KR20200025906A - 펩신에 의해 특이적으로 분해되는 펩타이드 및 이를 포함하는 역류성 인후두염 진단용 키트 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 펩신에 의해 특이적으로 분해되는 펩타이드, 이를 포함하는 역류성 인후두염 진단용 키트 및 이를 이용한 역류성 인후두염 진단방법에 관한 것이다.

Description

펩신에 의해 특이적으로 분해되는 펩타이드 및 이를 포함하는 역류성 인후두염 진단용 키트{Peptide cleaved specifically by pepsin and kit for diasnosing Laryngopharyngeal Reflux comprising the same}
본 발명은 펩신에 의해 특이적으로 분해되는 펩타이드, 이를 포함하는 역류성 인후두염 진단용 키트 및 이를 이용한 역류성 인후두염 진단방법에 관한 것이다.
역류성 인후두염은 위산을 포함한 내용물이 식도를 거쳐 후두와 인두로 역류하여 유발되는 후두와 인두의 만성 염증 또는 점막의 손상을 말한다. 현대인의 식생활 습관 변화 및 산업화, 도시화에 따른 기후와 대기 변화가 심해짐에 따라 역류성 인후두염을 호소하는 환자 수가 점차 증가하고 있지만, 아직까지 이를 간단하면서도 정확히 진단할 수 있는 방법이 부재하며, 진단한다 하더라도 치료하는 방법은 대부분 위산 분비의 억제에 머물러 있을 뿐이어서, 치료 후에도 증상이 지속되는 등 효율적인 치료가 어려운 상황이므로, 정확하고 빠른 진단을 통한 적절한 치료가 반드시 필요하다.
역류성 인후두염 진단의 gold standard로 알려져 있는 24시간 식도 산성도 검사법은 비용이 많이 들고, 검사 시간이 길고, 불편하여 쉽게 이용하기 어려울 뿐 아니라 비전형적인 증상을 가진 환자들에 있어서는 치료 반응을 예측할 수 없다. 역류성 인후두염 환자들은 역류 증상보다는 목의 이물감, 기침, 음성 변화와 같은 비특이적 증상을 호소하는 경우가 많으나, 이를 정확히 진단하기는 어려워 이러한 증상을 호소하는 많은 환자들에서 외래에서 바로 시행하고 결과를 확인할 수 있는 비침습적이고 객관적인 진단 방법의 개발이 필요한 실정이다.
한편, 펩신은 위에서만 생성되는 단백분해 효소이므로, 타액 내 펩신 검출기술은 위 내용물의 역류에 대한 민감하면서도 비침습적인 방법으로 유용할 수 있다. Saritas 등은 고속 측방 유동 장치(rapid lateral flow device)를 이용하여 타액 내 펩신의 검출이 역류성 식도염의 진단에 도움이 된다는 것을 밝혔으며(Saritas Yuksel, E. et al., Laryngoscope, 2012, 122(6): 1312-1316), Darija 등은 역류성 인후두염 환자에서 타액 내 펩신의 양이 정상인에 비해 유의하게 높음을 밝혔다(Darija, B. et al., Collegium Antropologicum, 2012, Supp. 2, 36: 83-86). 이에, 현재 미국을 비롯한 여러 나라에서, 보다 간단하고 신뢰도 높으며, 비침습적인 진단 방법을 개발하고 있다.
일반적으로, 래피드 테스트(rapid test)법으로 알려진 면역 크로마토그래피 분석법은 항원-항체 반응을 이용하여, 미량의 분석물질(analyte)을 단시간에 정성 및 정량적으로 분석할 수 있는 방법으로서, 각종 질병의 진단 또는 검사를 비롯하여, 의학, 농업, 축산업, 식품, 군사, 환경 등 다양한 분야에서 사용되고 있다. 이러한 면역 크로마토그래피 분석에는 검출하고자 하는 분석물질과 반응하여 변화를 나타낼 수 있는 반응물질을 포함하는 분석스트립(assay strip) 또는 상기 분석스트립을 플라스틱 케이스에 장착한 디바이스 형태의 분석장치가 일반적으로 사용되고 있다. 도 1은 통상적인 면역 크로마토그래피 분석에 사용되는 분석스트립의 단면도이다. 도 1에 나타난 바와 같이, 통상적인 분석스트립은 액상 검체를 수용하는 검체 패드, 육안 또는 센서를 이용하여 감지할 수 있는 시그널을 발생시키는 표지를 항원, 항체 등의 리간드에 접합시킨 접합체(conjugate)를 함유하는 접합체 패드, 검체 중의 분석물질 및/또는 상기 접합체와 특이적으로 결합하는 결합제(항체 또는 항원)를 고정시킨 다공성 멤브레인 패드 및 액상 검체를 최종적으로 수용하는 흡습 패드로 구성되며, 이러한 기능성 패드들은 상기 나열한 순서대로 일부 중첩된 형태로 연결되어 고체 지지체 상에 부착되어 연속적으로 배열된다. 상기 분석스트립이 플라스틱 케이스 내부에 장착되어 사용되는 경우, 케이스의 상부에는 검체 패드의 위치에 검체를 적하하기 위한 검체 투입구가, 다공성 멤브레인 패드의 결합제가 고정된 위치에는 검사 결과를 확인하기 위한 결과 확인창이 형성된다. 이와 같이, 분석스트립을 이용한 면역 크로마토그래피 분석법에 있어서, 검체 패드에 액상 검체를 적하하면, 액상 검체는 모세관 현상에 의하여 접합체 패드 및 다공성 멤브레인 패드를 통하여 이동하며, 최종적으로 흡습 패드에 수용된다. 이때, 상기 접합체 패드에 함유되어 있던 접합체도 액상 검체와 함께 이동하여, 검체 중에 분석하고자 하는 물질이 존재하면, 접합체가 분석물질을 매개하여 다공성 멤브레인 패드에 고정된 결합제와 결합하거나(통상, "샌드위치(sandwich) 반응"이라 한다.), 접합체와 분석물질이 경쟁적으로 결합제와 결합함으로서(통상, "경쟁(competition) 반응"이라 한다.), 검체 중 분석물질의 존재 여부를 육안으로 또는 센서를 이용하여 감지할 수 있다. 일반적으로 사용되는 샌드위치 반응을 이용하기 위해서는 분석물에 특이적인 두 종류의 항체를 필요로 하며, 상기 항체들은 동일 항원의 서로 다른 항원 결합 부위에 반응해야 한다. 이와 같이 항체를 사용하는 경우, 항체의 높은 특이성과 친화력을 이용하여 선택적이며 민감한 검출이 가능한 장점이 있으나, 동물이나 세포를 이용하는 제조 공정으로 인해 생산이 어렵고 오래 걸릴뿐 아니라 많은 비용이 소모되며, 만드는 시기에 따라 활성이 상이할 수 있어 원하는 항원과 높은 결합력을 갖는 고품질의 항체를 얻는 것은 쉽지 않다. 또한, 항체는 안정성이 낮으므로, pH, 온도 등의 환경에 의한 영향을 받으므로 보관이 까다로운 문제가 있다.
이에, 본 발명자들은, 경제적이며 보관에 용이하도록 항체를 불포함하는, 비침습적으로 수집 가능한 검체인 타액을 이용하여 역류성 인후두염을 진단할 수 있는 키트를 제공하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 역류성 인후두염을 진단할 수 있는 지표인 타액 내 펩신의 단백질 분해작용을 이용하여, 타 효소에 의해서는 분해되지 않고 펩신에 의해서만 특이적으로 분해 가능한 아미노산 서열을 고안하였다. 또한, 적절한 리간드의 조합을 사용함으로써, 면역 크로마토그래피의 원리를 적용하되 항체를 포함하지 않는, 펩신의 정성/정량 분석은 물론 이를 토대로 역류성 인후두염을 진단할 수 있는 키트를 구성할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 일말단에는 표지 물질 및 제1리간드가, 다른 말단에는 제2리간드가 결합된, 펩신에 의해 특이적으로 분해되는 펩타이드; 및 상기 제1리간드와 특이적으로 결합하는 제3리간드를 포함하여 유체의 흐름과 수직인 방향으로 소정의 폭을 갖도록 형성된 검사선(test line) 및 상기 제2리간드와 특이적으로 결합하는 제4리간드를 포함하여 상기 검사선과 일정 거리만큼 이격되어 평행하게 형성된 대조선(control line)을 포함하는 멤브레인 패드(membrane pad), 및 액상 검체를 최종적으로 수용하는 흡습 패드(absorption pad)로 구성되며, 상기 멤브레인 패드 및 흡습 패드가 일부 중첩된 형태로 연결된 면역크로마토그래피용 스트립을 포함하는 역류성 인후두염 진단용 키트로서, 상기 제1리간드와 제2리간드, 및 제3리간드와 제4리간드는 서로 상이하며, 제1리간드와 제4리간드 및 제2리간드와 제3리간드는 서로 결합하지 않도록 선택된 것인 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 역류성 인후두염의 발병이 의심되는 개체로부터 수집한 타액을, 상기 역류성 인후두염 진단용 키트의 멤브레인 패드에 투입하여 검사선 및 대조선을 지나도록 흡습 패드 방향으로 전개시키는 제1단계; 검사선 및 대조선에서 표지 물질에 의한 신호를 확인하는 제2단계; 및 역류성 인후두염에 대해 검사선 및 대조선에서 신호가 검출되는 경우에 양성으로, 대조선에서만 신호가 검출되는 경우에 음성으로 판단하는 제3단계를 포함하는, 역류성 인후두염 진단을 위한 정보제공 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 알라닌, 발린, 루신, 이소루신, 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판으로 구성된 군으로부터 선택되는 2개의 소수성 아미노산이 연속적으로 위치하고, 상기 연속적으로 위치한 소수성 아미노산의 양말단에 각각 2 내지 10개의 아미노산이 추가된 일련의 펩타이드를 제조하는 제1단계; 및 상기 제1단계로부터 제조된 일련의 펩타이드를 펩신, 트립신, 아밀라아제, 라이소자임 또는 뮤신과 접촉시키고, 각 효소에 의한 분해여부를 확인하는 제2단계를 포함하는, 펩신에 의해 특이적으로 분해되는 펩타이드의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 GDFLMGRDMRK(서열번호 1), GDFLGGRDARK(서열번호 2) 또는 CGDFLMGRDMRK(서열번호 3)의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한, 본 발명의 제1양태는
일말단에는 표지 물질 및 제1리간드가, 다른 말단에는 제2리간드가 결합된, 펩신에 의해 특이적으로 분해되는 펩타이드; 및
상기 제1리간드와 특이적으로 결합하는 제3리간드를 포함하여 유체의 흐름과 수직인 방향으로 소정의 폭을 갖도록 형성된 검사선(test line) 및 상기 제2리간드와 특이적으로 결합하는 제4리간드를 포함하여 상기 검사선과 일정 거리만큼 이격되어 평행하게 형성된 대조선(control line)을 포함하는 멤브레인 패드(membrane pad), 및 액상 검체를 최종적으로 수용하는 흡습 패드(absorption pad)로 구성되며, 상기 멤브레인 패드 및 흡습 패드가 일부 중첩된 형태로 연결된 면역크로마토그래피용 스트립을 포함하는 역류성 인후두염 진단용 키트로서,
상기 제1리간드와 제2리간드, 및 제3리간드와 제4리간드는 서로 상이하며, 제1리간드와 제4리간드 및 제2리간드와 제3리간드는 서로 결합하지 않도록 선택된 것인 키트를 제공한다.
예컨대, 본 발명의 키트에 포함된 면역크로마토그래피용 스트립은 액상 검체를 수용하는 검체 패드(sample pad) 및/또는 검체와 펩신에 의해 특이적으로 분해되는 펩타이드와의 반응을 위한 반응 패드(reaction pad)를 추가로 포함할 수 있다. 이들 패드는 선택적으로 멤브레인 패드의 전단 즉, 흡습 패드의 타측에 위치할 수 있다. 이들 패드는 검체 패드, 반응 패드, 멤브레인 패드 및 흡습 패드의 순으로 위치하며, 말단을 통해 일부 중첩되어 용액 상의 검체가 흡습 패드를 향해 순차적으로 이동할 수 있도록 배열될 수 있다.
한편, 본 발명의 키트에 포함된 펩신에 의해 특이적으로 분해되는 펩타이드는 면역크로마토그래피용 스트립과 독립적으로 제공되어, 이를 이용한 진단 시 외부에서 검체와 반응시켜 면역크로마토그래피용 스트립에 적용할 수 있다. 또는, 상기 면역크로마토그래피 스트립에 이에 포함된 반응 패드 상에 결합 또는 흡착된 상태로 제공되어 검체 전개 시 반응 패드 상에서 검체 중의 펩신과 반응할 수 있다. 그러나 이는 키트를 구현하는 방법에 대한 예시일 뿐, 본 발명의 범주는 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 면역 크로마토그래피의 원리를 적용하되 펩신의 특이적인 펩타이드 분해능을 이용하여 항체를 포함하지 않는 진단용 키트를 구성할 수 있도록, i) 타액 내 다른 효소에 의해 분해되지 않고, 펩신에 의해 특이적으로 분해되며, ii) 용액 상인 검체와 함께 반응 및 모세관 현상에 의해 분석 스트립을 통해 이동할 수 있도록 수가용성을 나타낼 수 있는, 적정한 길이의 특정 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 발굴한 것이 특징이다. 나아가, 상기 아미노산 서열의 일말단에 표지 물질을 도입하고, 분해된 2개 단편에 각각 상이한 리간드를 도입하여 표지 물질이 결합된 단편은 검사선에, 분해된 다른 단편 및 분해되지 않은 펩타이드는 대조선에 결합되도록 각각에 상응하는 리간드로 검사선과 대조선을 형성함으로써 역류성 인후두염 진단에 활용할 수 있다.
종래 래피드 테스트(rapid test)에 사용되는 면역 크로마토그래피는 항원-항체반응에 기초한 면역반응 원리와 검체 및 시약이 이동상에 의해 매질을 따라 이동하는 크로마토그래피 원리를 결합시킨 분석방법이다. 본 발명은 이중 검체 및 시약이 이동상에 의해 매질을 따라 이동하는 크로마토그래피 원리를 이용하되, 생산이 어렵고 변성되기 쉬워 장기간 보관성이 떨어지는 항체의 사용을 피하기 위하여, 항원-항체의 반응 대신에 특이적인 리간드 간의 결합을 이용할 수 있도록 고안된 것이다. 구체적으로, 본 발명은 역류성 인후두염을 진단하기 위한 방법으로 타액 중 펩신을 검출함에 있어서, 펩신의 단백질 분해능을 이용한다. 예컨대, 펩신은 단백질을 분해함에 있어서, 아미노산 서열의 무작위적 위치에서 절단하는 것이 아니라 연속한 소수성 펩타이드 사이의 결합을 우선적으로 분해한다. 이에, 본 발명자들은 다른 단백질 분해 효소나 타액 내 효소들에 비해 펩신에 의해 특이적으로 분해되는 아미노산 서열로 구성된 펩타이드를 발굴하였다. 또한, 전술한 바와 같이, 리간드 간의 특이적인 결합에 의해 이러한 현상을 검출할 수 있도록, 본 발명은 상기 펩타이드가 절단되어 형성되는 2개 단편에 서로 상이한 리간드들을 각각 도입하고, 이들 각각의 리간드와 특이적으로 결합하는 리간드들을 이용하여 검사선 및 대조선을 형성함으로써 펩타이드의 분해 여부를 확인할 수 있도록 키트를 구성한 것이 특징이다.
본 발명의 용어 "표지 물질"은 육안으로 또는 센서를 이용하여 감지할 수 있는 신호를 발생시키는 물질을 의미한다. 상기 표지 물질로는 라텍스 입자, 금 입자, 유색 폴리스티렌 미세입자, 효소, 형광성 염료, 전도성 고분자, 또는 자성입자 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한 상기 신호는 발광 등과 같이 표지 물질의 내재적 특성에 의해 자체적으로 발생할 수 있는 것이거나, 형광 등과 같이 외부의 자극에 의해 발생하는 것일 수 있다.
본 발명의 용어 "리간드"는 서로 특이적으로 결합하는 물질을 의미한다. 예를 들어, 항원에 대해 특이적으로 결합하는 항체, 특정 수용체에 특이적으로 결합하는 리간드, 서로 특이적으로 혼성화하는 상보적인 서열의 DNA 쌍 등이 서로 리간드로 작용한다. 이외에도 본 발명에서 리간드는 상기 정의된 특성을 나타내는 물질이면 제한없이 사용될 수 있다. 본 명세서 전반에서 사용된 리간드의 의미는 특정 수용체에 특이적으로 결합하는 리간드라고 구체화하여 표기되지 않는 한 상기 정의된 바와 같이 서로 특이적으로 결합하는 물질을 의미한다. 예컨대, 상기 제1리간드는 말레이미드기일 수 있고, 이때 제3리간드는 이와 특이적으로 결합하는 티올기를 포함하는 물질 예컨대, 티올기를 갖는 시스테인이 포함된 바이오틴일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예컨대, 상기 제2리간드는 바이오틴일 수 있고, 이때 제4리간드는 이와 특이적으로 결합하는 스트렙타비딘일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 제1리간드와 제3리간드 및 제2리간드와 제4리간드 쌍의 다른 예로는 히스티딘과 니켈의 선택적 결합을 가능하게 하는 물질을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 제1리간드 및 이와 특이적으로 결합하는 제3리간드 쌍의 다른 예는 서로 상보적인 결합에 의해 혼성화하여 이중가닥 DNA를 형성할 수 있는 단일가닥 DNA 쌍일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 검사선은 검체 패드에 함유된 펩타이드가 펩신에 의해 분해되어 형성되는 표지 물질 및 제1리간드가 결합된 단편을 선택적으로 포획함으로써 펩신에 의한 분해 반응의 유무 즉, 검체 중 펩신의 존재 여부를 확인하기 위하여 형성된 것으로, 이와 같은 선택적 포획을 위해 상기 제1리간드와 특이적으로 결합하는 제3리간드를 포함하도록 구성할 수 있다.
한편, 상기 대조선은 상기 검체 패드에 함유된 펩타이드의 펩신과의 반응 후 분해된 펩타이드 단편 중 표지 물질을 포함하지 않는 타측 단편을 및/또는 미반응 펩타이드 즉, 분해되지 않은 펩타이드를 포획하기 위하여 형성된 것으로, 이와 같은 포획을 위하여, 상기 펩타이드의 표지 물질이 결합된 타측의 말단은 제2리간드가 결합되며, 대조선은 이와 특이적으로 결합할 수 있는 제4리간드를 포함하도록 구성될 수 있다. 상기 대조선은 키트의 정상적인 작동 여부를 판단하는 기준이 될 수 있다. 구체적인 작동 원리는 후술한다.
상기 펩신에 의해 특이적으로 분해되는 펩타이드는 알라닌, 발린, 루신, 이소루신, 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판으로 구성된 군으로부터 선택되는, 연속적으로 위치한, 2개의 소수성 아미노산을 포함할 수 있다. 상기 2개 아미노산은 서로 동일하거나 상이할 수 있다. 상기 2개 소수성 아미노산으로 구성된 부분을 포함함으로써 펩신에 대한 절단 자리(cleavage site)를 제공할 수 있다. 나아가, 용액 상으로의 전개를 위하여, 극성의 및/또는 양 또는 음으로 하전된 아미노산들을 추가로 포함할 수 있으며, 상기 펩타이드는 예컨대, 총 5 내지 20개 아미노산으로, 구체적으로, 10 내지 15개 아미노산으로 구성될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예컨대, 상기 펩신에 의해 특이적으로 분해되는 펩타이드는, 펩신에 의한 절단 자리로서 -FL-을 포함하는, 서열번호 1의 아미노산 서열, 즉 GD FL MGRDMRK, 서열번호 2의 아미노산 서열, 즉 GD FL GGRDARK, 또는 서열번호 3의 아미노산 서열, 즉 CGD FL MGRDMRK로 표시되는 서열의 펩타이드일 수 있다.
예컨대, 본 발명의 진단용 키트는, 전술한 바와 같이, 검체 패드 및/또는 반응 패드를 추가로 포함할 수 있다. 이때, 반응 패드에 펩타이드를 포함하는 경우, 상기 펩타이드가 검체와 충분히 반응할 수 있도록 검체의 흐름을 지연시키기 위한 흐름통제 분리막, 펩신에 의한 분해 반응 속도를 향상시키기 위한 발열판 또는 둘 모두를 반응 패드에 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 흐름통제 분리막은 멤브레인 사이에 비닐 등의 재질을 추가하여 이에 의해 액상 검체의 흐름을 억제 또는 차단시켰다가 이를 제거시 멤브레인을 통해 다시 흐를 수 있도록 하는 것이 대표적인 예이며, 이외에 소수성 또는 초소수성 표면 처리를 통해 멤브레인 상에서 액상 검체의 흐름을 방해 또는 지연시켜 조절하거나, 멤브레인 상에 유체가 흐르는 채널을 추가로 구성하여 채널의 폭이나 수를 조절하는 방식으로도 구현될 수 있다.
한편, 발열판은 제작 단가를 고려하여 화학 반응을 이용한 발열판을 구성할 수 있다. 이때 손난로 등에 사용되는 화학물질, 예컨대, 아세트산나트륨 또는 티오황산나트륨과 금속판을 이용하여 구현할 수 있다. 다른 예로는 저렴한 전기식 발열필름을 구비할 수 있으며, 이는 고른 발열특성을 갖는 그래핀 발열필름을 이용하여 구현할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이들 흐름통제 분리막 및 발열판은 모두 반응 패드 하단에 구비되어 반응시간 및/또는 반응 온도를 조절함으로써 펩신에 의한 펩타이드 분해 반응을 촉진시켜 효율적인 반응 및/또는 민감한 검출이 이루어지도록 도울 수 있다.
본 발명의 진단용 키트에 사용하는 상기 액상 검체는 타액을 함유할 수 있다. 예컨대, 상기 액상 검체는 농도 및/또는 점도를 조절하고 유동성을 부여하기 위하여 완충액에 타액을 희석시킨 용액을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 진단용 키트는 매질을 따라 분석물질을 포함하는 이동상이 이동하는 크로마토그래피의 원리를 이용한다. 따라서, 이를 이용한 분석을 위해서는 분석물질을 포함하는 검체를 스트립을 따라 이동시키기 위한 이동상을 필요로 한다. 상기 완충액은 분석 스트립을 따라 검체를 이동시키는 이동상(mobile phase)으로서 작용할 뿐만 아니라, 필요에 따라서는 검체를 희석시키기 위한 희석액으로서의 역할도 겸할 수 있다. 예컨대, 상기 완충액으로는 10 mM 내지 1 M 농도의 인산염 완충액(phophate buffered solution; PBS), 비이온성 또는 양쪽성 계면활성제, 메탄올, 또는 이들의 혼합물 등 통상의 완충액을 제한없이 사용할 수 있다. 또한, 펩신의 분해 반응에 적합한 조건을 제공할 수 있도록 pH 조절제 또는 구연산을 추가로 포함할 수 있다. 구체적으로, 메탄올과 0.1 M 구연산 용액을 각각 5부피%와 95부피%로 혼합한 용액을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이에, 본 발명의 진단용 키트는 검체의 희석 및/또는 스트립 상에서 전개를 위한 이동상으로서 완충액과 함께 제공될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 진단용 키트는 흡습 패드를 구비하여, 액상 검체가 도입되는 검체 패드로부터 펩신에 의해 특이적으로 분해되는 펩타이드를 포함하는 반응 패드를 지나, 검사선 및 대조선이 구비된 멤브레인 패드로 검체가 이송될 수 있도록 구동력을 제공할 수 있다.
이와 같은 검체의 전개를 위하여, 상기 일련의 패드는 멤브레인 패드를 이용하여 형성함으로써 모세관 현상에 의해 이동할 수 있도록 하였고, 이의 일 말단에는 검체 이송을 위한 구동력을 제공하기 위하여 흡습패드를 구비하였다. 상기 흡습패드는 멤브레인 패드에 일부 중첩되어 위치할 수 있다. 상기 멤브레인으로는 니트로셀룰로스 멤브레인(nitrocellulose membrane), 유리섬유(glass fiber) 멤브레인, 폴리에테르술폰(polyethersulfone; PES) 멤브레인, 셀룰로스(cellulose) 멤브레인, 나일론(nylon) 멤브레인 또는 이들의 조합을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 진단용 키트는 추가적으로 하부에 고체 지지대를 포함하여 제조할 수 있다. 이러한 고체 지지대로는 플라스틱 재질의 지지대를 이용할 수 있으며, 이와 같이 고체 지지대 상에 키트를 부착하여 제조함으로 내구성을 높일 수 있고, 취급 및 보관을 용이하게 할 수 있다. 또한, 추가적인 외부 케이스 장착을 용이하게 할 수 있다. 상기 고체 지지대로 사용될 수 있는 플라스틱 재질로는 폴리프로필렌(polypropylene) 필름, 폴리에스테르(polyester) 필름, 폴리카보네이트(polycarbonate) 필름, 아크릴(acrylic) 필름 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 진단용 키트는 추가적으로 케이스 내에 고정될 수 있다. 하부 케이스의 내부에는 상기 진단용 키트를 적절한 위치에 배치시키고 고정 또는 압착시키기 위한 다수의 가이드 및/또는 키트 지지부가 구비될 수 있다. 선택적으로 하부 케이스에 구비된 가이드 및 키트 지지부에 대응되는 위치에 가이드 및 키트 지지부가 상부 케이스에도 구비된 것일 수 있다. 즉, 상기 가이드 및/또는 키트 지지부는 필요에 따라 하부 케이스에 형성되거나, 또는 상부 케이스 및 하부 케이스 모두에 형성될 수 있다. 또한, 상부 케이스에는 검체 투입구 및 검사선에 상응하는 위치에 표지 물질로부터의 신호를 검출하기 위한 결과 확인창을 구비할 수 있다. 상기 검체 투입구는 멤브레인 패드의 일 말단에 즉, 검사선을 기준으로 흡습 패드가 위치한 반대편 말단에 검사선과 검체가 멤브레인 패드를 따라 전개될 수 있도록 충분히 이격된 지점에 홀 또는 슬릿 등의 형태로 형성될 수 있다. 상기 결과 확인창은 멤브레인 패드 상에 검사선이 위치한 지점 및/또는 경우에 따라서 추가적으로 대조선이 형성되어 있는 경우 대조선까지 포함하여 외부로부터 육안으로 또는 센서를 통해 식별 가능하기에 충분한 크기로 형성될 수 있다. 상기 검사선 및/또는 대조선을 확인할 수 있는 한 그 크기 및 모양은 제한없이 형성될 수 있다.
상기 상부 및 하부 케이스는 통상의 플라스틱 소재를 이용하여 제조될 수 있으며, 예를 들어 폴리카보네이트, 아크릴로니트릴부타디엔스티렌(acrylonitrile butadiene styrene; ABS) 등의 소재가 이용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 상부 및 하부 케이스는 별도로 제작하여 결합 홈, 결합 돌기 등을 구비하여 통상의 수단으로 결합될 수 있고, 경우에 따라서는 일체형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 제2양태는 역류성 인후두염의 발병이 의심되는 개체로부터 수집한 타액을, 제1양태의 키트의 멤브레인 패드에 투입하여 검사선 및 대조선을 지나도록 흡습 패드 방향으로 전개시키는 제1단계; 검사선 및 대조선에서 표지 물질에 의한 신호를 확인하는 제2단계; 및 역류성 인후두염에 대해 검사선 및 대조선에서 신호가 검출되는 경우에 양성으로, 대조선에서만 신호가 검출되는 경우에 음성으로 판단하는 제3단계를 포함하는, 역류성 인후두염 진단을 위한 정보제공 방법을 제공한다.
예컨대, 본 발명의 진단용 키트에서 대조선은 반응 패드에 포함되어 액상 검체 투입시 유체 흐름에 따라 흡습 패드를 향해 이동하는 펩신에 의해 특이적으로 분해되는 펩타이드의 표지 물질이 결합되지 않은 타측 말단에 결합된 제2리간드와 특이적으로 결합하는 제4리간드를 포함하여 상기 검사선과 일정 거리만큼 이격되어 평행하게 형성된 것으로, 상기 제2리간드가 결합된, 펩신에 의해 분해된 펩타이드 단편 및 분해되지 않은 펩타이드가 결합하는 자리로서, 흡습 패드에 충분한 양의 펩타이드를 포함하는 한, 미분해 펩타이드의 결합에 의해 대조선은 표지 물질의 신호를 방출하게 된다. 따라서, 상기 제3단계에서 대조선으로부터 신호가 검출되지 않는다면 진단이 유효하지 않은 것으로 판단할 수 있다. 이는 키트 자체가 불량이거나, 예컨대, 흡습 패드에 함유된 펩타이드의 양이 충분하지 않거나, 액상 검체의 흐름이 원활하지 못하거나, 검체 중의 펩신 농도가 너무 높은 경우 이러한 발생할 수 있다.
본 발명의 제3양태는 알라닌, 발린, 루신, 이소루신, 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판으로 구성된 군으로부터 선택되는 2개의 소수성 아미노산이 연속적으로 위치하고, 상기 연속적으로 위치한 소수성 아미노산의 양말단에 각각 2 내지 10개의 아미노산이 추가된 일련의 펩타이드를 제조하는 제1단계; 및 상기 제1단계로부터 제조된 일련의 펩타이드를 펩신, 트립신, 아밀라아제, 라이소자임 또는 뮤신과 접촉시키고, 각 효소에 의한 분해여부를 확인하는 제2단계를 포함하는, 펩신에 의해 특이적으로 분해되는 펩타이드의 제조방법을 제공한다.
제2단계에서 효소에 의한 분해여부 확인을 용이하게 하기 위하여, 상기 펩타이드의 일말단에 표지 물질을 도입할 수 있다. 한편, 절단된 2개 단편의 분리를 용이하게 하기 위하여, 상기 펩타이드는 소정의 입자에 결합될 수 있고, 상기 입자에 의한 중량 차이를 이용하여 원심분리하는 간단한 방법으로 절단된 2개 단편을 각각으로부터 분리할 수 있다. 이때, 상기 표지 물질과 입자가 각각 다른 단편에 위치하도록 고안함으로써, 어느 한쪽의 회수된 단편에 대해 상기 표지 물질의 신호를 측정하고, 그 변화를 관찰하여 각 효소에 의한 펩타이드의 절단 여부 및/또는 정도를 확인할 수 있다. 다만, 이는 제2단계를 수행하기 위한 하나의 예시일 뿐, 본 발명의 범주가 이에 제한되는 것은 아니며, 상기 제2단계는 당업계에 공지된 다양한 방법을 적용하여 수행할 수 있다.
예컨대, 상기 펩타이드는, 용액 상으로의 전개를 위하여, 수가용성이도록 고안된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드일 수 있다. 구체적으로, 펩신에 의한 절단자리를 제공하는 상기 2개의 연속적으로 위치한 소수성 아미노산 이외의 자리에 극성의 및/또는 양 또는 음으로 하전된 아미노산들을 추가로 포함할 수 있으며, 상기 펩타이드는 예컨대, 총 5 내지 20개 아미노산으로, 구체적으로, 10 내지 15개 아미노산으로 구성될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
나아가, 상기 펩타이드는 역류성 인후두염 진단용 키트에 사용될 수 있다. 이를 위하여, 상기 펩타이드의 양말단 및 서열의 중간에는 적절한 표지 물질 및/또는 하나 이상의 리간드가 도입될 수 있다.
본 발명의 제4양태는 GD FL MGRDMRK(서열번호 1), GD FL GGRDARK(서열번호 2) 또는 CGD FL MGRDMRK(서열번호 3)의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 제공한다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 펩타이드는 펩신에 의해 특이적으로 분해되도록 고안된 서열을 갖는 것으로, 펩신에 의해서만 분해되며, 단백질 분해효소인 트립신, 또는 타액 내 존재하는 효소인 아밀라아제, 라이소자임 또는 뮤신에 의해서는 분해되지 않는다. 이는 상기 서열의 펩타이드를 이용함으로써 검체로 사용되는 타액 중에 포함된 다른 효소에 의한 영향 없이 펩신을 정성 및/또는 정량적으로 검출할 수 있음을 시사한다.
구체적으로, 본 발명의 펩타이드는 펩신에 의해 분해되어 GD(서열번호 4) 및 MGRDMRK(서열번호 5), GD(서열번호 4) 및 GGRDARK(서열번호 6), 또는 CGD(서열번호 7) 및 MGRDMRK(서열번호 5)의 2개 단편으로 절단될 수 있다.
본 발명의 신규한 아미노산 서열의 펩타이드는 다른 단백질 분해 효소나 타액 중의 효소에 의해서는 거의 분해되지 않고 펩신에 의해서만 특이적으로 분해되므로, 역류성 인후두염 진단에 유용하게 사용될 수 있다. 한편, 상기 펩타이드의 펩신에 의한 특이적인 분해를 이용하여, 항체 대신에 펩타이드를 이용하는 진단용 키트를 구성함으로써 경제적이며, 장기간 보관에 유리한 역류성 인후두염 진단용 키트를 제공할 수 있다.
도 1은 통상적인 면역 크로마토그래피 분석에 사용되는 분석 스트립의 단면을 개략적으로 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명에 따른 펩타이드 기반 역류성 인후두염 진단용 스트립의 작동 원리를 개략적으로 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명에 따른 펩신 특이적으로 분해되는 아미노산 서열의 펩타이드, 이를 이용한 펩신 검출 원리 및 반응 시간에 따른 분해율을 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명에 따른 펩신 특이적으로 분해되는 아미노산 서열에 대한 펩신 농도에 따른 분해능을 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명에 따른 아미노산 서열의 타 효소 대비 펩신 특이적 분해를 나타낸 도이다.
도 6은 (A) 본 발명에 따른 펩신 특이적으로 분해되는 아미노산 서열의 펩타이드, 비색표지자로서 금 나노입자 및 금 펩신에 의해 분해된 펩타이드 단편과의 선택적 포획을 위한 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 펩신 검출용 복합체 및 (B) 상기 복합체의 펩신 특이적 분해능을 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명에 따른 펩신 특이적으로 분해되는 펩타이드가 펩신에 의해 분해된 경우 특정 단편을 선택적으로 검출하기 위한 (A) 말레이미드로 기능화된 펩신 특이적 펩타이드의 구조, (B) 상기 펩타이드의 기능화에 따른 특이적 결합력 및 (C) 상기 선택적 결합을 위한 pH의 최적화를 나타낸 도이다.
도 8은 본 발명에 따른 면역크로마토그래피을 이용하는 분석 스트립에 의한 펩신 검출을 나타낸 도이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 펩타이드의 합성 및 분리
원하는 임의 서열의 펩타이드를 합성하기 위하여, 일반적인 펩타이드 고상 합성법(Wang C. Chan and Peter D. White, Fmoc Solid phase peptide synthesis, Oxiford 참조)에 따라 수행하였다. 구체적으로, 자동합성기(ASP48S, Peptron, Inc.)를 사용하여 Fmoc-SPPS(9-Fluorenyl methyl oxycarbonyl solid phase peptide synthesis) 방법으로 C-말단으로부터 아미노산 단량체를 하나씩 커플링(coupling)하였다. 펩타이드 합성에 사용한 모든 단량체 원료는 N-말단이 Fmoc으로 보호되고, 잔기는 트리틸(Trt), t-부틸옥시카보닐(Boc), t-부틸(t-Bu) 등으로 보호된 아미노산을 사용하였다. 커플링제(coupling reagent)로는 HBTU(2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate/HOBt(hydroxybenzotriazole)/NMM(N-methylmorpholine)을 사용하였다.
보호된 아미노산(8당량)과 커플링제 HBTU(8당량)/NMM(16당량)을 DMF(dimethyl formamide)에 용해시켜 첨가한 후, 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 이후 Fmoc를 제거하기 위하여, 20%(v/v) 피페리딘/DMF를 첨가하여 상온에서 5분 동안 2회 반응시켰다. 상기 2개 반응을 반복하여 원하는 서열의 펩타이드를 제조하였다.
이후, 레진(resin) 및 아미노산 보호기에서의 펩타이드 분리는 TFA(trifluoroacetic acid)/EDT(1,2-ethanedithol)/thioanisole/TIS(triisopropylsilane)/H2O(중량 기준으로 90/2.5/2.5/2.5/2.5의 비율로 혼합)을 사용하여 분리하였다. 이와 같이 준비한 혼합 용액은 냉장 보관된 디에틸에테르 용매를 과량 처리하여 침전물을 형성시키고, 원심분리하여 상기 생성된 침전물을 완전히 침전시킨 후, 과량의 TFA, EDT, thioanisole 및 TIS 등을 일차로 제거하였다. 동일한 과정을 2회 정도 반복하여 고형화된 침전물을 수득하였다.
수득한 침전물은 Ace C18 컬럼(250 mm×22 mm, 10 μm, UK)을 구비한 고성능 액체 크로마토그래피 장치(Shimadzu Prominence HPLC, Japan)를 이용하여 0.1%(v/v) TFA를 포함하는 물-아세토니트릴 선형구배(linear gradient, 아세토니크릴 농도: 10 내지 75%(v/v)) 방법으로 분리하여 정제하였다. 정제된 펩타이드의 분자량을 LC/MS(Shimadzu LC/Mass-2020, Japan)로 확인하고, 정제된 분획물을 동결건조하여 TFA 염 상태의 백색 분말 형태로 수득하였다.
실시예 2: 펩신 특이적 펩타이드의 검증
본 발명에 따른 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드의 펩신 특이적 분해를 실험적으로 확인하기 위하여, 3' 말단 K에는 바이오틴을 연결되고, 5' 말단 G에는 링커인 6-아미노헥사노익산(6-aminohexanoic acid)를 통해 형광체인 FITC가 연결된 펩타이드를 합성하고 질량분석으로 확인하였다.
FITC-(6-아미노헥사노익산)-GDFLGRDMRK(바이오틴)
- Mass Analysis
Instrument: SHIMADZU LCMS-2020
MS Expected: 2053.5
MS Found: 2053
상기와 같이 준비된, 일 말단에는 형광체인 FITC가 표지되고 다른 말단에는 바이오틴을 결합시킨 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 10 μM 농도로 준비하고, 이를 1,000 ng/mL 농도의 펩신과 반응시켰다. 상기 반응은 42℃에서 수행하였으며, 반응을 시작한 직후, 5분, 10분 및 30분 후, 표면에 스트렙타비딘이 결합된 아가로스 비드를 이용하여 바이오틴이 결합된 펩타이드 단편을 회수하였다. 회수된 펩타이드 단편으로부터 FITC의 형광을 측정하여 펩신에 의해 절단된 펩타이드의 양을 정량하였다. 펩신에 의한 분해시, 형광체 FITC가 표지된 단편은 세척에 의해 제거되므로, 형광의 감소로부터 펩신에 의해 펩타이드의 분해 정도를 확인할 수 있었다. 이에 따라 측정된 반응 시간에 따른 형광 세기를 도 3에 나타내었다. 도 3에 나타난 바와 같이, 약 30%의 펩타이드가 반응 개시 후 5분 이내에 분해되며, 30분 경과 후에는 70% 이상 분해되었음을 확인하였다.
실시예 3: 펩신 농도에 따른 펩타이드 분해능
펩신 농도에 따른 정량적인 분석 가능성을 확인하기 위하여, 펩신의 농도를 달리하면서 상기 실시예 2와 유사한 방법으로 펩타이드 분해를 측정하였다. 각각 5, 10, 20 및 40 μM 농도의 펩타이드 용액을 준비하여, 각각 250, 500, 1,000 및 2,000 ng/mL 농도의 펩신 용액과 상온에서 5분 동안 반응시킨 후 잔존하는 펩타이드 양을 산출하여 도 4에 나타내었다. 이중 펩신 농도에 따라 선형적 변화를 나타낸 10 μM 농도의 펩타이드를 다시 0, 10, 50, 100, 500 및 1,000 ng/mL 농도의 펩신 용액과 30분 동안 반응시킨 후 잔존하는 펩타이드 양을 산출하여 도 4에 함께 나타내었다. 도 4의 우측에 나타난 바와 같이, 10 μM 농도의 펩타이드를 반응시킨 경우, 0 내지 1,000 ng/mL 농도 범위에서 펩신 농도에 따른 선형적인 분해율을 나타냄을 확인하였다. 이는 해당 범위에서 형광 신호 또는 색 변화 측정을 통한 펩신 농도의 정량적 분석이 가능함을 나타내는 것이다.
실시예 4: 효소의 종류에 따른 펩타이드 분해율
본 발명에 따라 특이적으로 고안된 펩신 특이적 펩타이드의, 펩신 이외의 다른 효소 및 기타 단백질 분해 효소에 의한 절단 가능성을 확인하기 위하여, 펩신(1.5 유닛, 50 ng)을 대신하여, 트립신(1.5 유닛, 1500 ng), 아밀라아제(1.5 유닛, 5000 ng), 라이소자임(1.5 유닛, 150 ng) 및 뮤신(1000 ng)을 각각 5분 및 1시간 동안 반응시킨 후, 실시예 1과 유사한 방법으로, 형광세기 변화를 측정하고, 그 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에 나타난 바와 같이, 아가로스 비드 자체(resin)는 전혀 형광을 발생시키지 않았으며, 아무런 효소를 처리하지 않은 펩타이드 자체(PEP-Only)의 형광 신호에 비해 펩신으로 처리한 경우, 5분 이내의 반응에도 형광 세기는 5% 미만까지 감소하였으나, 기타 다른 효소를 처리한 경우에는 5분 이내에 15% 이내의 감소만을, 1시간까지 경과하여도 최대 35% 정도의 감소를 나타내었다. 이는 본 발명에 따라 고안된 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드는 펩신에 의해 특이적으로 분해되는 서열이므로, 해당 서열을 이용하면 다른 서열의 간섭없이 검체 중의 펩신을 정성 및 정량적으로 검출할 수 있음을 나타내는 것이다.
실시예 5: 펩신에 의해 분해된 펩타이드 단편의 선택적 결합을 위한 올리고뉴클레오타이드 -펩타이드 복합체의 제조 및 이의 펩신에 의한 특이적 분해 성능 평가
본 발명에 따라 고안된 펩신 특이적 펩타이드의 펩신에 의해 분해된 단편을 선택적으로 검출하기 위한 방법으로서 상보적인 DNA의 혼성화를 이용하기 위하여, 일 말단에 올리고뉴클레오타이드가 결합된, 펩신 특이적 펩타이드 복합체를 합성 후 결합(post-synthetic coupling) 방법을 이용하여 제조하였다. 펩신 특이적 펩타이드로는 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 이용하였다.
단계 1: 먼저, 서열의 G/C 함량, 헤어핀, 자기 이량체(self-dimer) 등의 2차 구조를 고려하여, OligoAnalyzer 3.1 프로그램(IDT, Inc.)을 이용하여 사전검증한 후, 그 결과를 반영하여 올리고뉴클레오티드를 제작하였다. 올리고뉴클레오타이드의 길이는 21mer로 설정하고, 5' 말단에는 티올기를, 3' 말단에는 말레이미드기를 도입하였다. 합성된 양 말단에 작용기를 갖는 올리고뉴클레오타이드는 PAGE(polyacrylamide gel electrophoresis)로 정제하고, MALDI-TOF QC로 정제된 정도를 확인하였다. 제작된 올리고뉴클레오타이드 서열은 5'-[티오C6]-AAg gAg ggg gAg AAg TgA ggT-[말레이미드]-3'(서열번호 8)로서, 비색표지자인 금 나노입자에 결합하기 위한 작용기로 5' 말단에 티올기를 포함하며, 3' 말단의 말레이미드기를 통해 펩신 특이적 펩타이드의 C 말단과 결합할 수 있도록 고안되었다.
단계 2: 다음으로, 상기 단계 1로부터 수득한 양말단에 작용기를 갖는 올리고뉴클레오타이드를 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드와 결합시키기 위하여, 이들 올리고뉴클레오타이드와 펩타이드를 1:2의 농도로 중성 조건(100 mM KH2PO4, pH 7.2)에서 4시간 이상 상온에서 반응시켰다. 수득한 올리고뉴클레오타이드와 펩타이드의 컨쥬게이트는 10% TBE-우레아 폴리아크릴아미드 젤에 전기영동하고 메틸렌블루로 올리고뉴클레오타이드를 염색하여 밴드를 젤 상에서 상기 컨쥬게이션 밴드의 위치를 확인하였다. 이를 토대로 상기 밴드를 젤로부터 잘라내어 Crush and Soak 기법으로 컨쥬게이션을 추출하였다. 나노드롭으로 추출된 올리고뉴클레오타이드-펩타이드 컨쥬게이트의 농도를 산출하였다.
단계 3: 마지막으로, 상기 단계 2로부터 수득한 올리고뉴클레오타이드-펩타이드 컨쥬게이트 중의 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단에 포함된 이황결합(-S-S-)을 TCEP(tris(2-chloroethyl)phosphate) 환원 비드(reducing bead)로 티올기(-SH)로 환원시켜 비색표지자인 금 나노입자를 결합시켰다(도 6(A)).
본 발명에 따라 특이적으로 고안된 올리고뉴클레오타이드-펩타이드 복합체가 펩신에 의해 특이적으로 분해되는지 여부를 확인하기 위하여, 상기 단계 1 내지 3에 따라 제조한 금 나노입자가 도입된 올리고뉴클레오타이드-펩타이드 복합체를 2,000 ng/mL 농도의 펩신과 반응시켰다. 상기 반응은 42℃에서 30분 동안 수행하였으며, 반응을 완료한 후, 표면에 스트렙타비딘이 결합된 아가로스 비드를 이용하여 원심분리에 의해 바이오틴이 결합된 펩타이드 단편을 제거하였다. 이후 상층액의 흡광도를 측정하여 금 나노입자를 정량함으로써 펩신에 의한 분해 성능을 평가하였다. 구체적으로, 상기 금 나노입자가 도입된 올리고뉴클레오타이드-펩타이드 복합체는 일 말단에는 금 나노입자를, 타측 말단에는 바이오틴을 포함하는 바, 이를 펩신과 반응시킨 후, 스트렙타비딘이 결합된 아가로스 비드와 접촉시킨 후 원심분리하면, 일 말단에 바이오틴을 포함하는, 분해되지 않은 올리고뉴클레오타이드-펩타이드 복합체 및 펩신에 의해 분해된 복합체 중 금 나노입자를 포함하지 않는 타측 단편이 비드에 결합되어 침전되고 상층액은 펩신에 의해 분해된 복합체 중 금 나노입자를 포함하는 단편만을 포함하므로 회수한 상층액의 흡광도를 측정하여 금 나노입자를 정량함으로써 펩신에 의한 펩타이드의 분해 정도를 산출할 수 있었다. 즉, 상층액에서 측정된 흡광도가 높은 것은 펩신에 의해 보다 많은 양의 펩타이드가 분해된 것을 나타내는 것이다.
실시예 6: 펩신 검출을 위한 현장진단용 스트립 구현을 위한 리간드로의 펩타이드 기능화 및 상기 리간드에 의한 선택적 결합의 실험적 검증
본 발명에 따라 고안된 펩신 특이적 펩타이드를 이용하여 실제 현장진단에 사용가능한 진단 스트립을 구현하기 위하여, 펩신에 의해 분해된 펩타이드의 비색표지자를 포함하는 단편을 검사선 상에서 확인할 수 있도록 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드의 비색표지자가 결합된 측면에 리간드로서 말레이미드기를 도입하였다. 또한, 형광뿐 아니라 육안으로도 색상 변화를 확인할 수 있는 TAMRA를 비색표지자로서 도입하였다. 이와 같이 합성된 펩타이드를 하기와 같이 분리 동정하였다:
TAMRA-MiniPEG2-K(4-maleimidobutyryl)-MiniPEG2-GDFLGGRDARK(biotin);
Rt=5.40분, 0.01%(v/v) TFA 함유 5%(v/v) 내지 100%(v/v) DW/아세토니트릴로부터 20분에 걸친 다양한 농도구배;
MS(ESI) 2412.96 m/e, [M+H]+=2413.
상기와 같이 합성하여 동정한 말레이미드로 기능화된 펩타이드를 이용하여, 펩신에 의한 절단시, 상기 말레이미드에 의해 이를 포함하는 펩타이드 단편의 선택적인 검출이 가능한지 확인하기 위하여, 티올기를 갖는 시스테인이 포함된 바이오틴(CK-Biotin) 용액을 이용하여 하기와 같이 실험하였다. 먼저, 10 μM 농도의 펩타이드를 2,000 ng/mL 펩신 용액과 42℃에서 30분 동안 반응시킨 후, 바이오틴이 결합된 펩타이드 단편을 제거하였다. 그 후, TAMRA와 말레이미드기를 포함하는 펩타이드 단편을 함유하는 상층액(pH 3 내지 4)에, 티올기를 갖는 시스테인이 포함된 바이오틴 용액(2 mM CK-Biotin)을 첨가하고 상온에서 20분 동안 유지하여 말레이미드기를 통해 CK-Biotin과 결합하도록 반응시켰다. 말레이미드기에 결합된 CK-Biotin을 스트렙타비딘이 결합된 아가로스 비드로 수거한 후, 남아있는 상층액의 형광을 측정하여 말레이미드기와 CK-Biotin의 결합을 정량적으로 분석하고, 그 결과를 도 7(B)에 나타내었다. 이때, 사용된 말레이미드로 기능화된 펩신 특이적 펩타이드의 구조를 도식화하여 도 7(A)에 함께 나타내었다. 도 7(B)에 나타난 바와 같이, CK-Biotin과 결합된 펩타이드 단편이 제거된 상층액으로부터는 형광이 거의 나타나지 않았다(CK-Biotin 결합전 측정된 형광에 대해 약 6.2% 수준). 이는 펩신에 의해 분해된 펩타이드 단편이 이에 기능화된 말레이미드기를 통해 CK-Biotin과 효과적으로 결합하였음을 나타내는 것이다.
한편, 펩신에 의해 분해되지 않은, 기능화된 펩타이드의 CK-Biotin과의 결합에 따른 위양성 신호에 의한 측정 오류를 최소화하기 위하여, 반응 조건을 변화시키면서 펩신에 의해 분해되지 않은, 기능화된 펩타이드와 CK-Biotin의 결합력을 확인하였다. 먼저, 전술한 바와 같이, 10 μM 농도의 말레이미드로 기능화된 펩타이드를 스트렙타비딘이 결합된 아가로스 비드와 상온에서 10분 동안 반응시켜 결합시켰다. 이후 말레이미드기와 결합 가능한 CK-Biotin 용액을 첨가하여 추가로 반응시켰다. 이때, 반응 용액의 pH를 각각 2(0.2 M 시트르산 용액), 4(1× PBX) 및 7(1× PBX)로 조절하여 상온에서 10분 동안 반응을 수행한 후, 스트렙타비딘이 결합된 아가로스 비드를 회수한 후, 회수한 비드의 형광을 측정하여 결합정도를 확인하고, 그 결과를 도 7(C)에 나타내었다. 도 7(C)에 나타난 바와 같이, pH에 따라 말레이미드기와 CK-Biotin의 결합 정도는 상이하게 나타났으며, pH 7에서 약 31%로부터 pH 2에서 약 7%까지 말레이미드와 CK-Biotin의 결합력인 pH 의존적으로 감소하는 것으로 나타났다. 이는 낮은 pH에서 CK-Biotin과의 반응을 수행함으로써 펩신에 의해 분해된 펩타이드 단편만을 선택적으로 검출할 수 있음을 나타내는 것이며, 진단을 위한 검체로서 타액 수집 시 pH 2의 구연산 용액을 이용하는 것을 고려할 때, 수집된 타액을 별도의 처리 없이 직접 진단에 사용할 수 있음을 시사하는 것이다.
실시예 7: 펩신 검출을 위한 현장진단용 스트립
상기 본 발명의 실시예 6에 따라 기능화된, 양 말단이 기능화된 펩신 특이적 펩타이드를 포함하여 구성한 진단 스트립을 이용하여 검체 중 펩신 유무를 검출할 수 있는지 확인하기 위하여, 니트로셀룰로스 멤브레인에 티올기를 갖는 시스테인이 포함된 바이오틴을 검사선에, 스트렙타비딘을 대조선에 고정시켜 펩신 검출용 스트립을 간략히 구성하였다.
먼저, 일 말단에는 형광체이자 육안으로 식별 가능한 붉은 색을 나타내는 TAMRA가 표지되고 말레이미드기가 도입되며, 다른 말단에는 바이오틴을 결합시킨, 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 2 mM 농도로 준비하였다. 비교군으로는 펩신과 반응시키지 않은 그대로 상기 스트립에 흘려주었다. 실험군은 상기와 같이 양 말단을 수식한 펩타이드를 60 μg/mL 농도의 펩신과 반응시킨 후, 새로운 스트립에 흘려주었다. 상기 비교군 및 실험군의 스트립을 육안으로 비교 관찰하고, 그 결과를 도 6(A) 및 (B)에 각각 나타내었다. 도 6에 나타난 바와 같이, 펩신과 반응시키지 않은 비교군의 경우 대조선 영역에서만 붉은 색으로 변하였으나(도 6(A)), 펩신과 반응시켜 전개한 실험군의 경우 검사선 및 대조선이 모두 붉은 색으로 변한 것을 확인할 수 있었다. 이는 본 발명에 따라 고안된 펩신 특이적 펩타이드가 전술한 구성의 스트립과 함께 검체 중 펩신의 유무를 검출하는 데 사용될 수 있음을 나타내는 것이다.
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Claims (14)

  1. 일말단에는 표지 물질 및 제1리간드가, 다른 말단에는 제2리간드가 결합된, 펩신에 의해 특이적으로 분해되는 펩타이드; 및
    상기 제1리간드와 특이적으로 결합하는 제3리간드를 포함하여 유체의 흐름과 수직인 방향으로 소정의 폭을 갖도록 형성된 검사선(test line) 및 상기 제2리간드와 특이적으로 결합하는 제4리간드를 포함하여 상기 검사선과 일정 거리만큼 이격되어 평행하게 형성된 대조선(control line)을 포함하는 멤브레인 패드(membrane pad), 및 액상 검체를 최종적으로 수용하는 흡습 패드(absorption pad)로 구성되며, 상기 멤브레인 패드 및 흡습 패드가 일부 중첩된 형태로 연결된 면역크로마토그래피용 스트립을 포함하는 역류성 인후두염 진단용 키트로서,
    상기 제1리간드와 제2리간드, 및 제3리간드와 제4리간드는 서로 상이하며, 제1리간드와 제4리간드 및 제2리간드와 제3리간드는 서로 결합하지 않도록 선택된 것인 키트.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 펩신에 의해 특이적으로 분해되는 펩타이드는 알라닌, 발린, 루신, 이소루신, 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판으로 구성된 군으로부터 선택되는, 연속적으로 위치한, 2개의 소수성 아미노산을 포함하는 것인 키트.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 펩신에 의해 특이적으로 분해되는 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 것인 키트.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 면역크로마토그래피용 스트립은 검체 패드(sample pad), 반응 패드(reaction pad) 또는 둘 모두를 추가로 포함하는 것인 키트.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 반응 패드는 흐름통제 분리막, 발열판 또는 둘 모두를 추가로 포함하는 것인 키트.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 액상 검체는 타액을 함유하는 것인 키트.
  7. 역류성 인후두염의 발병이 의심되는 개체로부터 수집한 타액을, 청구항 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 키트의 멤브레인 패드에 투입하여 검사선 및 대조선을 지나도록 흡습 패드 방향으로 전개시키는 제1단계;
    검사선 및 대조선에서 표지 물질에 의한 신호를 확인하는 제2단계; 및
    역류성 인후두염에 대해 검사선 및 대조선에서 신호가 검출되는 경우에 양성으로, 대조선에서만 신호가 검출되는 경우에 음성으로 판단하는 제3단계를 포함하는, 역류성 인후두염 진단을 위한 정보제공 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    제3단계에서 대조선으로부터 신호가 검출되지 않는 경우 진단이 유효하지 않은 것으로 판단하는 것인 정보제공 방법.
  9. 알라닌, 발린, 루신, 이소루신, 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판으로 구성된 군으로부터 선택되는 2개의 소수성 아미노산이 연속적으로 위치하고, 상기 연속적으로 위치한 소수성 아미노산의 양말단에 각각 2 내지 10개의 아미노산이 추가된 일련의 펩타이드를 제조하는 제1단계; 및
    상기 제1단계로부터 제조된 일련의 펩타이드를 펩신, 트립신, 아밀라아제, 라이소자임 또는 뮤신과 접촉시키고, 각 효소에 의한 분해여부를 확인하는 제2단계를 포함하는, 펩신에 의해 특이적으로 분해되는 펩타이드의 제조방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 펩타이드는 수가용성인 것인 제조방법.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 펩타이드는 역류성 인후두염 진단용 키트에 사용되는 것인 제조방법.
  12. GDFLMGRDMRK(서열번호 1), GDFLGGRDARK(서열번호 2) 또는 CGDFLMGRDMRK(서열번호 3)의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드.
  13. 제12항에 있어서,
    단백질 분해효소인 트립신, 또는 타액 내 존재하는 효소인 아밀라아제, 라이소자임 또는 뮤신에 의해 분해되지 않고, 펩신에 의해 특이적으로 분해되는 것인 펩타이드.
  14. 제12항에 있어서,
    펩신에 의해 각각 GD(서열번호 4) 및 MGRDMRK(서열번호 5), GD(서열번호 4) 및 GGRDARK(서열번호 6), 또는 CGD(서열번호 7) 및 MGRDMRK(서열번호 5)의 2개 단편으로 절단되는 것인 펩타이드.
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