ES2914592T3 - Composiciones cosméticas en particular con actividad antienvejecimiento que comprenden un extracto verde de la planta Aframomum angustifolium o Longoza - Google Patents

Abstract

Composición cosmética, caracterizada por que comprende, como ingrediente activo, un extracto, llamado extracto verde, de semillas de la planta Aframomum angustifolium o Longoza elaborado con un disolvente polar ecológicamente compatible y cosméticamente aceptable, que comprende o consiste en un disolvente polar de poliol, en particular, un glicol, en un excipiente cosméticamente aceptable.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones cosméticas en particular con actividad antienvejecimiento que comprenden un extracto verde de la planta Aframomum angustifolium o Longoza

La presente invención se refiere esencialmente a una composición cosmética, en particular, con actividad antienvejecimiento, caracterizada por que comprende, como ingrediente activo, un extracto verde de semillas de la planta Aframomum angustifolium o Longoza.

La invención también se refiere al uso de un extracto verde de semillas de la planta Aframomum angustifolium o Longoza, como agente cosmético, en particular, para la fabricación de una composición cosmética, teniendo especialmente una actividad antienvejecimiento.

En adelante, en la descripción y las reivindicaciones, por simplicidad, se utilizará preferentemente el término Longoza, pero que obviamente significa indistintamente también la planta Aframomum angustifolium. Además, por extracto verde se entiende, un extracto con un disolvente que proporciona compatibilidad ecológica y cosmética del extracto, por ejemplo, un disolvente polar que comprende o consiste en un poliol, en particular, un glicol, y más particularmente elegido entre el propilenglicol, butilenglicol, pentilenglicol. Este extracto también es verde, según una realización particular, gracias a:

el uso de un recurso vegetal renovable consistente en semillas de longoza;

la ausencia de residuos de disolventes y, en particular, de disolventes orgánicos como el hexano o el heptano el uso de disolventes alternativos verdes utilizados en cosméticos que comprenden o consisten en un poliol, en particular, un glicol, y más particularmente elegido entre el propilenglicol, butilenglicol, pentilenglicol;

Un proceso de extracción que involucra pocas etapas con bajo consumo de energía, en particular, mediante la realización de una primera extracción en frío, una segunda extracción a una temperatura suave de unos 55 °C; y El proceso debe evitar aportar un impacto de color, manteniendo la viabilidad industrial y sin aumentar el % de terpenos contenidos en el Longoza, para evitar riesgos toxicológicos.

Estado de la técnica

Se conoce por el artículo de E.M. Gaydou et al. publicado en la Revue frangaise des Corps Gras, N.° 1 de enero de 1983, páginas 21 a 25, un estudio sobre la composición de ácidos grasos de los aceites extraídos de semillas de algunas plantas en Madagascar, de las cuales la planta Aframomum angustifolium (véase tabla 1, continuación 2, página 24). Es un extracto por medio de un disolvente apolar de las semillas de la planta, en particular, con la ayuda de hexano (véase la página 24, "Parte experimental", 1er párrafo).

También se conoce por la patente de ANDRE et al., LVMH RECHERCHE, US 7,381,436B2 una composición cosmética que contiene un extracto de semillas de la planta Aframomum angustifolium o LONGOZA con un disolvente polar consistente en la práctica en una mezcla hidroalcohólica de etanol/agua en una relación volumétrica de 70/30. Este documento describe una actividad antienvejecimiento por una acción de estimulación de la síntesis de colágeno, en particular, el colágeno VII presente en la unión dermoepidérmica o JDE, y/o por una acción sobre las fibras de oxitalán y/o las fibras de elaunina; y también para proteger la piel contra el envejecimiento resultante de la acción de las radiaciones actínicas, particularmente debido a los rayos ultravioleta.

Análogamente, el documento US 2010/0055217 de NIZARD, LVMH RECHERCHE es similar a la patente de ANDRE anterior que describe un extracto hidroalcohólico de LONGOZA pero utilizado con Lipochronae-6 para obtener un efecto sinérgico.

Todavía se conoce por el artículo de Wiley et al. en Cell Metab. 2016, del 9 de febrero; 23(2):303-314 el resultado de una investigación que demuestra que la disfunción mitocondrial aumenta con la edad, lo que induce su senescencia con un fenotipo de secreción diferente.

Objetivos de la invención

La invención pretende resolver el problema técnico de dar una solución para encontrar nuevos extractos o principios activos a partir de la planta Aframomum angustifolium o LONGOZA, como un agente cosmético que tiene una buena actividad antienvejecimiento, o una actividad antienvejecimiento mejorada en comparación con los agentes cosméticos antienvejecimiento conocidos anteriormente, incluido el extracto hidroalcohólico de la planta Aframomum angustifolium o LONGOZA, y/o con muy buena compatibilidad en el contexto de la aplicación tópica con fines cosméticos, en particular, sobre la piel, y/o sin o sustancialmente sin efectos secundarios o irritantes.

La invención también pretende resolver el problema técnico planteado anteriormente utilizando nuevos extractos o principios activos a partir de la planta. Aframomum angustifolium o LONGOZA capaz de ralentizar o prevenir la disfunción de las mitocondrias que conduce a su senescencia y envejecimiento prematuro de la piel.

Todavía, el objetivo de la invención es resolver los problemas técnicos expuestos anteriormente proporcionando también un proceso para la obtención del principio activo compatible con el medio ambiente que evite el uso de disolventes nocivos para el medio ambiente, poco costoso en términos de energía, y que permita preparar cantidades suficientes para su uso a escala industrial y en particular a escala cosmética.

Sumario de la invención

La invención proporciona una solución a los problemas técnicos expuestos anteriormente, de una manera sencilla, poco costosa y utilizable a escala industrial y en particular a escala cosmética.

Según un primer aspecto, la presente invención proporciona una composición cosmética, caracterizada por que comprende, como ingrediente activo, un extracto, llamado extracto verde, de semillas de la planta Aframomum angustifolium o Longoza elaborado con un disolvente polar ecológicamente compatible y cosméticamente aceptable, que comprende o consiste en un disolvente polar de un poliol, en particular, un glicol, en un excipiente cosméticamente aceptable.

Según un segundo aspecto, la invención también se refiere al uso de un extracto, llamado extracto verde, de semillas de la planta Aframomum angustifolium o Longoza elaborado con un disolvente compatible con el medio ambiente y cosméticamente aceptable, que comprende o consiste en un disolvente polar de un poliol, en particular, un glicol, como agente cosmético, para la fabricación de una composición cosmética.

Según una realización particular de la invención, el extracto verde de Longoza se utiliza como agente cosmético que tiene actividad antienvejecimiento.

Según una variante de realización ventajosa de la invención, se utiliza el extracto verde de semillas de la planta Longoza, para una actividad antiarrugas, en particular, para reducir, eliminar o retrasar la aparición de arrugas, una acción que preserva o restaura la estructura de la piel, en particular, por una acción de estimulación de la síntesis de ATP sintasa 6 por las mitocondrias.

De este modo, la invención permite tener un efecto de protección, de reparación o de restauración de la actividad de las mitocondrias evitando su senescencia dando como resultado un efecto antienvejecimiento, especialmente antiarrugas.

La invención también permite proteger la piel contra el envejecimiento resultante de la acción de las radiaciones actínicas, particularmente debido a los rayos ultravioleta.

Según un tercer aspecto, la invención se refiere a un nuevo proceso para extraer las semillas de Aframomium angustifolium o Longoza.

En el contexto de la invención, se realiza la extracción de las semillas de la planta Aframomum angustifolium o Longoza con un disolvente polar ecológicamente compatible y cosméticamente aceptable, en particular, un disolvente polar que comprende o consiste en un poliol, en particular, un glicol, obteniendo así un extracto "verde". Para cada uno de los aspectos de la invención, el poliol utilizado puede tener la fórmula química genera1HO-R-OH, en la que R puede representar un radical hidrocarburo -(CH2)n, teniendo n de 2 a 16 átomos de carbono, en particular, de 3 a 8 átomos de carbono.

Según una realización particular de la invención, usaremos como poliol, un glicol común ampliamente disponible en la industria y de bajo coste, como, por ejemplo, el propilenglicol, el butilenglicol o 1,3-butilenglicol, pentilenglicol y su(s) mezcla(s).

Según otra variante de realización, se realiza la molienda de las semillas hasta obtener un polvo fino. Los granos de este polvo tienen ventajosamente un diámetro comprendido aproximadamente entre 0,01 y 1 mm.

Según otra variante más de realización, se pueden realizar varias extracciones sucesivas hasta agotar el material que se debe extraer por el disolvente poliol, en particular, un glicol.

Según una variante de realización, la extracción con el poliol, en particular, se produce un glicol una primera vez a temperatura ambiente llamada "frío" y una segunda vez a una temperatura de aproximadamente 55 °C.

Según una realización particular de la invención, el proceso de extracción comprende al menos una etapa de extracción de las semillas secas molidas con un disolvente polar que consiste en el 100 % de poliol, en particular, un glicol. Según una variante de realización, la relación planta/disolvente m/v puede ser de 1/1,75.

Según otra variante de realización, antes de la extracción real, las semillas molidas se impregnan mediante una maceración suave, por ejemplo, de 12 a 15 horas a temperatura ambiente en el poliol, en particular, un glicol, permitiendo así que las moléculas de interés sean más accesibles y estén más disponibles.

Según otra variante más, se realiza, después de la maceración, una primera filtración para obtener un primer filtrado y una torta de semillas molidas, a continuación, se realiza una extracción sobre la torta a temperatura suave, por ejemplo, del orden de 55 °C durante un período de varias horas, por ejemplo, unas 3 horas, a continuación, se realiza la filtración para obtener un segundo filtrado, por ejemplo, en un filtro con una porosidad de 20-25 micrómetros. Según una variante particular, los dos filtrados obtenidos se combinan y se pueden volver a filtrar en un filtro esterilizador o no, por ejemplo, de 0,5 a 0,1 micrómetros. La solución obtenida se puede ajustar con poliol, en particular, un glicol, u otro disolvente biocompatible y cosméticamente aceptable para lograr aproximadamente un 1 % en peso de extracto seco.

Según una realización particular de este proceso de extracción, el extracto de poliol, en particular, un glicol, puede constituir en sí mismo el ingrediente o el agente activo según la invención.

Se puede, según otra variante particular, evaporar sustancialmente por completo el disolvente de extracción, obteniendo un extracto seco que puede o bien usarse tal cual como el ingrediente activo antes mencionado, o bien disolverlo de nuevo en un disolvente compatible con el medio ambiente y cosméticamente aceptable, tal como un poliol, en particular, un glicol, o un alcohol o una mezcla hidroalcohólica para obtener otra variante del mencionado ingrediente activo.

Según otra variante ventajosa de la invención, el disolvente utilizado para la redisolución es un glicol.

Según una realización particular de la invención, como se indicó anteriormente, se utilizará un glicol común ampliamente disponible en la industria y de bajo coste como, por ejemplo, el propilenglicol, el butilenglicol o 1,3-butilenglicol, el pentilenglicol y mezclas de los mismos. Una variante de realización particular utiliza butilenglicol. En el contexto de la invención, el extracto obtenido es fácil de usar como agente cosmético y de mezclar con los demás ingredientes de la composición cosmética que se va a preparar, ya sea para su incorporación a una fase acuosa o a una fase grasa.

Según un quinto aspecto, la presente invención también se refiere a un proceso de cuidado cosmético, caracterizado por que comprende la aplicación tópica sobre la piel de una persona que lo necesite, de una cantidad cosméticamente eficaz de un extracto, llamado extracto verde, de semillas de la planta Aframomum angustifolium o Longoza, tal como se definió anteriormente.

Según una realización ventajosa de la invención, este proceso de cuidado cosmético se implementa para aplicar el extracto de semilla de la planta Aframomum angustifolium o Longoza antes mencionado en zonas de la piel, que necesitan un cuidado antienvejecimiento, en particular, para combatir los efectos del envejecimiento resultantes de la disfunción mitocondrial.

Se descubrió inesperadamente que el extracto verde de glicol de la invención tiene una acción significativa sobre el metabolismo energético. La adenosina trifosfato o ATP sintasa es un complejo enzimático que se encuentra en las crestas mitocondriales. El papel de esta enzima es sintetizar la ATP a partir del gradiente electroquímico y de la adenosina difosfato o ADP que es mantenida por la cadena respiratoria así como de fosfato inorgánico ("PI"), para obtener ADP PI = ATP.

La ADP y el PI son verdaderos motores moleculares esenciales para la vida de las células. La ATP es la única forma de energía química convertida en energía química y mecánica.

La invención tiene así inesperadamente una acción que preserva o restaura la estructura de la piel, un efecto de protección, de reparación o de restauración de la elasticidad y/o de la firmeza de la piel, en particular, por una acción de estimulación de la subunidad sintasa 6 de la ATP.

La invención también tiene una actividad antienvejecimiento que se dirige más particularmente a una actividad antiarrugas, para reducir, eliminar o retrasar la aparición de arrugas.

En el contexto de cualquiera de los aspectos de la invención, dicho extracto verde está presente en una concentración, expresada en extracto seco o en sustancia, comprendida entre el 0,001 % y el 5 %, en particular, entre el 0,01 % y el 1 %, en peso con respecto al peso total de la composición.

Otros objetivos, características y ventajas de la invención aparecerán claramente para los expertos en la materia a partir de la siguiente descripción que contiene varias realizaciones de la invención dadas a modo de ejemplo y que no pueden limitar en modo alguno el alcance de la invención.

En los ejemplos siguientes, todos los porcentajes se dan en peso, la temperatura es la temperatura ambiente, ya sea 25 °C, o se da en grados Celsius, la presión es la presión atmosférica, salvo indicación contraria.

Ejemplo 1 Según la invención

Ejemplo de preparación en laboratorio de un extracto verde de semillas de la planta Aframomum angustifolium o Longoza, con un glicol, por ejemplo, butilenglicol, según la invención,

A partir de 200 g de semillas de plantas Longoza de diferentes lotes comerciales, se lleva a cabo el siguiente procedimiento de extracción:

a) en primer lugar, las semillas secas comerciales se muelen, por ejemplo, hasta un tamaño medio de polvo de entre 0,01 mm y 1 mm.

b) a continuación, se procede a la maceración durante la noche, es decir, unas 12 horas, en 350 ml de butilenglicol, es decir, una relación semillas/disolvente (m/v) de 1/1,75 a temperatura ambiente y estática. c) se realiza, después de la maceración, una primera filtración, por ejemplo, en un filtro con una porosidad de 20­ 25 micrómetros, para obtener un primer filtrado obteniendo una solución opaca de color rojo anaranjado con un residuo seco de aproximadamente 20 g/l o jugo de maceración, y una torta de semillas molidas, a continuación, d) se realiza sobre la torta con otros 350 ml de butilenglicol, una extracción a temperatura suave, por ejemplo, del orden de 55 °C durante un período de varias horas, por ejemplo, unas 3 horas, a continuación,

e) se hace una segunda filtración, por ejemplo, en un filtro con una porosidad de 20-25 micrómetros, para obtener un segundo filtrado, obteniendo una solución naranja opaca con un residuo seco de aproximadamente 5 g/l.

f) Según una variante particular, los dos filtrados o extractos obtenidos se combinan y se pueden volver a filtrar en un filtro esterilizador, por ejemplo, de 0,5 a 0,1 micrómetros. El filtrado es una solución límpida naranja anaranjada sobre la que se pueden realizar los análisis de dosificación en principio activo y una cromatografía en capa fina y una microbiología.

g) La solución de filtrado o extracto obtenida puede ajustarse con butilenglicol u otro disolvente biocompatible y cosméticamente aceptable para conseguir una tasa de materias secas de 10 g/l, es decir, aproximadamente un 1 % en peso de extracto seco.

Este extracto de butilenglicol constituye en sí mismo según una realización particular, el extracto verde de semillas de Longoza o de Aframomum angustifolium según la invención, que puede ser utilizado como agente cosmético o como ingrediente activo para la fabricación de una composición cosmética como se muestra en los siguientes ejemplos (extracto 1 g). Esta solución de butilenglicol contiene un 1 % en peso de extracto seco. h) para incorporar este extracto seco en una composición cosmética según la invención, también es posible preparar una solución extemporánea en el momento de fabricar dicha composición, en un disolvente cosméticamente aceptable, especialmente en agua, alcohol, butilenglicol 1-3 o en una mezcla de estos disolventes. Esta realización permite así preparar soluciones de extracto verde seco de la planta Aframomum angustifolium o Longoza a la concentración deseada.

i) finalmente se puede proceder a una operación de envasado de las diferentes soluciones del extracto descritas anteriormente, en espera de su uso para la fabricación de las composiciones cosméticas deseadas. En este contexto, se recomienda realizar primero una filtración esterilizante en un filtro con un diámetro de poros de 0,22 |jm antes del envasado en botellas de volúmenes adecuados, a continuación, el almacenamiento en una cámara frigorífica, por ejemplo, a 4 °C.

De media, a partir de 1 kg de semillas molidas de Longoza o de Aframomum angustifolium, obtenemos de 3 a 3,5 kg de extracto al 1 % en peso de materias secas en butilenglicol, lo que corresponde a 30 a 35 gramos de extracto seco. El rendimiento de extracción en masa obtenido es en promedio del 35 % calculado de la siguiente manera: RDT en masa = masa de extracto seco contenido en el extracto final *100/masa de semillas molidas introducidas al inicio.

Ejemplo 2 según la invención

Ejemplo de preparación en piloto industrial de un extracto verde de semillas de la planta Aframomum angustifolium o Longoza, con un glicol, por ejemplo, butilenglicol, según la invención

1) Pilotos

Los pilotos están programados para procesar 10 kg por piloto de semillas de Aframomum angustifolium de MADAGASCAR según 3 lotes de semillas identificados como G1, G2 y G3 para los Pilotos 1, 2 y 3, y sistemas de filtración adecuados descritos a continuación.

2) Procedimiento de extracción según la invención en los pilotos

El extracto según la invención se elabora con un disolvente polar compuesto por butilenglicol al 100 % procedente de semillas secas de Aframomum angustifolium tradicionalmente molidas previamente con una relación planta/disolvente (m/v) de 1/1,75 impregnando primero la planta mediante una maceración suave de 12 a 15 horas a temperatura ambiente en butilenglicol para hacer más accesibles y disponibles las moléculas de interés. Se realiza una primera etapa de filtración para obtener un filtrado 1.

Se realiza una segunda extracción a 55 °C sobre la torta durante 3 horas y, a continuación, se filtra en un filtro con una porosidad de 20-25 pm para obtener un filtrado 2.

Los dos filtrados 1 y 2 obtenidos se juntan y se filtran de nuevo a través de un filtro de 0,5 a 0,1 pm.

La solución obtenida se ajusta con butilenglicol al 1 % de extracto seco.

Se obtiene una solución límpida anaranjada glicólica.

Los 3 extractos de los 3 lotes G1, G2 y G3, obtenidos con los 3 pilotos, se denominan E1, E2 y E3.

De media, a partir de 10 kg de semillas molidas, se obtienen aproximadamente de 30 a 35 kg de extracto al 1 % de MS en butilenglicol (lo que corresponde a 300 a 350 g de extracto seco).

El rendimiento de extracción en masa obtenido es en promedio del 35 %. Se calcula de esta manera:

RDT en masa = masa de extracto seco contenida en el extracto final *100/masa de semillas molidas introducidas al inicio.

3) Análisis fisicoquímicos de los extractos

3-1) Masa Seca (MS) comparable: 0,96 a 1 % (9,6 g/l a 10,0 g/l)

pH alrededor de 6,6; Color comparable: 7,8 a 7,9 (Gardner)

Valores Lab 87,8-88,9; -3,3 a -2,5, 67,7 a 69,3.

3-2) Polifenoles totales: Método de la Farmacopea Europea 2.8.14 La muestra de prueba de 0,05 g por muestra. La lectura se hace a 750 nm en el visible.

Concentración g/l en equivalente de ácido gálico

E1 0,012

E2 0,017

E3 0,016

Se obtienen contenidos entre 0,012 y 0,016 g/l. Se observa que los contenidos son ligeramente superiores para los extractos utilizados con los extractos de las semillas E2 y E3.

4) Dosificaciones de azúcares totales

Método de dosificación de Antrona sulfúrica. La lectura se realiza a 620 nm.

Contenidos en % en equivalente de glucosa

E1 5,9

E2 7,0

E3 8,1

Los contenidos son ligeramente superiores para los extractos utilizados con los extractos de las semillas E2 y E3.

Ejemplo 3 comparativo entre el proceso según la invención del ejemplo 2 con la obtención de un extracto verde con butilenglicol de semillas de la planta Aframomum angustifoium o Longoza, según la invención y el proceso según el ejemplo 1 del documento US 7.381.436 obteniendo un extracto de alcohol/agua 70/30 en volumen, de semillas de la planta Aframomum angustifoium o Longoza

3-1) Para llevar a cabo esta prueba comparativa, se utilizaron las 2 muestras siguientes:

a) un lote comparativo de semillas de la planta de Madagascar Aframomum angustifolium o Longoza denominado_lote SX000HH el cual es sometido al proceso de extracción descrito en el ejemplo 1 del documento US 7.381.436 el cual utiliza como disolvente de extracción una mezcla hidroalcohólica etanol/agua 70/30 en volumen y el extracto se denomina: extracto lote SX000HH

b) el extracto verde E2 según el ejemplo 2 de la invención anterior

3-2) Determinación de la actividad antienvejecimiento del extracto verde E2 del Ejemplo 2 de Longoza (Aframomum angustifolium) en células de queratinocitos humanos normales, abreviado KHN por la acción sobre la síntesis de la subunidad 6 de la ATP sintasa por parte de las mitocondrias.

1. Introducción

Un estudio sobre los efectos transcripcionales del extracto verde de butilenglicol de Longoza (Aframomum angustifolium) del ejemplo 1 en comparación con el extracto hidroalcohólico anterior de etanol/agua 70/30 en volumen según el ejemplo 1 de la patente US 7.381.436 B2, fueron evaluados utilizando la tecnología TLDA (TaqMan Low Density Array). Gracias a esta tecnología, se estudia la modulación de la expresión de 96 genes que codifican proteínas específicas en respuesta a un tratamiento de queratinocitos humanos normales.

Después de 24 horas de tratamiento, las capas celulares se lisaron para recuperar los ARN. Estos ARN se cuantificaron y normalizaron para realizar la transcriptasa inversa. A continuación, se prepararon los ADNc obtenidos para ser analizados en una tarjeta microfluídica TLDA FHN, KHN y MHN, 96 genes de "perfil cronobiológico".

2. Materiales y método

2.1. Preparación de los principios activos ensayados y controles de los principios activos ensayados

Activo 1 según la invención: extracto VERDE E2 con butilenglicol al 100 % de semillas de Longoza de Madagascar según el Ejemplo 2 anterior.

Activo 2 comparativo: extracto con una mezcla 70/30 v/v de EtOH/H2O de semillas de Longoza de Madagascar según el ejemplo 1 del documento US 7.381.436B2 y el ejemplo 3-1 a) anterior.

Las concentraciones finales ensayadas son del 0,0125 % en peso para el activo 1 y el activo 2

2.2. Tratamientos celulares

El estudio se realizó sobre queratinocitos humanos normales de una abdominoplastia de una donante mujer de 31 años (código 1477). Las células se sembraron primero en medio Epilife completo (suplemento en HKGS) en el paso 4 (P4), a una densidad de 125.000 células por pocillo, en placas de 12 pocillos. A continuación, las células se tratan con Perla de Madagascar Green al 0,0125 % y Perla de Madagascar al 0,0125 %, así como con sus respectivos excipientes de control (BG al 100 % y EtOH/H2O 70/30 v/v).

Después de 4 horas de tratamiento, las células se recuperan para extraer los RNA totales.

2.3. Técnica TLDA (TaqMan Low Density Array, matriz de baja densidad TaqMan)

2.3.1. Obtención de los ARN totales mediante el MicrolabSTAR (Hamilton)

Se elimina el medio de cultivo celular y se añaden 250 pl de tampón de lisis RLT (suministrado en el kit de Nucleospin RNA trace, (Réf. 740709, lote n.°1412/001, Macherey-Nagel). Las células se raspan usando un raspador celular Cell Scraper y, a continuación, el lisado celular, recogido en un pocillo profundo de 1,2 ml (suministrado en el kit de Nucleospin RNA). Los ARN totales se extraen según los protocolos desarrollados previamente (NS_96RNA_KHN o NS_96RNA_FHN.dws).

Las soluciones de ARN totales obtenidas se miden y se comprueba su calidad, utilizando un lector de microplacas, el spectrostarNANO (BMG Labtech) acoplado al MicrolabSTAR. Este dispositivo está conectado al ordenador que controla la plataforma robótica y dispone de un software específico para el análisis de los resultados (software MARS). La técnica requiere una microplaca de 384 pocillos (384 microclear plate black LoBase ref: 788876 lote: 1305055 Greiner), un control positivo (RNA 250 ref: AM7155 lote 1301028 (FHN), lote: 1208025 (KHN), lote: 1208026 (MHN), Thermofisher) para validar los pipeteos realizados por el robot así como los valores generados por el lector spectrostarNANO.

2.3.2. Síntesis de los ADN complementarios

El kit de transcripción inversa o en inglés "Reverse Transcription" (RT) utilizado es el Kit de la marca "High Capacity Reverse Transcription Kit" (Ref. 4368813, lote n.° 00288647; Thermo Fisher) y se utilizó de acuerdo con el protocolo proporcionado: se diluyen 500 ng de ARN total en agua hasta un volumen final de 25 pl Se incuban 10 minutos a 25 °C y a continuación 2 horas a 37 °C en presencia de 25 pl de High Capacity Reverse Reaction Mix Transcription Kit 2X previamente preparado como se indica a continuación. Las diferentes incubaciones se realizan dentro del TRobot (Biométra).

T l 2: Pr r i n l m z l r i n Hi h i R v r Tr n ri i n Ki 2X r 1 r i n

2.3.3. PCR-TaqMan Low Density Array

Se mezclan 15 |jl de cada RT con 60 |jl de agua y, a continuación, se añaden 75 |jl de la mezcla maestra TaqMan Gene Expression (Ref. 4369016, lote n.° 1507235, Thermo Fisher). Después de la homogeneización, se depositan 100 j l en las tarjetas microfluídicas de perfil cronobiológico de 96 genes (lote B1885 (FHN), lote B1884 (KHN) y lote B1942 (MHN)), estos últimos son centrifugados y a continuación sellados.

El CD, correspondiente al perfil de los genes depositados en las placas, se carga en el software SDS 2.4, lo que permite especificar la ubicación de cada gen en la tarjeta. Los genes de control (llamados "endogeneous" gene (gen endógeno) en el software) que se utilizarán para la normalización de los resultados se indican antes del lanzamiento de la PCR. Esta última se lleva a cabo según el protocolo proporcionado por Applied Biosystems en el dispositivo ABI Prism 7900HT Sequence Detection System. Las etapas de qPCR son de 2 min a 50 °C, 10 min a 94,5 °C, a continuación, 30 s a 97 °C y 1 min a 59,7 °C durante 40 ciclos.

2.3.4. Análisis estadístico de los resultados

La PCR cuantitativa en tiempo real se puede aprovechar si su eficacia está entre el 90 % y el 110 %.

En el método RT-PCR-TLDA, la cuantificación se realiza mediante el método comparativo de ACt, o la cuantización relativa (RQ). Este método determina el Ct de cada gen en la tarjeta utilizando el software RQ Manager que tiene en cuenta el ruido de fondo de cada gen. Este Ct se normaliza con respecto al Ct de un gen de mantenimiento (en nuestro estudio de Beta-2-microglobulina) que se estudia en paralelo en la tarjeta. Siendo este gen invariable en las células, sus variaciones reflejan las variabilidades del experimento (dosificación de los ARN totales, pipetas, etapa de transcripción inversa, depósitos en la tarjeta microfluídica, calidad de la tarjeta, PCR en el aparato). Con este software RQ Manager, obtenemos los valores de RQ (Relative Quantification) que corresponden al nivel de amplitud (x veces más o menos que el control) de la expresión con respecto a nuestro control. Este último puede ser el control no tratado o el excipiente. El RQ se obtiene mediante el siguiente cálculo (siendo el valor de no tratado igual a 1):

RQ = 2-AACt = 2-(ACt tratado - ACt no tratado)

ACt tratado = Ct gen diana tratado - Ct gen de mantenimiento tratado ACt no tratado Ct gen diana no tratado - Ct gen de mantenimiento no tratado

Para que este método sea fiable, es imperativo que la eficacia de la amplificación del gen de interés y del gen de mantenimiento sea la misma, esto se verificó durante los ajustes realizados antes del uso rutinario de las placas. Para evaluar variaciones estadísticamente significativas en la actividad transcripcional, se utilizará la prueba t de Student. Cada condición se realiza por triplicado (3 no tratadas y 3 tratadas en las mismas condiciones). Primero, se aplica la prueba F de Fischer comparando las dos matrices de datos. Cuando el valor es mayor que a = 0,05, la varianza de la prueba t de Student es 2, cuando la prueba F de Fischer es menor que a = 0.05, entonces la varianza será igual a 3. Las variaciones transcripcionales retenidas serán las que correspondan a una prueba t de Student inferior a a = 0,05.

Tabla 3: Tabla de codificación de color

- RQ<0,5 0,5>RQ<0,750 | 0,75>RQ<1 | 1>RQ<1,5 | 1,5>RQ<2 | RQ>2

Un criterio que tenga en cuenta el efecto esperado (+ para un aumento, - para una inhibición) permite realizar una primera interpretación de los resultados

- si el efecto obtenido va en la dirección esperada, entonces se aplica el código de escala de grises como se indica arriba

- si el resultado obtenido es contrario al efecto esperado, el código de escala de grises no se aplica pero el resultado permanece visible ya que es un resultado significativo

Todos estos datos nos permiten puntuar los extractos unos respecto a otros ya que la macro de Excel indica el número de genes modulados en la dirección esperada/número de genes modulados en total. En el contexto de un cribado, esta puntuación se puede utilizar como criterio de selección.

Resultados relativos al efecto del extracto E2 de Longoza verde con butilenglicol según la invención del ejemplo 2, en comparación con el Longoza previo a la mezcla hidroalcohólica Etanol/Agua 70/30 vol/vol del ejemplo 1 del documento US7.381.436B2, sobre los queratinocitos humanos normales o KHN después de 4 h

Tabla 4: Efecto de Longoza Verde E2 y Longoza en queratinocitos humanos normales

L Verde E2 Longoza 0,0125% 0,0125%

4h 4h

ATP sintasa 6 codificada en mitocondrias MT 2,697

El LONGOZA verde E2 según el ejemplo 2 de la invención aumenta inesperadamente en un coeficiente de 2,697 la síntesis de la subunidad 6 de la a Tp sintasa por parte de las mitocondrias de los KHN,

Como conclusión de lo anterior, gracias a la prueba anterior en KHN, se pudo demostrar el efecto significativamente reparador de la disfunción mitocondrial del extracto verde de Longoza con Butilenglicol, según la invención, que permite luchar contra la senescencia de las células mitocondriales y por tanto luchar contra el envejecimiento de la piel

De este modo, la invención puede utilizarse como agente cosmético para la preparación de una composición cosmética para uso tópico con vistas a la conservación de las mitocondrias y a la lucha contra el envejecimiento de la piel.

A continuación, se dan varios ejemplos de formulación de composición cosmética a título ilustrativo y que, por tanto, no limitan en modo alguno el alcance de la invención.

Ejemplo 4 según la invención

Gel cosmético para mejorar la firmeza facial

■ extracto verde con butilenglicol al 100 % de Longozaobtenido en el ejemplo 1, g) 2 -glicol 3%

■ polímero de AMPS disponible en el comercio, (nombre comercial Sepigel 305®) 3%

■ aceite de ricino hidrogenado (Cremophor CO-60®) 2% polietilenglicol 1,5 %

■ conservante 0,5 %

■ concentrado de perfume 0,3 %

■ filtro UV (benzofenona-4) 1%

■ agua, csp 100%

Este gel se puede aplicar una vez al día durante varias semanas en el rostro con el fin de mejorar la firmeza de la piel del rostro, y en particular en las zonas con arrugas, observando así al final de este tratamiento, una restauración de la flexibilidad con un claro efecto de rejuvenecimiento de la piel y reducción o desaparición de estas arrugas.

Ejemplo 5 según la invención

Crema de día antiarrugas en forma de emulsión

- extracto verde E1 con butilenglicol al 100 % de Longoza obtenido en el ^ ^

ejemplo 2 2 %

- esteareth-21 (Brij 721) 2,5 %

- estearato de glicerilo (Tegrin) 1,1 %

- alcohol estearílico 5 %

- tricaprato / caprilato de glicerol 12,5 %

- butilenglicol 3 %

- glicerina 2 %

- conservante 0,5 %

- concentrado de perfume 0,5 %

- filtro UV (metoxicinamato de octilo) 7,5 %

- agua, csp 100%

Ejemplo 6 según la invención

Loción tónica antiarrugas

- extracto verde E2 con butilenglicol al 100 % de Longoza obtenido en el ejemplo 2 2 % - butilenglicol 3%

-EDTA 0,1 %

- solubilizante 1% - concentrado de perfume 0,3 % - etanol 5% - filtro UV (benzofenona -4) 0,13 % - agua, csp 100%

Ejemplo 7 según la invención

Polvo de maquillaje facial protector ultravioleta

- extracto verde E3 con butilenglicol al 100 % de Longoza obtenido en el

ejemplo 2 0,25 % - talco 17 % - mica 20 % - sericita 20 % - pigmentos 8 % - polvo orgánico (nailon) 20 % - sílice 8,75 % - aceite mineral o silicona 3% - filtro UV (metoxicinamato de octilo) 3% Ejemplo 8 según la invención

Base de tratamiento antiarrugas

- extracto verde E2 con butilenglicol al 100% de Longoza obtenido en el ejemplo 2) 2% - isoestearato de poliglicerilo-4 y copoliol de cetildimeticona y laurato de hexilo 5.1 % - ciclopentasiloxano y ciclohexasiloxano 5.0 % - cetildimeticona 1.0 % - triglicéridos caprílicos/cápricos 2.2 % - estearato de octilo 1.4 % - aceite mineral 3.5 % - aceite de ricino hidrogenado 1,2 % - cera de abeja 0,8 % - polimetacrilato de metilo 1,1 % - óxidos de hierro 0,45 % - dióxidos de titanio 5,2 % -NaCl 0,6 % - concentrado de perfume 0,1 % - filtro UV (cinamato de octilo) 3% - agua, csp 100%

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Composición cosmética, caracterizada por que comprende, como ingrediente activo, un extracto, llamado extracto verde, de semillas de la planta Aframomum angustifolium o Longoza elaborado con un disolvente polar ecológicamente compatible y cosméticamente aceptable, que comprende o consiste en un disolvente polar de poliol, en particular, un glicol, en un excipiente cosméticamente aceptable.

2. Composición según la reivindicación 1, caracterizada por que el extracto de las semillas de la planta se obtiene mediante un proceso de extracción que comprende al menos una etapa de extracción de las semillas molidas con el disolvente polar de poliol, en particular, un glicol.

3. Composición según la reivindicación 1 o 2, caracterizada por que el extracto de las semillas de la planta se disuelve nuevamente en un disolvente ambientalmente compatible y cosméticamente aceptable, en particular, que comprende un poliol, más particularmente, un glicol, o un alcohol o una mezcla hidroalcohólica.

4. Composición según la reivindicación 1 o 2 o_3, caracterizada por que el poliol tiene la fórmula química general HO-R-Oh , en la que R puede representar un radical hidrocarburo -(CH2)n, teniendo n de 2 a 16 átomos de carbono, en particular, de 3 a 8 átomos de carbono.

5. Composición según la reivindicación 4, caracterizada por que el poliol, comprende un glicol, por ejemplo, elegido entre el propilenglicol, el butilenglicol o 1,3-butilenglicol, el pentilenglicol y mezclas de los mismos.

6. Composición según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada por que el mencionado extracto de semillas de Longoza, está presente en una concentración, expresada en extracto seco, comprendida entre el 0,001 % y el 5 %, preferentemente entre el 0,01 % y el 1 %, en peso con respecto al peso total de la composición.

7. Uso de un extracto, llamado extracto verde, de semillas de la planta Aframomum angustifolium o Longoza elaborado con un disolvente polar ecológicamente compatible y cosméticamente aceptable, como agente cosmético, para la fabricación de una composición cosmética, siendo dicho extracto tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

8. Uso según la reivindicación 7, caracterizado por que el extracto de Longoza se utiliza para una actividad antienvejecimiento, en particular, por una acción estimulante de la subunidad sintasa 6 de ATP.

9. Proceso de cuidado cosmético, caracterizado por que comprende la aplicación tópica sobre la piel de una persona que lo necesite, de una cantidad cosméticamente eficaz de un extracto, llamado extracto verde, de semillas de planta Aframomum angustifolium o Longoza como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

10. Proceso según la reivindicación 9, caracterizado por que se realiza la aplicación del extracto de semillas de la planta Aframomum angustifolium o Longoza citado anteriormente, en zonas de la piel que necesitan un cuidado antienvejecimiento, en particular, una actividad antiarrugas, para reducir, eliminar o retrasar la aparición de arrugas, o para combatir los efectos del envejecimiento resultantes de la disfunción de las mitocondrias, o por una acción que preserva o restaura la estructura de la piel, un efecto de protección, de reparación o de restauración de la elasticidad y/o de la firmeza de la piel, en particular, por una acción de estimulación de la subunidad sintasa 6 de la ATP.