KR20200043497A

KR20200043497A - 피리미디닐 티로신 키나아제 억제제

Info

Publication number: KR20200043497A
Application number: KR1020207010675A
Authority: KR
Inventors: 브라이언 티. 홉킨스; 패트릭 콘론; 티모시 알. 찬; 트레이시 제이. 젠킨스; 슝웨이 차이; 마이클 후모라; 샹린 스; 로스 에이. 밀러; 앤드류 톰슨
Original assignee: 바이오젠 엠에이 인코포레이티드; 선에시스 파마슈티컬스 인코포레이티드
Priority date: 2012-06-08
Filing date: 2013-06-07
Publication date: 2020-04-27
Also published as: EP2858499A4; DK2858499T3; PH12014502699A1; CN104540385A; BR112014030655A2; CA3108186A1; BR112014030655A8; US20150158843A1; LT2858499T; CY1120638T1; ES2834333T3; IL277951A; TWI719209B; EP3753934A1; SG10201708535UA; MX363672B; CN113549055A; TW201410668A; HUE039897T2; AU2017201536A1

Abstract

본 발명은 브루톤 티로신 키나아제의 억제제로써 바람직한 특징을 나타내는 유용한 화합물 및 이의 조성물을 제공한다.

Description

피리미디닐 티로신 키나아제 억제제{PYRIMIDINYL TYROSINE KINASE INHIBITORS}

관련 출원에 대한 교차 참조

본 출원은 2012년 6월 8일자로 제출된 U.S. 가출원 일련 번호 61/657,360에 대해 우선권을 주장하며, 이의 내용은 본원 명세서에 참고자료로 편입된다.

발명의 배경

Tec 키나아제는 다음의 것들이 포함된 비-수용체 티로신 키나아제이다: Tec (간세포 암종에서 발현되는 티로신 키나아제), Btk (브루톤 티로신 키나아제(Bruton's tyrosine kinase)), Itk (인터루킨-2 (IL-2)-유도성 T-세포 키나아제; Emt 또는 Tsk로도 또한 공지됨), Rlk (휴면 임파세포 키나아제;또한 Txk으로도 공지됨), Lck (임파세포 -특이적 단백질 티로신 키나아제), 그리고 Bmx (염색체 X 상의 골수 티로신 키나아제 유전자; 또한 Etk으로도 공지됨)). Bmx 및 Tec의 발현은 내피 및 간 세포에서 탐지되지만 이들 키나아제는 조혈성 세포에서 주로 발현된다. Tec 키나아제 (Itk, Rlk 및 Tec)는 T 세포에서 발현되며, 이들 모두 T-세포 수용체 (TCR)의 활성화된 하류이다. Btk는 B 세포 수용체 (BCR) 신호생성의 하류 중개물질로써, B 세포 활성화, 증식, 및 분화 조절에 관련된다. 좀더 구체적으로, Btk는 포스파티딜이노시톨 (3,4,5)-트리포스페이트 (PIP3)에 결합되는 PH 도메인을 포함한다. PIP3 결합은 Btk에 의한 포스포리파아제 C (PLCγ)의 인산화를 유도하고, 다시 PIP2를 가수분해시켜 2가지 부차적인 메신져, 이노시톨 트리포스페이트 (IP3)와 디아실글리세롤 (DAG)을 만드는데, 이는 단백질 키나아제 PKC를 활성화시키고, 그 다음 추가적인 B-세포 신호생성이 유도된다. Btk 효소 활성을 불가능하게 하는 돌연변이는 주요 면역결핍증인 XLA 증후군 (X-연계된 무감마글로불린혈증)을 야기한다. Tec 키나아제가 B-세포와 T-세포 신호생성 모두에 작용을 하는 중요한 역할이 있다면, Tec 키나아제는 자가면역 장애의 관심 표적이 된다.

결과적으로, Tec 키나아제 이를 테면 Btk의 효과적인 억제제가 당분야에서 절실하다. 본 발명은 이들 요구 및 기타 요구를 달성시킨다.

발명의 요약

특정 구체예들에 있어서, 본 발명은 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다:

여기에서 R¹ 및 링 A는 본 명세서에서 정의되고 설명된 것과 같다. 이러한 화합물들은 Btk를 포함하는 Tec 키나아제 패밀리의 억제제들이다. 따라서, 제공된 화합물들은 본 명세서에서 상세하게 설명되는 시험관 스크리닝 및 활성 분석 뿐만 아니라 생체내 전-임상, 임상, 그리고 치료 환경을 포함하는 다양한 방법에 이용될 수 있다.

특정 구체예들에 있어서, 본 발명은 제공된 화합물들을 포함하는 약학 제제(formulations)을 제공한다.

특정 구체예들에 있어서, 본 발명은 Btk의 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 구체예들에 있어서, 이러한 방법들은 Btk를 유효량의 Btk 억제제에 접촉시키는 것을 포함한다.

특정 구체예들에 있어서, 본 발명은 Btk 억제를 필요로 하는 대상에서 Btk 억제에 반응성이 있는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 이러한 장애 및 방법들은 본 명세서에서 상세하게 설명된다.

특정 구체예들에 있어서, 본 발명은 화학식 I의 화합물:

또는 약학적으로 허용가능한 이의 염을 제공한다;

여기에서:

각 R¹은 독립적으로, 수소, 임의로 치환된 C_1-6지방족 기(group), 임의로 치환된 3 내지 7 원(membered)의 단환 헤테로사이클 기, 또는 3 내지 7개의 탄소원자와 질소, 산소, 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 헤테로원자를 보유한 임의로 치환된 헤테로사이클릴알킬 기이거나;

또는 2개의 R¹ 기는, 이들의 개재(intervening) 원자들과 함께, 질소, 산소, 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 2개의 헤테로원자를 보유한, 임의로 치환된 3 내지 7 원 포화된 또는 부분적으로 불포화된 단환 헤테로사이클 고리를 형성하고;

여기에서, 임의로 치환된 기들은 할로겐, -NO₂, -CN, -OR, -SR, -N(R)₂, -C(O)R, -CO₂R, -N(R)C(O)OR, -C(O)N(R)₂,OC(O)R, -N(R)C(O)R, -S(O)R, -S(O)₂R, 또는 -S(O)₂N(R)₂로 치환될 수 있으며;

각 R은 독립적으로 수소 또는 C_1-6 지방족이거나;

또는 동일한 질소에 부착된 2개의 R기는, 이들의 개재 원자들과 함께, 1 내지 2개의 헤테로원자를 보유한, 임의로 치환된 3 내지 7 원의 포화된 또는 부분적으로 불포화된 단환 헤테로사이클 고리를 형성하고, 이때 임의의 두번째 헤테로원자는 질소, 산소, 또는 황으로부터 독립적으로 선택되며;

링 A는

이며;

R²는 -Cl 또는 -F이며; 그리고

R³은 -CF₃, -OCF₃, 또는 -F이다.

정의

본 발명의 화합물들은 일반적으로 상기에서 설명된 것들을 포함하고, 본 명세서에서 공개된 류별, 하위류별, 그리고 종에 의해 더 설명된다. 본 명세서에서 이용된 바와 같이, 명시적으로 다른 언급이 없는 한 다음의 정의가 적용될 것이다. 본 발명의 목적을 위하여, 화학 원소들은 Periodic Table of the Elements, CAS version, Handbook of Chemistry and Physics, 75^th Ed에 따라 확인된다. 추가적으로, 유기 화학의 일반적인 원리는 ＂Organic Chemistry＂, Thomas Sorrell, University Science Books, Sausalito: 1999, 및 ＂March＇s Advanced Organic Chemistry＂, 5^th Ed., Ed.: Smith, M.B. and March, J., John Wiley & Sons, New York: 2001에서 설명되고 있으며, 이의 전문이 참고자료에 편입된다.

본 명세서에서 이용된 약어들은 화학 및 생물 분야에서 통상적으로 사용하는 의미를 가진다. 본 명세서의 화학 구조 및 식은 화학분야에 공지된 화학 결합가의 표준 원리에 따라 만들어진 것이다.

본 명세서에서 이용된 용어 ＂지방족＂ 또는 ＂지방족 기＂는 완전하게 포화되거나 또는 하나 또는 그 이상의 불포화 단위를 포함하는 직쇄 (가령, 분기화되지 않은) 또는 분기화된, 치환된 또는 치환안된 탄화수소 쇄, 또는 완전하게 포화되거나 또는 하나 또는 그 이상의 불포화 단위를 포함하는 단환 탄화수소 또는 쌍환 탄화수소를 의미하지만 , 구조의 나머지에 단일 부착점을 가지는 방향족 (본 명세서에서 ＂탄소고리＂, ＂사이클로지방족＂ 또는 ＂사이클로알킬＂이라고도 불림)은 아니다. 다른 언급이 없는 한, 지방족 기들은 1 내지 6개의 지방족 탄소 원자를 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 지방족 기들은 1 내지 5개의 지방족 탄소 원자를 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 지방족 기들은 1 내지 4개의 지방족 탄소 원자를 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 지방족 기들은 1 내지 3개의 지방족 탄소 원자를 포함하지만, 다른 구체예들에 있어서, 지방족 기들은 1 내지 2개의 지방족 탄소 원자를 포함한다. 적합한 지방족 기들은 선형 또는 분기화된, 치환된 또는 치환안된 알킬, 알케닐, 알키닐 기들 및 이의 혼성 이를 테면 (사이클로알킬)알킬, (사이클로알케닐)알킬 또는 (사이클로알킬)알케닐을 포함하나 이에 국한되지 않는다.

본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 ＂사이클로지방족＂ (또는 ＂탄소고리＂ 또는 ＂사이클로알킬＂)은 완전하게 포화된 또는 하나 또는 그 이상의 불포화 단위를 포함하는 단환 C₃-C₆ 탄화수소를 지칭하지만, 그러나 구조의 나머지에 단일 부착점을 가지는 방향족은 아니다.

본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 ＂헤테로사이클,＂＂헤테로사이클릴,＂＂헤테로사이클 고리＂는 호환되며, 포화된 또는 부분적으로 불포화되고, 탄소 원자에 추가하여 상기에서 정의된 바와 같은 하나 또는 그 이상의, 바람직하게는 1 내지 4개의 헤테로원자를 갖는 안정적인 3- 내지 7-원의 단환 헤테로사이클 모이어티를 말한다. 헤테로사이클의 고리 원자를 언급할 때, 용어 "질소"는 치환된 질소를 포함한다. 예로써, 산소, 황 또는 질소로부터 선택된 0 내지 3개의 헤테로원자를 보유한 포화된 또는 부분적으로 불포화된 고리에서, 질소는 N (3,4-디히드로-2H-피롤일에서와 같이), NH (피롤리디닐에서와 같이), 또는 ⁺NR (N-치환된 피롤리디닐에서와 같이)일 수 있다. 용어 ＂헤테로사이클릴알킬＂은 헤테로사이클릴에 의해 치환된 알킬기를 말하고, 여기에서 알킬 및 헤테로사이클릴 부분은 독립적으로 임의로 치환된다.

헤테로사이클 고리는 임의의 헤테로원자 또는 탄소 원자에서 이의 부속기에 부착될 수 있고, 이로 인하여 안정적인 구조가 되며, 링의 임의의 원자는 임의로 치환될 수 있다. 이러한 포화된 또는 부분적으로 불포화된 헤테로사이클 라디칼의 예로는테트라히드로퓨라닐, 테트라히드로티오페닐 피롤리디닐, 피페리디닐, 피롤리닐, 테트라히드로퀴놀리닐, 테트라히드로이소퀴놀리닐, 데카히드로퀴놀리닐, 옥사졸리디닐, 피페라지닐, 디옥사닐, 디옥소라닐, 디아제피닐, 옥사제피닐, 티아제피닐, 몰포리닐, 그리고 퀴누클리디닐을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.

본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 ＂부분적으로 불포화된＂이란 최소한 한 개의 이중 또는 삼중 결합이 포함된 고리 모이어티를 말한다. 용어 ＂부분적으로 불포화된＂이란 다중의 불포화 부위를 가지는 링을 포괄하는 의도이지만, 본 명세서에서 정의된 바와 같이 아릴 또는 헤테로아릴 모이어티를 포함하지는 않는다.

용어 ＂헤테로원자＂는 하나 또는 그 이상의 산소, 황, 질소, 인, 또는 실리콘 (질소, 황, 인, 또는 실리콘의 임의의 산화된 형태; 임의의 기초적인 질소의 사중합화된 형태; 헤테로사이클 고리의 치환가능한 질소, 예를 들면 N (3,4-디히드로-2H-피롤일에서와 같이), NH (피롤리디닐에서와 같이) 또는 NR⁺ (N-치환된 피롤리디닐에서와 같이)를 포함하는)을 의미한다.

본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 ＂약학적으로 허용가능한 염＂은 이성적인 의학적 판단 범위내에서 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 및 이와 유사한 반응없이, 인간 및 하등 동물의 조직과 접촉 사용에 적합하고, 적절한 위험 대비 이익 비율을 가진 염들을 말한다. 약학적으로 허용가능한 염들은 당분야에 공지되어 있다. 예를 들면, S. M. Berge et al.,는 J. Pharmaceutical Sciences, 1977, 66, 1-19에서 약학적으로 허용가능한 염들을 상세하게 설명하였으며, 이는 본원 참고자료에 편입되어 있다.

특정 구체예들에 있어서, 화합물들의 중성 형태는 이 염에 염기 또는 산을 접촉시키고, 통상적인 방법으로 부모 화합물을 단리함으로써 생성된다. 일부 구체예들에 있어서, 이 화합물의 부모 형태는 특정 물리적 성질, 이를 테면 극성 용매내 용해도에서 다양한 염 형태들과는 상이하다.

다른 언급이 없는 한, 본 명세서에서 나타낸 구조들은 구조의 모든 이성질체 (이를 테면, 거울상체, 부분입체이성질체, 그리고 구조의 기하학적 형태(또는 배위); 예를 들면, 각 비대칭 중심에 있어서 R 및 S 배위, Z 및 E 이중 결합 이성질체, 그리고 Z 및 E 배위 이성질체를 모두 포함한다. 따라서, 단일 입체 화학 이성질체 뿐만 아니라 부모 화합물의 거울상체, 부분입체이성질체, 그리고 기하학적(또는 배위) 혼합물은 본 발명의 범위내에 속한다. 다른 언급이 없는 한, 본 발명의 화합물들의 모든 호변체들도 본 발명의 범위내에 속한다. 추가적으로, 다른 언급이 없는 한, 본 명세서에서 나타낸 구조들은 하나 또는 그 이상의 동위원소적으로 풍부한 원자의 존재에 의해서만 차이가 있는 화합물들을 또한 포함한다. 예를 들면, 본 구조에서 수소를 대신하여 중수소 또는 삼중수소가 포함된 구조를 가진 화합물, 또는 본 구조에서 탄소를 대신하여 ¹³C- 또는 ¹⁴C-풍부한 탄소로 대체된 구조를 가진 화합물들은 본 발명의 범위내에 속한다. 이러한 화합물들은 예를 들면, 생물학적 분석에서 분석용 도구, 또는 본 발명에 따른 치료 물질로 유용하다.

화합물

상기에서 설명된 바와 같이,특정 구체예들에 있어서 본 발명은 화학식 I의 화합물:

또는 약학적으로 허용가능한 이의 염을 제공하며, 여기에서 R¹ 및 링 A는 본 명세서에서 정의되고 설명된 것과 같다.

화학식 I의 화합물들이 공지의 Btk의 억제제보다 유익한 성질들을 나타낸다는 기대이상의 발견을 하였다. 특정 구체예들에 있어서, 화학식 I의 화합물들은 증가된 효능을 보유한다. 임의의 특정 이론에 결부되는 것을 원하지 않지만, 본 명세서에 기재된 화합물들은 hERG 억제 또는 PXR 유도 분석, 또는 이의 조합에 의해 측정되었을 때 Btk 억제제로써 개선된 효능, 개선된 오프-타겟 프로파일을 보유하는 것으로 보인다. 이러한 유익한 성질을 나타내는 실험 데이터는 다음의 실시예들에서 제시된다.

일부 구체예들에 있어서, R¹은 모두 수소다. 일부 구체예들에 있어서, 각 R¹은 독립적으로 C_1-6지방족이다. 일부 구체예들에 있어서, 각 R¹은 독립적으로 C_1-5지방족이다. 일부 구체예들에 있어서, 각 R¹은 독립적으로 C_1-4지방족이다. 일부 구체예들에 있어서, 각 R¹은 독립적으로 C_1-3지방족이다. 일부 구체예들에 있어서, 각 R¹은 독립적으로 C_1-2지방족이다. 일부 구체예들에 있어서, R¹은 모두 메틸이다.

일부 구체예들에 있어서, 각 R¹은 독립적으로 수소 또는 C_1-6지방족이다. 일부 구체예들에 있어서, 각 R¹은 독립적으로 수소 또는 C_1-5지방족이다. 일부 구체예들에 있어서, 각 R¹은 독립적으로 수소 또는 C_1-4지방족이다. 일부 구체예들에 있어서, 각 R¹은 독립적으로 수소 또는 C_1-3지방족이다. 일부 구체예들에 있어서, 각 R¹은 독립적으로 수소 또는 C_1-2지방족이다. 일부 구체예들에 있어서, 각 R¹은 독립적으로 수소 또는 메틸이다.

일부 구체예들에 있어서, 한 개 R¹은 수소이거나 또는 그리고 다른 R¹은 C_1-6지방족이다. 일부 구체예들에 있어서, 한 개의 R¹은 수소이고 다른 R¹은 메틸이다. 일부 구체예들에 있어서, 한 개의 R¹은 수소이고 다른 R¹은 에틸이다. 일부 구체예들에 있어서, 한 개의 R¹은 수소이고 다른 R¹은 C_1-6 (사이클로알킬)알킬이다. 일부 구체예들에 있어서, 한 개의 R¹은 수소이고 다른 R¹은 C_1-6 (사이클로알킬)이다.

일부 구체예들에 있어서, 한 개의 R¹은 수소이고 다른 R¹은 -OR에 의해 선택적으로 치환된 C_1-6지방족이며, 여기에서 R은 수소 또는 C_1-6 지방족이다.

일부 구체예들에 있어서, 한 개의 R¹은 수소이고 다른 R¹은 3 내지 7개의 탄소 원자와 질소, 산소, 또는 황로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 헤테로 원자를 보유하는 헤테로사이클릴알킬기다. 일부 구체예들에 있어서, 한 개의 R¹은 수소이고 다른 R¹은 임의로 치환된 3 내지 7 원의 단환 헤테로사이클이다.

일부 구체예들에 있어서, 두 개의 R¹ 기들은, 이들의 개재 원자들과 함께, 질소, 산소, 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 2개의 헤테로원자를 보유한, 임의로 치환된 3 내지 5 원의 포화된 또는 부분적으로 불포화된 단환 헤테로고리 고리를 형성한다. 일부 구체예들에 있어서, 두 개의 R¹ 기들은, 이들의 개재 원자들과 함께, 임의로 치환된 피페라진 고리를 형성한다.

상기에서 설명된 바와 같이, 링 A는

이다. 특정 구체예들에 있어서, R²는 -Cl이다. 다른 구체예들에 있어서, R²는 -F이다. 일부 구체예들에 있어서, R³은 -CF₃이다. 일부 구체예들에 있어서, R³은 -OCF₃이다. 일부 구체예들에 있어서, R³은 -F이다.

특정 구체예들에 있어서, 링 A는

및

으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

일부 구체예들에 있어서, 본 명세서에서 설명된 화합물들에서 카르복사미드 기를 보유한 피페리딘 치환체와 락탐기를 보유한 피페리딘 치환체 사이에 trans 입체화학 상관관계가 있다.

일부 구체예들에 있어서, 본 발명은 화학식 II-a의 화합물:

또는 약학적으로 허용가능한 이의 염을 제공하는데, 여기에서 각 R¹, R², 그리고 R³은 상기에서 정의된 바와 같고, 그리고 본원 명세서의 분류 및 하위분류에서 설명된다.

일부 구체예들에 있어서, 본 발명은 화학식 II-b의 화합물:

일부 구체예들에 있어서, 본 발명은 화학식 III의 화합물:

또는 약학적으로 허용가능한 이의 염을 제공하고, 여기에서 각각의 R² 그리고 R³은 상기에서 정의된 바와 같고, 그리고 본원 명세서의 분류 및 하위분류에서 설명된다.

일부 구체예들에 있어서, 본 발명은 화학식 IV의 화합물:

또는 약학적으로 허용가능한 이의 염을 제공하고, 여기에서 각각의 R¹ 그리고 R³은 상기에서 정의된 바와 같고, 그리고 본원 명세서의 분류 및 하위분류에서 설명된다. 일부 구체예들에 있어서, R¹은 모두 수소다. 일부 구체예들에 있어서, 한 개의 R¹은 수소이고 다른 R¹은 메틸이다.

일부 구체예들에 있어서, 제공된 화합물은 하기 표 1에 나타낸 화합물, 또는 약학적으로 허용가능한 이의 염이다.

표 1 - 선택된 화학식 I의 화합물들.

본 발명의 화합물들은 일반적으로 잘 알려진 합성 방법의 적절한 조합에 의해 합성된다. 본 발명의 화합물들을 합성하는데 유용한 기술은 관련 분야의 당업자에게 자명하고 접근가능하다. 하기의 논의는 본 발명의 화합물들을 조합하는데 유용하게 이용가능한 다양한 특정 방법들을 설명하기 위하여 제공된다. 그러나, 이러한 논의는 본 발명의 화합물들을 준비함에 있어서 유용한 반응 범위 또는 반영 순서를 특정하고자 함은 아니다.

화학식 I의 화합물들은 계획 1에 따라 일반적으로 준비될 수 있다.

계획 1

화학식 I의 화합물들은 계획 2, 3, 3a, 4, 4a, 5, 또는 5a에 따라 일반적으로 준비될 수 있다.

계획 2

계획 3

계획 3a

계획 4

계획 4a

계획 5

계획 5a

계획 1 내지 5a에 있는 화합물에서 각각 PG, PG₁, PG₂, 및 PG₃ 기는 각각 독립적으로 적절한 보호기들이다. 이러한 에스테르 및 아민 보호기들은 당업계에 공지되어 있으며, Protecting Groups in Organic Synthesis, T. W. Greene and P. G. M. Wuts, 3^rd edition, John Wiley & Sons, 1999에서 상세하게 설명되고, 이들의 전문이 본 명세서에 참고자료에 편입된다. 일부 구체예들에 있어서, 보호기는 Boc 기다.

특정 구체예들에 있어서, 계획 1 내지 5a에서 각 합성 단계들은 각 단계 이후 실행되는 각 중간생성물의 단리와 함께 연속적으로 실행될 수 있다. 대안으로, 상기 계획 1, 2, 3, 및 4에서 설명된 각각 단계들은 하나 또는 그 이상의 중간생성물의 단리없이 실행될 수 있다.

특정 구체예들에 있어서, 전술한 합성의 모든 단계들은 원하는 최종 산물을 준비하기 위하여 실행될 수 있다. 다른 구체예들에 있어서, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 이상의 연속 단계들은 중간생성물 또는 원하는 최종 산물을 준비하기 위하여 실행될 수 있다.

용도, 제형화 및 투여

특정 구체예들에 있어서, 본 발명의 화합물들은 의학에 이용된다. 일부 구체예들에 있어서, 본 발명은 Tec 키나아제 패밀리 (예컨데, Tec, Btk, Itk, Txk, Lck, 및 Bmx)에서 키나아제의 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 구체예들에 있어서, 이러한 방법들은 Tec 키나아제 패밀리의 키나아제에 유효량의 Tec 키나아제 패밀리 억제제를 접촉시키는 것을 포함한다. 따라서, 본 발명은 Tec 키나아제 패밀리 구성원에 본 발명의 Tec 키나아제 패밀리 억제제를 접촉시킴으로써, Tec 키나아제 패밀리 효소 활성을 억제시키는 방법을 더 제공한다. 본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 ＂Tec 키나아제 패밀리 구성원＂은 Tec 키나아제 패밀리의 임의의 비-수용체 티로신 키나아제를 지칭한다. 일부 구체예들에 있어서, Tec 키나아제 패밀리 구성원들은 Tec, Btk, Itk, Txk, Lck, 및 Bmx이다.

일부 구체예들에 있어서, 본 발명은 Btk 효소 활성을 감소시키는 방법들을 제공한다. 일부 구체예들에 있어서, 이러한 방법들은 Btk에 유효량의 Btk 억제제를 접촉시키는 것을 포함한다. 따라서, 본 발명은 Btk에 본 발명의 Btk 억제제를 접촉시킴으로써 Btk 효소 활성을 억제하는 방법들을 더 제공한다.

Btk 효소 활성은 본 명세서에서 이용된 바와 같이 Btk 키나아제 효소 활성을 말한다. 예를 들면, Btk 효소 활성이 감소될 때, PIP3 결합 및/또는 PLCγ의 인산화는 감소된다. 일부 구체예들에 있어서, Btk에 대항하는 BtK 억제제의 최대 억제의 절반 농도(IC₅₀)는 1 μM 미만이다. 일부 구체예들에 있어서, Btk에 대항하는 BtK 억제제의 IC₅₀는 500 nM 미만이다. 일부 구체예들에 있어서, Btk에 대항하는 BtK 억제제의 IC₅₀는 100 nM미만이다. Btk에 대항하는 BtK 억제제의 IC₅₀은 10 nM이다. 일부 구체예들에 있어서, Btk에 대항하는 BtK 억제제의 IC₅₀은 1 nM 미만이다. 일부 구체예들에 있어서, Btk에 대항하는 BtK 억제제의 IC₅₀은 0.1 nM 내지 10 μM이다. 일부 구체예들에 있어서, Btk에 대항하는 BtK 억제제의 IC₅₀은 0.1 nM 내지 1 μM이다. 일부 구체예들에 있어서, Btk에 대항하는 BtK 억제제의 IC₅₀은 0.1 nM 내지 100 nM이다. 일부 구체예들에 있어서, Btk에 대항하는 BtK 억제제의 IC₅₀은 0.1 nM 내지 10 nM이다.

일부 구체예들에 있어서, 이러한 Tec 키나아제의 억제제는 하나 또는 그 이상의 Tec 키나아제의 효소 활성을 억제(가령, 감소)시킴으로써 완화될 수 있는 질환 및 장애의 치료에 유용하다. 본 발명의 화합물들은 Tec 패밀리 키나아제의 효과적인 억제제들이며, 따라서 하나 또는 그 이상의 Tec 패밀리 키나아제의 활성과 관련된 질환 치료에 유용할 것이다. 용어 ＂질환＂은 질환, 증후군, 또는 질환 증상을 의미한다. 따라서, 본 발명은 자가면역 장애, 염증 장애, 및 암의 치료가 필요한 대상에서 이를 치료하는 방법들을 제공한다. 이러한 방법들은 치료요법적 유효량의 Tec, Btk, Itk, Txk, Lck, 및/또는 Bmx 키나아제 억제제를 대상에게 투여하는 것을 포함한다.

용어 "자가면역 장애"는 고유 항원에 대항하는 부적절한 면역 반응과 관련된 질환 또는 장애, 이를 테면 급성파종뇌척수염 (ADEM), Addison 질환, 원형탈모(증), 항인지질항체 증후군 (APS), 용혈빈혈, 자가면역간염, 물집유사천포창(BP), Coeliac 질환, 피부근염, 당뇨병 유형 1, Good Pasture 증후군, Graves 질환,

증후군 (GBS), Hashimoto 질환, 특발저혈소판자색반병, 낭창 또는 전신홍반루푸스 (SLE), 혼합결합조직병, 다발경화증, 중증근무력증, 보통천포창, 혈우병과 항체, 유독한 빈혈, 다발근육염, 원발쓸개관간경화증, Sjoegren 증후군, 관자동맥염 그리고 Wegener 육아종증을 포함한다. 용어 "염증 장애"는 급성- 또는 만성- 염증과 관련된 질환 또는 장애, 이를 테면 알레르기, 천식 (예컨데, 알레르기성 천식), 아토피성 피부염, 전립샘염, 사구체신염 , 골반염증질환 (PID), 염증성 장 질환 (IBD, 예컨데, Crohn 질환, 궤양성 대장염), 재관류 손상, 류마티스성 관절염, 이식거부반응 (양성 교차반응을 하는 이식거부 환자 포함) 그리고 혈관염을 포함한다. 특정 구체예들에 있어서, 본 발명은 비-Hodgkin 림프종(NHL), 만성 림프구 백혈병 (CLL), RA, Wegener 육아종증 (WG), 그리고 현미경다발혈관염 (MPA)이 포함된 리투시마브 (CD20에 대한 단클론항체 )를 이용한 치료가 승인된 질환, 장애 또는 상태를 치료하는 방법들을 제공한다. 일부 구체예들에 있어서, 본 발명은 류마티스성 관절염 (RA), SLE, 또는 아토피 피부염을 본 명세서에서 공개된 화합물들을 이용하여 치료하는 방법을 제공한다.

용어 ＂암＂은 비정상적인 세포 성장 및/또는 증식과 관련된 질환 또는 장애, 이를 테면 신경아교종, 갑상선 암종, 유방 암종, 폐 암 (예컨데 소-세포 폐 암종, 비-소-세포 폐 암종), 위 암종, 위장관기질종양, 췌장 암종, 담관 암종, 난소 암종, 내막 암종, 전립선 암종, 신장 세포 암종, 림프종 (예컨데, 악성 거대-세포 림프종), 백혈병 (예컨데 급성 골수성 백혈병, T-세포백혈병, 만성림프구백혈병), 다발골수종, 악성중피종, 악성흑색종, 그리고 결장 암 (예컨데 고빈도 현미부수체 불안정성 대장결장암)을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 본 발명은 백혈병 또는 림프종의 치료 방법을 제공한다.

용어 ＂대상＂은 본 명세서에서 이용된 바와 같이, 약학 조성물이 투여되는 포유류를 지칭한다. 예시적인 대상은 인간, 뿐만 아니라 수의학관련 및 실험실 동물들 이를 테면 말, 돼지, 소, 개, 고양이, 토끼, 렛, 마우스, 그리고 수중 포유류를 포함한다.

선택된 증상 및 B 세포 억제

상기에서 설명된 바와 같이, 제공된 화합물들은 RA 및 SLE가 포함된 질환 치료에 유용하다. 하기에서 더욱 상세하게 설명된 것과 같이, 이들 질환은 B 세포에 연계된다. 따라서, 본 명세서는 제공된 화합물들이 이러한 증상 및 다른 증상의 치료제로 유용하다는 인식을 포괄한다.

면역체계의 조절이상이 RA의 병리에 핵심이다(Panayi GS, et al. Rheum Dis Clin North Am 2001; 27:317-334). 윤활막에 있는 침윤 백혈구의 대부분은 T 임파세포 (주로 활성화된 CD4+ T 세포) 및 단핵구/대식세포 기원의 세포(전-염증 사이토킨 이를 테면 IL-1, TNF-알파 및 IL-6 그리고 콜라게나아제 및 메탈로프로테아제가 포함된 단백질분해성 효소를 방출하는)이며, B-세포 및 혈장 세포 또한 윤활막에서 발견된다 (Zhang Z, Bridges SL. Rheum Dis Clin North Am 2001; 27:335-353). RA에서 B 세포 및 이들의 연합된 작동체 기능에 대한 명백한 역할은 RA 치료에 승인된 선택적 B 세포 감소 치료제인 리투시마브의 효과에 의해 설명되었다 (Cohen SB, et al.; REFLEX Trial Group. Arthritis Rheum. 2006 Sep; 54(9):2793-806).

SLE의 원인은 아직 완전하게 이해되지 않지만, 병원성 자기항체 및 면역 복합체의 침착은 광범위한 조직 손상의 발생에 주요한 것으로 보인다 (Klippel JH, et al. Primer on the rheumatic diseases. Atlanta: Arthritis Foundation; 2001). 자가항체 및 면역 복합체 중재된 활성화는 Fc 수용체를 통하여 자극된 대식세포에 의한 대식세포 활성화 억제를 측정함으로써 연구될 수 있다 (예시 - 1차 인간 대식세포의 FcγR 활성화 참고). 자가-항원에 대한 내성 상실은 종국에는 B 세포가 흔히 핵 또는 세포질 성분들에 대항하는 자가-항체를 생산하도록 유도한다. 핵 성분들에 대항하는 항체 (항-핵 항체 [ANA])는 DNA (전형적으로 이중가닥으로 된 DNA [dsDNA]), RNA, 히스톤 및 작은 핵 리보핵산단백질을 포함하는 핵 항원을 표적으로 한다. 이들 항체는 조직에 침착되어 있는 자가-항원 형성 면역 복합체와 복합되어, 염증 반응을 일으키고, 조직 손상으로 이어진다. 병원성 자가항체 생산에서 이들의 역할에 추가하여, B 세포는 항원-특이적 반응의 개시에 역할을 하는T-세포에게 항원-제공 세포 (APCs)로도 또한 기능을 한다. SLE의 병리에서 면역계의 체액 부분의 중추적인 역할을 고려하면, B 세포 또는 B-세포 경로는 바람직한 치료 표적이 된다. SLE에 대해 최근에 승인된 단클론항체인 벨리무마브(Belimumab)는 BAFF가 발현된 B 세포인 이들의 수용체에 결합하는 것을 차단시킨다. 이들 수용체는 B 세포를 활성화시키고, 이의 생존을 강화시키는 작용을 하는데 이는 벨리무마브로 치료후 관찰되는 순환 B 세포의 감소와 일관된다. 또한 Chan OT, et al. Immunol Rev. 1999b;169:107-121; Navarra SV, et al. Lancet. 2011 Feb 26;377(9767):721-31; Furie R, et al. Arthritis Rheum. 2011 Dec;63(12):3918-30을 참고. 자가면역 질환 이를 테면 SLE에서 B 세포 및 골수 계통 세포의 역할은 소분자 비가역성 Btk 억제제로 마우스를 치료하였을 때 전임상 SLE 동물 모델에서 효과를 설명하는 최근 공개 내용에 의해 추가 뒷받침된다 (Honigberg, L.A. PNAS. 2010; 107: 13075).

복합

특정 구체예들에 있어서, 본 발명의 화합물은 또다른 물질과 복합되어 투여된다. 일부 구체예들에 있어서, 본 발명의 화합물은 RA 치료에 유용하며, 그리고 다음을 포함하나 이에 한정되지 않은 질환-변형 항류마티즘약 (DMARD)과 복합하여 투여된다: 메토트렉세이트, 아바타셉트, 아자티오프린, 세르툴리주마브, 페니실라민 그리고 히드록시클로로퀸, 시클로스포린, D-페니실아민, 아달리무마브, 에타네르셉트, 고리무마브, 금 염 (아우라노핀 그리고 아우로티오멜레이트 염을 포함), 인플릭시마브, 레풀루노미드, 미노사이클린, 리투시마브, 술파살라진, 토실리주마브, 또는 이의 복합. 일부 구체예들에 있어서, 본 발명의 화합물은 NSAID 또는 코르티코스테로이드와 복합되어 투여된다. 일부 구체예들에 있어서, 본 발명의 화합물은 SLE의 치료에 유용하고, 코르티코스테로이드, 말라리아예방약, 밸리무마브, 미코페놀레이트 모페틸 (MMF) 또는 미코페놀레이트 나트륨, 아자티오프린, 또는 이의 복합을 포함하나 이에 한정되지 않은 SLE 치료 물질과 복합 투여된다. 일부 구체예들에 있어서, 본 발명의 화합물은 아토피성 피부염 치료에 유용하고 국소 스테로이드, 타크로리무스, 메토트렉세이트, 모메타손 퓨로에이트(MMF), 아자티오프린, 레티노이드, 또는 이의 복합을 포함하나 이에 국한되지 않은 아토피성 피부염 치료를 위한 국소 물질과 복합 투여된다.

분석

유용한 Tec 키나아제 패밀리 억제제를 개발하기 위하여, Tec 키나아제 패밀리 효소 활성을 감소시킬 수 있는 후보 억제제를 시험관에서 확인할 수 있다. 억제제 화합물들의 활성은 당분야에 공지된 방법을 이용하거나 및/또는 본 명세서에서 제시하는 방법을 이용하여 분석될 수 있다.

Tec 키나아제 패밀리 구성원의 효소 활성을 감소시키는 화합물들은 재조합 또는 자연적으로 발생되는 생물학적으로 활성 Tec 키나아제 패밀리 구성원을 이용하여 식별되고 테스트될 수 있다. Tec 키나아제는 시험관내에서 분리된, 또는 세포 안에서 공동-발현 또는 발현되는 고유 세포에서 발견될 수 있다. 억제제가 없을 경우의 활성과 비교하여, 억제제가 존재할 때 Tec 키나아제 패밀리 구성원 효소 활성 감소 측정은 당분야에 공지된 다양한 방법들, 이를 테면 실시예에서 설명되는 POLYGAT-LS 분석을 이용하여 실시될 수 있다. Btk 및 다른 Tec 키나아제의 활성을 분석하는 다른 방법들도 당분야에 공지되어 있다. 적절한 분석 방법의 선택은 당업자의 능력 범위내에 있다.

일단 화합물들이 Tec 키나아제 패밀리 구성원 효소 활성을 감소시키는 것으로 확인되면, 이 화합물들이 다른 효소와 비교하여 Tec 키나아제 패밀리 구성원을 선택적으로 억제하는 능력이 있는지를 더 시험한다.

Tec 키나아제 패밀리 구성원 활성과 관련된 표현형에서 탐지가능한 변화를 야기시키는 능력에 대하여 세포 모델 또는 동물 모델에서 이들 화합물을 더 시험할 수 있다. 세포 배양에 추가하여, 동물 모델을 이용하여 Tec 키나아제 패밀리 구성원 억제제가 동물 모델에서 자가면역 장애, 염증 장애, 또는 암을 치료하는 능력에 대하여 테스트될 수 있다.

약학 조성물

또다른 측면에 있어서, 본 발명은 화학식 I의 화합물 또는 화학식 I의 화합물과 약학적으로 허용가능한 부형제 (예컨데, 운반체)의 조합이 포함된 약학 조성물을 제공한다.

약학 조성물은 본 명세서에서 공개된 억제제의 광학적 이성질체, 부분입체이성질체, 또는 약학적으로 허용가능한 염을 포함한다. 약학 조성물에 포함된 화학식 I의 화합물은 상기에서 설명된 바와 같이 운반체 모이어티에 공유적으로 부착될 수 있다. 대안으로, 약학 조성물에 포함된 화학식 I의 화합물은 운반체 모이어티에 공유적으로 연계되지 않는다.

＂약학적으로 허용가능한 운반체＂는 본 명세서에서 이용된 바와 같이 약학 부형제, 예를 들면, 활성 물질에 유해한 영향을 주지 않은 장 또는 비장관 용도에 적합한 약학적으로, 생리학적으로, 허용가능한 유기 또는 무기 운반체 물질을 말한다. 적합한 약학적으로 허용가능한 운반체는 물, 염 용액 (이를 테면 Ringer 용액), 알코올, 오일, 젤라틴, 그리고 탄수화물 이를 테면 락토즈, 아밀로즈 또는 전분, 지방산 에스테르, 히드록시메틸셀룰로오즈, 그리고 폴리비닐 피롤리돈을 포함한다. 이러한 조제물(preparations)은 보조 물질 이를 테면 윤활제, 보존제, 안정제, 습윤제, 유화제, 삼투압에 영향을 주는 염, 완충제, 발색제, 및/또는 방향족 물질 그리고 본 발명의 화합물들과 유해하게 반응하지 않은 이와 유사한 물질과 혼합되어 안정화될 수 있다.

본 발명의 화합물들은 대상에게 단독으로 또는 공동투여될 수 있다. 공동-투여는 화합물들이 개별적으로 또는 복합되어 (한 개 이상의 화합물) 동시 또는 순차적 투여를 포함한다는 의미다. 조제물은 또한 필요에 따라 다른 활성 물질 (예컨데 대사 분해를 감소시키기 위하여)과 함께 복합될 수 있다.

본 발명의 화합물들은 경구, 장관외 또는 국소 투약형의 다양한 방식으로 제조 및 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명의 화합물들은 주사 (예컨데 정맥내, 근육내, 피부내, 피부아래, 십이지장내, 또는 복막내)에 의해 투여될 수 있다. 또한, 본 명세서에서 설명되는 화합물들은 흡입 예를 들면, 비강내 흡입에 의해 투여될 수 있다. 추가적으로, 본 발명의 화합물들은 경피에 의해 투여될 수 있다. 다중 투여 경로 (예컨데, 근육내, 경구, 경피)를 이용하여 본 발명의 화합물들이 투여될 수 있다는 것을 또한 상상할 수 있다.

본 발명의 화합물들로부터 약학 조성물을 만들기 위하여, 약학적으로 허용가능한 운반체는 고체 또는 액체일 수 있다. 고형 조제물은 분말, 테들릿, 알약, 캡슐, 카시에(cachets), 좌약 및 분산가능한 미립자를 포함한다. 고체 운반체는 희석제, 풍미제, 결합제, 보존제, 테블릿 붕해제, 또는 캡슐화 재료로 작용할 수 있는 하나 또는 그 이상의 물질이 될 수 있다.

분말에서, 운반체는 미세하게 분할된 활성 성분과 함께 혼합물 안에 미세하게 분할된 고체다. 테블릿에서, 활성 성분은 적절한 비율로 필요한 결합 성질을 가진 운반체와 혼합되며, 원하는 크기와 모양으로 압착된다.

분말과 테블릿은 바람직하게는 5% 내지 70%의 활성 화합물을 포함한다. 적합한 운반체는 탄산마그네슘, 스테아레이트 마그네슘, 활석, 당, 락토즈, 펙틴, 덱스트린, 전분, 젤라틴, 트라가탄, 메틸셀룰로오즈, 카르복시 메틸셀룰로오즈 나트륨, 저융점 밀랍, 코코아버터, 그리고 이와 유사한 것들이다. 용어 ＂조제물(preparation)＂은 캡슐을 제공하는 운반체로 포집화 재료에 활성 화합물 제형화를 포함하며, 이때 다른 운반체와 함께 또는 다른 운반체 없이 활성 성분은 운반체에 의해 둘러싸이고, 따라서 운반체와 연합된다. 유사하게, 카시에 및 로젠지가 포함된다. 테블릿, 분말, 캡슐, 알약, 카시에 및 로젠지는 경구 투여에 적합한 고형 투약형으로 이용될 수 있다.

좌약을 만들기 위하여, 낮은 융점의 밀랍, 이를 테면 지방산 글리세라이드 또는 코코아버터 혼합물을 우선 용융시키고, 교반에 의해 활성 성분을 그 안에 균질하게 분산시킨다. 용융된 균질한 혼합물은 통상적인 크기의 몰드 안에 붇고, 냉각에 의해 고형화된다.

액체 조제물은 용액, 현탁액, 및 에멀션, 예를 들면, 물 또는 물/프로필렌 글리콜 용액을 포함한다. 비경구 주사를 위하여, 액체 조제물은 수성 폴리에틸렌 글리콜 용액에서 용액으로 제형화될 수 있다.

비장관 적용이 필요하거나 바람직할 때, 본 발명의 화합물들을 위한 특히 적절한 혼합물은 주사가능한 멸균 용액, 바람직하게는 유성 또는 수성 용액, 뿐만 아니라 현탁액, 에멀션, 또는 좌약이 포함된 임플란트다. 특히, 장관외 투여용 운반체는 덱스트로즈 수성 용액, 염수, 순수 물, 에탄올, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 땅콩유, 참기름, 폴리옥시에틸렌-블록 중합체, 및 이와 유사한 것들을 포함한다. 앰플은 편리한 단위 투약형이다. 본 발명의 화합물들은 리포좀에 혼입될 수 있거나 또는 경피 펌프 또는 패취를 통하여 투여될 수 있다. 본 발명에 사용하는데 적합한 약학 혼합물은 예를 들면, Pharmaceutical Sciences (17th Ed., Mack Pub. Co., Easton, PA) 및 WO 96/05309에서 설명되는 것들을 포함하며, 이 두 문헌의 교시내용은 참고자료에 편입된다.

경구용으로 적합한 수성 용액은 물에 활성 성분을 용해시키고, 적절한 발색제, 풍미제, 안정화제 및 농후제를 필요한 만큼 추가함으로써 만들어질 수 있다. 경구용으로 적합한 수성 현탁액은 물에 미세하게 분할된 활성 성분과 점성 물질 이를 테면 천연 또는 합성 검, 수지, 메틸셀룰로오즈, 카르복시메틸셀룰로오즈 나트륨, 그리고 기타 공지된 현탁제와 함께 분산시킴으로써 만들어질 수 있다.

사용 직전에 경구 투여용 액체 형태의 조제물로 전환될 수 있는 고체 형태의 조제물도 또한 포함된다. 이러한 액체 형태는 용액, 현탁액, 그리고 에멀션을 포함한다. 이러한 조제물은 활성 성분에 추가하여 발색제, 풍미제, 안정제, 완충제, 인공 및 천연 감미제, 분산제, 농후제, 가용화 물질, 그리고 이와 유사한 것들을 포함할 수 있다.

약학 조제물은 바람직하게는 단위 투약형이다. 이러한 형태에서 조제물은 적절한 양의 활성 성분이 포함된 단위 분량으로 분화된다. 단위 투약형은 포장된 조제물, 별도의 조제물 분량이 포함된 포장, 이를 테면 포장된 테블릿, 캡슐, 및 바이알 또는 앰플내 분말이 될 수 있다. 또한, 단위 투약형은 캡슐, 테블릿, 커시에, 또는 로젠지 자체이거나 또는 포장된 형태내 임의의 적절한 수로 존재할 수 있다.

단위 분량 조제물에서 활성 성분의 양은 활성 성분의 특정 용도 및 효능에 따라 변화될 수 있으며, 또는 0.1 mg 내지 10000 mg, 더 전형적으로 1.0 mg 내지 1000 mg, 가장 전형적으로 10 mg 내지 500 mg으로 조정될 수 있다. 원하는 경우, 이 조성물은 다른 양립가능한 치료제를 또한 포함할 수 있다.

일부 화합물들은 물에서 제한된 용해도를 가질 수 있고, 따라서 조성물 안에 계면활성제 또는 다른 적절한 공용매를 요구할 수 있다. 이러한 공-용매는 다음을 포함한다: Polysorbate 20, 60, 및 80; Pluronic F-68, F-84, 및 P-103; 시클로덱스트린; 그리고 폴리옥실 35 피마자유. 이러한 공용매는 일반적으로 중량의 약 0.01 % 내지 약 2% 사이의 수준으로 이용된다.

단순한 수성 용액보다 점성이 큰 점도는 제제의 현탁액 또는 에멀션 성분들의 물리적 분리를 감소시키거나, 및/또는 제제를 개선시키기 위하여 제제의 분산시 가변성을 감소시킬 때 바람직하다. 이러한 점성 구축 물질(viscosity building agents)은 예를 들면, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 메틸 셀룰로오즈, 히드록시 프로필 메틸셀룰로오즈, 히드록시에틸 셀룰로오즈, 카르복시메틸 셀룰로오즈, 히드록시 프로필 셀룰로오즈, 콘드로이틴 술페이트 그리고 이의 염, 히알루론산 및 이의 염, 그리고 전술한 것들의 조합을 포함한다. 이러한 물질은 일반적으로 중량의 약 0.01 % 내지 약 2% 사이의 수준으로 이용된다.

본 발명의 조성물은 지속적인 방출 및/또는 편의성을 제공하는 성분들을 추가적으로 포함할 수 있다. 이러한 성분들은 고분자량, 음이온성 점성모방성(mucomimetic) 중합체, 겔화 폴리사카라이드 그리고 미세하게 분할된 약물 운반체 물질을 포함한다. 이들 성분들은 U.S. 특허 번호 4,911,920; 5,403,841; 5,212,162; 그리고 4,861,760에서 더 상세하게 논의된다. 이들 특허의 전체 내용은 다목적용으로 이의 전문이 본 명세서의 참고자료에 편입된다.

효과적인 투약량

본 발명에 의해 제공되는 약학 조성물은 치료요법적 유효량, 가령 의도된 목적을 얻는데 효과적인 양이 포함된 활성 성분이 있는 조성물이다. 특정 용도의 실질적인 효과량은 무엇보다도 치료되는 상태에 따라 달라질 것이다. 예를 들면 암을 치료하는 방법에서 투여될 경우, 이러한 조성물은 원하는 결과(예컨데 대상의 암 세포 수를 감소)를 얻는데 효과적인 활성 성분의 양을 포함할 것이다.

투여되는 화합물의 투약량 및 빈도(1회 또는 다중 투여)는 투여 경우, 수령자의 연령, 신체, 성별, 건강, 체중, 체질량지수, 식이요법, 치료될 질환(예컨데, Btk 억제에 반응하는 질환)의 증상의 성질 및 정도; 다른 질환 또는 다른 건강-관련된 문제의 존재 여부; 동시 치료 종류; 그리고 임의의 질환 또는 치료 섭생으로부터 여병등이 포함된 다양한 인자들에 따라 변화될 수 있다. 다른 치료 섭생 또는 물질은 본 발명의 방법 및 화합물과 병용되어 이용될 수 있다.

본 명세서에서 설명된 임의의 화합물의 경우, 치료요법적 유효량은 세포 배양 분석으로부터 우선 결정될 수 있다. 목표 농도는 예를 들면, 설명된 방법들을 이용하여 측정되었을 때 키나아제 효소 활성을 감소시킬 수 있는 활성 화합물(들)의 농도가 될 것이다.

인간에서 사용되는 치료요법적으로 유효량은 동물 모델로부터 결정될 수 있다. 예를 들면, 인간에 대한 투여분량은 동물에서 효과가 있는 것으로 확인된 농도를 얻도록 조정될 수 있다. 인간에서 투여분량은 상기에서 설명된 바와 같이 키나아제 억제를 감시하여 이 투여분량을 상향 또는 하향 조정함으로써 조정될 수 있다. 특정 구체예들에 있어서, 투여된 분량은 하루에 1회, 2회 또는 그 이상으로 일일 약 10 mg 내지 약 1000 mg의 범위가 될 수 있다.

투여량은 환자의 요구 및 이용되는 화합물에 따라 변화될 수 있다. 본 발명의 내용에 있어서 환자에게 투여되는 투여분량은 시간의 경과에 따라 환자에게서 유익한 치료 반응을 얻는데 충분한 양이 되어야 한다. 투여분량의 크기는 임의의 부작용의 존재, 성질 및 그 정도에 따라 또한 결정될 수 있다. 일반적으로 치료는 화합물의 최적 분량보다 더 작은 분량의 투여량으로 시작된다. 그 다음, 투여분량은 환경 하에 최적의 효과에 도달될 때까지 조금씩 증분된다. 일부 구체예들에 있어서, 투여량 범위는 0.001% 내지 10% w/v이다. 일부 구체예들에 있어서, 투여량 범위는 0.1% 내지 5% w/v이다.

투여량 및 간격은 투여된 화합물의 수준이 치료될 특정 임상적 표시에 대하여 효과가 있도록 하기 위하여 개별적으로 조정될 수 있다. 개별 질환 상태의 심각성에 적합한 치료 섭생을 제공할 것이다.

본 명세서에서 기술된 발명을 더 잘 이해할 수 있도록 하기 위하여 다음의 실시예들이 제시된다. 이들 실시예는 단지 설명을 위한 것이며, 본 발명의 범위를 임의의 방식으로던 제한시키는 것으로 간주되어서는 안된다.

예시

하기 실시예에서 설명된 것과 같이, 다음의 전반적인 과정에 따라 화합물들이 제조된다. 전반적인 방법은 본 발명의 특정 화합물의 합성을 나타내지만, 당업자에게 공지된 일반적인 방법 및 기타 방법들은 본 명세서에서 설명된 것과 같이 모든 화합물, 하위분류 및 각 화합물의 종에 적용될 수 있다.

실시예 1

(3 ＇R ,4 ＇S )-1＇-tert-부틸 4＇-에틸 2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘]-1＇,4＇-디카르복실레이트의 합성

에틸 3-옥소피페리딘-4-카르복실레이트 중간생성물의 제조. 에틸 1-벤질-3-옥소피페리딘-4-카르복실레이트 1 (15.0 g, 50.5 mmol, 1.0 당량)은 16h 동안 기압하에 MeOH (250 mL)에서 10% Pd/C (1.5 g) 촉매 존재하에 수소처리되었다. 촉매는 여과에 의해 걸러지고, 용매는 진공하에서 농축되어 밝은 황색 고체의 에틸 3-옥소피페리딘-4-카르복실레이트 2(10.2 g, 수율: 98.0%)가 제공된다. ESI-MS (M+H) ⁺: 172.1. ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆) δ: 4.23 (q, 2H), 3.75 (s, 2H), 3.37 (s, 2H), 3.20-3.16 (m, 2H), 2.44 (t, 1H), 1.25 (t, 3H).

1- tert -부틸 4-에틸 3-옥소피페리딘-1,4-디카르복실레이트의 제조. 에틸 3-옥소피페리딘-4-카르복실레이트 2 (10.2 g, 60.0 mmol, 1.0 당량)는 건조 MeOH (200 mL)에 용해되었으며, 그리고 Et₃N (33.1 mL, 240 mmol, 4.0 당량)은 추가되었다. 혼합물은 1 h 동안 교반되었고, Boc₂O (19.5 g, 90.0 mmol, 1.5 당량)가 첨가되었고, 16 h 동안 교반되었다. 용매는 진공하에서 농축되었고, 미정제된 물질은 컬럼 크로마토그래피 (실리카, 석유 에테르/EtOAc =9:1)에 의해 정제되어 밝은 황색 오일로 된 1-tert-부틸 4-에틸 3-옥소피페리딘-1,4-디카르복실레이트 3이 제공되었다(11.5 g, 수율: 86%). ESI-MS (M+H-56) ⁺: 216.0_. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 4.24 (q, 2H), 4.03 (s, 2H), 3.49 (t, 2H), 2.33 (t, 2H), 1.47 (s, 9H), 1.31 (t, 3H).

( S )-1- tert -부틸 4-에틸 3-((1-페닐에틸)아미노)-5,6-디히드로 피리딘-1,4-(2H)-디카르복실레이트의 제조. Dean-스타크 트랩(tark trap) 및 환류 응축기가 구비된 건조 플라스크내 1-tert-부틸 4-에틸 3-옥소피페리딘-1,4-디카르복실레이트 3 (10.0 g, 37.0 mmol, 1.1 당량)이 톨루엔 (100 mL)에 용해되었다. S-(-)-α-M에틸벤질아민 (4.9 g, 40.5 mmol, 1.1 당량) 및 p-톨루엔술폰산 일수화물 (0.7 g, 3.7 mmol, 0.1 당량)이 추가되었고, 혼합물은 16 h 동안 재환류되도록 가열되었다. 미정제된(crude) 반응 혼합물은 진공하에서 농축되어 걸쭉한 오렌지색 오일의 (S)-1-tert-부틸 4-에틸 3-((1-페닐에틸)아미노)-5,6-디히드로 피리딘-1,4(2H)-디카르복실레이트 4 (12.0 g, Y: 88%)가 제공되었으며, 이는 추가 정제없이 다음 단계에 이용되었다. ESI-MS (M+H) ⁺: 375.2.

1- tert-부틸 4-에틸 3-((( S )1-페닐에틸)아미노)-5,6-디히드로 피리딘-1,4(2H) -디카르복실레이트의 제조. 1-tert-부틸 4-에틸 3-(((S)-1-페닐에틸)아미노)피페리딘-1,4-디카르복실레이트 4 (11.2 g, 30.0 mmol, 1.0 당량)는 CH₃CN (60 mL) 및 아세트산(60 mL)의 혼합물에 용해되었으며, 0 ℃로 냉각되었다. NaBH(OAc)₃ (19.0 g, 90.0 mmol, 3.0 당량)가 천천히 추가되었고, 반응 혼합물은 0 ℃에서 2h 동안 교반되었다. 플라스크의 내부 온도는 10 ℃ 아래로 유지되도록 하기 위하여 포화된 NaHCO₃가 천천히 추가되어 용액을 중화시켰다. 혼합물은 EtOAc (50 mL x 3)를 이용하여 추출되었다. 복합된 유기 층은 건조되었고 (Na₂SO₄), 여과되었고, 진공하에서 농축되었고 그 다음 컬럼 크로마토그래피 (실리카, 석유 에테르/EtOAc =9:1)에 의해 정제되어 밝은 황색 오일의 4-에틸 3-(((S)1-페닐에틸)아미노)-5,6-디히드로 피리딘-1,4(2H)-디카르복실레이트 5 (8.2 g, Y: 73%)가 제공되었다. ESI-MS (M+H) ⁺: 377.2. ¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ: 7.31-7.22 (m, 5H), 4.20 (q, 2H), 4.11-3.86 (m, 3H), 3.15 (s, 1H), 3.00-2.90 (m, 2H), 2.64 (d, 2H), 1.87-1.85 (m, 1H), 1.68 (s, 1H), 1.50-1.25 (m, 15H).

trans-1- tert -부틸 4-에틸 3-((( S )-1-페닐에틸)아미노) 피페리딘-1,4-디카르복실레이트의 제조. 1-tert-부틸 4-에틸 3-(((S)-1-페닐에틸)아미노)피페리딘-1,4- 디카르복실레이트 5 (8.0 g, 21.2 mmol, 1.0 당량)는 N₂하에서 건조 EtOH (20 mL)에 용해되었다. 별도의 불꽃-건조된 Schlenk 플라스크에 건조 EtOH (150 mL)를 넣고, 그리고 나트륨 (0.450 g, 63.6 mmol, 3.0 당량)은 N₂하에서 부분적(portion-wise)으로 추가되었다. 혼합물은 N₂하에서 유지시키고, 모든 나트륨이 용해될 때까지 발달된 기체가 배기에 의해 제거되었다. 1-tert-부틸 4-에틸 3-(((S)-1-페닐에틸)아미노)피페리딘-1,4-디카르복실레이트의 맑은 용액은 NaOEt 용액으로 이전되었으며, 혼합물은 80 ℃, N₂ 하에서 16 h 동안 교반되었다. 용매는 진공하에서 제거되었으며, 염수 (150 mL)가 추가되었고, 혼합물의 pH는 1 N NaOH을 이용하여 10으로 조정되었고, EtOAc (100 mL x 3)을 이용하여 추출되었다. 복합된 유기 층들은 건조되었고 (Na₂SO₄), 진공하에서 농축되었다. 잔류물은 컬럼 크로마토그래피 (실리카, 석유 에테르/EtOAc = 5:1)에 의해 정제되어 옅은 황색 고체로 된 (trans)-1-tert-부틸 4-에틸 3-(((S)-1-페닐에틸) 아미노)피페리딘-1,4-디카르복실레이트 6 (3.7 g, 수율: 46%)이 획득되었다. ESI-MS (M+H) ⁺: 377.2.

trans -1- tert -부틸 4-에틸 3-아미노피페리딘-1,4-디카르복실레이트의 제조. trans-1-tert-부틸 4-에틸 3-(((S)-1-페닐에틸)아미노)피페리딘-1,4-디카르복실레이트 6 (3.7 g, 8.3 mmol, 1.0 당량)은 10% Pd/C (0.37 g) 촉매 존재 상태에서 H₂ 하에 30 기압에서 MeOH (100 mL)에서 50 ℃, 8 h 시간동안 수소화되었다. 촉매는 여과에 의해 걸러내었고, 용매는 진공하에서 제거되어 밝은 황색 오일의 (trans)-1-tert-부틸 4-에틸 3-아미노피페리딘-1,4-디카르복실레이트 7 (2.5 g, 수율: 92%)이 수득되었다. ESI-MS (M+H) ⁺: 273.1. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 4.18 (q, 2H), 3.97-3.94 (m, 2H), 3.37 (s, 1H), 3.07-3.02 (m, 1H), 2.89-2.85 (m, 1H), 2.60-2.55 (m, 1H), 2.01-1.91 (m, 1H), 1.70-1.54 (m, 3H), 1.46 (s, 9H), 1.28 (t, 3H).

trans -1- tert -부틸 4-에틸 3-(5-브로모펜탄아미도)피페리딘-1,4-디카르복실레이트의 합성. trans-1-tert-부틸 4-에틸 3-아미노피페리딘-1,4-디카르복실레이트 7 (2.5 g, 9.2 mmol, 1.0 당량) 용액에 CH₂Cl₂ (50 mL), Et₃N (2.5 mL, 18.4 mmol, 2.0 당량)이 실온에서 추가되었다. 반응 용액은 실온에서 10분간 교반된 후, 5-브로모발레릴 클로라이드 (1.9 g, 9.6 mmol, 1.05 eq)가 추가되었다. 반응 용액은 실온에서 2 h 동안 교반되었다. 혼합물은 H₂O (20 mL)으로 진정(quench)되었으며, CH₂Cl₂ (50 mL x 3)을 이용하여 추출되었다. 유기 층이 수집되었고, 진공하에서 농축되었고, 잔류물은 컬럼 크로마토그래피 (실리카, 석유 에테르/EtOAc =1:1)에 의해 정제되어 황색 오일로 된 (trans)-1-tert-부틸 4-에틸 3-(5-브로모펜탄아미도)피페리딘-1,4-디카르복실레이트 8 (3.2 g, 수율: 80%)가 수득되었다. ESI-MS (M+H-56)⁺: 379.0. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 5.99 (d, 1H), 4.39-4.38 (m, 1H), 4.15 (q, 2H), 3.79-3.74 (m, 1H), 3.66-3.60 (m, 1H), 3.41 (t, 2H), 3.30-3.26 (m, 1H), 3.21-3.14 (m, 1H), 2.78-2.74 (m, 1H), 2.19 (t, 2H), 1.99-1.85 (m, 3H), 1.80-1.72 (m, 3H), 1.45 (s, 9H), 1.27 (t, 3H).

trans -1＇- tert -부틸 4＇-에틸 2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘] -1＇,4＇- 디카르복실레이트의 합성. trans-1-tert-부틸 4-에틸 3-(5-브로모펜탄아미도)피페리딘- 1,4-디카르복실레이트 8 (3.0 g, 6.9 mmol, 1.0 당량)/THF (20 mL) 용액에 NaH(276 mg, 6.9 mmol, 1.0 당량)가 0 ℃에서 소분량씩 신중하게 첨가되었다. 반응 용액은 재환류 조건에서 4h 동안 교반되었다. 혼합물은 H₂O (20 mL)으로 진정(quench)되었고, 그리고 EtOAc (30 mL x 3)을 이용하여 추출되었다. 유기 층은 수집되었고, 건조되었고 (Na₂SO₄), 여과되었고, 그리고 진공하에서 농축되었다. 잔류물은 컬럼 크로마토그래피 (실리카, 석유 에테르/EtOAc = 1:2)에 의해 정제되어 옅은 황색 오일의 (trans)-1＇-tert-부틸 4＇-에틸 2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘]-1＇,4＇-디카르복실레이트 9 (2.1 g, 수율: 88%)가 수득되었다. ESI-MS (M+H-56)⁺: 299.1. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 4.10 (q, 4H), 3.38-3.19 (m, 4H), 2.70-2.61 (m, 1H), 2.36-2.31 (m, 2H), 1.95-1.92 (m, 1H), 1.75-1.71 (m, 6H), 1.46 (s, 9H), 1.23 (t, 3H).

실시예 2

trans -1＇-(6-아미노-5-플루오르피리미딘-4-일) -3-((3-클로로-5- (트리플루오르메틸)페닐)아미노)-2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘]-4＇-카르복사미드의 제조

trans -1＇- tert -부틸-4＇-에틸-3-요오드-2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘]-1＇,4＇- 디카르복실레이트. 0 ℃에서 trans-1＇-tert-부틸 4＇-에틸 2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘] -1＇,4＇-디카르복실레이트 8 (141 mg, 2.58 mmol, 1.0 당량)의 건조 톨루엔 (10 mL) 용액에 TMEDA (0.89 g, 7.7 mmol, 3.0 당량) 및 TMSCl (0.6 mg, 1.0 mmol, 2.0 당량)가 N₂ 하에서 연속적으로 추가되었다. 0.5 h 후에, I₂ (0.98 g, 3.87 mmol, 1.5 당량)는 소분량으로 신중하게 추가되었다. 반응 용액은 0 ℃에서 실온으로 16 h 동안 교반되었다. 혼합물은 EtOAc (100 mL)으로 희석되었고, 포화된 Na₂S₂O₃ (20 mL x 2) 및 염수 (20 mL)로 세척되었고, 건조되었고 (Na₂SO₄), 여과되었고, 그리고 진공하에서 농축되었다. 미정제된 산물 9 (2.2 g, Y: 81%)는 추가 정제없이 다음 단계에 바로 이용되었다. ESI-MS (M+H-56)⁺: 424.9.¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 4.78-4.73 (m, 1H), 4.19-4.04 (m, 4H), 3.55-3.30 (m, 4H), 3.24-3.16 (m, 2H), 2.73-2.60 (m, 1H), 2.22-2.14 (m, 2H), 1.96-1.78 (m, 2H), 1.70-1.60 (m, 1H),1.44 (s, 9H), 1.25 (t, J = 7.2 Hz, 3H).

trans -1＇- tert -부틸 4＇-에틸 3-((3-클로로-5-(트리플루오르메틸) 페닐)아미노)-2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘]-1＇,4＇-디카르복실레이트의 제조. 1.0 M의 리튬 비스(트리메틸디실일)아미드/THF (13 mL, 12 mmol, 2.0 당량) 용액은 10-15 ℃에서 투입 깔때기를 통하여 3-클로로-5-(트리플루오르메틸)아닐린 (15 g, 78 mmol, 1.2 당량)/THF (13 mL) 용액에 추가되었다. 혼합물은 실온에서 20분 동안 교반되었고, 미정제된 trans-1＇-tert-부틸-4＇-에틸-3-요오드-2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘]-1＇,4＇- 디카르복실레이트 9 (3.7 g, 65 mmol, 1.0 당량)의 THF (13 mL) 용액은 30분간에 걸쳐 10-15 ℃에서 투입 깔때기를 통하여 첨가되었다. 첨가 후, 반응물은 이 온도에서 30분간 교반되었다. 완료될 때, 반응물은 5 ℃으로 냉각되었고, 물 (10 mL)을 이용하여 서서히 반응이 진정되었고, 온도는 20 ℃ 아래에서 유지되었다. 진정된(quenched) 반응물은 EtOAc (2 x 30 mL)을 이용하여 추출되었다. 복합된 유기 층들은 포화된 염수 (30 mL)로 세척되었고, 건조되었고 (Na₂SO₄), 여과되었고, 그리고 진공하에서 농축되었다. 생성된 미정제된 산물은 실리카 겔에서 10% 내지 75%의 EtOAc/헵탄 그라디언트 용리에 의해 정제되어 소요의 산물 10이 수득되었다. ESI-MS (M+H-56)⁺: 463.1. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 6.92 (s, 1H), 6.71-6.69 (m, 2H), 4.17-4.06 (m, 4H), 3.78-3.68 (m, 2H), 3.46-3.36 (m, 3H), 3.23-3.07 (m, 2H), 2.73-2.65 (m, 1H), 2.44-2.37 (m, 1H), 2.03-1.85 (m, 3H), 1.71-1.61 (m, 2H), 1.46 (s, 9H), 1.27-1.19 (m, 3H).

1＇-( tert -부톡시카르보닐)-3-((3-클로로-5-(트리플루오르메틸) 페닐) 아미노) -2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘]-4＇-카르복실산의 합성. trans-1＇-tert-부틸 4＇-에틸 3-((3-클로로-5-(트리플루오르메틸)페닐)아미노)-2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘]-1＇,4＇-디카르복실레이트 10 (180 mg, 0.33 mmol, 1.0 당량)의 EtOH (5 mL) 용액에 NaOH(40 mg, 0.99 mmol, 3.0 당량)가 추가되었으며, 이 용액은 80 ℃에서 1 h 동안 교반되었다. 용매은 진공하에서 농축되었고, 잔류물은 물 (10 mL)에 현탁되었고, HCl (4 N)을 이용하여 pH는 6으로 조정되었다. 침전물이 여과되어 황색 고체로 된 (trans)-1＇-(tert-부톡시카르보닐)-3-((3-클로로-5-(트리플루오르메틸)페닐)아미노)-2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘]-4＇-카르복실산 11 (150 mg, Y: 82%)이 수득되었고, 추가 정제없이 다음 단계에 이용되었다. ESI-MS (M+H-85)⁺: 463.1. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 6.85 (s, 1H), 6.82 (s, 1H), 6.78 (s, 1H), 4.12-3.96 (m, 4H), 3.53-3.37 (m, 2H), 3.11-3.04 (m, 2H), 2.75-2.67 (m, 1H), 2.24-2.18 (m, 1H), 1.98-1.89 (m, 3H), 1.71-1.58 (m, 2H), 1.44 (s, 9H).

trans - tert -부틸 4＇-카르바모일-3-((3-클로로-5-(트리플루오르메틸) 페닐)아미노)-2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘]-1＇-카르복실레이트의 합성. trans 1＇-(tert-부톡시카르보닐)-3-((3-클로로-5-(트리플루오르메틸)페닐)아미노)-2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘]-4＇-카르복실산 11 (70 mg, 0.14 mmol, 1.0 당량)의 DMF (2 mL) 용액에 NH₄Cl (22 mg, 0.41 mmol, 3.0 당량), HBTU (103 mg, 0.270 mmol, 2.0 당량) 및 DIPEA (52 mg, 0.41 mmol, 3.0 당량)가 첨가되었다. 반응 용액은 실온에서 16 h 동안 교반되었고, EtOAc (10 mL)로 희석되었고, 물 (5 mL) 및 염수 (5 mL)로 세척되었다. 유기 상은 분리되었고, 진공하에서 농축되어 미정에 오일이 수득되었고 프레-HPLC (MeOH/H₂O과 0.05% TFA, 이동상)에 정제되어 가벼운 고체로 된 화합물 (trans)-tert-부틸4＇-카르바모일-3-((3-클로로-5-(트리플루오르메틸) 페닐) 아미노)-2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘]-1＇-카르복실레이트 12 (60 mg, 수율: 86%)가 수득되었다. ESI-MS (M+H-56)⁺: 463.1. ¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ: 6.87-6.86 (m, 1H), 6.84-6.83 (m, 1H), 6.80 (s, 1H), 4.11-4.03 (m, 3H), 3.53-3.35 (m, 2H), 3.20-3.08 (m, 2H), 2.77-2.74 (m, 1H), 2.25-2.18 (m, 1H), 1.99-1.88 (m, 3H), 1.70-1.60 (m, 2H), 1.46 (s, 9H).

trans -3-((3-클로로-5-(트리플루오르메틸)페닐)아미노) -2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘]-4＇-카르복사미드의 합성. trans-tert-부틸 4＇-카르바모일-3-((3-클로로-5- (트리플루오르메틸)페닐)아미노)-2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘]-1＇-카르복실레이트 12 (60 mg, 0.11 mmol)의 CH₂Cl₂ (1.0 mL) 용액에 실온에서 CF₃CO₂H (1.0 mL)가 추가되었다. 반응 혼합물은 실온에서 2 h 동안 교반되었고, 진공하에서 농축되었어 원하는 산물 13 (43 mg, 90%)이 수득되었으며, 추가 정제없이 다음 단계에 바로 이용되었다. ESI-MS (M+H)⁺: 419.0.

trans -1＇-(6-아미노-5-플루오르피리미딘-4-일)-3- ((3-클로로-5-(트리플루오르메틸)페닐)아미노)-2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘]-4＇-카르복사미드의 합성. trans-3-((3-클로로-5-(트리플루오르메틸)페닐)아미노) -2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘]-4＇-카르복사미드 13 (42 mg, 0.10 mmol, 1.0 당량)의 1-부탄올 (2 mL), 6-클로로-5-플루오르피리미딘-4-아민 (18 mg, 0.12 mmol, 1.2 당량) 용액에 DIPEA (26 mg, 0.20 mmol, 2.0 당량)가 추가되었다. 반응 용액은 120 ℃에서 16 h 동안 교반되었다. 혼합물은 EtOAc (20 mL)으로 희석되었고, H₂O (10 mL) 및 염수 (10 mL)로 세척되었고, 건조되었고 (Na₂SO₄), 여과되었고, 그리고 진공하에서 농축되었다. 미정제된 물질은 프레-HPLC (MeOH/H₂O와 0.05% TFA 이동상)에 의해 정제되어 황색 고체로 된 화합물 (trans)-1＇-(6-아미노-5-플루오르피리미딘-4-일)-3-((3-클로로-5- (트리플루오르메틸)페닐)아미노)-2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘] -4＇-카르복사미드 14 (44 mg, 수율: 83%)가 수득되었다. ESI-MS (M+H)⁺: 530.0. HPLC: (214 nm: 100%, 254 nm: 100%). ¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ: 7.97 (s, 1H), 6.84 (s, 1H), 6.81 (s, 1H), 6.76 (s, 1H), 4.58-4.52 (m, 2H), 4.09-4.03 (m, 1H), 3.52-3.35 (m, 3H), 3.29-3.27 (m, 4H), 3.12-3.05 (m, 1H), 2.24-2.17 (m, 1H), 2.02-1.91 (m, 3H), 1.80-1.63 (m, 2H).

(3 R ,3 ＇R ,4 ＇S )-1＇-(6-아미노-5-플루오르피리미딘-4-일)-3-((3-클로로-5-(트리플루오르메틸) 페닐)아미노)-2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘]-4＇-카르복사미드. 화합물 14의 4가지 부분입체이성질체 혼합물은 SFC (IA(2 x 15 cm), 30% EtOH (0.1% DEA)/CO₂, 100 bar, 60 ml/min)에 의해 3개 피크로 분리되었고, 표제 화합물은 피크 3에 해당된다. LCMS (Agilent460, 254 nm): ES (+) MS m/e = 530.1 (M+1) ＠ 1.20 min. ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 7.77 (d, J = 2.01 Hz, 1H), 7.38 (br. s., 1H), 6.94 (s, 2H), 6.75 - 6.87 (m, 2H), 6.41 - 6.66 (m, 3H), 4.29 (br. s., 1H), 4.23 (d, J = 13.05 Hz, 1H), 3.96 - 4.18 (m, 2H), 3.44 (td, J = 6.15, 12.30 Hz, 1H), 3.24 - 3.33 (m, 1H), 3.10 (br. s., 1H), 2.88 (br. s., 1H), 2.82 (t, J = 12.30 Hz, 1H), 2.13 (qd, J = 5.94, 12.30 Hz, 1H), 1.74 - 1.93 (m, 3H), 1.58 - 1.74 (m, 1H), 1.41 - 1.58 (m, 1H).

(3 S ,3 ＇R ,4 ＇S )-1＇-(6-아미노-5-플루오르피리미딘-4-일)-3-((3-클로로-5-(트리플루오르메틸)페닐)아미노)-2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘]-4＇-카르복사미드. 화합물 14의 4가지 부분입체이성질체 혼합물은 SFC (IA(2 x 15 cm), 30% EtOH (0.1% DEA)/CO₂, 100 bar, 60 ml/min)에 의해 3개 피크로 분리되었고, 표제 화합물은 피크 2에 해당된다 LCMS (Agilent460, 254 nm): ES (+) MS m/e = 530.1 (M+1) ＠ 1.19 min. ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 7.77 (d, J = 1.76 Hz, 1H), 7.39 (br. s., 1H), 6.98 (s, 1H), 6.96 (s, 1H), 6.72 - 6.88 (m, 2H), 6.57 (s, 2H), 6.54 (d, J = 7.78 Hz, 1H), 4.05 - 4.33 (m, 4H), 3.37 (t, J = 6.27 Hz, 2H), 3.11 (br. s., 1H), 2.94 (br. s., 1H), 2.82 (t, J = 12.30 Hz, 1H), 2.02 - 2.16 (m, 1H), 1.75 - 1.92 (m, 3H), 1.57 - 1.74 (m, 1H), 1.36 - 1.54 (m, 1H).

(3 S ,3 ＇S ,4 ＇R )-1＇-(6-아미노-5-플루오르피리미딘-4-일)-3-((3-클로로-5-(트리플루오르메틸)페닐)아미노)-2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘]-4＇-카르복사미드. 화합물 14의 4가지 부분입체이성질체 혼합물은 SFC (IA(2 x 15 cm), 30% EtOH (0.1% DEA)/CO₂, 100 bar, 60 ml/min)에 의해 3개 피크로 분리되었다. 3개 피크중 피크 1은 SFC (AD-H (2 x 15cm), 30% iPrOH (0.1% DEA)/CO₂, 100 bar, 60 ml/min)에 의해 추가 정제되어 상기 표제 화합물이 획득되었다. LCMS (Agilent 460, 254 nm): ES (+) MS m/e = 530.1 (M+1) ＠ 1.20 min. ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 7.77 (d, J = 1.76 Hz, 1H), 7.38 (br. s., 1H), 6.94 (s, 2H), 6.83 (s, 1H), 6.80 (s, 1H), 6.42 - 6.66 (m, 3H), 4.18 - 4.47 (m, 2H), 3.95 - 4.18 (m, 2H), 3.39 - 3.52 (m, 1H), 3.24 - 3.31 (m, 1H), 3.10 (br. s., 1H), 2.88 (br. s., 1H), 2.82 (t, J = 12.30 Hz, 1H), 2.13 (qd, J = 5.91, 12.39 Hz, 1H), 1.73 - 1.92 (m, 3H), 1.58 - 1.73 (m, 1H), 1.42 - 1.58 (m, 1H).

(3 R ,3 ＇S ,4 ＇R )-1＇-(6-아미노-5-플루오르피리미딘-4-일)-3-((3-클로로-5-(트리플루오르메틸)페닐)아미노)-2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘]-4＇-카르복사미드. 화합물 14의 4가지 부분입체이성질체 혼합물은 SFC (IA(2 x 15cm), 30% EtOH (0.1% DEA)/CO₂, 100 bar, 60 ml/min)에 의해 3개 피크로 분리되었다. 3개 피크중 피크 1은 SFC (AD-H (2 x 15cm), 30% iPrOH (0.1% DEA)/CO₂, 100 bar, 60 ml/min)에 의해 추가 정제되어 상기 표제 화합물이 획득되었다. LCMS (Agilent 460, 254 nm): ES (+) MS m/e = 530.1 (M+1) ＠ 1.20 min. ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ) δ: 7.77 (d, J = 1.76 Hz, 1H), 7.39 (br. s., 1H), 6.98 (s, 1H), 6.96 (s, 1H), 6.73 - 6.88 (m, 2H), 6.57 (s, 2H), 6.54 (d, J = 7.78 Hz, 1H), 4.05 - 4.35 (m, 4H), 3.37 (t, J = 6.15 Hz, 2H), 3.12 (br. s., 1H), 2.94 (br. s., 1H), 2.82 (t, J = 12.30 Hz, 1H), 2.09 (sxt, J = 5.80 Hz, 1H), 1.74 - 1.92 (m, 3H), 1.56 - 1.73 (m, 1H), 1.36 - 1.52 (m, 1H).

실시예 3

(3 R ,3 ＇R ,4 ＇S )-1＇-(6-아미노-5-플루오르피리미딘-4-일)-3-((3-클로로-5-(트리플루오르메틸) 페닐)아미노)-2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘]-4＇-카르복사미드의 대체 합성.

실시예 2에서 설명된 방법에 추가하여, (3R,3＇R,4＇S)-1＇-(6-아미노-5-플루오르피리미딘-4-일)-3-((3-클로로-5-(트리플루오르메틸) 페닐)아미노)-2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘]-4＇-카르복사미드 (화합물 I-1)은 계획 6에 따라 합성되었다.

계획 6

1- ter- 부틸 4-에틸 3-옥소피페리딘-1,4-디카르복실레이트 3-2. 3-1 (5.0 kg, 19.1 mol, 1.0 당량)의 EtOH (50 L) 용액에 N₂하에서 (Boc)₂O (4.2 kg, 19.1 mol, 1.0 당량), Et₃N (1.9 kg, 19.1 mol, 1.0 당량) 그리고 10% Pd(OH)₂/C (250 g, 10%w/w)가 추가되었다. 비우고 수소첨가를 3회 실시한 후, 혼합물은 50 ℃에서 15 hr 동안 1 atm의 수소하에서 교반되었다. LC-MS에서 3-1의 완전한 소모됨이 표시된다. 혼합물이 실온으로 냉각된 후, 촉매는 셀라이트 층을 통하여 여과되었고, 그리고 EtOH (2.5 L)를 이용하여 세척되었다. 여과액은 진공하에서 농축되어 오일의 미정제된 3-2 (5.2 kg)가 획득되었으며, 이는 추가 정제없이 다음 단계에 이용되었다.

(S)-1- tert -부틸 4-에틸 3-((1-페닐에틸)아미노)-5,6-디히드로피리딘-1,4 (2H)-디카르복실레이트 (3-3). Dean-Stark 기구가 구비된 100L 반응기에 톨루엔 (20 L), 톨루엔 (30 L)으로 세척된 미정제된 화합물 3-2 (5.2 kg, 19.1 mol, 1.0 당량), pTSA (329 g, 0.2 mol, 0.01 당량), 및 S-(-)-α-메틸벤질아민 .95 kg, 16.2 mol, 0.85 당량)을 채워넣었다. 혼합물은 질소 블랭킷과 함께 재환류되도록 가열되었고, Dean-Stark를 통하여 물이 제거되었다. 18 시간 후, LC-MS에서 3-2의 완전한 소모됨이 표시된다. 그 다음 혼합물은 실온으로 냉각되었다. 여과를 통하여 불용성 물질은 제거되었고, 여과액은 진공하에서 농축되어 건조되면 걸쭉한 오일의 미정제된 3-3이 수득되었다. 이러한 미정제된 산물은 추가 정제없이 다음 단계에 이용되었다. 이 반응에서 형성된 3-10%의 아미드 부산물과 이의 구조는 LC-MS 데이터에 근거하여 실험적으로 할당되었다.

(3R)-1-tert-부틸 4-에틸 3-(((S)-1-페닐에틸)아미노)피페리딘-1,4-디카르복실레이트 (3-4). 질소 하에서 NaBH₄ (1.16 kg, 30.5 mol, 2.0 당량) 및 무수 THF (60 L)로 채워진 100L 반응기에 온도는 0~5 ℃으로 유지시키면서 30분에 걸쳐 서서히 TFA (10.5 kg, 92 mol, 6.0 당량)가 추가되었다. 그 다음 혼합물은 -45℃로 냉각되었다. 분리 반응기에서 미정제된 산물 3-3은 무수 아세토니트릴 (30 L)에 용해되었고, 이는 내부 온도는 -45~-30℃에서 유지되면서 NaBH₄/TFA의 상기 용액에 천천히 첨가되었다. 혼합물은 -45 ℃ 에서 1 h 동안 교반되었고, 이 시간 이후 HPLC에서 화합물 3-3의 완전한 소모가 확인되었다. 혼합물은 얼음물 (50 kg)로 천천히 희석되었고, 그 다음 혼합물은 10 ℃로 데워졌다. 생산물은 EtOAc (2 x 40 L)을 이용하여 추출되었고, 복합된 유기 층들은 포화된 NaHCO₃ 용액 (20 L)으로 세척되었다. 수성 용액의 pH는 ~8이었다. 유기 층들은 건조되었고(Na₂SO₄), 진공하에서 농축되어 거의 건조되면 잔류물이 수득되고, MeOH (10 L x 3)으로 추가 공비(azeotroped)화되어 과량의 EtOAc가 제거되었다. 끝에 미정제된 3-4의 MeOH 용액 10L가 획득되었으며, 추가 정제없이 후속 단계에 바로 이용되었다. ESI-MS (M+H-1)⁺: 377.2. ¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ: 7.31-7.22 (m, 5H), 4.20 (q, 2H), 4.11-3.86 (m, 3H), 3.15 (s, 1H), 3.00-2.90 (m, 2H), 2.64 (d, 2H), 1.87-1.85 (m, 1H), 1.68 (s, 1H), 1.50-1.25 (m, 15H).

(3R)-1-( tert -부톡시카르보닐)-3-((( S )-1-페닐에틸)아미노)피페리딘-4-카르복실산 (3-5). THF/MeOH (1:1, 80 L)으로 채워진 100L 반응기에 물(10 L)에 LiOH·H₂O (2.5 kg, 60 mol, 4.0 당량)의 용액과 상기 단계에서 얻은 MeOH (10 L)내 미정제된 3-4의 용액이 추가되었다. 생성된 혼합물은 22 ℃에서 18 시간 동안 교반되었고, 이때 LC/MS에서 출발 물질 3-4는 완전하게 소모되었다는 것을 알수 있다. 용액은 MTBE (40 L)으로 희석되었고, 20분간 교반되었다. 수성 층 분리되었고, 0 ℃로 냉각되었으며, 내부 온도는 10 ℃ 미만으로 유지되면서 3N HCl 용액으로 중화되어 pH는 7-8이었다. 이 용액은 LC/MS에서 수성 층에 산물 3-5가 남아있지 않을 때까지 DCM (5 x 30 L)으로 세척되었다. 복합된 유기 층들은 진공하에서 농축되었고 건조되며, EtOAc 및 석유 에테르 (2:1, 10 L)에 현탁되었고, 2시간 동안 교반되었으며, 고체는 여과되었고, 석유 에테르 (5 L)에 의해 세척되고, 진공 및 50 ℃에서 18 시간 동안 건조되어 95% 순도의 고체로 된 산물 (3.5 Kg, 53% 수율)을 얻었다. 화합물 3-5는 C-4에서 ~30:70 trans/cis이고, C-3에서 ~93:7 R:S 인 혼합물이다. 3-1의 전반적인 평균 수율은 43-55%이었다. ESI-MS (M+H-1)⁺: 349.2. ¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ: 8.22-8.06 (m, 5H) 4.11 (m, 1H), 3.86-3.82 (m, 1H), 3.59-3.56 (m, 1H), 2.79-2.65 (m, 1H), 3.22- 2.62 (m, 2H), 2.06 - 2.16 (m, 12H).

(3R)-1-(6-아미노-5-플루오르피리미딘-4-일)-3-((( S )-1-페닐에틸)아미노)피페리딘-4-카르복실산 (3-7). 50 L 반응기에 10 L의 2N HCl 및 3-5 (850 g, 2.44 mol, 1.0 당량)를 채워넣었다. 혼합물은 30 ℃로 데워졌고, 2시간 동안 교반되었으며, 이시점에서 출발 물질 3-5는 완전히 소모되었음을 나타낸다. 용액은 MTBE (4 L)로 희석되었고, 20분간 교반되었으며, 층들이 분리되었고, 수성층에 1시간에 걸쳐 고체 K₂CO₃(660 g)가 첨가되어 pH ~7이 되었다. 추가 K₂CO₃ (660 g, 4.8 mol, 2.0 당량)가 첨가되고, 이어서 6-클로로-5-플루오르피리미딘-4-일아민 (360 g, 2.44 mole 1.0 당량) 및 1,4-디옥산 (5 L)이 추가되었다. 혼합물은 100 ℃에서 부드럽게 재환류되도록 가열되었으며, 이 온도에서 16시간 동안 교반되었다. HPLC에 의해 화합물 3-6이 2% 미만으로 남아있음이 확인되었다. 혼합물은 DCM (2 x 5 L)으로 세척되었으며, 유기 세척 용액은 버렸다. 수성층은 슬러리를 30 ℃ 1시간 동안 교반시키고, 규조토를 통하여 여과시킴으로써 활성 탄소 (425 g)로 처리되었다. 이러한 활성 탄소 처리가 반복되었다. 생성된 수성 용액은 농축 HCl을 이용하여 pH~7로 중화되었고, 22 ℃에서 3시간 동안 교반되었고, 생성된 슬러리는 여과되었고 젖은 케익은 1,4-디옥산/물 (1:1, 1.2 L)으로 세척되었고, 산물 3-7의 KF가 ~0.5%가 될 때까지 진공하에 50 ℃에서 18 hr 시간 동안 건조되어 98.6%의 순도를 가진 옅은 백색 고체로 수득되었다 (690 g, 81% 수율). 이 산물은 C3 및 C4 위치에서 1:9 cis/trans 이성질체 혼합물을 포함한다. ESI-MS (M+H-1)⁺: 460.2. ¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ: 8.49 (d, J = 2.01 Hz, 1H), 8.21-8.14 (m, 5H) 4.94-4.90 (m, 1H), 4.63 (d, J = 11.55 Hz, 1H), 4.42 (m, 1H), 4.03 (m, 2H), 3.59 - 3.72 (m, 3H), 2.84 - 2.93 (m, 1H), 2.20 - 2.31 (m, 1H), 2.15 (d, J = 6.78 Hz, 3H).

(3R)-3-아미노-1-(6-아미노-5-플루오르피리미딘-4-일)피페리딘-4-카르복실산 (3-8). 10 L 반응기에 N₂ 하에서 i-PrOH (3.5 L), H₂O (3.5 L), 3-7 (1.0 당량, 0.97 mol, 350 g), 불화칼륨 단수화물 (290 g, 3.0 eq, 3.0 mol) 및 35 g의 20% Pd(OH)₂/C (10% v/w)을 채워넣었다. 수소로 배출/재충전을 3차례 한 후, 혼합물은 40-50 ℃로 데우고, 수소 1 기압하에서 이 온도에서 활발하게 교반되었다. 18시간 후, LC/MS에 의해 1% 미만의 출발 물질 3-7이 남아있음이 확인되었다. 혼합물은 N₂로 20분간 정화된 후 22 ℃으로 냉각되고, 여과되었다. 젖은 케익 및 여과액 모두에 이 산물이 포함되어 있었고, 별도로 처리되었다.

여과액은 50 ℃ 진공하에서 ~200 mL의 용적으로 농축되었다. 20 ℃로 냉각된 후, 이 온도에서 2시간 동안 교반된 후, 슬러리가 획득되었고, 고체는 여과되었고, 물 (400 mL)로 세척된 후, 진공하에 50 ℃에서 건조되어 산물 3-8 (65 g)이 수득되었다. 반응 여과로부터 얻은 젖은 케익은 2시간 동안 1N HCl (1 L)에서 교반되어 이 산물이 용해되었고, 남아있는 촉매 고체는 여과에 의해 제거되었다. 산성 여과액은 고체 LiOH를 이용하여 pH ~7로 중화되어 산물 3-8이 침전되었다. 이 산물은 물 (200 mL)로 세척되었고, 진공하에 50 ℃에서 건조되어 120 g의 산물이 수득되었다. 총 185 g의 산물이 수득되었고, H NMR에 기초하면 98.7% 순도와 수율은 75%였다. 모든 모액이 복합되었고, ~400 mL의 용적으로 농축되어 슬러리가 되었으며 여과 및 물로 세척 그리고 건조에 의해 ~50% 순도를 가진 고체 64g이 추가로 수득되었다. ¹H NMR (400 MHz, D₂O): δ 7.77 (s, 1H) 4.12 (d, J = 14.05 Hz, 1H), 4.01 (d, J = 13.05 Hz, 1H), 3.26 (d, J = 13.80 Hz,1), 2.99 - 3.10 (m, 1H), 2.64 - 2.73 (m, 1H), 1.98 (dd, J = 3.39, 14.18 Hz, 1H), 1.74 - 1.87 (m, 1H).

((3R,3'R)-1'-(tert-부톡시카르보닐)-3-((3-클로로-5-(트리플루오르메틸)페닐)아미노)-2-옥소-[1,3'-바이피페리딘]-4'-카르복실산 (3-10). 3-8 (440 g, 1.9 mole, 1.0 당량)의 DMSO (10 L) 용액에 순차적으로 3-8A (640 g, 1.9 mole, 1.0 당량) 및 트리아세톡시보로하이드리드 나트륨 (STAB, 402.0 g, 3.8 mole, 2 당량) 그리고 Et₃N (, 190 g, 1.9 mol, 1.0 당량)가 추가되었다. 혼합물은 50 ℃로 가열되었고, 3시간 동안 교반되어 HPLC에 의해 중간생성물 3-9로 완전하게 전환되었음을 보여주었다.

용액은 MeOH (182 g, 5.7 mol, 3.0 eq,)로 여과되어 과량의 STAB는 소멸되고, 반응물은 70~80 ℃로 가열되었다. 16시간 후, HPLC에 의해 산물 3-10의 22%가 형성되었으며, 61% 중간생성물 3-9가 남아있음이 확인되었고, 키랄 HPLC는 ~3% 락탐 에피머를 나타내었다. 혼합물은 추가 24시간 동안 70-80 ℃에서 유지되어 50%의 3-10, 35%의 3-9, 및 7%의 락탐 에피머를 제공하였다. 추가 40시간의 교반 후, 80%의 3-10이 형성되었고, 4%의 3-9가 남아있었고, 그리고 락탐 에피머는 14%로 증가되었다. 혼합물은 22 ℃로 냉각되었으며, 2N NH₄Cl 용액 (5 L)으로 진정되어 슬러리 혼합물이 수득되었다. 30분 교반 후, 혼합물은 여과되었고 젖은 케익은 물 (3 L)로 세척되고, KF<0.1일 때 까지 55 ℃ 진공에서 건조되었다. 미정제된 3-10은 갈색 고체로 수득되었고(850 g, 97.7%); 키랄 HPLC는 12.5% 락탐 에피머임을 나타내었다. 이 산물은 추가 정제없이 다음 단계에 바로 이용되었다.

(3R,3＇R,4＇S)-1＇-(6-아미노-5-플루오르피리미딘-4-일)-3-((3-클로로-5-(트리플루오르메틸)페닐)아미노)-2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘]-4＇-카르복실산 (3-10-trans). 맑은 용액을 제공하기 위하여 10 L 반응기에 N₂ 하에서 3-10 (850 g, 1.9 mol, 1.0 당량)/DMF (4.25 L, 5 v/w)를 충전하고, 4-디메틸아미노피리딘 (DMAP 116g, 0.95 mol, 0.5 당량) 및 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 (EDCI, 36.5 g, 0.19 mol, 0.1 당량)가 추가되었다. 이 혼합물은 15 내지 22 ℃에서 약 1 시간 동안 교반된 후, 추가 EDCI ( 36.5 g, 0.19 mol, 0.1 당량)가 추가되었고, 또다른 1 시간 동안 교반되었다. HPLC에서 69:1 trans/cis 혼합물로 나타났다. 산물 3-10-trans는 단리되지 않았고, 단일-포트에서 화합물 I-1로 전환되었다. ¹H NMR (300 MHz, DMSO d ₆ ): δ 1.47-1.55 (m, 1H), 1.63-1.68 (m, 1H), 1.81-1.87 (m, 1H), 1.90-1.97 (m, 1H), 2.93-3.19 (m, 1H), 3.16-3.23 (m, 1H), 3.33-3.45 (m, 2H) 4.07-4.33 (m, 3H), 6.80 (m, 1H), 6.94-6.98 (m, 1H), 7.10-7.16 (m, 2H), 7.91 (s, 1H).

(3R,3＇R,4＇S)-1＇-(6-아미노-5-플루오르피리미딘-4-일)-3-((3-클로로-5-(트리플루오르메틸)페닐)아미노)-2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘]-4＇-카르복사미드 (I-1). 상기 반응 혼합물에 22 ℃에서 O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'- 테트라메틸우라늄 헥사플로오르포스페이트 (HATU, 600 g, 1.9 mol, 1.0 당량), N,N-디이소프로필에틸아민 (DIPEA, 1.0 kg, 9.5 mol, 5.0 당량) 그리고 끝으로 NH₄Cl (260 g, 5.7 mol, 3.0 당량)이 충전되었다. 생성된 혼합물은 15 ℃에서 1 시간 동안 교반되었고, HPLC에서 3-10-trans가 완전히 소비되었음이 나타났고, 이 혼합물을 염수 (25 L)에 붇고, EtOAc (2 x 2L)로 추출되었다. 복합된 유기물은 염수 (2 x 2L)로 세척되었고, 45 ℃ 이하 진공하에서 농축되어 건조되어 미정제된 I-1이 되었으며, 이는 EtOAc/석유 에테르/MeOH (1:1:0 내지 50:50:10)에 의해 정제되어 3개 분획이 제공되었으며, 이 분획에는 각각 차례로 316 g, 98.8% 화학적 순도 및 10.8% 에피머, 160 g, 82.3% 화학적 순도 및 17.5% 에피머 그리고 180 g, 61% 순도 및 11.3% 에피머가 포함되었다. 상기 처음 두 개의 분획은 복합되어 프레-HPLC에 의해 추가 정제되어 >99% 순도 및 <1% 에피머를 가진 200g 산물이 수득되었다. ¹H NMR (400 MHz, DMSO d ₆ ): δ 1.48-1.53 (m, 1H), 1.66-1.69 (m, 1H), 1.77-1.79 (m, 3H), 2.11-2.16 (m, 1H), 2.80-2.88 (m, 2H), 3.11 (s, 1H), 3.42-3.48 (m, 1H), 4.0-4.25 (m, 4H), 6.58 (s, 3H), 6.80-6.85 (d, J = 10.2, 2H), 6.95 (s, 2H), 7.40 (s, 1H), 7.77 (s, 1H).

실시예 4

(3 R ,3 ＇R ,4 ＇S )-1＇-(6-아미노-5-플루오르피리미딘-4-일)-3-((3-클로로-5-(트리플루오르메틸)페닐)아미노)-2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘]-4＇-카르복사미드의 대체 합성.

실시예 2와 3에서 설명된 방법에 추가하여, 계획 6에 따라 (3R,3＇R,4＇S)-1＇-(6-아미노-5-플루오르피리미딘-4-일)-3-((3-클로로-5-(트리플루오르메틸) 페닐)아미노)-2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘]-4＇-카르복사미드 (화합물 I-1)가 또한 합성되었다.

계획 7

(3R)-3-아미노-1-( tert -부톡시카르보닐)피페리딘-4-카르복실산 (4-L-6). 질소하에 10 L 반응기에 화합물 4-5 (100 g, 0.287 mole), MeOH (6 L, 60 v/w) 및 10 g의 20% Pd(OH)₂/C이 충전되었다. 이 반응기는 수소로 배출/재충전이 3차례되었고, 혼합물은 3 Mpa의 수소하에 40 시간 동안 교반되면서 40-50 ℃로 데워졌다. LC/MS에서 출발 물질 4-5의 완전한 소모가 나타났다. 혼합물은 22 ℃로 냉각되었고, 여과되었고, 여과액은 진공하에서 농축되어 건조되었고 고체 산물이 수득되었다. 이 미정제된 산물은 EtOH (500 mL)안에서 22 ℃에서 2 시간 동안 슬러리화되었고, 여과되었고, 진공하에 50 ℃에서 건조되어 85% 수율의 백색 고체로 된 산물 4-L-6 (60 g, 0.245 mole)이 수득되었다.

(3R)-1-(tert-부톡시카르보닐)-3-(((R)-4-((3-클로로-5-(트리플루오르메틸)페닐)아미노)-5-에톡시-5-옥소펜틸)아미노)피페리딘-4-카르복실산 (4-L-8). 4-L-6 (48.4 g, 0.197 mole)의 DMSO (450 mL) 용액에 Et₃N (20.2 g, 0.199 mole, 1 당량), 3-8A (67.4 g, 0.199 mole, 1 당량) 및 트리아세톡시보로하이드리드 나트륨 (STAB, 84.8 g, 0.40 mole, 2.0 당량)이 추가되었다. 혼합물은 30분에 걸쳐 50 ℃로 가열되었고, 그 온도에서 3시간 동안 교반되었다. LC/MS에서 출발 물질 4-L-6의 대부분이 소모되었고, 4-L-8이 형성됨이 나타났다.

EtOH (35 mL)를 추가하고, 50 ℃에서 30 분간 교반시켜 반응은 진정되었고, 혼합물은 75-85℃에서 3일간 가열되었다 혼합물은 18 ℃로 냉각되었고, 슬러리를 만들기 위하여 활발하게 교반시키면서 물 (6 L)로 이동시켰다. 2 시간 후, 고체는 여과되었고, 물 (3 x 3 L)로 세척된 후, 진공하에 60-70 ℃에서 24 시간 동안 건조되어 갈색 고체로 된 4-L-9 (114 g)가 획득되었다. 고체는 후속 단계에 바로 이용되었다.

(3R,3＇R,4＇S)-1＇-(tert-부톡시카르보닐)-3-((3-클로로-5-(트리플루오르메틸)페닐)아미노)-2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘]-4＇-카르복실산 (4-L-9-trans). 미정제된 4-L-9 (100 g)의 DMF (500 mL) 용액에 4-디메틸아미노피리딘 (11 g, 0.09 mole, 0.5 당량)이 추가되었고, 20 ℃에서 10 분간 교반되었으며, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 (7.0 g, 0.036 mole, 0.2 당량)이 추가되었고, 반응물은 20 ℃에서 3 시간 동안 교반되었다. HPLC에서 57:43의 cis/trans 혼합물 및 추가 EDAC (3.5 g, 0.018 mole, 0.1 당량)가 추가되었음을 확인하였다. 5 시간 후, HPLC에서 4-L-9-trans로 완전하게 전환되었음을 확인하였다. 혼합물은 서서히 물 (2.25 L)로 이동되었으며, 혼합물은 EtOAc (2 x 500 mL)으로 추출되었고, 유기 층들은 염수 (500 mL) 및 물 (500 mL)로 세척되었고, 진공하에서 농축되어 건조되어 갈색 고체로 된 미정제 4-L-9-trans (100 g)가 획득되었다. 미정제물은 60 ℃에서 EtOAc (135 mL)에 용해되고, 그 다음 1시간에 걸쳐 20 ℃로 냉각된 후, 50 mL 석유 에테르가 추가되었다. 혼합물은 2 시간 동안 숙성되었다(aged). 고체는 여과되었고, 3:1 EtOAc/석유 에테르 (50 mL)로 세척되었고, 진공하에 50 ℃에서 16 시간 동안 건조되어 4-L-9-trans (23 g, 22% 수율, 99% 순도)가 획득되었다.¹H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ) δ 6.94 (s, 2H), 6.81 (s, 1H), 6.54 - 6.61 (m, 1H), 3.99 - 4.08 (m, 1H), 3. 42 - 3.38 (m, 2H), 2.07 - 2.16 (m, 1H), 1.74 - 1.92 (m, 3H), 1.39 (s, 9H).

(3R,3＇R,4＇S)-3-((3-클로로-5-(트리플루오르메틸)페닐)아미노)-2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘]-4＇-카르복실산 히드로클로라이드 (4-L-10 trans). 0.5N HCl의 EtOAc (76 mL) 용액에 4-L-9 trans (20 g, 38 mmol)를 추가하고 20 ℃에서 18 시간 동안 가열하여 슬러리를 만들었다. 고체는 여과되었고, EtOAc (5 mL)으로 세척되었고, 진공하에서 45 ℃에서 18 h 동안 건조되어 HCl 염으로 4-L-10이 수득되었다 (17 g, 97% 수율).

(3R,3＇R,4＇S)-1＇-(6-아미노-5-플루오르피리미딘-4-일)-3-((3-클로로-5-(트리플루오르메틸)페닐)아미노)-2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘]-4＇-카르복실산 (3-10-trans). 4-L-10 (2.0 g, 4.38 mole), 6-클로로-5-플루오르-피리미딘-4-일아민 (711 mg, 4.82 mmole, 1.1 당량), DIPEA (1.52 mL, 8.77 mole, 2 eq.)의 40 mL nBuOH 용액은 72시간 동안 130-140 ℃로 가열되었다. 혼합물은 22 ℃로 냉각되었고, 진공하에서 농축되어 잔류물이 수득되었고, 이 잔류물은 컬럼에 의해 정제되어 3-10-trans (1.1 g, 47%)가 수득되었다. 상대적으로 소량의 에피머 (3S,3＇R,4＇S)-1＇-(6-아미노-5-플루오르피리미딘-4-일)-3-((3-클로로-5-(트리플루오르메틸)페닐)아미노)-2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘]-4＇-카르복실산이 또한 관찰되었다. 중간생성물 3-10-trans는 상기에서 설명된 과정을 통하여 화합물 I-1로 전환되었다.

화합물 I-1은 또한 계획 8에 따라 합성되었다.

계획 8

(R)-tert-부틸 1-(3-클로로-5-(트리플루오르메틸)페닐)-5-옥소피롤리돈-2-카르복실레이트 4-e는 Phillips, D. P.; Zhu, X. -F.; Lau, T. L.; Yang, K.; Liu, H. Tetrahedron Letters, 2009, 50, 7293에서 설명된 것과 유사한 과정을 이용하여 합성되었다, 이로 인하여 (S)-메틸 5-옥소피롤리돈-2-카르복실레이트 및 1-클로로-4-요오드벤젠은 (R)-tert-부틸 5-옥소피롤리돈-2-카르복실레이트 및 1-클로로-3-요오드-5-(트리플루오르메틸)벤젠으로 치환되었다.

(2R)- tert -부틸 1-(3-클로로-5-(트리플루오르메틸)페닐)-5-히드록시피롤리돈-2-카르복실레이트. 4-e (11 g, 30 mmol)의 Me-THF (100 mL) 무수 용액은 질소 대기하에 -35 ℃로 냉각되었다. DIABL-H (5.9 g, 42 mmol)의 톨루엔 (42 mL) 용액은 온도를 -35 ℃로 유지시키는 동안 점적 추가되었다. 반응은 HPLC로 감시하고, 완료시 반응 온도는 0 ℃이하로 유지시키면서 1N Rochell 염 (100 mL) 용액이 추가되었다. 유기 상 분리되었고, 1N Rochell 염 (50 mL x 3)으로 세척되었고, 분리되었고, Et₃N (4 mL)으로 희석되었고, 건조되었고 (Na₂SO₄) 그리고 진공에서 농축되어 오일로 된 4-f (8.3 g)가 획득되었다.

(3R)-1-(6-아미노-5-플루오르피리미딘-4-일)-3-(((R)-5-(tert-부톡시)-4-((3-클로로-5-(트리플루오르메틸) 페닐)아미노)-5-옥소펜틸)아미노)피페리딘-4-카르복실산. 4-f (37.4 g, 0.146 mmol)의 DMF (700 mL) 용액은 3-8 (40.2 g, 0.11 mmol), Et₃N (10.1 g, 0.1 mmol) STAB (42.4 g, 0.2 mmol)으로 처리되었고, 혼합물은 5시간 동안 55 ℃로 가열되었다. 반응물은 물 (2.5 L)로 희석되었고, EtOAc (500 mL x 3)으로 추출되었고, 유기 상들은 복합되었으며, 염수로 세척되었고, 분리되었고, 건조되었고 (Na₂SO₄) 그리고 진공하에서 농축되어 고체로 된 4-a가 획득되었고 (40. 2 g) 임의의 추가 정제없이 이용되었다.

(3R)-1-(6-아미노-5-플루오르피리미딘-4-일)-3-(((R)-4-카르복시-4-((3-클로로-5-(트리플루오르메틸)페닐)아미노)부틸)아미노)피페리딘-4-카르복실산. 5 N HCl (250 mL)의 용액에 t-부틸 에스테르 4-a가 추가되었고, 현탁액은 5시간 동안 55 ℃로 가열되었고, 가수분해는 HPLC에 의해 감시되었다. 산물의 형성이 완성될 때, 물은 진공하에서 제거되어 고체 4-b가 형성되고, 진공하에 건조되었으며, 임의의 추가 정제없이 이용되었다.

(3R,3＇R)-1＇-(6-아미노-5-플루오르피리미딘-4-일)-3-((3-클로로-5-(트리플루오르메틸)페닐)아미노)-2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘]-4＇-카르복실산. 산 4-b (55 g, 0.1 mol)의 DMF (500 mL) 용액에 0 ℃에서 DIEA (64.5 g, 0.5 mol), CDI (32.5 g, 0.2 mol)가 추가되었다. 용액은 0 ℃에서 1.5 시간 동안 교반되었고, 물 (3 L)로 희석되었고, HCl을 이용하여 pH 3으로 조정되었고, 그리고 EtOAc (2 L x 3)로 추출되었다. 유기 상은 복합되었고, 건조되었고 (Na₂SO₄) 그리고 진공하에서 농축되어 4-c (48 g)가 획득되었다.

화합물 I-1에 대한 나머지 단계들은 상기에서 설명된 과정을 통하여 완성되었다.

실시예 5

trans - tert -부틸 3-((3-클로로-5-(트리플루오르메틸)페닐) 아미노)-4＇-(메틸카르바모일)-2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘]-1＇-카르복실레이트의 합성.

trans - tert -부틸 3-((3-클로로-5-(트리플루오르메틸)페닐) 아미노)-4＇-(메틸카르바모일)-2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘]-1＇-카르복실레이트의 합성. (3＇R,4＇S)-1＇-(6-아미노-5-플루오르피리미딘-4-일)-3-((3-클로로-5-(트리플루오르메틸)페닐)아미노)-2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘]-4＇-카르복사미드 14의 합성에서 설명된 것과 유사한 과정이 이용되어 상기 미정제 물질을 얻고, 이는 프레-HPLC (0.05% NH₃.H₂O 이동상, MeOH/H₂O )에 의해 정제되어 황색 고체로 된 표제 화합물 (360 mg, 수율: 67%)이 획득되었다. ESI-MS (M+H)⁺: 544.18. HPLC: (214 nm: 100.0%, 254 nm: 100.0%). ¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) (이성질체 혼합물) δ: 7.69-7.68 (m, 1H), 6.78 (s, 1H), 6.75 (s, 1H), 6.71 (s, 1H), 4.39-4.36 (m, 2H), 4.09-4.03 (m, 1H), 3.53-3.31 (m, 3H), 3.20-3.10 (m, 1H), 2.99-2.92 (m, 1H), 2.55 (s, 3H), 2.28-2.19 (m, 1H), 1.96-1.77 (m, 5H), 1.68-1.58 (m, 1H).

(3 R ,3 ＇R ,4 ＇S )-1＇-(6-아미노-5-플루오르피리미딘-4-일)-3-((3-클로로-5-(트리플루오르메틸)페닐)아미노)- N -메틸-2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘]-4＇-카르복사미드. 4가지 부분입체이성질체 혼합물이 SFC (AD-H (2 x 15 cm), 50% 1:1 IPA:메탄올 (0.1% DEA)/CO₂, 100 bar, 60 ml/min)에 의해 두 개의 피크로 분리되었다. 피크 2는 SFC 분리 (AD-H (2 x 15 cm), 30% iPrOH(0.15% DEA)/CO₂, 100 bar, 60 ml/min)에 의해 추가 정제되어 표제 화합물이 수득되었다. LCMS (Agilent 460, 254 nm): ES (+) MS m/e = 544.1 (M+1) ＠ 1.24 min. ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 7.72 - 7.85 (m, 2H), 6.92 (s, 2H), 6.81 (s, 1H), 6.43 - 6.64 (m, 3H), 4.34 (br. s., 1H), 4.23 (d, J = 13.05 Hz, 1H), 3.93 - 4.19 (m, 2H), 3.37 - 3.49 (m, 1H), 3.22 - 3.30 (m, 1H), 3.13 (br. s., 1H), 2.84 (t, J = 12.05 Hz, 2H), 2.57 (d, J = 4.52 Hz, 3H), 2.13 (qd, J = 6.05, 12.45 Hz, 1H), 1.60 - 1.89 (m, 4H), 1.40 - 1.58 (m, 1H).

(3 S ,3 ＇R ,4 ＇S )-1＇-(6-아미노-5-플루오르피리미딘-4-일)-3-((3-클로로-5-(트리플루오르메틸)페닐)아미노)- N -메틸-2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘]-4＇-카르복사미드. 4가지 부분입체이성질체 혼합물이 SFC (AD-H (2 x 15 cm), 50% 1:1 IPA:메탄올 (0.1% DEA)/CO₂, 100 bar, 60 ml/min)에 의해 두 개의 피크로 분리되었다. 피크 2는 SFC 분리(AD-H (2 x 15cm), 30% iPrOH (0.15% DEA)/CO₂, 100 bar, 60 ml/min)에 의해 추가 정제되어 표제 화합물이 획득되었다. LCMS (Agilent 460, 254 nm): ES (+) MS m/e = 544.1 (M+1) ＠ 1.24 min. ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 7.83 (q, J = 4.60 Hz, 1H), 7.77 (d, J = 1.76 Hz, 1H), 6.97 (d, J = 6.78 Hz, 2H), 6.81 (s, 1H), 6.58 (s, 2H), 6.53 (d, J = 7.78 Hz, 1H), 4.23 (d, J = 13.05 Hz, 2H), 3.90 - 4.19 (m, 2H), 3.14 (br. s., 1H), 2.92 (br. s., 1H), 2.74 - 2.90 (m, 1H), 2.55 (d, J = 4.52 Hz, 3H), 2.00 - 2.18 (m, 1H), 1.74 - 1.89 (m, 3H), 1.56 - 1.74 (m, 1H), 1.34 - 1.50 (m, 1H).

(3 S ,3 ＇S ,4 ＇R )-1＇-(6-아미노-5-플루오르피리미딘-4-일)-3-((3-클로로-5-(트리플루오르메틸)페닐)아미노)- N -메틸-2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘]-4＇-카르복사미드. 4가지 부분입체이성질체 혼합물이 SFC (AD-H (2 x 15 cm), 50% 1:1 IPA:메탄올 (0.1% DEA)/CO₂, 100 bar, 60 ml/min)에 의해 두 개의 피크로 분리되었다. 피크 1은 SFC (AD-H (2 x 15cm), 30% MeOH (0.15% DEA)/CO₂, 100 bar, 60 ml/min)에 의해 추가 정제되어 표제 화합물이 획득되었다. LCMS (Agilent 460, 254nm): ES (+) MS m/e = 544.1 (M+1) ＠ 1.23 min. ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 7.72 - 7.85 (m, 2H), 6.92 (s, 2H), 6.81 (s, 1H), 6.57 (s, 2H), 6.54 (d, J = 7.53 Hz, 1H), 4.23 (d, J = 13.30 Hz, 1H), 4.15 (dd, J = 3.26, 12.30 Hz, 1H), 4.08 (td, J = 7.06, 10.48 Hz, 1H), 3.36 - 3.47 (m, 1H), 3.23 - 3.30 (m, 1H), 3.13 (br. s., 1H), 2.84 (t, J = 11.80 Hz, 2H), 2.57 (d, J = 4.52 Hz, 3H), 2.13 (qd, J = 6.17, 12.61 Hz, 1H), 1.62 - 1.91 (m, 4H), 1.42 - 1.57 (m, 1H).

trans -1＇-(6-아미노-5-플루오르피리미딘-4-일)-3-((3-클로로-5-(트리플루오르메틸)페닐)아미노)- N -메틸-2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘]-4＇-카르복사미드. 4가지 부분입체이성질체 혼합물이 SFC (AD-H (2 x 15 cm), 50% 1:1 IPA:메탄올 (0.1% DEA)/CO₂, 100 bar, 60 ml/min)에 의해 두 개의 피크로 분리되었다. 피크 1은 SFC (AD-H (2 x 15 cm), 30% MeOH (0.15% DEA)/CO₂, 100 bar, 60 ml/min)에 의해 추가 정제되어 표제 화합물이 획득되었다. LCMS (Agilent 460, 254 nm): ES (+) MS m/e = 544.1 (M+1) ＠ 1.23 min. LCMS (Agilent 460, 254 nm): ES (+) MS m/e = 544.1 (M+1) ＠ 1.24 min. ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 7.80 - 7.89 (m, 1H), 7.72 - 7.80 (m, 1H), 6.97 (d, J = 6.53 Hz, 2H), 6.81 (s, 1H), 6.58 (s, 2H), 6.53 (d, J = 7.78 Hz, 1H), 4.23 (d, J = 13.05 Hz, 2H), 3.89 - 4.19 (m, 2H), 3.13 (br. s., 1H), 2.74 - 3.02 (m, J = 12.42, 12.42 Hz, 2H), 2.55 (d, J = 4.52 Hz, 3H), 2.08 (qd, J = 5.97, 12.20 Hz, 1H), 1.81 (td, J = 6.24, 12.36 Hz, 3H), 1.56 - 1.74 (m, 1H), 1.33 - 1.51 (m, 1H).

실시예 6

trans -1＇-(6-아미노-5-플루오르피리미딘-4-일)-3-((3-클로로-5- (트리플루오르메틸)페닐)아미노)- N , N -디메틸-2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘]-4＇-카르복사미드의 합성. (3＇R,4＇S)-1＇-(6-아미노-5-플루오르피리미딘-4-일)-3-((3-클로로-5-(트리플루오르메틸)페닐)아미노)-2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘]-4＇-카르복사미드 14의 합성에서 설명된 것과 유사한 과정이 이용되어 상기 미정제 물질을 얻고, 이는 프레-HPLC (이동상으로 0.05% TFA와 함께 MeOH/H₂O )에 의해 추가 정제되어 황색 고체로 된 표제 화합물 (45 mg, 수율: 90%)이 수득되었다. ESI-MS (M+H)⁺: 558.0. HPLC: (214 nm: 98.2%, 254 nm: 100.0%). ¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ: 7.77 (s, 1H), 6.92-6.89 (m, 1H), 6.83-6.81 (m, 1H), 6.79 (s, 1H), 4.38-4.38 (m, 2H), 4.05-4.00 (m, 2H), 3.55-3.53 (m, 1H), 3.45-3.40 (m, 2H), 3.15-2.89 (m, 7H), 2.21-2.16 (m, 1H), 1.90-1.86 (m, 3H), 1.66-1.56 (m, 2H).

(3 R ,3 ＇R ,4 ＇S )-1＇-(6-아미노-5-플루오르피리미딘-4-일)-3-((3-클로로-5-(트리플루오르메틸)페닐)아미노)- N , N -디메틸-2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘]-4＇-카르복사미드. 표제 화합물은 2단계의 키랄 SFC 분리를 이용하여 trans-1＇-(6-아미노-5-플루오르피리미딘-4-일)-3-((3-클로로-5-(트리플루오르메틸)페닐) 아미노)-N,N-디메틸-2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘]-4＇-카르복사미드로부터 획득되었다. 우선, 혼합물은 ChiralPak IC(2 x 15 cm, 30% 메탄올 w/0.1 DEA) 컬럼을 이용하여 두 개의 부분입체이성질체 ((3＇R,4＇S)-1＇-(6-아미노-5-플루오르피리미딘-4-일) -3-((3-클로로-5-(트리플루오르메틸)페닐)아미노)-N,N-디메틸-2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘]-4＇-카르복사미드와 (3＇S,4＇R)-1＇-(6-아미노- 5-플루오르피리미딘-4-일)-3-((3-클로로-5 -(트리플루오르메틸)페닐)아미노)-N,N-디메틸-2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘]-4＇-카르복사미드)의 혼합물이 포함된 두 개의 피크로 분리되었고, 그 다음 이성질체 쌍이 포함된 혼합물은 ChiralPak IA (2 x 15 cm, 30% 메탄올 w/0.1% DEA 100 bar) 컬럼을 이용하여 단일 거울상체로 추가 분리되었다. ESI-MS (M+H)⁺: 558.0 ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 7.92 (d, J = 1.76 Hz, 1H), 6.94 (s, 1H), 6.72 (d, J = 7.78 Hz, 2H), 5.21 (d, J = 3.51 Hz, 1H), 4.70 (s, 2H), 4.45 (dd, J = 2.76, 12.80 Hz, 2H), 4.17 - 4.32 (m, 1H), 3.64 - 3.80 (m, 2H), 3.44 - 3.58 (s, 3H), 3.09 (s, 3H), 3.00 - 3.09 (m, 1H), 2.95 (s, 3H), 2.40 (dd, J = 5.52, 13.30 Hz, 1H), 1.63 - 1.99 (m, 3H), 1.26 - 1.43 (m, 1H).

(3 S ,3 ＇R ,4 ＇S )-1＇-(6-아미노-5-플루오르피리미딘-4-일)-3-((3-클로로-5-(트리플루오르메틸)페닐)아미노)- N , N -디메틸-2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘]-4＇-카르복사미드. 표제 화합물은 2단계의 키랄 SFC 분리를 이용하여 trans-1＇-(6-아미노-5-플루오르피리미딘-4-일)-3-((3-클로로-5-(트리플루오르메틸)페닐) 아미노)-N,N-디메틸-2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘]-4＇-카르복사미드로부터 획득되었다. 우선, 혼합물은 ChiralPak IC(2 x 15 cm, 30% 메탄올 w/0.1 DEA) 컬럼을 이용하여 두 개의 부분입체이성질체 ((3＇R,4＇S)-1＇-(6-아미노-5-플루오르피리미딘-4-일) -3-((3-클로로-5-(트리플루오르메틸)페닐)아미노)-N,N-디메틸-2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘]-4＇-카르복사미드와 (3＇S,4＇R)-1＇-(6-아미노- 5-플루오르피리미딘-4-일)-3-((3-클로로-5 -(트리플루오르메틸)페닐)아미노)-N,N-디메틸-2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘]-4＇-카르복사미드)의 혼합물이 포함된 두 개의 피크로 분리되었고, 그 다음 이성질체 쌍이 포함된 혼합물은 ChiralPak IA (2 x 15 cm, 30% 메탄올 w/0.1% DEA 100 bar) 컬럼을 이용하여 단일 거울상체로 추가 분리되었다. ESI-MS (M+H)⁺: 558.0 ¹H NMR (400 MHz, (400 MHz, CDCl₃) δ: 7.93 (d, J = 1.26 Hz, 1H), 6.93 (s, 1H), 6.69 (br. s., 2H), 5.06 (d, J = 4.27 Hz, 1H), 4.71 (s, 1H), 4.45 (d, J = 12.55 Hz, 2H), 4.16 - 4.26 (m, 1H), 3.66 - 3.81 (m, 2H), 3.54 - 3.64 (m, 1H), 3.40 - 3.54 (m, 2H), 3.01 - 3.10 (m, 4H), 2.95 (s, 3H), 2.37 (dd, J = 5.27, 13.05 Hz, 1H), 1.91 - 2.02 (m, 2H), 1.48 - 1.75 (m, 2H).

(3 S ,3 ＇S ,4 ＇R )-1＇-(6-아미노-5-플루오르피리미딘-4-일)-3-((3-클로로-5-(트리플루오르메틸)페닐)아미노)- N , N -디메틸-2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘]-4＇-카르복사미드. 표제 화합물은 2단계의 키랄 SFC 분리를 이용하여 trans-1＇-(6-아미노-5-플루오르피리미딘-4-일)-3-((3-클로로-5-(트리플루오르메틸)페닐) 아미노)-N,N-디메틸-2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘]-4＇-카르복사미드로부터 획득되었다. 우선, 혼합물은 ChiralPak IC(2 x 15 cm, 30% 메탄올 w/0.1 DEA) 컬럼을 이용하여 두 개의 부분입체이성질체 ((3＇R,4＇S)-1＇-(6-아미노-5-플루오르피리미딘-4-일) -3-((3-클로로-5-(트리플루오르메틸)페닐)아미노)-N,N-디메틸-2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘]-4＇-카르복사미드와 (3＇S,4＇R)-1＇-(6-아미노- 5-플루오르피리미딘-4-일)-3-((3-클로로-5 -(트리플루오르메틸)페닐)아미노)-N,N-디메틸-2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘]-4＇-카르복사미드)의 혼합물이 포함된 두 개의 피크로 분리되었고, 그 다음 이성질체 쌍이 포함된 혼합물은 ChiralPak IA (2 x 15 cm, 30% 메탄올 w/0.1% DEA 100 bar) 컬럼을 이용하여 단일 거울상체로 추가 분리되었다. ESI-MS (M+H)⁺: 558.0 ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 7.92 (d, J = 1.76 Hz, 1H), 6.94 (s, 1H), 6.72 (d, J = 7.78 Hz, 2H), 5.21 (d, J = 3.51 Hz, 1H), 4.70 (s, 2H), 4.45 (dd, J = 2.76, 12.80 Hz, 2H), 4.19 - 4.30 (m, 1H), 3.66 - 3.79 (m, 2H), 3.47 - 3.56 (m, 3H), 3.09 (s, 3H), 2.97 - 3.07 (m, 1H), 2.95 (s, 3H), 2.40 (dd, J = 5.52, 13.30 Hz, 1H), 1.81 - 1.97 (m, 3H), 1.73 (dd, J = 3.76, 12.80 Hz, 1H).

(3 R ,3 ＇S ,4 ＇R )-1＇-(6-아미노-5-플루오르피리미딘-4-일)-3-((3-클로로-5-(트리플루오르메틸)페닐)아미노)- N , N -디메틸-2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘]-4＇-카르복사미드. 표제 화합물은 2단계의 키랄 SFC 분리를 이용하여 trans-1＇-(6-아미노-5-플루오르피리미딘-4-일)-3-((3-클로로-5-(트리플루오르메틸)페닐) 아미노)-N,N-디메틸-2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘]-4＇-카르복사미드로부터 획득되었다. 우선, 혼합물은 ChiralPak IC(2 x 15 cm, 30% 메탄올 w/0.1 DEA) 컬럼을 이용하여 두 개의 부분입체이성질체 ((3＇R,4＇S)-1＇-(6-아미노-5-플루오르피리미딘-4-일) -3-((3-클로로-5-(트리플루오르메틸)페닐)아미노)-N,N-디메틸-2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘]-4＇-카르복사미드와 (3＇S,4＇R)-1＇-(6-아미노- 5-플루오르피리미딘-4-일)-3-((3-클로로-5 -(트리플루오르메틸)페닐)아미노)-N,N-디메틸-2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘]-4＇-카르복사미드)의 혼합물이 포함된 두 개의 피크로 분리되었고, 그 다음 이성질체 쌍이 포함된 혼합물은 ChiralPak IA (2 x 15 cm, 30% 메탄올 w/0.1% DEA 100 bar) 컬럼을 이용하여 단일 거울상체로 추가 분리되었다. ESI-MS (M+H)⁺: 558.0 ¹H NMR (400 MHz, (400 MHz, CDCl₃) δ: 7.93 (d, J = 1.26 Hz, 1H), 6.93 (s, 1H), 6.69 (br. s., 2H), 5.06 (d, J = 4.27 Hz, 1H), 4.71 (s, 1H), 4.45 (d, J = 12.55 Hz, 2H), 4.16 - 4.26 (m, 1H), 3.66 - 3.81 (m, 2H), 3.54 - 3.64 (m, 1H), 3.40 - 3.54 (m, 2H), 3.01 - 3.10 (m, 4H), 2.95 (s, 3H), 2.37 (dd, J = 5.27, 13.05 Hz, 1H), 1.91 - 2.02 (m, 2H), 1.48 - 1.75 (m, 2H).

실시예 7

trans -1＇-(6-아미노-5-플루오르피리미딘-4-일)-3-((3-클로로-5-(트리플루오르메틸)페닐)아미노)-4＇-(4-메틸피페라진-1-카르보닐)-[1,3＇-바이피페리딘]-2-온의 합성. trans-1＇-(6-아미노-5-플루오르피리미딘-4-일)-3-((3-클로로-5-(트리플루오르메틸)페닐)아미노)-2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘]-4＇-카르복사미드 14의 합성에 대하여 설명된 것과 유사한 과정을 이용하여 23이 획득되었고, 이는 역상 HPLC (이동상으로 0.05% NH₃.H₂O 와 함께 MeOH/H₂O)에 의해 추가 정제되어 황색 고체로 된 표제 화합물 (100 mg, 수율: 70%)이 수득되었다. ESI-MS (M+H)⁺: 613.24. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 7.94 (s, 1H), 6.94 (s, 1H), 6.73-6.67 (m, 2H), 5.25-5.03 (m, 1H), 4.71 (s, 2H), 4.49-4.40 (m, 2H), 4.35-4.16 (m, 1H), 3.82-3.64 (m, 3H), 3.62-3.41 (m, 6H), 3.08-2.97 (m, 1H), 2.52-2.34 (m, 3H), 2.30-2.25 (m, 2H), 2.20 (s, 3H), 1.85-1.64 (m, 2H), 1.72-1.64 (m, 2H), 1.49-1.31 (m, 1H).

(3R,3＇R,4＇S)-1＇-(6-아미노-5-플루오르피리미딘-4-일)-3-((3-클로로-5-(트리플루오르메틸)페닐)아미노)-4＇-(4-메틸피페라진-1-카르보닐)-[1,3＇-바이피페리딘]-2-온. 표제 화합물은 2단계의 키랄 SFC 분리를 이용하여 trans-1＇-(6-아미노-5-플루오르피리미딘-4-일)-3-((3-클로로-5-(트리플루오르메틸)페닐) 아미노)-N,N-디메틸-2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘]-4＇-카르복사미드 23의 키랄 분리로부터 획득되었다. 우선, 혼합물은 ChiralPak IC (2 x 15 cm, 30% 메탄올 w/0.1 DEA) 컬럼을 이용하여 두 개의 부분입체이성질체 ((3＇R,4＇S)-1＇-(6-아미노-5-플루오르피리미딘-4-일)-3-((3-클로로-5-(트리플루오르메틸)페닐)아미노)-N,N-디메틸-2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘]-4＇-카르복사미드와 (3＇S,4＇R)-1＇-(6-아미노- 5-플루오르피리미딘-4-일)-3-((3-클로로-5 -(트리플루오르메틸)페닐)아미노)-N,N-디메틸-2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘]-4＇-카르복사미드)의 혼합물이 포함된 두 개의 피크로 분리되었고, 그 다음 그 다음 이성질체 쌍이 포함된 혼합물은 ChiralPak IA (2 x 15 cm, 30% 메탄올 w/0.1% DEA 100 bar) 컬럼을 이용하여 단일 거울상체로 추가 분리되었다. ESI-MS (M+H)⁺: 613.2 ¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ: 7.95 (s, 1H), 6.83 - 6.97 (m, 3H), 4.50 - 4.68 (m, 2H), 4.28 - 4.40 (m, 1H), 3.66 - 3.91 (m, 8H), 3.30 - 3.52 (m, 4H), 3.14 (t, J = 12.42 Hz, 2H), 2.73 (br. s., 2H), 2.27 (dd, J = 5.65, 12.93 Hz, 1H), 1.83 - 2.05 (m, 2H), 1.54 - 1.79 (m, 2H).

(3S,3＇R,4＇S)-1＇-(6-아미노-5-플루오르피리미딘-4-일)-3-((3-클로로-5-(트리플루오르메틸)페닐)아미노)-4＇-(4-메틸피페라진-1-카르보닐)-[1,3＇-바이피페리딘]-2-온. 표제 화합물은 2단계의 키랄 SFC 분리를 이용하여 trans-1＇-(6-아미노-5-플루오르피리미딘-4-일)-3-((3-클로로-5-(트리플루오르메틸)페닐)아미노)-N,N-디메틸-2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘]-4＇-카르복사미드 23의 키랄 분리로부터 획득되었다. 우선, 혼합물은 ChiralPak IC(2 x 15 cm, 30% 메탄올 w/0.1 DEA) 컬럼을 이용하여 두 개의 부분입체이성질체 ((3＇R,4＇S)-1＇-(6-아미노-5-플루오르피리미딘-4-일) -3-((3-클로로-5-(트리플루오르메틸)페닐)아미노)-N,N-디메틸-2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘]-4＇-카르복사미드와 (3＇S,4＇R)-1＇-(6-아미노- 5-플루오르피리미딘-4-일)-3-((3-클로로-5 -(트리플루오르메틸)페닐)아미노)-N,N-디메틸-2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘]-4＇-카르복사미드)의 혼합물이 포함된 두 개의 피크로 분리되었고, 그 다음 이성질체 쌍이 포함된 혼합물은 ChiralPak IA (2 x 15 cm, 30% 메탄올 w/0.1% DEA 100 bar) 컬럼을 이용하여 단일 거울상체로 추가 분리되었다. ESI-MS (M+H)⁺: 613.2. ¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ: 7.91 - 7.99 (m, 1H), 6.84 - 6.97 (m, 3H), 4.57 (dd, J = 14.18, 19.70 Hz, 2H), 4.34 (br. s., 1H), 3.42 - 3.53 (m, 1H), 3.37 (d, J = 1.51 Hz, 3H), 3.05 - 3.19 (m, 1H), 2.86 (t, J = 7.53 Hz, 1H), 2.68 - 2.78 (m, 2H), 2.26 (dd, J = 5.65, 12.93 Hz, 1H), 1.82 - 2.03 (m, 3H), 1.55 - 1.79 (m, 2H).

(3S,3＇S,4＇R)-1＇-(6-아미노-5-플루오르피리미딘-4-일)-3-((3-클로로-5-(트리플루오르메틸)페닐)아미노)-4＇-(4-메틸피페라진-1-카르보닐)-[1,3＇-바이피페리딘]-2-온. 표제 화합물은 2단계의 키랄 SFC 분리를 이용하여 trans-1＇-(6-아미노-5-플루오르피리미딘-4-일)-3-((3-클로로-5-(트리플루오르메틸)페닐) 아미노)-N,N-디메틸-2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘]-4＇-카르복사미드 23의 키랄 분리로부터 획득되었다. 우선, 혼합물은 ChiralPak IC(2 x 15 cm, 30% 메탄올 w/0.1 DEA) 컬럼을 이용하여 두 개의 부분입체이성질체 ((3＇R,4＇S)-1＇-(6-아미노-5-플루오르피리미딘-4-일) -3-((3-클로로-5-(트리플루오르메틸)페닐)아미노)-N,N-디메틸-2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘]-4＇-카르복사미드와 (3＇S,4＇R)-1＇-(6-아미노- 5-플루오르피리미딘-4-일)-3-((3-클로로-5 -(트리플루오르메틸)페닐)아미노)-N,N-디메틸-2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘]-4＇-카르복사미드)의 혼합물이 포함된 두 개의 피크로 분리되었고, 그 다음 이성질체 쌍이 포함된 혼합물은 ChiralPak IA (2 x 15 cm, 30% 메탄올 w/0.1% DEA 100 bar) 컬럼을 이용하여 단일 거울상체로 추가 분리되었다. ESI-MS (M+H)⁺: 613.2. ¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ: 7.94 (s, 1H), 6.87 - 6.93 (m, 3H), 4.57 (dd, J = 14.18, 19.70 Hz, 1H), 4.34 (br. s., 1H), 3.43 - 3.51 (m, 1H), 3.36 - 3.38 (m, 2H), 3.13 (t, J = 12.30 Hz, 1H), 2.86 (t, J = 7.53 Hz, 1H), 2.73 (br. s., 1H), 2.26 (dd, J = 5.65, 12.93 Hz, 1H), 1.96 - 2.03 (m, 1H), 1.83 - 1.94 (m, 1H), 1.51 - 1.75 (m, 1H).

((3R,3＇S,4＇R)-1＇-(6-아미노-5-플루오르피리미딘-4-일)-3-((3-클로로-5-(트리플루오르메틸)페닐)아미노)-4＇-(4-메틸피페라진-1-카르보닐)-[1,3＇-바이피페리딘]-2-온. 표제 화합물은 2단계의 키랄 SFC 분리를 이용하여 trans-1＇-(6-아미노-5-플루오르피리미딘-4-일)-3-((3-클로로-5-(트리플루오르메틸)페닐) 아미노)-N,N-디메틸-2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘]-4＇-카르복사미드 23의 키랄 분리로부터 획득되었다. 우선, 혼합물은 ChiralPak IC(2 x 15 cm, 30% 메탄올 w/0.1 DEA) 컬럼을 이용하여 두 개의 부분입체이성질체 ((3＇R,4＇S)-1＇-(6-아미노-5-플루오르피리미딘-4-일) -3-((3-클로로-5-(트리플루오르메틸)페닐)아미노)-N,N-디메틸-2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘]-4＇-카르복사미드와 (3＇S,4＇R)-1＇-(6-아미노- 5-플루오르피리미딘-4-일)-3-((3-클로로-5 -(트리플루오르메틸)페닐)아미노)-N,N-디메틸-2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘]-4＇-카르복사미드)의 혼합물이 포함된 두 개의 피크로 분리되었고, 그 다음 그 다음 이성질체 쌍이 포함된 혼합물은 ChiralPak IA (2 x 15 cm, 30% 메탄올 w/0.1% DEA 100 bar) 컬럼을 이용하여 단일 거울상체로 추가 분리되었다. ¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ: 7.96 (br. s., 1H), 6.90 (br. s., 1H), 6.76 (d, J = 10.04 Hz, 2H), 4.60 (t, J = 14.06 Hz, 2H), 4.19 - 4.32 (m, 1H), 3.67 - 3.78 (m, 1H), 3.43 - 3.54 (m, 3H), 3.35 - 3.38 (m, 3H), 3.16 (t, J = 12.42 Hz, 1H), 2.86 (t, J = 7.40 Hz, 2H), 2.79 (s, 3H), 2.32 (dd, J = 5.02, 12.80 Hz, 1H), 1.89 - 2.07 (m, 4H), 1.62 - 1.76 (m, 5H),

실시예 8

1＇-(6-아미노-5-플루오르피리미딘-4-일)-3-((3-플루오르-5- (트리플루오르메틸)페닐)아미노)-2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘]-4＇-카르복사미드의 합성. (3＇R,4＇S)-1＇-(6-아미노-5-플루오르피리미딘-4-일)-3-((3-클로로-5-(트리플루오르메틸)페닐)아미노)-2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘]-4＇-카르복사미드 14의 합성에서 설명된 것과 유사한 과정이 이용되어 상기 미정제 물질을 얻고, 이는 프레-HPLC (이동상으로 0.05% NH₃.H₂O와 함께 MeOH/H₂O)의해 정제되어 황색 고체로 된 표제 화합물 (175 mg, 수율: 69%)이 획득되었다. ESI-MS (M+H)⁺: 514.19. HPLC: (214 nm: 96.13%, 254 nm: 96.53%). ¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ: 7.79-7.78 (m, 1H), 6.76 (s, 1H), 6.63-6.54 (m, 2H), 4.41-4.36 (m, 2H), 4.08-4.06 (m, 1H), 3.55-3.41 (m, 3H), 3.28-3.25 (m, 1H), 2.99-2.93 (m, 1H), 2.28-2.21 (m, 1H), 1.98-1.78 (m, 6H).

(3 R ,3 ＇R ,4 ＇S )-1＇-(6-아미노-5-플루오르피리미딘-4-일)-3-((3-플루오르-5-(트리플루오르메틸)페닐)아미노)-2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘]-4＇-카르복사미드. 4가지 부분입체이성질체 혼합물은 SFC (IA( 3 x 15 cm), 30% EtOH (0.1% DEA)/CO₂, 100 bar, 70 ml/min)에 의해 3개 피크로 분리되었고, 표제 화합물은 피크 3에 해당된다 LCMS (Agilent 460, 254 nm): ES (+) MS m/e = 514.0 (M+1) ＠ 1.09 min. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 7.91 (br. s., 1H), 6.66 (d, J = 8.53 Hz, 1H), 6.63 (s, 1H), 6.46 (d, J = 10.79 Hz, 1H), 6.12 (br. s., 1H), 5.47 (br. s., 1H), 5.16 (d, J = 3.51 Hz, 1H), 4.91 (br. s., 2H), 4.35 - 4.54 (m, 2H), 3.82 (td, J = 5.11, 10.60 Hz, 2H), 3.51 - 3.60 (m, 1H), 3.34 - 3.48 (m, 3H), 2.96 (t, J = 12.30 Hz, 1H), 2.35 - 2.47 (m, 1H), 1.91 - 2.06 (m, 3H), 1.84 (dq, J = 3.89, 12.76 Hz, 1H), 1.48 - 1.62 (m, 1H).

(3 S ,3 ＇R ,4＇ S )-1＇-(6-아미노-5-플루오르피리미딘-4-일)-3-((3-플루오르-5-(트리플루오르메틸)페닐)아미노)-2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘]-4＇-카르복사미드. 4가지 부분입체이성질체 혼합물은 SFC (IA (3 x 15 cm), 30% EtOH (0.1% DEA)/CO₂, 100 bar, 70 ml/min)에 의해 3개 피크로 분리되었다. 피크 3중 2가 원하는 화합물에 해당된다. LCMS (Agilent 460, 254 nm): ES (+) MS m/e = 514.0 (M+1) ＠ 1.10 min. ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ) δ: 7.77 (d, J = 1.76 Hz, 1H), 7.39 (s, 1H), 6.85 (s, 1H), 6.81 (s, 1H), 6.74 (d, J = 12.30 Hz, 1H), 6.47 - 6.66 (m, 4H), 4.23 (d, J = 12.80 Hz, 2H), 3.90 - 4.18 (m, 2H), 3.34 - 3.46 (m, 2H), 3.12 (br. s., 1H), 2.94 (br. s., 1H), 2.82 (t, J = 12.42 Hz, 1H), 2.10 (qd, J = 5.75, 12.11 Hz, 1H), 1.74 - 1.92 (m, 3H), 1.56 - 1.72 (m, 1H), 1.37 - 1.52 (m, 1H).

(3 R ,3 ＇S ,4 ＇R )-1＇-(6-아미노-5-플루오르피리미딘-4-일)-3-((3-플루오르-5-(트리플루오르메틸)페닐)아미노)-2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘]-4＇-카르복사미드. 4가지 부분입체이성질체 혼합물은 SFC (IA (3 x 15 cm), 30% EtOH (0.1% DEA)/CO₂, 100 bar, 70 ml/min)에 의해 3개 피크로 분리되었다. 피크 3중 1은 SFC (IA (3 x 15 cm), 30% iPrOH (0.1% DEA)/CO₂, 100 bar, 70 ml/min)에 의해 추가 정제되어 표제 화합물이 획득되었다. LCMS (Agilent 460, 254 nm): ES (+) MS m/e = 514.0 (M+1) ＠ 1.10 min. ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ) δ: 7.77 (d, 1.5 Hz, 1H), 7.39 (s., 1H), 6.85 (s, 1H), 6.81 (s., 1H), 6.74 (d, J = 12.30 Hz, 1H), 6.47 - 6.66 (m, 4H), 4.16 - 4.46 (m, 2H), 3.95 - 4.16 (m, 2H), 3.34 - 3.48 (m, 2H), 3.12 (br. s., 1H), 2.87 - 3.01 (m, 2H), 2.82 (t, J = 12.30 Hz, 1H), 2.10 (qd, J = 5.75, 12.11 Hz, 1H), 1.74 - 1.92 (m, 3H), 1.54 - 1.74 (m, 1H), 1.35 - 1.52 (m, 1H).

(3 S ,3＇ R ,4＇ S )-1＇-(6-아미노-5-플루오르피리미딘-4-일)-3-((3-플루오르-5-(트리플루오르메틸)페닐)아미노)-2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘]-4＇-카르복사미드 . 4가지 부분입체이성질체 혼합물은 SFC (IA (3 x 15 cm), 30% EtOH (0.1% DEA)/CO₂, 100 bar, 70 ml/min)에 의해 3개 피크로 분리되었다. 피크 3중 1은 SFC (IA (3 x 15cm), 30% iPrOH (0.1% DEA)/CO₂, 100 bar, 70 ml/min)에 의해 추가 정제되어 표제 화합물이 획득되었다.

LCMS (Agilent 460, 254 nm): ES (+) MS m/e = 514.0 (M+1) ＠ 1.10 min. ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ) δ: 7.77 (d, J = 1.76 Hz, 1H), 7.38 (br. s., 1H), 6.84 (s, 2H), 6.70 (d, J = 12.30 Hz, 1H), 6.47 - 6.65 (m, 4H), 4.18 - 4.48 (m, 2H), 3.92 - 4.18 (m, 2H), 3.38 - 3.49 (m, 1H), 3.20 - 3.30 (m, 1H), 3.11 (br. s., 1H), 2.88 - 2.99 (m, 1H), 2.83 (t, J = 12.30 Hz, 1H), 2.14 (qd, J = 6.03, 12.52 Hz, 1H), 1.74 - 1.92 (m, 3H), 1.59 - 1.74 (m, 1H), 1.41 - 1.58 (m, 1H).

실시예 9

(3＇R,4＇S)-1＇-(6-아미노-5-플루오르피리미딘-4-일)-3- ((3-클로로-5-플루오르페닐) 아미노)-2-옥소- [1,3＇-바이피페리딘] -4＇-카르복사미드의 합성. (3＇R,4＇S)-1＇-(6-아미노-5-플루오르피리미딘-4-일)-3-((3-클로로-5-(트리플루오르메틸)페닐)아미노)-2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘]-4＇-카르복사미드 14의 합성에서 설명된 것과 유사한 과정이 이용되어 상기 미정제 물질을 얻고, 프레-HPLC (이동상으로 0.05% NH₃.H₂O과 함께 MeOH/H₂O)에 의해 백색 고체로 된 표제 화합물 (141 mg, Y: 30%)이 수득되었다. ESI-MS (M+H)⁺: 479.9. HPLC: (214 nm: 100%, 254 nm: 100%). ¹H NMR (400 MHz, DMSO d ₆) δ: 7.78-7.77 (m, 1H), 7.40-7.38 (m, 1H), 6.86-6.82 (m, 1H), 6.62-6.55 (m, 3H), 6.45-6.37 (m, 3H), 4.26-3.94 (m, 4H), 3.47-3.39 (m, 1H), 3.20-3.03 (m, 2H), 2.90-2.78 (m, 2H), 2.18-2.04 (m, 1H), 1.86-1.34 (m, 5H).

(3 R ,3 ＇R ,4 ＇S )-1＇-(6-아미노-5-플루오르피리미딘-4-일)-3-((3-클로로-5-플루오르페닐)아미노)-2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘]-4＇-카르복사미드. 피크 3의 표제 화합물을 획득하기 위하여 4가지 부분입체이성질체 혼합물은 SFC (IC (2 x 15 cm), 25% MeOH (0.1% DEA)/CO₂, 100 bar, 60 ml/min)에 의해 3개 피크로 각각 분리되었다. LCMS (Agilent 460, 254nm): ES (+) MS m/e = 480.0 (M+1) ＠ 1.01 min. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 7.90 (br. s., 1H), 6.44 (d, J = 8.53 Hz, 1H), 6.40 (s, 1H), 6.30 (br. s., 1H), 6.23 (d, J = 11.04 Hz, 1H), 5.63 (br. s., 1H), 5.09 (br. s., 1H), 4.94 (br. s., 2H), 4.45 (d, J = 12.80 Hz, 2H), 3.68 - 3.95 (m, 2H), 3.49 - 3.56 (m, 2H), 3.35 - 3.46 (m, 2H), 2.89 - 2.99 (m, 1H), 2.31 - 2.44 (m, 1H), 1.90 - 2.04 (m, 3H), 1.76 - 1.89 (m, 1H), 1.49 - 1.61 (m, 1H).

(3 S ,3 ＇R ,4 ＇S )-1＇-(6-아미노-5-플루오르피리미딘-4-일)-3-((3-클로로-5-플루오르페닐)아미노)-2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘]-4＇-카르복사미드. 피크 1의 표제 화합물을 획득하기 위하여 4가지 부분입체이성질체 혼합물은 SFC (IC (2 x 15 cm), 25% MeOH (0.1% DEA)/CO₂, 100 bar, 60 ml/min) 에 의해 3개 피크로 각각 분리되었다.　

LCMS (Agilent 460, 254nm): ES (+) MS m/e = 480.0 (M+1) ＠ 1.01 min. ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ) δ: 7.77 (d, J = 1.76 Hz, 1H), 7.39 (s., 1H), 6.81 (s, 1H), 6.57 (s, 3H), 6.46 (d, J = 12.30 Hz, 1H), 6.39 (dd, J = 1.76, 8.78 Hz, 1H), 6.34 (d, J = 7.53 Hz, 1H), 4.28 (br. s., 1H), 4.23 (d, J = 13.05 Hz, 1H), 4.13 (dd, J = 2.76, 12.30 Hz, 1H), 4.03 (td, J = 6.56, 10.98 Hz, 1H), 3.33 - 3.46 (m, 2H), 3.11 (br. s., 1H), 2.94 (br. s., 1H), 2.82 (t, J = 12.30 Hz, 1H), 2.09 (qd, J = 5.75, 12.11 Hz, 1H), 1.72 - 1.92 (m, 3H), 1.56 - 1.72 (m, 1H), 1.29 - 1.50 (m, 1H).

(3 S ,3 ＇S ,4 ＇R )-1＇-(6-아미노-5-플루오르피리미딘-4-일)-3-((3-클로로-5-플루오르페닐)아미노)-2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘]-4＇-카르복사미드. 4가지 부분입체이성질체 혼합물은 SFC (IC (2 x 15 cm), 25% MeOH(0.1% DEA)/CO₂, 100 bar, 60 ml/min)에 의해 3개 피크로 분리되었다. 피크 3중 2는 SFC (IA (3 x 15 cm), 30% iPrOH (0.1% DEA)/CO₂, 100 bar, 60 ml/min)에 의해 추가 정제되어 표제 화합물이 획득되었다. LCMS (Agilent460, 254 nm): ES (+) MS m/e = 480.0 (M+1) ＠ 1.01 min. ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 7.77 (d, J = 2.01 Hz, 1H), 7.37 (br. s., 1H), 6.84 (s, 1H), 6.57 (s, 2H), 6.55 (br. s., 1H), 6.30 - 6.48 (m, 3H), 4.28 (br. s., 1H), 4.23 (d, J = 13.05 Hz, 1H), 4.13 (dd, J = 3.39, 12.67 Hz, 1H), 3.97 (td, J = 6.84, 10.42 Hz, 1H), 3.38 - 3.50 (m, 1H), 3.22 - 3.29 (m, 1H), 3.10 (br. s., 1H), 2.71-2.97 (m, 1H), 2.83 (t, J = 12.30 Hz, 1H), 2.13 (qd, J = 6.13, 12.49 Hz, 1H), 1.73 - 1.91 (m, 3H), 1.58 - 1.73 (m, 1H), 1.39 - 1.53 (m, 1H).

(3 R ,3 ＇S ,4 ＇R )-1＇-(6-아미노-5-플루오르피리미딘-4-일)-3-((3-클로로-5-플루오르페닐)아미노)-2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘]-4＇-카르복사미드. 4가지 부분입체이성질체 혼합물은 SFC (IC (2x15cm), 25% MeOH(0.1% DEA)/CO₂, 100 bar, 60 ml/min)에 의해 3개 피크로 분리되었다. 피크 3중 2는 SFC (IA (3 x 15 cm), 30% iPrOH (0.1% DEA)/CO₂, 100 bar, 60 ml/min)에 의해 추가 정제되어 표제 화합물이 획득되었다. LCMS (Agilent460, 254 nm): ES (+) MS m/e = 480.0 (M+1) ＠ 1.01 min. ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ) δ 7.77 (d, J = 1.76 Hz, 1H), 7.39 (s, 1H), 6.81 (s, 1H), 6.57 (s, 3H), 6.46 (td, J = 2.01, 12.30 Hz, 1H), 6.39 (td, J = 1.95, 8.66 Hz, 1H), 6.34 (d, J = 7.53 Hz, 1H), 4.18 - 4.48 (m, 2H), 4.09 - 4.18 (m, 1H), 3.79 - 4.09 (m, 1H), 3.33 - 3.45 (m, 2H), 3.11 (br. s., 1H), 2.92 (br. s., 1H), 2.82 (t, J = 12.42 Hz, 1H), 2.09 (qd, J = 5.75, 12.11 Hz, 1H), 1.74 - 1.93 (m, 3H), 1.51 - 1.74 (m, 1H), 1.32 - 1.51 (m, 1H).

실시예 10

(3 ＇R ,4＇ S )-1＇-(6-아미노-5-플루오르피리미딘-4-일) -3-((3-클로로-5- (트리플루오르메톡시) 페닐)아미노)-2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘] -4＇-카르복사미드의 합성. (3＇R,4＇S)-1＇-(6-아미노-5-플루오르피리미딘-4-일)-3-((3-클로로-5-(트리플루오르메틸)페닐)아미노)-2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘]-4＇-카르복사미드 14의 합성에서 설명된 것과 유사한 과정이 이용되어 상기 미정제 물질을 얻고, 프레-HPLC (이동상으로 0.05% NH₃.H₂O와 함께 MeOH/H₂O) 황색 고체로 된 표제 화합물 (320 mg, 수율: 44%)을 얻었다. ESI-MS (M+H)⁺: 546.16. HPLC: (214 nm: 98.4%, 254 nm: 98.0%). ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 7.77 (s, 1H), 7.39 (s, 1H), 6.84-6.81 (m, 1H), 6.75-6.72 (m, 1H), 6.62-6.57 (m, 3H), 6.52-6.47 (m, 2H), 4.24-3.98 (m, 4H), 3.47-3.40 (m, 1H), 3.17-2.99 (m, 2H), 2.86-2.79 (m, 2H), 2.15-1.99 (m, 1H), 1.86-1.60 (m, 4H), 1.48-1.39 (m, 1H).

(3 R ,3 ＇S ,4 ＇R )-1＇-(6-아미노-5-플루오르피리미딘-4-일)-3-((3-클로로-5-(트리플루오르메톡시)페닐)아미노)-2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘]-4＇-카르복사미드. 표제 화합물을 획득하기 위하여 4가지 부분입체이성질체 혼합물은 SFC (AD-H(2 x 25 cm), 30% EtOH(0.1% DEA)/CO₂, 100 bar, 70 ml/min)에 의해 정제되었다. LCMS (Agilent460, 254 nm): ES (+) MS m/e = 546.0 (M+1) ＠ 1.20 min. ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ) δ: 7.77 (d, J = 1.76 Hz, 1H), 7.39 (br. s., 1H), 6.81 (s, 1H), 6.75 (s, 1H), 6.62 (s, 1H), 6.57 (s, 2H), 6.38 - 6.52 (m, 2H), 4.23 (d, J = 13.05 Hz, 2H), 3.92 - 4.18 (m, 2H), 3.34 - 3.45 (m, 2H), 3.11 (br. s., 1H), 2.93 (br. s., 1H), 2.82 (t, J = 12.30 Hz, 1H), 2.08 (qd, J = 5.75, 12.11 Hz, 1H), 1.74 - 1.92 (m, 3H), 1.56 - 1.73 (m, 1H), 1.36 - 1.50 (m, 1H).

(3 S ,3 ＇S ,4 ＇R )-1＇-(6-아미노-5-플루오르피리미딘-4-일)-3-((3-클로로-5-(트리플루오르메톡시)페닐)아미노)-2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘]-4＇-카르복사미드. 표제 화합물을 획득하기 위하여 4가지 부분입체이성질체 혼합물은 SFC (AD-H(2 x 25 cm), 30% EtOH (0.1% DEA)/CO₂, 100 bar, 70 ml/min) 에 의해 정제되었다. LCMS (Agilent 460, 254 nm): ES (+) MS m/e = 546.0 (M+1) ＠ 1.23 min. ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ) δ: 7.77 (d, J = 2.01 Hz, 1H), 7.37 (br. s., 1H), 6.84 (s, 1H), 6.72 (s, 1H), 6.60 (s, 1H), 6.57 (s, 2H), 6.43 - 6.54 (m, 2H), 4.23 (d, J = 13.05 Hz, 1H), 4.22 (br. s., 1H), 4.13 (dd, J = 3.26, 12.30 Hz, 1H), 4.01 (td, J = 6.81, 10.23 Hz, 1H), 3.44 (td, J = 6.18, 12.49 Hz, 1H), 3.20 - 3.29 (m, 1H), 3.11 (br. s., 1H), 2.88 (br. s., 1H), 2.83 (t, J = 12.30 Hz, 1H), 2.12 (qd, J = 6.05, 12.46 Hz, 1H), 1.73 - 1.91 (m, 3H), 1.59 - 1.73 (m, 1H), 1.48 (td, J = 9.41, 19.33 Hz, 1H).

(3 S ,3 ＇R ,4 ＇S )-1＇-(6-아미노-5-플루오르피리미딘-4-일)-3-((3-클로로-5-(트리플루오르메톡시)페닐)아미노)-2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘]-4＇-카르복사미드. 표제 화합물을 획득하기 위하여 4가지 부분입체이성질체 혼합물은 SFC (AD-H (2 x 25 cm), 30% EtOH (0.1% DEA)/CO₂, 100 bar, 70 ml/min) 에 의해 정제되었다. LCMS (Agilent 460, 254 nm): ES (+) MS m/e = 546.0 (M+1) ＠ 1.22 min. ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 7.77 (d, J = 2.01 Hz, 1H), 7.38 (br. s., 1H), 6.81 (s, 1H), 6.75 (s, 1H), 6.62 (s, 1H), 6.57 (s, 2H), 6.42 - 6.51 (m, 2H), 4.23 (d, J = 12.80 Hz, 2H), 3.97 - 4.18 (m, 2H), 3.34 - 3.44 (m, 2H), 3.10 (br. s., 1H), 2.93 (br. s., 1H), 2.82 (t, J = 12.17 Hz, 1H), 2.03 - 2.15 (m, 1H), 1.77 - 1.90 (m, 3H), 1.57 - 1.73 (m, 1H), 1.37 - 1.48 (m, 1H).

(3 R ,3 ＇R ,4 ＇S )-1＇-(6-아미노-5-플루오르피리미딘-4-일)-3-((3-클로로-5-(트리플루오르메톡시)페닐)아미노)-2-옥소-[1,3＇-바이피페리딘]-4＇-카르복사미드. 표제 화합물을 획득하기 위하여 4가지 부분입체이성질체 혼합물은 SFC (AD-H (2 x 25cm), 30% EtOH(0.1% DEA)/CO₂, 100bar, 70ml/min) 에 의해 정제되었다. 화합물. LCMS(Agilent 460, 254nm): ES (+) MS m/e = 546.0 (M+1) ＠ 1.23 min. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 7.93 (s, 1H), 6.60 (s, 1H), 6.52 (s, 1H), 6.35 (s, 1H), 5.85 (br. s., 1H), 5.32 (br. s., 1H), 4.97 - 5.15 (m, 1H), 4.78 (br. s., 2H), 4.46 (d, J = 13.05 Hz, 2H), 3.67 - 3.87 (m, 2H), 3.34 - 3.60 (m, 4H), 2.99 (t, J = 12.17 Hz, 1H), 2.34 - 2.49 (m, 1H), 1.91 - 2.08 (m, 3H), 1.83 (dq, J = 3.76, 12.72 Hz, 1H), 1.47 - 1.74 (m, 1H).

실시예 11

시험관내 BTK 키나아제 분석: BTK-POLYGAT-LS 분석. BTK 시험관 분석의 목적은 IC₅₀의 측정을 통하여 BTK에 대항한 화합물의 효능을 측정하는 것이다. 화합물 억제는 활성 BTK 효소 (Upstate 14-552), ATP, 및 억제제 존재하에 플루오레세인-라벨된 폴리GAT 펩티드 (Invitrogen PV3611)의 인산화 양을 감시한 후 측정되었다. BTK 키나아제 반응은 블랙 96 웰 플레이트에서 실행되었다 (costar 3694). 전형적인 분석을 위하여, 키나아제 완충액 (10 mM Tris-HCl pH 7.5, 10 mM MgCl₂, 200 uM Na₃PO₄, 5 mM DTT, 0.01% Triton X-100, 그리고 0.2 mg/ml 카제인)안에 24 uL 방울의 ATP/펩티드 마스터 믹스 (최종 농도; ATP 10 uM, 폴리GAT 100 nM)가 각 웰에 추가되었다. 그 다음, 100% DMSO 용매 내 1　uL의 4-배, 40X 화합물 적정이 추가되었고, 이어서 1X 키나아제 완충액 내 15　uL 의 BTK 효소 믹스(최종 농도는 0.25　nM)가 추가되었다. 50 mM EDTA 용액 28　uL으로 중단하기에 앞서 분석물은 30분간 항온처리되었다. 한 방울(5 uL)의 키나아제 반응물은 작은 용적 384 웰 플레이트(Corning 3674)로 옮기고, 5 uL의 2X 탐지 완충액 (Invitrogen PV3574, 4 nM Tb-PY20 항체와 함께, Invitrogen PV3552)이 추가되었다. 플레이트를 덮고, 실온에서 45분간 항온처리하였다. Molecular Devices M5 (332 nm 여기; 488 nm 방출; 518 nm 형광 방출)에서 시간 분해 형광(TRF)이 측정되었다. IC₅₀ 값은 4개 매개변수 피트를 이용하여 산출되었으며, DMSO 대조군에서 100% 효소 활성이 측정되고, EDTA 대조군에서 0% 활성이 측정되었다.

선택된 화학식 I의 화합물들이 테스트되었으며, 폴리GAT 분석에서 활성인 것으로 확인되었다. 화합물 I-1, I-2, I-3, I-4, I-5 및 I-7의 IC₅₀값은 차례로 0.73 nM, 0.68 nM, 2.07 nM, 0.63 nM, 1.6 nM, 및 1.2 nM이었다. 화합물 I-6은 1 nM 미만의 IC₅₀값을 보유한다. 아래에 나타낸 것과 같이 비교 화합물 I ^C 의 IC₅₀ 값은 2.0 nM이었다.

실시예 12

인간 DPX2 세포에서 PXR 핵 수용체의 활성을 측정하는 연구 프로토콜

a) 프로토콜 요약: PXR은 CYP3A4의 약물-유도된 발현을 중재하는 1차 핵 수용체인 것으로 나타났다(Bertilsson G, et al.; Proc Natl Acad Sci U S A. 1998 Oct 13;95(21):12208-13). 이러한 CYP3A4 유도 경로에 근거하여, 세포-기반의 PXR 리포터 유전자 분석은 초기 약물 발견 단계에서 CYP3A4를 유도하는 능력에 대해 새로운 분자 엔터티(NMEs)를 선별해내는데 흔히 이용된다(Luo G, et al.; Drug Metab Dispos. 2002 Jul;30(7):795-804.) 연구는 DPX2 세포에서 인간 PXR의 활성화에 있어서 새로운 분자 엔터티(NMEs)의 효과가 평가되도록 기획되었다. PXR 핵 수용체와 대응하는 반응 요소들로 안정적으로 형질감염된 세포 계통이 96-웰 플레이트에 접종되었다. 접종 24시간 후, 3중의 웰에서 6개의 별개 농도의 NMEs로 처리되었고 (아래 참고), 그리고 그 다음 세포는 추가 24시간 동안 배양기 안에 넣었다. 이 항온처리 기간 종료시, 웰당 살아있는 세포의 수는 Promega＇s Cell Titer Fluor 세포독성 분석을 이용하여 측정되었다. 이 분석에 이어서, Promega＇s ONE-Glo는 동일 웰에 추가되었으며, 그리고 리포터 유전자 활성이 평가되었다.

b) 테스트 시스템: 이 테스트 시스템은 96-웰 미량적정 플레이트상에 도말된 안정적으로 형질변환된 DPX2 종양 세포계통으로 구성되었다. 루시퍼라제 리포터 유전자에 연계된 적절한 인헨서와 프로모터 그리고 PXR 핵 수용체가 포함된 발현 벡터는 이들 종양 세포 계통에 안정적으로 통합되었다. 리포터 활성화는 리포터 유전자 활성을 감시함으로써 평가되었고, 운반체-처리된 세포의 것과 비교되었다. 양성 대조군은 6가지 상이한 농도의 (0.1, 0.5, 1, 5, 10, 및 20 μM) 리팜피신으로 처리된 세포들로 구성된다. 이 방식에서 PXR을 활성화시키는 화합물들이 용이하고 신속하게 확인될 수 있다. 안정적으로-통합된 세포 계통이 이용되었기 때문에, 3- 내지 70-배의 수용체 활성화를 관찰하는 것이 가능하다.

c) 데이터 처리 및 리포터 활성화 역학: MS-Excel을 이용하여 처리된 데이터는 6가지 각각 상이한 분량에서 운반체-처리된 세포와 비교하여 PXR 활성화의 평균(n=3) 및 배수 CV%로 산출되었다. 모든 활성화 데이터는 웰당 생존 세포의 수로 표준화되었다. 결과는 10 μM 분량에서 적절한 양성 대조군에 의해 제공된 반응의 비율로 또한 표현되었다. 전형적인 로그 분량-반응 곡선의 비-선형 회귀를 이용하여 수용체를 활성화시키는 테스트 화합물에서 EC₅₀ 및 E_max 값이 유도되었다 (Prism V5.0c, GraphPad Software, San Diego, CA). 비전형적 분량-반응 곡선을 나타내는 물질은 이 방식에서 분석되지 않았다.

d) 새로운 분자 엔터티 (NMEs): 테스트 화합물들은 0.05, 0.1, 0.5, 1, 2.5, 및 10 μM에서 테스트되었다.

선택된 화학식 I의 화합물들은 PXR 분석에서 테스트되었다. 화합물 I-1, I-2, I-3, I-4, 및 I-5는 차례로 (리팜피신 10 uM과 비교하여) 62%, 42%, 47%, 67%, 및 90%의 PXR 유도 %을 나타내었다. 상기에서 나타낸 비교 화합물 I ^C 는 95%의 PXR 유도 %를 나타내었다.

실시예 13

FastPatch hERG 억제 분석을 위한 프로토콜:

심장 칼륨 채널, hERG는 인간의 심실에서 신속하게 지연된 정류기 전류를 담당하고, I_Kr의 억제는 비-심장 약물에 의한 심작 작용 및 전위 연장의 가장 큰 원인이다 (예컨데, Weirich and Antoni, Basic Res. Cardiol., 93, Suppl. 1, 125-32, 1998; Yap and Camm, Clin. Exp. Allergy, 29, Suppl. 3, 174-81, 1999). 증가된 작용 전위 기간은 위험한 심실부정맥, 다형성심실빈맥(torsade de pointes)과 연관된 QT 간격의 연장을 야기하는 인자로 언급되었다. (Brown and Rampe, Pharmaceutical News, 7, 15-20, 2000).

제공된 화합물들의 시험관 효과는 hERG cDNA로 안정적으로 형질감염된 인간 배우 신장(HEK293) 세포에서 발현된 hERG (인간 에테르-

-관련된 유전자) 칼륨 전류 (I_Kr의 대리물, 신속하게 활성화되는, 지연된 정류기 심장 칼륨 전류)에서 조사되었다. 세포들은 유리로 안을 댄 96-웰 플레이트에서 HEPES-완충된 생리염수 안에 두었고, 각 농도에서 3-분 노출 기간 동안 적절한 양의 테스트 용액 및 대조 용액이 로딩되었다. 테스트 화합물은 0.3% DMSO에서 희석되었다. 다양한 농도(예컨데, 10 μM)에서 평가하기 위하여 자동화된 평행 패치 클램프 시스템, QPatch HT (Sophion Bioscience A/S, Denmark)가 이용되었다. IC₅₀ 값은 hERG 억제 데이터에 근거하여 예측되었다. 연구는 Chan테스트 (14656 Neo Parkway, Cleveland, OH)에서 실행되었다. QPatch 스크린은 Janzen and Bernasconi (eds.), High Throughput Screening, Methods and Protocols, Second Edition, vol. 565, chapter 10, pg. 209-223, 2009에서 더 설명되고 있다.

선택된 화학식 I의 화합물들이 hERG 분석에서 테스트되었다. 화합물 I-1, I-2, I-3, 및 I-4는 차례로 15.6 uM, 30 uM, 14.6 uM, 및 13.7 uM의 hERG IC₅₀을 제공하였다. hERG 분석에서 화합물 I-5는 10 uM (이용가능한 IC₅₀는 없음)에서 관측가능한 활성은 나타내지 않는다. hERG 분석에서 화합물 I-6은 10uM에서 hERG 활성 (< 20% 억제)이 거의 관찰되지 않는다 (이용가능한 IC₅₀는 없음). 화합물 I-7은 10uM에서 hERG 활성 (65% 억제)을 보인다 (이용가능한 IC₅₀는 없음). 상기에서 나타낸 것과 같이 비교 화합물 I ^C 는 10 uM에서 hERG IC₅₀ 1.18 uM 또는 활성 (87% 억제)을 나타내었다.

실시예 14

인간의 간 마이크로좀에서 GSH 트랩핑(Trapping): 프로토콜

테스트 화합물 (최종 농도 10 uM)은 인간 또는 렛의 간 마이크로좀 (최종 농도 1 mg/mL), 그리고 활성화 공인자 NADPH (최종 농도 1 mM), 인산 칼륨 (최종 농도 100 mM pH 7.4), 염화 마그네슘 (최종 농도 3.3 mM) 그리고 트랩핑 물질 GSH (최종 농도 5 mM)와 함께 항온처리되었다. 항온처리 혼합물은 60분간 37 ℃에서 항온처리되었으며, 얼음으로 냉각된 아세토니트릴 (항온처리 혼합물과 동일한 용적)로 종료되었고, 상청액은 단리되었다. 상청액은 LC/MS/MS 분석을 위하여 바로 주입되거나 또는 N₂ 하에서 건조되고 그리고 LC/MS/MS 분석에 앞서 물:아세토니트릴 (80:20) 혼합물에서 재구성되었다. 대응하는 GSH 접합체는 Triple TOF5600/Xevo Qtof MSe를 이용하여 LC/MS/MS를 통하여 평가되었다.

실시예 15

렛-콜라겐-유도된 관절염 모델

Lewis 암컷 렛의 콜라겐 유도된 관절염 (CIA) 모델은 심각한 염증 질환을 발생시키기 위하여 유형 II 콜라겐(CII) 면역화에 대하여 1차 T 및 B 세포 면역 반응을 요구한다 (Goldschmidt TJ, Holmdahl R. Cell Immunol. 154(1):240-8, 1994; Helfgott, S. M., et al,; Clin. Immunol. Immunopathol. 31:403, 1984; Holmdahl R. et al., J Autoimmun. 7(6):739-52, 1994; 그리고 Stuart, J. M., et al., J. Exp. Med. 155:1, 1982 참고). 임상 질환은 2차 CII 도전 후에 시작되었고, 질환은 연이은 8일에 걸쳐 진행된다.

일반적으로 Lewis 암컷 렛은 불완전한 Freund 어쥬번트에서 소의 콜라겐 유형 II로 면역주사를 맞는다. 렛 (한 집단에 N=10)은 1일차(치료)에 경구 위관영양을 시작하여 테스트 화합물 또는 운반체 BID를 매일 경구로 제공받는다. 관절염의 임상적 심각성은 0일차에 시작하여 매일 발목의 칼리퍼 측정으로 평가된다.

상세한 프로토콜: Lewis 암컷 렛은 등의 피부 3군데에 소의 콜라겐 유형 II ( 0.01 N 아세트산에 2 mg/ml 소 CII의 에멀션 : 불완전 Freund 어쥬번트 1: 1)으로 피하를 통하여 면역주사를 맞았다. 면역주사후 6일 뒤 렛은 소의 CII로 2차 피하 주사를 맞았다. 화학식 I의 화합물 현탁액 또는 운반체 (0.5% CMC, 0.1% Tween 80)는 0일차 (치료) 시점에서 시작하여 경구 위관영양 BID에 의해 투여된다 (한 집단에서 n=10 마리 동물). CIA의 임상적 심각성은 9일차에 시작하여 매일 발목의 칼리퍼 측정으로 평가된다. 기준 발목 칼리퍼 측정이 있고, 예방 치료를 위한 임상 기준(0.260-0.264 in)으로 확인되었다. 질환이 있는 동물에서 기준 발목 칼리퍼 측정은 치료 투약 1일차에 측정되었고, 동물은 임상 질환 개시 확인 후 무작위로 치료 집단에 할당된다 (0.2751-0.2755 in). 적절한 다중 비교 포스트-테스트와 함께 일원 변량 분석(1-way ANOVA)을 이용하여 모든 집단에 대하여 데어타거 분석된다. 모든 테스트의 유의성은 p ≤ 0.05에서 설정된다.

실시예 16

PLCγ2의 인산화 억제를 통하여 BCR 경로 활성화분석

프로토콜: 처리 하루 전, Ramos 세포는 96-웰 조직 배양 필터 플레이트 (Millipore, Billerica, MA)에서 200μL의 완전 배지내에 웰당 3x10⁵ 세포의 밀도로 도말된다. 처리 당일, 사용된 배지는 여과에 의해 제거되고, 세포는 일련의 화합물 희석 및 DMSO가 포함된 무혈청 배지 200 μL에 0.1%로 재현탁되고, 그 다음 2 시간 동안 37 ℃에서 항온처리되었다. 세포는 5분간 37 ℃에서 10 μg/mL 염소 항-인간 IgM으로 자극되었다. 모든 배지는 여과에 의해 제거되었고, 세포는 얼음 냉각된 PBS로 세척되고, 그 다음 20 mM Tris (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 2 mM Na₃VO₄, 1% Triton X-100, 0.1% SDS, 프로테아제 억제제 칵테일, 1 mM 페닐메틸술포닐 플로라이드, (PMSF), 포스파타아제 억제제 믹스 2 (Sigma cat # P5726, Sigma, St. Louis, Mo.), 그리고 포스파타아제 억제제 믹스 3 (Sigma cat # P0044, Sigma, St. Louis, Mo.)이 포함된 용해 완충액으로 1시간 동안 얼음위에서 용해된다. 용해물은 후속적으로 표준 MSD 플레이트 (Meso Scale Discovery, (MSD), (Gaithersburg, Maryland))로 이동되며, 포획 항체 (항-전체 PLCγ2 항체 B10, (SantaCruz Biotechnologies (Santa Cruz, CA))로 전-처리되었으며, 그리고 제조업자의 지시에 따라 BSA로 차단되었다. 용해물은 약간의 교반과 함께 4 ℃에서 하룻밤 동안 준비된 MSD 플레이트에서 항온처리되었다. 웰은 TBST로 3회 세척되었고, PBS에서 1% BSA에서 항 pPLCγ2 (SantaCruz)로 실온에서 1시간 동안 처리되었다. 웰은 다시 TBST로 3회 세척되었고, 그리고 항-토끼 술포(sulfo)-테그 항체 (MSD)로 1 시간 동안 실온에서 처리되었다. TBST로 세척된 후, MSD 판독 완충액이 추가되었고, 발광은 MSD SECTOR Imager 6000에서 측정되었다. 최대 반응은 항-IgM 및 DMSO로 처리된 자극된 세포가 포함된 웰에서 평균 발광으로 측정된다. 최저 반응은 DMSO 단독으로 처리된 자극안된 세포가 포함된 웰에서 평균 발광으로 측정된다. 최대 및 최저치는 화합물 처리 웰에서 발광을 표준화시키는데 이용된다. 표준화된 값은 로그 스케일로 화합물 농도에 대하여 플롯되며, Prizm 소프트웨어 (GraphPad Software, Inc.)를 이용하여 분석된다. 가변 기울기와 함께 S자 형태(sigmoidal)의 분량-반응 식은 데이터를 피팅하고, 50% 억제 농도 (IC₅₀)를 생성하는데 이용된다.

Ramos 세포는 다양한 농도 범위의 화학식 I의 화합물과 함께 2 시간 동안 항온처리되고, 10 μg/mL 항-IgM으로 5분간 자극을 받고, 그리고 PLCγ2 인산화는 전기화학-발광 면역분석을 이용하여 측정된다. EC₅₀는 GraphPad Prism 소프트웨어를 이용하여 산출된다.

실시예 17

BCR-유도된 인간 B 세포 증식의 억제

인간 CD19+ B 세포는 항-IgM 항체에 의해 자극되고, 화학식 I의 화합물 활성은 72시간 후 대체 세포 대사에 대하여 평가된다. 이 내용에서, 세포 대사는 세포 활성화 및 증식과 직접적으로 관련되며, 증식하는 동안 상대적 세포 생존을 또한 반영할 수 있다. 항-IgM 항체는 B 세포 증식에 있어서 효과에 대하여 평가되며, 10 μg/ml의 활성화를 위한 최대 농도의 절반 농도를 나타내도록 결정된다. 이들 활성화 조건을 이용하여, 다양한 농도의 테스트 화합물이 상이한 공여자로부터 단리된 CD19+ B 세포의 세포 기전에 대한 영향에 대해 0.1% DMSO에서 삼중으로 분석된다.

프로토콜: 인간 B 세포는 Ficoll-Hypaque 그라디언트(Amersham)를 이용하여 말초 혈액 단핵 세포 또는 미정제된 연막(buffy coats)으로부터 단리되고, 그리고 자석에 의한 세포 분류 (Human B Cell Isolation Kit II, Miltenyi Biotec)를 이용하여 음성적으로 선택된다. 표적 세포 순도는 B 세포, T 세포 및 단핵구의 표식 (차례로 CD19, CD3, CD14; BD Biosciences)에 대한 착색에 의해 흐름세포측정에 의해 결정된다. 데이터는 FACsCaliber 흐름세포측정기에서 수집되고, FloJo 소프트웨어 (BD Biosciences)를 이용하여 분석된다. 인간 B 세포 제제의 순도는 대개 95% 이상이다. 음성적으로 선택된 인간 B 세포는 96 웰 플레이트에서 10 μg/mL 항-IgM F(ab＇)₂ (Jackson ImmunoResearch)으로 자극된다. 0.2 mL RPMI + 10% FBS에서 100,000개의 B 세포는 삼중 웰에서 37 ℃, 5% CO₂에서 30분간 다양한 농도의 (0.5% DMSO에서 5000 nM 내지 0 nM으로 적정됨 ) 화학식 I의 화합물로 처리되거나 또는 0.5% DMSO 최종 농도의 운반체 대조군으로 처리되고, 그 다음 세포는 10 μg/mL 항-IgM F(ab＇)2로 자극된다. B 세포는 37 ℃, 5% CO₂에서 72시간 동안 자극된다. 광도계에서 측정되는 것과 같이 CellTiter-Glo 시약 (Promega)을 이용하여 증식이 측정된다. 평균 값은 최대 증식에 대하여 플롯되고, IC₅₀ 값은 GraphPad Prism v5 소프트웨어를 이용하여 결정된다.

실시예 18

시험관내 골수 세포 활성화에 있어서 화합물들의 효과평가

1차 인간 대식세포의 FcγR 활성화. FcγR를 통하여 자가항체 및 면역-복합체 중재된 활성화는 고정된 IgG로 대식세포의 활성와에 의해 모형화될 수 있다. GM-CSF 처리된 단세포로부터 유도된 1차 인간 대식세포는 활성화 표식들 이를 테면 CD80, CD86, MHC 항원 그리고 FcγRIII 수용체를 상향조절한다. 대식세포로부터 유도된 인간 단세포는 플레이트-결합된 정제된 인간 IgG에 의해 활성화될 수 있다. 이 자극은 FcγRIII 수용체와 교차 연결되고, 전-염증 사이토킨 이를 테면 TNFα, IL-6, IL1β 그리고 MCP-1의 배출을 유도한다. 화학식 I의 화합물은 인간 대식세포의 FcR 활성화 후 사이토킨 발현의 억제에 대해 평가된다.

일반적으로, 대식세포는 미리 정제된 IgG로 항온처리되고, 그 다음 세척된 플레이트에서 배양된다. 테스트 화합물의 적정(10,000 nM 내지 0 nM)이 이들 배양물에 추가된다. 세포 배양 상청액은 TNFα 및 IL-6의 발현에 대해 ELISA에 의해 분석된다.

프로토콜: 인간 단세포는 건강한 기증자의 연막으로부터 단리되고, 자석에 의한 세포 분류 (Monocyte Isolation Kit II, Miltenyi Biotec)를 이용하여 음성적으로 선택된다. 정제된 단세포는 소량의-IgG FBS 및 100 ng/mL GM-CSF이 보충된 표준 배지에서 5-7 일간 배양되어, 대식세포 분화가 유도된다. 배양된 대식세포는 100 μg/mL 플레이트-결합된 정제된 IgG ± 테스트 화합물의 적정 (10 μM 내지 0 nM)에 의해 자극된다. 상청액은 4시간 및 18시간 후 수집되고, 각각 TNFα 및 IL-6에 대하여 분석된다.

실시예 19

마우스 콜라겐 항체-유도된 관절염에서 효과

본 실시예는 관절염 뿐만 아니라 생체내 자가항체 및 면역복합체의 활성을 평가하는 것에 관련되며, 따라서 다른 염증 장애 이를 테면 SLE에 관련된다. 본 실험에서, 자기항체 및 면역 복합체의 활성은 FcR 신호생성에 따라 달라지는 병리학적 종점을 만들고, 이러한 항체의 Fc 부분은 화학식 I의 화합물 투여에 의해 저해된다.

암컷 DBA/1 마우스에서 콜라겐 항체-유도된 관절염 (CAIA) 모델은 염증 유도를 위하여 동족계의 T 및 B 세포 반응을 요구하지 않고, 오히려 임상 질환의 발생을 위하여 면역 효과물질 기전에 의존한다. CII 특이적 항체 전달이 항체-Fc-리포터 참여를 촉진시킨 후 3일 뒤 4가지 항-콜라겐 II (CII) 특이적 단클론 항체와 면역 자극 리포폴리사카라이드 (LPS) 칵테일이 투여되고 (Kagari T.et al.; J Immunol.170:4318-24 (2003)), immune complex formation, complement activation (Banda NK, et al.; Clin Exp Immunol. 159:100-8 (2010)) 그리고 전-염증 사이토킨 생산은 10일 기간에 걸쳐 심각한 염증 질환을 유도한다.

일반적으로, 관절염은 DBA/1 마우스에게 0일차 시점에 단클론 항-콜라겐 항체 칵테일의 주사에 의해 유도된다. 마우스 (한 집단에 N=10임)는 0일차에 시작된 것과 같이 QD 또는 BID로 테스트 화합물을 매일 경구 투여받는다. 발 염증은 매일 평가된다.

프로토콜: 6-8주령의 암컷 DBA/1 마우스는 2 mg의 관절염 유발성 4개 클론 단클론 항체 칵테일 (Chondrex#10100)을 0일차 시점에 i.v.로 제공받고, 이어서 3일 후 50 ug 분량의 LPS를 제공받는다. 테스트 화합물 현탁액 또는 운반체 (0.5% CMC, 0.1% Tween 80)는 0일차 시작 시점에서 항체 칵테일의 i.v. 제공 직전 경구 위관영양법에 의해 BID 투여된다 (한 집단에 10 마리 동물). CIA의 임상적 심각성은 4개 발 모두에서 염증을 관찰하여 평가되는데, 등급은 0 내지 4의 범위로 적용된다. 각 발은 다음과 같이 등급화된다: 0, 정상; 1, 약하지만 분명히 발목 또는 손목의 붉어짐과 부풀어오름, 또는 1 또는 2 숫자는 임의의 심각성으로 붉어짐과 부풀어오름; 2, 중간 내지 심각한 발목 또는 손목의 붉어짐 및 부풀어오름, 또는 2이상의 숫자; 3, 전체 발이 붉어지고 부풀어오름(확실한 부종) ; 그리고 4, 다중 관절이 연관되고, 최대한으로 염증이 생긴 사지. 4개 개별 점수의 합이 관절염 지수이며, 각 동물에서 최대 점수는 16이다.

Claims

화학식 I의 화합물 또는 약학적으로 허용가능한 이의 염:

상기 화학식 I에서,
각 R¹은 독립적으로, 수소, 임의로 치환된 C_1-6지방족 기(group), 임의로 치환된 3 내지 7 원(membered)의 단환 헤테로사이클 기, 또는 3 내지 7개의 탄소원자와 질소, 산소, 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 헤테로원자를 보유한 임의로 치환된 헤테로사이클릴알킬 기이거나;
또는 2개의 R¹ 기는, 이들의 개재(intervening) 원자들과 함께, 질소, 산소, 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 2개의 헤테로원자를 보유한, 임의로 치환된 3 내지 7 원의 포화된 또는 부분적으로 불포화된 단환 헤테로사이클 고리를 형성하고;
여기에서, 임의로 치환된 기들은 할로겐, -NO₂, -CN, -OR, -SR, -N(R)₂, -C(O)R, -CO₂R, -N(R)C(O)OR, -C(O)N(R)₂, -OC(O)R, -N(R)C(O)R, -S(O)R, -S(O)₂R, 또는 -S(O)₂N(R)₂로 치환될 수 있으며;
각 R은 독립적으로 수소 또는 C_1-6 지방족이거나;
또는 동일한 질소에 부착된 2개의 R기는, 이들의 개재 원자들과 함께, 1 내지 2개의 헤테로원자를 보유한, 임의로 치환된 3 내지 7 원의 포화된 또는 부분적으로 불포화된 단환 헤테로사이클 고리를 형성하고, 이때 임의의 두번째 헤테로원자는 질소, 산소, 또는 황으로부터 독립적으로 선택되며;
링 A는
이며;
R²는 -Cl 또는 -F이며; 그리고
R³은 -CF₃, -OCF₃, 또는 -F이다.
제1항에 있어서, 상기 화합물은 화학식 II-a인, 화합물 또는 약학적으로 허용가능한 이의 염:
제1항에 있어서, 상기 화합물은 화학식 II-b인, 화합물 또는 약학적으로 허용가능한 이의 염:
제1항에 있어서, 상기 화합물은 화학식 III인, 화합물:

.
제1항에 있어서, 상기 화합물은 화학식 IV인, 화합물:
제5항에 있어서, R³은 -CF₃인, 화합물.
제5항에 있어서, R³은 -F인, 화합물
제5항에 있어서, R¹ 은 둘 다 수소인, 화합물.
제5항에 있어서, 한 개의 R¹은 수소이며, 다른 R¹은 임의로 치환된 C_1-6지방족인, 화합물.
제9항에 있어서, 한 개의 R¹은 수소이며, 다른 R¹은 메틸인, 화합물.
제5항에 있어서, R¹은 둘 다 임의로 치환된 C_1-6지방족 기인, 화합물.
제1항에 있어서, 한 개의 R¹은 수소이며, 다른 하나는 임의로 치환된 C_1-6지방족인, 화합물.
제1항에 있어서, R¹은 둘 다 임의로 치환된 C_1-6지방족 기인, 화합물.
제1항에 있어서, R¹은 둘 다 수소인, 화합물.
제1항에 있어서, R²는 -Cl인, 화합물.
제1항에 있어서, R²는 -F인, 화합물.
제1항에 있어서, R³은 -CF₃인, 화합물.
제1항에 있어서, R³은 -OCF₃인, 화합물.
제1항에 있어서, R³은 -F인, 화합물.
다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 화합물:
브루톤 티로신 키나아제(Bruton's tyrosine kinase)를 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 이의 조성물의 유효량과 접촉시키는 것을 포함하는, 브루톤 티로신 키나아제의 효소 활성을 감소시키는 방법.
대상에게 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 이의 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 브루톤 티로신 키나아제의 억제에 반응하는 장애를 치료하는 방법.
대상에게 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 이의 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 자가면역 장애, 염증 장애, 및 암으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 장애를 치료하는 방법.
제23항에 있어서, 상기 장애는 류마티스성 관절염인, 방법.
제23항에 있어서, 상기 장애는 전신홍반루프스인, 방법.
제23항에 있어서, 상기 장애는 아토피성 피부염인, 방법.
제23항에 있어서, 상기 장애는 백혈병 또는 림프종인, 방법.