KR20200094871A - 진세노사이드를 포함하는 지질-단백질 나노복합체 및 이의 용도 - Google Patents

진세노사이드를 포함하는 지질-단백질 나노복합체 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 진세노사이드를 포함하는 지질-단백질 나노복합체 및 이의 용도에 관한 것으로, 진세노사이드를 포함하는 지질나노입자에 양전하성 단백질을 처리하여 지질-단백질 나노복합체 제조를 위한 최적의 조건을 확인하였다. 또한, 확인된 최적의 조건으로 제조된 진세노사이드를 포함하는 지질-단백질 나노복합체를 이용해 진세노사이드의 피부 전달 효능을 확인한 결과, 진세노사이드의 피부 잔류량이 현저히 증가하는 것을 확인함으로써, 본 발명의 진세노사이드를 포함하는 지질-단백질 나노복합체를 이용하여 의약 분야 및 화장품 분야에서의 효과적인 진세노사이드의 피부 전달을 위한 피부 외용제를 개발할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

진세노사이드를 포함하는 지질-단백질 나노복합체 및 이의 용도{Lipid-protein nanocomposites comprising ginsenoside and use thereof}
본 발명은 진세노사이드를 포함하는 지질-단백질 나노복합체 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 난용성 진세노사이드의 피부 전달 효율을 증진시키기 위한 진세노사이드를 포함하는 지질-단백질 나노복합체 및 이를 포함하는 피부 외용제 조성물에 관한 것이다.
인삼의 대표적인 약리 효능에는 항암 활성, 면역 증진 등이 있으며, 상당 부분 인삼의 사포닌 성분인 진세노사이드(ginsenoside)란 성분에 기인한 것으로 밝혀졌다. 진세노사이드는 트리테르페노이드 계열의 담마란(dammarane) 골격에 포도당(glucose), 아라비노스(arabinose), 자일로스(xylose), 람노스(rhamnose) 등이 결합한 비스데모사이드의 중성 배당체이다. 현재 약 40여 종의 진세노사이드 성분들이 규명되어 있으며 화학 구조식에 따라 크게 프로토파낙사디올(protopanaxadiol, PPD)계와 프로토파낙사트리올(protopanaxatriol, PPT)계로 나눌 수 있다.
진세노사이드는 또한 인삼 내 함량에 따라 주요(major) 진세노사이드와 희귀(minor) 진세노사이드로 분류할 수 있다. 주요 진세노사이드인 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re 및 Rg1은 총 진세노사이드의 90% 이상을 차지하고, 특히 프로토파낙사디올계의 4가지 주요 진세노사이드인 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc와 Rd가 총 진세노사이드의 50~70%를 차지하고 있다. 이러한 주요 진세노사이드는 고분자 구성성분과 연결되어 있어 인체에 섭취 후 체내에서 잘 흡수가 되지 못하지만 사람의 장내에 서식하는 특유의 미생물에 의해 가수분해되어 여러 개의 당이 떨어진 희귀 진세노사이드 형태인 진세노사이드 Rg3, Rh1, Rh2와 컴파운드 K(compound K) 등으로 전환되면 쉽게 흡수가 된다(Cui, C.H., et al., 2013). 뿐만 아니라 이러한 희귀 진세노사이드는 주요 진세노사이드에 비해 항암 활성, 면역증가, 혈액개선, 치매 방지 등에서 탁월한 약효를 나타낸다는 것이 보고되어 있다(Kang, S.W., et al., 2012).
인삼의 주름 예방 효과가 알려진 이후로, 진세노사이드 함량이 14% 이상인 인삼엑기스를 피부에 발랐을 때 보습과 피부탄력을 증진시키고, 진세노사이드 F1은 자외선 조사로 인한 인간 각질세포의 세포 사멸을 감소시킬 뿐만 아니라 자외선으로 촉진되는 세포자기사멸(apoptosis)로부터 각질세포를 보호한다(Lee, E.H., et al., 2003)는 연구 결과들이 보고되고 있다. 또한 진세노사이드 Rb2는 생체외(in vitro) 상의 표피세포에 대한 증식 효과가 있고(Choi, S.W., 2002), 컴파운드 K는 히알루론산 생합성에 관련된 히알루론산 합성 유전자 발현을 증진시키는 것으로 알려져있다(Kim, S.W., et al., 2004). 진세노사이드 Re는 피부 노화 억제 효능을 갖고 있으며 피부 내 수분 보유, 세포 간 간격유지, 세포 분열과 분화 이동에도 많이 관여하는 히알루론산 양을 유의적으로 증가시켰고, 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)의 증가와 타입 I 콜라겐 분해효소(Type I collagenase)의 과발현 억제 효과가 보고되었다(Yeom, M.H., et al., 2010).
진세노사이드의 항노화, 항산화, 면역증진 등의 다양한 약리학적 활성으로 인해 최근에는 진세노사이드를 이용해 화장품과 의약품의 중간적인 성격을 갖는 기능성 화장품의 소재로 많이 활용하고 있다. 그러나 기존의 진세노사이드 함유 화장품은 진세노사이드의 함량이 매우 낮아 용해도 및 피부 투과도 면에서 한계가 드러나지 않았으나, 실제 생리활성을 나타낼 수 있도록 고함량의 진세노사이드를 함유한 제품을 설계함에 있어서 그 약제학적 특성을 개선할 필요성이 대두되고 있다. 진세노사이드 Re는 현재 화장품 등에 첨가되어 판매되고 있는 대표적인 활성성분이나, 수난용성이며 피부에 대한 전달률이 낮아, 이에 대한 개선 방안이 필요하다.
화장품 업계는 미백, 주름, 항산화, 항노화 등의 기능성 화장품의 신소재 개발과 더불어 실제적으로 피부에 적용시 경피 흡수율을 높이는 기술이 중요한 과제이다. 피부라는 장벽에 의해 유효성분이 흡수되지 못하기 때문에 아무리 뛰어난 효능을 가진 성분이라고 할지라도 피부에 적용 시 그 효과를 발휘하지 못하기 때문이다. 따라서 화장품 업계의 가장 큰 관심은 유효성분을 피부에 자극을 주지 않으면서도 흡수를 촉진시키고 효과를 최대화할 수 있느냐에 놓여 있다. 이에, 유효 성분의 흡수를 촉진시키기 위한 많은 방법들이 제시되어 왔으며 현재도 국소 작용(topical effect)에서 전신 작용(systemic effect) 등으로 활발한 연구가 진행되고 있으며, 이러한 연구를 통해 크기가 500㎚ 이하이고, 수중유(oil in water, O/W) 제형일 경우에 피부 투과가 보다 용이하다는 사실을 확인하였다(김은주, et al., 2010).
최근 경피 흡수 촉진 방법 중 가장 많은 연구를 차지하는 방법은 제형적 접근법으로, 크게 5가지로 나눌 수 있다. 첫 번째는 pH 감응형 고분자 수화젤이다. 즉, pH 감응성을 가지는 고분자 수화젤을 만들어 외부 환경에 불안정한 활성물질을 화장품 제형 내에서는 안정하게 보존하고, 피부 도포 시 빠른 방출로 피부에 흡수될 수 있는 시스템이다. 두 번째는 친수성 고분자와 소수성 고분자가 블록 공중합체의 형태로 결합되어 소수성 활성성분을 수용액상에 분산시키는데 있어서 효율적인 고분자 마이셀(micelle)이다. 세 번째는 100~500㎚의 입자 크기를 갖는 에멀젼의 한 종류로 일반 에멀젼과는 달리 입자들 사이 응집 현상이나 합일 현상이 없어 낮은 점도 조건에서도 장기간 안정성을 보유하는 특징이 있는 나노 에멀젼이다. 네 번째는 세포막 또는 각질층의 세포 간 지질과 구조적으로 유사한 지질 이중층으로 구성되어 있어 세포막과 융합하여 활성성분을 효과적으로 세포 내로 전달하는 구조인 리포좀이다. 다섯 번째는 에토좀과 탄성리포좀으로 리포좀보다 피부 투과율을 높이기 위해 고안된 방법으로 막을 좀 더 유연하고 변형이 쉬운 상태로 만든 제형이다(Chung, J.Y., et al., 2014).
이에 본 발명자들은, 난용성 진세노사이드의 피부 전달률을 높이기 위한 전달 시스템을 개발하는 과정에서, 진세노사이드를 포함하는 지질나노입자에 양전하성 단백질을 처리하여 지질-단백질 나노복합체를 제조하였고, 제조한 지질-단백질 나노복합체의 피부에의 진세노사이드 전달 효과를 확인한 결과, 진세노사이드의 피부 잔류량이 현저히 증가하는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성할 수 있었다.
종래선행기술로, 비특허문헌인 Lemos, C.N., et al, (2018)에는 지질나노입자 및 입자 표면이 양전하를 띤 경우에 피부 투과율이 증가한다는 것이 기재되어 있으나, 본 발명의 진세노사이드를 포함하는 지질나노입자에 라이소자임 또는 파파인 단백질을 처리하여 제조된 조성물의 현저히 증가된 진세노사이드 피부 전달률에 대한 효과는 기재되어 있지 않다. 또한, 미국등록특허 제7459283호에는 난용성 활성제 및 활성제 표면에 흡착되거나 결합된 표면 안정화제로서 라이소자임을 포함하는 나노입자 조성물이 기재되어 있으나, 본 발명의 진세노사이드를 포함하는 지질-단백질 나노복합체 구성 및 이로 인한 진세노사이드의 피부 전달률 증진 효과는 기재되어 있지 않다.
미국등록특허 제7459283호, Nanoparticulate compositions having lysozyme as a surface stabilizer, 2008. 12. 02. 등록.
김은주, et al., 마이크로니들 시술에 의한 발효제품의 피부재생 및 항상성 강화 기술, 한국생물공학회, 25, 116-122, 2010. Choi, S.W., Epidermis proliferative effects of the Panax ginseng ginsenoside Rb2, Arch. Pharm. Res., 25, 71-76, 2002. Chung, J.Y., et al., The Recent Trend of Percutaneous Absorption Used in Cosmetics, Kor. J. Aesthet. Cosmetol., 12(5), 597-605, 2014. Cui, C.H., et al., Identification and characterization of a Mucilaginibacter sp. strain QM49 β-glucosidase and its use in the production of the pharamceutically active mior ginsenosides (S)-Rh1 and (S)-Rg2, Appl. Environ. Microbiol., 79(19), 5788-5798, 2013. Kang, S.W., et al., Ginseng, the 'Immunity Boost': The Effects of Panax ginseng on immune system, J. Ginseng Res., 36(4), 354-368, 2012. Kim, S.J., et al., Compound K induces expression of hyaluronan synthase 2 gene in transformed human keratinocytes and increases hyaluronan in hairless mouse skin, Biochemical and Biophysical Research Communications, 316, 348-355, 2004. Lee, E.H., et al., Ginsenoside F1 protects human HaCaT keratinocytes from Ultraviolet-B-induced apoptosis by maintaining constant levels of Bcl-2, J. Invest. Dermatol., 121(3), 607-613, 2003. Lemos, C.N., et al., Chapter 6-Nanoparticles influence in skin penetration of drugs: In vitro and in vivo characterization, Nanostructres for the Engineering of Cells, Tissues and Organs, 187-248, 2018. Yeom, M.H., et al., The anti-aging effects of Korean Ginseng Berry in the skin, Kor. J. Pharmacogn., 41, 26-30, 2010.
본 발명의 목적은 진세노사이드를 포함하는 지질-단백질 나노복합체 및 이의 제조 방법을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 진세노사이드를 포함하는 지질-단백질 나노복합체를 포함하는 피부 외용제 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명은 진세노사이드를 포함하는 지질-단백질 나노복합체를 기준으로 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine) 0.3~3%(w/v), 자당 지방산 에스테르(sucrose fatty acid ester) 0.2~1.5%(w/v), 계면활성제 0.2~1.5%(v/v) 및 진세노사이드 0.1~0.4%(w/v)로 이루어진 지질나노입자에 양전하성 단백질 0.3~2.5%(w/v)를 가하여 제조한 진세노사이드를 포함하는 지질-단백질 나노복합체에 관한 것이다.
상기 진세노사이드는 진세노사이드 Re, Rb1, Rb2, Rc, Rd 및 Rg3로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
상기 계면활성제는 트윈 20(Tween 20), 크레모포르 EL(Cremophor EL) 및 솔루톨 HS 15(Solutol HS 15)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다. 바람직하게는 솔루톨 HS 15이다.
상기 양전하성 단백질은 파파인(papain), 라이소자임(lysozyme), 히스톤(histone) 및 사이토크롬 C(cytochrome C)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
상기 진세노사이드를 포함하는 지질-단백질 나노복합체는 입자 크기가 50~1000㎚일 수 있다.
상기 진세노사이드를 포함하는 지질-단백질 나노복합체는 진세노사이드의 피부 잔류량을 진세노사이드를 함유하는 지질나노입자와 대비하여 7배 이상 증가시킨 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 진세노사이드를 포함하는 지질-단백질 나노복합체를 함유하는 피부 외용제 조성물에 관한 것이다.
상기 피부 외용제 조성물은 화장료 조성물 또는 약학 조성물일 수 있다.
본 발명은 또한, 진세노사이드, 포스파티딜콜린 및 자당 지방산 에스테르를 메탄올에 녹이고, 계면활성제를 첨가하여 혼합액을 제조하는 1단계; 상기 1단계의 혼합액을 50~85℃에서 질소가스 하에 노출시켜 건조하여 고체 분산체를 제조하는 2단계; 상기 2단계의 고체 분산체에 증류수를 가한 후, 초음파 처리하여 지질나노입자를 제조하는 3단계; 및 상기 3단계의 지질나노입자에 양전하성 단백질 용액을 혼합하는 4단계;를 포함하며, 상기 진세노사이드를 포함하는 지질-단백질 나노복합체를 기준으로 포스파티딜콜린 0.3~3%(w/v), 자당 지방산 에스테르 0.2~1.5%(w/v), 계면활성제 0.2~1.5%(v/v), 진세노사이드 0.1~0.4%(w/v) 및 양전하성 단백질 0.3~2.5%(w/v)를 사용한 진세노사이드를 포함하는 지질-단백질 나노복합체의 제조방법에 관한 것이다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 진세노사이드를 포함하는 지질-단백질 나노복합체에 관한 것으로, 구체적으로는 진세노사이드를 포함하는 지질-단백질 나노복합체를 기준으로 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine) 0.3~3%(w/v), 자당 지방산 에스테르(sucrose fatty acid ester) 0.2~1.5%(w/v), 계면활성제 0.2~1.5%(v/v) 및 진세노사이드 0.1~0.4%(w/v)로 이루어진 지질나노입자에 양전하성 단백질 0.3~2.5%(w/v)를 가하여 제조한 것이다.
상기 진세노사이드는 물에 대한 용해도가 낮은 것일 수 있다. 바람직하게는 진세노사이드 Re, Rb1, Rb2, Rc, Rd 및 Rg3로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상이고, 더 바람직하게는 진세노사이드 Re이다. 그러나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, "포스파티딜콜린(phosphatidylcholine)"은 콜린(choline)을 머리 그룹(head group)으로 갖는 인지질(phospholipid)의 한 구성 성분으로 세포막에 풍부하게 포함되어 있으며, 달걀의 난황, 대두(soybean), 기타 동식물 조직에 다량으로 존재하는 것이다. 본 발명의 포스파티딜콜린은 상기 진세노사이드를 포함하는 지질-단백질 나노복합체를 이루는 주요 성분으로, 대두의 포스파티딜콜린(soybean phosphatidylcholine, SPC)이 바람직하다.
상기 포스파티딜콜린은 상기 진세노사이드를 포함하는 지질-단백질 나노복합체를 기준으로 0.3~3%(w/v)가 포함될 수 있다. 바람직하게는 0.5~2%(w/v)이고, 더 바람직하게는 1~1.5%(w/v)이고, 가장 바람직하게는 1%(w/v)이다. 상기 포스파티딜콜린이 0.3%(w/v) 미만일 경우에는 적은 양으로 인해 적정한 크기의 나노지질입자가 생성되지 않을 수 있으며, 3%(w/v) 초과일 경우에는 안정성이 떨어져 나노지질입자의 침전물이 생길 수 있어 바람직하지 못하다.
본 발명에 있어서, "자당 지방산 에스테르(sucrose fatty acid ester, SFE)"는 자당 에스테르(sugar ester)라고도 하며, 자당의 수산기에 지방산이 에스테르 결합한 것이다. 자당 지방산 에스테르는 넓은 범위의 HLB(hydrophile-lipophile balance)를 가지며, O/W(oil in water) 유화제, W/O(water in oil) 유화제, 분산제, 기포제 등으로 이용된다. 본 발명의 자당 지방산 에스테르는 상기 진세노사이드를 포함하는 지질-단백질 나노복합체 입자의 균일한 구성을 위해 이용할 수 있다.
상기 자당 지방산 에스테르는 상기 진세노사이드를 포함하는 지질-단백질 나노복합체를 기준으로 0.2~1.5%(w/v)가 포함될 수 있다. 바람직하게는 0.5~1%(w/v)이다. 상기 자당 지방산 에스테르가 0.2%(w/v) 미만일 경우에는 지질-단백질 나노복합체 입자의 제타 전위를 유의하게 감소시킬 수 있으며, 1.5%(w/v) 초과일 경우에는 진세노사이드를 포함하는 지질-단백질 나노복합체 입자가 침전될 수 있어 바람직하지 못하다.
상기 계면활성제는 상기 진세노사이드를 포함하는 지질-단백질 나노복합체의 안정성을 위해 첨가하는 것으로, 생체 내 독성이 없어야 한다. 상기 계면활성제는 트윈 20(Tween 20), 크레모포르 EL(Cremophore EL) 및 솔루톨 HS 15(Solutol HS 15)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다. 바람직하게는 솔루톨 HS 15이다. 그러나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 계면활성제는 상기 진세노사이드를 포함하는 지질-단백질 나노복합체를 기준으로 0.2~1.5%(w/v)가 포함될 수 있다. 바람직하게는 0.2~0.8%(w/v)이다. 상기 계면활성제가 0.2%(w/v) 미만일 경우에는 상기 진세노사이드를 포함하는 지질-단백질 나노복합체 제조 후 1시간 이내에 침전물이 생성되어 바람직하지 못하며, 1.5%(w/v) 초과일 경우에는 계면활성제가 지질의 양에 비해 많아져 지질나노입자를 벗어나 계면활성제끼리 독립적으로 마이셀(micelle)을 형성할 수 있어 바람직하지 못하다.
상기 양전하성 단백질은 포스파티딜콜린, 자당 지방산 에스테르, 계면활성제 및 진세노사이드로 이루어진 지질나노입자에 첨가함으로써 주성분인 포스파티딜콜린에 의해 음의 표면전하(negative surface charge)를 갖는 지질나노입자의 제타 전위를 변위시켜 양의 표면전하(positive surface charge)를 갖도록 하는 것으로, 생체 pH 조건에서 양전하를 띠는 단백질을 이용할 수 있다. 바람직하게는 파파인, 라이소자임, 히스톤 및 사이토크롬 C로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상이다. 더 바람직하게는 피부에 이로운 작용을 가지며, 화장품에 널리 사용되고 있는 파파인 및 라이소자임으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상이다. 그러나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 라이소자임은 등전점(isoelectric point, pI)이 11.35로, 피부의 pH 조건에서 강한 양전하를 나타내며, 세포 내의 리소좀(lysosome)에 존재하는 효소로 항균, 항바이러스, 항종양 및 면역조절 활성 등을 나타낸다. 또한, 상기 라이소자임은 시판중인 효소 화장품의 원료로 사용되며, 고유의 항균 효과 및 항염증 효과로 인해 욕창, 여드름 등을 주요 적응증으로 하고 있다.
상기 파파인은 파파야로부터 추출된 단백질 분해효소로, pI는 8.75로, 피부의 pH 조건에서 양전하를 나타낸다. 상기 파파인은 시판중인 효소 화장품의 원료로 사용되며, 각질제거 및 그에 따른 화장품 유효성분을 피부에 효율적으로 전달 시켜주는 효과를 나타낸다.
상기 양전하성 단백질은 상기 진세노사이드를 포함하는 지질-단백질 나노복합체를 기준으로 0.3~2.5%(w/v)가 포함될 수 있다. 바람직하게는 0.5~2%(w/v)이고, 더 바람직하게는 1~2%(w/v)이다. 상기 양전하성 단백질이 0.3%(w/v) 미만일 경우에는 상기 진세노사이드를 포함하는 지잘-단백질 나노복합체의 제타 전위의 변위에 영향을 주지 못할 수 있으며, 2.5%(w/v) 초과일 경우에는 각각의 단백질이 가지고 있는 피부 자극성으로 인해 피부가 손상될 수 있어 바람직하지 못하다.
상기 진세노사이드를 포함하는 지질-단백질 나노복합체는 입자 크기가 1000㎚ 이하 일 수 있다. 바람직하게는 50~1000㎚이고, 더 바람직하게는 50~500㎚이며, 가장 바람직하게는 50~200㎚이다. 그러나 이에 한정되는 것은 아니다. 입자 크기가 1000㎚ 초과일 경우에는 피부 투과가 어려워 진세노사이드의 피부 전달 효과가 감소될 뿐만 아니라 안정성이 떨어져 침전물이 생길 수 있어 바람직하지 못하다.
본 발명에 있어서, 피부는 피부의 표면을 구성하는 주된 단백질인 pI가 3.57인 케라틴으로 인해 pH가 4.5~5.0인 피부의 생리학적 조건에서 음전하를 띠고 있다. 따라서, 양전하성 단백질 처리로 인한 양의 표면전하(positive surface charge)를 갖는 상기 진세노사이드를 포함하는 지질-단백질 나노복합체는 피부의 음전하와 정전기적인 반발력을 줄이고 인력을 증가시켜 지질-단백질 나노복합체의 피부 접착률을 증가시켜 진세노사이드의 피부 전달량을 증가시킬 수 있다.
상기 진세노사이드를 포함하는 지질-단백질 나노복합체는 진세노사이드의 피부 잔류량을 진세노사이드를 함유하는 지질나노입자와 대비하여 7배 이상 증가시킬 수 있어, 진세노사이드의 피부에서의 미용학적 또는 약제학적 효과를 증가시킬 수 있다. 예컨대, 진세노사이드 Re의 피부 전달량이 증가함으로써 진세노사이드 Re에 의한 피부 노화 억제, 피부 내 수분 유지, 콜라겐 분해효소 억제 활성이 증가될 수 있고, 이를 이용하여 피부 노화 방지용 또는 주름 개선용 화장료 조성물과 같은 기능성 화장료 조성물을 개발할 수 있다.
상기 진세노사이드를 포함하는 지질-단백질 나노복합체는 진세노사이드, 포스파티딜콜린 및 자당 지방산 에스테르를 메탄올에 녹이고, 계면활성제를 첨가하여 혼합액을 제조하는 1단계; 상기 1단계의 혼합액을 50~85℃에서 질소가스 하에 노출시켜 건조하여 고체 분산체를 제조하는 2단계; 상기 2단계의 고체 분산체에 증류수를 가한 후, 초음파 처리하여 지질나노입자를 제조하는 3단계; 및 상기 3단계의 지질나노입자에 양전하성 단백질 용액을 혼합하는 4단계;로 이루어진 제조 방법을 통해 제조할 수 있다.
상기 1단계의 계면활성제는 액화시킨 상태의 계면활성제로, 계면활성제가 반고체상태일 경우에는 37℃의 항온수조에서 중탕하여 액화시킬 수 있다.
상기 2단계의 혼합액 건조 온도는 50~85℃일 수 있다. 바람직하게는 70℃이다. 상기 온도가 50℃ 미만일 경우에는 건조 시 걸리는 시간이 증가되어 바람직하지 못하며, 85℃ 초과일 경우에는 제조된 지질나노입자가 높은 온도에 의해 변성되거나 손상될 수 있어 바람직하지 못하다.
상기 2단계의 질소 가스는 화학적 반응을 일으키지 않는 안정한 가스로, 분사시 지질나노입자의 변성 및 손상이 없이 용매의 증발을 촉진시켜 건조 시간을 단축시킬 수 있다.
상기 3단계의 초음파 처리는 프로브 초음파 처리로, 펄스모드로 2초 on/3초 off, 진폭은 20% 조건으로 1분 동안 처리하는 것으로, 1분 후에는 용기 바닥에 붙어 있는 지질 필름이 분산되어 불투명한 현탁액을 형성하여 바람직하지 못하다.
상기 4단계의 양전하성 단백질은 용액 상태로 처리할 수 있으며, 양전하성 단백질이 염산염이 되도록 HCl을 추가할 수 있다.
상기 진세노사이드를 포함하는 지질-단백질 나노복합체는 진세노사이드에 난용성 물질을 추가하거나, 진세노사이드 대신에 다른 난용성 물질을 대체할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 진세노사이드를 포함하는 지질-단백질 나노복합체를 포함하는 피부 외용제 조성물에 관한 것이다.
상기 피부 외용제 조성물은 화장료 조성물 일 수 있다.
상기 화장료 조성물은 상기 진세노사이드를 포함하는 지질-단백질 나노복합체 및 화장 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제, 예컨대 친수성 또는 친유성 겔화제, 친수성 또는 친유성 활성제, 보존제, 항산화제, 용매, 방향제, 충전제, 차단제, 안료, 흡취제 또는 염료를 함유할 수 있다.
상기 보조제의 양은 당해 분야에서 통상적으로 사용되는 양이며, 어떠한 경우라도 보조제 및 그 비율은 본 발명에 따른 화장료 조성물의 바람직한 성질에 악영향을 미치지 않도록 선택될 수 있다.
상기 화장료 조성물은 로션, 스킨소프너, 스킨토너, 앰플, 아스트리젠트, 크림, 파운데이션, 에센스, 팩, 마스크팩, 비누, 바디클렌져, 클렌징폼, 샴푸, 린스, 헤어트리트먼트, 헤어오일, 바디오일 및 바디로션으로 이루어지 군에서 선택되는 하나 이상의 제형으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 화장료 조성물은 매일 사용할 수 있으며, 또한, 정해지지 않은 기간 동안에도 사용할 수 있고, 바람직하게는 사용자의 연령, 피부상태 또는 피부타입에 따라 사용량, 사용횟수 및 기간을 조절할 수 있다.
또한, 상기 피부 외용제 조성물은 약학 조성물일 수 있다.
상기 약학 조성물은 상기 진세노사이드를 포함하는 지질-단백질 나노복합체 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함할 수 있다.
상기 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 진세노사이드를 포함하는 지질-단백질 나노복합체에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토즈, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
또한, 제형에 특별한 제한을 두지는 않으나, 연고제, 로션제, 스프레이제, 패취제, 크림제, 겔제 및 젤 중에서 선택되는 1종의 제형을 갖는 피부 외용제로 사용될 수 있다. 경피 흡수를 증가시키는 제제, 예를 들면 비한정적인 의미로 특히 디메틸설폭사이드, 디메틸아세트아마이드, 디메틸포름아마이드, 계면활성제, 알코올, 아세톤, 프로필렌글리콜 또는 폴리에틸렌글리콜을 포함할 수 있다. 도포 빈도는 치료받을 대상의 연령, 성별, 체중, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 상당히 변할 수 있으며, 도포 빈도는 매달 내지 1일 10회, 바람직하게는 매주 내지 1일 4회, 더 바람직하게는 1주당 3회 내지 1일 3회, 보다 더 바람직하게 는 1일 1회 또는 2회가 제안된다.
본 발명의 약학 조성물은 쥐, 가축, 인간, 반려동물 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 피부, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다. 바람직하게는 피부 투여이다.
본 발명은 진세노사이드를 포함하는 지질-단백질 나노복합체 및 이의 용도에 관한 것으로, 진세노사이드를 포함하는 지질나노입자에 양전하성 단백질을 처리하여 지질-단백질 나노복합체를 제조하기 위한 최적의 조건을 확인하였다. 확인된 최적의 조건으로 제조된 진세노사이드를 포함하는 지질-단백질 나노복합체를 이용해 진세노사이드의 피부 전달 효능을 확인한 결과, 진세노사이드의 피부 잔류량이 현저히 증가하는 것을 확인하였다.
이를 통해, 본 발명의 진세노사이드를 포함하는 지질-단백질 나노복합체를 이용하여 의약 분야 및 화장품 분야에서의 효과적인 진세노사이드의 피부 전달을 위한 피부 외용제를 개발할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명의 진세노사이드를 포함하는 지질-단백질 나노복합체의 제타 전위에 대한 자당 지방산 에스테르(SFE), 솔루톨 HS 15(SOL) 및 라이소자임(Lysozyme)의 영향을 확인한 주효과도 결과를 보여주고 있다.
도 2는 본 발명의 진세노사이드를 포함하는 지질-단백질 나노복합체에서 자당 지방산 에스테르(SFE) 및 솔루톨 HS 15(SOL)(A), 자당 지방산 에스테르 및 라이소자임(B) 또는 솔루톨 HS 15 및 라이소자임(C) 간의 교호작용(interaction)에 의한 제타 전위의 변화에의 영향을 확인한 결과를 보여주고 있다.
도 3은 본 발명의 진세노사이드를 포함하는 지질-단백질 나노복합체의 제타 전위에 대한 자당 지방산 에스테르(SFE) 및 솔루톨 HS 15(SOL)(A), 자당 지방산 에스테르 및 라이소자임(B) 또는 솔루톨 HS 15 및 라이소자임(C) 간의 영향을 확인한 반응 표면도 결과를 보여주고 있다.
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지고, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.
<실시예 1. 진세노사이드를 포함하는 지질-단백질 나노복합체 제조의 최적화 조건 확인>
실시예 1-1. 지질-단백질 나노복합체 제조를 위한 계면활성제 선정
본 발명의 진세노사이드를 포함하는 지질-단백질 나노복합체를 제조하기 위한 최적의 조건을 확립하기 위해, 지질-단백질 나노복합체 제조시 사용할 계면활성제를 선정하였다.
지질나노입자(lipid nanoparticle)를 위해 일반적으로 화장품에 가장 흔히 사용되는 지질인 대두의 포스파티딜콜린(soybean phosphatidylcholine, 이하, SPC라 함)을, 지질나노입자의 균일성을 위해서 자당 지방산 에스테르(sucrose fatty acid ester, 이하, SFE라 함)를, 진세노사이드는 수난용성인 진세노사이드 Re를 이용하였다.
진세노사이드 Re 2㎎, SPC 10㎎과 SFE 5㎎을 칭량한 후 메탄올 0.5㎖에 녹이고, 하기 표 1의 계면활성제를 각각 5㎕씩 첨가하고 볼텍싱(vortexing)하여 혼합액을 확보하였다. 확보한 혼합액을 70℃에서 질소가스 하에 노출시킨 채로 2시간 동안 건조하여 고체 분산체를 제조하였다. 상기 고체 분산체에 증류수 0.5㎖를 넣고 프로브 초음파 처리(펄스모드: 2초 on/3초 off, 진폭: 20%)하여 지질나노입자를 제조하였고, 여기에 20㎎/㎖의 라이소자임 0.5㎖을 첨가하여 최종 부피가 1㎖이 되도록 하였다. 제조한 진세노사이드를 포함하는 지질-단백질 나노복합체의 입자크기, 입도분포(다분산지수(polydispersity index), PDI), 제타 전위(zeta potential)를 입도분석기(Zetasizer, Malvern)를 이용하여 분석하였고, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
계면활성제 평균 입자 크기 (㎚) PDI 제타 전위 (㎷)
트랜스쿠톨(Transcutol) 2768.0±429.2 0.235±0.124 2.38±0.10
라브라필 1944(Labrafil 1944) 1689.3±249.2 0.575±0.340 0.13±0.70
라브라필 2125(Labrafil 2125) 1450.9±574.7 0.665±0.440 5.83±1.71
라브라솔(Labrasol) 649.4±18.8 0.756±0.345 -0.52±0.21
트윈 20(Tween 20) 144.8±2.2 0.407±0.041 1.23±0.39
크레모포르 EL(Cremophor EL) 197.3±0.5 0.318±0.040 2.36±0.20
솔루톨 HS 15(Solutol HS 15) 182.3±42.7 0.287±0.185 3.88±0.14
상기 표 1에서 보듯이, 트랜스쿠톨, 라브라필 1944 및 라브라필 2125를 이용한 경우에, 입자의 크기가 1000㎚ 초과로 피부 전달에 효과적이지 못할 것으로 판단되었다. 반면에, 라브라솔, 트윈 20, 크레모포르 EL 및 솔루톨 HS 15를 이용한 경우에는 입자 크기가 1000㎚ 이하인 것을 확인하였고, 특히나, 트윈 20, 크레모포르 EL 및 솔루톨 HS 15을 이용한 경우에는 입자 크기가 200㎚ 이하이며, 제타 전위가 양의 값을 나타내고 있는 것을 확인하였으며, 솔루톨 HS 15를 이용한 경우에 제타 전위 값이 가장 높게 나타나는 것을 확인하였다.
이를 통해, 본 발명의 진세노사이드를 포함하는 지질-단백질 나노복합체 제조에 있어서 적합한 계면활성제가 트윈 20, 크레모포르 EL 및 솔루톨 HS 15임을 알 수 있었고, 이후, 진세노사이드를 포함하는 지질-단백질 나노복합체 제조시 계면활성제로 솔루톨 HS 15(이하, SOL이라 함)를 이용하였다.
실시예 1-2. 지질-단백질 나노복합체의 주요 구성성분의 효과 평가
본 발명의 진세노사이드를 포함하는 지질-단백질 나노복합체에 있어서, 이를 구성하는 주요 구성성분의 효과를 평가하기 위하여 하기 표 2의 성분 및 함량을 바탕으로 6종의 지질나노입자를 제조하였다.
구체적인 제조 방법을 살펴보면, 하기 표 2의 F1 및 F2는 진세노사이드 Re, SPC 및 SFE를 칭량한 후 메탄올 0.5㎖에 녹인 후, 70℃에서 질소가스 하에 노출시킨 채로 2시간 동안 건조하여 고체 분산체를 제조하였다. 상기 고체 분산체에 증류수 0.5㎖를 넣고 프로브 초음파 처리(펄스모드 : 2초 on/3초 off, 진폭: 20%)하여 지질나노입자를 제조하였고, 여기에 증류수 0.5㎖을 첨가하여 최종 부피가 1㎖이 되도록 하였다.
하기 표 2의 F3는 진세노사이드 Re, SPC 및 SFE를 칭량한 후 메탄올 0.5㎖에 녹이고, 37℃ 항온 수조에서 중탕하여 액화시킨 SOL 5㎕를 첨가하고 볼텍싱하여 혼합액을 확보하였다. 확보한 혼합액을 70℃에서 질소가스 하에 노출시킨 채로 2시간 동안 건조하여 고체 분산체를 제조하였다. 상기 고체 분산체에 증류수 0.5㎖를 넣고 프로브 초음파 처리(펄스모드 : 2초 on/3초 off, 진폭: 20%)하여 지질나노입자를 제조하였고, 여기에 증류수 0.5㎖을 첨가하여 최종 부피가 1㎖이 되도록 하였다.
상기 표 2의 F4~F6는 진세노사이드 Re, SPC 및 SFE를 칭량한 후 메탄올 0.5㎖에 녹이고, 37℃ 항온수조에서 중탕하여 액화시킨 SOL 5㎕를 첨가하고 볼텍싱하여 혼합액을 확보하였다. 확보한 혼합액을 70℃에서 질소가스 하에 노출시킨 채로 2시간 동안 건조하여 고체 분산체를 제조하였다. 상기 고체 분산체에 증류수 0.5㎖를 넣고 프로브 초음파 처리(펄스모드 : 2초 on/3초 off, 진폭: 20%)하여 지질나노입자를 제조하였다. 20mM HCl 용액을 이용하여 20㎎/㎖의 농도가 되도록 녹인 라이소자임 또는 파파인 용액을 0.5㎖씩 취하여 상기 지질나노입자에 넣고 볼텍싱하여 혼합하여 최종 부피가 1㎖이 되도록 하였다. 이때, 단백질을 처리한 지질나노입자를 지질-단백질 나노복합체라고 명명하였다.
상기에서 제조한 6종의 지질나노입자의 입자크기, 입도분포(PDI), 제타 전위를 입도분석기를 이용하여 분석하였고, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
지질
나노입자		 진세노
사이드 Re
(㎎)		 SPC
(㎎)		 SFE
(㎎)		 SOL
(㎕)		 라이소자임
(10㎎)		 평균 입자
크기
(㎚)		 PDI 제타 전위
(㎷)
F1 0 10 5 - - 236.5±4.0 0.44±0.01 -39.30±0.86
F2 2 10 5 - - 측정불가 측정불가 측정불가
F3 2 10 5 5 - 406.3±67.0 0.245±0.190 -44.67±3.22
F4 2 10 5 5 파파인 453.5±61.8 0.394±0.157 -0.04±0.09
F5 0 10 5 5 라이소자임 166.2±3.7 0.27±0.02 1.87±0.24
F6 2 10 5 5 라이소자임 182.3±43.7 0.287±0.185 3.88±0.14
상기 표 2에서 보듯이, F1과 F2를 비교해보면, 진세노사이드 Re의 포함 여부에 따라 지질나노입자의 안정성이 차이가 있음을 확인하였다. 즉, 진세노사이드 Re를 포함하지 않는 F1의 경우에는 지질나노입자가 일정하게 형성되는 반면에, 진세노사이드 Re가 포함하는 F2의 경우에는 제조 후 1시간 이내로 침전이 형성되어 입자의 크기, 입도분포, 제타 전위 측정이 불가능하였다.
한편, F2에 계면활성제로 SOL을 처리하여 제조한 F3~F6의 경우에는 F2와 달리 침전이 형성되지 않았으며, 양전하성의 단백질을 첨가하여 제조한 F4~F6의 경우에는 제타 전위가 0에 가깝거나 양의 값으로 전환된 것을 확인하였다. 특히나 양전하성 단백질로 라이소자임을 이용한 F5 및 F6의 경우에는 입자 크기가 파파인을 이용한 F4에 비해 2배 정도 감소하였는데, 이는 지질의 음전하와 라이소자임의 양전하 사이의 큰 정전기적 인력으로 인해 입자가 응축된 것으로 예상된다.
또한, 진세노사이드 Re를 포함하지 않는 F5와 진세노사이드 Re를 포함하고 있는 F6를 비교해보면, F6가 F5에 비해 입자 크기가 약간 크게 나타났으나, 이는 진세노사이드의 봉입에 의한 영향으로 예상된다.
이를 통해, 진세노사이드를 포함하는 지질-단백질 나노복합체 제조에 있어서 진세노사이드, 계면활성제 및 양전하성 단백질의 종류에 따라 나노입자의 크기 및 특성에 영향을 받는다는 것을 알 수 있으며, 본 발명의 진세노사이드를 포함하는 지질-단백질 나노복합체 제조에 최적의 조건은 계면활성제는 솔루톨 HS 15를, 양전하성 단백질은 라이소자임을 이용하는 것이 가장 바람직하다는 것을 알 수 있었다.
실시예 1-3. 지질-단백질 나노복합체의 주요 구성성분 혼합 비율에 따른 효과 평가
본 발명의 진세노사이드를 포함하는 지질-단백질 나노복합체에 있어서, 이를 구성하는 주요 구성성분의 혼합비율에 따른 효과를 평가하기 위하여 하기 표 3의 성분 및 함량을 바탕으로 지질나노입자를 제조하였다.
구체적인 제조 방법을 살펴보면, 진세노사이드 Re 2㎎, SPC 10㎎을 칭량하여 메탄올 0.5㎖에 녹이고, 여기에 하기 표 3에 따라 SFE를 넣어 용해시켰다. 37℃ 항온수조에서 중탕하여 액화시킨 SOL을 하기 표 3에 따라 첨가하고 볼텍싱하여 혼합액을 확보하였다. 확보한 혼합액을 70℃에서 질소가스 하에 노출시킨 채로 2시간 동안 건조하여 고체 분산체를 제조하였다. 상기 고체 분산체에 증류수 0.5㎖를 넣고 프로브 초음파 처리(펄스모드 : 2초 on/3초 off, 진폭: 20%)하여 지질나노입자를 제조하였다. 상기 지질나노입자에 하기 표 3에 따라, 증류수, 20㎎/㎖ 또는 40㎎/㎖ 라이소자임 0.5㎖씩을 넣고, 20㎎/㎖ 라이소자임을 가하는 제형에는 1N HCl 5㎕, 40㎎/㎖ 라이소자임을 가하는 제형에는 1N HCl 10㎕를 첨가하여 볼텍싱하여 지질나노입자를 제조하였다.
상기에서 제조한 지질나노입자의 입자크기, 입도분포(PDI), 제타 전위를 입도분석기를 이용하여 분석하였고, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
지질
나노입자		 SFE
(㎎)		 SOL
(% [v/v])		 라이소자임
(㎎)		 평균 입자
크기
(㎚)		 PDI 제타 전위
(㎷)
G1 0 0.2 10 261.8±2.5 0.47±0.02 3.89±0.23
G2 10 0.2 10 270.6±11.7 0.44±0.01 3.46±0.21
G3 0 0.8 10 247.6±5.9 0.39±0.01 1.45±0.38
G4 10 0.8 10 262.5±6.6 0.49±0.04 2.34±0.00
G5 0 0.5 0 169.4±1.9 0.28±0.01 -24.43±0.54
G6 10 0.5 0 144.6±1.5 0.30±0.01 -19.50±1.00
G7 0 0.5 20 204.1±1.6 0.29±0.01 2.23±0.16
G8 10 0.5 20 183.0±3.0 0.38±0.02 3.00±0.17
G9 5 0.2 0 196.8±2.5 0.38±0.06 -28.37±0.66
G10 5 0.8 0 160.3±0.2 0.31±0.00 -18.7±0.29
G11 5 0.2 20 203.1±9.2 0.39±0.01 3.05±0.05
G12 5 0.8 20 245.1±1.0 0.43±0.01 1.74±0.09
G13 5 0.5 10 246.7±32.5 0.34±0.10 3.27±0.01
G14 5 0.5 10 231.9±11.3 0.28±0.02 3.03±0.19
G15 5 0.5 10 263.5±17.6 0.40±0.05 3.40±0.08
상기 표 3에서 보듯이, G1~G15의 지질나노입자의 입자크기가 300㎚ 이하로, 피부 적용에 적절한 입자 크기를 가지는 것을 확인하였다.
상기 표 3의 결과를 바탕으로, 본 발명의 진세노사이드를 포함하는 지질-단백질 나노복합체의 효과적인 피부 전달을 위해 제타 전위를 최대화하는 제형의 최적화 조건을 확인하였다. 제형의 최적화 조건을 확인하기 위해 Minitab®, 소프트웨어를 이용하여 라이소자임, SFE, SOL의 비율에 따른 제타 전위의 상관관계를 수식화하였고, 그 결과를 도 1~3에 나타내었다.
도 1의 제타 전위에 대한 각 성분의 주효과도에서 보듯이, SFE 및 SOL은 제타 전위에 큰 영향을 미치지 않는 반면에, 라소이소자임이 제타 전위에 큰 영향을 미치는 것을 확인하였다.
또한, 도 2의 제타 전위에 대한 각 성분의 교호작용(interaction)도에서 보듯이, SFE와 SOL 간에 교호작용이 있으나, 그 변화가 제타 전위에는 영향이 거의 없었다(A). 반면에, SFE와 라이소자임(B) 및 SOL과 라이소자임(C) 간에 교호작용이 있으며, 이러한 교호작용은 제타 전위에 큰 영향을 주는 것을 확인하였다.
도 3의 제타 전위에 대한 SFE과 SOL(A), SFE와 라이소자임(B) 및 SOL과 라이소자임(C) 간의 반응표면도에서 보듯이, SFE 및 SOL은 제타 전위에 큰 영향을 미치지 않는 반면에, 라이소자임은 제타 전위에 대해 영향이 크게 나타나는 것을 확인하였다.
상기 도 1~3의 결과를 바탕으로, 본 발명의 진세노사이드를 포함하는 지질-단백질 나노복합체의 최적 조성 및 제타 전위를 예측한 결과, SFE 10㎎, SOL 2㎕ 및 라이소자임 16㎎일 때, 제타 전위가 최대값을 갖는다는 것을 확인하였다.
상기 실시예 1-1~1-3에서 확인한 결과를 통해 본 발명의 진세노사이드를 포함하는 지질-단백질 나노복합체 제조를 위한 최적화 조건을 결정하였다.
구체적으로, 상기 실시예 1-3에서 확인한 제타 전위가 최대값을 갖도록 하는 최적 조성에 따르면, SFE와 SOL의 경우에는 제타 전위에 대하여 통계학적을 유의미한 영향을 미치지 못하므로, SFE와 SOL의 범위는 상기 표 3에서 실험한 범위의 중간값인 5㎎ SFE와 0.5%[v/v] SOL(5㎕)로 선정하였다. 라이소자임의 경우에는 예측한 최적값이 16㎎이지만, 이보다 높은 단백질의 농도는 오히려 제타 전위를 감소시키고 입자 분포 면에서의 안정성을 떨어뜨릴 가능성이 있어, 제타 전위가 양의 값을 유지할 수 있는 범위인 8~16㎎에서 제조의 편의성을 고려하여 10㎎으로 결정하였다.
<실시예 2. 진세노사이드를 포함하는 지질-단백질 나노복합체의 피부 전달 평가>
상기 실시예 1을 통해 확인된 발명의 진세노사이드를 포함하는 지질-단백질 나노복합체 제조를 위한 최적화 조건을 바탕으로 하기 표 4의 진세노사이드를 포함하는 지질-단백질 나노복합체를 상기 실시예 1-2에 기재된 제조 방법을 통해 제조하였다.
제조된 진세노사이드를 포함하는 지질-단백질 나노복합체를 이용하여 진세노사이드의 피부 전달률을 평가하였다. 진세노사이드 Re의 표적 부위는 피부이므로, 피부에 대한 투과도를 평가하기 보다는 피부 자체에 대한 잔류량을 측정하였으며, 케사리-치엔 확산 셀(Keshary-Chien diffusion cell)을 이용하였다.
확산 셀의 어셉터 챔버(acceptor chamber)에는 PBS(phosphate buffered saline)(pH 7.4)를 채운 뒤, 어셉터 챔버의 위쪽에 인공피부(Strat-M, Millipore 사)를 올리고 도너 챔버(donor chamber)를 조립하였다. 도너 챔버에는 하기 표 4의 진세노사이드를 포함하는 지질-단백질 나노복합체를 가한 뒤, 32℃에서 24시간 동안 반응시켰다. 이후, 인공피부를 취하여 증류수로 세척하고, 진세노사이드를 포함하는 지질-단백질 나노복합체가 가해졌던 부분만을 취하여 진세노사이드 Re를 녹일 수 있는 용매인 메탄올 6㎖에 넣고 1시간 동안 초음파 처리하여 진세노사이드 Re를 추출하여 추출액을 확보하였다. 확보한 추출액에서 메탄올을 증발시킨 뒤, 상기 추출 시 사용한 메탄올 1㎖당 메탄올 20㎕ 및 증류수 80㎕을 넣고 볼텍싱 혼합하여 농축액을 제조하였다. 농축액을 16000×g에서 5분 동안 원심 분리하여 상층액을 분리하였다.
분리한 상층액을 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography, HPLC)에 가하여 진세노사이드 Re의 양을 분석하였고, 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다. 이때, 분리, 정제된 진세노사이드 Re를 이용하여 진세노사이드 Re의 정량을 위한 표준 곡선을 확보하였고, 이를 기반으로 각 인공피부에 잔류해 있는 진세노사이드 Re의 양을 분석하였다. 또한, 진세노사이드 Re의 잔류율은 도너 챔버에 처리한 진세노사이드 Re의 총량 대비 인공피부에 잔류한 진세노사이드 Re의 양을 백분율(%)로 환산한 것이다.
상기 HPLC의 분석 조건은 하기와 같다.
a) 장비 : Agilent 1260 infinity II
b) 컬럼 : Kinetex (C18, 5.0㎛, 100Å, 4.6×250㎜)
c) 유속 : 1㎖/min
d) 흡광도 파장 : 203㎚
e) 시료주입량 : 20㎕
f) 이동상 : 아세토니트릴 : 증류수 = 25 : 75(v/v)
지질-단백질
나노복합체		 진세노사이드 Re
(㎎)		 SPC
(㎎)		 SFE
(㎎)		 SOL
(㎕)		 단백질
(10㎎)		 진세노사이드 Re
잔류량 (㎍) 잔류율 (%)
비교예 1-1 3 10 5 - - 1.98±1.89 0.066±0.063
비교예 1-2 3 10 5 5 - 2.13±2.10 0.071±0.070
실시예 1-1 3 10 5 5 파파인 16.42±20.79 0.547±0.693
실시예 1-2 3 10 5 5 라이소자임 16.98±4.36 0.566±0.145
상기 표 4의 비교예 1-1은 상기 실시예 1-2의 표 2의 F1과 마찬가지로 침전이 나타났으나 피부에 적용함에는 문제가 없어 피부 전달률 분석에 이용하였다.
상기 표 4에서 보듯이, 비교예 1-1 및 1-2를 처리한 경우와 비교하여 실시예 1-1 및 1-2를 처리한 경우에 인공피부에 잔류해 있는 진세노사이드 Re의 양이 최소 7배 정도 많은 것을 확인하였다.
이를 통해, 지질나노입자에 양전하성 단백질 첨가하여 입자의 제타 전위가 증가하여 양전하를 띠는 경우에 진세노사이드 Re의 피부 잔류량이 증가한다는 것을 알 수 있었고, 본 발명의 진세노사이드를 포함하는 지질-단백질 나노복합체를 진세노사이드의 피부 전달률이 높은 피부 외용제 개발에 이용할 수 있을 것으로 기대된다.

Claims (10)

  1. 진세노사이드를 포함하는 지질-단백질 나노복합체를 기준으로 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine) 0.3~3%(w/v), 자당 지방산 에스테르(sucrose fatty acid ester) 0.2~1.5(w/v), 계면활성제 0.2~1.5%(v/v) 및 진세노사이드 0.1~0.4%(w/v)로 이루어진 지질나노입자에 양전하성 단백질 0.3~2.5%(w/v)를 가하여 제조한 것을 특징으로 하는 진세노사이드를 포함하는 지질-단백질 나노복합체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 진세노사이드는 진세노사이드 Re, Rb1, Rb2, Rc, Rd 및 Rg3로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 진세노사이드를 포함하는 지질-단백질 나노복합체.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 계면활성제는 트윈 20(Tween 20), 크레모포르 EL(Cremophor EL) 및 솔루톨 HS 15(Solutol HS 15)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 진세노사이드를 포함하는 지질-단백질 나노복합체.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 계면활성제는 솔루톨 HS 15인 것을 특징으로 하는 진세노사이드를 포함하는 지질-단백질 나노복합체.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 양전하성 단백질은 파파인(papain), 라이소자임(lysozyme), 히스톤(histone) 및 사이토크롬 C(cytochrome C)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 진세노사이드를 포함하는 지질-단백질 나노복합체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 진세노사이드를 포함하는 지질-단백질 나노복합체는 입자 크기가 50~1000㎚인 것을 특징으로 하는 진세노사이드를 포함하는 지질-단백질 나노복합체.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 진세노사이드를 포함하는 지질-단백질 나노복합체는 진세노사이드의 피부 잔류량을 진세노사이드를 함유하는 지질나노입자와 대비하여 7배 이상 증가시킨 것을 특징으로 하는 진세노사이드를 포함하는 지질-나노복합체.
  8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 진세노사이드를 포함하는 지질-나노복합체를 함유하는 피부 외용제 조성물.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 피부 외용제 조성물은 화장료 조성물 또는 약학 조성물인 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
  10. 진세노사이드, 포스파티딜콜린 및 자당 지방산 에스테르를 메탄올에 녹이고, 계면활성제를 첨가하여 혼합액을 제조하는 1단계;
    상기 1단계의 혼합액을 50~85℃에서 질소가스 하에 노출시켜 건조하여 고체 분산체를 제조하는 2단계;
    상기 2단계의 고체 분산체에 증류수를 가한 후, 초음파 처리하여 지질나노입자를 제조하는 3단계; 및
    상기 3단계의 지질나노입자에 양전하성 단백질 용액을 혼합하는 4단계;를 포함하며,
    상기 진세노사이드를 포함하는 지질-단백질 나노복합체를 기준으로 포스파티딜콜린 0.3~3%(w/v), 자당 지방산 에스테르 0.2~1.5%(w/v), 계면활성제 0.2~1.5%(v/v), 진세노사이드 0.1~0.4%(w/v) 및 양전하성 단백질 0.3~2.5%(w/v)를 사용한 것을 특징으로 하는 진세노사이드를 포함하는 지질-단백질 나노복합체의 제조방법.
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