KR20200047430A

KR20200047430A - 역미셀을 포함하는 경피 전달 시스템

Info

Publication number: KR20200047430A
Application number: KR1020190133886A
Authority: KR
Inventors: 김광년; 손주현; 조사랑
Original assignee: 주식회사 유나이티드엑티브
Priority date: 2018-10-26
Filing date: 2019-10-25
Publication date: 2020-05-07
Also published as: WO2020085857A1; KR102283338B1; WO2020085857A9

Abstract

본 발명은 역미셀(reverse micelle)을 포함하는 경피 전달 시스템을 이용하여 피부 활성물질을 지질층 사이로 통과시켜 피부에 효과적으로 전달할 수 있도록 한다. 또한, 산화되기 쉬운 활성물질, 난용성물질, 항산화물질, 수용성물질, 결정성물질 등의 안정성이 낮고, 피부투과가 어려운 생리활성물질을 화장품 제형에 용이하게 접목시킬 수 있으며, 용해성, 유화, 산화 안정성, 피부 내 효능 등을 향상시킬 수 있다. 또한, 합성물이 아닌 발효물로써 친환경적이고, 피부자극이 없는 천연유래의 경피 전달 시스템으로서 다양한 분야에 적용할 수 있다.

Description

역미셀을 포함하는 경피 전달 시스템{TRANSEPIDERMAL DELIVERY SYSTEM COMPRISING REVERSE MICELL}

본 발명은 역미셀을 포함하는 경피 전달 시스템에 관한 것이다.

본 출원은 2018.10.26자 한국 특허 출원 제2018-0129023호에 기초한 우선권의 이익을 주장하며, 해당 한국 특허 출원의 문헌에 개시된 모든 내용은 본 명세서의 일부로서 포함된다.

인간의 피부는 크게 표피와 진피, 피하지방으로 나누어지고 다시 표피는 각질층, 투명층, 과립층, 유극층, 기저층으로 세분화되어 있다. 피부의 최외각층인 각질층은 죽은 케라틴세포 덩어리로 이루어져 있으며, 주로 단백질로 이루어져 있는 각질 세포로 구성되고, 각질 세포 간의 사이를 세라마이드, 콜레스테롤, 유리지방산 등의 지질이 채우고 있는 구조를 가진다. 이 지질층은 체내 수분이 증발되는 것을 방지하며, 외부 침입에 대해 신체를 보호하는 건강학적 기능과 동시에, 피부를 윤택하고 매끄럽게 보이게 하는 심미적 기능을 가지고 있다.

피부 내 물질을 투과시키기 위한 경로는 intrapathway, interpathway, transcelluar pathway가 있다. 이중, 피부 내로의 물질 투과효율은 interpathway가 높다. 한편, 피부 각질층은 친수성 물질보다 소수성 물질이 흡수 및 투과되기 용이하다.

약물의 피부 흡수에 영향을 미치는 요인은 크기, 모양, 표면 전하, 친유성, 투과 촉진제, 제형의 형태 그리고 각질층의 상태이다. 유효 성분을 피부에 자연스럽게 통과시키기 위해서는 소수성 혹은, 친수성과 소수성이 결합된 담체를 이용해야 하며 특히, 수용성 활성물질을 피부에 전달하기 위해 미셀(micelle) 혹은 리포좀(liposome)과 같은 형태의 담체를 이용하는 것이 일반적이다.

그러나 이러한 미셀 혹은 리포좀의 형태는 피부의 지질층을 통과시켜 유효물질을 흡수시키기에는 한계가 있다. 이는 피부의 최외각층인 각질층은 각질세포들로 쌓여있고, 그 사이 사이는 지질성분으로 이루어진 구조이기 때문에 구조적으로 친수성의 물질보다는 소수성의 물질이 각질세포 사이로 투과시키는 것이 용이하다.

역미셀이란, 계면활성제의 활성에 의해 유기용매 안에 나노미터 사이즈(1~10 nm)의 둥근 형태의 입자가 분산되어 있는 것을 의미한다.

한편, 역미셀계(reverse micelle system)는 비극성용매의 환경에서 계면활성제의 소수성 부분(tail)이 외부로 향하고, 친수성 부분(head)이 내부로 향하도록 자발적으로 배열되는 응집체이다. 이는 나노크기의 입자로 분산될 수 있다.

그러므로, 역미셀을 적용하여 피부로부터 유효성분을 효과적으로 침투시킬 수 있는 방법이 필요하다. 또한, 산화 및 분해에 취약한 활성물질을 포집함으로 써 안정성을 향상시키고자 하였다.

상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명은,

Candida bombicola UA-06(기탁번호: KCTC13855BP, 한국생명공학연구원) 미생물로부터 형성된 발효물; 및

피부 활성물질을 포함하되,

상기 발효물은 역미셀 구조를 형성하고, 상기 피부 활성물질은 상기 역미셀 구조 내에 포집된 형태인 것인, 역미셀을 포함하는 경피 전달 시스템을 제공한다.

일구현예에 따르면, 상기 발효물은 Candida bombicola UA-06 미생물을 활성화시키는 종균배양 단계; 및

상기 종균배양시킨 미생물 및 식물성 오일을 발효시키는 발효 단계를 포함하는 방법으로 제조될 수 있다.

일구현예에 따르면, 상기 종균배양 단계에서 사용하는 배지는 이스트 추출물(yeast extract), 글리세린(glycerin), K₂HPO₄, KH₂PO₄, NH₄NO₃ 및 MgSO₄를 포함할 수 있다.

일구현예에 따르면, 상기 발효 단계에서 사용하는 배지는 이스트 추출물(yeast extract), 글리세린(glycerin), K₂HPO₄, KH₂PO₄, NH₄NO₃, MgSO₄, 글루쿠로노락톤(glucuronolactone) 및 식물성 오일을 포함할 수 있다.

일구현예에 따르면, 상기 종균배양 단계에서 사용하는 배지는 이스트 추출물(yeast extract) 5 내지 30g/L, 글리세린(glycerin) 10 내지 40g/L, K₂HPO₄ 10 내지 50g/L, KH₂PO₄ 3 내지 15g/L, NH₄NO₃ 1 내지 10g/L 및 MgSO₄ 0.5 내지 5g/L를 포함하고,

상기 발효 단계에서 사용하는 배지는 이스트 추출물(yeast extract) 0.5 내지 3g/L, 글리세린(glycerin) 1 내지 20g/L, K₂HPO₄ 10 내지 50g/L, KH₂PO₄ 3 내지 15g/L, NH₄NO₃ 1 내지 10g/L, MgSO₄ 0.5 내지 5g/L, 글루쿠로노락톤(glucuronolactone) 40 내지 200g/L 및 식물성 오일 50 내지 1000g/L을 포함할 수 있다.

일구현예에 따르면, 상기 종균배양 단계는 15 내지 30℃, 100 내지 500rpm, 0.5 내지 2vvm, 호기 조건으로 진행되고,

상기 발효 단계는 20 내지 35℃의 온도 및 50 내지 200rpm의 혼합 조건으로 진행될 수 있다.

일구현예에 따르면, 상기 종균발효 단계는 균의 지수생장 종말점 시점에서 종료시킬 수 있다.

일구현예에 따르면, 상기 식물성 오일은 해바라기씨, 포도씨, 카놀라, 쌀눈, 올리브, 대두, 아르간, 현미, 들깨, 참깨, 아몬드, 땅콩, 옥수수, 홍삼, 아보카도, 마카다미아, 코코넛, 로즈힙, 비타민나무씨, 시어나무열매, 기름야자, 베르가모트열매, 동백씨, 홍화씨, 살구씨, 양귀비씨, 달맞이꽃씨, 피마자씨, 녹차씨, 메도우폼씨, 아마씨 및 햄프씨로 이루어지는 군으로부터 추출된 것일 수 있다.

일구현예에 따르면, 상기 발효 단계 후 정제공정 단계를 더 포함할 수 있고, 상기 정제 단계는 발효물을 정치시켜 상층과 하층을 분리하여 하층을 폐 기하고, MgSO₄를 첨가하여 교반 후 원심분리하여 미생물 및 수분을 제거하는 단계 및,

친화크로마토그라피 컬럼에 규산마그네슘을 충진제로 사용하여 지방산 및 불순물이 제거된 오일을 회수하는 단계를 포함할 수 있다.

일구현예에 따르면, 상기 역미셀 내에 피부 활성물질이 포집된 형태를 형성할 수 있다.

일구현예에 따르면, 상기 피부 활성물질은 비타민C, 비타민 B, 코직산, 이소플라본, 아미노산류, 펩타이드류, 아데노신, 단백질 분해효소 및 효소류, 알부틴, 히알루론산, 하이드로퀴논, 세라마이드, 코엔자임Q10, 테트라하이드로커큐미노이드, 안토시아닌, 콜라겐, 레티놀, 벌사상자추출물, 치자추출물, 강황추출물 및 병풀추출물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다.

기타 본 발명에 따른 구현예들의 구체적인 사항은 이하의 상세한 설명에 포함되어 있다.

본 발명은 역미셀(reverse micelle)을 포함하는 경피 전달 시스템을 이용하여 피부 활성물질을 지질층에 통과시켜 피부에 효과적으로 전달할 수 있도록 한다. 또한, 산화되기 쉬운 활성물질, 난용성물질, 항산화물질, 수용성물질 등의 생리활성물질을 화장품 제형에 용이하게 접목시킬 수 있으며, 용해성, 유화, 산화 안정성, 피부 내 효능 등을 향상시킬 수 있다. 또한, 합성물이 아닌 발효물로써 친환경적이고, 피부세포에 대한 독성이 없으므로 인체 친화적인 경피 전달 시스템으로서 다양한 분야에 적용할 수 있다.

도 1은 열 안정성 평가 결과를 나타내는 사진이다.
도 2 및 3은 역미셀의 입자 크기를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 역미셀을 관찰한 현미경 사진이다.
도 5 내지 7은 피부 투과량 측정 결과를 나타내는 그래프이다.

본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예를 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

천연유래의 계면활성제는 피부에 유용한 성분을 다량 함유하고 있으며, 그 중, 미생물을 이용하는 생물 계면활성제(bio-surfactant)는 많은 이점을 가진다.

한편, 계면활성제는 일정 농도 이상일 때, 수상에서 중심에 소수기를 밀집시키는 미셀(micelle) 구조를 이루는 것이 일반적이다. 반대로, 유상에서는 저분자 친수기를 중심에 밀집시키는 역미셀(reverse micelle) 구조를 이룬다. 역미셀은 미셀보다 피부의 지질층을 통과하는데 더 효율적이기 때문에 세포간극을 통하여 수용성 활성물질을 피부세포에 안정적으로 전달하는 시스템으로 적용할 수 있다.

그러므로 본 발명에서는 이러한 역미셀을 포함하는 경피 전달 시스템을 제공하고자 한다.

구체적으로 본 발명은,

피부 활성물질을 포함하되,

일구현예에 따르면, 상기 발효물은 Candida bombicola UA-06 미생물을 활성화시키는 종균배양 단계 및 상기 종균배양시킨 미생물 및 식물성 오일을 발효시키는 발효 단계를 포함할 수 있다.

일구현예에 따르면, 상기 종균배양 단계에서 사용하는 배지는 이스트 추출물(yeast extract), 글리세린(glycerin), K₂HPO₄, KH₂PO₄, NH₄NO₃ 및 MgSO₄를 포함할 수 있다. 구체적으로 예를 들어, 이스트 추출물(yeast extract) 5 내지 30g/L, 예를 들어 10g/L, 글리세린(glycerin) 10 내지 40g/L, 예를 들어 20g/L, K₂HPO₄ 10 내지 50g/L, 예를 들어 25g/L, KH₂PO₄ 3 내지 15g/L, 예를 들어 7 g/L, NH₄NO₃ 1 내지 10, 예를 들어 3 g/L 및 MgSO₄ 0.5 내지 5g/L, 예를 들어 2g/L을 포함할 수 있다. 또한, 추가로 물을 포함할 수 있고, 구체적으로는 정제수가 바람직하며, 예를 들어 이온교환수지를 이용한 정제수를 사용할 수 있다.

일구현예에 따르면, 상기 발효 단계에서 사용하는 배지는 이스트 추출물(yeast extract), 글리세린(glycerin), K₂HPO₄, KH₂PO₄, NH₄NO₃, MgSO₄, 글루쿠로노락톤(glucuronolactone) 및 식물성 오일을 포함할 수 있다. 구체적으로 예를 들어, 이스트 추출물(yeast extract) 0.5 내지 3g/L, 예를 들어 1g/L, 글리세린(glycerin) 1 내지 20g/L, 예를 들어 20g/L, K₂HPO₄ 10 내지 50g/L, 예를 들어 25g/L, KH₂PO₄ 3 내지 15g/L, 예를 들어 7g/L, NH₄NO₃ 1 내지 10, 예를 들어 3g/L, MgSO₄ 0.5 내지 5g/L, 예를 들어 2g/L, 글루쿠로노락톤(glucuronolactone) 40 내지 200g/L, 예를 들어 100g/L 및 식물성 오일 50 내지 1000g/L, 예를 들어 500g/L을 포함할 수 있다. 또한, 추가로 물을 포함할 수 있고, 구체적으로는 정제수가 바람직하며, 예를 들어 이온교환수지를 이용한 정제수를 사용할 수 있다.

구체적으로, 글루쿠로노락톤을 포함함으로써 글루쿠로노락톤-지방산 형태의 친수성이 증가된 유화제를 생성시킬 수 있으며, 그에 따라 발효유화제의 유화력을 증가시키거나 친수성 활성물질 포집력을 향상시킬 수 있다.

일구현예에 따르면, 상기 종균배양 단계는 15 내지 30℃, 100 내지 500rpm, 0.5 내지 2vvm, 호기 조건으로 진행될 수 있다. 또한, 상기 발효 단계는 20 내지 35℃의 온도 및 50 내지 200rpm으로 50 내지 100시간, 예를 들어 3일 동안 진행될 수 있다.

일구현예에 따르면, 상기 종균발효 단계는 균의 지수생장 종말점 시점에서 종료될 수 있다. 구체적으로 상기 지수생장 종말점은 40 내지 120시간일 수 있으며, 예를 들어 50 내지 100시간, 예를 들어 60시간이 되는 시점에서 종균발효를 종료시킬 수 있다.

일구현예에 따르면, 상기 식물성 오일은 해바라기씨, 포도씨, 카놀라(canola), 쌀눈, 올리브(olive), 대두, 아르간(argan), 현미, 들깨, 참깨, 아몬드(almond), 땅콩, 옥수수, 홍삼, 아보카도(avocado), 마카다미아(macadamia), 코코넛(coconut), 로즈힙(rose hip), 시어나무(shea tree)열매, 기름야자(african oil palm), 베르가모트(bergamot)열매, 비타민나무씨, 동백씨, 홍화씨, 살구씨, 양귀비씨, 달맞이꽃씨, 피마자씨, 호호바씨, 녹차씨, 메도우폼씨(meadowfoam seed), 아마씨 및 햄프씨(hemp seed) 등의 식용 가능 또는 인체 친화적인 오일로 이루어지는 군으로부터 추출된 하나 이상을 사용할 수 있다.

일구현예에 따르면, 상기 발효 단계 후 정제공정 단계를 더 포함할 수 있다. 구체적으로, 수분 및 미생물의 제거를 위하여, 오일발효 후 발효물을 정치시켜 상층에 위치하는 소수성 부분(발효물)과 하층에 위치하는 친수성 부분(배지 및 불순물)을 분리하여 하층을 폐기하고, MgSO₄를 첨가하여 교반한 후 원심분리기를 이용하여 잔존 불순물 및 미생물을 제거할 수 있다.

또한, 상기 발효 후 발효물의 지방산 및 불순물의 정제를 위하여, 크로마토그라피(chromatography) 방법을 사용할 수 있다. 구체적으로, 친화크로마토그라피 컬럼(affinity chromatography column)에 규산마그네슘(magnesium silicate)을 충진제로 사용하여 지방산 및 불순물 등을 흡착, 여과시킬 수 있다. 단, 발효물은 50~60℃까지 가온시켜 사용한다.

본 발명이 포함하는 발효물은 역미셀을 포함하는 것으로, 역미셀은 친수성 용해물 존재 하에 극성기가 안쪽으로 배향되고, 소수기가 바깥쪽 비극성 용매측으로 배향되며, 거의 구상의 배향성 집단을 이루는 분자 집단을 의미한다.

일구현예에 따르면, 역미셀 내에 피부 활성물질이 포집된 형태를 형성할 수 있다. 구체적으로 예를 들면, 상기 피부 활성물질은 비타민C, 비타민 B, 코직산, 이소플라본, 아미노산류, 펩타이드류, 아데노신, 단백질 분해효소 및 효소류, 알부틴, 히알루론산, 하이드로퀴논, 세라마이드, 코엔자임Q10, 테트라하이드로커큐미노이드, 안토시아닌, 콜라겐, 레티놀, 벌사상자추출물, 치자추출물, 강황추출물 및 병풀추출물 등 친수성의 생리활성물질 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다.

발효물의 계면장력은 낮을수록 분자의 응집력이 낮음을 의미하며, 분자의 응집력이 낮으면 다른 상과 혼합될 수 있는 유화능력이 향상될 수 있으므로, 일구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 계면장력이 30 dyne/cm 이하, 예를 들어 10 내지 30dyne/cm, 예를 들어 20 내지 30 dyne/cm일 수 있다.

본 발명에 따른 경피 전달 시스템은 역미셀을 포함함으로써 피부 활성물질, 약물 등을 피부 각질층에 예를 들어, 인터패스웨이(interpathway)법을 통하여 효과적으로 침투시킬수 있으므로 경피 흡수율을 향상시켜 피부학적 효능을 향상시킬 수 있다. 또한 산화되기 쉬운 물질, 수용성 물질, 결정성 물질 및 난용성 물질을 역미셀로 포집시킴으로써 안정화된 제형을 제조할 수 있으므로 화장품 및 의약품에 용이하게 사용할 수 있다.

또한, 역미셀을 포함하는 전달 시스템을 활용하면 피부 활성물질, 약물 등을 경피, 모낭 등의 경로를 통하여 용이하게 흡수시킬 수 있으므로, 화장료, 약제학적 조성물 등 다양한 분야에 적용할 수 있다.

이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.

제조예

Candida bombicola UA 06(기탁번호: KCTC13855BP, 한국생명공학연구원) 균체 수득

Candida bombicola UA 06을 이스트 추출물(yeast extract) 10 g/L, 글리세린(glycerin) 20 g/L, K₂HPO₄ 25 g/L, KH₂PO₄ 7 g/L, NH₄NO₃ 3 g/L, MgSO₄ 2 g/L 및 증류수 933 g/L로 구성된 배지에 접종하여 20℃, 300rpm, 1NL/min(1vvm)의 호기적인 조건에서 배양을 진행하였다. 배양은 분광광도계(Epoch2, BioTek)로 600nm에서 흡광도를 측정하여 균의 지수생장 종말점인 60시간 시점에서 종료하였다. 배양액을 원심분리(16,000g, 30분)하여 균체를 침전시키고 인산 버퍼로 수 회 세척하여 균체를 수득하였다.

오일의 발효

오일 발효를 위하여 이스트 추출물(yeast extract) 1.0 g/L, 글리세린(glycerin) 20 g/L, K₂HPO₄ 25 g/L, KH₂PO₄ 7 g/L, NH₄NO₃ 3 g/L, MgSO₄ 2 g/L, 글루쿠로노락톤(glucuronolactone) 100 g/L, 식물성오일 500 g/L 및 증류수 333 g/L 로 구성된 발효액을 5 L 발효조에 25℃, 100rpm 조건으로 발효액을 혼합 제조하였다. 상기 발효액의 온도가 25℃일 때, 균체 2.5 g/L를 투입하고, 3일 동안 발효를 진행하였다. 식물성 오일로는 해바라기씨유를 사용하였다.

정제

발효 3일 후, 발효물에 대하여 잔존하는 효소활성을 90℃ 고온으로 활성 상실시킨 후, 1N HCl로 pH를 4 내지 5로 조정하고, 발효물을 6 내지 12시간 정치하여 수층(미생물 및 배지)과 유층(역미셀 형성 발효 유화물)을 분리하여 수층을 제거하였다. 발효물에 남아있는 수분을 제거하기 위하여 MgSO₄를 20 g/L 첨가하고, 50℃, 300rpm 조건으로 2시간 교반하여 원심분리 후 투명한 유층(역미셀 형성 발효 유화물)을 수득하였다. 또한, 상기 발효 유화물의 지방산 및 불순물을 규산마그네슘이 충진된 컬럼으로 정제 후, 잔존하는 작은 입자의 MgSO₄를 완전히 제거하기 위하여 0.45 ㎛ 필터로 감압여과시켜 역미셀을 포함하는 발효물을 수득하였다.

실시예 1 내지 11 및 비교예 1

제조예에 따른 역미셀을 포함하는 발효물을 표 1에 따른 각각의 실시예 및 비교예의 발효액 배지 조성으로 배양하였다. 실시예에 기재된 식물성 오일 외에, 해바라기씨, 포도씨, 카놀라, 쌀눈, 올리브, 대두, 아르간, 현미, 들깨, 참깨, 아몬드, 땅콩, 옥수수, 홍삼, 아보카도, 마카다미아, 코코넛, 로즈힙, 비타민나무씨, 시어나무열매, 기름야자, 베르가모트열매, 동백씨, 홍화씨, 살구씨, 양귀비씨, 달맞이꽃씨, 호호바씨, 피마자씨, 녹차씨, 메도우폼씨, 아마씨, 햄프씨 등의 식용 가능 또는 인체 친화적인 오일이라면 본 발명의 범위에 포함될 수 있다.

실시예 12 내지 29:

표 2 및 3과 같은 조성으로 역미셀을 포함하는 경피전달 조성물을 제조하였다.

실시예 1과 같은 배지 조성을 선택하였으며, 실시예 1에 따른 역미셀 형성 유화제가 포함된 발효오일은 피부전달 매개체이므로 캐리어 오일(Carrier Oil)로 지칭하였다. 포집 방법은 활성물질과 용매를 혼합 및 용해시킨 후 70℃로 가온한 캐리어 오일에 투입하여 투명하게 될 때까지 교반하였다. 그리고 30℃까지 냉각한 후, 투명도를 확인함으로써 완성하였다.

실험예 1: 온도별 안정성 평가

활성물질을 포집시킨 조성물에 대한 시간 및 온도 조건의 변화에 따른 안정성을 평가하기 위하여, 실시예 12 내지 29에 따른 조성물에 대하여 상온(15~25℃), 저온(-5℃), 고온(50℃), 순환(-5 내지 40℃)조건에서 1개월, 3개월의 시간이 경과함에 따른 안정도를 관찰하였다.

평가는 색상, 침전(투명도)을 확인함으로써, 활성성분의 안정적 포집 여부, 물질의 변성여부를 판단하는 것으로 실시하였다. 안정적으로 포집되지 않을 시에는, 성상이 불투명해지고, 활성물질의 침전이 발생하게 된다.

가혹조건에서의 평가 결과는 표 4에, 일반조건에서의 평가 결과는 표 5에 나타내었다. 순환 조건은 12시간 동안 온도를 -5 내지 40℃로 변화시킨 것을 한 사이클로 하였다. 또한, 일반조건에서는 3개월, 가혹조건에서는 1개월 동안 안정도를 관찰하였다.

그 결과, 비타민, 아미노산, 펩타이드, 식물추출물, 항균제, 항산화제, 효소 등을 나노입자로 포집시킴으로써 안정적인 조성물을 제조할 수 있다.

실험예 2: 열 안정성시험

실시예를 이용하여, 역미셀을 형성하여 활성물질을 포집시킨 조성물에 대한 열안정성을 평가하였다. 시험방법으로는 실시예 1, 12, 13, 16을 유리용기에 150g 칭량하여 수조에서 90~100℃로 1시간 30분 동안 가열하였다. 이후 가열 전, 가열 후 1일 경과하였을 때 색상 및 취를 비교하였다. 그 결과, 모든 시료에서 가열 전후의 색상 및 취 변화는 나타나지 않았다. 또한, 캐리어 오일인 실시예 1을 동일하게 실험하여 활성물질이 포집된 조성물과 비교하여, 그 결과를 도 1에 나타내었다.

실험예 3: 역미셀 입자 사이즈 측정

실시에 13 및 19에 따른 조성물의 역미셀 입자를 입도분석기(Particle size analyzer,ELSZ-1000, Otsuka Electronics)를 이용하여 측정하였다. 그 결과는 도 2 및 3에 나타내었으며, 평균적으로 1.4 ~ 2.2 nm 수준의 입자 사이즈가 분포하고 있는 것이 확인되었다.

실험예 4: 역미셀(reverse micelle) 관찰

실시예 12의 활성물질 포집 여부를 확인하기 위해 투과전자현미경(JEM-F200, JEOL)을 이용하여 역미셀(reverse micelle)형성을 관찰하였다. 시료를 carbon으로 코팅된 Cu grid 위에 한 방울 떨어뜨려 상온에서 6시간 동안 건조시켜 전처리하고 현미경으로 관찰하였다.

현미경 사진은 도 4에 나타내었다. 오일 상에서 활성물질이 나노 사이즈로 포집되어 둥근 형태의 역미셀(reverse micelle)이 형성된 것을 확인할 수 있다.

실험예 5: 피부투과시험

상기 실시예 및 비교예에 따른 조성물의 피부 투과 평가를 위하여 인공피부(Strat-M)를 사용하였다. 공여관(donor chamber)을 덮어 클램프로 고정시킨 후 수용상을 프란츠 확산 셀(franz diffusion cell)에 채우고, 32℃로 유지시켰다. 상기 제조된 실시예와 비교예를 각각 0.5 ml씩 도포하여 투과시험을 진행하였다. 투과시험으로 시간 별로 수용상을 5.0ml채취하고, 분석하였다. 그리고, 새로운 수용상으로 보충하였다. 단, 수용상은 활성물질의 용해도가 높은 용매를 사용하였다.

피부 누적 투과량을 분석하기 위하여 HPLC법으로 측정하였다.

실시예 12(테트라하이드로커큐민, tetrahydrocurcumin, THC)의 HPLC 분석 조건은 표 6과 같고, Waters Alliance2690 liquid chromatograph system (Waters, USA)과 Waters 2420 detector(Waters, USA)를 이용하였다. 컬럼은 5C18-AR-II(4.6 mm I.D.x 150 mm), 4.5um(Cosmosil, Japan)을 사용하였다. 비교예 1은 테트라하이드로커큐민(Tetrahydrocurcumin, THC)을 실시예 12와 동일한 농도로 디프로필렌글라이콜(Dipropylene glycol)에 용해시킨 것이다. 결과는 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타난 바와 같이, 실시예 12의 피부 누적 투과량은 비교예 1(대조군)과 비교하였을 때 4.6배 증가함을 확인하였다.

또한, 실시예 13(아스코르브산, Ascorbic acid)의 HPLC 분석을 실시하였으며, 조건은 표 7와 같고, Waters Alliance2690 liquid chromatograph system(Waters, USA)와 UV detector를 이용하였다. 컬럼은 5C18-AR-II(4.6mm I.D.x150mm), 4.5 um(Cosmosil, Japan)을 사용하였다. 비교예 2는 아스코르브산(Ascorbic acid)을 실시예 13과 동일한 농도로 디프로필렌글라이콜(Dipropylene glycol)에 용해시킨 것이다. 결과는 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타난 바와 같이, 실시예 13의 피부 누적 투과량 비교예 2(대조군)과 비교하였을 때, 비교예 2에서는 투과되는 아스코르브산이 검출되지 않았으며, 실시예 13의 누적 투과량은 54 ㎍/cm²로 확인되었다.

또한, 실시예 15(아데노신, adenosine)의 HPLC 분석 조건은 표 8과 같고, Waters Alliance2690 liquid chromatograph system (Waters, USA)와 UV detector를 이용하였다. 컬럼은 5C18-AR-II(4.6mm I.D.x150mm), 4.5 um(Cosmosil, Japan)을 사용하였으며, 그 결과는 도 7에 나타내었다. 비교예 3은 아데노신을 실시예 15와 동일한 농도로 디프로필렌글라이콜(Dipropylene glycol)에 용해시킨 것이다. 결과는 도 6에 나타내었다.

도 7에 나타난 바와 같이, 실시예 15의 피부 투과율은 비교예 3(대조군)과 비교하였을 때 16배 증가함을 확인할 수 있다.

상기와 같은 결과로 역미셀을 형성하는 유화제가 포함된 발효 오일(캐리어 오일)은 피부에 유효한 활성물질을 나노 사이즈로 포집시키기 때문에, 물질의 안정성을 향상시키며, 이를 피부에 적용하였을 때 화장품에 주로 이용되는 용매보다 피부 흡수율이 높고, 빠르게 작용하는 것을 확인할 수 있다. 이는 피부 투과에 있어서 주로 각질층에 대한 제한을 받지만, 캐리어 오일은 각질층을 구성하는 세포간 지질(라멜라 층)을 통하여 활성물질을 경피(eideraml)내로 용이하고, 효과적으로 전달할 수 있다.

실험예 6: 피부자극시험

본 실험은 실시예 13에 대한 피부 안전성 평가를 목적으로 피부 일차 자극평가를 실시하였다. 평가기관은 (주)대한피부과학연구소로부터 의뢰하여 진행하였다. 피험자 31명을 선정하여 등 부위에 24시간 첩포한 후 첩포 제거 30분, 24시간, 48시간에 각각 일차 피부자극 유무를 피부과 전문의가 판정하였다. 피부 반응 판정은 국제접촉피부염학회(ICDRG)기준 및 미국화장품협회(PCPC)의 피부 반응 평가 기준에 의거하여 평가(표 9)하였고, 피험자들의 피부 반응 점수를 이용하여 다음과 같이 자극지수를 계산하였다.

평균 자극 지수를 산출한 후 Draize Dermal Classification System 및 EPA(Environmental Protection Agency) Standard Procedure Dermal Classification System을 응용한 다음 피부 자극 결과 판정표에 따라 자극성의 정도를 판정하였다(표 10).

표 9 및 10의 기준에 따른 결과를 표 11에 나타내었다.

*첩포 제거 후 30분에 측정

표 11에 나타난 바와 같이, 실시예 13이 무자극 물질로 판정되었다.

실시예 30: 크림 제형 1

하기 표 12의 조성에 따라 실시예 13을 포함하는 크림제형을 제조하였다. 구체적으로, 하기 표 10의 A상의 카보머를 분산한 후 B상을 투입하여 70℃로 가열하여 교반한다. 그리고, C상을 A+B상 용기에 투입하고, 호모믹서로 3500 rpm에서 5분간 혼합하였다. D상을 투입하여 호모믹서로 3500 rpm에서 5분간 혼합하여 중화시키고, 냉각 및 탈포시켰다.

실시예 31: 천연 페이스오일 제형

하기 표 13의 조성에 따라 실시예 13을 포함하는 천연페이스오일 제형을 제조하였다. 구체적으로, 하기 표 11의 A상의 순서대로 투입하여 아지믹서로 교반한 후 A상에 B상을 투입하여 교반하였다. 이후 투명도를 확인하여 완성하였다.

상기와 같은 결과로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명은 역미셀(reverse micelle)을 형성함으로써 유효 활성물질을 나노 사이즈로 포집시킴으로써, 피부 투과율을 증가시키고, 피부학적 효능을 향상시킬 수 있다.

실시예 32: 크림 제형 2

하기 표 14의 조성에 따라 실시예 27을 포함하는 크림제형을 제조하였다. 구체적으로, 하기 표 12의 A상의 카보머를 분산한 후 B상을 투입하여 70℃로 가열하여 호모믹서로 3000 rpm에서 1분간 혼합하였다. 그리고, C상을 A+B상 용기에 투입하고, 호모믹서로 3000 rpm에서 1분간 혼합하였다. 순서대로, D상을 A+B+C상 용기에 투입하고, 호모믹서로 3000 rpm에서 10분간 혼합하여 유화시킨다. E상을 투입하여 호모믹서로 3000 rpm에서 3분간 혼합 후 F상을 투입하여 호모믹싱하였다. 마지막으로 G상으로 중화시키고, 냉각 및 탈모하여 완성하였다.

따라서, 쉽게 산화되거나, 열에 의하여 변성되는 물질, 난용성 물질 등을 본 발명에 따라 포접시킴으로써 피부 침투성을 향상시킬 수 있으며, 화장품 제형에 안정적이고 용이하게 적용시킬 수 있다.

이상의 설명은 본 발명의 기술 사상을 예시적으로 설명한 것에 불과한 것으로서, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 다양한 수정 및 변형이 가능하다. 또한, 본 발명에 개시된 실시 예들은 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시 예에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 보호 범위는 아래의 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

Candida bombicola UA-06(기탁번호: KCTC13855BP, 한국생명공학연구원) 미생물로부터 형성된 발효물; 및
피부 활성물질을 포함하되,
상기 발효물은 역미셀 구조를 형성하고, 상기 피부 활성물질은 상기 역미셀 구조 내에 포집된 형태인 것인, 역미셀을 포함하는 경피 전달 시스템.
제1항에 있어서,
상기 발효물이 Candida bombicola UA-06 미생물을 활성화시키는 종균배양 단계; 및
상기 종균배양시킨 미생물 및 식물성 오일을 발효시키는 발효 단계를 포함하는 방법으로 제조된 것인, 역미셀을 포함하는 경피 전달 시스템.
제2항에 있어서,
상기 종균배양 단계에서 사용하는 배지가 이스트 추출물(yeast extract), 글리세린(glycerin), K₂HPO₄, KH₂PO₄, NH₄NO₃ 및 MgSO₄를 포함하는 것인, 역미셀을 포함하는 경피 전달 시스템.
제2에 있어서,
상기 발효 단계에서 사용하는 배지가 이스트 추출물(yeast extract), 글리세린(glycerin), K₂HPO₄, KH₂PO₄, NH₄NO₃, MgSO₄, 글루쿠로노락톤(glucuronolactone) 및 식물성 오일을 포함하는 것인, 역미셀을 포함하는 경피 전달 시스템.
제2항에 있어서,
상기 종균배양 단계에서 사용하는 배지가 이스트 추출물(yeast extract) 5 내지 30g/L, 글리세린(glycerin) 10 내지 40g/L, K₂HPO₄ 10 내지 50g/L, KH₂PO₄ 3 내지 15g/L, NH₄NO₃ 1 내지 10g/L 및 MgSO₄ 0.5 내지 5g/L를 포함하고,
상기 발효 단계에서 사용하는 배지가 이스트 추출물(yeast extract) 0.5 내지 3g/L, 글리세린(glycerin) 1 내지 20g/L, K₂HPO₄ 10 내지 50g/L, KH₂PO₄ 3 내지 15g/L, NH₄NO₃ 1 내지 10g/L, MgSO₄ 0.5 내지 5g/L, 글루쿠로노락톤(glucuronolactone) 40 내지 200g/L 및 식물성 오일 50 내지 1000g/L을 포함하는 것인, 역미셀을 포함하는 경피 전달 시스템.
제2항에 있어서,
상기 종균배양 단계가 15 내지 30℃, 100 내지 500rpm, 0.5 내지 2vvm, 호기 조건으로 진행되고,
상기 발효 단계가 20 내지 35℃의 온도 및 50 내지 200rpm의 혼합 조건으로 진행되는 것인, 역미셀을 포함하는 경피 전달 시스템.
제2항에 있어서,
상기 종균발효 단계가 균의 지수생장 종말점 시점에서 종료하는 것인, 역미셀을 포함하는 경피 전달 시스템.
제2항에 있어서,
상기 식물성 오일이 해바라기씨, 포도씨, 카놀라, 쌀눈, 올리브, 대두, 아르간, 현미, 들깨, 참깨, 아몬드, 땅콩, 옥수수, 홍삼, 아보카도, 마카다미아, 코코넛, 로즈힙, 비타민나무씨, 시어나무열매, 기름야자, 베르가모트열매, 동백씨, 홍화씨, 살구씨, 양귀비씨, 달맞이꽃씨, 피마자씨, 녹차씨, 메도우폼씨, 아마씨 및 햄프씨로 이루어지는 군으로부터 추출된 것인, 역미셀을 포함하는 경피 전달 시스템.
제2항에 있어서,
상기 발효 단계 후 정제공정 단계를 더 포함할 수 있고,
상기 정제 단계가 발효물을 정치시켜 상층과 하층을 분리하여 하층을 폐 기하고, MgSO₄를 첨가하여 교반 후 원심분리하여 미생물 및 수분을 제거하는 단계 및,
친화크로마토그라피 컬럼에 규산마그네슘을 충진제로 사용하여 지방산 및 불순물이 제거된 오일을 회수하는 단계를 포함하는 것인, 역미셀을 포함하는 경피 전달 시스템.
제1항에 있어서,
상기 피부 활성물질이 비타민C, 비타민 B, 코직산, 이소플라본, 아미노산류, 펩타이드류, 아데노신, 단백질 분해효소 및 효소류, 알부틴, 히알루론산, 하이드로퀴논, 세라마이드, 코엔자임Q10, 테트라하이드로커큐미노이드, 안토시아닌, 콜라겐, 레티놀, 벌사상자추출물, 치자추출물, 강황추출물 및 병풀추출물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 것인, 역미셀을 포함하는 경피 전달 시스템.