KR20200044374A

KR20200044374A - 바랭이 꽃 앱솔루트를 포함하는 피부 재생 및 상처 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20200044374A
Application number: KR1020180125037A
Authority: KR
Inventors: 이환명; 박수민; 황대일; 김하빈; 김도윤; 최인호; 리야리
Original assignee: 호서대학교 산학협력단
Priority date: 2018-10-19
Filing date: 2018-10-19
Publication date: 2020-04-29
Also published as: KR102109274B1

Abstract

본 발명은 바랭이 꽃으로부터 추출된 앱솔루트를 포함하는 피부재생용 조성물 및 화장료에 관한 것으로, 상기 앱솔루트는 피부세포 수준에서 세포 증식과 이동 및 콜라겐 합성 유도효과를 통하여 우수한 피부 재생, 피부 탄력 증진 및 상처 치유 효과를 제공한다.

Description

바랭이 꽃 앱솔루트를 포함하는 피부 재생 및 상처 치료용 조성물{COMPOSITION FOR SKIN REGENERATION AND WOUND HEALING CONTAINING ABSOLUTE OF DIGITARIA SANGUINALIS FLOWER}

본 발명은 바랭이 꽃(Digitaria sanguinalis)으로부터 추출된 앱솔루트를 유효성분으로 포함하는 피부 재생 및 상처 치료용 조성물 및 이의 화장료 및 피부 외용제 용도에 대한 것이다.

피부는 크게 3개의 층(표피, 진피, 피하지방)으로 구성되어 있으며 외부의 유해한 자극으로 부터 몸을 보호하고, 수분을 유지하며 감각기능을 수행하고 체온을 조절하는 등 다양한 기능을 하는 기관이다. 표피층은 피부의 가장 바깥층에 위치하며 대부분이 각징형성세포로 이루어져 있다. 진피층은 여러 세포외기질 등으로 구성되어 있으며 그 중 콜라겐은 α-chain에 따라 20종 이상이 있으며, 사람의 피부에는 type I, III, IV, V, VI 및 VII 형 콜라겐이 분포하고 있다. 주로 type I 콜라겐은 피부 진피층의 85% 이상을 구성하고, type IV 콜라겐은 기저막(basement membrane)의 주요 구조 단백질로서, type I 및 IV 콜라겐의 합성은 피부의 탄력을 증진시키고, 기저막 형성을 향상시켜 피부 세포들의 부착과 증식이 조절되고, 유해물질을 선택적으로 투과하는 장벽기능의 향상과 표피와 진피의 상호작용 등을 제공하는 것으로 알려졌다. 이로 인해, 피부 진피세포의 이동과 증식, 그리고 콜라겐 합성의 유도는 피부 재생과 상처치유 뿐만 아니라 피부 탄력을 증진시키고 건강한 피부가 유지되도록 도와준다.

현대 사회에 생활수준의 향상과 소비자들의 인식 변화 등으로 기존에 사용되어온 합성향료가 인체에 대한 높은 독성과 호르몬 교란 등의 문제가 인식되면서 천연 향료가 다시금 주목을 받고 있다. 특히 천연 향료는 향기뿐만 아니라 항균 및 항염 작용과 아로마 테라피 효과까지 알려지면서 천연물 유래 천연 향료에 대한 연구가 더욱 중요해지고 있다. 천연 향료(香料)는 추출물, 추출법, 용도 및 목적에 따라 다양하게 분류되며, 식물 유래 천연향료는 추출법에 따라 에센셜 오일(essential oil), 엡솔루트(absolute), 콘크리트(concrete) 등으로 분류된다. 식물 유래 천연 향료는 식물의 2차 대사 산물 중 인체에 약리효과를 나타내는 휘발성 화학물질로, 주로 테르펜, 알코올, 알데하이드, 에스테르, 케톤 등의 여러가지 유기화합물로 구성되어 있다. 이러한 천연 향료의 방향성 성분이 피부, 순환계, 후각계를 통해 스트레스 해소, 피로 회복, 근육 이완 등의 효과를 나타낼 뿐만 아니라 항균작용, 면역 증진, 항알러지 작용 등의 치료효과를 나타내어 오래전부터 질병의 치료와 예방에 활용되어왔을 뿐만 아니라, 식품 향료와 향장품 원료로 사용되고 있다. 최근에 들어 환경오염과 오존층 파괴와 같은 지구 환경의 변화와 스트레스로 인해 피부 건강이 위협을 받고 있는 현대인들에게 부작용을 일으키지 않는 천연 소재가 주목을 받으면서, 천연물 유래 기능성 소재 개발 관련 연구가 요구되고 있다.

바랭이(Digitaria sanguinalis)는 벼과 (Gramineae)에 속하는 한해살이 초본으로 말에게 먹이면 말은 사탕을 먹는 것처럼 좋아한다고 하여 마당으로도 불려진다. 7~8월경에 연한 녹색 또는 자주색 꽃이 핀다. 높이는 40~70 cm이고 잎은 선상피침형이며 줄기의 마디에서 뿌리가 난다. 예로부터 물을 넣고 달여서 복용하면 눈과 귀를 맑아지게 하고 소화력이 증진된다고 알려져있다. 최근 생리활성에 관한 연구는 알팔파(Alfalfa)식물에 대한 타감작용(allelopathy)이 보고되었다.

한국공개특허 제10-2011-0036317호

상기와 같은 문제를 해소하기 위해, 본 발명은 바랭이 꽃에서 앱솔루트를 추출하여 이의 구성 성분을 규명하고, 이의 피부 탄력증진, 피부재생 및 상처 치유 효능을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 바랭이(Digitaria sanguinalis) 꽃으로부터 추출된 앱솔루트를 유효성분으로 포함하는 피부 재생 및 상처 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 앱솔루트는 휘발성 용제를 이용하여 유기용매 추출법에 의해 추출될 수 있으며, 유기용매 추출법에 의해 추출된 콘크리트를 알코올로 추출하여 불용성 왁스를 제거한 앱솔루트일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 앱솔루트는 휘발성 유기 화합물을 포함하며, 예를 들어, 리놀렌산 (Linolenic acid), 시토스테논(Sitostenone), 사이클로옥타코산(Cyclooctacosane), 헥사데카노익산(Hexadecanoic acid), 스티그마스테롤(Stigmasterol), 멀티플로라-7,9(11)-dien-3β-ol(Multiflora-7,9(11)-dien-3β-ol), 펜타코산(Pentacosane), 메틸레네비스(Phenol, 2,2'-methylenebis[6-(1,1-dimethylethyl)-4-methyl-), 스테아르산(Octadecanoic acid), 캄페스테롤(Campesterol), 헵타코산(Heptacosane), 노나데칸(Nonadecane), 스쿠알렌(Squalene), 옥타코산(Octacosane), 1-도코센(1-Docosene), 1-노나데센(1-Nonadecene), 아이코산(Eicosane), 자이카인(Xycaine), 라노스테롤(Lanosterol)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 휘발성 유기 화합물을 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 앱솔루트는 0.1~100 μg/mL의 범위로 포함될 수 있으며, 예를 들어 1~50 μg/mL의 범위로 포함될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 앱솔루트는 표피 각질형성세포 및 진피세포의 증식 및 이동을 유도할 수 있다. 구체적으로, 상기 앱솔루트는 인체피부 유래 각질형성세포주(HaCat) 및 인체피부 유래 진피세포(CCD986skt)의 증식과 이동 및 콜라겐 합성을 유도할 수 있다.

또한, 본 발명은 바랭이 꽃으로부터 추출한 앱솔루트를 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 바랭이 꽃으로부터 추출한 앱솔루트를 유효성분으로 포함하는 피부 외용제 조성물을 제공한다.

본 발명은 바랭이 꽃으로부터 추출된 앱솔루트의 성분을 규명하고, 이의 피부 탄력증진, 피부재생 및 상처 치유 효능을 입증한 것으로, 피부세포 수준에서 세포 증식 및 이동을 유도하여 피부 재생 및 상처 치유에 우수한 효과를 갖는다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 있어서 바랭이 꽃으로부터 앱솔루트(absolute)를 추출하는 과정을 나타내는 흐름도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 있어서 바랭이 꽃의 앱솔루트가 피부 각질형성세포(A) 및 진피세포(B)의 증식에 미치는 효과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 있어서 바랭이 꽃의 앱솔루트가 피부 각질형성세포(A) 및 진피세포(B)의 이동에 미치는 효과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 있어서 바랭이 꽃의 앱솔루트의 피부 각질형성세포(A) 및 진피세포(B)에서의 콜라겐 type I 및 IV 합성에 미치는 효과를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 있어서 바랭이 꽃의 앱솔루트의 (A) 진피세포에서 콜라젠 맹아(sprouting) 자연성장(out growth)에 미치는 효과를 나타낸 이미지 및 (B) 콜라젠 맹아(sprouting) 자연성장(out growth)에 미치는 결과를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 6은 일 실시예에 있어서 바랭이 꽃의 앱솔루트의 (A) 진피세포 내 세포외 신호조절 키나제(Erk1/2) 및 세포내 세린/트레오닌 단백질 키나제(p38)의 인산화에 미치는 영향을 나타낸 이미지, (B) 진피세포 내 세포외 신호 조절 키나제(Erk1/2)의 인산화에 미치는 결과를 정량화하여 나타낸 그래프 및 (C) 진피세포 내 세린/트레오닌 단백질 키나제(p38)의 인산화에 미치는 결과를 정량화하여 나타낸 그래프이다.

이하 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예들을 상세히 설명한다. 이하의 설명에 있어, 당업자에게 주지 저명한 기술에 대해서는 그 상세한 설명을 생략할 수 있다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기능 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다.

따라서 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본 발명은 바랭이 꽃으로부터 추출된 앱솔루트를 유효성분으로 포함하는 피부 재생 및 상처 치유용 조성물, 이를 포함하는 화장료 조성물 및 피부 외용제 조성물에 대한 것이다

상기 앱솔루트는 건조하지 않은 바랭이 꽃으로부터 얻는 것이 바람직하며, 유기용매 추출법에 의해 추출된 콘크리트(concrete)를 알코올로 추출하여 불용성 왁스(wax)를 제거한 앱솔루트(absolute)일 수 있다.

구체적으로, 상기 앱솔루트는 바랭이 꽃을 휘발성 용제를 이용한 유기용매 추출법으로 추출하여 콘크리트(concrete)를 얻는 단계; 및 상기 얻은 콘크리트를 알코올로 추출하여 불용성 왁스(wax)를 제거하고 앱솔루트(absolute)를 얻는 단계에 의해 추출될 수 있다.

일 예로서, 상기 앱솔루트는 도 1의 흐름도와 같이 추출할 수 있다. 우선, 건조하지 않은 바랭이 꽃을 헥산(n-hexane)에 침전시킨 뒤, 얻은 추출물을 회전식 증발기(rotary evaporation)를 이용하여 농축시켜서 콘크리트를 얻은 다음, 상기 얻은 콘크리트에 에틸알코올(ethyl alcohol)을 넣고 -20℃에서 12시간 동안 보관하여 용해시킨 후, 진공 냉각 필터(vacuum cooling filtration) 및 회전식 증발기를 이용하여 분리/정제함으로써, 본 발명에 따른 바랭이 꽃 앱솔루트를 제조할 수 있다.

상기 유기용매 추출법과 추출물로부터 앱솔루트를 분리하는 방법은 이 기술 분야에서 보통의 지식을 가진 자가 변형할 수 있는 모든 방법을 포함하는 것이 가능하다.

바랭이 꽃에서 추출한 상기 앱솔루트는 다양한 생리활성을 나타내는 성분을 함유하고 있는데, 보다 구체적으로 리놀렌산 (Linolenic acid), 시토스테논(Sitostenone), 사이클로옥타코산(Cyclooctacosane), 헥사데카노익산(Hexadecanoic acid), 스티그마스테롤(Stigmasterol), 멀티플로라-7,9(11)-dien-3β-ol(Multiflora-7,9(11)-dien-3β-ol), 펜타코산(Pentacosane), 메틸레네비스(Phenol, 2,2'-methylenebis[6-(1,1-dimethylethyl)-4-methyl-), 스테아르산(Octadecanoic acid), 캄페스테롤(Campesterol), 헵타코산(Heptacosane), 노나데칸(Nonadecane), 스쿠알렌(Squalene), 옥타코산(Octacosane), 1-도코센(1-Docosene), 1-노나데센(1-Nonadecene), 아이코산(Eicosane), 자이카인(Xycaine), 라노스테롤(Lanosterol)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 휘발성 유기 화합물을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 이들 성분의 함량은 구체적으로 리놀렌산 (Linolenic acid) 56~57 중량%, 시토스테논(Sitostenone) 7~8 중량%, 사이클로옥타코산(Cyclooctacosane) 6~7 중량%, 헥사데카노익산(Hexadecanoic acid) 4~5 중량%, 스티그마스테롤(Stigmasterol) 4~5 중량%, 멀티플로라-7,9(11)-dien-3β-ol(Multiflora-7,9(11)-dien-3β-ol) 2~3 중량%, 펜타코산(Pentacosane) 2~3 중량%, 메틸레네비스(Phenol, 2,2'-methylenebis[6-(1,1-dimethylethyl)-4-methyl-) 1~2 중량%, 스테아르산(Octadecanoic acid) 1~2 중량%, 캄페스테롤(Campesterol) 1~2 중량%, 헵타코산(Heptacosane) 1~2 중량%, 노나데칸(Nonadecane) 1~2 중량%, 스쿠알렌(Squalene) 1~2 중량%, 옥타코산(Octacosane) 1~2 중량%, 1-도코센(1-Docosene) 1~2 중량%, 1-노나데센(1-Nonadecene) 1~2 중량%, 아이코산(Eicosane) 1~2 중량%, 자이카인(Xycaine) 0~1 중량%, 라노스테롤(Lanosterol) 0~1 중량% 범위 안에서 포함될 수 있다.

본 발명에서는 바랭이에서 추출한 앱솔루트가 상기에서 기술한 생리활성을 나타내는 성분들을 포함하고 있고, 이러한 성분들에 의해 표피 각질형성세포의 증식과 이동의 효과를(도 2, 3 및 5 참조) 나타낸다는 것을 규명하였다. 또한, 바랭이 꽃에서 추출한 앱솔루트는 진피세포 내 세린/트레오닌 키나제(p38) 및 세포외 신호조절 키나제(ERK1/2)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 인산화 과정 또는 신호전달 과정을 유도할 수 있다.

이에 따라 본 발명에 따른 바랭이 꽃에서 추출한 앱솔루트를 유효성분으로 포함하는 피부 재생 및 상처치유 조성물로 사용될 수 있으며, 약학적으로 유효한 양의 바랭이에서 추출한 앱솔루트를 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 앱솔루트를 피부재생 및 상처치유 조성물로 사용하는 경우 앱솔루트는 0.1 ~ 100 μg/mL의 농도로 사용할 수 있다. 바랭이 꽃 앱솔루트를 0.1 μg/mL 이하의 농도로 사용할 경우에는 표피 각질형성세포의 증식과 이동의 효과가 미미하며, 앱솔루트를 100 μg/mL 이상의 농도로 사용할 경우에는 함유량 증가에 따른 뚜렷한 효과의 증가가 나타나지 않고 오히려 감소하므로 바람직하지 않다.

상기에서 "약학적으로 유효한 양"이란 상기 생리활성성분이 동물 또는 사람에게 투여되어 목적하는 생리학적 또는 약리학적 활성을 나타내기에 충분한 양을 말한다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 증상의 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.

또한, 상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 것을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있으며, 경구 또는 비경구 투여를 위한 다양한 형태로 제형화 될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캡슐, 멸균 주사용액, 멸균 분말, 연고, 로션, 크림, 고약, 페이스트 등의 형태일 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 목적하는 효과를 상승시킬 수 있는 공지의 화합물과도 병행하여 투여할 수 있다.

나아가 본 발명에 따른 항비만 조성물은 상기 기술한 바와 같이 약학적 조성물로 사용할 수 있을 뿐만 아니라, 건강기능식품으로도 사용할 수 있다. 예컨대, 식품의 주원료, 부원료, 식품 첨가제, 기능성 식품 또는 음료로 용이하게 활용할 수 있다.

상기 “식품”이란, 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 식품, 식품 첨가제, 기능성식품 및 음료를 모두 포함하는 것을 말한다.

상기 식품용 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합체, 기능성 식품 등이 있다. 추가로, 특수영양식품(예, 조제유류, 영, 유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예, 라면류, 국수류 등), 빵류, 건강보조식품, 조미식품(예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예, 스낵류), 캔디류, 쵸코렛류, 껌류, 아이스크림류, 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예, 과실음료, 채소류 음료, 두유류, 발효음료류 등), 천연조미료(예, 라면스프 등)를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 식품, 음료 또는 식품첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.

또한, 상기 “기능성 식품”또는 “건강기능성 식품”이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물 공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체내조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미하며, 구체적으로는 건강 기능성 식품일 수 있다. 상기 기능성 식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 기능성 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.

상기 건강보조식품의 종류로는 이에 제한되지는 않으나, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료 형태 일 수 있다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예들은 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1: 바랭이 꽃 앱솔루트의 제조

도 1에 도시된 공정에 따라 바랭이 꽃 앱솔루트를 제조하였다.

본 실시예에서 바랭이 꽃은 하나로농원(해남, 한국) 실습지 인근에서 자생된 바랭이 꽃을 채취하여 사용하였다. 건조되지 않은 바랭이 꽃 3 kg을 유기용매 추출법을 이용하여 추출하였다.

즉, 건조하지 않은 바랭이 꽃을 헥산(n-hexane)에 침전시켰고, 이렇게 얻은 침전물을 회전식 증발기(rotary evaporation)에서 증발시켜서 농축시킴으로서 고형의 콘크리트(concrete)를 획득하였다. 그 다음, 상기 콘크리트를 에틸알코올(ethyl alcohol)를 넣어서 용해시킨 후, 진공 냉각 필터(vacuum cooling filtration)를 거쳐서 불용성 왁스(wax)를 제거하였으며, 다시 회전식 증발기에서 증발시켜서 분리/정제함으로써 바랭이 꽃 앱솔루트를 제조하였다. 그리고 상기 제조한 바랭이 꽃 앱솔루트는 -80℃의 저온고에서 보관하였다.

실시예 2. 바랭이 꽃 앱솔루트의 성분 분석

바랭이 꽃 앱솔루트의 성분 분석은 KBSI(Korea Basic Science Institute, Seoul Center)에 의뢰하였다. 가스 크로마토그래피/질량분석계(6890N GC/5975i MS, Agilent, USA)를 사용하였고, GC/MS의 컬럼(column)은 DB5-MS (30 m×50 μm, 0.25 μm)를 사용하였으며, 캐리어 가스(carrier gas)는 헬륨을 사용하여 1 mL/분으로 흐르게 하여 분석하였다. 오븐의 온도는 40℃-2℃/분-230℃-5℃/분-300℃(5분)으로 유지하였으며, injection의 온도는 280℃에서 분석하였다. 또한 Interface의 온도는 300℃, ion source의 온도는 230℃, analyzer의 온도는 150℃에서 분석하였으며, Mass range는 40~800 m/z에서 분석하였다.

바랭이 꽃 앱솔루트 성분의 확인은 휘발성분의 지체시간(retention indices, RI)과 표준물질의 지체시간과 일치하거나 휘발물질의 질량 스펙트럼과 Wiley 7Nist 05 library의 질량 스펙트럼을 비교하여 물질을 확인하였다. RI는 C₆ ~ C₂₄ (nalkane)를 이용하여 시료와 동일 조건에서 결정하였다. 그 결과, 총 19개의 성분으로 구성되어 있음을 확인할 수 있었으며, 리놀렌산 (Linolenic acid), 시토스테논(Sitostenone), 사이클로옥타코산(Cyclooctacosane), 헥사데카노익산(Hexadecanoic acid), 스티그마스테롤(Stigmasterol), 멀티플로라-7,9(11)-dien-3β-ol(Multiflora-7,9(11)-dien-3β-ol), 펜타코산(Pentacosane), 메틸레네비스(Phenol, 2,2'-methylenebis[6-(1,1-dimethylethyl)-4-methyl-), 스테아르산(Octadecanoic acid), 캄페스테롤(Campesterol), 헵타코산(Heptacosane), 노나데칸(Nonadecane), 스쿠알렌(Squalene), 옥타코산(Octacosane), 1-도코센(1-Docosene), 1-노나데센(1-Nonadecene), 아이코산(Eicosane), 자이카인(Xycaine), 라노스테롤(Lanosterol) 순으로 높은 함량을 나타내었다.(표 1).

실시예 3. 바랭이 꽃 앱솔루트가 피부 각질형성세포 및 진피세포의 증식에 미치는 효과

상기 실시예 1에서 얻은 바랭이 꽃 앱솔루트가 표피 각질형성세포 및 진피세포 증식에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 하기와 같이 조사하였다.

사람 피부 유래 표피 각질형성세포(HaCat)를 10%의 우태아 혈청(fetal bovine serum)이 포함된 DMEM 배지를 이용하여 배양하고 본 발명의 실시예에 활용하였다. 표피 각질형성세포를 96 well microtiter plate에 각 well 당 세포수 3 X 10³cells/100 μL/well이 되도록 주입하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 부착시켰다.

바랭이 꽃 앱솔루트 0.1 ~ 100 μg/mL 농도로 각 well에 100 μL씩 처리하여 36시간 동안 배양시켰다. Ez-cytox와 DMEM를 1:1로 혼합하여 각 well 당 20 μL씩 처리한 후 배양기에서 30분간 반응시켰다. ELISA plate reader(Synerge2, BioTek, USA)를 이용하여 450 nm에서 흡광도 측정 후, 백분율로 환산하여 바랭이 꽃 앱솔루트의 표피 각질형성세포 증식에 대한 결과를 확보하였다.

사람 피부 유래 진피세포 (CCD986skt)를 10%의 우태아 혈청(fetal bovine serum)이 포함된 RPMI1940 배지를 이용하여 배양하고 본 발명의 실험예에 활용하였다. 진피세포를 96 well microtiter plate에 각 well 당 세포수 3 X 10³cells/100 μL/well이 되도록 주입하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 부착시켰다.

바랭이 꽃 앱솔루트 0.1 ~ 100 μg/mL 농도로 각 well에 100 μL씩 처리하여 36시간 동안 배양시켰다. Ez-cytox와 RPMI1640를 1:1로 혼합하여 각 well 당 20 μL씩 처리한 후 배양기에서 30분간 반응시켰다. ELISA plate reader(Synerge2, BioTek, USA)를 이용하여 450 nm에서 흡광도 측정 후, 백분율로 환산하여 바랭이 꽃 앱솔루트의 피부 진피세포 증식에 대한 결과를 확보하였다. 도 3A 및 3B는 본 발명의 실시예 1에 의해 추출된 바랭이 꽃 앱솔루트의 표피 각질형성세포 및 진피세포의 증식 효과를 나타낸 그래프이다. 여기서, 음성 대조군은 바랭이 꽃 앱솔루트를 이용하지 않은 것이고, 양성 대조군은 종래에 상처치유 및/또는 피부 재생에 활용되고 있는 표피성장인자(epithermal growth factor, EGF 50 ng/mL)를 이용한 것이다.

그 결과, 도 2A 및 2B에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 바랭이 꽃 앱솔루트는 표피 각질형성세포 및 진피세포의 증식을 농도 의존적으로 유도하는 것으로 나타났다.

즉, 표피성장인자(50 ng/mL)에 의한 표피 각질형성세포 및 진피세포의 증식은 각각 169.87±1.91%, 117.79±3.58%, 유도가 되었으며, 음성 대조군과 비교하여 바랭이 꽃 앱솔루트 1 μg/mL 농도에서 각각 103.90±5.32%, 102.49±2.52%,의 증식 유도율을 나타내었고, 100 μg/mL의 농도에서 각각 185.32±5.13%, 127.20±4.46%,의 증식 유도율을 나타내어, 표피 각질형성세포 및 진피세포의 증식을 효과적으로 유도하는 것으로 나타났다.

실시예 4. 바랭이 꽃 앱솔루트가 피부 각질형성세포 및 진피세포 이동에 미치는 효과

상기 실시예 1에서 얻은 바랭이 꽃 앱솔루트가 표피 각질형성세포 및 진피세포 이동에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 하기와 같이 실험하였다.

사람 피부 유래 표피 각질형성세포(HaCat)를 10%의 우태아 혈청(fetal bovine serum)이 포함된 DMEM 배지를 이용하여 배양하고 본 발명의 실시예에 활용하였다. 48 well Boyden microchemotaxis chamber를 사용하여 표피 각질형성세포의 이동률을 조사하였으며, 먼저 lower chamber에 바랭이 꽃 앱솔루트를 각각 0.1 ~ 100 μg/mL 의 농도를 처리하고, type I 콜라겐 코팅이 된 8 μm pore의 polycarbonate membrane을 올려 주었다. 이후, upper chamber에 표피 각질형성세포를 well당 5×10⁴cell/50μL씩 처리하였다. Chamber를 37℃ 배양기에서 3시간 30분 배양시킨 후, membrane을 Diff-Quick solution으로 염색 및 고정하였다.

Membrane을 통과하여 이동한 세포의 수를 세어, 백분율로 환산하여 바랭이 꽃 앱솔루트의 피부 표피 각질형성세포 이동에 대한 결과를 확보하였다.

사람 피부 유래 진피세포(CCD986sk)를 10%의 우태아 혈청(fetal bovine serum)이 포함된 RPMI1640 배지를 이용하여 배양하고 본 발명의 실시예에 활용하였다. 48 well Boyden microchemotaxis chamber를 사용하여 진피세포의 이동률을 조사하였으며, 먼저 lower chamber에 바랭이 꽃 앱솔루트를 각각 0.1 ~ 100 μg/mL 의 농도를 처리하고, type I 콜라겐 코팅이 된 8 μm pore의 polycarbonate membrane을 올려 주었다. 이후, upper chamber에 진피세포를 well당 5×10⁴cell/50μL씩 처리하였다. Chamber를 37℃ 배양기에서 90분 배양시킨 후, membrane을 Diff-Quick solution으로 염색 및 고정하였다.

Membrane을 통과하여 이동한 세포의 수를 세어, 백분율로 환산하여 바랭이 꽃 앱솔루트의 피부 진피세포 이동에 대한 결과를 확보하였다.

도 3A 및 3B는 본 발명의 실시예 1에 의해 추출된 바랭이 꽃 앱솔루트의 피부 각질형성세포 및 진피세포의 이동효과를 나타내는 그래프이다. 음성 대조군은 바랭이 꽃 앱솔루트를 이용하지 않은 것이고, 양성 대조군은 종래에 상처치유 및/또는 피부 재생에 활용되는 있는 표피성장인자(epithermal growth factor, EGF 5 ng/mL)를 이용한 것이다.

그 결과, 도 3B에 나타난 바와 같이, 본 발명의 실시예 1에 따른 바랭이 꽃 앱솔루트는 진피세포의 이동을 농도 의존적으로 유도하였으며, 특히, 바랭이 꽃 앱솔루트 1 μg/mL의 농도에서 104.92±1.78%의 이동 유도율을 나타내었고, 100 μg/mL의 농도에서 156.83±9.07%의 최대 이동률을 나타내어, 바랭이 꽃 앱솔루트가 진피세포의 이동을 효과적으로 유도하는 것으로 나타났다.

실시예 5. 바랭이 꽃 앱솔루트가 피부 각질형성세포 및 진피세포의 콜라겐 TypeⅠ또는 Ⅳ 합성과 분비에 미치는 영향 조사

상기 실시예 1에 의해 얻은 바랭이 꽃 앱솔루트가 표피 각질형성세포 및 진피세포의 증식과 이동에 필요한 ECM 구성 성분인 콜라겐 TypeⅠ,Ⅳ 합성에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 하기와 같이 실험하였다.

96 well microtiter plate에 monoclonal anti-collagen Ⅰ 또는 Ⅳ Ab, (2 μg/well/PBS)를 주입 후 12시간 동안 RT에서 코팅하였다. Blocking buffer로 1시간 동안 blocking 후, 샘플을 well당 100μL 씩 처리하여 RT에서 90분 동안 반응시켰다. 샘플은 바랭이 앱솔루트를 처리하지 않은 표피 각질형성세포의 배양액(CM)과 바랭이 앱솔루트 10 μg/mL 농도로 처리된 표피 각질형성세포의 배양액(CM)과 바랭이 앱솔루트 100 μg/mL 농도로 처리된 표피 각질형성세포의 배양액(CM)을 처리하였다. 그 후, polyclonal anti-collagen I 또는 IV Ab를 각 well에 처리하여 RT에서 90분 동안 반응시킨 다음, avidin-HRP를 각 well에 처리하여 RT에서 60분 동안 반응시켰다. Supersignal ELISA pico chemiluminescent substrate를 각 well 당 100μL 씩 주입하여 10분 동안 반응시킨 후, ELISA platereader를 이용하여 luminescence 정도를 측정하였고, 바랭이 앱솔루트의 표피 각질형성세포의 type I 또는 IV 콜라겐 합성과 분비에 대한 결과를 확보하였다(도 4A).

96 well microtiter plate에 monoclonal anti-collagen Ⅰ 또는 Ⅳ Ab, (2 μg/well/PBS)를 주입 후 12시간 동안 RT에서 코팅하였다. Blocking buffer로 1시간 동안 blocking 후, 샘플을 well당 100μL 씩 처리하여 RT에서 90분 동안 반응시켰다. 샘플은 바랭이 앱솔루트를 처리하지 않은 진피세포의 배양액(CM)과 바랭이 앱솔루트 10 μg/mL 농도로 처리된 진피세포의 배양액(CM)과 바랭이 앱솔루트 100 μg/mL 농도로 처리된 진피세포의 배양액(CM)을 처리하였다. 그 후, polyclonal anti-collagen I 또는 IV Ab를 각 well에 처리하여 RT에서 90분 동안 반응시킨 다음, avidin-HRP를 각 well에 처리하여 RT에서 60분 동안 반응시켰다. Supersignal ELISA pico chemiluminescent substrate를 각 well 당 100μL 씩 주입하여 10분 동안 반응시킨 후, ELISA platereader를 이용하여 luminescence 정도를 측정하였고, 바랭이 앱솔루트의 진피세포의 type I 또는 IV 콜라겐 합성과 분비에 대한 결과를 확보하였다.

그 결과 도 4B에 나타낸 바와 같이, 바랭이 엡솔루트는 진피세포의 type I 콜라겐과 type IV 콜라겐의 합성과 분비를 유의하게 촉진시키는 것으로 나타났다. 특히 진피세포의 배양액(CM)에서 type I 콜라겐의 합성은 100 μg/mL의 농도에서 169.39±11.96% 유도되었으며 type IV 콜라겐의 합성은 100 μg/mL의 농도에서 196.33±17.36% 유도되어, 바랭이 앱솔루트는 진피세포의 type I과 IV 콜라겐 합성과 분비를 효과적으로 유도하는 것으로 확인되었다.

실시예 6. 바랭이 꽃 앱솔루트가 진피세포 콜라겐 sprouting의 out growth에 미치는 영향

상기 실시예 1에 의해 얻은 바랭이 꽃 앱솔루트가 진피세포 콜라겐 sprouting의 out growth에 미치는 효과를 측정하기 위해서, 하기와 같이 조사하였다.

Type I 콜라겐과 진피세포를 2.5×10⁷ cells/mL이 되도록 섞은 후, NaOH (1 N)용액을 처리하여 중화한 후, 24 well plate에 10 μL씩 spoting하고, 10분 정도 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 건조한 뒤 상온에서 10분 정도 건조하여 인공피부조직을 형성하였다. 샘플을 처리하고, 48시간 동안 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 배양액을 제거하고, Diff-Quik solution을 이용하여 세포와 조직을 고정 및 염색하였으며, 염색된 세포와 조직을 촬영하여 결과를 확보하였다.

도 5는 본 발명의 실시예 1에 의해 추출된 바랭이 꽃 앱솔루트의 진피세포 콜라겐 sprouting의 out growth에 미치는 영향을 나타낸 결과이며, 음성 대조군은 바랭이 꽃 앱솔루트를 이용하지 않은 것이고, 양성 대조군은 종래의 상처치유 및/또는 피부 재생에 활용되는 있는 표피성장인자(epithermal growth factor, EGF 50 ng/mL)를 이용한 것이다.

그 결과, 도 5A에 나타난 바와 같이, 바랭이 꽃 앱솔루트는 진피세포 콜라겐 sprouting의 out growth를 농도 의존적으로 유도하는 것으로 나타났다. 즉, 양성 대조군과 비교하여 바랭이 꽃 앱솔루트 100 μg/mL 농도에서 진피세포 콜라겐 sprouting의 out growth를 효과적으로 유도하는 것으로 나타났다. 특히, 도 5B에 나타난 바와 같이 바랭이 꽃 앱솔루트 1 μg/mL 농도에서 179.60±11.06%가 유도되었으며, 100 μg/mL 농도에서 572.82±2.51%가 유도되었다.

실시예 7. 바랭이 꽃 앱솔루트가 진피세포내 신호전달 과정에 미치는 영향 조사

상기 실시예 1에 의해 얻은 바랭이 꽃 앱솔루트가 진피세포의 증식과 이동을 조절하는 주요 신호전달과정인 세포외 신호조절 키나제(Erk1/2)와 세린/트레오닌 키나제(p38)의 인산화 과정에 미치는 효과를 측정하기 위해서, 상기 실시예 3에서 제시된 바랭이 꽃 앱솔루트의 농도를 처리하고, 각각의 특이항체(P-Erk1/2, Erk1/2, P-p38, p38)를 이용하여 면역블롯(Immuno Blot)법을 활용하였다.

도 6A는 본 발명의 일 실시예 1에 의해 추출된 바랭이 꽃 앱솔루트의 진피세포외 신호조절 키나제(Erk1/2)와 세포내 세린/트레오닌 키나제(p38)의 인산화 과정에 미치는 영향을 나타낸 결과이며, 음성 대조군은 바랭이 꽃 앱솔루트를 이용하지 않은 것이고, 양성 대조군은 종래의 상처치유 및/또는 피부 재생에 활용되는 있는 표피성장인자(epithermal growth factor, EGF 50 ng/mL)를 이용한 것이다.

그 결과, 도 6B, 및 6C에 나타난 바와 같이, 바랭이 꽃 앱솔루트는 농도 의존적으로 진피세포외 신호조절 키나제(Erk1/2)와 세포내 세린/트레오닌 키나제(p38)의 인산화를 유도하였으며, 특히, 바랭이 꽃 앱솔루트 100 μg/mL 농도에서 세포외 신호조절 키나제(ERK1/2)의 인산화가 205.82±28.43% 유도되었으며, 세포내 세린/트레오닌 키나제(p38)의 인산화는 212.34±9.90%가 유도되는 것으로 나타났다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

바랭이(Digitaria sanguinalis) 꽃으로부터 추출된 앱솔루트를 유효성분으로 포함하는 피부 재생 및 상처 치료용 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 앱솔루트는 휘발성 용제를 이용하여 유기용매 추출법에 의해 추출된 것인 피부 재생 및 상처 치료용 조성물.
제 2 항에 있어서,
상기 앱솔루트는 상기 유기 용매 추출법에 의해 추출된 콘크리트를 알코올로 추출하여 불용성 왁스를 제거한 앱솔루트인 것인 피부 재생 및 상처 치료용 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 앱솔루트는 리놀렌산 (Linolenic acid), 시토스테논(Sitostenone), 사이클로옥타코산(Cyclooctacosane), 헥사데카노익산(Hexadecanoic acid), 스티그마스테롤(Stigmasterol), 멀티플로라-7,9(11)-dien-3β-ol(Multiflora-7,9(11)-dien-3β-ol), 펜타코산(Pentacosane), 메틸레네비스(Phenol, 2,2'-methylenebis[6-(1,1-dimethylethyl)-4-methyl-), 스테아르산(Octadecanoic acid), 캄페스테롤(Campesterol), 헵타코산(Heptacosane), 노나데칸(Nonadecane), 스쿠알렌(Squalene), 옥타코산(Octacosane), 1-도코센(1-Docosene), 1-노나데센(1-Nonadecene), 아이코산(Eicosane), 자이카인(Xycaine), 라노스테롤(Lanosterol)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 휘발성 유기 화합물을 포함하는 것인 피부 재생 및 상처 치료용 조성물.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 앱솔루트는 0.1 ~ 100 μg/mL의 범위로 포함되는 것인 피부 재생 및 상처 치료용 조성물.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 앱솔루트는 표피 각질형성세포 및 진피세포의 증식 및 이동을 유도하는 것인 피부 재생 및 상처 치료용 조성물.
바랭이(Digitaria sanguinalis) 꽃으로부터 추출된 앱솔루트 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물.
바랭이(Digitaria sanguinalis) 꽃으로부터 추출된 앱솔루트를 유효성분으로 포함하는 피부 외용제 조성물.