WO2022059995A1 - 소수성 히알루론산을 제조하기 위한 발효방법 - Google Patents

소수성 히알루론산을 제조하기 위한 발효방법 Download PDF

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WO2022059995A1
WO2022059995A1 PCT/KR2021/012162 KR2021012162W WO2022059995A1 WO 2022059995 A1 WO2022059995 A1 WO 2022059995A1 KR 2021012162 W KR2021012162 W KR 2021012162W WO 2022059995 A1 WO2022059995 A1 WO 2022059995A1
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WO
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hyaluronic acid
hydrophobic
producing
exist
seed
Prior art date
Application number
PCT/KR2021/012162
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English (en)
French (fr)
Inventor
김광년
한현탁
손주현
조사랑
김나연
Original Assignee
주식회사 유나이티드엑티브
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor

Definitions

  • the present invention relates to a fermentation method for producing hyaluronic acid having hydrophobic properties.
  • the stratum corneum which is the outermost layer of the skin, is composed of a mass of dead keratinocytes, and is mainly composed of keratinocytes composed of protein, and has a structure in which lipids such as ceramide, cholesterol, and free fatty acid fill the spaces between the keratinocytes.
  • This lipid layer prevents the evaporation of moisture from the body, has a health function to protect the body against external invasion, and has an aesthetic function to make the skin look shiny and smooth.
  • hydrophobicity or a carrier combining hydrophilicity and hydrophobicity should be used. It is common to use
  • these micelles or liposomes have a limit in absorbing the active material through the lipid layer of the skin. This is because the stratum corneum, which is the outermost layer of the skin, is stacked with keratinocytes, and the structure between them is composed of lipid components.
  • hyaluronic acid is a linear polysaccharide composed of repeating disaccharide units in which N-acetyl-glucosamine and glucuronic acid are bonded by ⁇ -1,3-glucosidic bonds. It has high hydrophilicity and is easily combined with moisture and has excellent moisturizing effect, but has a limit in penetrating the skin.
  • hyaluronic acid can act as a lubricant in the body, such as joints and eyes, and can serve as a part of the extracellular matrix, it is necessary to control the degree of dissolution for various applications.
  • a hydrophobic group was bound by a chemical synthesis method.
  • a carboxyl group is bonded to hyaluronic acid through an esterification reaction, and organic compounds such as 2,4,6-trichlorobenzoic acid (TCBA) and alcohol are used.
  • TCBA 2,4,6-trichlorobenzoic acid
  • the present invention is to provide a method for producing hydrophobic hyaluronic acid using a microorganism.
  • Candida bombicola UA-06 (Accession No.: KCTC13855BP, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology) Seed culture step to activate microorganisms;
  • It provides a method for producing hydrophobic hyaluronic acid, wherein the medium of the fermentation step includes hyaluronic acid.
  • the separating may include adjusting the pH of the fermented emulsion to 1 to 5, and leaving the fermented emulsion to stand for 1 to 20 hours to separate the aqueous layer, the intermediate layer, and the oil layer, respectively.
  • the purifying step includes adding 80 to 100% (w/w) ethanol in 1 to 10 weight multiples to the fermented product and standing at 1 to 10° C. for 1 to 20 hours; and
  • It may include the steps of filtration, concentration and drying.
  • the purifying may include suspending the fermented product in water and adjusting the pH to 4 to 8;
  • It may include a step of filtration and drying.
  • the medium used in the seed culture step may include yeast extract, glycerin, K 2 HPO 4 , KH 2 PO 4 , NH 4 NO 3 and MgSO 4 .
  • the medium used in the fermentation step may include yeast extract, glycerin, K 2 HPO 4 , KH 2 PO 4 , NH 4 NO 3 , MgSO 4 , hyaluronic acid and vegetable oil.
  • the medium used in the seed culture step is yeast extract 5 to 30 g/L, glycerin 10 to 40 g/L, K 2 HPO 4 10 to 50 g/L, KH 2 PO 4 3 to 15 g/L, NH 4 NO 3 1 to 10 g/L and MgSO 4 0.5 to 5 g/L may be included.
  • the fermentation step is yeast extract 0.1 to 10 g / L, glycerin 1 to 40 g / L, K 2 HPO 4 10 to 50 g / L, KH 2 PO 4 3 to 15 g / L, NH 4 NO 3 1 To 10 g/L, MgSO 4 0.5 to 5 g/L, hyaluronic acid 0.01 to 20 g/L and vegetable oil 50 to 1000 g/L 0.1 to 10 g/L of the seed cultured microorganism in a medium containing 50 to 1000 g/L can
  • the seed culture step may include culturing for 40 to 100 hours at 15 to 30° C. at 100 to 500 rpm and 0.5 to 2 vvm, aerobic conditions.
  • the fermentation step may include mixing at a temperature of 20 to 35° C. at 50 to 200 rpm, and fermenting for 1 to 10 days.
  • the present invention can provide a method for preparing a composition with improved feeling of use by imparting hydrophobic properties to hyaluronic acid in a nature-friendly method to improve moisturizing power and reduce stickiness.
  • FIG. 3 is a photograph of a hydrophobic hyaluronic acid composition observed under a microscope.
  • Hyaluronic acid acts as a lubricant in the body and has potential effects in various fields, such as used for moisturizing the skin.
  • the present invention provides a method for producing hydrophobic hyaluronic acid by a nature-friendly method rather than a chemical synthesis method.
  • Candida bombicola UA-06 (Accession No.: KCTC13855BP, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology) Seed culture step to activate microorganisms;
  • It provides a method for producing hydrophobic hyaluronic acid, wherein the medium of the fermentation step includes hyaluronic acid.
  • the fermented emulsion in the separating step, is adjusted to pH 1 to 5, for example, pH 1 to 4, for example, pH 2 to 3, and 1 to 20 hours, for example 3 to 15 It may include the step of separating the aqueous layer, the intermediate layer and the oil layer by standing still for a period of time, for example, 6 to 12 hours.
  • the aqueous layer contains microorganisms and a medium
  • the intermediate layer contains a fermented product
  • the oil layer contains a fermented oil.
  • the purifying step is 80 to 100% (w / w), for example 90 to 98 (w / w) in 1 to 10 weight times, for example 1 to 5 weight times, in the fermented product adding ethanol and standing at 1 to 10° C., for example, 2 to 8° C., for 1 to 20 hours, for example, 3 to 15 hours, for example, 5 to 10 hours; and
  • It may include the steps of filtration, concentration and drying.
  • the purifying may include suspending the fermented product in water and adjusting the pH to 4 to 8, for example, to pH 5 to 7, for example, to pH 6 to 8; and
  • It may include a step of filtration and drying.
  • Water that can be used in the present invention may include distilled water, purified water, ultrapure water, etc., but is not particularly limited to the above description.
  • the filtration method applied to the purification step is not particularly limited as long as it is a general one, but may include, for example, filtration with 200 to 400 mesh.
  • the concentration step is not particularly limited as long as it is a general method of removing and drying ethanol, but, for example, a reduced pressure concentration method may be applied.
  • ethanol may be used by substituting one or more of the substances having a polarity of 5 to 6 or adding one or more of the substances, such as methanol and acetonitrile.
  • the drying step may be, for example, a freeze-drying method, but is not particularly limited as long as it is conventional.
  • the medium used in the seed culture step may include yeast extract, glycerin, K 2 HPO 4 , KH 2 PO 4 , NH 4 NO 3 and MgSO 4 .
  • the medium used in the fermentation step may include yeast extract, glycerin, K 2 HPO 4 , KH 2 PO 4 , NH 4 NO 3 , MgSO 4 , hyaluronic acid and vegetable oil.
  • the medium used in the seed culture step is yeast extract 5 to 30 g / L, for example 5 to 20 g / L, for example 5 to 15 g / L, glycerin 10 to 40 g / L, for example
  • 10 to 30 g/L for example 15 to 25 g/L
  • K 2 HPO 4 10 to 50 g/L for example 15 to 40 g/L
  • KH 2 PO 4 3 to 15 g/L for example 5-10 g/L
  • NH 4 NO 3 1-10 g/L for example 1-5 g/L
  • MgSO 4 0.5-5 g/L for example 1-3 g/L can do.
  • the medium used in the fermentation step is yeast extract 0.1 to 10 g / L, 0.5 to 3 g / L, for example 0.5 to 2 g / L, for example 0.5 to 1.5 g / L, glycerin 1 to 40 g / L, 10 to 40 g/L, for example 10 to 30 g/L, for example 15 to 25 g/L, K 2 HPO 4 10 to 50 g/L, for example 15 to 40 g/L, for example 20 to 30 g/L L, KH 2 PO 4 3 to 15 g/L, for example 5 to 10 g/L, NH 4 NO 3 1 to 10 g/L, for example 1 to 5 g/L, MgSO 4 0.5 to 5 g/L, for example For example 1-3 g/L, hyaluronic acid 0.01-20 g/L, 0.5-20 g/L, for example 1-10 g/L, for example 1-5 g/L and vegetable oil 50-1000 g/L, for example
  • the hyaluronic acid may include sodium hyaluronate.
  • the seed culture step is 20 to 40 °C, for example, 23 to 30 °C 100 to 500 rpm, for example 200 to 400 rpm and 0.5 to 2vvm, for example 0.5 to 1.5vvm, aerobic conditions It may include culturing for 40 to 100 hours, for example 50 to 80 hours, for example 50 to 70 hours.
  • the seed culture step may be terminated at the end point of exponential growth of the bacteria.
  • the exponential growth endpoint may be 40 to 120 hours, for example, 50 to 100 hours, for example, the seed culture may be terminated at a time point of 60 hours after culture.
  • 10,000 to 20,000 g, for example, 13,000 to 18,000 g, and 10 minutes to 1 hour, for example, centrifuging for 20 minutes to 40 minutes of the culture medium Separation may include the step of precipitating the cells.
  • the step of washing several times with a phosphate buffer to obtain the cells may be further included.
  • the fermentation step is 20 to 35 °C, for example, at a temperature of 20 to 30 °C 50 to 200 rpm, for example 80 to 150 rpm mixing, 1 to 10 days, for example 1 to 5 It may include a step of fermenting for days.
  • the vegetable oil is, for example, sunflower seed, grape seed, canola, rice bran, olive, soybean, argan, brown rice, perilla, sesame, almond, peanut, corn, red ginseng, avocado, macadamia, coconut, rosehip , vitamin tree seed, shea fruit, oil palm, bergamot fruit, camellia seed, safflower seed, apricot seed, poppy seed, evening primrose seed, castor seed, green tea seed, meadowfoam seed, flax seed and hemp seed It may include one or more, but is not limited to the above description, and any edible or human-friendly oil may be included in the scope of the present invention.
  • the hydrophobic hyaluronic acid formed according to the method as described above may have hydrophobic properties as a form in which a fat-soluble substance is bound to hyaluronic acid.
  • R may include various fatty acids which may be derived from vegetable oils.
  • it may include unsaturated and saturated fatty acids such as oleic acid, linoleic acid, eiconenoic acid, palmitic acid, stearic acid, and the like.
  • R may be a monoglyceride or diglyceride in which the fatty acids are randomly composed.
  • R may be a fat-soluble substance derived from vegetable oil in addition to the substances described above.
  • the hydrophobic hyaluronic acid to which the fat-soluble material is bound as in the above structure may have improved hydrophobic properties regardless of the molecular weight of the hyaluronic acid.
  • Candida bombicola UA 06 (Accession No.: KCTC13855BP, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology) was mixed with yeast extract 10 g/L, glycerin 20 g/L, K 2 HPO 4 25 g/L, Inoculated into a medium composed of KH 2 PO 4 7 g/L, NH 4 NO 3 3 g/L, MgSO 4 2 g/L and distilled water 933 g/L at 25°C, 300rpm, 1NL/min (1vvm) aerobic Cultivation was carried out under the conditions. The culture was terminated at 60 hours, the endpoint of exponential growth, by measuring absorbance at 600 nm with a spectrophotometer (Epoch2, BioTek). The culture medium was centrifuged (16,000 g, 30 minutes) to precipitate the cells and washed several times with a phosphate buffer to obtain the cells.
  • Each medium composed of the composition shown in Table 1 was mixed in a 5 L fermenter at 25° C. and 100 rpm. When the temperature of the medium was 25° C., 2.5 g/L of the cells was added, and fermentation was performed for 3 days to prepare a fermented emulsion. A photograph after completion of fermentation for Example 1 is shown in FIG. 1 .
  • Example 2 Example 3 yeast extract 1 g/L yeast extract 1 g/L yeast extract 1 g/L yeast extract 1 g/L Glycerin 20 g/L Glycerin 20 g/L Glycerin 20 g/L Glycerin 20 g/L K 2 HPO 4 25 g/L K 2 HPO 4 25 g/L K 2 HPO 4 25 g/L K 2 HPO 4 25 g/L KH 2 PO 4 7 g/L KH 2 PO 4 7 g/L KH 2 PO 4 7 g/L KH 2 PO 4 7 g/L KH 2 PO 4 7 g/L NH 4 NO 3 3 g/L NH 4 NO 3 3 g/L MgSO 4 2 g/L MgSO 4 2 g/L MgSO 4 2 g/L - Sodium Hyaluronate 3 g/L Sodium Hyaluronate 3 g/L Sodium Hyaluronate 3 g/L Sodium Hyaluronate 3 g/
  • the pH is adjusted to 2-3 with 1N HCl, and the fermented product is left standing for 8 hours to form an aqueous layer (microorganisms and medium) and an intermediate layer (fermented product) and The oil layer (oil) was separated to remove the water layer and the oil layer.
  • the fermented product was suspended in distilled water. Then, the pH was adjusted to 6 to 7 with 1N NaOH, and 95% (w/w) ethanol in 2 weights was added. After standing in refrigeration (4° C.) for 8 hours to precipitate the fermented product, the precipitate was filtered through a 300 mesh and turbid in purified water. All ethanol was evaporated using a rotary vacuum concentrator (EV-1001V, SciLab), and the powder was prepared by freeze-drying for 3-5 days.
  • a rotary vacuum concentrator EV-1001V, SciLab
  • a uronic acid detection test was performed using carbazole.
  • Carbazole reacts with uronic acid at high temperatures to form a reddish-purple compound.
  • 200 mg of the powder prepared according to Example 1 and 800 uL of 25 mM sodium tetraborate dissolved in concentrated sulfuric acid were mixed, heated at 100° C. for 10 minutes, and cooled to room temperature.
  • 200 uL of 0.125% carbazole dissolved in ethanol was added and reacted by heating at 100° C. for 10 minutes.
  • uronic acid was confirmed by measuring absorbance at 550 nm with a microplate reader (Epoch2, BioTek). The uronic acid detection results are shown in Table 2 below.
  • Hyaluronic acid has a structure of a polymer sugar chain in which glucuronic acid and N-acetylglucosamine are bonded, and carbazole reacts with this glucuronic acid to show a reddish purple color. Therefore, glucuronic acid constituting hyaluronic acid was detected in the fermented product that was not mixed with the aqueous layer, and finally hyaluronic acid with increased hydrophobicity was confirmed.
  • the composition was prepared as shown in Table 3 below and observed on the same day and the next day.
  • Comparative Examples 3 and 6 The preparation methods of Comparative Examples 3 and 6 are as follows. Raw materials 1 to 4 or 5 were mixed at 70° C. at 2,000 rpm using a homomixer in the main container. After mixing, raw material No. 6 heated to 70° C. was added, and homogenized at 2,000 rpm for 5 minutes.
  • Example 6 had higher turbidity than Comparative Example 3 on the same day, and on the next day, although the oil layer and the aqueous layer were separated in Comparative Example 3, Example 6 was observed to be stable.
  • the fermented product according to the present invention is a form in which hyaluronic acid and a fat-soluble substance are combined, and exhibits amphipathic properties due to increased hydrophobicity compared to conventional hyaluronic acid. Therefore, it can be understood that the amphiphilic properties of the fermented product in Example 6 increase the stability of the formulation by maintaining the micelles in the formulation at a stable and high density level.
  • each medium having the composition shown in Table 4 was mixed and prepared in a 5 L fermenter at 25° C. and 100 rpm. When the temperature of the medium was 25° C., 2.5 g/L of the cells was added, and fermentation was performed for 3 days to prepare a fermented emulsion.
  • the molecular weight range of low molecular weight hyaluronic acid is 10-100 KDa
  • the molecular weight range of medium molecular weight hyaluronic acid is 800-1200 kDa
  • the molecular weight range of high molecular weight hyaluronic acid is 1500-2000 kDa.
  • Example 7 Example 8
  • Example 9 Yeast extract 1 g/L Yeast extract 1 g/L Yeast extract 1 g/L Glycerin 20 g/L Glycerin 20 g/L Glycerin 20 g/L K 2 HPO 4 25 g/L K 2 HPO 4 25 g/L K 2 HPO 4 25 g/L KH 2 PO 4 7 g/L KH 2 PO 4 7 g/L KH 2 PO 4 7 g/L NH 4 NO 3 3 g/L NH 4 NO 3 3 g/L NH 4 NO 3 3 g/L MgSO 4 2 g/L MgSO 4 2 g/L MgSO 4 2 g/L Low Molecular Sodium Hyaluronate 3 g/L Medium Molecular Sodium Hyaluronate 3 g/L Polymer Sodium Hyaluronate 3 g/L Distilled water 439 g/L Distilled water 439 g/L Distilled water 439 g/L High
  • the intermediate layer (fermented product) was separated in the same manner as in Example 1.
  • the intermediate layer was suspended in distilled water to neutralize and the pH was adjusted to 6-7 with 1N NaOH. This was ultra-filtered (MWCO 10kDa) and freeze-dried for 3-5 days to prepare a powder.
  • the intermediate layer was suspended in distilled water to neutralize and the pH was adjusted to 6-7 with 1N NaOH.
  • Example 8 4 times volume of 95% ethanol, Example 9, 2 times volume of 95% ethanol was added and refrigerated (4° C.) for 8 hours to precipitate the fermented product.
  • the precipitate was filtered through a 300 mesh ethanol and turbid in purified water, and then all of the ethanol was evaporated using a rotary vacuum concentrator (EV-1001V, SciLab).
  • the fermented turbidity was freeze-dried for 3-5 days to prepare a powder.
  • Examples were prepared as shown in Table 5 below.
  • the preparation methods of Examples 10 to 12 are as follows. Raw materials No. 1 to 3 and hydrophobic hyaluronic acid for each molecular weight were mixed at 70° C. at 2,000 rpm using a homomixer in the main container. After mixing, raw material No. 7 heated to 70° C. was added, and homogenized for 5 minutes at 2,000 rpm.
  • the present invention it is possible to prepare an oil emulsion stabilizer or dispersion stabilizer having thickening by preparing hydrophobic hyaluronic acid.
  • the method for producing hydrophobic hyaluronic acid according to the present invention is a method using a natural product, not a chemical synthesis method, and is environmentally friendly and has low human toxicity.

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Abstract

본 발명은 미생물을 이용하여 히알루론산에 소수성 특성을 부여시킨 친환경적인 조성물을 제공한다. 또한, 히알루론산에 소수성을 부여하여 오일 분산안정화 특성의 유화안정제 또는 분산안정제 등으로 적용이 용이하며, 사용감 개선 및 피부 친밀도를 향상시켜 화장료 또는 피부 외용제 등으로 적용이 용이하다.

Description

소수성 히알루론산을 제조하기 위한 발효방법
본 발명은 소수성 특성을 가지는 히알루론산을 제조하기 위한 발효방법에 관한 것이다.
인간의 피부는 크게 표피와 진피, 피하지방으로 나누어지고 다시 표피는 각질층, 투명층, 과립층, 유극층, 기저층으로 세분화되어 있다. 피부의 최외각층인 각질층은 죽은 케라틴세포 덩어리로 이루어져 있으며, 주로 단백질로 이루어져 있는 각질 세포로 구성되고, 각질 세포 간의 사이를 세라마이드, 콜레스테롤, 유리지방산 등의 지질이 채우고 있는 구조를 가진다. 이 지질층은 체내 수분이 증발되는 것을 방지하며, 외부 침입에 대해 신체를 보호하는 건강학적 기능과 동시에, 피부를 윤택하고 매끄럽게 보이게 하는 심미적 기능을 가지고 있다. 피부에 유효 기능성 물질을 자연스럽게 통과시키기 위해서는 소수성 혹은, 친수성과 소수성이 결합된 담체를 이용해야 하며 특히, 수용성 활성물질을 피부에 전달하기 위해 미셀(micelle) 혹은 리포좀(liposome)과 같은 형태의 담체를 이용하는 것이 일반적이다.
그러나, 이러한 미셀 혹은 리포좀의 형태는 피부의 지질층을 통과시켜 활성물질을 흡수시키기에는 한계가 있다. 이는 피부의 최외각층인 각질층이 각질세포들로 쌓여있고, 그 사이사이는 지질성분으로 이루어진 구조이기 때문에 구조적으로 친수성의 물질보다는 소수성의 물질이 각질세포 사이로 투과하는 것이 용이하기 때문이다.
한편, 히알루론산은 N-아세틸-글루코사민과 글루쿠론산이 β-1,3-글루코시드 결합으로 결합된 반복적인 이당류 단위들로 이루어진 선형 다당류이다. 친수성이 높아 수분과 쉽게 결합하며, 보습작용이 뛰어나지만, 피부를 침투하는데에는 한계가 있다. 또한, 히알루론산은 관절, 눈 등 신체 내에서 윤활제로서 작용할 수 있고, 세포외 기질의 일부로서의 역할을 할 수 있으므로 다양한 활용을 위하여 용해 정도를 조절할 필요가 있다.
종래에는 히알루론산에 소수성 특성을 부여하기 위하여 화학적인 합성 방법으로 소수성 기를 결합시켰다. 예를 들면 에스테르화 반응을 통하여 히알루론산에 카르복시기를 결합하며, 2,4,6-트리클로로벤조산(TCBA), 알코올 등의 유기화합물을 사용한다.
그러므로, 본 발명에서는 미생물을 이용하여 소수성 히알루론산을 제조하기 위한 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 목적은 미생물을 이용하여 히알루론산에 소수성 특성을 부여하기 위한 방법을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은
Candida bombicola UA-06(기탁번호: KCTC13855BP, 한국생명공학연구원) 미생물을 활성화하는 종균배양 단계;
종균배양한 미생물 및 식물성 오일을 발효하여 발효유화물을 제조하는 발효 단계;
상기 발효유화물로부터 발효물을 분리하는 단계; 및
상기 발효물을 정제하는 단계를 포함하고,
상기 발효 단계의 배지가 히알루론산을 포함하는, 소수성 히알루론산의 제조방법을 제공한다.
일구현예에 따르면, 상기 분리하는 단계는 상기 발효유화물을 pH 1 내지 5로 조정하고, 1 내지 20시간 동안 정치하여 수층, 중간층 및 유층을 각각 분리하는 단계를 포함할 수 있다.
일구현예에 따르면, 상기 정제하는 단계는 상기 발효물에 1 내지 10중량배수로 80 내지 100%(w/w) 에탄올을 첨가하고 1 내지 10℃에서 1 내지 20시간 동안 정치하는 단계; 및
여과, 농축 및 건조하는 단계를 포함할 수 있다.
또는, 상기 정제하는 단계는 상기 발효물을 물에 현탁하고, pH를 4 내지 8로 조정하는 단계; 및
여과 및 건조하는 단계를 포함할 수 있다.
일구현예에 따르면, 상기 종균배양 단계에서 사용하는 배지는 이스트 추출물, 글리세린, K2HPO4, KH2PO4, NH4NO3 및 MgSO4를 포함할 수 있다.
일구현예에 따르면, 상기 발효 단계에서 사용하는 배지는 이스트 추출물, 글리세린, K2HPO4, KH2PO4, NH4NO3, MgSO4, 히알루론산 및 식물성 오일을 포함할 수 있다.
일구현예에 따르면, 상기 종균배양 단계에서 사용하는 배지는 이스트 추출물 5 내지 30g/L, 글리세린 10 내지 40g/L, K2HPO4 10 내지 50g/L, KH2PO4 3 내지 15g/L, NH4NO3 1 내지 10g/L 및 MgSO4 0.5 내지 5g/L를 포함할 수 있다.
일구현예에 따르면, 상기 발효 단계는 이스트 추출물 0.1 내지 10g/L, 글리세린 1 내지 40g/L, K2HPO4 10 내지 50g/L, KH2PO4 3 내지 15g/L, NH4NO3 1 내지 10g/L, MgSO4 0.5 내지 5g/L, 히알루론산 0.01 내지 20g/L 및 식물성 오일 50 내지 1000g/L을 포함하는 배지에 상기 종균배양한 미생물을 0.1 내지 10g/L 첨가하는 단계를 포함할 수 있다.
일구현예에 따르면, 상기 종균배양 단계는 15 내지 30℃에서 100 내지 500rpm 및 0.5 내지 2vvm, 호기 조건으로 40 내지 100시간 동안 배양하는 단계를 포함할 수 있다.
일구현예에 따르면, 상기 발효 단계는 20 내지 35℃의 온도에서 50 내지 200rpm으로 혼합하고, 1 내지 10일 동안 발효하는 단계를 포함할 수 있다.
기타 본 발명의 구현예들의 구체적인 사항은 이하의 상세한 설명에 포함되어 있다.
본 발명은 자연 친화적인 방법으로 히알루론산에 소수성 특성을 부여하여 보습력을 향상시키고, 끈적임을 감소시켜 사용감이 개선된 조성물을 제조하는 방법을 제공할 수 있다.
도 1은 발효 종료 후의 사진이다.
도 2는 소수성 히알루론산 조성물을 육안으로 관찰한 사진이다.
도 3은 소수성 히알루론산 조성물을 현미경으로 관찰한 사진이다.
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예를 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
히알루론산은 체내에서 윤활제 등의 역할을 하며, 피부 보습에 사용하는 등 다양한 분야에서 잠재적 효과를 가진다. 그러나, 높은 친수성 특성에 의하여 그 활용도가 제한된다는 단점이 있다. 종래에는 이러한 단점을 극복하기 위하여 화학적인 합성법으로 예를 들면 에스테르화 반응을 유도하여 지용성 특성을 가지는 히알루론산을 제조하는 방법이 있다.
본 발명에서는 화학적인 합성법이 아닌, 자연 친화적인 방법으로 소수성 히알루론산을 제조하는 방법을 제공한다.
구체적으로 본 발명은,
Candida bombicola UA-06(기탁번호: KCTC13855BP, 한국생명공학연구원) 미생물을 활성화하는 종균배양 단계;
종균배양한 미생물 및 식물성 오일을 발효하여 발효유화물을 제조하는 발효 단계;
상기 발효유화물로부터 발효물을 분리하는 단계; 및
상기 발효물을 정제하는 단계를 포함하고,
상기 발효 단계의 배지가 히알루론산을 포함하는, 소수성 히알루론산의 제조방법을 제공한다.
일구현예에 따르면, 상기 분리하는 단계는 상기 발효유화물을 pH 1 내지 5, 예를 들면 pH 1 내지 4, 예를 들면 pH 2 내지 3으로 조정하고, 1 내지 20시간, 예를 들면 3 내지 15시간, 예를 들면 6 내지 12시간 동안 정치하여 수층, 중간층 및 유층을 분리하는 단계를 포함할 수 있다. 이 때, 상기 수층은 미생물 및 배지를 포함하고, 상기 중간층은 발효물을 포함하고, 상기 유층은 발효오일을 포함한다.
일구현예에 따르면, 상기 정제하는 단계는 상기 발효물에 1 내지 10중량배수, 예를 들면 1 내지 5중량배수로 80 내지 100%(w/w), 예를 들면 90 내지 98(w/w) 에탄올을 첨가하고, 1 내지 10℃, 예를 들면 2 내지 8℃에서 1 내지 20시간, 예를 들면 3 내지 15시간, 예를 들면 5 내지 10시간 동안 정치하는 단계; 및
여과, 농축 및 건조하는 단계를 포함할 수 있다.
또는, 상기 정제하는 단계는 상기 발효물을 물에 현탁하고, pH를 4 내지 8, 예를 들면 pH 5 내지 7, 예를 들면 pH 6 내지 8로 조정하는 단계; 및
여과 및 건조하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에 사용할 수 있는 물은 증류수, 정제수, 초순수 등을 포함할 수 있으나, 상기한 기재에 특별히 한정되지는 않는다.
정제단계에 적용되는 여과 방법으로는 일반적인 것이라면 크게 제한되지는 않으나, 예를 들면 200 내지 400메쉬(mesh)로 여과하는 단계를 포함할 수 있다.
또한, 농축 단계는 일반적인 에탄올의 제거 및 건조 방법이라면 크게 제한되지는 않으나, 예를 들면 감압농축법을 적용할 수 있다. 예를 들면, 에탄올은 메탄올(methanol), 아세토니트릴(acetonitrile)과 같이 극성도(polarity)가 5 내지 6인 물질 중 하나 이상으로 대체 또는 상기 물질 중 하나 이상을 추가하여 사용할 수 있다.
건조단계는 예를 들면 동결건조법을 적용할 수 있으나, 통상적인 것이라면 특별히 제한되지 않는다.
일구현예에 따르면, 상기 종균배양 단계에서 사용하는 배지는 이스트 추출물, 글리세린, K2HPO4, KH2PO4, NH4NO3 및 MgSO4를 포함할 수 있다.
또한, 상기 발효 단계에서 사용하는 배지는 이스트 추출물, 글리세린, K2HPO4, KH2PO4, NH4NO3, MgSO4, 히알루론산 및 식물성 오일을 포함할 수 있다.
구체적으로 예를 들면, 상기 종균배양 단계에서 사용하는 배지는 이스트 추출물 5 내지 30g/L, 예를 들면 5 내지 20g/L, 예를 들면 5 내지 15g/L, 글리세린 10 내지 40g/L, 예를 들면 10 내지 30g/L, 예를 들면 15 내지 25g/L, K2HPO4 10 내지 50g/L, 예를 들면 15 내지 40g/L, 예를 들면 20 내지 30g/L, KH2PO4 3 내지 15g/L, 예를 들면 5 내지 10g/L, NH4NO3 1 내지 10g/L, 예를 들면 1 내지 5g/L 및 MgSO4 0.5 내지 5g/L, 예를 들면 1 내지 3g/L를 포함할 수 있다.
또한, 상기 발효 단계에서 사용하는 배지는 이스트 추출물 0.1 내지 10g/L, 0.5 내지 3g/L, 예를 들면 0.5 내지 2g/L, 예를 들면 0.5 내지 1.5g/L, 글리세린 1 내지 40g/L, 10 내지 40g/L, 예를 들면 10 내지 30g/L, 예를 들면 15 내지 25g/L, K2HPO4 10 내지 50g/L, 예를 들면 15 내지 40g/L, 예를 들면 20 내지 30g/L, KH2PO4 3 내지 15g/L, 예를 들면 5 내지 10g/L, NH4NO3 1 내지 10g/L, 예를 들면 1 내지 5g/L, MgSO4 0.5 내지 5g/L, 예를 들면 1 내지 3g/L, 히알루론산 0.01 내지 20g/L, 0.5 내지 20g/L, 예를 들면 1 내지 10g/L, 예를 들면 1 내지 5g/L 및 식물성 오일 50 내지 1000g/L, 예를 들면 100 내지 800g/L, 예를 들면 300 내지 700g/L를 포함하는 배지에 상기 종균배양한 미생물을 0.1 내지 10g/L, 예를 들면 1 내지 5g/L, 예를 들면 2 내지 3g/L 첨가하는 단계를 포함할 수 있다.
일구현예에 따르면, 상기 히알루론산은 소듐히알루로네이트(sodium hyaluronate)를 포함할 수 있다.
일구현예에 따르면, 상기 종균배양 단계는 20 내지 40℃, 예를 들면 23 내지 30℃에서 100 내지 500rpm, 예를 들면 200 내지 400rpm 및 0.5 내지 2vvm, 예를 들면 0.5 내지 1.5vvm, 호기 조건으로 40 내지 100시간, 예를 들면 50 내지 80시간, 예를 들면 50 내지 70시간 동안 배양하는 단계를 포함할 수 있다.
또한, 상기 종균배양 단계는 균의 지수생장 종말점 시점에서 종료할 수 있다. 구체적으로 상기 지수생장 종말점은 40 내지 120시간일 수 있으며, 예를 들면 50 내지 100시간, 예를 들면 배양 후 60시간이 되는 시점에서 종균배양을 종료할 수 있다.
일구현예에 따르면, 상기 종균배양 단계는 배양 종료 후, 배양을 완료한 배양액을 10,000 내지 20,000g, 예를 들면 13,000 내지 18,000g 및 10분 내지 1시간, 예를 들면 20분 내지 40분 동안 원심분리하여 균체를 침전시키는 단계를 포함할 수 있다.
또한, 균체 침전 후 예를 들면 인산 버퍼로 수 회세척하여 균체를 수득하는 단계를 더 포함할 수 있다.
일구현예에 따르면, 상기 발효 단계는 20 내지 35℃, 예를 들면 20 내지 30℃의 온도에서 50 내지 200rpm, 예를 들면 80 내지 150rpm으로 혼합하고, 1 내지 10일, 예를 들면 1 내지 5일 동안 발효하는 단계를 포함할 수 있다.
일구현예에 따르면, 상기 식물성 오일은 예를 들면, 해바라기씨, 포도씨, 카놀라, 쌀눈, 올리브, 대두, 아르간, 현미, 들깨, 참깨, 아몬드, 땅콩, 옥수수, 홍삼, 아보카도, 마카다미아, 코코넛, 로즈힙, 비타민나무씨, 시어나무열매, 기름야자, 베르가모트열매, 동백씨, 홍화씨, 살구씨, 양귀비씨, 달맞이꽃씨, 피마자씨, 녹차씨, 메도우폼씨, 아마씨 및 햄프씨 등으로 이루어지는 군으로부터 추출된 하나 이상을 포함할 수 있으나, 상기한 기재에 제한되지는 않으며, 식용 또는 인체 친화적인 오일이라면 본 발명의 범위에 포함할 수 있다.
일구현예에 따르면, 상기한 바와 같은 방법에 따라 형성되는 소수성 히알루론산은 히알루론산에 지용성 물질이 결합된 형태로서 소수성 특정을 가질 수 있다.
본 발명에 따른 소수성 히알루론산의 예측되는 구조는 화학식 1과 같다.
Figure PCTKR2021012162-appb-img-000001
R은 식물성 오일로부터 유래할 수 있는 다양한 지방산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 올레익애씨드, 리놀레익애씨드, 에이코네노익애씨드, 팔미틱애씨드, 스테아릭애씨드 등의 불포화 및 포화 지방산을 포함할 수 있다.
또한, R은 상기 지방산이 무작위로 구성된 모노글리세라이드 또는 다이글리세라이드일 수 있다.
또한, R은 상기 기재한 물질 외에 식물성 오일로부터 유래하는 지용성 물질일 수 있다.
상기 구조와 같이 지용성 물질이 결합된 소수성 히알루론산은 히알루론산의 분자량과 관계없이 소수성 특성이 향상될 수 있다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
실시예 1 내지 3 및 비교예 1
종균배양
균체를 수득하기 위하여 Candida bombicola UA 06(기탁번호: KCTC13855BP, 한국생명공학연구원)을 이스트 추출물(yeast extract) 10 g/L, 글리세린(glycerin) 20 g/L, K2HPO4 25 g/L, KH2PO4 7 g/L, NH4NO3 3 g/L, MgSO4 2 g/L 및 증류수 933 g/L로 구성된 배지에 접종하여 25℃, 300rpm, 1NL/min (1vvm)의 호기적인 조건에서 배양을 진행하였다. 배양은 분광광도계(Epoch2, BioTek)로 600nm에서 흡광도를 측정하여 균의 지수생장 종말점인 60시간 시점에서 종료하였다. 배양액을 원심분리(16,000g, 30분)하여 균체를 침전시키고 인산 버퍼로 수 회 세척하여 균체를 수득하였다.
발효
표 1과 같은 조성으로 구성된 각각의 배지를 5 L 발효조에 25℃, 100rpm 조건으로 혼합 제조하였다. 상기 배지의 온도가 25℃일 때, 상기 균체 2.5 g/L를 투입하고, 3일 동안 발효를 진행하여 발효유화물을 제조하였다. 실시예 1에 대한 발효 종료 후의 사진을 도 1에 나타내었다.
비교예 1 실시예 1 실시예 2 실시예 3
Yeast extract
1 g/L		 Yeast extract
1 g/L		 Yeast extract
1 g/L		 Yeast extract
1 g/L
Glycerin 20 g/L Glycerin 20 g/L Glycerin 20 g/L Glycerin 20 g/L
K2HPO4 25 g/L K2HPO4 25 g/L K2HPO4 25 g/L K2HPO4 25 g/L
KH2PO4 7 g/L KH2PO4 7 g/L KH2PO4 7 g/L KH2PO4 7 g/L
NH4NO3 3 g/L NH4NO3 3 g/L NH4NO3 3 g/L NH4NO3 3 g/L
MgSO4 2 g/L MgSO4 2 g/L MgSO4 2 g/L MgSO4 2 g/L
- 소듐히알루로네이트
3 g/L		 소듐 히알루로네이트
3 g/L		 소듐 히알루로네이트
3 g/L
증류수 442 g/L 증류수 439 g/L 증류수 439 g/L 증류수 439 g/L
고올레인산 해바라기씨 오일 500 g/L 고올레인산 해바라기씨 오일 500 g/L 포도씨 오일 500 g/L 카놀라 오일 500 g/L
분리
상기 발효유화물에 잔존하는 균체의 활성을 90℃고온으로 상실시킨 후, 1N HCl로 pH를 2 내지 3으로 조정하고, 발효물을 8시간 정치하여 수층(미생물 및 배지)과 중간층(발효물) 및 유층(오일)을 분리하여 수층과 유층을 제거하였다.
발효물 정제
중간층의 발효물로부터 소수성 히알루론산을 수득하기 위하여 발효물을 증류수에 현탁하였다. 그 후, 1N NaOH로 pH를 6 내지 7로 조정하고, 2중량배수의 95%(w/w) 에탄올을 첨가하였다. 8시간 냉장(4℃) 정치하여 발효물을 침전한 후, 침전물을 300메쉬로 여과하여 정제수에 혼탁시켰다. 회전감압농축기(EV-1001V, SciLab)를 이용하여 에탄올을 모두 증발시키고, 3~5일간 동결건조하여 분말을 제조하였다.
실험예 1: 소수성 히알루론산 검출
발효물의 소수성 히알루론산을 확인하기 위해 카바졸(carbazole)을 이용하여 우론산(uronic acid) 검출 시험을 진행하였다. 카바졸은 고온에서 우론산과 반응하여 적자색 화합물을 생성한다. 유리 시험관에서 실시예 1에 따라 제조된 분말 200mg과 농황산에 용해한 25 mM sodium tetraborate 800 uL를 혼합하여 100℃에서 10분간 가열하고 상온으로 식혔다. 에탄올에 용해한 0.125% 카바졸 200 uL를 첨가하고 100℃에서 10분간 가열하여 반응시켰다. 상온으로 식힌 후, microplate reader (Epoch2, BioTek)로 550nm에서 흡광도를 측정하여 우론산을 확인하였다. 우론산 검출 결과는 하기 표 2에 나타내었다.
구 분 비교예 1 실시예 1
검출여부 - ++
측정 결과, 실시예 1에서 분리한 발효물에서 우론산이 검출되었다. 히알루론산은 글루쿠론산과 N-아세틸글루코사민이 결합된 고분자 당 사슬의 구조로 이루어져 있는데, 카바졸은 이 글루쿠론산과 반응하여 적자색을 나타낸다. 따라서, 수층과 혼합되지 않는 형태로 존재하는 발효물에서 히알루론산을 구성하고 있는 글루쿠론산을 검출하여 최종적으로 소수성이 증가된 히알루론산을 확인하였다.
실험예 2: 물성 관찰
조성물의 물성 변화를 관찰하기 위해 하기 표 3의 조성과 같이 조성물을 제조하여 당일 및 익일 관찰하였다.
비교예 3 및 실시예 6의 제조방법은 다음과 같다. 1 내지 4 또는 5번 원료를 메인용기에서 호모믹서를 이용하여 70℃에서 2,000rpm으로 혼합하였다. 혼합 후에 70℃로 가온한 6번 원료를 투입하여 2,000rpm으로 5분간 균질화하여 제조하였다.
구분 원료 비교예 3 (%) 실시예 6 (%)
1 증류수 82 82
2 부틸렌글라이콜 10 10
3 헥산다이올 2 2
4 실시예1 - 1
5 소듐 히알루로네이트 1 -
6 마카다미아 씨드 오일 5 5
합 계 100 100
조성물의 물성을 관찰한 결과, 도 2와 같이 당일에 실시예 6이 비교예 3보다 탁도가 더 높았고, 익일째에는 비교예 3에서 유층과 수층이 분리되었지만 실시예 6은 안정적인 것으로 관찰되었다.
또한, 도 3과 같이 실시예 6에서 마이셀의 밀집도가 비교예 3보다 더 높아 탁도가 증가한 것으로 확인되었다.
본 발명에 따른 발효물은 히알루론산과 지용성 물질이 결합된 형태로서 기존의 히알루론산보다 소수성이 증가하여 양친매성을 나타낸다. 따라서, 실시예 6에서 발효물의 양친매적 특성이 제형 내 마이셀을 안정적이면서 높은 밀집도 수준으로 유지하여 제형의 안정도를 증가시키는 것으로 이해할 수 있다.
실시예 7 내지 9: 분자량별 소수성 히알루론산 제조
종균배양
실시예 1과 동일한 방법으로 미생물을 활성화하여 균체를 수득하였다.
발효
분자량별 히알루론산에 지용성 물질을 결합하기 위하여, 표 4와 같은 조성으로 구성된 각각의 배지를 5 L 발효조에 25℃, 100rpm 조건으로 혼합 제조하였다. 상기 배지의 온도가 25℃일 때, 상기 균체 2.5 g/L를 투입하고, 3일 동안 발효를 진행하여 발효유화물을 제조하였다. 저분자 히알루론산의 분자량 범위는 10~100KDa, 중분자 히알루론산의 분자량 범위는 800~1200kDa, 고분자 히알루론산의 분자량 범위는 1500~2000kDa이다.
실시예 7 실시예 8 실시예 9
Yeast extract 1 g/L Yeast extract 1 g/L Yeast extract 1 g/L
Glycerin 20 g/L Glycerin 20 g/L Glycerin 20 g/L
K2HPO4 25 g/L K2HPO4 25 g/L K2HPO4 25 g/L
KH2PO4 7 g/L KH2PO4 7 g/L KH2PO4 7 g/L
NH4NO3 3 g/L NH4NO3 3 g/L NH4NO3 3 g/L
MgSO4 2 g/L MgSO4 2 g/L MgSO4 2 g/L
저분자 소듐 히알루로네이트
3 g/L		 중분자 소듐 히알루로네이트
3 g/L		 고분자 소듐 히알루로네이트
3 g/L
증류수 439 g/L 증류수 439 g/L 증류수 439 g/L
고올레인산 해바라기씨오일
500 g/L		 고올레인산 해바라기씨오일
500 g/L		 고올레인산 해바라기씨오일
500 g/L
분리
실시예 1과 동일한 방법으로 중간층(발효물)을 분리하였다.
발효물 정제
1) 실시예 7
중간층을 중화하기 위하여 증류수에 현탁하고 1N NaOH로 pH를 6 내지 7로 조정하였다. 이를 한외여과(MWCO 10kDa)하고 3~5일간 동결건조하여 분말을 제조하였다.
2) 실시예 8 및 9
중간층을 중화하기 위하여 증류수에 현탁하고 1N NaOH로 pH를 6 내지 7로 조정하였다. 실시예 8은 4배 용량의 95% 에탄올, 실시예 9는 2배 용량의 95% 에탄올을 첨가하고 8시간 냉장(4℃) 정치하여 발효물을 침전시켰다. 침전물은 300 메쉬로 에탄올을 여과하고 정제수에 혼탁시킨 후 회전감압농축기(EV-1001V, SciLab)를 이용하여 에탄올을 모두 증발시켰다. 발효물 혼탁액은 3~5일간 동결건조하여 분말로 제조하였다.
실시예 10 내지 12 제조
발효물의 분자량별 제형안정도를 평가하기 위해 하기 표 5와 같이 실시예를 제조하였다. 실시예 10 내지 12의 제조방법은 다음과 같다. 1 내지 3번 원료와 각 분자량별 소수성 히알루론산을 메인용기에서 호모믹서를 이용하여 70℃에서 2,000rpm으로 혼합하였다. 혼합 후에 70℃로 가온한 7번 원료를 투입하여 2,000rpm으로 5분간 균질화하여 제조하였다.
구분 원료 실시예 10 (%) 실시예 11 (%) 실시예 12 (%)
1 증류수 82 82 82
2 부틸렌글라이콜 10 10 10
3 헥산다이올 2 2 2
4 실시예 7 1 - -
5 실시예 8 - 1 -
6 실시예 9 - - 1
7 마카다미아 씨드 오일 5 5 5
합 계 100 100 100
실험예 3: 안정도 평가
실시예 10 내지 12에 따른 제형의 안정도를 평가하기 위하여, -5℃, 순환 (-5~50℃), 50℃의 온도조건에서 1일, 1개월, 3개월의 시간 동안 제형을 보관한 후 육안관찰하였다. 순환 (-5~50℃) 온도조건은 12시간 동안 변화하는 것을 한 사이클로 설정하였다. 안정도 결과는 하기 표 8에 나타내었다.
온도
시간 구분 -5℃ -5~50℃ 50℃
실시예 10 1일 분리 없음 없음 없음
침전 없음 없음 없음
1개월 분리 없음 없음 없음
침전 없음 없음 없음
3개월 분리 없음 없음 없음
침전 없음 없음 없음
실시예 11 1일 분리 없음 없음 없음
침전 없음 없음 없음
1개월 분리 없음 없음 없음
침전 없음 없음 없음
3개월 분리 없음 없음 없음
침전 없음 없음 없음
실시예 12 1일 분리 없음 없음 없음
침전 없음 없음 없음
1개월 분리 없음 없음 없음
침전 없음 없음 없음
3개월 분리 없음 없음 없음
침전 없음 없음 없음
실시예 10 내지 12의 안정도를 3개월간 관찰한 결과, 모든 온도 조건에서 제형의 변형이 관찰되지 않았다.
상기와 같은 결과로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따르면 소수성 히알루론산을 제조함으로써 점증을 가지는 오일 유화안정제 또는 분산안정제를 제조할 수 있다. 또한, 본 발명에 따르면, 히알루론산에 소수성 특성을 부여하여 피부 침투력 및 유화안정성을 향상시키고, 피부 보습, 탄력, 피부장벽 개선 효능을 극대화할 수 있다. 더하여, 본 발명에 따른 소수성 히알루론산 제조방법은 화학적인 합성법이 아닌, 천연물을 사용한 방법으로, 자연친화적이고, 인체 독성이 낮다.
이상의 설명은 본 발명의 기술 사상을 예시적으로 설명한 것에 불과한 것으로서, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 다양한 수정 및 변형이 가능하다. 또한, 본 발명에 개시된 실시 예들은 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시 예에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 보호 범위는 아래의 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.
[미생물기탁증]
Figure PCTKR2021012162-appb-img-000002

Claims (10)

  1. Candida bombicola UA-06(기탁번호: KCTC13855BP, 한국생명공학연구원) 미생물을 활성화하는 종균배양 단계;
    종균배양한 미생물 및 식물성 오일을 발효하여 발효유화물을 제조하는 발효 단계;
    상기 발효유화물로부터 발효물을 분리하는 단계; 및
    상기 발효물을 정제하는 단계를 포함하고,
    상기 발효 단계의 배지가 히알루론산을 포함하는, 소수성 히알루론산의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 분리하는 단계가 상기 발효유화물을 pH 1 내지 5로 조정하고, 1 내지 20시간 동안 정치하여 수층, 중간층 및 유층을 각각 분리하는 단계를 포함하는 것인, 소수성 히알루론산의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 정제하는 단계가 상기 발효물에 1 내지 10중량배수로 80 내지 100%(w/w) 에탄올을 첨가하고 1 내지 10℃에서 1 내지 20시간 동안 정치하는 단계; 및
    여과, 농축 및 건조하는 단계를 포함하는 것인, 소수성 히알루론산의 제조방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 정제하는 단계가 상기 발효물을 물에 현탁하고, pH를 4 내지 8로 조정하는 단계; 및
    여과 및 건조하는 단계를 포함하는 것인, 소수성 히알루론산의 제조방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 종균배양 단계에서 사용하는 배지가 이스트 추출물, 글리세린, K2HPO4, KH2PO4, NH4NO3 및 MgSO4를 포함하는 것인, 소수성 히알루론산의 제조방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 발효 단계에서 사용하는 배지가 이스트 추출물, 글리세린, K2HPO4, KH2PO4, NH4NO3, MgSO4, 히알루론산 및 식물성 오일을 포함하는 것인, 소수성 히알루론산의 제조방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 종균배양 단계에서 사용하는 배지가 이스트 추출물 5 내지 30g/L, 글리세린 10 내지 40g/L, K2HPO4 10 내지 50g/L, KH2PO4 3 내지 15g/L, NH4NO3 1 내지 10g/L 및 MgSO4 0.5 내지 5g/L를 포함하는 것인, 소수성 히알루론산의 제조방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 발효 단계가 이스트 추출물 0.1 내지 10g/L, 글리세린 1 내지 40g/L, K2HPO4 10 내지 50g/L, KH2PO4 3 내지 15g/L, NH4NO3 1 내지 10g/L, MgSO4 0.5 내지 5g/L, 히알루론산 0.01 내지 20g/L 및 식물성 오일 50 내지 1000g/L을 포함하는 배지에 상기 종균배양한 미생물을 0.1 내지 10g/L 첨가하는 단계를 포함하는 것인, 소수성 히알루론산의 제조방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 종균배양 단계가 15 내지 30℃에서 100 내지 500rpm 및 0.5 내지 2vvm, 호기 조건으로 40 내지 100시간 동안 배양하는 단계를 포함하는 것인, 소수성 히알루론산의 제조방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 발효 단계가 20 내지 35℃의 온도에서 50 내지 200rpm으로 혼합하고, 1 내지 10일 동안 발효하는 단계를 포함하는 것인, 소수성 히알루론산의 제조방법.
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