EA027823B1 - Пиримидиниловые ингибиторы тирозинкиназы - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к соединениям и их композициям, пригодным для применения в качестве ингибиторов тирозинкиназы Брутона и обладающим требуемыми для этого характеристиками.

Description

(57) Изобретение относится к соединениям и их композициям, пригодным для применения в качестве ингибиторов тирозинкиназы Брутона и обладающим требуемыми для этого характеристиками.

027823 Β1

Перекрестная ссылка на родственные заявки

Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании предварительной заявки на патент США № 61/657360, поданной 8 июня 2012 г., полное содержание которой включено в данное описание посредством ссылки.

Уровень техники

Тес киназы представляют собой нерецепторные тирозинкиназы и включают Тес (тирозинкиназа, которая экспрессируется в гепатоцеллюлярной карциноме), Б1к (тирозинкиназа Брутона), Пк (интерлейкин-2 (1Ь-2)-индуцируемая киназа Т-клеток; также известная как Еш1 или Тзк), К1к (англ. гезйпд 1утрйоеу!е ктазе, киназа покоящихся лимфоцитов, также известна как Тхк), Ьск (англ. 1ушрЬосу1е-зрес1йс рго1ет 1угоз1пе ктазе, тирозинкиназа лимфоцит специфического протеина) и Втх (ген тирозинкиназы костного мозга на хромосоме X; также известная как Б1к)). Эти киназы в основном экспрессируются в гемопоэтических клетках, хотя экспрессия Втх и Тес была обнаружена также в клетках эндотелия и печени. Тес киназы (Пк, К1к и Тес) экспрессируются в Т-клетках, и все они активируются ниже Т-клеточного рецептора (англ. Т-се11 гесер!ог, ТСК). В1к является нижележащим медиатором сигнализации В-клеточного рецептора (англ. В-се11 гесер!ог, ВСК), которая участвует в регуляции активации, пролиферации и дифференциации В-клеток. Более конкретно, В1к содержит домен РН, который связывает фосфатидилинозит-(3,4,5)-трисфосфат (ΡΙΡ3). Связывание ΡΙΡ3 вызывает фосфорилирование киназой В1к фосфолипазы С (ΡΠΟγ), что в свою очередь приводит к гидролизу ΡΙΡ2 с образованием двух вторичных мессенджеров инозит трифосфата (ΙΡ3) и диацилглицерина (ΌΛΟ), которые активируют протеинкиназу РКС, что затем индуцирует дополнительную сигнализацию В-клеток. Мутации, которые отключают ферментативную активность В1к, приводят к развитию синдрома ХЬЛ (Х-хромосомной агаммаглобулинемии), первичному иммунодефициту. Учитывая очень важное значение, которое Тес киназы оказывают на сигнализацию как В-клеток, так и Т-клеток, Тес киназы представляют интерес с точки зрения аутоиммунных расстройств.

Следовательно, в данной области техники существует большая потребность в эффективных ингибиторах для Тес-киназ, таких как В1к. Настоящее изобретение удовлетворяет эти и другие потребности.

Краткое описание изобретения

В определенных вариантах реализации в изобретении предложено соединение формулы I

или его фармацевтически приемлемая соль, где К¹ и кольцо А такие, как определено и описано в настоящем документе. Такие соединения представляют собой ингибиторы киназ семейства Тес, в том числе В1к. Соответственно, предложенные соединения можно применять в различных способах, включая скрининг и анализ активности ίη уПго, а также ίη У1уо в доклинических, клинических и терапевтических исследованиях, как подробно описано в настоящем документе.

В определенных вариантах реализации настоящее изобретение обеспечивает фармацевтические композиции, содержащие предложенные соединения.

В определенных вариантах реализации настоящее изобретение обеспечивает способ уменьшения ферментативной активности В1к. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения такие способы включают приведение В1к в контакт с эффективным количеством ингибитора В1к.

В некоторых вариантах реализации настоящее изобретение обеспечивает способ лечения расстройства, восприимчивого к ингибированию В1к у субъекта, нуждающегося в этом. Такие расстройства и способы подробно описаны в настоящем документе.

Подробное описание определенных вариантов реализации изобретения

В определенных вариантах реализации изобретение обеспечивает соединение формулы Ι

- 1 027823

или его фармацевтически приемлемую соль; где каждый К¹ независимо представляет собой водород, возможно замещенную С_1-6алифатическую группу, возможно замещенную 3-7-членную моноциклическую гетероциклическую группу или возможно замещенную гетероциклилалкильную группу, содержащую 3-7 атомов углерода и 1-3 гетероатома, независимо выбранных из азота, кислорода или серы;

или две группы К¹ совместно с находящимися между ними атомами образуют возможно замещенное 3-7-членное насыщенное или частично ненасыщенное моноциклическое гетероциклическое кольцо, содержащее 1-2 гетероатома, независимо выбранных из азота, кислорода или серы;

где возможно замещенные группы могут содержать в качестве заместителя галоген, -ΝΟ₂, -ΕΝ, -ОК, -8К, -Ν(Κ)2, -С(О)К, -СО2К, -Х(К)С(О)ОК, -С(О)Х(КД, -ОС(О)К, -Х(К)С(О)К, -8(О)К, -8(ОДК или 8(Ο)₂Ν(Κ)₂; каждый К независимо представляет собой водород или С_1-6алифатическую группу;

или две группы К, присоединенные к одному и тому же атому азота, совместно с находящимися между ними атомами образуют возможно замещенное 3-7-членное насыщенное или частично ненасыщенное моноциклическое гетероциклическое кольцо, содержащее 1-2 гетероатома, при этом любой второй гетероатом независимо выбран из азота, кислорода или серы;

кольцо А представляет собой

В²

К² представляет собой -С1 или -Р; и

К³ представляет собой -СР₃, -ОСР₃ или -Р.

Определения.

Соединения согласно настоящему изобретению включают те, которые в целом описаны выше и далее проиллюстрированы классами, подклассами и видами, приведенными в настоящем описании. При использовании в настоящем документе применяются следующие определения, если не указано иное. Для целей настоящего изобретения химические элементы идентифицированы в соответствии с Периодической таблицей элементов, СА8 версией, НапСЪоок о£ СРет1з1гу апС РРуз1сз, 75 Εά. Кроме того, общие принципы органической химии описаны в Огдатс СРет1з1гу, ТРотаз 8огге11, итуегзРу 8с1епсе Боокз, 8аиза1Ро: 1999, и МагсР'з АСуапсеС Огдатс СРет1з1гу, 5* Εά., Εά.: 8тРР М.В. апС МагсР Е, ,1оНп \\а!еу & 8опз, Хеш Уогк: 2001, полное содержание которых включено в настоящий документ посредством ссылки.

При использовании в настоящем документе сокращения имеют свое обычное значение в пределах областей химии и биологии. Химические структуры и формулы, изложенные в настоящем документе, составлены в соответствии со стандартными правилами химической валентности, известными в области химии.

Термин алифатический или алифатическая группа при использовании в настоящем документе означает прямолинейную (т.е. неразветвленную) или разветвленную, замещенную или незамещенную углеводородную цепь, которая является полностью насыщенной или которая содержит одно или более звеньев ненасыщенности, или моноциклический углеводород или бициклический углеводород, который является полностью насыщенным или который содержит одно или более звеньев ненасыщенности, но который не является ароматическим (также называемые здесь карбоцикл, циклоалифатический или циклоалкил), и который имеет одну точку присоединения к остальной части молекулы. Если не указано иное, алифатические группы содержат 1-6 алифатических атомов углерода. В некоторых вариантах реализации алифатические группы содержат 1-5 алифатических атомов углерода. В некоторых вариантах реализацииалифатические группы содержат 1-4 алифатических атома углерода. В некоторых вариантах реализацииалифатические группы содержат 1-3 алифатических атома углерода и в еще других вариантах реализацииалифатические группы содержат 1-2 алифатических атома углерода. Подходящие алифатические группы включают, но не ограничиваются ими, линейный или разветвленный, замещенный или незамещенный алкильные, алкенильные, алкинильные группы и их гибриды, такие как (циклоалкил)алкил, (циклоалкенил)алкил или (циклоалкил)алкенил.

- 2 027823

При использовании в настоящем документе термин циклоалифатический (или карбоцикл или циклоалкил) относится к моноциклическому С₃-С₆углеводороду, который полностью насыщен или который содержит одно или более звеньев ненасыщенности, но который не является ароматическим, и который имеет одну точку присоединения к остальной части молекулы.

При использовании в настоящем документе термины гетероцикл, гетероциклил и гетероциклическое кольцо применяются взаимозаменяемо и относятся к стабильному 3-7-членному моноциклическому гетероциклическому фрагменту, который либо насыщен либо частично ненасыщен, и имеет в дополнение к атомам углерода один или более, предпочтительно от одного до четырех, гетероатомов, как определено выше. При использовании по отношению к атому кольца гетероцикла термин азот включает замещенный азот. В качестве примера в насыщенном или частично ненасыщенном кольце, содержащем 0-3 гетероатома, выбранных из кислорода, серы или азота, азот может представлять собой N (как в 3,4-дигидро-2Н-пирролиле), ΝΗ (как в пирролидиниле) или +ΝΚ (как в Ν-замещенном пирролидиниле). Термин гетероциклилалкил относится к алкильной группе, замещенной гетероциклилом, при этом алкильные и гетероциклильные части независимо являются возможно замещенными.

Г етероциклическое кольцо может быть присоединено к его боковой группе по любому гетероатому или атому углерода, что приводит к образованию стабильной структуры, и любой из атомов кольца может являться возможно замещенным. Примеры таких насыщенных или частично ненасыщенных гетероциклических радикалов включают, без ограничения, тетрагидрофуранил, тетрагидротиофенил пирролидинил, пиперидинил, пирролинил, тетрагидрохинолинил, тетрагидроизохинолинил, декагидрохинолинил, оксазолидинил, пиперазинил, диоксанил, диоксоланил, диазепинил, оксазепинил, тиазепинил, морфолинил и хинуклидинил.

При использовании в настоящем документе термин частично ненасыщенный относится к кольцевому фрагменту, который содержит по меньшей мере одну двойную или тройную связь. Подразумевается, что термин частично ненасыщенный охватывает кольца, содержащие несколько участков ненасыщенности, но не включает арильные или гетероарильные фрагменты, как определено в настоящем документе.

Термин гетероатом означает один или более атомов кислорода, серы, азота, фосфора или кремния (включая любую окисленную форму азота, серы, фосфора или кремния; кватернизованную форму любого основного азота или способный к замещению азот гетероциклического кольца, например, N (как в 3,4дигидро-2Н-пирролиле), ΝΗ (как в пирролидиниле) или ΝΚ+ (как в Ν-замещенном пирролидиниле)).

При использовании в настоящем документе термин фармацевтически приемлемая соль относится к таким солям, которые, в рамках тщательного медицинского обследования, подходят для применения в контакте с тканями человека и низших животных без чрезмерной токсичности, раздражения, аллергической реакции и тому подобного и которым соответствует разумное соотношение польза/риск. Фармацевтически приемлемые соли хорошо известны в данной области техники. Например, δ.Μ. Вегде с соавторами детально описывают фармацевтически приемлемые соли в публикации I. РЬагтасеи11са1 8с1спсс5. 1977, 66, 1-19, содержание которой включено в настоящий документ посредством ссылки.

В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения нейтральные формы соединений регенерируют путем приведения соли в контакт с основанием или кислотой и выделения исходного соединения обычным способом. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения исходная форма соединения отличается от различных солевых форм по определенным физическим свойствам, таким как растворимость в полярных растворителях.

Если не указано иное, структуры, изображенные в настоящем документе, также подразумевают все изомерные (например, энантиомерные, диастереомерные и геометрические (или конформационные)) формы этой структуры; например, К и δ конфигурации для каждого центра асимметрии, Ζ и Е изомеры по двойной связи и Ζ и Е конформационные изомеры. Следовательно, отдельные стереохимические изомеры, а также энантиомерные, диастереомерные и геометрические (или конформационные) смеси представленных соединений находятся в пределах объема настоящего изобретения. Если не указано иное, все таутомерные формы соединений согласно настоящему изобретению находятся в пределах объема настоящего изобретения. Кроме того, если не указано иное, структуры, изображенные в настоящем документе, также включают соединения, которые отличаются только присутствием одного или более изотопно обогащенных атомов. Например, соединения, имеющие структуры согласно настоящему изобретению, включающие замену водорода дейтерием или тритием или замену углерода ¹³С- или ¹⁴Собогащенным углеродом, находятся в пределах объема настоящего изобретения. Такие соединения можно применять, например, в качестве аналитических средств, в качестве зондов в биологических анализах или в качестве терапевтических агентов в соответствии с настоящим изобретением.

Соединения.

Как описано выше, в определенных вариантах реализации настоящее изобретение обеспечивает соединение формулы I

- 3 027823

описанные в настоящем документе.

Неожиданно было обнаружено, что соединения формулы I обладают преимущественными свойствами по сравнению с известными ингибиторами Б1к. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения соединения формулы I имеют повышенную активность. Не желая быть связанными какойлибо конкретной теорией, полагают, что соединения, описанные в настоящем документе, обладают улучшенной активностью в качестве ингибиторов Б1к, улучшенным профилем вне мишени, полученным при измерении ингибирования НЕКО или в анализах индукции РХК, или их комбинацией. Экспериментальные данные, показывающие эти преимущественные свойства, приведены в последующих примерах.

В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения оба Б¹ представляют собой водород. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения каждый К¹ независимо представляет собой С16алифатическую группу. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения каждый К¹ независимо представляет собой С1-5алифатическую группу. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения каждый К¹ независимо представляет собой С1-4алифатическую группу. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения каждый К¹ независимо представляет собой С1-3алифатическую группу. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения каждый К¹ независимо представляет собой С_1-2алифатическую группу. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения оба К¹ представляют собой метил.

В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения каждый К¹ независимо представляет собой водород или С1-6алифатическую группу. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения каждый К¹ независимо представляет собой водород или С1-5алифатическую группу. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения каждый К¹ независимо представляет собой водород или С1-4алифатическую группу. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения каждый К¹ независимо представляет собой водород или С1-3алифатическую группу. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения каждый К¹ независимо представляет собой водород или С_1-2алифатическую группу. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения каждый К¹ независимо представляет собой водород или метил.

В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения один К¹ представляет собой водород или и другой К¹ представляет собой С1-6алифатическую группу. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения один К¹ представляет собой водород, а другой К¹ представляет собой метил. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения один К¹ представляет собой водород, а другой К¹ представляет собой этил. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения один К¹ представляет собой водород, а другой К¹ представляет собой С1-6(циклоалкил)алкил. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения один К¹ представляет собой водород, а другой К¹ представляет собой С1-6(циклоалкил).

В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения один К¹ представляет собой водород, а другой К¹ представляет собой С1-6алифатическую группу, возможно замещенную -ОК, где К¹ представляет собой водород или С1-6алифатическую группу.

В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения один К¹ представляет собой водород, а другой К¹ представляет собой гетероциклилалкильную группу, содержащую 3-7 атомов углерода и 1-3 гетероатома, независимо выбранные из азота, кислорода или серы. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения один К¹ представляет собой водород, а другой К¹ представляет собой возможно замещенный 3-7-членный моноциклический гетероцикл.

В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения две группы К¹ совместно с находящимися между ними атомами образуют возможно замещенное 3-5-членное насыщенное или частично ненасыщенное моноциклическое гетероциклическое кольцо, содержащее 1-2 гетероатома, независимо выбранные из азота, кислорода или серы. В некоторых вариантах реализации две группы К¹ совместно с находящимися между ними атомами образуют возможно замещенное пиперазиновое кольцо.

Как описано выше, кольцо А представляет собой

- 4 027823 к²

В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения К² представляет собой -С1. В других вариантах реализации настоящего изобретения К² представляет собой -Р. В некоторых вариантах реализации К³ представляет собой -СР3. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения К³ представляет собой -ОСР3. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения К³ представляет собой -Р.

В некоторых вариантах реализации изобретения кольцо А выбрано из группы, состоящей из

В некоторых вариантах реализации изобретения в описанных в настоящем документе соединениях существует трансстереохимическое взаимное расположение между пиперидиновым заместителем, несущим карбоксамидную группу, и пиперидиновым заместителем, несущим лактамную группу.

В некоторых вариантах реализации настоящее изобретение обеспечивает соединение формулы 11-а

и описано в классах и подклассах в настоящем документе.

В некоторых вариантах реализации настоящее изобретение обеспечивает соединение формулы 11-Ь

или его фармацевтически приемлемую соль, где каждый из К¹, К² и К³ такой, как определено выше

или его фармацевтически приемлемую соль, при этом каждый из К² и К³ такой, как определено выше и описано в классах и подклассах в настоящем документе.

В некоторых вариантах реализации настоящее изобретение обеспечивает соединение формулы IV

- 5 027823

ше и описано в классах и подклассах в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения оба К¹ представляют собой водород. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения один К¹ представляет собой водород, а другой К¹ представляет собой метил.

В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения предложенное соединение представляет собой соединение, изображенное ниже в таблице, или его фармацевтически приемлемую соль.

Соединения согласно настоящему изобретению синтезируют при помощи соответствующего сочетания способов синтеза, которые в целом хорошо известны. Способы, полезные при синтезе соединений

- 6 027823 согласно настоящему изобретению очевидны и доступны специалистам в данной области техники. Приведенное ниже обсуждение предлагается для иллюстрирования некоторых из различных способов, доступных для применения для получения соединений согласно настоящему изобретению. Однако обсуждение не предназначено для того, чтобы определить объем реакций или последовательности реакций, полезных при получении соединений согласно настоящему изобретению.

Соединения формулы I можно в общем случае получить в соответствии со схемой 1.

Соединения формулы I можно в общем случае получить также в соответствии со схемами 2, 3, За, 4, 4а, 5 или 5а.

- 7 027823

Схема 3

- 8 027823

Схема 4

Схема 5

- 9 027823

Каждая из групп РО, РО_Ь РО₂ и РО₃ в соединениях на схемах с 1 по 5а независимо представляет собой подходящую защитную группу. Такие сложноэфирные и аминные защитные группы известны в данной области техники и описаны подробно в Рго!ес!тд Огоирз т Огдашс 8уп!йез13, Т.А. Огеепе апб Р.О. М. Аи!з, 3^гб ебШоп, 1оЬп АПеу & 8оп§, 1999, включенном в полном объеме в настоящее описание в качестве ссылки. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения защитная группа представляет собой группу Вос.

В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения каждый из этапов синтеза на схемах с 1 по 5 а можно выполнять последовательно с выделением каждой промежуточной формы, выполненным после каждого этапа. Альтернативно, каждый из этапов, показанных выше на схемах 1, 2, 3 и 4, можно выполнять без выделения одного или более промежуточных форм соединений.

В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения для получения желаемого конечного продукта можно выполнять все этапы синтеза, указанного выше. В других вариантах реализации настоящего изобретения можно выполнить два, три, четыре, пять или более последовательных этапов для получения промежуточной формы или желаемого конечного продукта.

Применение, состав и введение.

В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения соединения согласно настоящему изобретению предназначены для применения в медицине. В некоторых вариантах реализации настоящее изобретение обеспечивает способ снижения ферментативной активности киназы из семейства киназ Тес (например, Тес, В!к, Ик, Тхк, кск и Втх). В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения такие способы включают приведение киназы из семейства киназ Тес в контакт с эффективным количеством ингибитора семейства киназ Тес. Таким образом, настоящее изобретение также обеспечивает способы ингибирования ферментативной активности семейства киназ Тес путем приведения члена семейства киназ Тес в контакт с ингибитором семейства киназ Тес согласно настоящему изобретению. При использовании в настоящем документе термин член семейства киназ Тес относится к любой нерецепторной тирозинкиназе из семейства киназ Тес. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения члены семейства киназ Тес представляют собой Тес, В!к, Ик, Тхк, кск и Втх.

В некоторых вариантах реализации настоящее изобретение относится к способам уменьшения ферментативной активности В!к. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения такие способы включают приведение В!к в контакт с эффективным количеством ингибитора В!к. Таким образом, настоящее изобретение также обеспечивает способы ингибирования ферментативной активности В!к путем приведения В!к в контакт с ингибитором В!к согласно настоящему изобретению.

При использовании в настоящем документе ферментативная активность В!к относится к ферментативной активности киназы В!к. Например, когда уменьшается ферментативная активность В!к, уменьшается связывание Р1Р3 и/или фосфорилирование РкСу. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения концентрация полумаксимального ингибирования (1С₅₀) ингибитора В!к по отношению к В!к составляет меньше 1 мкМ. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения 1С₅₀ ингибитора В!к по отношению к В!к составляет менее 500 нМ. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения 1С₅₀ ингибитора В!к по отношению к В!к составляет менее 100 нМ. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения 1С₅₀ ингибитора В!к по отношению к В!к составляет менее 10 нМ. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения 1С₅₀ ингибитора В!к по отношению к В!к составляет менее 1 нМ. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения 1С₅₀ ингибитора В!к по отношению к В!к составляет от 0,1 нМ до 10 мкМ. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения 1С₅₀ ингибитора В!к по отношению к В!к составляет от 0,1 нМ до 1 мкМ. В некоторых вариан- 10 027823 тах реализации настоящего изобретения 1С₅₀ ингибитора В!к по отношению к В!к составляет от 0,1 до 100 нМ. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения 1С₅₀ ингибитора В!к по отношению к В!к составляет от 0,1 до 10 нМ.

В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения ингибиторы таких Тес киназ полезны для лечения заболеваний и расстройств, которые можно облегчить путем ингибирования (т.е. уменьшения) ферментативной активности одной или более киназ Тес. Соединения согласно настоящему изобретению представляют собой эффективные ингибиторы киназ семейства Тес и, таким образом, будут применены при лечении заболеваний, связанных с активностью одной или более из киназ семейства Тес. Термин заболевание означает заболевания, синдромы или симптомы заболевания. Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает способы лечения аутоиммунных расстройств, воспалительных заболеваний и рака у субъекта, нуждающегося в таком лечении. Такие способы включают введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества ингибитора киназы Тес, В!к, Ик, Тхк, Ьск и/или Втх.

Термин аутоиммунные расстройства включает заболевания или расстройства, при которых наблюдается ненадлежащий иммунный ответ против нативных антигенов, такие как острый рассеянный энцефаломиелит (ОРЭМ), болезнь Аддисона, очаговая алопеция, антифосфолипидный синдром (АФС), гемолитическая анемия, аутоиммунный гепатит, буллезный пемфигоид (БП), глютеновая энтеропатия, дерматомиозит, сахарный диабет типа 1, синдром Гудпасчера, болезнь Грейвса, синдром Гийена-Барре (СГБ), тиреоидит Хашимото, идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура, волчанка или системная красная волчанка (СКВ), смешанное поражение соединительной ткани, рассеянный склероз, тяжелая миастения, обыкновенная пузырчатка, гемофилия с ингибиторами, злокачественная анемия, полимиозит, первичный билиарный цирроз печени, синдром Шегрена, височный артериит и гранулематоз Вегенера. Термин воспалительные заболевания включает заболевания или расстройства, при которых наблюдается острое или хроническое воспаление, такие как аллергия, астма (например, аллергическая астма), атопический дерматит, простатит, гломерулонефрит, воспалительные заболевания тазовых органов (ВЗТО), воспалительное заболевание кишечника (ВЗК, например, болезнь Крона, неспецифический язвенный колит), реперфузионное повреждение, ревматоидный артрит, отторжение трансплантата (в том числе у пациентов с трансплантацией с положительным тестом на совместимость крови донора и реципиента) и васкулит. В некоторых вариантах реализации настоящее изобретение обеспечивает способы лечения заболеваний, расстройств или состояний, которые одобрены для лечения ритуксимабом (моноклональное антитело против СЭ20), в том числе неходжкинской лимфомы (НХЛ), хронического лимфоцитарного лейкоза (ХЛЛ), ревматоидного артрита (РА), гранулематоза Вегенера (ГВ) и микроскопического полиангиита (МПА). В некоторых вариантах реализации настоящее изобретение обеспечивает способ лечения ревматоидного артрита (РА), системной красной волчанки или атопического дерматита с применением соединений, описанных в настоящем документе.

Термин рак включает заболевания или расстройства, при которых наблюдается аномальный рост и/или пролиферация клеток, такие как глиома, рак щитовидной железы, рак молочной железы, рак легкого (например, мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого), рак желудка, желудочнокишечные стромальные опухоли, рак поджелудочной железы, рак желчного протока, рак яичников, карцинома эндометрия, рак предстательной железы, почечно-клеточная карцинома, лимфома (например, анапластическая крупноклеточная лимфома), лейкоз (например, острый миелоидный лейкоз, лейкоз Тклеток, хронический лимфоцитарный лейкоз), множественная миелома, злокачественная мезотелиома, злокачественная меланома и рак толстой кишки (например, колоректальный рак с высокой микросателлитной нестабильностью). В некоторых вариантах реализации настоящее изобретение обеспечивает способ лечения лейкемии или лимфомы.

Термин субъект при использовании в настоящем документе относится к млекопитающему, которому вводят фармацевтическую композицию. Примеры субъектов включают людей, а также ветеринарных и лабораторных животных, таких как лошади, свиньи, крупный рогатый скот, собаки, кошки, кролики, крысы, мыши и водные млекопитающие.

Некоторые показания и ингибирование В-клеток.

Как описано выше, предложенные соединения можно применять для лечения заболеваний, в том числе РА и СКВ. Как более подробно описано ниже, эти заболевания связаны с В-клетками. Таким образом, настоящее изобретение включает доказательства того, что предложенные соединения являются полезными в качестве терапевтических средств для этих и других показаний.

Нарушение регуляции иммунной системы имеет решающее значение для патогенеза РА (Рапау1 С.8., е! а1. Кйеит. Όίδ. СПп. ΝοΠίι. Ат. 2001; 27:317-334). Поскольку большинство проникающих в синовиальную мембрану лейкоцитов представляют собой Т-лимфоциты (преимущественно активированные СЭ4+Т-клетки) и клетки, происходящие от моноцитов/макрофагов (которые высвобождают провоспалительные цитокины, такие как Ш-1, ΤΝΡ-альфа и Ш-6 и протеолитические ферменты, включая коллагеназы и металлопротеиназы), в синовиальной жидкости также находят В-клетки и плазматические клетки (Ζ1ι;πΐβ Ζ., ВгМдек §.Ь. РНеит. Όίδ. С1ш. ΝοΠίι. Ат. 2001; 27:335-353). Ясность роли В-клеток и связанных с ними эффекторных функций при РА продемонстрирована эффективностью ритуксимаба, лекарст- 11 027823 венного средства, которое выборочно разрушает В-клетки, и которое было утверждено для лечения РА (СоНеп 8.В., е! а1.; КЕРЬЕХ Тпа1 Сгоир. ΑτίΕτίΐίβ КНеит. 2006 Зер.; 54(9):2793-806).

Хотя этиология СКВ изучена не до конца, считают, что патогенетические аутоиммунные антитела и отложение иммунных комплексов имеют решающее значение для развития обширного повреждения тканей (Кйрре1 ΙΗ.. е! а1. Рптег оп 1Не гйеитайс Лвеавев. А!1ап!а: АгШгШв Роипбайоп; 2001). Опосредованную аутоиммунными антителами и иммунным комплексами активацию можно изучать путем измерения ингибирования активации макрофагов с помощью макрофагов, стимулированных через рецепторы Рс (см. приведенный пример - РсуК активация основных человеческих макрофагов). Потеря толерантности к собственным антигенам в конечном счете ведет к стимулированию В-клеток к выработке аутоиммунных антител, часто направленных против нуклеарных или цитоплазматических компонентов. Антитела против нуклеарных компонентов (антинуклеарные антитела [ΑΝΑ]) нацелены на нуклеарные антигены, включая ДНК (обычно двухцепочечные ДНК [дцДНК]), РНК, гистоны и небольшие нуклеарные рибонуклеопротеины. Эти антитела соединяются с собственными антигенами, образуя иммунные комплексы, которые откладываются в тканях, возбуждают воспалительные реакции и приводят к повреждению тканей. В дополнение к их роли в производстве патогенных аутоиммунных антител, В-клетки также функционируют в качестве антигенпрезентирующих клеток (англ. апйдеп-ргевепйпд се11в, АРС) по отношению к Т-клеткам, таким образом, играя важную роль в инициировании антиген-специфической реакции. Учитывая центральную роль гуморального звена иммунной системы в патогенезе СКВ, В-клетки или путь реакции В-клеток представляют собой желаемые терапевтические мишени. Белимумаб, моноклональное антитело, которое недавно было одобрено для лечения СКВ, блокирует связывание ВАРР с его рецепторами, которые экспрессируются В-клетками. В соответствии с уменьшением циркулирующих В-клеток, наблюдаемых после лечения белимумабом, эти рецепторы служат для активации и усиления выживаемости В-клеток. См. также СНап О.Т., е! а1. 1ттипо1. Кеу. 1999Ь;169:107-121; Ыауагга 8.У., е! а1. ЬапсеР 2011 РеЬ. 26;377(9767):721-31; Рште К., е! а1. АйЬгйк КНеит. 2011 Эес.;63(12):3918-30. Роль Вклеток и миелоидных клеток при аутоиммунных заболеваниях, таких как СКВ, дополнительно подтверждается недавней публикацией, которая описывает эффективность в доклинической животной модели с СКВ, в которой мышей лечили низкомолекулярным необратимым ингибитором В!к (НошдЬегд Ь.А. ΡΝΑ8. 2010; 107: 13075).

Комбинации.

В некоторых вариантах реализации соединение согласно настоящему изобретению вводят в комбинации с другим агентом. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения соединение согласно настоящему изобретению можно применять для лечения РА, и его вводят в комбинации с противоревматическими препаратами, модифицирующими течение болезни (англ. Лвеаве-тоййутё аийгйеитаОс бгидв, ЭМАКО), включая, без ограничения: метотрексат, абатацепт, азатиоприн, цертолизумаб, хлорохин и гидроксихлорохин, циклоспорин, Ό-пеницилламин, адалимумаб, этанерцепт, голимумаб, соли золота (в том числе ауранофин и натрия ауротиомалат), инфликсимаб, лефлуномид, миноциклин, ритуксимаб, сульфасалазин, тоцилизумаб или их комбинации. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения соединение согласно настоящему изобретению вводят в комбинации с нестероидным противовоспалительным препаратом (англ. пои5!егоМа1 ап!1-1пйатта!огу бгид, ΝδΛΙΩ) или кортикостероидами. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения соединение согласно настоящему изобретению можно применять для лечения СКВ, и его вводят в комбинации с агентом для лечения СКВ, в том числе, без ограничения: кортикостероидами, противомалярийными средствами, белимумабом, мофетила микофенолатом (ММР) или натрия микофенолатом, азатиоприном или их комбинациями. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения соединение согласно настоящему изобретению можно применять для лечения атопического дерматита, и его вводят в сочетании с агентом для местного применения для лечения атопического дерматита, в том числе, без ограничения: стероидами для местного применения, такролимусом, метотрексатом, мометазона фуроатом (ММР), азатиоприном, ретиноидами или их комбинациями.

Испытания.

Для разработки полезных ингибиторов киназ Тес семейства можно ш νίΙΐΌ определить потенциальные ингибиторы, способные снизить ферментативную активностью семейства Тес киназ. Активность соединений-ингибиторов можно проанализировать с применением способов, известных в данной области техники, и/или способов, представленных в настоящем документе.

Соединения, которые уменьшают ферментативную активность членов семейства Тес киназ, можно идентифицировать и протестировать с применением биологически активного члена семейства Тес киназ, либо рекомбинантным либо природного происхождения. Тес киназы можно обнаружить в нативных клетках, выделить ш νίΙΐΌ или совместно экспрессировать или экспрессировать в клетке. Измерение снижения ферментативной активности члена семейства Тес киназ в присутствии ингибитора по отношению к активности в отсутствие ингибитора можно выполнить с применением различных способов, известных в данной области техники, такого как РОРУСАТ-ЬЗ анализ, описанный ниже в примерах. В данной области техники известны другие способы анализа активности В!к и других киназ Тес. Выбор соответствующих методов анализа находится в пределах возможностей специалистов в данной области техники.

- 12 027823

После определения соединений, которые способны уменьшать ферментативную активность членов семейства Тес киназ, соединения можно дополнительно протестировать на их способность селективно ингибировать киназу семейства Тес по отношению к другим ферментам.

Соединения можно дополнительно протестировать в клеточных моделях или животных моделях на способность таких соединений вызывать обнаруживаемые изменения в фенотипе, связанном с активностью члена семейства Тес киназ. В дополнение к клеточным культурам можно применять животные модели для проверки ингибиторов киназ семейства Тес на способность таких ингибиторов обеспечивать лечение аутоиммунных расстройств, воспалительных заболеваний или рака в животных моделях.

Фармацевтические композиции.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает фармацевтические композиции, содержащие соединение формулы I или соединение формулы I в комбинации с фармацевтически приемлемым наполнителем (например, носителем).

Фармацевтические композиции содержат оптические изомеры, диастереомеры или фармацевтически приемлемые соли ингибиторов, описанных в настоящем документе. Соединение формулы I, включенное в фармацевтическую композицию, можно присоединить посредством ковалентной связи к фрагменту носителя, как описано выше. Альтернативно, соединение формулы I, включенное в фармацевтическую композицию, не соединено ковалентной связью с фрагментом носителя.

Термин фармацевтически приемлемый носитель при использовании в настоящем документе относится к фармацевтическим наполнителям, например фармацевтически, физиологически приемлемым органическим или неорганическим носителям, пригодным для энтерального или парентерального применения, которые не реагируют нежелательным образом с активным агентом. Подходящие фармацевтически приемлемые носители включают воду, солевые растворы (например, раствор Рингера), спирты, масла, желатины и углеводы, такие как лактоза, амилоза или крахмал, сложные эфиры жирных кислот, гидроксиметилцеллюлозу и поливинилпирролидин. Такие препараты можно стерилизовать и при необходимости смешивать со вспомогательными агентами, такими как смазывающие вещества, консерванты, стабилизаторы, смачивающие агенты, эмульгаторы, соли, которые влияют на осмотическое давление, буферы, окрашивающие и/или ароматические вещества и т.п., которые не реагируют нежелательным образом с соединениями согласно настоящему изобретению.

Соединения согласно настоящему изобретению можно вводить субъекту по отдельности или можно вводить совместно. Совместное введение означает одновременное или последовательное введение соединений по отдельности или в сочетании (более чем одно соединение). Препараты также можно при необходимости комбинировать с другими активными веществами (например, для снижения метаболической деградации).

Соединения согласно настоящему изобретению можно получать и вводить в широком разнообразии пероральных, парентеральных лекарственных форм и лекарственных форм для местного применения. Таким образом, соединения согласно настоящему изобретению можно вводить путем инъекции (например, внутривенно, внутримышечно, внутрикожно, подкожно, интрадуоденально или внутрибрюшинно). Кроме того, соединения, описанные в настоящем документе, можно вводить путем ингаляции, например, интраназально. Кроме того, соединения согласно изобретению можно вводить трансдермально. Предполагается также, что для введения соединений согласно настоящему изобретению можно применять несколько путей введения (например, внутримышечный, пероральный, трансдермальный).

Для получения фармацевтических композиций из соединений согласно настоящему изобретению фармацевтически приемлемые носители могут находиться либо в твердой, либо жидкой форме. Препараты в твердой форме включают порошки, таблетки, пилюли, капсулы, облатки, суппозитории и диспергируемые гранулы. Твердый носитель может представлять собой одно или более веществ, которые также могут действовать как разбавители, ароматизаторы, связующие вещества, консерванты, агенты, дезинтегрирующие таблетки, или как инкапсулирующий материал.

В порошках носитель представляет собой тонкоизмельченное твердое вещество в смеси с тонкоизмельченным активным компонентом. В таблетках активный компонент смешан с носителем, обладающим необходимыми связывающими свойствами, в соответствующих пропорциях и спрессован в желаемую форму с желаемыми размерами.

Порошки и таблетки предпочтительно содержат от 5 до 70% активного соединения. Подходящими носителями являются карбонат магния, стеарат магния, тальк, сахар, лактоза, пектин, декстрин, крахмал, желатин, трагакант, метилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза натрия, легкоплавкий воск, масло какао и подобные. Термин препарат включает состав с активным соединением с инкапсулирующим материалом в качестве носителя с обеспечением капсулы, в которой активный компонент с другими носителями или без них окружен носителем, который, таким образом, находится в ассоциации с ней. Аналогичным образом включены облатки и пастилки для рассасывания. Таблетки, порошки, капсулы, пилюли, облатки и пастилки для рассасывания можно применять в качестве твердых дозированных форм, подходящих для перорального введения.

Для приготовления суппозиториев сначала расплавляют легкоплавкий воск, такой как смесь глицеридов жирных кислот или масло какао, затем в нем гомогенно диспергируют активный компонент, на- 13 027823 пример, с помощью перемешивания. Расплавленную гомогенную смесь затем выливают в формы удобного размера, дают остыть и таким образом затвердеть.

Препараты в жидкой форме включают растворы, суспензии и эмульсии, например водные или водно/пропиленгликолевые растворы. Для парентерального введения жидкие препараты можно приготовить в виде раствора в водном полиэтиленгликолевом растворе.

При необходимости или если желательным является парентеральное введение, особенно подходящими добавками для соединений согласно настоящему изобретению являются инъекционные стерильные растворы, предпочтительно масляные или водные растворы, а также суспензии, эмульсии или имплантаты, включая суппозитории. В частности, носители для парентерального введения включают водные растворы декстрозы, солевой раствор, чистую воду, этанол, глицерин, пропиленгликоль, арахисовое масло, кунжутное масло, блок-полимеры полиоксиэтилена и тому подобное. Ампулы представляют собой удобные единичные дозы. Соединения согласно настоящему изобретению также можно заключать в липосомы или вводить с помощью трансдермальных помп или пластырей. Пригодные для применения в настоящем изобретении фармацевтические добавки включают те, которые описаны, например, в Рйагшасеибса1 Зшеисек (171й Εά., Маек РиЬ. Со., ЕахЮп. РА) и \УО 96/05309, при этом оба источника включены в данное описание в качестве ссылки.

Водные растворы, пригодные для перорального применения, можно получать путем растворения активного компонента в воде и добавления при необходимости подходящих красителей, ароматизаторов, стабилизаторов и загустителей. Водные суспензии, пригодные для перорального применения, можно приготовить с помощью диспергирования тонкоизмельченного активного компонента в воде с вязким материалом, таким как природные или синтетические камеди, смолы, метилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза натрия и другими хорошо известными суспендирующими агентами.

Также включены твердые формы препаратов, которые предназначены для превращения незадолго до применения в препараты в жидкой форме для перорального введения. Такие жидкие формы включают растворы, суспензии и эмульсии. Эти препараты могут содержать, в дополнение к активному компоненту, красители, ароматизаторы, стабилизаторы, буферы, искусственные и природные подсластители, диспергирующие добавки, загустители, солюбилизирующие агенты и тому подобное.

Фармацевтический препарат предпочтительно находится в стандартной лекарственной форме. В такой форме препарат подразделен на стандартные дозы, содержащие соответствующее количество активного компонента. Стандартная лекарственная форма может представлять собой упакованный препарат, причем упаковка содержит дискретное количество препарата, как, например, упакованные таблетки, капсулы и порошки во флаконах или ампулах. Также стандартная лекарственная форма может представлять собой саму капсулу, облатку или пастилку для рассасывания или может представлять собой соответствующее количество любого из них в упакованной форме.

Количество активного компонента в препарате с единичной дозой можно варьировать или регулировать от 0,1 до 10000 мг, более обычно от 1,0 до 1000 мг, наиболее обычно от 10 до 500 мг в зависимости от конкретного применения и эффективности активного компонента. Композиция может при необходимости содержать также другие совместимые терапевтические агенты.

Некоторые соединения могут иметь ограниченную растворимость в воде и, следовательно, в композиции может потребоваться поверхностно-активное вещество или другой подходящий сорастворитель. Такие сорастворители включают: Полисорбат 20, 60 и 80; Плюроник Р-68, Р-84 и С-103; циклодекстрин; и полиоксил 35 касторового масла. Такие сорастворители, как правило, используются в количестве в диапазоне от примерно 0,01 до примерно 2 мас.%.

Вязкость больше, чем в простых водных растворах, может быть желательна для уменьшения непостоянства в извлечении составов из упаковки, для уменьшения физического разделения компонентов суспензии или эмульсии состава и/или для улучшения состава иным образом. Такие агенты для увеличения вязкости включают, например, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, метилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, гидроксиэтилцеллюлозу, карбоксиметилцеллюлозу, гидроксипропилцеллюлозу, хондроитин сульфат и его соли, гиалуроновую кислоту и ее соли, а также их комбинации. Такие агенты, как правило, используются в количестве в диапазоне от примерно 0,01 до примерно 2 мас.%.

Композиции согласно настоящему изобретению могут дополнительно содержать компоненты для обеспечения замедленного высвобождения и/или удобства. Такие компоненты включают анионные мукомиметические полимеры с высокой молекулярной массой, желирующие полисахариды и субстраты тонкоизмельченного носителя лекарственного средства. Эти компоненты описаны более подробно в патентах США №4911920; 5403841; 5212162 и 4861760. Все содержание этих патентов включено в настоящий документ в качестве ссылки во всей их полноте для всех целей.

Эффективные дозы.

Фармацевтические композиции, описанные в настоящем изобретении, включают композиции, в которых активный ингредиент содержится в терапевтически эффективном количестве, т.е. в количестве, эффективном для достижения поставленной цели. Фактическое количество, эффективное для конкретного применения, будет зависеть, в числе прочего, от состояния, подлежащего лечению. Например, при введении в способах лечения рака такие композиции будут содержать количество активного ингредиен- 14 027823 та, эффективное для достижения желаемого результата (например, уменьшение количества раковых клеток у субъекта).

Дозировка и частота (одна или несколько доз) введения соединения могут варьироваться в зависимости от целого ряда факторов, включая путь введения; размера, возраста, пола, состояния здоровья, массы тела, индекса массы тела и питания реципиента; характера и степени выраженности симптомов заболевания, подлежащего лечению (например, заболевание, восприимчивое к ингибированию В1к); наличия других заболеваний или других проблем, связанных со здоровьем; вида сопутствующего лечения; и осложнений от любого заболевания или схемы лечения. Другие терапевтические схемы или агенты могут быть использованы в сочетании со способами и соединениями согласно изобретению.

Для любого соединения, описанного в настоящем документе, терапевтически эффективное количество можно первоначально определить, исходя из анализов клеточной культуры. Целевыми концентрациями будут являться такие концентрации активного(их) соединения(ий), которые способны уменьшить ферментативную активность киназы, измеренную, например, с использованием описанных способов.

Терапевтически эффективные количества для применения у людей можно определить с использованием животных моделей. Например, для человека можно составить дозу с достижением концентрации, которая, как было установлено, была эффективна у животных. Дозировку у людей можно регулировать путем контроля над ингибированием киназы и регулированием дозы в большую или в меньшую сторону, как описано выше. В некоторых вариантах реализации изобретения введенная доза находится в диапазоне от примерно 10 до примерно 1000 мг в сутки, один, два или более чем два раза в сутки.

Дозы могут меняться в зависимости от требований пациента и применяемого соединения. Доза, вводимая пациенту, в контексте настоящего изобретения должна быть достаточной для того, чтобы вызвать полезный терапевтический ответ у пациента с течением времени. Размер дозы также определяют наличием, природой и степенью каких-либо побочных эффектов. Как правило, лечение начинают с небольших доз, которые меньше, чем оптимальная доза соединения. После этого дозу понемногу увеличивают до тех пор, пока не будет достигнут оптимальный эффект при конкретных обстоятельствах. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения диапазон дозировки составляет от 0,001 до 10% мас./об. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения диапазон дозировки составляет от 0,1 до 5% мас./об.

Величину дозы интервалы можно регулировать индивидуально для обеспечения уровней вводимого соединения, эффективных для конкретных клинических показаний для лечения. Это обеспечит лечебную схему, соразмерную с тяжестью состояния болезни человека.

Для более полного понимания описанного в настоящем изобретении приведены следующие примеры. Следует понимать, что эти примеры приведены только в иллюстративных целях и не должны быть истолкованы как ограничивающие настоящее изобретение каким-либо образом.

Пояснительный пример

Как показано в приведенных ниже примерах, в некоторых примерах реализации настоящего изобретения соединения получают в соответствии со следующими общими способами. Следует иметь в виду, что, хотя общие способы отражают синтез некоторых соединений согласно настоящему изобретению, следующие общие способы, а также другие способы, известные среднему специалисту в данной области техники, можно применять ко всем соединениям и подклассам и видам каждого из этих соединений, как описано в настоящем документе.

Пример 1. Синтез (3'К,4'§)-1'-трет-бутилового 4'-этилового эфира 2-оксо-[1,3'-бипиперидин]-1',4'дикарбоновой кислоты

- 15 027823

Получение промежуточного продукта - этилового эфира 3-оксопиперидин-4-карбоновой кислоты. Этиловый эфир 1-бензил-3-оксопиперидин-4-карбоновой кислоты 1 (15,0 г, 50,5 ммоль, 1,0 экв) гидрировали в присутствии катализатора 10% Рб/С (1,5 г) в атмосфере Н₂ при атмосферном давлении в МеОН (250 мл) в течение 16 ч. Катализатор отфильтровывали и растворитель концентрировали в вакууме с получением этилового эфира 3-оксопиперидин-4-карбоновой кислоты 2 в виде светло-желтого твердого вещества (10,2 г, выход: 98,0%). ΕδΙ-Μδ (М+Н)+: 172,1. ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСо-б..) δ: 4,23 (ς, 2Н), 3,75 (8, 2Н), 3,37 (8, 2Н), 3,20-3,16 (т, 2Н), 2,44 (I, 1Н), 1,25 (I, 3Н).

Получение 1-трет-бутилового 4-этилового эфира 3-оксопиперидин-1,4-дикарбоновой кислоты. Этиловый эфир 3-оксопиперидин-4-карбоновой кислоты 2 (10,2 г, 60,0 ммоль, 1,0 экв) растворяли в сухом МеОН (200 мл) и добавляли Ε(₃Ν (33,1 мл, 240 ммоль, 4,0 экв). Смесь перемешивали в течение 1 ч, добавляли Вос₂О (19,5 г, 90,0 ммоль, 1,5 экв) и перемешивали в течение 16 ч. Растворитель концентрировали в вакууме и неочищенный продукт очищали с помощью колоночной хроматографии (силикагель, петролейный эфир/ЕЮЛс = 9:1) с получением 1-трет-бутилового 4-этилового эфира 3-оксопиперидин-1,4дикарбоновой кислоты 3 в виде масла светло-желтого цвета (11,5 г, выход: 86%). ΕδΙ-Μδ (М+Н-56)+: 216,0. ¹Н ЯМР (400 МГц, С1)С1д δ: 4,24 (ς, 2Н), 4,03 (8, 2Н), 3,49 ((, 2Н), 2,33 ((, 2Н), 1,47 (8, 9Н), 1,31 ((, 3Н).

Получение ^)-1-трет-бутилового 4-этилового эфира 3-((1-фенилэтил)-амино)-5,6-дигидропиридин1,4-(2Н)-дикарбоновой кислоты. В сухой колбе, снабженной ловушкой Дина-Старка и обратным холодильником, растворяли 1-трет-бутиловый 4-этиловый эфир 3-оксопиперидин-1,4-дикарбоновой кислоты 3 (10,0 г, 37,0 ммоль, 1,1 экв) в толуоле (100 мл). Добавляли δ-(-)-α-метилбензиламин (4,9 г, 40,5 ммоль, 1,1 экв) и моногидрат р-толуолсульфоновой кислоты (0,7 г, 3,7 ммоль, 0,1 экв) и смесь кипятили с обратным холодильником в течение 16 ч. Неочищенную реакционную смесь концентрировали в вакууме с получением ^)-1-трет-бутилового 4-этилового эфира 3-((1-фенилэтил)амино)-5,6-дигидропиридин1,4(2Н)-дикарбоновой кислоты 4 (12,0 г, вых.: 88%) в виде густого оранжевого масла, которое применяли на следующем этапе без дополнительной очистки, ΕδΙ-Μδ (М+Н)+: 375,2.

Получение 1-трет-бутилового 4-этилового эфира 3-((^)1-фенилэтил)амино)-5,6-дигидропиридин1,4(2Н)-дикарбоновой кислоты. 1-трет-Бутиловый 4-этиловый эфир 3-((^)-1-фенилэтил)амино)пиперидин-1,4-дикарбоновой кислоты 4 (11,2 г, 30,0 ммоль, 1,0 экв) растворяли в смеси СНзСN (60 мл) и уксусной кислоты (60 мл) и охлаждали до 0°С. Медленно добавляли №ВН(ОАс)₃ (19,0 г, 90,0 ммоль, 3,0 экв) и реакционную смесь перемешивали в течение 2 ч при 0°С. Насыщенный раствор №НСО₃ медленно добавляли для нейтрализации раствора для поддержания температуры внутри колбы ниже 10°С. Смесь экстрагировали Ε(ОАс (50 мл х 3). Объединенный органический слой сушили (Ν₂δΟ₄), фильтровали, концентрировали в вакууме и затем очищали с помощью колоночной хроматографии (силикагель, петролейный эфир/Ε(ΟАс=9:1) с получением 4-этилового эфира 3-((^)1-фенилэтил)амино)-5,6-дигидропиридин1,4(2Н)-дикарбоновой кислоты 5 (8,2 г, вых.: 73%) в виде светло-желтого масла. ΕδΙ-Μδ (М+Н)+: 377,2. ¹Н ЯМР (400 МГц, СП₃О0) δ: 7,31-7,22 (т, 5Н), 4,20 (ц, 2Н), 4,11-3,86 (т, 3Н), 3,15 (8, 1Н), 3,00-2,90 (т, 2Н), 2,64 (б, 2Н), 1,87-1,85 (т, 1Н), 1,68 (8, 1Н), 1,50-1,25 (т, 15Н).

- 16 027823

Получение транс-1-трет-бутилового 4-этилового эфира 3-(((3)-1-фенилэтил)амино)пиперидин-1,4дикарбоновой кислоты. 1-трет-Бутиловый 4-этиловый эфир 3-(((3)-1-фенилэтил)амино)пиперидин-1,4дикарбоновой кислоты 5 (8,0 г, 21,2 ммоль, 1,0 экв) растворяли в сухом ΕΐΟΗ (20 мл) в атмосфере Ν₂. В отдельную высушенную пламенем колбу Шленка помещали безводный ΕΐΟΗ (150 мл) и порционно в атмосфере Ν₂ добавляли натрий (0,450 г, 63,6 ммоль, 3,0 экв). Смесь выдерживали в атмосфере Ν₂ и вентилировали для удаления выделяющегося газа до тех пор, весь натрий не растворился. Прозрачный раствор 1-трет-бутилового 4-этилового эфира 3-(((3)-1-фенилэтил)амино)пиперидин-1,4-дикарбоновой кислоты затем переносили в раствор ΝαΟΕί и смесь перемешивали при 80°С в атмосфере Ν₂ в течение 16 ч. Растворитель удаляли в вакууме, добавляли солевой раствор (150 мл) и смесь доводили до рН 10 с помощью 1Ν ΝαΟΗ и экстрагировали ЕЮАс (100 мл х 3). Объединенные органические слои сушили (№₂8О₄) и концентрировали в вакууме. Остаток очищали с помощью колоночной хроматографии (силикагель, петролейный эфир/ЕЮАс=5:1) с получением (транс)-1-трет-бутилового 4-этилового эфира 3(((3)-1-фенилэтил)амино)пиперидин-1,4-дикарбоновой кислоты 6 в виде светло-желтого твердого вещества (3,7 г, выход: 46%). Ε3Ι-Μ3 (М+Н)+: 377,2.

Получение транс-1-трет-бутилового 4-этилового эфира 3-аминопиперидин-1,4-дикарбоновой кислоты. транс-1-трет-Бутиловый 4-этиловый эфир 3-(((3)-1-фенилэтил)амино)пиперидин-1,4дикарбоновой кислоты 6 (3,7 г, 8,3 ммоль, 1,0 экв) гидрировали в присутствии 10% Ρά/С (0,37 г) в качестве катализатора в атмосфере Н₂ при давлении, равном 30 атмосферам, в МеОН (100 мл) при 50°С в течение 8 ч. Катализатор отфильтровывали, растворитель удаляли в вакууме с получением (транс)-1-третбутилового 4-этилового эфира 3-аминопиперидин-1,4-дикарбоновой кислоты 7 в виде светло-желтого масла (2,5 г, выход: 92%). Ε3Ι-Μ3 (М+Н)+: 273,1. 'ΐ I ЯМР (400 МГц, ОСТ) δ: 4,18 (ц, 2Η), 3,97-3,94 (т, 2Η), 3,37 (5, 1Η), 3,07-3,02 (т, 1Η), 2,89-2,85 (т, 1Η), 2,60-2,55 (т, 1Η), 2,01-1,91 (т, 1Η), 1,70-1,54 (т, 3Η), 1,46 (5, 9Η), 1,28 (ΐ, 3Η).

Синтез транс-1-трет-бутилового 4-этилового эфира 3-(5-бромпентанамидо)пиперидин-1,4дикарбоновой кислоты. К раствору транс-1-трет-бутилового 4-этилового эфира 3-аминопиперидин-1,4дикарбоновой кислоты 7 (2,5 г, 9,2 ммоль, 1,0 экв) в СЩС1₂ (50 мл), добавляли при комнатной температуре Εΐ3Ν (2,5 мл, 18,4 ммоль, 2,0 экв). После реакции раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 10 мин, добавляли хлорид 5-бромвалерила (1,9 г, 9,6 ммоль, 1,05 экв). Реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. Смесь гасили Η₂Ο (20 мл) и экстрагировали СЩС1₂ (50 мл х 3). Собирали органический слой, концентрировали в вакууме, остаток очищали с помощью колоночной хроматографии (силикагель, петролейный эфир/ΕΐΟАс=1:1) с получением (транс)-1трет-бутилового 4-этилового эфира 3-(5-бромпентанамидо)пиперидин-1,4-дикарбоновой кислоты 8 в виде желтого масла (3,2 г, выход: 80%). Ε3Ι-Μ3 (М+Н-56)+: 379,0. 'ΐ I ЯМР (400 МГц, ОСТ) δ: 5,99 (ά, 1Η), 4,39-4,38 (т, 1Η), 4,15 (ц, 2Η), 3,79-3,74 (т, 1Η), 3,66-3,60 (т, 1Η), 3,41 (ΐ, 2Η), 3,30-3,26 (т, 1Η), 3,21-3,14 (т, 1Η), 2,78-2,74 (т, 1Η), 2,19 (ΐ, 2Η), 1,99-1,85 (т, 3Η), 1,80-1,72 (т, 3Η), 1,45 (5, 9Η), 1,27 (ΐ, 3Η).

Синтез транс-1'-трет-бутилового 4'-этилового эфира 2-оксо-[1,3'-бипиперидин]-1',4'-дикарбоновой кислоты. К раствору транс-1-трет-бутилового 4-этилового эфира 3-(5-бромпентанамидо)пиперидин-1,4дикарбоновой кислоты 8 (3,0 г, 6,9 ммоль, 1,0 экв) в ТГФ (20 мл) осторожно добавляли ΝαΗ (276 мг, 6,9 ммоль, 1,0 экв) небольшими порциями при 0°С. Реакционный раствор перемешивали при кипячении с обратным холодильником в течение 4 ч. Смесь гасили Η₂Ο (20 мл) и экстрагировали ΕΐΟАс (30 мл х 3). Органический слой собирали, сушили (№₂3Ο₄) и концентрировали в вакууме. Остаток очищали с помощью колоночной хроматографии (силикагель, петролейный эфирЖЮАсШД) с получением (транс)-1'трет-бутилового 4'-этилового эфира 2-оксо-[1,3'-бипиперидин]-1',4'-дикарбоновой кислоты 9 виде светложелтого масла (2,1 г, выход: 88%). Ε3Ι-Μ3 (М+Н-56)+: 299,1. '11 ЯМР (400 МГц, ОСТ) δ: 4,10 (ц, 4Η), 3,38-3,19 (т, 4Η), 2,70-2,61 (т, 1Η), 2,36-2,31 (т, 2Н), 1,95-1,92 (т, 1Η), 1,75-1,71 (т, 6Н), 1,46 (5, 9Η), 1,23 (ΐ, 3Η).

Пример 2. Получение транс-1'-(6-амино-5-фторпиримидин-4-ил)-3-((3-хлор-5-(трифторметил)фенил)амино)-2-оксо-[1,3'-бипиперидин]-4'-карбоксамида

- 17 027823

Синтез транс-1'-трет-бутилового 4'-этилового эфира 3-йод-2-оксо-[1,3'-бипиперидин]-1',4'дикарбоксилата. К раствору транс-1'-трет-бутилового 4'-этилового эфира 2-оксо-[1,3'-бипиперидин]-1',4'дикарбоновой кислоты 8 (141 мг, 2,58 ммоль, 1,0 экв) в сухом толуоле (10 мл) при 0°С последовательно добавляли ΤΜΕΌΑ (0,89 г, 7,7 ммоль, 3,0 экв) и ТМ8С1 (0,6 мг, 1,0 ммоль, 2,0 экв) в атмосфере Ν₂. Через 0,5 ч осторожно небольшими порциями добавляли 1₂ (0,98 г, 3,87 ммоль, 1,5 экв). Реакционный раствор перемешивали при температуре от 0°С до комнатной температуры в течение 16 ч. Смесь разбавляли с помощью ЕЮАс (100 мл), промывали насыщенным Να₂8₂Ο₃ (20 мл х 2) и насыщенным раствором соли (20 мл), сушили (Να₂8Θ₄), фильтровали и концентрировали в вакууме. Неочищенный продукт 9 (2,2 г, вых.: 81%) применяли непосредственно на следующем этапе без дополнительной очистки. Ε8Ι-Μ8 (М+Н-56)+: 424,9?Н ЯМР (400 МГц, СПС1₃) δ: 4,78-4,73 (т, 1Н), 4,19-4,04 (т, 4Н), 3,55-3,30 (т, 4Н), 3,24-3,16 (т, 2Н), 2,73-2,60 (т, 1Н), 2,22-2,14 (т, 2Н), 1,96-1,78 (т, 2Н), 1,70-1,60 (т, 1Н), 1,44(8, 9Н), 1,25 (1, 1= 7,2 Гц, 3Н).

Синтез транс-1'-трет-бутилового 4'-этилового эфира 3-((3-хлор-5-(трифторметил)фенил)амино)-2оксо-[1,3'-бипиперидин]-1',4'-дикарбоновой кислоты. Раствор 1,0М бис(триметилдисилил)амида лития в ТГФ (13 мл, 12 ммоль, 2,0 экв) добавляли через капельную воронку при 10-15°С в раствор 3-хлор-5(трифторметил)анилина (15 г, 78 ммоль, 1,2 экв) в ТГФ (13 мл). Смесь оставляли перемешиваться при комнатной температуре в течение 20 мин и добавляли раствор неочищенного транс-1'-трет-бутил-4'-этил3-йод-2-оксо-[1,3'-бипиперидин]-1',4'-дикарбоксилата 9 (3,7 г, 65 ммоль, 1,0 экв) в ТГФ (13 мл) через капельную воронку при 10-15°С в течение 30 мин. После добавления реакционную смесь оставляли перемешиваться при температуре в течение 30 мин. По окончании реакции реакционную смесь охлаждали до 5°С и медленно гасили водой (10 мл), поддерживая температуру ниже 20°С. После гашения реакционную смесь экстрагировали ЕЮАс (2х30 мл). Объединенные органические слои промывали насыщенным солевым раствором (30 мл), сушили (Να₂8Θ₄), фильтровали и концентрировали в вакууме. Полученный неочищенный продукт очищали на силикагеле, элюируя с градиентом от 10 до 75% ЕЮАс в гептанах с получением желаемого продукта 10. Ε8Ι-Μ8 (М+Н-56)+: 463,1. 'И ЯМР (400 МГц, СОС1₃) δ: 6,92 (δ, 1Н), 6,71-6,69 (т, 2Н), 4,17-4,06 (т, 4Н), 3,78-3,68 (т, 2Н), 3,46-3,36 (т, 3Н), 3,23-3,07 (т, 2Н), 2,73-2,65 (т, 1Н), 2,44-2,37 (т, 1Н), 2,03-1,85 (т, 3Н), 1,71-1,61 (т, 2Н), 1,46 (δ, 9Н), 1,27-1,19 (т, 3Н).

Синтез транс-1'-(трет-бутоксикарбонил)-3-((3-хлор-5-(трифторметил)фенил)амино)-2-оксо-[1,3'бипиперидин]-4'-карбоновой кислоты. К раствору транс-1'-трет-бутилового 4'-этилового эфира 3-((3хлор-5-(трифторметил)фенил)амино)-2-оксо-[1,3'-бипиперидин]-1',4'-дикарбоновой кислоты 10 (180 мг, 0,33 ммоль, 1,0 экв) в ЕЮН (5 мл) добавляли ΝαΟΙ I (40 мг, 0,99 ммоль, 3,0 экв) и раствор перемешивали при 80°С в течение 1 ч. Растворитель концентрировали в вакууме, остаток суспендировали в воде (10 мл) и доводили до рН 6 с помощью НС1 (4Ν). Осадок фильтровали с получением (транс)-1'-(третбутоксикарбонил)-3-((3-хлор-5-(трифторметил)фенил)амино)-2-оксо-[1,3'-бипиперидин]-4'-карбоновой кислоты 11 (150 мг, выход: 82%) в виде желтого твердого вещества, которое применяли на следующем этапе без дополнительной очистки. Ε8Ι-Μ8 (М+Н-85)+: 463,1. *Н ЯМР (400 МГц, СОС1₃) δ: 6,85 (δ, 1Н), 6,82 (δ, 1Н), 6,78 (δ, 1Н), 4,12-3,96 (т, 4Н), 3,53-3,37 (т, 2Н), 3,11-3,04 (т, 2Н), 2,75-2,67 (т, 1Н), 2,24- 18 027823

2,18 (т, 1Н), 1,98-1,89 (т, 3Н), 1,71-1,58 (т, 2Н), 1,44 (з, 9Н).

Синтез транс-трет-бутилового эфира 4'-карбамоил-3-((3-хлор-5-(трифторметил)фенил)амино)-2оксо-[1,3'-бипиперидин]-1'-карбоновой кислоты. К раствору транс 1'-(трет-бутоксикарбонил)-3-((3-хлор5-(трифторметил)фенил)амино)-2-оксо-[1,3'-бипиперидин]-4'-карбоновой кислоты 11 (70 мг, 0,14 ммоль, 1,0 экв) в ДМФА (2 мл) добавляли ХН₄С1 (22 мг, 0,41 ммоль, 3,0 экв), НВТи (103 мг, 0,270 ммоль, 2,0 экв) и ΏΙΡΕΆ (52 мг, 0,41 ммоль, 3,0 экв). Реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 16 ч, разбавляли ЕЮАс (10 мл) и промывали водой (5 мл) и насыщенным солевым раствором (5 мл). Органическую фазу отделяли и концентрировали в вакууме с получением неочищенного масла, которое очищали с помощью препаративной ВЭЖХ (МеОН/Н₂О 0,05% ТРА в качестве подвижной фазы) с получением соединения (транс)-трет-бутилового эфира 4'-карбамоил-3-((3-хлор-5(трифторметил)фенил)амино)-2-оксо-[1,3'-бипиперидин]-1'-карбоновой кислоты 12 (60 мг, выход: 86%) в виде светлого твердого вещества. Ε8Ι-Μ8 (М+Н-56)+: 463,1. ¹Н ЯМР (400 МГц, СП₃ОЭ) δ: 6,87-6,86 (т, 1Н), 6,84-6,83 (т, 1Н), 6,80 (з, 1Н), 4,11-4,03 (т, 3Н), 3,53-3,35 (т, 2Н), 3,20-3,08 (т, 2Н), 2,77-2,74 (т, 1Н), 2,25-2,18 (т, 1Н), 1,99-1,88 (т, 3Н), 1,70-1,60 (т, 2Н), 1,46 (з, 9Н).

Синтез транс-3-((3-хлор-5-(трифторметил)фенил)амино)-2-оксо-[1,3'-бипиперидин]-4'-карбоксамида. К раствору транс-трет-бутилового эфира 4'-карбамоил-3-((3-хлор-5-(трифторметил)фенил)амино)2-оксо-[1,3'-бипиперидин]-1'-карбоновой кислоты 12 (60 мг, 0,11 ммоль) в СН₂С1₂ (1,0 мл) добавляли СР₃СО₂Н (1,0 мл) при комнатной температуре. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч, концентрировали в вакууме с получением желаемого продукта 13 (43 мг, 90%), который применяли непосредственно на следующем этапе без дополнительной очистки. Ε8Ι-Μ8 (М+Н) : 419,0.

Синтез транс-1'-(6-амино-5-фторпиримидин-4-ил)-3-((3-хлор-5-(трифторметил)фенил)амино)-2оксо-[1,3'-бипиперидин]-4'-карбоксамида. К раствору транс-3-((3-хлор-5-(трифторметил)фенил)амино)-2оксо-[1,3'-бипиперидин]-4'-карбоксамида 13 (42 мг, 0,10 ммоль, 1,0 экв) в 1-бутаноле (2 мл), 6-хлор-5фторпиримидин-4-амин (18 мг, 0,12 ммоль, 1,2 экв) добавляли ΏΙΡΕΑ (26 мг, 0,20 ммоль, 2,0 экв). Реакционный раствор перемешивали при 120°С в течение 16 ч. Смесь разбавляли ΕίОΑс (20 мл), промывали Н₂О (10 мл) и солевым раствором (10 мл), сушили (Ха₂8О₄), фильтровали и концентрировали в вакууме. Неочищенный продукт очищали с помощью препаративной ВЭЖХ (МеОН/Н₂О с 0,05% ТРА в качестве подвижной фазы) с получением соединения (транс)-1'-(6-амино-5-фторпиримидин-4-ил)-3-((3-хлор-5(трифторметил)фенил)амино)-2-оксо-[1,3'-бипиперидин]-4'-карбоксамид 14 (44 мг, выход: 83%) в виде желтого твердого вещества. Ε8Ι-Μ8 (М+Н)⁺: 530,0. ВЭЖХ: (214 нм: 100%, 254 нм: 100%). ¹Н ЯМР (400 МГц, СО₃ОО) δ: 7,97 (з, 1Н), 6,84 (з, 1Н), 6,81 (з, 1Н), 6,76 (з, 1Н), 4,58-4.52 (т, 2Н), 4,09-4,03 (т, 1Н), 3,52-3,35 (т, 3Н), 3,29-3,27 (т, 4Н), 3,12-3,05 (т, 1Н), 2,24-2,17 (т, 1Н), 2,02-1,91 (т, 3Н), 1,80-1,63 (т, 2Н).

(3К,3'К,4'8)-1'-(6-Амино-5-фторпиримидин-4-ил)-3-((3-хлор-5-(трифторметил)фенил)амино)-2-оксо[1,3'-бипиперидин]-4'-карбоксамид. Смесь четырех диастереомеров соединения 14 разделяли на три пика с помощью 8РС (сверхкритическая флюидная хроматография) (ΙΑ (2x15 см), 30% ΕίОН (0,1% ^ΕΑ)/СО₂, 100 бар, 60 мл/мин) и указанное в названии соединение соответствовало пику 3. ЖХ-МС (Адйеп! 460, 254 нм): Ε8 (+) МС т/е = 530,1 (М+1) при 1,20 мин. ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-ф,) δ: 7,77 (ά, 1= 2,01 Гц, 1Н), 7,38 (шир. з., 1Н), 6,94 (з, 2Н), 6,75 - 6,87 (т, 2Н), 6,41 - 6,66 (т, 3Н), 4,29 (шир. з., 1Н), 4,23 (ά, I = 13,05 Гц, 1Н), 3,96 - 4,18 (т, 2Н), 3,44 (ΐά, I = 6,15, 12,30 Гц, 1Н), 3,24 - 3,33 (т, 1Н), 3,10 (шир. з., 1Н), 2,88 (шир. з., 1Н), 2,82 (ΐ, I = 12,30 Гц, 1Н), 2,13 (ςά, I = 5,94, 12,30 Гц, 1Н), 1,74 - 1,93 (т, 3Н), 1,58 - 1,74 (т, 1Н), 1,41 - 1,58 (т, 1Н).

(38,3'К,4'8)-1'-(6-Амино-5-фторпиримидин-4-ил)-3-((3-хлор-5-(трифторметил)фенил)амино)-2-оксо[1,3'-бипиперидин]-4'-карбоксамид. Смесь четырех диастереомеров соединения 14 разделяли на три пика

- 19 027823 с помощью 8РС (ΙΑ (2 х 15 см), 30% ΕΐΟΗ (0,1% ПЕЛ)/СО₂, 100 бар, 60 мл/мин) и указанное в названии соединение соответствовало пику 2. ЖХ-МС (Αβίΐβπΐ 460, 254 нм): Е8 (+) МС т/е = 530,1 (М+1) при 1,19 мин. Ίί ЯМР (400 МГц, ДМСО-6₆) δ: 7,77 (6, 1= 1,76 Гц, 1Η), 7,39 шир. з., 1Η), 6,98 (з, 1Η), 6,96 (з, 1Η), 6,72 - 6,88 (т, 2Н), 6,57 (з, 2Н), 6,54 (6, I =7,78 Гц, 1Η), 4,05 - 4,33 (т, 4н), 3,37 (ΐ, I = 6,27 Гц, 2Н), 3,11 (шир. з., 1Η), 2,94 (шир. з., 1Η), 2,82 (ΐ, I = 12,30 Гц, 1Η), 2,02 - 2,16 (т, 1Η), 1,75 - 1,92 (т, 3Η), 1,57 - 1,74 (т, 1Η), 1,36 - 1,54 (т, 1Η).

(38,3'8,4'К)-1'-(6-Амино-5-фторпиримидин-4-ил)-3-((3-хлор-5-(трифторметил)фенил)амино)-2-оксо[1,3'-бипиперидин]-4'-карбоксамид. Смесь четырех диастереомеров соединения 14 разделяли на три пика с помощью 8РС (ΙΑ (2 х 15 см), 30% ΕΐΟΗ (0,1% ОЕЛ)/СО₂, 100 бар, 60 мл/мин). Пик 1 из 3 в дальнейшем очищали с помощью 8РС (ΑΌ-Η (2х15 см), 30% нзо-ΡτΟΗ (0,1% ОЕЛ)/СО₂, 100 бар, 60 мл/мин) с получением указанного в заголовке соединения. ЖХ-МС (Αβί^πΐ 460, 254 нм): Е8 (+) МС т/е = 530,1 (М+1) при 1,20 мин. 'Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-6₆) δ: 7,77 (б, I = 1,76 Гц, 1Η), 7,38 (шир. з., 1Η), 6,94 (з, 2Н), 6,83 (з, 1Η), 6,80 (з, 1Η), 6,42 - 6,66 (т, 3Η), 4,18 - 4,47 (т, 2Н), 3,95 - 4,18 (т, 2Н), 3,39 - 3,52 (т, 1Η), 3,24 - 3,31 (т, 1Η), 3,10 (шир. з., 1Η), 2,88 (шир. з., 1Η), 2,82 (ΐ, I = 12,30 Гц, 1Η), 2,13 (ς6, I =5,91, 12,39 Гц, 1Η), 1,73 - 1,92 (т, 3Η), 1,58 - 1,73 (т, 1Η), 1,42 -1,58 (т, 1Η).

(3К,3'8,4'К)-1'-(6-Амино-5-фторпиримидин-4-ил)-3-((3-хлор-5-(трифторметил)фенил)амино)-2-оксо[1,3'-бнпнпернднн]-4'-карбоксамнд. Смесь четырех диастереомеров соединения 14 разделяли на три пика с помощью 8РС (ΙΑ (2х 15 см), 30% ΕΐΟΗ (0,1% ОЕД)^/СО2, 100 бар, 60 мл/мин). Пик 1 из 3 дополнительно очищали с помощью 8РС (ΑΌ-Η (2х 15 см), 30% изо-Ρ^ΟΗ (0,1% ^ΕΑ)/СΟ₂, 100 бар, 60 мл/мин) с получением указанного в заголовке соединения. ЖХ-МС (Αβί^πΐ 460, 254 нм): Е8 (+) МС т/е = 530,1 (М+1) при 1,20 мин. 'Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-6₆) δ: 7,77 (6, I = 1,76 Гц, 1Η), 7,39 шир. з., 1Η), 6,98 (з, 1Η), 6,96 (з, 1Η), 6,73 - 6,88 (т, 2Н), 6,57 (з, 2Н), 6,54 (6, I = 7,78 Гц, 1Η), 4,05 -4,35 (т, 4Н), 3,37 (ΐ, I = 6,15 Гц, 2Н), 3,12 (шир. з., 1Η), 2,94 (шир. з., 1Η), 2,82 (ΐ, I = 12,30 Гц, 1Η), 2,09 (зх!, I = 5,80 Гц, 1Η), 1,74 1,92 (т, 3Η), 1,56 - 1,73 (т, 1Η), 1,36 - 1,52 (т, 1Η).

Пример 3. Альтернативный синтез (3К,3'К,4'8)-1'-(6-амино-5-фторпиримидин-4-ил)-3-((3-хлор-5(трифторметил)фенил)амино)-2-оксо-[1,3'-бипиперидин]-4'-карбоксамида.

В дополнение к способам, описанным в примере 2, (3К,3'К,4'8)-1'-(6-амино-5-фторпиримидин-4ил)-3-((3-хлор-5-(трифторметил)фенил)амино)-2-оксо-[1,3'-бипиперидин]-4'-карбоксамид (соединение I1) был также синтезирован согласно схеме 6.

- 20 027823

1-трет-Бутиловый 4-этиловый эфир 3-оксопиперидин-1,4-дикарбоновой кислоты 3-2. К раствору 3-1 (5,0 кг, 19,1 моль, 1,0 экв) в ΕίΘΗ (50 л) в атмосфере Ν₂ добавляли (Вос)₂О (4,2 кг, 19,1 моль, 1,0 экв), Εί₃Ν (1,9 кг, 19,1 моль, 1,0 экв) и 10% Гд(ОН)₂/С (250 г, 10% мас./мас.). После вакуумирования и заполнения водородом три раза смесь перемешивали при 1 атм водорода при 50°С в течение 15 ч. ЖХ-МС показала полное расходование соединения 3-1. После того как смесь охладили до комнатной температуры, катализатор отфильтровывали через слой целита и промывали ЕЮН (2,5 л). Фильтрат концентрировали в вакууме с получением неочищенного соединения 3-2 (5,2 кг) в виде масла, которое использовали на следующем этапе без дополнительной очистки.

(3)-1-трет-Бутиловый 4-этиловый эфир 3-((1-фенилэтил)амино)-5,6-дигидропиридин-1,4(2Н)дикарбоновой кислоты (3-3). В 100 л реактор, снабженный насадкой Дина-Старка, загружали толуол (20 л), неочищенное соединение 3-2 (5,2 кг, 19,1 моль, 1,0 экв), промытое толуолом (30 л), рТЗЛ (329 г, 0,2 моль, 0,01 экв) и 3-(-)-а-метилбензиламин (0,95 кг, 16,2 моль, 0,85 экв). Смесь кипятили с обратным холодильником в атмосфере азота и удаляли воду с помощью насадки Дина-Старка. Через 18 ч ЖХ-МС показала полное расходование 3-2. Затем смесь охлаждали до температуры окружающей среды. Нерастворимые вещества удаляли с помощью фильтрования и фильтрат концентрировали в вакууме досуха с получением неочищенного 3-3 в виде густого масла. Полученный неочищенный продукт использовали на следующем этапе без дополнительной очистки. В этой реакции образуется 3-10% побочного амидного

- 21 027823 продукта, его структуру предварительно определяли на основании данных ЖХ-МС.

(3К)-1-трет-Бутиловый 4-этиловый эфир 3-(((8)-1-фенилэтил)амино)пиперидин-1,4-дикарбоновой кислоты (3-4). В 100 л реактор, загруженный ЫаВН₄ (1,16 кг, 30,5 моль, 2,0 экв) и безводным ТГФ (60 л), в атмосфере азота медленно добавляли ТГЛ (10,5 кг, 92 моль, 6,0 экв) в течение 30 мин при поддержании температуры на уровне 0~5°С. Затем смесь охлаждали до -45°С. В разделительном реакторе неочищенный продукт 3-3 растворяли в безводном ацетонитриле (30 л), который медленно добавляли к указанному раствору ЫаВН₄/ТГЛ при поддержании внутренней температуры между -45—30°С. Смесь перемешивали при -45°С в течение 1 ч, после чего ВЭЖХ показала полное расходование соединения 3-3. Смесь медленно разбавляли ледяной водой (50 кг) и затем смесь нагревали до 10°С. Продукт экстрагировали ЕЮАс (2x40 л) и объединенные органические слои промывали насыщенным раствором ЫаНСО₃(20 л). рН водного слоя составлял ~8. Органические слои сушили (Ыа₂8О₄) и концентрировали в вакууме почти досуха с получением остатка, который далее подвергали азеотропной перегонке с МеОН (10 л х 3) с удалением избытка ЕЮАс. В результате получали 10 л раствора неочищенного 3-4 в МеОН, который использовали непосредственно на последующем этапе без дополнительной очистки. Е81-М8 (М+Н-1)+: 377,2. ¹Н ЯМР (400 МГц, СЭ₃ОЭ) δ: 7,31-7,22 (т, 5Н), 4,20 (ц, 2Н), 4,11-3,86 (т, 3Н), 3,15 (а, 1Н), 3,002,90 (т, 2Н), 2,64 (ά, 2Н), 1,87- 1,85 (т, 1Н), 1,68 (а, 1Н), 1,50-1,25 (т, 15Н).

(3К)-1-(трет-Бутоксикарбонил)-3-(((8)-1-фенилэтил)амино)пиперидин-4-карбоновая кислота (3-5). 100 л реактор загружали смесью ТГФ/МеОН (1:1, 80 л), добавляли раствор ЕЮН-Н₂О(2,5 кг, 60 моль, 4,0 экв) в воде (10 л) и раствор неочищенного 3-4 в МеОН (10 л) из этапа, указанного выше. Полученную смесь перемешивали при 22°С в течение 18 ч, после чего ЖХ/МС показала полное расходование исходного материала 3-4. Раствор разбавляли МТВЕ (40 л) и перемешивали в течение 20 мин. Водный слой отделяли, охлаждали до 0°С и нейтрализовали раствором 3Ν НС1 до рН в диапазоне 7-8, при поддержании внутренней температуры ниже 10°С. Раствор промывали ДХМ (5x30 л) или до тех пор, пока ЖХ/МС не показала отсутствие в водном слое оставшегося продукта 3-5. Объединенные органические слои концентрировали в вакууме до высыхания, суспендировали в ЕЮАс и петролейном эфире (2:1, 10 л) и перемешивали в течение 2 ч, твердые вещества отфильтровывали, промывали петролейным эфиром (5 л) и сушили в вакууме при 50°С в течение 18 ч с получением продукта (3,5 кг, выход 53%) в виде твердого вещества с чистотой 95%. Соединение 3-5 представляет собой смесь ~30:70 транс/цис при С-4 и ~93:7 К.8 при С-3. Общий средний выход 3-1 составил 43-55%. Е81-М8 (М+Н-1)+: 349,2. ¹Н ЯМР (400 МГц, СО3ОО) δ: 8,22-8,06 (т, 5Н) 4,11 (т, 1Н), 3,86-3,82 (т, 1Н), 3,59-3,56 (т, 1Н), 2,79-2,65 (т, 1Н), 3,22- 2,62 (т, 2Н), 2,06 - 2,16 (т, 12Н).

(3К)-1 -(6-амино-5-фторпиримидин-4-ил)-3-(((8)-1 -фенилэтил)амино)пиперидин-4-карбоновая кислота (3-7). В 50 л реактор загружали 10 л 2Ν НС1 и 3-5 (850 г, 2,44 моль, 1,0 экв). Смесь нагревали до 30°С и перемешивали в течение 2 ч, после чего ВЭЖХ показала полное расходование исходного 3-5. Раствор разбавляли МТВЕ (4 л) и перемешивали в течение 20 мин, слои разделяли и в водный слой добавляли твердый К₂СО₃ (660 г) в течение 1 ч до рН~7. Добавляли дополнительное количество К₂СО₃ (660 г, 4,8 моль, 2,0 экв), а затем добавляли 6-хлор-5-фторпиримидин-4-иламин (360 г, 2,44 моль 1,0 экв) и 1,4-диоксан (5 л). Смесь нагревали до слабого кипения с обратным холодильником при 100°С и перемешивали при этой температуре в течение 16 ч. ВЭЖХ показала, что осталось <2% соединения 3-6. Смесь промывали ДХМ (2x5 л), промывочные органические растворы выбрасывали. Водный слой обра- 22 027823 батывали активированным углем (425 г) при перемешивании суспензии в течение 1 ч при 30°С с последующим фильтрованием через диатомит. Эту обработку активированным углем повторяли. Полученный водный раствор нейтрализовали до значения рН~7 с помощью концентрированной НС1 и перемешивали при 22°С в течение 3 ч, полученную суспензию фильтровали и влажный осадок промывали смесью 1,4диоксан/вода (1:1, 1,2 л), сушили в вакууме при 50°С в течение 18 ч до значения КР~0,5%. Продукт 3-7 получали в виде бледно-белого твердого вещества (690 г, выход 81%) с чистотой 98,6%. Продукт содержал смесь 1:9 цис/транс изомеров при положениях С3 и С4. Ε5Ι-Μ5 (М+Н-1)+: 460,2. ¹Н ЯМР (400 МГц, СПэОП) δ: 8,49 (ά, I = 2,01 Гц, 1Н), 8,21-8,14 (т, 5Н) 4,94-4,90 (т, 1Н), 4,63 (ά, I = 11,55 Гц, 1Н), 4,42 (т, 1Н), 4,03 (т, 2Н), 3,59-3,72 (т, 3Н), 2,84-2,93 (т, 1Н), 2,20-2,31 (т, 1Н), 2,15 (ά, I = 6,78 Гц, 3Н).

(3К)-3-Амино-1-(6-амино-5-фторпиримидин-4-ил)пиперидин-4-карбоновая кислота (3-8). В 10 л реактор в атмосфере Ν₂ загружали изо-БгОН (3,5 л), Н₂О (3,5 л), 3-7 (1,0 экв, 0,97 моль, 350 г), моногидрат фторида калия (290 г, 3,0 экв, 3,0 моль) и 35 г 20%-ного Ρά(ОΗ)₂/С (10% об./мас.). После трехкратного разряжения/заполнения водородом смесь нагревали до 40-50°С и энергично перемешивали при этой температуре при давлении водорода 1 атмосфера. Через 18 ч ЖХ/МС показала, что осталось <1% исходного материала 3-7. Смесь продували Ν₂ в течение 20 мин, охлаждали до 22°С и фильтровали. И влажный осадок, и фильтрат содержали продукт и были обработаны отдельно.

Фильтрат концентрировали в вакууме при 50°С до объема ~200 мл. После охлаждения до 20°С и перемешивания при этой температуре в течение 2 ч получали суспензию и твердое вещество отфильтровывали, промывали водой (400 мл) и сушили в вакууме при 50°С с получением продукта 3-8 (65 г). Влажный осадок после фильтрации реакционной смеси перемешивали в 1Ν НС1 (1 л) в течение 2 ч для растворения продукта, затем оставшийся твердый катализатор удаляли фильтрованием. Кислый фильтрат нейтрализовали твердым НОН до значения рН~7 с осаждением продукта 3-8. Продукт промывали водой (200 мл) и сушили в вакууме при температуре 50°С с получением 120 г продукта. В общей сложности получали 185 г продукта с чистотой 98,7% и выходом 75% по данным Н ЯМР. Все маточные растворы объединяли и концентрировали до объема ~400 мл с получением суспензии, фильтровали, промывали водой и сушили с получением дополнительно 64 г твердого вещества с ~ чистотой 50%. ¹Н ЯМР (400 МГц, О₂О): δ 7,77 (з, 1Н) 4,12 (ά, I = 14,05 Гц, 1Н), 4,01 (ά, I = 13,05 Гц, 1Н), 3,26 (ά, I = 13,80 Гц, 1), 2,99 - 3,10 (т, 1Н), 2,64 - 2,73 (т, 1Н), 1,98 (άά, I = 3,39, 14,18 Гц, 1Н), 1,74 - 1,87 (т, 1Н).

((3К,3'К)-1'-(трет-Бутоксикарбонил)-3-((3-хлор-5-(трифторметил)фенил)амино)-2-оксо-[1,3'бипиперидин]-4'-карбоновая кислота (3-10). К раствору 3-8 (440 г, 1,9 моль, 1,0 экв) в ДМСО (10 л) последовательно добавляли 3-8А (640 г, 1,9 моль, 1,0 экв), триацетоксиборгидрид натрия (5ТЛВ, 402,0 г, 3,8 моль, 2 экв.) и Εί₃Ν (190 г, 1,9 моль, 1,0 экв). Смесь нагревали до 50°С и перемешивали в течение 3 ч, пока ВЭЖХ не показала полное превращение в промежуточный продукт 3-9.

Раствор разбавляли МеОН (182 г, 5,7 моль, 3,0 экв) с гашением избытка 5ТЛВ и реакционную смесь нагревали до 70~80°С. Через 16 ч ВЭЖХ показала, что образовалось 22% продукта 3-10 и остался 61% промежуточного продукта 3-9, и хиральная ВЭЖХ показала ~3% эпимера лактама. Смесь выдерживали при температуре 70-80°С в течение еще 24 ч с получением 50% 3-10, 35% 3-9 и 7% эпимера лактама. Через еще 40 ч перемешивания образовалось 80% 3-10, осталось 4% 3-9, и содержание эпимера лактама увеличилось до 14%. Смесь охлаждали до 22°С и гасили раствором 2Ν КН₄С1 (5 л) с получением густой смеси. После 30 мин перемешивания смесь фильтровали и влажный осадок промывали водой (3 л), сушили в вакууме при температуре 55°С до значения КР<0,1. Неочищенный продукт 3-10 получали в виде коричневого твердого вещества (850 г, 97,7%); хиральная ВЭЖХ показала 12,5% эпимера лактама. Этот продукт использовали непосредственно без дополнительной очистки

- 23 027823

((3К,3'К,4'8)-1'-(6-Амино-5-фторпиримидин-4-ил)-3-((3-хлор-5-(трифторметил)фенил)амино)-2оксо-[1,3'-бипиперидин]-4'-карбоновая кислота (3-10-транс). В 10 л реактор в атмосфере Ν₂ загружали 310 (850 г, 1,9 моль, 1,0 экв) в ДМФА (4,25 л, 5 об./мас.) с получением прозрачного раствора, добавляли 4диметиламинопиридин (ЭМЛР 116 г, 0,95 моль, 0,5 экв) и 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (ЕЭС1, 36,5 г, 0,19 моль, 0,1 экв). После того как смесь перемешивали при температуре от 15 до 22°С в течение приблизительно 1 ч, дополнительно добавляли ЕЭС1 (36,5 г, 0,19 моль, 0,1 экв) и перемешивали в течение еще 1 ч. ВЭЖХ показала смесь транс/цис 69:1. Продукт 3-10транс не выделяли и превращали в соединение 1-1 в том же реакторе. 'Н ЯМР (300 МГц, ДМСО ά₆): δ 1,47-1,55 (т, 1Н), 1,63-1,68 (т, 1Н), 1,81-1,87 (т, 1Н), 1,90-1,97 (т, 1Н), 2,93-3,19 (т, 1Н), 3,16-3,23 (т, 1Н), 3,33-3,45 (т, 2Н) 4,07-4,33 (т, 3Н), 6,80 (т, 1Н), 6,94-6,98 (т, 1Н), 7,10-7,16 (т, 2Н), 7,91 (з, 1Н).

((3К,3'К,4'8)-1'-(6-Амино-5-фторпиримидин-4-ил)-3-((3-хлор-5-(трифторметил)фенил)амино)-2оксо-[1,3'-бипиперидин]-4'-карбоксамид (1-1). К вышеуказанной реакционной смеси при 22°С загружали О-(7-азабензотриазол-1-ил)-Х^Х,№-тетраметилурония гексафторфосфат (НАТИ, 600 г, 1,9 моль, 1,0 экв), Ν,Ν-диизопропилэтиламин (ΏΙΡΕΑ, 1,0 кг, 9,5 моль, 5,0 экв) и, наконец, Ν4₄Ο (260 г, 5,7 моль, 3,0 экв). Полученную смесь перемешивали при температуре 15°С в течение 1 ч, ВЭЖХ показала полное расходование продукта 3-10-транс, смесь выливали в солевой раствор (25 л) и экстрагировали этилацетатом ЕЮАс (2x2 л). Объединенные органические слои промывали солевым раствором (2x2 л) и концентрировали в вакууме при температуре ниже 45°С до высыхания с получением неочищенного Ι-1, которое очищали с помощью хроматографии со смесью ЕЮАс/петролейный эфир/МеОН (от 1:1:0 до 50:50:10) с получением трех фракций, которые содержали 316 г: химическая чистота 98,8% и эпимер 10,8%, 160 г: химическая чистота 82,3% и эпимер 17,5%, и 180 г: чистота 61% и эпимер 11,3%, соответственно. Две первые вышеуказанные фракции объединяли и далее очищали с помощью препаративной ВЭЖХ с получением 200 г продукта с чистотой >99% и <1% эпимера. 'Н ЯМР (400 Мгц, ДМСО ά₆): δ 1,48-1,53 (т, 1Н), 1,66-1,69 (т, 1Н), 1,77-1,79 (т, 3Н), 2,11-2,16 (т, 1Н), 2,80-2,88 (т, 2Н), 3,11 (з, 1Н), 3,42-3,48 (т, 1Н), 4,0-4,25 (т, 4Н), 6,58 (з, 3Н), 6,80-6,85 (ά, 1 = 10,2, 2Н), 6,95 (з, 2Н), 7,40 (з, 1Н), 7,77 (з, 1Н).

Пример 4. Альтернативные синтезы (3К,3'К,4'8)-1'-(6-амино-5-фторпиримидин-4-ил)-3-((3-хлор-5(трифторметил)фенил)амино)-2-оксо-[1,3'-бипиперидин] -4'-карбоксамида.

В дополнение к способам, описанным в примерах 2 и 3, (3К,3'К,4'8)-1'-(6-амино-5-фторпиримидин4-ил)-3-((3-хлор-5-(трифторметил)фенил)амино)-2-оксо-[1,3'-бипиперидин]-4'-карбоксамид (соединение Ι-1) также синтезировали согласно схеме 6.

- 24 027823

(3К)-3-Амино-1-(трет-бутоксикарбонил)пиперидин-4-карбоновая кислота (4-Б-6). В 10 л реактор в атмосфере азота загружали соединение 4-5 (100 г, 0,287 моль), МеОН (6 л, 60 об./мас.) и 10 г 20% РС(ОН)₂/С. Реактор три раза вакуумировали/заполняли водородом и смесь нагревали до 40-50°С при перемешивании при давлении водорода 3 МПа в течение 40 ч. ЖХ/МС показала полное расходование исходного материала 4-5. Смесь охлаждали до 22°С и фильтровали, фильтрат концентрировали в вакууме досуха с получением твердого продукта. Этот неочищенный продукт суспендировали в ЕЮН (500 мл) при 22°С в течение 2 ч, фильтровали и сушили в вакууме при 50°С с получением 85% выхода продукта 4-Б-6 (60 г, 0,245 моль) в виде твердого вещества белого цвета.

(3К)-1-(трет-Бутоксикарбонил)-3-(((К)-4-((3-хлор-5-(трифторметил)фенил)амино)-5-этокси-5оксопентил)амино)пиперидин-4-карбоновая кислота (4-Б-8). К раствору 4-Б-6 (48,4 г, 0,197 моль) в ДМСО (450 мл) добавляли Εί₃Ν (20,2 г, 0,199 моль, 1 экв), 3-8А (67,4 г, 0,199 моль, 1 экв.) и триацетоксиборгидрид натрия (8ТАВ, 84,8 г, 0,40 моль, 2,0 экв.). Смесь нагревали до 50°С в течение 30 мин и перемешивали при этой температуре в течение 3 ч. ЖХ/МС показала расходование большей части исходного вещества 4-Б-6 и образование 4-Б-8.

Реакцию гасили добавлением 1лО11 (35 мл) и перемешивали при 50°С в течение 30 мин. Смесь нагревали при 75-85°С в течение 3 дней. Смесь охлаждали до 18°С и медленно переносили в воду (6 л) при интенсивном перемешивании с получением суспензии. После 2 ч твердые вещества фильтровали и промывали водой (3x3 л), сушили в вакууме при 60-70°С в течение 24 ч с получением 4-Б-9 (114 г) в виде коричневого твердого вещества. Твердое вещество использовали непосредственно на последующем этапе.

- 25 027823

((3К,3'К,4'8)-1'-(трет-Бутоксикарбонил)-3-((3-хлор-5-(трифторметил)фенил)-амино)-2-оксо-[1,3'бипиперидин]-4'-карбоновая кислота (4-Б-9-транс). К раствору неочищенного 4-Б-9 (100 г) в ДМФА (500 мл) добавляли 4-диметиламинопиридин (11 г, 0,09 моль, 0,5 экв) и перемешивали при 20°С в течение 10 мин. Добавляли 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (7,0 г, 0,036 моль, 0,2 экв) и реакционную смесь перемешивали при 20°С в течение 3 ч. ВЭЖХ показала смесь цис/транс в соотношении 57:43, и дополнительно был добавлен ЕЭАС (3,5 г, 0,018 моль, 0,1 экв). После 5 ч ВЭЖХ показала полное превращение в 4-Б-9-транс. Смесь медленно переносили в воду (2,25 л), смесь экстрагировали ЕЮАс (2x500 мл), органические слои промывали солевым раствором (500 мл) и водой (500 мл), концентрировали в вакууме досуха с получением неочищенного 4-Б-9-транс (100 г) в виде твердого вещества коричневого цвета. Неочищенный продукт растворяли в ЕЮАс (135 мл) при 60°С и затем охлаждали до 20°С в течение 1 ч с последующим добавлением 50 мл петролейного эфира. Смесь выдерживали в течение 2 ч. Твердые вещества отфильтровывали и промывали 3:1 ЕЮАс/петролейный эфир (50 мл), сушили в вакууме при 50°С в течение 16 ч с получением 4-Б-9-транс (23 г, выход 22% с чистотой 99%). ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-б₆) δ 6,94 (δ, 2Н), 6,81 (δ, 1Н), 6,54-6,61 (т, 1Н), 3,99-4,08 (т, 1Н), 3, 42 - 3,38 (т, 2Н), 2,072,16 (т, 1Н), 1,74 - 1,92 (т, 3Н), 1,39 (δ, 9Н).

Гидрохлорид (3К,3'К,4'5)-3-((3-хлор-5-(трифторметил)фенил)амино)-2-оксо-[1,3'-бипиперидин]-4'карбоновой кислоты (4-Б-10 транс). К раствору 0,5Ν НС1 в ЕЮАс (76 мл) добавляли 4-Б-9 транс (20 г, 38 ммоль) и нагревали до 20°С в течение 18 ч с получением суспензии. Твердое вещество отфильтровывали, промывали ЕЮАс (5 мл) и сушили в вакууме при 45°С в течение 18 ч с получением 4-Б-10 в виде соли НС1 (17 г, выход 97%).

(3К,3'К,4'8)-1'-(6-Амино-5-фторпиримидин-4-ил)-3-((3-хлор-5-(трифторметил)-фенил)амино)-2оксо-[1,3'-бипиперидин]-4'-карбоновая кислота (3-10-транс). Раствор 4-Б-10 (2,0 г, 4,38 моль), 6-хлор-5фтор-пиримидин-4-иламин (711 мг, 4,82 ммоль, 1,1 экв), Э1РЕА (1,52 мл, 8,77 моль, 2 экв.) в 40 мл пВиОН нагревали до 130-140°С в течение 72 ч. Смесь охлаждали до 22°С и концентрировали в вакууме с получением остатка, который очищали с помощью колонки с получением 3-10-транс (1,1 г, 47%). Также наблюдали относительно небольшое количество эпимера (38,3'К,4'8)-1'-(6-амино-5-фторпиримидин-4ил)-3-((3-хлор-5-(трифторметил)фенил)амино)-2-оксо-[1,3'-бипиперидин]-4'-карбоновой кислоты.

Промежуточный 3-10-транс может быть преобразован в соединение 1-1 с помощью процедуры, описанной выше.

Соединение 1-1 также было синтезировано в соответствии со схемой 8.

- 26 027823

Синтез (К)-трет-бутилового эфира 1-(3-хлор-5-(трифторметил)фенил)-5-оксопирролидин-2карбоновой кислоты 4-е синтезировали способом, подобным тому, который описан в публикации ΡΗίίίίρδ Ό.Ρ.; ΖΙπι Х.-Р.; Ьаи Т.Ь.; Уапд К.; 1ли Н. Те1гайебгоп ВеИегБ, 2009, 50, 7293, где (З)-метиловый эфир 5оксопирролидин-2-карбоновой кислоты и 1-хлор-4-йодбензол использовали вместо (К)-трет-бутилового эфира 5-оксопирролидин-2-карбоновой кислоты и 1-хлор-3-йод-5-(трифторметил)бензола.

(2К)-трет-Бутиловый эфир 1 -(3-хлор-5-(трифторметил)фенил)-5-гидроксипирролидин-2-карбоновой кислоты. Безводный раствор 4-е (11 г, 30 ммоль) в Ме-ТГФ (100 мл) охлаждали до -35°С в атмосфере азота. Раствор РМАВЬ-ГI (5,9 г, 42 ммоль) в толуоле (42 мл) добавляли по каплям при поддержании температуры при -35°С. За ходом реакции следили с помощью ВЭЖХ и после завершения добавляли 1Ν раствор сегнетовой соли (100 мл) при поддержании температуры реакционной смеси ниже 0°С. Органическую фазу отделяли, промывали 1Ν сегнетовой солью (50 млх3) и разделяли, разбавляли Εΐ3Ν (4 мл), сушили (Να₂8Ο₄) и концентрировали в вакууме с получением 4-Г (8,3 г) в виде масла.

(3К)-1-(6-Амино-5-фторпиримидин-4-ил)-3-(((К)-5-(трет-бутокси)-4-((3-хлор-5-(трифторметил)фенил)амино)-5-оксопентил)амино)пиперидин-4-карбоновая кислота.

Раствор 4-Г (37,4 г, 0,146 ммоль) в ДМФА (700 мл) обрабатывали с помощью 3-8 (40,2 г, 0,11 ммоль), Εΐ₃Ν (10,1 г, 0,1 ммоль) 8ТАВ (42,4 г, 0,2 ммоль) и смесь нагревали до 55°С в течение 5 ч. Реакционную смесь разбавляли водой (2,5 л), экстрагировали ЕЮАс (500 мл х 3), органические фазы объединяли и промывали насыщенным солевым раствором, разделяли, сушили (Να₂8Ο₄) и концентрировали в вакууме с получением 4-а (40,2 г) в виде твердого вещества, которое использовали без дополнительной очистки.

(3К)-1-(6-Амино-5-фторпиримидин-4-ил)-3-(((К)-4-карбокси-4-((3-хлор-5-(трифторметил)фенил) амино)бутил)амино)пиперидин-4-карбоновая кислота. В раствор 5Ν НС1 (250 мл) добавляли ΐ-бутиловый эфир 4-а и суспензию нагревали до 55°С в течение 5 ч, в это время гидролиз контролировали с помощью ВЭЖХ. После полного образования продукта воду удаляли в вакууме с получением твердого вещества 4Ь, которое сушили под вакуумом и использовали без дополнительной очистки.

(3К,3'К)-1'-(6-Амино-5-фторпиримидин-4-ил)-3-((3-хлор-5-(трифторметил)фенил)амино)-2-оксо[1,3'-бипиперидин]-4'-карбоновая кислота. К раствору кислоты 4-Ь (55 г, 0,1 моль) в ДМФА (500 мл) добавляли ОША (64,5 г, 0,5 моль), СТЯ (32,5 г, 0,2 моль) при 0°С. Раствор перемешивали в течение 1,5 ч при 0°С, разбавляли водой (3 л), доводили рН до 3 с помощью НС1 и экстрагировали ЕЮАс (2л х 3). Органические фазы объединяли, сушили (Να₂8Ο₄) и концентрировали в вакууме с получением 4-с (48 г).

Остальные этапы для получения соединения Р1 завершали с помощью процедур, описанных выше.

Пример 5. Синтез транс-трет-бутилового эфира 3-((3-хлор-5-(трифторметил)фенил)амино)-4'(метилкарбамоил)-2-оксо-[ 1,3'-бипиперидин] -1 '-карбоновой кислоты

- 27 027823

Синтез транс-трет-бутилового эфира 3-((3-хлор-5-(трифторметил)фенил)амино)-4'-(метилкарбамоил)-2-оксо-[1,3'-бипиперидин]-1'-карбоновой кислоты.

Использовали процедуру, аналогичную вышеуказанной для синтеза (3'К,4'8)-1'-(6-амино-5фторпиримидин-4-ил)-3-((3-хлор-5-(трифторметил)фенил)амино)-2-оксо-[1,3'-бипиперидин]-4'-карбоксамида 14 с получением неочищенного вещества, которое очищали с помощью препаративной ВЭЖХ (МеОН/Н₂О 0,05% ΝΗ₃Η₂Ο в качестве подвижной фазы) с получением указанного в заголовке соединения (360 мг, выход: 67%) в виде желтого твердого вещества. Е51-М5 (М+Н)+: 544,18. ВЭЖХ: (214 нм: 100,0%, 254 нм: 100,0%). ¹Н ЯМР (400 МГц, СП₃ОП) (смесь изомеров) δ: 7,69-7,68 (т, 1Н), 6,78 (з, 1Н), 6,75 (з, 1Н), 6,71 (з, 1Н), 4,39-4,36 (т, 2Н), 4,09-4,03 (т, 1Н), 3,53-3,31 (т, 3Н), 3,20-3,10 (т, 1н), 2,992,92 (т, 1Н), 2,55 (з, 3Н), 2,28-2,19 (т, 1Н), 1,96-1,77 (т, 5Н), 1,68-1,58 (т, 1Н).

(3К,3'К,4'5)-Г-(6-Амино-5-фторпиримидин-4-ил)-3-((3-хлор-5-(трифторметил)фенил)амино)^метил-2-оксо-[1,3'-бипиперидин]-4'-карбоксамид. Смесь четырех диастереомеров разделяли на два пика с помощью 5РС (ΆΏ-Η (2x15 см), 50% 1:1 ИПС:метанол (0,1% ИЕЛ)/СО₂, 100 бар, 60 мл/мин). Пик 2 дополнительно очищали путем разделения 5РС (ΆΏ-Η (2x15 см), 30% изо-РгОН (0,15% ИЕЛ)/СО₂, 100 бар, 60 мл/мин) с получением указанного в заголовке соединения. ЖХ-МС (Лдйеп! 460, 254 нм): Е5 (+) МС т/е = 544,1 (М+1) при 1,24 мин ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСОЖ δ: 7,72 - 7,85 (т, 2Н), 6,92 (з, 2Н), 6,81 (з, 1Н), 6,43 - 6,64 (т, 3Н), 4,34 (шир. з., 1Н), 4,23 (б, 1 = 13,05 Гц, 1Н), 3,93 - 4,19 (т, 2Н), 3,37 - 3,49 (т, 1Н), 3,22 - 3,30 (т, 1Н), 3,13 (шир. з., 1Н), 2,84 (ί, 1 = 12,05 Гц, 2Н), 2,57 (б, 1 =4,52 Гц, 3Н), 2,13 (цб, 1 = 6,05, 12,45 Гц, 1Н), 1,60- 1,89 (т, 4Н), 1,40- 1,58 (т, 1Н).

(35,3'К,4'5)-Г-(6-Амино-5-фторпиримидин-4-ил)-3-((3-хлор-5-(трифторметил)фенил)амино)^метил-2-оксо-[1,3'-бипиперидин]-4'-карбоксамид. Смесь четырех диастереомеров разделяли на два пика с помощью 5РС (ΆΏ-Η (2x15 см), 50% 1:1 ИПС:метанол (0,1% ИЕЛ)/СО₂, 100 бар, 60 мл/мин). Пик 2 в дальнейшем очищали путем разделения 5РС (ΆΏ-Η (2x15 см), 30% изо-РгОН (0,15% ИЕЛ)/СО₂, 100 бар, 60 мл/мин) с получением указанного в заголовке соединения. ЖХ-МС (Лдйеп! 460, 254 нм): Е5 (+) МС т/е = 544,1 (М+1) при 1,24 мин. ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-бв) δ: 7,83 (ς, 1 = 4,60 Гц, 1Н), 7,77 (б, 1 = 1,76 Гц, 1Н), 6,97 (б, 1 = 6,78 Гц, 2Н), 6,81 (з, 1Н), 6,58 (з, 2Н), 6,53 (б, 1 = 7,78 Гц, 1Н), 4,23 (б, 1 = 13,05 Гц, 2Н), 3,90-4,19 (т, 2Н), 3,14 (шир. з., 1Н), 2,92 (шир. з., 1Н), 2,74-2,90 (т, 1Н), 2,55 (б, 1 = 4,52 Гц, 3Н), 2,00-2,18 (т, 1Н), 1,74-1,89 (т, 3Н), 1,56-1,74 (т, 1Н), 1,34-1,50 (т, 1Н).

- 28 027823

(38,3'8,4'К)-1'-(6-Амино-5-фторпиримидин-4-ил)-3-((3-хлор-5-(трифторметил)фенил)амино)-Кметил-2-оксо-[1,3'-бипиперидин]-4'-карбоксамид. Смесь четырех диастереомеров разделяли на два пика с помощью 8РС (ΑΏ-Η (2х15 см), 50% 1:1 ИПС:метанол (0,1% ^ΕΑ)/СΟ₂, 100 бар, 60 мл/мин). Пик 1 в дальнейшем очищали с помощью 8РС (ΑΏ-Η (2х15 см), 30% МеОН (0,15% ^ΕΑ)/СΟ₂, 100 бар, 60 мл/мин) с получением указанного в заголовке соединения. ЖХ-МС (Αβϊ^ηΐ 460, 254 нм): Е8 (+) МС т/е = 544,1 (М+1) при 1,23 мин. ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-6₆) δ: 7,72-7,85 (т, 2Н), 6,92 (з, 2Η), 6,81 (з, 1Η), 6,57 (з, 2Н), 6,54 (6, I = 7,53 Гц, 1Η), 4,23 (6, I = 13,30 Гц, 1Η), 4,15 (66, I = 3,26, 12,30 Гц, 1Η), 4,08 (ΐ6, I = 7,06, 10,48 Гц, 1Η), 3,36-3,47 (т, 1Η), 3,23-3,30 (т, 1Η), 3,13 (шир. з., 1Η), 2,84 (ΐ, I = 11,80 Гц, 2Н), 2,57 (6, I = 4,52 Гц, 3Η), 2,13 (ς6, I = 6,17, 12,61 Гц, 1Η), 1,62-1,91 (т, 4Н), 1,42-1,57 (т, 1Η).

транс-1'-(6-Амино-5-фторпиримидин-4-ил)-3-((3-хлор-5-(трифторметил)фенил)амино)-К-метил-2оксо-[1,3'-бипиперидин]-4'-карбоксамид. Смесь четырех диастереомеров разделяли на два пика с помощью 8РС (ΑΏ-Η (2х15 см), 50% 1:1 ИПС:метанол (0,1% ^ΕΑ)/СΟ₂, 100 бар, 60 мл/мин). Пик 1 в дальнейшем очищали с помощью 8РС (ΑΏ-Η (2х 15 см), 30% МеОН (0,15% ^ΕΑ)/СΟ₂, 100 бар, 60 мл/мин) с получением вышеуказанного в заголовке соединения. ЖХ-МС (Α§ΐ^ηΐ 460, 254 нм): Е8 (+) МС м/е=544,1 (М+1) при 1,23 мин. ЖХМС (Α^ΐ^ηΐ 460, 254 им): Е8 (+) МС т/е = 544,1 (М+1) при 1,24 мин ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-6₆) δ: 7,80-7,89 (т, 1Η), 7,72-7,80 (т, 1Η), 6,97 (6, I = 6,53 Гц, 2Н), 6,81 (з, 1Η), 6,58 (з, 2Н), 6,53 (6, I = 7,78 Гц, 1Η), 4,23 (6, I = 13,05 Гц, 2Н), 3,89-4,19 (т, 2Н), 3,13 (шир. з., 1Η), 2,74-3,02 (т, I = 12,42, 12,42 Гц, 2Н), 2,55 (6, I = 4,52 Гц, 3Η), 2,08 (ς6, I = 5,97, 12,20 Гц, 1Η), 1,81 (ΐ6, I = 6,24, 12,36 Гц, 3Η), 1,56-1,74 (т, 1Η), 1,33-1,51 (т, 1Н).

Пример 6

Синтез транс-1 '-(6-амино-5-фторпиримидин-4-ил)-3-((3-хлор-5-(трифторметил)фенил)амино)-К,Кдиметил-2-оксо-[1,3'-бипиперидин]-4'-карбоксамид.

Использовали процедуру, аналогичную вышеуказанной для синтеза (3'К,4'8)-1'-(6-амино-5фторпиримидин-4-ил)-3-((3-хлор-5-(трифторметил)фенил)амино)-2-оксо-[1,3'-бипиперидин]-4'карбоксамида 14 с получением неочищенного материала, который очищали с помощью препаративной ВЭЖХ (МеО11/Ι ГО с 0,05% ΤΡΑ в качестве подвижной фазы) с получением указанного в заголовке соединения (45 мг, выход: 90%) в виде желтого твердого вещества. Е81-М8 (М+Н)+: 558,0. ВЭЖХ: (214 нм: 98,2%, 254 нм: 100,0%). ¹Н ЯМР (400 МГц, СП₃ОП) 5: 7,77 (з, 1Η), 6,92-6,89 (т, 1Η), 6,83-6,81 (т, 1Η), 6,79 (з, 1Η), 4,38-4,38 (т, 2Η), 4,05-4,00 (т, 2Η), 3,55-3,53 (т, 1Η), 3,45-3,40 (т, 2Η), 3,15-2,89 (т, 7Η), 2,21-2,16 (т, 1Η), 1,90-1,86 (т, 3Η), 1,66-1,56 (^2Η).

- 29 027823

(3К,3'К,4'5)-Г-(6-Амино-5-фторпиримидин-4-ил)-3-((3-хлор-5-(трифторметил)фенил)амино)-НОТ диметил-2-оксо-[1,3'-бипиперидин]-4'-карбоксамид.

Вышеуказанное соединение получали при хиральном разделении транс-1'-(6-амино-5фторпиримидин-4-ил)-3-((3-хлор-5-(трифторметил)фенил)амино)-Ы\ОТдиметил-2-оксо[1,3'бипиперидин]-4'-карбоксамида с использованием двухэтапного хирального разделения с помощью 5РС. Сначала смесь разделяли на два пика, содержащих смесь двух диастереомеров ((3'К,4'5)-1'-(6-амино-5фторпиримидин-4-ил)-3-((3-хлор-5-(трифторметил)-фенил)амино)-Ы\ОТдиметил-2-оксо-[1,3'-бипиперидин]-4'-карбоксамида и (3'5,4'К)-Г-(6-амино-5-фторпиримидин-4-ил)-3-((3-хлор-5-(трифторметил)фенил)амино)-Ы\ОТдиметил-2-оксо-[1,3'-бипиперидин]-4'-карбоксамида) с использованием колонки СЫга1Рак 1С (2x15 см, 30% метанол с 0,1 ΏΕΑ) и затем полученную смесь, содержащую пару изомеров, дополнительно разделяли на отдельные энантиомеры в колонке СЫга1Рак ΙΑ (2x15 см, 30% метанол с 0,1% ΏΕΑ 100 бар). Ε5Ι-Μ5 (М+Н)+: 558,0 ¹Н ЯМР (400 МГц, СЭС^) δ: 7,92 (ά, 1 = 1,76 Гц, 1Н), 6,94 (δ, 1Н), 6,72 (ά, 1 = 7,78 Гц, 2Н), 5,21 (ά, 1 = 3,51 Гц, 1Н), 4,70 (δ, 2Н), 4,45 (άά, 1 = 2,76, 12,80 Гц, 2Н), 4,17-4,32 (т, 1Н), 3,64-3,80 (т, 2Н), 3,44-3,58 (δ, 3Н), 3,09 (δ, 3Н), 3,00-3,09 (т, 1Н), 2,95 (δ, 3Н), 2,40 (άά, 1 = 5,52, 13,30 Гц, 1Н), 1,63-1,99 (т, 3Н), 1,26-1,43 (т, 1Н).

(35,3'К,4'5)-Г-(6-Амино-5-фторпиримидин-4-ил)-3-((3-хлор-5-(трифторметил)фенил)амино)-НОТ диметил-2-оксо-[1,3'-бипиперидин]-4'-карбоксамид.

Вышеуказанное соединение получали при хиральном разделении транс-1'-(6-амино-5фторпиримидин-4-ил)-3-((3-хлор-5-(трифторметил)фенил)амино)-Ы\ОТдиметил-2-оксо[1,3'-бипиперидин]-4'-карбоксамида с использованием двухэтапного хирального разделения с помощью 5РС. Сначала смесь разделяли на два пика, содержащих смесь двух диастереомеров ((3'К,4'5)-1'-(6-амино-5фторпиримидин-4-ил)-3-((3-хлор-5-(трифторметил)-фенил)амино)-Ы\ОТдиметил-2-оксо-[1,3'-бипиперидин]-4'-карбоксамида и (3'5,4'К)-Г-(6-амино-5-фторпиримидин-4-ил)-3-((3-хлор-5-(трифторметил)фенил)амино)-Ы\ОТдиметил-2-оксо-[1,3'-бипиперидин]-4'-карбоксамида) с использованием колонки СЫга1Рак 1С (2x15 см, 30% метанол с 0,1 ΏΕΑ) и затем полученную смесь, содержащую пару изомеров, дополнительно разделяли на отдельные энантиомеры в колонке СЫга1Рак ΙΑ (2x15 см, 30% метанол с 0,1% ΏΕΑ 100 бар). Ε5Ι-Μ5 (М+Н)+: 558,0 ¹Н ЯМР (400 МГц, (400 МГц, СПС1₃) δ: 7,93 (ά, 1 = 1,26 Гц, 1Н),

6,93 (δ, 1Н), 6,69 (шир. δ., 2Н), 5,06 (ά, 1 = 4,27 Гц, 1Н), 4,71 (δ, 1Н), 4,45 (ά, 1 = 12,55 Гц, 2Н), 4,16-4,26 (т, 1Н), 3,66-3,81 (т, 2Н), 3,54-3,64 (т, 1Н), 3,40-3,54 (т, 2Н), 3,01-3,10 (т, 4Н), 2,95 (δ, 3Н), 2,37 (άά, 1 = 5,27, 13,05 Гц, 1Н), 1,91-2,02 (т, 2Н), 1,48-1,75 (т, 2Н).

(35,3'5,4'К)-Г-(6-Амино-5-фторпиримидин-4-ил)-3-((3-хлор-5-(трифторметил)-фенил)амино)-НОТ диметил-2-оксо-[1,3'-бипиперидин]-4'-карбоксамид. Вышеуказанное соединение получали при хиральном разделении транс-1 '-(6-амино-5 -фторпиримидин-4-ил)-3 -((3 -хлор-5-(трифторметил)фенил)амино)^ОТдиметил-2-оксо[1,3'-бипиперидин]-4'-карбоксамида с использованием двухэтапного хирального разделения с помощью 5РС. Сначала смесь разделяли на два пика, содержащих смесь двух диастереомеров ((3'К,4'5)-Г-(6-амино-5-фторпиримидин-4-ил)-3-((3-хлор-5-(трифторметил)фенил)амино)-^ОТдиметил-2оксо-[1,3'-бипиперидин]-4'-карбоксамида и (3'5,4'К)-Г-(6-амино-5-фторпиримидин-4-ил)-3-((3-хлор-5- 30 027823 (трифторметил)фенил)амино)-^№диметил-2-оксо-[1,3'-бипиперидин]-4'-карбоксамида) с использованием колонки СЫга1Рак 1С (2х 15 см, 30% метанол с 0,1 ΌΕΑ) и затем полученную смесь, содержащую пару изомеров, дополнительно разделяли на отдельные энантиомеры в колонке СЫга1Рак ΙΑ (2х15 см, 30% метанол с 0,1% ΌΕΑ 100 бар). ΕδΙ-Μδ (М+Н)+: 558,0 ¹Н ЯМР (400 МГц, СИС1₃) δ: 7,92 (б, I = 1,76 Гц, 1Н), 6,94 (8, 1Н), 6,72 (б, I = 7,78 Гц, 2Н), 5,21 (б, I = 3,51 Гц, 1Н), 4,70 (8, 2Н), 4,45 (бб, I = 2,76, 12,80 Гц, 2Н), 4,19-4,30 (т, 1Н), 3,66-3,79 (т, 2Н), 3,47-3,56 (т, 3Н), 3,09 (8, 3Н), 2,97-3,07 (т, 1Н), 2,95 (8, 3Н), 2,40 (бб, I = 5,52, 13,30 Гц, 1Н), 1,81-1,97 (т, 3Н), 1,73 (бб, I = 3,76, 12,80 Гц, 1Н).

(3К,3%4'К)-1'-(6-Амино-5-фторпиримидин-4-ил)-3-((3-хлор-5-(трифторметил)фенил)амино)-Н№ диметил-2-оксо-[1,3'-бипиперидин]-4'-карбоксамид.

Вышеуказанное соединение получали при хиральном разделении транс-1'-(6-амино-5фторпиримидин-4-ил)-3-((3-хлор-5-(трифторметил)фенил)амино)-Н№диметил-2-оксо[1,3'бипиперидин]-4'-карбоксамида с использованием двухэтапного хирального разделения с помощью δΓίλ Сначала смесь разделяли на два пика, содержащих смесь двух диастереомеров ((3'К,4^)-1'-(6-амино-5фторпиримидин-4-ил)-3-((3-хлор-5-(трифторметил)-фенил)амино)-^№диметил-2-оксо-[1,3'-бипиперидин]-4'-карбоксамида и (3%4'К)-1'-(6-амино-5-фторпиримидин-4-ил)-3-((3-хлор-5-(трифторметил)фенил)амино)^^-диметил-2-оксо-[1,3'-бипиперидин]-4'-карбоксамида) с использованием колонки СЫга1Рак ΙΟ (2х 15 см, 30% метанол с 0,1% ΌΕΑ) и затем каждую смесь, содержащую пару изомеров, дополнительно разделяли на отдельные энантиомеры в колонке СЫга1Рак ΙΑ (2х 15 см, 30% метанол с 0,1% ΌΕΑ 100 бар). ΕδΙ-Μδ (М+Н)+: 558,0 ¹Н ЯМР (400 МГц,(400 МГц, СИС1₃) δ: 7,93 (б, I = 1,26 Гц, 1Н), 6,93 (8, 1Н), 6,69 (шир. 8., 2Н), 5,06 (б, I = 4,27 Гц, 1Н), 4,71 (8, 1Н), 4,45 (б, I = 12,55 Гц, 2Н), 4,16-4,26 (т, 1Н), 3,66-3,81 (т, 2Н), 3,54-3,64 (т, 1Н), 3,40-3,54 (т, 2Н), 3,01-3,10 (т, 4Н), 2,95 (8, 3Н), 2,37 (бб, I = 5,27, 13,05 Гц, 1Н), 1,91-2,02 (т, 2Н), 1,48-1,75 (т, 2Н).

Пример 7

Синтез транс-1'-(6-амино-5-фторпиримидин-4-ил)-3-((3-хлор-5-(трифторметил)фенил)амино)-4'-(4метилпиперазин-1-карбонил)-[1,3'-бипиперидин]-2-она. Использовали процедуру, аналогичную вышеуказанной для синтеза транс-1'-(6-амино-5-фторпиримидин-4-ил)-3-((3-хлор-5-(трифторметил)фенил)амино)-2-оксо-[1,3'-бипиперидин]-4'-карбоксамида 14 с получением 23, который очищали с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой (МеОН/Н₂О с 0,05% Ν^Ή^ в качестве подвижной фазы) с получением указанного в заголовке соединения (100 мг, выход: 70%) в виде желтого твердого вещества. ΕδΙ-Μδ (М+Н)+: 613,24. ¹Н ЯМР (400 МГц, СИС1₃) δ: 7,94 (8, 1Н), 6,94 (8, 1Н), 6,73-6,67 (т, 2Н), 5,25-5,03 (т, 1Н), 4,71 (8, 2Н), 4,49-4,40 (т, 2Н), 4,35-4,16 (т, 1Н), 3,82-3,64 (т, 3Н), 3,62-3,41 (т, 6Н), 3,08-2,97 (т, 1Н), 2,52-2,34 (т, 3Н), 2,30-2,25 (т, 2Н), 2,20 (8, 3Н), 1,85-1,64 (т, 2Н), 1,72-1,64 (т, 2Н), 1,49-1,31 (т, 1Н).

- 31 027823

(3К,3'К,4'8)-1'-(6-амино-5-фторпиримидин-4-ил)-3-((3-хлор-5-(трифторметил)фенил)амино)-4'-(4метилпиперазин-1-карбонил)-[1,3'-бипиперидин]-2-он.

Вышеуказанное соединение получали при хиральном разделении транс-1'-(6-амино-5фторпиримидин-4 -ил)-3 -((3-хлор-5 -(трифторметил)фенил)амино)-N,N-диметил-2-оксо- [1,3'бипиперидин]-4'-карбоксамида 23 с использованием двухэтапного хирального разделения с помощью 8РС. Сначала смесь разделяли на два пика, содержащих смесь двух диастереомеров ((3'К,4'8)-1'-(6амино-5-фторпиримидин-4-ил)-3-((3-хлор-5-(трифторметил)-фенил)амино)-N,N-диметил-2-оксо-[1,3'бипиперидин]-4'-карбоксамида и (3'8,4'К)-1'-(6-амино-5-фторпиримидин-4-ил)-3-((3-хлор-5-(трифторметил)фенил)амино)-N,N-диметил-2-оксо-[1,3'-бипиперидин]-4'-карбоксамида) с использованием колонки СЬ1га1Рак 1С (2x15 см, 30% метанол с 0,1% ΌΕΑ) и затем полученную смесь, содержащую пару изомеров, дополнительно разделяли на отдельные энантиомеры в колонке СЫга1Рак ΙΑ (2x15 см, 30% метанол с 0,1% ΌΕΑ 100 бар). Ε8Ι-Μ8 (М+Н)+: 613,2 ¹Н ЯМР (400 МГц, С1),О1)) δ: 7,95 (§, 1Н), 6,83-6,97 (т, 3Н), 4,50-4,68 (т, 2Н), 4,28-4,40 (т, 1Н), 3,66-3,91 (т, 8Н), 3,30-3,52 (т, 4Н), 3,14 (ΐ, Д = 12,42 Гц, 2Н), 2,73 (шир. §., 2Н), 2,27 (άά, Д = 5,65, 12,93 Гц, 1Н), 1,83-2,05 (т, 2Н), 1,54-1,79 (т, 2Н).

(38,3'К,4'8)-1'-(6-Амино-5-фторпиримидин-4-ил)-3-((3-хлор-5-(трифторметил)-фенил)амино)-4'-(4метилпиперазин-1-карбонил)-[1,3'-бипиперидин]-2-он.

Вышеуказанное соединение получали при хиральном разделении транс-1'-(6-амино-5фторпиримидин-4 -ил)-3 -((3-хлор-5 -(трифторметил)фенил)амино)-N,N-диметил-2-оксо [1,3'бипиперидин]-4'-карбоксамида 23 с использованием двухэтапного хирального разделения с помощью 8РС. Сначала смесь разделяли на два пика, содержащих смесь двух диастереомеров ((3'К,4'8)-1'-(6амино-5-фторпиримидин-4-ил)-3-((3-хлор-5-(трифторметил)-фенил)амино)-N,N-диметил-2-оксо-[1,3'бипиперидин]-4'-карбоксамида и (3'8,4'К)-1'-(6-амино-5-фторпиримидин-4-ил)-3-((3-хлор-5-(трифторметил)фенил)амино)-N,N-диметил-2-оксо-[1,3'-бипиперидин]-4'-карбоксамида) с использованием колонки СЫга1Рак 1С (2x15 см, 30% метанол с 0,1% ΌΕΑ) и затем полученную смесь, содержащую пару изомеров, дополнительно разделяли на отдельные энантиомеры в колонке СЫга1Рак ΙΑ (2x15 см, 30% метанол с 0,1% ΌΕΑ 100 бар). Ε8Ι-Μ8 (М+Н)+: 613,2. ¹Н ЯМР (400 МГц, СВ3ОВ) δ: 7,91-7,99 (т, 1Н), 6,84 - 6,97 (т, 3Н), 4,57 (άά, I = 14,18, 19,70 Гц, 2Н), 4,34 (шир. §., 1Н), 3,42-3,53 (т, 1Н), 3,37 (ά, I = 1,51 Гц, 3Н), 3,05-3,19 (т, 1Н), 2,86 (ΐ, Д = 7,53 Гц, 1Н), 2,68-2,78 (т, 2Н), 2,26 (άά, I = 5,65, 12,93 Гц, 1Н), 1,822,03 (т, 3Н), 1,55 - 1,79 (т, 2Н).

(38,3'8,4'К)-1'-(6-Амино-5-фторпиримидин-4-ил)-3-((3-хлор-5-(трифторметил)фенил)амино)-4'-(4метилпиперазин-1-карбонил)-[1,3'-бипиперидин]-2-он.

Вышеуказанное соединение получали при хиральном разделении транс-1'-(6-амино-5фторпиримидин-4-ил)-3-((3-хлор-5-(трифторметил)фенил)амино)-N,N-диметил-2-оксо-[1,3'-бипиперидин]-4'-карбоксамида 23 с использованием двухэтапного хирального разделения с помощью 8РС. Сначала смесь разделяли на два пика, содержащих смесь двух диастереомеров ((3'К,4'8)-1'-(6-амино-5фторпиримидин-4-ил)-3-((3-хлор-5-(трифторметил)-фенил)амино)-N,N-диметил-2-оксо-[1,3'-бипипери- 32 027823 дин]-4'-карбоксамида и (3'8,4'К)-1'-(6-амино-5-фторпиримидин-4-ил)-3-((3-хлор-5-(трифторметил)фенил) амино)-И^-диметил-2-оксо-[1,3'-бипиперидин]-4'-карбоксамида) с использованием колонки СЫга1Рак 1С (2х 15 см, 30% метанол с 0,1% ΌΕΑ) и затем полученную смесь, содержащую пару изомеров, дополнительно разделяли на отдельные энантиомеры в колонке СЫга1Рак ΙΑ (2х15 см, 30% метанол с 0,1% ΌΕΑ 100 бар). Ε8Ι-Μ8 (М+Н)+: 613,2. ¹Н ЯМР (400 МГц, СЭ₃ОЭ) δ: 7,94 (δ, 1Н), 6,87-6,93 (т, 3Н), 4,57 (άά, I = 14,18, 19,70 Гц, 1Н), 4,34 (шир. δ., 1Н), 3,43 - 3,51 (т, 1Н), 3,36 - 3,38 (т, 2Н), 3,13 (ΐ, I = 12,30 Гц, 1Н), 2,86 (ΐ, I = 7,53 Гц, 1Н), 2,73 (шир. δ., 1Н), 2,26 (άά, I = 5,65, 12,93 Гц, 1Н), 1,96-2,03 (т, 1Н), 1,831,94 (т, 1Н), 1,51-1,75 (т, 1Н).

((3К,3'8,4'К)-1'-(6-Амино-5-фторпиримидин-4-ил)-3-((3-хлор-5-(трифторметил)фенил)амино)-4'-(4метилпиперазин-1 -карбонил)-[1,3'-бипиперидин]-2-он.

Вышеуказанное соединение получали при хиральном разделении транс-1'-(6-амино-5фторпиримидин-4-ил)-3-((3-хлор-5-(трифторметил)фенил)амино)-И,№диметил-2-оксо-[1,3'-бипиперидин]-4'-карбоксамида 23 с использованием двухэтапного хирального разделения с помощью 8РС. Сначала смесь разделяли на два пика, содержащих смесь двух диастереомеров ((3'К,4'8)-1'-(6-амино-5фторпиримидин-4-ил)-3-((3-хлор-5-(трифторметил)-фенил)амино)-И^-диметил-2-оксо-[1,3'-бипиперидин]-4'-карбоксамида и (3'8,4'К)-1'-(6-амино-5-фторпиримидин-4-ил)-3-((3-хлор-5-(трифторметил)фенил) амино)-И^-диметил-2-оксо-[1,3'-бипиперидин]-4'-карбоксамида) с использованием колонки СЫга1Рак ΙΟ (2х 15 см, 30% метанол с 0,1% ΌΕΑ) и затем каждую смесь, содержащую пару изомеров, дополнительно разделяли на отдельные энантиомеры в колонке СЫга1Рак ΙΑ (2х15 см, 30% метанол с 0,1% ΌΕΑ 100 бар). ¹Н ЯМР (400 МГц, СЭ₃ОЭ) δ: 7,96 (шир. δ., 1Н), 6,90 (шир. δ., 1Н), 6,76 (ά, I = 10,04 Гц, 2Н), 4,60 (ΐ, I = 14,06 Гц, 2Н), 4,19-4,32 (т, 1Н), 3,67-3,78 (т, 1Н), 3,43-3,54 (т, 3Н), 3,35-3,38 (т, 3Н), 3,16 (ΐ, I = 12,42 Гц, 1Н), 2,86 (ΐ, I = 7,40 Гц, 2Н), 2,79 (δ, 3Н), 2,32 (άά, I = 5,02, 12,80 Гц, 1Н), 1,89-2,07 (т, 4Н), 1,621,76 (т, 5Н).

Пример 8

Синтез 1'-(6-амино-5-фторпиримидин-4-ил)-3-((3-фтор-5-(трифторметил)фенил)амино)-2-оксо-[1,3'бипиперидин]-4'-карбоксамида. Использовали процедуру, аналогичную вышеуказанной для синтеза (3'К,4'8)-1'-(6-амино-5-фторпиримидин-4-ил)-3-((3-хлор-5-(трифторметил)фенил)амино)-2-оксо-[1,3'бипиперидин]-4'-карбоксамида 14 с получением неочищенного материала, который очищали с помощью препаративной ВЭЖХ (МеОН/Н₂О с 0,05% ИН₃-Н₂О в качестве подвижной фазы) с получением указан- 33 027823 ного в заголовке соединения (175 мг, выход: 69%) в виде желтого твердого вещества. Ε8Ι-Μ8 (М+Н)+: 514,19. ВЭЖХ: (214 нм: 96,13%, 254 нм: 96,53%). ¹Н ЯМР (400 МГц, СП₃ОП) δ: 7,79-7,78 (т, 1Н), 6,76 (з, 1Н), 6,63-6,54 (т, 2Н), 4,41-4,36 (т, 2Н), 4,08-4,06 (т, 1Н), 3,55-3,41 (т, 3Н), 3,28-3,25 (т, 1Н), 2,99-2,93 (т, 1Н), 2,28-2,21 (т, 1Н), 1,98-1,78 (т, 6Н).

(3К,3'К,4'8)-1'-(6-Амино-5-фторпиримидин-4-ил)-3-((3-фтор-5-(трифторметил)фенил)амино)-2оксо-[1,3'-бипиперидин]-4'-карбоксамид. Смесь четырех диастереомеров разделяли на три пика с помощью 8РС (сверхкритическая флюидная хроматография) СА (3x15 см), 30% ΕΐОΗ (0,1% ^ΕΑ)/СО₂, 100 бар, 70 мл/мин) и указанное соединение соответствовало пику 3. ЖХ-МС (АуПеп! 460, 254 нм): Ε8 (+) МС т/е = 514,0 (М+1) при 1,09 мин. ¹Н ЯМР (400 МГц, СПС1₃) δ: 7,91 (шир. з., 1Н), 6,66 (ά, I = 8,53 Гц, 1Н), 6,63 (з, 1Н), 6,46 (ά, I = 10,79 Гц, 1Н), 6,12 (шир. з., 1Н), 5,47 (шир. з., 1Н), 5,16 (ά, I = 3,51 Гц, 1Н), 4,91 (шир. з., 2Н), 4,35-4,54 (т, 2Н), 3,82 (ΐά, I = 5,11, 10,60 Гц, 2н), 3,51-3,60 (т, 1Н), 3,34-3,48 (т, 3н), 2,96 (ΐ, I = 12,30 Гц, 1Н), 2,35-2,47 (т, 1Н), 1,91-2,06 (т, 3Н), 1,84 (άς, I = 3,89, 12,76 Гц, 1Н), 1,48-1,62 (т, 1Н).

(38,3'К,4'8)-1'-(6-Амино-5-фторпиримидин-4-ил)-3-((3-фтор-5-(трифторметил)фенил)амино)-2-оксо[1,3'-бипиперидин]-4'-карбоксамид. Смесь четырех диастереомеров разделяли на три пика с помощью 8РС (сверхкритическая флюидная хроматография) СА (3 х 15 см), 30% ШО11 (0,1% ^ΕΑ)/СО₂, 100 бар, 70 мл/мин). Пик 2 из 3 соответствует целевому соединению. ЖХ-МС (АуПеп! 460, 254 нм): Ε8 (+) МС т/е = 514,0 (М+1) при 1,10 мин. ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-ά,,) δ: 7,77 (ά, I = 1,76 Гц, 1Н), 7,39 (з, 1Н), 6,85 (з, 1Н), 6,81 (з, 1Н), 6,74 (ά, I = 12,30 Гц, 1Н), 6,47- 6,66 (т, 4Н), 4,23 (ά, I = 12,80 Гц, 2Н), 3,90-4,18 (т, 2Н), 3,34-3,46 (т, 2Н), 3,12 (шир. з., 1Н), 2,94 (шир. з., 1Н), 2,82 (ΐ, I = 12,42 Гц, 1Н), 2,10 (ςά,Ι = 5,75, 12,11 Гц, 1Н), 1,74-1,92 (т, 3Н), 1,56-1,72 (т, 1Н), 1,37-1,52 (т, 1Н).

(3К,3'8,4'К)-1'-(6-Амино-5-фторпиримидин-4-ил)-3-((3-фтор-5-(трифторметил)фенил)амино)-2оксо-[1,3'-бипиперидин]-4'-карбоксамид. Смесь четырех диастереомеров разделяли на три пика с помощью 8РС (сверхкритическая флюидная хроматография) СА (3x15 см), 30% [ДОН (0,1% ^ΕΑ)/СО₂, 100 бар, 70 мл/мин). Пик 1 из 3 в дальнейшем очищали с помощью 8РС СА (3x15 см), 30% изо-РгОН (0,1% ^ΕΑ)/СО₂, 100 бар, 70 мл/мин) с получением указанного в заголовке соединения. ЖХ-МС (АуПеп! 460, 254 нм): Ε8 (+) МС т/е = 514,0 (М+1) при 1,10 мин. ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-ά^ δ: 7,77 (ά, 1,5 Гц, 1Н), 7,39 (з., 1Н), 6,85 (з, 1Н), 6,81 (з., 1Н), 6,74 (ά, I = 12,30 Гц, 1Н), 6,47-6,66 (т, 4Н), 4,16-4,46 (т, 2Н), 3,954,16 (т, 2Н), 3,34-3,48 (т, 2Н), 3,12 (шир. з., 1Н), 2,87-3,01 (т, 2Н), 2,82 (ΐ, I = 12,30 Гц, 1Н), 2,10 (ςά, I = 5,75, 12,11 Гц, 1Н), 1,74-1,92 (т, 3Н), 1,54-1,74 (т, 1Н), 1,35-1,52 (т, 1Н).

- 34 027823

(38,3'К,4'8)-1'-(6-Амино-5-фторпиримидин-4-ил)-3-((3-фтор-5-(трифторметил)фенил)амино)-2-оксо[1,3'-бипиперидин]-4'-карбоксамид. Смесь четырех диастереомеров разделяли на три пика с помощью 8ЕС (сверхкритическая флюидная хроматография) (1А (3x15 см), 30% ЕЮН (0,1% ИЕА)/СО₂, 100 бар, 70 мл/мин). Пик 1 из 3 в дальнейшем очищали с помощью 8ЕС (1А (3x15 см), 30% изо-РгОН (0,1% ИЕА)/СО₂, 100 бар, 70 мл/мин) с получением указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (А§йеп1 460, 254 нм): Е8 (+) МС т/е = 514,0 (М+1) при 1,10 мин. ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-0₆) δ: 7,77 (ά, ά = 1,76 Гц, 1Н), 7,38 (шир. δ., 1Н), 6,84 (δ, 2Н), 6,70 (ά, I = 12,30 Гц, 1Н), 6,47-6,65 (т, 4Н), 4,18-4,48 (т, 2Н), 3,92-4,18 (т, 2Н), 3,38-3,49 (т, 1Н), 3,20-3,30 (т, 1Н), 3,11 (шир. δ., 1Н), 2,882,99 (т, 1Н), 2,83 (1, I = 12,30 Гц, 1Н), 2,14 (ςά, I = 6,03, 12,52 Гц, 1Н), 1,74-1,92 (т, 3Н), 1,59-1,74 (т, 1Н), 1,41-1,58 (т, 1Н).

Пример 9

Синтез (3'К,4'8)-1'-(6-амино-5-фторпиримидин-4-ил)-3-((3-хлор-5-фторфенил)амино)-2-оксо-[1,3'бипиперидин]-4'-карбоксамида. Использовали процедуру, аналогичную вышеуказанной для синтеза (3'К,4'8)-1'-(6-амино-5-фторпиримидин-4-ил)-3-((3-хлор-5-(трифторметил)фенил)амино)-2-оксо-[1,3'бипиперидин]-4'-карбоксамида 14 с получением неочищенного материала, который очищали с помощью препаративной ВЭЖХ (МеОН/Н₂О с 0,05% Ν^-^Ο в качестве подвижной фазы) с получением указанного в заголовке соединения (141 мг, выход: 30%) в виде белого твердого вещества. Е81-М8 (М+Н)+: 479,9. ВЭЖХ: (214 нм: 100%, 254 нм: 100%). ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО ά₆) д: 7,78-7,77 (т, 1Н), 7,40-7,38 (т, 1Н), 6,86-6,82 (т, 1Н), 6,62-6,55 (т, 3Н), 6,45-6,37 (т, 3Н), 4,26-3,94 (т, 4Н), 3,47-3,39 (т, 1Н), 3,203,03 (т, 2Н), 2,90-2,78 (т, 2Н), 2,18-2,04 (т, 1Н), 1,86-1,34 (т, 5Н).

- 35 027823 (3К,3'К,4'8)-1'-(6-Амино-5-фторпиримидин-4-ил)-3-((3-хлор-5-фторфенил)амино)-2-оксо-[1,3'бипиперидин]-4'-карбоксамид. Смесь четырех диастереомеров разделяли на три пика с помощью 8РС (сверхкритическая флюидная хроматография) (1С (2x15 см), 25% МеОН (0,1% ЭЕА)/СО₂, 100 бар, 60 мл/мин) с получением указанного в заголовке соединения в качестве пика 3 соответственно. ЖХ-МС (Адйеп! 460, 254 нм): Е8 (+) МС т/е = 480,0 (М+1) при 1,01 мин. ¹Н ЯМР (400 МГц, СПС1₃) д: 7,90 (шир. з., 1Н), 6,44 (ά, 1 = 8,53 Гц, 1Н), 6,40 (з, 1Н), 6,30 (шир. з., 1Н), 6,23 (ά, 1 = 11,04 Гц, 1Н), 5,63 (шир. з., 1Н), 5,09 (шир. з., 1Н), 4,94 (шир. з., 2Н), 4,45 (ά, 1 = 12,80 Гц, 2Н), 3,68-3.95 (т, 2Н), 3,49-3,56 (т, 2Н), 3,35-

(38,3'К,4'8)-1'-(6-Амино-5-фторпиримидин-4-ил)-3-((3-хлор-5-фторфенил)амино)-2-оксо-[1,3'бипиперидин]-4'-карбоксамид. Смесь четырех диастереомеров разделяли на три пика с помощью 8РС (сверхкритическая флюидная хроматография) (1С (2x15 см), 25% МеОН (0,1% РЕА)/СО₂, 100 бар, 60 мл/мин) с получением указанного в заголовке соединения в качестве пика 1 соответственно. ЖХ-МС (Адйеп! 460, 254 нм): Е8 (+) МС т/е = 480,0 (М+1) при 1,01 мин. ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-άο) д: 7,77 (ά, 1 = 1,76 Гц, 1Н), 7,39 (з., 1Н), 6,81 (з, 1Н), 6,57 (з, 3Н), 6,46 (ά, 1 = 12,30 Гц, 1Н), 6,39 (άά, 1 = 1,76, 8,78 Гц, 1Н), 6,34 (ά, 1 = 7,53 Гц, 1Н), 4,28 (шир. з., 1Н), 4,23 (ά, 1 = 13,05 Гц, 1Н), 4,13 (άά, 1 = 2,76, 12,30 Гц, 1Н), 4,03 (ίά, 1 = 6,56, 10,98 Гц, 1Н), 3,33-3,46 (т, 2Н), 3,11 (шир. з., 1Н), 2,94 (шир. з., 1Н), 2,82 (ί, 1 = 12,30 Гц, 1Н), 2,09 (ςά, 1 = 5,75, 12,11 Гц, 1Н), 1,72-1,92 (т, 3Н), 1,56-1,72 (т, 1Н), 1,29-1,50 (т, 1Н).

(38,3'8,4'К)-1'-(6-Амино-5-фторпиримидин-4-ил)-3-((3-хлор-5-фторфенил)амино)-2-оксо-[1,3'бипиперидин]-4'-карбоксамид. Смесь четырех диастереомеров разделяли на три пика с помощью 8РС (сверхкритическая флюидная хроматография) (1С (2x15 см), 25% МеОН (0,1% РЕА)/СО₂, 100 бар, 60 мл/мин). Пик 2 из 3 в дальнейшем очищали с помощью 8РС (1А (3x15 см), 30% изо-РгОН (0,1% РЕА)/СО₂, 100 бар, 60 мл/мин) с получением указанного в заголовке соединения. ЖХ-МС (АцПеШ 460, 254 нм): Е8 (+) МС т/е = 480,0 (М+1) при 1,01 мин. ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-бб) δ: 7,77 (ά, 1 = 2,01 Гц, 1Н), 7,37 (шир. з., 1Н), 6,84 (з, 1Н), 6,57 (з, 2Н), 6,55 (шир. з., 1Н), 6,30-6,48 (т, 3Н), 4,28 (шир. з., 1Н), 4,23 (ά, 1 = 13,05 Гц, 1Н), 4,13 (άά, 1 = 3,39, 12,67 Гц, 1Н), 3,97 (ίά, 1 = 6,84, 10,42 Гц, 1Н), 3,38-3,50 (т, 1Н), 3,22-3,29 (т, 1Н), 3,10 (шир. з., 1Н), 2,71-2,97 (т, 1Н), 2,83 (ί, 1 = 12,30 Гц, 1Н), 2,13 (ςά, 1 = 6,13, 12,49 Гц, 1Н), 1,73-1,91 (т, 3Н), 1,58-1,73 (т, 1н), 1,39-1,53 (т, 1Н).

(3К,3'8,4'К)-1'-(6-Амино-5-фторпиримидин-4-ил)-3-((3-хлор-5-фторфенил)амино)-2-оксо-[1,3'бипиперидин]-4'-карбоксамид. Смесь четырех диастереомеров разделяли на три пика с помощью 8РС (1С (2x15 см), 25% МеОН (0,1% РЕА)/СО₂, 100 бар, 60 мл/мин). Пик 2 из 3 в дальнейшем очищали с помощью 8РС (1А (3x15 см), 30% изо-РгОН (0,1% РЕА)/СО₂, 100 бар, 60 мл/мин) с получением указанного в заголовке соединения. ЖХ-МС (Адйеп! 460, 254 нм): Е8 (+) МС т/е = 480,0 (м+1) при 1,01 мин. ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСОЧ) δ 7,77 (ά, 1 = 1,76 Гц, 1Н), 7,39 (з, 1Н), 6,81 (з, 1Н), 6,57 (з, 3Н), 6,46 (ίά, 1 = 2,01, 12,30 Гц, 1Н), 6,39 (ίά, 1 = 1,95, 8,66 Гц, 1Н), 6,34 (ά, 1 = 7,53 Гц, 1Н), 4,18-4,48 (т, 2Н), 4,09-4,18 (т, 1Н), 3,79-4,09 (т, 1Н), 3,33-3,45 (т, 2Н), 3,11 (шир. з., 1Н), 2,92 (шир. з., 1Н), 2,82 (ί, 1 = 12,42 Гц, 1Н), 2,09

- 36 027823 (ςά, I = 5,75, 12,11 Гц, 1Η), 1,74-1,93 (т, 3Η), 1,51-1,74 (т, 1Η), 1,32-1,51 (т, 1Η). Пример 10

Синтез (3'К,4'8)-1'-(6-амино-5-фторпиримидин-4-ил)-3-((3-хлор-5-(трифторметокси)фенил)амино)2-оксо-[1,3'-бипиперидин]-4'-карбоксамида.

Использовали процедуру, аналогичную вышеуказанной для синтеза (3'К,4'8)-Г-(6-амино-5фторпиримидин-4-ил)-3-((3-хлор-5-(трифторметил)фенил)амино)-2-оксо-[1,3'-бипиперидин]-4'карбоксамида 14 с получением неочищенного материала, который очищали с помощью препаративной ВЭЖХ (МеОН/^Ο с 0,05% ΝΗ₃Η₂Ο в качестве подвижной фазы) с получением указанного в заголовке соединения (320 мг, выход: 44%) в виде желтого твердого вещества. Ε8Ι-Μ8 (М+Н)+: 546,16. ВЭЖХ: (214 нм: 98,4%, 254 нм: 98,0%). ²Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-άΟ δ: 7,77 (5, 1Η), 7,39 (5, 1Η), 6,84-6,81 (т, 1Η), 6,75-6,72 (т, 1Η), 6,62-6,57 (т, 3Η), 6,52-6,47 (т, 2Η), 4,24-3,98 (т, 4Η), 3,47-3,40 (т, 1Η), 3,17-2,99 (т, 2Η), 2,86-2,79 (т, 2Η), 2,15-1,99 (т, 1Η), 1,86-1,60 (т, 4Η), 1,48-1,39 (т, 1Η).

(3К,3'8,4'К)-1'-(6-Амино-5-фторпиримидин-4-ил)-3-((3-хлор-5-(трифторметокси)фенил)амино)-2оксо-[1,3'-бипиперидин]-4'-карбоксамид. Смесь четырех диастереомеров очищали с помощью 8РС (АЭΗ (2х25 см), 30% ΕΐΟΗ (0,1% ΏΕΑ)^Ο₂, 100 бар, 70 мл/мин) с получением указанного в заголовке соединения. ЖХ-МС (АдйеП 460, 254 нм): Ε8 (+) МС т/е = 546,0 (М+1) при 1,20 мин. ²Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-ά^ δ: 7,77 (ά, I = 1,76 Гц, 1Η), 7,39 (шир. 5., 1Η), 6,81 (5, 1Η), 6,75 (5, 1Η), 6,62 (5, 1Η), 6,57 (5, 2Η), 6,38-6,52 (т, 2Н), 4,23 (ά, I = 13,05 Гц, 2Н), 3,92-4,18 (т, 2Н), 3,34-3,45 (т, 2Н), 3,11 (шир. 5., 1Η), 2,93 (шир. 5., 1Η), 2,82 (ΐ, I = 12,30 Гц, 1Η), 2,08 (ςά, I = 5,75, 12,11 Гц, 1Η), 1,74-1,92 (т, 3Η), 1,56-1,73 (т, 1Η), 1,36-1,50 (т, 1Η).

- 37 027823

(38,3'8,4'К)-1'-(6-Амино-5-фторпиримидин-4-ил)-3-((3-хлор-5-(трифторметокси)фенил)амино)-2оксо-[1,3'-бипиперидин]-4'-карбоксамид. Смесь четырех диастереомеров очищали с помощью 8РС (АБН (2x25 см), 30% ЕЮН (0,1% БЕА)/СО₂, 100 бар, 70 мл/мин) с получением указанного в заголовке соединения. ЖХ-МС (Ад1еп1 460, 254 нм): Е8 (+) МС т/е = 546,0 (М+1) при 1,23 мин. X ЯМР (400 МГц, ДМСО-а₆) δ: 7,77 (ά, I = 2,01 Гц, 1Н), 7,37 (шир. з., 1Н), 6,84 (з, 1Н), 6,72 (з, 1Н), 6,60 (з, 1Н), 6,57 (з, 2Н), 6,43-6,54 (т, 2Н), 4,23 (ά, I = 13,05 Гц, 1Н), 4,22 (шир. з., 1Н), 4,13 (άά, I = 3,26, 12,30 Гц, 1Н), 4,01 (ίά, I = 6,81, 10,23 Гц, 1Н), 3,44 (ίά, I = 6,18, 12,49 Гц, 1Н), 3,20-3,29 (т, 1Н), 3,11 (шир. з., 1Н), 2,88 (шир. з., 1Н), 2,83 (ί, I = 12,30 Гц, 1Н), 2,12 (ςά, I = 6,05, 12,46 Гц, 1Н), 1,73-1,91 (т, 3Н), 1,59-1,73 (т, 1Н), 1,48 (ίά, I = 9,41, 19,33 Гц, 1Н).

(38,3'К,4'8)-1'-(6-Амино-5-фторпиримидин-4-ил)-3-((3-хлор-5-(трифторметокси)фенил)амино)-2оксо-[1,3'-бипиперидин]-4'-карбоксамид. Смесь четырех диастереомеров очищали с помощью 8РС (АБН (2x25 см), 30% ЕЮН (0,1% БЕА)/СО₂, 100 бар, 70 мл/мин) с получением указанного в заголовке соединения. ЖХ-МС (А§йеп1 460, 254 нм): Е8 (+) МС т/е = 546,0 (М+1) при 1,22 мин. ¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-ά») δ: 7,77 (ά, I = 2,01 Гц, 1Н), 7.38 (шир. з., 1Н), 6,81 (з, 1Н), 6,75 (з, 1Н), 6,62 (з, 1Н), 6,57 (з, 2Н), 6,42-6,51 (т, 2Н), 4,23 (ά, I = 12,80 Гц, 2Н), 3,97-4,18 (т, 2Н), 3,34-3,44 (т, 2Н), 3,10 (шир. з., 1Н), 2,93 (шир. з., 1Н), 2,82 (ί, I = 12,17 Гц, 1Н), 2,03-2,15 (т, 1Н), 1,77-1,90 (т, 3Н), 1,57-1,73 (т, 1Н), 1,37-1,48 (т, 1Н).

(3К,3'К,4'8)-1'-(6-Амино-5-фторпиримидин-4-ил)-3-((3-хлор-5-(трифторметокси)фенил)амино)-2оксо-[1,3'-бипиперидин]-4'-карбоксамид. Смесь четырех диастереомеров очищали с помощью 8РС (АБН (2x25 см), 30% ЕЮН (0,1% БЕА)/СО₂, 100 бар, 70 мл/мин) с получением указанного в заголовке соединения. ЖХ-МС (А§йеп1 460, 254 нм): Е8 (+) МС т/е = 546,0 (М+1) при 1,23 мин. ¹Н ЯМР (400 МГц, СБС1₃) δ: 7,93 (з, 1Н), 6,60 (з, 1Н), 6,52 (з, 1Н), 6,35 (з, 1Н), 5,85 (шир. з., 1Н), 5,32 (шир. з., 1Н), 4,97-5,15 (т, 1Н), 4,78 (шир. з., 2Н), 4,46 (ά, I = 13,05 Гц, 2Н), 3,67-3,87 (т, 2Н), 3,34-3,60 (т, 4Н), 2,99 (ί, I = 12,17 Гц, 1Н), 2,34-2,49 (т, 1Н), 1,91-2,08 (т, 3Н), 1,83 (άς, I = 3,76, 12,72 Гц, 1Н), 1,47-1,74 (т, 1Н).

Пример 11. Анализ ВТК киназы ίη νΐίΓΟ. Анализ ВТК-РОРУОАТ-ЬЗ.

Целью анализа ВТК ίη νΐίΓΟ являлось определение активности соединения против ВТК посредством измерения 1С₅₀. Ингибирование соединения измеряли после мониторинга уровня фосфорилирования меченного флуоресцеином пептида ро1уОАТ (ΙηνΐίΓΟ^η РУ3611) в присутствии активного фермента ВТК (υрзίаίе 14-552), АТФ и ингибитора. Реакция киназы ВТК проводилась в черном 96-луночном планшете (Созίа^ 3694). Для обычного анализа аликвоту 24 мкл АТФ/пептидной основной смеси (конечная концентрация; АТФ 10 мкМ, ро1уОАТ 100 нМ) в киназном буфере (10 мМ Тпз-НС1 рН 7,5, 10 мМ МдС1₂, 200 мкМ №₃РО₄, 5 мМ БТТ, 0,01% Тгйоп Х-100 и 0,2 мг/мл казеин) добавляли в каждую лунку. Далее, добавляли 1 мкл 4-кратного 40Х титрования соединения в 100% ДМСО в качестве растворителя с после- 38 027823 дующим добавлением 15 мкл ферментной смеси ВТК в киназном буфере 1Х (с конечной концентрацией 0,25 нМ). Смесь для анализа инкубировали в течение 30 мин, после чего останавливали с помощью 28 мкл 50 мМ раствора БИТА. Аликвоты (5 мкл) киназной реакционной смеси переносили в белый 384луночный планшет небольшого объема (Согшпд 3674) и добавляли 5 мкл буфера для обнаружения 2Х (ЗпуНгодеп РУ3574 с антителом ТЬ-РУ20 4 нМ, 1пуПгодеп РУ3552). Планшет накрывали и инкубировали в течение 45 мин при комнатной температуре. Проводили измерения флуоресценции с временным разрешением (ТКР) с помощью прибора Мо1еси1аг Όον^δ М5 (возбуждение 332 нм; испускание 488 нм; излучение флуоресцеина 518 нм). Значения 1С₅₀ рассчитывали с использованием подгонки по четырем параметрам со 100% ферментативной активностью, определенной контролем ДМСО и 0% активностью по контролю ЕИТА.

Проанализированы некоторые соединения формулы I, и в ро1уОАТ анализе было обнаружено, что они активны. Соединения 1-1, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5 и 1-7 показывали значения 1С₅₀, составляющие 0,73, 0,68, 2,07, 0,63, 1,6 и 1,2 нМ соответственно. Для соединения 1-6 значение 1С₅₀ составляло менее 1 нМ. Соединение сравнения 1^С, показанное ниже, показало значение 1С₅₀, равное 2,0 нМ.

Пример 12. Протокол исследования для определения активации нуклеарного рецептора РХК в клетках ИРХ2 человека.

a) Обобщенный протокол. Было показано, что РХК представляет собой главный нуклеарный рецептор, который опосредует индуцированную лекарственными средствами экспрессию СУР3А4 (Ве^ι^1δδоη О, е! а1.; Ргос. №И. АсаД δα. υδΛ. 1998 Ос1. 13;95(21): 12208-13). Для скрининга новых молекулярных субстанций (англ. пе\у то1еси1аг ейт^, NМЕ) на ранней стадии разработки лекарственных средств на предмет их способности индуцировать СУР3А4 обычно используют анализ гена-репортера РХК в клетке, основанный на этом пути индукции СУР3А4 (Био О., е! а1.; Итид Ме!аЬ. ^^δроδ. 2002 1и1.;30(7):795-804.) Исследования были направлены на оценку влияния новых молекулярных субстанций (NМЕ) на активацию человеческого РХК в клетках ИРХ2. Клеточные линии, стабильно трансфицированные нуклеарным рецептором РХК и соответствующие элементы ответа высевали в 96-луночные планшеты. Через 24 ч после посева клетки обрабатывали 6 различными концентрациями NМЕ в трех лунках (см. ниже) и клетки затем возвращали в инкубатор еще на 24 ч. В конце этого инкубационного периода определяли количество жизнеспособных клеток/лунку с использованием анализа цитотоксичности Рготеда^ Се11 ТПег Ииог. После этого анализа в те же лунки добавляли Ртотеда^ О№>О1о и оценивали активность генарепортера.

b) Тест-система. Тест-система состояла из стабильно трансформированной опухолевой клеточной линии ИРХ2, помещенной в 96-луночные микротитрационные планшеты. Вектор экспрессии, несущий нуклеарный рецептор РХК, плюс соответствующие энхансеры и промоторы, связанные с геномрепортером люциферазы, были стабильно интегрированы в эти опухолевые клеточные линии. Активацию рецептора оценивали с помощью мониторинга активности гена-репортера и сравнения полученных результатов с клетками, обработанными носителем. Положительные контроли состояли из клеток, обработанных 6 различными концентрациями (0,1, 0,5, 1, 5, 10 и 20 мкМ) рифампицина. Таким образом, можно легко и быстро идентифицировать соединения, активирующие РХК. Поскольку были использованы стабильно интегрированные клеточные линии, то можно наблюдать от 3- до 70-кратную активацию рецептора.

c) Обработка данных и кинетика активации рецептора. Данные, обработанные с помощью программы М8-Ехсе1, рассчитывали как среднее (п=3) и % СУ кратной активации РХК относительно обработанных носителем клеток в каждой из 6 различных доз. Все данные активации нормализовали к числу жизнеспособных клеток/лунку. Результаты также выражали как процент от ответа, данного соответствующим положительным контролем на дозу 10 цМ. Значения ЕС₅₀ аий Е_тах были получены для тестируемых соединений, которые обеспечивают активацию рецептора, с использованием нелинейной регрессии обычных логарифмических кривых доза-ответ (Τπδΐη У5.0с, ОтарЬРай 8ойтаге, 8ап И1едо, Калифорния, США). Агенты, проявляющие атипичные кривые доза-ответ, не были проанализированы таким образом.

ά) Новые молекулярные субстанции ЩМЕ). Тестовые соединения испытывали при 0,05, 0,1, 0,5, 1,2,5 и 10 мкМ.

- 39 027823

Отдельные соединения формулы I тестировали в анализе ΡΧΚ. Соединения Ι-1, Ι-2, Ι-3, Ι-4 и Ι-5 продемонстрировали % ΡΧΚ индукции (по отношению к 10 мкМ рифампицина), равные 62, 42, 47, 67 и 90% соответственно. Соединение сравнения 1^С, показанное выше, продемонстрировало значение % ΡΧΚ индукции, равное 95%.

Пример 13. Протокол анализа ингибирования ΡазίΡаΐсЬ ΙιΕΚΟ.

Калиевый канал сердца, ΙιΕΚΟ. отвечает за быстрый ток выпрямляющего канала (1_Кг) в желудочке человека, и ингибирование 1_Кг является наиболее распространенной причиной продления потенциала действия сердечной мышцы несердечными препаратами (см., например, ХУетсН апб ЛЩопк Вазю Кез. Сагбю1., 93, §ирр1. 1, 125-32, 1998; Уар апй Сатт, С1ш. Εxр. А11егду, 29, §ирр1. 3, 174-81, 1999). Увеличение длительности потенциала действия было названо в качестве фактора, вызывающего удлинение интервала РТ, что связано с опасной желудочковой аритмией, желудочковой тахикардей типа пируэт (Вго^п ;·ιηά Катре, ΡЬа^тасеиί^са1 №\уз, 7, 15-20, 2000).

Ιη νίίΐΌ эффекты соединений, предложенных согласно настоящему изобретению, исследовали в отношении тока калиевых каналов (заменитель для Ι_Κγ, быстро активируемый, калиевый ток замедленного выпрямления) ΗΕΚΟ (ген специфических калиевых каналов сердца человека), при этом ток экспрессирован в клетках почки эмбриона человека (ΠΕΚ293), стабильно трансфицированных кДНК ΙιΕΚΟ. Клетки помещали в ΠΕΡΕδ-забуференный физиологический раствор в 96-луночный остеклованный планшет и загружали соответствующими количествами исследуемых и контрольных растворов с продолжительностью воздействия 3 мин при каждой концентрации. Все соединения были разведены в 0,3% ДМСО. Использовали автоматизированную параллельную систему пэтч-кламп, ^ΡаΐсЬ НТ (§орЫоп Вюзшепсе А/δ, Дания) для оценки при различных концентрациях (например, 10 мкМ). Значения Ιί'.'₅₀ определяли на основе данных ингибирования ΙιΕΚΟ. Исследование было проведено в СНапТез! (14656 №о С1е\'е1апД, ОН, США). Экран ΟΡπίΠι дополнительно описан в 1ап/еп ηηά Вегпазсош (еДз.), НщН ТНгоидНрШ §сгеешпд, МеШоДз πηά Ρ^оΐосо1з, ЗесоиЧ Εά^η, νо1. 565, сНарЮг 10, рд. 209-223, 2009.

Некоторые соединения формулы Ι тестировали в анализе ΗΕΚΟ. Соединения Ι-1, Ι-2, Ι-3 и Ι-4 показали Юзе в отношении ΗΕΚΟ 15,6, 30, 14,6 и 13,7 мкМ соответственно. Соединение Ι-5 не показало заметной активности в анализе ΗΕΚΟ при 10 мкМ (ΙΟ₅₀ недоступно). Соединение Ι-6 показало незначительную активность в отношении ΗΕΚΟ (ингибирование <20%) при 10 мкМ (ΙΟ₅₀ недоступно). Соединение Ι-7 показало активность в отношении ΗΕΚΟ (ингибирование 65%) при 10 мкМ (ΙΟ₅₀ недоступно). Соединение сравнения Г, показанное выше, показало Ιί'.\₀ в отношении ΗΕΚΟ 1,18 мкМ или активность (ингибирование 87%) при 10 мкМ.

Пример 14. Накопление С8Н в микросомах печени человека: протокол.

Тестовое соединение (конечная концентрация 10 мкМ) инкубировали с микросомами печени человека или крысы (конечная концентрация 1 мг/мл) вместе с активирующими кофакторами УДОБН (конечная концентрация 1 мМ), фосфатом калия (конечная концентрация 100 мМ рН 7,4), хлоридом магния (конечная концентрация 3,3 мМ) и перехватывающим агентом С8Н (конечная концентрация 5 мМ). Инкубационную смесь инкубировали в течение 60 мин при 37°С, останавливали с помощью ледяного ацетонитрила (объем равен объему инкубационной смеси) и выделяли супернатанты. Супернатанты вводили либо непосредственно для анализа ЖХ/МС/МС, либо сушили под Ν₂ и перерастворяли в смеси воды:ацетонитрила (80:20) перед анализом ЖХ/МС/МС. Соответствующий конъюгат С8Н оценивали с помощью ЖХ/МС/МС с использованием Тпр1е ТОΡ5600/Xеνо О1оГ МЗе.

Пример 15. Модель крысы с коллаген-индуцированным артритом.

Модель коллаген-индуцированного артрита (СЧА) на самках крыс Льюиса требует первичного иммунного ответа Т- и В-клеток на иммунизацию коллагеном типа ΙΙ (СИ) для развития тяжелого воспалительного заболевания (см. Со16зс1иш61 ТД., Но1тбаН1 К. Се11 Iттиηо1. 154(1):240-8, 1994; Не1Гдо11 З.М., е! а1.; С1ш. ^тиюЕ Иптшюрабюк 31:403, 1984; Но1тбаН1 К. е! а1., 1. АиЮттищ 7(6):739-52, 1994; зп6 81иай Ч.М., е! а1., 1. Εxр. Меб. 155:1, 1982). Клиническая форма заболевания начинается после вторичной стимуляции СИ, и заболевание прогрессирует в течение следующих восьми дней.

Обычно самок крыс Льюис иммунизировали бычьим коллагеном типа ΙΙ в неполном адъюванте Фрейнда. Крысам (Ν=1((/группу) ежедневно перорально вводили тестируемое соединение или носитель дважды в сутки через желудочный зонд, начиная с 1 дня (терапевтического). Клиническую тяжесть артрита оценивали путем измерения лодыжек штангенциркулем, проводимого каждый день начиная с 0 дня.

Подробный протокол. Самок крыс линии Льюис иммунизировали подкожно бычьим коллагеном типа ΙΙ (1:1 эмульсия 2 мг/мл бычьего СИ в 0,01 Ν уксусной кислоте: неполный адъювант Фрейнда) на трех участках кожи спины. Через шесть дней после иммунизации крысы получали вторую подкожную инъекцию бычьего СИ. Суспензию соединения формулы Ι или носитель (0,5% СМС, 0,1% Твин-80) вводили через желудочный зонд дважды в сутки, начиная с 0 дня (профилактически) (η=10 животных/группу). Клиническую тяжесть СЧА оценивали путем измерения лодыжек штангенциркулем, проводимого каждый день, начиная с 9 дня. Брали исходные измерения лодыжки штангенциркулем и подтверждали их как клинически нормальные (0,260-0,264 дюйма) для профилактического лечения. Исходные измерения лодыжки штангенциркулем для животных с устоявшимся заболеванием оценивали в 1 день терапевтического дозирования и животных рандомизировано разделили по группам лечения после

- 40 027823 подтверждения начала клинического заболевания (0,2751-0,2755 дюймов). Данные анализировали по всем группам с использованием одностороннего дисперсионного анализа (однофакторный ΛNОVΑ), а также соответствующего множественного сравнения после испытаний. Значимость для всех тестов устанавливали р < 0,05.

Пример 16. Анализ активации пути ВСК через ингибирование фосфорилирования РЬСу2.

Протокол. За один день до обработки клетки Катов высевали при плотности 3х10⁵ клеток на лунку в 200 мкл полной среды в 96-луночные планшеты с фильтром для культуры ткани (МИйроге, ВШейса, МА). В день обработки использованную среду удаляли фильтрованием, клетки ресуспендировали в 200 мкл среды без сыворотки, содержащей последовательные разведения соединения и ДМСО до 0,1%, а затем инкубировали в течение 2 ч при 37°С. Клетки стимулировали в течение 5 мин 10 мкг/мл козьего антитела против человеческого 1дМ при 37°С. Всю среду удаляли фильтрованием и клетки промывали ледяным РВЗ, а затем лизировали на льду в течение 1 ч лизисным буфером, содержащим: 20 мМ Трис (рН 7,5), 150 мМ №С1, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ ЕСТА, 2 мМ ΝιΛΌ. 1% Тритон Х-100, 0,1% ЗЭЗ, смесь ингибиторов протеаз, 1 мМ фенилметилсульфонилфторида, (ФМСФ), ингибитор фосфатазы смесь 2 (З1дша Са! # Р5726 от Зфта, З!. Ьошв, МО, США), и ингибитор фосфатазы смесь 3 (З1дша Са! # Р0044 от З1дта, 8!. Ьошв, МО, США). Затем лизаты перенесли в стандартные планшеты МЗЭ (Мево Зса1е Э1всоуегу, (МЗЭ), (СаННегвЬигд, Магу1апй, США)), предварительно обработанные иммобилизованным антителом (поли РЬСу2 антитело В10, (ЗаШаСгн/ Вю!есНио1од1ев (8ап!а Сгн/, СА, США)), и блокировали с помощью ВЗА в соответствии с указаниями изготовителя. Лизаты инкубировали в подготовленных планшетах МЗЭ в течение ночи при 4°С при осторожном перемешивании. Лунки промывали ТВЗТ три раза и обрабатывали анти рРЬСу2 (ЗаШаСгн/) в 1% ВЗА в РВЗ в течение 1 ч при комнатной температуре. Лунки снова три раза промывали ТВЗТ и обрабатывали антикроличьим антителом с сульфо-меткой ЗнИо-Тад (МЗЭ) в течение 1 ч при комнатной температуре. После промывания ТВЗТ добавляли буфер считывания МЗЭ и измеряли люминесценцию на приборе МЗЭ ЗЕСТОК 1тадег 6000. Максимальный отклик определяли как среднюю люминесценцию в лунках, содержащих стимулированные клетки, обработанных анти-1дМ и ДМСО. Минимальный отклик определяли как среднюю люминесценцию в лунках, содержащих нестимулированные клетки, обработанные только ДМСО. Максимальные и минимальные значения использовали для нормализации люминесценции в лунках, обработанных соединением. Нормированные значения наносили на график в зависимости от концентрации соединения по логарифмической шкале, а затем анализировали с помощью программного обеспечения Рп/т (СгарНРай ЗоП\уаге, 1пс.). Сигмоидальное уравнение доза-ответ с переменным наклоном использовали для подгонки данных и получения значений концентрации 50% ингибирования (1С₅₀).

Клетки Катов инкубировали в 96-луночных планшетах с диапазоном концентраций соединения формулы I в течение 2 ч, стимулировали с помощью 10 мкг/мл анти-1дМ в течение 5 мин и измеряли фосфорилирование РЬСу2 с использованием электрохимического люминесцентного иммуноанализа. ЕС₅₀ рассчитывали с использованием программного обеспечения СгарНРай Рпвт.

Пример 17. Ингибирование пролиферации ВСК-индуцированных В-клеток человека.

СЭ19+ В-клетки человека стимулировали антителом анти-1дМ и оценивали активность соединения формулы I с точки зрения изменения клеточного метаболизма после 72 ч. В этом контексте клеточный метаболизм непосредственно коррелирует с клеточной активацией и пролиферацией, а также может отражать относительную выживаемость клеток при пролиферации. Антитела анти-1дМ оценивали по воздействию на пролиферацию В-клеток, и было определено, что они обладают половинной максимальной концентрацией для активации, составляющей 10 мкг/мл. Используя эти условия активации, анализировали различные концентрации тестируемого соединения в трех повторностях в 0,1% ДМСО с точки зрения воздействия на клеточный метаболизм СЭ19+ В-клеток, выделенных из различных доноров.

Протокол. В-клетки человека выделяли из мононуклеарных клеток периферической крови или неочищенных лейкоцитарных пленок с использованием градиентов Псо11-Нурас|ие (АшегвНаш) и отрицательно отбирают путем магнитной сортировке клеток (набор для изоляции В-клеток человека Κι! II, МН!епу1 Вю!ес). Чистоту клеток-мишеней определяли при проточной цитометрии с помощью окрашивании маркеров В-клеток, Т-клеток и моноцитов (СЭ19, СЭ3, СЭ14 соответственно; ВЭ Вюваепсев). Данные получали на проточном цитометре РАСвСайЬег и анализировали с использованием программного обеспечения Р1о1о (ВЭ Вюваепсев). Чистота препаратов В-клеток человека обычно составляла более 95%. Отрицательно отобранные В-клетки человека стимулировали 10 мкг/мл антиЧдМ Р(аЬ')₂ (Засквоп йпншпоКевеагсй) в 96-луночных планшетах. 100000 В-клеток в 0,2 мл среды КΡМI + 10% РВЗ обрабатывали различными концентрациями (титровали от 5000 до 0 нМ в 0,5% ДМСО) соединения формулы I в трех лунках или контролем-носителем в 0,5% конечной концентрации ДМСО в течение 30 мин при 37°С, 5% СО₂ и затем клетки стимулировали с помощью 10 мкг/мл антиЧдМ Р(аЬ')₂. В-клетки стимулировали в течение 72 ч при 37°С, 5% СО₂. Пролиферацию измеряли с использованием реагента Се11Тйег-С1о (Рготеда) при измерении на люминометре. Средние значения наносили на график в зависимости от максимальной пролиферации и с помощью программного обеспечения СгарНРай Рпвт ν5 определяли значения Ю₅₀.

- 41 027823

Пример 18. Оценка эффекта соединений на активацию миелоидных клеток ίη νίΐτο.

РсуК активация первичных человеческих макрофагов. Активацию, опосредованную аутоиммунными антителами и иммунным комплексом, посредством РсуК можно смоделировать путем активации макрофагов иммобилизованным 1§О. Первичные макрофаги человека, полученные из обработанных ОМС8Р моноцитов, повышающе регулируют активацию маркеров, таких как СЭ80. СЭ86. МНС антигенов и рецептора РсуКШ. Человеческие макрофаги моноцитарного происхождения можно активировать с помощью связанного с планшетом очищенного человеческого 1дО. Эта стимуляция поперечно связывает рецептор РсуКШ и вызывает секрецию провоспалительных цитокинов, таких как ΤΝΡα, 1Ь-6, Ш-1(1 и МСР-1. Соединение формулы I оценивали на ингибирование экспрессии цитокинов, следующей за активацией РсК макрофагов человека.

Обычно макрофаги культивировали в планшетах, предварительно инкубированных с очищенным 1дО, затем промывали. Титры тестируемого соединения (10000 до 0 нМ) добавляли к этим культурам. Супернатанты клеточной культуры анализировали с помощью ЕЬ18А на экспрессию ΤΝΡα и Ш-6.

Протокол. Моноциты человека выделяли из лейкоцитарных пленок здоровых доноров и отрицательно выбирали магнитной сортировкой клеток (набор для изоляции моноцитов Κίΐ II, МП1епу1 Вю1ес). Очищенные моноциты культивировали в стандартных средах, дополненных низко-1дО РВ8 и 100 нг/мл ОМ-С8Р, в течение 5-7 дней для индуцирования дифференциации макрофагов. Культивируемые макрофаги стимулировали с помощью 100 мкг/мл связанного с планшетом очищенного 1дО ± титр тестируемого соединения (10 мкМ до 0 нМ). Супернатанты собирали через 4 и 18 ч и анализировали на ΤΝΡα и Ш-6, соответственно.

Пример 19. Эффективность в отношении индуцированного антителом коллагена артрита у мышей.

Этот пример относится не только к артриту, но также оценивает активность аутоиммунных антител и иммунных комплексов ίη νίνο и, следовательно, имеет отношение к другим воспалительным заболеваниям, таким как СКВ. В этом эксперименте активность аутоиммунных антител и иммунных комплексов обеспечила патологическую конечную точку, которая зависит от сигнализации РсК, и при этом часть Рс таких антител подавляется путем введения соединения формулы I.

Модель артрита, индуцированного антителом коллагена (англ. Со11адеп апПЪойу-шбисей аПНпШ, САШ), у самок мышей ЭВА/1 не требует схожих ответов Т- и В-клеток для индукции воспаления, но в основе развития клинического заболевания лежат иммунные эффекторные механизмы. Смесь из четырех специфических моноклональных антител антиколлагенов II (СП) и иммунного стимулирующего липополисахарида (ЬР8) вводили через 3 дня после того, как передача специфических антител СП стимулировала взаимодействие антитело-Рс-рецептор (Кадап Т. е! а1.; 1. Iттиηο1. 170:4318-24 (2003)), образование иммунных комплексов, активацию комплемента (Вапба Ν.Κ. е! а1.; СПп. Ехр. Iттиηο1. 159:100-8 (2010)) и выработку провоспалительных цитокинов для индуцирования серьезного воспалительного заболевания в течение 10-дневного периода.

Обычно артрит индуцировали путем инъекции коктейля моноклональных антиколлагеновых антител мышам ЭВА/1 на 0 день. Мышам Щ=10/группу) ежедневно перорально вводили тестируемое соединение раз в сутки или дважды в сутки как показано, начиная с 0 дня. Воспаление лап оценивали ежедневно.

Протокол. Самки мышей ЭВА/1 в возрасте 6-8 недель получали 2 мг артритогенного коктейля четырех клонов моноклональных антител (СПопбгех # 10100) внутривенно на 0 день, за которым следовало введение 50 мкг дозы ЬР8 через 3 дня. Суспензию тестируемого соединения или носитель (0,5% СМС, 0,1% Т\уееп 80) вводили дважды в сутки через желудочный зонд, начиная с 0 дня (10 животных/группу) непосредственно перед внутривенным внесением коктейля антител. Клиническую тяжесть СЛА оценивали с помощью мониторинга воспаления на всех четырех лапах, применяя шкалу от 0 до 4. Каждую лапу оценивали следующим образом: 0, нормальная; 1, слабые, но заметные покраснение и отек лодыжки или запястья, или покраснение и отек любой степени тяжести 1 или 2 пальцев; 2, покраснение и отек лодыжки или запястья от умеренной до тяжелой степени, или более чем двух пальцев; 3, покраснение и отек (резко выраженный отек) всей лапы; и 4, максимально воспаленная конечность с вовлечением нескольких суставов. Сумма четырех отдельных показателей представляет собой индекс артрита, при этом максимально возможное число равно 16 для каждого животного.

Claims (27)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Соединение формулы I

   - 42 027823 или его фармацевтически приемлемая соль, где каждый К¹ независимо представляет собой водород или возможно замещенную С_1-6алифатическую группу;

   или две группы К¹ совместно с находящимися между ними атомами образуют возможно замещенное 3-7-членное насыщенное или частично ненасыщенное моноциклическое гетероциклическое кольцо, содержащее 1-2 гетероатома, независимо выбранных из азота, кислорода или серы;

   при этом возможно замещенные группы могут содержать в качестве заместителя галоген, -ΝΟ₂, -СЧ -ΟΕ, -ЗК, -Ν(£)2, -СЮ)К, -ТО2К, -Ν^^ΟΕ, -СЮЖКД, ЮС^К, -Ν^Ο^β, -δ(Ο)Ε, -З^ДК или -ЗЮД^КД; каждый К независимо представляет собой водород или С_1-6алифатическую группу;

   кольцо А представляет собой

   Р²

   К² представляет собой -С1 или -Р; и

   К³ представляет собой -СР₃, ЮСР₃ или -Р.
2. 2. Соединение по п.1, отличающееся тем, что имеет формулу П-а или его фармацевтически приемлемая соль.
3. 3. Соединение по п.1, отличающееся тем, что имеет формулу П-Ь или его фармацевтически приемлемая соль.
4. 4. Соединение по п.1, отличающееся тем, что имеет формулу III

   - 43 027823
5. 5. Соединение по п.1, отличающееся тем, что имеет формулу IV
6. 6. Соединение по п.5, отличающееся тем, что К³ представляет собой -СР₃.
7. 7. Соединение по п.5, отличающееся тем, что К³ представляет собой -Р.
8. 8. Соединение по п.5, отличающееся тем, что оба К¹ представляют собой водород.
9. 9. Соединение по п.5, отличающееся тем, что один К¹ представляет собой водород, а другой К¹ представляет собой возможно замещенную С1_-6алифатическую группу.
10. 10. Соединение по п.9, отличающееся тем, что один К¹ представляет собой водород, а другой К¹ представляет собой метил.
11. 11. Соединение по п.5, отличающееся тем, что оба К¹ представляют собой возможно замещенные С1_-6алифатические группы.
12. 12. Соединение по п.1, отличающееся тем, что один К¹ представляет собой водород, а другой представляет собой возможно замещенную С1_-6алифатическую группу.
13. 13. Соединение по п.1, отличающееся тем, что оба К¹ представляют собой возможно замещенные С1_-6алифатические группы.
14. 14. Соединение по п.1, отличающееся тем, что оба К¹ представляют собой водород.
15. 15. Соединение по п.1, отличающееся тем, что К² представляет собой -С1.
16. 16. Соединение по п.1, отличающееся тем, что К² представляет собой -Р.
17. 17. Соединение по п.1, отличающееся тем, что К³ представляет собой -СР₃.
18. 18. Соединение по п.1, отличающееся тем, что К³ представляет собой -ОСР₃.
19. 19. Соединение по п.1, отличающееся тем, что К³ представляет собой -Р.
20. 20. Соединение, выбранное из группы, состоящей из

    - 44 027823
21. 21. Способ уменьшения ферментативной активности тирозинкиназы Брутона, включающий приведение тирозинкиназы Брутона в контакт с эффективным количеством соединения по любому из пп.1-20 или его композиции.
22. 22. Способ лечения расстройства, восприимчивого к ингибированию тирозинкиназы Брутона, включающий введение субъекту эффективного количества соединения по любому из пп.1-20 или его композиции.
23. 23. Способ лечения расстройства, выбранного из группы, состоящей из ревматоидного артрита, системной красной волчанки, атопического дерматита, лейкоза и лимфомы, включающий введение субъекту эффективного количества соединения по любому из пп.1-20 или его композиции.
24. 24. Способ по п.23, отличающийся тем, что указанное расстройство представляет собой ревматоидный артрит.
25. 25. Способ по п.23, отличающийся тем, что указанное расстройство представляет собой системную красную волчанку.
26. 26. Способ по п.23, отличающийся тем, что указанное расстройство представляет собой атопический дерматит.
27. 27. Способ по п.23, отличающийся тем, что указанное расстройство представляет собой лейкоз или лимфому.