KR20200072842A - 꽃송이버섯 균사체를 이용한 불미나리 발효추출물을 포함하는 피부 항산화, 주름 개선, 탄력 개선 또는 미백용 화장료 조성물 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 꽃송이버섯 균사체를 이용한 불미나리 발효추출물에 관한 것으로, 본 발명에서는 불미나리를 꽃송이버섯 균사체로 발효시켜 수득된 발효물을 추출용매로 추출하여 수득된 불미나리 발효추출물을 포함함에 따라, 항산화, 주름 개선, 탄력 개선 또는 미백 효과를 구현해낼 수 있는, 화장료 조성물을 제공한다.

Description

꽃송이버섯 균사체를 이용한 불미나리 발효추출물을 포함하는 피부 항산화, 주름 개선, 탄력 개선 또는 미백용 화장료 조성물 및 이의 제조방법{COSMETIC COMPOSITION COMPRISING EXTRACTS OF FERMENTED OENANTHE JAVANICA D.C USING MYCELIUM OF CAULIFLOWER MUSHROOM FOR ANTI-OXIDATION, ANTI-WRINKLE, IMPROVING SKIN ELASTICITY AND SKIN WHITENING}

본 발명은 꽃송이버섯 균사체를 이용한 불미나리 발효추출물을 포함하는 피부 항산화, 주름 개선, 탄력 개선 또는 미백용 화장료 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

피부 노화에는 내적 요인과 외적 요인이 작용되는데, 내적 요인에 의한 노화는 특별한 환경적인 요인 없이 나이가 들면서 나타나는 자연스러운 현상이다. 반면, 외적 요인에 의한 노화는 자외선, 흡연, 스트레스, 화학물질, 환경오염물질, 공해 등을 포함하는 외부 환경적인 요인에 의한 노화 현상이다.

노화에는 프리라디칼(free radical)에 해당하는 활성산소가 관여하는데, 이러한 활성산소는 체내 침입 물질을 제거하거나 억제하는 역할을 한다. 반면, 활성산소종은 에너지가 크고 반응성이 매우 높아 그 양이 과다할 경우에는 피 부 노화를 가속시키는 것으로 알려져 있다(Yang et al., J. Soc. Cosmet. Sci. Korea, 34:275-286, 2008). 활성산소 및 자유라디칼은 피부가 자외선에 노출될 때 더욱 많이 생성되어, 피부노화 및 각종 면역관련 질병 등을 유발한다고 보고되고 있다(Norins, J. Invest. Dermatol., 39:445, 1962; Cadenas, Ann. Rev. Biochem., 58:79, 1989).

이와 같은 피부 노화 과정에서, 피부의 주요 구성물질인 지질, 단백질, 다당류 및 핵산 등이 산화되며, 이에 따라 피부 세포 및 조직이 파괴된다. 특히, 단백질의 산화는 콜라겐 등 피부 결합조직을 손상시켜, 피부의 탄력을 저하시키고, 주름을 유발한다.

따라서, 노화된 피부를 빠르게 회복시키고 피부의 노화를 예방하기 위해서는, 신체의 대사 과정 및 자외선 조사에 의해 매개되는 활성산소를 소거하여 세포막을 보호하고, 이미 손상된 세포에 대해서는 재생을 촉진시켜 세포를 증식시켜야 할 필요가 있다.

자유라디칼 및 활성 산소종(reactive oxygen species, ROS)에는 대표적으로 O₂ ^- (superoxide anion radical), OH(hydroxyl radical), ¹O₂(singlet oxygen), H₂O₂(hydrogen peroxide) 등이 있다. 이러한 활성산소종에 의한 효소적 및 비효소적 산화를 억제함으로써 피부노화를 방지하기 위한 항산화제가 다양하게 개발되어오고 있으며, 합성 항산화제와 천연 항산화제로 크게 구분할 수 있다.

일례로, BHA(Butylated hydroxy anisole), BHT(Butylated hydroxy toluene), NDGA(Nordihydroguaiaretic acid) 등과 같은 합성 항산화제의 경우 알러지 및 종양을 유발하고 열에 약한 문제가 있어 천연 항산화제에 대한 관심이 높아지고 있다. 대한민국 등록특허 제 10-0506384호에서는 당귀, 천궁, 작약 등의 천연물질로부터 얻어지며 산화적 생체 손상을 억제할 수 있는 생약조성물에 대해 개시하고 있으나, 산화적 생체 손상의 억제 효과, 및 면역 효과가 미약하며, 염증반응에 의해 과발현된 사이토카인, 활성질소종에 의한 신체적 손상에는 대비하지 못하는 문제가 있었다.

이에 따라, 종래의 합성 항산화제가 나타내는 부작용이 없으면서도 항산화 효과를 구현하여 콜라겐 등의 단백질의 손상에 의한 피부 탄력 저하 또는 피부 주름 생성을 방지할 수 있는 화장료 조성물에 대한 개발이 요구되고 있다.

대한민국 등록특허 제 10-0506384호

본 발명의 첫 번째 목적은 불미나리를 꽃송이버섯 균사체로 발효시켜 수득된 발효물을 추출용매로 추출하여 수득된 불미나리 발효추출물을 포함함에 따라, 항산화, 주름 개선, 탄력 개선 또는 미백 효과를 구현해낼 수 있는, 화장료 조성물을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 두 번째 목적은 불미나리를 꽃송이버섯 균사체로 발효시켜 수득된 발효물을 추출용매로 추출하여 불미나리 발효추출물을 제조하되, 이를 특정 조건에서 발효 및 숙성함으로써, 항산화, 주름 개선, 탄력 개선 또는 미백 효과를 구현해낼 수 있는, 화장료 조성물의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 목적은 상기된 바와 같은 기술적 과제로 한정되지 않으며, 이하의 설명으로부터 또 다른 기술적 과제가 도출될 수 있다.

상기 첫 번째 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 불미나리(Oenanthe　javanica　DC)를 꽃송이버섯 균사체로 발효시킨 발효물을 추출한 불미나리 발효추출물을 유효성분으로 포함하는, 피부 항산화용, 주름 개선용, 탄력 개선용 또는 미백용 화장료 조성물을 제공한다.

상기 화장료 조성물은 상기 화장료 조성물 총 중량 기준으로 상기 불미나리 발효추출물을 0.001 ~ 30 중량%로 포함할 수 있다.

상기 화장료 조성물은 유연화장수, 영양화장수, 수렴화장수, 스킨, 로션, 에센스, 크림, 마사지 크림, 팩, 메이크업 베이스, 비비크림, 파운데이션, 파우더, 바디로션, 바디클렌저, 클렌징 폼, 클렌징 크림 및 클렌징 워터로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 제형인 것일 수 있다.

상기 두 번째 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 불미나리를 멸균하는 멸균 단계; 상기 멸균된 불미나리를 배지에 습윤시키는 습윤 단계; 상기 습윤된 불미나리에 꽃송이버섯 균사체를 접종한 후 발효시켜 발효물을 수득하는 발효 단계; 상기 발효물을 고온으로 가열하는 가열 단계; 상기 가열된 발효물을 저온에서 숙성시키는 숙성 단계; 상기 숙성된 발효물을 추출용매로 추출한 후 여과 및 농축하여 불미나리 발효추출물을 수득하는 추출 단계; 및 상기 불미나리 발효추출물을 부형제와 혼합하여 제형화하는 제형화 단계를 포함하는, 피부 항산화용, 주름 개선용, 탄력 개선용 또는 미백용 화장료 조성물의 제조방법을 제공한다.

상기 발효 단계는 20 ~ 30 ℃에서 1 ~ 10 일 동안 실시될 수 있다.

상기 숙성 단계는 5 ~ 15 ℃에서 20 ~ 40 시간 동안 실시될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 불미나리를 꽃송이버섯 균사체로 발효한 뒤 이를 추출용매로 추출한 불미나리 발효추출물을 포함함에 따라, 피부에 저자극이면서도 항산화 효과, 피부 주름 개선 또는 탄력 개선 효과, 피부 미백 효과를 구현해낼 수 있다.

더 상세히, 본 발명의 화장료 조성물은 불미나리 발효추출물을 포함함에 따라, DPPH 라디칼 소거능, XOD(Xanthine oxidase) 저해능을 보임으로써, 항산화 효과를 구현해낼 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 불미나리 발효추출물을 포함함에 따라, 콜라겐 생합성을 촉진하고, 콜라겐 분해 효소 중 하나인 MMP-1의 활성 저해능을 보임으로써, 피부 주름 개선 및 피부 탄력 개선 효과를 구현해낼 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 불미나리 발효추출물을 포함함에 따라, 멜라닌 생성을 억제함으로써, 피부 미백 효과를 구현해낼 수 있다.

또한, 본 발명에서는 화장료 조성물 제조방법에 따라, 불미나리를 꽃송이버섯 균사체로 발효시킨 뒤 숙성하고 이를 추출하여 불미나리 발효추출물을 수득하되, 상기 발효, 숙성 및 추출을 특정 조건에서 실시하여 불미나리 발효추출물을 제조함으로써, 피부에 저자극이면서도 항산화 효과, 피부 주름 개선 또는 탄력 개선 효과, 피부 미백 효과를 가지는 화장료 조성물을 제조할 수 있다.

아래에서는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예를 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였다.

본 발명의 명세서 및 청구범위에 사용된 용어 또는 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정 해석되지 아니하며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.

본 발명의 명세서 전체에 있어서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본 발명의 명세서 전체에 있어서, "A 및/또는 B"는, A 또는 B, 또는 A 및 B를 의미한다.

본 발명의 명세서 전체에 있어서, "꽃송이버섯 균사체를 이용한 불미나리 발효추출물"은 "불미나리 발효추출물"로 간략하게 호칭될 수 있다.

본 발명의 명세서 전체에 있어서, "불미나리 발효추출물"은 불미나리를 꽃송이버섯 균사체로 발효시켜 수득된 발효물을 추출용매로 추출하여 수득된 추출물을 의미할 수 있다.

본 발명의 명세서 전체에 있어서, "추출물"은 추출 방법, 추출 용매, 추출된 성분 또는 추출물의 형태를 불문하고, 대상물질의 성분을 뽑아냄으로써 얻어진 물질을 모두 포함하는 것이며 또한 대상물질의 성분을 뽑아내어 얻어진 물질을 추출 후 다른 방법으로 가공 또는 처리하여 얻어질 수 있는 물질을 모두 포함하는 광범위한 개념이다.

이하에서 본 발명을 구체적으로 설명하였으나, 본 발명이 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서는 꽃송이버섯 균사체를 이용한 불미나리 발효추출물을 포함하는 피부 항산화, 주름 개선, 탄력 개선 또는 미백용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에서는 불미나리(Oenanthe　javanica　DC)를 꽃송이버섯 균사체로 발효시킨 발효물을 추출한 불미나리 발효추출물을 유효성분으로 포함하는, 피부 항산화용, 주름 개선용, 탄력 개선용 또는 미백용 화장료 조성물을 제공한다.

불미나리(학명: Oenanthe Javanica D.C)는 산형과에 속하는 다년생 초본으로 말레이시아, 필리핀, 타이완 등의 동남아 지역으로부터 한국, 중국, 시베리아 등의 일부 온대 북부 지역까지 널리 분포되어 있으며, 땅을 기는 가지줄기를 가지고 있고, 줄기는 굵은 능선이 있어 30cm 내외의 높이로 곧게 자라며 털이 없고, 가을철에 가지의 마디에서 뿌리가 내려 번식한다. 7 ~ 8월에 줄기의 끝에 가까운 잎겨드랑이의 반대쪽으로부터 꽃대가 자라나 작은 꽃이 총상화서로 피고, 열매는 작은 타원형으로 맺는다. 일반 물미나리는 습지에서 자생하지만, 불미나리는 밭에서 자생한다. 일반적인 불미나리는 돌미나리와 같이 유기질비료가 충분한 점토질에서 담수상태가 아닌 충분한 수분공급, 수온유지 및 일조량이 조절된 조건에서 잘 자라지만, 개량 불미나리는 거의 야생에 가까운 재배방법으로써 종묘재법, 물 공급에 의한 수온조절, 일조량조절 등 독특한 방법으로 재배되어 맛과 향기가 좋은 특징이 있다.

우리나라 전역에서 자생하는 불미나리는 기원전 480년의 여씨춘추(呂氏春秋)에도 그 기록이 존재할 정도로 오랜 세월동안 인류의 음식사와 함께 해왔다. 불미나리는 달고 독성이 없어 예로부터 여러 가지 요리에 독특한 향기와 맛을 더해 주는 재료로 사용해 왔다. 특히, 불미나리는 비타민 A, 비타민C와 칼슘, 철분 등 비타민, 무기질이 풍부한 대표적인 알칼리성 식품으로서 미나리강회, 미나리무침, 미나리김치, 보리 미나리전, 미나리생채, 미나리튀김, 각 종 매운탕 등 일상에서 많이 사용되고 있다.

불미나리는 식품 뿐 아니라 약초로서도 그 효능을 인정받고 있다. 한방에서는 불미나리를 수근(水芹) 혹은 수영(水英)이라 부르며, 주로 잎과 줄기를 약재로 사용한다. 고열로 가슴이 답답하고 갈증이 심한 증세에 효과적이고, 이뇨작용으로 부기를 빼주며, 가래를 삭이고 기관지와 폐를 보호하는 효능이 있다. 덧붙여, 동의보감에 의하면 불미나리는 갈증을 풀어 주고 머리를 맑게 해주며, 주독을 제거할 뿐 아니라 대장과 소장을 원활하게 해주어 신진대사를 촉진시켜준다.

실제로 불미나리는 혈액의 산성화를 막아주는 역할을 하며, 정신을 맑게 하고 혈액을 보호하면서도 심한 갈증을 없애고 열을 깨끗이 내려준다. 뿐만 아니라, 최근 수년간 중금속 해독 및 수질정화기능이 과학적으로 입증되면서 하수처리장이나 축산 폐수장의 수질정화물질로 보급되고 있으며, 가래를 삭히는 효과가 있어 매연이나 먼지가 많은 곳에서 일하는 사람의 기관지와 폐를 보호하는데 사용되고 있다. 이 외에도, 섬유질이 풍부하기 때문에 식물성 섬유가 창자의 내벽을 자극하여 장의 운동을 촉진시켜 변비에 효험이 있고, 칼로리가 거의 없어 다이어트 식품으로도 좋다. 최근에는 혈압을 내리는 약효도 인정받고 있으며, 심장병, 류마티스, 신경통, 식욕증진 등에도 효과적이다.

꽃송이버섯 균사체는 꽃송이버섯의 균사 집합체이다. 꽃송이버섯(학명 : Sparassis crispa Wulf. ex Fr.)은 담자균문 민주름버섯목 꽃송이버섯과의 버섯으로서 전세계에 1과 1속 2종이 보고되어 있다. 영어로는 cauliflower mushroom 또는 crestedsparassis 으로 불린다.

상기 꽃송이버섯은 2001년 3월 동경약과대학 약학부 면역학 교실의 꽃송이버섯 성분분석 결과 건조 꽃송이버섯 에 1,3-β-D-glucan이 43.6% (100g 중 43.6g) 함유되어 다른 버섯에 비하여 훨씬 높으며 항암효과가 큰 것으로 알려져 있다(Harada, T. et al., 2002a. Biol Pharm Bull 25(7): 931-939). 이러한 꽃송이버섯은 1,3-

-Dglucan 덩어리라고 해도 좋을 정도인데, 상기 1,3-β-D-glucan은 인체의 면역력을 높여주는 핵심 성분으로서 신체의 면역 체계를 바로잡아, 암 및 고혈압, 당뇨병 등을 다스리는 것으로 밝혀졌다. 또한, 상기 꽃송이버섯은 뛰어난 항암 효과 이외에도 혈압을 낮추거나 혈당치를 정상으로 돌려줄 뿐만 아니라 조혈 작용도 있는 것으로 알려져 있다.

본 실시예의 불미나리 발효추출물은 상기 불미나리를 건조 및 전처리한 후 이에 꽃송이버섯 균사체를 접종하여 발효시킴으로써 수득된 발효물을 추출용매로 추출하여 수득된 것일 수 있다. 바람직하게, 본 실시예의 불미나리 발효추출물은 하기 본 실시예의 불미나리 발효추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 항산화용, 주름 개선용, 탄력 개선용 또는 미백용 화장료 조성물의 제조방법에 따라 제조된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 추출용매는 물, 탄소수 1 내지 6의 다가 알코올, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 에틸아세테이트 및 글리세린으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다. 바람직하게, 본 실시예의 추출용매는 에탄올일 수 있다. 더욱 바람직하게, 본 실시예의 추출용매는 50% 에탄올일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 실시예에 따라 불미나리 발효추출물을 포함하는 화장료 조성물은 상기 화장료 조성물은 상기 화장료 조성물 총 중량 기준으로 상기 불미나리 발효추출물을 0.001 ~ 30 중량%로 포함할 수 있다.

본 실시예의 화장료 조성물이 총 중량 기준으로 상기 불미나리 발효추출물을 0.001 중량% 미만으로 포함할 경우에는 항산화, 주름 개선, 탄력 개선 또는 미백 효과가 거의 나타나지 않는 문제가 있을 수 있다. 반면, 본 실시예의 화장료 조성물이 총 중량 기준으로 상기 불미나리 발효추출물을 30 중량%를 초과하여 포함할 경우에는 항산화, 주름 개선, 탄력 개선 또는 미백 효과의 향상 정도가 미미하여 경제적이지 못할 수 있다.

또한, 본 실시예의 화장료 조성물은 유연화장수, 영양화장수, 수렴화장수, 스킨, 로션, 에센스, 크림, 마사지 크림, 팩, 메이크업 베이스, 비비크림, 파운데이션, 파우더, 바디로션, 바디클렌저, 클렌징 폼, 클렌징 크림 및 클렌징 워터로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 제형으로 형성될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 실시예의 불미나리 발효추출물을 포함하는 화장료 조성물은 피부에 저자극이면서도 항산화 효과, 피부 주름 개선 또는 탄력 개선 효과, 피부 미백 효과를 구현해낼 수 있다.

더 상세히, 본 실시예의 화장료 조성물은 불미나리 발효추출물을 포함함에 따라, DPPH 라디칼 소거능, XOD(Xanthine oxidase) 저해능을 보임으로써, 항산화 효과를 구현해낼 수 있다.

본 실시예의 화장료 조성물은 불미나리 발효추출물을 포함함에 따라, 콜라겐 생합성을 촉진하고, 콜라겐 분해 효소 중 하나인 MMP-1의 활성 저해능을 보임으로써, 피부 주름 개선 및 피부 탄력 개선 효과를 구현해낼 수 있다.

본 실시예의 화장료 조성물은 불미나리 발효추출물을 포함함에 따라, 멜라닌 생성을 억제함으로써, 피부 미백 효과를 구현해낼 수 있다.

본 실시예의 화장료 조성물은 상기 불미나리 발효추출물과 함께 공지된 모든 종류의 부형제를 더 포함할 수 있다.

예를 들어, 상기 부형제는 계면활성제, 착색제, 방향제, 유화제, 유화보조제, 유화안정제, 농화제, 안료, 향료, 산화방지제, 방부제, 살균제, 용매, 점증제, 무기염류, 천연 고분자, 합성 고분자 등을 포함할 수 있으며, 기능성 성분으로 피부컨디셔닝제, 미백제, 항산화제, 주름개선제, 보습제 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명에서는 꽃송이버섯 균사체를 이용한 불미나리 발효추출물을 포함하는 피부 항산화, 주름 개선, 탄력 개선 또는 미백용 화장료 조성물의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에서는 불미나리 발효추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 항산화용, 주름 개선용, 탄력 개선용 또는 미백용 화장료 조성물의 제조방법에 있어서, 불미나리를 멸균하는 멸균 단계, 상기 멸균된 불미나리를 배지에 습윤시키는 습윤 단계, 상기 습윤된 불미나리에 꽃송이버섯 균사체를 접종한 후 발효시켜 발효물을 수득하는 발효 단계, 상기 발효물을 고온으로 가열하는 가열 단계, 상기 가열된 발효물을 저온에서 숙성시키는 숙성 단계, 상기 숙성된 발효물을 추출용매로 추출한 후 여과 및 농축하여 불미나리 발효추출물을 수득하는 추출 단계 및 상기 불미나리 발효추출물을 부형제와 혼합하여 제형화하는 단계를 포함하는, 피부 항산화용, 주름 개선용, 탄력 개선용 또는 미백용 화장료 조성물의 제조방법을 제공한다.

특히, 본 실시예에서는 불미나리에 꽃송이버섯 균사체를 접종한 후 특정 조건에서 발효시켜 발효물을 수득하고, 상기 발효물을 특정 조건에서 숙성 및 추출함으로써, 피부 항산화, 주름 개선, 탄력 개선 또는 미백 효과가 우수한 불미나리 발효추출물과 이를 포함하는 화장료 조성물을 제조할 수 있다.

(1)불미나리를 멸균하는 멸균 단계

본 실시예의 멸균 단계에서는 불미나리를 멸균하며, 상기 멸균은 오토클레이브(Autoclave)를 이용하여 불미나리에 함유된 균, 세균, 세포, 미생물 등을 사멸시킬 수 있다. 본 실시예에서는 상기 오토클레이브를 100 ~ 125 ℃의 온도에서 5 ~ 30 분 동안 작동할 수 있다.

본 실시예에서는 멸균 단계를 실시하기 전에 불미나리를 세척, 세절 또는 건조하는 전처리가 실시될 수 있다.

(2)상기 멸균된 불미나리를 배지에 습윤시키는 습윤 단계

본 실시예의 습윤 단계에서는 상기 멸균 단계에 따라 멸균된 상태의 불미나리를 배지에 습윤시킨다.

상기 배지는 PDA(potato dextrose agar), PDB(potato dextrose broth) 및 SDB(sabouraud dextrose broth)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다. 본 실시예의 습윤 단계에서 상기 배지 중량 대비 1.0 내지 30 중량%의 불미나리를 혼합할 수 있다.

(3)상기 습윤된 불미나리에 꽃송이버섯 균사체를 접종한 후 발효시켜 발효물을 수득하는 발효 단계

본 실시예의 발효 단계에서는 상기 습윤 단계에서 배지에 습윤된 불미나리에 꽃송이버섯 균사체를 접종한 후 발효시켜 발효물을 수득한다.

본 실시예의 발효 단계는 20 ~ 30 ℃에서 발효를 실시할 수 있다.

만약, 본 실시예의 발효 단계가 20 ℃ 미만의 온도에서 실시될 경우에는 균사체가 충분히 성장하지 않아 항산화, 주름 개선, 탄력 개선 또는 미백 효과가 저하되는 문제가 있을 수 있다. 반면, 본 실시예의 발효 단계가 30 ℃ 를 초과한 온도에서 실시될 경우에는 균사체가 과도하게 성장하여 부산물, 응집물 등을 형성하며, 오히려 불미나리 발효추출물의 항산화, 주름 개선, 탄력 개선 또는 미백 효과가 저하되는 문제가 있을 수 있다.

본 실시예의 발효 단계는 20 ~ 30 ℃에서 1 ~ 10 일 동안 발효를 실시할 수 있다.

만약, 본 실시예의 발효 단계가 20 ~ 30 ℃에서 1 일 미만으로 실시될 경우에는 균사체의 성장이 더뎌 발효가 충분히 이뤄지지 않음에 따라 항산화, 주름 개선, 탄력 개선 또는 미백 효과가 저하되는 문제가 있을 수 있다. 반면, 본 실시예의 발효 단계가 20 ~ 30 ℃에서 10 일을 초과하여 실시될 경우에는 균사체가 과도하게 성장하거나 사멸되어 부산물, 응집물 등을 형성하여, 오히려 불미나리 발효추출물의 항산화, 주름 개선, 탄력 개선 또는 미백 효과가 저하되는 문제가 있을 수 있다.

(4)상기 발효물을 고온으로 가열하는 가열 단계

본 실시예의 가열 단계에서는 상기 발효 단계에서 수득된 발효물을 고온으로 가열한다. 본 실시예의 가열 단계에 의해 발효물 내에 함유된 꽃송이버섯 균사체는 활성을 잃고 사멸됨에 따라, 발효는 정지될 수 있다.

본 실시예의 가열 단계는 70 ~ 90 ℃ 로 발효물을 가열함으로써, 실시될 수 있다.

만약, 본 실시예의 가열 단계에서 발효물을 70 ℃ 미만으로 가열할 경우에는 발효가 정지되지 않고 계속해서 진행됨에 따라 오히려 부산물, 응집물 등이 형성되어 불미나리 발효추출물의 항산화, 주름 개선, 탄력 개선 또는 미백 효과가 저하되는 문제가 있을 수 있다. 반면, 본 실시예의 가열 단계에서 발효물을 90 ℃을 초과하여 가열할 경우에는 발효물 내 유효성분의 변화가 발생되어, 불미나리 발효추출물의 항산화, 주름 개선, 탄력 개선 또는 미백 효과가 저하되는 문제가 있을 수 있다.

(5)상기 가열된 발효물을 저온에서 숙성시키는 숙성 단계

본 실시예의 숙성 단계에서는 상기 가열 단계에서 가열된 발효물을 저온에서 일정 시간 동안 방치하면서 숙성시킨다.

본 실시예의 숙성 단계는 5 ~ 15 ℃에서 실시될 수 있다.

만약, 본 실시예의 숙성 단계가 5 ℃ 미만에서 실시될 경우에는 발효물 내 액체 상태의 물질과 고체 상태의 물질 간의 분리가 발생되는 문제가 있을 수 있다. 반면, 본 실시예의 숙성 단계가 15 ℃ 를 초과하여 실시될 경우에는 발효물이 불안정하며, 미생물의 활동이 활발해져 발효되거나 부패 또는 산패되어 항산화, 주름 개선, 탄력 개선 또는 미백 효과가 저하되는 문제가 있을 수 있다.

본 실시예의 숙성 단계는 5 ~ 15 ℃에서 20 ~ 40 시간 동안 실시될 수 있다.

만약, 본 실시예의 숙성 단계가 5 ~ 15 ℃에서 20 시간 미만으로 실시될 경우에는 숙성이 충분히 이뤄지지 않아 항산화, 주름 개선, 탄력 개선 또는 미백 효과가 저하되는 문제가 있을 수 있다. 반면, 본 실시예의 숙성 단계가 5 ~ 15 ℃에서 40 시간을 초과하여 실시될 경우에는 발효물이 부패 또는 산패되어 항산화, 주름 개선, 탄력 개선 또는 미백 효과가 저하되는 문제가 있을 수 있다.

(6)상기 숙성된 발효물을 추출용매로 추출한 후 여과 및 농축하여 불미나리 발효추출물을 수득하는 추출 단계

본 실시예의 추출 단계에서는 상기 숙성 단계에서 숙성된 발효물을 추출용매로 추출하고, 이를 여과하여 고형물을 제거한 뒤 농축함으로써, 발효추출물을 수득한다.

본 실시예의 추출은 열수 추출, 실온 추출, 고압 추출, 가온 추출, 초음파 추출, 초임계 추출 등 공지된 모든 방법에 의해 실시될 수 있다.

본 실시예의 추출용매는 물, 탄소수 1 내지 6의 다가 알코올, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 에틸아세테이트 및 글리세린으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다. 바람직하게, 본 실시예의 추출용매는 에탄올일 수 있다. 더욱 바람직하게, 본 실시예의 추출용매는 50% 에탄올일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이때, 추출은 발효물(원료) 중량의 2 ~ 50 배 부피의 추출 용매를 혼합하여 실시될 수 있다.

본 실시예의 추출 단계는 20 ~ 100 ℃에서 실시될 수 있고, 바람직하게는 50 ~ 70 ℃에서 실시될 수 있다.

만약, 본 실시예의 추출 단계가 20 ℃ 미만에서 실시될 경우에는 유효 성분이 추출이 용이하지 못하여, 항산화, 주름 개선, 탄력 개선 또는 미백 효과의 향상이 미미한 문제가 있을 수 있다. 반면, 본 실시예의 추출 단계가 100 ℃를 초과하여 실시될 경우에는 유효 성분의 추출 정도에 차이가 없어 경제적이지 못한 문제가 있을 수 있다.

본 실시예의 추출 단계는 20 ~ 100 ℃에서 8 ~ 15 시간 동안 실시될 수 있다.

만약, 본 실시예의 추출 단계가 20 ~ 100 ℃에서 8 시간 미만으로 실시될 경우에는 유효 성분의 추출이 충분히 이뤄지지 못하여, 항산화, 주름 개선, 탄력 개선 또는 미백 효과가 저하되는 문제가 있을 수 있다. 반면, 본 실시예의 추출 단계가 20 ~ 100 ℃에서 15 시간을 초과하여 실시될 경우에는 추출의 정도에 차이가 없어 경제적이지 못한 문제가 있을 수 있다.

본 실시예의 추출 단계에서 상기 여과는 5 ~ 15 마이크로미터의 미세 구멍이 형성된 여과지로 1차 여과한 후, 0.1 ~ 1 마이크로미터의 미세 구멍이 형성된 여과지로 2차 여과함으로써, 실시될 수 있다.

본 실시예의 추출 단계에서는 여과 후 액상의 물질을 수득하여 감압농축함으로써, 불미나리 발효추출물을 제조할 수 있다.

본 실시예의 불미나리 발효추출물은 농축된 점성의 액체 상태의 것을 그대로 사용할 수도 있고, 필요에 따라 이를 건조하여 분말 상태의 것을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

(7)상기 불미나리 발효추출물을 부형제와 혼합하여 제형화하는 제형화 단계

본 실시예의 제형화 단계에서는 상기 추출 단계에 따라 수득된 불미나리 발효추출물과 화장료 조성물에 사용되는 통상의 부형제를 혼합하여, 화장료 조성물의 제형을 형성한다.

상기 부형제는 계면활성제, 착색제, 방향제, 유화제, 유화보조제, 유화안정제, 농화제, 안료, 향료, 산화방지제, 방부제, 살균제, 용매, 점증제, 무기염류, 천연 고분자, 합성 고분자 등을 포함할 수 있으며, 기능성 성분으로 피부컨디셔닝제, 미백제, 항산화제, 주름개선제, 보습제 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 실시예의 제형화 단계에 따라 꽃송이버섯 균사체를 이용한 불미나리 발효추출물을 포함하는 화장료 조성물은 유연화장수, 영양화장수, 수렴화장수, 스킨, 로션, 에센스, 크림, 마사지 크림, 팩, 메이크업 베이스, 비비크림, 파운데이션, 파우더, 바디로션, 바디클렌저, 클렌징 폼, 클렌징 크림 및 클렌징 워터로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 제형으로 형성될 수 있다.

본 실시예의 제형화 단계에서는 상기된 부형제 이외에 화장료 조성물이 적정한 색, 점도, 사용감을 가질 수 있도록 하는 공지된 모든 종류의 첨가제, 보조제, 부형제 등을 더 포함할 수 있다.

이하 실시예, 비교예, 및 실험예를 통하여 본 발명의 불미나리 발효추출물을 포함하는 피부 항산화용, 주름 개선용, 탄력 개선용 또는 미백용 화장료 조성물 및 이의 제조방법에 대해 구체적으로 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

[ 실시예 ]

실시예 1

(1)오토클레이브(100 ℃, 20 분)로 불미나리를 멸균한 다음 이를 미분 분쇄(최대 1mm 이내)하였다. (2) 이 후, 미분 분쇄된 불미나리에 상기 불미나리 건조 중량의 10 배의 증류수를 가하여 균일하게 혼합한 후, PDB(potato dextrose broth) 배지에 불미나리가 습윤되도록 하였다.

(3) 이어서, 불미나리가 습윤된 배지에 꽃송이버섯 균사체(전체 배양액)를 10 %(w/w)로 접종한 후 24 ~ 28 ℃에서 약 5 일간 정치 발효시켰다. 이때, 통기량은 0.4 ~ 0.8 vvm이었다. (4) 약 5 일이 지난 후, 발효를 정지시키기 위해 발효물을 약 80 ℃로 가열한 다음, (5) 이를 10 ℃ 로 냉각시켜 저온에서 약 24 시간 동안 숙성시켰다. (6) 숙성을 마친 발효물에 상기 발효물 중량의 10 배 부피의 50% 에탄올 수용액을 혼합한 다음, 60 ℃에서 10 시간 동안 추출을 실시하였다. 추출된 추출물을 10 마이크로미터의 미세 구명이 형성된 여과지로 1차 여과하고, 0.5 마이크로미터의 미세 구멍이 형성된 여과지로 2차 여과하였으며, 최종 산물을 감압농축 및 건조함으로써, 분말 형태의 꽃송이버섯 균사체를 이용한 불미나리 발효추출물을 수득하였다.

실시예 2

추출용매로 50% 에탄올 수용액을 대신하여 에틸아세테이트를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일하게 제조하였다.

[ 비교예 ]

비교예 1 : 불미나리 추출물

오토클레이브(100 ℃, 20 분)로 불미나리를 멸균한 다음 이를 미분 분쇄(최대 1mm 이내)하였다.

상기 미분 분쇄된 불미나리에 불미나리 중량의 10 배 부피의 50% 에탄올 수용액을 혼합한 다음 80 ℃에서 3 시간 동안 환류 추출을 실시하였다. 수득된 추출물을 10 마이크로미터의 미세 구명이 형성된 여과지로 1차 여과하고, 0.5 마이크로미터의 미세 구멍이 형성된 여과지로 2차 여과하였으며, 최종 산물을 감압농축 및 건조함으로써, 분말 형태의 불미나리 추출물을 제조하였다.

비교예 2 내지 5

표 1의 조건으로 발효를 실시한 것을 제외하고는, 실시에 1과 동일하게 제조하였다.

	비교예2	비교예3	비교예4	비교에5
온도(℃)	12 ~ 16	35 ~ 39	24 ~ 28	24 ~ 28
시간(일)	5 일	5 일	12 시간	13일

비교예 6 내지 9

표 2의 조건으로 숙성을 실시한 것을 제외하고는, 실시에 1과 동일하게 제조하였다.

	비교예6	비교예7	비교예8	비교에9
온도(℃)	2	20	10	10
시간(시간)	24	24	15	45

비교에 10

꽃송이버섯 균사체를 대신하여 고초균을 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일하게 제조하였다.

비교에 11

꽃송이버섯 균사체를 대신하여 유산균을 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일하게 제조하였다.

비교에 12

꽃송이버섯 균사체를 대신하여 효모를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일하게 제조하였다.

[ 제조예 ]

실시예와 비교예의 불미나리 발효추출물(또는 불미나리 추출물)을 부형제 등과 혼합하여 크림, 에멀젼 베이스, 영양 화장수, 에센스, 마사지 크림, 바디클렌저, 아이크림으로 제형화하였다. 이때, 불미나리 발효추출물(또는 불미나리 추출물)과 부형제, 첨가제 등의 혼합 함량(중량%)은 하기 표 3 내지 9와 같다.

제조예 1 : 크림 제조

원료명	중량%
불미나리 발효추출물	3.0
히아루론산	6.0
수상점증제	30.0
베타글루칸	4.0
항산화제	0.1
알부틴	3.0
아데노신	1.0
방부제, 색소, 향료	적량
정제수	37.0

제조예 2 : 에멀젼 베이스

원료명	중량%
불미나리 발효추출물	5.0
글리세린	3.0
디소듐이디티에이	0.05
폴리글리세릴-3-메틸글루코스 디스테아레이트	1.5
세테아릴알코올	0.8
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드	7.0
폴리아크릴아마이드 & C13-14이소파라핀 & 라우레스-7	0.6
방부제	적량
정제수	to 100

제조예 3 : 영양 화장수

원료명	중량%
불미나리 발효추출물	1.0
스쿠알란	5.0
밀납	3.8
솔비탄세스퀴올레이트	1.5
유동파라핀	0.5
폴리솔베이트 60	1.5
부틸렌글리콜	3.2
카프릭트리글리세라이드	5.0
프로필렌글리콜	3.0
글리세린	3.0
카르복시비닐폴리머	0.1
트리에탄올아민	0.1
방부제, 색소, 향료	적량
정제수	to 100

제조예 4 : 에센스

원료명	중량%
불미나리 발효추출물	5.0
부틸렌글리콜	3.0
글리세린	3.0
알란토인	0.7
판테놀	0.2
EDTA-2Na	0.05
에탄올	5.0
트리에탄올아민	1.5
스쿠알란	2.0
밀납	2.0
폴리솔베이트60	3.0
카르복실비닐폴리머	1.0
솔비탄세스퀴올레이트	2.8
방부제, 색소, 향	적량
정제수	to 100

제조예 5 : 마사지 크림

원료명	중량%
불미나리 발효추출물	5.0
밀납	12.0
폴리솔베이트 60	2.0
PEG 60 경화피마자유	2.0
솔비탄세스퀴올레이트	1.0
유동파라핀	30.0
스쿠알란	5.0
카프릭트리글리세라이드	5.0
글리세린	5.0
부틸렌글리콜	3.5
프로필렌글리콜	3.5
트리에탄올아민	0.3
방부제, 색소, 향료	적량
정제수	to 100

제조예 6 : 바디클렌저

원료명	중량%
불미나리 발효추출물	5.0
알킬에텔상산염 (30%)	30.0
알킬에텔설포석신산염 (30%)	15.0
알킬아미도베타인 (30%)	4.0
프로필렌글리콜	5.0
라우라미드디이에이	4.0
베타인	5.0
셀룰로스검	0.1
가수분해단백질	0.2
염화나트륨	미량
구연산	미량
방부제, 색소, 향료	적량
정제수	to 100

제조예 7 : 아이크림

원료명	중량%
불미나리 발효추출물	5.0
수상점증제	30.0
히아루론산	6.0
베타글루칸	4.0
알부틴	3.0
아데노신	1.0
항산화제	0.1
방부제, 색소, 향료	적량
정제수	35.0

[ 실험예 ]

실험예 1 : 항산화 활성 평가

(1) DPPH를 이용한 라디칼 소거능 평가

500 uM DPPH (2.2-diphenyl-1-picryl hydrezyl) 용액을 에칠 알콜에 녹여 여과한 후 즉시 사용하였다. 제조된 DPPH 용액과 시료 용액을 1 : 1로 혼합하여 격렬하게 섞은 후, 상온 암소에 20 분간 방치하였다. Microplate reader (Chromate, USA) 를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하고, 하기 수학식 1을 통해 DPPH 라디칼 제거율(%)을 산출한 후, 그 결과를 표 10[단위 : %]에 나타내었다. 상기 시료 용액은 실시예 또는 비교예에 따라 제조된 추출물과 증류수를 혼합한 것을 의미한다.

이때, 라디칼을 제거하는 양성 대조군(positive control)으로 아스코르브산(ascorbic acid)을 사용하였다.

(수학식 1) DPPH 라디칼 제거율(scavenging, %) = (A - B) / A x 100

상기 수학식 1에서, A는 공시험액에서 얻은 흡광도이고, B는 검액에서 얻은 흡광도이다.

	시료 용액 농도
	0.05(%)	0.1(%)	1(%)
양성대조군 (Ascorbic acid)	75	99	99
실시예1	45	67	98
실시예2	42	58	92
비교예1	35	45	80
비교예2	36	42	77
비교예3	37	43	76
비교예4	35	41	75
비교예5	30	40	74
비교예6	34	40	77
비교예7	32	41	76
비교예8	31	42	73
비교예9	38	45	72
비교예10	40	55	90
비교예11	41	56	91
비교예12	40	53	89

표 10을 보면, 본 실시예에 따라 꽃송이버섯 균사체를 이용한 불미나리 발효추출물의 라디칼 소거능이 우수함을 확인할 수 있다. 즉, 항산화 효과를 가짐을 의미한다.

(2) XOD(Xanthine oxidase) 저해능 평가

XOD 저해활성측정은 Noro(Chen. Pharm. Bull., 31, 3984~3987, 1983)의 방법을 변형한 것으로, 잔틴/잔틴옥시다아제(xanthine/xanthine oxidase) 효소반응에 의한 활성산소 발생계를 이용하여 활성산소에 의한 니트로블루테트라졸리움(NBT, nitroblue tetrazolium)의 산화작용에 의한 흡광도 변화를 측정하였다.

Na₂CO₃ 2.5 ㎖, EDTA(Ethylenediaminetetraacetic acid) 0.1 ㎖, 잔틴 0.2 ㎖, BSA(Bovine serum albumin) 0.1 ㎖, NBT 0.1 ㎖ 및 시료 용액 0.1 ㎖을 넣고 혼합하여 30 ℃에서 15 분간 정치하였다. 이어서, 잔틴옥시다아제 0.2 ㎖을 넣고 30 ℃에서 15 분간 반응시킨 후, 6 mM CuCl₂를 넣어 반응을 정지시키고, 흡광도 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

대조군은 시료 용액 대신 정제수를 넣어 같은 방법으로 측정하였으며, 잔틴옥시다아제 용액 대신 정제수를 넣어서 추출 시료 용액 및 대조군 개별에 대한 색 보정값을 얻었다. 하기 수학식 2를 이용하여 활성산소 소거율을 수치화하여 하기 표 11[단위 : %]에 그 계산값을 나타내었다.

(수학식 2) 활성산소 소거율(%) =100 - (각 추출물 시료의 흡광도) / (대조군의 흡광도) x 100

한편, 양성대조군으로 Ascorbic acid 1mM 을 처리한 결과, 67 % 의 활성산소 소거율을 보였다.

	시료 용액 농도
	0.1 %	1 %
실시예1	55	88
실시예2	46	81
비교예1	39	77
비교예2	32	65
비교예3	31	64
비교예4	30	61
비교예5	33	68
비교예6	35	70
비교예7	31	62
비교예8	30	60
비교예9	30	61
비교예10	44	79
비교예11	42	77
비교예12	43	78

표 11을 보면, 본 실시예에 따라 꽃송이버섯 균사체를 이용한 불미나리 발효추출물의 활성산소 소거 능력이 우수함을 확인할 수 있다. 즉, 항산화 효과를 가짐을 의미한다.

실험예 2 : 피부 주름 개선 및 피부 탄력 개선 활성 평가

(1) 콜라겐 생합성 평가

시료 용액에 대한 Fibroblast 세포 내에서 새로 생성되는 collagen 양을 측정하기 위해 procollagen assay 를 실시하였다.

콜라겐 생성에 관여하는 세포주의 하나인 Fibroblast를 1 % Antibiotic-Antimycotic (AA, Welgene, Korea)과 10 Fetal bovine serum (FBS, Welgene, Korea)을 포함한 Dulbecco's modified essential medium (DMEM, Welgene, Korea)을 이용하여 37 ℃, 5 % CO₂ incubator에서 배양하였다. 2 x 10⁵ 농도의 Fibroblast 세포를 6 well plate에 접종하여 24 시간 동안 배양한 후, 배지를 제거하고 무혈청 배지를 처리하여 24 시간 동안 starvation 시켰다. 약 24시간 후, 무혈청 배지를 제거하고 PBS로 세척한 다음, UV 312nm 파장에서 12.5mJ로 조사하였다.

이어서, 시료 용액을 phenolred free DMEM 배지에 농도 별로 처리하여 50 시간 동안 추가 배양하였다. Ascorbic acid 50 uM 을 positive control 로, UV(+)군을 Negative control 로, 배지만 처리한 그룹을 control 로 사용하여 시료 용액의 결과와 비교하였다.

시료 용액 처리 후, 50 시간 동안의 배양이 끝난 후 배지를 수거하였다. 수거한 배지는 Procollagen Type-I C-Peptide (PIP) EIA kit(Takara Bio Inc. MK101) 를 이용하여 콜라겐 양을 측정하였다. 더 상세히, Antibody-POD conjugate solution 100 ul를 각 well에 첨가하고, sample이나 standard를 20 ul 씩 넣은 뒤, 혼합하여 실온에서 5 시간 방치한 다음, 반응이 끝나면 내용물을 제거한 후 PBS 400 ul로 4 번 세척하였다. 세척 후 기질 용액 100 ul를 첨가하여 실온에서 15분간 반응시킨 뒤, stop solution 100 ul 첨가하여 부드럽게 섞어준 다음, microplate reader (Chromate, USA) 를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하고, 이의 표준 농도 곡선을 작성하여 콜라겐 양을 산정하였다.

상기에 따라 산정된 콜라겐의 양[procollagen conc.(ug/ml)]을 표 12에 나타내었다.

	시료 용액 농도
	0.04%	0.2%
UV(+)	78
AS 25 uM	104
실시예1	130	149
실시예2	125	144
비교예1	122	139
비교예2	121	135
비교예3	120	134
비교예4	119	130
비교예5	115	130
비교예6	110	125
비교예7	120	140
비교예8	123	141
비교예9	120	141
비교예10	123	140
비교예11	124	143
비교예12	123	140

표 12를 보면, 본 실시예에 따를 경우 콜라겐 생합성량이 현저히 증가함을 확인할 수 있다.

(2)MMP-1 저해 평가

Collagen을 분해하는 효소는 그 종류가 다양하며 가장 많이 알려져 있는 것이 collagen type I을 분해하는 MMP-1 (Matrix metalloproteinase I, collagenase)으로 이를 측정하기 위해 MMP-1 assay 를 실시하였다.

콜라겐 생성에 관여하는 세포주의 하나인 Fibroblast를 1 % Antibiotic-Antimycotic (AA, Welgene, Korea)과 10 % Fetal bovine serum (FBS, Welgene, Korea)을 포함한 Dulbecco's modified essential medium (DMEM, Welgene, Korea)을 이용하여 37 ℃, 5 % CO₂ incubator에서 배양하였다. 이어서, 2 x 10⁵ 농도의 Fibroblast 세포를 6 well plate에 접종하여 24시간 동안 배양한 후, 배지를 제거하고 무혈청 배지를 처리하여 24시간 동안 starvation 시켰다. 약 24시간 후, 무혈청 배지를 제거하고 PBS로 세척하고, UV 312nm 파장에서 12.5mJ로 조사하였다.

이어서, 시료(시료 용액)를 phenolred free DMEM 배지에 농도 별로 처리하여 50시간 동안 추가 배양하였다. Ascorbic acid 50 uM 을 positive control 로, UV(+)군을 Negative control 로, 배지만 처리한 그룹을 control 로 사용하여 시료의 결과와 비교하였다.

시료 용액을 처리하고, 약 50 시간 동안의 배양이 끝난 후 배지를 수거하였다. 수거한 배지는 MMP-1 측정 키트 (RPN 2610, Amersham Bioscience, UK) 를 이용하여 ELISA reader 로 450nm에서 흡광도를 측정하였다.

더 상세히, Anti-MMP1 antibody로 코팅된 96 well plate에 buffer를 well 하나에 첨가하여 blank로 삼고, 배지 중에 유리된 샘플과 표준액 100 ul를 각각의 well 에 넣는 후, 실온에서 shaking 없이 3 시간 동안 반응시켰다. Washing buffer로 well을 가득 채워서 3 회 반복해서 세척 한 후, 물기를 완전히 제거하였으며, 이에 100 ul peroxide conjugate를 첨가하고, 실온에서 shaking 없이 3 시간 동안 반응시켰다. 이어서, Washing buffer로 well을 가득 채워서 20 ~ 30분간 shaking 하면서 반응시키고, 100 ul 1 M H₂SO₄로 반응을 중지시킨 후 microplate reader (Chromate, USA) 를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

상기에 따라 측정된 MMP-1 의 양을 표 13[MMP-1 (% of control)]에 나타내었다.

	시료 용액 농도
	0.04%	0.2%
UV(+)	100	-
AS 50 uM	72	-
실시예1	85	69
실시예2	89	75
비교예1	94	80
비교예2	95	80
비교예3	94	81
비교예4	95	80
비교예5	96	79
비교예6	94	85
비교예7	93	80
비교예8	92	81
비교예9	94	82
비교예10	92	79
비교예11	91	78
비교예12	93	79

표 13을 보면, 본 실시예에 따를 경우 MMP-1의 활성이 현저히 저하됨을 확인할 수 있다.

(3) 피부 탄력 평가

본 발명에 따른 화장품의 피부 탄력 효과에 대한 검사를 측정하기 위하여, 건강한 20 ~ 40대 성인 남녀 30 명을 대상으로 하였다.

시험 시작 전, 상기 시험자들의 피부 탄력도를 측정하였으며, 이때 시험자들의 평균 피부 탄력도는 약 30 ~ 34 % 이었다. 이 후, 상기 시험자들에게 실시예 1의 불미나리 발효추출물을 포함하는 크림(제조예 1 참조)을 1일 1회 도포하도록 하도록 하고, 약 6 주가 지난 후에 피부 탄력도를 측정하도록 하여 그 결과를 표 14에 나타내었다.

상기 피부 탄력도 측정은 상기 시험자들이 세안 후, 항온항습실(온도 20 - 25℃, 상대습도 35%)에서 1시간 동안 피부를 안정화하도록 한 다음, 측정을 수행하였다. 피부의 탄력도는 cutometer SEM 474(Courage+Khasaka, Germany)로 피부 왼쪽 안면을 측정하였으며, 측정 시 음압은 500 mbar, 흡입시간은 2 sec, 반복 측정 횟수는 5 회로 측정하여 평균 수치를 표 14에 나타내었다.

또한, 상기와 동일한 방법으로 실시예 2, 비교예 1 내지 12의 피부 탄력도를 측정하여, 그 결과를 표 14에 나타내었다.

	피부탄력도(%)		피부탄력도(%)
실시예1	52	비교예6	35
실시예2	48	비교예7	38
비교예1	40	비교예8	39
비교예2	37	비교예9	40
비교예3	36	비교예10	42
비교예4	40	비교예11	43
비교예5	38	비교예12	41

표 14를 보면, 본 실시예에 따를 경우 피부 탄력도가 현저히 향상됨을 확인할 수 있다.

상기 실험예 2의 (1) ~ (3)의 결과를 보면, 본 실시예에 따르는 꽃송이버섯 균사체를 이용한 불미나리 발효추출물은 콜라겐의 생합성을 촉진하면서도 콜라겐을 분해하는 MMP-1 효소의 활성을 효과적으로 억제함을 확인할 수 있다. 즉, 피부의 주름 또는 탄력을 효과적으로 개선하여 노화를 방지할 수 있음을 의미한다.

실험예 3 : 피부 미백 평가

연구대상은 건강한 20 ~ 50대 성인 남녀 40 명을 대상으로 피검자의 상박 부위에 직경 1.5 ㎝의 구멍이 뚫린 불투명 테이프를 부착한 뒤, 각 피검자의 최소 홍반량(Minimal Erythema Dose)의 1.5 ~ 2 배 정도의 자외선(UVB)을 조사하여 피부의 흑화를 유도하였다.

조사 후 실시예 1의 시료(시료 용액) 각 1.5 %, 대조군으로 알부틴 1.5 %, 용매(vehicle)만을 바르고, 한곳은 아무 것도 바르지 않고 12 주 동안 상태 변화를 관찰하였다. 1주 단위로 피부의 색깔을 색차계 CR2002(일본, 미놀타 사)로 측정하였다.

도포 개시 시점과 완료 시점에서의 피부색의 차이(△L*)를 하기 수학식 3에 따라 계산하였고, 그 결과를 하기 표 15에 나타내었다.

(수학식 3) △L* = 도포 완료시점에서의 L* 값 - 도포 개시시점에서의 L* 값

상기에 따라 평가된 △L* 값이 2 이상일 경우는 침착된 색소의 미백화가 뚜렷한 경우이고, 1.50 이상이면 미백효과가 있다고 판정할 수 있다.

또한, 상기와 동일한 방법으로 실시예 2 및 비교예 1 내지 12의 미백 정도를 평가하여, 그 결과를 표 15에 나타내었다.

	△L*		△L*
용매(Vehicle)	0.50±0.23	비교예5	1.42±0.21
알부틴	1.50±0.15	비교예6	1.50±0.19
실시예1	2.38±0.15	비교예7	1.51±0.11
실시예2	2.21±0.07	비교예8	1.44±0.23
비교예1	1.56±0.15	비교예9	1.40±0.24
비교예2	1.44±0.11	비교예10	2.08±0.51
비교예3	1.46±0.24	비교예11	2.11±0.09
비교예4	1.40±0.09	비교예12	2.00±0.14

표 15를 보면, 본 실시예에 따를 경우 미백 효과가 현저히 우수함을 알 수 있다.

실험예 4 : 피부 자극성 평가

화장품의 안전도를 평가하기 위해 인체 피부 자극성 평가를 실시하였다.

시험 평가는 인체의 피부 1차 자극 시험으로서 첩포 시험(패치 테스트)으로 판별하였다. 연구대상은 건강한 10 ~ 30대 피험자 30명을 대상으로 CTFA (The Cosmetic Toiletry and Frangrance Association, Safety testing guidelines)가이드 라인에 따라 실시하였다.

실시예 1의 불미나리 발효추출물을 포함하는 크림(제조예 1 참고)을 각각을 2 g씩 적하 시킨 후, 시험 부위인 좌측 상완 내측에 첩포 검사를 실시하였다. 첩포는 12 시간 도포하며 첩포를 제거한 후는 마킹 펜(marking pen)으로 시험 부위를 표시하며 12 시간 간격으로 12 시간, 24 시간, 36 시간, 48 시간 후에 각 시험 부위의 염증 및 피부 반응을 관찰하여 국제 접촉 피부염 연구회(International Contact Dermatitis Research Group; ICDRG)의 규정에 따라 판정하도록 하였다.

(수학식 4) 피부반응도 = [(Grade x No. of respones) x 100] / [3(Maximum. grad) x n(No. of total subjects)]

시험물질 (Sample)	피부 반응도에 따른 평가 기준(계산값)
	0.0~0.9	1.0~2.9	3.0~4.9	5.0이상
	무자극	경자극	중자극	강자극

반응	가중치	피부 안전성 판독의 판정기준
-	0	무반응
±	0.5	희미한 홍반
+	1	경계가 뚜렷하나 약한 홍반, 부종 및 구진 형성
++	2	뚜렷한 홍반, 구진 및 수포 형성
+++	3	대수포 형성

1차 자극 실험 결과
분류(-:무자극)	비교예 1	실시예 1
적용 농도(%)	3%	3%
의양성 반응(±	-	-
약양성 반응(+)	-	-
접촉성 피부염 유발확률(%)	0.00	0.00

표 16 내지 18에 개시된 바와 같이, 최종 판독 결과는 모두 음성반응을 보여 피부 안전성이 우수한 것으로 나타났다.

전술한 바와 같이, 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며, 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.

본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (6)

1. 불미나리(Oenanthe　javanica　D.C)를 꽃송이버섯 균사체로 발효시킨 발효물을 추출한 불미나리 발효추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 피부 항산화용, 주름 개선용, 탄력 개선용 또는 미백용 화장료 조성물.
   
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 화장료 조성물은
   상기 화장료 조성물 총 중량 기준으로 상기 불미나리 발효추출물을 0.001 ~ 30 중량%로 포함하는 것을 특징으로 하는, 피부 항산화용, 주름 개선용, 탄력 개선용 또는 미백용 화장료 조성물.
   
3. 제 1 항에 있어서,
   상기 화장료 조성물은
   유연화장수, 영양화장수, 수렴화장수, 스킨, 로션, 에센스, 크림, 마사지 크림, 팩, 메이크업 베이스, 비비크림, 파운데이션, 파우더, 바디로션, 바디클렌저, 클렌징 폼, 클렌징 크림 및 클렌징 워터로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 제형인 것을 특징으로 하는, 피부 항산화용, 주름 개선용, 탄력 개선용 또는 미백용 화장료 조성물.
   
4. 불미나리 발효추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 항산화용, 주름 개선용, 탄력 개선용 또는 미백용 화장료 조성물의 제조방법에 있어서,
   불미나리를 멸균하는 멸균 단계;
   상기 멸균된 불미나리를 배지에 습윤시키는 습윤 단계;
   상기 습윤된 불미나리에 꽃송이버섯 균사체를 접종한 후 발효시켜 발효물을 수득하는 발효 단계;
   상기 발효물을 고온으로 가열하는 가열 단계;
   상기 가열된 발효물을 저온에서 숙성시키는 숙성 단계;
   상기 숙성된 발효물을 추출용매로 추출한 후 여과 및 농축하여 불미나리 발효추출물을 수득하는 추출 단계; 및
   상기 불미나리 발효추출물을 부형제와 혼합하여 제형화하는 제형화 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 피부 항산화용, 주름 개선용, 탄력 개선용 또는 미백용 화장료 조성물의 제조방법.
   
5. 제 4 항에 있어서,
   상기 발효 단계는
   20 ~ 30 ℃에서 1 ~ 10 일 동안 실시되는 것을 특징으로 하는, 피부 항산화용, 주름 개선용, 탄력 개선용 또는 미백용 화장료 조성물의 제조방법.
   
6. 제 4 항에 있어서,
   상기 숙성 단계는
   5 ~ 15 ℃에서 20 ~ 40 시간 동안 실시되는 것을 특징으로 하는, 피부 항산화용, 주름 개선용, 탄력 개선용 또는 미백용 화장료 조성물의 제조방법.