-Liquid Chromatography, LLC), 포말 크로마토그래피(Foam Chromatography, FC), 유화 크로마토그래피(Emulsion Chromatography, EC), 기체-액체 크로마토그래피(Gas-Liquid Chromatography, GLC), 이온 크로마토그래피(Ion Chromatography, IC), 겔 여과 크로마토그래피(Gel Filtration Chromatograhy, GFC) 또는 겔 투과 크로마토그래피(Gel Permeation Chromatography, GPC)를 포함하나, 이에 제한되지 않고 당업계에서 통상적으로 사용되는 모든 정량용 크로마토그래피를 사용할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 크로마토그래피는 GC/TOF MS(gas chromatography/time-of-flight mass spectrometry) 분석기기일 수 있다.
본 발명의 대사체는 가스 크로마토그래피에서 각 성분들이 분리되며, TOF MS를 거쳐 얻어진 정보를 이용하여 정확한 분자량 정보뿐만 아니라 구조 정보(elemental composition)를 통해 구성 성분을 확인한다.
본 발명은 또한 소변 내 서로 다른 그룹 간 구별하기 위한 대사체 차별성을 분석하는 방법을 포함한다.
일 구현예로, 본 발명은 소변 시료 내 서로 다른 그룹(예, 성별, 질병 등) 간의 구별하기 위한 대사체 차별성을 분석하는 방법으로서,
소변 시료를 우레아제(urease) 처리 없이 정치 배양하고, 순수 메탄올 또는 포름산과 메탄올의 혼합 용매를 사용하여 대사체를 추출하는 대사체 샘플링 단계를 포함하는, 소변 시료 내 서로 다른 그룹 간의 구별하기 위한 대사체 차별성을 분석하는 방법을 포함한다.
상기 대사체 차별성을 분석하는 방법은 소변 시료 내 서로 다른 그룹 간 차별성을 분석하는 방법으로써, 우선, 퀀칭(quenching) 과정과 대사체 추출 과정을 포함하는 대사체 샘플링 단계를 거친다.
대사체 샘플링은 소변 시료를 우레아제 처리 없이 정치 배양하고, 추출 용매로 순수 메탄올, 순수 에탄올, 아세토니트릴:물 혼합물, 물:2-프로판올:메탄올 혼합물, 포름산:메탄올 혼합물을 사용하여 대사체를 추출한다. 특히, 포름산:메탄올의 혼합 용매를 사용하는 것이 보다 바람직하다. 포름산과 메탄올의 혼합 비는 0.05~0.5 : 99.5~99.95 의 부피 비가 더욱 바람직하다.
이때, 소변과 추출 용매는 1:8~10의 부피비로 처리되는 것이 실험의 오차를 줄일 수 있으므로 바람직하다.
상기 대사체 샘플링 단계에서 추출된 대사체에 대해서는 다음의 분석 단계를 거친다:
추출된 대사체를 GC/TOF MS(gas chromatography/time-of-flight mass spectrometry) 분석기기로 분석하는 단계;
GC/TOF MS 분석 결과를 통계처리 가능한 수치로 변환하는 단계; 및
변환된 수치를 이용하여 통계학적으로 상기 서로 다른 그룹 의 차별성을 검증하는 단계를 더 포함한다.
다음으로, 대사체의 프로파일링 차이를 비교하기 위해 부분최소제곱회귀법(Partial least squares discriminant analysis: PLS-DA)을 수행하여 서로 다른 그룹 간의 유의적인 차이를 나타내는 대사체 바이오마커를 선정하고, 분석 및 검증한다.
일 구현예로서, 본 발명의 분석 방법은 GC/TOF MS 분석 결과를 통계처리 가능한 수치로 변환하는 단계는 총 분석시간을 단위시간 간격으로 나누어 단위시간 동안 나타난 크로마토그램 피크의 면적 또는 높이 중 가장 큰 수치를 단위시간 동안의 대표값으로 정한다.
변환된 수치를 이용하여 통계학적으로 상기 두 생체시료군의 차별성을 검증하는 단계는 부분최소제곱회귀법(Partial least squares discriminant analysis: PLS-DA)을 수행하여 두 생체시료군 간의 유의적인 차이를 나타내는 대사체 바이오마커를 분석 및 검증한다.
본 발명의 일 구현예에 따른 상기 대사체 바이오마커는 남성과 여성의 성별 구별한다.
대사체 바이오마커는 숙신산 (succinate), 푸마르산 (fumarate), 아스파라진 디하이드레이티드 (asparagine dehydrated), 팔미트산 (palmitic acid), 베타-알라닌 (β-alanine), L-시스테인 (L-cysteine), 젖산 (lactate), 티로신 (tyrosine), 글라이신 (glycine) 및 스테아르산 (stearic acid)으로 구성된다.
부분최소제곱회귀법(Partial least squares discriminant analysis: PLS-DA)의 로딩 값이 양수인 것은 대사체 바이오마커의 증가 경향을, 로딩 값이 음수인 것은 대사체 바이오마커의 감소 경향을 나타낸다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 성별을 구별하기 위한 바이오마커로, 숙신산 (succinate), 푸마르산 (fumarate), 아스파라진 디하이드레이티드 (asparagine dehydrated), 팔미트산 (palmitic acid), 베타-알라닌 (β-alanine), L-시스테인 (L-cysteine), 젖산 (lactate), 티로신 (tyrosine), 글라이신 (glycine) 및 스테아르산 (stearic acid)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 사용할 수 있다.
상기 바이오마커들 중 남성에서는 푸마르산 (fumarate), 아스파라진 디하이드레이티드 (asparagine dehydrated), 베타-알라닌 (β-alanine), L-시스테인 (L-cysteine), 및 티로신 (tyrosine)은 증가하는 경향을, 숙신산 (succinate), 팔미트산 (palmitic acid), 젖산 (lactate), 스테아르산 (stearic acid) 및 글라이신 (glycine)은 감소하는 경향을 나타낸다.
상기 바이오마커들 중 여성에서는 숙신산 (succinate), 팔미트산 (palmitic acid), 젖산 (lactate), 스테아르산 (stearic acid) 및 글라이신 (glycine)은 증가하는 경향을, 푸마르산 (fumarate), 아스파라진 디하이드레이티드 (asparagine dehydrated), 베타-알라닌 (β-alanine), L-시스테인 (L-cysteine), 티로신 (tyrosine)은 감소하는 경향을 나타낸다.
이하, 본 발명에 따르는 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
[ 실시예 ]
실시예 1: PLS - DA를 이용한 68 개 소변 샘플의 대사체 프로파일링
68 명의 건강한 성인 (표 1)에서 얻은 소변 샘플을 우레아제의 처리 및 37℃에서 1시간 정치배양군(UI), 우레아제 비처리 및 37℃에서 1시간 정치배양군(WI), 우레아제 및 정치배양 비처리군(DE)으로 나누어 처리한 후, 기존에 많이 사용되고 있는 순수 메탄올을 추출 용매로 이용하여 대사체를 추출한 후 GC/TOF MS로 분석하였다.
아민류, 아미노산류, 당 및 당 알코올류, 지방산류, 유기산류 등을 포함한 107개의 대사체를 동정하였다(표 2).
대사체 프로파일링 차이를 비교하기 위하여 우레아 (urea)를 제외한 106개의 대사체를 기반으로 PLS-DA를 실시하였다. 우레아제 및 정치배양 처리군과 urease 비처리 및 정치배양 처리군, 우레아제 및 정치배양 비처리군 각각에서 서로 다른 대사체 패턴을 가짐을 살펴보았다 (도 1, 표 3). 따라서 우레아제의 처리나 정치 배양 각각의 처리방법이 우레아뿐만 아니라 다른 소변 본연의 대사체를 변화시킴을 밝혔다.
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(계속)
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Figure pat00010
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Figure pat00011
실시예 2: 68 개 소변 샘플의 주요 대사체 선정
실시예 1로부터 나온 PLS-DA 분석을 이용하여, 68 개 소변 샘플의 우레아제의 처리 및 37℃에서 1시간 정치배양군(UI), 우레아제 비처리 및 37℃에서 1시간 정치배양군(WI), 우레아제 및 정치배양 비처리군(DE) 세 개의 그룹을 분리하는데 높은 기여를 한 주요 대사체를 VIP값 기준으로 상위 10개를 선정하였다 (표 4).
Figure pat00012
실시예 3: PLS-DA를 이용한 68 개 소변 샘플의 남성 및 여성을 구분하는 대사체 프로파일링
68 명의 건강한 성인 (표 1)에서 얻은 소변 샘플 중 31명의 남성 소변 샘플과 37명의 여성 소변 샘플에 기존에 많이 사용되고 있는 순수 메탄올을 추출 용매로 이용하여 대사체를 추출한 후 GC/TOF MS로 분석하였다. 이 후 각 성별을 구분지을 수 있도록 우레아를 제외한 106개의 대사체를 이용하여 PLS-DA 모델을 생성하였다 (도 2, 표 5).
도 2에 나타난 바와 같이 남성과 여성의 소변 내 대사체는 서로 다른 패턴을 가지며, PLS-DA 모델을 기반으로 통계적으로 유의적 차이를 보였다. 즉, 남성 구분 시의 대사체 프로파일은 스코어 플롯에서 대부분의 샘플이 [t]1 및 [t]2 값 기준으로 양수를, 여성 구분 시의 대사체 프로파일은 스코어 플롯에서 [t]1 및 t[2] 값 기준으로 음수를 띠어 성별에 따른 대사체 프로파일이 완전히 구분되었다. 이러한 대사체 프로파일의 차이를 나타내는 주요 대사물질을 선정하기 위해서 표 5에서의 로딩 1과 로딩 2 모두에서 동일한 경향을 보이고 그 값이 큰 대사체를 선별하였다.
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(계속)
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(계속)
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실시예 4: PLS - DA를 이용한 68 개 소변 샘플의 남성 및 여성을 구분하는 대사체 프로파일링에서 차이를 나타내는 주요 대사체 선정
실시예 3으로부터 나온 PLS-DA 분석을 이용하여, 각 성별 그룹이 분리가 됨을 확인하고, 모델 내 각 성별의 분리에 기여하는 정도인 VIP값에서 높은 수치를 보인 주요 대사체 상위 10개를 선정하였다 (표 6). 또한 10개의 대사체의 양을 박스 플롯으로 나타내어 성별에 따른 대사체의 양을 비교하였다 (도 3).
Figure pat00020
실시예 5: 소변 샘플의 대사체 분석을 위한 최적의 추출 용매 선정
소변 샘플에서 대사체 샘플을 얻기 위하여 68 명의 소변 샘플을 동일한 비율로 하나로 합친 후에, 100 μl의 소변에 우레아제 처리 없이 직접 900 μl의 추출용매, 순수 메탄올 (MeOH), 순수 에탄올 (EtOH), 아세토니트릴:물 혼합물 (50ACN; 1:1, v/v), 물:2-프로판올:메탄올 혼합물 (WiPM; 2:2:5, v/v/v), 포름산:메탄올 혼합물 (AM; 0.125:99.875, v/v)을 처리하여 대사체를 추출한 후 GC/TOF-MS로 분석하여 추출 효율을 비교 분석하였다.
아민류, 아미노산류, 당 및 당 알코올류, 지방산류, 유기산류 등을 포함한 113 개의 대사체를 동정하였다(표 7).
도 4 및 도 5에 나타난 바와 같이, 추출 용매에 따라서 추출율 및 추출 재현성이 다름을 확인할 수 있었다. 정성 및 상대적으로 정량 분석된 피크 인텐시티가 AM에서 가장 높아, 종합적인 대사체의 추출율이 AM에서 가장 높음을 볼 수 있었다 (도 4). 또한 추출 용매에 따른 재현성을 살펴보면, %CV 값이 AM에서 모두 최저의 수치를 기록하여, 재현성이 제일 높음을 알 수 있었다 (도 5). 또한 단백질의 침전율이 AM에서 두 번째로 높은 수치를 기록하여, AM이 적절한 단백질을 침전능을 가지는 것으로 보였다 (도 6). 이를 통하여 소변의 대사체 분석을 위한 대사체 추출 시에 추출율 및 재현성과 단백질 침전율에 기반한 최적 용매로 AM을 선정하였다.
Figure pat00021
(계속)
Figure pat00022

Claims (11)

  1. 숙신산 (succinate), 푸마르산 (fumarate), 아스파라진 디하이드레이티드 (asparagine dehydrated), 팔미트산 (palmitic acid), 베타-알라닌 (β-alanine), L-시스테인 (L-cysteine), 젖산 (lactate), 티로신 (tyrosine), 글라이신 (glycine) 및 스테아르산 (stearic acid)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 대사체에 대한 정량 장치를 포함하는 성별 구별용 키트.
  2. 제 1 항에 있어서,
    정량 장치는 GC/TOF MS(gas chromatography/time-of-flight mass spectrometry) 분석기기인 키트.
  3. 제 1 항에 있어서,
    남성은 대사체 중에서 푸마르산 (fumarate), 아스파라진 디하이드레이티드 (asparagine dehydrated), 베타-알라닌 (β-alanine), L-시스테인 (L-cysteine), 및 티로신 (tyrosine)은 증가하는 경향을, 숙신산 (succinate), 팔미트산 (palmitic acid), 젖산 (lactate), 스테아르산 (stearic acid) 및 글라이신 (glycine)은 감소하는 경향을 나타내는 키트.
  4. 제 1 항에 있어서,
    여성은 대사체 중에서 숙신산 (succinate), 팔미트산 (palmitic acid), 젖산 (lactate), 스테아르산 (stearic acid) 및 글라이신 (glycine)은 증가하는 경향을, 푸마르산 (fumarate), 아스파라진 디하이드레이티드 (asparagine dehydrated), 베타-알라닌 (β-alanine), L-시스테인 (L-cysteine), 및 티로신 (tyrosine)은 감소하는 경향을 나타내는 키트.
  5. 소변 시료 내 서로 다른 그룹 간의 대사체 차별성을 분석하는 방법으로서,
    소변에 우레아제(urease) 처리 없이 순수 메탄올 또는 포름산과 메탄올의 혼합 용매를 사용하여 대사체를 추출하는 대사체 샘플링 단계를 포함하는, 소변 시료 내 서로 다른 그룹 간의 대사체 차별성을 분석하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 분석 방법은 추출된 대사체를 GC/TOF MS(gas chromatography/time-of-flight mass spectrometry) 분석기기로 분석하는 단계; GC/TOF MS 분석 결과를 통계처리 가능한 수치로 변환하는 단계; 및 변환된 수치를 이용하여 통계학적으로 두 생체시료군의 차별성을 검증하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  7. 제 5 항에 있어서,
    GC/TOF MS 분석 결과를 통계처리 가능한 수치로 변환하는 단계는 총 분석시간을 단위시간 간격으로 나누어 단위시간 동안 나타난 크로마토그램 피크의 면적 또는 높이 중 가장 큰 수치를 단위시간 동안의 대표값으로 정하는 것인, 방법.
  8. 제 5 항에 있어서,
    변환된 수치를 이용하여 통계학적으로 두 생체시료군의 차별성을 검증하는 단계는 부분최소제곱회귀법(Partial least squares discriminant analysis: PLS-DA)을 수행하여 두 생체시료군 간의 유의적인 차이를 나타내는 대사체 바이오마커를 분석 및 검증하는 것인, 방법.
  9. 제 8 항에 있어서,
    부분최소제곱회귀법(Partial least squares discriminant analysis: PLS-DA)의 로딩 값이 양수인 것은 대사체 바이오마커의 증가 경향을, 로딩 값이 음수인 것은 대사체 바이오마커의 감소 경향을 나타내는 것인, 방법.
  10. 제 8 항에 있어서,
    대사체 바이오마커는 숙신산 (succinate), 푸마르산 (fumarate), 아스파라진 디하이드레이티드 (asparagine dehydrated), 팔미트산 (palmitic acid), 베타-알라닌 (β-alanine), L-시스테인 (L-cysteine), 젖산 (lactate), 티로신 (tyrosine), 글라이신 (glycine) 및 스테아르산 (stearic acid)으로 구성된 것인, 방법.
  11. 제 8 항에 있어서,
    대사체 바이오마커는 성별을 구별하는 것인, 방법.
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20100100154A (ko) * 2009-03-05 2010-09-15 한국과학기술연구원 뇨 내의 담배성분 및 그 대사체들의 동시분석 방법
KR20160134106A (ko) * 2015-05-14 2016-11-23 배재대학교 산학협력단 성별 판별용 키트
WO2017204636A2 (en) * 2016-05-24 2017-11-30 In Ovo B.V. Method and system for the non-destructive in ovo determination of fowl gender

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120040383A1 (en) * 2010-08-12 2012-02-16 Wei Jia Methods and Kits Relating To Metabolite Biomarkers For Colorectal Cancer
CN102323351B (zh) * 2011-08-12 2014-12-10 深圳华大基因科技有限公司 膀胱癌患者尿液特异性代谢物谱、建立方法及用途
WO2013048344A1 (en) * 2011-09-29 2013-04-04 National University Of Singapore Urinary metabolomic markers for renal insufficiency
KR101516086B1 (ko) * 2013-10-25 2015-05-07 고려대학교 산학협력단 대사체 분석을 이용한 류마티스 관절염 진단방법
WO2015109263A2 (en) * 2014-01-17 2015-07-23 University Of Washington Biomarkers for detecting and monitoring colon cancer
KR101946884B1 (ko) * 2017-04-25 2019-02-13 고려대학교 산학협력단 대사체 분석을 이용한 베체트병의 진단방법

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20100100154A (ko) * 2009-03-05 2010-09-15 한국과학기술연구원 뇨 내의 담배성분 및 그 대사체들의 동시분석 방법
KR20160134106A (ko) * 2015-05-14 2016-11-23 배재대학교 산학협력단 성별 판별용 키트
WO2017204636A2 (en) * 2016-05-24 2017-11-30 In Ovo B.V. Method and system for the non-destructive in ovo determination of fowl gender

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Chan EC et al., 2011, Nat. Protoc. vol. 6, pp. 1483-1499.
Dong Sheng Ming 등, Journal of chromatography b, 2011, 879권, 페이지 421-428.(2011.12.31.)* *
Sili fan 등, Scientific reports, 2018, DOI:10.1038/s41598-018-29592-3.(2018.12.31.)* *

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