KR20200102436A - 아프라모뮴 앙구스티폴륨 또는 론고자 식물의 그린 추출물을 포함하는 특히 노화방지 효과를 갖는 미용제 조성물 - Google Patents
아프라모뮴 앙구스티폴륨 또는 론고자 식물의 그린 추출물을 포함하는 특히 노화방지 효과를 갖는 미용제 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 미용제 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물은 선택적으로 미용학적으로 허용 가능한 부형제 중의 극성 폴리올 용매, 특히 글리콜에 의한 추출에 의해 얻은 아프라모뮴 앙구스티폴륨 또는 론고자 식물 종자의 그린 추출물을 활성 성분으로서 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 미용제 조성물은 양호한 노화방지 효과를 갖는다.
Description
본 발명은 본질적으로 아프라모뮴 앙구스티폴륨(Aframomum angustifolium) 또는 론고자(longoza) 식물 종자의 그린 추출물(green extract)을 활성 성분으로서 포함하는 것을 특징으로 하는 특히 노화방지 효과를 갖는 미용제 조성물(cosmetic composition)에 관한 것이다.
본 발명은 또한 특히 노화방지 효과를 갖는 특히 미용제 조성물의 제조를 위한 미용제(cosmetic agent)로서의 아프라모뮴 앙구스티폴륨 또는 론고자 식물 종자의 그린 추출물의 용도에 관한 것이다.
이하에 본 명세서 및 청구항에서, 용어 론고자는 단순함을 위해 사용될 것이지만, 명확히 이것은 아프라모뮴 앙구스티폴륨 식물을 또한 의미한다.
더욱이, 그린 추출물은 추출물의 생태계학적 및 미용학적 상용성을 제공하는 용매, 예를 들어 폴리올, 특히 글리콜을 포함하거나 이것으로 이루어지고, 보다 특히 프로필렌 글리콜, 부틸렌 글리콜, 펜틸렌 글리콜로부터 선택된 극성 용매에 의한 추출물을 의미한다. 이 추출물은 또한 특정 실시형태에 따라
론고자 종자로 이루어진 재생 가능한 식물 자원의 사용;
폐기 용매 및 특히 유기 용매, 예컨대 헥산 또는 헵탄의 부재;
폴리올, 특히 글리콜을 포함하거나 이것으로 이루어지고, 보다 특히 프로필렌 글리콜, 부틸렌 글리콜, 펜틸렌 글리콜로부터 선택된 미용품에 사용되는 대안적인 그린 용매의 사용;
특히 제1 저온 추출, 약 55℃의 온화한 온도에서의 제2 추출을 수행함으로써 낮은 에너지 소모에 의한 몇몇 단계를 수반하는 추출 공정 덕분에 그린이고;
상기 공정은 산업상 실행성을 유지시키고 독성학적 위험을 피하도록 론고자에 함유된 테르펜의 백분율을 증가시키지 않으면서 색상 영향을 야기하는 것을 피해야 한다.
또한, ANDRE 등, LVMH RECHERCHE의 특허, US 7,381,436B2는 실제로 70/30 용적비로 수성알코올성 에탄올/물 혼합물로 구성된 극성 용매에 의한 아프라모뮴 앙구스티폴륨 또는 론고자 식물 종자의 추출물을 함유하는 미용제 조성물을 기재한다. 이 문헌은 콜라겐, 특히 진피-상피 연접부 또는 JDE에 존재하는 콜라겐 VII의 합성의 자극의 작용에 의한, 및/또는 옥시탈란 섬유 및/또는 엘라우닌 섬유에 대한 작용에 의한; 그리고 또한 특히 자외선으로 인해 광선 방사선의 작용으로 생긴 노화에 대해 피부를 보호하기 위한 노화방지 효과를 기재한다.
또한, NIZARD, LVMH RECHERCHE의 문헌 US 2010/0055217은 상승작용 효과를 얻기 위해 리포크로나에-6과 사용되는 것을 제외하고는 론고자의 수성알코올성 추출물을 기재하는 상기 ANDRE 특허와 유사하다.
또한, 문헌[Cell Metab. 2016, 9 February; 23(2):303-314]에서 Wiley 등에 의한 논문은 미토콘드리아 기능이상이 노화에 따라 증가하고, 이것이 상이한 분비 표현형을 갖는 미토콘드리아 노쇠를 유도한다는 것을 보여주는 조사 결과를 기재한다.
본 발명은, 아프라모뮴 앙구스티폴륨 또는 론고자 식물의 수성알코올성 추출물을 포함하는, 이전에 공지된 미용제용 노화방지제와 비교하여 양호한 노화방지 효과 또는 개선된 노화방지 효과를 갖고/갖거나, 미용 목적을 위해 특히 피부에 대한 국소 도포의 상황에서 매우 양호한 상용성을 갖고/갖거나, 부작용 또는 자극 효과가 없거나 실질적으로 없는 미용제로서, 아프라모뮴 앙구스티폴륨 또는 론고자 식물로부터의 신규의 추출물 또는 활성 성분을 발견하기 위한 해결책을 제공하는 기술적 문제를 해결하는 것을 목표로 한다.
본 발명은 또한 미토콘드리아 노쇠 및 조기 피부 노화를 일으키는 미토콘드리아 기능이상을 둔화시키거나 방지할 수 있는 아프라모뮴 앙구스티폴륨 또는 론고자 식물로부터의 신규의 추출물 또는 활성 성분의 도움에 의해 상기 기재된 기술적 문제를 해결하는 것을 목표로 한다.
다시, 본 발명은 환경상 해로운 용매의 사용을 피하여, 적은 에너지를 요하고, 산업용 규모로 그리고 특히 미용품용 규모로 사용하기에 충분한 분량이 제조되는 것을 허용하는, 환경 친화적인 활성 성분을 얻는 공정을 또한 제공함으로써 상기 기술적 문제를 해결하는 것을 목표로 한다.
본 발명은 산업용 규모로 그리고 특히 미용품용 규모로 사용될 수 있는 단순하고 저렴한 방식으로 상기 기재된 기술적 문제에 대한 해결을 제공한다.
제1 양태에 따르면, 본 발명은 미용학적으로 허용 가능한 부형제 중에 폴리올, 특히 글리콜의 극성 용매를 포함하거나 이것으로 이루어진 생태 친화적이고 미용학적으로 허용 가능한 극성 용매로 제조된, 그린 추출물이라 불리는, 아프라모뮴 앙구스티폴륨 또는 론고자 식물 종자의 추출물을 활성 성분으로서 포함하는 것을 특징으로 하는 미용제 조성물을 제공한다.
제2 양태에 따르면, 본 발명은 또한 미용제 조성물의 제조를 위한, 미용제로서의, 폴리올, 특히 글리콜의 극성 용매를 포함하거나 이것으로 이루어진 환경 친화적이고 미용학적으로 허용 가능한 용매로 제조된, 그린 추출물이라 불리는, 아프라모뮴 앙구스티폴륨 또는 론고자 식물 종자의 추출물의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 특정 실시형태에 따르면, 론고자의 그린 추출물은 노화방지 효과를 갖는 미용제로서 사용된다.
본 발명의 유리한 대안적인 실시형태에 따르면, 론고자 식물 종자의 그린 추출물은 특히 외관 주름을 줄이거나 제거하거나 둔화시키기 위한 주름방지 효과, 특히 미토콘드리아에 의한 ATP 합성효소 6의 합성의 자극의 작용을 통해 피부 구조를 보존하거나 복원하는 작용에 사용된다.
따라서, 본 발명은 미토콘드리아 노쇠를 방지하여 노화방지 효과, 특히 주름방지를 일으키는 미토콘드리아 활성의 보호, 복구 및 복원의 효과를 제공한다.
본 발명은 또한 특히 자외선으로 인해 광선 방사선의 작용에서 생긴 노화에 대해 피부를 보호한다.
제3 양태에 따르면, 본 발명은 아프라모뮴 앙구스티폴륨 또는 론고자 종자를 추출하기 위한 신규의 공정에 관한 것이다.
본 발명의 맥락에서, 아프라모뮴 앙구스티폴륨 또는 론고자 식물 종자를 생태 친화적이고 미용학적으로 허용 가능한 극성 용매, 특히 폴리올, 특히 글리콜을 포함하거나 이것으로 이루어진 극성 용매로 추출하여 "그린" 추출물이 얻어진다.
본 발명의 각각의 양태에 대해, 사용된 폴리올은 일반 화학식 HO-R-OH를 가질 수 있고, 여기서 R은 탄화수소 라디칼 -(CH2)n을 나타낼 수 있고, n은 2개 내지 16개의 탄소 원자, 특히 3개 내지 8개의 탄소 원자를 갖는다.
본 발명의 특정 실시형태에 따르면, 사용된 폴리올은 산업에서 널리 입수 가능하고 저렴한 흔한 글리콜, 예컨대 프로필렌 글리콜, 부틸렌 글리콜 또는 1,3-부틸렌 글리콜, 펜틸렌 글리콜, 및 이들의 혼합물일 것이다.
다른 대안적인 실시형태에서, 종자를 미세한 분말로 분쇄한다. 이 분말의 그레인은 유리하게는 직경이 0.01 내지 1 mm이다.
또 다른 대안적인 실시형태에서, 몇몇 연속적인 추출을 추출되는 재료가 용매 폴리올, 특히 글리콜에 의해 고갈될 때까지 수행할 수 있다.
대안적인 실시형태에 따르면, 폴리올, 특히 글리콜에 의한 추출을 소위 "차가운" 실온에서 한번 수행하고, 약 55℃의 온도에서 재차 수행한다.
본 발명의 특정 실시형태에 따르면, 추출 공정은 100% 폴리올, 특히 글리콜로 이루어진 극성 용매에 의해 분쇄된 건조 종자를 추출하는 적어도 하나의 단계를 포함한다. 대안적인 실시형태에 따르면, 식물/용매 m/v 비는 1/1.75일 수 있다.
다른 대안적인 실시형태에 따르면, 적절한 추출 전에, 분쇄된 종자를 폴리올, 특히 글리콜에서 실온에서 예를 들어 12 내지 15시간의 가벼운 온침에 의해 함침하여, 관심 대상의 분자의 접근가능성 및 이용가능성이 증가한다.
또 다른 대안에 따르면, 온침 후, 제1 여과를 제1 여과액 및 분쇄된 종자의 케이크를 얻도록 수행하고, 이후 케이크를 예를 들어 약 55℃의 온화한 온도에서 몇시간, 예를 들어 약 3시간의 기간 동안 추출한 후, 여과를 예를 들어 20 내지 25 마이크로미터의 다공도를 갖는 필터에서 제2 여과액을 얻도록 수행한다. 특정 대안에 따르면, 얻은 2개의 여과액을 합하고, 예를 들어 0.5 내지 0.1 마이크로미터의 무균 또는 비무균 필터에서 다시 여과시킬 수 있다. 얻은 용액을 약 1 중량%의 건조 추출물을 생성시키도록 폴리올, 특히 글리콜, 또는 다른 생체적합성이고 미용학적으로 허용 가능한 용매로 조정할 수 있다.
이 추출 공정의 특정 실시형태에 따르면, 폴리올, 특히 글리콜에서의 추출물은 그 자체가 본 발명에 따른 활성 성분 또는 활성제를 구성할 수 있다.
다른 특정 대안에 따르면, 상기 언급된 활성 성분으로서 그대로 사용되거나, 상기 언급된 활성 성분의 다른 대안을 얻기 위해 환경 친화적이고 미용학적으로 허용 가능한 용매, 예컨대 폴리올, 특히 글리콜, 또는 알코올 또는 수성알코올성 혼합물에 다시 용해될 수 있는 건조 추출물을 얻기 위해 추출 용매를 실질적으로 완전히 증발시킬 수 있다.
본 발명의 다른 유리한 대안에 따르면, 재용해에 사용된 용매는 글리콜이다.
본 발명의 특정 실시형태에 따르면, 상기 표시된 것처럼, 산업에서 널리 입수 가능하고 저렴한 흔한 글리콜, 예컨대 프로필렌 글리콜, 부틸렌 글리콜 또는 1,3-부틸렌 글리콜, 펜틸렌 글리콜, 및 이들의 혼합물이 사용될 것이다. 대안적인 특정 실시형태는 부틸렌 글리콜을 사용한다.
본 발명의 맥락에서, 얻은 추출물은 미용제로서 사용되고, 수상에 혼입되든 또는 지방상에 혼입되든 제조되는 미용제 조성물의 다른 성분과 혼합되기 쉽다.
제5 양태에 따르면, 본 발명은 또한 이전에 정의된 바와 같은, 그린 추출물이라 불리는, 아프라모뮴 앙구스티폴륨 또는 론고자 식물 종자의 추출물의 미용학적 유효량을 이를 필요로 하는 사람의 피부에 대한 국소 도포를 포함하는 것을 특징으로 하는 미용 관리 과정에 관한 것이다.
본 발명의 유리한 실시형태에 따르면, 이 미용 관리 과정은 특히 미토콘드리아 기능이상으로 생긴 노화의 효과를 방지하기 위해 노화방지 관리를 필요로 하는 피부의 부위에 상기 언급된 아프라모뮴 앙구스티폴륨 또는 론고자 식물의 종자 추출물을 도포하기 위해 사용된다.
글리콜의 그린 추출물 발명이 에너지 대사에 상당한 효과를 갖는다는 것이 예상치 못하게 발견되었다. 아데노신 트리포스페이트(ATP) 합성효소는 미토콘드리아 크리스테에서 발견되는 효소 복합체이다. 이 효소의 역할은 ADP + IP = ATP를 얻도록 전기화학 구배 및 호흡기 사슬에 의해 유지되는 아데노신 디포스페이트(ADP), 및 무기 포스페이트(IP)로부터 ATP를 합성하는 것이다.
ADP 및 IP는 세포의 삶에 필수적인 진정한 분자 모터이다. ATP는 화학적 에너지와 기계적 에너지로 전환되는 화학적 에너지의 유일한 형태이다.
본 발명은 따라서 예상치 못하게 특히 ATP 합성효소 서브유닛 6(subunit 6)의 자극 작용에 의해, 피부 구조를 보존하거나 복원하는 작용, 피부의 탄력 및/또는 탄탄함(firmness)에 대한 보호, 복구 또는 복원 효과를 갖는다.
본 발명은 또한 외관 주름을 줄이거나 제거하거나 둔화시키기 위해 보다 특히 주름방지 효과를 목표로 하는 노화방지 효과를 갖는다.
본 발명의 임의의 양태에서, 상기 그린 추출물은, 건조 추출물 또는 물질로 표시될 때, 상기 조성물의 총 중량을 기준으로, 0.001 중량% 내지 5 중량%, 특히 0.01 중량% 내지 1 중량%의 농도로 존재한다.
본 발명의 다른 목표, 특징 및 이점은 본 발명의 몇몇 실시형태를 함유하는 하기 설명으로부터 당업자에게 명확할 것이고, 이 실시형태는 예로서 제공되고 어떤 방식으로든 본 발명을 제한하지 않는다.
하기 실시예에서, 달리 기재되지 않는 한 모든 백분율은 중량으로 주어지고, 온도는 실온, 즉 25℃이거나, 섭씨 온도로 주어지고, 압력은 대기압이다.
본 발명에 따른 실시예 1
본 발명에 따른, 글리콜, 예를 들어 부틸렌 글리콜에 의한 아프라모뮴 앙구스티폴륨 또는 론고자 식물 종자의 그린 추출물의
실험실
제조의 실시예
다양한 상업용 로트로부터의 200 g의 론고자 식물 종자로부터, 하기 추출 절차를 수행한다:
a) 처음에, 상업적으로 입수 가능한 건조된 종자를 예를 들어 0.01 mm 내지 1 mm의 평균 분말 크기로 분쇄한다.
b) 이후, 분말을 350 mL의 부틸렌 글리콜, 또는 1/1.75의 종자/용매 비율(w/v)에서 정적 실내 온도에서 약 12시간 동안 밤새 온침한다.
c) 온침 후, 제1 여과를 예를 들어 20 내지 25 마이크로미터의 다공도를 갖는 필터에서 수행하여, 대략 20 g/L의 건조 잔류물 또는 온침액을 갖는 불투명한 오렌지색 내지 적색의 용액을 얻어 제1 여과액과 분쇄된 종자의 케이크를 얻고, 이후
d) 추출을 몇시간, 예를 들어 대략 3시간의 기간 동안 온화한 온도, 예를 들어 대략 55℃에서 추가의 350 mL의 부틸렌 글리콜으로 케이크에서 수행하고, 이후
e) 제2 여과를 제2 여과액을 얻도록 예를 들어 20 내지 25 마이크로미터의 다공도를 갖는 필터에서 수행하여, 대략 5 g/L의 건조 잔류물을 갖는 불투명한 오렌지색의 용액이 얻어진다.
f) 특정 대안에 따르면, 얻은 2개의 여과액 또는 추출물을 합하고, 예를 들어 0.5 내지 0.1 마이크로미터의 무균 필터를 통해 재여과시킬 수 있다. 여과액은 활성 성분 검정 및 박층 크로마토그래피 및 미생물학이 수행될 수 있는 투명한 오렌지 같은 색 내지 오렌지색의 용액이다.
g) 얻은 여과액 또는 추출물 용액은 10 g/L 또는 약 1 중량%의 건조물의 건조물 함량을 생성하도록 부틸렌 글리콜 또는 다른 생체적합성이고 미용학적으로 허용 가능한 용매로 조정될 수 있다.
이 부틸렌 글리콜 추출물은 그 자체가 특정 실시형태에 따르면 하기 실시예에 기재된 바와 같은 미용제 조성물의 제조를 위해 미용제로서 또는 활성 성분으로서 사용될 수 있는 본 발명에 따른 론고자 또는 아프라모뮴 앙구스티폴륨 종자의 그린 추출물(1 g의 추출물)을 구성한다. 이 부틸렌 글리콜 용액은 1 중량%의 건조 추출물을 함유한다.
h) 본 발명에 따른 미용제 조성물로 이 건조 추출물을 혼입하기 위해, 상기 조성물의 제조 시 미용학적으로 허용 가능한 용매 중에, 특히 물, 알코올, 1,3-부틸렌 글리콜 또는 이들 용매의 혼합물 중에 이의 새로운 용액을 또한 제조할 수 있다. 이 실시형태는 따라서 원하는 농도로 아프라모뮴 앙구스티폴륨 또는 론고자 식물의 건조 그린 추출물의 용액을 제조하는 것이 가능하게 한다.
i) 마지막으로, 상기 기재된 추출물의 다양한 용액은 원하는 미용제 조성물의 제조에서의 이의 사용에 따라 포장될 수 있다. 이 맥락에서, 처음에 적절한 용적의 병에 포장하기 전에 기공 직경이 0.22 ㎛인 필터에서 무균 여과를 수행한 후, 차가운 룸에서 예를 들어 4℃에서 저장하는 것이 추천된다.
평균적으로, 1 kg의 분쇄된 론고자 또는 아프라모뮴 앙구스티폴륨 종자로부터, 약 3 내지 3.5 kg의 추출물은 부틸렌 글리콜 중에 1 중량%의 건조물로 얻어지는데, 이는 30 내지 35 그램의 건조 추출물에 상응한다. 얻은 질량 추출 수율은 하기와 같이 계산될 때 평균적으로 35%이다.
질량 수율 = 최종 추출물에 함유된 건조 추출물의 질량 x 100 / 시작 시 도입된 분쇄된 종자의 질량.
본 발명에 따른 실시예 2
본 발명에 따른, 글리콜, 예를 들어 부틸렌 글리콜에 의한 아프라모뮴 앙구스티폴륨 또는 론고자 식물 종자의 그린 추출물의
산업용 파일럿
규모의 제조의 실시예
1)
파일럿-규모 시험
파일럿-규모 시험은 파일럿-규모 시험 1, 2 및 3에 대해 종자 확인된 G1, G2 및 G3의 3개 로트, 및 하기에 기재된 적절한 여과 시스템에 따라 마다가스카르로부터의 아프라모뮴 앙구스티폴륨 종자의 파일럿-규모 시험마다 10 kg를 공정처리하도록 설계된다.
2)
파일럿-규모 시험에서의 본 발명에 따른 추출 절차
본 발명에 따른 추출물은 처음에 관심 대상의 분자가 더 접근 가능하고 이용 가능하게 하도록 식물을 실온에서 부틸렌 글리콜 중에 12 내지 15시간의 온화한 온침에 의해 함침하여 1/1.75의 식물/용매 비율(m/v)로 종래대로 이전에 분쇄된 아프라모뮴 앙구스티폴륨의 건조 종자로부터의 100% 부틸렌 글리콜로 이루어진 극성 용매로 제조된다. 제1 여과 단계를 수행하여 여과액 1을 얻는다.
제2 추출을 3시간 동안 케이크에서 55℃에서 수행한 후, 여과를 20 내지 25 ㎛의 다공도를 갖는 필터에서 수행하여 여과액 2를 얻는다.
얻은 2개의 여과액 1 및 여과액 2를 합하고, 0.5 내지 0.1 ㎛ 필터에 다시 여과시킨다.
생성된 용액을 1% 건조 추출물이 되도록 부틸렌 글리콜로 조정한다.
결과는 투명한 오렌지색의 글리콜성 용액이다.
3개의 파일럿-규모 시험에 의해 얻은 3개의 로트 G1, G2 및 G3의 3개의 추출물은 E1, E2 및 E3으로 명칭된다.
평균적으로, 10 kg의 분쇄된 종자는 부틸렌 글리콜 중에 1%의 DM으로 약 30 내지 35 kg의 추출물을 생성한다(이는 300 내지 350 g의 건조 추출물에 상응함).
얻은 질량 추출 수율은 평균적으로 35%이다. 이것은 하기와 같이 계산된다:
질량 수율 = 최종 추출물에 함유된 건조 추출물의 질량 x 100 / 시작 시 도입된 분쇄된 종자의 질량.
3)
추출물의 물리화학적 분석
3-1) 필적하는 건조 중량(DM): 0.96 내지 1%(9.6 g/L 내지 10.0 g/L)
6.6의 범위의 pH; 필적하는 색상: 7.8 내지 7.9(Gardner)
랩 값 87.8 내지 88.9; -3.3 내지 -2.5; 67.7 내지 69.3.
3-2) 총 폴리페놀: 유럽 약전 방법 2.8.14
시험 용량은 샘플마다 0.05 g이다. 가시광선에서 750 nm에서 판독을 한다.
0.012 g/L과 0.016 g/L 사이의 함량이 얻어진다. 이 함량이 E2 및 E3 종자 추출물과 사용되는 추출물에 대해 약간 더 높다는 것이 관찰될 수 있다.
4)
총 당의 결정
안트론-황산 검정 방법. 620 nm에서 판독을 한다.
이 함량은 E2 및 E3 종자 추출물과 사용되는 추출물에 대해 약간 더 높다.
본 발명에 따른 아프라모뮴 앙구스티폴륨 또는 론고자 식물 종자로부터 부틸렌 글리콜에 의해 그린 추출물을 얻는 실시예 2의 본 발명에 따른 공정과 아프라모뮴 앙구스티폴륨 또는 론고자 식물 종자로부터 70/30 용적비의 알코올/물 추출물을 얻는 US 7,381,436의 실시예 1에 따른 공정 사이의
비교예 3
3-1)
이 비교용 시험을 수행하기 위해, 하기 2개의 샘플을 사용하였다
:
a)
추출 용매로서 70/30 용적비의 수성알코올성 에탄올/물 혼합물을 사용하고, US 7,381,436의 실시예 1에 기재된 추출 공정으로 처리되는 로트 SX000HH라 불리는 마다가스카르 아프라모뮴 앙구스티폴륨 또는 론고자 식물 종자의 비교용 로트 그리고 그 추출물은 추출물 로트 SX000HH라 불린다.
b)
상기 발명의 실시예 2에 따른 그린 추출물 E2
3-2)
미토콘드리아에 의한 ATP 합성효소 서브유닛 6의 합성에 대한 작용에 의한 정상 인간 각질세포(NHK) 세포에서의 론고자(아프라모뮴 앙구스티폴륨)의 실시예 2의 그린 추출물 E2의
노화방지 효과의 결정
.
1. 도입
특허 US 7,381,436B2호의 실시예 1에 따른 이전의 수성알코올성 에탄올/물 70/30 용적 추출물과 비교하여 실시예 1로부터의 론고자(아프라모뮴 앙구스티폴륨)의 부틸렌 글리콜 그린 추출물의 전사 효과에 대한 연구는 TaqMan 저밀도 어레이(TLDA) 기술을 사용하여 평가되었다. 이 기술을 사용하여, 특정 단백질을 암호화하는 96개의 유전자의 발현의 조절은 정상 인간 각질세포의 치료에 대한 반응에서 연구된다.
치료 24시간 후, 세포 단층을 용해시켜 RNA를 회수한다. 이 RNA를 정량화하고 정규화하여 역전사를 수행한다. 이후, 얻은 cDNA는 NHF, NHK 및 NHM TLDA 마이크로유체 카드, 96 "시간생물학 프로파일" 유전자에서 분석을 위해 준비된다.
2. 재료 및 방법
2.1. 시험된 활성제 및 활성제 대조군의 제조
본 발명에 따른 활성제 1: 상기 실시예 2에 따른 마다가스카르 론고자 종자로부터의 100% 부틸렌 글리콜 추출물 GREEN E2
비교용 활성제 2: US 7,381,436B2의 실시예 1 및 상기 실시예 3-1 a)에 따른 마다가스카르 론고자 종자의 EtOH/H2O 70/30 v/v 혼합물을 갖는 추출물.
시험된 최종 농도는 활성제 1 및 활성제 2에 대해 0.0125 중량%이다.
2.2. 세포 치료
연구는 31세 여성 공여자(코드 1477)로부터 복부성형술에서 얻은 정상 인간 각질세포에서 수행되었다. 세포를 처음에 12웰 플레이트에서 웰당 125,000개의 세포의 밀도로 계대배양 4(P4)에서 완전 Epilife 배지(HKGS 보충제)에서 시딩하였다. 이후, 세포를 0.0125%의 Perle de Madagascar Green 및 0.0125%의 Perle de Madagascar뿐만 아니라 이들의 각각의 부형제 대조군(BG 100% 및 EtOH/H2O 70/30 v/v)으로 치료하였다.
치료 4시간 후, 총 RNA를 추출하도록 세포를 회수한다.
2.3. TaqMan 저밀도 어레이(TLDA) 기법
2.3.1. Microlab STAR(Hamilton)를 사용한 총 RNA 추출
세포 배양 배지를 제거하고, (Nucleospin RNA 트레이스 키트(제품 코드 740709, 로트 번호 1412/001, Macherey-Nagel)에서 제공된) 250 ㎕의 RLT 용해 완충액을 첨가한다. 세포를 세포 스크래퍼로 긁어내고, 이후 세포 용해물을 (Nucleospin RNA 키트에서 제공된) 1.2 mL의 딥-웰에 회수한다. 총 RNA를 이전에 개발된 프로토콜(NS_96RNA_KHN 또는 NS_96RNA_FHN.dws)에 따라 추출한다. 얻은 총 RNA 용액을 평가하고, 이의 품질을 Microlab STAR에 커플링된 SPECTROstar Nano(BMG Labtech)인 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 확인하였다. 이 장치는 로봇 플랫폼을 제어하는 컴퓨터에 연결되고, 결과를 분석하기 위한 특정 소프트웨어(MARS 소프트웨어)를 갖는다. 이 기법은 로봇에 의해 수행되는 피페팅을 검증하기 위한 384웰 마이크로플레이트(384개의 마이크로-클레어 플레이트 블랙 LoBase, 제품 코드: 788876 로트: 1305055 Greiner), 양성 대조군(RNA 250, 제품 코드: AM7155, 로트: 1301028(NHF), 로트: 1208025(NHK), 로트: 1208026(NHM), Thermofisher), 및 SPECTROstar Nano 판독기에 의해 생성된 값을 요한다.
2.3.2. 상보성 DNA의 합성
사용된 역전사(RT) 키트는 High-Capacity Reverse Transcription Kit(제품 코드: 4368813, 로트: 00288647; Thermo Fisher)이고, 제공된 프로토콜에 따라 사용되고: 500 ng의 총 RNA는 25 ㎕의 최종 용적으로 물에 희석된다. 이후, 이것을 하기에 기재된 바대로 이전에 제조된 25 ㎕의 High-Capacity Reverse Transcription Kit 2X 반응 혼합물의 존재 하에 25℃에서 10분 동안, 이어서 37℃에서 2시간 동안 항온처리한다. TRobot(
)에서 상이한 항온처리가 수행된다.
2.3.3. PCR-TaqMan 저밀도 어레이
15 ㎕의 각각의 RT를 60 ㎕의 물과 혼합하고, 이후 75 ㎕의 TaqMan Gene Expression Master Mix(제품 코드: 4369016, 로트: 1507235; Thermo Fisher)를 첨가한다. 균질화 후, 100 ㎕를 96-유전자 시간생물학 프로파일 마이크로유체 카드(로트 B1885(NHF), 로트 B1884(NHK) 및 로트 B1942(NHM))에 침착시키고, 이것을 원심분리하고 이후 밀봉한다.
플레이트에 침착된 유전자의 프로파일에 상응하는 CD를 SDS 2.4 소프트웨어에 로딩하고, 이것은 따라서 카드에서 각각의 유전자의 위치를 규정할 수 있게 한다. 결과의 정규화에 사용되는 대조군 유전자(소프트웨어에서 "내인성" 유전자라 칭함)는 PCR이 시작하기 전에 표시된다. PCR은 ABI Prism 7900HT Sequence Detection System에서 Applied Biosystems에 의해 제공된 프로토콜에 따라 수행된다. qPCR 단계는 40회 사이클 동안 50℃에서 2분, 94.5℃에서 10분, 이어서 97℃에서 30분 및 59.7℃에서 1분이다.
2.3.4. 결과의 통계 분석
실시간 정량적 PCR은 이의 효율이 90%와 110% 사이인 경우 사용될 수 있다.
RT-PCR/TLDA 방법에서, 정량화는 ΔCt의 비교용 방법, 즉 상대 정량화(RQ)를 사용하여 수행된다. 이 방법은 각각의 유전자에 대한 배경 노이즈를 고려하는 RQ Manager 소프트웨어를 사용하여 카드에서 각각의 유전자의 Ct를 결정한다. 이 Ct는 카드에서 동시에 연구되는 (본 발명자들의 연구 베타-2-마이크로글로불린에서) 하우스키핑 유전자의 Ct로 정규화된다.. 이 유전자는 세포에서 변함없지만, 이의 변동은 실험 변동성(그 장치에서의 총 RNA 검정, 피페팅, 역전사 단계, 마이크로유체 카드에서의 침착물, 카드 품질, PCR)을 반영한다. 이 RQ Manager 소프트웨어에 의해, 본 발명자들은 본 발명자들의 대조군과 비교하여 발현의 진폭 수준(대조군보다 x배 높거나 낮음)에 상응하는 RQ(상대 정량화) 값을 얻는다. 본 발명자들의 대조군은 비치료된 대조군 또는 부형제일 수 있다. RQ는 하기 계산에 의해 얻어진다(1인 비치료의 값):
RQ = 2-ΔΔCt = 2-(ΔCt 치료된 - ΔCt 비치료된)
ΔCt 치료된 = Ct 치료된 표적 유전자 - Ct 치료된 하우스키핑 유전자
ΔCt 비치료된 = Ct 비치료된 표적 유전자 - Ct 비치료된 하우스키핑 유전자
이 방법이 신뢰 가능하도록, 관심 대상의 유전자 및 하우스키핑 유전자의 증폭 효율은 반드시 동일해야 한다. 이는 플레이트의 일상적 사용 전에 개발 과정 동안 검증되었다.
스튜던트 t-시험은 전사 활성에서 통계적으로 유의미한 변동을 평가하도록 사용될 것이다. 각각의 조건은 삼중으로(동일한 조건 하에 3의 비치료 및 3의 치료) 수행된다. 피셔 F-시험은 처음에 2개의 데이터 행렬을 비교하여 적용된다. 그 값이 α = 0.05 초과일 때, 스튜던트 t-시험의 분산은 2이고, 피셔 F-시험이 α = 0.05 미만일 때 분산은 3일 것이다. 선택된 전사 변동은 α = 0.05보다 낮은 스튜던트 t-시험에 상응하는 것일 것이다.
예상된 효과(증가의 경우 +, 억제의 경우 -)를 고려하는 기준은 처음의 결과 해석이 이루어지게 한다
- 얻은 효과가 예상된 방향으로 가면, 그레이스케일 코드가 상기처럼 적용된다
- 얻은 결과가 예상된 효과의 반대이면, 그레이스케일 코드가 적용되지 않지만 그 결과는 상당한 결과이므로 계속 시각적으로 표시된다.
엑셀 매크로가 전체로서 조절된 유전자의 예상된 방향 / 조절된 유전자의 수를 나타내므로, 모든 이들 데이터는 본 발명자가 추출물들을 서로와 관련하여 주의하게 한다. 스크리닝의 맥락에서, 이 점수는 선택 기준으로 사용될 수 있다.
4시간 후 정상 인간 각질세포(NHK)에서 US 7,381,436B2 실시예 1의 에탄올/물 70/30 vol/vol 수성알코올성 혼합물 전에 론고자와 비교된 실시예 2의 본 발명에 따른 론고자 그린 부틸렌 글리콜 추출물 E2의 효과에 관련된 결과.
본 발명의 실시예 2에 따른 론고자 그린 E2는 NHK 미토콘드리아에 의한 ATP 합성효소 서브유닛 6의 합성을 +2.697의 계수로 비예상된 방식으로 증가시킨다.
상기의 결론에서, NHK에서의 상기 시험 덕분에, 미토콘드리아 세포의 노쇠를 방지하고 따라서 피부 노화를 방지하는, 본 발명에 따른 론고자의 그린 부틸렌 글리콜 추출물의 미토콘드리아 기능이상의 상당한 복구 효과를 입증할 수 있다.
따라서, 본 발명은 미토콘드리아를 보존하고 피부 노화를 방지하기 위한 국소 용도를 위한 미용제 조성물의 제조를 위한 미용제로서 사용될 수 있다.
미용제 조성물의 제제의 다양한 실시예는 예시의 방식으로 하기에 주어지고, 따라서 어떤 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.
본 발명에 따른 실시예 4
얼굴의 탄탄함을 개선하기 위한 미용품용 겔
- 실시예 1, g)에서 얻은
론고자의 부틸렌 글리콜 100% 그린 추출물
2%
- 글리콜
3%
- 상업적으로 입수 가능한 AMPS 중합체,
3%
(상표명 Sepigel 305®)
- 수소화 피마자유(Cremophor CO-60®)
2%
- 폴리에틸렌 글리콜
1.5%
- 보존제
0.5%
- 향료 농축액
0.3%
- UV 필터(벤조페논-4)
1%
- 물, 적량, 100%
이 겔은 특히 주름을 갖는 부위에서 얼굴 피부의 탄탄함을 개선하기 위해 몇주 동안 1일 1회 얼굴에 도포될 수 있어서, 이 치료의 종료 시 피부 회춘 및 이 주름의 약화 또는 소실의 명확한 효과와 함께 유연함의 복원이 관찰된다.
본 발명에 따른 실시예 5
에멀션 형태의 주름방지 데이 크림
- 실시예 2에서 얻은
론고자의 부틸렌 글리콜 100% 그린 추출물 E1
2%
- 스테아레쓰-21(Brij 721)
2.5%
- 글리세릴 스테아레이트(Tegrin)
1.1%
- 스테아릴 알코올
5%
- 글리세롤 트리카프릴레이트 / 카프릴레이트
12.5%
- 부틸렌 글리콜
3%
- 글리세린
2%
- 보존제
0.5%
- 향료 농축액
0.5%
- UV 필터(옥틸 메톡시신나메이트)
7.5%
- 물, 적량, 100%
본 발명에 따른 실시예 6
주름방지 토닉 로션
- 실시예 2에서 얻은
론고자의 부틸렌 글리콜 100% 그린 추출물 E2
2%
- 부틸렌 글리콜
3%
- EDTA
0.1%
- 가용화제
1%
- 향료 농축액
0.3%
- 에탄올
5%
- UV 필터(벤조페논-4)
0.13%
- 물, 적량, 100%
본 발명에 따른 실시예 7
얼굴용 자외선 보호 메이크업 분말
- 실시예 2에서 얻은
론고자의 부틸렌 글리콜 100% 그린 추출물 E3
0.25%
- 활석
17%
- 운모
20%
- 견운모
20%
- 안료
8%
- 유기 분말(나일론)
20%
- 실리카
8.75%
- 광유 또는 실리콘
3%
- UV 필터(옥틸 메톡시신나메이트)
3%
본 발명에 따른 실시예 8
주름방지 치료 파운데이션
- 실시예 2)에서 얻은
론고자의 부틸렌 글리콜 100% 그린 추출물 E2
2%
- 4-폴리글리세릴 이소스테아레이트 및
세틸 디메티콘 코폴리올 및 헥실 라우레이트
5.1%
- 사이클로펜타실록산 및 사이클로헥사실록산
5.0%
- 세틸 디메티콘
1.0%
- 카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드
2.2%
- 옥틸 스테아레이트
1.4%
- 광유
3.5%
- 수소화 피마자유
1.2%
- 비즈왁스
0.8%
- 폴리메틸 메타크릴레이트
1.1%
- 철 산화물
0.45%
- 이산화티탄
5.2%
- NaCl
0.6%
- 향료 농축액
0.1%
- UV 필터(옥틸 신나메이트)
3%
- 물, 적량, 100%
Claims (10)
- 미용제 조성물(cosmetic composition)로서,
미용학적으로 허용 가능한 부형제 중에 폴리올, 특히 글리콜의 극성 용매를 포함하거나 이것으로 이루어진 생태 친화적이고 미용학적으로 허용 가능한 극성 용매로 제조된, 그린 추출물(green extract)이라 불리는, 아프라모뮴 앙구스티폴륨(Aframomum angustifolium) 또는 론고자(longoza) 식물 종자의 추출물을 활성 성분으로서 포함하는 것을 특징으로 하는 미용제 조성물. - 제1항에 있어서, 식물 종자로부터의 추출물이 분쇄된 종자를 폴리올, 특히 글리콜의 극성 용매로 추출하는 적어도 하나의 단계를 포함하는 추출 공정에 의해 얻어지는 것을 특징으로 하는, 조성물.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식물 종자로부터의 추출물이 특히 폴리올, 보다 특히 글리콜, 또는 알코올 또는 수성알코올성 혼합물을 포함하는 환경 친화적이고 미용학적으로 허용 가능한 용매에 다시 용해되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 폴리올이 일반 화학식 HO-R-OH를 가지며, 식 중, R은 탄화수소 라디칼 -(CH2)n을 나타낼 수 있고, n은 2개 내지 16개의 탄소 원자, 특히 3개 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 것을 특징으로 하는, 조성물.
- 제4항에 있어서, 폴리올이 예를 들어 프로필렌 글리콜, 부틸렌 글리콜 또는 1,3-부틸렌 글리콜, 펜틸렌 글리콜, 및 이들의 혼합물로부터 선택된 글리콜을 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 론고자 종자의 상기 추출물이, 상기 조성물의 총 중량을 기준으로, 건조 추출물로 표시될 때, 0.001 중량% 내지 5 중량%, 바람직하게는 0.01 중량% 내지 1 중량%의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
- 미용제 조성물의 제조를 위해, 미용제(cosmetic agent)로서의, 생태 친화적이고 미용학적으로 허용 가능한 극성 용매로 제조된, 그린 추출물이라 불리는, 아프라모뮴 앙구스티폴륨 또는 론고자 식물 종자의 추출물의 용도로서, 상기 추출물은 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은, 용도.
- 제7항에 있어서, 론고자 추출물이 특히 ATP 합성효소 서브유닛 6(subunit 6)의 자극 작용에 의해 노화방지 효과에 사용되는 것을 특징으로 하는, 용도.
- 미용 관리 방법(cosmetic care process)으로서,
그린 추출물이라 불리는, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 아프라모뮴 앙구스티폴륨 또는 론고자 식물 종자의 추출물의 미용학적 유효량을 이를 필요로 하는 사람의 피부에 국소 도포하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 미용 관리 방법. - 제9항에 있어서,
상기 언급된 아프라모뮴 앙구스티폴륨 또는 론고자 식물의 종자 추출물의 도포가 외관 주름을 줄이거나 제거하거나 둔화시키기 위해, 또는 미토콘드리아 기능이상으로 생긴 노화의 효과를 방지하기 위해 노화방지 관리, 특히 주름방지 효과를 필요로 하는 피부의 부위에서 수행되거나,
피부 구조를 보존하거나 복원하는 작용, 피부의 탄력 및/또는 탄탄함(firmness)에 대한 보호, 복구 또는 복원 효과에 의해, 특히 ATP 합성효소 서브유닛 6의 자극 작용에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는, 미용 관리 방법.
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