KR20200024869A - 스캐폴드 단백질 - Google Patents

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KR20200024869A
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KR1020207002753A
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지오프 윌리엄 플랫
그레이엄 로버트 파이-스미스 스펜스
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아박타 라이프 사이언시스 리미티드
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Abstract

본 발명은 서열식별번호: 1의 아미노산 잔기 1 내지 11, 13 내지 15, 17 내지 19, 21 내지 25, 27 내지 28, 35 내지 37, 39, 41, 43 내지 44, 46 내지 47, 49 내지 50, 52 내지 53, 55 내지 58, 63 내지 64, 66, 68 내지 82, 84 내지 85, 및 87 내지 98과 적어도 80％ 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며; T51L, T51V, M65V, N32G, A59I, L38A, V20I, A40I, L38V, A12I, A12V, I16L, V20L, Q26E, E29M, T31K, N32D, N32H, T34V, T34R, T34D, T34P, A40V, Q42D, T45I, T45V, V48E, V48G, V48A, T51F, T51A, A59L, L67I, (V20I, L38A), (V20L, L38A), (V20I, L38V), (V20L, L38V), (E29K, K30E, E33K), (Y54D, T83D, Q86E), (A59L, G60N, D61G, N62K), (A59V, D61N, N62K), (G60N, D61G, N62K), (G60N, ΔD61, N62G), ΔD61, (A59L, G60N, ΔD61, N62G), (A59V, G60N, D61G, N62K), (A59I, G60N, D61G, N62K), (A59I, G60N, ΔD61, N62G), (A59V, G60N, ΔD61, N62G), (A59V, ΔD61), (G60P, ΔD61, N62P), (G60P, D61P, N62K), (G60P, ΔD61, N62G), (G60P, D61G, N62K), (D61N, N62K) 및 (T83D, Q86E)로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열식별번호: 1에 비한 1개 이상의 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드, 예컨대 아피머 폴리펩티드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 다양한 방법 및 핵산에 관한 것이다.

Description

스캐폴드 단백질
WO 2009/136182는 D48L 및 G50S를 사용한 선행 기술 스캐폴드 STM의 돌연변이를 개시하며, 이는 박테리아 시스템에서의 증가된 발현을 초래하는 것으로 개시되어 있다 (22페이지, 제12행 내지 제13행).
WO 2009/136182 뿐만 아니라 WO 2006/131749는 각각 야생형 스테핀 (Stefin) A의 V48 부위, 특히 도메인-교환 이량체화의 폐기에 유용한 V48D의 돌연변이를 이전에 개시하였다 (WO 2006/131749, 35페이지, 제25행).
E78A 및 L80R의 동시 돌연변이는 WO 2009/136182에서 스캐폴드 SQT에 대해 개시되었을 뿐만 아니라, SQM 스캐폴드에서 L82R 및 T83S의 동시 돌연변이를 개시한다 (WO 2009/136182의 단락 연결 페이지 22 내지 23). 동시 돌연변이의 이들 쌍은 이. 콜라이 (E. coli)에서 높은 발현을 나타내는 것으로 개시되었다.
WO 2009/136182는 변형된 스테핀 A 스캐폴드 단백질을 개시한다. 특히, 이 문서의 개시내용은 스테핀 A의 G4 부위 또는 STM의 W4 부위에 상응하는 "위치 4 돌연변이"에 초점을 맞춘다. 특히, 이 문서는 G4R 돌연변이체의 특수한 이점을 교시한다. 이 문서는 스캐폴드 단백질의 열 안정성의 변경에 관한 어떤 것도 교시하지 않는다. 열 안정성은 단지 표적 펩티드에 의해 변형되는 스캐폴드 단백질의 저항성을 평가하기 위해 측정될 수 있는 몇몇 특성 중 하나로서, 이 문서에서 단지 한 단락에 언급되어 있다 (WO 2009/136182, 13페이지, 제1 단락).
WO 2006/131749는 스캐폴드 단백질로서의 스테핀 A의 용도를 개시하며, 스캐폴드의 생물학적 중성을 보장하는 데 유용한 몇몇 돌연변이를 개시한다. 이 문서는 열안정성 검정을 개시하며 (32페이지, 제1 단락), STM의 열 안정성에 대한 데이터를 나타낸다 (35페이지, 제9행 내지 제12행). 이 문서에서의 열안정성은 단지 표적 펩티드에 의해 변형되는 스캐폴드 단백질의 저항성의 평가하기 위해 측정될 수 있는 특성으로서 개시되어 있다 (WO 2006/131749의 단락 연결 페이지 6 내지 7 참조). 이 문서에는 열 안정성의 변이 또는 조정에 관한 어떤 것도 교시가 없다.
WO 2014/125290은 식물 시스타틴으로부터 유래된 스캐폴드 단백질을 개시한다. 특히, 이 문서는 3가지 바람직한 합성 단백질을 WO 2014/125290의 서열식별번호 (SEQ ID NO): 1, 서열식별번호: 2 및 서열식별번호: 3으로서 개시한다. 이 문서는 시차 주사 열량측정법에 의한 그들의 바람직한 스캐폴드의 열 안정성의 측정을 개시한다 (48페이지, 제31행 내지 제32행 및 도 7a). 이 문서의 어디에도 열 안정성에 영향을 미칠 수 있는 돌연변이의 개시는 없다. 사실, 상기 발명자들은 그들의 스캐폴드 단백질의 열 안정성에 영향을 미치는 어떠한 방식에 대해서도 언급하지 않는다. 이들은 그들의 바람직한 스캐폴드의 열 안정성이 "높다"고 주장하지만, 이를 그들의 스캐폴드의 조밀한 성질에 기인한다고 본다:
"스테핀 또는 시스타틴의 다른 구조에서 보여진 것보다 더 현저한, 스캐폴드의 조밀한 성질은 그의 높은 열 안정성에 기여할 가능성이 있는 것으로 보인다" (WO 2014/125290, 53페이지, 제17행 내지 제19행).
이 문서에는 어떻게 열 안정성이 조정되거나 변경될 수 있는지에 대한 교시는 없다. 더욱이, 이 문서에서의 돌연변이의 유일한 논의는 선행 기술의 돌연변이와, 또는 격자 이동 돌연변이를 생성하지 않도록 삼량체 삽입 또는 결실을 사용할 필요와 관련된 것이다. 이 문서의 과학적 초점은 식물 시스타틴 단백질로부터 유래된 컨센서스 서열을 설계하는 것에 집중되어 있다 - 열 안정성에 영향을 미치는 서열을 조작하는 것의 개시는 없다.
발명의 요약
본 발명자들은 그의 특성, 예컨대 그의 열 안정성을 개선시키는 것을 목표로 스테핀 A 스캐폴드 단백질을 연구하였다. 단백질 구조 및 기능으로의 그들의 통찰을 기반으로, 이들은 그들 특성을 개선시키는 다양한 변화 및 치환을 설계하였다. 이는 예를 들어 단백질이 특정 방식으로 거동할 것으로 예상될 수 있지만, 객관적 발견이 예측과 상충하였던, 예측되지 않는 변칙을 비롯한 다양한 놀라운 결과를 초래하였다 (예를 들어 하기에 상세히 논의된 Q42D/E 변칙). 이 실질적 연구 및 지적 노력의 결과는 스테핀 A 단백질의 열 안정성이 어떻게 변경되는지 및 열 안정성의 그러한 변화가 어떻게 스캐폴드 단백질로서의 그의 용도에 대한 유익을 산출하는지의 포괄적인 교시이다.
따라서, 본 발명은 서열식별번호: 1의 아미노산 잔기 1 내지 11, 13 내지 15, 17 내지 19, 21 내지 25, 27 내지 28, 35 내지 37, 39, 41, 43 내지 44, 46 내지 47, 49 내지 50, 52 내지 53, 55 내지 58, 63 내지 64, 66, 68 내지 82, 84 내지 85, 및 87 내지 98과 적어도 80％ 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, T51L, T51V, M65V, N32G, A59I, L38A, V20I, A40I, L38V, A12I, A12V, I16L, V20L, Q26E, E29M, T31K, N32D, N32H, T34V, T34R, T34D, T34P, A40V, Q42D, T45I, T45V, V48E, V48G, V48A, T51F, T51A, A59L, L67I, (V20I, L38A), (V20L, L38A), (V20I, L38V), (V20L, L38V), (E29K, K30E, E33K), (Y54D, T83D, Q86E), (A59L, G60N, D61G, N62K), (A59V, D61N, N62K), (G60N, D61G, N62K), (G60N, ΔD61, N62G), ΔD61, (A59L, G60N, ΔD61, N62G), (A59V, G60N, D61G, N62K), (A59I, G60N, D61G, N62K), (A59I, G60N, ΔD61, N62G), (A59V, G60N, ΔD61, N62G), (A59V, ΔD61), (G60P, ΔD61, N62P), (G60P, D61P, N62K), (G60P, ΔD61, N62G), (G60P, D61G, N62K), (D61N, N62K) 및 (T83D, Q86E)로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열식별번호: 1에 비한 1개 이상의 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드, 예컨대 아피머 (Affimer) 폴리펩티드에 관한 것이다.
본 발명은 서열식별번호: 1과 적어도 80％ 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며;
T51L, T51V, M65V, N32G, A59I, L38A, V20I, A40I, L38V, A12I, A12V, I16L, V20L, Q26E, E29M, T31K, N32D, N32H, T34V, T34R, T34D, T34P, A40V, Q42D, T45I, T45V, V48E, V48G, V48A, T51F, T51A, A59L, L67I, (V20I, L38A), (V20L, L38A), (V20I, L38V), (V20L, L38V), (E29K, K30E, E33K), (Y54D, T83D, Q86E), (A59L, G60N, D61G, N62K), (A59V, D61N, N62K), (G60N, D61G, N62K), (G60N, ΔD61, N62G), ΔD61, (A59L, G60N, ΔD61, N62G), (A59V, G60N, D61G, N62K), (A59I, G60N, D61G, N62K), (A59I, G60N, ΔD61, N62G), (A59V, G60N, ΔD61, N62G), (A59V, ΔD61), (G60P, ΔD61, N62P), (G60P, D61P, N62K), (G60P, ΔD61, N62G), (G60P, D61G, N62K), (D61N, N62K) 및 (T83D, Q86E)로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열식별번호: 1에 비한 1개 이상의 돌연변이를 포함하는 것을 특징을 하는 폴리펩티드, 예컨대 아피머 폴리펩티드에 관한 것이다.
본 발명은 서열식별번호: 1의 아미노산 잔기 1 내지 98과 적어도 80％ 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며;
T51L, T51V, M65V, N32G, A59I, L38A, V20I, A40I, L38V, A12I, A12V, I16L, V20L, Q26E, E29M, T31K, N32D, N32H, T34V, T34R, T34D, T34P, A40V, Q42D, T45I, T45V, V48E, V48G, V48A, T51F, T51A, A59L, L67I, (V20I, L38A), (V20L, L38A), (V20I, L38V), (V20L, L38V), (E29K, K30E, E33K), (Y54D, T83D, Q86E), (A59L, G60N, D61G, N62K), (A59V, D61N, N62K), (G60N, D61G, N62K), (G60N, ΔD61, N62G), ΔD61, (A59L, G60N, ΔD61, N62G), (A59V, G60N, D61G, N62K), (A59I, G60N, D61G, N62K), (A59I, G60N, ΔD61, N62G), (A59V, G60N, ΔD61, N62G), (A59V, ΔD61), (G60P, ΔD61, N62P), (G60P, D61P, N62K), (G60P, ΔD61, N62G), (G60P, D61G, N62K), (D61N, N62K) 및 (T83D, Q86E)로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열식별번호: 1에 비한 1개 이상의 돌연변이를 포함하는 것을 특징을 하는 폴리펩티드, 예컨대 아피머 폴리펩티드에 관한 것이다.
적합하게는 상기 서열식별번호: 1에 비한 1개 이상의 돌연변이는
T51L, T51V, M65V, N32G, A59I, E29M, T34V, T34R, T45I, T45V, T51F, A59L, L67I, (E29K, K30E, E33K), (A59L, G60N, D61G, N62K), (A59V, D61N, N62K), (G60N, D61G, N62K), (G60N, ΔD61, N62G), ΔD61, (A59L, G60N, ΔD61, N62G), (A59V, G60N, D61G, N62K), (A59I, G60N, D61G, N62K), (A59I, G60N, ΔD61, N62G), (A59V, G60N, ΔD61, N62G), 및 (A59V, ΔD61)이거나 또는 이로 이루어진 군으로부터 선택되고;
바람직하게는 상기 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 Tm보다 더 높은 Tm을 갖는다.
적합하게는 상기 서열식별번호: 1에 비한 1개 이상의 돌연변이는
L38A, V20I, A40I, L38V, A12I, A12V, I16L, V20L, Q26E, T31K, N32D, N32H, T34D, T34P, A40V, Q42D, V48E, V48G, V48A, T51A, (V20I, L38A), (V20L, L38A), (V20I, L38V), (V20L, L38V), (Y54D, T83D, Q86E), (G60P, ΔD61, N62P), (G60P, D61P, N62K), (G60P, ΔD61, N62G), (G60P, D61G, N62K), (D61N, N62K) 및 (T83D, Q86E)이거나 또는 이로 이루어진 군으로부터 선택되고;
바람직하게는 상기 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 Tm보다 더 낮은 Tm을 갖는다.
본 발명의 또다른 측면은 하기 화학식으로 나타내어지는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 예컨대 아피머 폴리펩티드를 제공한다:
MIP-Xaa1-GLSEAKPA12TPEI16QEIV20DKVKPQ26LEE29K30T31N32E33T34YGKL38EA40VQ42
YKT45QVV48A-(Xaa)n-Xaa2-T51NYY54IKVRA59G60D61N62KYM65HL67KVF-Xaa3-Xaa4-
Xaa5-(Xaa)m-Xaa6-D-Xaa7-VLT83GYQ86VDKNKDDELTGF
상기 식에서,
Xaa는 각각의 경우에 대해 개별적으로 아미노산 잔기이고;
n 및 m은 각각 독립적으로 3 내지 20의 정수이고;
Xaa1은 Gly, Ala, Val, Arg, Lys, Asp, 또는 Glu이고;
Xaa2는 Gly, Ala, Val, Ser 또는 Thr이고;
Xaa3은 Arg, Lys, Asn, Gln, Ser, Thr이고;
Xaa4는 Gly, Ala, Val, Ser 또는 Thr이고;
Xaa5는 Ala, Val, Ile, Leu, Gly 또는 Pro이고;
Xaa6은 Gly, Ala, Val, Asp 또는 Glu이고;
Xaa7은 Ala, Val, Ile, Leu, Arg 또는 Lys이고;
하기 아미노산 위치 중 적어도 하나는 인용된 대안적 아미노 잔기로부터 선택된다:
A12는 Ala, 또는 Val, Ile 또는 Leu로부터, 및 바람직하게는 Ile 또는 Val로부터 선택되는 대안적 아미노산 잔기이고;
I16은 Ile 또는 Val 또는 Leu로부터 선택되는 대안적 아미노산 잔기, 바람직하게는 Leu이고;
V20은 Val 또는 Ala, Ile 또는 Leu로부터 선택되는 대안적 아미노산 잔기, 바람직하게는 Ile 또는 Leu이고;
Q26은 Gln 또는 Asp 또는 Glu로부터 선택되는 대안적 아미노산 잔기, 바람직하게는 Glu이고;
E29는 Glu, 또는 Asp 또는 Met로부터 선택되는 대안적 아미노산 잔기, 바람직하게는 Met이고;
K30은 Lys, 또는 Arg, His, Glu 또는 Asp로부터 선택되는 대안적 아미노산 잔기, 바람직하게는 Glu이고;
T31은 Thr, 또는 Ser, Arg 또는 Lys로부터 선택되는 대안적 아미노산 잔기, 바람직하게는 Lys이고;
N32는 Asn, 또는 Gly, Asp, Glu 또는 His로부터 선택되는 대안적 아미노산 잔기, 바람직하게는 Gly, Asp 또는 His이고;
E33은 Glu, 또는 Arg, His, Lys 또는 Asp로부터 선택되는 대안적 아미노산 잔기, 바람직하게는 Lys이고;
T34는 Thr, 또는 Ser, Ala, Val, Ile, Leu, Arg, Lys, Asp, Glu 또는 Pro로부터 선택되는 대안적 아미노산 잔기, 바람직하게는 Val, Arg, Asp 또는 Pro이고;
L38은 Leu, 또는 Gly, Ala 또는 Val로부터 선택되는 대안적 아미노산 잔기, 바람직하게는 Ala 또는 Val이고;
A40은 Ala, 또는 Gly, Val, Leu 또는 Ile로부터 선택되는 대안적 아미노산 잔기, 바람직하게는 Ile 또는 Val이고;
Q42는 Gln, 또는 Asp, Glu, 또는 Asn으로부터 선택되는 대안적 아미노산 잔기, 바람직하게는 Asp이고;
T45는 Thr, 또는 Ser, Ala, Val, Ile 또는 Leu로부터 선택되는 대안적 아미노산 잔기, 바람직하게는 Ile 또는 Val이고;
V48은 Val, 또는 Gly, Ala, Ile, Leu, Glu 또는 Asp로부터 선택되는 대안적 아미노산 잔기, 바람직하게는 Gly, Ala 또는 Glu이고;
T51은 Thr, 또는 Gly, Ala, Val, Ile, Leu, Ser 또는 Phe로부터 선택되는 대안적 아미노산 잔기, 바람직하게는 Phe, Ala, Val 또는 Leu이고;
Y54는 Tyr, 또는 Asp 또는 Glu로부터 선택되는 대안적 아미노산 잔기, 바람직하게는 Asp이고;
A59는 Ala, 또는 Gly, Val, Ile 또는 Leu로부터 선택되는 대안적 아미노산 잔기, 바람직하게는 Ile, Leu 또는 Val이고;
G60은 Gly, 또는 Asn, Gln, Gly 또는 Pro로부터 선택되는 대안적 아미노산 잔기, 바람직하게는 Asn 또는 Pro이고;
D61은 Asp, 또는 ΔD61 (부재), Gly, Pro, Glu, Asn 또는 Gln으로부터 선택되는 대안적 아미노산 잔기, 바람직하게는 ΔD61 (부재), Gly, Pro 또는 Asn이고;
N62는 Asn, 또는 Gln, Lys, Arg, His, Gly 또는 Pro로부터 선택되는 대안적 아미노산 잔기, 바람직하게는 Lys, Pro 또는 Gly이고;
M65는 Met, 또는 Ala, Val, Ile, Leu로부터 선택되는 대안적 아미노산 잔기, 바람직하게는 Val이고;
L67은 Leu, 또는 Ala, Val 또는 Ile로부터 선택되는 대안적 아미노산 잔기, 바람직하게는 Ile이고;
T83은 Thr, 또는 Ser, Asp 또는 Glu로부터 선택되는 대안적 아미노산 잔기, 바람직하게는 Asp이고;
Q86은 Gln, 또는 Asn, Glu 또는 Asp로부터 선택되는 대안적 아미노산 잔기, 바람직하게는 Glu이다.
한 측면에서, 본 발명은
상기 폴리펩티드가 적어도 1개의 이종 펩티드 삽입을 추가로 포함하고,
상기 이종 펩티드 삽입이 서열식별번호: 1에 비해 하기 위치 중 하나에 이종 펩티드를 포함하는 것인 상기 기재된 바와 같은 폴리펩티드에 관한 것이다:
a) 47-<이종 펩티드>-55
b) 46-<이종 펩티드>-54
c) 46-<이종 펩티드>-50
d) 48-<이종 펩티드>-50
e) 49-<이종 펩티드>-51
f) 50-<이종 펩티드>-52
g) 66-<이종 펩티드>-85
h) 67-<이종 펩티드>-84
i) 70-<이종 펩티드>-74
j) 72-<이종 펩티드>-74
k) 71-<이종 펩티드>-73
l) 72-<이종 펩티드>-81
m) 73-<이종 펩티드>-80
n) 79-<이종 펩티드>-81
o) 80-<이종 펩티드>-81
p) 82-<이종 펩티드>-83
q) 72-<이종 펩티드>-77
r) 73-<이종 펩티드>-78
s) 74-<이종 펩티드>-79
t) 4-<이종 펩티드>-5
적합하게는 상기 폴리펩티드는 2개의 이종 펩티드 삽입, 위치 (a) 내지 (f) 중 임의의 것에서의 제1 이종 펩티드 삽입, 및 위치 (g) 내지 (s) 중 임의의 것에서의 제2 이종 펩티드 삽입을 포함한다.
적합하게는 상기 폴리펩티드는 2개의 이종 펩티드 삽입, 위치 (a) 내지 (f) 중 임의의 것에서의 제1 이종 펩티드 삽입, 및 위치 (t)에서의 제2 이종 펩티드 삽입을 포함한다.
적합하게는 상기 폴리펩티드는 2개의 이종 펩티드 삽입, 위치 (g) 내지 (s) 중 임의의 것에서의 제1 이종 펩티드 삽입, 및 위치 (t)에서의 제2 이종 펩티드 삽입을 포함한다.
적합하게는 상기 폴리펩티드는 3개의 이종 펩티드 삽입, 위치 (a) 내지 (f) 중 임의의 것에서의 제1 이종 펩티드 삽입, 및 위치 (g) 내지 (s) 중 임의의 것에서의 제2 이종 펩티드 삽입, 및 위치 (t)에서의 제3 이종 펩티드 삽입을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 서열식별번호: 1의 아미노산 잔기 1 내지 11, 13 내지 15, 17 내지 19, 21 내지 25, 27 내지 28, 35 내지 37, 39, 41, 43 내지 44, 46 내지 47, 49 내지 50, 52 내지 53, 55 내지 58, 63 내지 64, 66, 68 내지 82, 84 내지 85, 및 87 내지 98과 적어도 80％ 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고;
적어도 1개의 이종 펩티드 삽입을 포함하며;
M65I, T51I, T51L, T51V, M65V, A59V, N32G, A59I, L38A, V20A, V20I, A40I, L38V, G50S, L38F, A12I, A12V, I16L, V20L, Q26E, E29M, T31K, N32D, N32H, T34V, T34R, T34K, T34D, T34P, A40V, Q42E, Q42D, T45I, T45V, V48E, V48D, V48G, V48A, V48L, T51F, T51A, A59L, K63R, L67I, N90T, (V20I, L38A), (V20L, L38A), (V20I, L38V), (V20L, L38V), (E29K, K30E, E33K), (Y54D, T83D, Q86E), (A59L, G60N, D61G, N62K), (A59V, D61N, N62K), (G60N, D61G, N62K), (G60N, ΔD61, N62G), ΔD61, (A59L, G60N, ΔD61, N62G), (A59V, G60N, D61G, N62K), (A59I, G60N, D61G, N62K), (A59I, G60N, ΔD61, N62G), (A59V, G60N, ΔD61, N62G), (A59V, ΔD61), (G60P, ΔD61, N62P), (G60P, D61P, N62K), (G60P, ΔD61, N62G), (G60P, D61G, N62K), (D61N, N62K), 및 (T83D, Q86E)로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열식별번호: 1에 비한 1개 이상의 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하고;
상기 이종 펩티드 삽입이 서열식별번호: 1에 비해 하기 위치 중 하나에 삽입된 이종 펩티드를 포함하는 것인 폴리펩티드, 예컨대 아피머 폴리펩티드에 관한 것이다:
d) 48-<이종 펩티드>-50,
e) 49-<이종 펩티드>-51,
f) 50-<이종 펩티드>-52,
q) 72-<이종 펩티드>-77,
r) 73-<이종 펩티드>-78; 또는
s) 74-<이종 펩티드>-79.
한 측면에서, 본 발명은 서열식별번호: 1과 적어도 80％ 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고;
적어도 1개의 이종 펩티드 삽입을 포함하며;
M65I, T51I, T51L, T51V, M65V, A59V, N32G, A59I, L38A, V20A, V20I, A40I, L38V, G50S, L38F, A12I, A12V, I16L, V20L, Q26E, E29M, T31K, N32D, N32H, T34V, T34R, T34K, T34D, T34P, A40V, Q42E, Q42D, T45I, T45V, V48E, V48D, V48G, V48A, V48L, T51F, T51A, A59L, K63R, L67I, N90T, (V20I, L38A), (V20L, L38A), (V20I, L38V), (V20L, L38V), (E29K, K30E, E33K), (Y54D, T83D, Q86E), (A59L, G60N, D61G, N62K), (A59V, D61N, N62K), (G60N, D61G, N62K), (G60N, ΔD61, N62G), ΔD61, (A59L, G60N, ΔD61, N62G), (A59V, G60N, D61G, N62K), (A59I, G60N, D61G, N62K), (A59I, G60N, ΔD61, N62G), (A59V, G60N, ΔD61, N62G), (A59V, ΔD61), (G60P, ΔD61, N62P), (G60P, D61P, N62K), (G60P, ΔD61, N62G), (G60P, D61G, N62K), (D61N, N62K), 및 (T83D, Q86E)로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열식별번호: 1에 비한 1개 이상의 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하고;
상기 이종 펩티드 삽입이 서열식별번호: 1에 비해 하기 위치 중 하나에 삽입된 이종 펩티드를 포함하는 것인 폴리펩티드, 예컨대 아피머 폴리펩티드에 관한 것이다:
d) 48-<이종 펩티드>-50,
e) 49-<이종 펩티드>-51,
f) 50-<이종 펩티드>-52,
q) 72-<이종 펩티드>-77,
r) 73-<이종 펩티드>-78; 또는
s) 74-<이종 펩티드>-79.
한 측면에서, 본 발명은 서열식별번호: 1의 아미노산 잔기 1 내지 98과 적어도 80％ 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고;
적어도 1개의 이종 펩티드 삽입을 포함하며;
M65I, T51I, T51L, T51V, M65V, A59V, N32G, A59I, L38A, V20A, V20I, A40I, L38V, G50S, L38F, A12I, A12V, I16L, V20L, Q26E, E29M, T31K, N32D, N32H, T34V, T34R, T34K, T34D, T34P, A40V, Q42E, Q42D, T45I, T45V, V48E, V48D, V48G, V48A, V48L, T51F, T51A, A59L, K63R, L67I, N90T, (V20I, L38A), (V20L, L38A), (V20I, L38V), (V20L, L38V), (E29K, K30E, E33K), (Y54D, T83D, Q86E), (A59L, G60N, D61G, N62K), (A59V, D61N, N62K), (G60N, D61G, N62K), (G60N, ΔD61, N62G), ΔD61, (A59L, G60N, ΔD61, N62G), (A59V, G60N, D61G, N62K), (A59I, G60N, D61G, N62K), (A59I, G60N, ΔD61, N62G), (A59V, G60N, ΔD61, N62G), (A59V, ΔD61), (G60P, ΔD61, N62P), (G60P, D61P, N62K), (G60P, ΔD61, N62G), (G60P, D61G, N62K), (D61N, N62K), 및 (T83D, Q86E)로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열식별번호: 1에 비한 1개 이상의 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하고;
상기 이종 펩티드 삽입이 서열식별번호: 1에 비해 하기 위치 중 하나에 삽입된 이종 펩티드를 포함하는 것인 폴리펩티드, 예컨대 아피머 폴리펩티드에 관한 것이다:
d) 48-<이종 펩티드>-50,
e) 49-<이종 펩티드>-51,
f) 50-<이종 펩티드>-52,
q) 72-<이종 펩티드>-77,
r) 73-<이종 펩티드>-78; 또는
s) 74-<이종 펩티드>-79.
적합하게는 상기 폴리펩티드는 2개의 이종 펩티드 삽입, 위치 (d) 내지 (f) 중 임의의 것에서의 제1 이종 펩티드 삽입, 및 위치 (q) 내지 (s) 중 임의의 것에서의 제2 이종 펩티드 삽입을 포함한다.
적합하게는 상기 서열식별번호: 1에 비한 1개 이상의 돌연변이는
M65I, T51I, T51L, T51V, M65V, A59V, N32G, A59I, E29M, T34V, T34R, T34K, Q42E, T45I, T45V, T51F, A59L, K63R, L67I, N90T, (E29K, K30E, E33K), (A59L, G60N, D61G, N62K), (A59V, D61N, N62K), (G60N, D61G, N62K), (G60N, ΔD61, N62G), ΔD61, (A59L, G60N, ΔD61, N62G), (A59V, G60N, D61G, N62K), (A59I, G60N, D61G, N62K), (A59I, G60N, ΔD61, N62G), (A59V, G60N, ΔD61, N62G), 및 (A59V, ΔD61)이거나 또는 이로 이루어진 군으로부터 선택되고;
바람직하게는 상기 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 Tm보다 더 높은 Tm을 갖는다.
적합하게는 상기 서열식별번호: 1에 비한 1개 이상의 돌연변이는
L38A, V20A, V20I, A40I, L38V, G50S, L38F, A12I, A12V, I16L, V20L, Q26E, T31K, N32D, N32H, T34D, T34P, A40V, Q42D, V48E, V48D, V48G, V48A, V48L, T51A, (V20I, L38A), (V20L, L38A), (V20I, L38V), (V20L, L38V), (Y54D, T83D, Q86E), (G60P, ΔD61, N62P), (G60P, D61P, N62K), (G60P, ΔD61, N62G), (G60P, D61G, N62K), (D61N, N62K) 및 (T83D, Q86E)이거나 또는 이로 이루어진 군으로부터 선택되고;
바람직하게는 상기 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 Tm보다 더 낮은 Tm을 갖는다.
적합하게는 상기 서열식별번호: 1에 비한 1개 이상의 돌연변이는
T51L, T51V, M65V, N32G, A59I, L38A, V20I, A40I, L38V, A12I, A12V, I16L, V20L, Q26E, E29M, T31K, N32D, N32H, T34V, T34R, T34D, T34P, A40V, Q42D, T45I, T45V, V48E, V48G, V48A, T51F, T51A, A59L, L67I, (V20I, L38A), (V20L, L38A), (V20I, L38V), (V20L, L38V), (E29K, K30E, E33K), (Y54D, T83D, Q86E), (A59L, G60N, D61G, N62K), (A59V, D61N, N62K), (G60N, D61G, N62K), (G60N, ΔD61, N62G), ΔD61, (A59L, G60N, ΔD61, N62G), (A59V, G60N, D61G, N62K), (A59I, G60N, D61G, N62K), (A59I, G60N, ΔD61, N62G), (A59V, G60N, ΔD61, N62G), (A59V, ΔD61), (G60P, ΔD61, N62P), (G60P, D61P, N62K), (G60P, ΔD61, N62G), (G60P, D61G, N62K), (D61N, N62K) 및 (T83D, Q86E)이거나 또는 이로 이루어진 군으로부터 선택된다.
적합하게는 상기 서열식별번호: 1에 비한 1개 이상의 돌연변이는
T51L, T51V, M65V, N32G, A59I, E29M, T34V, T34R, T45I, T45V, T51F, A59L, L67I, (E29K, K30E, E33K), (A59L, G60N, D61G, N62K), (A59V, D61N, N62K), (G60N, D61G, N62K), (G60N, ΔD61, N62G), ΔD61, (A59L, G60N, ΔD61, N62G), (A59V, G60N, D61G, N62K), (A59I, G60N, D61G, N62K), (A59I, G60N, ΔD61, N62G), (A59V, G60N, ΔD61, N62G), 및 (A59V, ΔD61)이거나 또는 이로 이루어진 군으로부터 선택되고;
바람직하게는 상기 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 Tm보다 더 높은 Tm을 갖는다.
적합하게는 상기 서열식별번호: 1에 비한 1개 이상의 돌연변이는
L38A, V20I, A40I, L38V, A12I, A12V, I16L, V20L, Q26E, T31K, N32D, N32H, T34D, T34P, A40V, Q42D, V48E, V48G, V48A, T51A, (V20I, L38A), (V20L, L38A), (V20I, L38V), (V20L, L38V), (Y54D, T83D, Q86E), (G60P, ΔD61, N62P), (G60P, D61P, N62K), (G60P, ΔD61, N62G), (G60P, D61G, N62K), (D61N, N62K) 및 (T83D, Q86E)이거나 또는 이로 이루어진 군으로부터 선택되고;
바람직하게는 상기 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 Tm보다 더 낮은 Tm을 갖는다.
한 측면에서, 본 발명은 상기 폴리펩티드가 서열식별번호: 1의 Tm보다 더 높은 Tm을 갖는 것인 상기 기재된 바와 같은 폴리펩티드에 관한 것이다.
한 측면에서, 본 발명은 상기 폴리펩티드가 서열식별번호: 1의 Tm보다 더 낮은 Tm을 갖는 것인 상기 기재된 바와 같은 폴리펩티드에 관한 것이다.
적합하게는 상기 폴리펩티드는 G4R, G4W, V48D, V48E, G50 S, Y35W, Y43W, Y53W, Y54W, Y64W, F70W, Y85W, F98W, (K71N S72G L73P), 또는 (E78A L80R)로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열식별번호: 1에 비한 1개 이상의 돌연변이를 추가로 포함한다.
적합하게는 상기 기재된 바와 같은 폴리펩티드는 서열식별번호: 1에 비해 5개 이하의 돌연변이를 포함한다.
적합하게는 상기 5개 이하의 돌연변이는 Y35W, N32G, V48D, M65I, Q42E 및 T51L로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 측면에서, 본 발명은 상기 5개 이하의 돌연변이가 N32G, V48D, M65I, Q42E 및 T51L로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 상기 기재된 바와 같은 폴리펩티드에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 하기 군 중 하나에서의 돌연변이 각각을 갖는 상기 기재된 바와 같은 폴리펩티드에 관한 것이다:
i) N32G V48D
ii) N32G V48D M65I
iii) N32G V48D M65I T51L
iv) N32G V48D M65I Q42E
v) N32G V48D M65I Q42E T51L.
한 실시양태에서, 본 발명은 하기 군 중 하나에서의 돌연변이 각각을 갖고, 서열식별번호: 1에 비해 추가의 돌연변이를 갖지 않는 상기 기재된 바와 같은 폴리펩티드에 관한 것이다:
i) N32G V48D
ii) N32G V48D M65I
iii) N32G V48D M65I T51L
iv) N32G V48D M65I Q42E
v) N32G V48D M65I Q42E T51L.
한 실시양태에서, 본 발명은 돌연변이 iv) N32G, V48D, M65I 및 Q42E 각각을 갖는 상기 기재된 바와 같은 폴리펩티드에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 돌연변이 iv) N32G, V48D, M65I 및 Q42E 각각을 갖고, 서열식별번호: 1에 비해 추가의 돌연변이를 갖지 않는 상기 기재된 바와 같은 폴리펩티드에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 하기 군 중 하나에서의 돌연변이 각각을 갖는 상기 기재된 바와 같은 폴리펩티드에 관한 것이다:
a) Y35W N32G V48D M65I Q42E T51L (A59V ΔD61) (E29K K30E E33K)
b) Y35W N32G V48D M65I Q42E T51L (A59V G60N ΔD61 N62G) (E29K K30E E33K).
한 실시양태에서, 본 발명은 하기 군 중 하나에서의 돌연변이 각각을 갖고, 서열식별번호: 1에 비해 추가의 돌연변이를 갖지 않는 상기 기재된 바와 같은 폴리펩티드에 관한 것이다:
a) Y35W N32G V48D M65I Q42E T51L (A59V ΔD61) (E29K K30E E33K)
b) Y35W N32G V48D M65I Q42E T51L (A59V G60N ΔD61 N62G) (E29K K30E E33K).
한 실시양태에서, 본 발명은 돌연변이 b) Y35W N32G V48D M65I Q42E T51L (A59V G60N ΔD61 N62G) (E29K K30E E33K) 각각을 갖는 상기 기재된 바와 같은 폴리펩티드에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 돌연변이 b) Y35W N32G V48D M65I Q42E T51L (A59V G60N ΔD61 N62G) (E29K K30E E33K) 각각을 갖고, 서열식별번호: 1에 비해 추가의 돌연변이를 갖지 않는 상기 기재된 바와 같은 폴리펩티드에 관한 것이다.
적합하게는 상기 이종 펩티드는 길이가 6 내지 36개 아미노산이다.
한 측면에서, 본 발명은
- 상기 기재된 바와 같은 폴리펩티드; 및
- 분비 신호 서열, 펩티드 링커 서열, 친화성 태그, 막횡단 도메인, 세포 표면 체류 서열, 번역후 변형을 위한 기질 인식 서열, 단백질-단백질 상호작용을 통해 응집하는 단백질의 다량체성 구조를 생성하는 다량체화 도메인, 반감기 연장 폴리펩티드 모이어티, 조직 국재화 및 항체의 항원 결합 부위를 변경시키기 위한 폴리펩티드 서열, 동일하거나 상이한 표적에 결합하는 상기 기재된 바와 같은 1종 이상의 추가의 폴리펩티드, 및 동일하거나 상이한 표적에 결합하는 1종 이상의 추가의 아피머 폴리펩티드 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 추가의 아미노산 서열
을 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다.
적합하게는 상기 융합 단백질은 Fc 도메인 또는 그의 부분, 알부민 단백질 또는 그의 부분, 알부민-결합 폴리펩티드 모이어티, 트랜스페린 또는 그의 부분, 트랜스페린-결합 폴리펩티드 모이어티, 피브로넥틴 또는 그의 부분, 또는 피브로넥틴-결합 폴리펩티드 모이어티로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 반감기 연장 폴리펩티드 모이어티를 포함한다.
적합하게는 Fc 도메인 또는 그의 부분은 FcN 결합을 보유한다.
적합하게는 Fc 도메인 또는 그의 부분은 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM 또는 그의 하위부류 (이소형), 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 또는 IgA2로부터의 것이다.
적합하게는 Fc 도메인 또는 그의 부분은 C1q 결합, 보체 의존성 세포독성 (CDC), 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC); 포식작용; B 세포 수용체의 하향 조절, 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 이펙터 기능을 보유한다.
적합하게는 반감기 연장 폴리펩티드 모이어티는 단백질의 혈청 반감기를 단백질로부터의 그의 부재에 비해 적어도 5배 증가시킨다.
적합하게는 폴리펩티드는 아피머 또는 아피머 폴리펩티드이다. 아피머/아피머 폴리펩티드는 하기에 보다 상세히 기재된다.
한 측면에서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산에 관한 것이다.
한 측면에서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다.
한 측면에서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 폴리펩티드의 집단을 포함하며, 상기 집단 내의 적어도 2개의 개별적 폴리펩티드가 상이한 이종 펩티드 삽입을 포함하는 것인 라이브러리에 관한 것이다.
한 측면에서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 폴리펩티드의 집단을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산의 집단을 포함하는 라이브러리에 관한 것이다. 적합하게는 각각의 핵산은 상기 기재된 바와 같은 단일 폴리펩티드를 코딩한다.
한 측면에서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 폴리펩티드, 상기 기재된 바와 같은 핵산, 또는 상기 기재된 바와 같은 라이브러리를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
한 측면에서, 본 발명은 의료에 사용하기 위한 상기 기재된 바와 같은 폴리펩티드에 관한 것이다.
한 측면에서, 본 발명은
(i) 이종 펩티드 삽입을 포함하는 상기 기재된 바와 같은 폴리펩티드를 제공하고;
(ii) 상기 폴리펩티드를 관심 구조와 접촉시키고;
(iii) 폴리펩티드 및 관심 구조 사이의 회합을 모니터링하는 것
을 포함하며;
폴리펩티드와 관심 구조의 회합이 펩티드를 상기 구조에 결합할 수 있는 후보 펩티드로서 확인하는 것인, 관심 구조에 결합할 수 있는 펩티드를 확인하는 방법에 관한 것이다.
한 측면에서, 본 발명은 스캐폴드 단백질로서의 상기 기재된 바와 같은 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다.
보다 적합하게는 본 발명은 상기 이종 펩티드 삽입이 서열식별번호: 1에 비해 하기 위치 중 하나에 삽입된 이종 펩티드를 포함하는 것인 상기 기재된 바와 같은 폴리펩티드에 관한 것이다:
d) 48-<이종 펩티드>-50
e) 49-<이종 펩티드>-51
f) 50-<이종 펩티드>-52
q) 72-<이종 펩티드>-77
r) 73-<이종 펩티드>-78
s) 74-<이종 펩티드>-79
t) 4-<이종 펩티드>-5.
보다 적합하게는 상기 폴리펩티드는 2개의 이종 펩티드 삽입, 위치 (d) 내지 (f) 중 임의의 것에서의 제1 이종 펩티드 삽입, 및 위치 (q) 내지 (s) 중 임의의 것에서의 제2 이종 펩티드 삽입을 포함한다.
보다 적합하게는 상기 폴리펩티드는 2개의 이종 펩티드 삽입, 위치 (d) 내지 (f) 중 임의의 것에서의 제1 이종 펩티드 삽입, 및 위치 (t)에서의 제2 이종 펩티드 삽입을 포함한다.
보다 적합하게는 상기 폴리펩티드는 2개의 이종 펩티드 삽입, 위치 (q) 내지 (s) 중 임의의 것에서의 제1 이종 펩티드 삽입, 및 위치 (t)에서의 제2 이종 펩티드 삽입을 포함한다.
보다 적합하게는 상기 폴리펩티드는 3개의 이종 펩티드 삽입, 위치 (d) 내지 (f) 중 임의의 것에서의 제1 이종 펩티드 삽입, 및 위치 (q) 내지 (s) 중 임의의 것에서의 제2 이종 펩티드 삽입, 및 위치 (t)에서의 제3 이종 펩티드 삽입을 포함한다.
적합하게는 본 발명의 폴리펩티드는 기재된 바와 같은 돌연변이(들)를 포함하는, 서열식별번호: 1의 아미노산 1 내지 98에 상응하는 아미노산 서열을 포함한다. 기재된 소수의 돌연변이는 결실이며, 예를 들어 서열식별번호: 1의 아미노산 61에 상응하는 아미노산은 치환에 의해 또는 결실에 의해 돌연변이될 수 있다. 결실에 의해 돌연변이되는 경우, 최종 생성된 폴리펩티드는 서열식별번호: 1에 상응하는 단지 97개의 아미노산을 포함할 수 있다 - 다시 말해서 D61이 결실되는 경우, ΔD61은 서열식별번호: 1의 D61에 상응한다 - 통상의 기술자는 이러한 특색을 그에 따라 해석할 것이다. 가장 적합하게는 돌연변이는 치환이다.
폭넓은 측면에서, 또한
M65I, T51I, T51L, T51V, M65V, A59V, N32G, A59I, L38A, V20A, V20I, A40I, L38V, G50S, L38F, A12I, A12V, I16L, V20L, Q26E, E29M, T31K, N32D, N32H, T34V, T34R, T34K, T34D, T34P, A40V, Q42E, Q42D, T45I, T45V, V48E, V48D, V48G, V48A, V48L, T51F, T51A, A59L, K63R, L67I, N90T, (V20I, L38A), (V20L, L38A), (V20I, L38V), (V20L, L38V), (E29K, K30E, E33K), (Y54D, T83D, Q86E), (A59L, G60N, D61G, N62K), (A59V, D61N, N62K), (G60N, D61G, N62K), (G60N, ΔD61, N62G), ΔD61, (A59L, G60N, ΔD61, N62G), (A59V, G60N, D61G, N62K), (A59I, G60N, D61G, N62K), (A59I, G60N, ΔD61, N62G), (A59V, G60N, ΔD61, N62G), (A59V, ΔD61), (G60P, ΔD61, N62P), (G60P, D61P, N62K), (G60P, ΔD61, N62G), (G60P, D61G, N62K), (D61N, N62K), 및 (T83D, Q86E)로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열식별번호: 1에 비한 돌연변이를 포함하고;
이종 펩티드 삽입을 추가로 포함하는, 서열식별번호: 1의 아미노산 1 내지 98에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 예컨대 아피머 폴리펩티드가 개시된다. 적합하게는 상기 이종 펩티드 삽입은 서열식별번호: 1에 비해 하기 위치 중 하나에 삽입된 이종 펩티드를 포함한다:
d) 48-<이종 펩티드>-50,
e) 49-<이종 펩티드>-51,
f) 50-<이종 펩티드>-52,
q) 72-<이종 펩티드>-77,
r) 73-<이종 펩티드>-78, 또는
s) 74-<이종 펩티드>-79.
아피머®는 조작된 비-항체 결합 단백질 (즉, 폴리펩티드 친화성 시약)이다. 아피머 (AFFIMER)는 등록 상표명이다.
관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 압타머 및 아피머® 시약은 동일하지 않다. 아피머 기술은 압타머와 또는 항체와 연관된 많은 문제를 극복하기 위해 조작되었으며, 다수의 유익을 갖는다. 예를 들어, 검정 환경에 대한 민감도는 아피머® 스캐폴드가 폭넓은 pH 범위에 대해 저항성이기 때문에 개선되었으며, 이는 이들을 폭넓은 범위의 검정 조건에 적합하게 만든다. 아피머® 분자는 또한 EDTA에 민감성이지 않다 (폴딩 및 기능을 위해 Mg++를 요구하는 압타머에 대한 문제). 압타머는 속박되지 않는 반면, 아피머® 단백질은 제시된 이종 펩티드를 속박한다.
적합하게는 아피머® 시약, 예컨대 본원에 기재된 아피머® 스캐폴드/폴리펩티드는 인간 스테핀 A 단백질에 기초하거나 그로부터 유래된다. 이는 하기에 보다 상세히 기재된다.
적합하게는 폴리펩티드는 스테핀 A 폴리펩티드이다.
한 측면에서, 본 발명은 모두 각각 폴리펩티드의 안정성, 예컨대 열 안정성 (Tm)에 영향을 미치는 것으로 입증된 공통적인 기술적 특색을 공유하는 한정된 돌연변이의 세트로부터의 1개 이상의 돌연변이의 조합 및 이종 펩티드 삽입을 갖는 스테핀 A 폴리펩티드에 관한 것이다. 출원일에서 본 발명자들의 지식 및 믿음의 한에 있어서, 이들 조합은 신규하다.
본 발명자들에 의해 교시된 특정 위치에서의 소수의 아미노산은 전에 관련 기술분야에서 (예를 들어 멀게 관련된 스테핀 A 동족체에서 천연 발생 잔기로서, 즉, 이종 펩티드 삽입이 없고, 따라서 상기 기재된 신규 조합에서 발생하지 않음); 또는 이종 펩티드 삽입과 조합으로, 예를 들어 선행 기술 스캐폴드 STM에서 발생할 수 있었다. 전에 관련 기술분야에서 발생할 수 있었던 이러한 돌연변이 (치환)의 예로는 V20A,T34K,L38F,Q42E,V48D,G50S,T51I,A59V,K63R,M65I, 및 N90T를 들 수 있다. 한 실시양태에서, 적합하게는 본 발명의 폴리펩티드는 이 군으로부터 선택되는 돌연변이를 포함하지 않는다. 적합하게는 본 발명의 폴리펩티드가 이 군으로부터 선택되는 돌연변이를 갖는 경우, 이는 또한 가장 적합하게는 서열식별번호: 1에 비해 하기 위치 중 하나 이상에 적어도 1개의 이종 펩티드 삽입을 갖는다:
d) 48-<이종 펩티드>-50,
e) 49-<이종 펩티드>-51,
f) 50-<이종 펩티드>-52,
q) 72-<이종 펩티드>-77,
r) 73-<이종 펩티드>-78, 또는
s) 74-<이종 펩티드>-79.
적합하게는 본 발명의 폴리펩티드가 이 군으로부터 선택되는 돌연변이를 갖는 경우, 이는 또한 표 A로부터 선택되는 적어도 1개의 추가의 돌연변이를 갖는다.
<표 A>
Figure pct00001
스테핀 A 폴리펩티드의 Tm을 증가시키는 것에 관하여, 전에 관련 기술분야에서 발생할 수 있었던 이러한 돌연변이 (치환)의 예로는 T34K,Q42E,G50S,T51I,A59V,K63R,M65I, 및 N90T를 들 수 있다. 한 실시양태에서, 적합하게는 본 발명의 폴리펩티드는 이 군으로부터 선택되는 돌연변이를 포함하지 않는다. 적합하게는 본 발명의 폴리펩티드가 이 군으로부터 선택되는 돌연변이를 갖는 경우, 이는 가장 적합하게는 서열식별번호: 1에 비해 하기 위치 중 하나 이상에 적어도 1개의 이종 펩티드 삽입을 갖는다:
d) 48-<이종 펩티드>-50,
e) 49-<이종 펩티드>-51,
f) 50-<이종 펩티드>-52,
q) 72-<이종 펩티드>-77,
r) 73-<이종 펩티드>-78, 또는
s) 74-<이종 펩티드>-79.
적합하게는 본 발명의 폴리펩티드가 이 군으로부터 선택되는 돌연변이를 갖는 경우, 이는 또한 표 B로부터 선택되는 적어도 1개의 추가의 돌연변이를 갖는다.
<표 B>
Figure pct00002
스테핀 A 폴리펩티드의 Tm을 감소시키는 것에 관하여, 전에 관련 기술분야에서 발생할 수 있었던 이러한 돌연변이 (치환)의 예로는 V20A,L38F, 및 V48D를 들 수 있다. 한 실시양태에서, 적합하게는 본 발명의 폴리펩티드는 이 군으로부터 선택되는 돌연변이를 포함하지 않는다. 적합하게는 본 발명의 폴리펩티드가 이 군으로부터 선택되는 돌연변이를 갖는 경우, 이는 또한 가장 적합하게는 서열식별번호: 1에 비해 하기 위치 중 하나 이상에 적어도 1개의 이종 펩티드 삽입을 갖는다:
d) 48-<이종 펩티드>-50,
e) 49-<이종 펩티드>-51,
f) 50-<이종 펩티드>-52,
q) 72-<이종 펩티드>-77,
r) 73-<이종 펩티드>-78, 또는
s) 74-<이종 펩티드>-79.
적합하게는 본 발명의 폴리펩티드가 이 군으로부터 선택되는 돌연변이를 갖는 경우, 이는 표 C로부터 선택되는 적어도 1개의 추가의 돌연변이를 갖는다.
<표 C>
Figure pct00003
적합하게는 폴리펩티드는 상기 기재된 바와 같은 돌연변이(들)를 포함하는, 서열식별번호: 1의 아미노산 1 내지 98에 상응하는 아미노산 서열을 포함한다.
따라서, 한 측면에서, 본 발명은 서열식별번호: 1의 아미노산 1 내지 98에 상응하는 아미노산 서열을 포함하고,
상기 아미노산 서열이 서열식별번호: 1의 아미노산 잔기 1 내지 11, 13 내지 15, 17 내지 19, 21 내지 25, 27 내지 28, 35 내지 37, 39, 41, 43 내지 44, 46 내지 47, 49 내지 50, 52 내지 53, 55 내지 58, 63 내지 64, 66, 68 내지 82, 84 내지 85, 및 87 내지 98과 적어도 80％ 동일성을 가지며;
상기 개시된 군으로부터 선택되는 서열식별번호: 1에 비한 1개 이상의 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드, 예컨대 아피머 폴리펩티드에 관한 것이다.
적합하게는 폴리펩티드는 적어도 80개의 아미노산; 적합하게는 적어도 81개의 아미노산, 적합하게는 적어도 82개의 아미노산, 적합하게는 적어도 83개의 아미노산, 적합하게는 적어도 84개의 아미노산, 적합하게는 적어도 85개의 아미노산, 적합하게는 적어도 86개의 아미노산, 적합하게는 적어도 87개의 아미노산, 적합하게는 적어도 88개의 아미노산, 적합하게는 적어도 89개의 아미노산, 적합하게는 적어도 90개의 아미노산, 적합하게는 적어도 91개의 아미노산, 적합하게는 적어도 92개의 아미노산, 적합하게는 적어도 93개의 아미노산, 적합하게는 적어도 94개의 아미노산, 적합하게는 적어도 95개의 아미노산, 적합하게는 적어도 96개의 아미노산; 보다 적합하게는 적어도 97개의 아미노산; 가장 적합하게는 98개의 아미노산을 포함한다 (임의의 이종 펩티드 삽입을 제외함). 적합하게는 폴리펩티드는 전장 hSteA에 상응하는 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는 전장 hSteA는 가장 적합하게는 서열식별번호: 1에 나타내어진 것들에 상응하는 98aa를 의미한다.
스캐폴드
관련 기술분야에 널리 공지된 바와 같이, 용어 '스캐폴드'는 그 자신의 구조가 표적 펩티드에 의해 변형되지 않고 표적 펩티드(들)를 용매에 제시할 수 있는 단백질을 지칭한다.
용매에의 펩티드의 제시에 관하여, 이는 면역침전 실험을 사용하여 시험될 수 있다. 예를 들어, 펩티드가 용매에 제시되고 있다는 지시는 이를 인식할 수 있는 항체에 대한 그의 이용가능성에 의해 얻어질 수 있다. 따라서, 펩티드를 용매에 제시하는 스캐폴드 단백질의 능력을 시험하기 위해, 펩티드를 포함하는 스캐폴드는 발현될 것이며, 펩티드를 인식하는 항체는 스캐폴드-펩티드 융합물을 면역침전시키려는 시도에 사용될 것이다. 이 단백질이 면역침전되거나 항체 상에 포회될 수 있는 경우, 이는 펩티드가 스캐폴드 단백질에 의해 요구되는 바와 같이 용매에 제시되었음을 나타낸다. 또다르게, 또는 대안적으로, 펩티드가 용매에 제시되고 있다는 지시는 인산화 연구에 의해 얻어질 수 있다. 포스페이트 수용자 부위를 표적 펩티드 내로 혼입시킨 후, 스캐폴드-펩티드 융합물을 인산화를 허용하는 조건에서 동족 키나제와 접촉시킴으로써, 용매에의 펩티드의 제시는 확인될 수 있다. 펩티드의 인산화는 용매에의 정확한 제시를 지시한다.
스캐폴드 단백질은 본원에 교시된 바와 같은 펩티드 삽입, 즉, 이종 펩티드 삽입 ('표적' 펩티드)을 수용할 수 있어야 한다. 바람직하게는 펩티드 삽입은 36 아미노산 이하, 바람직하게는 20 아미노산 이하이다. 바람직하게는 펩티드 삽입은 12 아미노산 이하이다.
그것이 갖는 표적 펩티드에 의해 변형되는 스캐폴드 단백질의 저항성에 관하여, 이는 원편광 이색성과 같은 기법을 사용하여 시험될 수 있다. 구체적으로, 그 내로 삽입된 표적 펩티드가 없는 스캐폴드 단백질의 원편광 이색성 분석은 표적 펩티드를 함유하는 경우 동일한 스캐폴드 단백질의 원편광 이색성 특징과 실질적으로 동일해야 한다. 이는 스캐폴드 단백질에서의 표적 펩티드의 존재가 그것을 함유하는 스캐폴드 단백질의 구조를 손상시키거나 변형시키지 않았다는 입증을 제공한다.
예를 들어, 근거리 UV CD 스펙트럼은 방향족 측쇄의 환경에 대해 보고한다. 근거리 UV CD 스펙트럼에서의 양성 또는 음성의 피크는 방향족 잔기 주위의 환경이 고정됨을 지시한다. 이는 고정된 3차 구조를 갖는 단백질로서 해석된다. 이종 펩티드를 본원에 교시된 바와 같은 삽입 부위(들) 내로 혼입시키는 것은 적합하게는 "비어있는" 스캐폴드와 동일한 형상을 갖는 근거리 UV CD 스펙트럼을 초래하며, 이는 이종 펩티드의 첨가가 스캐폴드 단백질의 3차 구조를 파괴하지 않았음을 지시한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 실현될 것인 바와 같이, 스펙트럼은 상이한 규모를 가질 수 있으며, 예를 들어 피크는 보다 높을 수 있고/거나, 트로프는 보다 낮을 수 있지만, 동일한 형상화된 스펙트럼의 보유는 중요한 인자이다.
예를 들어, 원거리 UV CD 스펙트럼은 전체 2차 구조에 대해 보고한다. 알파-나선, 베타-가닥 및 무작위 코일은 모두 별개로 상이한 원거리 UV CD 스펙트럼을 갖는다. 이종 펩티드를 본원에 교시된 바와 같은 삽입 부위(들) 내로 혼입시키는 것은 "비어있는" 스캐폴드와 동일한 형상을 갖는 원거리 UV CD 스펙트럼을 초래하며, 이는 이종 펩티드의 첨가가 스캐폴드 단백질의 전체 2차 구조를 파괴하지 않았음을 지시한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 실현될 것인 바와 같이, 스펙트럼은 상이한 규모를 가질 수 있으며, 예를 들어 피크는 보다 높을 수 있고/거나, 트로프는 보다 낮을 수 있지만, 동일한 형상화된 스펙트럼의 보유는 중요한 인자이다.
적합하게는 스캐폴드 단백질은 표적 펩티드를 속박한다. 스캐폴드 단백질에서의 속박 효과의 존재는 표적 펩티드가 스캐폴드 단백질에 있는 경우의 표적 펩티드에 결합하는 실체의 친화도를 펩티드가 스캐폴드 단백질에 있지 않은 경우의 친화도와 비교함으로써 입증될 수 있다. 이들 2가지 친화도의 차이는 스캐폴드 단백질이 특정 3차원 입체형태를 가정하는 펩티드를 속박하고 있음을 지시한다. 적합하게는 스캐폴드 단백질은 펩티드를 속박하므로, 이것은 스캐폴드 단백질의 맥락에서 존재하는 경우 증가된 결합 친화도를 입증한다. 다시 말해서, 적합하게는 스캐폴드 단백질은 결합의 엔트로피 비용을 감소시키며, 따라서 유리 펩티드의 결합과 비교할 경우 측정된 친화도를 증가시킨다.
스캐폴드 단백질은 적합하게는 생물학적으로 중성이다. '생물학적으로 중성'이란 다른 단백질과의 공지된 상호작용이 폐기되었음을 의미한다. 더욱이, 단백질에 의해 소유되는 임의의 신호전달 능력은 바람직하게는 제거된다. 스테핀 A 기재 스캐폴드의 생물학적 중성을 위한 돌연변이는 공지되어 있으며, 바람직한 예는 본원에서 논의된다. 생물학적 중성을 위한 이러한 돌연변이와 열 안정성의 조정을 위한 본원에 교시된 돌연변이의 조합은 명백하게 고려된다.
적합하게는 본 발명의 폴리펩티드는 스캐폴드 단백질이다.
또다른 측면에서, 본 발명은 스캐폴드 단백질로서의 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다.
열 안정성
본 발명의 핵심적 부분은 열 안정성의 조정이다. 본 발명의 지식 없이, 원칙적으로 본 발명의 폴리펩티드에서의 임의의 잔기를 돌연변이시키는 것은 열 안정성의 변화를 초래할 수 있다. 그러나, 본 발명자들은 단백질을 그의 구조의 모든 수준에서 상세히 연구하였으며, 열 안정성에 영향을 미치기 위해 단백질의 특정 변화를 설계하였다. 놀랍게도, 본 발명자들이 설계한 돌연변이의 전부가 예상되는 효과를 생성하지는 않았다. 따라서, 스캐폴드 단백질에서 열 안정성에 영향을 미치는 돌연변이를 생성하는 것과 연관된 큰 정도의 비예측가능성이 있다. 상당한 지적 노력 및 실험의 결과로서, 본 발명자들은 어느 잔기가 열 안정성에 영향을 미치는 데 사용될 수 있는 지에 관한 본원에 제시된 매우 상세한 교시에 도달하였다.
또한, 비교 목적을 위해, 놀랍게도 안정성에 대한 효과를 갖지 않거나 중성 효과를 갖는 잔기를 나타내는 다양한 데이터, 예컨대 Tm이 포함된다 - 그들 데이터는 본 발명이 어떻게 관련 기술분야로부터의 예측에 의해 도달될 수 없었는지를 추가로 예시한다.
열 안정성은 관련 기술분야에 공지된 임의의 적합한 수단에 의해 평가될 수 있다. 가장 적합하게는 열 안정성은 적합하게는 Tm을 측정함으로써 판독되거나 평가된다. 따라서, 적합하게는 '열 안정성'에 대한 언급은 'Tm'에 대한 언급으로서 이해될 수 있다. 맥락으로부터 달리 명백하지 않다면, '개선된' 열 안정성/Tm은 증가된 열 안정성/Tm을 의미한다. '증가된'은 상대적 용어이다 - 맥락으로부터 달리 명백하지 않다면, '증가된'은 '야생형 스테핀 A에 비해 증가된'을 의미한다. 다시 말해서, 언급된 위치에 야생형 아미노산 잔기를 갖는 스테핀 A에 비해; 가장 적합하게는 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 갖는 야생형 스테핀 A에 비해.
본원에 제시된 대다수의 측정은 hSteA Y35W에 비한 것임이 주목되어야 하며; hSteA에 대한 동일한 상대적 차이는 과학적 가정이다.
열 안정성의 평가를 제공하는 것 외에도, Tm은 스캐폴드 단백질이 얼마나 용이하게 제조되는 지를 평가하기 위한 우수한 대용물이다 - 보다 높은 Tm을 갖는 스캐폴드는 유리하게는 제조하기가 보다 용이하다. 더욱이, Tm의 증가는 단백질이 "더 딱딱하고", 따라서 이종 펩티드 삽입의 수용에 보다 양호하게 적합함을 나타낼 수 있다. 더욱이, Tm은 안정성의 우수한 지표이며, 예를 들어 단백질의 저장 수명은 유리하게는 그것이 보다 안정한, 즉, 보다 높은 Tm을 갖는 경우 증가될 수 있다. 더욱이, 증가된 Tm은 추가의 이점(들), 예컨대 하류 포맷팅에서 개선된 성능, 장기 안정성, 및/또는 검정 설계에서 유연성을 제공할 수 있다.
단백질의 Tm은 또한 변성 중점으로 공지되어 있으며, 폴딩된 및 비폴딩된 상태 둘 다가 평형에서 동등한 양 또는 집단으로 존재하는 온도로서 정의된다. Tm은 이 방식에서 2가지 상태 단백질 폴딩을 가정하여 측정된다.
본원에서 주어진 Tm 값은 본 발명의 '비어있는' 폴리펩티드 / 스캐폴드 단백질, 즉, 이종 펩티드 삽입이 없는 스캐폴드 단백질을 지칭한다 (달리 지시되지 않는다면). 이종 서열(들)의 삽입은 열 안정성, 예컨대 Tm을 감소시킬 수 있고, 종종 그러하며, 따라서 가장 유의미한 값은 비어있는 스캐폴드 단백질이 비교되는 경우 얻어진다.
용융 온도는 단백질 안정성의 특히 유용한 지표이다. 본원에 사용된 바와 같은 용융 온도는 열 언폴딩 전이의 명시 중점을 의미한다. 폴딩된 및 언폴딩된 단백질의 상대적 비율은 시차 주사 열량측정법, UV 차이 분광법, 형광, 원편광 이색성 (CD), 또는 NMR을 비롯한 통상의 기술자에게 공지된 임의의 기법에 의해 측정될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Pace, C. Nick, and J. Martin Scholtz. "Measuring the conformational stability of a protein." Protein structure: A practical approach 2 (1997): 299-321] 참조).
측정 기법
동일한 특성, 예컨대 Tm을 평가하기 위해 대안적 측정 기법을 사용하는 것이 가능하다. Tm을 측정하기 위한 바람직한 기법으로는 옵팀 (Optim) (가장 적합하게는 옵팀 2) 및/또는 시차 주사 열량측정법 (DSC)을 들 수 있다. 가장 적합하게는 열 안정성, 예컨대 Tm의 평가는 임의의 시판되는 기기를 사용한 시차 주사 열량측정법 (DSC)에 의해, 및/또는 아벡타 아날리티칼 (Avacta Analytical) (영국 LS23 7FA 웨더비 애쉬 웨이 토프 아크 에스테이트 유닛 20)로부터 및/또는 언체인드 랩스 (Unchained Labs) (미국 94566 캘리포니아주 플리샌톤 콜 센터 파크웨이 6870)로부터 시판되는 '옵팀 2' 고 처리량 단백질 안정성 기기 ('Optim 2' High Throughput Protein Stability Instrument) (유닛 (UNit)으로도 공지됨)를 사용함으로써 수행된다.
보다 상세하게는, 특성이 2가지 상이한 기법에 의해 측정되는 경우 동일한 절대 값을 생성할 가능성이 있지 않음은 임의의 과학자/관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 인정될 것이다. 옵팀에 의해 측정된 및 DSC에 의해 측정된 Tm은 매우 유사한 값을 생성한다고 말했지만, 때때로 정확하게 동일한 값은 아니다. DSC에 의해 측정된 Tm 및 옵팀에 의해 측정된 Tm은 변화의 동일한 지시를 생성한다. 따라서, 폴리펩티드의 Tm이 옵팀에 의해 측정되고, 동일한 폴리펩티드의 Tm이 DSC에 의해 측정되는 경우, 이들은 정확하게 동일한 절대 값을 제공하지 않을 수 있지만, 이들은 둘 다 변화의 동일한 지시, 예를 들어 +10℃를 제공할 것이다. 더욱이, 개별적 폴리펩티드의 순위는 양쪽 기법을 사용하여 동일하다. 따라서, 통상적인 과학적 실시에 따르면, 인용된 절대 값은 측정하는 데 사용되는 기법에 따라 약간 다양할 수 있음을 유념해야 한다. 달리 언급되지 않는다면, 본원에서 값은 적합하게는 옵팀에 의해 측정된다. 옵팀의 이점으로는 그것이 매우 빠르고, 그것이 투입 물질을 거의 사용하지 않고 신뢰성 있다는 것을 들 수 있다. 옵팀의 한 가지 제한은 Tm이 95℃ 미만, 적합하게는 92℃ 미만, 가장 적합하게는 90℃ 미만인 경우 측정이 가장 신뢰성 있다는 점이다. DSC의 이점은 그것이 보다 높은 온도에서 매우 잘 작동하고, 간섭 효과를 회피하는 데 약간 더 좋을 수 있다는 점이다. 따라서, 절대 Tm을 측정하려고 시도하는 것이 바람직한 경우, DSC는 선택의 측정 기법일 것이다. 그러나, 개별적 폴리펩티드의 "델타" 또는 차이를 측정하는 경우 실질적인 문제로서, 옵팀은 매우 편리하고, 매우 신뢰성 있으며, 사용하기에 강력한 기법이다. 달리 언급되지 않는다면, 본원에서 제공된 값은 옵팀을 사용하여 측정된다. 모든 상황에서, 동일한 측정 기법을 사용하여 측정된 개별적 폴리펩티드 사이의 측정을 비교하는 것은 모범 과학적 관행이다. 적합하게는 Tm은 DSC 또는 옵팀에 의해 측정된 Tm이다. 가장 적합하게는, Tm은 옵팀에 의해 측정되는 경우의 Tm이다.
가장 적합하게는 안정성, 예컨대 Tm은 안정성, 예컨대 Tm이 본원에 개시된 바와 같은 돌연변이를 함유하는 폴리펩티드 / 스캐폴드 단백질에 대해 평가되는 것과 동일한 방식으로 야생형 스테핀 A에 대해 평가된다. 참조 목적으로, DSC (r/t)에 의해 평가되는 경우 야생형 스테핀 A의 Tm은 89.0℃이다.
비교 목적으로, 선행 기술 SQT 스캐폴드 단백질은 동일한 기법에 의해 평가되는 경우 64.6℃의 Tm을 갖는다.
측정 기법은 하기에 보다 상세하게 논의된다.
유사하게, 인간 SteA는 기재된 바와 같은 이종 펩티드를 돌연변이시키고/거나 삽입하기 전에 스캐폴드에 대한 바람직한 시작점이다. 유리하게는, Y35W 돌연변이는 열 안정성을 용이하게 모니터링하기 위해 측정될 수 있는 신호를 제공하기 위해 포함된다. 따라서, 제공된 많은 또는 대부분의 측정은 Y35W를 포함하는 스캐폴드에서 이루어졌다. 예를 들어, 본 발명자들이 안정성을 3도 증가시키는 N32G에 대한 데이터를 나타내는 경우, 측정은 hSteA Y35W N32G가 hSteA Y35W에 비해 안정성을 3도 증가시킨다는 것이었다.
hSteA Y35W에 대해 측정된 바와 같은 돌연변이의 효과는 hSteA에 대한 것과 동일한 효과를 갖는다는 것은 합리적이고 강력한 과학적 예상이다. 이는 주의깊게 입증되었으며, 본 발명자들은 이를 지지하는 데이터를 제시한다: 본 발명자들은 hSteA 및 hSteA Y35W 둘 다에서 몇몇 돌연변이에 대한 DSC 실험을 수행하였다. 본 발명자들은 이들 데이터를 하기에 포함시키며, 이는 hSteA / hSteA Y35W로부터의 안정성의 차이를 제공하고, 이 예상이 과학적으로 허용됨을 나타낸다:
Figure pct00004
적합하게는 본 발명의 폴리펩티드 / 스캐폴드 단백질은 적어도 90℃, 보다 바람직하게는 적어도 91℃, 보다 바람직하게는 적어도 92℃, 보다 바람직하게는 적어도 94℃, 보다 바람직하게는 적어도 95℃, 보다 바람직하게는 적어도 98℃, 및 가장 바람직하게는 적어도 100℃의 용융 온도 (Tm)를 갖는다.
한 측면에서, 본 발명은 본원에 교시된 바와 같은 돌연변이의 사용에 의해 스테핀 A 폴리펩티드, 예컨대 스테핀 A 스캐폴드 단백질의 열 안정성을 증가시키는 것에 관한 것이다.
또다른 측면에서, 본 발명은 본원에 교시된 바와 같은 돌연변이의 사용에 의한 스테핀 A 폴리펩티드, 예컨대 스테핀 A 스캐폴드 단백질의 열 안정성의 감소에 관한 것이다.
따라서, 한 측면에서, 본 발명은 스테핀 A 폴리펩티드, 예컨대 스테핀 A 스캐폴드 단백질에서 1개 이상의 돌연변이(들)를 생성함으로써 상기 스테핀 A 폴리펩티드, 예컨대 스테핀 A 스캐폴드 단백질의 열 안정성을 증가시키는 방법에 관한 것이며, 돌연변이(들)는
E29M, N32G, T34V, T34R, T34K, Q42E, T45I, T45V, T51F, T51V, T51L, T51I, A59L, A59I, A59V, K63R, M65V, M65I, L67I, N90T, (E29K, K30E, E33K), (A59L, G60N, D61G, N62K), (A59V, D61N, N62K), (G60N, D61G, N62K), (G60N, ΔD61, N62G), ΔD61, (A59L, G60N, ΔD61, N62G), (A59V, G60N, D61G, N62K), (A59I, G60N, D61G, N62K), (A59I, G60N, ΔD61, N62G), (A59V, G60N, ΔD61, N62G), 및 (A59V, ΔD61)로 이루어진 군으로부터 선택되고;
보다 적합하게는
E29M, N32G, T34V, T34R, T45I, T45V, T51F, T51V, T51L, A59L, A59I, M65V, L67I, (E29K, K30E, E33K), (A59L, G60N, D61G, N62K), (A59V, D61N, N62K), (G60N, D61G, N62K), (G60N, ΔD61, N62G), ΔD61, (A59L, G60N, ΔD61, N62G), (A59V, G60N, D61G, N62K), (A59I, G60N, D61G, N62K), (A59I, G60N, ΔD61, N62G), (A59V, G60N, ΔD61, N62G), 및 (A59V, ΔD61)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
따라서, 한 측면에서, 본 발명은 스테핀 A 폴리펩티드, 예컨대 스테핀 A 스캐폴드 단백질에서 1개 이상의 돌연변이(들)를 생성함으로써 상기 스테핀 A 폴리펩티드, 예컨대 스테핀 A 스캐폴드 단백질의 열 안정성을 감소시키는 방법에 관한 것이며, 돌연변이(들)는
A12I, A12V, I16L, V20A, V20I, V20L, Q26E, T31K, N32D, N32H, T34D, T34P, L38A, L38V, L38F, A40I, A40V, Q42D, V48E, V48D, V48G, V48A, V48L, T51A, (V20I, L38A), (V20L, L38A), (V20I, L38V), (V20L, L38V), (Y54D, T83D, Q86E), (G60P, ΔD61, N62P), (G60P, D61P, N62K), (G60P, ΔD61, N62G), (G60P, D61G, N62K), (D61N, N62K) 및 (T83D, Q86E)로 이루어진 군으로부터 선택되고;
보다 적합하게는
A12I, A12V, I16L, V20I, V20L, Q26E, T31K, N32D, N32H, T34D, T34P, L38A, L38V, A40I, A40V, Q42D, V48E, V48G, V48A, T51A, (V20I, L38A), (V20L, L38A), (V20I, L38V), (V20L, L38V), (Y54D, T83D, Q86E), (G60P, ΔD61, N62P), (G60P, D61P, N62K), (G60P, ΔD61, N62G), (G60P, D61G, N62K), (D61N, N62K) 및 (T83D, Q86E)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명은 교시된 돌연변이가 상호의존적이 아니라는 점에서 주목할 만하다 (텍스트에서 달리 언급되지 않는다면). 다시 말해서, 열 안정성에 영향을 미치는 본원에 교시된 돌연변이 (또는 텍스트에서 달리 언급되는 경우 돌연변이의 군)가 독립적인 것은 상이한 순열로 조합되어 본 발명의 동일한 기술적 유익을 달성할, 즉, 열 안정성을 증가시킬 (또는 감소시킬) 수 있다. 따라서, 돌연변이의 특정 하위세트가 본 발명에 따른 폴리펩티드에 사용되는 것이 바람직한 경우, 하위세트는 본원에 개시된 돌연변이의 전체 집합으로부터 선택될 수 있는데, 이는 유리하게는 그들 돌연변이가 그들의 유리한 효과를 산출하기 위해 단백질의 다른 부분에 의존하지 않기 때문이다. 따라서, 열 안정성의 큰 변화가 요구되는 경우, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 개시된 바와 같은 보다 많은 수의 돌연변이를 선택할 것이다. 열 안정성의 증가가 요구되는 경우, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 열 안정성을 증가시키는 본원에 개시된 돌연변이를 선택할 수 있거나, 바람직한 수준의 열 안정성의 증가를 산출하기 위해 조합된 그들 돌연변이의 임의의 하위세트를 선택할 수 있다.
동등하게, 열 안정성의 감소가 요구되는 경우, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 열 안정성을 감소시키는 본원에 개시된 돌연변이를 선택할 수 있거나, 바람직한 수준의 열 안정성의 감소를 산출하기 위해 조합된 그들 돌연변이의 임의의 하위세트를 선택할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드의 열 안정성 (예컨대 Tm)의 조작 또는 조정에 유용한 것으로서 본원에 개시된 돌연변이 각각은 독립적으로 사용될 수 있다. 설명된 바와 같이, 일부 실시양태에서, 통상의 조작자는 보다 높은 열 안정성을 갖는 폴리펩티드를 제공하기 위해 Tm을 증가시키는 데 유용한 각각의 돌연변이를 선택하기를 추구할 수 있다 (달리 언급되지 않는다면, 보다 높은/증가된 또는 보다 낮은/감소된은 그의 서열이 이미 본원에 제공된 야생형 스테핀 A의 열 안정성에 비한 것임). 또다른 세트의 실시양태에서, 통상의 조작자는 야생형 스테핀 A에 비해 폴리펩티드, 예컨대 스캐폴드 단백질의 열 안정성 (예를 들어 Tm)을 감소시키거나 (decrease) 감소시키기 (reduce) 위해 개시된 각각의 돌연변이를 선택할 수 있다. 또다른 세트의 실시양태에서, 통상의 조작자는 열 안정성을 증가시키는 것들로부터 및 열 안정성을 감소시키는 것들로부터 돌연변이를 선택할 수 있다 - 이러한 "혼합된" 실시양태는 유리하게는 통상의 조작자가 이 방식으로 생성된 폴리펩티드 / 스캐폴드 단백질에 대한 보다 정확한 미리 선택된 열 안정성 (예컨대 Tm)에 도달하는 것을 허용할 수 있다. 예를 들어, 특정 열 안정성 (예컨대 Tm)이 바람직한 경우, 어느 특정 돌연변이체를 사용할 지를 선택하는 데 있어서, 통상의 기술자는 (예를 들어) 열 안정성을 바람직한 값을 향해 증가시킬 수 있는 돌연변이를 선택하기 위해 산수를 수행할 것이다. 그러나, 각각의 돌연변이는 열 안정성 (예컨대 Tm)의 증가에 대해 약간 상이한 값을 기여하기 때문에, 또한 전체 바람직한 선택된 열 안정성 값을 "균형화"하기 위해 열 안정성을 감소시키는 것들로부터 1종 또는 돌연변이를 선택하는 것이 필요할 수 있다. 예를 들어, 바람직한 열 안정성이 야생형 스테핀 A보다 6° 더 높은 경우, 각각 열 안정성을 4° 증가시키는 2가지 상이한 돌연변이, 및 열 안정성을 2° 감소시키는 1종의 추가의 돌연변이를 선택함으로써, 야생형 스테핀 A에 비해 6° (+4, +4, -2) 증가된 열 안정성의 전체 효과에 도달하는 것이 가능할 수 있다. 야생형 스테핀 A에 비해 Tm을 증가시키는 것들 및 Tm을 감소시키는 것들 둘 다로부터 선택되는 돌연변이의 조합을 명백하게 포함하는 임의의 이러한 돌연변이의 조합은 통상의 조작자에 의해 사용될 수 있다. 이는 추가의 돌연변이, 예를 들어 생물학적 중성을 달성하는 데 유용한 그러한 돌연변이를 혼입시키는 스캐폴드를 설계하는 경우 중요할 수 있다. 특히, V48 돌연변이, 예컨대 V48D를 사용하는 것이 바람직한 경우, 이는 도메인 교환 이량체화를 억제하며, 따라서 생물학적 중성을 입증하는 데 지극히 유용하다. 그러나, 이 돌연변이는 또한 폴리펩티드 / 스캐폴드 단백질에 대한 불안정화 (열 안정성, 예컨대 Tm을 감소시키는) 효과를 갖는다. 따라서, 열 안정성에 영향을 미치고, 바람직한 값에 도달하기 위해, V48D 생물학적 중성 돌연변이를 선택하는 것의 효과를 "균형화"하기 위해 돌연변이를 선택하는 것이 중요할 것이다. 이 방식으로 설계된 예시적인 폴리펩티드 / 스캐폴드 단백질은 하기 돌연변이를 가질 수 있다: V48D, N32G, M65I (본원에서 3 T2로 지칭됨).
따라서, 예시적인 3t 계열 스캐폴드는 "혼합된" 실시양태의 예이다. 이들은 불안정화 V48D 돌연변이, 더하기 '복원하고' (즉, 불안정화된 보다 낮은 Tm V48D 돌연변이체로부터 Tm을 증가시킴으로써 야생형 Tm을 향해 다시 이동시키고), 그 후 Tm을 추가로 증가시키는 상이한 수의 안정화 돌연변이를 갖는다. 이러한 혼합된 실시양태의 상이한 예의 Tm을 입증하는 데이터는 하기와 같다:
hSteA N32G V48D = 3t1 = 85.6℃
hSteA N32G V48D M65I = 3t2 = 89.2℃
hSteA N32G V48D M65I T51L = 3t3 = 91.6℃
hSteA N32G V48D M65I Q42E = 3t4 = 92.4℃
hSteA N32G V48D Q42E T51L M65I = 3t5 = 94.7℃
명확하게, 야생형 스테핀 A에 비해 열 안정성, 예를 들어 Tm의 보통의 최종 변화를 초래하는 조합된 돌연변이를 갖는 본 발명에 따른 폴리펩티드 / 스캐폴드 단백질을 제조하는 것이 가능할 것이다. 예를 들어, 한 이러한 실시양태는 폴리펩티드 / 스캐폴드 단백질의 최종 Tm이 선택된 돌연변이에 따라 야생형 스테핀 A의 Tm보다 더 높거나 더 낮을 수 있도록, Tm을 저하시키는 V48D 돌연변이를 갖고, 또한 Tm을 상승시키는 본 발명에 따른 1개 이상의 돌연변이를 갖는 폴리펩티드 / 스캐폴드 단백질을 포함할 수 있다. 따라서, 야생형 스테핀 A에 비해 Tm의 변화는 적합하게는 스캐폴드 단백질이 - 청구범위에 정의된 바와 같을 것인 - 본 발명의 스캐폴드 단백질이든 아니든 결정적이지 않지만, 본 발명의 스캐폴드 단백질이 Tm에 영향을 미치기 위한, 예컨대 스테핀 A에 비해 이를 증가시키거나 이를 감소시키기 위한 본원에 교시된 바와 같은 적어도 1개의 돌연변이를 포함할 것이다. 그들 돌연변이(들)가 다른 돌연변이, 예컨대 공지된 V48D 돌연변이와 조합으로 폴리펩티드 / 스캐폴드 단백질에 사용되는 경우, 생성된 폴리펩티드 / 스캐폴드 단백질은 최종 생성물이 야생형 스테핀 A보다 더 높거나 더 낮은 Tm을 갖든지 그렇지 않든지, 열 안정성, 예컨대 Tm에 영향을 미치기 위한 본원에 개시된 돌연변이(들)를 포함함으로써 여전히 본 발명의 일부로서 간주된다.
돌연변이가 야생형 스테핀 A에 비해 Tm을 상승시키는지 저하시키는지 여부의 평가는 적합하게는 돌연변이 (또는 맥락으로부터 명백한 바와 같이 적절할 경우 상호의존적 돌연변이의 군)에 대해 별개로, 즉, 단독으로 생성된 경우 (또는 맥락으로부터 명백한 바와 같이 적절할 경우 상호의존적 돌연변이의 단일 군으로서) 및 그렇게 돌연변이된 폴리펩티드 / 스캐폴드 단백질이 야생형 스테핀 A와 비교되는 경우 측정된다.
그럼에도 불구하고, 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드 / 스캐폴드 단백질은 야생형 스테핀 A에 비해 증가된 열 안정성을 갖는다. 따라서, 적합하게는 폴리펩티드 / 스캐폴드 단백질이 야생형 스테핀 A에 비해 그의 열 안정성, 예컨대 Tm을 저하시키는 돌연변이 (예를 들어 V48D 돌연변이)를 포함하는 경우, 적합하게는 상기 폴리펩티드 / 스캐폴드 단백질은 그 돌연변이 또는 돌연변이들 (예를 들어 V48D 돌연변이)에 의해 유발된 열 안정성, 예컨대 Tm의 감소를 보상하고, 그에 의해 여전히 야생형 스테핀 A에 비해 증가된 열 안정성을 갖는 폴리펩티드 / 스캐폴드 단백질을 초래하는 데 충분한 본원에 개시된 바와 같은 돌연변이를 추가로 포함한다.
따라서, 적합하게는 폴리펩티드 / 스캐폴드 단백질은 야생형 스테핀 A에 비해 적어도 +1℃ 증가된, 적합하게는 야생형 스테핀 A에 비해 적어도 +2℃ 증가된, 적합하게는 적어도 +3℃ 증가된, 적합하게는 적어도 +4℃ 증가된, 적합하게는 적어도 +5℃ 증가된, 적합하게는 적어도 +6℃ 증가된, 적합하게는 적어도 +7℃ 증가된, 적합하게는 적어도 +10℃ 증가된, 적합하게는 적어도 +13℃ 증가된, 적합하게는 적어도 +14℃ 증가된, 적합하게는 적어도 +17℃ 증가된 Tm을 갖는다.
특정 돌연변이 또는 돌연변이의 조합에 대한 이러한 값의 예로는
hSteA N32G M65I +7.6℃
hSteA N32G M65I Q42E +10.0℃
hSteA N32G M65I Q42E T51L +14.4℃
hSteA N32G M65I Q42E T51L A59V dD61 +13.6℃
hSteA N32G M65I Q42E T51L A59V G60N dD61 N62G +17.1℃
를 들 수 있다.
혼합된 실시양태 (즉, 불안정화 돌연변이를 포함하지만, 보상하는 안정화 돌연변이를 갖는 서열)의 예는 생성될 수 있다. 예로서, V48D를 포함하는 스캐폴드는 생성되며, 그들의 Tm은 측정된다 - 값은 하기에 나타내어진다:
hSteA N32G V48D M65I = 3t2; Tm 89.2℃
hSteA N32G V48D M65I T51L = 3t3; Tm 91.6℃
hSteA N32G V48D M65I Q42E = 3t4; Tm 92.4℃
hSteA N32G V48D Q42E T51L M65I = 3t5; Tm 94.7℃
hSteA Y35W V48D N32G Q42E T51L M65I (A59V ΔD61) (E29K K30E E33K) = 3r1; Tm 95.1℃
hSteA Y35W V48D N32G Q42E T51L M65I (A59V G60N ΔD61 N62G) (E29K K30E E33K) = 3r2; Tm >98.3℃
예시적인 스캐폴드, 예컨대 3t1은 야생형 hSteA보다 약간 덜 안정할 수 있으며, 3t2는 대략 hSteA만큼 안정하지만 (hSteA보다 약간 더 안정함), 이러한 스캐폴드는 여전히 유용하다. 예를 들어 3t1은 야생형에 비해 매우 소수의 돌연변이 (단지 3개의 돌연변이)를 가지며, 따라서 양호한 안정성을 갖는 유용한 스캐폴드를 여전히 설계하면서 야생형에 가까운 서열을 유지하는 것 사이에 우수한 절충을 나타낸다. 3t1에서, 불안정화 V48D는 2개의 추가의 안정화 돌연변이에 의해 강하게 보상되며, 이는 매우 안정한 스캐폴드를 초래하지만, 생물학적 중성을 위한 유용한 V48D 돌연변이를 여전히 함유한다.
적합하게는 본 발명의 폴리펩티드는 위치 48에 D, 예컨대 V48D를 포함한다.
열 안정성을 감소시키기
동등하게, 본 발명의 특정 주변 실시양태에서, 폴리펩티드 / 스캐폴드 단백질은 야생형 스테핀 A에 비해 감소된 열 안정성을 가질 수 있다. 따라서, 적합하게는 폴리펩티드 / 스캐폴드 단백질이 야생형 스테핀 A에 비해 그의 열 안정성, 예컨대 Tm을 상승시키는 돌연변이 (예를 들어 N32G 돌연변이)를 포함하는 경우, 적합하게는 상기 폴리펩티드 / 스캐폴드 단백질은 그 돌연변이 또는 돌연변이들 (예를 들어 N32G 돌연변이)에 의해 유발되는 열 안정성, 예컨대 Tm의 증가에 대해 보상하고, 그에 의해 여전히 야생형 스테핀 A에 비해 감소된 열 안정성을 갖는 폴리펩티드 / 스캐폴드 단백질을 초래하는 데 충분한 본원에 개시된 바와 같은 돌연변이를 추가로 포함한다.
참고로, 야생형 인간 스테핀 A는 89.0℃의 Tm을 갖는다.
따라서, 일부 실시양태에서, 적합하게는 폴리펩티드 / 스캐폴드 단백질은 야생형 스테핀 A에 비해 적어도 -1℃ 감소된, 적합하게는 야생형 스테핀 A에 비해 적어도 -2℃ 감소된, 적합하게는 적어도 -3℃ 감소된, 적합하게는 적어도 -4℃ 감소된, 적합하게는 적어도 -5℃ 감소된, 적합하게는 적어도 -6℃ 감소된, 적합하게는 적어도 -7℃ 감소된, 적합하게는 적어도 -8℃ 감소된, 적합하게는 적어도 -9℃ 감소된, 적합하게는 적어도 -10℃ 감소된, 적합하게는 적어도 -11℃ 감소된, 적합하게는 적어도 -12℃ 감소된, 적합하게는 적어도 -13℃ 감소된, 적합하게는 적어도 -15℃ 감소된, 적합하게는 적어도 -16℃ 감소된, 적합하게는 적어도 -21℃ 감소된 Tm을 갖는다.
특정 돌연변이 또는 돌연변이의 조합에 대한 이러한 값의 예로는
hSteA Y35W V20I L38A -16.7℃
hSteA Y35W V20L L38A -15.3℃
hSteA Y35W Y54D T83D Q86E -21.1℃
를 들 수 있다.
보다 적합한 예는
hSteA N32D V48D Y54D T83D Q86E (Tm 대략 58℃)
hSteA V48D Y35W V20A L38A (Tm 대략 57℃)
hSteA V48D Y35W A40I T31K A12I V20I (Tm 대략 50℃)
이다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 불안정화 돌연변이가 예를 들어 실온, 예를 들어 18 내지 24℃에서 정확하게 폴딩되는 스캐폴드 단백질을 유지하면서 선택되어야 함을 알 것이다. 명확하게, 본원에 교시된 모든 불안정화 돌연변이가 SteA 폴리펩티드 내로 동시에 도입되는 경우, 그 폴리펩티드는 실온보다 더 낮은 Tm을 가질 수 있으며, 실제 사용이 제한될 것이다. 따라서, 이 실시양태에서, 적합하게는 본원에 교시된 바와 같은 돌연변이는 25℃ 이상, 적합하게는 30℃ 이상, 적합하게는 40℃ 이상, 적합하게는 50℃ 이상의 Tm을 갖는 폴리펩티드를 초래하는 조합으로 사용된다. 따라서, 이 실시양태에서, 적합하게는 본원에 교시된 바와 같은 돌연변이는 25℃ 이상, 적합하게는 30℃ 이상, 적합하게는 40℃ 이상, 적합하게는 50℃ 이상의 Tm을 갖는 폴리펩티드를 초래하는 조합으로 사용된다. 따라서, 이 실시양태에서, 적합하게는 본원에 교시된 바와 같은 돌연변이는 25 내지 88℃ 이상, 적합하게는 30 내지 88℃ 이상, 적합하게는 40 내지 88℃ 이상, 적합하게는 50 내지 88℃ 이상의 Tm을 갖는 폴리펩티드를 초래하는 조합으로 사용된다.
정확한 폴딩 (예를 들어 구조 또는 입체형태)을 평가하는 것, 예를 들어 근거리 또는 원거리 UV CD 스펙트럼을 사용하는 것은 본원에 교시되어 있다. 따라서, 어떤 의혹이 있는 경우, 통상의 작업자는 단지 점검되는 돌연변이 조합을 갖는 단백질을 제조한 후, 정확한 폴딩 (예를 들어 구조 또는 입체형태)을 평가하고/거나, 본원에 교시된 바와 같은 Tm을 측정할 필요가 있다.
가장 바람직한 실시양태는 야생형 스테핀 A에 비해 증가된 열 안정성을 갖는 것들이다.
P25 부위
P25는 돌연변이될 수 있다. P25 돌연변이체, 예컨대 P25S는 예를 들어 이를 보다 딱딱하게 만듦으로써 폴리펩티드 / 스캐폴드 단백질을 개선시키는 데 유용할 수 있다. P25 부위는 스테핀 A 기재 스캐폴드 단백질의 나선에서 꼬임부에 위치한다. P25를 또다른 잔기 (예컨대 P25S)로 돌연변이시키는 것은 나선에서 꼬임부를 보유한다. P25 돌연변이체, 예컨대 P25S는 유의한 효과, 또는 열 안정성에 대한 효과를 나타내지 않는다.
V48 부위
V48은 도메인 교환 이량체화에 중요하다. 적합하게는 V48은 도메인 교환 이량체화를 방지하거나 억제하기 위해 돌연변이된다. 가장 적합하게는 V48은 V48D이다.
V48은 또한 카텝신 (Cathepsin) 결합에 중요하다. 따라서, 우수한 생물학적 중성을 위해 적합하게는 V48은 돌연변이된다. 가장 적합하게는 V48은 V48D로 돌연변이된다.
V48G 또는 V48D 돌연변이, 가장 적합하게는 V48D가 사용될 수 있다.
N32 부위
유리하게는 N32 부위는 돌연변이된다. 예를 들어, 이는 N32G로 돌연변이될 수 있다. 이는 폴리펩티드 / 스캐폴드 단백질의 열 안정성을 증가시키는 데 유리한 효과를 갖는다. 또한, 이는 폴리펩티드 / 스캐폴드 단백질로부터 글리코실화 부위를 제거함으로써, 생물학적 중성을 보장하는 것을 돕는 유리한 특성을 갖는다.
N32 부위에서의 다른 돌연변이는 사용될 수 있다. 예를 들어, N32G 돌연변이는 글리코실화될 잔기를 제거함으로써 글리코실화를 방지한다. 그러나, N은 단지 그것이 NXS/T 모티프 (여기서, X는 P를 제외한 임의의 잔기임)에서 인식되는 경우 글리코실화된다. hSteA에서, 이 부위에서의 서열은 NET이다. 본 발명자들은 N을 다른 어떤 것으로, 또는 T를 S 이외의 다른 것으로 돌연변이시킴으로써 글리코실화를 방지할 수 있다. N32G는 가외의 열안정성의 이점을 갖는다. 적합하게는 T34는 S를 제외한 임의의 아미노산에 대해 치환된다. T34E는 그것이 열안정성을 변화시키지 않는다는 특성을 갖는다. N32 또는 T34 돌연변이 중 어느 하나는 요구되는 모티프를 제거함으로써 N32에서 글리코실화를 정지시킬 것이다.
N32G는 나선-캡핑에서 추가의 유익을 갖는다. G는 이 위치에서 평균보다 2배 초과만큼 자주 발견된다. 다음으로 가장 바람직한 것은 히스티딘이며, 가깝게 N이 이어진다. 모든 다른 돌연변이는 나선 캡핑에 N보다 덜 바람직하다. 적합하게는 32에서 히스티딘 (N32H)은 사용되지 않는데, 이는 이 아미노산 잔기가 바람직하지 않을 수 있는 적정가능한 측쇄를 첨가하기 때문이다.
N32G 돌연변이의 추가의 이점은 이것이 폴리펩티드 / 스캐폴드 단백질의 이 영역에서 나선의 말단에서 캡을 최적화한다는 점이다. 따라서, 다른 N32 돌연변이체가 사용될 수 있지만, N32G는 상기 언급된 바와 같은 특정 이점을 산출한다.
통상적으로, 특정 돌연변이가 예를 들어 본원에서 도면 또는 표의 일부에 나타내어진 바와 같이 함께 괄호로 묶어지는 경우, 이는 그들 돌연변이가 적합하게는 함께, 즉, 조합으로 생성됨을 지시한다. 예를 들어 "(T83D,Q86E)"는 동일한 폴리펩티드에서의 "T83D의 치환 및 Q86E의 치환"을 의미한다. 다시 말해서, 함께 괄호로 묶어진 돌연변이는 적합하게는 본 발명에 따른 폴리펩티드 / 스캐폴드 단백질에서 군으로서 생성된다. 이는 예를 들어 한 쌍의 돌연변이가 "전하-교환" 배열로 생성되는 경우 중요할 수 있다 - 이 경우, 전하를 교환시키도록 제1 위치를 돌연변이시키고, 상응하는 반대 전하-교환 돌연변이를 제2 부위에 생성함으로써 최종 폴리펩티드 / 스캐폴드 단백질에서 그들 2개의 잔기 사이의 전하-전하 상호작용을 방지하는 것이 중요하다. 예를 들어, E29K K30E E33K 돌연변이는 표면 전하 돌연변이이고, 적합하게는 군으로서 돌연변이되며, 따라서 함께 괄호로 묶어진 단일 선택안으로서 기재된다: "(E29 K30 E33)", 즉, 적합하게는 모든 3개의 돌연변이 E29K K30E E33K는 본 발명에 따른 개별적 폴리펩티드 / 스캐폴드 단백질에서 생성되거나, 또는 3개의 돌연변이 중 어느 것도 생성되지 않는다. 돌연변이의 (E29K K30E E33K) 세트의 이점은 스캐폴드의 표면 상의 바람직한 쿨롱 상호작용의 형성이다.
참조 서열
적합하게는 본원에서 모든 서열은 서열 유니프롯 (Uniprot) P01040 (가장 적합하게는 유니프롯 P01040-1)을 갖는 인간 야생형 스테핀 A (시스타틴 A)를 참조로 논의된다. 의혹을 없애기 위해, 이 서열을 하기에 제시한다:
서열식별번호: 1 - 유니프롯 P01040 - 야생형 인간 시스타틴 A
10 20 30 40 50
MIPGGLSEAK PATPEIQEIV DKVKPQLEEK TNETYGKLEA VQYKTQVVAG
60 70 80 90
TNYYIKVRAG DNKYMHLKVF KSLPGQNEDL VLTGYQVDKN KDDELTGF
특정 아미노산 잔기가 수치 주소를 사용하여 본원에서 언급되는 경우, 넘버링은 야생형 스테핀 A (시스타틴 A) 아미노산 서열 (또는 핵산을 언급하는 경우 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열)을 참조로 취해진다. 야생형 스테핀 A (시스타틴 A)를 코딩하는 예시적인 핵산은
서열식별번호: 2 (DNA 서열; 인공 (천연이 아님); 아미노산 서열 서열식별번호: 1을 사용하여 이. 콜라이에서의 발현에 적합한 코돈-최적화된 DNA 서열을 생성하였다):
ATGATTCCTGGTGGTTTGTCGGAAGCCAAACCGGCTACTCCGGAAATCCAGGAGATTGTGGACAAAGTCAAACCGCAACTGGAGGAAAAGACCAATGAAACCTATGGCAAACTCGAAGCGGTACAGTACAAAACCCAAGTCGTTGCGGGTACGAACTACTACATCAAAGTACGCGCAGGAGATAACAAGTATATGCATCTGAAAGTGTTCAAAAGCTTACCAGGGCAGAATGAGGATCTGGTTCTTACGGGCTATCAGGTGGATAAGAACAAAGACGATGAACTGACAGGCTTT
적합하게는 서열 데이터베이스(들)의 현재 버전은 의지된다. 대안적으로, 출원일에 효력이 있는 발표는 의지된다. 의혹을 없애기 위해, 유니프롯 발표 2017_02는 의지된다. 보다 상세하게는, 2017년 2월 15일에 공개된 유니프롯 컨소시엄 유러피언 바이오인포매틱스 인스티튜트 (European Bioinformatics Institute) (EBI), SIB 스위스 인스티튜트 오브 바이오인포매틱스 (Swiss Institute of Bioinformatics) 및 프로테인 인포메이션 리소스 (Protein Information Resource) (PIR)의 유니프롯 날리지베이스 (UniProt Knowledgebase) (UniProtKB) 발표 2017_02는 의지된다. 유니프롯 (유니버셜 프로테인 리소스 (Universal Protein Resource))은 단백질에 대한 정보의 포괄적인 카탈로그이다 ("UniProt: the universal protein knowledgebase" Nucleic Acids Res. 45: D158-D169 (2017)).
이는 관련 기술분야에 널리 이해된 바와 같이 관심 잔기를 위치시키는 데 사용된다. 이는 항상 엄격한 카운팅 활동은 아니다 - 맥락에 대해 주의가 기울여져야 한다. 예를 들어, 관심 단백질이 약간 상이한 길이의 것인 경우, 그 서열에서의 정확한 잔기의 위치는 서열이 정렬되고, 등가의 또는 상응하는 잔기가 선택될 것을 요구할 수 있다. 이는 널리 통상의 독자의 영역 내에 있다.
돌연변이시키는 것은 관련 기술분야에서의 그의 통상적인 의미를 가지며, 1개 이상의 잔기, 모티프 또는 도메인의 치환 또는 말단절단 또는 결실을 지칭할 수 있다. 돌연변이는 폴리펩티드 수준에서, 예를 들어, 돌연변이된 서열을 갖는 폴리펩티드의 합성에 의해 실행될 수 있거나, 뉴클레오티드 수준에서, 예를 들어, 돌연변이된 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 생성함으로써 실행될 수 있으며, 폴리뉴클레오티드는 이어서 번역되어 돌연변이된 폴리펩티드를 생성할 수 있다. 적합하게는, 사용되는 돌연변이는 본원에 제시된 바와 같다. 맥락으로부터 달리 명백하지 않다면, 본원에서 언급된 돌연변이는 치환이다. 예를 들어 'N32G'는 야생형 스테핀 A (서열식별번호: 1)에서 'N32'에 상응하는 잔기가 G로 치환된 것을 의미한다.
서열 변이
본원에 기재된 폴리펩티드는 열 안정성, 예컨대 Tm을 조정하기 위해 본원에 기재된 핵심 돌연변이 외에도 야생형 서열에 비해 서열 변화를 포함할 수 있다. 구체적으로, 본원에 기재된 폴리펩티드는 본원에 기재된 폴리펩티드의 기능 또는 작동을 유의하게 손상시키지 않는 부위에서의 추가의 서열 변화를 포함할 수 있다. 서열 변화는 폴리펩티드 또는 뉴클레오티드 수준에서일 수 있다.
폴리펩티드 기능은 예를 들어 펩티드 구조 또는 입체형태가 유의하게 변경되지 않았음을 입증하기 위해, 실시예 섹션에 제시된 바와 같은 방법을 사용하여 용이하게 시험될 수 있다. 따라서, 폴리펩티드가 본원에 제시된 바와 같이 용이하게 시험될 수 있는 그의 구조 또는 입체형태를 보유한다면, 서열 변이는 야생형 참조 서열에 비해 폴리펩티드에 생성될 수 있다.
예를 들어, 폴리펩티드는 근거리 및 원거리 UV CD 스펙트럼을 평가함으로써 그것이 그의 구조 또는 입체형태를 보유하는 지를 알기 위해 시험될 수 있으며; 이들은 각각 0.6 mg/mL 및 0.2 mg/mL에서 혼화성 완충제 (예를 들어 50 mM 인산나트륨, pH 7.4)에서 기록된다. 스펙트럼은 샘플 스펙트럼으로부터 완충제 스펙트럼을 빼고, 단위를 몰 타원율 (근거리 UV CD 스펙트럼에 대해) 또는 평균 잔류 타원율 (원거리 UV CD 스펙트럼)로 전환시킴으로써 가공된다. 근거리 UV CD 스펙트럼은 단일 트립토판이 위치 35에 존재하는 경우, 275 nm 내지 280 nm에서 최댓값, 및 295 nm 주위에서 추가 최솟값을 가질 것이다. 이는 상이한 위치가 트립토판에 대해 선택되는 경우 최대일 수 있다. 원거리 UV CD 스펙트럼은 218 nm 주위에서 최솟값을 갖는 전형적인 베타-쉬트 단백질의 그것을 닮을 것이다. 이들 조건이 충족되는 경우, 폴리펩티드는 정확한 구조 또는 입체형태를 보유하였다. 근거리 UV CD 스펙트럼이 없거나, 원거리 UV CD 스펙트럼이 208 nm 및 222 nm에서 최솟값, 또는 198 nm에서 최솟값을 갖는 경우, 폴리펩티드는 정확한 구조 또는 입체형태를 보유하지 않았으며, 유의하게 변경되었을 수 있다.
폴리펩티드는 의도적으로 조작될 수 있는 임의의 유형의 추가의 변경 (예를 들어, 아미노산의 삽입, 결실, 또는 치환; 글리코실화 상태의 변화; 재폴딩 또는 이성질체화, 3차원 구조, 또는 자기-회합 상태에 영향을 미치는 변화)을 도입함으로써 생성된 변이체를 포함한다. 변이체는 침묵 변화를 생성하고, 기능적으로 등가의 폴리펩티드를 초래하는 변경을 가질 수 있다. 의도적인 아미노산 치환은 폴리펩티드의 구조 또는 입체형태가 보유되는 한, 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및 양친매성 성질의 유사성에 기초하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 음으로 하전된 아미노산으로는 아스파르트산 및 글루탐산을 들 수 있고; 양으로 하전된 아미노산으로는 리신 및 아르기닌을 들 수 있고; 유사한 친수성 값을 갖는 비하전된 극성 헤드 기를 갖는 아미노산으로는 류신, 이소류신, 발린, 글리신, 알라닌, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 페닐알라닌, 및 티로신을 들 수 있다.
보존적 치환은 예를 들어 하기 표에 따라 이루어질 수 있다. 제2 컬럼에서 동일한 블록에서의 및 적합하게는 제3 컬럼에서 동일한 라인에서의 아미노산은 서로에 대해 치환될 수 있다:
Figure pct00005
무슨 돌연변이, 치환 또는 다른 이러한 변화가 야생형 서열에 비해 생성될 수 있는 지를 고려하는 데 있어서, 폴리펩티드의 구조 또는 입체형태의 보유는 중요하다. 전형적으로 보존적 아미노산 치환은 기능에 유해하게 영향을 미칠 가능성이 더 적을 것이다.
본원에 교시된 바와 같이 열 안정성을 조정하기 위해 폴리펩티드를 조작하는 경우, 아미노산
A12I, A12V, I16L, V20A, V20I, V20L, Q26E, E29M, T31K, N32G, N32D, N32H, T34V, T34R, T34K, T34D, T34P, L38A, L38V, L38F, A40I, A40V, Q42E, Q42D, T45I, T45V, V48E, V48D, V48G, V48A, V48L, G50S, T51F, T51V, T51L, T51I, T51A, A59L, A59I, A59V, K63R, M65V, M65I, L67I, N90T, (V20I, L38A), (V20L, L38A), (V20I, L38V), (V20L, L38V), (E29K, K30E, E33K), (Y54D, T83D, Q86E), (A59L, G60N, D61G, N62K), (A59V, D61N, N62K), (G60N, D61G, N62K), (G60N, ΔD61, N62G), ΔD61, (A59L, G60N, ΔD61, N62G), (A59V, G60N, D61G, N62K), (A59I, G60N, D61G, N62K), (A59I, G60N, ΔD61, N62G), (A59V, G60N, ΔD61, N62G), (A59V, ΔD61), (G60P, ΔD61, N62P), (G60P, D61P, N62K), (G60P, ΔD61, N62G), (G60P, D61G, N62K), (D61N, N62K), 및 (T83D, Q86E)
중 1개 이상은 본원에 교시된 바와 같이 치환되어야 하거나, 치환되지 않는 경우, 적합하게는 서열식별번호: 1에 상응해야 한다. 서열식별번호: 1에 나타내어진 것 이외의 잔기 또는 본원에 교시된 것 이외의 치환은 적합하게는 이들 위치에 사용되지 않는다.
본원에 교시된 바와 같이 열 안정성을 증가시키기 위해 폴리펩티드를 조작하는 경우, 아미노산
E29M, N32G, T34V, T34R, T34K, Q42E, T45I, T45V, T51F, T51V, T51L, T51I, A59L, A59I, A59V, K63R, M65V, M65I, L67I, N90T, (E29K, K30E, E33K), (A59L, G60N, D61G, N62K), (A59V, D61N, N62K), (G60N, D61G, N62K), (G60N, ΔD61, N62G), ΔD61, (A59L, G60N, ΔD61, N62G), (A59V, G60N, D61G, N62K), (A59I, G60N, D61G, N62K), (A59I, G60N, ΔD61, N62G), (A59V, G60N, ΔD61, N62G), 및 (A59V, ΔD61)
중 1개 이상은 본원에 교시된 바와 같이 치환되어야 하거나, 치환되지 않는 경우 적합하게는 서열식별번호: 1에 상응해야 한다. 서열식별번호: 1에 나타내어진 것 이외의 잔기 또는 본원에 교시된 것 이외의 치환은 적합하게는 이들 위치에 사용되지 않는다.
본원에 교시된 바와 같이 열 안정성을 감소시키기 위해 폴리펩티드를 조작하는 경우, 아미노산
A12I, A12V, I16L, V20A, V20I, V20L, Q26E, T31K, N32D, N32H, T34D, T34P, L38A, L38V, L38F, A40I, A40V, Q42D, V48E, V48D, V48G, V48A, V48L, G50S, T51A, (V20I, L38A), (V20L, L38A), (V20I, L38V), (V20L, L38V), (Y54D, T83D, Q86E), (G60P, ΔD61, N62P), (G60P, D61P, N62K), (G60P, ΔD61, N62G), (G60P, D61G, N62K), (D61N, N62K) 및 (T83D, Q86E)
중 1개 이상은 본원에 교시된 바와 같이 치환되어야 하거나, 치환되지 않는 경우 적합하게는 서열식별번호: 1에 상응해야 한다. 서열식별번호: 1에 나타내어진 것 이외의 잔기 또는 본원에 교시된 것 이외의 치환은 적합하게는 이들 위치에 사용되지 않는다.
본원에 교시된 바와 같이 형광/흡광도를 위한 방향족 잔기(들)를 제공하기 위해 폴리펩티드를 조작하는 경우, 아미노산 Y35W, Y43W, Y53W, Y54W, Y64W, F70W 또는 Y85W 중 1개 이상은 본원에 교시된 바와 같이 치환되어야 하거나, 치환되지 않는 경우 적합하게는 서열식별번호: 1에 상응해야 한다. 서열식별번호: 1에 나타내어진 것 이외의 잔기 또는 본원에 교시된 것 이외의 치환은 적합하게는 이들 위치에 사용되지 않는다.
적합하게는 본 발명의 폴리펩티드는 위치 35에 W, 예를 들어 Y35W를 포함한다.
Y85W는 고유 형광 방출 스펙트럼의 BCM에 의해 판단된 바와 같이 언폴딩 시 명확한 전이 및 hSteA에 비해 개선된 흡광도 특성을 나타내지만, 원 형광 방출 스펙트럼의 진폭의 자명한 개선은 없음이 주목되어야 한다. 의혹을 없애기 위해, Y85W는 여전히 언폴딩에서 전이에 사용될 수 있다 - 작은 개선이 제공된다. 따라서, 이 돌연변이는 전이를 관찰하는 데 여전히 유용하지만, 형광을 매우 많이 증가시키지는 않지만, 여전히 이 환경에서 작동한다.
본원에 교시된 바와 같이 생물학적 중성을 위해 폴리펩티드를 조작하는 경우, 하기 표로부터의 1종 이상의 아미노산은 본원에 교시된 바와 같이 치환되어야 하거나, 치환되지 않는 경우 적합하게는 서열식별번호: 1에 상응해야 한다. 서열식별번호: 1에 나타내어진 것 이외의 잔기 또는 본원에 교시된 것 이외의 치환은 적합하게는 이들 위치에 사용되지 않는다:
Figure pct00006
Figure pct00007
단백질 사이에 덜 보존된 잔기는 돌연변이를 내성화할 가능성이 보다 많다.
전체적으로, 서열식별번호: 1에 비해 15개만큼 많은 치환은 열 안정성을 증가시키기 위해 생성될 수 있다.
또한, 서열식별번호: 1에 비해 2개만큼 많은 치환은 생물학적 중성을 위해 생성될 수 있다.
또한, 서열식별번호: 1에 비해 1개만큼 많은 치환은 형광/흡광도를 위한 방향족 잔기(들)를 제공하기 위해 생성될 수 있다.
따라서, 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 1에 비해 18개 이하의 치환을 갖는 폴리펩티드(들)에 관한 것이다.
예로서, 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 1에 비해 하기 치환을 갖는 폴리펩티드에 관한 것이다:
형광을 위해 1개 (예를 들어 Y35W); 생물학적 중성을 위해 2개 (예를 들어 N32G, V48D); Tm (T34, Q42, T45, T51, K63, M65, L67, N90 (이들은 모두 단일 돌연변이임), E29K K30E E33K (전하 상호작용), A59 G60 D61 N62 (b-턴)을 위해 15개.
상기 명백하게 언급된 것들 이외의 1개 이상의 잔기의 추가의 돌연변이, 가장 적합하게는 치환은 폴리펩티드의 구조 또는 입체형태가 보유된다면 생성될 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 1에 비해 25개 이하의 돌연변이, 가장 적합하게는 치환을 갖는 폴리펩티드(들)에 관한 것이다.
예를 들어 (1 - 신규하고 Tm이 증가되거나 감소됨):
Figure pct00008
X1, 여기서 야생형은 A이고, 돌연변이는 I, V임
X2, 여기서 야생형은 I이고, 돌연변이는 L임
X3, 여기서 야생형은 V이고, 돌연변이는 I, L임
X4, 여기서 야생형은 Q이고, 돌연변이는 E임
X5, 여기서 야생형은 E이고, 돌연변이는 M임
X7, 여기서 야생형은 T이고, 돌연변이는 K임
X8, 여기서 야생형은 N이고, 돌연변이는 G, D, H임
X10, 여기서 야생형은 T이고, 돌연변이는 V, R, D, P임
X11, 여기서 야생형은 L이고, 돌연변이는 A, V임
X12, 여기서 야생형은 A이고, 돌연변이는 I, V임
X13, 여기서 야생형은 Q이고, 돌연변이는 D임
X14, 여기서 야생형은 T이고, 돌연변이는 I, V임
X15, 여기서 야생형은 V이고, 돌연변이는 E, G, A임
X16, 여기서 야생형은 T이고, 돌연변이는 F, V, L, A임
X18, 여기서 야생형은 A이고, 돌연변이는 L, I임
X20, 여기서 야생형은 D이고, 돌연변이는 Δ임
X22, 여기서 야생형은 M이고, 돌연변이는 V임
X23, 여기서 야생형은 L이고, 돌연변이는 I임
(X3, X11), 여기서 야생형은 (V, L)이고, 돌연변이는 (I, A), (L, A), (I, V), (L, V)임
(X5, X6, X9), 여기서 야생형은 (E, K, E)이고, 돌연변이는 (K, E, K)임
(X17, X24, X25), 여기서 야생형은 (Y, T, Q)이고, 돌연변이는 (D, D, E)임
(X18, X19, X20, X21), 여기서 야생형은 (A, G, D, N)이고, 돌연변이는 (L, N, G, K), (L, N, Δ, G), (V, N, G, K), (I, N, G, K), (I, N, Δ, G), (V, N, Δ, G)임
(X18, X20, X21), 여기서 야생형은 (A, D, N)이고, 돌연변이는 (V, N, K)임
(X18, X20), 여기서 야생형은 (A, D)이고, 돌연변이는 (V, Δ)임
(X19, X20, X21), 여기서 야생형은 (G, D, N)이고, 돌연변이는 (N, G, K), (N, Δ, G), (P, Δ, P), (P, P, K), (P, Δ, G), (P, G, K)임
(X24, X25), 여기서 야생형은 (T, Q)이고, 돌연변이는 (D, E)임
(X20, X21), 여기서 야생형은 (D, N)이고, 돌연변이는 (N, K)임
따라서, 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 1에 비해 13개 이하의 돌연변이, 가장 적합하게는 치환을 갖는 폴리펩티드(들)에 관한 것이다. 예를 들어 (2 - 신규하고 Tm이 증가됨):
Figure pct00009
X1, 여기서 야생형은 E이고, 돌연변이는 M임
X3, 여기서 야생형은 N이고, 돌연변이는 G임
X5, 여기서 야생형은 T이고, 돌연변이는 V, R임
X6, 여기서 야생형은 T이고, 돌연변이는 I, V임
X7, 여기서 야생형은 T이고, 돌연변이는 F, V, L임
X8, 여기서 야생형은 A이고, 돌연변이는 L, I임
X10, 여기서 야생형은 D이고, 돌연변이는 Δ임
X12, 여기서 야생형은 M이고, 돌연변이는 V임
X13, 여기서 야생형은 L이고, 돌연변이는 I임
(X1, X2, X4), 여기서 야생형은 (E, K, E)이고, 돌연변이는 (K, E, K)임
(X8, X9, X10, X11), 여기서 야생형은 (A, G, D, N)이고, 돌연변이는 (L, N, G, K), (L, N, Δ, G), (V, N, G, K), (I, N, G, K), (I, N, Δ, G), (V, N, Δ, G)임
(X8, X10, X11), 여기서 야생형은 (A, D, N)이고, 돌연변이는 (V, N, K)임
(X9, X10, X11), 여기서 야생형은 (G, D, N)이고, 돌연변이는 (N, G, K), (N, Δ, G)임
(X8, X10), 여기서 야생형은 (A, D)이고, 돌연변이는 (V, Δ)임
따라서, 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 1에 비해 18개 이하의 돌연변이, 가장 적합하게는 치환을 갖는 폴리펩티드(들)에 관한 것이다. 예를 들어 (3 - 신규하고 Tm이 감소됨):
Figure pct00010
X1, 여기서 야생형은 A이고, 돌연변이는 I, V임
X2, 여기서 야생형은 I이고, 돌연변이는 L임
X3, 여기서 야생형은 V이고, 돌연변이는 I, L임
X4, 여기서 야생형은 Q이고, 돌연변이는 E임
X5, 여기서 야생형은 T이고, 돌연변이는 K임
X6, 여기서 야생형은 N이고, 돌연변이는 D, H임
X7, 여기서 야생형은 T이고, 돌연변이는 D, P임
X8, 여기서 야생형은 L이고, 돌연변이는 A, V임
X9, 여기서 야생형은 A이고, 돌연변이는 I, V임
X10, 여기서 야생형은 Q이고, 돌연변이는 D임
X11, 여기서 야생형은 V이고, 돌연변이는 E, G, A임
X12, 여기서 야생형은 T이고, 돌연변이는 A임
(X3, X8), 여기서 야생형은 (V, L)이고, 돌연변이는 (I, A), (L, A), (I, V), (L, V)임
(X13, X17, X18), 여기서 야생형은 (Y, T, Q)이고, 돌연변이는 (D, D, E)임
(X14, X15, X16), 여기서 야생형은 (G, D, N)이고, 돌연변이는 (P, Δ, P), (P, P, K), (P, Δ, G), (P, G, K)임
(X15, X16), 여기서 야생형은 (D, N)이고, 돌연변이는 (N, K)임
(X17, X18), 여기서 야생형은 (T, Q)이고, 돌연변이는 (D, E)임
따라서, 한 실시양태에서, 본 발명은 적합하게는 이종 펩티드 삽입과 함께, 서열식별번호: 1에 비해 28개 이하의 돌연변이, 가장 적합하게는 치환을 가지며, 상기 이종 펩티드 삽입은 서열식별번호: 1에 비해 하기 위치 중 하나에 삽입된 이종 펩티드를 포함하는 것인 폴리펩티드(들)에 관한 것이다:
d) 48-<이종 펩티드>-50,
e) 49-<이종 펩티드>-51,
f) 50-<이종 펩티드>-52,
q) 72-<이종 펩티드>-77,
r) 73-<이종 펩티드>-78; 또는
s) 74-<이종 펩티드>-79. 예를 들어 (9 - Tm이 증가되거나 감소됨):
Figure pct00011
X1, 여기서 야생형은 A이고, 돌연변이는 I, V임
X2, 여기서 야생형은 I이고, 돌연변이는 D임
X3, 여기서 야생형은 V이고, 돌연변이는 A, I, L임
X4, 여기서 야생형은 Q이고, 돌연변이는 E임
X5, 여기서 야생형은 E이고, 돌연변이는 M임
X7, 여기서 야생형은 T이고, 돌연변이는 K임
X8, 여기서 야생형은 N이고, 돌연변이는 G, D, H임
X10, 여기서 야생형은 T이고, 돌연변이는 V, R, K, D, P임
X11, 여기서 야생형은 L이고, 돌연변이는 A, V, F임
X12, 여기서 야생형은 A이고, 돌연변이는 I, V임
X13, 여기서 야생형은 Q이고, 돌연변이는 E, D임
X14, 여기서 야생형은 T이고, 돌연변이는 I, V임
X15, 여기서 야생형은 V이고, 돌연변이는 E, D, G, A, L임
X16, 여기서 야생형은 G이고, 돌연변이는 S임
X17, 여기서 야생형은 T이고, 돌연변이는 F, V, L, I, A임
X19, 여기서 야생형은 A이고, 돌연변이는 L, I, V임
X21, 여기서 야생형은 D이고, 돌연변이는 Δ임
X23, 여기서 야생형은 K이고, 돌연변이는 R임
X24, 여기서 야생형은 M이고, 돌연변이는 V, I임
X25, 여기서 야생형은 L이고, 돌연변이는 I임
X28, 여기서 야생형은 N이고, 돌연변이는 T임
(X3, X11), 여기서 야생형은 (V, L)이고, 돌연변이는 (I, A), (L, A), (I, V), (L, V)임
(X5, X6, X9), 여기서 야생형은 (E, K, E)이고, 돌연변이는 (K, E, K)임
(X18, X26, X27), 여기서 야생형은 (Y, T, Q)이고, 돌연변이는 (D, D, E)임
(X19, X20, X21, X22), 여기서 야생형은 (A, G, D, N)이고, 돌연변이는 (L, N, G, K), (L, N, Δ, G), (V, N, G, K), (I, N, G, K), (I, N, Δ, G), (V, N, Δ, G)임
(X19, X21, X22), 여기서 야생형은 (A, D, N)이고, 돌연변이는 (V, N, K)임
(X20, X21, X22), 여기서 야생형은 (G, D, N)이고, 돌연변이는 (N, G, K), (N, Δ, G), (P, Δ, P), (P, P, K), (P, Δ, G), (P, G, K)임
(X19, X21), 여기서 야생형은 (A, D)이고, 돌연변이는 (V, Δ)임
(X21, X22), 여기서 야생형은 (D, N)이고, 돌연변이는 (N, K)임
(X26, X27), 여기서 야생형은 (T, Q)이고, 돌연변이는 (D, E)임
적합하게는 서열 동일성을 고려하는 경우, 'X'로 표시된 아미노산은 고려되지 않으며; 적합하게는 서열 동일성은 상기와 같이 구체화되거나 정의된 아미노산 잔기 (즉, 비-X 잔기)에 걸쳐 평가된다.
임의의 추가의 지침이 요구되는 경우, 참조 서열이 그 안에 가변 잔기 (예를 들어 'X')를 갖는 경우 서열 동일성을 평가하기 위해, 서열 동일성은 NIH로부터의 프로테인 (Protein) BLAST 서버 (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)를 사용하여 계산된다. 의문 서열은 모든 X (Xn)가 제거된 아미노산 참조 서열이다. 대상 서열은 등가의 잔기가 제거된 의문 서열과 비교되는 관심 서열이다. 그 후, 분석이 실행되고, 동일성 (Ident) 값이 결과로서 취해진다.
예를 들어:
X1 내지 X25를 함유하는 hSteA의 서열 (참조 서열)을 관심 서열과 함께 정렬한다 - 이 실시예에서 개 SteA (cSteA):
Figure pct00012
모든 Xn은 제거되며, 관심 서열 cSteA에서의 상응하는 잔기도 마찬가지이다:
hSteA - 의문 서열
Figure pct00013
cSteA - 대상 서열
Figure pct00014
이들 의문 서열 및 대상 서열을 프로테인 BLAST를 사용하여 비교한다. 결과는 이들 서열이 73개의 잔기 중 59개가 동일한 것이며, 81％ 서열 동일성을 제공한다.
유사하게, 관심 서열이 '갭' 또는 말단절단을 갖는 경우, 예를 들어 참조 서열, 예컨대 서열식별번호: 1보다 더 짧을 경우, 이러한 갭 또는 말단절단은 서열 비교에 의해 평가되고, 상응하게 더 낮은 서열 동일성 값에 기여한다. 이와 관련하여, 서열 동일성은 적합하게는 서열식별번호: 1의 전체 길이에 걸쳐 평가되어야 한다. 통상적으로, 보다 짧은 서열은 단지 관심있는 보다 짧은 서열의 길이에 걸쳐 참조 서열 (서열식별번호: 1)과 비교될 수 있다. 그러나, 맥락으로부터 달리 명백하지 않다면, 서열 동일성 (및 본원에서 언급된 서열 동일성 값)의 논의 / 측정은 적합하게는 말단절단을 '갭'으로서 처리한다. 실제적인 예를 제공하기 위해, 관심 서열이 단지 49 아미노산 길이이고, 서열식별번호: 1 (이는 98 아미노산 길이임)과 비교된 경우, 최대 서열 동일성 점수는 50％일 것이다 (그리고 서열식별번호: 1에 비해 임의의 치환은 서열 동일성 점수를 추가로 감소시킬 것이다). 따라서, 50％의 서열식별번호: 1과 비교된 관심 폴리펩티드에 대한 서열 동일성 점수는 관심 폴리펩티드에서의 적어도 49개의 아미노산 잔기의 존재를 암시하며, 그 중 49개는 서열식별번호: 1에서의 그들의 상응하는 잔기와 동일하다.
적합하게는 잔기가 상기와 같이 돌연변이되지 않는 경우, 이는 상기와 같이 '야생형'이다. 다시 말해서, 적합하게는 잔기가 상기와 같이 돌연변이되지 않는 경우, 이는 hSteA (서열식별번호: 1)에 나타내어진 바와 같다.
서열 동일성
정확성을 위해, 서열 관계는 서열식별번호: 1 (야생형 인간 스테핀 A)에 비해 치환의 관점에서 논의되었다. 그러나, 서열 관계를 서열 동일성의 관점에서 고려하는 것이 바람직할 수 있다.
서열 비교는 육안에 의해, 또는 보다 통상적으로, 용이하게 이용가능한 서열 비교 프로그램의 도움으로 수행될 수 있다. 이들 공개적으로 및 상업적으로 이용가능한 컴퓨터 프로그램은 2개 이상의 서열 사이의 퍼센트 상동성 (예컨대 퍼센트 동일성)을 계산할 수 있다.
퍼센트 동일성은 인접한 서열에 걸쳐 계산될 수 있으며, 즉, 한 서열을 다른 서열과 정렬하고, 한 서열에서의 각각의 아미노산을 다른 서열에서의 상응하는 아미노산과, 한 번에 한 잔기를 직접적으로 비교한다. 이는 "비갭화된" 정렬로 지칭된다. 전형적으로, 이러한 비갭화된 정렬은 단지 상대적으로 짧은 수의 잔기 (예를 들어 50개 미만의 인접한 아미노산)에 걸쳐 수행된다.
이는 매우 간단하고 일관된 방법이지만, 이는 예를 들어 그렇지 않다면 서열의 동일한 쌍에서, 하나의 삽입 또는 결실이 하기 아미노산 잔기가 정렬로부터 놓여지게 할 것이고, 따라서 잠재적으로 전체 정렬 (전체 서열에 걸친 정렬)이 수행되는 경우 퍼센트 상동성 (퍼센트 동일성)의 큰 감소를 초래할 것이라는 점을 고려하지 않는다. 결과적으로, 대부분의 서열 비교 방법은 전체 상동성 (동일성) 점수를 과도하게 페널티하지 않고 가능한 삽입 및 결실을 고려하는 최적 정렬을 생성하도록 설계된다. 이는 "갭"을 서열 정렬에 삽입하여 국소적 상동성/동일성을 최대화하기 위해 시도함으로써 달성된다.
이들 보다 복잡한 방법은 동일한 수의 동일한 아미노산에 대해, 가능한 한 소수의 갭을 갖는 서열 정렬 - 2개의 비교되는 서열 사이의 보다 높은 관련성을 반영함 - 이 많은 갭을 갖는 것보다 더 높은 점수를 달성하게 되도록, 정렬에서 발생하는 각각의 갭에 "갭 페널티"를 할당한다. 갭의 존재에 대해 상대적으로 높은 코스트 및 갭에서의 각각의 후속 잔기에 대해 보다 작은 페널티를 부담하는 "아핀 (Affine) 갭 코스트"가 전형적으로 사용된다. 이는 가장 통상적으로 사용되는 갭 점수화 시스템이다. 높은 갭 페널티는 물론 보다 적은 갭을 갖는 최적화된 정렬을 생성할 것이다. 대부분의 정렬 프로그램은 갭 페널티가 변형되는 것을 허용한다. 그러나, 서열 비교를 위해 이러한 소프트웨어를 사용하는 경우 디폴트 값을 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들어 GCG 위스콘신 베스트핏 (GCG Wisconsin Bestfit) 패키지 (하기 참조)를 사용하는 경우, 아미노산 서열에 대한 디폴트 갭 페널티는 갭에 대해 -12 및 각각의 연장에 대해 -4이다.
따라서, 최대 퍼센트 상동성의 계산은 먼저 갭 페널티를 고려하여 최적 정렬의 생성을 요구한다. 이러한 정렬을 수행하기 위한 적합한 컴퓨터 프로그램은 GCG 위스콘신 베스트핏 패키지 (유니버시티 오브 위스콘신 (University of Wisconsin), 미국; Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12:387)이다. 서열 비교를 수행할 수 있는 다른 소프트웨어의 예로는 BLAST 패키지, FASTA (Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410) 및 GENEWORKS 비교 툴의 스위트를 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
최종 퍼센트 상동성은 동일성의 관점에서 측정될 수 있지만, 정렬 프로세스 자체는 전형적으로 전부-또는-전무 쌍 비교에 기초하지 않는다. 대신, 화학적 유사성 또는 진화적 거리에 기초한 각각의 쌍별 비교에 점수를 할당하는 규모화된 유사성 점수 행렬이 일반적으로 사용된다. 통상적으로 사용되는 이러한 행렬의 예는 BLOSUM62 행렬 - BLAST 프로그램의 스위트에 대한 디폴트 행렬이다. GCG 위스콘신 프로그램은 일반적으로 공개적 디폴트 값 또는 공급되는 경우 관습 기호 비교 표 중 어느 하나를 사용한다. GCG 패키지에 대해 공개적 디폴트 값, 또는 다른 소프트웨어의 경우, 디폴트 행렬, 예컨대 BLOSUM62를 사용하는 것이 바람직하다. 일단 소프트웨어가 최적 정렬을 생성하였으면, 퍼센트 상동성, 바람직하게는 퍼센트 서열 동일성을 계산하는 것이 가능하다. 소프트웨어는 전형적으로 이를 서열 비교의 일부로서 수행하며, 수치적 결과를 생성한다.
적합하게는 본 발명의 폴리펩티드는 서열식별번호: 1과 적어도 80％ 서열 동일성, 보다 적합하게는 서열식별번호: 1과 85％, 보다 적합하게는 88％, 보다 적합하게는 90％, 보다 적합하게는 92％, 보다 적합하게는 94％, 보다 적합하게는 95％, 보다 적합하게는 96％, 보다 적합하게는 97％, 보다 적합하게는 98％, 보다 적합하게는 99％ 동일성을 갖는다.
한 실시양태에서, 보다 적합하게는 본 발명의 폴리펩티드는 고려 하의 본 발명의 폴리펩티드를 정의하는 경우 (예를 들어 첨부된 청구항(들)에서) 치환되는 것으로서 구체적으로 인용된 것들 이외의 것인 서열식별번호: 1의 그러한 잔기와 적어도 80％ 서열 동일성, 보다 적합하게는 85％, 보다 적합하게는 88％, 보다 적합하게는 90％, 보다 적합하게는 92％, 보다 적합하게는 94％, 보다 적합하게는 95％, 보다 적합하게는 96％, 보다 적합하게는 97％, 보다 적합하게는 98％, 보다 적합하게는 99％ 동일성을 갖는다. 다시 말해서, 이 실시양태에서, 보다 적합하게는 퍼센트 서열 동일성은 고려 하의 폴리펩티드의 특정 실시양태에서 구체적으로 정의된 잔기 (예를 들어 치환)를 제외하면서, 서열식별번호: 1에 비해 관심 서열에 대해 평가된다.
적합하게는 임의의 이종 펩티드 삽입은 퍼센트 동일성 계산으로부터 제외된다.
한 실시양태에서, 적합하게는 치환 및 임의의 이종 펩티드 삽입은 정의된 바와 같으며, 서열 동일성은 서열식별번호: 1의 상응하는 잔기에 비해 폴리펩티드의 나머지 '배경' 또는 '백본' 서열에 대해 판단된다.
서열 동일성의 모든 논의에서, 서열식별번호: 1은 길이가 98개 아미노산임이 주목될 것이다. 따라서 각각의 단일 치환은 모든 98개의 아미노산이 고려되는 경우 동일성의 1.020408％ 변화와 등가이다. 상기 값은 가장 가까운 전체 퍼센트 포인트에 대해 주어지며, 폴리펩티드 서열 내의 부분적 아미노산을 치환하는 것이 가능하지 않음을 고려하여 그에 따라 이해되어야 한다. 명확하게 98개 미만의 아미노산이 고려되는 경우 (예를 들어 고려 하의 본 발명의 폴리펩티드를 정의하는 경우 치환되는 것으로 구체적으로 인용된 것들 이외의 것인 서열식별번호: 1의 그러한 잔기에 대한 서열 동일성을 고려하는 경우), 각각의 단일 아미노산 치환은 1.020408％ 초과의 동일성의 변화에 상응할 수 있으며; 통상의 독자는 폴리펩티드 서열 내의 부분적 아미노산을 치환하는 것이 가능하지 않음을 고려하여 그에 따라 값을 해석할 수 있다.
임의의 추가의 지침이 필요한 경우, 하기 표는 퍼센트 서열 동일성 값이 비교되는 잔기의 수 및 비교되는 잔기의 그 수 내에서 생성된 아미노산 치환의 수를 고려하여 얼마나 다양한 지를 나타낸다. 표에서 예 외부의 임의의 추가의 값은 통상의 작업자에 의해 용이하게 계산될 수 있다.
Figure pct00015
아미노산 서열 동일성 값이 특정 폴리펩티드에 대해 주어지는 경우, 통상의 독자는 이 특정 폴리펩티드가 또한 이종 펩티드 삽입을 포함할 것이며, 이것은 서열 동일성을 평가하는 경우 유념해야 함을 알 것이다. 적합하게는 서열 동일성은 서열식별번호: 1의 야생형 스테핀 A 서열에서의 것들에 상응하는 아미노산 잔기에 걸쳐 평가된다. 다시 말해서, 적합하게는 서열 동일성의 평가는 이종 펩티드 삽입 (또는 삽입의 결여)을 포함하지 않지만, 서열식별번호: 1에 존재하는 것들에 상응하는 아미노산에 걸쳐 고려된다.
한 실시양태에서, 보다 적합하게는 서열 동일성은 서열식별번호: 1에 존재하는 것들에 상응하는 아미노산에 걸쳐 고려되지만, 임의의 이종 펩티드 삽입을 제외하고, 고려 하의 청구항에 이미 정의된 임의의 치환을 제외한다.
가장 적합하게는 퍼센트 서열 동일성은 열 안정성 이유로 치환된 것들을 제외한 아미노산 잔기에 대해 계산된다.
일부 적용에 대해, 예를 들어 의도되는 치료 적용에 대해, 사용되는 폴리펩티드 / 스캐폴드 단백질에서의 돌연변이의 수를 최소화하는 것이 바람직하다. 따라서, 일부 실시양태에서, 적합하게는 폴리펩티드 / 스캐폴드 단백질은 야생형 인간 스테핀 A에 비해 5개 이하의 돌연변이, 적합하게는 4개 이하, 적합하게는 3개 이하, 적합하게는 2개 이하의 돌연변이를 포함한다. 이 맥락에서 "돌연변이"는 소수의, 예컨대 5개 이하의 아미노산의 점 돌연변이, 또는 삽입 또는 결실을 지칭한다. 본 발명의 폴리펩티드 / 스캐폴드 단백질 내로의 이종 펩티드의 삽입은 별개로 논의된다. 1개 이상의 이종 펩티드의 삽입은 이 맥락에서 "돌연변이"로서 카운팅되지 않는다. 가장 적합하게는 돌연변이(들)는 치환(들)을 의미한다.
관련 기술분야에서의 표준은 WO 2009/136182에 개시된 바와 같은 SQT 스캐폴드 단백질임이 주목되어야 한다. 이는 64.6℃의 낮은 열 안정성/Tm을 갖는다. 적합하게는 SQT 스캐폴드는 WO 2009/136182의 서열식별번호: 24의 서열을 갖는 스캐폴드 (SQT)이다: MIPRGLSEAK PATPEIQEIV DKVKPQLEEK TNETYGKLEA VQYKTQVLAS TNYYIKVRAG DNKYMHLKVF NGPPGQNADR VLTGYQVDKN KDDELTGF.
따라서, 본 발명의 실시양태는 선행 기술 SQT 스캐폴드에 비해 유의한 이점을 나타낸다. 그러나, 본원에 표현된 비교 값은 맥락으로부터 달리 명백하지 않다면 야생형 스테핀 A에 비한 것임이 주목되어야 한다. 따라서, 야생형 스테핀 A에 비해 감소된 (보다 낮은) Tm을 갖지만, 그럼에도 불구하고 SQT에 비해 개선된 (보다 높은) Tm의 이점을 제공하는 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드 / 스캐폴드 단백질을 갖는 것이 가능하다. 값은 이해의 용이성 및 일관성을 위해 모두 야생형 스테핀 A에 비해 표현되지만 (맥락으로부터 달리 명백하지 않다면), 본 발명의 이점은 결과의 Tm이 야생형 스테핀 A의 그것보다 더 높든지 낮든지 Tm을 조정하는 데 있어서 얻어질 수 있다. 본 발명의 작업자가 목적하는 Tm은 야생형 스테핀 A의 것보다 또는 SQT의 것보다 더 높거나 또는 더 낮을 수 있다. 더 핵심적 이점은 통상의 독자가 이제 본원에 교시된 바와 같이 폴리펩티드 / 스캐폴드 단백질의 Tm을 변경시킬/조정할 수 있게 된 점이다.
적합하게는 본 발명의 스캐폴드는 SQT보다 더 높은, 즉, 64.6℃보다 더 높은 Tm을 갖는다. 가장 적합하게는 본 발명의 스캐폴드는 야생형 스테핀 A보다 더 높은, 즉, 89.0℃보다 더 높은 Tm을 갖는다.
본 발명의 이점은 생물학적으로 중성인 폴리펩티드 / 스캐폴드 단백질이 제공된다는 것이다.
본 발명의 이점은 글리코실화 부위가 결여된 폴리펩티드 / 스캐폴드 단백질이 제공된다는 것이다.
본 발명의 이점은 감소되거나 개선된 이량체화하는 성향을 갖는 폴리펩티드 / 스캐폴드 단백질이 제공된다는 것이다. 이는 이량체화가 스캐폴드가 약물인 경우 약동학을 변화시킬 수 있기 때문에 유리하다. 이는 또한 이량체화가 친화도에 영향을 미칠 수 있고, 따라서 표적과의 상호작용에 영향을 미칠 수 있기 때문에 유리하다. 이는 또한 이량체화가 면역원성에 영향을 미칠 수 있기 때문에 유리하다. 이량체화는 또한 효능제로부터 길항제로 (또는 역도 마찬가지임) 특정 분자의 효과를 변화시킬 수 있다. 또한, 일부의 경우, 이량체화는 시간 경과에 따라 보다 높은-차수 구조 형성 및 불안정성을 촉진시킬 수 있다. 더욱이, 단량체를 갖는 것 (즉, 이량체화의 감소), 예를 들어 단량체가 작은 것의 특정 이점 (예를 들어 종양 침투의 개선)이 있다.
명확하게 통상의 조작자가 이량체를 요망하는 경우, 이량체화 잔기는 그에 따라 처리될 수 있으며, 예를 들어 이것이 특정 적용에 유리한 것으로 간주되는 경우 도메인-변환 이량체화를 허용하는/촉진시키는 야생형, 예컨대 V48로서 보유될 수 있다.
이종 펩티드 삽입
적합하게는 이종 펩티드는 36개 이하의 아미노산, 보다 적합하게는 20개 이하의 아미노산, 보다 적합하게는 12개 이하의 아미노산을 포함한다.
적합하게는 이종 펩티드는 3개 이상의 아미노산, 보다 적합하게는 12개 이상의 아미노산, 보다 적합하게는 20개 이상의 아미노산, 보다 적합하게는 36개 이하의 아미노산을 포함한다.
적합하게는 이종 펩티드는 3 내지 36개의 아미노산, 보다 적합하게는 3 내지 20개의 아미노산, 보다 적합하게는 3 내지 12개의 아미노산, 보다 적합하게는 3 내지 9개의 아미노산, 보다 적합하게는 6 내지 36개의 아미노산, 보다 적합하게는 6 내지 20개의 아미노산, 보다 적합하게는 6 내지 12개의 아미노산, 보다 적합하게는 6 내지 9개의 아미노산, 가장 적합하게는 9개의 아미노산을 포함한다.
본 발명의 이점은 이종 펩티드 삽입이 본원에 교시된 바와 같은 본 발명의 폴리펩티드에 포함되는 경우 열 안정성의 작은 증가가 관찰된다는 것이다.
이종 펩티드 삽입의 위치
이종 펩티드 서열은 아미노산 46 내지 54 사이에 (포함적) (예를 들어 WO 2006/131749 (스캐폴드, 예컨대 'STM'을 기재함) 또는 예를 들어 WO 2009/136182 (스캐폴드, 예컨대 'SQT'를 기재함)에 기재된 바와 같음), 보다 적합하게는 아미노산 46 내지 50 사이에 (포함적), 보다 적합하게는 아미노산 48 내지 50 사이에 (포함적) 삽입될 수 있다. 이 맥락에서, '... 사이에 (포함적)'은 언급된 아미노산이 이종 펩티드 삽입을 위해 결실될 수 있음, 즉, (예를 들어) 46 내지 54의 임의의 또는 모든 아미노산(들)이 결실되고, 이종 펩티드 삽입이 그들 대신 첨가될 수 있음을 의미한다. 따라서 아미노산 46 내지 54를 결실시키고, 이들을 대체하는 삽입은 어구 '아미노산 46 내지 54 사이에'에 의해 포함된다. 아미노산 46 및 아미노산 54가 보유될 필요는 없다 - 펩티드는 그들 '사이에' 있기 위해 아미노산 46 및 아미노산 54의 실제 존재를 요구한다기 보다는 서열식별번호: 1에 관하여 그들 위치 사이에 삽입된다. 아미노산 46 내지 54의 모두가 결실되는 경우, 이는 "45-<이종 펩티드>-55"로서 나타내어질 수 있다.
이종 펩티드 서열은 아미노산 67 내지 84 사이에 (포함적) 삽입될 수 있다. 이종 펩티드 서열은 아미노산 71 내지 73 사이에 (포함적) 삽입될 수 있다. 이종 펩티드 서열은 아미노산 82 내지 83 사이에 (포함적) 삽입될 수 있다. 'Leu 73' 부위는 이종 펩티드 (때때로 '표적 펩티드'로 지칭됨)에 대한 삽입 부위이다. 이는 스테핀 A 단백질의 용매 노출된 루프를 나타내며, 따라서 용매 접근가능한 방식으로 표적 펩티드의 제시를 처리할 수 있다. 용어 'Leu73 삽입'은 인간 SteA의 L73 내지 L80 루프에 가까운 또는 적합하게는 그에서의 (예를 들어 내의) 이종 펩티드의 삽입을 기재하기 위해 본원에서 사용된다. 상기 용어는 인간 스테핀 A의 Leu 80에의 부가(들) 또는 그에서의 삽입(들), 또는 그의 대체를 지칭할 수 있다. 보다 적합하게는 상기 용어는 인간 스테핀 A의 Leu 73에의 부가(들) 또는 그에서의 삽입(들), 또는 그의 대체를 지칭한다. 한 실시양태에서, Leu73 돌연변이는 L73 및 L80 사이의 전체 루프의 이종 펩티드 서열로의 대체를 포함할 수 있다. 이종 펩티드 서열은 아미노산 73 내지 80 사이에 (포함적) 삽입될 수 있다.
예를 들어, 삽입은 이와 같이 이루어질 수 있다 (예로서 SQT 서열을 사용함):
MIPRGLSEAK PATPEIQEIV DKVKPQLEEK TNETYGKLEA VQYKTQVLA[루프2에서의 이종 펩티드 서열]S TNYYIKVRAG DNKYMHLKVF NGP[루프4에서의 이종 펩티드 서열][ΔPGQN]ADR VLTGYQVDKN KDDELTGF
따라서, 적합하게는, 루프 2는 49 및 50 사이에 삽입된 이종 펩티드 서열 (49-<이종 펩티드>-50)을 갖고, 루프 4는 잔기 74 내지 77이 대체되기 때문에 73 및 78 사이에 삽입된 이종 펩티드 서열 (73-<이종 펩티드>-78)을 갖는다.
이종 펩티드 서열은 G4 부위에 삽입될 수 있다. 이종 펩티드 서열은 위치 4에 삽입될 수 있다. 이종 펩티드 서열은 위치 4에 가깝게, 즉, 위치 4 및 폴리펩티드의 중심 사이에, 예컨대 아미노산 4 내지 45 사이에 (포함적), 또는 아미노산 4 내지 44 사이에 (포함적) 삽입될 수 있다. 적합하게는 G4 잔기는 보유된다. 가장 적합하게는 G4 잔기는 G4R로 돌연변이된다. 따라서, 적합하게는 이종 펩티드 서열은 아미노산 5 내지 45 사이에 (포함적), 또는 아미노산 5 내지 44 사이에 (포함적) 삽입될 수 있다. 보다 적합하게는 이종 펩티드 서열은 아미노산 4 및 5 사이에 (포함적), 가장 적합하게는 아미노산 4 직후에 삽입될 수 있으며, 예를 들어 위치 5에서의 삽입이다.
이종 펩티드(들)는 단백질에서 하기 위치 중 적어도 하나에 삽입될 수 있다 (예를 들어 WO2014/125290 (스캐폴드, 예컨대 '식물 아드히론'을 기재함) 참조): β-쉬트의 제1 및 제2 가닥 사이의 루프 (때때로 루프1로 공지됨); 및/또는 β-쉬트의 제3 및 제4 가닥 사이의 루프 (때때로 루프2로 공지됨). 이 맥락에서, 제1, 제2, 제3 및 제4는 단백질 서열에 비해, 즉, 단백질의 N- 에서 C- 말단으로를 의미한다. 적합하게는 이종 펩티드는 이들 위치 둘 다에, 즉, 루프1 및 루프2에 삽입된다.
루프 명명법
폴리펩티드 / 스캐폴드 단백질의 2차 구조는 공개 소스 소프트웨어를 사용하여, 가장 적합하게는 독일의 테크니컬 유니버시티 오브 뮌헨 (Technical University of Munich)으로부터 이용가능한 "PP오픈 (PPopen)"을 사용하여 모델링될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드 / 스캐폴드 단백질에서 구조, 예컨대 루프의 넘버링은 PP오픈 소프트웨어를 사용하여 주어진 체계적 명명을 고수한다.
선행 기술 문서는 비공식적 명명법을 사용하였음이 주목되어야 한다. 따라서, 선행 기술 문서, 예컨대 WO 2006/131749 및/또는 WO 2009/136182 및/또는 WO2014/125290에서의 개시내용은 비공식적 명칭 "루프 1"을 언급할 수 있으며, 이는 사실상 PP오픈 소프트웨어를 통한 체계적 명명을 사용하여 "루프 2"와 관련될 것이다. 하기 표는 단백질의 상이한 구조적 부분의 명명법을 제시하며, 이는 달리 지시되지 않는다면 텍스트 전반에 걸쳐 고수될 것이다.
맥락으로부터 달리 명백하지 않다면, 하기 루프 명명법이 고수된다. 아미노산 잔기 수는 서열식별번호: 1에서와 같거나, 그에 상응한다:
명칭 아미노산 주소 (서열식별번호: 1)
-------------------------------------------------
N-말단 1 - 13
나선 1 14 - 30
루프 1 31 - 37
가닥 1 38 - 48
루프 2 49 - 51
가닥 2 52 - 59
루프 3 60 - 62
가닥 3 63 - 70
루프 4 71 - 78
가닥 4 79 - 85
C-말단 86 - 98 (GH6 태그가 혼입되지 않음)
본원에 사용된 바와 같은 단어 "루프"는 "연결하는 규칙적 2차 구조" (즉, 알파/베타)를 의미한다.
때때로, 비공식적 명명법은 본 발명의 특정 실시양태와 관련되어 사용된다. 예를 들어, 바람직한 스캐폴드는 "3 T" 또는 "3 R"로 지칭될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시양태의 특정 구성은 항상 텍스트에 제시된 바와 같은 돌연변이된 잔기를 구체적으로 참조하여 개시된다.
적합하게는 각각 상이한 이종 펩티드 서열 (가장 적합하게는 스캐폴드 폴리펩티드 당 1개)을 갖는 스캐폴드 폴리펩티드의 집단, 즉, 라이브러리가 생성된다.
'이종'은 그의 자연적 의미를 가지며, 즉, 삽입된 폴리펩티드는 사용된 스테핀 A 서열, 예를 들어 서열식별번호: 1로부터 유래되거나 그에 상응하는 서열에 대해 이종인 아미노산 서열을 갖는다. 따라서, 이종은 또다른 종으로부터를 의미할 수 있고/거나, 인간 야생형 스테핀 A (서열식별번호: 1) 이외의 폴리펩티드로부터를 의미할 수 있다. 가장 적합하게는 이종 폴리펩티드 삽입은 인공 아미노산 서열, 가장 적합하게는 조작자에 의해 설계된 인공 아미노산 서열을 포함한다.
시험 이종 펩티드 삽입이 사용될 수 있으며, 예를 들어 GGS 반복부, 예컨대 GGSGGSGGS를 포함하는 구량체성 펩티드가 사용될 수 있다. 이는 이것이 엔트로피적으로 닫기가 매우 곤란하기 때문에 특히 힘든 펩티드이다. 따라서, 이를 이종 펩티드로서 본 발명의 폴리펩티드 / 스캐폴드 단백질 내로 삽입함으로써, 스캐폴드는 이러한 가용성 및 엔트로피적으로 닫기가 곤란한 루프를 제시하는 데 매우 성능이 좋음이 입증된다. 이러한 루프를 제시하는 능력은 본 발명의 폴리펩티드 / 스캐폴드 단백질의 안정성의 매우 강한 지표이다.
이종 펩티드 삽입에 특히 적합한 부위
본 발명의 폴리펩티드 / 스캐폴드 단백질에서 이종 펩티드 삽입을 위한 가장 바람직한 부위는 그들 자신이 스테핀 A 기재 폴리펩티드 / 스캐폴드 단백질의 선행 기술 개시내용에서의 삽입을 위해 개시된 부위와 상이함이 주목되어야 한다.
단일 삽입 - 루프 2
48-<이종 펩티드>-50
49-<이종 펩티드>-51
50-<이종 펩티드>-52
단일 삽입 - 루프 4
72-<이종 펩티드>-77
73-<이종 펩티드>-78
74-<이종 펩티드>-79
의혹을 없애기 위해, "48-<이종 펩티드>-50"은 서열식별번호: 1의 위치 48에 상응하는 아미노산 및 서열식별번호: 1의 위치 50에 상응하는 아미노산 사이를 의미하는 등이다. 유사하게 "72-<이종 펩티드>-77"은 서열식별번호: 1의 위치 72에 상응하는 아미노산 및 서열식별번호: 1의 위치 77에 상응하는 아미노산 사이를 의미하는 (개재하는 아미노산은 결실됨 (즉, 이종 펩티드 삽입에 의해 대체됨) 등이다.
조합 - 이중 삽입
2개의 삽입, 즉, 루프 2 내로 1개 및 루프 4 내로 1개의 조합은 도 1에 개시된 바와 같이 생성될 수 있다.
추가의 조합
상기 언급된 구체적 예 삽입 외에도, 단일 삽입 또는 이중 삽입은 단백질의 N-말단에서, 예를 들어 상기 논의된 바와 같이 G4 부위에서 또는 근위에서 추가의 삽입과 조합될 수 있다 - 그에 의해 바람직한 경우 이중 삽입 (G4 부위 + 루프 2 또는 G4 부위 + 루프 4) 또는 삼중 삽입 (G4 부위 + 루프 2 + 루프 4)을 생성한다.
가장 적합하게는 이종 펩티드는 잔기 A49를 결실시키면서, 잔기 D48 및 G50 사이에 삽입된다 ("48-<이종 펩티드>-50"으로 지칭됨).
가장 적합하게는 이종 펩티드는 잔기 P74, G75, Q76 및 N77을 결실시키면서, 잔기 L73 및 E78 사이에 삽입된다 ("73-<이종 펩티드>-78"로 지칭됨).
가장 적합하게는 이중 삽입은 48-<제1 이종 펩티드>-50에서 제1 이종 펩티드 및 73-<제2 이종 펩티드>-78에서 제2 이종 펩티드를 삽입함으로써 생성된다.
제1 및 제2 이종 펩티드는 적합하게는 서로 상이하다.
제1 및 제2 및 제3 이종 펩티드는 적합하게는 서로 상이하다.
예시적인 삽입을 나타내는 예시적인 서열은 하기이다 (X=임의의 아미노산; 이들 예에서 이종 펩티드 삽입은 9 아미노산 길이임):
예시적인 스캐폴드 3r2
MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEKETGKTWGKLEAVEYKTQVD48XXXXXXXXXG50LNYYIKVRVN-GKYIHLKVFKSL73XXXXXXXXXE78DLVLTGYQVDKNKDDELTGF
예시적인 스캐폴드 3t4
MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVEYKTQVD48XXXXXXXXXG50TNYYIKVRAGDNKYIHLKVFKSL73XXXXXXXXXE78DLVLTGYQVDKNKDDELTGF
본원에 교시된 구체적인 바람직한 삽입 점은 특정 추가의 이점을 산출한다. 이들 이점은 삽입 부위의 선택에 기인하며, 따라서 유리하게는 본원에 개시된 것들과는 상이한 돌연변이를 갖는 폴리펩티드 / 스캐폴드 단백질에 대해 채용될 수 있다. 다시 말해서, 이 문서에서 생성된 구체적인 삽입 부위의 개시내용은 기술적 특색에 의해 제공된 유리한 특성의 별개의 개시내용이다. 따라서, 한 측면에서, 본 발명은 본원에 개시된 바와 같은 구체적인 위치 (또는 위치들)에 삽입된 이종 펩티드 (또는 이종 펩티드들)를 갖는 폴리펩티드 / 스캐폴드 단백질, 예컨대 스테핀 A 기재 폴리펩티드 / 스캐폴드 단백질에 관한 것일 수 있다. 예를 들어, 단일 삽입 - 루프 2: 48-<이종 펩티드>-50; 49-<이종 펩티드>-51; 50-<이종 펩티드>-52; 단일 삽입 - 루프 4 - 72-<이종 펩티드>-77; 73-<이종 펩티드>-78; 74-<이종 펩티드>-79; 조합 - 이중 삽입 - 2개의 삽입, 즉, 루프 2 내로 1개 및 루프 4 내로 1개의 조합은 도 1에 개시된 바와 같이 생성될 수 있다.
친화성 성숙
친화성 성숙은 관련 기술분야에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, "미니-라이브러리"는 단지 제2 또는 추가의 이종 펩티드 삽입(들)을 다양화하면서 한 이종 펩티드를 관심 결합제로부터 일정하게 유지하면서 구축될 수 있다.
또다른 접근법은 표적과의 상호작용에 가장 중요한 아미노산(들)을 확인하기 위해 이종 펩티드 삽입을 알라닌 스캔하는 것이다.
대안적 접근법은 "민첩한 PCR"을 수행하고, 이종 펩티드 삽입(들)의 생성된 변이체를 표적에 대해 재스크리닝하는 것이다.
야생형 스테핀 A에서, 그의 결합 상대 중 하나 (카텝신)가 스테핀 A 분자의 관련 표면 상의 모든 3개의 루프를 통해 결합함이 이해된다. 따라서, 친화성 성숙에 대한 또다른 접근법은 단백질의 N-말단에서 제3 위치 (스테핀 A의 G4 잔기를 포함하는 영역) 내로 이종 펩티드를 도입하고, 표적에 대해 이종 펩티드의 그 세트를 운반하는 스캐폴드 단백질을 재스크리닝하는 것이다.
본원에 기재된 바와 같이, 'd'는 '의 결실'을 의미한다 - 예를 들어 'dD61'은 'D61의 결실'을 의미한다 - 이는 통상적으로 관련 기술분야에 통상적인 바와 같이 'ΔD61' (즉, 델타 D61)로 나타내어진다. 잔기 넘버링은 항상 인간 야생형 SteA, 즉, 서열식별번호: 1을 따른다.
다시 말해서, 결실 돌연변이가 본 발명에 따른 폴리펩티드 / 스캐폴드 단백질에 생성되는 경우, 인간 야생형 스테핀 A 단백질에 따른 넘버링은 여전히 고수된다. 예를 들어, 아미노산 61이 결실되는 경우, 본 발명의 폴리펩티드 / 스캐폴드 단백질의 그 특정 실시양태의 넘버링은 아미노산 60으로부터 직접적으로 아미노산 62로 진행할 것이다 - 다시 말해서, 아미노산 넘버링은 본 발명의 폴리펩티드 / 스캐폴드 단백질의 특정 바람직한 실시양태에 존재하는 아미노산 각각을 연속적으로 넘버링하도록 조정되기 보다는 인간 야생형 스테핀 A 참조 서열에 비해 보유된다. 이는 통상적이며, 분자 생물학의 분야에서 통상적인 바와 같이 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 이해된다.
이종 펩티드에 대한 다중 삽입 부위가 개시됨이 주목되어야 한다. 따라서, 폴리펩티드 / 스캐폴드 단백질은 단일 이종 펩티드 삽입을 포함할 수 있거나, 2개의 상이한 삽입 부위에 2개의 이종 펩티드 삽입 (즉, 제1 및 제2 부위에 단일 삽입, 전체적으로 총 2개의 이종 펩티드 삽입)을 포함할 수 있거나, 3개의 상이한 삽입 부위에 3개의 이종 펩티드 삽입 (즉, 제1, 제2 및 제3 부위에 단일 삽입, 전체적으로 총 3개의 이종 펩티드 삽입)을 포함할 수 있다. 폴리펩티드 / 스캐폴드 단백질을 포함하는 라이브러리는 폴리펩티드 / 스캐폴드 단백질 당 단일 이종 펩티드 삽입을 포함할 수 있거나, 폴리펩티드 / 스캐폴드 단백질 당 2개의 이종 펩티드 삽입을 포함할 수 있거나, 폴리펩티드 / 스캐폴드 단백질 당 3개의 이종 펩티드 삽입을 포함할 수 있다.
감소된 열안정성을 초래하는 본 발명의 실시양태는 열 처리에 의해 폴리펩티드 / 스캐폴드 단백질의 기능성을 제거하는 것이 바람직한 환경에서 적용을 발견한다. 한 예는 효소가 그것을 설정 온도로 가열함으로써 기능하는 것을 허용하도록 (예를 들어 열-시작 폴리머라제) 효소를 억제하도록 설계된 아피머® 단백질의 Tm을 감소시키는 것이다. 예를 들어, 아피머® 시약, 예컨대 본원에 기재된 바와 같은 이종 펩티드 삽입을 포함하는 폴리펩티드 / 스캐폴드 단백질은 열안정성 핵산 폴리머라제를 억제하는 데 사용될 수 있다. 이들은 PCR 반응 혼합물에서 적용을 발견한다. 예를 들어, 열안정성 핵산 폴리머라제의 엑소뉴클레아제 기능을 억제하는 아피머® 시약, 예를 들어 본 발명에 따른 폴리펩티드 / 스캐폴드 단백질을 생성하는 것이 유용할 수 있다. 이는 프라이머가 PCR 반응 혼합물 내로 사전 혼합된 후, 사용될 때까지 저장되는 경우 특히 유용하다. 열안정성 핵산 폴리머라제의 엑소뉴클레아제 기능이 억제되지 않는 경우, 그 엑소뉴클레아제 기능은 반응 혼합물에서 프라이머를 분해할 수 있다. 그러나, 그 폴리머라제의 엑소뉴클레아제 기능을 억제할 수 있는 본 발명에 따른 폴리펩티드 / 스캐폴드 단백질을 반응 혼합물 내로 포함시킴으로써, 선행 기술 반응 혼합물에서의 이 단점은 회피될 수 있다. 이 시나리오에서, 폴리펩티드 / 스캐폴드 단백질은 PCR 반응이 진행하는 것을 허용하기 위해 탈-기능화될 (예컨대 변성될) 수 있다.
따라서, 적합하게는 이 출원에 사용되는 폴리펩티드 / 스캐폴드 단백질은 그것이 PCR 반응의 제1 열 주기 동안 분해되고 (예컨대 변성되고), 그에 의해 열안정성 폴리머라제의 엑소뉴클레아제 기능의 억제가 반응이 진행하는 것을 허용하면서 제거되도록 감소된 열 안정성을 갖는다.
또다른 예는 표적 단백질과 공동-용리될 수 있지만, 그 후 아피머® 단백질이 표적 단백질보다 더 낮은 Tm을 갖도록 설계되는 가열 단계에 의해 제거되는 (또는 그의 기능이 제거되는) 친화성 리간드이다.
형광
단백질에서 방향족 아미노산, 예컨대 페닐알라닌을 280 nm에서 형광 및/또는 흡광도 특성을 나타내는 대안적 방향족 아미노산에 대해 교환하는 것이 유용할 수 있다. 예를 들어, 페닐알라닌은 티로신 (이는 약한 형광 특성을 가짐)으로 돌연변이될 수 있거나, 트립토판 (이는 강한 형광 특성을 가짐)으로 돌연변이될 수 있다. 야생형 스테핀 A 내에 이들 돌연변이에 대한 8개의 가능한 부위가 있다. 이들은 본 발명자들에 의해 시험되었다. 돌연변이 및 이들 적용에서의 그들의 유용성은 하기 표에 지시된다.
Figure pct00016
1 옵팀 열 램프에 의해 판단된 바와 같음.
2 옵팀 열 램프 동안 고유 형광을 사용하여 측정됨.
이로부터 특정의 상기 돌연변이는 예를 들어 단백질 농도를 측정하는 데 있어서 280 nm에서의 흡광도에 대해 유용하다고 결론내릴 수 있다. 더욱이, 특정 돌연변이는 단백질의 입체형태의 변화, 예컨대 단백질 언폴딩을 모니터링하는 데 도움을 주는 형광을 도입하는 데 유용할 수 있다.
보다 적합하게는 본 발명의 폴리펩티드는 Y35W, Y43W, Y53W, Y54W, Y64W, F70W 또는 Y85W로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열식별번호: 1에 비해 치환을 포함한다. 이들은 모두 양호한 형광 특성을 갖는다.
적합하게는 본 발명의 폴리펩티드는 Y35W, Y43W 및 Y53W로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열식별번호: 1에 비해 치환을 포함한다. 이들은 가장 양호한 형광 특성을 갖는다.
상기 표에 따르면, 본 발명에 따른 폴리펩티드 / 스캐폴드 단백질에서 가장 바람직한 돌연변이는 Y35W일 것이다. 이는 돌연변이의 가장 적은 불안정화이며 또한 분석을 위한 가장 양호한 스펙트럼을 제공하는 이점을 갖는다.
본 발명의 폴리펩티드 / 스캐폴드 단백질 내로 도입된 각각의 트립토판은 어느 정도 불안정화됨이 주목되어야 한다. 이는 감소된 열 안정성을 초래하는 본 발명의 실시양태를 고려하는 경우 유리할 것이다. 대안적으로, 이들 돌연변이의 감소된 안정성 효과는 이 출원 전반에 걸쳐 상세하게 교시되는 바와 같이 열 안정성을 증가시키는 다른 돌연변이를 생성함으로써 개선될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드 / 스캐폴드 단백질은 그 특정 폴리펩티드 / 스캐폴드 단백질에 대한 목표 또는 우선성에 따라 안정화 및 불안정화 돌연변이 둘 다를 포함할 수 있다.
열 안정성의 특히 강한 증가, 예를 들어 대략 3℃ 증가가 산출된다는 것이 N32G 돌연변이의 이점이다.
+6℃의 열 안정성의 특히 강한 증가가 산출된다는 것이 바람직한 M65I 돌연변이의 이점이다.
본 발명의 폴리펩티드 / 스캐폴드 단백질의 열 안정성을 증가시키는 것으로 본원에 기재된 각각의 돌연변이의 설명은 그 자체가 신규함이 주목된다.
시스타틴 C는 시스타틴 A (스테핀 A)의 서열과 단지 멀게 관련됨이 주목되어야 한다. 시스타틴 C는 천연적으로 이량체이고, 더 긴 단백질이며, 스테핀 A에 비해 낮은 서열 동일성 수준을 갖는다. 시스타틴 폴드는 시스타틴 A 및 시스타틴 C 사이에 유사하지만, 이들 단백질은 시스타틴 A의 아미노산 위치 16 내지 60에 상응하는 시스타틴 C의 아미노산 49 내지 95에 상응하는 상동성의 단지 하나의 영역을 공유한다. 이 관련성의 영역에 걸쳐, 단지 13/47 아미노산이 동일하며, 이는 28％의 서열 동일성에 상응한다.
돌연변이의 하위세트
한 군으로부터의 돌연변이(들)는 소수성 코어의 패킹을 증가시키기 위해 선택될 수 있다.
한 군으로부터의 돌연변이(들)는 폴리펩티드 / 스캐폴드 단백질의 표면 상의 전하 상호작용을 증가시키기 위해 선택될 수 있다.
한 군으로부터의 돌연변이(들)는 폴리펩티드 구조에서 특정 턴의 기하학을 증가시키기 위해 선택될 수 있다. "증가시키다"란 본 발명자들은 턴을 에너지적으로 보다 바람직하게, 예를 들어 에너지적으로 보다 안정하게 만드는 것을 의미한다. 한 이러한 돌연변이의 예는 D61의 결실 (ΔD61)이다.
한 군으로부터의 돌연변이(들)는 예를 들어 β 턴의 말단에서 3차원 구조의 속박 내에서 여전히 작동하면서 안정성을 증가시키기 위해 선택될 수 있다. 보다 구체적으로, 돌연변이는 특정 β 턴의 말단에서 I-I+4 수소 결합 배열을 보존하기 위해 주의깊게 선택될 수 있다.
한 군으로부터의 돌연변이(들)는 유리하게는 단백질의 3차원 구조에서 턴의 유형을 변화시키면서 안정성을 개선시키기 위해 선택될 수 있다. 예를 들어, 돌연변이는 바람직할 경우 유형-1에서 유형-2 β 턴으로 변화시키기 위해 생성될 수 있다.
개시된 기술적 특색 및 이점을 제공하는 데 유용한 돌연변이의 이 출원에서의 포괄적인 교시가 있음이 주목되어야 한다. 예를 들어, 위치 Q42에서의 돌연변이에 관하여, E에서 D로 돌연변이시키는 것은 이것이 아미노산의 측쇄로부터 단지 단일 메틸렌 기만을 유효하게 떨어뜨리기 때문에 폭넓게 보존적 치환으로 간주된다. 그러나, 이 출원에 포함된 데이터로부터 보여질 수 있는 바와 같이, Q42E 돌연변이는 +3℃의 열 안정성의 증가를 제공하는 반면, Q42D 돌연변이는 -3℃의 열 안정성의 감소를 제공한다. 따라서, 이 위치에서 아미노산 잔기의 구조에 대한 외견상 작은 변화를 제공하는 외견상 보존적 치환은 2개의 폴리펩티드 / 스캐폴드 단백질 변이체의 Tm 사이에 6℃의 극적인 차이를 제공할 수 있다. 따라서, 이 출원에서의 데이터는 이들이 주의깊게 선택되고, 설계되고, 시험되었을 뿐만 아니라, 각각 동일한 단일 특수한 기술적 효과를 제공하는 것으로 입증되었기 때문에, 개시된 상이한 돌연변이 각각 사이에 발명의 단일성을 뒷받침한다. 더욱이, 이 출원의 청구항은 그 공지된 특수한 기술적 효과를 갖고, 산출하는 것으로 공지되고, 입증된 변이체에만 제한된다. 이러한 이유로, 첨부된 청구항에 기재된 다양한 돌연변이는 사실 단지 단일 발명에 관한 것이며, 단일성의 요건을 충족시킨다.
모든 예에서, 예를 들어 특정 폴리펩티드 / 스캐폴드 단백질의 Tm의 증가 또는 감소에 의해 반영된 바와 같은 안정성의 "증가" 또는 "감소"의 언급은 인간 스테핀 A, 즉, 서열식별번호: 1에 나타내어진 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 야생형 인간 스테핀 A 폴리펩티드의 특성에 비해 인용된다. 유사하게, 모든 돌연변이는 동일한 야생형 인간 스테핀 A 서열 서열식별번호: 1을 참조로 기재되었다.
하기 군의 돌연변이는 하기 이유로 특히 유리하다.
· 용매 노출된
이들 위치에서의 돌연변이는 단백질의 표면 상의 전하의 네트워크를 개선시키며, 이는 이를 보다 안정하게 만드는 것을 돕는다. 스테핀 A 단백질의 표면 상의 아미노산 치환을 전하 변화시키는 것이 보다 용이할 수 있으며, 이는 유리하다. 또한, 단백질 표면 상의 잔기를 돌연변이시키는 것은 치환의 선택에서 보다 많은 자유를 허용할 수 있다. 또한, 상응하는 구조적 변화는 다른 위치에 비해 단백질 표면 상의 잔기를 변경시키는 경우 보다 예측가능할 수 있음이 이점이다.
용매 노출된 잔기의 1개 이상의 치환은
(E29K K30E E33K), N32G, N90T, K63R, T34V, T34K 및 T34R
로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
텍스트 전반에 걸쳐 돌연변이의 군이 함께 괄호로 묶어진 경우 (예를 들어 "(E29K K30E E33K)"), 적합하게는 그들 돌연변이는 함께, 즉, 군으로서 동시에 / 주어진 목록으로부터 단일 선택안으로서 생성됨이 주목되어야 한다.
특히, N32G는 나선의 개선된 안정성을 제공한다.
특히, K63R은 쇄를 연장시켜 증가된 소수성 모이어티를 초래하며, 이는 하전된 원자를 재위치시킨다.
· 부분적으로 매몰된
이들 잔기를 돌연변이시키는 것은 유리하게는 단백질의 코어에 대해 가외의 소수성 덩어리/영역을 첨가한다. 이는 단백질의 코어에서 소수성 상호작용의 양을 증가시킨다. 이는 단백질의 안정성을 개선시키는 이점을 갖는다.
"지방족 쇄 연장" 돌연변이에 관하여, 그들은 유리하게는 보다 큰 측쇄를 첨가하며, 이는 유리하게는 단백질의 코어에 가외의 소수성 덩어리를 첨가한다.
부분적으로 매몰된 잔기의 1개 이상의 치환은
Q42E, T51I, T51V, T51L 및 T51F
로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
치환의 특정 하위군에 의해 공유되는 추가의 유리한 특성은 하기 제시된다:
지방족 쇄 연장
T51I, T51L, T51F
양친매성에서 지방족으로
T51I, T51V, T51L
양친매성에서 방향족으로
T51F
아민에서 산으로
Q42E
Q42E 돌연변이에 관하여, 이는 유리하게는 아미노산 잔기의 쇄 길이를 동일하게 유지하며, 유리하게는 화학의 변화가 아미노산 측쇄의 전체 크기에 대한 변화로부터 분리되는 것을 가능하게 한다.
· 소수성 코어 (3차 구조)
이들 돌연변이는 소수성 모이어티의 매몰을 증가시키며, 따라서 이 방식으로 안정성을 증가시키는 이점을 갖는다.
소수성 코어 (3차 구조) 잔기의 1개 이상의 치환은
T45V, T45I, A59V, A59I, A59L, M65V 및 M65I
로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
치환의 특정 하위군에 의해 공유되는 추가의 유리한 특성은 하기 제시된다:
쇄 연장
T45I, A59V, A59I, A59L
양친매성에서 지방족으로
T45V, T45I
베타-분지화
M65V, M65I, A59V, A59I
"쇄 연장" 돌연변이에 관하여, 이들은 추가의 소수성 접촉을 첨가하며, 따라서 안정성을 추가로 증가시키는 것을 돕는다. 이는 특히 도입되는 아미노산에서 보다 긴 및/또는 분지된 측쇄에 관해 사실이다. 더욱이, 특정 돌연변이는 아미노산 잔기로부터 극성 기를 제거하며, 완전히 소수성 잔기를 초래하는 반면, 야생형은 양친매성이었을 수 있다.
이론에 구애되기를 원하지는 않지만, 안정성의 획득은 폴딩된 상태에서 매몰된 소수성 측쇄에 비해 언폴딩된 상태에서 노출된 소수성 모이어티의 상대적 불안정성에 기인하는 것으로 믿어진다. 따라서, 양호한 패킹이 폴딩된 상태의 코어에서 일어난다면, 소수성 부분이 보다 많을 수록 천연 상태가 보다 안정한 것은 언폴딩된 상태에 비해 상대적일 것이다 - 이는 본 발명자들이 Tm (폴딩의 깁스 자유 에너지 (DG)에 대한 대용물)으로 측정한 것이다. 따라서, 안정성 획득은 다른 소수성으로 효율적으로 패킹함으로써 매몰된 소수성의 양을 최대화하는 것으로부터 온다.
돌연변이의 부분적으로 매몰된 및 소수성 코어 (3차 구조) 군 둘 다에 관하여, 이들은 단백질 구조 내에서 보다 많은 접촉을 갖는 경향성이 있다는 이점의 공통적인 특성을 공유한다. 이들 잔기를 표적화하는 것의 효과는 단백질 안정성에 대한 잠재적으로 보다 큰 효과가 단백질의 다른 부분을 표적화하는 것에 비해 더 적은 수의 치환에 의해 얻어질 수 있다는 것이다. 따라서, 이들 군의 돌연변이는 함께, 모두 동일한 단일 특수한 기술적 특색을 공유하는 치환의 상위세트를 형성한다.
· 2차 구조
아미노산 61의 결실은 잔기 59 내지 63으로부터의 5 아미노산 패치를 정준 β 턴 모티프와 일치하는 서열로 전환시킴이 주목되어야 한다. 아미노산 61의 결실에 의해 생성된 이 4 아미노산 모티프는 정준 β 턴 모티프를 제시한다. 본 발명자들에 의해 취해진 이 혁신적 접근은 출발 폴리펩티드의 최소 돌연변이를 가능하게 하면서 안정성에 대한 상당한 변화를 생성하는 야생형 단백질에서의 기존의 잔기를 사용한다. 돌연변이의 군에 의해 산출된 이점은 단백질에서 턴을 안정화시키는 (및/또는 N32G의 경우 나선을 안정화시키는) 이점이다. 어느 경우에도, 이들 잔기를 표적화하는 것은 단백질의 영향을 받은 영역 전반에 걸쳐 안정한 수소 결합을 촉진시키고, 그에 의해 유리하게는 안정성을 증가시키는 이점을 산출한다.
2차 구조 잔기의 1개 이상의 치환은
N32G, 59AN-GK, 59IN-GK, 59VN-GK, 59LN-GK, 59AG-NK, 59VG-NK, A59V, A59I, A59L, T34K 및 T34R
로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
텍스트 전반에 걸쳐, 돌연변이의 군이 쌍으로서 제시되는 경우 (예를 들어 "59AN-GK"), 적합하게는 그들 돌연변이는 함께, 즉, 쌍으로서 동시에 / 주어진 목록으로부터 단일 선택안으로서 생성됨이 주목되어야 한다.
치환의 특정 하위군에 의해 공유되는 추가의 유리한 특성은 하기 제시된다:
C-말단 나선 캡
N32G, T34K, T34R
턴
A59V, A59I, A59L, 59AN-GK, 59IN-GK, 59VN-GK, 59LN-GK, 59AG-NK, 59VG-NK
유형 I' (유형 1 프라임)
59AN-GK, 59IN-GK, 59VN-GK, 59LN-GK
유형 II' (유형 2 프라임)
59AG-NK, 59VG-NK
증가된 가닥 성향
T45V, T45I, M65V, M65I
· 전하 - 전하 상호작용
이들 돌연변이는 전하 상호작용을 개선시키고, 그에 의해 안정성을 증가시키는 기술적 이점을 산출한다.
전하-전하 상호작용 잔기의 1개 이상의 치환은
Q42E, (E29K K30E E33K), T34K 및 T34R
로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
치환의 특정 하위군에 의해 공유되는 추가의 유리한 특성은 하기 제시된다:
표면
(E29K K30E E33K), T34K, T34R
부분적으로 매몰된
Q42E
산성에서 염기성으로 및 역도 마찬가지임
(E29K K30E E33K)
아민에서 산으로
Q42E
극성에서 염기성으로
T34R, T34K
Q42E의 특정 경우에, 이는 표면 전하 네트워크를 개선시킨다. 이론에 구애되기를 원하지는 않지만, Q42E는 전하를 첨가하며, 그렇지 않다면 이러한 상호작용을 형성하기에는 단백질의 3차원 공간에서 너무 멀리 떨어진 염 가교 (리신 잔기일 가능성이 가장 많음)를 가능하게 하는 것으로 믿어진다. 염 가교는 전형적으로 4 Å 이하 떨어진 원자 사이의 전하-전하 상호작용으로 간주된다. 따라서, 이 돌연변이는 Q42E에서 Lys로의 염 가교의 형성을 촉진시키는 것으로 믿어진다.
· 위치
본원에 교시된 압도적인 다수의 치환은 스테핀 A 기재 폴리펩티드/스캐폴드 단백질의 반대 면, 즉, 단백질의 비-결합 말단 상에 있음은 유리하다. 이는 본 발명자들에게 놀라운 것이다. 예상은 돌연변이가 폴리펩티드의 서열 전반에 걸쳐 산포될 것이라는 것이다. 그러나, 제시된 교시는 단백질의 반대 면을 표적화함으로써, 안정성의 유의한 획득이 단백질의 결합 말단을 비-돌연변이되거나 단지 최소로 돌연변이된 채 남겨 두면서 이루어질 수 있는 것이다.
특정 위치에서의 잔기의 1개 이상의 치환은
T51, A59, M65, N32, Q42, N90, K63, 59AN-GK, 59IN-GK, 59VN-GK, 59LN-GK, 59AG-NK, 59VG-NK 및 T34
로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
돌연변이를 폴리펩티드 내의 특정 위치로 제한하는 것이 바람직할 경우, 이는 유리하게는 하기 제시된 개별적 군 중 하나로부터 돌연변이(들)를 선택함으로써 달성될 수 있다.
앞면 (결합 말단)
T51.
반대 면 (비-결합 말단)
A59, M65, N32, Q42, N90, K63, 59AN-GK, 59IN-GK, 59VN-GK, 59LN-GK, 59AG-NK, 59VG-NK 및 T34.
이와 관련하여, 본 발명자들에 의해 수행된 포괄적인 분석에서, 단백질의 소수성 코어에서의 모든 잔기는 개별적으로 연구되었음이 주목되어야 한다. 가장 유용한 안정성 향상 돌연변이는 단백질의 반대 면 영역에 집중됨은 본 발명자들에게 놀라운 것이다.
· 번역후 변형
특정의 이들 돌연변이의 추가의 이점은 분자의 화학적 안정성을 촉진시키는 것이다. 예를 들어, 메티오닌 잔기는 산화될 수 있는 반면, 발린/이소류신 잔기는 그럴 수 없다. 따라서, 본 발명자들에 의해 교시된 돌연변이는 바람직하지 않은 단백질에서의 이 점에서의 산화를 회피하는 추가의 이점을 가지며, 따라서 유리하게는 그렇지 않다면 산화에 의해 야기될 수 있는 변화에 저항성인 분자를 산출한다.
번역후 변형 잔기의 1개 이상의 치환은
N32G, M65V, M65I, T34V, T34K, 및 T34R
로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
특정 유형의 번역후 변형을 제거하는 것이 바람직한 경우, 이는 유리하게는 하기 제시된 개별적 군 중 하나로부터 돌연변이(들)를 선택함으로써 달성될 수 있다:
잠재적 글리코실화
N32G, T34V, T34K, T34R
잠재적 산화
M65V, M65I
N32G 돌연변이체는 또한 탈아미드화의 위험성을 제거함이 또한 주목되어야 한다. 탈아미드화에 의한 N 잔기의 분해는 문제일 수 있다 - 이 돌연변이는 유리하게는 이러한 문제를 제거한다. 동일한 것이 Q42E에 적용되는데, 이는 Q 잔기가 또한 탈아미드화되기 쉽기 때문이다.
잠재적 탈아미드화
N32G, Q42E
· hSteA 및 SQT 사이에 상이함
N90T는 단백질의 이 영역에서 턴의 일부일 수 있으며, 따라서 그 턴을 안정화시키는 추가의 이점을 산출함이 주목되어야 한다.
예시적인 스캐폴드
연구 적용을 위한 예시적인 스캐폴드:
3r(연구) 스캐폴드로 명명됨:
3r1 - hSteA Y35W N32G V48D M65I Q42E T51L (A59V ΔD61) (E29K K30E E33K)
3r2 - hSteA Y35W N32G V48D M65I Q42E T51L (A59V G60N ΔD61 N62G) (E29K K30E E33K)
치료 적용을 위한 예시적인 스캐폴드:
3t(치료) 스캐폴드로 명명됨:
3t1 - hSteA N32G V48D
3t2 - hSteA N32G V48D M65I
3t3 - hSteA N32G V48D M65I T51L
3t4 - hSteA N32G V48D M65I Q42E
3t5 - hSteA N32G V48D M65I Q42E T51L
본원에 사용된 표준/통상적인 명명법을 유념하여, 전체 스캐폴드 단백질의 서열은 서열식별번호: 1 및 언급된 돌연변이를 참조로 개시된다. 그러나, 예시 목적으로, 하기는 바람직한 스캐폴드 단백질 서열의 대표적인 예이다:
2개의 이종 펩티드 삽입을 갖는 3r1. 이 예에서 n=9: 서열식별번호: 18
MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEKETGKTWGKLEAVEYKTQVD(Xn)GLNYYIKVRVGNKYIHLKVFKSL(Xn)EDLVLTGYQVDKNKDDELTGF
2개의 이종 펩티드 삽입을 갖는 3r2. 이 예에서 n=9: 서열식별번호: 19
MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEKETGKTWGKLEAVEYKTQVD(Xn)GLNYYIKVRVNGKYIHLKVFKSL(Xn)EDLVLTGYQVDKNKDDELTGF
2개의 이종 펩티드 삽입을 갖는 3t1. 이 예에서 n=9: 서열식별번호: 20
MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVD(Xn)GTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSL(Xn)EDLVLTGYQVDKNKDDELTGF
2개의 이종 펩티드 삽입을 갖는 3t2. 이 예에서 n=9: 서열식별번호: 21
MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVD(Xn)GTNYYIKVRAGDNKYIHLKVFKSL(Xn)EDLVLTGYQVDKNKDDELTGF
2개의 이종 펩티드 삽입을 갖는 3t3. 이 예에서 n=9: 서열식별번호: 22
MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVQYKTQVD(Xn)GLNYYIKVRAGDNKYIHLKVFKSL(Xn)EDLVLTGYQVDKNKDDELTGF
2개의 이종 펩티드 삽입을 갖는 3t4. 이 예에서 n=9: 서열식별번호: 23
MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVEYKTQVD(Xn)GTNYYIKVRAGDNKYIHLKVFKSL(Xn)EDLVLTGYQVDKNKDDELTGF
2개의 이종 펩티드 삽입을 갖는 3t5. 이 예에서 n=9: 서열식별번호: 24
MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTGETYGKLEAVEYKTQVD(Xn)GLNYYIKVRAGDNKYIHLKVFKSL(Xn)EDLVLTGYQVDKNKDDELTGF
상기 식에서, X는 임의의 아미노산이고,
n은 0 내지 36의 정수이다.
가장 적합하게는 n은 9이다.
시스타틴 A 또는 시스타틴 B
인간 스테핀 A는 시스타틴 상과의 족 1에 속한다. 시스타틴 A 및 시스타틴 B는 상이하다. 시스타틴 B는 전형적으로 거의 중성 pI를 가지며, C-말단 부근에 시스테인 잔기를 갖는다. 모든 시스타틴 B는 이 시스테인을 가지며, 시스타틴 B는 디술피드 결합된 이량체를 형성하는 반면, 시스타틴 A는 보다 산성 pI를 가지며, 어떠한 시스타틴 A도 이 C-말단 시스테인을 갖지 않는 것으로 믿어진다.
핵산, 프로모터, 라이브러리, 숙주 세포
본 발명에 따른 재조합 폴리펩티드 및/또는 핵산의 제작/제조는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있으며, 실험실 또는 확대된 상업적 생물반응기에서 어떻게 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 합성하는지, 및/또는 어떻게 폴리뉴클레오티드를 발현시켜 폴리펩티드를 제조하는지와 같은 단지 통상적인 지식을 요구한다. 전세계의 다수의 회사가 이러한 통상적인 제조 서비스를 제공하며, 단지 제조되는 서열(들)의 지시를 요구한다.
숙주 세포, 본 발명에 따른 폴리펩티드(들)의 발현을 위한 벡터, 이러한 시스템에 사용하기 위한 프로모터 및 이들을 코딩하는 핵산(들)의 코돈 최적화 (존재하는 경우)는 모두 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 본원에 기재된 폴리펩티드 또는 라이브러리의 제조를 위한 특정 벡터, 예컨대 파지, 파지미드, 플라스미드의, 또는 프로모터 또는 숙주 세포 또는 다른 이러한 '도구'의 선택은 본 발명을 실시하는 통상의 기술자에 대한 문제이다. 유사하게, PCR 또는 클로닝 전략, 라이게이션, 형질전환/전기천공 기법은 모두 통상적이며, 본 발명의 일부를 형성하지 않지만, 조작자에 의해 결정된다.
추가의 지침이 요구되는 경우, 일반적인 분자 생물학적 기법은 예를 들어 문헌 [(2000 Current Protocols in Molecular Biology F.M. Ausubel et al., Eds. ISBN: 978-0-471-50338-5 published by John Wiley & Sons Ltd, Oldlands Way, Bognor Regis, West Sussex, PO22 9NQ, UK)]에서와 같이 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다.
예시적인 세포 균주:
TG1 (루시젠 (Lucigen), 카탈로그 번호 60502-2)
ER2738 (뉴 잉글랜드 바이오랩스 (New England Biolabs), 카탈로그 번호 E4104)
예시적인 파지 균주:
M13KO7 (뉴 잉글랜드 바이오랩스, 카탈로그 번호 N0315)
예시적인 파지미드 벡터:
pUC119 (클론테크 (Clontech), 카탈로그 번호 3319), 이는 lac 프로모터를 함유함
예시적인 프로모터:
lac 프로모터 (상기 참조)
본 발명의 폴리펩티드 / 스캐폴드 단백질은 예컨대 정제를 위한 태그, 예를 들어 6his 태그, MBP (말토스 결합 단백질) 태그, 또는 정제에 도움이 되는 임의의 다른 적합한 서열을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드 / 스캐폴드 단백질은 또다른 폴리펩티드에 연결하기 위한 링커, 예컨대 글리신 링커를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드 / 스캐폴드 단백질은 예컨대 항체에 의한 검출을 위한 검출 서열, 예를 들어 myc 태그 또는 플래그 태그 또는 검출을 용이하게 하는 임의의 다른 적합한 서열을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드 / 스캐폴드 단백질은 예컨대 폴리펩티드 / 스캐폴드 단백질에 연결된 형광 표지로 표지될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드 / 스캐폴드 단백질은 세포 내로의 진입을 용이하게 하는 운반체 단백질, 예컨대 수송 단백질에 연결될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드 / 스캐폴드 단백질은 폴리펩티드 / 스캐폴드 단백질을 특정 위치에 지정하는, 예컨대 이를 표적 세포 또는 표적화 단백질이 결합할 수 있는 임의의 다른 실체에 부착시키도록, 표적화 단백질, 예컨대 항체 또는 그의 단편, 또는 압타머, 또는 아피머® 시약에 연결될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드 / 스캐폴드 단백질은 기질 또는 구조, 예를 들어, 비드, 또는 나노구, 또는 전극 (예를 들어 전극의 어레이의 일부로서), 또는 막 (예컨대 니트로셀룰로스 막), 또는 반응 용기, 예컨대 ELISA 플레이트 또는 미세원심분리 튜브 또는 임의의 다른 이러한 물품에 부착될 수 있다.
적합하게는 본 발명의 폴리펩티드 / 스캐폴드 단백질은 고정될 수 있다.
폴리펩티드 / 스캐폴드 단백질을 다른 모이어티에 연결하는 것은 관련 기술분야에 공지된 임의의 적합한 수단에 의해, 예를 들어 공유 연결에 의해, 디술피드 가교에 의해, 단일 폴리펩티드 (융합 단백질)로서의 제조에 의해, 폴리펩티드의 N- 또는 C- 말단에 연결하는 적합한 아미노산 잔기(들), 예컨대 시스테인 잔기(들)에의 접합에 의해, 또는 관련 기술분야에 공지된 임의의 다른 적합한 수단에 의해서일 수 있다.
폴리펩티드(들)를 제조하기
또한,
A12I,A12V,I16L,V20A,V20I,V20L,Q26E,E29M,
T31K,N32G,N32D,N32H,T34V,T34R,T34K,T34D,
T34P,L38A,L38V,L38F,A40I,A40V,Q42E,Q42D,
T45I,T45V,V48E,V48D,V48G,V48A,V48L,G50S,
T51F,T51V,T51L,T51I,T51A,A59L,A59I,A59V,
K63R,M65V,M65I,L67I,N90T,(V20I,L38A),
(V20L,L38A),(V20I,L38V),(V20L,L38V),
(E29K,K30E,E33K),(Y54D,T83D,Q86E),
(A59L,G60N,D61G,N62K),(A59V,D61N,N62K),
(G60N,D61G,N62K),(G60N,ΔD61,N62G),
ΔD61,(A59L,G60N,ΔD61,N62G),
(A59V,G60N,D61G,N62K),(A59I,G60N,D61G,N62K),
(A59I,G60N,ΔD61,N62G),(A59V,G60N,ΔD61,N62G),
(A59V,ΔD61),(G60P,ΔD61,N62P),
(G60P,D61P,N62K),(G60P,ΔD61,N62G),
(G60P,D61G,N62K),(D61N,N62K), 및
(T83D,Q86E)
로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열식별번호: 1에 비해 1개 이상의 치환(들)을 포함하는 폴리펩티드를 합성하는 것을 포함하는, 서열식별번호: 1에 비해 변경된 안정성, 예컨대 증가된 열 안정성 또는 감소된 열 안정성을 갖는 폴리펩티드를 제조하는 방법이 개시되며; 보다 적합하게는 치환(들)은
A12I,A12V,I16L,V20I,V20L,Q26E,E29M,T31K
N32G,N32D,N32H,T34V,T34R,T34D,T34P,L38A
L38V,A40I,A40V,Q42D,T45I,T45V,V48E,V48G
V48A,T51F,T51V,T51L,T51A,A59L,A59I,M65V
L67I
(V20I,L38A),(V20L,L38A),(V20I,L38V),(V20L,L38V)
(E29K,K30E,E33K),(Y54D,T83D,Q86E)
(A59L,G60N,D61G,N62K),(A59V,D61N,N62K)
(G60N,D61G,N62K),(G60N,ΔD61,N62G)
ΔD61,(A59L,G60N,ΔD61,N62G)
(A59V,G60N,D61G,N62K),(A59I,G60N,D61G,N62K)
(A59I,G60N,ΔD61,N62G),(A59V,G60N,ΔD61,N62G)
(A59V,ΔD61),(G60P,ΔD61,N62P)
(G60P,D61P,N62K),(G60P,ΔD61,N62G)
(G60P,D61G,N62K),(D61N,N62K) 및
(T83D,Q86E)
로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또한,
E29M,N32G,T34V,T34R,T34K,Q42E,T45I,T45V
G50S,T51F,T51V,T51L,T51I,A59L,A59I,A59V
K63R,M65V,M65I,L67I,N90T
(E29K,K30E,E33K),(A59L,G60N,D61G,N62K)
(A59V,D61N,N62K),(G60N,D61G,N62K)
(G60N,ΔD61,N62G),ΔD61
(A59L,G60N,ΔD61,N62G),(A59V,G60N,D61G,N62K)
(A59I,G60N,D61G,N62K),(A59I,G60N,ΔD61,N62G)
(A59V,G60N,ΔD61,N62G), 및 (A59V,ΔD61)
로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열식별번호: 1에 비해 1개 이상의 치환(들)을 포함하는 폴리펩티드를 합성하는 것을 포함하는, 서열식별번호: 1에 비해 변경된 안정성, 예컨대 증가된 열 안정성을 갖는 폴리펩티드를 제조하는 방법이 개시되며; 보다 적합하게는 치환(들)은
E29M,N32G,T34V,T34R,T45I,T45V,T51F,T51V
T51L,A59L,A59I,M65V,L67I
(E29K,K30E,E33K),(A59L,G60N,D61G,N62K)
(A59V,D61N,N62K),(G60N,D61G,N62K)
(G60N,ΔD61,N62G),ΔD61
(A59L,G60N,ΔD61,N62G),(A59V,G60N,D61G,N62K)
(A59I,G60N,D61G,N62K),(A59I,G60N,ΔD61,N62G)
(A59V,G60N,ΔD61,N62G), 및 (A59V,ΔD61)
로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또한,
A12I,A12V,I16L,V20A,V20I,V20L,Q26E,T31K
N32D,N32H,T34D,T34P,L38A,L38V,L38F,A40I
A40V,Q42D,V48E,V48D,V48G,V48A,V48L,T51A
(V20I,L38A),(V20L,L38A),(V20I,L38V),(V20L,L38V)
(Y54D,T83D,Q86E),(G60P,ΔD61,N62P)
(G60P,D61P,N62K),(G60P,ΔD61,N62G)
(G60P,D61G,N62K),(D61N,N62K) 및
(T83D,Q86E)
로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열식별번호: 1에 비해 1개 이상의 치환(들)을 포함하는 폴리펩티드를 합성하는 것을 포함하는, 서열식별번호: 1에 비해 변경된 안정성, 예컨대 감소된 열 안정성을 갖는 폴리펩티드를 제조하는 방법이 개시되며; 보다 적합하게는 치환(들)은
A12I,A12V,I16L,V20I,V20L,Q26E,T31K,N32D
N32H,T34D,T34P,L38A,L38V,A40I,A40V,Q42D
V48E,V48G,V48A,T51A
(V20I,L38A),(V20L,L38A),(V20I,L38V),(V20L,L38V)
(Y54D,T83D,Q86E),(G60P,ΔD61,N62P)
(G60P,D61P,N62K),(G60P,ΔD61,N62G)
(G60P,D61G,N62K),(D61N,N62K) 및
(T83D,Q86E)
로 이루어진 군으로부터 선택된다.
적합하게는 합성하는 단계는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 제조하고, 상기 핵산의 번역을 위해 배열하여 폴리펩티드를 제조하는 것을 포함한다. 적합하게는 핵산은 파지 게놈, 예컨대 파지 제시 라이브러리의 1종 이상의 구성원에 의해 포함될 수 있다.
추가의 돌연변이
G4R,E18Q,P25S,N32Q,T34E,T34Q,G36E,M65F
M65L,E78A,(K91E,D92K),(K91P,D93G), NPDG
로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 추가의 돌연변이를 생성하는 것에 대한 추가의 이점이 있을 수 있다.
이 군의 돌연변이는 각각 열 안정성에 대한 작은 효과에 기여하는 특성을 공유함이 주목되어야 한다. 측정에서 실험적 오차가 낮은 효과, 또는 심지어 효과가 없거나 효과의 작은 반전의 지시를 제공할 수 있기 때문에, 개별적으로 측정되는 경우 이들을 측정하는 데 주의가 기울여져야 한다 (예를 들어 +0.5℃로서 나타내기 보다는, 효과는 실험적 오차 또는 개별적 측정이 ℃ 변화의 +/- 0.7℃ 내인 경우 0으로서 또는 -0.2℃로서 나타낼 수 있음). 이는 실험적 오차가 측정되는 효과의 규모에 접근하거나 이를 초과하는 경우 모든 과학적 측정으로의 경우이다.
아미노산 90에서 시작하는 NPDG 돌연변이 ('90NPDG')에 관하여, 이는 단백질에서 이 점에서 유형 1 턴을 형성할 통계적 가능성을 증가시키며, 그에 의해 이 메커니즘을 통해 안정성을 증가시킨다.
· 작은 효과 - 열 안정성의 증가
G4R +0.05℃
E18Q +0.57℃
P25S +0.01℃
N32Q +0.37℃
T34Q +0.29℃
G36E +0.18℃
M65F +0.19℃
E78A +0.50℃
(K91E, D92K) +0.56℃
(K91P, D93G) +0.22℃
90NPDG +0.7℃
(N90 K91P D92 D93G) +0.22℃
· 작은 효과 - 열 안정성의 감소
T34E -0.39℃
M65L -0.23℃
PK 효과
특정 실시양태에서, 폴리펩티드, 예컨대 아피머 폴리펩티드는 약 1 μM 이하, 약 100 nM 이하, 약 40 nM 이하, 약 20 nM 이하, 약 10 nM 이하, 약 1 nM 이하, 또는 약 0.1 nM 이하의 해리 상수 (KD)를 갖는 단량체로서, 표적 모이어티, 바람직하게는 단백질, 보다 바람직하게는 인간 단백질에 결합하는 폴리펩티드 부분, 예컨대 아피머 폴리펩티드 부분을 포함한다.
특정 실시양태에서, 폴리펩티드, 예컨대 아피머 폴리펩티드는 예컨대 비아코어 (Biacore)에 의해 측정된 약 10-3 s-1 (즉, 1/초의 단위) 이하의; 약 10-4 s-1 이하의 또는 심지어 약 10-5 s-1 이하의 오프-레이트 상수 (koff)를 갖는 단량체로서, 표적 모이어티, 바람직하게는 단백질, 보다 바람직하게는 인간 단백질에 결합하는 폴리펩티드 부분, 예컨대 아피머 폴리펩티드 부분을 포함한다.
특정 실시양태에서, 폴리펩티드, 예컨대 아피머 폴리펩티드는 예컨대 비아코어에 의해 측정된 적어도 약 103 M-1s-1 이상; 적어도 약 104 M-1s-1 이상; 적어도 약 105 M-1s-1 이상; 또는 심지어 적어도 약 106 M-1s-1 이상의 온-레이트 상수 (kon)를 갖는, 표적 모이어티, 바람직하게는 단백질, 보다 바람직하게는 인간 단백질에 결합하는 폴리펩티드 부분, 예컨대 아피머 폴리펩티드 부분을 포함한다.
특정 실시양태에서, 폴리펩티드, 예컨대 아피머 폴리펩티드는 동족 결합 상대와의 경쟁적 결합 검정에서 1 μM 이하, 약 100 nM 이하, 약 40 nM 이하, 약 20 nM 이하, 약 10 nM 이하, 약 1 nM 이하, 또는 약 0.1 nM 이하의 IC50을 갖는 단량체로서, 동족 결합 상대를 갖는 표적 모이어티, 바람직하게는 단백질, 보다 바람직하게는 인간 단백질에 결합하는 폴리펩티드 부분, 예컨대 아피머 폴리펩티드 부분을 포함한다.
이점
본 발명의 이점은 탁월한 발현 특성을 갖는 스캐폴드가 제공된다는 것이다.
본 발명의 이점은 보통의 또는 감소된 면역원성 (낮은 면역원성)을 갖는 스캐폴드가 제공된다는 것이다.
본 발명의 이점은 기재된 폴리펩티드 / 스캐폴드 단백질이 응집/침전의 문제를 겪지 않는다는 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명의 스캐폴드는 그들이 언폴딩하기 전에 응집/침전하지 않는 것으로 관찰되며, 따라서 본 발명의 스캐폴드가 hSteA에 비해 증가된 Tm을 갖는 경우, 그 스캐폴드는 또한 유리하게는 응집/침전에 대한 증가된 저항성을 갖는다.
기재된 폴리펩티드 / 스캐폴드 단백질의 이점은 이들이 이종 펩티드 삽입을 수용한다는 것이다.
본 발명의 폴리펩티드 / 스캐폴드 단백질의 이점은 이종 펩티드 삽입이 적절하게 제시된다는 것이다.
본 발명의 이점은 기재된 폴리펩티드 / 스캐폴드 단백질이 도입된 돌연변이에 의해 안정성/프로테아제 저항성에 관하여 부정적으로 영향을 받지 않는다는 것이다. 다시 말해서, 본 발명의 폴리펩티드 / 스캐폴드 단백질은 유리하게는 그들의 안정성 및/또는 프로테아제 저항성을 보유한다. 이는 본원에 교시된 특정 돌연변이의 또다른 유리한 특성이다.
추가의 실시양태
또한, 연구 적용에서 상기 기재된 바와 같은 스캐폴드의 용도, 예컨대 특정 표적에 결합할 수 있는 펩티드(들)에 대한 스크리닝, 및/또는 특정 활성/활성들을 갖는 펩티드(들)에 대한 스크리닝이 개시된다.
또한, 의학적 적용에서 상기 기재된 바와 같은 스캐폴드의 용도, 예컨대 신체 내의 특정 세포 또는 위치에 화합물(들)을 표적화하는 것, 및/또는 특정 대사 활성을 억제하거나 촉진시키는 데 있어서의 용도가 개시된다.
또한, 상기 기재된 바와 같은 폴리펩티드(들) / 스캐폴드 단백질(들)을 포함하는 조성물, 예컨대 제약 조성물이 개시된다.
또한, 제약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 상기 기재된 바와 같은 1종 이상의 폴리펩티드(들) / 스캐폴드 단백질(들)을 포함하는 조성물이 개시된다.
또한, 진단제, 치료제, 바이오마커, 바이오마커를 특이적으로 검출하는 작용제, 합리적인 약물 설계 주형, 약물 발견을 위한 표적 또는 시약, 항체 치환물, 압타머, 아피머® 시약, 또는 연구 도구로서의 상기 기재된 바와 같은 폴리펩티드 / 스캐폴드 단백질의 용도가 개시된다.
또한, 스캐폴드 단백질로서의 상기 기재된 바와 같은 폴리펩티드의 용도가 개시된다.
한 실시양태에서, 서열식별번호: 3 (개 야생형 SteA)의 아미노산 잔기 1 내지 11, 13 내지 15, 17 내지 19, 21 내지 25, 27 내지 28, 35 내지 37, 39, 41, 43 내지 44, 46 내지 47, 49 내지 50, 52 내지 53, 55 내지 58, 63 내지 64, 66, 68 내지 82, 84 내지 85, 및 87 내지 98와 적어도 80％ 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고;
T51L, T51V, M65V, N32G, A59I, L38A, V20I, A40I, L38V, A12I, A12V, I16L, V20L, Q26E, E29M, T31K, N32D, N32H, T34V, T34R, T34D, T34P, A40V, Q42D, T45I, T45V, V48E, V48G, V48A, T51F, T51A, A59L, L67I, (V20I, L38A), (V20L, L38A), (V20I, L38V), (V20L, L38V), (E29K, K30E, E33K), (Y54D, T83D, Q86E), (A59L, G60N, D61G, N62K), (A59V, D61N, N62K), (G60N, D61G, N62K), (G60N, ΔD61, N62G), ΔD61, (A59L, G60N, ΔD61, N62G), (A59V, G60N, D61G, N62K), (A59I, G60N, D61G, N62K), (A59I, G60N, ΔD61, N62G), (A59V, G60N, ΔD61, N62G), (A59V, ΔD61), (G60P, ΔD61, N62P), (G60P, D61P, N62K), (G60P, ΔD61, N62G), (G60P, D61G, N62K), (D61N, N62K) 및 (T83D, Q86E)로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열식별번호: 3에 비한 1개 이상의 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드, 예컨대 아피머 폴리펩티드가 기재된다.
적합하게는 상기 서열식별번호: 1에 비한 1개 이상의 돌연변이는
T51L, T51V, M65V, N32G, A59I, E29M, T34V, T34R, T45I, T45V, T51F, A59L, L67I, (E29K, K30E, E33K), (A59L, G60N, D61G, N62K), (A59V, D61N, N62K), (G60N, D61G, N62K), (G60N, ΔD61, N62G), ΔD61, (A59L, G60N, ΔD61, N62G), (A59V, G60N, D61G, N62K), (A59I, G60N, D61G, N62K), (A59I, G60N, ΔD61, N62G), (A59V, G60N, ΔD61, N62G), 및 (A59V, ΔD61)이거나 또는 이로 이루어진 군으로부터 선택되고;
바람직하게는 상기 폴리펩티드는 서열식별번호: 3의 Tm보다 더 높은; 보다 바람직하게는 서열식별번호: 1의 Tm보다 더 높은 Tm을 갖는다. 또다른 실시양태에서, 적합하게는 상기 서열식별번호: 1에 비한 1개 이상의 돌연변이는
L38A, V20I, A40I, L38V, A12I, A12V, I16L, V20L, Q26E, T31K, N32D, N32H, T34D, T34P, A40V, Q42D, V48E, V48G, V48A, T51A, (V20I, L38A), (V20L, L38A), (V20I, L38V), (V20L, L38V), (Y54D, T83D, Q86E), (G60P, ΔD61, N62P), (G60P, D61P, N62K), (G60P, ΔD61, N62G), (G60P, D61G, N62K), (D61N, N62K) 및 (T83D, Q86E)이거나 또는 이로 이루어진 군으로부터 선택되고;
바람직하게는 상기 폴리펩티드는 서열식별번호: 3의 Tm보다 더 낮은; 보다 바람직하게는 서열식별번호: 1의 Tm보다 더 낮은 Tm을 갖는다.
또다른 실시양태에서, 서열식별번호: 3의 아미노산 잔기 1 내지 11, 13 내지 15, 17 내지 19, 21 내지 25, 27 내지 28, 35 내지 37, 39, 41, 43 내지 44, 46 내지 47, 49 내지 50, 52 내지 53, 55 내지 58, 63 내지 64, 66, 68 내지 82, 84 내지 85, 및 87 내지 98과 적어도 80％ 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고;
적어도 1개의 이종 펩티드 삽입을 포함하며;
M65I, T51I, T51L, T51V, M65V, A59V, N32G, A59I, L38A, V20A, V20I, A40I, L38V, G50S, L38F, A12I, A12V, I16L, V20L, Q26E, E29M, T31K, N32D, N32H, T34V, T34R, T34K, T34D, T34P, A40V, Q42E, Q42D, T45I, T45V, V48E, V48D, V48G, V48A, V48L, T51F, T51A, A59L, K63R, L67I, N90T, (V20I, L38A), (V20L, L38A), (V20I, L38V), (V20L, L38V), (E29K, K30E, E33K), (Y54D, T83D, Q86E), (A59L, G60N, D61G, N62K), (A59V, D61N, N62K), (G60N, D61G, N62K), (G60N, ΔD61, N62G), ΔD61, (A59L, G60N, ΔD61, N62G), (A59V, G60N, D61G, N62K), (A59I, G60N, D61G, N62K), (A59I, G60N, ΔD61, N62G), (A59V, G60N, ΔD61, N62G), (A59V, ΔD61), (G60P, ΔD61, N62P), (G60P, D61P, N62K), (G60P, ΔD61, N62G), (G60P, D61G, N62K), (D61N, N62K), 및 (T83D, Q86E)로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열식별번호: 1에 비한 1개 이상의 돌연변이를 포함하고;
상기 이종 펩티드 삽입이 서열식별번호: 1에 비해 하기 위치 중 하나에 삽입된 이종 펩티드를 포함하는 것인 폴리펩티드, 예컨대 아피머 폴리펩티드가 기재된다:
d) 48-<이종 펩티드>-50,
e) 49-<이종 펩티드>-51,
f) 50-<이종 펩티드>-52,
q) 72-<이종 펩티드>-77,
r) 73-<이종 펩티드>-78; 또는
s) 74-<이종 펩티드>-79.
도 1은 막대 차트를 나타낸다.
도 2는 막대 차트를 나타낸다.
도 3은 막대 차트를 나타낸다.
도 4a 및 4b는 그래프를 나타낸다.
도 5는 그래프를 나타낸다.
도 6은 그래프를 나타낸다.
도 7은 그래프를 나타낸다.
도 8은 그래프를 나타낸다.
도 9는 그래프를 나타낸다.
도 10은 그래프를 나타낸다.
도 11은 플롯을 나타낸다.
도 12는 표를 나타낸다.
도 13은 표를 나타낸다.
도 14는 표를 나타낸다.
도 15는 플롯을 나타낸다.
도 16은 플롯을 나타낸다.
도 17은 표를 나타낸다.
도 18은 그래프를 나타낸다.
도 19는 그래프를 나타낸다.
예시적인 실시양태의 설명
I. 정의
본 발명의 이해를 용이하게 하기 위해, 다수의 용어 및 어구가 하기에 정의된다.
용어 "아피머" (또는 "아피머 폴리펩티드")는 스테핀 폴리펩티드의 재조합적으로 조작된 작은, 매우 안정한 단백질을 지칭한다. 아피머 단백질은 모두 모노클로날 항체와 유시한 방식으로, 높은 친화도 및 특이성으로 바람직한 표적 단백질에 결합하도록 무작위화될 수 있는 펩티드 루프 (전형적으로 2개) 및 N-말단 서열을 제시한다. 스테핀 단백질 스캐폴드에 의한 펩티드 루프(들)의 안정화는 펩티드가 취할 수 있는 가능한 입체형태를 속박하며, 이는 유리 펩티드의 라이브러리에 비해 결합 친화도 및 특이성을 증가시킨다. 이들 조작된 비-항체 결합 단백질은 상이한 적용에서 모노클로날 항체의 분자 인식 특징을 모방하도록 설계된다. 스테핀 폴리펩티드 서열의 다른 부분에 대한 변이는 수행될 수 있으며, 이러한 변이는 이들 친화성 시약의 특성을 개선시키고, 예컨대 안정성을 증가시키고, 이들을 다양한 온도 및 pH 등에 걸쳐 강력하게 만든다.
"코딩된 아피머"는 유전자 전달 프로세스를 통해 환자의 신체에서 세포에 의해 발현되는 경우, 의도되는 아피머 폴리펩티드를 생체내에서 생산하는 핵산 구축물을 지칭한다.
"아피머-연결된 접합체"는 아피머 폴리펩티드 서열을 함유하는 아피머 폴리펩티드의 폴리펩티드 부분의 C-말단 또는 N-말단을 통한 연속적 펩티드 결합의 형성을 통해서 이외의 화학적 접합을 통해 그에 접합된 1종 이상의 모이어티를 갖는 아피머 폴리펩티드를 지칭한다. 아피머-연결된 접합체는 "아피머-약물 접합체"일 수 있으며, 이는 그에 접합된 1종 이상의 약물학적 활성 모이어티를 포함하는 아피머 폴리펩티드를 지칭한다. 아피머-연결된 접합체는 또한 "아피머-태그 접합체"일 수 있으며, 이는 그에 접합된 1종 이상의 검출가능한 모이어티 (즉, 검출가능한 표지)를 포함하는 아피머 폴리펩티드를 지칭한다.
용어 "폴리펩티드" 및 "펩티드" 및 "단백질"은 본원에서 상호교환가능하게 사용되며, 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 지칭한다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 이는 변형된 아미노산을 포함할 수 있으며, 이는 비-아미노산에 의해 중단될 수 있다. 상기 용어는 또한 자연적으로 또는 개입; 예를 들어, 디술피드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예컨대 표지화 성분으로의 접합에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포괄한다. 또한, 상기 정의 내에는 예를 들어, 아미노산 (예를 들어, 비천연 아미노산을 포함함)의 1종 이상의 유사체, 뿐만 아니라 관련 기술분야에 공지된 다른 변형을 함유하는 폴리펩티드가 포함된다.
용어 "아미노산 잔기" 및 "아미노산"은 상호교환가능하게 사용되며, 폴리펩티드의 맥락에서, 폴리펩티드의 하나 더의 펩티드 결합에 참여하고 있는 아미노산을 의미한다. 일반적으로, 아미노산을 지정하기 위해 본원에서 사용된 약어는 생화학 명명법에 대한 IUPAC-IUB 위원회 (IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature)의 권고사항에 기초한다 (문헌 [Biochemistry (1972) 11:1726-1732] 참조). 예를 들어, Met, Ile, Leu, Ala 및 Gly는 각각 메티오닌, 이소류신, 류신, 알라닌 및 글리신의 "잔기"를 나타낸다. 잔기란 카르복실 기의 OH 부분 및 α-아미노 기의 H 부분을 제거함으로써 상응하는 α-아미노산으로부터 유래된 라디칼을 의미한다. 용어 "아미노산 측쇄"는 문헌 [K. D. Kopple, "Peptides and Amino Acids", W. A. Benjamin Inc., New York and Amsterdam, 1966, pages 2 and 33]에 의해 정의된 바와 같이, --CH(NH2)COOH 부분을 제외한 아미노산의 그 부분이다.
대개, 이 발명의 적용에 사용된 아미노산은 단백질에서 발견되는 그러한 천연 발생 아미노산, 또는 아미노 및 카르복실 기를 함유하는 이러한 아미노산의 천연 발생 동화작용 또는 이화작용 생성물이다. 특히 적합한 아미노산 측쇄로는 하기 아미노산의 것들로부터 선택되는 측쇄를 들 수 있다: 글리신, 알라닌, 발린, 시스테인, 류신, 이소류신, 세린, 트레오닌, 메티오닌, 글루탐산, 아스파르트산, 글루타민, 아스파라긴, 리신, 아르기닌, 프롤린, 히스티딘, 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판, 및 펩티도글리칸 박테리아 세포벽의 구성성분으로서 확인된 그러한 아미노산 및 아미노산 유사체.
"염기성 측쇄"를 갖는 아미노산 잔기로는 Arg, Lys 및 His를 들 수 있다. "산성 측쇄"를 갖는 아미노산 잔기로는 Glu 및 Asp를 들 수 있다. "중성 극성 측쇄"를 갖는 아미노산 잔기로는 Ser, Thr, Asn, Gln, Cys 및 Tyr를 들 수 있다. "중성 비-극성 측쇄"를 갖는 아미노산 잔기로는 Gly, Ala, Val, Ile, Leu, Met, Pro, Trp 및 Phe를 들 수 있다. "비-극성 지방족 측쇄"를 갖는 아미노산 잔기로는 Gly, Ala, Val, Ile 및 Leu를 들 수 있다. "소수성 측쇄"를 갖는 아미노산 잔기로는 Ala, Val, Ile, Leu, Met, Phe, Tyr 및 Trp를 들 수 있다. "작은 소수성 측쇄"를 갖는 아미노산 잔기로는 Ala 및 Val을 들 수 있다. "방향족 측쇄"를 갖는 아미노산 잔기로는 Tyr, Trp 및 Phe를 들 수 있다.
용어 아미노산 잔기는 예를 들어, 대상 폴리펩티드, 예컨대 아피머 (특히 화학적 합성에 의해 생성되는 경우)는 아미노산 유사체 예컨대, 예를 들어, 시아노알라닌, 카나바닌, 젠콜산, 노르류신, 3-포스포세린, 호모세린, 디히드록시-페닐알라닌, 5-히드록시트립토판, 1-메틸히스티딘, 3-메틸히스티딘, 디아미노피멜산, 오르니틴, 또는 디아미노부티르산을 포함할 수 있기 때문에, 본원에서 언급된 임의의 구체적 아미노산의 유사체, 유도체 및 동류물을 추가로 포함한다.
본원에서 적합한 측쇄를 갖는 다른 천연 발생 아미노산 대사물 또는 전구체는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 인식될 것이며, 본 발명의 범위에 포함된다.
2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드의 맥락에서 용어 "동일한" 또는 퍼센트 "동일성"은 임의의 보존적 아미노산 치환을 서열 동일성의 일부로서 간주하지 않고, 최대 상응성에 대해 비교하고 정렬한 경우 (필요에 따라 갭을 도입함), 동일하거나, 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 구체화된 백분율을 갖는 2개 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다. 퍼센트 동일성은 서열 비교 소프트웨어 또는 알고리듬을 사용하여 또는 육안 검사에 의해 측정될 수 있다. 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열의 정렬을 얻는 데 사용될 수 있는 다양한 알고리듬 및 소프트웨어는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 이들로는 BLAST, ALIGN, 멕얼라인 (Megalign), 베스트핏 (BestFit), GCG 위스콘신 패키지, 및 이들의 변형을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 2개의 핵산 또는 폴리펩티드는 실질적으로 동일하며, 이는 이들이 서열 비교 알고리듬을 사용하여 또는 육안 검사에 의해 측정된 바와 같이, 최대 상응성에 대해 비교하고 정렬한 경우, 적어도 70％, 적어도 75％, 적어도 80％, 적어도 85％, 적어도 90％, 및 일부 실시양태에서 적어도 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기 동일성을 가짐을 의미한다. 일부 실시양태에서, 동일성은 길이가 적어도 약 10개 잔기, 적어도 약 20개 잔기, 적어도 약 40 내지 60개 잔기, 적어도 약 60 내지 80개 잔기 또는 그 사이의 임의의 적분 값인 아미노산 서열의 영역에 걸쳐 존재한다. 일부 실시양태에서, 동일성은 60 내지 80개 잔기, 예컨대 적어도 약 80 내지 100개 잔기보다 더 긴 영역에 걸쳐 존재하고, 일부 실시양태에서, 서열은 비교되는 서열, 예컨대 표적 단백질 또는 항체의 코딩 영역의 전장에 걸쳐 실질적으로 동일하다. 일부 실시양태에서, 동일성은 길이가 적어도 약 10개 염기, 적어도 약 20개 염기, 적어도 약 40 내지 60개 염기, 적어도 약 60 내지 80개 염기 또는 그 사이의 임의의 적분 값인 뉴클레오티드 서열의 영역에 걸쳐 존재한다. 일부 실시양태에서, 동일성은 60 내지 80개 염기, 예컨대 적어도 약 80 내지 100개 염기 이상보다 더 긴 영역에 걸쳐 존재하고, 일부 실시양태에서, 서열은 비교되는 서열, 예컨대 관심 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 전장에 걸쳐 실질적으로 동일하다.
"보존적 아미노산 치환"은 한 아미노산 잔기기 유사한 측쇄를 갖는 또다른 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 족은 일반적으로 관련 기술분야에서 정의되었으며, 염기성 측쇄 (예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전된 극성 측쇄 (예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지된 측쇄 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 들 수 있다. 예를 들어, 티로신에 대한 페닐알라닌의 치환은 보존적 치환이다. 일반적으로, 본 발명의 폴리펩티드, 가용성 단백질, 및/또는 항체의 서열에서의 보존적 치환은 표적 결합 부위에의, 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩티드, 가용성 단백질, 또는 항체의 결합을 철폐하지 않는다. 결합을 제거하지 않는 아미노산 보존적 치환을 확인하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다.
"단리된" 폴리펩티드, 가용성 단백질, 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포, 또는 조성물은 자연에서 발견되지 않는 형태로의 폴리펩티드, 가용성 단백질, 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포, 또는 조성물이다. 단리된 폴리펩티드, 가용성 단백질, 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포, 또는 조성물은 이들이 더이상 이들이 자연에서 발견되는 형태가 아닌 정도로 정제된 것들을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 폴리펩티드, 가용성 단백질, 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포, 또는 조성물은 실질적으로 순수하다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "실질적으로 순수한"은 적어도 50％ 순수한 (즉, 오염물이 없는), 적어도 90％ 순수한, 적어도 95％ 순수한, 적어도 98％ 순수한, 또는 적어도 99％ 순수한 물질을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "융합 단백질" 또는 "융합 폴리펩티드"는 적어도 2개의 유전자의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 의해 발현된 혼성체 단백질을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "링커" 또는 "링커 영역"은 제1 폴리펩티드 (예를 들어, 아피머의 카피) 및 제2 폴리펩티드 (예를 들어, 또다른 아피머, Fc 도메인, 리간드 결합 도메인 등) 사이에 삽입된 링커를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 링커는 펩티드 링커이다. 링커는 폴리펩티드의 발현, 분비, 또는 생활성에 유해하게 영향을 미치지 않아야 한다. 바람직하게는, 링커는 항원성이 아니며, 면역 반응을 유발하지 않는다.
용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산" 및 "핵산 분자"는 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체를 지칭하며, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 또는 염기, 및/또는 그들의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제에 의해 중합체 내로 혼입될 수 있는 임의의 기질일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "핵산 분자 코딩", "DNA 서열 코딩" 및 "DNA 코딩"은 데옥시리보핵산 데옥시리보뉴클레오티드의 가닥을 따르는 뉴클레오티드의 순서 또는 순차를 지칭한다. 이들 데옥시리보뉴클레오티드의 순서는 폴리펩티드 (단백질) 쇄를 따르는 아미노산의 순서를 결정한다. 따라서, 핵산 서열은 아미노산 서열을 코딩한다.
뉴클레오티드 서열에 관하여 사용되는 경우, 문법적 및 다른 형태의 용어인 본원에 사용된 바와 같은 "서열"은 DNA 또는 RNA를 포함할 수 있으며, 단일 또는 이중 가닥일 수 있다. 핵산 서열은 돌연변이될 수 있다. 핵산 서열은 임의의 길이, 예를 들어 2 내지 100,000개 이상의 뉴클레오티드 (또는 그 위의 또는 그 사이의 임의의 적분 값) 핵산, 예를 들어 약 100개 내지 약 10,000개, 또는 약 200개 뉴클레오티드 내지 약 500개 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "벡터"는 숙주 세포에서 1개 이상의 유전자(들) 또는 서열(들)을 전달하고, 통상적으로 발현할 수 있는 구축물을 의미한다. 벡터의 예로는 바이러스 벡터, 네이키드 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 플라스미드, 코스미드, 또는 파지 벡터, 양이온성 응축제와 회합된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 및 리포솜에 캡슐화된 DNA 또는 RNA 발현 벡터를 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "형질감염"은 진핵생물 세포 내로의 외인성 핵산을 지칭한다. 형질감염은 인산칼슘-DNA 공동-침전, DEAE-덱스트란-매개 형질감염, 폴리브렌-매개 형질감염, 전기천공, 미세주사, 리포솜 융합, 리포펙션, 원형질체 융합, 레트로바이러스 감염, 및 바이올리스틱스 기술 (바이올리스틱스)을 비롯한 관련 기술분야에 공지된 다양한 수단에 의해 달성될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "운반체"는 조성물을 세포의 내부로 전달하는 데 사용될 수 있는 단리된 핵산을 포함하는 단리된 핵산이다. 선형 폴리뉴클레오티드, 이온성 또는 양친매성 화합물과 회합된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 및 바이러스를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다수의 운반체가 관련 기술분야에 공지되어 있다. 따라서, 용어 "벡터"는 자율 복제 플라스미드 또는 바이러스를 포함한다. 상기 용어는 또한 비-플라스미드 및 비-바이러스 화합물, 예를 들어, 폴리리신 화합물, 리포솜 등의 세포 내로의 핵산의 전달을 용이하게 하는 것을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 바이러스 벡터의 예로는 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관된 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "발현 벡터"는 발현 제어 서열 및 작동적으로 연결된 발현되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 지칭한다. 발현 벡터는 발현에 사용되는 충분한 시스-작용 요소 (시스-작용 요소)를 포함하며; 발현을 위한 다른 요소는 숙주 세포에 의해 또는 시험관내 발현 시스템에서 공급될 수 있다. 발현 벡터는 관련 기술분야에 공지된 모든 것들, 예컨대 코스미드, 플라스미드 (예를 들어, 네이키드 또는 리포솜에 함유된) 및 바이러스 (예를 들어, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-연관된 바이러스)를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "작동적으로 연결된"은 조절 서열 및 이종 핵산 서열 사이의 기능적 연결이 후자의 발현을 초래하는 연결로 연결된 것을 지칭한다. 예를 들어, 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열이 기능적 관계인 경우, 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열 사이는 작동적으로 연결된다. 예를 들어, 프로모터가 코딩 서열의 전사 또는 발현에 영향을 미치는 경우, 프로모터는 코딩 서열에 작동적으로 연결된다. 전형적으로, 작동적으로 연결된 DNA 시퀀싱은 인접하며, 필요에 따라 동일한 리딩 프레임에서 2개의 단백질 코딩 영역을 연결하는 것이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "프로모터"는 폴리뉴클레오티드 서열의 세포 특이적 전사의 합성 기구에 요구되는 합성 기구에 의해 인식되거나 도입되는 프로모터 DNA 서열로서 정의된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "구성적 발현"은 모두 생리학적 조건 하에서 발현되는 것을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "유도성 발현"은 특정 조건 하에서의 발현, 예컨대 세포내 신호전달 경로의 활성화 (또는 불활성화) 또는 발현 구축물을 함유하는 세포의 소분자의 농도에 민감한 유도성 프로모터에 작동적으로 연결된 유전자의 발현 (또는 발현의 정도)을 조절하는 소분자와의 접촉을 지칭한다.
용어 "전기천공"은 생체막에서의 현미경적 경로를 유도하는 막횡단 전기장 펄스 (기공)의 사용을 지칭하며; 그들의 존재는 생체분자, 예컨대 플라스미드 또는 다른 올리고뉴클레오티드가 세포 막의 한 측에서 다른 측으로 통과하는 것을 허용한다.
적합하게는 본 발명의 폴리펩티드는 본원에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는 본 발명의 폴리펩티드는 본원에 기재된 바와 같은 아미노산 서열로 본질적으로 이루어진다. 적합하게는 본 발명의 폴리펩티드는 본원에 기재된 바와 같은 아미노산 서열로 이루어진다.
II. 융합 단백질 - 일반
일부 실시양태에서, 아피머 폴리펩티드는 아피머 폴리펩티드의 생물학적 활성을 조정하는 아피머 서열의 하나 또는 둘 다의 말단에 1개 이상의 추가의 폴리펩티드 서열을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 첨가는 변형된 아피머의 하나 이상의 특성 또는 활성, 예컨대 예를 들어, 표적 분자에 결합하고, 이를 억제하기 위해 친화도를 조정하거나, 순환 반감기를 조정하거나, 치료 반감기를 조정하거나, 아피머 폴리펩티드의 안정성을 조정하거나, 프로테아제에 의한 절단을 조정하거나, 용량을 조정하거나, 방출 또는 생체-이용률을 조정하거나, 정제를 용이하게 하거나, 탈아미드화를 감소시키거나, 저장 수명을 개선시키거나, 투여의 특정 경로를 개선시키거나 변경시킬 수 있다. 유사하게, 아피머 폴리펩티드는 폴리펩티드의 검출, 정제 또는 다른 속성을 개선시키는 프로테아제 절단 서열, 반응성 기, 항체-결합 도메인 (FLAG 또는 폴리-His를 포함하나 이에 제한되지는 않음) 또는 다른 친화도 기재 서열 (FLAG, 폴리-His, GST 등을 포함하나 이에 제한되지는 않음) 또는 연결된 분자 (비오틴을 포함하나 이에 제한되지는 않음)를 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명의 특정 측면에서, 아피머 폴리펩티드는 적어도 1개의 아피머 폴리펩티드 서열 및 1개 이상의 이종 폴리펩티드 서열 (본원에서 "융합 도메인")을 갖는 융합 단백질이다. 융합 도메인은 바람직한 특성, 예컨대 세포로부터의 분비 또는 세포 표면 상의 체류 (즉, 코딩된 아피머에 대해)를 부여하거나, 번역후 변형을 위한 기질 또는 다른 인식 서열로서 기능하거나, 단백질-단백질 상호작용을 통해 응집하는 다량체성 구조를 생성하거나, 혈청 반감기를 변경시키거나 (종종 연장시키거나), 조직 국재화 또는 조직 배제 및 다른 ADME 특성을 변경시키도록 선택될 수 있다 - 단지 예로서.
예를 들어, 일부 융합 도메인은 예컨대 친화성 크로마토그래피에 의한 융합 단백질의 단리 및/또는 정제에 특히 유용하다. 발현 또는 정제를 용이하게 하는 이러한 융합 도메인의 널리 공지된 예로는 단지 예시를 위해 친화성 태그, 예컨대 폴리히스티딘 (즉, His6 태그), 스트렙 (Strep) II 태그, 스트렙타비딘-결합 펩티드 (SBP) 태그, 칼모둘린-결합 펩티드 (CBP), 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (GST), 말토스-결합 단백질 (MBP), S-태그, HA 태그, c-Myc 태그, 티오레독신, 단백질 A 및 단백질 G를 들 수 있다.
아피머 폴리펩티드가 분비되기 위해, 이는 일반적으로 세포질 세망의 루멘으로의 단백질의 수송을 지정하고, 궁극적으로 분비되는 (또는 막횡단 도메인 또는 다른 세포 표면 체류 신호의 경우 세포 표면 상에 체류되는) 신호 서열을 함유할 것이다. 신호 서열 (또한 신호 펩티드 또는 리더 서열로 지칭됨)은 발생기 폴리펩티드의 N-말단에 위치한다. 이들은 폴리펩티드를 세포질 세망에 표적화하며, 단백질은 그들의 목적지로, 예를 들어, 세포소기관의 내부 공간으로, 내부 막으로, 세포 외부 막으로, 또는 분비를 통해 세포 외부로 분류된다. 대부분의 신호 서열은 단백질이 세포질 세망으로 수송된 후에 신호 펩티다제에 의해 단백질로부터 절단된다. 폴리펩티드로부터의 신호 서열의 절단은 통상적으로 아미노산 서열에서의 특이적 부위에서 일어나며, 신호 서열 내의 아미노산 잔기에 의존한다.
일부 실시양태에서, 신호 펩티드는 길이가 약 5 내지 약 40개 아미노산 (예컨대 길이가 약 5 내지 약 7, 약 7 내지 약 10, 약 10 내지 약 15, 약 15 내지 약 20, 약 20 내지 약 25, 또는 약 25 내지 약 30, 약 30 내지 약 35, 또는 약 35 내지 약 40개 아미노산)이다.
일부 실시양태에서, 신호 펩티드는 인간 단백질로부터의 천연 신호 펩티드이다. 다른 실시양태에서, 신호 펩티드는 비-천연 신호 펩티드이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 비-천연 신호 펩티드는 상응하는 천연 분비된 인간 단백질로부터의 돌연변이체 천연 신호 펩티드이며, 1개 이상의 (예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의) 치환, 삽입 또는 결실을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 신호 펩티드는 이뮤노글로불린 (예컨대 IgG 중쇄 or IgG-카파 경쇄), 시토카인 (예컨대 인터류킨-2 (IL-2), 또는 CD33), 혈청 알부민 단백질 (예를 들어 HSA 또는 알부민), 인간 아주로시딘 단백질원 신호 서열, 루시페라제, 트립시노겐 (예를 들어 키모트립시노겐 또는 트립시노겐)으로부터의 신호 펩티드 또는 그의 돌연변이체, 또는 세포로부터 단백질을 효율적으로 분비할 수 있는 다른 신호 펩티드이다. 예시적인 신호 펩티드로는 하기를 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다:
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분비된 아피머 폴리펩티드의 일부 실시양태에서, 재조합 폴리펩티드는 발현되는 경우 신호 펩티드를 포함하며, 신호 펩티드 (또는 그의 부분)는 분비 시 아피머 폴리펩티드로부터 절단된다.
대상 융합 단백질은 또한 이종 단백질 서열 또는 도메인을 분리하는 1개 이상의 링커를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "링커"는 제1 폴리펩티드 (예를 들어, 아피머) 및 제2 폴리펩티드 (예를 들어, 제2 아피머, Fc 영역, 수용체 트랩, 알부민 등) 사이에 삽입된 링커 아미노산 서열을 지칭한다. 연구자들에 의해 설계된 경험적 링커는 일반적으로 그들의 구조에 따라 3개의 카테고리로 분류된다: 유연성 링커, 강성 링커, 및 생체내 절단가능한 링커. 기능적 도메인을 함께 연결하는 (유연성 및 강성 링커에서와 같이) 또는 유리 기능적 도메인을 생체내에서 방출시키는 (생체내 절단가능한 링커에서와 같이) 데 있어서의 기본적인 역할 외에도, 링커는 융합 단백질의 생산을 위한 많은 다른 이점, 예컨대 생물학적 활성의 개선, 발현 수율의 증가, 및 바람직한 약동학 프로파일의 달성을 제공할 수 있다. 링커는 융합 단백질의 발현, 분비, 또는 생활성에 유해하게 영향을 미치지 않아야 한다. 링커는 항원성이 아니어야 하고, 면역 반응을 유발하지 않아야 한다.
적합한 링커는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있으며, 종종 글리신 및 세린 잔기의 혼합물을 들 수 있고, 종종 입체적으로 장해되지 않은 아미노산을 들 수 있다. 유용한 링커 내로 혼입될 수 있는 다른 아미노산으로는 트레오닌 및 알라닌 잔기를 들 수 있다. 링커 길이는 예를 들어 길이가 1 내지 50개 아미노산, 길이가 1 내지 22개 아미노산, 길이가 1 내지 10개 아미노산, 길이가 1 내지 5개 아미노산, 또는 길이가 1 내지 3개 아미노산의 범위일 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커는 절단 부위를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커는 제2 폴리펩티드가 제1 폴리펩티드로부터 분비될 수 있도록, 효소 절단 부위를 포함할 수 있다.
특정 바람직한 실시양태에서, 링커는 유연성으로서 특징화될 수 있다. 유연성 링커는 통상적으로 연결된 도메인이 특정 정도의 이동 또는 상호작용을 요구하는 경우 적용된다. 이들은 일반적으로 작은, 비-극성 (예를 들어 Gly) 또는 극성 (예를 들어 Ser 또는 Thr) 아미노산으로 구성된다. 예를 들어, 문헌 [Argos P. (1990) "An investigation of oligopeptides linking domains in protein tertiary structures and possible candidates for general gene fusion" J Mol Biol. 211:943-958]을 참조한다. 이들 아미노산의 작은 크기는 유연성을 제공하며, 기능적 도메인을 연결하는 이동성을 허용한다. Ser 또는 Thr의 혼입은 물 분자와 수소 결합을 형성함으로써 수용액에서 링커의 안정성을 유지할 수 있으며, 따라서 링커 및 단백질 모이어티 사이의 바람직하지 않은 상호작용을 감소시킨다. 가장 통상적으로 사용되는 유연성 링커는 Gly 및 Ser 잔기의 스트레치로 주로 이루어진 서열을 갖는다 ("GS" 링커). 가장 폭넓게 사용되는 유연성 링커의 예는 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n의 서열을 갖는다. 카피 수 "n"을 조정함으로써, 이 GS 링커의 길이는 기능적 도메인의 적절한 분리를 달성하거나, 필요한 내부-도메인 상호작용을 유지하도록 최적화될 수 있으며, 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이다. GS 링커 외에도, 많은 다른 유연성 링커는 재조합 융합 단백질을 위해 설계되었다. 이들 유연성 링커는 또한 작은 또는 극성 아미노산, 예컨대 Gly 및 Ser이 풍부하기 때문에, 그러나 유연성을 유지하기 위해 추가의 아미노산, 예컨대 Thr 및 Ala, 뿐만 아니라 용해도를 개선시키기 위해 극성 아미노산, 예컨대 Lys 및 Glu를 함유할 수 있다.
특정 바람직한 실시양태에서, 링커는 강성으로서 특징화될 수 있다. 유연성 링커는 기능적 도메인을 수동적으로 연결하는 이점을 가지며, 특정 정도의 이동을 허용하는 반면, 이들 링커의 강성의 결여는 특정 융합 단백질 실시양태에서, 예컨대 발현 수율 또는 생물학적 활성에서 제한일 수 있다. 이들 예에서 유연성 링커의 비유효성은 단백질 도메인의 비유효한 분리 또는 서로와의 그들의 간섭의 불충분한 감소에 기인하였다. 이들 상황 하에서, 강성 링커는 도메인 사이의 고정된 거리를 유지하고, 그들의 독립적인 기능을 유지하도록 성공적으로 적용되었다.
많은 천연 링커는 α-나선 구조를 나타내었다. α-나선 구조는 강성이고 안정하였으며, 절편내 수소 결합 및 밀접하게 패킹된 백본을 갖는다. 따라서, 딱딱한 α-나선 링커는 단백질 도메인 사이에 강성 스페이서로서 작용할 수 있다. 문헌 [George et al. (2002) "An analysis of protein domain linkers: their classification and role in protein folding" Protein Eng. 15(11):871-9]. 일반적으로, 강성 링커는 α-나선 구조를 채택함으로써 또는 다수의 Pro 잔기를 함유함으로써 상대적으로 딱딱한 구조를 나타낸다. 많은 상황 하에서, 이들은 유연성 링커보다 더 유효하게 기능적 도메인을 분리한다. 링커의 길이는 도메인 사이의 최적 거리를 달성하도록 카피 수를 변화시킴으로써 용이하게 조정될 수 있다. 그 결과, 강성 링커는 도메인의 공간적 분리가 융합 단백질의 안정성 또는 생활성을 보존하는 것이 중요한 경우 선택된다. 이와 관련하여, (EAAAK)n (여기서, n은 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10임)의 서열을 갖는 알파 나선-형성 링커는 많은 재조합 융합 단백질의 구축에 적용되었다. 또다른 유형의 강성 링커는 Pro-풍부 서열, (XP)n을 가지며, X는 임의의 아미노산, 바람직하게는 Ala, Lys, 또는 Glu를 지정하고, n은 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이다.
단지 예시를 위해, 예시적인 링커로는 하기를 들 수 있다:
Figure pct00018
대상 융합 단백질에 사용될 수 있는 다른 링커로는 SerGly, GGSG (서열식별번호: 59), GSGS (서열식별번호: 60), GGGS(서열식별번호: 61), S(GGS)n (서열식별번호: 62) (여기서, n은 1 내지 7임), GRA, 폴리(Gly), 폴리(Ala), GGGSGGG (서열식별번호: 63), ESGGGGVT (서열식별번호: 64), LESGGGGVT (서열식별번호: 65), GRAQVT (서열식별번호: 66), WRAQVT (서열식별번호: 67), 및 ARGRAQVT (서열식별번호: 68)를 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 하기 기재된 Fc 융합물의 힌지 영역은 또한 링커로 간주될 수 있다.
세포의 형질막 상에 단백질을 앵커링하기 위해 다양한 요소가 채용될 수 있다. 예를 들어, 유형-I (세포 외부의 N-말단을 따라 배향됨) 및 유형-II (시토졸에서 N-말단을 따라 배향됨) 내재성 막 단백질의 막횡단 도메인 (TM)은 키메라 단백질을 형질막에 표적화하는 데 사용될 수 있다. 단백질은 또한 유전자의 3' 말단에의 GPI (글리코포스파티딜이노시톨 지질) 신호의 융합에 의해 세포 표면에 부착될 수 있다. 짧은 카르복시-말단 펩티드의 절단은 아미드 연결을 통해 새롭게 노출된 C-말단에의 당지질의 부착을 허용한다. 문헌 [Udenfriend et al. (1995) "How Glycosylphoshpatidylinositol Anchored Membrane Proteins are Made" Annu Rev Biochem 64:563-591]을 참조한다.
특정 실시양태에서, 융합 단백질은 막횡단 폴리펩티드 서열 (막횡단 도메인)을 포함한다. 적절한 막횡단 폴리펩티드의 구별되는 특색은 아피머 폴리펩티드가 제시되어야 하는 세포의 표면에서 발현되는 능력을 포함한다. 특정 실시양태에서, 이는 면역 세포, 특히 림프구 세포 또는 자연 살해 (NK) 세포일 수 있으며, 일단 거기에서 미리 정의된 표적 종양 세포에 대해 면역 세포의 세포 반응을 지정하도록 면역 세포 표면 상의 아피머 폴리펩티드가 결합하는 세포 표면 특색을 발현하는 종양 세포와 상호작용하기 위한 것이다. 막횡단 도메인은 천연으로부터 또는 합성 공급원으로부터 유래될 수 있다. 막횡단 도메인은 임의의 막-결합된 또는 막횡단 단백질로부터 유래될 수 있다. 비-제한적 예로서, 막횡단 폴리펩티드는 T 세포 수용체의 서브유닛, 예컨대 α, β, γ 또는 δ, CD3 복합체를 구성하는 폴리펩티드, IL2 수용체 p55 (a 쇄), p75 (β 쇄) 또는 γ 쇄, Fc 수용체의 서브유닛 쇄, 특히 Fey 수용체 III 또는 CD 단백질일 수 있다. 대안적으로, 막횡단 도메인은 합성일 수 있으며, 우세하게는 소수성 잔기, 예컨대 류신 및 발린을 포함할 수 있다.
특정 다른 실시양태에서, 아피머 폴리펩티드는 아피머 폴리펩티드 외에도, 글리코실포스파티딜이노시톨 (GPI) 앵커의 번역후 첨가를 신호전달하는 서열을 포함하는 융합 단백질이다. GPI 앵커는 많은 진핵생물 단백질의 C-말단에 번역후에 첨가되는 당지질 구조이다. 아피머 폴리펩티드로의 이 변형은 이를 아피머 폴리펩티드가 재조합 단백질 (즉, 하기 기재된 바와 같이 코딩된 아피머)로서 재-발현되는 세포의 세포막의 세포외 표면 상에 앵커링되게 (부착되게) 할 것이다. 이들 실시양태에서, GPI 앵커 도메인은 아피머 폴리펩티드 서열에 대해 C-말단이며, 바람직하게는 융합 단백질의 C-말단에서 발생한다.
한 실시양태에서, GPI 앵커 도메인은 그것이 일부인 융합 단백질이 진핵생물 시스템에서 발현되는 경우 GPI 앵커의 번역후 첨가를 신호전달하는 폴리펩티드이다. GPI 앵커 신호 서열은 앵커 첨가의 부위 (ω 부위)에서, 이어서 친수성 스페이서 및 소수성 스트레치에서 종료되는 작은 아미노산의 세트로 이루어진다 (Low, (1989) FASEB J. 3:1600-1608). 이 신호 서열의 절단은 보존된 중심 성분을 갖지만, 가변 주변 모이어티를 갖는 앵커의 첨가 전에 ER에서 일어난다 (Homans et al., Nature, 333:269-272 (1988)). GPI-앵커링된 단백질의 C-말단은 포스포에탄올아민 가교를 통해 고도로 보존된 코어 글리칸, 만노스(α1-2)만노스(α1-6)만노스(α1-4)글루코스아민(α1-6)미오-이노시톨에 연결된다. 인지질 꼬리는 GPI 앵커를 세포막에 부착시킨다.
대상 아피머-함유 융합 단백질에 사용될 수 있는 예시적인 GPI 앵커 도메인으로는
Figure pct00019
를 들 수 있다.
GPI 앵커 부착은 GPI 번역후 변형을 수행할 수 있는 진핵생물 시스템에서 GPI 앵커 도메인을 함유하는 아피머 융합 단백질의 발현에 의해 달성될 수 있다. 막횡단 도메인 융합 단백질과 마찬가지로, 항종양을 개시하거나 촉진시키는 데 관여하는 림프구 및 다른 세포를 비롯한 인간 세포는 그렇게 할 수 있으며, 조작된 세포의 표면 상에 융합을 함유하는 발현된 아피머를 보유하기 위해 GPI 앵커 도메인을 포함하는 코딩된 아피머를 발현하도록 조작될 수 있다.
아피머 폴리펩티드 서열 자체에 또는 융합 단백질의 일부로서 제공되는 플랭킹 폴리펩티드 모이어티에 생성될 수 있는 추가의 다른 변형은 효소에 의한 번역후 변형을 위한 부위인 1개 이상의 서열이다. 이들로는 글리코실화, 아세틸화, 아실화, 지질-변형, 팔미토일화, 팔미테이트 첨가, 인산화, 당지질-연결 변형 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
a. PK 및 ADME 특성을 조작하기
특정 실시양태에서, 아피머 폴리펩티드는 투여의 경로, 예컨대 비경구 치료 투여에 최적인 반감기 및/또는 PK 프로파일을 갖지 않을 수 있다. 용어 "반감기"는 물질, 예컨대 본 발명의 아피머 폴리펩티드가 그의 약리학적 또는 생리학적 활성 또는 농도의 반을 소실하는 데 걸리는 시간의 양을 지칭한다. 생물학적 반감기는 물질의 제거, 배출, 분해 (예를 들어, 효소적), 또는 신체의 특정 기관 또는 조직에서의 흡수 또는 농축에 의해 영향을 받을 수 있다. 일부 실시양태에서, 생물학적 반감기는 물질의 혈장 농도가 그의 안정 상태 수준의 반에 도달하는 데 걸리는 시간 ("혈장 반감기")을 측정함으로써 평가될 수 있다. 이 단점을 다루기 위해, 아피머 폴리펩티드의 일부로서 반감기 연장 모이어티의 혼입을 비롯한, 다른 단백질 치료제의 경우 사용된 반감기의 연장을 위한 다양한 일반적 전략이 있다.
용어 "반감기 연장 모이어티"는 아피머 폴리펩티드의 생체내 단백질분해성 분해 또는 다른 활성-감소 변형을 방지하거나 경감시키고/거나, 반감기를 증가시키고/거나, 비교자, 예컨대 변형된 아피머 폴리펩티드의 비접합된 형태에 비해, 흡수의 속도의 증가, 독성의 감소, 용해도의 개선, 단백질 응집의 감소, 변형된 아피머 폴리펩티드의 생물학적 활성 및/또는 표적 선택성의 증가, 제조가능성의 증가, 및/또는 변형된 아피머 폴리펩티드의 면역원성의 감소를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다른 약동학적 또는 생물물리학적 특성을 개선시키거나 변경시키는, 임의로 비-천연 코딩된 아미노산을 통해, 직접적으로 또는 링커를 통해, 본원에 기재된 아피머 폴리펩티드를 형성하기 위해 아피머 폴리펩티드에 공유적으로 연결된 ("접합된" 또는 "융합된") 제약학적으로 허용되는 모이어티, 도메인, 또는 분자를 지칭한다. 용어 "반감기 연장 모이어티"는 비-단백질성, 반감기 연장 모이어티, 예컨대 수용성 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 또는 디스크리트 PEG, 히드록시에틸 전분 (HES), 지질, 분지되거나 비분지된 아실 기, 분지되거나 비분지된 C8-C30 아실 기, 분지되거나 비분지된 알킬 기, 및 분지되거나 비분지된 C8-C30 알킬 기; 및 단백질성 반감기 연장 모이어티, 예컨대 혈청 알부민, 트랜스페린, 아드넥틴 (예를 들어, 알부민-결합 또는 약동학 연장 (PKE) 아드넥틴), Fc 도메인, 및 비구조화된 폴리펩티드, 예컨대 XTEN 및 PAS 폴리펩티드 (예를 들어 아미노산 Pro, Ala, 및/또는 Ser로 구성된 입체형태적으로 장애된 폴리펩티드 서열), 및 상기 중 임의의 것의 단편을 포함한다.
특정 실시양태에서, 반감기 연장 모이어티는 모이어티에 그렇게 접합되지 않은 단백질의 반감기에 비해 (예컨대 아피머 폴리펩티드 단독에 비해) 포유동물 혈청에서 순환하는 생성된 아피머 폴리펩티드의 반감기를 연장시킨다. 일부 실시양태에서, 반감기는 약 1.2배, 1.5배, 2.0배, 3.0배, 4.0배., 5.0배, 또는 6.0배 초과 연장된다. 일부 실시양태에서, 반감기는 반감기 연장 모이어티 없는 단백질에 비해 생체내 투여 후에 6시간 초과, 12시간 초과, 24시간 초과, 48시간 초과, 72시간 초과, 96시간 초과 또는 1주 초과 연장된다.
추가의 예시를 위한 수단으로서, 본 발명의 아피머 폴리펩티드의 생성에 사용될 수 있는 반감기 연장 모이어티로는 하기를 들 수 있다:
· 천연적으로 긴-반감기 단백질 또는 단백질 도메인에 대한 약리학적 활성 아피머 서열의 유전적 융합 (예를 들어, Fc 융합, 트랜스페린 [Tf] 융합, 또는 알부민 융합). 예를 들어, 문헌 [Beck et al. (2011) "Therapeutic Fc-fusion proteins and peptides as successful alternatives to antibodies. MAbs. 3:1-2]; [Czajkowsky et al. (2012) "Fc-fusion proteins: new developments and future perspectives. EMBO Mol Med. 4:1015-28]; [Huang et al. (2009) "Receptor-Fc fusion therapeutics, traps, and Mimetibody technology" Curr Opin Biotechnol. 2009;20:692-9]; [Keefe et al. (2013) "Transferrin fusion protein therapies: acetylcholine receptor-transferrin fusion protein as a model. In: Schmidt S, editor. Fusion protein technologies for biopharmaceuticals: applications and challenges. Hoboken: Wiley; p. 345-56]; [Weimer et al. (2013) "Recombinant albumin fusion proteins. In: Schmidt S, editor. Fusion protein technologies for biopharmaceuticals: applications and challenges. Hoboken: Wiley; 2013. p. 297-323]; [Walker et al. (2013) "Albumin-binding fusion proteins in the development of novel long-acting therapeutics. In: Schmidt S, editor. Fusion protein technologies for biopharmaceuticals: applications and challenges. Hoboken: Wiley; 2013. p. 325-43]을 참조한다.
· 불활성 폴리펩티드에 대한 약리학적 활성 아피머 서열의 유전적 융합, 예를 들어, XTEN (또한 재조합 PEG 또는 "rPEG"로 공지됨), 단독아미노산 중합체 (HAP; HAP화), 프롤린-알라닌-세린 중합체 (PAS; PAS화), 또는 엘라스틴-유사 펩티드 (ELP; ELP화). 예를 들어, 문헌 [Schellenberger et al. (2009) "A recombinant polypeptide extends the in vivo half-life of peptides and proteins in a tunable manner. Nat Biotechnol. 2009;27:1186-90]; [Schlapschy et al. Fusion of a recombinant antibody fragment with a homo-amino-acid polymer: effects on biophysical properties and prolonged plasma half-life. Protein Eng Des Sel. 2007;20:273-84]; [Schlapschy (2013) PASylation: a biological alternative to PEGylation for extending the plasma half-life of pharmaceutically active proteins. Protein Eng Des Sel. 26:489-501]; [Floss et al. (2012) "Elastin-like polypeptides revolutionize recombinant protein expression and their biomedical application. Trends Biotechnol. 28:37-45]; [Floss et al. "ELP-fusion technology for biopharmaceuticals. In: Schmidt S, editor. Fusion protein technologies for biopharmaceuticals: application and challenges. Hoboken: Wiley; 2013. p. 372-98]을 참조한다.
· 반복 화학적 모이어티에의, 예를 들어, PEG (PEG화) 또는 히알루론산에의 약리학적 활성 펩티드 또는 단백질의 화학적 접합에 의해 수력학적 반경을 증가시키는 것. 예를 들어, 문헌 [Caliceti et al. (2003) "Pharmacokinetic and biodistribution properties of poly(ethylene glycol)-protein conjugates" Adv Drug Delivery Rev. 55:1261-77]; [Jevsevar et al. (2010) PEGylation of therapeutic proteins. Biotechnol J 5:113-28]; [Kontermann (2009) "Strategies to extend plasma half-lives of recombinant antibodies" BioDrugs. 23:93-109]; [Kang et al. (2009) "Emerging PEGylated drugs" Expert Opin Emerg Drugs. 14:363-80]; 및 [Mero et al. (2013) "Conjugation of hyaluronan to proteins" Carb Polymers. 92:2163-70]을 참조한다.
· 폴리시알릴화에 의해 약리학적 활성 펩티드 또는 단백질을 융합시키는 것의 음전하를 유의하게 증가시키는 것; 또는 대안적으로, (b) 생물학적 약물 후보에, 천연 단백질, 예컨대 인간 CG b-서브유닛의 반감기를 연장시키는 것으로 공지된 음으로 하전된, 고도로 시알릴화된 펩티드 (예를 들어, 카르복시-말단 펩티드 [CTP; 융모성 고나도트로핀 (CG) b-쇄의])를 융합시키는 것. 예를 들어, 문헌 [Gregoriadis et al. (2005) "Improving the therapeutic efficacy of peptides and proteins: a role for polysialic acids" Int J Pharm. 2005; 300:125-30]; [Duijkers et al. "Single dose pharmacokinetics and effects on follicular growth and serum hormones of a long-acting recombinant FSH preparation (FSHCTP) in healthy pituitary-suppressed females" (2002) Hum Reprod. 17:1987-93]; 및 [Fares et al. "Design of a long-acting follitropin agonist by fusing the C-terminal sequence of the chorionic gonadotropin beta subunit to the follitropin beta subunit" (1992) Proc Natl Acad Sci USA. 89:4304-8. 35]; 및 [Fares "Half-life extension through O-glycosylation]을 참조한다.
· 생활성 단백질에의, 통상적으로 긴-반감기 단백질, 예컨대 HSA, 인간 IgG, 트랜스페린 또는 피브로넥틴에의 펩티드 또는 단백질-결합 도메인의 부착을 통해 비-공유적으로 결합시키는 것. 예를 들어, 문헌 [Andersen et al. (2011) "Extending half-life by indirect targeting of the neonatal Fc receptor (FcRn) using a minimal albumin binding domain" J Biol Chem. 286:5234-41]; [O'Connor-Semmes et al. (2014) "GSK2374697, a novel albumin-binding domain antibody (albudAb), extends systemic exposure of extendin-4: first study in humans-PK/PD and safety" Clin Pharmacol Ther. 2014;96:704-12]; [Sockolosky et al. (2014) "Fusion of a short peptide that binds immunoglobulin G to a recombinant protein substantially increases its plasma half-life in mice" PLoS One. 2014;9:e102566]을 참조한다.
오래 살아남는 혈청 단백질에 대한 고전적인 유전적 융합은 PEG 또는 지질에의 화학적 접합으로부터 구별되는 반감기 연장의 대안적 방법을 제공한다. 2가지 주요한 단백질은 전통적으로 융합 상대로서 사용되었다: 항체 Fc 도메인 및 인간 혈청 알부민 (HSA). Fc 융합은 항체의 Fc 부분에 대한 펩티드, 단백질 또는 수용체 외도메인의 융합을 포함한다. Fc 및 알부민 융합 둘 다는 펩티드 약물의 크기를 증가시킴으로써 뿐만 아니라, 둘 다 신체의 자연 재생 메커니즘을 사용함으로써 연장된 반감기를 달성한다: 신생아 Fc 수용체, FcRn. FcRn에의 이들 단백질의 pH-의존적 결합은 엔도솜에서 융합 단백질의 분해를 방지한다. 이들 단백질에 기초한 융합은 전형적인 PEG화된 또는 지질화된 펩티드보다 훨씬 더 긴, 3 내지 16일 범위의 반감기를 가질 수 있다. 항체 Fc 도메인에의 융합은 펩티드 또는 단백질 약물의 용해도 및 안정성을 개선시킬 수 있다. 펩티드 Fc 융합의 예는 현재 후기-단계 임상 시험 중인 GLP-1 수용체 효능제인 둘라글루티드이다. 지방 아실화 펩티드에 의해 이용되는 동일한 단백질인 인간 혈청 알부민은 다른 대중적인 융합 상대이다. 알비글루티드는 이 플랫폼에 기초한 GLP-1 수용체 효능제이다. Fc 및 알부민 사이의 주요한 차이는 융합 상대의 선택에 따라 이량체 또는 단량체로서 융합된 펩티드의 제시를 초래하는 Fc의 이량체성 성질 대 HSA의 단량체성 구조이다. 아피머-Fc 융합의 이량체성 성질은 아피머 표적, 예컨대 표적 세포 상의 세포 표면 단백질이 함께 충분히 가깝게 간격화되거나, 그들 자신이 이량체 또는 보다 높은 차수 단량체인 경우, 결합력 효과를 생성할 수 있다. 이는 표적에 따라 바람직하거나 그렇지 않을 수 있다.
(i) Fc 융합
일부 실시양태에서, 아피머 폴리펩티드는 이뮤노글로불린 Fc 도메인 ("Fc 도메인"), 또는 그의 단편 또는 변이체, 예컨대 기능적 Fc 영역을 갖는 융합 단백질의 일부일 수 있다. 이 맥락에서, Fc 융합 ("Fc-융합"), 예컨대 아피머-Fc 융합 단백질로서 생성된 아피머 폴리펩티드는 펩티드 백본을 통해 (직접적으로 또는 간접적으로) 이뮤노글로불린의 Fc 영역에 공유적으로 연결된 1개 이상의 아피머 서열을 포함하는 폴리펩티드이다. Fc-융합은 예를 들어, 항체의 Fc 영역 (이는 이펙터 기능 및 약동학을 용이하게 함) 및 동일한 폴리펩티드의 일부로서 아피머 서열을 포함할 수 있다. 이뮤노글로불린 Fc 영역은 또한 1종 이상의 아피머에 간접적으로 연결될 수 있다. 다양한 링커는 관련 기술분야에 공지되어 있으며, Fc-융합을 생성하기 위해 아피머 서열을 포함하는 폴리펩티드에 Fc를 연결하는 데 임의로 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, Fc-융합은 이량체화되어 Fc-융합 동종이량체를 형성하거나, 비-동일한 Fc 도메인을 사용하여, Fc-융합 이종이량체를 형성할 수 있다.
아피머 융합 단백질로서 대상 아피머 폴리펩티드를 생성하는 데 사용하기 위해 인간 항체의 Fc 영역을 선택하는 데에는 몇몇 이유가 있다. 원리 근거는 항체의 그것에 비해 유사한 약동학 프로파일을 입증하는 데 충분히 큰 안정한 단백질을 생성하는 것, 및 Fc 영역에 의해 부여되는 특성을 사용하는 것이며; 이는 세포내이입 후 세포 표면에 대한 융합 단백질의 FcRn-매개된 재생을 포함하는 구제 신생아 FcRn 수용체 경로를 포함하며, 이는 리소좀 분해를 회피하고, 혈류 내로의 다시 방출을 초래하며, 따라서 연장된 혈청 반감기에 기여한다. 또다른 자명한 이점은 단백질 A에의 Fc 도메인의 결합이며, 이는 아피머 폴리펩티드의 제조 동안 하류 프로세싱을 단순화하고, 아피머 폴리펩티드의 매우 순수한 제제의 생성을 허용할 수 있다.
일반적으로, Fc 도메인은 제1 불변 영역 이뮤노글로불린 도메인을 제외한 항체의 불변 영역을 포함할 것이다. 따라서, Fc 도메인은 IgA, IgD, 및 IgG의 마지막 2개의 불변 영역 이뮤노글로불린 도메인, 및 IgE 및 IgM의 마지막 3개의 불변 영역 이뮤노글로불린 도메인, 및 이들 도메인에 대한 유연성 힌지 N-말단을 지칭한다. IgA 및 IgM에 대해 Fc는 J 쇄를 포함할 수 있다. IgG에 대해, Fc는 이뮤노글로불린 도메인 Cγ2 및 Cγ3 및 Cγ1 및 Cγ2 사이의 힌지를 포함한다. Fc 도메인의 경계는 다양할 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 통상적으로 그의 카르복실-말단에 대한 잔기 C226 또는 P230을 포함하도록 정의되며, 여기서 넘버링은 카바트 (Kabat)에 제시된 바와 같은 EU 인덱스를 따른다 (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, NIH, Bethesda, Md. (1991)). Fc는 별도로 이 영역, 또는 전체 항체, 항체 단편, 또는 Fc 융합 단백질의 맥락에서 이 영역을 지칭할 수 있다. 다형성은 다수의 상이한 Fc 위치에서 관찰되었으며, 또한 본원에 사용된 바와 같은 Fc 도메인으로서 포함된다.
특정 실시양태에서, 본원에 사용된 바와 같은 Fc, "기능적 Fc 영역"은 FcRn에 결합하는 능력을 보유하는 Fc 도메인 또는 그의 단편을 지칭한다. 기능적 Fc 영역은 FcRn에 결합하지만, 이펙터 기능을 갖지 않는다. FcRn에 결합하는 Fc 영역 또는 그의 단편의 능력은 관련 기술분야에 공지된 표준 결합 검정에 의해 측정될 수 있다. 예시적인 "이펙터 기능"으로는 C1q 결합; 보체 의존성 세포독성 (CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC); 포식작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체; BCR)의 하향 조절 등을 들 수 있다. 이러한 이펙터 기능은 이러한 항체 이펙터 기능을 평가하기 위한 관련 기술분야에 공지된 다양한 검정을 사용하여 평가될 수 있다.
예시적인 실시양태에서, Fc 도메인은 IgG1 하위부류로부터 유래되지만, 다른 하위부류 (예를 들어, IgG2, IgG3, 및 IgG4)는 또한 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 인간 IgG1 이뮤노글로불린 Fc 도메인의 예시적인 서열은
Figure pct00020
이다.
일부 실시양태에서, 융합 단백질에 사용되는 Fc 영역은 Fc 분자의 힌지 영역을 포함할 수 있다. 예시적인 힌지 영역은 상기 제공된 예시적인 인간 IgG1 이뮤노글로불린 Fc 도메인 서열의 위치 1 내지 16에 걸치는 코어 힌지 잔기 (즉, DKTHTCPPCPAPELLG (서열식별번호: 76))를 포함한다. 특정 실시양태에서, 아피머-함유 융합 단백질은 부분적으로 상기 제공된 예시적인 인간 IgG1 이뮤노글로불린 Fc 도메인 서열의 힌지 영역 내의 위치 6 및 9에서의 시스테인 잔기로 인해 다량체성 구조 (예를 들어, 이량체)를 채택할 수 있다. 다른 실시양태에서, 본원에 사용된 바와 같은 힌지 영역은 상기 제공된 예시적인 인간 IgG1 이뮤노글로불린 Fc 도메인 서열의 코어 힌지 서열에 플랭킹된 CH1 및 CH2 영역으로부터 유래된 잔기를 추가로 포함할 수 있다. 추가의 다른 실시양태에서, 힌지 서열은 GSTHTCPPCPAPELLG (서열식별번호: 77) 또는 EPKSCDKTHTCPPCPAPELLG (서열식별번호: 78)를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.
일부 실시양태에서, 힌지 서열은 바람직한 약동학적, 생물물리학적, 및/또는 생물학적 특성을 부여하는 1개 이상의 치환을 포함할 수 있다. 일부 예시적인 힌지 서열로는
Figure pct00021
를 들 수 있다.
한 실시양태에서, 상기 제공된 예시적인 인간 IgG1 이뮤노글로불린 Fc 도메인 서열의 위치 18에서의 잔기 P는 Fc 이펙터 기능을 제거하기 위해 S로 대체될 수 있으며; 이 대체는 서열 EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGSS (서열식별번호: 85), EPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSS (서열식별번호: 86), 및 DKTHTCPPCPAPELLGGSS (서열식별번호: 87)를 갖는 힌지에서 예시된다. 또다른 실시양태에서, 상기 제공된 예시적인 인간 IgG1 이뮤노글로불린 Fc 도메인 서열의 위치 1 내지 2에서의 잔기 DK는 잠재적 클립 부위를 제거하기 위해 GS로 대체될 수 있으며; 이 대체는 서열 EPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSS (서열식별번호: 88)에서 예시된다. 또다른 실시양태에서, 인간 IgG1의 중쇄 불변 영역 (즉, 도메인 CH1 내지 CH3)의 위치 103에서의 C는 경쇄의 부재 하에서의 부적절한 시스테인 결합 형성을 방지하기 위해 S로 대체될 수 있으며; 이 대체는 EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPS (서열식별번호: 89), EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGSS (서열식별번호: 90), 및 EPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSS (서열식별번호: 91)에 의해 예시된다.
일부 실시양태에서, Fc는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4로부터 유래된 Fc 도메인을 비롯한 포유동물 Fc, 예컨대 인간 Fc이다. Fc 영역은 천연 Fc 영역과 및/또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역과 적어도 약 80％, 85％, 90％, 95％, 96％, 97％, 98％, 또는 99％ 서열 동일성을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, Fc 영역은 천연 Fc 영역과 및/또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역과 적어도 약 90％ 서열 동일성을 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, Fc 도메인은 서열식별번호: 4 내지 16에 의해 제공된 예로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. Fc 도메인의 C-말단 리신은 Fc 도메인을 포함하는 융합 단백질의 임의적 성분임이 이해되어야 한다. 일부 실시양태에서, Fc 도메인은 그의 C-말단 리신이 생략된 것을 제외하고는, 서열식별번호: 4 내지 16으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
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Figure pct00023
아피머 서열은 Fc 도메인의 N-말단 또는 C-말단 중 어느 하나에 위치할 수 있으며, 직접적으로 부착될 수 있거나, 융합 단백질은 Fc 도메인 및 아피머 폴리펩티드 서열 사이에 개재하는 다른 폴리펩티드 서열을 가질 수 있다.
"항체-의존성 세포-매개 세포독성" 또는 "ADCC"는 특정 세포독성 세포 (예를 들어, 자연 살해 (NK) 세포, 호중구, 및 대식세포) 상에 제시된 Fc 수용체 (FcR) 상으로 결합된 분비된 Ig가 이들 세포독성 이펙터 세포가 항원-함유 표적 세포에 특이적으로 결합하고, 이어서 표적 세포를 세포독소로 살해하는 것을 가능하게 하는 세포독성의 형태를 지칭한다.
특정 실시양태에서, 융합 단백질은 생성된 아피머 폴리펩티드가 ADCC 및/또는 보체 활성화 또는 이펙터 기능성을 갖지 않는 (또는 이들이 감소된) Fc 도메인 서열을 포함한다. 예를 들어, Fc 도메인은 IgG2 또는 IgG4 이소형의 천연적으로 장애가 있는 불변 영역 또는 돌연변이된 IgG1 불변 영역을 포함할 수 있다. 적합한 변형의 예는 EP0307434에 기재되어 있다. 한 예는 위치 235 및 237 (EU 인덱스 넘버링)에서의 알라닌 잔기의 치환을 포함한다.
다른 실시양태에서, 융합 단백질은 예를 들어 융합 단백질이 인간 IgG1 또는 IgG3으로부터의 Fc 도메인을 포함하는 경우와 같이, 생성된 아피머 폴리펩티드가 일부 또는 모든 Fc 기능성을 보유할, 예를 들어 ADCC 및 CDC 활성 중 하나 또는 둘 다가 가능할 Fc 도메인 서열을 포함한다. 이펙터 기능의 수준은 공지된 기법에 따라, 예를 들어 IgG1 CH2 도메인이 239 및 332 및 330으로부터 선택되는 위치에 1개 이상의 돌연변이를 갖는 예를 들어 CH2 도메인에서의 돌연변이, 예를 들어 항체가 향상된 이펙터 기능을 갖도록 S239D 및 I332E 및 A330L로부터 선택되는 돌연변이, 및/또는 예를 들어 Fc 영역의 푸코실화의 감소가 있도록 본 발명의 항원-결합 단백질의 글리코실화 프로파일을 변경시키는 것에 의해 다양화될 수 있다.
(ii) 알부민 융합
다른 실시양태에서, 아피머 폴리펩티드는 적어도 1개의 아피머 서열 외에도 알부민 서열 또는 알부민 단편을 포함하는 융합 단백질이다. 다른 실시양태에서, 아피머 폴리펩티드는 아피머를 포함하는 폴리펩티드 서열 내로의 혼입 이외의 화학적 연결을 통해 알부민 서열 또는 알부민 단편에 접합된다. 일부 실시양태에서, 알부민, 알부민 변이체, 또는 알부민 단편은 인간 혈청 알부민 (HSA), 인간 혈청 알부민 변이체, 또는 인간 혈청 알부민 단편이다. HSA에 필적하는 알부민 혈청 단백질은 예를 들어, 시노몰거스 원숭이, 소, 개, 토끼 및 래트에서 발견된다. 비-인간 종 중에서, 소 혈청 알부민 (BSA)은 HSA와 가장 구조적으로 유사하다. 예를 들어, 문헌 [Kosa et al., (2007) J Pharm Sci. 96(11):3117-24]을 참조한다. 본 개시내용은 시노몰거스 혈청 알부민 또는 소 혈청 알부민으로부터 유래된 알부민 서열을 포함하나 이에 제한되지는 않는 비-인간 종으로부터의 알부민의 사용을 고려한다.
약 20일의 혈청 반감기를 갖는 585 아미노산 폴리펩티드 (대략 67 kDa)인 성숙한 HSA는 콜로이드성 삼투 혈압, 혈액 pH의 유지, 및 다수의 내인성 및 외인성 리간드의 수송 및 분포를 주로 담당한다. 단백질은 3가지 구조적으로 상동성 도메인 (도메인 I, II 및 III)을 갖고, 거의 전체적으로 알파-나선 입체형태이며, 17개의 디술피드 가교에 의해 고도로 안정화된다. 특정 바람직한 실시양태에서, 아피머 폴리펩티드는 1개 이상의 아피머 폴리펩티드 서열 및 성숙한 인간 혈청 알부민에 대한 서열 (서열식별번호: 17) 또는 융합 단백질에서 바람직한 정도로 성숙한 알부민의 PK 및/또는 생체분포 특성을 유지하는 그의 변이체 또는 단편을 포함하는 알부민 융합 단백질일 수 있다.
Figure pct00024
알부민 서열은 상기 기재된 바와 같은 링커 서열의 사용에 의해 아피머 폴리펩티드 서열 또는 아피머 폴리펩티드에서의 다른 플랭킹 서열로부터 유발될 수 있다.
달리 지시되지 않는다면, 본원에서 "알부민"에 대한 또는 "성숙한 알부민"에 대한 언급은 HSA를 지칭하는 것으로 의미된다. 그러나, 전장 HSA는 18 아미노산 (MKWVTFISLLFLFSSAYS)의 신호 펩티드, 이어서 6 아미노산 (RGVFRR)의 프로-도메인을 가지며; 이 24 아미노산 잔기 펩티드는 프리-프로 도메인으로 지칭될 수 있음이 주목된다. 아피머-HSA 융합 단백질은 재조합 단백질 코딩 서열에서 HSA 프리-프로-도메인을 사용하여 발현되고 분비될 수 있다. 대안적으로, 아피머-HSA 융합은 상기 기재된 바와 같이, 다른 분비 신호 서열의 포함을 통해 발현되고 분비될 수 있다.
대안적 실시양태에서, 아피머 폴리펩티드를 갖는 융합 단백질의 일부로서 제공되기 보다는, 혈청 알부민 폴리펩티드는 백본 아미드 결합 이외의 결합을 통해 아피머-함유 폴리펩티드에 공유적으로 결합될, 예컨대 알부민 폴리펩티드 및 아피머-함유 폴리펩티드 각각 상의 아미노산 측쇄 사이의 화학적 접합을 통해 가교될 수 있다.
(iii) 알부민 결합 도메인
특정 실시양태에서, 아피머 폴리펩티드는 혈청-결합 모이어티를 포함할 수 있다 - 아피머 폴리펩티드 서열을 갖는 또는 인접한 폴리펩티드 쇄의 일부인 것 이외의 부위를 통해 화학적으로 접합된 융합 단백질 (또한 폴리펩티드의 경우)의 일부로서.
특정 실시양태에서, 혈청-결합 폴리펩티드는 알부민 결합 모이어티이다. 알부민은 다수의 소수성 결합 포켓을 함유하며, 자연적으로 다양한 상이한 리간드, 예컨대 지방산 및 스테로이드 뿐만 아니라 상이한 약물의 수송체로서 기능한다. 더욱이, 알부민의 표면은 음으로 하전되며, 이는 이를 고도로 수용성으로 만든다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "알부민 결합 모이어티"는 알부민에 결합할 수 있는, 즉 알부민 결합 친화도를 갖는 임의의 화학적 기를 지칭한다. 알부민은 내인성 리간드, 예컨대 지방산에 결합하지만; 이는 또한 외인성 리간드, 예컨대 와파린, 페니실린 및 디아제팜과 상호작용한다. 알부민에의 이들 약물의 결합은 가역적이기 때문에, 알부민-약물 복합체는 약물 생체분포 및 생체이용률을 향상시킬 수 있는 약물 저장소로서 기능한다. 내인성 알부민-결합 리간드를 모방하는 성분, 예컨대 지방산의 혼입은 알부민 회합을 강화하고, 약물 효능을 증가시키는 데 사용되었다.
특정 실시양태에서, 단백질 반감기를 증가시키는 대상 아피머 폴리펩티드의 생성에 적용될 수 있는 화학적 변형 방법은 지질화이며, 이는 펩티드 측쇄에의 지방산의 공유 결합을 포함한다. 원래 인슐린의 반감기를 연장시키기 위한 방법으로서 상정되고 개발되었지만, 지질화는 PEG화와 동일한 반감기 연장의 기본적 메커니즘, 즉, 신장 여과를 감소시키는 수력학적 반경의 증가를 공유한다. 그러나, 지질 모이어티는 그 자체가 상대적으로 작으며, 효과는 순환 알부민에의 지질 모이어티의 비-공유 결합을 통해 간접적으로 매개된다. 지질화의 하나의 결과는 그것이 펩티드의 수-용해도를 감소시킨다는 것이지만, 펩티드 및 지방산 사이의 링커의 조작은 예를 들어 링커 내의 글루타메이트 또는 미니 PEG의 사용에 의해 이를 조정할 수 있다. 링커 조작 및 지질 모이어티의 변이는 알부민과 독립적으로 생체분포를 감속시킴으로써 증가된 반감기에 기여할 수 있는 자기-응집에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Jonassen et al. (2012) Pharm Res. 29(8):2104-14]을 참조한다.
특정 아피머 폴리펩티드의 생성에 사용하기 위한 알부민 결합 모이어티의 다른 예로는 알부민-결합 (PKE2) 아드넥틴 (WO2011140086 "혈청 알부민 결합 분자", WO2015143199 "혈청 알부민-결합 피브로넥틴 유형 III 도메인" 및 WO2017053617 "빠른-오프 레이트 혈청 알부민 결합 피브로넥틴 유형 iii 도메인" 참조), 스트렙토코쿠스 (Streptococcus) 균주 G148의 단백질 G의 알부민 결합 도메인 3 (ABD3), 및 알부민 결합 도메인 항체 GSK2374697 ("AlbudAb") 또는 ATN-103 (오조랄리주맙 (Ozoralizumab))의 알부민 결합 나노바디 부분을 들 수 있다.
(iv) PEG화, XTEN, PAS 및 다른 중합체
폭넓게 다양한 거대분자 중합체 및 다른 분자는 생성된 아피머 폴리펩티드의 생물학적 특성을 조정하고/거나, 아피머 폴리펩티드에 새로운 생물학적 특성을 제공하기 위해 본 개시내용의 아피머 함유 폴리펩티드에 연결될 수 있다. 이들 거대분자 중합체는 천연 코딩된 아미노산을 통해, 비-천연 코딩된 아민노산, 또는 천연 또는 비-천연 아미노산의 임의의 기능적 치환기, 또는 천연 또는 비-천연 아미노산에 첨가된 임의의 치환기 또는 관능기를 통해 아피머 함유 폴리펩티드에 연결될 수 있다. 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 약 100,000 Da 이상을 포함하나 이에 제한되지는 않는 폭넓은 범위의 것일 수 있다. 중합체의 분자량은 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da, 1,000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da, 및 100 Da을 포함하나 이에 제한되지는 않는 약 100 Da 내지 약 100,000 Da일 수 있다. 일부 실시양태에서, 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 약 50,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 중합체의 분자량은 약 1,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 중합체의 분자량은 약 5,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 중합체의 분자량은 약 10,000 Da 내지 약 40,000 Da이다.
이 목적을 위해, 페길화, 폴리시알릴화, HES화, 글리코실화, 또는 유연성 및 친수성 아미노산 쇄 (500 내지 600 아미노산)에 융합된 재조합 PEG 유사체를 비롯한 다양한 방법이 개발되었다 (문헌 [Chapman, (2002) Adv Drug Deliv Rev. 54. 531-545; Schlapschy et al., (2007) Prot Eng Des Sel. 20, 273-283]; [Contermann (2011) Curr Op Biotechnol. 22, 868-876]; [Jevsevar et al., (2012) Methods Mol Biol. 901, 233-246] 참조).
중합체의 예로는 폴리알킬 에테르 및 그의 알콕시-캡핑된 유사체 (예를 들어, 폴리옥시에틸렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌/프로필렌 글리콜, 및 그의 메톡시 또는 에톡시-캡핑된 유사체, 특히 폴리옥시에틸렌 글리콜, 후자는 또한 폴리에틸렌 글리콜 또는 PEG로 공지됨); 디스크리트 PEG (dPEG); 폴리비닐피롤리돈; 폴리비닐알킬 에테르; 폴리옥사졸린, 폴리알킬 옥사졸린 및 폴리히드록시알킬 옥사졸린; 폴리아크릴아미드, 폴리알킬 아크릴아미드, 및 폴리히드록시알킬 아크릴아미드 (예를 들어, 폴리히드록시프로필메타크릴아미드 및 그의 유도체); 폴리히드록시알킬 아크릴레이트; 폴리시알산 및 그의 유사체; 친수성 펩티드 서열; 덱스트란 및 덱스트란 유도체, 예를 들어, 카르복시메틸덱스트란, 덱스트란 술페이트, 아미노덱스트란을 비롯한 다당류 및 그들의 유도체; 셀룰로스 및 그의 유도체, 예를 들어, 카르복시메틸 셀룰로스, 히드록시알킬 셀룰로스; 키틴 및 그의 유도체, 예를 들어, 키토산, 숙시닐 키토산, 카르복시메틸키틴, 카르복시메틸키토산; 히알루론산 및 그의 유도체; 전분; 알기네이트; 콘드로이틴 술페이트; 알부민; 풀루란 및 카르복시메틸 풀루란; 폴리아미노산 및 그의 유도체, 예를 들어, 폴리글루탐산, 폴리리신, 폴리아스파르트산, 폴리아스파르트아미드; 말레산 무수물 공중합체, 예컨대: 스티렌 말레산 무수물 공중합체, 디비닐에틸 에테르 말레산 무수물 공중합체; 폴리비닐 알콜; 그의 공중합체; 그의 삼량체; 그의 혼합물; 및 상기의 유도체를 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
선택된 중합체는 그것이 부착되는 아피머 폴리펩티드가 수성 환경, 예컨대 생리학적 환경에서 침전되지 않도록 수용성일 수 있다. 수용성 중합체는 선형, 포크형 또는 분지형을 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 구조적 형태일 수 있다. 전형적으로, 수용성 중합체는 폴리(알킬렌 글리콜), 예컨대 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG)이지만, 다른 수용성 중합체는 또한 채용될 수 있다. 예로서, PEG는 이 개시내용의 특정 실시양태를 기재하는 데 사용된다. 아피머 폴리펩티드의 치료적 용도를 위해, 중합체는 제약학적으로 허용될 수 있다.
용어 "PEG"는 PEG의 말단에 크기 또는 변형에 상관 없이 임의의 폴리에틸렌 글리콜 분자를 포괄하도록 폭넓게 사용되며, 하기 화학식에 의해 아피머 함유 폴리펩티드에 연결된 것으로서 나타내어질 수 있다:
XO-(CH2CH2O)n-CH2CH2-
또는
XO-(CH2CH2O)n-
여기서, n은 2 내지 10,000이고, X는 H 또는 C1-4 알킬, 보호기, 또는 말단 관능기를 포함하나 이에 제한되지는 않는 말단 변형이다. 일부의 경우, 본 개시내용의 폴리펩티드에 사용되는 PEG는 한 말단 상에 히드록시 또는 메톡시로 종결되며, 즉, X는 H 또는 CH3이다 ("메톡시 PEG").
상기 화학식에서 말단 "-"에 의해 나타내어지는 PEG의 다른 말단은 천연-발생 또는 비-천연 코딩된 아미노산을 통해 아피머 함유 폴리펩티드에 부착될 수 있음이 주목된다. 예를 들어, 부착은 폴리펩티드의 아민 기 (리신 또는 N-말단의 엡실론 아민을 포함하나 이에 제한되지는 않음)에의 아미드, 카르바메이트 또는 우레아 연결을 통해서일 수 있다. 대안적으로, 중합체는 티올 기 (시스테인의 티올 기를 포함하나 이에 제한되지는 않음)에 말레이미드 연결에 의해 연결된다 - 이는 아피머 폴리펩티드 서열에의 부착의 경우 그 자체로 아피머 서열에서의 잔기를 시스테인으로 변경시키는 것을 요구한다.
아피머-함유 폴리펩티드에 연결되는 수용성 중합체의 수 (즉, PEG화 또는 글리코실화의 정도)는 변경된 (증가되거나 감소된을 포함하나 이에 제한되지는 않음) 약리학적, 약동학적 또는 약역학적 특징, 예컨대 생성된 아피머 폴리펩티드에서의 생체내 반감기를 제공하도록 조정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 생성된 아피머 폴리펩티드의 반감기는 비변형된 폴리펩티드에 비해 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 퍼센트, 2배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배, 15배, 16배, 17배, 18배, 19배, 20배, 25배, 30배, 35배, 40배, 50배, 또는 적어도 약 100배 증가된다.
생성된 아피머 폴리펩티드의 PK 또는 다른 생물학적 특성을 변형시키는 데 유용한 중합체 시스템의 또다른 변화는 특히 아피머 폴리펩티드 서열을 갖는 융합 단백질의 일부로서, PEG의 기능적 유사체인 비구조화된, 친수성 아미노산 중합체의 사용이다. 폴리펩티드 플랫폼의 고유 생체분해성은 이를 PEG에 대한 잠재적으로 보다 양성 대안으로서 매력적으로 만든다. 또다른 이점은 PEG의 다분산성과 반대로 재조합 분자의 정확한 분자 구조이다. 융합 상대의 3차원 폴딩이 유지될 필요가 있는 HSA 및 Fc 펩티드 융합과는 달리, 비구조화된 상대에의 재조합 융합은 많은 경우 보다 높은 온도 또는 가혹한 조건, 예컨대 HPLC 정제에 처해질 수 있다.
이 부류의 폴리펩티드의 보다 진보된 것 중 하나는 XTEN (아무닉스 (Amunix))로 용어화되고, 864 아미노산 길이이며, 6개의 아미노산 (A, E, G, P, S 및 T)으로 구성된다. 문헌 [Schellenberger et al. "A recombinant polypeptide extends the in vivo half-life of peptides and proteins in a tuneable manner" 2009 Nat Biotechnol. 27(12):1186-90]을 참조한다. 중합체의 생체분해성 성질에 의해 가능하게 되어, 이는 전형적으로 사용되는 40 kDa PEG보다 훨씬 더 크며, 수반하여 보다 큰 반감기 연장을 부여한다. 아피머 함유 폴리펩티드에의 XTEN의 융합은 비변형된 폴리펩티드에 비해 최종 아피머 폴리펩티드의 60 내지 130배 반감기 연장을 초래할 것이다.
유사한 개념적 고려사항에 기초한 제2 중합체는 PAS (XL-프로테인 게엠베하 (XL-Protein GmbH))이다. 문헌 [Schlapschy et al. "PASYlation: a biological alternative to PEGylation for extending the plasma half-life of pharmaceutically active proteins" 2013 Protein Eng Des Sel. 26(8):489-501]. 무작위 코일 중합체는 단지 3개의 작은 비하전된 아미노산, 즉, 프롤린, 알라닌 및 세린의 훨씬 더 제한된 세트로 구성되었다. Fc, HAS 및 XTEN와 마찬가지로, PAS 변형은 아피머 폴리펩티드 서열로 유전적으로 코딩되어, 발현되는 경우 인라인 융합 단백질을 생성할 수 있다.
b. 다중-특이적 융합 단백질
특정 실시양태에서, 아피머 폴리펩티드는 예를 들어, 제1 표적에 결합하는 제1 아피머 폴리펩티드 및 제1 표적과는 상이한 제2 표적에 결합하는 적어도 1종의 추가의 결합 도메인을 포함하는 다중-특이적 및/또는 다가 폴리펩티드이다 - 이는 모두 상이한 분자 (이중특이적) 또는 동일한 부위에서 동일한 분자 유형 (다가) 또는 그러나 상이한 부위에서 동일한 분자 (이중파라토프 또는 다중파라토프)일 수 있다. 추가의 결합 도메인은 예시를 위해 제2 아피머 폴리펩티드 서열 (이는 제1 아피머 폴리펩티드 서열과 동일하거나 상이할 수 있음), 항체 또는 그의 단편 또는 다른 항원 결합 폴리펩티드, 수용체의 리간드 결합 부분 (예컨대 수용체 트랩 폴리펩티드), 수용체-결합 리간드 (예컨대 시토카인, 성장 인자 등), 조작된 T-세포 수용체, 효소 또는 그의 촉매 단편, 또는 일부를 부여하는 다른 폴리펩티드 서열 중으로부터 선택되는 폴리펩티드 서열일 수 있다.
특정 실시양태에서, 아피머 폴리펩티드는 항체로부터의 1개 이상의 항원 결합 부위를 포함한다. 생성된 아피머 폴리펩티드는 아피머 서열 및 항체 항원 결합 부위를 위한 서열 (예컨대 scFV의 경우) 둘 다를 포함하는 단일 쇄일 수 있거나, 예컨대 아피머의 서열이 또한 융합된 중쇄 및/또는 경쇄와 어셈블리된 항체에서 다량체성 단백질 복합체일 수 있다.
전장 이뮤노글로불린을 포함하는 다중-특이적 아피머 폴리펩티드에 관한 일부 실시양태에서, 항체에의 아피머 폴리펩티드 서열의 융합은 이뮤노글로불린의 Fc 영역의 Fc 기능을 보존할 것이다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 아피머 폴리펩티드는 그의 Fc 부분을 통해, Fc 수용체-양성 세포의 Fc 수용체에 결합할 수 있을 것이다. 일부 추가의 실시양태에서, 아피머 폴리펩티드는 Fc 수용체-양성 세포에 결합하고, 그에 의해 시토카인 및/또는 공동-자극성 항원의 발현을 개시하거나 증가시킴으로서 Fc 수용체-양성 세포를 활성화시킬 수 있다. 더욱이, 아피머 폴리펩티드는 공동-자극성 항원 및/또는 시토카인을 통해 T 세포의 생리학적 활성화에 요구되는 적어도 제2 활성화 신호를 T 세포로 전달할 수 있다.
일부 실시양태에서, 면역계로부터 이펙터 세포의 표면 상에 제시된 Fc 수용체를 발현하는 다른 세포, 예컨대 면역 세포, 간세포, 및 내피 세포에의 그의 Fc 부분의 결합으로부터 초래되어, 아피머 폴리펩티드는 항체-의존성 세포성 세포독성 (ADCC) 기능, 즉, 면역계의 이펙터 세포가 그의 막-표면 항원이 항체에 의해 결합된 표적 세포를 활성적으로 용해시키고, 따라서 ADCC를 통한 종양 세포 사멸을 촉발시키는 세포-매개 면역 방어의 메커니즘을 가질 수 있다. 일부 추가의 실시양태에서, 아피머 폴리펩티드는 ADCC 기능을 입증할 수 있다.
상기 기재된 바와 같이, Fc-매개 세포독성을 제외하고, Fc 부분은 그의 안정성 및 신체에서의 지속성에 중요한 아피머 폴리펩티드의 혈청 수준을 유지하는 것에 기여할 수 있다. 예를 들어, Fc 부분이 내피 세포 상의 및 포식세포 상의 Fc 수용체에 결합하는 경우, 아피머 폴리펩티드는 내재화되고 혈류로 다시 재생되어, 신체 내에서의 그의 반감기를 향상시킬 수 있다.
추가의 아피머 폴리펩티드의 예시적인 표적으로는 단지 예시를 위해 또다른 면역 관문 단백질, 및 면역 공동-자극성 수용체 (특히 추가의 아피머(들)가 공동-자극성 수용체를 효능작용할 수 있는 경우), 수용체, 시토카인, 성장 인자, 또는 종양-연관된 항원을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
c. 접합체
대상 아피머 폴리펩티드는 또한 아피머 폴리펩티드에 검출가능성 또는 추가의 약리학적 활성을 부여하도록 의도되는 1종 이상의 기능성 모이어티를 포함할 수 있다. 검출을 위한 기능성 모이어티는 생체내에서 세포 또는 조직 (예컨대 종양 세포)과의 아피머 폴리펩티드의 회합을 검출하는 데 채용될 수 있는 것들이다. 약리학적 활성을 갖는 기능적 모이어티는 아피머 폴리펩티드의 표적을 발현하는 조직으로 전달되고, 그렇게 하는 데 있어서 표적화된 조직 또는 세포에 약리학적 결과를 갖는 것으로 의미되는 그러한 작용제이다.
본 개시내용은 폭넓게 다양한 관능기, 치환기 또는 모이어티를 갖는 물질의 접합체를 포함하는 아피머 폴리펩티드를 제공하며, 그들 기능적 모이어티는 표지; 염료; 면역부착 분자; 방사성핵종; 세포독성 화합물; 약물; 친화성 표지; 광친화성 표지; 반응성 화합물; 수지; 제2 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체; 항체 또는 항체 단편; 금속 킬레이터; 보조인자; 지방산; 탄수화물; 폴리뉴클레오티드; DNA; RNA; 안티센스 폴리뉴클레오티드; 당류; 수용성 덴드리머; 시클로덱스트린; 억제성 리보핵산; 생체물질; 나노입자; 스핀 표지; 형광단, 금속-함유 모이어티; 방사성 모이어티; 신규 관능기; 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기; 광케이징된 모이어티; 화학 방사선 여기가능한 모이어티; 광이성질체화가능한 모이어티; 비오틴; 비오틴의 유도체; 비오틴 유사체; 중 원자를 혼입시키는 모이어티; 화학적으로 절단가능한 기; 광절단가능한 기; 신장된 측쇄; 탄소-연결된 당; 산화환원-활성제; 아미노 티오산; 독성 모이어티; 동위원소적으로 표지된 모이어티; 생물물리학적 프로브; 인광성 기; 화학발광 기; 전자 밀집 기; 자성 기; 개재 기; 발색단; 에너지 전달제; 생물학적 활성제; 검출가능한 표지; 소분자; 양자 점; 나노전달물질; 방사성뉴클레오티드; 방사성전달물질; 중성자-포획제; 또는 상기의 임의의 조합, 또는 임의의 다른 바람직한 화합물 또는 물질을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
(i) 표지 및 검출가능한 모이어티
모이어티가 검출가능한 표지인 경우, 이는 형광 표지, 방사성 표지, 효소적 표지 또는 통상의 기술자에게 공지된 임의의 다른 표지일 수 있다. 특정 실시양태에서, 기능적 모이어티는 의학적 영상화에 적합한 특정 아피머 폴리펩티드를 형성하는 접합체의 일부로서 포함될 수 있는 검출가능한 표지이다. "의학적 영상화"란 진단, 연구 또는 치료적 치료의 목적으로 인간 또는 동물 신체의 내부 영역을 가시화하는 데 사용되는 임의의 기법을 의미한다. 예를 들어, 아피머 폴리펩티드는 방사성-섬광조영술, 자기 공명 영상화 (MRI), 컴퓨터 단층촬영술 (CT 스캔), 핵 영상화, 금속 단층촬영술 (PET) 조영제를 포함하는 양전자 방출, 광학 영상화 (예컨대 근적외선 형광 (NIRF) 영상화를 비롯한 형광 영상화), 생체발광 영상화, 또는 이들의 조합에 의해 검출될 (및 정량화될) 수 있다. 기능적 모이어티는 임의로 X-선 영상화를 위한 조영제이다. 이러한 기법을 향상시키는 데 유용한 작용제는 그들 영상의 개선되거나 보다 용이한 해석을 제공하는, 신체 내의 특정 좌위, 기관 또는 질환 부위의 시각화를 가능하게 하고/거나, 영상화 기법에 의해 생성된 영상의 품질의 일부 개선을 초래하는 그러한 물질이다. 이러한 작용제는 본원에서 조영제로 지칭되며, 그의 사용은 영상의 그들 상이한 영역 사이의 "콘트라스트"를 증가시킴으로써 영상의 상이한 부분의 구분을 용이하게 한다. 따라서, 용어 "조영제"는 그럼에도 불구하고 이러한 작용제의 부재 하에서 생성될 수 있는 영상의 품질을 향상시키는 데 사용되는 작용제 (예를 들어, MRI의 경우와 같이), 뿐만 아니라 영상의 생성을 위한 전제조건인 작용제 (예를 들어, 핵 영상화에서와 같이)를 포괄한다.
특정 바람직한 실시양태에서, 검출가능한 표지는 금속을 킬레이팅하는 킬레이트 모이어티, 예를 들어, 방사성금속 또는 상자성 이온에 대한 킬레이터를 포함한다. 특정 바람직한 실시양태에서, 검출가능한 표지는 방사선요법 또는 영상화 절차에 유용한 방사성 핵종에 대한 킬레이터이다. 본 발명 내에서 유용한 방사성핵종으로는 감마-방출제, 양성자-방출제, 오제 전자-방출제, X-선 방출제 및 형광-방출제를 들 수 있으며, 베타- 또는 알파-방출제가 치료 용도에 바람직하다. 방사선 요법에서 독소로서 유용한 방사성핵종의 예로는 43K, 47Sc, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 64Cu, 67Ga, 67Cu, 68Ga, 71Ge, 75Br, 76Br, 77Br, 77As, 81Rb, 90Y, 97Ru, 99mTc, 100Pd, 101Rh, 103Pb, 105Rh, 109Pd, 111Ag, 111In, 113In, 119Sb 121Sn, 123I, 125I, 127Cs, 128Ba, 129Cs, 131I, 131Cs, 143Pr, 153Sm, 161Tb, 166Ho, 169Eu, 177Lu, 186Re, 188Re, 189Re, 191Os, 193Pt, 194Ir, 197Hg, 199Au, 203Pb, 211At, 212Pb, 212Bi 및 213Bi를 들 수 있다. 킬레이터가 금속을 배위할 조건은 예를 들어, 간소우 (Gansow) 등, 미국 특허 제4,831,175호, 제4,454,106호 및 제4,472,509호에 기재되어 있다. 킬레이터의 예로는 단지 예시를 위해 1,4,7-트리아자시클로노난-N,N',N"-트리아세트산 (NOTA), 1,4,7,10-테트라아지시클로도데칸-N,N',N",N'"-테트라아세트산 (DOTA), 1,4,8,11-테트라아자시클로테트라데칸-N,N',N",N'"-테트라아세트산 (TETA)을 들 수 있다.
아피머 폴리펩티드의 아미노산 잔기 내로 직접적으로 혼입될 수 있거나, 다르게는 킬레이터를 요구하지 않는 다른 검출가능한 동위원소로는 3H, 14C, 32P, 35S 및 36Cl을 들 수 있다.
진단 절차에 유용한 상자성 이온은 또한 투여될 수 있다. 상자성 이온의 예로는 크로뮴 (III), 망간 (II), 철 (III), 철 (II), 코발트 (II), 니켈 (II), 구리 (II), 네오디뮴 (III), 사마륨 (III), 이테르븀 (III), 가돌리늄 (III), 바나듐 (II), 테르븀 (III), 디스프로슘 (III), 홀뮴 (III), 에르븀 (III), 또는 이들 상자성 이온의 조합을 들 수 있다.
형광 표지의 예로는 유기 염료 (예를 들어 시아닌, 플루오레세인, 로다민, 알렉사 플루오르 (Alexa Fluor), 딜라이트 플루오르 (Dylight fluor), ATTO 염료, BODIPY 염료 등), 생물학적 형광단 (예를 들어 녹색 형광 단백질 (GFP), R-피코에리트린 등), 및 양자 점을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에 사용될 수 있는 비-제한적 형광 화합물로는 Cy5, Cy5.5 (또한 Cy5++로 공지됨), Cy2, 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC), 테트라메틸로다민 이소티오시아네이트 (TRITC), 피코에리트린, Cy7, 플루오레세인 (FAM), Cy3, Cy3.5 (또한 Cy3++로 공지됨), 텍사스 레드 (Texas Red), 라이트시클러-레드 (LightCycler-Red) 640, 라이트시클러 레드 705, 테트라메틸로다민 (TMR), 로다민, 로다민 유도체 (ROX), 헥사클로로플루오레세인 (HEX), 로다민 6G (R6G), 로다민 유도체 JA133, 알렉사 형광 염료 (예컨대 알렉사 플루오르 488, 알렉사 플루오르 546, 알렉사 플루오르 633, 알렉사 플루오르 555, 및 알렉사 플루오르 647), 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI), 아이오드화프로피듐, AMCA, 스펙트럼 그린 (Spectrum Green), 스펙트럼 오렌지 (Spectrum Orange), 스펙트럼 아쿠아 (Spectrum Aqua), 리사민 (Lissamine), 및 형광 전이 금속 착체, 예컨대 유로퓸을 들 수 있다. 사용될 수 있는 형광 화합물로는 또한 형광 단백질, 예컨대 GFP (녹색 형광 단백질), 향상된 GFP (EGFP), 청색 형광 단백질 및 유도체 (BFP, EBFP, EBFP2, 아주라이트 (Azurite), m칼라마1 (mKalama1)), 시안 형광 단백질 및 유도체 (CFP, ECFP, 세룰린 (Cerulean), CyPet) 및 황색 형광 단백질 및 유도체 (YFP, 시트린 (Citrine), 비너스 (Venus), YPet)를 들 수 있다. WO2008142571, WO2009056282, WO9922026.
효소적 표지의 예로는 서양고추냉이 페록시다제 (HRP), 알칼리성 포스파타제 (AP), 글루코스 옥시다제 및 β-갈락토시다제를 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
또다른 널리 공지된 표지는 비오틴이다. 비오틴 표지는 전형적으로 비오티닐 기, 스페이서 아암 및 단백질 상의 표적 관능기에의 부착을 담당하는 반응성 기로 구성된다. 비오틴은 표지된 단백질을 아비딘 모이어티를 포함하는 다른 모이어티에 부착시키는 데 유용할 수 있다.
(ii) 아피머-약물 접합체
특정 실시양태에서, 아피머 폴리펩티드는 예를 들어, 아피머-약물 접합체를 형성하는 1종 이상의 치료제를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "치료제"는 인간 또는 또다른 동물에서 질환의 치유, 경감, 치료, 또는 예방에 사용될 수 있는 물질을 지칭한다. 이러한 치료제는 미국 약전 (official United States Pharmacopeia), 미국 동종요법 약전 (official Homeopathic Pharmacopeia of the United States), 국가처방 의약품집 (official National Formulary), 또는 이들의 임의의 보충판에서 인식된 물질을 포함하며, 소분자, 뉴클레오티드, 올리고펩티드, 폴리펩티드 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 아피머-함유 폴리펩티드에 부착될 수 있는 치료제로는 예시와 같이, 세포독성제, 항-대사물, 알킬화제, 항생제, 성장 인자, 시토카인, 항-혈관신생제, 항-유사분열제, 독소, 세포자멸사제 등, 예컨대 DNA 알킬화제, 토포이소머라제 억제제, 세포질 세망 스트레스 유도제, 백금 화합물, 항대사물, 빈카알칼로이드, 탁산, 에포틸론, 효소 억제제, 수용체 길항제, 치료 항체, 티로신 키나제 억제제, 방사선민감화제, 및 화학치료 조합 요법을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
DNA 알킬화제의 비-제한적 예는 질소 머스타드, 예컨대 메클로레타민 (Mechlorethamine), 시클로포스파미드 (Cyclophosphamide) (이포스파미드 (Ifosfamide), 트로포스파미드 (Trofosfamide)), 클로람부실 (Chlorambucil) (멜팔란 (Melphalan), 프레드니무스틴 (Prednimustine)), 벤다무스틴 (Bendamustine), 우라무스틴 (Uramustine) 및 에스트라무스틴 (Estramustine); 니트로소우레아, 예컨대 카르무스틴 (Carmustine) (BCNU), 로무스틴 (Lomustine) (세무스틴 (Semustine)), 포테무스틴 (Fotemustine), 니무스틴 (Nimustine), 라니무스틴 (Ranimustine) 및 스트렙토조신 (Streptozocin); 알킬 술포네이트, 예컨대 부술판 (Busulfan) (만노술판 (Mannosulfan), 트레오술판 (Treosulfan)); 아지리딘 (Aziridine), 예컨대 카르보쿠온 (Carboquone), 티오테파 (ThioTEPA), 트리아지쿠온 (Triaziquone), 트리에틸렌멜라민 (Triethylenemelamine); 히드라진 (Hydrazine) (프로카르바진 (Procarbazine)); 트리아젠 (Triazene), 예컨대 다카르바진 (Dacarbazine) 및 테모졸로미드 (Temozolomide); 알트레타민 (Altretamine) 및 미토브로니톨 (Mitobronitol)이다.
토포이소머라제 I 억제제의 비-제한적 예로는 문헌 [Pommier Y. (2006) Nat. Rev. Cancer 6(10):789-802] 및 미국 특허 공개 제200510250854호에 기재된 바와 같은 캄포테신 (Campothecin) 유도체, 예컨대 CPT-11 (이리노테칸), SN-38, APC, NPC, 캄포테신, 토포테칸, 엑사테칸 메실레이트, 9-니트로캄프포테신, 9-아미노캄프토테신, 루르토테칸, 루비테칸, 실라테칸, 기마테칸, 디플로모테칸, 엑스타테칸, BN-80927, DX-8951f, 및 MAG-CPT; 문헌 [Li et al. (2000) Biochemistry 39(24):7107-7116] 및 [Gatto et al. (1996) Cancer Res. 15(12):2795-2800]에 기재된 바와 같은 프로토베르베린 알칼로이드 (Protoberberine alkaloid) 및 그의 유도체, 예컨대 베르베르루빈 및 코랄린; 문헌 [Makhey et al. (2003) Bioorg. Med. Chem. 11 (8): 1809-1820]에 기재된 바와 같은 페난트롤린 (Phenanthroline) 유도체, 예컨대 벤조[i]페난트리딘, 니티딘 (Nitidine), 및 파가로닌; 문헌 [Xu (1998) Biochemistry 37(10):3558-3566]에 기재된 바와 같은 터벤즈이미다졸 (Terbenzimidazole) 및 그의 유도체; 및 문헌 [Foglesong et al. (1992) Cancer Chemother. Pharmacol. 30(2):123-]25], [Crow et al. (1994) J. Med. Chem. 37(19):31913194], 및 [Crespi et al. (1986) Biochem. Biophys. Res. Commun. 136(2):521-8]에 기재된 바와 같은 안트라시클린 (Anthracycline) 유도체, 예컨대 독소루비신 (Doxorubicin), 다우노루비신 (Daunorubicin), 및 미토크산트론 (Mitoxantrone)을 들 수 있다. 토포이소머라제 II 억제제로는 에토포시드 (Etoposide) 및 테니포시드 (Teniposide)를 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 이중 토포이소머라제 I 및 II 억제제로는 문헌 [Denny and Baguley (2003) Curr. Top. Med. Chem. 3(3):339-353]에 기재된 바와 같은 사인토핀 (Saintopin) 및 다른 나프테센디온 (Naphthecenedione), DACA 및 다른 아크리딘-4-카르복스아미드, 인토플리신 (Intoplicine) 및 다른 벤조피리도인돌 (Benzopyridoindole), TAS-103 및 다른 7H-인데노[2,1-c]퀴놀린-7-온, 피라졸로아크리딘 (Pyrazoloacridine), XR 11576 및 다른 벤조페나진 (Benzophenazine), XR 5944 및 다른 이량체성 화합물, 7-옥소-7H-디벤즈[f,ij]이소퀴놀린 및 7-옥소-7H-벤조[e]페리미딘, 및 안트라세닐-아미노산 접합체를 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 작용제, 예컨대 안트라시클린 (아클라루비신 (Aclarubicin), 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신 (Epirubicin), 이다루비신 (Idarubicin), 암루비신 (Amrubicin), 피라루비신 (Pirarubicin), 발루비신 (Valrubicin), 조루비신 (Zorubicin)) 및 안트라센디온 (Antracenedione) (미토크산트론 및 피크산트론 (Pixantrone)) (그러나, 이에 제한되지는 않음)은 토포이소머라제 II를 억제하며, DNA 개재 활성을 갖는다.
세포질 세망 스트레스 유도제의 예로는 디메틸-셀레콕시브 (DMC), 넬피나비르, 셀레콕시브, 및 붕소 방사선민감화제 (즉, 벨케이드 (보르테조밉 (Bortezomib)))를 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
백금-기재 화합물의 비-제한적 예로는 카르보플라틴 (Carboplatin), 시스플라틴 (Cisplatin), 네다플라틴 (Nedaplatin), 옥살리플라틴 (Oxaliplatin), 트리플라틴 테트라니트레이트 (Triplatin tetranitrate), 사트라플라틴 (Satraplatin), 아로플라틴 (Aroplatin), 로바플라틴 (Lobaplatin), 및 JM-216을 들 수 있다. (문헌 [McKeage et al. (1997) J. Clin. Oncol. 201:1232-1237] 및 일반적으로, 문헌 [CHEMOTHERAPY FOR GYNECOLOGICAL NEOPLASM, CURRENT THERAPY AND NOVEL APPROACHES, in the Series Basic and Clinical Oncology, Angioli et al. Eds., 2004] 참조).
항대사물제의 비-제한적 예로는 엽산 기재, 즉 디히드로폴레이트 리덕타제 억제제, 예컨대 아미노프테린 (Aminopterin), 메토트렉세이트 (Methotrexate) 및 페메트렉시드 (Pemetrexed); 티미딜레이트 신타제 억제제, 예컨대 랄티트렉시드 (Raltitrexed), 페메트렉시드; 퓨린 기재, 즉 아데노신 데아미나제 억제제, 예컨대 펜토스타틴 (Pentostatin), 티오퓨린, 예컨대 티오구아닌 (Thioguanine) 및 머캅토퓨린 (Mercaptopurine), 할로겐화/리보뉴클레오티드 리덕타제 억제제, 예컨대 클라드리빈 (Cladribine), 클로파라빈 (Clofarabine), 플루다라빈 (Fludarabine), 또는 구아닌/구아노신: 티오퓨린, 예컨대 티오구아닌; 또는 피리미딘 기재, 즉 시토신/시티딘: 히포메틸화제, 예컨대 아자시티딘 (Azacitidine) 및 데시타빈 (Decitabine), DNA 폴리머라제 억제제, 예컨대 시타라빈 (Cytarabine), 리보뉴클레오티드 리덕타제 억제제, 예컨대 겜시타빈 (Gemcitabine), 또는 티민/티미딘: 티미딜레이트 신타제 억제제, 예컨대 플루오로우라실 (5-FU)을 들 수 있다. 5-FU에 대한 등가물은 예를 들어 문헌 [Papamicheal (1999) The Oncologist 4:478-487]에 기재된 바와 같이 그의 프로드러그, 유사체 및 유도체, 예컨대 5'-데옥시-5-플루오로우리딘 (독시플루오로이딘), 1-테트라히드로푸라닐-5-플루오로우라실 (프토라푸르), 카페시타빈 (Capecitabine) (젤로다 (Xeloda)), S-I (MBMS-247616, 테가푸르 및 2종의 조정제, 즉, 5-클로로-2,4-디히드록시피리딘 및 칼륨 옥소네이트로 이루어짐), 랄리티트렉시드 (토무덱스), 놀라트렉시드 (티미탁 (Thymitaq), AG337), LY231514 및 ZD9331을 포함한다.
빈카알칼로이드의 예로는 빈블라스틴 (Vinblastine), 빈크리스틴 (Vincristine), 빈플루닌 (Vinflunine), 빈데신 (Vindesine) 및 비노렐빈 (Vinorelbine)을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
탁산의 예로는 도세탁셀, 라로탁셀 (Larotaxel), 오르타탁셀 (Ortataxel), 파클리탁셀 (Paclitaxel) 및 테세탁셀 (Tesetaxel)을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 에포틸론의 예는 이아베필론이다.
효소 억제제의 예로는 파르네실트랜스퍼라제 억제제 (티피파밉 (Tipifamib)); CDK 억제제 (알보시딥 (Alvocidib), 셀리시클립 (Seliciclib)); 프로테아솜 억제제 (보르테조밉); 포스포디에스테라제 억제제 (아나그렐리드 (Anagrelide); 롤리프람); IMP 데히드로게나제 억제제 (티아조푸린 (Tiazofurine)); 및 리폭시게나제 억제제 (마소프로콜 (Masoprocol))를 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 수용체 길항제의 예로는 ERA (아트라센탄 (Atrasentan)); 레티노이드 X 수용체 (벡사로텐 (Bexarotene)); 및 성 스테로이드 (테스토락톤 (Testolactone))를 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
치료 항체의 예로는 항-HER1/EGFR (세툭시맙 (Cetuximab), 파니투무맙 (Panitumumab)); 항-HER2/neu (erbB2) 수용체 (트라스투주맙 (Trastuzumab)); 항-EpCAM (카투막소맙 (Catumaxomab), 에드레콜로맙 (Edrecolomab)) 항-VEGF-A (베바시주맙 (Bevacizumab)); 항-CD20 (리툭시맙 (Rituximab), 토시투모맙 (Tositumomab), 이브리투모맙 (Ibritumomab)); 항-CD52 (알렘투주맙 (Alemtuzumab)); 및 항-CD33 (겜투주맙 (Gemtuzumab))을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 미국 특허 제5,776,427호 및 제7,601,355호.
티로신 키나제 억제제의 예로는 ErbB: HER1/EGFR (에를로티닙 (Erlotinib), 게피티닙 (Gefitinib), 라파티닙 (Lapatinib), 반데타닙 (Vandetanib), 수니티닙 (Sunitinib), 네라티닙 (Neratinib)); HER2/neu (라파티닙, 네라티닙); RTK 부류 III: C-키트 (악시티닙 (Axitinib), 수니티닙, 소라페닙 (Sorafenib)), FLT3 (레스타우르티닙 (Lestaurtinib)), PDGFR (악시티닙, 수니티닙, 소라페닙); 및 VEGFR (반데타닙, 세막사닙 (Semaxanib), 세디라닙 (Cediranib), 악시티닙, 소라페닙); bcr-abl (이마티닙 (Imatinib), 닐로티닙 (Nilotinib), 다사티닙 (Dasatinib)); Src (보수티닙 (Bosutinib)) 및 야누스 (Janus) 키나제 2 (레스타우르티닙)에 대한 억제제를 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 아피머-함유 폴리펩티드에 부착될 수 있는 화학치료제로는 또한 암사크린, 트라벡테딘 (Trabectedin), 레티노이드 (알리트레티노인 (Alitretinoin), 트레티노인 (Tretinoin)), 아르세닉 트리옥시드 (Arsenic trioxide), 아스파라긴 고갈제 아스파라기나제 (Asparaginase)/페가스파르가제 (Pegaspargase)), 셀레콕시브, 데메콜신 (Demecolcine), 엘레스클로몰 (Elesclomol), 엘사미트루신 (Elsamitrucin), 에토글루시드 (Etoglucid), 로니다민 (Lonidamine), 루칸톤 (Lucanthone), 미토구아존 (Mitoguazone), 미토탄 (Mitotane), 오블리메르센 (Oblimersen), 템시롤리무스 (Temsirolimus), 및 보리노스타트 (Vorinostat)를 들 수 있다.
본 발명의 아피머-함유 폴리펩티드와 연결되거나, 라이게이션되거나, 회합될 수 있는 특이적 치료제의 예는 플로목세프; 포르티미신(들); 겐타미신(들); 글루코술폰 솔라술폰; 그라미시딘 S; 그라미시딘(들); 그레파플록사신; 구아메시클린; 헤타실린; 이세파미신; 조사마이신; 카나마이신(들); 플로목세프; 포르티미신(들); 겐타미신(들); 글루코술폰 솔라술폰; 그라미시딘 S; 그라미시딘(들); 그레파플록사신; 구아메시클린; 헤타실린; 이세파미신; 조사마이신; 카나마이신(들); 바시트라신; 밤베르마이신(들); 비아페넴; 브로디모프림; 부티로신; 카프레오마이신; 카르베니실린; 카르보마이신; 카루모남; 세파드록실; 세파만돌; 세파트리진; 세프부페라존; 세프클리딘; 세프디니르; 세프디토렌; 세페핌; 세페타메트; 세픽심; 세피네녹심; 세피니녹스; 클라드리빈; 아팔실린; 아피시클린; 아프라마이신; 아르베카신; 아스폭시실린; 아지담페니콜; 아즈트레오남; 세포디짐; 세포니시드; 세포페라존; 세포라미드; 세포탁심; 세포테탄; 세포티암; 세포조프란; 세프피미졸; 세프피라미드; 세프피롬; 세프프로질; 세프록사딘; 세프테람; 세프티부텐; 세푸조남; 세팔렉신; 세팔로글리신; 세팔로스포린 C; 세프라딘; 클로람페니콜; 클로르테트라시클린; 클리나플록사신; 클린다마이신; 클로모시클린; 콜리스틴; 시클라실린; 답손; 데메클로시클린; 디아티모술폰; 디베카신; 디히드로스트렙토마이신; 6-머캅토퓨린; 티오구아닌; 카페시타빈; 도세탁셀; 에토포시드; 겜시타빈; 토포테칸; 비노렐빈; 빈크리스틴; 빈블라스틴; 테니포시드; 멜팔란; 메토트렉세이트; 2-p-술파닐리아닐리노에탄올; 4,4'-술피닐디아닐린; 4-술파닐아미도살리실산; 부토르파놀; 날부핀; 스트렙토조신; 독소루비신; 다우노루비신; 플리카마이신; 이다루비신; 미토마이신 C; 펜토스타틴; 미토크산트론; 시타라빈; 플루다라빈 포스페이트; 부토르파놀; 날부핀; 스트렙토조신; 독소루비신; 다우노루비신; 플리카마이신; 이다루비신; 미토마이신 C; 펜토스타틴; 미토크산트론; 시타라빈; 플루다라빈 포스페이트; 아세디아술폰; 아세토술폰; 아미카신; 암포테리신 B; 암피실린; 아토르바스타틴; 에날라프릴; 라니티딘; 시프로플록사신; 프라바스타틴; 클라리트로마이신; 시클로스포린; 파모티딘; 류프롤리드; 아시클로비르; 파클리탁셀; 아지트로마이신; 라미부딘; 부데소니드; 알부테롤; 인디나비르; 메트포르민; 알렌드로네이트; 니자티딘; 지도부딘; 카르보플라틴; 메토프롤롤; 아목시실린; 디클로페낙; 리시노프릴; 세프트리악손; 카프토프릴; 살메테롤; 크시나포에이트; 이피페넴; 실라스타틴; 베나제프릴; 세파클로르; 세프타지딤; 모르핀; 도파민; 비알라미콜; 플루바스타틴; 페나미딘; 포도필린산 2-에틸히드라진; 아크리플라빈; 클롤로아조딘; 아르스페나민; 아미카르빌리드; 아미노퀴누리드; 퀴나프릴; 옥시모르폰; 부프레노르핀; 플록수리딘; 디리트로마이신; 독시시클린; 에녹사신; 엔비오마이신; 에피실린; 에리트로마이신; 류코마이신(들); 린코마이신; 로메플록사신; 루센소마이신; 리메시클린; 메클로시클린; 메로페넴; 메타시클린; 미크로노미신; 미데카마이신(들); 미노시클린; 목살락탐; 무피로신; 나디플록사신; 나타마이신; 네오마이신; 네틸미신; 노르플록사신; 올레안도마이신; 옥시테트라시클린; p-술파닐릴벤질아민; 파니페넴; 파로모마이신; 파주플록사신; 페니실린 N; 피파시클린; 피페미드산; 폴리믹신; 프리마이신; 퀴나실린; 리보스타마이신; 리파미드; 리팜핀; 리파마이신 SV; 리파펜틴; 리팍시민; 리스토세틴; 리티페넴; 로키타마이신; 롤리테트라시클린; 로사라마이신; 록시트로마이신; 살라조술파디미딘; 산시클린; 시소미신; 스파르플록사신; 스펙티노마이신; 스피라마이신; 스트렙토마이신; 숙시술폰; 술파크리소이딘; 술팔록스산; 술프아미도크리소이딘; 술파닐산; 술폭손; 테이코플라닌; 테마플록사신; 테모실린; 테트록소프림; 티암페니콜; 티아졸술폰; 티오스트렙톤; 티카르실린; 티게모남; 토브라마이신; 토수플록사신; 트리메토프림; 트로스펙토마이신; 트로바플록사신; 투베락티노마이신; 반코마이신; 아자세린; 칸디시딘(들); 클로르페네신; 더모스타틴(들); 필리핀; 푼기크로민; 메파르트리신; 니스타틴; 올리고마이신(들); 페리마이신 A; 투베르시딘; 6-아자우리딘; 6-디아조-5-옥소-L-노르류신; 아클라시노마이신(들); 안시타빈; 안트라마이신; 아자시타딘; 아자세린; 블레오마이신(들); 에틸 비스코우마세테이트; 에틸리덴 디코우마롤; 일로프로스트; 라미피반; 타프로스텐; 티오클로마롤; 티로피반; 아미프릴로스; 부실라민; 구스페리무스; 겐티스산; 글루카메타신; 글리콜 살리실레이트; 메클로페남산; 메페남산; 메살라민; 니플룸산; 올살라진; 옥사세프롤; S-에노실메티오닌; 살리실산; 살살레이트; 술파살라진; 톨페남산; 카루비신; 카르지노필린 A; 클로로조토신; 크로모마이신(들); 데노프테린; 독시플루리딘; 에다트렉세이트; 에플로르니틴; 엘리프티늄; 에노시타빈; 에피루비신; 만노무스틴; 메노가릴; 미토브로니톨; 미토락톨; 모피다몰; 미코페놀산; 노갈라마이신; 올리보마이신(들); 페플로마이신; 피라루비신; 피리트렉심; 프레드니무스틴; 프로카르바진; 프테로프테린; 푸로마이신; 라니무스틴; 스트렙토니그린; 티아미프린; 미코페놀산; 프로코다졸; 로무르티드; 시롤리무스 (라파마이신); 타크롤리무스; 부테타민; 페날코민; 히드록시테트라카인; 나에파인; 오르토카인; 피리도카인; 살리실 알콜; 3-아미노-4-히드록시부티르산; 아세클로페낙; 알미노프로펜; 암페낙; 브롬페낙; 브로모살리게닌; 부마디존; 카르프로펜; 디클로페낙; 디플루니살; 디타졸; 엔페남산; 에토돌락; 에토페나메이트; 펜도살; 페프라디놀; 플루페남산; 토무덱스 (Tomudex) (N-[[5-[[(1,4-디히드로-2-메틸-4-옥소-6-퀴나졸리닐)메틸]메틸아미노]-2-티에닐]카르보닐]-L-글루탐산), 트리메트렉세이트, 투베르시딘, 우베니멕스, 빈데신, 조루비신; 아르가트로반; 코우메타롤 또는 디코우마롤이다.
특정 실시양태에서, 아피머 폴리펩티드는 접합된 세포독성 인자, 예컨대 디프테리아 독소, 슈도모나스 아에루기노사 (Pseudomonas aeruginosa) 외독소 A 쇄, 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모덱신 A 쇄, 알파-사르신, 알류리테스 포르디이 (Aleurites fordii) 단백질 및 화합물 (예를 들어, 지방산), 디안틴 단백질, 피토이아카 아메리카나 (Phytoiacca americana) 단백질 PAPI, PAPII, 및 PAP-S, 모모르디카 카란티아 (momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사포나리아 오피시날리스 (saponaria officinalis) 억제제, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 및 에노마이신을 포함한다.
문헌 [Hunter, et al., (1962) Nature 144:945]; [David, et al., (1974) Biochemistry 13:1014]; [Pain, et al., (1981) J. Immunol. Meth. 40:219]; 및 [Nygren, J., (1982) Histochem. and Cytochem. 30:407]에 의해 기재된 그러한 방법을 비롯한, 항체 및 다른 단백질에 접합시키기 위한 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법은 본 발명의 접합체를 생성하는 데 채용될 수 있다. 펩티드, 폴리펩티드 및 유기 및 무기 모이어티를 항체 및 다른 단백질에 접합시키는 방법은 통상적이고, 관련 기술분야에 매우 널리 공지되어 있으며, 대상 아피머 폴리펩티드의 그러한 버전을 생성하기 위해 용이하게 조정된다.
접합된 모이어티가 펩티드 또는 폴리펩티드인 경우, 그 모이어티는 아피머-함유 폴리펩티드에 화학적으로 가교될 수 있거나, 아피머-함유 폴리펩티드를 갖는 융합 단백질의 일부로서 포함될 수 있다. 그리고, 예시적인 예는 디프테리아 독소-아피머 융합 단백질일 것이다. 비-펩티드 실체의 경우, 아피머-함유 폴리펩티드에의 첨가는 일반적으로 아피머-함유 폴리펩티드에의 화학적 접합에 의해서일 것이다 - 예컨대 폴리펩티드의 C-말단에서의 아미노산 측쇄 또는 카르복실 기 또는 N-말단에서의 아미노기 상의 관능기를 통해. 특정 실시양태에서, 융합 단백질로서든 화학적으로 가교된 모이어티로서든, 접합된 모이어티는 효소에 의해 절단될 수 있는 1개 이상의 부위를 포함할 것이거나, 다르게는 접합된 모이어티가 아피머-함유 폴리펩티드로부터 방출되는 것을 허용하는 환경적 조건 (예컨대 pH)에, 예컨대 종양 또는 다른 질환에 걸린 조직 (또는 접합된 모이어티가 건강한 조직을 보호하도록 기능하는 경우 보호되는 조직)에서 민감성이다.
III. 발현 방법 및 시스템
본원에 기재된 재조합 아피머-함유 단백질은 관련 기술분야에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 제조될 수 있다. 이러한 방법은 직접 단백질 합성 방법부터 폴리펩티드 서열을 코딩하는 DNA 서열을 구축하고, 그들 서열을 적합한 숙주에서 발현시키는 것까지의 범위이다. 추가의 변형, 예컨대 화학적 변형 또는 접합을 포함하는 그들 재조합 아피머 폴리펩티드에 대해, 재조합 아피머 폴리펩티드는 숙주 세포로부터의 단리 또는 화학적 합성 후에 화학적으로 또는 효소적으로 추가로 조작될 수 있다.
본 발명은 (i) 아피머 폴리펩티드의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 도입하고 (예를 들어, 여기서 폴리뉴클레오티드는 벡터에 있고/거나, 프로모터에 작동적으로 연결됨); (ii) 숙주 세포 (예를 들어, 진핵생물 또는 원핵생물)를 폴리뉴클레오티드의 발현에 바람직한 조건 하에서 배양하고, (iii) 임의로, 숙주 세포 및/또는 숙주 세포가 성장된 배지로부터 아피머 폴리펩티드를 단리하는 것을 포함하는, 본 발명의 재조합 아피머 폴리펩티드를 재조합적으로 발현시키기 위한 재조합 방법 및 핵산을 포함한다. 예를 들어, WO 04/041862, WO 2006/122786, WO 2008/020079, WO 2008/142164 또는 WO 2009/068627을 참조한다.
일부 실시양태에서, 관심 재조합 아피머 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열은 올리고뉴클레오티드 합성기를 사용한 화학적 합성에 의해 구축될 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 바람직한 폴리펩티드의 아미노산 서열에 기초하여 및 관심 재조합 폴리펩티드가 제조될 숙주 세포에 바람직한 그러한 코돈을 선택하여 설계될 수 있다. 표준 방법은 관심있는 단리된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 합성하는 데 적용될 수 있다. 예를 들어, 완전 아미노산 서열은 역-번역된 유전자를 구축하는 데 사용될 수 있다. 또한, 특정 단리된 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 DNA 올리고머를 합성할 수 있다. 예를 들어, 바람직한 폴리펩티드의 부분을 코딩하는 몇몇 작은 올리고뉴클레오티드를 합성한 후, 라이게이션할 수 있다. 개별적 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 상보성 어셈블리에 대한 5' 또는 3' 오버행을 함유한다.
본 발명의 재조합 아피머 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열이 얻어지면, 재조합 아피머 폴리펩티드의 제조를 위한 벡터는 관련 기술분야에 널리 공지된 기법을 사용한 재조합 DNA 기술에 의해 제조될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 방법을 사용하여 재조합 아피머 폴리펩티드 코딩 서열 및 적절한 전사 및 번역 제어 신호를 함유하는 발현 벡터를 구축할 수 있다. 이들 방법으로는 예를 들어, 시험관내 재조합 DNA 기법, 합성 기법, 및 생체내 유전자 재조합을 들 수 있다. (예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., 1990, MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.] 및 [Ausubel et al. eds., 1998, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, NY]에 기재된 기법 참조).
재조합 아피머 폴리펩티드의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터는 통상적인 기법 (예를 들어, 전기천공, 리포솜 형질감염, 및 인산칼슘 침전)에 의해 숙주 세포로 전달되고, 형질감염된 세포는 그 후 통상적인 기법에 의해 배양되어 본 발명의 재조합 아피머 폴리펩티드를 생성할 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 재조합 아피머 폴리펩티드의 발현은 구성적, 유도성 또는 조직 특이적 프로모터에 의해 조절된다.
발현 벡터는 복제 원점을 포함할 수 있으며, 예컨대 발현에 사용되는 숙주 세포의 유형에 기초하여 선택될 수 있다. 예로서, 플라스미드 pBR322 (제품 번호 303-3s, 뉴 잉글랜드 바이오랩스, 미국 매사추세츠주 베버리)로부터의 복제 원점은 대부분의 그람-음성 박테리아에 유용한 반면, SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, 소수포 구내염 바이러스 (VSV) 또는 유두종바이러스 (예컨대 HPV 또는 BPV)로부터의 다양한 원점은 포유동물 세포에서 클로닝 벡터에 유용하다. 일반적으로, 복제 원점 성분은 포유동물 발현 벡터에는 필요하지 않다 (예를 들어, SV40 원점은 그것이 초기 프로모터를 함유하기 때문에 종종 사용됨).
벡터는 1개 이상의 선택가능한 마커 유전자, 예를 들어, 선택적 배양 배지에서 성장된 숙주 세포의 생존 및 성장에 필요한 단백질을 코딩하는 유전적 요소를 포함할 수 있다. 전형적인 선택 마커 유전자는 (a) 원핵생물 숙주 세포에 대해 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어, 암피실린, 테트라시클린, 또는 카나마이신에 대한 저항성을 부여하거나, (b) 세포의 영양요구성 결핍을 보완하거나; (c) 복합 배지로부터 이용가능하지 않은 중요한 영양분을 공급하는 단백질을 코딩한다. 바람직한 선택가능한 마커는 카나마이신 저항성 유전자, 암피실린 저항성 유전자, 및 테트라시클린 저항성 유전자이다. 네오마이신 저항성 유전자는 또한 원핵생물 및 진핵생물 숙주 세포에서 선택을 위해 사용될 수 있다. 다른 선택 유전자는 발현될 유전자를 증폭시키는 데 사용될 수 있다. 증폭은 성장에 중요한 단백질의 생산에 대한 보다 큰 요구가 있는 유전자가 재조합 세포의 연속적 생성의 염색체 내에서 탠덤으로 반복되는 프로세스이다. 포유동물 세포를 위한 선택가능한 마커의 예로는 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) 및 티미딘 키나제를 들 수 있다. 포유동물 세포 형질전환체는 단지 형질전환체가 벡터에 존재하는 마커에 의해 생존하도록 고유하게 적응되는 선택 압력 하에 놓인다. 선택 압력은 배지 중의 선택제의 농도가 연속적으로 변화하고, 그에 의해 선택 유전자 및 재조합 아피머 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 둘 다의 증폭을 초래하는 조건 하에서 형질전환된 세포를 배양함으로써 부과된다. 그 결과, 증가된 양의 재조합 아피머 폴리펩티드가 증폭된 DNA로부터 합성된다.
벡터는 또한 1개 이상의 리보솜 결합 부위를 포함할 수 있으며, 이는 재조합 아피머 폴리펩티드에 대한 코딩 서열을 포함하는 mRNA로 전사될 것이다. 예를 들어, 이러한 부위는 샤인-달가노 (Shine-Dalgarno) 서열 (원핵생물) 또는 코작 (Kozak) 서열 (진핵생물)을 특징으로 한다. 요소는 전형적으로 프로모터에 대해 3' 및 발현되는 폴리펩티드의 코딩 서열에 대해 5'에 위치한다. 샤인-달가노 서열은 다양하지만, 전형적으로 폴리퓨린 (높은 A-G 함량을 가짐)이다. 많은 샤인-달가노 서열이 확인되었으며, 이들 각각은 상기 제시된 방법을 사용하여 용이하게 합성되고, 원핵생물 벡터에서 사용될 수 있다.
발현 벡터는 전형적으로 숙주 유기체에 의해 인식되고, 재조합 아피머 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자에 작동적으로 연결된 프로모터를 함유할 것이다. 천연 또는 이종 프로모터는 발현에 사용되는 숙주 세포 및 바람직한 수율에 따라 사용될 수 있다.
원핵생물 숙주와 함께 사용하기 위한 프로모터로는 베타-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템; 알칼리성 포스파타제, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템; 및 혼성체 프로모터, 예컨대 tac 프로모터를 들 수 있다. 다른 공지된 박테리아 프로모터는 또한 적합하다. 그들의 서열은 공개되었으며, 이들은 바람직한 경우 링커 또는 어댑터를 사용하여 바람직한 핵산 서열(들)에 라이게이션되어 제한 부위를 공급할 수 있다.
효모 숙주와 함께 사용하기 위한 프로모터는 또한 관련 기술분야에 공지되어 있다. 효모 인핸서는 유리하게는 효모 프로모터와 함께 사용된다. 포유동물 숙주 세포와 함께 사용하기 위한 적합한 프로모터는 널리 공지되어 있으며, 바이러스, 예컨대 폴리오마 바이러스, 조류폭스 바이러스, 아데노바이러스 (예컨대 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 시토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스, 및 가장 바람직하게는 원숭이 바이러스 (Simian Virus) 40 (SV40)의 게놈으로부터 얻어진 것들을 들 수 있다. 다른 적합한 포유동물 프로모터로는 이종 포유동물 프로모터, 예를 들어, 열-충격 프로모터 및 액틴 프로모터를 들 수 있다.
본 발명의 선택적 결합제를 발현시키는 데 사용될 수 있는 추가의 프로모터로는 SV40 초기 프로모터 영역 (Bernoist and Chambon, Nature, 290:304-310, 1981); CMV 프로모터; 라우스 육종 바이러스의 3' 긴 말단 반복부에 함유된 프로모터 (Yamamoto et al. (1980), Cell 22: 787-97); 포진 티미딘 키나제 프로모터 (Wagner et al. (1981), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78: 1444-5); 메탈로티오닌 유전자의 조절 서열 (Brinster et al., Nature, 296; 39-42, 1982); 원핵생물 발현 벡터, 예컨대 베타-락타마제 프로모터 (Villa-Kamaroff, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 75; 3727-3731, 1978); 또는 tac 프로모터 (DeBoer, et al. (1983), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80: 21-5)를 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 흥미로운 것은 조직 특이성을 나타내고, 트랜스제닉 동물에서 이용된 하기 동물 전사 제어 영역이다: 췌장 선포 세포에서 활성인 엘라스타제 I 유전자 제어 영역 (Swift et al. (1984), Cell 38: 639-46; Ornitz et al. (1986), Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 399-409; MacDonald (1987), Hepatology 7: 425-515); 췌장 베타 세포에서 활성인 인슐린 유전자 제어 영역 (Hanahan (1985), Nature 315: 115-22); 림프 세포에서 활성인 이뮤노글로불린 유전자 제어 영역 (Grosschedl et al. (1984), Cell 38; 647-58; Adames et al. (1985), Nature 318; 533-8; Alexander et al. (1987), MoI. Cell. Biol. 7: 1436-44); 고환, 유방, 림프 및 비만 세포에서 활성인 마우스 유방 종양 바이러스 제어 영역 (Leder et al. (1986), Cell 45: 485-95), 간에서 활성인 알부민 유전자 제어 영역 (Pinkert et al. (1987), Genes and Devel. 1: 268-76); 간에서 활성인 알파페토단백질 유전자 제어 영역 (Krumlauf et al. (1985), MoI. Cell. Biol. 5: 1639-48; Hammer et al. (1987), Science, 235: 53-8); 간에서 활성인 알파 1-안티트립신 유전자 제어 영역 (Kelsey et al. (1987), Genes and Devel. 1: 161-71); 골수 세포에서 활성인 베타-글로빈 유전자 제어 영역 (Mogram et al., Nature, 315 338-340, 1985; Kollias et al. (1986), Cell 46: 89-94); 뇌에서의 희소돌기아교세포에서 활성인 미엘린 염기성 단백질 유전자 제어 영역 (Readhead et al. (1987), Cell, 48: 703-12); 골격근에서 활성인 미오신 경쇄-2 유전자 제어 영역 (Sani (1985), Nature, 314: 283-6); 및 시상하부에서 활성인 고나도트로픽 방출 호르몬 유전자 제어 영역 (Mason et al. (1986), Science 234: 1372-8).
인핸서 서열은 벡터 내로 삽입되어 진핵생물 숙주 세포에서 전사를 증가시킬 수 있다. 포유동물 유전자로부터 이용가능한 몇몇 인핸서 서열은 공지되어 있다 (예를 들어, 글로빈, 엘라스타제, 알부민, 알파-페토-단백질 및 인슐린). 그러나, 전형적으로, 바이러스로부터의 인핸서가 사용될 것이다. SV40 인핸서, 시토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서는 진핵생물 프로모터의 활성화를 위한 예시적인 인핸싱 요소이다.
인핸서는 폴리펩티드 코딩 영역에 대해 위치 5' 또는 3'에서 벡터 내로 스플라이싱될 수 있지만, 이는 전형적으로 프로모터로부터 부위 5'에 위치한다.
핵산을 발현시키기 위한 벡터로는 박테리아, 곤충, 및 포유동물 숙주 세포와 혼화성인 것들을 들 수 있다. 이러한 벡터로는 그 중에서도, pCRII, pCR3, 및 pcDNA3.1 (인비트로젠 컴퍼니 (Invitrogen Company), 미국 캘리포니아주 샌 디에고), pBSII (스트라타진 컴퍼니 (Stratagene Company), 미국 캘리포니아주 라 욜라), pET15 (노바젠 (Novagen), 미국 위스콘신주 매디슨), pGEX (파마시아 바이오테크 (Pharmacia Biotech), 미국 뉴저지주 피스캐터웨어), pEGFP-N2 (클론테크, 미국 캘리포니아주 팔로 알토), pETL (블루(Blue)BacII; 인비트로젠), pDSR-알파 (PCT 공개 제WO90/14363호) 및 pFastBacDual (지브코 (Gibco)/BRL, 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드)을 들 수 있다.
추가의 가능한 벡터로는 코스미드, 플라스미드 또는 변형된 바이러스를 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않지만, 벡터 시스템은 선택된 숙주 세포와 혼화성이어야 한다. 이러한 벡터로는 플라스미드, 예컨대 블루스크립트 (Bluescript)® 플라스미드 유도체 (높은 카피 수 ColEl-기재 파지미드, 스트라타진 클로닝 시스템즈, 인크. (Stratagene Cloning Systems Inc.), 미국 캘리포니아주 라 욜라), Taq-증폭된 PCR 생성물을 클로닝하기 위해 설계된 PCR 클로닝 플라스미드 (예를 들어, TOPO™. TA 클로닝® 키트, PCR2.1 플라스미드 유도체, 인비트로젠, 미국 캘리포니아주 칼스배드), 및 포유동물, 효모 또는 바이러스 벡터, 예컨대 바쿨로바이러스 발현 시스템 (pBacPAK 플라스미드 유도체, 클론테크, 미국 캘리포니아주 팔로 알토)을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 재조합 분자는 형질전환, 형질감염, 감염, 전기천공, 또는 다른 공지된 기법을 통해 숙주 세포 내로 도입될 수 있다.
본원에 개시된 재조합 아피머 폴리펩티드의 발현을 위한 숙주로서 포유동물 세포를 비롯한 진핵생물 및 원핵생물 숙주 세포는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으며, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection) (ATCC)으로부터 이용가능한 많은 불멸화 세포주를 들 수 있다. 이들로는 그 중에서도, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, NSO, SP2 세포, HeLa 세포, 아기 햄스터 신장 (BHK) 세포, 원숭이 신장 세포 (COS), 인간 간세포 암종 세포 (예를 들어, Hep G2), A549 세포, 3T3 세포, HEK-293 세포 및 다수의 다른 세포주를 들 수 있다. 포유동물 숙주 세포로는 인간, 마우스, 래트, 개, 원숭이, 돼지, 염소, 소, 말 및 햄스터 세포를 들 수 있다. 특정 바람직한 세포주는 어느 세포주가 높은 발현 수준을 갖는 지를 측정하는 것을 통해 선택된다. 사용될 수 있는 다른 세포주는 곤충 세포주, 예컨대 Sf9 세포, 양서류 세포, 박테리아 세포, 식물 세포 및 진균 세포이다. 진균 세포로는 예를 들어, 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris), 피키아 핀란디카 (Pichia finlandica), 피키아 트레할로필라 (Pichia trehalophila), 피키아 코클라마에 (Pichia koclamae), 피키아 멤브라나에파시엔스 (Pichia membranaefaciens), 피키아 미누타 (Pichia minuta) (오가타에아 미누타 (Ogataea minuta), 피키아 린드네리 (Pichia lindneri)), 피키아 오푼티아에 (Pichia opuntiae), 피키아 써모톨레란스 (Pichia thermotolerans), 피키아 살릭타리아 (Pichia salictaria), 피키아 구에르쿰 (Pichia guercuum), 피키아 피지페리 (Pichia pijperi), 피키아 스팁티스 (Pichia stiptis), 피키아 메타놀리카 (Pichia methanolica), 피키아 (Pichia) 종, 사카로미세스 세레비지아에 (Saccharomyces cerevisiae), 사카로미세스 (Saccharomyces) 종, 한세눌라 폴리모르파 (Hansenula polymorpha), 클루이베로미세스 (Kluyveromyces) 종, 클루이베로미세스 락티스 (Kluyveromyces lactis), 칸디다 알비칸스 (Candida albicans), 아스페르길루스 니둘란스 (Aspergillus nidulans), 아스페르길루스 니게르 (Aspergillus niger), 아스페르길루스 오리자에 (Aspergillus oryzae), 트리코더마 리세이 (Trichoderma reesei), 크리소스포리움 루크노웬스 (Chrysosporium lucknowense), 푸사리움 (Fusarium) 종, 푸사리움 그라미네움 (Fusarium gramineum), 푸사리움 베네나툼 (Fusarium venenatum), 피스코미트렐라 페텐스 (Physcomitrella patens) 및 뉴로스포라 크라사 (Neurospora crassa), 피키아 종, 임의의 사카로미세스 종, 한세눌라 폴리모르파, 임의의 클루이베로미세스 종, 칸디다 알비칸스, 임의의 아스페르길루스 종, 트리코더마 리세이, 크리소스포리움 루크노웬스, 임의의 푸사리움 종, 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica), 및 뉴로스포라 크라사를 비롯한 효모 및 필라멘트성 진균 세포를 들 수 있다.
다양한 숙주-발현 벡터 시스템은 본 발명의 재조합 아피머 폴리펩티드를 발현시키는 데 이용될 수 있다. 이러한 숙주-발현 시스템은 재조합 아피머 폴리펩티드의 코딩 서열이 생성되고, 이어서 정제될 수 있는 비히클을 나타내지만, 또한 적절한 뉴클레오티드 코딩 서열로 형질전환되거나 형질감염되는 경우, 본 발명의 재조합 아피머 폴리펩티드를 계내에서 발현시킬 수 있는 세포를 나타낸다. 이들로는 아피머 폴리펩티드 코딩 서열을 함유하는 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 미생물, 예컨대 박테리아 (예를 들어, 이. 콜라이 및 비. 서브틸리스 (B. subtilis)); 아피머 폴리펩티드 코딩 서열을 함유하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모 (예를 들어, 사카로미세스 피키아 (Saccharomyces pichia)); 아피머 폴리펩티드 코딩 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터 (예를 들어, 바쿨로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 재조합 바이러스 발현 벡터 (예를 들어, 콜리플라워 모자이크 바이러스 (CμMV) 및 담배 모자이크 바이러스 (TMV))로 감염되거나, 아피머 폴리펩티드 코딩 서열을 함유하는 재조합 플라스미드 발현 벡터 (예를 들어, Ti 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포 시스템; 또는 포유동물 세포 시스템 (예를 들어, COS, CHO, BHK, 293, 293T, 3T3 세포, 림프 세포 (미국 특허 제5,807,715호 참조), 포유동물 세포 (예를 들어, 메탈로티오네인 프로모터)의 게놈으로부터 또는 포유동물 바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터; 우두 바이러스 7.5K 프로모터)로부터 유래된 프로모터를 함유하는 재조합 발현 구축물을 함유하는 Per C.6 세포 (크루셀 (Crucell)에 의해 개발된 래트 망막 세포)를 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
박테리아 시스템에서, 다수의 발현 벡터는 유리하게는 발현되는 재조합 아피머 폴리펩티드에 대해 의도되는 용도에 따라 선택될 수 있다. 예를 들어, 재조합 아피머 폴리펩티드의 제약 조성물의 생성을 위해, 다량의 이러한 단백질이 제조되어야 하는 경우, 용이하게 정제되는 높은 수준의 융합 단백질 생성물의 발현을 지정하는 벡터가 바람직할 수 있다. 이러한 벡터로는 아피머 폴리펩티드 코딩 서열이 융합 단백질이 생성되도록 lac Z 코딩 영역과 인 프레임으로 벡터 내로 개별적으로 라이게이션될 수 있는 이. 콜라이 발현 벡터 pUR278 (Ruther et al. (1983) "Easy Identification Of cDNA Clones," EMBO J. 2:1791-1794); pIN 벡터 (Inouye et al. (1985) "Up-Promoter Mutations In The Lpp Gene Of Escherichia coli," Nucleic Acids Res. 13:3101-3110; Van Heeke et al. (1989) "Expression Of Human Asparagine Synthetase In Escherichia coli," J. Biol. Chem. 24:5503-5509) 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. pGEX 벡터는 또한 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (GST)를 갖는 융합 단백질로서 외래 폴리펩티드를 발현하는 데 사용될 수 있다. 일반적으로, 이러한 융합 단백질은 가용성이며, 매트릭스 글루타티온-아가로스 비드에의 흡착 및 결합, 이어서 유리 글루타티온의 존재 하에서의 용리에 의해 용해된 세포로부터 용이하게 정제될 수 있다. pGEX 벡터는 클로닝된 표적 유전자 생성물이 GST 모이어티로부터 방출될 수 있도록 트롬빈 또는 인자 Xa 프로테아제 절단 부위를 포함하도록 설계된다.
곤충 시스템에서, 오토그라파 칼리포르니카 (Autographa californica) 핵 다각체병 바이러스 (AcNPV)는 외래 유전자를 발현시키는 벡터로서 사용된다. 바이러스는 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) 세포에서 성장한다. 아피머 폴리펩티드 코딩 서열은 바이러스의 비-필수 영역 (예를 들어, 폴리헤드린 유전자) 내로 직접적으로 클로닝되고, AcNPV 프로모터 (예를 들어, 폴리헤드린 프로모터)의 제어 하에 정치될 수 있다.
포유동물 숙주 세포에서, 다수의 바이러스-기재 발현 시스템이 이용될 수 있다. 아데노바이러스가 발현 벡터로서 사용되는 경우, 관심 아피머 폴리펩티드 코딩 서열, 예를 들어, 후기 프로모터 및 삼중 리더 서열은 아데노바이러스 전사/번역 제어 복합체에 라이게이션될 수 있다. 이 키메라 유전자는 그 후 시험관내 또는 생체내 재조합에 의해 아데노바이러스 게놈에 삽입될 수 있다. 바이러스 게놈의 비-필수 영역 (예를 들어, 영역 E1 또는 E3)에서의 삽입은 생존가능하고, 감염된 숙주에서 이뮤노글로불린 분자를 발현할 수 있는 재조합 바이러스를 초래할 것이다. (예를 들어, 문헌 [Logan et al. (1984) "Adenovirus Tripartite Leader Sequence Enhances Translation Of mRNAs Late After Infection," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 81:3655-3659] 참조). 특이적 개시 신호는 또한 삽입된 아피머 폴리펩티드 코딩 서열의 효율적인 번역에 요구될 수 있다. 이들 신호는 ATG 개시 코돈 및 인접한 서열을 포함한다. 더욱이, 개시 코돈은 전체 삽입물의 번역을 보장하기 위해 바람직한 코딩 서열의 리딩 프레임과 동상이어야 한다. 이들 외인성 번역 제어 신호 및 개시 코돈은 천연 및 합성 둘 다의 다양한 기원의 것일 수 있다. 발현의 효율성은 적절한 전사 인핸서 요소, 전사 종결자 등의 포함에 의해 향상될 수 있다. (문헌 [Bitter et al. (1987) "Expression And Secretion Vectors For Yeast," Methods in Enzymol. 153:516-544] 참조).
또한, 삽입된 서열의 발현을 조정하거나, 바람직한 특수한 방식으로 유전자 생성물을 변형시키고 프로세싱하는 숙주 세포 균주는 선택될 수 있다. 단백질 생성물의 이러한 변형 (예를 들어, 글리코실화) 및 프로세싱 (예를 들어, 절단)은 단백질의 기능에 중요할 수 있다. 상이한 숙주 세포는 단백질 및 유전자 생성물의 번역후 프로세싱 및 변형을 위한 특징 및 특수한 메커니즘을 갖는다. 적절한 세포주 또는 숙주 시스템은 발현되는 외래 단백질의 정확한 변형 및 프로세싱을 보장하기 위해 선택될 수 있다. 이 목적으로, 1차 전사체의 적절한 프로세싱, 글리코실화, 및 유전자 생성물의 인산화를 위한 세포 기구를 갖는 진핵생물 숙주 세포가 사용될 수 있다. 이러한 포유동물 숙주 세포로는 CHO, VERY, BHK, Hela, COS, MDCK, 293, 293T, 3T3, WI38, BT483, Hs578T, HTB2, BT20 및 T47D, CRL7030 및 Hs578Bst를 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
재조합 단백질의 장기, 고-수율 제조를 위해, 안정한 발현이 바람직하다. 예를 들어, 본 발명의 항체를 안정하게 발현하는 세포주는 조작될 수 있다. 바이러스 복제 원점을 함유하는 발현 벡터를 사용하기 보다는, 숙주 세포는 적절한 발현 제어 요소 (예를 들어, 프로모터, 인핸서, 서열, 전사 종결자, 폴리아데닐화 부위 등), 및 선택가능한 마커에 의해 제어된 DNA로 형질전환될 수 있다. 외래 DNA의 도입 후, 조작된 세포는 풍부화된 배지에서 1 내지 2일 동안 성장한 후, 선택적 배지로 전환될 수 있다. 재조합 플라스미드에서 선택가능한 마커는 선택에 대한 저항성을 부여하고, 세포가 플라스미드를 그들의 염색체 내로 안정하게 통합하게 하고, 성장하여 다시 세포주 내로 클로닝되고, 확장될 수 있는 초점을 형성한다. 이 방법은 유리하게는 본 발명의 재조합 아피머 폴리펩티드를 발현하는 세포주를 조작하는 데 사용될 수 있다. 이러한 조작된 세포주는 재조합 아피머 폴리펩티드와 직접적으로 또는 간접적으로 상호작용하는 화합물의 스크리닝 및 평가에 특히 유용할 수 있다.
각각 tk-, hgprt- 또는 aprt- 세포에 채용될 수 있는 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제 (Wigler et al. (1977) "Transfer Of Purified Herpes Virus Thymidine Kinase Gene To Cultured Mouse Cells," Cell 11:223-232), 히포크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제 (Szybalska et al. (1962) "Genetics Of Human Cess Line. IV. DNA-Mediated Heritable Transformation Of A Biochemical Trait," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 48:2026-2034), 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제 (Lowy et al. (1980) "Isolation Of Transforming DNA: Cloning The Hamster Aprt Gene," Cell 22:817-823) 유전자를 포함하나 이에 제한되지 않는 다수의 선택 시스템이 사용될 수 있다. 또한, 항대사물 저항성은 하기 유전자에 대한 선택의 기초로서 사용될 수 있다: 메토트렉세이트에 대한 저항성을 부여하는 dhfr (Wigler et al. (1980) "Transformation Of Mammalian Cells With An Amplfiable Dominant-Acting Gene," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 77:3567-3570; O'Hare et al. (1981) "Transformation Of Mouse Fibroblasts To Methotrexate Resistance By A Recombinant Plasmid Expressing A Prokaryotic Dihydrofolate Reductase," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 78:1527-1531); 미코페놀산에 대한 저항성을 부여하는 gpt (Mulligan et al. (1981) "Selection For Animal Cells That Express The Escherichia coli Gene Coding For Xanthine-Guanine Phosphoribosyltransferase," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 78:2072-2076); 아미노글리코시드 G-418에 대한 저항성을 부여하는 neo (Tachibana et al. (1991) "Altered Reactivity Of Immunoglobutin Produced By Human-Human Hybridoma Cells Transfected By pSV2-Neo Gene," Cytotechnology 6(3):219-226; Tolstoshev (1993) "Gene Therapy, Concepts, Current Trials And Future Directions," Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan (1993) "The Basic Science Of Gene Therapy," Science 260:926-932; 및 Morgan et al. (1993) "Human gene therapy," Ann. Rev. Biochem. 62:191-217). 사용될 수 있는 재조합 DNA 기술의 관련 기술분야에 통상적으로 공지된 방법은 문헌 [Ausubel et al. (eds.), 1993, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, NY]; [Kriegler, 1990, GENE TRANSFER AND EXPRESSION, A LABORATORY MANUAL, Stockton Press, NY]에; 및 [Chapters 12 and 13, Dracopoli et al. (eds), 1994, CURRENT PROTOCOLS IN HUMAN GENETICS, John Wiley & Sons, NY.]; [Colbere-Garapin et al. (1981) "A New Dominant Hybrid Selective Marker For Higher Eukaryotic Cells," J. Mol. Biol. 150:1-14]에 기재되어 있다; 및 히그로마이신에 대한 저항성을 부여하는 hygro (Santerre et al. (1984) "Expression Of Prokaryotic Genes For Hygromycin B And G418 Resistance As Dominant-Selection Markers In Mouse L Cells," Gene 30:147-156).
재조합 아피머 폴리펩티드의 발현 수준은 벡터 증폭에 의해 증가될 수 있다 (검토를 위해, 문헌 [Bebbington and Hentschel, "The Use Of Vectors Based On Gene Amplification For The Expression Of Cloned Genes In Mammaian Cells," in DNA CLONING, Vol. 3. (Academic Press, New York, 1987)] 참조). 재조합 아피머 폴리펩티드를 발현하는 벡터 시스템에서 마커가 증폭가능한 경우, 숙주 세포의 배양물에 존재하는 억제제의 수준의 증가는 마커 유전자의 카피의 수를 증가시킬 것이다. 증폭된 영역은 재조합 아피머 폴리펩티드의 뉴클레오티드 서열과 연관되기 때문에, 재조합 아피머 폴리펩티드의 생성은 또한 증가할 것이다 (Crouse et al. (1983) "Expression And Amplification Of Engineered Mouse Dihydrofolate Reductase Minigenes," Mol. Cell. Biol. 3:257-266).
아피머 폴리펩티드가 아피머 항체 융합물 또는 다른 다중단백질 복합체인 경우, 숙주 세포는 2개의 발현 벡터, 예를 들어 중쇄를 코딩하는 제1 벡터 및 경쇄 유래된 폴리펩티드를 코딩하는 제2 벡터로 공동-형질감염될 수 있으며, 이들 중 하나 또는 둘 다는 아피머 폴리펩티드 코딩 서열을 포함한다. 2개의 벡터는 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드의 동등한 발현을 가능하게 하는 동일한 선택가능한 마커를 함유할 수 있다. 대안적으로, 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드 둘 다를 코딩하는 단일 벡터가 사용될 수 있다. 이러한 상황에서, 경쇄는 과량의 독성 유리 중쇄를 회피하기 위해 중쇄 앞에 정치되어야 한다 (Proudfoot (1986) "Expression And Amplification Of Engineered Mouse Dihydrofolate Reductase Minigenes," Nature 322:562-565; Kohler (1980) "Immunoglobulin Chain Loss In Hybridoma Lines," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 77:2197-2199). 중쇄 및 경쇄에 대한 코딩 서열은 cDNA 또는 게놈 DNA를 포함할 수 있다.
일반적으로, 특정 세포주 또는 트랜스제닉 동물에서 생산된 당단백질은 세포주 또는 트랜스제닉 동물에서 생산된 당단백질에 대한 특징인 글리코실화 패턴을 가질 것이다. 따라서, 재조합 아피머 폴리펩티드의 특정 글리코실화 패턴은 단백질을 생산하는 데 사용되는 특정 세포주 또는 트랜스제닉 동물에 의존할 것이다. 아피머/항체 융합물의 특정 실시양태에서, 단지 비-푸코실화된 N-글리칸을 포함하는 글리코실화 패턴은, 항체의 경우 이는 전형적으로 시험관내 및 생체내 둘 다에서 푸코실화된 대응물보다 더 강력한 효능을 나타내는 것으로 나타났기 때문에 유리할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Shinkawa et al., J. Biol. Chem. 278: 3466-3473 (2003)]; 미국 특허 제6,946,292호 및 제7,214,775호 참조).
또한, 생산 세포주로부터의 아피머 폴리펩티드의 발현은 다수의 공지된 기법을 사용하여 향상될 수 있다. 예를 들어, 글루타민 신테타제 유전자 발현 시스템 (GS 시스템)은 특정 조건 하에서 발현을 향상시키기 위한 통상적인 접근법이다. GS 시스템은 전체적으로 또는 부분적으로 유럽 특허 제0216846호, 제0256055호, 및 제0323997호 및 유럽 특허 출원 제89303964.4호와 관련하여 논의되어 있다. 따라서, 본 발명의 실시양태에서, 포유동물 숙주 세포 (예를 들어, CHO)는 글루타민 신테타제 유전자가 결여되며, 배지에서 글루타민의 부재 하에서 성장되지만, 여기서 이뮤노글로불린 쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포에서의 유전자의 결여를 보완하는 글루타민 신테타제 유전자를 포함한다. 본원에서 논의된 바와 같은 결합제 또는 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 함유하는 이러한 숙주 세포 뿐만 아니라 이러한 숙주 세포를 사용하여 결합제를 제조하는 본원에서 논의된 바와 같은 발현 방법은 본 발명의 일부이다.
곤충 세포 배양 시스템 (예를 들어, 바쿨로바이러스)에서의 재조합 단백질의 발현은 또한 정확하게 폴딩되고 생물학적으로 기능적 단백질을 생산하는 강력한 방법을 제공한다. 곤충 세포에서 이종 단백질의 생산을 위한 바쿨로바이러스 시스템은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다.
형질전환된 숙주에 의해 생산되는 재조합 아피머 폴리펩티드는 임의의 적합한 방법에 따라 정제될 수 있다. 표준 방법으로는 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환, 친화도, 및 사이징 컬럼 크로마토그래피), 원심분리, 차등적 용해도, 또는 단백질 정제를 위한 임의의 다른 표준 기법에 의해를 들 수 있다. 친화성 태그, 예컨대 헥사-히스티딘, 말토스 결합 도메인, 인플루엔자 외피 서열, 및 글루타티온-S-트랜스퍼라제는 적절한 친화성 컬럼 상으로의 통과에 의한 용이한 정제를 허용하기 위해 단백질에 부착될 수 있다. 단리된 단백질은 또한 단백질분해, 질량 분광법 (MS), 핵 자기 공명 (NMR), 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 및 x-선 결정학과 같은 기법을 사용하여 물리적으로 특징규명될 수 있다.
일부 실시양태에서, 박테리아 배양에서 생산된 재조합 아피머 폴리펩티드는 예를 들어, 세포 펠릿으로부터의 초기 추출, 이어서 1회 이상의 농축, 염석, 수성 이온 교환, 또는 크기 배제 크로마토그래피 단계에 의해 단리될 수 있다. HPLC는 최종 정제 단계에 채용될 수 있다. 재조합 단백질의 발현에 채용되는 미생물 세포는 동결-해동 사이클링, 초음파처리, 기계적 파괴, 또는 세포 용해제의 사용을 비롯한 임의의 편리한 방법에 의해 파괴될 수 있다.
IV. 생체내 전달을 위한 코딩된 아피머
치료 아피머 폴리펩티드의 전달에 대한 대안적 접근법은 치료 폴리펩티드의 생산을 신체 자체에 남겨두는 것일 것이다. 다수의 임상적 연구는 다양한 상이한 전달 시스템을 사용한 세포 내로의 생체내 유전자 전달의 유용성을 예시하였다. 생체내 유전자 전달은 아피머 폴리펩티드라기 보다는 "코딩된 아피머" 뉴클레오티드 서열을 환자에게 투여하는 것을 추구한다. 이는 환자의 신체가 관심 치료 아피머 폴리펩티드를 연장된 기간 동안 생산하고, 생산 부위에 따라 이를 전신적으로 또는 국소적으로 분비하는 것을 허용한다. 유전자-기재 코딩된 아피머는 아피머 폴리펩티드의 폴리펩티드 버전의 통상적인 생산, 정제 및 투여에 대한 노동- 및 비용-효과적 대안을 제시할 수 있다. 다수의 항체 발현 플랫폼은 코딩된 아피머의 전달이 적응될 수 있는 생체내에서 추구되었다: 이들은 바이러스 벡터, 네이키드 DNA 및 RNA를 포함한다. 코딩된 아피머 유전자 전달은 상품의 및 생산의 비용을 감소시킴으로써 비용-절감을 가능하게 할 수 있을 뿐만 아니라, 약물 투여의 빈도를 감소시킬 수 있다. 전체적으로, 코딩된 아피머의 발현에 의한 치료 아피머 폴리펩티드의 연장된 생체내 생산은 (i) 가격-민감성 조건에서 아피머 폴리펩티드의 보다 넓은 치료적 또는 예방적 적용, (ii) 선진국 및 개발도상국 둘 다에서 요법에 대한 개선된 접근가능성, 및 (iii) 보다 효과적이고 감당가능한 치료 양상에 기여할 수 있다. 생체내 유전자 전달 외에도, 세포는 숙주 (또는 공여자)로부터 수확되고, 코딩된 아피머 서열로 조작되어 아피머 폴리펩티드를 생산하고, 환자에게 재-투여될 수 있다.
근육내 항체 유전자 투여는 가장 폭넓게 평가되었으며 (문헌 [Deal et al. (2015) "Engineering humoral immunity as prophylaxis or therapy" Curr Opin Immunol. 35:113-22]에서 검토됨.), 또한 코딩된 아피머에 적용되는 경우 가장 높은 임상적 변환성 및 적용을 갖는다. 사실, 골격근의 고유한 해부학적, 세포적 및 생리학적 특성은 이를 장기 코딩된 아피머 발현 및 전신 순환을 위한 안정한 환경으로 만든다. 골격근은 용이하게 접근가능하며, 이는 다중 또는 반복된 투여를 허용한다. 풍부한 혈관 공급은 순환 내로의 분비된 치료 아피머 폴리펩티드에 대한 효율적인 수송 시스템을 제공한다. 근육 섬유의 융합적 성질은 침투의 제한된 부위로부터 섬유 내의 다수의 이웃하는 핵으로의 뉴클레오티드의 분산을 허용한다. 골격근 섬유는 또한 종말적으로 분화된 세포이며, 섬유 내의 핵은 유사분열-후이다. 결과적으로, 숙주 게놈에서의 통합은 연장된 mAb 발현을 달성하기 위한 전제조건이 아니다. 간은 전임상 항체 유전자 전달에 종종 사용되는 또다른 부위이며, 전형적으로 정맥내 주사를 통해 형질감염되고, 또한 아피머 폴리펩티드의 국소 전달을 위한 (예컨대 간암 및/또는 화생의 치료에서) 또는 전신 순환을 위해 혈관 내로 분비된 아피머 폴리펩티드의 생성을 위한 코딩된 아피머에 대한 유전자 전달의 부위일 수 있다. 이 기관은 혈장 단백질의 합성을 비롯한 다양한 생리학적 기능을 갖는다. 이 기관은 생체내 코딩된 아피머 발현에 특히 매우 적합할 수 있다.
종양은 정맥내 또는 직접 주사/전기천공 중 어느 하나를 통해 표적화된 코딩된 아피머 전달을 위한 또다른 부위를 제시한다. 사실, 종양내 코딩된 아피머 발현은 치료 아피머 폴리펩티드의 국소적 생산을 허용할 수 있으며, 이는 그렇지 않다면 고형 종양에 침투하고 영향을 미치는 데 요구될 수 있는 높은 전신 아피머 폴리펩티드 수준에 대한 필요를 면제한다. 유사한 근거가 뇌에 적용되며, 이는 항체 유전자 전달의 맥락에서 빈번히 표적화되어 혈액-뇌 장벽 트래피킹을 갖는 곤란을 회피하며, 마찬가지로 코딩된 아피머의 전달을 위한 표적일 것이다. 예를 들어, 문헌 [Beckman et al. (2015) "Antibody constructs in cancer therapy: protein engineering strategies to improve exposure in solid tumors" Cancer 109(2):170-9]; [Dronca et al. (2015) "Immunomodulatory antibody therapy of cancer: the closer, the better" Clin Cancer Res. 21(5):944-6]; 및 [Neves et al. (2016) "Antibody approaches to treat brain diseases" Trends Biotechnol. 34(1):36-48]을 참조한다.
유전자 요법의 성공은 비바이러스 및 바이러스 유전자 전달 벡터에서의 개선에 의해 크게 유도되었다. 다수의 물리적 및 화학적 비바이러스 방법은 DNA 및 mRNA를 포유동물 세포에 전달하는 데 사용되었고, 이들 중 실질적인 수는 생체외 및 생체내 둘 다에서 유전자 요법을 위한 임상 단계 기술로서 개발되었으며, 본 발명의 코딩된 아피머의 전달을 위해 용이하게 조정된다. 예시를 위해, 양이온성 리포솜 기술이 채용될 수 있으며, 이는 음으로 하전된 DNA 또는 RNA에 결합하고, 일반적으로 세포내이입에 의해 세포로 진입하는 입자를 형성하는, 양으로 하전된 헤드 기 및 소수성 지질 꼬리를 갖는 양친매성 지질의 능력에 기초한다. 일부 양이온성 리포솜은 또한 중성 공동-지질을 함유하며, 이는 포유동물 세포에 의한 리포솜 흡수를 향상시키는 것으로 생각된다. 예를 들어, 문헌 [Felgner et al. (1987) Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. MNAS 84:7413-7417]; [San et al. (1983) "Safety and short term toxicity of a novel cationic lipid formulation for human gene therapy" Hum. Gene Ther. 4:781-788]; [Xu et al. (1996) "Mechanism of DNA release from cationic liposome/DNA complexes used in cell transfection" Biochemistry 35,:5616-5623]; 및 [Legendre et al. (1992) "Delivery of plasmid DNA into mammalian cell lines using pH-sensitive liposomes: comparison with cationic liposomes" Pharm. Res. 9, 1235-1242]을 참조한다.
유사하게, 다른 다가양이온, 예컨대 폴리-l-리신 및 폴리에틸렌-이민은 코딩된 아피머를 전달하는 데 사용될 수 있다. 이들 다가양이온은 전하 상호작용을 통해 핵산과 복합체화하며, DNA 또는 RNA의 나노입자로의 응축을 돕고, 이는 그 후 엔도솜-매개된 흡수를 위한 기질이 된다. 이들 양이온성 핵산 복합체 기술 중 몇몇은 플라스미드 DNA, 올리고데옥시뉴클레오티드, 및 다양한 형태의 합성 RNA와의 복합체를 비롯한 잠재적인 임상 제품으로서 개발되었다. 변형된 (및 비변형된 또는 "네이키드") DNA 및 RNA는 또한 다수의 상황에서 성공적인 유전자 전달을 매개하는 것으로 나타났으며, 또한 코딩된 아피머의 전달을 위한 시스템으로서 사용될 수 있다. 이들은 직접 근육내 주사에 의한 플라스미드 DNA의 사용, 플라스미드 DNA의 종양내 주사의 사용을 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Rodrigo et al. (2012) "De novo automated design of small RNA circuits for engineering synthetic riboregulation in living cells" PNAS 109:15271-15276]; [Oishi et al. (2005) "Smart polyion complex micelles for targeted intracellular delivery of PEGylated antisense oligonucleotides containing acid-labile linkages" Chembiochem. 6:718-725]; [Bhatt et al. (2015) "Microbeads mediated oral plasmid DNA delivery using polymethacrylate vectors: an effectual groundwork for colorectal cancer" Drug Deliv. 22:849-861]; [Ulmer et al. (1994) Protective immunity by intramuscular injection of low doses of influenza virus DNA vaccines" Vaccine 12: 1541-1544]; 및 [Heinzerling et al. (2005) "Intratumoral injection of DNA encoding human interleukin 12 into patients with metastatic melanoma: clinical efficacy" Hum. Gene Ther. 16:35-48]을 참조한다.
바이러스 벡터는 현재 대다수의 전임상 및 임상 유전자 요법 시험에서 전달 비히클로서 사용되며, 첫째로 지정된 유전자 요법으로 승인되어 있다. 문헌 [Gene Therapy Clinical Trials Worldwide 2017] (http://www.abedia.com/wiley/)을 참조한다. 그에 대한 주요 유도자는 자연 진화적 발달을 반영하는 그들의 이례적인 유전자 전달 효율성이며; 바이러스 벡터 시스템은 바이러스가 감염에 의해 세포막을 통해 횡단하는 능력을 진화시켰고, 그에 의해 핵산, 예컨대 코딩된 아피머를 표적 세포에 전달하기 때문에, 유전자 전달을 위해 매력적이다. 아데노바이러스 시스템에 의해 개척되어, 바이러스 벡터-매개 항체 유전자 전달의 분야는 과거 수십 년에 상당한 진전을 이루었다. 무수한 성공적으로 평가된 투여 경로, 전임상 모델 및 질환 적응증은 항체 유전자 전달의 능력을 그를 통해 통상의 기술자가 항체 유전자 전달 시스템 및 코딩된 아피머 구축물의 생체내 전달을 위한 기법을 용이하게 확인하고 조정할 수 있을 것인 전면 제시에 놓는다. 근육은 연장된 mAb 발현을 위한 선택의 투여 부위로서 나타났으며, 유사하게 연장된 아피머 폴리펩티드 발현을 위한 적합한 표적 조직일 것이다. 벡터화된 종양내 코딩된 아피머 유전자 전달의 맥락에서, 종양용해성 바이러스는 이들이 종양 세포를 특이적으로 표적화하고, 아피머 폴리펩티드 발현을 신장시키고, 치료 반응을 증폭시키기 때문에 뚜렷한 이점을 갖는다 - 예컨대 관문 억제성 또는 공동자극성 효능제 아피머 폴리펩티드에 대해.
코딩된 아피머의 생체내 유전자 전달은 또한 비바이러스 벡터, 예컨대 발현 플라스미드의 사용에 의해 달성될 수 있다. 비바이러스 벡터는 용이하게 생산되며, 특이적 면역 반응을 유도하는 것으로 보이지 않는다. 근육 조직은, 근육 조직이 잘 혈관화되고, 용이하게 접근가능하며, 근세포가 장수하는 세포이기 때문에, 형질감염을 위한 표적 조직으로서 가장 흔히 사용된다. 네이키드 플라스미드 DNA의 근육내 주사는 특정 백분율의 근세포의 형질감염을 초래한다. 이 접근법을 사용하여, 시토카인 및 시토카인/IgG1 키메라 단백질을 코딩하는 플라스미드 DNA는 생체내에서 도입되었고, (자가면역) 질환 결과에 긍정적으로 영향을 미쳤다.
일부 예에서, 증가된 유전자 전달 및 발현 수준이 정맥에서 오래가지 못하는 일시적인 높은 압력을 유도함으로써 달성되는 소위 혈관내 전달을 통해 형질감염 효율성을 증가시키기 위해. 특수한 혈압 밴드는 혈관 압력을 일시적으로 증가시킴으로써 국소화된 흡수를 용이하게 할 수 있고, 이 유형의 유전자 전달을 위한 인간 환자에서의 사용을 위해 조정될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Zhang et al. (2001) "Efficient expression of naked DNA delivered intraarterially to limb muscles of nonhuman primates" Hum. Gene Ther., 12:427-438]을 참조한다.
증가된 효율성은 또한 예컨대 핵산의 전달이 화학적 운반체-양이온성 중합체 또는 지질-의 사용에 의해 또는 물리적 접근법-유전자 총 전달 또는 전기천공을 통해 개선되는 다른 기법을 통해 얻어질 수 있다. 문헌 [Tranchant et al. (2004) "Physicochemical optimisation of plasmid delivery by cationic lipids" J. Gene Med., 6 (Suppl. 1):S24-S35]; 및 [Niidome et al. (2002) "Gene therapy progress and prospects: nonviral vectors" Gene Ther., 9:1647-1652]을 참조한다. 전기천공은 특히 비바이러스성 유전자 전달을 위한 흥미로운 기법으로 간주된다. 문헌 [Somiari, et al. (2000) "Theory and in vivo application of electroporative gene delivery" Mol. Ther. 2:178-187]; 및 [Jaroszeski et al. (1999) "In vivo gene delivery by electroporation" Adv. Drug Delivery Rev., 35:131-137]. 전기천공으로, 펄스화된 전류는 국소 조직 영역에 인가되어 세포 투과성을 향상시키며, 이는 막을 가로지르는 유전자 전달을 초래한다. 연구는 생체내 유전자 전달이 전기천공이 없는 것보다 있는 것이 적어도 10 내지 100배 더 효율적일 수 있음을 보였다. 예를 들어, 문헌 [Aihara et al. (1998) "Gene transfer into muscle by electroporation in vivo" Nat. Biotechnol. 16:867-870]; [Mir, et al. (1999) "High-efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses" PNAS 96:4262-4267]; [Rizzuto, et al. (1999) "Efficient and regulated erythropoietin production by naked DNA injection and muscle electroporation" PNAS 96: 6417-6422]; 및 [Mathiesen (1999) "Electropermeabilization of skeletal muscle enhances gene transfer in vivo" Gene Ther., 6:508-514]을 참조한다.
코딩된 아피머는 바이러스, 비-바이러스, 또는 물리적을 비롯한 유전자 요법에 통상적으로 사용되는 폭넓은 범위의 유전자 전달 시스템에 의해 전달될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Rosenberg et al., Science, 242:1575-1578, 1988], 및 [Wolff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9011-9014 (1989)]을 참조한다. 유전자 요법에 사용하기 위한 방법 및 조성물의 논의로는 문헌 [Eck et al., in Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ninth Edition, Hardman et al., eds., McGraw-Hill, New York, (1996), Chapter 5, pp. 77-101]; [Wilson, Clin. Exp. Immunol. 107 (Suppl. 1):31-32, 1997]; [Wivel et al., Hematology/Oncology Clinics of North America, Gene Therapy, S. L. Eck, ed., 12(3):483-501, 1998]; [Romano et al., Stem Cells, 18:19-39, 2000] 및 그에 인용된 참고문헌을 들 수 있다. 미국 특허 제6,080,728호는 또한 폭넓게 다양한 유전자 전달 방법 및 조성물의 논의를 제공한다. 전달의 경로로는 예를 들어, 전신 투여 및 계내 투여를 들 수 있다.
효과적인 코딩된 아피머 유전자 전달 접근법은 그것이 필요한 특이적 조직/세포에 지정되어야 하며, 생성된 트랜스진 발현은 특이적 적용에 적절한 수준이어야 한다. 프로모터는 발현의 전체적인 강도 뿐만 아니라 세포-특이성을 좌우할 수 있는 벡터 게놈 설계 내의 주요한 시스-작용 요소이다.
<표 1>
예시적인 보편적 및 세포-특이적 프로모터.
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
일부의 경우, 모든 세포 유형에서의 코딩된 아피머 구축물의 보편적 발현이 바람직하다. 구성적 프로모터, 예컨대 인간 신장 인자 1α-서브유닛 (EF1α), 극초기 시토메갈로바이러스 (CMV), 닭 β-액틴 (CBA) 및 그의 유도체 CAG, β 글루쿠로니다제 (GUSB), 또는 유비퀴틴 C (UBC)는 대부분의 조직에서 코딩된 아피머 구축물의 발현을 촉진시키는 데 사용될 수 있다. 일반적으로, CBA 및 CAG는 구성적 프로모터 중에서 보다 큰 발현을 촉진시킨다; 그러나, CMV (약 0.8 kbs) 또는 EF1α (약 1.2 kbs)에 비해 약 1.7 kbs의 그들의 크기는 패키징 제약을 갖는 벡터, 예컨대 특히 코딩된 아피머 구축물의 발현에 의해 생산되는 아피머 폴리펩티드가 큰 AAV에서 사용을 제한할 수 있다. GUSB 또는 UBC 프로모터는 각각 378 bps 및 403 bps의 보다 작은 크기를 갖는 보편적 유전자 발현을 제공할 수 있지만, 이들은 CMV 또는 CBA 프로모터보다 상당히 더 약하다. 따라서, 그의 발현에 영향을 미치지 않고 크기를 감소시키기 위한 구성적 프로모터에 대한 변형이 추구되었으며, CBh (약 800 bps) 및 미니CBA (약 800 bps)와 같은 예는 필적하고 선택된 조직에서 훨씬 더 높은 발현을 촉진시킬 수 있다 (Gray et al., Hum Gene Ther. 2011 22:1143-1153).
코딩된 아피머 구축물의 발현이 기관 내의 특정 세포 유형에 제한되어야 하는 경우, 프로모터는 이 특이성을 매개하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 신경계 내에서 프로모터는 발현을 뉴런, 성상세포, 또는 희소돌기아교세포에 제한하는 데 사용되었다. 뉴런에서, 뉴런-특이적 에놀라제 (NSE) 프로모터는 보편적 프로모터보다 더 강한 발현을 유도한다. 추가적으로, 혈소판-유래된 성장 인자 B-쇄 (PDGF-β), 시냅신 (Syn), 및 메틸-CpG 결합 단백질 2 (MeCP2) 프로모터는 NSE보다 더 낮은 수준으로 뉴런-특이적 발현을 유도할 수 있다. 성상세포에서, 아교세포 섬유 산성 단백질 (GFAP, 2.2 kbs) 프로모터의 680 bps-길이 단축된 버전 [gfaABC(1)D]은 GFAP 프로모터와 동일한 성상세포-특이성을 갖는 발현의 보다 높은 수준을 부여할 수 있다. 희소돌기아교세포를 표적화하는 것은 또한 그의 발현이 이 아교 세포에 제한되는 미엘린 염기성 단백질 (MBP) 프로모터의 선택에 의해 달성될 수 있다; 그러나, 1.9 kbs의 그의 크기 및 낮은 발현 수준이 그의 사용을 제한한다.
코딩된 아피머 구축물을 골격근 세포에서 발현시키는 경우, 근육 크레아틴 키나제 (MCK) 및 데스민 (1.7 kbs)에 기초한 예시적인 프로모터는 높은 비율의 특이성을 나타내었다 (바람직한 경우 간에서 최소 발현을 가짐). α-미오신 중쇄 (α-MHC; 1.2 kbs)의 프로모터는 다른 근육 프로모터에 비해 상당한 심장 특이성을 나타내었다 (Lee et al., 2011 J Cardiol. 57(1):115-22). 조혈 줄기 세포에서, 합성 MND 프로모터 (Li et al., 2010 J Neurosci Methods. 189(1):56-64) 및 2AUCOE에 함유된 프로모터 (보편적 크로마틴 개방 요소)는 각각 EF1α 및 CMV 프로모터와 비교할 경우 모든 세포 계통에서 더 높은 트랜스진 발현을 유도하는 것으로 나타났다 (Zhang et al., 2007 Blood. 110(5):1448-57; Koldej 2013 Hum Gene Ther Clin Dev. 24(2):77-85; Dighe et al., 2014 PLoS One. 9(8):e104805.). 반대로, 벡터-매개 유전자 전달 후에 발현을 단지 간 간세포에 제한하는 프로모터를 사용하는 것은 그것이 위험인 시스템에서 트랜스진-특이적 면역 반응을 감소시키고, 심지어 발현된 단백질에 대한 면역 내성을 유도하는 것으로 나타났으며 (Zhang et al., 2012 Hum Gene Ther. 23(5):460-72), 이는 특정 아피머 폴리펩티드에 대해 유익할 수 있다. α1-안티트립신 (hAAT; 347 bps) 및 티록신 결합 글로불린 (TBG; 약 400 bps) 프로모터는 다른 조직에 대한 최소 침습으로 간에 제한된 유전자 발현을 유도한다 (Yan et al., 2012 Gene. 506(2):289-94; Cunningham et al., 2008 Mol Ther. 16(6):1081-8).
특정 실시양태에서, 생체내 코딩된 아피머 발현의 지속기간 및 양을 제어하는 메커니즘은 전형적으로 바람직할 것이다. 바이러스 벡터화된- 및 플라스미드 DNA-기재 코딩된 아피머 유전자 전달과 함께 사용하기 위해 조정될 수 있는 다양한 유도성 프로모터가 있다. 문헌 [Fang et al. (2007) "An antibody delivery system for regulated expression of therapeutic levels of monoclonal antibodies in vivo" Mol Ther. 5(6):1153-9]; 및 [Perez et al. (2004) "Regulatable systemic production of monoclonal antibodies by in vivo muscle electroporation" Genet Vaccines Ther. 2(1):2]을 참조한다. 현재 임상 평가 하의 예시적인 조절가능한 메커니즘은 소분자 리간드에 의해 활성화되는 엑디손-기재 유전자 스위치이다. 문헌 [Cai et al. (2016) "Plasma pharmacokinetics of veledimex, a small-molecule activator ligand for a proprietary gene therapy promoter system, in healthy subjects" Clin Pharmacol Drug Dev. 2016].
코딩된 아피머 구축물의 특정 실시양태에서, 바이러스 전사후 조절 요소 (PRE)가 사용될 수 있으며; 이들 시스-작용 요소는 무인트론 바이러스 RNA의 핵 수송에 요구된다 (문헌 [Huang and Yen, 1994 J Virol. 68(5):3193-9]; 및 [1995 Mol Cell Biol. 15(7):3864-9]). 예로는 HPRE (B형 간염 바이러스 PRE, 533 bps) 및 WPRE (마멋 간염 바이러스 PRE, 600 bps)를 들 수 있으며, 이는 트랜스진 발현의 수준을 특정 예에서 거의 10배 증가시킬 수 있다 (Donello et al., 1998 J Virol. 72(6):5085-92). 추가의 예시를 위해, 렌티바이러스 및 AAV 벡터를 사용하여, WPRE는 CMV 프로모터 유래된 트랜스진 발현을 증가시킬 뿐만 아니라 PPE, PDGF 및 NSE 프로모터-유래된 트랜스진 발현을 증가시키는 것으로 밝혀졌다. WPRE의 또다른 효과는 코딩된 아피머 구축물 트랜스진을 침묵화로부터 보호하는 것일 수 있다 (Paterna et al., 2000 Gene Ther. 7(15):1304-11; Xia et al., 2007 Stem Cells Dev. 2007 Feb; 16(1):167-76).
전사된 코딩된 아피머 전사체의 폴리아데닐화는 또한 핵 수송, 번역, 및 mRNA 안정성에 중요할 수 있다. 따라서, 특정 실시양태에서, 코딩된 아피머 구축물은 폴리아데닐화 신호 서열을 포함할 것이다. 유전자 발현 및 mRNA 안정성에 대한 상이한 폴리A 신호의 효과를 측정한 다양한 연구는 이용가능하다. 예시적인 폴리아데닐화 신호 서열로는 SV40 후기 또는 소 성장 호르몬 폴리A (bGHpA) 신호 서열, 뿐만 아니라 최소 합성 폴리A (SPA) 신호를 들 수 있다 (Levitt et al., 1989 Genes Dev. 3(7):1019-25; Yew et al., 1997 Hum Gene Ther. 1997 8(5):575-84). 폴리아데닐화의 효율성은 다른 폴리A 신호의 상류에 위치한 SV40 후기 폴리A 신호 상류 인핸서 (USE)에 의해 증가된다 (Schek et al., 1992 Mol Cell Biol. 12(12):5386-93). 특정 실시양태에서, 단지 예시를 위해, 코딩된 아피머 구축물은 SV40 후기 + 2xUSE 폴리A 신호를 포함할 것이다.
<표 2>
예시적인 폴리아데닐화 신호
Figure pct00028
특정 실시양태에서, 코딩된 아피머 구축물이 즉, 임의의 프로모터 서열 외에도 1종 이상의 조절성 인핸서를 포함하는 것이 바람직할 수 있다. CMV 인핸서는 -598 내지 -68에서 CMV 프로모터의 상류이며 (Boshart et al., 1985 Cell. 41(2):521-30) (약 600 bps), 전사 결합 부위를 함유한다. 특정 실시양태에서, CMV 인핸서는 예컨대 ANF (심방 나트륨이뇨 인자) 프로모터, CC10 (곤봉체 세포 10) 프로모터, SP-C (계면활성제 단백질 C) 프로모터, 또는 PDGF-β (혈소판-유래된 성장 인자-β) 프로모터 (단지 예로서)를 사용하여, 조직-특이적 프로모터-유래된 트랜스진 발현을 증가시키기 위해 구축물에 포함될 수 있다. 모두 함께, CMV 인핸서는 상이한 세포-특이적 프로모터 및 상이한 세포 유형 하에서 트랜스진 발현을 증가시키며, 이는 이를 트랜스진 발현 수준을 증가시키는 폭넓게 적용가능한 도구로 만든다. 근육에서, 예를 들어, AAV 발현 시스템에서, 근육-특이적 프로모터를 갖는 CMV 인핸서를 사용한 트랜스진 발현은 트랜스진에 의해 코딩되는 단백질의 발현 수준을 증가시킬 수 있으며, 따라서 환자의 근육 세포 내로 도입된 코딩된 아피머 구축물로부터 아피머 폴리펩티드를 발현시키기 위해 본 발명에서 특히 유용할 것이다.
대상 코딩된 아피머 구축물은 또한 1종 이상의 인트론 서열을 포함할 수 있다. mRNA에서 인트론 또는 개재 서열의 존재는 먼저 시험관내에서 mRNA 프로세싱 및 증가된 트랜스진 발현에 중요한 것으로 기재되었다 (Huang and Gorman, 1990 Mol Cell Biol. 10(4):1805-10; Niwa et al., 1990 Genes Dev. 4(9):1552-9). 인트론(들)은 아피머 폴리펩티드에 대한 코딩 서열 내에 위치할 수 있고/거나, 프로모터 및 트랜스진 사이에 위치할 수 있다. 프로모터 및 트랜스진 사이에 위치한 다양한 인트론 (표 3)은 AAV2를 사용한 마우스에서 간 트랜스진 발현에 대해 비교되었다 (Wu et al., 2008). MVM (마우스의 미세 바이러스) 인트론은 트랜스진 발현을 시험된 임의의 다른 인트론보다 많이 및 인트론이 없는 것에 비해 80배 초과 증가시켰다 (Wu et al., 2008). 그러나, AAV 발현 카세트를 사용하여 배양된 뉴런에서, 트랜스진 발현은 WPRE에 비해 트랜스진 및 폴리A 신호 사이에 키메라 인트론 (인간 β-글로빈 공여자 및 이뮤노글로불린 중쇄 수용자)을 갖는 CaMPKII 프로모터 하에서 더 적었다 (Choi et al., 2014). 함께, 인트론은 트랜스진 발현을 증가시키기 위해 발현 카세트에 포함되는 가치있는 요소일 수 있다.
<표 3>
예시적인 인트론
Figure pct00029
에피솜 벡터의 경우, 대상 코딩된 아피머 구축물은 또한 1종 이상의 복제 원점, 미니염색체 유지 요소 (MME) 및/또는 핵 국재화 요소를 포함할 수 있다. 본 발명의 에피솜 벡터는 이러한 벡터가 자기-복제하고, 따라서, 수 세대에 걸쳐 숙주 세포에서 존속하는 데 요구되는 복제 원점 (ori)을 코딩하는 바이러스 게놈 DNA의 부분을 포함한다. 또한, 본 발명의 에피솜 벡터는 또한 복제에 요구되는 바이러스 단백질, 즉, 복제자 단백질(들)을 코딩하는 1개 이상의 유전자를 함유할 수 있다. 임의로, 복제를 개시하는 것을 돕는 복제자 단백질(들)은 이 발명의 자기-복제 에피솜 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포에서, 또다른 DNA 분자 상에, 예컨대 또다른 벡터 상에 또는 숙주 게놈 DNA 상에 트랜스로 발현될 수 있다. 본 발명의 바람직한 자기-복제 에피솜 LCR-함유 발현 벡터는 진핵생물 숙주 세포에서 장기간 안정한 유지에 요구되지 않는 바이러스 서열, 예컨대 전장 바이러스 게놈 DNA 분자에 존재할 수 있는 감염성 바이러스 입자 또는 바이러스 종양형성 서열을 생산할 코어 또는 캡시드 단백질을 코딩하는 바이러스 게놈 DNA의 영역을 함유하지 않는다. 본원에서 용어 "안정한 유지"는 비-분열 세포에서 또는 분열 세포의 자손 세포에서 2세대 및 바람직하게는 5세대 이상 동안 벡터의 카피 수의 유의한 소실 (예를 들어, >50％) 없이 연속적 선택의 부재 하에서 존속하거나 유지되는 이 발명의 자기-복제 에피솜 발현 벡터의 능력을 지칭한다. 가장 바람직한 벡터는 10 내지 15 이상 세포 세대에 걸쳐 유지될 것이다. 대조적으로, 숙주 세포에서의 플라스미드의 "일시적" 또는 "단기" 존속성은 숙주 세포에서 안정한 방식으로 복제하고 번식하는 벡터의 무능력을 지칭하며; 즉, 벡터는 1 또는 2세대 후에 소실될 것이거나, 연속적 세대 사이에 그의 카피 수의 >51％의 소실을 겪을 것이다.
본 발명의 맥락에서 유용한 몇몇 대표적인 자기-복제, LCR-함유, 에피솜 벡터는 하기에 추가로 기재된다. 자기-복제 기능은 대안적으로 임의로 핵 체류에 요구될 수 있는 1개 이상의 서열과 조합으로, 예컨대 문헌 [Wohlgeuth et al., 1996, Gene Therapy 3:503; Vos et al., 1995, Jour. Cell. Biol., Supp. 21A, 433]; 및 [Sun et al., 1994, Nature Genetics 8:33]에 의해 기재된 1개 이상의 포유동물 서열에 의해 제공될 수 있다. 자기-복제 기능을 제공하기 위해 포유동물, 특히 인간 서열을 사용하는 것의 이점은 독성 또는 종양형성 특성을 가질 수 있는 외부적인 활성화 인자가 요구되지 않는다는 것이다. 본 발명은 어느 하나의 복제 원점 또는 어느 하나의 에피솜 벡터에 제한되지 않지만, 에피솜 벡터에서 LCR의 조직-제한된 제어의 조합을 포괄함이 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해될 것이다. 또한, WO1998007876 "조직-특이적 유전자 발현을 제공하는 자기-복제 에피솜 발현 벡터" 및 미국 특허 7790446 "벡터, 세포주 및 혼성체 플라스미드의 연장된 에피솜 유지 복제 및 유전자 생성물의 발현을 얻는 데 있어서의 그들의 용도"를 참조한다.
엡스타인-바 바이러스-기재 자기-복제 에피솜 발현 벡터. 엡스타인-바 바이러스 (EBV)로부터의 잠재적 원점 oriP는 문헌 [Yates et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 81:3806-3810 (1984)]; [Yates et al., Nature 313:812-815 (1985)]; [Krysan et al., Mol . Cell . Biol . 9:1026-1033 (1989)]; [James et al.. Gene 86: 233-239 (1990)], [Peterson and Legerski, Gene 107:279-284 (1991)]; 및 [Pan et al., Som . Cell Molec. Genet . 18:163-177 (1992)]에 기재되어 있다. 본 발명에 따라 유용한 EBV-기재 에피솜 벡터는 EBV의 2.61 kb 단편 상에 운반되는 EBV의 oriP 영역 및 EBV의 2.18 kb 단편 상에 운반되는 EBNA-1 유전자를 함유할 수 있다. oriP를 함유하는 벡터의 트랜스로 에피솜 복제를 지지하는 데 요구되는 유일한 바이러스 유전자 생성물인 EBNA-1 단백질은 oriP를 함유하는 동일한 에피솜 발현 벡터 상에 제공될 수 있다. 또한, 트랜스로 바이러스 플라스미드의 복제를 지지하는 데 요구되는 것으로 공지된 임의의 단백질, 예컨대 EBNA-1과 마찬가지로, 상기 유전자는 또한 또다른 DNA 분자, 예컨대 상이한 DNA 벡터 상에 발현될 수 있음이 이해된다.
유두종 바이러스-기재, 자기-복제, 에피솜 발현 벡터. 본 발명의 에피솜 발현 벡터는 또한 소 유두종 바이러스 (BPV) 및 인간 유두종 바이러스 (HPV)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 유두종 족의 바이러스의 복제 기능에 기초할 수 있다. BPV 및 HPV는 포유동물 세포에서 안정하게 유지된 플라스미드로서 존속한다. BPV 및 HPV에 의해 코딩되는 -S 트랜스-작용 인자, 즉, 최소 복제 원점을 통해 많은 세포 유형에서 복제를 매개하는 데 필요하고 충분한 E1 및 E2는 또한 확인되었다 (Ustav et al., EMBO J. 10: 449-457 (1991); Ustavet al., EMBO J . 10:4231-4329, (1991); Ustav et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90: 898-902 (1993)).
본 발명에 따라 유용한 에피솜 벡터는 문헌 [Piirsoo et al., EMBO J. , 15:1 (1996)]에 및 WO 94/12629에 기재된 BPV-I 벡터 시스템이다. 피르수 (Piirsoo) 등에 기재된 BPV-1 벡터 시스템은 BPV-1 복제 원점 (최소 원점 더하기 염색체외 유지 요소) 및 임의로 E1 및 E2 유전자를 갖는 플라스미드를 포함한다. BPV-l E1 및 E2 유전자는 BPV 에피솜 벡터의 안정한 유지에 요구된다. 이들 인자는 플라스미드가 세포 주기 상태와 독립적으로 세포 당 30 카피 이하의 안정한 카피 수로 복제됨을 보장한다. 따라서, 유전자 구축물은 분열 및 비-분열 세포 둘 다에서 안정하게 존속한다. 이는 조혈 줄기 세포 및 보다 관여된 전구체 세포와 같은 세포에서 유전자 구축물의 유지를 허용한다.
BPV 복제 원점은 E1 및 E2 복제 인자에 대한 결합 부위를 포함하는 60 염기쌍 (bp) DNA 단편 (뉴클레오티드 (nt) 7914 내지 7927) 내의 상류 조절 영역의 3' 말단에 위치하였다. HPV의 최소 복제 원점은 또한 특징규명되었으며, HPV의 URR 단편 (nt 7022 내지 7927)에 위치하였다 (예를 들어, 문헌 [Chiang et al., Proc . Natl . Acad. Sci . USA 89:5799-5803 (1992)] 참조). 본원에 사용된 바와 같은 "El"은 BPV 하위유형 1의 뉴클레오티드 (nt) 849 내지 2663에 의해 또는 하위유형 11의 HPV의 nt 832 내지 2779에 의해 다른 유두종 바이러스의 등가의 El 단백질로, 또는 유두종 바이러스 El 단백질의 기능적 단편 또는 돌연변이체, 즉, El의 복제 특성을 갖는 El의 단편 또는 돌연변이체로 코딩되는 단백질을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 "E2H는 BPV 하위유형 1의 nt 2594 내지 3837에 의해 또는 HPV 하위유형 11의 nt 2723 내지 3823에 의해 다른 유두종 바이러스의 등가의 E2 단백질로, 또는 유두종 바이러스 E2 단백질의 기능적 단편 또는 돌연변이체, 즉, E2의 복제 특성을 갖는 E2의 단편 또는 돌연변이체로 코딩되는 단백질을 지칭한다. "미니염색체 유지 요소" (MME)는 피르수 등 (상기 문헌)에 기재된 바와 같이, 영역이 숙주 세포에서 유두종 바이러스 MO의 안정한 에피솜 유지에 필수적인, 유두종 바이러스 복제에 필수적인 바이러스 또는 인간 단백질이 결합하는 유두종 바이러스 게놈의 염색체외 유지 요소를 지칭한다. 바람직하게는, MME는 전사 활성화제 E2에 대한 다중 결합 부위를 함유하는 서열이다. BPV에서 MME는 본원에서 최소 약 6개의 연속적 E2 결합 부위를 포함하며, 약 10개의 연속적 E2 결합 부위를 갖는 최적의 안정한 유지를 제공하는 상류 조절 영역 내에 위치한 BPV의 영역으로 정의된다. E2 결합 부위 9는 하기 기재된 바와 같이 이 부위에 대한 바람직한 서열이며, 여기서 연속적 부위는 약 4 내지 10 뉴클레오티드, 및 최적으로 6 뉴클레오티드의 스페이서에 의해 분리된다. E1 및 E2는 또한 WO 94/12629 및 피르수 등 (상기 문헌)에 기재된 바와 같이, 시스로 또는 트랜스로 플라스미드에 제공될 수 있다.
"E2 결합 부위"는 E2 단백질이 결합하는 유두종바이러스 이중-가닥 DNA의 최소 서열을 지칭한다. E2 결합 부위는 BPV-1 URR의 고 친화도 E2 결합 부위 9인 서열 5* ACCGTTGCCGGT 3'를 포함할 수 있으며; 대안적으로, E2 결합 부위는 과변이가 URR 내에서 발견되었고, 포괄적 E2 결합 서열 5' ACCN6GGT 3' 내에 해당하는 결합 부위 9의 과변이를 포함할 수 있다. 1개 이상의 전사 활성화제 E2 결합 부위는 대부분의 유두종바이러스에서 BPV 및 HPV에서와 같이 상류 조절 영역에 위치한다. 또한 본 발명에 따라 유용한 벡터는 BPV 유전자 지도 상의 6959 내지 7945/1 내지 470 사이의 BPV의 영역을 포함할 수 있으며 (WO 94/12629에 기재된 바와 같음), 이 영역은 복제 원점, 관심 유전자와 작동적으로 회합된 제1 프로모터, El 유전자의 전사를 유도하는 제2 프로모터와 작동적으로 회합된 BPV El 유전자; 및 E2 유전자의 전사를 유도하는 제3 프로모터와 작동적으로 회합된 BPV E2 유전자를 포함한다.
BPV로부터의 E1 및 E2는 BPV 원점 또는 많은 HPV 하위유형의 원점을 함유하는 벡터를 복제할 것이다 (Chiang et al., 상기 문헌). HPV로부터의 E1 및 E2는 BPV 원점을 통해 및 많은 HPV 하위유형의 원점을 통해 벡터를 복제할 것이다 (Chiang et al., 상기 문헌). 본 발명의 모든 벡터와 마찬가지로, 본 발명의 BPV-기재 에피솜 발현 벡터는 숙주 세포의 2 내지 5회 이상의 분열을 통해 존속해야 한다.
또한 BPV1 E2 단백질 의존성 MME 및 EBV EBNA1 의존성 FR 분리/분할 활성이 플라스미드의 복제와 독립적으로 기능함을 보인 미국 특허 7790446 및 문헌 [Abroi et al. (2004) "Analysis of chromatin attachment and partitioning functions of bovine papillomavirus type 1 E2 protein. Journal of Virology 78:2100-13]을 참조한다. EBNA1/FR 및 E2/MME의 안정한-유지 기능은 세포 복제 원점에 대한 장기 에피솜 유지를 보장하는 데 사용될 수 있다.
파포바바이러스-기재, 자기-복제, 에피솜 발현 벡터. 본 발명의 벡터는 또한 인간 파포바바이러스 BK 게놈 DNA 분자로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, BK 바이러스 게놈은 제한 효소 EcoRI 및 BamHI로 소화되어, 벡터 상에 안정한 유지를 제공할 수 있는 BK 바이러스 복제 원점 서열을 함유하는 5 킬로베이스 (kb) 단편을 생성할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [De Benedetti and Rhoads, Nucleic Acids Res . 19:1925 (1991)] 참조, BK 바이러스의 3.2 kb 단편일 수 있는 바와 같음 (Cooper and Miron, Human Gene Therapy 4:557 (1993)).
본 발명의 코딩된 아피머 구축물은 원형 또는 선형 핵산으로서 제공될 수 있다. 원형 및 선형 핵산은 적절한 대상 세포에서 아피머 폴리펩티드 코딩 서열의 발현을 지정할 수 있다. 아피머 폴리펩티드를 발현시키기 위한 1종 이상의 핵산 시스템은 키메라일 수 있으며, 이는 그의 성분 중 적어도 하나가 그의 다른 성분 중 적어도 하나에 대해 이종임을 의미한다.
바이러스 벡터
본 발명에 사용하기 위해 용이하게 조정되는 예시적인 바이러스 유전자 요법 시스템으로는 플라스미드, 아데노바이러스, 아데노-연관된 바이러스 (AAV), 레트로바이러스, 렌티바이러스, 단순 포진 바이러스, 우두 바이러스, 폭스바이러스, 레오바이러스, 홍역 바이러스, 셈리키 삼림 바이러스 등을 들 수 있다. 바람직한 바이러스 벡터는 비-필수적 유전자가 에피토프를 코딩하고, 관심 서열을 표적화하는 핵산 서열을 운반하는 핵산 구축물로 대체된 비-세포변성 진핵생물 바이러스에 기초한다.
추가의 예시를 위해, 코딩된 아피머는 이미 유전자 요법에서 인간 사용을 위해 승인된 이중-가닥 DNA 바이러스인 아데노바이러스 및 아데노-연관된 (AAV) 바이러스를 사용하여 생체내에서 전달될 수 있다.
아데노바이러스 벡터
1개 이상의 핵산 서열의 생체내 전달을 위한 한 예시적인 방법은 아데노바이러스 ("AdV") 발현 벡터의 사용을 포함한다. AdV는 숙주 게놈에서 통합되지도 않고, 세포 분열 동안 복제하지도 않는 비-외피화된, 이중-가닥 DNA 바이러스이다. AdV-매개 항체 유전자 전달은 다양한 상이한 질환 모델에서 치료 효능을 나타내었으며, 임상을 향해 진행하고 있다. 전신 mAb 발현은 대부분 피하 및 특히 정맥내 및 근육내 AdV 주사를 통해 추구되었다. 문헌 [Wold et al. (2013) "Adenovirus vectors for gene therapy, vaccination and cancer gene therapy" Curr Gene Ther. 13(6):421-33]; 및 [Deal et al. "Engineering humoral immunity as prophylaxis or therapy" 2015 Curr Opin Immunol. 35:113-22]을 참조한다. 다른 전달의 경로는 예컨대 코딩 AdV의 비내, 기관내 또는 흉강내 투여를 통한 보다 많은 국소 mAb 생산에 초점을 맞추었다. 종양용해성 벡터로서 AdV의 사용은 특히 종양의 부위에서 코딩된 항체의 생성을 위한 대중적인 접근법이다. 현재 아데노바이러스 유전자 전달 시스템에 의해 전달되는 외래 유전자는 에피솜이며, 따라서, 숙주 세포에 대한 낮은 유전자독성을 갖는다. 따라서, 아데노바이러스 유전자 전달 시스템을 사용한 유전자 요법은 상당히 안전할 수 있다. 본 발명은 구체적으로 아데노바이러스 벡터 및 전달 시스템의 형태로 전달되는 코딩된 아피머 구축물의 발현에 의한 아피머 폴리펩티드의 전달을 고려한다.
아데노바이러스는 그의 중간-크기 게놈, 조작의 용이성, 높은 역가, 폭넓은 표적-세포 범위 및 높은 감염성 때문에 유전자 전달 벡터로서 통상적으로 채용되었다. 바이러스 게놈의 둘 다의 말단은 100 내지 200 bp ITR (반전된 말단 반복부)를 함유하며, 이는 바이러스 DNA 복제 및 패키징에 필요한 시스 요소이다. 게놈의 E1 영역 (E1A 및 E1B)은 바이러스 게놈 및 소수의 세포 유전자의 전사의 조절을 담당하는 단백질을 코딩한다. E2 영역 (E2A 및 E2B)은 바이러스 DNA 복제를 담당하는 단백질을 코딩한다. 지금까지 개발된 아데노바이러스 벡터 중에서, 결실된 E1 영역을 갖는 복제 부적격 아데노바이러스는 통상적으로 사용되며, 본 발명의 코딩된 아피머 구축물을 생성하기 위한 AdV의 한 예시적인 선택을 나타낸다. 아데노바이러스 벡터에서 결실된 E3 영역은 트랜스진에 대한 삽입 부위를 제공할 수 있다 (문헌 [Thimmappaya, B. et al., Cell, 31:543-551(1982)]; 및 [Riordan, J. R. et al., Science, 245:1066-1073(1989)]).
"아데노바이러스 발현 벡터"는 (a) 구축물의 패키징을 지지하고, (b) 아피머 폴리펩티드 (코딩된 아피머 서열)를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현하는 데 충분한 아데노바이러스 서열을 함유하는 그러한 구축물을 포함하는 것을 의미한다. 특정 실시양태에서, 코딩된 아피머에 대한 서열은 DA 프로모터 영역 내로 삽입될 수 있다. 예시적인 실시양태에 따르면, 재조합 아데노바이러스는 결실된 E1B 및 E3 영역을 포함하며, 코딩된 아피머에 대한 뉴클레오티드 서열은 결실된 E1B 및 E3 영역 내로 삽입된다.
아데노-연관된 바이러스 벡터 (AAV)
AAV (또는 재조합 AAV에 대해 "rAAV")는 분열 및 비-분열 세포 둘 다를 감염시킬 수 있는 비-외피화된 작은, 단일-가닥 DNA 바이러스이다. AdV와 유사하게, AAV-기재 벡터는 핵에서 에피솜 상태로 남아 있으며, 통합의 제한된 위험성을 나타낸다. AdV-매개 유전자 전달의 일반적으로 제한된 내구성과 대조적으로, 트랜스진 발현은 근육내 재조합 AAV (rAAV) 벡터 전달 후 수 년 동안 존속할 수 있다.
인간 지질단백질 리파제 유전자를 코딩하는 rAAV인 알리포겐 티파보벡 (Alipogene tiparvovec) (글리베라 (Glybera)™)은 유럽에서 제1 유전자 요법 제품으로서 2012년에 승인되었다. 그 이래로, 다양한 rAAV-기재 유전자 요법 제품이 현재 임상 평가 하에 있다. 항체 유전자 전달의 맥락에서, 다양한 보고는 mAb-코딩 rAAV의 근육내 주사 후 마우스에서 항-인간 면역 결핍 바이러스 (HIV) mAb의 생체내 생산을 입증하였다. 조합 요법에 대한 rAAV 벡터의 잠재성은 또한 즉, 2개의 mAb를 발현시킴으로써 입증되었다. AdV와 유사하게, 근육내 및 정맥내 rAAV 투여는 가장 자주 추구되었다. 문헌 [Deal et al. "Engineering humoral immunity as prophylaxis or therapy" 2015 Curr Opin Immunol. 35:113-22]에서 검토되었다. 두개내, 비내, 유리체내, 경막내, 흉강내, 및 복강내 경로를 비롯한 다양한 추가의 전달 부위는 또한 보다 국소적 치료 효과를 달성하는 것으로 입증되었다. rAAV의 유용성이 항체 유전자 전달에 대해 입증되어, 본 발명은 또한 구체적으로 생체내에서 코딩된 아피머 서열의 전달 및 rAAV 구축물의 발현에 대한 결과로서 환자의 신체에서 아피머 폴리펩티드의 생산을 위한 rAAV 시스템의 사용을 고려한다.
AAV에 대한 한 가지 중요한 특색은 이들 유전자 전달 바이러스가 비-분열 세포 및 다양한 유형의 세포를 감염시킬 수 있다는 것이며, 이는 이들을 이 발명의 코딩된 아피머 전달 시스템을 구축하는 데 유용하게 만든다. 예시적인 AAV 벡터의 용도 및 제조에 대한 상세한 설명은 예를 들어, 미국 특허 제5,139,941호 및 제4,797,368호, 뿐만 아니라 문헌 [LaFace et al., Viology, 162:483486 (1988)], [Zhou et al., Exp. Hematol. (NY), 21:928-933 (1993)], [Walsh et al., J. Clin. Invest., 94:1440-1448(1994)] 및 [Flotte et al., Gene Therapy, 2:29-37(1995)]에서 발견된다. AAV는 그의 안전성으로 인해 전달 비히클의 좋은 선택이며, 즉, 유전적으로 조작된 (재조합)은 숙주 게놈 내로 통합되지 않는다. 마찬가지로, AAV는 병원성이 아니며, 임의의 질환과 연관되지 않는다. 바이러스 코딩 서열의 제거는 바이러스 유전자 발현에 대한 면역 반응을 최소화하며, 따라서, 재조합 AAV는 염증 반응을 유발하지 않는다.
전형적으로, 재조합 AAV 바이러스는 2개의 AAV 말단 반복부에 의해 플랭킹된 관심 유전자 (즉, 아피머 폴리펩티드에 대한 코딩 서열)를 함유하는 플라스미드 (McLaughlin et al., J. Virol., 62:1963-1973(1988); Samulski et al., J. Virol., 63:3822-3828(1989)) 및 말단 반복부를 갖지 않는 야생형 AAV 코딩 서열을 함유하는 발현 플라스미드 (McCarty et al., J. Virol., 65:2936-2945(1991))를 공동-형질감염시킴으로써 제조된다. 전형적으로, 코딩된 아피머 구축물을 함유하는 바이러스 벡터는 아피머 함유 폴리펩티드, 적합한 조절 요소 및 세포 형질도입을 매개하는 코딩된 아피머의 발현에 필요한 요소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로부터 어셈블리된다. 한 실시양태에서, 아데노-연관된 바이러스 (AAV) 벡터가 채용된다. 보다 구체적인 실시양태에서, AAV 벡터는 AAV1, AAV6, 또는 AAV8이다.
AAV ITR에 의해 경계화된 코딩된 아피머 서열을 갖는 AAV 발현 벡터는 선택된 서열(들)을 그로부터 절제된 주요 AAV 오픈 리딩 프레임 ("ORF")을 가진 AAV 게놈 내로 직접적으로 삽입함으로써 구축될 수 있다.
진핵생물 세포에 대해, 발현 제어 서열은 전형적으로 프로모터, 인핸서, 예컨대 이뮤노글로불린 유전자, SV40, 시토메갈로바이러스 등으로부터 유래된 것 (상기 참조), 및 스플라이스 공여자 및 수용자 부위를 포함할 수 있는 폴리아데닐화 서열을 포함한다. 폴리아데닐화 서열은 일반적으로 트랜스진 서열 뒤에 및 3' ITR 서열 앞에 삽입된다.
이들 및 다른 통상적인 벡터 및 조절 요소의 선택은 통상적이며, 많은 이러한 서열이 이용가능하다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al.], 및 예를 들어 페이지 3.18 내지 3.26 및 16.17 내지 16.27에서 그에 인용된 참고문헌, 및 문헌 [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, (1989)]을 참조한다. 물론, 모든 벡터 및 발현 제어 서열이 이 발명의 모든 트랜스진을 발현시키는 데 동등하게 잘 기능하지는 않을 것이다. 그러나, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 이 발명의 범위로부터 벗어나지 않고 이들 발현 제어 서열 중에서 선택할 수 있다. 적합한 프로모터/인핸서 서열은 이 출원에 의해 제공된 지침을 사용하여 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 선택될 수 있다. 이러한 선택은 통상적인 문제이며, 분자 또는 구축물의 제한이 아니다.
레트로바이러스 벡터
코딩된 아피머 구축물의 전달의 맥락에서 유용한 비-세포변성 바이러스로는 레트로바이러스를 들 수 있으며, 그의 생활 주기는 숙주 세포 DNA 내로의 후속의 프로바이러스 통합을 갖는 게놈 바이러스 RNA의 DNA로의 역전사를 포함한다. 레트로바이러스는 인간 유전자 요법 시험에 대해 승인되었다. 가장 유용한 것은 복제-결핍성 (즉, 바람직한 단백질의 합성을 지정할 수 있지만, 감염성 임자를 제조할 수 없는) 그러한 레트로바이러스이다. 이러한 유전적으로 변경된 레트로바이러스 발현 벡터는 생체내에서 유전자의 고-효율성 형질도입을 위한 일반적 유용성을 갖는다. 복제-결핍성 레트로바이러스를 제조하기 위한 표준 프로토콜 (플라스미드 내로의 외인성 유전 물질의 혼입, 플라스미드로 라이닝된 패키징 세포의 형질감염, 패키징 세포주에 의한 재조합 레트로바이러스의 제조, 조직 배양 배지로부터 바이러스 입자의 수집, 및 바이러스 입자로의 표적 세포의 감염의 단계를 포함함)은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다.
레트로바이러스 벡터를 구축하기 위해, 아피머 폴리펩티드 코딩 서열을 특정 바이러스 서열 대신 바이러스 게놈 내로 삽입하여 복제-결핍성 바이러스를 제조한다. 비리온을 생성하기 위해, gag, pol 및 env 유전자를 함유하지만, LTR (긴 말단 반복부) 및 psi (Y) 성분을 갖지 않는 패키징 세포주를 구축한다 (Mann et al., Cell, 33:153-159(1983)). 시토카인 유전자, LTR 및 psi를 함유하는 재조합 플라스미드가 이 세포주 내로 도입되는 경우, psi 서열은 재조합 플라스미드의 RNA 전사체가 바이러스 입자 내로 패키징되는 것을 허용하며, 이는 그 후 배양 배지 내로 분비된다 (Nicolas and Rubinstein "Retroviral vectors," In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodriguez and Denhardt (eds.), Stoneham: Butterworth, 494-513(1988)). 그 후, 재조합 레트로바이러스를 함유하는 배지를 수집하고, 임의로 농축시키고, 유전자 전달 시스템에 사용한다.
이러한 제2-세대 레트로바이러스 벡터를 사용한 성공적인 유전자 전달이 보고되었다. 카사하라 (Kasahara) 등 (Science, 266:1373-1376(1994))은 EPO (에리트로포이에틴) 서열이 외피 영역 대신에 삽입되어, 결과적으로 신규 결합 특성을 갖는 키메라 단백질을 생산하는 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스의 변이체를 제조하였다. 마찬가지로, 본 유전자 전달 시스템은 제2-세대 레트로바이러스 벡터에 대한 구축 전략에 따라 구축될 수 있다.
특정 실시양태에서, 레트로바이러스는 "감마레트로바이러스"이며, 이는 레트로비리다에 과의 속을 지칭한다. 예시적인 감마레트로바이러스로는 마우스 줄기 세포 바이러스, 뮤린 백혈병 바이러스, 고양이 백혈병 바이러스, 고양이 육종 바이러스, 및 조류 망상내피증 바이러스를 들 수 있다.
특정 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 사용하기 위한 레트로바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이며, 이는 분열 및 비-분열 세포를 감염시킬 수 있으며, 전형적으로 높은 바이러스 역가를 생성하는 레트로바이러스의 속을 지칭한다. 렌티바이러스의 몇몇 예로는 HIV (인간 면역결핍 바이러스: HIV 유형 1, 및 HIV 유형 2를 포함함); 말 감염성 빈혈 바이러스; 고양이 면역결핍 바이러스 (FIV); 소 면역 결핍 바이러스 (BIV); 및 원숭이 면역결핍 바이러스 (SIV)를 들 수 있다.
코딩된 아피머의 전달 및 발현에 사용될 수 있는 폭넓게 사용되는 레트로바이러스 벡터의 또다른 부류로는 뮤린 백혈병 바이러스 (MuLV), 긴팔원숭이 백혈병 바이러스 (GaLV) 및 이들의 조합에 기초한 것들을 들 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Buchscher et al., J. Virol. 66:2731-2739, 1992]; [Johann et al., J. Virol. 66: 1635-1640, 1992]; [Sommerfelt et al., Virol. 176:58-59, 1990]; [Wilson et al., J. Virol. 63:2374-2378, 1989]; [Miller et al., J. Virol. 65:2220-2224, 1991]; 및 PCT/US94/05700 참조).
본 발명에 또한 사용될 수 있는 추가의 다른 레트로바이러스 벡터로는 예를 들어, 인간 거품형성 바이러스 (HFV) 또는 스푸마바이러스 (Spumavirus) 속에서의 다른 바이러스에 기초한 벡터를 들 수 있다. 거품형성 바이러스 (FV)는 오늘날 공지된 가장 큰 레트로바이러스이며, 모든 비-인간 영장류 종을 비롯한 상이한 포유동물 중에서 널리 퍼져 있지만, 인간에는 부재한다. 이 완전한 비병원성은 FV 벡터를 인간에서의 유전자 요법을 위한 이상적인 유전자 전달 비히클로 자격부여하며, 유전자 전달 시스템으로서의 FV 벡터를 HIV-유래된 및 또한 감마레트로바이러스-유래된 벡터로부터 명백하게 구별한다.
본원에서 사용하기에 적합한 레트로바이러스 벡터는 예를 들어, 미국 특허 제5,399,346호 및 제5,252,479호에; 및 WIPO 공개 WO 92/07573, WO 90/06997, WO 89/05345, WO 92/05266 및 WO 92/14829에 기재되어 있으며, 이들은 이러한 레트로바이러스 벡터를 사용하여 핵산을 인간 세포 내로 효율적으로 도입하는 방법의 설명을 제공한다. 다른 레트로바이러스 벡터로는 예를 들어, 마우스 유방 종양 바이러스 벡터 (예를 들어, 문헌 [Shackleford et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:9655-9659, 1998]), 렌티바이러스 등을 들 수 있다.
아피머 폴리펩티드를 코딩하는 트랜스진의 전달을 위해 용이하게 조정될 수 있는 추가의 레트로바이러스 바이러스 전달 시스템으로는 단지 예시를 위해 공개된 PCT 출원 WO/2010/045002, WO/2010/148203, WO/2011/126864, WO/2012/058673, WO/2014/066700, WO/2015/021077, WO/2015/148683, WO/2017/040815를 들 수 있다 - 이들 각각의 명세서 및 도면은 본원에 참조로 포함된다.
특정 실시양태에서, 레트로바이러스 벡터는 바이러스 게놈의 패키징 및 통합에 필요한 모든 시스-작용 서열, 즉, (a) 벡터 각각의 말단에 긴 말단 반복부 (LTR), 또는 그의 부분; (b) 음성 및 양성 가닥 DNA 합성을 위한 프라이머 결합 부위; 및 (c) 비리온 내로의 게놈 RNA의 혼입에 필요한 패키징 신호를 함유한다. 레트로바이러스 벡터에 관한 보다 상세사항은 문헌 [Boesen, et al., 1994, Biotherapy 6:291-302]; [Clowes, et al., 1994, J. Clin. Invest. 93:644-651]; [Kiem, et al., 1994, Blood 83: 1467-1473]; [Salmons and Gunzberg, 1993, Human Gene Therapy 4: 129-141]; [Miller, et al., 1993, Meth. Enzymol. 217:581-599]; 및 [Grossman and Wilson, 1993, Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3: 110-114]에서 발견될 수 있다.
특정 실시양태에서, 레트로바이러스는 레트로바이러스 GAG 단백질을 코딩하는 핵산 서열; 레트로바이러스 POL 단백질을 코딩하는 핵산 서열; 레트로바이러스 외피를 코딩하는 핵산 서열; 온코레트로바이러스 폴리뉴클레오티드 서열의 5' 및 3' 말단에 긴-말단 반복부 (LTR) 서열을 포함하는 온코레트로바이러스 폴리뉴클레오티드 서열; 아피머 폴리펩티드에 대한 코딩 서열에 작동적으로 연결된 내부 리보솜 진입 부위 (IRES)를 포함하는 카세트 (여기서, 카세트는 3' LTR의 U3 영역에 대해 5' 및 레트로바이러스 외피를 코딩하는 서열에 대해 3'에 위치함); 및 역전사, 표적 세포에서의 패키징 및 통합을 위한 시스-작용 서열을 포함하는 재조합 복제 적격 레트로바이러스이다.
특정 실시양태에서, 레트로바이러스는 레트로바이러스 GAG 단백질; 레트로바이러스 POL 단백질; 레트로바이러스 외피; 레트로바이러스 폴리뉴클레오티드 서열의 3' 말단에 긴-말단 반복부 (LTR) 서열, 레트로바이러스 폴리뉴클레오티드의 5' 말단에 프로모터 서열 (프로모터는 포유동물 세포에서의 발현에 적합함), gag 핵산 도메인, pol 핵산 도메인 및 env 핵산 도메인을 포함하는 레트로바이러스 폴리뉴클레오티드; 코딩된 아피머 서열을 포함하는 카세트 (여기서, 카세트는 3' LTR의 5'에 위치하고, 작동적으로 연결되며, 레트로바이러스 외피를 코딩하는 env 핵산 도메인에 대해 3'임); 및 역전사, 표적 세포에서의 패키징 및 통합에 필요한 시스-작용 서열을 포함하는 재조합 복제 적격 레트로바이러스이다.
재조합 복제 적격 레트로바이러스의 특정 바람직한 실시양태에서, 외피는 암포트로픽, 폴리트로픽, 제노트로픽, 10A1, GALV, 비비 내인성 바이러스, RD114, 랍도바이러스, 알파바이러스, 홍역 또는 인플루엔자 바이러스 외피 중 1종으로부터 선택된다.
재조합 복제 적격 레트로바이러스의 특정 바람직한 실시양태에서, 레트로바이러스 폴리뉴클레오티드 서열은 뮤린 백혈병 바이러스 (MLV) , 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 (MoMLV) , 고양이 백혈병 바이러스 (FeLV) , 비비 내인성 레트로바이러스 (BEV), 돼지 내인성 바이러스 (PERV), 고양이 유래된 레트로바이러스 RD114, 다람쥐 원숭이 레트로바이러스, 제노트로픽 뮤린 백혈병 바이러스-관련된 바이러스 (XMRV), 조류 망상내피증 바이러스 (REV), 또는 긴팔원숭이 백혈병 바이러스 (GALV)로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스로부터 조작된다.
재조합 복제 적격 레트로바이러스의 특정 바람직한 실시양태에서, 레트로바이러스는 감마레트로바이러스이다.
재조합 복제 적격 레트로바이러스의 특정 바람직한 실시양태에서, 예를 들어, 카세트의 하류에, 제2 치료 단백질, 예컨대 또다른 관문 억제제 폴리펩티드, 공동-자극성 폴리펩티드 및/또는 면역자극성 시토카인 (단지 예로서)에 대한 코딩 서열을 포함하는 제2 카세트가 있다. 특정 예에서, 제2 카세트는 제2 치료 단백질에 대한 코딩 서열에 작동적으로 연결된 내부 리보솜 진입 부위 (IRES) 또는 미니프로모터 또는 polIII 프로모터를 포함할 수 있다.
재조합 복제 적격 레트로바이러스의 특정 바람직한 실시양태에서, 이는 바람직하게는 종양 미세환경의 세포에서 선택적으로 감염시키고 복제하는 비용해성, 암포트로픽 레트로바이러스 복제 벡터이다.
발현 구축물로서의 다른 바이러스 벡터
벡터화된 종양내 코딩된 아피머 유전자 전달의 맥락에서, 종양용해성 바이러스는 이들이 종양 세포를 특이적으로 표적화하고, 치료 아피머 폴리펩티드 발현을 신장시키며, 항종양 치료 반응을 증폭시킬 수 있기 때문에 뚜렷한 이점을 갖는다. 상기 기재된 특정 바이러스 시스템과 중첩되는 종양용해성 바이러스는 선택적 종양 세포 살해 및 전신 항-종양 면역의 유도를 통해 항-종양 반응을 촉진시킨다. 작용의 메커니즘은 완전히 해명되어 있지 않지만, 형질전환된 세포 내의 바이러스 복제, 1차 세포 사멸의 유도, 종양 세포 항-바이러스 요소와의 상호작용 및 선천 및 적응 항-종양 면역의 개시에 의존할 가능성이 있다. 문헌 [Kaufman et al. 2015 "Oncolytic viruses: a new class of immunotherapy drugs" Nat Rev Drug Discov. 14(9):642-62]에 검토되어 있다. 현재 임상에 있는 종양용해성 바이러스 중 많은 것은 암 세포에 의해 비정상적으로 발현되는 세포 표면 단백질에 대한 자연 향성을 갖는다. 지금까지, AdV, 폭스바이러스, 콕사키바이러스, 폴리오바이러스, 홍역 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 레오바이러스, 및 다른 것들은 초기-상 임상 시험으로 들어갔다. 2015년에, FDA 및 EMA는 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF)에 대한 유전자로 무장된 종양용해성 포진 바이러스인 탈리모겐 라허파렙벡 (T-VEC, 임리직 (Imlygic)™)을 승인하였다. 종양용해성 바이러스의 자기-영구화 성질은 이들을 본 발명의 코딩된 아피머 유전자 전달을 위한 매력적인 플랫폼으로 만드는데, 이는 트랜스진 생성물이 바이러스 복제와 함께 증폭될 수 있고, 그에 의해 치료 효과를 최대화하기 때문이다. 문헌 [Liu et al. 2008 "Oncolytic adenoviruses for cancer gene therapy" Methods Mol Biol. 433:243-58].
거대 융합 단백질인, 즉, 단일 아피머 도메인 너머에 다른 단백질 도메인을 포함하는 아피머 폴리펩티드의 경우, 국소 종양내 발현은 문제일 수 있는 경우 고형 종양에서 저조한 침투를 극복하기 위한 매력적인 전략을 제시할 수 있다. 문헌 [Beckman et al. (2007) "Antibody constructs in cancer therapy: protein engineering strategies to improve exposure in solid tumors" Cancer 109(2):170-9]; 및 [Dronca et al. 2015 "Immunomodulatory antibody therapy of cancer: the closer, the better" Clin Cancer Res. 21(5):944-6]. 마찬가지로, 코딩된 아피머 구축물의 종양내 전달 및 아피머 폴리펩티드의 수반 국소 발현은, 용량-제한 독성이 그렇지 않다면 아피머 폴리펩티드가 전신적으로 전달되는 (또는 발현되는) 경우 효능을 위한 유효한 종양내 농도에 도달하는 것을 방지할 수 있는 보다 양호한 치료 지수를 생성할 수 있다.
본 발명의 면역-종양학 활성 아피머 폴리펩티드, 예컨대 관문 억제제 또는 공동자극성 효능제의 경우, 이들 아피머의 면역조정 성질은 종양용해성 바이러스의 사용과 매우 관련된다. 사실, 종양용해성 바이러스 요법을 위해, 면역 관문 억제제 네트워크를 무효화하고, 그에 의해 암 내의 전-염증성 환경을 생성하는 것이 바람직하다. 종양용해성 바이러스 및 통상적인 면역조정성 mAb 투여의 조합을 평가하기 위한 다수의 임상 시험은 현재 진행중이다. 문헌 [Kaufman et al. 2015 "Oncolytic viruses: a new class of immunotherapy drugs" Nat Rev Drug Discov. 14(9):642-62]; 및 [Lichty et al. 2014 "Going viral with cancer immunotherapy" Nat Rev Cancer. 14(8):559-67]. 그러나, 관문-차단 mAb로의 전신 치료는 중증 면역-관련된 유해 효과를 초래할 수 있으며, 이는 예를 들어 코딩된 아피머-무장된 종양용해성 바이러스를 통한 국소 요법에 대한 기회를 강조한다. 상이한 연구는 이 접근법을 추구하였으며, 대상 코딩된 아피머와 함께 사용하기 위해 용이하게 조정될 수 있다. 디아스 (Dias) 등은 항-인간 CTLA-4 mAb를 갖는 복제-결핍성 및 -적격 종양용해성 AdV를 무장하였다. 문헌 [Dias et al. 2012 "Targeted cancer immunotherapy with oncolytic adenovirus coding for a fully human monoclonal antibody specific for CTLA-4" Gene Ther. 19(10):988-98]. 최근 기재된 (및 본 발명의 코딩된 아피머와 함께 사용하기 위해 조정될 수 있는) 또다른 시스템은 항-뮤린 프로그래밍된 세포 사멸 단백질 1 (PD-1) Fab, scFv 또는 전장 mAb를 갖는 무장된 종양용해성 우두 바이러스를 포함하였다. 바이러스 복제를 반영하여, 종양에서의 mAb 수준은 종양 모델에 따라 9 또는 30 μg/ml로의 종양내 주사 후 3 내지 5일에 피크가 되었다. 혈청 mAb 수준은 비록 3배 이상 더 낮지만 동일한 경향을 따랐지만, mAb 검출은 5일 후에 소실되었다. 종양내로 발현된 mAb는 항-PD-1 mAb 단백질의 종양내 주사에 비해 더 길게 지속되었으며, 추적은 주사 후 11일에 제한되었다. Fab 및 scFv 발현은 보고되지 않았다. 항-PD-1 scFv 또는 mAb 중 어느 하나로 무장된 바이러스의 항-종양 반응은 비무장된 바이러스보다 우수하며, 비무장된 바이러스 및 전신 항-PD-1 mAb 단백질 주사의 조합만큼 유효하였다. 문헌 [Kleinpeter et al. 2016 "Vectorization in an oncolytic vaccinia virus of an antibody, a Fab and a scFv against programmed cell death-1 (PD-1) allows their intratumoral delivery and an improved tumor-growth inhibition" Oncoimmunology. 5(10):e1220467 (온라인)]. 또한 최근, 항-PD-L1 미니-항체 (scFv CH2-CH3 융합 단백질)로 무장된, 종양용해성 AdV 및 헬퍼-의존성 AdV의 조합의 종양내 투여는 마우스에서 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포 요법의 항-종양 효과를 개선시켰다. 국소적으로 생성된 항-PD-L1 미니-항체의 유익은 항-PD-L1 IgG 주입 더하기 CAR T-세포 및 비무장된 AdV의 공동-투여에 의해 달성될 수 없었다. 문헌 [Tanoue et al 2017 "Armed oncolytic adenovirus expressing PD-L1 mini-body enhances anti-tumor effects of chimeric antigen receptor T-cells in solid tumors" Cancer Res. 77(8):2040-51]. 특히 CAR-T 세포 요법과의 조합에서 그 시스템의 사용은 또한 코딩된 아피머를 표적 종양에 전달하는 데 사용하기 위해 고려된다.
다른 바이러스 벡터는 본 발명에서 유전자 전달 시스템으로서 채용될 수 있다. 바이러스, 예컨대 우두 바이러스 (Puhlmann M. et al., Human Gene Therapy, 10:649-657(1999); Ridgeway, "Mammalian expression vectors," In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses. Rodriguez and Denhardt, eds. Stoneham: Butterworth, 467-492(1988); Baichwal and Sugden, "Vectors for gene transfer derived from animal DNA viruses: Transient and stable expression of transferred genes," In: Kucherlapati R, ed. Gene transfer. New York: Plenum Press, 117-148(1986) 및 Coupar et al., Gene, 68:1-10(1988)), 렌티바이러스 (Wang G. et al., J. Clin. Invest., 104(11):R55-62(1999)), 단순 포진 바이러스 (Chamber R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 92:1411-1415(1995)), 폭스바이러스 (GCE, NJL, Krupa M, Esteban M., The poxvirus vectors MVA and NYVAC as gene delivery systems for vaccination against infectious diseases and cancer Curr Gene Ther 8(2):97-120(2008)), 레오바이러스, 홍역 바이러스, 셈리키 삼림 바이러스, 및 폴리오바이러스로부터 유래된 벡터는 세포 내로 관심 유전자를 전달하기 위한 본 전달 시스템에 사용될 수 있다. 이들은 다양한 포유동물 세포에 대해 몇몇 매력적인 특색을 제공한다. 또한, B형 간염 바이러스가 포함된다.
b. 비-바이러스 벡터
1990년에, 울프 (Wolff) 등은 마우스의 골격근 내로의 네이키드 플라스미드 DNA (pDNA)의 주사가 어떻게 DNA-기재 치료제의 분야에 시동을 거는 코딩된 단백질의 국소 발현을 초래하였는 지를 보였다. 문헌 [Wolff et al. 1990 "Direct gene transfer into mouse muscle in vivo" Science. 247(4949 Pt 1):1465-8]을 참조한다. 본 발명의 코딩된 아피머를 전달하기 위한 "pDNA"의 사용은 생물학적 벡터로서 바이러스에 대한 필요를 면제하며, 코딩된 아피머 유전자 전달을 위한 매력적인 플랫폼을 제시한다. 바이러스 벡터에 비해, pDNA는 저-면역원성 (예를 들어 반복된 투여를 허용함)인 것으로 간주되고, 제조, 선적 및 저장하기에 보다 저렴하며, 훨씬 더 긴 저장-수명을 갖는다. 핵에 진입 후, pDNA는 비-복제 비-통합 에피솜 상태로 남아 있으며, 유사분열에서 핵 외피의 파괴 동안 소실된다. pDNA는 바이러스 벡터에 비해 트랜스진의 크기에 관한 한정된 제한을 갖지 않고, 그의 모듈 성질은 간단한 분자 클로닝을 허용하며, 이는 이들을 치료 용도를 위해 조작하고 설계하기에 용이하게 만든다. 문헌 [Hardee et al. 2017 "Advances in non-viral DNA vectors for gene therapy" Genes. 8(2):65]. 플라스미드는 진행중인 또는 완료된 유전자 요법 임상 시험의 약 17％에 사용되며, 양호하게 내성화되고 안전한 것으로 나타났다.
DNA 투여의 방법은 트랜스진 발현에 크게 영향을 미칠 수 있다. 생체내 DNA-매개 코딩된 아피머 유전자 전달은 항체 유전자 전달에 사용되는 형질감염의 이러한 물리적 방법, 예컨대 전기천공 또는 수력학 주사를 이용할 수 있다. 전기천공은 조직 내의 전기장의 전파를 제공하며, 이는 세포막 투과성의 일시적 증가를 유도한다. DNA의 전기전달은 (i) 형질막을 향한 DNA의 전기영동적 이동, (ii) DNA 축적 및 형질막과의 상호작용, 및 (iii) 유전자 발현이 시작된 후에, 핵으로의 DNA의 세포내 트래피킹을 포함하는 다단계 프로세스이다. 문헌 [Heller LC. 2015 "Gene electrotransfer clinical trials" Adv Genet. 89:235-62]. 근육내, 종양내 및 진피내 투여는 임상 시험에서 평가되었으며, 또한 코딩된 아피머 구축물의 전기천공을 위한 적합한 표적 조직이다.
수력학-기재 형질감염은 DNA 분자를 혈액 순환으로부터 및 조직 내로 유도하는, 고 부피의 pDNA의 정맥내 주사를 이용한다. 다른 잠재적으로 덜 침습성인 물리적 전달 방법으로는 초음파천공 및 자기감염을 들 수 있다. DNA 흡수는 또한 분자를 화학적 전달 비히클 (예를 들어 양이온성 지질 또는 중합체 및 지질 나노입자)과 복합체화함으로써 개선될 수 있다. 이러한 기법은 또한 생체내 DNA-매개 코딩된 아피머 유전자 전달에 적용될 수 있다.
전달 방법의 선택 외에도, 코딩된 아피머 트랜스진 발현은 pDNA 구축물의 구성을 변형시킴으로써 개선될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Hardee et al. 2017 "Advances in non-viral DNA vectors for gene therapy" Genes 8(2):65]; 및 [Simcikova et al. 2015 "Towards effective non-viral gene delivery vector" Biotechnol Genet Eng Rev. 31(1-2):82-107]을 참조한다. 통상적인 pDNA는 전사 단위 및 박테리아 백본으로 이루어진다. 전사 단위는 코딩된 아피머 서열을 조절 요소와 함께 운반한다. 박테리아 백본은 항생제 저항성 유전자, 복제 원점, 비메틸화된 CpG 모티프, 및 잠재적으로 은폐성 발현 신호와 같은 요소를 포함한다. 이들 서열의 일부는 플라스미드 DNA의 제조에 요구된다. 그러나, 일반적으로, 치료 코딩된 아피머 유전자 요법을 위해, 박테리아 백본의 존재는 반생산적일 가능성이 있을 것이다. 그러나, 항체 유전자 전달에 이미 사용되었고, 코딩된 아피머 유전자 전달을 위해 용이하게 조정될 수 있는 미니서클 DNA (mcDNA)를 비롯한 선택될 수 있는 다양한 상이한 유형의 이용가능한 최소 벡터가 있다. 미니서클은 재조합, 제한 및/또는 정제의 프로세스를 통해 생성된, 박테리아 서열이 없는 플라스미드 분자이다. Simcikova et al. 2015 상기 문헌. 박테리아 백본의 제거는 보다 높은 형질감염 효율성 및 다양한 조직에서의 연장된 트랜스진 발현을 나타내었다.
또한, 전기천공을 통해 대상체에게 효율적으로 전달될 수 있고, 그 안에 포함된 코딩된 아피머 서열을 발현할 수 있는 선형 핵산, 또는 선형 발현 카세트 ("LEC")가 본원에서 제공된다. LEC는 임의의 포스페이트 백본이 없는 임의의 선형 DNA일 수 있다. LEC는 프로모터, 인트론, 정지 코돈, 및/또는 폴리아데닐화 신호를 함유할 수 있다. 코딩된 아피머 코딩 서열의 발현은 프로모터에 의해 제어될 수 있다.
플라스미드 벡터
특정 실시양태에서, 대상 코딩된 아피머 구축물은 플라스미드 벡터로서 전달된다. 플라스미드 벡터는 관련 기술분야에 광범위하게 기재되었으며, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 예를 들어 상기 인용된 문헌 [Sambrook et al., 1989]을 참조한다. 지난 수 년간, 플라스미드 벡터는 생체내에서 항원-코딩 유전자를 세포에 전달하기 위한 DNA 백신으로서 사용되었다. 이들은 이들이 다른 벡터에 비해 안전성 문제를 감소시켰기 때문에 이에 특히 유리하다. 그러나, 숙주 세포와 혼화성인 프로모터를 갖는 이들 플라스미드는 플라스미드 내의 핵산에 의해 코딩되는 펩티드 에피토프를 발현할 수 있다. 다른 플라스미드는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 추가적으로, 플라스미드는 DNA의 특이적 단편을 제거하고 첨가하는 제한 효소 및 라이게이션 반응을 사용하여 주문 설계될 수 있다. 플라스미드는 다양한 비경구, 점막 및 국소 경로에 의해 전달될 수 있다. 예를 들어, DNA 플라스미드는 근육내, 진피내, 피하, 또는 다른 경로에 의해 주사될 수 있다. 이는 또한 비내 스프레이 또는 액적, 직장 좌제에 의해 및 경구로 투여될 수 있다. 이는 또한 유전자-총을 사용하여 표피 또는 점막 표면 내로 투여될 수 있다. 플라스미드는 금 입자 상으로 건조된 수성 용액으로, 또는 리포솜, 덴드리머, 코킬레이트 및 미세캡슐화를 포함하나 이에 제한되지는 않는 또다른 DNA 전달 시스템과 함께 주어질 수 있다.
생체내에서 코딩된 아피머 구축물을 조직에 전달하기 위해 플라스미드 DNA를 사용하는 것의 적용 및 효율성을 확장시키기 위해, 상이한 접근법이 선행 기술 보고에서 보다 높은 mAb 발현 또는 전체적 효능을 생성하는 원리에 기초하여 추구되었다. 첫번째 전략은 간단히 다중 또는 반복된 pDNA 용량을 제공하는 것에 의존한다. 문헌 [Kitaguchi et al. 2005 "Immune deficiency enhances expression of recombinant human antibody in mice after nonviral in vivo gene transfer" Int J Mol Med 16(4):683-8]; 및 [Yamazaki et al. 2011 "Passive immune-prophylaxis against influenza virus infection by the expression of neutralizing anti-hemagglutinin monoclonal antibodies from plasmids" Jpn J Infect Dis. 64(1):40-9]. 또다른 접근법은 전달 아주번트의 사용과 관련된다. pDNA 전기전달은 근육을 히알루론산을 일시적으로 파괴하여, 세포외 매트릭스의 점도를 감소시키고, DNA 확산을 용이하게 하는 효소인 히알루로니다제로 사전-처리함으로써 향상될 수 있다. 문헌 [Yamazaki et al. 2011, 상기 문헌; 및 문헌 [McMahon et al. 2001 "Optimisation of electrotransfer of plasmid into skeletal muscle by pretreatment with hyaluronidase: increased expression with reduced muscle damage" Gene Ther. 8(16):1264-70]. 항체 유전자 전달을 위해, 이는 30 μg pDNA로 3.5 μg/ml의 혈장 피크 역가를 달성하는 대략 3.5배의 mAb 발현의 증가를 초래하였으며, 코딩된 아피머 유전자 전달을 위해 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 조정될 수 있을 것이다. 추가의 또다른 전략은 항체 또는 카세트 조작에 초점을 맞춘다. 코돈-, RNA- 및 리더 서열-최적화 후, 피크 혈청 mAb 또는 Fab 역가는 '최적화된' pDNA의 근육내 전기전달로 달성되었다. 예를 들어, 문헌 [Flingai et al. 2015 "Protection against dengue disease by synthetic nucleic acid antibody prophylaxis/immunotherapy" Sci Rep. 5:12616]을 참조한다.
플라스미드의 목적은 세포 또는 조직에서 치료 아피머 폴리펩티드로의 핵산 서열의 효율적인 전달 및 그의 발현이다. 특히, 플라스미드의 목적은 높은 카피 수를 달성하고, 플라스미드 불안정성의 잠재적 원인을 회피하고, 플라스미드 선택을 위한 수단을 제공하는 것일 수 있다. 발현에 대해, 핵산 카세트는 카세트 내의 코딩된 아피머의 발현을 위한 필요한 요소를 함유한다. 발현은 플라스미드로의 삽입된 유전자, 핵산 서열 또는 핵산 카세트의 효율적인 전사를 포함한다. 따라서, 한 측면에서, 플라스미드는 아피머 폴리펩티드에 대한 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 코딩된 아피머 구축물의 발현을 위해 제공되며; 또한 전사 단위로 지칭된다. 플라스미드가 에피토프 발현에 적합한 환경에 정치되는 경우, 전사 단위는 아피머 폴리펩티드 및 구축물에서 코딩되는 다른 어떤 것을 발현할 것이다. 전사 단위는 세포 면역 반응 요소 코딩 서열과 전사적으로 연결된 전사 제어 서열을 포함한다. 전사 제어 서열로는 프로모터/인핸서 서열, 예컨대 상기 기재된 바와 같은 시토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터/인핸서 서열을 들 수 있다. 그러나, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 인간 환자 세포를 비롯한 포유동물 세포에서의 발현에 적합한 다양한 다른 프로모터 서열이 공지되어 있음과, 본원에 개시된 구축물에 유사하게 사용될 수 있음을 인식할 것이다. 아피머 폴리펩티드의 발현의 수준은 연관된 프로모터 및 연관된 인핸서 요소의 존재 및 활성화에 의존할 것이다.
특정 실시양태에서, 코딩된 아피머 서열 (바람직한 아피머 폴리펩티드를 코딩함)은 전사, 번역, RNA 안정성 및 복제를 위한 조절 요소 (즉, 전사 제어 서열을 포함함)를 함유하는 발현 플라스미드 내로 클로닝될 수 있다. 이러한 발현 플라스미드는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으며, 통상의 기술자는 생체내에서 재조합 아피머 폴리펩티드를 제조하기 위한 적절한 발현 구축물을 설계할 수 있을 것이다.
미니서클
미니서클 (mcDNA)-기재 항체 유전자 전달은 또한 생체내에서 코딩된 아피머를 조직에 전달하기 위해 조정될 수 있다. 특정 상황 하에서, 비-바이러스 유전자 전달에 사용되는 플라스미드 DNA는 비허용가능한 염증 반응을 유발할 수 있다. 이것이 일어나는 경우, 면역독성 반응은 플라스미드 DNA의 박테리아 번식 후 플라스미드 상의 비메틸화된 CpG 모티프 및 그들의 연관된 조절 서열의 존재에 크게 기인한다. 시험관내에서 DNA의 간단한 메틸화는 염증 반응을 감소시키기에 충분할 수 있지만, 감소된 유전자 발현을 초래할 수 있다. 클로닝 제거에 의한 CpG 섬의 제거, 또는 비-필수 서열의 제거는 염증 반응을 감소시키기 위한 성공적인 기법이었다. 문헌 [Yew et al. 2000 "Reduced inflammatory response to plasmid DNA vectors by elimination and inhibition of immunostimulatory CpG motifs" Mol Ther 1(3), 255-62].
박테리아 DNA는 포유동물 DNA보다 평균 4배 더 많은 CpG 섬을 함유하기 때문에, 우수한 해결책은 박테리아 제어 영역, 예컨대 복제 원점 및 항생제 저항성 유전자를 플라스미드 제조 동안 유전자 전달 벡터로부터 제거하는 것이다. 따라서, "모" 플라스미드는 일반적으로 전달되는 유전자 (이 경우, 코딩된 아피머 코딩 서열) 및 그의 발현에 적합한 제어 영역을 포함하는 "미니서클", 및 일반적으로 모 플라스미드의 나머지를 포함하는 미니플라스미드로 재조합된다.
박테리아 서열의 제거는 단지 유전자 발현 요소로 이루어진 수퍼코일화된 DNA 미니서클을 적절한 --바람직하게는 포유동물-- 제어 영역 하에서 생성하면서, 최소의 가능한 절제 부위를 사용하여 효율적일 필요가 있다. 미니서클 제조를 위한 일부 기법은 박테리아 파지 람다 (λ) 인테그라제 매개 재조합을 사용하여 미니서클 DNA를 제조한다. 예를 들어, 문헌 [Darquet, et al. 1997 Gene Ther 4(12): 1341-9; Darquet et al. 1999 Gene Ther 6(2): 209-18]; 및 [Kreiss, et al. 1998 Appl Micbiol Biotechnol 49(5):560-7)]을 참조한다.
따라서, 본원에 기재된 핵산 구축물의 실시양태는 미니서클 DNA의 형태로 프로세싱될 수 있다. 미니서클 DNA는 모든 원핵생물 벡터 부분으로부터 유리된 작은 (2 내지 4 kb) 원형 플라스미드 유도체와 관련된다. 미니서클 DNA 벡터는 박테리아 DNA 서열을 함유하지 않기 때문에, 이들은 외래물로서 인지되고 파괴될 가능성이 적다. 그 결과, 이들 벡터는 특정 통상적인 플라스미드에 비해 보다 긴 기간 동안 발현될 수 있다. 미니서클의 보다 작은 크기는 또한 그들의 클로닝 용량을 확장시키고, 세포 내로의 그들의 전달을 용이하게 한다. 미니서클 DNA를 제조하기 위한 키트는 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 시판된다 (시스템 바이오사이언시즈, 인크. (System Biosciences, Inc.), 미국 캘리포니아주 팔로 알토). 미니서클 DNA에 대한 정보는 문헌 [Dietz et al., Vector Engineering and Delivery Molecular Therapy (2013); 21 8, 1526-1535] 및 [Hou et al., Molecular Therapy-Methods & Clinical Development, Article number: 14062 (2015) doi:10.1038/mtm.2014.62]에서 제공된다. 미니서클에 대한 보다 많은 정보는 문헌 [Chen Z Y, He C Y, Ehrhardt A, Kay M A. Mol Ther. 2003 September; 8(3):495-500]에서 제공되며, 미니서클 DNA 벡터는 활성 크로마틴 및 전사 수준에 의해 반영되는 지속된 발현을 달성한다. 문헌 [Gracey Maniar L E, Maniar J M, Chen Z Y, Lu J, Fire A Z, Kay M A. Mol Ther. 2013 January; 21(1):131-8].
비제한적 예로서, 미니서클 DNA 벡터는 하기와 같이 제조될 수 있다. 코딩된 아피머 코딩 서열을 그의 발현을 위한 조절 요소와 함께 포함하는 발현 카세트를 리콤비나제에 대한 부착 부위에 의해 플랭킹한다. 리콤비나제를 코딩하는 서열은 발현 카세트의 외부에 위치하며, 유도성 발현을 위한 요소 (예컨대, 예를 들어, 유도성 프로모터)를 포함한다. 리콤비나제 발현의 유도 시, 벡터 DNA는 재조합되어, 2개의 별개의 원형 DNA 분자를 생성한다. 원형 DNA 분자 중 하나는 상대적으로 작고, 코딩된 아피머에 대한 발현 카세트를 포함하는 미니서클을 형성하며; 이 미니서클 DNA 벡터는 임의의 박테리아 DNA 서열이 없다. 제2 원형 DNA 서열은 박테리아 서열 및 리콤비나제를 코딩하는 서열을 비롯한 나머지 벡터 서열을 함유한다. 그 후, 코딩된 아피머 서열을 함유하는 미니서클 DNA는 별개로 단리되고 정제될 수 있다. 특정 실시양태에서, 미니서클 DNA 벡터는 pBAD.Φ.C31.hFIX 및 pBAD.Φ.C31.RHB와 유사한 플라스미드를 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Chen et al. (2003) Mol. Ther. 8:495-500]을 참조한다.
미니서클 DNA 벡터를 생성하는 데 사용될 수 있는 예시적인 리콤비나제로는 스트렙토미세스 (Streptomyces) 박테리오파지 Φ31 인테그라제, Cre 리콤비나제, 및 λ 인테그라제/DNA 토포이소머라제 IV 복합체를 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 이들 리콤비나제 각각은 별개의 부위 사이의 재조합을 촉매한다. 예를 들어, Φ31 인테그라제는 상응하는 attP 및 attB 부위 사이의 재조합을 촉매하고, Cre 리콤비나제는 loxP 부위 사이의 재조합을 촉매하고, λ 인테그라제/DNA 토포이소머라제 IV 복합체는 박테리오파지 λ attP 및 attB 부위 사이의 재조합을 촉매한다. 예를 들어, Φ31 인테그라제를 갖는 또는 λ의 부재 하에서 λ 인테그라제를 갖는 것이 단백질인 것과 같은 특정 실시양태에서, 리콤비나제는 원형 생성물의 고유한 집단 및 따라서 높은 수율을 생성하는 비가역적 반응을 매개한다. 예를 들어, Cre 리콤비나제를 갖는 또는 λ의 존재 하에서 λ 인테그라제를 갖는 것이 단백질인 것과 같은 다른 실시양태에서, 리콤비나제는 원형 생성물의 혼합물 및 따라서 보다 낮은 수율을 생성하는 가역적 반응을 매개한다. Cre 리콤비나제에 의한 가역적 반응은 돌연변이체 loxP71 및 loxP66 부위를 채용함으로써 조작될 수 있으며, 이는 미니서클 분자 상의 기능적으로 손상된 P71/66 부위 및 미니서클 분자 상의 야생형 loxP 부위를 생성하고, 그에 의해 미니서클 DNA 생성물의 제조를 향한 평형을 이동시키는 높은 효율성과 조합한다.
공개된 미국 출원 20170342424는 또한 재조합 부위에서 재조합을 유발하고, 그에 의해 (i) 코딩된 아피머 서열을 포함하는 미니서클 및 (ii) 모 플라스미드의 나머지를 포함하는 미니플라스미드를 형성하는 효소에 노출된 모 플라스미드를 사용하는 시스템을 기재하고 있다. 한 재조합 부위는 효소와의 그의 반응이 야생형 부위보다 덜 효율적이도록 5' 말단에서 변형되고, 다른 재조합 부위는 효소와의 그의 반응의 야생형 부위보다 덜 효율적이도록 3' 말단에서 변형되고, 다른 재조합 부위는 효소와의 그의 반응이 야생형 부위보다 덜 효율적이도록 3' 말단에서 변형되며, 둘 다의 변형된 부위는 재조합 후 미니서클에 위치한다. 이는 미니서클의 형성을 선호한다.
c. RNA-매개 코딩된 아피머 유전자 전달
본 발명의 코딩된 아피머 폴리펩티드에 대한 예시적인 핵산 또는 폴리뉴클레오티드로는 리보핵산 (RNA), 데옥시리보핵산 (DNA), 트레오스 핵산 (TNA), 글리콜 핵산 (GNA), 펩티드 핵산 (PNA), 잠금 핵산 (LNA, β-D-리보 배위를 갖는 LNA, a-L-리보 배위를 갖는 a-LNA (LNA의 부분입체이성질체), 2'-아미노 관능화를 갖는 2'-아미노-LNA, 및 2'-아미노 관능화를 갖는 2'-아미노-a-LNA를 포함함), 에틸렌 핵산 (ENA), 시클로헥세닐 핵산 (CeNA) 또는 이들의 혼성체 또는 조합을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
mRNA는 본 발명의 코딩된 아피머 구축물의 전달을 위해 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 조정될 수 있는 항체 유전자 전달을 위한 신흥 플랫폼을 제시한다. 현재의 결과는 상당히 상이하지만, 특정 예에서, mRNA 구축물은 생성된 혈청 mAb 역가의 관점에서 바이러스 벡터를 경쟁할 수 있는 것으로 보인다. 수준은 DNA에 비해 속도에서 현저한 이동인 mRNA 투여 후 수 시간 내의 치료적으로 관련된 범위에 있었다. DNA에 전형적으로 요구되는 물리적 방법이라기 보다는, mRNA 형질감염을 위한 지질 나노입자 (LNP)의 사용은 특정 실시양태에서 적용 범위에 대한 상당한 이점을 제공할 수 있다.
그들의 1990년 연구에서, 울프 등 (1990, 상기 문헌)은 pDNA 외에도, 시험관내에서 전사된 (IVT) mRNA의 근육내 주사가 또한 코딩된 단백질의 국소 발현을 초래하였음을 밝혀내었다. mRNA는 그의 낮은 안정성 때문에 그 때 DNA만큼 활발하게 추구되지 않았다. 지난 수 년에 걸친 진보는 mRNA가 유전자 전달을 위한 도구로서 DNA 및 바이러스 벡터를 따라잡는 것을 허용하였다. 문헌 [Sahin et al. (2014) "mRNA-based therapeutics: developing a new class of drugs" Nat Rev Drug Discov. 13(10):759-80]에서 검토되었다. 개념적으로, 이들 발현 플랫폼과는 몇몇 차이점이 있다. mRNA는 기능성이 되기 위해 핵 내로 진입할 필요가 없다. 이것이 세포질에 도달하면, mRNA는 즉시 번역된다. mRNA-기재 치료제는 DNA- 또는 바이러스 벡터-매개 유전자 전달에 비해 보다 일시적으로 발현되며, 숙주 게놈에서 삽입 돌연변이유발의 위험성을 제기하지 않는다. mRNA 제조는 상대적으로 간단하며 저렴하다. 투여의 관점에서, mRNA 흡수는 전기천공을 사용하여 향상될 수 있다. 문헌 [Broderick et al. 2017 "Enhanced delivery of DNA or RNA vaccines by electroporation" Methods Mol Biol. 2017;1499:193-200]. 그러나, 대부분의 초점은 비-물리적 형질감염 방법으로 나아갔다. 사실, 지질 나노입자 (LNP)를 비롯한 다양한 mRNA 복합 제형이 개발되었으며, 이는 다양한 조직에서 및 정맥내에서 투여를 위한 안전하고 매우 효율적인 mRNA 운반체인 것으로 입증되었다. 문헌 [Pardi et al. 2015 "Expression kinetics of nucleoside-modified mRNA delivered in lipid nanoparticles to mice by various routes" J Control Release 217:345-51]. 이 진보에 따라, IVT mRNA는 임상 평가의 단계에 도달하였다.
바이서트 (Beissert) 등의 WO2017162266 "다목적 및 효율적 유전자 발현을 위한 RNA 레플리콘"은 본 발명의 아피머의 효율적인 발현에 적합한, 예컨대 종양의 예방 및 요법을 위한 면역치료적 치료에 적합한 작용제 및 방법을 기재하고 있다. 예를 들어, 아피머 폴리펩티드 코딩 서열은 예컨대 알파바이러스 5' 복제 인식 서열로부터의 5' 복제 인식 서열을 포함하는 RNA 레플리콘으로서 제공될 수 있다. 특정 실시양태에서, RNA 레플리콘은 예컨대 5' 복제 인식 서열 및 오픈 리딩 프레임이 중첩되지 않는, 예를 들어 5' 복제 인식 서열이 기능적 개시 코돈을 함유하지 않고, 바람직하게는 임의의 개시 코돈을 함유하지 않는, (변형된) 5' 복제 인식 서열, 및 특히 5' 복제 인식 서열로부터 하류에 위치한, 아피머 폴리펩티드를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 가장 바람직하게는, 아피머 폴리펩티드를 코딩하는 오픈 리딩 프레임의 개시 코돈은 RNA 레플리콘의 5'→ 3' 방향에 있다.
특정 실시양태에서, 면역 활성화를 방지하기 위해, 변형된 뉴클레오시드는 시험관내에서-전사된 mRNA 내로 혼입될 수 있다. 특정 실시양태에서, IVT RNA는 5' 캡핑될 수 있으며, 예컨대 m7G5'ppp5'G2'-O-Met-캡핑된 IVT이다. 변형된 mRNA의 효율적인 번역은 이중-가닥 RNA를 제거함으로써 보장될 수 있다. 더욱이, 5' 및 3' UTR 및 폴리(A) 꼬리는 개선된 세포내 안정성 및 번역 효율성을 위해 최적화될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Stadler et al. (2017) Nature Medicine 23:815-817] 및 카리코 (Kariko) 등의 WO/2017/036889 "RNA의 면역원성을 감소시키는 방법"을 참조한다.
특정 실시양태에서, 아피머 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA는 본원에 기재된 적어도 하나의 화학적 변형을 포함할 수 있다. 비-제한적 예로서, 화학적 변형은 1-메틸슈도우리딘, 5-메틸시토신 또는 1-메틸슈도우리딘 및 5-메틸시토신일 수 있다. 한 실시양태에서, 단지 시험관내 전사 (IVT) 효소적 합성 방법을 사용하여 제조되는 본 발명의 1종 이상의 아피머 폴리펩티드를 코딩하는 선형 폴리뉴클레오티드는 "IVT 폴리뉴클레오티드"로 지칭된다. IVT 폴리뉴클레오티드를 제조하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고, PCT 출원 WO2013/151666에 기재되어 있으며, 그의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
또다른 실시양태에서, 본 발명의 아피머 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 크기 및/또는 화학적 변형 패턴, 화학적 변형 위치, 화학적 변형 퍼센트 또는 화학적 변형 집단이 상이한 부분 또는 영역을 가지며, 상기의 조합은 "키메라 폴리뉴클레오티드"로 공지되어 있다. 본 발명에 따른 "키메라"는 2개 이상의 부조화되거나 이종의 부분 또는 영역을 갖는 실체이다. 본원에 사용된 바와 같은 폴리뉴클레오티드 "부분" 또는 "영역"은 폴리뉴클레오티드의 전체 길이 미만인 폴리뉴클레오티드의 임의의 부분으로 정의된다. 이러한 구축물은 예를 들어 PCT 출원 WO2015/034928에 교시되어 있다.
추가의 또다른 실시양태에서, 원형인 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 "원형 폴리뉴클레오티드" 또는 "circP"로 공지되어 있다. 본원에 사용된 바와 같은 "원형 폴리뉴클레오티드" 또는 "circP"는 RNA와 실질적으로 같고, 그의 특성을 갖는 단일 가닥 원형 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 용어 "원형"은 또한 circP의 임의의 2차 또는 3차 배위를 포괄하는 것으로 의미된다. 이러한 구축물은 예를 들어 PCT 출원 WO2015/034925 및 WO2015/034928에 교시되어 있으며, 이들 각각의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
본 발명의 아피머 폴리펩티드를 코딩하는 데 사용될 수 있는 예시적인 mRNA (및 다른 폴리뉴클레오티드)로는 WO2015/105926 (이는 발명의 명칭이 "항체의 생체내 생산을 위한 폴리뉴클레오티드"임)과 함께, 예를 들어, PCT 공개 WO2017/049275, WO2016/118724, WO2016/118725, WO2016/011226, WO2015/196128, WO/2015/196130, WO/2015/196118, WO/2015/089511의 명세서 및 도면으로부터 조정될 수 있는 것들을 들 수 있으며, 이들 각각은 본원에 참조로 포함된다.
하기 기재된 바와 같이 전기천공은 세포 내로 mRNA 또는 다른 폴리뉴클레오티드를 도입하기 위한 한 예시적인 방법이다.
지질-함유 나노입자 조성물은 다양한 RNA (및 본원에 기재된 관련된 폴리뉴클레오티드)를 위한 세포 및/또는 세포내 구획 내로의 수송 비히클로서 효과적인 것으로 입증되었다. 이들 조성물은 일반적으로 1종 이상의 "양이온성" 및/또는 이온화가능한 지질, 다가불포화된 지질을 비롯한 인지질, 구조적 지질 (예를 들어, 스테롤), 및 폴리에틸렌 글리콜을 함유하는 지질 (PEG 지질)을 포함한다. 양이온성 및/또는 이온화가능한 지질로는 예를 들어, 용이하게 양성자화될 수 있는 아민-함유 지질을 들 수 있다.
d. 표적 세포 내로의 코딩된 아피머 구축물의 전달
유전자 전달 시스템의 숙주 세포 내로의 도입은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다양한 방법을 통해 수행될 수 있다.
본 유전자 전달 시스템이 바이러스 벡터 구축에 기초하여 구축되는 경우, 전달은 관련 기술분야에 공지된 통상적인 감염 방법으로서 수행될 수 있다.
바이러스 및 비-바이러스 코딩된 아피머 구축물 둘 다의 전달을 향상시키기 위한 물리적 방법으로는 전기천공 (문헌 [Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)]; 및 [Tur-Kaspa et al., Mol. Cell Biol., 6:716-718(1986)]), DNA가 (예를 들어, 금) 입자 상으로 로딩되고, 세포 내로의 DNA의 침투를 달성하도록 강제되는 유전자 포격 (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572 (1990)), 초음파천공, 자기천공, 수력학 전달 등을 들 수 있으며, 이들 모두는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다.
전기천공
과거 몇 년간, 단백질의 생체내 생산에 이용되는 플라스미드 DNA 전달 기술의 큰 진보가 있었다. 이는 인간 세포에서의 발현을 위한 코돈 최적화, mRNA 안정성 뿐만 아니라 리보솜 수준에서 보다 효율적인 번역을 개선시키기 위한 RNA 최적화, 번역 효율성을 향상시키기 위한 특이적 리더 서열의 첨가, 생체내에서의 생산을 추가로 향상시키기 위한 합성 삽입물의 생성, 및 생체내 전달을 개선시키기 위한 개선된 적응성 전기천공 (EP) 전달 프로토콜의 사용을 포함하였다. EP는 DNA가 세포 내로 보다 효율적으로 통과하는 것을 허용하는 전기장을 생성함으로써 플라스미드 DNA의 전달에 도움을 준다. 생체내 전기천공은 많은 상이한 조직으로의 플라스미드 DNA의 효율적인 전달에 성공적으로 사용된 유전자 전달 기법이다. 문헌 [Kim et al. "Gene therapy using plasmid DNA-encoded anti-HER2 antibody for cancers that overexpress HER2" (2016) Cancer Gene Ther. 23(10): 341-347]은 혈청에서 높고 지속된 항체 발현을 초래하는 플라스미드의 근육내 주사 및 생체내 전기천공을 위한 벡터 및 전기천공 시스템을 교시하고 있으며; 킴 (Kim) 등의 플라스미드 및 전기천공 시스템은 본 발명의 코딩된 아피머를 발현시키기 위한 플라스미드의 생체내 전달을 위해 용이하게 조정될 수 있다.
따라서, 본 개시내용의 어떤 특정 실시양태에서, 코딩된 아피머 구축물은 전기천공을 통해 표적 세포 내로 도입된다.
전기천공을 통한 조성물의 투여는 포유동물의 바람직한 조직에 전달되도록 구성될 수 있는 전기천공 장치, 가역적 기공이 세포막에서 형성되도록 하는 데 유효한 에너지의 펄스를 사용하여 달성될 수 있으며, 에너지의 펄스는 사용자에 의한 미리-설정된 전류 투입과 유사한 일정한 전류인 것이 바람직하다. 전기천공 장치는 전기천공 성분 및 전극 어셈블리 또는 취급 어셈블리를 포함할 수 있다. 전기천공 성분은 컨트롤러, 전류 파형 생성기, 임피던스 시험기, 파형 로거, 투입 요소, 상태 보고 요소, 통신 포트, 기억 성분, 전력 공급원, 및 전력 스위치를 비롯한 전기천공 장치의 다양한 요소 중 1종 이상을 포함하거나 혼입할 수 있다. 전기천공은 플라스미드에 의한 세포의 형질감염을 용이하게 하는 생체내 전기천공 장치, 예를 들어 셀렉트라 (CELLECTRA) EP 시스템 (브이지엑스 파마슈티칼즈 (VGX Pharmaceuticals), 미국 펜실베니아주 블루 벨) 또는 엘겐 (Elgen) 전기천공기 (진트로닉스, 미국 캘리포니아주 샌 디에고)를 사용하여 달성될 수 있다.
전기천공 성분은 전기천공 장치의 한 요소로서 기능할 수 있으며, 다른 요소는 전기천공 성분과 통신하는 별개의 요소 (또는 성분)이다. 전기천공 성분은 전기천공 장치의 하나 초과의 요소로서 기능할 수 있으며, 이는 전기천공 성분과는 별개의 전기천공 장치의 추가의 다른 요소와 통신할 수 있다. 한 전기기계적 또는 기계적 장치의 부분으로서 존재하는 전기천공 장치의 요소는 요소가 한 장치로서 또는 서로 통신하는 별개의 요소로서 기능할 수 있기 때문에 제한되지 않을 수 있다. 전기천공 성분은 바람직한 조직에서 일정한 전류를 생성하는 에너지의 펄스를 전달할 수 있으며, 피드백 메커니즘을 포함한다. 전극 어셈블리는 공간 배열에서 복수의 전극을 갖는 전극 어레이를 포함할 수 있으며, 여기서 전극 어셈블리는 전기천공 성분으로부터 에너지의 펄스를 송신하고, 이를 전극을 통해 바람직한 조직에 전달한다. 복수의 전극 중 적어도 하나는 에너지의 펄스의 전달 동안 중성이고, 바람직한 조직에서 임피던스를 측정하며, 임피던스를 전기천공 성분에 통신한다. 피드백 메커니즘은 측정된 임피던스를 송신할 수 있으며, 전기천공 성분에 의해 전달된 에너지의 펄스를 일정한 전류를 유지하도록 조정할 수 있다.
복수의 전극은 에너지의 펄스를 분산된 패턴으로 전달할 수 있다. 복수의 전극은 프로그래밍된 서열 하에서 전극의 제어를 통해 분산된 패턴으로 에너지의 펄스를 전달할 수 있으며, 프로그래밍된 서열은 사용자에 의해 전기천공 성분으로 투입된다. 프로그래밍된 서열은 서열에 전달된 복수의 펄스를 포함할 수 있으며, 여기서 복수의 펄스 각각의 펄스는 임피던스를 측정하는 1개의 중성 전극을 갖는 적어도 2개의 활성 전극에 의해 전달되며, 복수의 펄스의 후속 펄스는 임피던스를 측정하는 1개의 중성 전극을 갖는 적어도 2개의 활성 전극 중 상이한 1개에 의해 전달된다.
피드백 메커니즘은 하드웨어 또는 소프트웨어 중 어느 하나에 의해 수행될 수 있다. 피드백 메커니즘은 아날로그 폐쇄된-루프 회로에 의해 수행될 수 있다. 피드백은 50 μs, 20 μs, 10 μs 또는 1 μs마다 일어나지만, 바람직하게는 실시간 피드백 또는 순간적 (즉, 반응 시간을 측정하기 위한 이용가능한 기법에 의해 측정된 바와 같이 실질적으로 순간적)이다. 중성 전극은 바람직한 조직에서 임피던스를 측정하고, 임피던스를 피드백 메커니즘에 통신하며, 피드백 메커니즘은 임피던스에 반응하고, 에너지의 펄스를 미리-설정된 전류와 유사한 값에서 일정한 전류를 유지하도록 조정한다. 피드백 메커니즘은 일정한 전류를 에너지의 펄스의 전달 동안 연속적으로 및 순간적으로 유지할 수 있다.
본 발명의 코딩된 아피머 구축물의 전달을 용이하게 할 수 있는 전기천공 장치 및 전기천공 방법의 예로는 미국 특허 제7,245,963호; 제6,302,874호; 제5,676,646호; 제6,241,701호; 제6,233,482호; 제6,216,034호; 제6,208,893호; 제6,192,270호; 제6,181,964호; 제6,150,148호; 제6,120,493호; 제6,096,020호; 제6,068,650호; 및 제5,702,359호에 기재된 것들을 들 수 있으며, 이들의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 전기천공은 최소 침습성 장치를 통해 수행될 수 있다.
특정 실시양태에서, 전기천공은 최소 침습성 전기천공 장치 ("MID")를 사용하여 수행된다. 장치는 중공 바늘, DNA 카세트, 및 유체 전달 수단을 포함할 수 있으며, 여기서 장치는 신체 조직 내로의 바늘의 삽입 동안 코딩된 아피머 핵산 구축물을 신체 조직 내로 동시에 (예를 들어, 자동적으로) 주사하도록 사용에서 유체 전달 수단을 작동시키도록 조정된다. 이는 바늘이 삽입되고 있는 동안 DNA 및 연관된 유체를 점차적으로 주사하는 능력이 신체 조직을 통한 유체의 보다 고른 분포를 초래하는 이점을 갖는다. 주사 동안 경험되는 통증은 보다 큰 면적에 걸쳐 주사되는 DNA의 분포로 인해 감소될 수 있다.
MID는 바늘을 사용하지 않고 코딩된 아피머 핵산 구축물을 조직 내로 주사할 수 있다. MID는 코딩된 아피머 핵산 구축물을 핵산이 조직의 표면을 뚫고, 기저의 조직 및/또는 근육으로 진입하는 그러한 힘을 갖는 작은 스트림 또는 제트로서 주사할 수 있다. 작은 스트림 또는 제트 뒤의 힘은 1초의 몇분의 1 내에서 미세-오리피스를 통한 압축된 기체, 예컨대 이산화탄소의 팽창에 의해 제공될 수 있다. 최소 침습성 전기천공 장치, 및 이를 사용하는 방법의 예는 공개된 미국 특허 출원 제20080234655호; 미국 특허 제6,520,950호; 미국 특허 제7,171,264호; 미국 특허 제6,208,893호; 미국 특허 제6,009,347호; 미국 특허 제6,120,493호; 미국 특허 제7,245,963호; 미국 특허 제7,328,064호; 및 미국 특허 제6,763,264호에 기재되어 있으며, 이들 각각의 내용은 본원에 참조로 포함된다.
MID는 조직을 통증없이 뚫는 액체의 고속 제트를 생성하는 인젝터를 포함할 수 있다. 이러한 무바늘 인젝터는 시판된다. 본원에서 이용될 수 있는 무바늘 인젝터의 예로는 미국 특허 제3,805,783호; 제4,447,223호; 제5,505,697호; 및 제4,342,310호에 기재된 것들을 들 수 있으며, 이들 각각의 내용은 본원에 참조로 포함된다.
직접적 또는 간접적 전기수송에 적합한 형태의 바람직한 코딩된 아피머 핵산 구축물은 통상적으로 조직 내로의 핵산의 침투를 유발하기에 충분한 힘으로, 작용제의 제트의 전달을 작동시키도록 조직 표면을 인젝터와 접촉시킴으로써, 무바늘 인젝터를 사용하여 치료되는 조직 내로 도입될 (예를 들어, 주사될) 수 있다. 예를 들어, 치료되는 조직이 점막, 피부 또는 근육인 경우, 작용제는 작용제가 각질층을 통해 및 진피층 내로, 또는 기저의 조직 및 근육 내로 각각 침투하도록 하는 충분한 힘으로 점막 또는 피부 표면을 향해 발사된다. 무바늘 인젝터는 코딩된 아피머 핵산 구축물을 종양 내로 (종양내 전달)를 비롯한 모든 유형의 조직으로 전달하는 데 매우 적합하다.
MID는 조직을 전기천공하는 바늘 전극을 가질 수 있다. 예를 들어 직사각형 또는 정사각형 패턴으로 설정된 다수의 전극 어레이에서 다수의 쌍의 전극 사이에 펄싱함으로써, 한 쌍의 전극 사이에 펄싱하는 것에 비해 개선된 결과를 제공한다. 예를 들어, 발명의 명칭이 "약물 및 유전자의 매개된 전달을 위한 바늘 전극"인 미국 특허 제5,702,359호에는 복수의 쌍의 바늘이 치료적 치료 동안 펄싱될 수 있는 바늘의 어레이가 개시되어 있다. 완전히 제시된 것처럼 본원에 참조로 포함되는 그 출원에서, 바늘은 원형 어레이로 배치되었지만, 바늘 전극의 대향하는 쌍 사이의 펄싱을 가능하게 하는 커넥터 및 스위칭 장치를 갖는다. 코딩된 아피머 핵산 구축물을 세포에 전달하기 위한 한 쌍의 바늘 전극이 사용될 수 있다. 이러한 장치 및 시스템은 미국 특허 제6,763,264호에 기재되어 있으며, 그의 내용은 본원에 참조로 포함된다. 대안적으로, 통상적인 주사 바늘을 닮은 단일 주사로의 DNA의 주사 및 전기천공을 허용하며, 현재 사용되는 장치에 의해 전달되는 것들보다 더 낮은 전압의 펄스를 인가하고, 따라서 환자에 의해 경험되는 전기적 감각을 감소시키는 단일 바늘 장치가 사용될 수 있다.
MID는 1개 이상의 전극 어레이를 포함할 수 있다. 어레이는 동일한 직경 또는 상이한 직경의 2개 이상의 바늘을 포함할 수 있다. 바늘은 고르게 또는 고르지 않게 떨어진 간격일 수 있다. 바늘은 0.005 인치 내지 0.03 인치, 0.01 인치 내지 0.025 인치; 또는 0.015 인치 내지 0.020 인치일 수 있다. 바늘은 직경이 0.0175 인치일 수 있다. 바늘은 0.5 mm, 1.0 mm, 1.5 mm, 2.0 mm, 2.5 mm, 3.0 mm, 3.5 mm, 4.0 mm 이상 떨어진 간격일 수 있다.
MID는 코딩된 아피머 핵산 구축물 및 전기천공 펄스를 단일 단계로 전달하는 펄스 생성기 및 2개 이상의-바늘 백신 인젝터로 이루어질 수 있다. 펄스 생성기는 플래쉬 카드 작동된 퍼스널 컴퓨터를 통한 펄스 및 주사 파라미터의 유연한 프로그래밍, 뿐만 아니라 전기천공 및 환자 데이터의 포괄적 기록 및 저장을 허용할 수 있다. 펄스 생성기는 짧은 기간 동안 다양한 볼트 펄스를 전달할 수 있다. 예를 들어, 펄스 생성기는 지속기간으로 100 ms의 3개의 15 볼트 펄스를 전달할 수 있다. 이러한 MID의 예는 그의 내용이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 제7,328,064호에 기재된 이노비오 바이오메디칼 코포레이션 (Inovio Biomedical Corporation)에 의한 엘겐 1000 시스템이다.
MID는 신체에서의 선택된 조직의 세포 내로 거대분자, 예컨대 코딩된 아피머 핵산 구축물의 도입을 용이하게 하는 모듈 전극 시스템인 셀렉트라 (이노비오 파마슈티칼스 (Inovio Pharmaceuticals), 미국 펜실베니아주 플리마우스 미팅) 장치 및 시스템일 수 있다. 모듈 전극 시스템은 복수의 바늘 전극; 피하 바늘; 프로그래밍가능한 정전류 펄스 컨트롤러로부터 복수의 바늘 전극으로 전도성 연결을 제공하는 전기 커넥터; 및 전력 공급원을 포함할 수 있다. 조작자는 지지 구조 상에 실장된 복수의 바늘 전극을 잡고, 이들을 신체 또는 식물의 선택된 조직 내로 단단히 삽입할 수 있다. 그 후, 핵산은 피하 바늘을 통해 선택된 조직 내로 전달된다. 프로그래밍가능한 정전류 펄스 컨트롤러는 활성화되고, 정전류 전기 펄스는 복수의 바늘 전극에 인가된다. 인가된 정전류 전기 펄스는 복수의 전극 사이의 세포 내로의 핵산의 도입을 용이하게 한다. 세포의 과다가열로 인한 세포 사멸은 정전류 펄스에 의해 조직에서 전력 소멸을 제한함으로써 최소화된다. 셀렉트라 장치 및 시스템은 미국 특허 제7,245,963호에 기재되어 있으며, 그의 내용은 본원에 참조로 포함된다.
MID는 엘겐 1000 시스템 (이노비오 파마슈티칼스)일 수 있다. 엘겐 1000 시스템은 중공 바늘을 제공하는 장치; 및 유체 전달 수단을 포함할 수 있으며, 여기서 장치는 유체, 즉, 본원에서 기재된 코딩된 아피머 핵산 구축물을 신체 조직 내로 상기 신체 조직 내로의 바늘의 삽입 동안 동시에 (예를 들어 자동적으로) 주사하도록 사용에서 유체 전달 수단을 작동시키도록 조정된다. 이점은 바늘이 삽입되고 있는 동안 점차적으로 유체를 주사하는 능력이 신체 조직을 통한 유체의 보다 고른 분포를 초래하는 것이다. 또한, 주사 동안 경험되는 통증은 보다 큰 면적에 걸쳐 주사되는 유체의 부피의 분포로 인해 감소된다.
또한, 유체의 자동 주사는 주사되는 유체의 실제 용량의 자동 모니터링 및 등록을 용이하게 한다. 이 데이터는 바람직할 경우 문서화 목적을 위해 제어 유닛에 의해 저장될 수 있다.
주사의 속도는 선형 또는 비-선형 중 어느 하나일 수 있으며, 주사는 바늘이 치료되는 대상체의 피부를 통해 삽입된 후 및 이들이 신체 조직 내로 추가로 삽입되는 동안 수행될 수 있음이 인정될 것이다.
유체가 본 발명의 장치에 의해 주사될 수 있는 적합한 조직으로는 단지 예로서 종양 조직, 피부 및 다른 상피 조직, 간 조직 및 근육 조직을 들 수 있다.
장치는 신체 조직 내로의 바늘의 삽입을 가이드하는 바늘 삽입 수단을 추가로 포함한다. 유체 주사의 속도는 바늘 삽입의 속도에 의해 제어된다. 이는 바늘 삽입 및 유체의 주사 둘 다가 삽입의 속도가 바람직한 경우 주사의 속도와 매칭될 수 있도록 제어될 수 있다는 이점을 갖는다. 이는 또한 장치를 사용자가 작동하기에 보다 용이하게 만든다. 바람직한 경우, 바늘을 신체 조직 내로 자동적으로 삽입하는 수단이 제공될 수 있다.
사용자는 유체의 주사를 시작할 때를 선택할 수 있다. 그러나, 이상적으로, 주사는 바늘의 팁이 표적 조직에 도달한 경우 시작되며, 장치는 바늘이 유체의 주사가 시작되는 충분한 깊이로 삽입된 때를 감지하는 수단을 포함할 수 있다. 이는 바늘이 바람직한 깊이 (이는 통상적으로 근육 조직이 시작하는 깊이일 것임)에 도달한 경우 유체의 주사가 자동적으로 시작되도록 촉발될 수 있음을 의미한다. 근육 조직이 시작하는 깊이는 예를 들어 미리-설정된 바늘 삽입 깊이, 에컨대 바늘이 피부 층을 통과하기에 충분한 것으로 간주될 4 mm의 값으로 취해질 수 있다.
감지 수단은 초음파 프로브를 포함할 수 있다. 감지 수단은 임피던스 또는 저항의 변화를 감지하는 수단을 포함할 수 있다. 이 경우, 수단은 신체 조직에서 바늘의 깊이를 그렇게 기록하지 않을 수 있지만, 오히려 바늘이 상이한 유형의 신체 조직으로부터 근육 내로 이동함에 따라 임피던스 또는 저항의 변화를 감지하도록 조정될 것이다. 이들 대안 모두는 주사가 시작될 수 있음을 감지하는 수단을 상대적으로 정확하고 간단하게 작동하는 것을 제공한다. 바늘의 삽입의 깊이는 바람직할 경우 추가로 기록될 수 있으며, 바늘 삽입의 깊이가 기록되고 있음과 같이 주사되는 유체의 부피가 측정되도록 유체의 주사를 제어하는 데 사용될 수 있다.
장치는 바늘을 지지하기 위한 베이스; 및 그 안에 베이스를 수용하는 하우징을 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 베이스는 베이스가 하우징에 비해 제1 후방 위치에 있는 경우 바늘이 하우징 내에 들어가고, 베이스가 하우징 내의 제2 전방 위치에 있는 경우 바늘이 하우징으로부터 연장되도록 하우징에 비해 이동가능하다. 이는 하우징이 환자의 피부 상으로 정렬될 수 있고, 그 후 바늘이 베이스에 비해 하우징을 이동시킴으로써 환자의 피부 내로 삽입될 수 있기 때문에 사용자에게 유리하다.
상기 언급된 바와 같이, 유체가 그것이 피부 내로 삽입됨에 따라 바늘의 길이에 걸쳐 고르게 분포되도록 유체 주사의 제어된 속도를 달성하는 것이 바람직하다. 유체 전달 수단은 유체를 제어된 속도로 주사하도록 조정된 피스톤 운전 수단을 포함할 수 있다. 피스톤 운전 수단은 예를 들어 서보 모터에 의해 활성화될 수 있다. 그러나, 피스톤 운전 수단은 하우징에 비해 축 방향으로 이동하는 베이스에 의해 작동될 수 있다. 유체 전달을 위한 대안적 수단이 제공될 수 있음이 인정될 것이다. 따라서, 예를 들어, 제어된 또는 비-제어된 속도로의 유체 전달을 위해 짜내질 수 있는 폐쇄된 용기가 시린지 및 피스톤 시스템 대신 제공될 수 있다.
상기 기재된 장치는 임의의 유형의 주사에 사용될 수 있다. 그러나, 이는 전기천공의 분야에 특히 유용한 것으로 상정되며, 따라서 이는 바늘에 전압을 인가하는 수단을 추가로 포함할 수 있다. 이는 바늘이 주사를 위해 뿐만 아니라 전기천공 동안 전극으로서 사용되는 것을 허용한다. 이는 그것이 전기장이 주사되는 유체와 동일한 면적에 인가됨을 의미하기 때문에 특히 유리하다. 전극을 이전에 주사된 유체와 정확하게 정렬하는 것이 매우 곤란하고, 따라서 사용자는 보다 큰 면적에 걸쳐 요구되는 것보다 유체의 보다 큰 부피를 주사하고, 주사된 물질 및 전기장 사이의 중첩을 보장하려는 시도로 보다 높은 면적에 걸쳐 전기장을 인가하는 경향이 있었다는 점에서, 전통적으로 전기천공으로의 문제가 있었다. 본 발명을 사용하여, 주사되는 유체의 부피 및 인가되는 전기장의 크기 둘 다는 전기장 및 유체 사이의 양호한 적합을 달성하면서 감소될 수 있다.
드라기아-아클리 (Draghia-Akli) 등에 의한 미국 특허 제7,245,963호는 신체 또는 식물에서 선택된 조직의 세포 내로의 생체분자의 도입을 용이하게 하기 위한 모듈 전극 시스템 및 그들의 용도를 기재하고 있다. 모듈 전극 시스템은 복수의 바늘 전극; 피하 바늘; 프로그래밍가능한 정전류 펄스 컨트롤러로부터 복수의 바늘 전극으로 전도성 연결을 제공하는 전기 커넥터; 및 전력 공급원을 포함할 수 있다. 조작자는 지지 구조 상에 실장된 복수의 바늘 전극을 잡고, 이들을 신체 또는 식물의 선택된 조직 내로 단단히 삽입할 수 있다. 그 후, 생체분자는 피하 바늘을 통해 선택된 조직 내로 전달된다. 프로그래밍가능한 정전류 펄스 컨트롤러는 활성화되고, 정전류 전기 펄스는 복수의 바늘 전극에 인가된다. 인가된 정전류 전기 펄스는 복수의 전극 사이의 세포 내로의 생체분자의 도입을 용이하게 한다. 미국 특허 제7,245,963호의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
스미스 (Smith) 등에 의한 미국 특허 공개 2005/0052630은 신체 또는 식물에서의 선택된 조직의 세포 내로의 생체분자의 도입을 효과적으로 용이하게 하는 데 사용될 수 있는 전기천공 장치를 기재하고 있다. 전기천공 장치는 그의 작동이 소프트웨어 또는 펌웨어에 의해 특정되는 전기-동역학 장치 ("EKD 장치")를 포함한다. EKD 장치는 사용자 제어 및 펄스 파라미터의 투입에 기초한 어레이에서의 전극 사이의 일련의 프로그래밍가능한 정전류 펄스 패턴을 생성하며, 전류 파형 데이터의 저장 및 획득을 허용한다. 전기천공 장치는 또한 바늘 전극의 어레이, 주사 바늘을 위한 중심 주사 채널, 및 제거가능한 가이드 디스크를 갖는 대체가능한 전극 디스크를 포함한다. 미국 특허 공개 2005/0052630의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
미국 특허 제7,245,963호 및 미국 특허 공개 2005/0052630에 기재된 전극 어레이 및 방법은 조직, 예컨대 근육 뿐만 아니라 다른 조직 또는 기관 내로의 깊은 침투를 위해 조정될 수 있다. 전극 어레이의 배치 때문에, 주사 바늘 (선택의 생체분자를 전달하는)은 또한 표적 기관 내로 완전히 삽입되고, 주사는 전극에 의해 미리-설명된 영역에서, 표적 문제에 수직으로 투여된다. 미국 특허 제7,245,963호 및 미국 특허 공개 2005/005263에 기재된 전극은 바람직하게는 20 mm 길이 및 21 게이지이다.
생체내 전기천공의 사용은 종양 조직에서 플라스미드 DNA 흡수를 향상시켜 종양 내에서의 발현을 초래하고, 플라스미드를 근육 조직으로 전달하여 분비된 단백질, 예컨대 시토카인의 전신 발현을 초래한다 (예를 들어, US8026223 참조). 생체내에서 세포 내로 아피머 폴리펩티드 트랜스진을 전기천공하기 위한 추가의 예시적인 기법, 벡터 및 장치로는 PCT 공개 WO/2017/106795, WO/2016/161201, WO/2016/154473, WO/2016/112359 및 WO/2014/066655를 들 수 있다.
전형적으로, 생체내 세포 전기천공에 필요한 전기장은 일반적으로 시험관내에서 세포에 요구되는 장과 규모에 있어서 유사하다. 한 실시양태에서, 전기장의 규모는 대략 10 V/cm 내지 약 1500 V/cm, 바람직하게는 약 300 V/cm 내지 1500 V/cm 및 바람직하게는 약 1000 V/cm 내지 1500 V/cm의 범위이다. 대안적으로, 장 강도가 보다 낮을 수록 (약 10 V/cm 내지 100 V/cm, 및 보다 바람직하게는 약 25 V/cm 내지 75 V/cm), 펄스 길이는 길다. 예를 들어, 공칭 전기장은 약 25 내지 75 V/cm인 경우, 펄스 길이는 약 10 msec인 것이 바람직하다.
펄스 길이는 약 10 s 내지 약 100 ms일 수 있다. 임의의 바람직한 수의 펄스, 전형적으로 초 당 1 내지 100 펄스가 있을 수 있다. 펄스 설정 사이의 지연은 임의의 바람직한 시간, 예컨대 1초일 수 있다. 파형, 전기장 강도 및 펄스 지속기간은 또한 세포의 유형 및 전기천공을 통해 세포에 진입하게 되는 분자의 유형에 의존할 수 있다.
또한, 전기화학적 임피던스 분광법 ("EIS")을 포함하는 전기천공 장치가 포함된다. 이러한 장치는 생체내, 특히 종양내 전기천공 효율성에 대한 실시간 정보를 제공하며, 이는 조건의 최적화를 허용한다. EIS를 포함하는 전기천공 장치의 예는 예를 들어, WO2016/161201에서 발견될 수 있으며, 이는 본원에 참조로 포함된다.
본 발명의 코딩된 아피머 핵산 구축물의 흡수는 또한 애벌란시 형질감염으로 용어화된 플라스마 전기천공에 의해 향상될 수 있다. 간략하게, 마이크로초 방전은 전극 표면에 캐비테이션 미세버블을 생성한다. 자기장과 조합된 붕괴하는 미세버블에 의해 생성된 기계적 힘은 통상적인 전기천공과 연관된 확산 매개 수송에 비해 세포막을 가로지르는 수송 효율성을 증가시키는 기능을 한다. 플라스마 전기천공의 기법은 미국 특허 제7,923,251호 및 제8,283,171호에 기재되어 있다. 이 기법은 또한 세포의 형질전환을 위해 생체내에서 채용될 수 있다. 문헌 [Chaiberg, et al. (2006) Investigative Ophthalmology & Visual Science 47:4083-4090]; [Chaiberg, et al. United States Patent No 8, 101 169 Issued January 24, 2012].
다른 대안적 전기천공 기술은 또한 고려된다. 생체내 핵산 전달은 또한 콜드 플라스마를 사용하여 수행될 수 있다. 플라스마는 물질의 4가지 근본적 상태 중 하나이며, 다른 것은 고체, 액체, 및 기체이다. 플라스마는 비결합된 양성 및 음성 입자의 전기적으로 중성 매질이다 (즉, 플라스마의 전체 전하는 대략 0임). 플라스마는 기체를 가열하거나, 이를 레이저 또는 마이크로파 생성기로 인가된 강한 전자기장에 처하게 함으로써 생성될 수 있다. 이는 전자의 수를 감소시키거나 증가시켜 이온으로 지칭되는 양 또는 음 하전된 입자를 생성하고 (Luo, et al. (1998) Phys. Plasma 5:2868-2870), 존재하는 경우, 분자 결합의 해리가 수반된다.
콜드 플라스마 (즉, 비-열 플라스마)는 적합한 전극으로의 펄스화된 고전압 신호의 전달에 의해 생성된다. 콜드 플라스마 장치는 기체 제트 장치 또는 유전체 장벽 방전 (DBD) 장치의 형태를 취할 수 있다. 콜드 온도 플라스마는 상대적으로 낮은 기체 온도에서 플라스마의 그들의 제공에 의해 대단한 열광 및 흥미를 끌었다. 이러한 온도에서의 플라스마의 제공은 상처 치유, 항-박테리아 프로세스, 다양한 다른 의학적 요법 및 멸균을 비롯한 다양한 적용에 흥미롭다. 앞서 언급된 바와 같이, 콜드 플라스마 (즉, 비-열 플라스마)는 적합한 전극으로의 펄스화된 고전압 신호의 전달에 의해 생성된다. 콜드 플라스마 장치는 기체 제트 장치, 유전체 장벽 방전 (DBD) 장치 또는 다중-주파수 조파-풍부 전력 공급기의 형태를 취할 수 있다.
유전체 장벽 방전 장치는 콜드 플라스마를 생성하기 위해 상이한 프로세스에 의존한다. 유전체 장벽 방전 (DBD) 장치는 유전체 층에 의해 커버된 적어도 1개의 전도성 전극을 함유한다. 전기적 리턴 경로는 콜드 플라스마 처리를 겪은 표적 기질에 의해 또는 전극에 대한 내재된 그라운드를 제공함으로써 제공될 수 있는 그라운드에 의해 형성된다. 유전체 장벽 방전 장치에 대한 에너지는 예컨대 상기 언급된 고전압 전력 공급기에 의해 제공될 수 있다. 보다 일반적으로, 에너지는 플라스마 방전을 형성하는 펄스화된 DC 전기 전압의 형태로 유전체 장벽 방전 장치에 투입된다. 유전체 층에 의해, 방전은 전도성 전극으로부터 분리되고, 전극 에칭 및 기체 가열은 감소된다. 펄스화된 DC 전기 전압은 작동의 다양한 체제를 달성하도록 진폭 및 주파수에 있어서 다양할 수 있다. 콜드 플라스마 생성의 이러한 원리를 포함하는 임의의 장치 (예를 들어, DBD 전극 장치)는 본 발명의 다양한 실시양태의 범위 내에 해당한다.
콜드 플라스마는 세포를 외래 핵산으로 형질감염시키는 데 채용되었다. 특히, 종양 세포의 형질감염 (예를 들어, 문헌 [Connolly, et al. (2012) Human Vaccines & Immune-therapeutics 8: 1729-1733]; 및 [Connolly et al. (2015) Bioelectrochemistry 103: 15-21] 참조).
특정 예시적인 실시양태에서, 본 발명의 아피머 폴리펩티드를 코딩하는 트랜스진 구축물은 어플리케이터; 어플리케이터로부터 연장되는 복수의 전극 (전극은 커버 영역과 연관됨); 전극과 전기적 통신하는 전력 공급기 (전력 공급기는 1개 이상의 전기천공 신호를 커버 영역 내의 세포에 생성하도록 구성됨); 및 전극에 결합된 가이드 부재 (가이드 부재는 전극의 커버 영역을 조정하도록 구성됨)를 포함하는 전기천공 장치를 사용하여 전달된다. 전극의 적어도 일부는 원뿔형 배열로 어플리케이터 내에 위치될 수 있다. 1개 이상의 전기천공 신호는 각각 전기장과 연관될 수 있다. 장치는 전력 공급기 및 전극에 결합된 전위차계를 추가로 포함할 수 있다. 전위차계는 전기장을 실질적으로 미리 결정된 범위 내에서 유지하도록 구성될 수 있다.
1개 이상의 전기천공 신호는 각각 전기장과 연관될 수 있다. 장치는 전력 공급기 및 전극에 결합된 전위차계를 추가로 포함할 수 있다. 전위차계는 커버 영역 내의 세포에서 영구적 손상을 실질적으로 방지하고/거나 통증을 실질적으로 최소화하도록 전기장을 미리 결정된 범위 내에서 유지하도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 전위차계는 전기장을 약 1300 V/cm로 유지하도록 구성될 수 있다.
전력 공급기는 제1 전기적 신호를 제1 전극에 및 제2 전기적 신호를 제2 전극에 제공할 수 있다. 제1 및 제2 전기적 신호는 조합되어 진동 주파수를 갖는 파를 생성할 수 있다. 제1 및 제2 전기적 신호는 각각 단일극성 파형 및 이중극성 파형 중 적어도 하나를 가질 수 있다. 제1 전기적 신호는 제1 주파수 및 제1 진폭을 가질 수 있다. 제2 전기적 신호는 제2 주파수 및 제2 진폭을 가질 수 있다. 제1 주파수는 제2 주파수와 상이하거나 동일할 수 있다. 제1 진폭은 제2 진폭과 상이하거나 동일할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 종양을 아피머 폴리펩티드를 코딩하는 플라스미드의 유효 용량으로 주사하고; 전기천공 요법을 종양에 투여하는 것을 포함하는, 종양을 갖는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 전기천공 요법은 약 100 마이크로초 내지 약 20 밀리초의 펄스 폭에 걸쳐 약 200 V/cm 내지 약 1500 V/cm의 적어도 하나의 전압 펄스의 투여를 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 플라스미드 (또는 제2 전기천공된 플라스미드)는 예컨대 IL-12, IL-15, 및 IL-12 및 IL-15의 조합을 코딩하는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 면역자극성 시토카인을 추가로 코딩한다.
형질감염 향상 제형
코딩된 아피머 핵산 구축물은 또한 세포막과 상호작용하고, 융합하거나 세포내이입을 겪어 세포 내로의 핵산 전달을 실행할 수 있는 리포솜, 바람직하게는 양이온성 리포솜 (문헌 [Wong, T. K. et al., Gene, 10:87(1980)]; [Nicolau and Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190 (1982)]; 및 [Nicolau et al., Methods Enzymol., 149:157-176 (1987)]) 또는 폴리머솜 (합성 리포솜)에 캡슐화될 수 있다. DNA는 또한 그들의 로드를 세포의 세포질 내로 직접적으로 방출할 수 있는 중합체와의 (폴리플렉스) 또는 덴드리머와의 복합체로 형성될 수 있다.
이와 관련하여 유용한 예시적인 담체로는 폴리(락티드-코-글리콜리드), 폴리아크릴레이트, 라텍스, 전분, 셀룰로스, 덱스트란 등의 미세입자를 들 수 있다. 다른 예시적인 담체로는 비-액체 친수성 코어 (예를 들어, 가교된 다당류 또는 올리고당류) 및 임의로, 양친매성 화합물, 예컨대 인지질을 포함하는 외부 층을 포함하는 초분자 생체벡터를 들 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 제5,151,254호 및 PCT 출원 WO 94/20078, WO/94/23701 및 WO 96/06638 참조). 서방형 제형 내에 함유되는 활성제의 양은 삽입의 부위, 방출의 속도 및 예상되는 지속기간 및 치료되거나 예방되는 상태의 성질에 의존한다.
생체분해성 미소구 (예를 들어, 폴리락테이트 폴리글리콜레이트)는 조성물을 위한 담체로서 채용될 수 있다. 적합한 생체분해성 미소구는 예를 들어, 미국 특허 제4,897,268호; 제5,075,109호; 제5,928,647호; 제5,811,128호; 제5,820,883호; 제5,853,763호; 제5,814,344호, 제5,407,609호 및 제5,942,252호에 개시되어 있다. 예컨대 WO/99 40934, 및 그에 인용된 참고문헌에 기재된 변형된 B형 간염 코어 단백질 담체 시스템은 또한 많은 적용에 유용할 것이다. 또다른 예시적인 담체/전달 시스템은 미립자-단백질 복합체를 포함하는 담체, 예컨대 미국 특허 제5,928,647호에 기재된 것들을 채용하며, 이는 아피머에 대한 코딩 서열을 종양내로 전달하는 데 사용되는 경우 추가된 유익을 가질 수 있다.
생체분해성 중합체성 나노입자는 세포 내로의 비-바이러스 핵산 전달을 용이하게 한다. 작은 (대략 200 nm), 양으로 하전된 (대략 10 mV) 입자는 양이온성, 가수분해적으로 분해가능한 폴리(베타-아미노 에스테르) 및 플라스미드 DNA의 자기-어셈블리에 의해 형성된다.
폴리뉴클레오티드는 또한 직접 미세주사, 일시적 세포 투과화 (예를 들어, 세포 투과화제와 억제제 및/또는 활성화제의 공동-투여), 막 전위 펩티드에의 융합 등에 의해 세포에 투여될 수 있다.
시험관내 및 생체내에서의 mRNA를 비롯한 외래 핵산의 지질-매개 핵산 전달 및 발현은 매우 성공적이었다. 지질 기재 비-바이러스 제형은 바이러스 유전자 요법에 대한 대안을 제공한다. 현재 생체내 지질 전달 방법은 피하, 진피내, 종양내, 또는 두개내 주사를 사용한다. 지질 제형에서의 진보는 생체내에서 유전자 전달의 효율성을 개선시켰다 (PCT 출원 WO 98/07408 참조). 예를 들어, 등몰 비의 1,2-비스(올레오일옥시)-3-(트리메틸 암모니오)프로판 (DOTAP) 및 콜레스테롤로 구성된 지질 제형은 전신 생체내 유전자 전달을 유의하게 향상시킬 수 있다. DOTAP:콜레스테롤 지질 제형은 "샌드위치 리포솜"으로 용어화된 독특한 구조를 형성한다. 이 제형은 함입된 이중층 또는 '화병' 구조 사이의 "샌드위치" DNA로 보고된다. 이들 지질 구조의 유익한 특징으로는 양의 p, 콜레스테롤에 의한 콜로이드 안정화, 2차원 핵산 패킹 및 증가된 혈청 안정성을 들 수 있다.
양이온성 리포솜 기술은 음으로 하전된 DNA 또는 RNA에 결합하고, 일반적으로 세포내이입에 의해 세포에 진입하는 입자를 형성하는, 양으로 하전된 헤드 기 및 소수성 지질 꼬리를 갖는 양친매성 지질의 능력에 기초한다. 일부 양이온성 리포솜은 또한 포유동물 세포에 의한 리포솜 흡수를 향상시키는 것으로 생각되는 중성 공동-지질을 함유한다. 유사하게, 다른 다가양이온, 예컨대 폴리-L-리신 및 폴리에틸렌-이민은 전하 상호작용을 통해 핵산과 복합체화하고, DNA 또는 RNA의 나노입자로의 응축을 보조하며, 이는 그 후 엔도솜-매개 흡수를 위한 기질이 된다. 이들 양이온성-핵산 복합체 기술 중 몇몇은 플라스미드 DNA (pDNA), 올리고데옥시뉴클레오티드, 및 다양한 형태의 합성 RNA와의 복합체를 비롯한 잠재적인 임상적 제품으로서 개발되었으며, 본 발명의 코딩된 아피머 핵산 구축물을 위한 전달 시스템의 일부로서 사용되었다.
본원에 개시된 코딩된 아피머 핵산 구축물은 세포 내로의 흡수를 향상시키는 기능을 하는 다가양이온성 분자와 회합될 수 있다. 핵산 구축물을 다가양이온성 분자와 복합체화하는 것은 또한 그들의 크기가 감소되도록 구축물을 패키징하는 데 도움이 되며, 이는 세포 흡수를 돕는 것으로 믿어진다. 일단 엔도솜에서, 복합체는 보다 낮은 pH로 인해 해리되며, 다가양이온성 분자는 엔도솜의 막을 파괴하여 그것이 분해될 수 있기 전에 세포질 내로의 DNA 탈출을 용이하게 한다. 예비 데이터는 핵산 구축물 실시양태가 다가양이온성 분자 폴리리신 또는 폴리에틸렌이민과 복합체화되는 경우 DC에 비해 SC 내로의 흡수를 향상시켰음을 나타낸다.
핵산 구축물과 복합체화하는 데 유용한 다가양이온성 분자의 한 예로는 세포 침투 펩티드 (CPP)를 들 수 있으며, 예로는 폴리리신 (상기 기재됨), 폴리아르기닌 및 Tat 펩티드를 들 수 있다. 세포 침투 펩티드 (CPP)는 DNA에 결합하고, 일단 방출되면, 세포막에 침투하여 엔도솜으로부터 세포질로의 DNA의 탈출을 용이하게 할 수 있는 작은 펩티드이다. CPP의 또다른 예는 MPG로 용어화된 27 잔기 키메라 펩티드에 관한 것이며, 얼마 전에 ss- 및 ds-올리고뉴클레오티드에 안정한 방식으로 결합하여, 핵산을 DN아제에 의한 분해로부터 보호하고, 올리고뉴클레오티드를 시험관내에서 세포에 효과적으로 전달한 비-공유 복합체를 생성하는 것으로 나타났다 (Mahapatro A, et al., J Nanobiotechnol, 2011, 9:55). 복합체는 상이한 펩티드:DNA 비, 및 10:1 및 5:1 비 (각각 150 nm 및 1 um)가 조사된 경우, 대략 150 nm 내지 1 um의 작은 입자를 형성하였다. 또다른 CPP는 변형된 테트라펩티드 [구아니디노카르보닐피롤 (GCP) 기를 함유하는 테트라리신 (TL-GCP)]에 관한 것이며, 이는 높은 친화도로 6.2 kb 플라스미드 DNA에 결합하여 700 내지 900 nm의 양으로 하전된 응집체를 생성하는 것으로 보고되었다 (Li et al., Agnew Chem Int Ed Enl 2015; 54(10):2941-4). RNA는 또한 생체내 전달을 위해 이러한 다가양이온성 분자에 의해 복합체화될 수 있다.
본원에 기재된 핵산 구축물과 복합체화될 수 있는 다가양이온성 분자의 다른 예로는 제트프라임 (JETPRIME)® 및 인 비보 제트 (In Vivo JET) (폴리푸스-트랜스펙션, 에스.에이. (Polypus-transfection, S.A.), 프랑스 일키르히)로서 시판되는 다가양이온성 중합체를 들 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 (i) 화학식 (I)의 화합물, 인지질, 구조적 지질, 및 PEG 지질을 포함하는 지질 성분; 및 (ii) mRNA (또는 다른 폴리뉴클레오티드)를 포함하는 나노입자 조성물을 투여함으로써 (상기 투여는 상기 포유동물 세포를 상기 나노입자 조성물과 접촉시키고, 그에 의해 상기 mRNA (또는 다른 폴리뉴클레오티드)가 상기 세포에 전달되는 것을 포함함) 아피머 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA (또는 다른 폴리뉴클레오티드)를 환자의 세포에 전달하는 방법을 고려한다.
예시적인 실시양태에서, PEG 지질은 PEG-변형된 포스파티딜에탄올아민, PEG-변형된 포스파티드산, PEG-변형된 세라마이드, PEG-변형된 디알킬아민, PEG-변형된 디아실글리세롤 및 PEG-변형된 디알킬글리세롤로 이루어진 군으로부터 선택된다. 예시적인 실시양태에서, 구조적 지질은 콜레스테롤, 페코스테롤, 시토스테롤, 에르고스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤, 브라시카스테롤, 토마티딘, 우르솔산, 및 알파-토코페롤로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 바람직한 실시양태에서, 구조적 지질은 콜레스테롤이다.
예시적인 실시양태에서, 인지질은 포스파티딜 콜린, 포스파티딜 에탄올아민, 포스파티딜 글리세롤, 포스파티딜 세린, 포스파티드산, 2-리소포스파티딜 콜린, 및 스핑고미엘린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 모이어티를 포함한다. 특정 실시양태에서, 인지질은 라우르산, 미리스트산, 미리스트올레산, 팔미트산, 팔미트올레산, 스테아르산, 올레산, 리놀레산, 알파-리놀렌산, 에루스산, 아라키드산, 아라키돈산, 피탄산, 에이코사펜타엔산, 베헨산, 도코사펜타엔산, 및 도코사헥사엔산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 지방산 모이어티를 포함한다. 특정 바람직한 실시양태에서, 인지질은 1,2-디리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DLPC), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-포스포콜린 (DMPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DOPC), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DPPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DSPC), 1,2-디운데카노일-sn-글리세로-포스포콜린 (DUPC), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (POPC), 1,2-디-0-옥타데세닐-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1 8:0 디에테르 PC), 1-올레오일-2-콜레스테릴헤미숙시노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (OChemsPC), 1-헥사데실-sn-글리세로-3-포스포콜린 (C16 리소 PC), 1,2-디리놀레노일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디아라키도노일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디도코사헥사에노일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE), 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (ME 1 6.0 PE), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1,2-디리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1,2-디리놀레노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1,2-디아라키도노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1,2-디도코사헥사에노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포-rac-(1 -글리세롤) 나트륨 염 (DOPG), 및 스핑고미엘린으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 바람직한 실시양태에서, 인지질은 DOPE 또는 DSPC이다.
추가의 예시를 위해, 인지질은 DOPE일 수 있고, 상기 성분은 약 35 몰％ 내지 약 45 몰％ 상기 화합물, 약 10 몰％ 내지 약 20 몰％ DOPE, 약 38.5 몰％ 내지 약 48.5 몰％ 구조적 지질, 및 약 1.5 몰％ PEG 지질을 포함할 수 있다. 지질 성분은 약 40 몰％ 상기 화합물, 약 15 몰％ 인지질, 약 43.5 몰％ 구조적 지질, 및 약 1.5 몰％ PEG 지질일 수 있다.
특정 실시양태에서, 지질 성분 대 아피머 폴리펩티드 코딩 mRNA (또는 다른 폴리뉴클레오티드)의 중량/중량 비는 약 5:1 내지 약 50:1 및 보다 바람직하게는 약 10:1 내지 약 40:1이다.
특정 실시양태에서, 상기 나노입자 조성물의 평균 크기는 약 50 nm 내지 약 150 nm, 및 보다 더 바람직하게는 약 80 nm 내지 약 120 nm이다.
특정 실시양태에서, 상기 나노입자 조성물의 다분산성 지수는 약 0 내지 약 0.18, 보다 바람직하게는 약 0.13 내지 약 0.17이다.
특정 실시양태에서, 나노입자 조성물은 약 -10 내지 약 +20 mV의 제타 전위를 갖는다.
특정 실시양태에서, 나노입자 조성물은 3-(디도데실아미노)-N1,N1,4-트리도데실-1-피페라진에탄아민 (KL10), 14,25-디트리데실-15,18,21,24-테트라아자-옥타트리아콘탄 (KL25), 1,2-디리놀레일옥시-N,N-디메틸아미노프로판 (DLin-DMA), 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노메틸-[1,3]-디옥솔란 (DLin-K-DMA), 헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일 4-(디메틸아미노)부타노에이트 (DLin-MC3-DMA), 2,2-디리놀레일-4-(2-디메틸아미노에틸)-[1,3]-디옥솔란 (DLin-KC2-DMA), 1,2-디올레일옥시-N,N-디메틸아미노프로판 (DODMA), 및 (2R)-2-({8-[(3P)-콜레스트-5-엔-3-일옥시]옥틸}옥시)-N,N-디메틸-3-[(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일옥시]프로판-1-아민 (옥틸-CLinDMA (2R))으로 이루어진 군으로부터 선택되는 양이온성 및/또는 이온화가능한 지질을 추가로 포함한다.
본 발명은 이하 실시예에 의해 설명된다. 이들 실시예는 예시이며, 청구항의 범위에 의해 한정되는 본 발명을 제한하는 것으로서 해석되는 것으로 의도되지 않는다.
이들 실시예에서 일부 데이터는 C-말단 G6H 태그 (즉, 폴리펩티드의 C-말단에서 첨가로서 GHHHHHH (서열식별번호: 104))를 갖는 스캐폴드로 생성되었다. 이는 예를 들어 미국 캘리포니아주 뉴악에 소재하는 ATUM으로부터의 표준 '오프-더-쉘프' 일렉트라 벡터 시스템®을 사용함으로써, 나타내어진 실험을 수행하기 위한 조작/검출의 용이성을 위한 관련 기술분야의 표준이다. 특히 적합하게는 pMOTHER 및 pDAUGHTER 플라스미드, 또는 이들로부터 유래된 벡터이다. 물론 통상의 조작자는 동일한 원리에 기초한 병행 클로닝 시스템, 또는 조작자 선택에 기초한 상이한 시스템을 용이하게 사용할 수 있다.
V. 제약 조성물
본 발명은 또한 본원에 기재된 아피머 폴리펩티드 및 제약학적으로 허용되는 비히클을 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 면역요법에서 용도를 발견한다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 면역-종양학에서 용도를 발견한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 종양 성장을 억제하는 데 있어서 용도를 발견한다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 대상체 (예를 들어, 인간 환자)에서 종양 성장을 억제하는 데 있어서 용도를 발견한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 암을 치료하는 데 있어서 용도를 발견한다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 대상체 (예를 들어, 인간 환자)에서 암을 치료하는 데 있어서 용도를 발견한다.
제형은 본 발명의 정제된 아피머 폴리펩티드를 제약학적으로 허용되는 비히클 (예를 들어, 담체 또는 부형제)과 조합함으로써 저장 및 사용을 위해 제조된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 일반적으로 제약학적으로 허용되는 담체, 부형제, 및/또는 안정화제를 제형 또는 제약 조성물의 불활성 성분인 것으로 간주한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 아피머 폴리펩티드는 동결건조되고/거나 동결건조된 형태로 저장된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 아피머 폴리펩티드를 포함하는 제형은 동결건조된다.
적합한 제약학적으로 허용되는 비히클로는 비독성 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기산; 염, 예컨대 염화나트륨; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제, 예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드, 헥사메토늄 클로라이드, 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드, 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜, 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤, 카테콜, 레조르시놀, 시클로헥산올, 3-펜탄올, 및 m-크레졸; 저분자량 폴리펩티드 (예를 들어, 약 10 아미노산 잔기 미만); 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신; 탄수화물, 예컨대 단당류, 이당류, 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대-이온, 예컨대 나트륨; 금속 착체, 예컨대 Zn-단백질 착체; 및 비-이온성 계면활성제, 예컨대 트윈 (TWEEN) 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. (Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22.sup.nd Edition, 2012, Pharmaceutical Press, London.).
본 발명의 제약 조성물은 국소 또는 전신 치료를 위해 임의의 수의 방법으로 투여될 수 있다. 투여는 표피 또는 경피 패치, 연고, 로션, 크림, 겔, 액적, 좌제, 스프레이, 액체 및 분말에 의해 국소적; 네불라이저, 기관내, 및 비내에 의해서를 비롯한 분말 또는 에어로졸의 흡입 또는 취입에 의한 폐로; 또는 정맥내, 동맥내, 종양내, 피하, 복강내, 근육내 (예를 들어, 주사 또는 주입), 또는 두개내 (예를 들어, 경막내 또는 뇌실내)를 비롯한 비경구일 수 있다.
치료 제형은 단위 투여 형태일 수 있다. 이러한 제형으로는 정제, 환제, 캡슐, 분말, 과립, 물 또는 비-수성 매질 중 용액 또는 현탁액, 또는 좌제를 들 수 있다. 고체 조성물, 예컨대 정제에서, 주요 활성 성분은 제약 담체와 혼합된다. 통상적인 정제화 성분으로는 옥수수 전분, 락토스, 수크로스, 소르비톨, 활석, 스테아르산, 스테아르산마그네슘, 인산이칼슘 또는 검, 및 희석제 (예를 들어, 물)를 들 수 있다. 이들은 본 발명의 화합물, 또는 그의 비-독성 제약학적으로 허용되는 염의 균질한 혼합물을 함유하는 고체 예비제형 조성물을 형성하는 데 사용될 수 있다. 그 후, 고체 예비제형 조성물은 상기 기재된 유형의 단위 투여 형태로 세분된다. 제형 또는 조성물의 정제, 환제 등은 코팅되거나 다르게는 화합되어 연장된 작용의 이점을 제공하는 투여 형태를 제공할 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 환제는 외부 성분에 의해 커버된 내부 조성물을 포함할 수 있다. 더욱이, 2가지 성분은 붕괴에 저항하는 기능을 하고, 내부 성분이 위를 통해 온전하게 통과하거나 방출에서 지연되는 것을 허용하는 장용 층에 의해 분리될 수 있다. 다양한 물질은 이러한 장용 층 또는 코팅에 사용될 수 있으며, 이러한 물질은 다수의 중합체성 산 및 중합체성 산과 셸락, 세틸 알콜 및 셀룰로스 아세테이트와 같은 물질의 혼합물을 포함한다.
본원에 기재된 아피머 폴리펩티드는 또한 미세캡슐에 포착될 수 있다. 이러한 미세캡슐은 예를 들어, 코아세르베이션 기법에 의해 또는 계면 중합에 의해 제조되며, 예를 들어, 각각 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22nd Edition, 2012, Pharmaceutical Press, London]에 기재된 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 미소구, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 중 또는 매크로에멀젼 중 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-미세캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 미세캡슐이다.
특정 실시양태에서, 제약 제형은 리포솜과 복합체화된 본 발명의 아피머 폴리펩티드를 포함한다. 리포솜을 제조하는 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 일부 리포솜은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤, 및 PEG-유도체화된 포스파티딜에탄올아민 (PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물로의 역상 증발에 의해 생성될 수 있다. 리포솜은 한정된 기공 크기의 필터를 통해 압출되어 바람직한 직경을 갖는 리포솜을 생성할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 아피머 폴리펩티드를 포함하는 서방형 제제가 제조될 수 있다. 서방형 제제의 적합한 예로는 아피머 폴리펩티드를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반-투과성 매트릭스를 들 수 있으며, 여기서 매트릭스는 성형품 (예를 들어, 필름 또는 미세캡슐)의 형태이다. 서방형 매트릭스의 예로는 폴리에스테르, 히드로겔, 예컨대 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐 알콜), 폴리락티드, L-글루탐산 및 7 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예컨대 루프론 데포 (LUPRON DEPOT).TM. (락트산-그리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사가능한 미소구), 수크로스 아세테이트 이소부티레이트, 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 들 수 있다.
실시예
실시예 1 - 돌연변이는 안정성을 조정하기 위해 독립적으로 조합될 수 있다
하기 돌연변이를 서열식별번호: 1에 비해 제조하였다:
Figure pct00030
이들 모두는 또한 hSteA Y35W의 Tm을 증가시켰다.
이는 돌연변이의 순서가 문제가 되지 않음을 나타낸다. 다시 말해서, 이는 안정성 (예를 들어 Tm)을 조정하기 위한 본원에 교시된 돌연변이가 독립적으로 생성되거나, 독립적으로 조합될 수 있음을 입증한다.
본 발명의 이점은 안정성을 조정하기 위한 본원에 교시된 특정 돌연변이가 그들의 개별적 효과를 달성하기 위해 서로에게 의존하지 않는다는 것이다.
실시예 2: 이종 펩티드 삽입
L2 및 L4 내로 삽입된 시험 이종 펩티드 GGSGGSGGS
각각의 루프에 대해 3개의 상이한 위치 (9개의 조합)
옵팀 2 상에서 측정된 열 안정성
변성제의 부재 하에서 측정된 3r2, 그러나 안정성은 범위를 초과하였다
Tm을 범위 내로 가져오기 위한 1 M GuHCl의 존재 하에서 다시 측정된 3r2
이 폴리펩티드에서 고유 트립토판 형광이 없는 것으로서 시프로 오렌지 (SYPRO Orange)의 존재 하에서 측정된 3t4
요약하면, 예시된 다양한 선택안을 하기에 나타낸다:
Figure pct00031
결과를 도 1에 나타낸다.
이는 이종 펩티드를 루프 3r2 내로 삽입하는 것이 유리하게는 안정성에 유해하게 영향을 미치지 않음을 입증한다.
L2 Tm에 대해, 48-L2-50 > 49-L2-51 > 50-L2-52
L4 Tm에 대해, 73-L4-78은 그것이 단연 최소로 안정한 50-L2-52와의 조합에서를 제외하고, 통상적으로 가장 안정하다
가장 안정한 조합은 48-L2-50과 73-L4-78이다
3t4는 나머지보다 명확하게 훨씬 덜 안정한 한 변이체를 제외하고는, 심지어 시프로의 존재 하에서도 양호한 데이터를 제공하지 않았다. 이는 3r2에 대해서 동일한 조합이다.
따라서, 가장 적합하게는 3r2 및 3t4 둘 다에 대한 삽입/루프는 하기와 같아야 한다:
잔기 D48 및 G50 사이에 삽입되고, 잔기 A49가 결실된 L2
잔기 L73 및 E78 사이에 삽입되고, 잔기 P74, G75, Q76 및 N77 (hSteA 넘버링을 사용함)이 결실된 L4
실시예 3: 예시적인 스캐폴드 단백질
예시적인 스캐폴드 단백질이 입증된다.
이 실험에서, Tm은 DSC (r/t) 및 옵팀 2 (3r)에 의해 측정된다.
연구 적용을 위한 예시적인 스캐폴드:
Figure pct00032
치료 적용을 위한 예시적인 스캐폴드:
Figure pct00033
도 2는 열 안정성의 척도로서 Tm에 대한 데이터를 나타낸다.
도 3은 상이한 pH 값에서 측정된 Tm을 나타낸다.
도 4는 CD 스펙트럼을 나타낸다.
본 발명자들은 상기와 같은 예시적인 스캐폴드에 대한 DSC 데이터를 생성하였으며, 하기 Tm 값을 관찰하였다:
3t1 = 85.6℃
3t2 = 89.2℃
3t3 = 91.6℃
3t4 = 92.4℃
3t5 = 94.7℃
따라서, 본 발명자들은 예시적인 스캐폴드 단백질이 개선된 안정성을 나타냄을 입증한다.
실시예 4: 스캐폴드 단백질의 구조적 통합성
본 발명의 스캐폴드 단백질은 유리하게는 표적 펩티드 삽입으로 완료되는 경우 그들의 구조적 통합성을 유지한다. 이를 입증하기 위해, 본 발명자들은 이종 펩티드 삽입을 갖는 3r2 및 3t4 스캐폴드에 대한 근거리 및 원거리 UV CD 스펙트럼을 측정하였다. 이 실시예에서, 이종 펩티드 삽입은 서열 (GGS)3, 즉 GGSGGSGGS (서열식별번호: 92)를 갖는 9mer 삽입이다.
근거리 UV CD 스펙트럼은 방향족 측쇄의 환경에 대해 보고한다. 근거리 UV CD 스펙트럼에서의 양의 또는 음의 피크는 방향족 잔기 주위의 환경이 고정됨을 지시한다. 이는 고정된 3차 구조를 갖는 단백질로서 해석된다. 이종 펩티드 (GGS)3을 루프 2 및 4에 첨가하는 것은 상이한 규모에도 불구하고 "비어있는" 스캐폴드와 동일한 형상을 갖는 근거리 UV CD 스펙트럼을 초래하며, 이는 이종 펩티드의 첨가가 스캐폴드 단백질의 3차 구조를 파괴하지 않았음을 지시한다.
원거리 UV CD 스펙트럼은 전체 2차 구조에 대해 보고한다. 알파-나선, 베타-가닥 및 무작위 코일 모두는 뚜렷하게 상이한 원거리 UV CD 스펙트럼을 갖는다. 이종 펩티드 (GGS)3을 루프 2 및 4에 첨가하는 것은 상이한 규모에도 불구하고 "비어있는" 스캐폴드와 동일한 형상을 갖는 원거리 UV CD 스펙트럼을 초래하며, 이는 이종 펩티드의 삽입이 스캐폴드 단백질의 전체 2차 구조를 파괴하지 않았음을 지시한다.
도 5에 대한 언급, 평균 잔기 타원율 ([θ]MRE)을 나타내는 3r2 (실선) 및 3r2(GGS)3 (파선)의 원거리 UV CD 스펙트럼. 3r2는 그의 루프가 이종 펩티드를 함유하지 않는 "비어있는" 스캐폴드이다. 3r2(GGS)3은 A49 (루프 2) 대신 (즉 48-<이종 펩티드>-50) 및 P74-G75-Q76-N77 (루프 4) 대신 (즉 73-<이종 펩티드>-78) 이종 펩티드 서열 GGSGGSGGS (서열식별번호: 92)를 함유한다.
도 6에 대한 언급: 평균 잔기 타원율 ([θ]MRE)을 나타내는 3t4 (실선) 및 3t4(GGS)3 (파선)의 원거리 UV CD 스펙트럼. 3t4는 그의 루프가 이종 펩티드를 함유하지 않는 "비어있는" 스캐폴드이다. 3t4(GGS)3은 A49 (루프 2) 대신 및 P74-G75-Q76-N77 (루프 4) 대신 이종 펩티드 서열 GGSGGSGGS (서열식별번호: 92)를 함유한다.
도 7에 대한 언급: 몰 타원율 ([θ])을 나타내는 3r2 (실선) 및 3r2(GGS)3 (파선)의 근거리 UV CD 스펙트럼. 3r2는 그의 루프가 이종 펩티드를 함유하지 않는 "비어있는" 스캐폴드이다. 3r2(GGS)3은 A49 (루프 2) 대신 및 P74-G75-Q76-N77 (루프 4) 대신 이종 펩티드 서열 GGSGGSGGS (서열식별번호: 92)를 함유한다.
도 8에 대한 언급: 몰 타원율 ([θ])을 나타내는 3t4 (실선) 및 3t4(GGS)3 (파선)의 근거리 UV CD 스펙트럼. 3t4는 그의 루프가 이종 펩티드를 함유하지 않는 "비어있는" 스캐폴드이다. 3t4(GGS)3은 A49 (루프 2) 대신 및 P74-G75-Q76-N77 (루프 4) 대신 이종 펩티드 서열 GGSGGSGGS (서열식별번호: 92)를 함유한다.
따라서, 측정된 파장에 걸쳐, 이종 펩티드 삽입을 함유하는 스캐폴드의 스펙트럼의 형상은 삽입을 갖지 않는 스캐폴드와 본질적으로 상이하지 않음이 보여질 수 있다. 이는 구조가 이종 펩티드 삽입으로 유지되었음을 나타낸다. 이는 본 발명의 상이한 예시적인 스캐폴드에 대해 보여진다.
실시예 5: 면역원성
본 발명에 따른 폴리펩티드의 면역원성을 모델링하였다.
％순위는 200000개의 무작위 천연 인간 펩티드의 세트에 비한 예측된 친화도의 ％순위이며, 예를 들어 1％의 값은 15mer 펩티드가 200000개의 무작위 펩티드 중 상위 1％만큼 강하게 결합하는 것으로 예측됨을 의미한다. 10％ 미만의 임의의 순위 (즉 10％ 내지 100％)는 면역원성인 것으로 간주되지 않는다. 이들 계산은 NetMHCIIpan (v3.1) 서버를 사용하여 수행되었다. 41개의 MHC 대립유전자를 각각의 서열에 대해 전체적으로 시험하였다. 이 플롯은 대표적인 예로서 1개의 대립유전자 (DRB1 1502 대립유전자)에 대한 결과를 나타낸다.
도 9에 대해 언급하면, 본원에 교시된 돌연변이는 면역원성에 대해 단지 작은 상하 이동을 생성한다고 결론내릴 수 있다. 플롯은 hSteA와 크게 유사하다. 큰 면역원성 영역은 도입되지 않았다. 야생형으로부터의 큰 변화/편차는 도입되지 않았다.
실시예 6: 혈청 안정성
안정성, 예컨대 혈청 안정성을 시험하였다.
각각의 단백질을 인간 혈청 (시그마 (Sigma))에서 37℃에서 16일 이하 동안 인큐베이션하였다. 샘플을 제0일, 제1일, 제2일, 제4일, 제8일 및 제16일에 뽑아내고, 측정까지 동결하여 유지하였다. 모든 샘플을 웨스 (Wes) 간단 웨스턴 시스템 (프로테인 심플 (Protein Simple))을 사용하여 분석하여 단량체 및 존재하는 임의의 다른 종의 존재를 검출하였다. 검출은 항-(His6) 모노클로날을 통해서였다. 이 실험의 과정에 걸쳐, SQT는 단량체 피크의 면적의 안정한 감소를 나타낸 반면 (도 6a), 다른 단백질은 안정하게 남아 있었다. SQT 단량체의 양의 감소는 SQT 이량체의 증가에 의해 매칭되었다 (도 6b). 이는 SQT가 V48L을 가지며, 따라서 여전히 이량체화할 수 있기 때문에 예상된다.
예를 들어 프로테아제 소화로부터 보다 낮은 분자량에서 나타나는 임의의 물질의 증거는 없었다.
동일한 결과가 완충제 (혈청이라기 보다는)에서 나타났다.
따라서, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 안정하며, 나타내어진 시간 과정에 걸쳐 인간 혈청에서, 또는 사실 표준 저장 완충제에서 유의하게 분해되지 않음이 입증된다.
실시예 7: 생물학적 중성 (파파인 결합)
인간 스테핀 A는 시스테인 프로테아제 파파인의 억제제이다. 인간 스테핀 A, SQT 및 3r2 및 3t4로 지칭되는 hSteA의 변이체를 파파인 활성 검정에서 시험하였다. 잔기 48 내지 50 및 73 내지 78 (hSteA 잔기 넘버링) 사이에 삽입된 이종 펩티드 (GGSGGSGGS) (서열식별번호: 92)를 갖는 3r2 및 3t4를 또한 시험하였다. 활성화된 파파인을 각각의 변이체의 희석 계열과 함께 인큐베이션한 후, 기질 (N-카르보벤질옥시-Phe-Arg-7-아미도-4-메틸쿠마린)을 첨가하였다. 각각의 반응의 형광을 기질 방출 후 5분 동안 측정하였다 (380 nm에서 여기, 460 nm에서 방출). 데이터를 도 11에 제시한다. hSteA는 파파인의 강력한 억제제이지만, 시험된 변이체 중 어느 것도 시험된 농도에 대해 파파인의 유의한 억제를 나타내지 않는다. 이는 생물학적 중성이 본 발명의 예시적인 스캐폴드 단백질에서 달성되었음을 입증한다.
실시예 8: 예시적인 라이브러리 수립
1. 벡터 제조
a. SapI 소화
● 반응 혼합물:
60 μL SapI (10 U/μL)
7.5 μL MfeI-HF (20 U/μL)
150 μg 벡터 (말단절단된 유전자 III을 함유함; 라이브러리는 스캐폴드-링커-유전자 III일 것임)
150 μL 컷스마트 (CutSmart) 완충제 (10x)
H20를 1500 μL로 첨가한다.
● 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한다 (500 μL 분취물).
● 소화의 성공을 아가로스 겔 상에서 점검한다.
b. 페놀/클로로포름 추출
● 1 부피의 페놀/클로로포름 (시그마; 77617)을 1 부피의 당신의 샘플에 (보다 큰 부피는 취급하기 보다 용이함; 500 μL가 이상적임) 1.5 mL 튜브에서 첨가하고, 튜브가 완전히 폐쇄된 것을 보장하고, 뒤집음으로써 철저하게 혼합한다.
● 샘플을 13,000 x g에서 5분 동안 (실온에서) 회전시킨다.
● 상부 층을 신선한 튜브 내로 주의깊게 옮긴다 (처음에 400 μL, 그 후 나머지).
● 1 부피의 클로로포름 (시그마; C0549)을 샘플에 첨가하고, 튜브가 완전히 폐쇄된 것을 보장하고, 뒤집음으로써 철저하게 혼합한다.
● 샘플을 13,000 x g에서 5분 동안 (실온에서) 회전시킨다.
● 상부 층을 신선한 2 mL 튜브 내로 주의깊게 옮긴다 (처음에 400 μL, 그 후 나머지).
● DNA를 이제 추출한다.
c. 에탄올 침전
● 0.1x 부피의 3 M 아세트산나트륨 (pH 5.2; 써모피셔 (ThermoFisher); R1181), 1 μL 글리코겐 (로슈 (Roche); 10901393001) 및 2.5x 부피의 사전-냉각된 (-20℃) 무수 에탄올을 페놀/클로로포름 추출된 샘플에 첨가하고; 뒤집음으로써 철저하게 혼합한다.
● 샘플을 -80℃에서 적어도 2시간 동안 인큐베이션한다 (밤새가 더 좋을 것임).
● 침전된 DNA를 사전-냉각된 원심분리기에서 16,000 x g / 4℃에서 15분 동안 회전시킨다.
● 상청액을 피펫팅함으로써 제거하고, 펠릿을 400 μL 사전-냉각된 70％ (v/v) 에탄올을 펠릿의 반대편에 첨가함으로써 세척한다.
● 16,000 x g / 4℃에서 5분 동안 다시 회전시킨다.
● 주의깊게 피펫팅함으로써 가능한 한 많은 에탄올을 제거한다.
● 펠릿이 실온에서 건조되도록 튜브를 열어 놓는다.
● DNA를 분자 등급수 (전형적으로 100 μL)에 재현탁시킨다.
d. 크로마스핀 (Chromaspin) TE-1000 컬럼으로의 정제
● 300 bp 미만의 소화 단편을 제거하기 위해 소화된 벡터 DNA를 크로마스핀 TE-1000 컬럼을 통해 추가로 정제한다. 정제된 벡터 DNA는 관류 중일 것이다. 이는 농축 단계가 아니다. 70 내지 100 μL DNA는 1 mg/mL의 최대 농도로 적용될 수 있다.
● 컬럼의 슬러리를 뒤집음으로써 혼합한다 (타카라 클론테크 (Takara Clontech); 636079).
● 컬럼의 말단을 부러뜨리고, 이를 수집 튜브에 정치한다.
● 컬럼의 뚜껑을 제거하고, 이를 수집 튜브와 함께 15 mL 팔콘 튜브에 정치한다.
● 700 x g / 4℃에서 5분 동안 회전시킨다.
● 컬럼을 새로운 수집 튜브 내로 옮기고, 15 mL 팔콘 튜브 내로 다시 옮긴다.
● 샘플을 이를 슬러리의 상부 상에 주의깊게 피펫팅함으로써 적용한다.
● 700 x g / 4℃에서 5분 동안 회전시킨다.
● 정제된 벡터 DNA는 이제 관류 중이며, -20℃에서의 저장을 위해 1.5 mL 튜브 내로 옮겨질 수 있다.
2. 삽입물 제조
a. SapI 소화
● 반응 혼합물:
15 μg 라이브러리 DNA (비오티닐화됨)
75 μL 컷스마트 완충제 (10x)
30 μL SapI (10 U/μL)
H2O를 750 μL로 첨가한다
● 3x 250 μL 분취물로 분할한다.
● 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하고 (에펜도르프 써모믹서 (Eppendorf Thermomixer)), 이어서 65 ℃/20분에서 열 불활성화시킨다 (열 차단).
b. 비드 정제 I (스트렙타비딘 비드)
● 세척 완충제 (2x)를 제조한다:
10 mM 트리스 (Tris)-HCl (pH 7.5)
1 mM EDTA
2 M NaCl
● 50 μL M280 스트렙타비딘 비드 (라이프테크놀로지즈 (LifeTechnologies) 11205D)를 1 mL 세척 완충제 (1x)와 혼합한다. 5초 이상 동안 볼텍싱함으로써 혼합한다.
● 비드를 자기 랙 상에 1분 동안 고정시킨다.
● 상청액을 제거하고, 1 mL의 세척 완충제 (1x)를 다시 첨가한다.
● 비드를 자기 랙 상에 1분 동안 고정시킨다.
● 상청액을 제거하고, 비드를 250 μL 세척 완충제 (2x)에 재현탁시킨다.
● 250 μL 소화물을 세척된 비드에 첨가하고, 롤러 믹서 상에서 실온에서 15분 동안 인큐베이션한다.
● 비드를 자기 랙 상에 2 내지 3분 동안 고정시킨다.
● 상청액을 새로운 튜브 (소화된 라이브러리 삽입물을 함유함) 내로 옮긴다.
c. 비드 정제 II (AM퓨어 (AMPure) 비드)
● 상청액을 새로운 튜브 (소화된 라이브러리 삽입물을 함유함) 내로 옮긴다.
● 600 μL AM퓨어 비드를 250 μL 소화된 및 스트렙타비딘-정제된 삽입물에 첨가한다. 롤러 믹서 상에서 10분 동안 인큐베이션한다.
● 비드를 자석 상에서 2 내지 3분 동안 고정시킨다. 상청액을 버린다.
● 비드를 1.1 mL 70％ (v/v) 에탄올로 세척한다.
● 비드를 자석 상에 2 내지 3분 동안 고정시킨다. 상청액을 버린다.
● 비드를 1.1 mL 70％ (v/v) 에탄올로 다시 세척한다.
● 비드를 자석 상에 2 내지 3분 동안 고정시킨다. 상청액을 버린다.
● 비드를 10분 동안 공기-건조시킨다.
● 비드를 50 μL 물에 2분 동안 재현탁시킨다.
● 비드를 자석 상에 2 내지 3분 동안 고정시키고, 상청액을 새로운 튜브 내로 옮긴다.
● 비드를 50 μL 물에 2분 동안 다시 재현탁시킨다.
● 비드를 자석 상에 2 내지 3분 동안 고정시키고, 상청액을 이전의 것과 동일한 튜브 내로 옮긴다.
● 소화 및 정제의 성공을 분석 아가로스 겔 상에서 점검한다.
3. 시험 라이게이션 및 초기 QC
a. 라이게이션
상이한 벡터:삽입물 비를 시험하기
● 라이게이션 혼합물 (삽입물이 없는 음성 대조군을 포함함):
100 ng 소화된 벡터
X ng 소화된 라이브러리 삽입물 (X는 라이게이션 비에 따라 다양함)
0.5 μL T4 DNA 리가제 (2000 U/μL)
2 μL T4 DNA 리가제 완충제 (10x)
H2O를 20 μL로 첨가한다
● 라이게이션 혼합물을 실온에서 30분 동안 인큐베이션한다. 리가제를 65℃에서 10분 동안 불활성화시킨다.
b. 전기천공
● 전기천공 큐벳 (2 mm)을 그들의 백에 정치하고, 1.5 mL 에펜도르프 튜브 및 멸균수를 얼음 상에 정치하여 사전-냉각시킨다.
● 전기적격 TG1 세포의 분취물을 얼음 상에 정치하여 해동시킨다.
● 60 μL의 빙냉된 멸균수를 60 μL TG1 세포에 첨가한다.
● 2 μL 라이게이션 혼합물을 사전-냉각된 1.5 mL 튜브 내로 분취한다.
● 25 μL의 희석된 TG1 세포를 각각의 튜브에 첨가하고, 플리킹함으로써 혼합한다.
● 세포/DNA 혼합물을 사전-냉각된 큐벳 내로 옮기고, 큐벳을 전기천공기 및 펄스 세포 (25 μF/200 ohm/2500 V) 내로 정치한다.
● 975 μL 회수 배지 (Recovery Medium)를 즉시 첨가하고, 상하로 3x 피펫팅하고, 세포 현탁액을 새로운 1.5 mL 튜브 내로 옮긴다.
● 세포를 37℃ / 1000 rpm에서 1시간 동안 인큐베이션한다.
● 세포를 2YT에서 10-2 및 10-3 희석하고, 50 μL를 25 μg/mL 클로람페니콜 및 2％ 글루코스로 보충된 2YT 한천 플레이트 상에 플레이팅한다. 플레이트를 30℃에서 16시간 동안 인큐베이션한다.
● 다음 날 cfu를 카운팅한다.
c. 시퀀싱
● 가장 양호한 벡터:삽입물 비를 선택하고, 콜로니를 카운팅 플레이트 (총 192개)로부터 25 μg/mL 클로람페니콜 및 2％ 글루코스로 보충된 1 mL 2YT 내로 집어낸다.
● 37℃ / 800 rpm / 35％ 습도에서 밤새 인큐베이션한다.
● 파지미드 DNA 및 서열을 M13-RP 프라이머로 단리한다.
4. 벌크 라이게이션
a. 라이게이션
● 라이게이션 혼합물 (2x 3.5 mL):
15 내지 20 μg SapI-소화된 pALSphm-더미T2
X μg SapI-소화된 라이브러리 삽입물 (X는 결정된 최적 라이게이션 비에 의존함)
70 μL T4 DNA 리가제 (2000 U/μL)
350 μL T4 DNA 리가제 완충제 (10x)
뉴클레아제-무함유수를 3.5 mL로 첨가한다
14x 500 μL 분취물로 분할한다
● 16℃에서 밤새 인큐베이션한다.
● 리가제를 65℃에서 10분 동안 불활성화시킨다.
b. 페놀/클로로포름 추출
● 1.b를 참조한다
c. 아미콘 (Amicon) 필터 유닛으로의 재-완충
● 추출된 DNA를 아미콘 필터 유닛 (50 K)에 첨가한다. 총 부피는 500 μL이어야 한다. 이는 필요할 경우 뉴클레아제-무함유수로 500 μL까지 첨가될 수 있다.
● 컬럼을 3,000 x g에서 10 내지 15분 동안 상부 컬럼 중의 액체 부피가 30 내지 50 μL로 하향될 때까지 회전시킨다.
● 관류액을 버리고, 농축된 샘플을 400 μL 뉴클레아제 무함유수로 보충한다. 물 및 샘플을 혼합하고, 3,000 x g에서 10 내지 15분 동안 상부 컬럼 중의 액체 부피가 30 내지 50 μL로 하향될 때까지 다시 회전시킨다.
● 샘플을 총 8x400 μL 뉴클레아제-무함유수로 재-완충시킨다.
● 마지막 회전 단계 후, 컬럼을 뒤집으면서 신선한 수집 튜브 내로 주의깊게 옮긴다. 1,000 x g에서 2분 동안 회전시키고, 용리된 DNA를 수집 튜브로부터 DNA-로바인드 (LoBind) 튜브 내로 옮긴다.
● DNA 농도를 측정한다.
5. 대규모 형질전환
a. 라이브러리를 슈팅하기
● 회수 배지를 37℃에서 해동시키고, 이를 사전-가온으로 유지한다.
● 18 내지 19 mL 2YT 배지를 갖는 일회용 125 mL 플라스크를 제조하고, 이를 37℃에서 사전-가온한다 (1x 형질전환을 위해 19 mL, 2x 형질전환을 위해 18 mL)
● 큐벳 (2 mm)을 얼음 상에서 그들의 백에 정치한다.
● 뉴클레아제-무함유수를 얼음 상에서 사전-냉각시킨다.
● 벌크 라이게이션을 해동시키고, 이를 얼음 상에서 유지한다.
● TG1 세포를 얼음 상에서 약 10분 동안 해동시킨다.
● 60 μL 사전-냉각된 뉴클레아제-무함유수를 세포 및 10 μL의 라이게이션 혼합물에 첨가한다. 플리킹함으로써 혼합한다.
● 희석된 세포/라이게이션 혼합물을 사전-냉각된 큐벳 내로 옮기고, 이를 벤치 상으로 부드럽게 두드림으로써 세포가 큐벳의 바닥에 있도록 한다.
● 큐벳을 전기천공기에 정치하고, 펄스 (25 μF / 200 ohm / 2500 V)를 인가한다.
● 펄스 후에 늦어도 10초까지 870 μL 회수 배지를 첨가하고, 부드럽게 3회 상하로 피펫팅한다.
● 형질전환된 세포를 제조된 125 mL 플라스크 내로 옮기고, 이들을 37℃ / 220 rpm에서 1시간 동안 인큐베이션한다. (2회의 연속적인 형질전환은 한 플라스크에서 풀링될 수 있음).
● 배양물을 50 mL 튜브 내로 옮기고, 3,220 x g에서 5분 동안 회전시킨다. 상청액을 버리고, 세포 펠릿을 1 mL 2YT에 재현탁시킨다. 10 μL를 계열 희석 (10-2/-4/-5/-6/-7)을 위해 제거하고, 나머지 세포를 형질전환 당 2YT 한천 (25 μg/mL 클로람페니콜, 2％ 글루코스)을 갖는 2개의 생물검정 디쉬 상에 플레이팅한다. 플레이팅된 부피를 메모한다.
● 20 μL의 10-5/-6/-7 희석액을 작은 한천 플레이트 (25 μg/mL 클로람페니콜, 2％ 글루코스를 갖는 2YT 한천) 상으로 플레이팅한다.
● 생물검정 디쉬 및 한천 플레이트를 30℃에서 밤새 인큐베이션한다.
● 형질전환을 충분한 형질전환된 세포가 수집될 때까지 (라이브러리 크기에 대해 목표한 것보다 약 10x) 반복한다. 생물검정 디쉬를 파라필름으로 밀봉하고, 모든 형질전환이 종료될 때까지 4℃에서 저장할 수 있다.
b. 생거 (Sanger) 시퀀싱에 의한 QC
● 3.c의 단계를 반복한다
c. 형질전환된 세포를 풀링하고 글리세롤을 제조하기
● 15％ (v/v) 글리세롤 (최종 농도)로 보충된 2YT 배지를 제조한다.
● 10 내지 15 mL 2YT/글리세롤 혼합물을 1개의 생물검정 디쉬에 첨가하고, 콜로니를 긁어낸다.
● 모든 콜로니가 긁어내어지면, 세포 현탁액을 다음 트레이 상으로 옮기고, 콜로니를 긁어내기를 계속한다. 현탁액이 매우 점성으로 된 경우, 이는 신선한 배지로 보충될 수 있다. 그러나, 최종 부피는 14 mL를 초과하지 않아야 한다.
● 모든 형질전환의 콜로니 (동일한 배치로부터 옴)가 풀링되었으면, 세포 현탁액을 15 mL 팔콘 튜브 내로 옮긴다.
● 각각의 튜브의 OD600을 측정하고, 각각의 형질전환 배치에 대한 카운팅 플레이트로부터 계산된 다양성에 따라 세포 현탁액을 합한다.
● 분취물은 15x 배 과다-표시된 라이브러리 다양성의 세포를 함유하도록 제조하고, -80℃에서 저장한다.
d. 글리세롤의 생존력을 시험하기
● 풀링된 라이브러리 글리세롤의 한 분취물을 해동시킨다.
● 풀링된 글리세롤 스톡의 계열 희석액을 2YT에서 제조한다 (10-6/10-7).
● 20 μL의 각각의 희석액을 25 μg/mL 클로람페니콜 및 2％ 글루코스 (이중!)로 보충된 LB 한천 플레이트 상에 플레이팅한다. 플레이트를 37℃에서 밤새 인큐베이션한다.
● Cfu 수는 mL 당 생존성 세포의 실제 농도를 지시한다.
6. 파지 번식
a. 필요한 글리세롤 스톡의 계산
● 글리세롤의 생존력에 관한 이전의 계산에 기초하여, 얼마나 많은 글리세롤이 10x 라이브러리 다양성을 커버하는 데 필요할 것인지를 계산한다.
b. 파지 배양
● 25 μg/ml 클로람페니콜 및 5％ 글루코스를 함유하는 6x 500 ml 사전-가온된 2xYT를 글리세롤로 2 리터 일회용 플라스크에서 OD600 = 0.08 내지 0.1로 접종하여 양호한 통기를 허용한다.
● OD600이 0.5가 될 때까지 (75 내지 90분) 250 rpm에서 진탕하면서 37℃에서 성장시킨다.
● 선택: 세포의 계산된 양이 OD 600 = 0.08 내지 0.1을 갖는 6개의 플라스크에 수용될 수 없는 경우, 일부 사전-배양물 (동일한 배지 및 멸균 플라스크)을 제조하고, 배양물을 1시간 동안 성장시키고, 그들 사전-배양물을 사용하여 주요 6개의 배양 플라스크를 접종한다
● 배양물을 원뿔형 500 mL 원심분리기 포트 (최대 500 mL) 내로 옮기고, 500 mL 배양물 당 2x1012개의 M13K07 헬퍼 파지를 첨가한다. 잘 혼합한다.
● 37℃ 수조에서 60분 동안 진탕하지 않고 인큐베이션한다.
● 3,300 xg, 20℃에서 15분 동안 회전시킨다. 필요할 경우 점검하고 재-회전시킨다. 각각의 원심분리기 튜브의 펠릿을 25 μg/ml 클로람페니콜 및 50 μg/ml 카나마이신 (및 0.1％ 글루코스)을 함유하는 2xYT에 재현탁시킨다. 원래 배양물 250 mL 당 500 ml을 사용한다.
● 배양물을 일회용 2 L 플라스크 (플라스크 당 최대 500 mL)로 옮긴다. 사전-감염 단계로부터의 플라스크는 재-사용될 수 있다.
● 25℃에서 밤새 진탕하면서 (170 rpm) 인큐베이션한다.
c. 파지 정제
● PEG-NaCl 분취물 (및 이용가능한 경우 0.5 L 또는 0.25 L 원심분리기 포트)을 차가운 방으로 옮겨 밤새 사전-냉각시킨다.
● 밤샘 배양물을 3,300 xg / 4℃에서 30분 동안 원심분리한다. 상청액을 회수하고, 100 mL 사전-냉각된 PEG/NaCl을 400 mL의 상청액 당 첨가한다. 그 전날 PEG/NaCl을 사전-분취하고, 이를 차가운 방에 밤새 방치하는 것이 바람직한데, 이는 이것이 튜브 및 PEG가 냉각되는 것을 보장할 것이고, 파지의 회수에 도움이 될 것이기 때문이다.
● 혼합물을 차가운 방에서 얼음 상에서 2 내지 3시간 동안 인큐베이션한다. PEG와 함께 밤새 인큐베이션하지 않는다. 이는 보다 큰 펠릿을 초래할 것이지만, 대부분 숙주 DNA 및 박테리아 데브리스에 기인할 것이다.
● 혼합물을 3,300 xg / 4℃에서 30분 동안 원심분리하고, 상청액을 버린다.
● 생성된 펠릿을 각각 PBS (400 mL SN + 100 mL PEG/NaCl 당 8 mL)에 재현탁시킨다. 펠릿이 완전히 재현탁되었으면, 파지 용액을 50 mL 팔콘 튜브 내로 옮기고, 11,600 xg / 4℃에서 10분 동안 다시 회전시킨다.
● 상청액을 새로운 50 mL 튜브 내로 옮기고, 사전-냉각된 PEG/NaCl (8 mL PBS 당 2 mL)을 첨가한다. 용액을 뒤집음으로써 잘 혼합하고, 얼음 상에서 1시간 동안 방치한다.
● 혼합물을 3,300 xg / 4℃에서 30분 동안 원심분리하고, 상청액을 버린다.
● 펠릿을 PBS (제1 침전 후 사용된 8 mL PBS 당 5 mL)에 재현탁시키고, 11,600 xg에서 10분 동안 원심분리하여 임의의 잔류의 박테리아 데브리스를 제거한다.
● 상청액을 풀링한다 (여과하지 않음). 글리세롤을 파지 용액에 첨가하고 (최종 농도 15 ％), 철저하게 혼합한다.
● 파지 스톡을 이제 제조하고, PBS / 15 ％ 글리세롤에서 4℃에서 (적정 및 제시 수준이 측정될 때까지 2일 이하), 그 후 작업 크기 분취물에서 -80℃에서 저장해야 한다 (각각의 파지 분취물은 라이브러리의 적어도 10x 과다-표시를 가져야 함). 단백질 로바인드 튜브를 사용한다.
● 광학 밀도 및 이. 콜라이 감염 둘 다에 의해 파지의 역가를 측정하는 것이 바람직하다. 제시 수준은 웨스턴 블롯팅에 의해 측정되어야 한다.
d. 오염/감염성 시험
● 14 cm 배기된 튜브에서 단일 콜로니로부터의 ER2738 이. 콜라이 세포의 5 ml 배양물 (12 μg/ml 테트라시클린으로 보충된 2YT 배지)을 설치한다.
● 오비탈 인큐베이터에서 37℃, 220 rpm에서 밤새 인큐베이션한다.
● 밤샘 ER2738 배양물의 10-1 희석액의 OD600을 측정한다.
● OD600이 <5인 경우, 이는 이들이 감염에 적합하지 않을 것임을 지시할 수 있다. 밤샘 배양물을 버리고, 신선한 밤샘 배양물을 제조한다.
● 20 mL 배양물을 OD600nm = 0.18 내지 0.20에서 ON을 12 μg/mL 테트라시클린으로 보충된 2YT에서 희석함으로써 제조한다. OD600nm를 조사한다.
● 37℃, 220 rpm에서 45 내지 90분 동안 세포가 0.50 내지 0.70의 OD600 범위에 도달할 때까지 인큐베이션한다.
● 이 인큐베이션 동안 하기를 제조한다:
○ 상부 한천 대조군 (오염 점검):
■ 수조를 45℃로 설정하고, 상부 한천을 마이크로웨이브에서 용융시킨다.
■ 4 x 3 ml 용융된 상부 한천을 14 cm 배기된 튜브 내로 분취하고, 수조에 정치하여 사용 전에 적어도 30분 동안 냉각시킨다.
■ 파지 샘플을 PBS에서의 계열 희석에 의해 제조하고, 얼음 상에 정치한다:
1E10 ph/mL
1E9 ph/mL
1E8 ph/mL
■ 두번째 반의 인큐베이션 동안, 10 μl 파지를 2 ml 마이크로퓨즈 튜브에 첨가한다.
■ 10 μL PBS를 갖는 또다른 2 ml 마이크로퓨즈 튜브 (이는 음성 대조군임)를 제조한다.
■ 튜브를 실온에서 필요할 때까지 방치한다.
○ 증폭된 파지 대조군:
■ 파지 샘플을 계열 희석에 의해 제조하고, 얼음 상에 정치한다:
2E9 ph/mL
2E8 ph/mL
2E7 ph/mL
2E6 ph/mL
2E5 ph/mL
■ 두번째 반의 인큐베이션 동안, 10 μl의 희석된 정제된 파지를 1.5 mL 튜브에 첨가한다.
■ 튜브를 실온에서 필요할 때까지 방치한다.
● ER2738 세포가 OD600 = 0.50 내지 0.70에 도달하면, 1 mL 세포를 각각의 제조된 1.5 및 2 mL 튜브에 첨가한다. 모든 튜브를 뒤집음으로써 혼합한다.
● 모든 튜브를 37℃에서 15분 동안 진탕하지 않고 즉시 인큐베이션한다.
● 15분 인큐베이션 후:
○ 증폭된 파지 대조군: 3x 2 ml 마이크로퓨즈 튜브를 37℃, 1000 rpm에서 튜브 진탕기로 옮기고, 추가의 시간 동안 인큐베이션한다.
○ 상부 한천 대조군 (용리된 파지): 300 μl의 세포/파지 혼합물을 상부 한천으로 제조된 14 cm 배기된 튜브에 첨가한다. 튜브를 돌림으로써 부드럽게 혼합하고, 12 μg/ml 테트라시클린으로 보충된 LB-한천 플레이트 상으로 즉시 붓고, 플레이트를 상부 한천 용액이 플레이트를 커버하도록 기울인다. 플레이트를 어두운 장소에서 한천-하향하도록 방치하여 상부 한천이 세팅되게 한다.
● 증폭된 파지 대조군: 각각의 희석액으로부터의 50 μl를 100 μg/ml 카르베니실린 또는 25 μg/mL 클로람페니콜 또는 50 μg/mL 카나마이신으로 보충된 LB-한천 플레이트 상으로 플레이팅한다.
● 모든 플레이트를 한천-상향으로 37℃에서 밤새 정적 인큐베이터에서 인큐베이션한다.
● 감염성 파지 [pfu/ml]를 계산한다.
7. 제시 수준 (항-gIIIp 웨스턴 블롯)
a. SDS-PAGE
● 1E11 파지를 6.5 μL PBS에서 제조하고, 2.5 μL의 4x 로딩 염료 및 1 μL 10x 환원제를 첨가한다. 이중 샘플을 제조한다.
● 70℃에서 10분 동안 인큐베이션한다.
● 파지 프렙을 12-웰 BOLT 비스-트리스 (Bis-Tris) 겔의 웰 내로 옮긴다.
● 겔을 200 V에서 22분 동안 실행한다.
b. 블롯팅
● 필터 페이퍼 (청색 백으로부터)를 밀리Q (MilliQ) 물로 적신다.
● 호일을 NC 미니/레귤러 스택 (Mini/Regular Stack)으로부터 벗기고, 플라스틱 트레이를 갖는 스택을 iBlot2 장치에 정치한다.
● 구리/겔 층을 스택으로부터 들어올리고, 이를 제거된 호일 상으로 정치한다.
● 스택의 니트로셀룰로스 막을 덮고 있는 얇은 플라스틱을 제거하고 버린다.
● SDS 겔을 보유하는 카세트를 열고, 웰 및 바닥 엣지를 제거하고, 이를 NC 막 상으로 정치한다 (이상적으로는 재위치화하지 않음). 임의의 버블은 젖은 글로브로 겔 위에 주의깊게 스트리킹함으로써 제거될 수 있다.
● 이전에 적신 필터 페이퍼를 겔의 상부 상에 정치하고, 롤러로 필터 페이퍼에 걸쳐 롤링함으로써 임의의 버블을 제거한다.
● 구리/겔 층을 다시 필터 페이퍼 상에 정치하고 (겔 측이 하향하도록), 롤러를 다시 사용한다.
● 부착된 전극을 갖는 필터 페이퍼를 NC 미니 스택 박스로부터 취하고, 이를 iBlot2 장치에서 전자장치를 덮고 있는 전극을 갖는 스택의 상부 상에 정치한다.
● iBlot2 장치의 뚜껑을 닫고, "마지막 실행 시작"이 디스플레이 상에 밝혀지는 것을 기다린다. 필요할 경우 전극을 갖는 필터 페이퍼를 재위치화한다.
● "주형"에서 P0 프로그램을 선택한다 (7분 걸림).
c. gIIIp의 검출
● 블롯팅된 니트로셀룰로스 막을 50 mL 팔콘 튜브 내로 옮기고, TBS pH 7.5 중 5 mL의 3 ％ (w/v) 탈지유를 그에 첨가한다.
● 혼합 롤러 상에서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한다.
● 차단 용액을 버리고, 막을 5 mL TBS-T (0.05％)를 첨가함으로서 세척한다.
● 혼합 롤러 상에서 실온에서 5분 동안 혼합한다. 2회 더 반복한다.
● 1차 항체: TBS pH 7.5 중 1 ％ (w/v) 탈지유 중 항-gIIIp 항체의 1:1000 희석액 5 mL를 첨가한다.
● 혼합 롤러 상에서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한다.
● 막을 전과 같이 TBS-T로 3x 세척한다.
● 2차 항체: TBS pH 7.5 중 1 ％ (w/v) 탈지유 중 HRP-커플링된 항-마우스 항체의 1:2000 희석액 5 mL를 첨가한다.
● 혼합 롤러 상에서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한다.
● 막을 전과 같이 TBS-T로 3x 세척한다.
● 결합된 항체를 1.5 mL의 화학발광 기질 (예를 들어 ECL)로 검출한다. 용액을 막 상에 1분 동안 방치한 후, 트레이를 기울이고, 임의의 과량의 ECL 용액을 페이퍼 타올로 받는다.
● 막을 화상화한다.
● 생성된 화상을 저장하고, 밴드를 정량화하고, 제시 수준을 평가한다.
실시예 9 - 추가의 예시적인 스캐폴드 단백질
본 발명은 청구범위에 언급된 바와 같이 인간 스테핀 A (서열식별번호: 1)에 관하여 특정 한정된 서열 동일성을 갖는 상기 기재된 바와 같은 돌연변이를 갖는 스테핀 A 스캐폴드를 포함한다. 여기에 본 발명자들은 상이한 수준의 서열 동일성에서의 기능성을 예시하는 본 발명에 따른 유용한 스캐폴드의 예를 제공한다.
이 실시예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 개 SteA로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다.
개 야생형 서열에 비한 돌연변이는 밑줄친다 (서열식별번호: 1에 비한 돌연변이는 서열 정렬에 의해 확인될 수 있음).
cSteA3r2: 서열식별번호: 93
Figure pct00034
(GGS)3 이종 펩티드 삽입 (박스침)을 갖는 cSteA3r2: 서열식별번호: 94
Figure pct00035
이들은 성공적으로 발현되었다.
예시적인 Tm 측정은 하기와 같다:
cSteA 3r2 Tm = 79.2℃
루프 2 및 4에 (GGS)3을 갖는 cSteA 3r2 Tm = 83.6℃
이는 이종 펩티드가 hSteA에 대하여 교시된 바와 같은 위치에 삽입될 수 있음을 입증한다.
cSteA에 기초한 추가의 예시적인 서열 (야생형 cSteA로부터의 변화는 밑줄침)로는 하기를 들 수 있다:
Figure pct00036
cSteAtA는 번역의 가능한 모호한 개시를 방지하고 (M2I - hSteA 서열로 복귀함), 글리코실화 부위를 제거하고 (N32G), 도메인 교환 이량체화를 최소화하는 (V48D - 이미 기재됨) 이점을 갖는 돌연변이의 최소 세트를 포함한다. 이들 돌연변이는 유용하며, 개별적으로 생성될 수 있다.
Figure pct00037
cSteAtB는 최소 돌연변이 및 유리하게는 루프 4의 "진입" 및 "퇴장"을 hSteA와 동일하게 만드는 추가의 돌연변이 (G72S, P78E 및 T79D - 모두 hSteA 서열로 복귀함)를 포함한다.
Figure pct00038
cSteAtC는 최소 돌연변이 및 잔기를 인간 서열로 "복귀시키는" 야생형 cSteA에 비해 추가의 돌연변이 (잔기는 hSteA에서 불안정화되는 것으로 밝혀졌음 (A20V, F38L - 둘 다 hSteA 서열로 복귀함))를 포함한다. 이는 cSteA에 기초한 폴리펩티드를 보다 안정하게 하는 이점을 갖는다.
Figure pct00039
cSteAtD는 최소 돌연변이 및 루프 4의 "진입" 및 "퇴장"을 hSteA와 동일하게 만드는 돌연변이 (G72S, P78E 및 T79D - 모두 hSteA 서열로 복귀함)를 조합한다 포함한다.
Figure pct00040
cSteAtA로서 그러나 GGSGGSGGS (서열식별번호: 92) 이종 펩티드 삽입 (박스침)을 포함함 - 잔기 48 대신 1개 및 잔기 74 내지 77 대신 1개
Figure pct00041
cSteAtB로서 그러나 GGSGGSGGS (서열식별번호: 92) 이종 펩티드 삽입 (박스침)을 포함함 - 잔기 48 대신 1개 및 잔기 74 내지 77 대신 1개
Figure pct00042
cSteAtC로서 그러나 GGSGGSGGS (서열식별번호: 92) 이종 펩티드 삽입 (박스침)을 포함함 - 잔기 48 대신 1개 및 잔기 74 내지 77 대신 1개
Figure pct00043
cSteAtD로서 그러나 GGSGGSGGS (서열식별번호: 92) 이종 펩티드 삽입 (박스침)을 포함함 - 잔기 48 대신 1개 및 잔기 74 내지 77 대신 1개
추가의 예시적인 스캐폴드
야생형 cSteA는 이미 유익한 잔기 E42 및 I65 및 I51을 함유한다 (T51L은 가장 바람직하지만, T51I는 동등하게 양호함). 최소 돌연변이체 cSteAA (상기)는 hSteA 서열로부터 유래된 3t5와 등가이다.
여기서 본 발명자들은 하기 주어진 개 서열 (cSteAr1)을 사용하여 hSteA 3r1에 대한 등가물을 입증한다.
Figure pct00044
cSteA 3r2는 이미 상기 제시되어 있다 (서열식별번호: 93).
실시예 10: 증가된 Tm
돌연변이(들)를 갖는 폴리펩티드를 본원에 기재된 바와 같이 생성하였다.
이 실시예에서, 폴리펩티드는 기재된 바와 같은 돌연변이를 갖는 인간 Ste A 서열 (서열식별번호: 1)에 기초하였으며; 야생형 인간 SteA에 비한 데이터를 하기에 나타낸다.
증가하는 안정성 치환의 표
Figure pct00045
Figure pct00046
실시예 11: 감소된 Tm
돌연변이(들)를 갖는 폴리펩티드를 본원에 기재된 바와 같이 생성하였다.
이 실시예에서, 폴리펩티드는 기재된 바와 같은 돌연변이를 갖는 인간 Ste A 서열 (서열식별번호: 1)에 기초하였으며; 야생형 인간 SteA에 비한 데이터를 하기에 나타낸다.
감소하는 안정성 치환의 표
Figure pct00047
Figure pct00048
실시예 12: 다양한 3r2 결합제 및 다양한 유형 4 (개) 결합제의 입증
유형 3r2 라이브러리
도 12 내지 14는 "iQue 검정"에서 시험된, 인간 표피 성장 인자 수용체 2 (Her2), 인간화 모노클로날 치료 항체 트라스투주맙, 및 인간 프로그래밍된 사멸-리간드 1 (PD-L1)에 대한 선택의 출력을 나타낸다. 이들 데이터는 아피머 시약이 관련된 및 비관련된 단백질에 대한 교차-반응성 없이, 표적에 긴밀하고 특이적으로 결합할 수 있음을 나타낸다. 이들 데이터는 또한 아피머 시약으로부터의 결과가, 루프 서열이 종종 유사한 결과를 제공하는 iQue 검정에서 다수회 표시되기 때문에 검출가능함을 나타낸다.
인텔리시트 iQue 스크리너 (Intellicyt iQue Screener)는 표적 단백질 및 관련 대조군이 형광적으로 인덱싱된 비드 상에 고정되는 유동-세포측정법 기재, 다중 비드 검정이다. 아피머 시약을 비드와 함께 인큐베이션하고, 표적 단백질에 결합하며, 그 후 복합체를 항-HA 알렉사488 표지된 항체로 검출한다. 스크리닝을 위해, iQue 검정을 사용하여 바람직한 표적에 대한 그들의 친화도 및 선택성에 기초하여 가장 양호한 아피머 시약을 선택한다. 이상적으로, 아피머 시약은 그들의 표적에 코팅된 비드에 대해 강한 양성 신호를 나타낼 것이지만, 다른 비드 중 임의의 것에 대해서는 그렇지 않을 것이다.
도 12 내지 14에서, 아피머 작업 ID는 내부 식별자이며; 이종 펩티드는 루프 2 및 루프 4 위치에 제시된다 (삽입된다). 아미노산 서열은 DNA 시퀀싱 데이터로부터 측정된다. iQue 검정에서 시험된 표적은 EGFR, mIgG2b, hIgGG1 Fc, hPD-L2, Her2 (R&D), hPD-L1, 트라스투주맙, hIgG, Her2 (Sino), Her 3, mPD-L1, 아바스틴, 휴미라, 리툭시맙, mPD-L2, Her 4 및 표적 없는 대조군이었다. FL1-A는 측정된 신호이다. QSHxx (여기서 xx는 수임)는 특이적 유형의 형광적으로 인덱싱된 비드를 지칭한다.
도 12는 Her2에의 결합제에 대한 iQue 검정의 출력을 나타낸다.
도 13은 트라스투주맙에의 결합제에 대한 iQue 검정의 출력을 나타낸다.
도 14는 인간 PD-L1에의 결합제에 대한 iQue 검정의 출력을 나타낸다.
도 15 및 16은 전형적인 다중-점 ELISA 데이터를 나타내며, 여기서 아피머 시약은 96 웰 플레이트 상에 코팅되고, 포획 시약으로서 사용된다. 이들 데이터는 파지 ELISA (플레이트 상에서, 그러나 아피머 시약이 파지에 부착됨) 또는 iQue 검정 (비드 상에서, 그러나 정제된 아피머 시약) 중 어느 하나에서 확인된 결합제가 전형적인 ELISA 적용에서 표적을 검출할 수 있고, 그 신호가 적정가능하며, 특히 PD-L1에 대해, 낮은 농도의 표적이 검출될 수 있음을 나타낸다.
여기서, PD-L1 (도 15) 및 Her2 (도 16)에 대해 확인된 아피머 시약을 ELISA 플레이트 상에 고정된 농도로 코팅하였다. 세척 및 차단 후, 적절한 비오티닐화된 표적을 적정하고, 코팅된 아피머 시약에 결합하도록 방치한다. 추가의 세척 후, 스트렙타비딘-HRP를 사용하여 포획된 표적의 존재를 적절한 기질의 사용으로 검출한다. 둘 다의 항-PD-L1 아피머 시약은 비오티닐화된 PD-L1에 낮은 농도에서 결합하고, 비오티닐화된 PD-L1은 ELISA 플레이트에 결합하지 않는다 (외피 없는 대조군; 각각의 클론은 별개의 ELISA 플레이트 상에 있었으며, 각각은 그 자신의 외피 대조군을 함유하지 않았음). 항-Her2 아피머 시약은 보다 낮은 전체 신호를 갖는 항-PD-L1 아피머 시약만큼 잘 수행하지 않지만, 이들은 적정가능한 반응을 입증한다. 여기서, 비오티닐화된 Her2는 시험된 최고 농도에서 ELISA 플레이트와 약간 상호작용한다.
도 15는 2가지 상이한 항-PD-L1 아피머 시약 (클론 A8 및 G8)에 대한 ELISA 데이터를 나타낸다.
도 16은 2가지 상이한 항-Her2 아피머 시약 (클론 C4 및 E10)에 대한 ELISA 데이터를 나타낸다.
유형 4 라이브러리 (개 스캐폴드)
스테핀 A의 추정 개 동족체에 기초한 유형 4 라이브러리는 개 PD-L1에 대한 아피머 시약, 구체적으로 개 PD-1 및 개 PD-L1 사이의 상호작용을 억제할 것들을 선택하는 데 사용되었다. 이들 시약에 대한 iQue 검정의 출력 (도 17; 상기와 같은 iQue 스크리너의 설명)은 본 발명자들이 또한 이 개 스캐폴드를 사용하여 특이적 결합 시약을 발견할 수 있음을 나타낸다. 여기서, 상위 6개의 아피머 시약은 인간 Fc에 대한 교차-반응성을 나타내고 있으며, 선택 프로세스에 사용된 개 PD-L1은 개 PD-L1 / 인간 Fc 융합 단백질이다. 개 PD-L1에 실제로 결합하기 보다는, 이들은 현실적으로 인간 Fc 도메인에 대한 매우 양호한 결합 시약이다. 비-인간 단백질, 예컨대 개 단백질에 기초한 스캐폴드의 사용은 비-인간 (생체)치료제, 예컨대 개 (생체)치료제를 제조하는 데 유용하며, 이는 훨씬 더 면역원성이고, 따라서 상이한 종으로부터 유래된 치료제보다 더 양호하게 내성화되어야 한다.
도 17은 개 스테핀 A-기재 아피머 시약에 의한 개 PD-L1에의 결합제에 대한 iQue 검정의 출력을 나타낸다. 도 17에서, iQue 검정에서 시험된 표적은 개 PD-L1, 인간 VEGFR2, SMA(4A6)+BA-펩티드, 인간 Fc, 개 PD-1, 아민 PEG11, mIgG2b, 푸모니신 및 SMA (2A9) + BA-펩티드, 뿐만 아니라 표적 없는 대조군이었다.
개 스캐폴드에 대한 한 산업적 용도는 개 치료 시약을 생성하는 것이다. 적합하게는 개 아피머 시약은 그들의 표적에 결합하고, 적합하게는 생물학적 효과를 갖는 천연 리간드의 결합을 방해하도록 하는 방식으로 그렇게 한다. 이 선택에서, 본 발명자들은 암 치료에서 관문 억제제로서 사용하기 위한 잠재성을 가질, 개 PD-L1에의 개 PD-1 결합을 방지하는 개 아피머 시약을 발견하기를 원하였다. 여기서, 11개의 항-개 PD-L1 아피머 시약을 개 PD-L1과 개 PD-1의 상호작용을 억제하는 그들의 능력에 대해 경쟁 ELISA에서 시험하였다. 결과는 일부 개 아피머 시약이 개 PD-1과 대략 동일한 친화도로 및 다른 것은 다양한 보다 낮은 친화도로 개 PD-L1에 결합할 수 있음을 나타내었다.
다음으로, ELISA 플레이트를 개 PD-1로 코팅하였다. 별개로, 비오티닐화된 개 PD-L1을 상이한 아피머 시약, 및 대조군으로서 개 PD-1 (경쟁 반응물)의 적정으로 인큐베이션한다. 인큐베이션 후, 이들 경쟁 반응물을 그 후 코팅된 ELISA 플레이트와 함께 인큐베이션한다. 억제가 없는 경우, 비오티닐화된 PD-L1은 플레이트의 표면 상에서 PD-1에 결합하는 데 자유로울 것이며, 이는 스트렙타비딘-HRP 시약 및 적합한 기질로 검출되는 경우 높은 신호를 제공할 것이다. 그러나, 아피머 시약이 PD-1에의 결합을 억제하는 방식으로 개 PD-L1에 결합하는 경우, 이는 낮은 신호를 제공할 것이다. 도 18은 PD-1과 유사한 친화도를 갖는 개 아피머 시약에 대한 경쟁 ELISA 데이터를 나타내고, 도 19는 PD-1보다 더 낮은 친화도를 갖는 개 아피머 시약에 대한 데이터를 나타낸다.
도 18은 개 PD-1과 유사한 친화도로 cPD-L1에 결합하는 개 아피머 시약에 대한 경쟁 ELISA를 나타낸다. 곡선은 4-변수 로지스틱 모델에 대한 적합이다.
도 19는 개 PD-1보다 더 낮은 친화도로 cPD-L1에 결합하는 개 아피머 시약에 대한 경쟁 ELISA를 나타낸다. 곡선은 4-변수 로지스틱 모델에 대한 적합이다.
도 12 내지 14에서의 모든 아피머는 mIgG2b G12 및 지카 (Zika) NS1 C12를 제외하고 3r2 (서열식별번호: 19)이다 - 하기 참조.
마우스 IgG2b G12는 아드히론 스캐폴드 ("유형 2 스캐폴드", 인간 스테핀 A과 그다지 비관련된 식물 스테핀의 컨센서스)를 갖는다. 서열은 하기와 같다:
Figure pct00049
개 아피머는 야생형 cSteA로부터의 돌연변이 M2I, N32G 및 V48D (밑줄침)를 갖는다; 하기 서열:
Figure pct00050
이 예에서, 지카 NS1 C12는 또한 아드히론 스캐폴드에 기초한다:
Figure pct00051
SEQUENCE LISTING <110> Avacta Life Sciences Limited <120> Scaffold Proteins <130> P10266GBWO <150> GB1710973.7 <151> 2017-07-07 <160> 107 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ile Pro Gly Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile 1 5 10 15 Gln Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn 20 25 30 Glu Thr Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Val 35 40 45 Ala Gly Thr Asn Tyr Tyr Ile Lys Val Arg Ala Gly Asp Asn Lys Tyr 50 55 60 Met His Leu Lys Val Phe Lys Ser Leu Pro Gly Gln Asn Glu Asp Leu 65 70 75 80 Val Leu Thr Gly Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp Glu Leu Thr 85 90 95 Gly Phe <210> 2 <211> 294 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon optimised nucleic acid encoding SEQ ID NO:1 <400> 2 atgattcctg gtggtttgtc ggaagccaaa ccggctactc cggaaatcca ggagattgtg 60 gacaaagtca aaccgcaact ggaggaaaag accaatgaaa cctatggcaa actcgaagcg 120 gtacagtaca aaacccaagt cgttgcgggt acgaactact acatcaaagt acgcgcagga 180 gataacaagt atatgcatct gaaagtgttc aaaagcttac cagggcagaa tgaggatctg 240 gttcttacgg gctatcaggt ggataagaac aaagacgatg aactgacagg cttt 294 <210> 3 <211> 98 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 3 Met Met Pro Gly Gly Leu Thr Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Val 1 5 10 15 Gln Glu Ile Ala Asn Glu Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Asn 20 25 30 Glu Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Ala Val Glu Tyr Lys Thr Gln Val Val 35 40 45 Ala Gly Ile Asn Tyr Tyr Ile Lys Val Arg Val Gly Asp Asn Ser Tyr 50 55 60 Ile His Leu Lys Ile Phe Lys Gly Leu Pro Gly Gln Asn Pro Thr Leu 65 70 75 80 Thr Leu Thr Gly Tyr Gln Thr Asp Lys Ser Lys Asp Asp Glu Leu Thr 85 90 95 Gly Phe <210> 4 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hIgG1a_191 <400> 4 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro Gly Lys 225 <210> 5 <211> 225 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hIgG1a_189 [hIgG1a_191 sans "GK" on C term <400> 5 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro 225 <210> 6 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hIgG1a_191b [A/F subtype] <400> 6 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg 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(49)..(49) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (74)..(74) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 18 Met Ile Pro Gly Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile 1 5 10 15 Gln Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Lys Glu Thr Gly 20 25 30 Lys Thr Trp Gly Lys Leu Glu Ala Val Glu Tyr Lys Thr Gln Val Asp 35 40 45 Xaa Asn Gly Leu Asn Tyr Tyr Ile Lys Val Arg Val Gly Asn Lys Tyr 50 55 60 Ile His Leu Lys Val Phe Lys Ser Leu Xaa Asn Glu Asp Leu Val Leu 65 70 75 80 Thr Gly Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe 85 90 95 <210> 19 <211> 96 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3r2 with insertions after TQVD and FKSL <220> <221> misc_feature <222> (49)..(49) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (74)..(74) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 19 Met Ile Pro Gly Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile 1 5 10 15 Gln Glu Ile Val 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<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (75)..(75) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 22 Met Ile Pro Gly Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile 1 5 10 15 Gln Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Gly 20 25 30 Glu Thr Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Lys Thr Gln Val Asp 35 40 45 Xaa Asn Gly Leu Asn Tyr Tyr Ile Lys Val Arg Ala Gly Asp Asn Lys 50 55 60 Tyr Ile His Leu Lys Val Phe Lys Ser Leu Xaa Asn Glu Asp Leu Val 65 70 75 80 Leu Thr Gly Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly 85 90 95 Phe <210> 23 <211> 97 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3t4 with insertions after TQVD and FKSL <220> <221> misc_feature <222> (49)..(49) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (75)..(75) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 23 Met Ile Pro Gly Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile 1 5 10 15 Gln Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Gly 20 25 30 Glu Thr Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Glu Tyr Lys Thr Gln Val Asp 35 40 45 Xaa Asn Gly Thr Asn Tyr Tyr Ile Lys Val Arg Ala Gly Asp Asn Lys 50 55 60 Tyr Ile His Leu Lys Val Phe Lys Ser Leu Xaa Asn Glu Asp Leu Val 65 70 75 80 Leu Thr Gly Tyr Gln Val Asp Lys Asn Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly 85 90 95 Phe <210> 24 <211> 97 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3t5 with insertions after TQVD and FKSL <220> <221> misc_feature <222> (49)..(49) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (75)..(75) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 24 Met Ile Pro Gly Gly Leu Ser Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Ile 1 5 10 15 Gln Glu Ile Val Asp Lys Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Gly 20 25 30 Glu Thr Tyr Gly Lys Leu Glu Ala Val Glu Tyr Lys Thr Gln Val Asp 35 40 45 Xaa Asn Gly Leu Asn Tyr Tyr Ile Lys Val Arg Ala Gly Asp Asn Lys 50 55 60 Tyr Ile His Leu Lys Val Phe Lys Ser Leu Xaa Asn Glu 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Leu Trp Phe Phe Leu Leu 1 5 10 15 Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp Val Leu Ser 20 25 <210> 36 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> signal peptide <400> 36 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Leu Ser Gly Ala Arg Cys 20 <210> 37 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> signal peptide <400> 37 Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala 1 5 10 15 Ala Gln Pro Ala Met Ala 20 <210> 38 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> signal peptide <400> 38 Met Gly Val Lys Val Leu Phe Ala Leu Ile Cys Ile Ala Val Ala Glu 1 5 10 15 Ala <210> 39 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> signal peptide <400> 39 Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala 1 5 10 15 Tyr Ser <210> 40 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> signal peptide <400> 40 Met Ala Phe Leu Trp Leu Leu Ser Cys Trp Ala Leu Leu Gly Thr Thr 1 5 10 15 Phe Gly <210> 41 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> signal peptide <400> 41 Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ile Leu Ala Leu Val 1 5 10 <210> 42 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> signal peptide <400> 42 Met Asn Leu Leu Leu Ile Leu Thr Phe Val Ala Ala Ala Val Ala 1 5 10 15 <210> 43 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> signal peptide <400> 43 Met Pro Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp Ala Gly Ala Leu Ala 1 5 10 15 <210> 44 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> signal peptide <400> 44 Met Asp Ser Lys Gly Ser Ser Gln Lys Gly Ser Arg Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Val Val Ser Asn Leu Leu Leu Cys Gln Gly Val Val Ser 20 25 30 <210> 45 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> signal peptide <400> 45 Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly 1 5 10 15 Ala Val Phe Val Ser Pro Ser 20 <210> 46 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> signal peptide <400> 46 Met Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu 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Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser 20 <210> 91 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant immunoglobulin <400> 91 Glu Pro Lys Ser Ser Gly Ser Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser 20 <210> 92 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heterologous peptide insertion <400> 92 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser 1 5 <210> 93 <211> 97 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cSteA3r2 <400> 93 Met Met Pro Gly Gly Leu Thr Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Val 1 5 10 15 Gln Glu Ile Ala Asn Glu Val Lys Pro Gln Leu Glu Lys Glu Thr Gly 20 25 30 Lys Thr Trp Gln Glu Phe Glu Ala Val Glu Tyr Lys Thr Gln Val Asp 35 40 45 Ala Gly Leu Asn Tyr Tyr Ile Lys Val Arg Val Asn Gly Lys Tyr Ile 50 55 60 His Leu Lys Ile Phe Lys Gly Leu Pro Gly Gln Asn Pro Thr Leu Thr 65 70 75 80 Leu Thr Gly Tyr Gln Thr Asp Lys Ser Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly 85 90 95 Phe <210> 94 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cSteA3r2 with (GGS)3 heterologous peptide insertions <400> 94 Met Met Pro Gly Gly Leu Thr Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Val 1 5 10 15 Gln Glu Ile Ala Asn Glu Val Lys Pro Gln Leu Glu Lys Glu Thr Gly 20 25 30 Lys Thr Trp Gln Glu Phe Glu Ala Val Glu Tyr Lys Thr Gln Val Asp 35 40 45 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Leu Asn Tyr Tyr Ile Lys 50 55 60 Val Arg Val Asn Gly Lys Tyr Ile His Leu Lys Ile Phe Lys Gly Leu 65 70 75 80 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Pro Thr Leu Thr Leu Thr Gly 85 90 95 Tyr Gln Thr Asp Lys Ser Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe 100 105 110 <210> 95 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cSteAtA <400> 95 Met Ile Pro Gly Gly Leu Thr Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Val 1 5 10 15 Gln Glu Ile Ala Asn Glu Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Gly 20 25 30 Glu Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Ala Val Glu Tyr Lys Thr Gln Val Asp 35 40 45 Ala Gly Ile Asn Tyr Tyr Ile Lys Val Arg Val Gly Asp Asn Ser Tyr 50 55 60 Ile His Leu Lys Ile Phe Lys Gly Leu Pro Gly Gln Asn Pro Thr Leu 65 70 75 80 Thr Leu Thr Gly Tyr Gln Thr Asp Lys Ser Lys Asp Asp Glu Leu Thr 85 90 95 Gly Phe <210> 96 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cSteAtB <400> 96 Met Ile Pro Gly Gly Leu Thr Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Val 1 5 10 15 Gln Glu Ile Ala Asn Glu Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Gly 20 25 30 Glu Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Ala Val Glu Tyr Lys Thr Gln Val Asp 35 40 45 Ala Gly Ile Asn Tyr Tyr Ile Lys Val Arg Val Gly Asp Asn Ser Tyr 50 55 60 Ile His Leu Lys Ile Phe Lys Ser Leu Pro Gly Gln Asn Glu Asp Leu 65 70 75 80 Thr Leu Thr Gly Tyr Gln Thr Asp Lys Ser Lys Asp Asp Glu Leu Thr 85 90 95 Gly Phe <210> 97 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cSteAtC <400> 97 Met Ile Pro Gly Gly Leu Thr Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Val 1 5 10 15 Gln Glu Ile Val Asn Glu Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Gly 20 25 30 Glu Thr Tyr Gln Glu Leu Glu Ala Val Glu Tyr Lys Thr Gln Val Asp 35 40 45 Ala Gly Ile Asn Tyr Tyr Ile Lys Val Arg Val Gly Asp Asn Ser Tyr 50 55 60 Ile His Leu Lys Ile Phe Lys Gly Leu Pro Gly Gln Asn Pro Thr Leu 65 70 75 80 Thr Leu Thr Gly Tyr Gln Thr Asp Lys Ser Lys Asp Asp Glu Leu Thr 85 90 95 Gly Phe <210> 98 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cSteAtD <400> 98 Met Ile Pro Gly Gly Leu Thr Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Val 1 5 10 15 Gln Glu Ile Val Asn Glu Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Gly 20 25 30 Glu Thr Tyr Gln Glu Leu Glu Ala Val Glu Tyr Lys Thr Gln Val Asp 35 40 45 Ala Gly Ile Asn Tyr Tyr Ile Lys Val Arg Val Gly Asp Asn Ser Tyr 50 55 60 Ile His Leu Lys Ile Phe Lys Ser Leu Pro Gly Gln Asn Glu Asp Leu 65 70 75 80 Thr Leu Thr Gly Tyr Gln Thr Asp Lys Ser Lys Asp Asp Glu Leu Thr 85 90 95 Gly Phe <210> 99 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cSteAt1AL <400> 99 Met Ile Pro Gly Gly Leu Thr Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Val 1 5 10 15 Gln Glu Ile Ala Asn Glu Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Gly 20 25 30 Glu Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Ala Val Glu Tyr Lys Thr Gln Val Asp 35 40 45 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ile Asn Tyr Tyr Ile Lys 50 55 60 Val Arg Val Gly Asp Asn Ser Tyr Ile His Leu Lys Ile Phe Lys Gly 65 70 75 80 Leu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Pro Thr Leu Thr Leu Thr 85 90 95 Gly Tyr Gln Thr Asp Lys Ser Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe 100 105 110 <210> 100 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cSteAt2BL <400> 100 Met Ile Pro Gly Gly Leu Thr Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Val 1 5 10 15 Gln Glu Ile Ala Asn Glu Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Gly 20 25 30 Glu Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Ala Val Glu Tyr Lys Thr Gln Val Asp 35 40 45 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ile Asn Tyr Tyr Ile Lys 50 55 60 Val Arg Val Gly Asp Asn Ser Tyr Ile His Leu Lys Ile Phe Lys Ser 65 70 75 80 Leu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Glu Asp Leu Thr Leu Thr 85 90 95 Gly Tyr Gln Thr Asp Lys Ser Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe 100 105 110 <210> 101 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cSteAt3CL <400> 101 Met Ile Pro Gly Gly Leu Thr Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Val 1 5 10 15 Gln Glu Ile Val Asn Glu Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Gly 20 25 30 Glu Thr Tyr Gln Glu Leu Glu Ala Val Glu Tyr Lys Thr Gln Val Asp 35 40 45 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ile Asn Tyr Tyr Ile Lys 50 55 60 Val Arg Val Gly Asp Asn Ser Tyr Ile His Leu Lys Ile Phe Lys Gly 65 70 75 80 Leu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Pro Thr Leu Thr Leu Thr 85 90 95 Gly Tyr Gln Thr Asp Lys Ser Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe 100 105 110 <210> 102 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cSteAt4DL <400> 102 Met Ile Pro Gly Gly Leu Thr Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Val 1 5 10 15 Gln Glu Ile Val Asn Glu Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Gly 20 25 30 Glu Thr Tyr Gln Glu Leu Glu Ala Val Glu Tyr Lys Thr Gln Val Asp 35 40 45 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ile Asn Tyr Tyr Ile Lys 50 55 60 Val Arg Val Gly Asp Asn Ser Tyr Ile His Leu Lys Ile Phe Lys Ser 65 70 75 80 Leu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Glu Asp Leu Thr Leu Thr 85 90 95 Gly Tyr Gln Thr Asp Lys Ser Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly Phe 100 105 110 <210> 103 <211> 97 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cSteAr1 <400> 103 Met Met Pro Gly Gly Leu Thr Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Val 1 5 10 15 Gln Glu Ile Ala Asn Glu Val Lys Pro Gln Leu Glu Lys Glu Thr Gly 20 25 30 Lys Thr Trp Gln Glu Phe Glu Ala Val Glu Tyr Lys Thr Gln Val Asp 35 40 45 Ala Gly Leu Asn Tyr Tyr Ile Lys Val Arg Val Gly Asn Lys Tyr Ile 50 55 60 His Leu Lys Ile Phe Lys Gly Leu Pro Gly Gln Asn Pro Thr Leu Thr 65 70 75 80 Leu Thr Gly Tyr Gln Thr Asp Lys Ser Lys Asp Asp Glu Leu Thr Gly 85 90 95 Phe <210> 104 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tag <400> 104 Gly His His His His His His 1 5 <210> 105 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse IgG2b G12 adhiron scaffold <220> <221> misc_feature <222> (50)..(58) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (84)..(92) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 105 Met Ser Ala Ala Thr Gly Val Arg Ala Val Pro Gly Asn Glu Asn Ser 1 5 10 15 Leu Glu Ile Glu Glu Leu Ala Arg Phe Ala Val Asp Glu His Asn Lys 20 25 30 Lys Glu Asn Ala Leu Leu Glu Phe Val Arg Val Val Lys Ala Lys Glu 35 40 45 Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Met Tyr Tyr Leu Thr 50 55 60 Leu Glu Ala Lys Asp Gly Gly Lys Lys Lys Leu Tyr Glu Ala Lys Val 65 70 75 80 Trp Val Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asn Phe Lys Glu 85 90 95 Leu Gln Glu Phe Lys Pro Val Gly Asp Ala Ala Ala Ala His His His 100 105 110 His His His Gly 115 <210> 106 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> canine Affimers with the mutations M2I, N32G and V48D from wildtype cSteA <400> 106 Met Ile Pro Gly Gly Leu Thr Glu Ala Lys Pro Ala Thr Pro Glu Val 1 5 10 15 Gln Glu Ile Ala Asn Glu Val Lys Pro Gln Leu Glu Glu Lys Thr Gly 20 25 30 Glu Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Ala Val Glu Tyr Lys Thr Gln Val Asp 35 40 45 Ala Gly Ile Asn Tyr Tyr Ile Lys Val Arg Val Gly Asp Asn Ser Tyr 50 55 60 Ile His Leu Lys Ile Phe Lys Gly Leu Pro Gly Gln Asn Pro Thr Leu 65 70 75 80 Thr Leu Thr Gly Tyr Gln Thr Asp Lys Ser Lys Asp Asp Glu Leu Thr 85 90 95 Gly Phe <210> 107 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Zika NS1 C12 based on the adhiron scaffold <220> <221> misc_feature <222> (50)..(58) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (84)..(92) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 107 Met Ser Ala Ala Thr Gly Val Arg Ala Val Pro Gly Asn Glu Asn Ser 1 5 10 15 Leu Glu Ile Glu Glu Leu Ala Arg Phe Ala Val Asp Glu His Asn Lys 20 25 30 Lys Glu Asn Ala Leu Leu Glu Phe Val Arg Val Val Lys Ala Lys Glu 35 40 45 Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Met Tyr Tyr Leu Thr 50 55 60 Leu Glu Ala Lys Asp Gly Gly Lys Lys Lys Leu Tyr Glu Ala Lys Val 65 70 75 80 Trp Val Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asn Phe Lys Glu 85 90 95 Leu Gln Glu Phe Lys Pro Val Gly Asp Gly 100 105

Claims (42)

  1. 서열식별번호 (SEQ ID NO): 1의 아미노산 잔기 1 내지 11, 13 내지 15, 17 내지 19, 21 내지 25, 27 내지 28, 35 내지 37, 39, 41, 43 내지 44, 46 내지 47, 49 내지 50, 52 내지 53, 55 내지 58, 63 내지 64, 66, 68 내지 82, 84 내지 85, 및 87 내지 98과 적어도 80％ 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며;
    T51L, T51V, M65V, N32G, A59I, E29M, T34V, T34R, T45I, T45V, T51F, A59L, L67I, (E29K, K30E, E33K), (A59L, G60N, D61G, N62K), (A59V, D61N, N62K), (G60N, D61G, N62K), (G60N, ΔD61, N62G), ΔD61, (A59L, G60N, ΔD61, N62G), (A59V, G60N, D61G, N62K), (A59I, G60N, D61G, N62K), (A59I, G60N, ΔD61, N62G), (A59V, G60N, ΔD61, N62G), 및 (A59V, ΔD61)로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열식별번호: 1에 비한 1개 이상의 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하고;
    서열식별번호: 1의 Tm보다 더 높은 Tm을 갖는
    폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 89.0℃보다 더 높은 Tm을 갖는 것인 폴리펩티드.
  3. 서열식별번호: 1의 아미노산 잔기 1 내지 11, 13 내지 15, 17 내지 19, 21 내지 25, 27 내지 28, 35 내지 37, 39, 41, 43 내지 44, 46 내지 47, 49 내지 50, 52 내지 53, 55 내지 58, 63 내지 64, 66, 68 내지 82, 84 내지 85, 및 87 내지 98과 적어도 80％ 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며;
    L38A, V20I, A40I, L38V, A12I, A12V, I16L, V20L, Q26E, T31K, N32D, N32H, T34D, T34P, A40V, Q42D, V48E, V48G, V48A, T51A, (V20I, L38A), (V20L, L38A), (V20I, L38V), (V20L, L38V), (Y54D, T83D, Q86E), (G60P, ΔD61, N62P), (G60P, D61P, N62K), (G60P, ΔD61, N62G), (G60P, D61G, N62K), (D61N, N62K) 및 (T83D, Q86E)로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열식별번호: 1에 비한 1개 이상의 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하고;
    서열식별번호: 1의 Tm보다 더 낮은 Tm을 갖는
    폴리펩티드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 적어도 1개의 이종 펩티드 삽입을 추가로 포함하고, 상기 이종 펩티드 삽입이 서열식별번호: 1에 비해 하기 위치 중 하나에 삽입된 이종 펩티드를 포함하는 것인 폴리펩티드:
    a) 47-<이종 펩티드>-55
    b) 46-<이종 펩티드>-54
    c) 46-<이종 펩티드>-50
    d) 48-<이종 펩티드>-50
    e) 49-<이종 펩티드>-51
    f) 50-<이종 펩티드>-52
    g) 66-<이종 펩티드>-85
    h) 67-<이종 펩티드>-84
    i) 70-<이종 펩티드>-74
    j) 72-<이종 펩티드>-74
    k) 71-<이종 펩티드>-73
    l) 72-<이종 펩티드>-81
    m) 73-<이종 펩티드>-80
    n) 79-<이종 펩티드>-81
    o) 80-<이종 펩티드>-81
    p) 82-<이종 펩티드>-83
    q) 72-<이종 펩티드>-77
    r) 73-<이종 펩티드>-78
    s) 74-<이종 펩티드>-79
    t) 4-<이종 펩티드>-5.
  5. 제4항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 2개의 이종 펩티드 삽입, 위치 (a) 내지 (f) 중 임의의 것에서의 제1 이종 펩티드 삽입, 및 위치 (g) 내지 (s) 중 임의의 것에서의 제2 이종 펩티드 삽입을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  6. 제4항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 2개의 이종 펩티드 삽입, 위치 (a) 내지 (f) 중 임의의 것에서의 제1 이종 펩티드 삽입, 및 위치 (t)에서의 제2 이종 펩티드 삽입을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  7. 제4항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 2개의 이종 펩티드 삽입, 위치 (g) 내지 (s) 중 임의의 것에서의 제1 이종 펩티드 삽입, 및 위치 (t)에서의 제2 이종 펩티드 삽입을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  8. 제4항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 3개의 이종 펩티드 삽입, 위치 (a) 내지 (f) 중 임의의 것에서의 제1 이종 펩티드 삽입, 및 위치 (g) 내지 (s) 중 임의의 것에서의 제2 이종 펩티드 삽입, 및 위치 (t)에서의 제3 이종 펩티드 삽입을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  9. 서열식별번호: 1의 아미노산 잔기 1 내지 11, 13 내지 15, 17 내지 19, 21 내지 25, 27 내지 28, 35 내지 37, 39, 41, 43 내지 44, 46 내지 47, 49 내지 50, 52 내지 53, 55 내지 58, 63 내지 64, 66, 68 내지 82, 84 내지 85, 및 87 내지 98과 적어도 80％ 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 적어도 1개의 이종 펩티드 삽입을 포함하며;
    M65I, T51I, T51L, T51V, M65V, A59V, N32G, A59I, L38A, V20A, V20I, A40I, L38V, G50S, L38F, A12I, A12V, I16L, V20L, Q26E, E29M, T31K, N32D, N32H, T34V, T34R, T34K, T34D, T34P, A40V, Q42E, Q42D, T45I, T45V, V48E, V48D, V48G, V48A, V48L, T51F, T51A, A59L, K63R, L67I, N90T, (V20I, L38A), (V20L, L38A), (V20I, L38V), (V20L, L38V), (E29K, K30E, E33K), (Y54D, T83D, Q86E), (A59L, G60N, D61G, N62K), (A59V, D61N, N62K), (G60N, D61G, N62K), (G60N, ΔD61, N62G), ΔD61, (A59L, G60N, ΔD61, N62G), (A59V, G60N, D61G, N62K), (A59I, G60N, D61G, N62K), (A59I, G60N, ΔD61, N62G), (A59V, G60N, ΔD61, N62G), (A59V, ΔD61), (G60P, ΔD61, N62P), (G60P, D61P, N62K), (G60P, ΔD61, N62G), (G60P, D61G, N62K), (D61N, N62K), 및 (T83D, Q86E)로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열식별번호: 1에 비한 1개 이상의 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하고;
    상기 이종 펩티드 삽입이 서열식별번호: 1에 비해 하기 위치 중 하나에 삽입된 이종 펩티드를 포함하는 것인 폴리펩티드:
    d) 48-<이종 펩티드>-50,
    e) 49-<이종 펩티드>-51,
    f) 50-<이종 펩티드>-52,
    q) 72-<이종 펩티드>-77,
    r) 73-<이종 펩티드>-78; 또는
    s) 74-<이종 펩티드>-79.
  10. 제9항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 2개의 이종 펩티드 삽입, 위치 (d) 내지 (f) 중 임의의 것에서의 제1 이종 펩티드 삽입, 및 위치 (q) 내지 (s) 중 임의의 것에서의 제2 이종 펩티드 삽입을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  11. 제9항에 있어서, 상기 서열식별번호: 1에 비한 1개 이상의 돌연변이가 M65I, T51I, T51L, T51V, M65V, A59V, N32G, A59I, E29M, T34V, T34R, T34K, Q42E, T45I, T45V, T51F, A59L, K63R, L67I, N90T, (E29K, K30E, E33K), (A59L, G60N, D61G, N62K), (A59V, D61N, N62K), (G60N, D61G, N62K), (G60N, ΔD61, N62G), ΔD61, (A59L, G60N, ΔD61, N62G), (A59V, G60N, D61G, N62K), (A59I, G60N, D61G, N62K), (A59I, G60N, ΔD61, N62G), (A59V, G60N, ΔD61, N62G), 및 (A59V, ΔD61)이거나 또는 이로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    바람직하게는 상기 폴리펩티드가 서열식별번호: 1의 Tm보다 더 높은 Tm을 갖는 것인 폴리펩티드.
  12. 제9항에 있어서, 상기 서열식별번호: 1에 비한 1개 이상의 돌연변이가 L38A, V20A, V20I, A40I, L38V, G50S, L38F, A12I, A12V, I16L, V20L, Q26E, T31K, N32D, N32H, T34D, T34P, A40V, Q42D, V48E, V48D, V48G, V48A, V48L, T51A, (V20I, L38A), (V20L, L38A), (V20I, L38V), (V20L, L38V), (Y54D, T83D, Q86E), (G60P, ΔD61, N62P), (G60P, D61P, N62K), (G60P, ΔD61, N62G), (G60P, D61G, N62K), (D61N, N62K) 및 (T83D, Q86E)이거나 또는 이로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    바람직하게는 상기 폴리펩티드가 서열식별번호: 1의 Tm보다 더 낮은 Tm을 갖는 것인 폴리펩티드.
  13. 제9항에 있어서, 상기 서열식별번호: 1에 비한 1개 이상의 돌연변이가 T51L, T51V, M65V, N32G, A59I, L38A, V20I, A40I, L38V, A12I, A12V, I16L, V20L, Q26E, E29M, T31K, N32D, N32H, T34V, T34R, T34D, T34P, A40V, Q42D, T45I, T45V, V48E, V48G, V48A, T51F, T51A, A59L, L67I, (V20I, L38A), (V20L, L38A), (V20I, L38V), (V20L, L38V), (E29K, K30E, E33K), (Y54D, T83D, Q86E), (A59L, G60N, D61G, N62K), (A59V, D61N, N62K), (G60N, D61G, N62K), (G60N, ΔD61, N62G), ΔD61, (A59L, G60N, ΔD61, N62G), (A59V, G60N, D61G, N62K), (A59I, G60N, D61G, N62K), (A59I, G60N, ΔD61, N62G), (A59V, G60N, ΔD61, N62G), (A59V, ΔD61), (G60P, ΔD61, N62P), (G60P, D61P, N62K), (G60P, ΔD61, N62G), (G60P, D61G, N62K), (D61N, N62K) 및 (T83D, Q86E)이거나 또는 이로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 폴리펩티드.
  14. 제13항에 있어서, 상기 서열식별번호: 1에 비한 1개 이상의 돌연변이가 T51L, T51V, M65V, N32G, A59I, E29M, T34V, T34R, T45I, T45V, T51F, A59L, L67I, (E29K, K30E, E33K), (A59L, G60N, D61G, N62K), (A59V, D61N, N62K), (G60N, D61G, N62K), (G60N, ΔD61, N62G), ΔD61, (A59L, G60N, ΔD61, N62G), (A59V, G60N, D61G, N62K), (A59I, G60N, D61G, N62K), (A59I, G60N, ΔD61, N62G), (A59V, G60N, ΔD61, N62G), 및 (A59V, ΔD61)이거나 또는 이로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    바람직하게는 상기 폴리펩티드가 서열식별번호: 1의 Tm보다 더 높은 Tm을 갖는 것인 폴리펩티드.
  15. 제13항에 있어서, 상기 서열식별번호: 1에 비한 1개 이상의 돌연변이가 L38A, V20I, A40I, L38V, A12I, A12V, I16L, V20L, Q26E, T31K, N32D, N32H, T34D, T34P, A40V, Q42D, V48E, V48G, V48A, T51A, (V20I, L38A), (V20L, L38A), (V20I, L38V), (V20L, L38V), (Y54D, T83D, Q86E), (G60P, ΔD61, N62P), (G60P, D61P, N62K), (G60P, ΔD61, N62G), (G60P, D61G, N62K), (D61N, N62K) 및 (T83D, Q86E)이거나 또는 이로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    바람직하게는 상기 폴리펩티드가 서열식별번호: 1의 Tm보다 더 낮은 Tm을 갖는 것인 폴리펩티드.
  16. 제11항 또는 제14항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 서열식별번호: 1의 Tm보다 더 높은 Tm을 갖는 것인 폴리펩티드.
  17. 제12항 또는 제15항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 서열식별번호: 1의 Tm보다 더 낮은 Tm을 갖는 것인 폴리펩티드.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 G4R, G4W, V48D, V48E, G50S, Y35W, Y43W, Y53W, Y54W, Y64W, F70W, Y85W, F98W, (K71N S72G L73P), 또는 (E78A L80R)로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열식별번호: 1에 비한 1개 이상의 돌연변이를 추가로 포함하는 것인 폴리펩티드.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 서열식별번호: 1에 비해 5개 이하의 돌연변이를 포함하는 폴리펩티드.
  20. 제19항에 있어서, 상기 5개 이하의 돌연변이가 Y35W, N32G, V48D, M65I, Q42E 및 T51L로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 폴리펩티드.
  21. 제19항에 있어서, 상기 5개 이하의 돌연변이가 N32G, V48D, M65I, Q42E 및 T51L로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 폴리펩티드.
  22. 제19항에 있어서, 하기 군 중 하나에서의 돌연변이 각각을 갖는 폴리펩티드:
    i) N32G V48D
    ii) N32G V48D M65I
    iii) N32G V48D M65I T51L
    iv) N32G V48D M65I Q42E
    v) N32G V48D M65I Q42E T51L.
  23. 제22항에 있어서, 돌연변이 iv) N32G, V48D, M65I 및 Q42E 각각을 갖는 폴리펩티드.
  24. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 군 중 하나에서의 돌연변이 각각을 갖는 폴리펩티드:
    a) Y35W N32G V48D M65I Q42E T51L (A59V ΔD61) (E29K K30E E33K)
    b) Y35W N32G V48D M65I Q42E T51L (A59V G60N ΔD61 N62G) (E29K K30E E33K).
  25. 제24항에 있어서, 돌연변이 b) Y35W N32G V48D M65I Q42E T51L (A59V G60N ΔD61 N62G) (E29K K30E E33K) 각각을 갖는 폴리펩티드.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종 펩티드가 길이가 6 내지 36개 아미노산인 폴리펩티드.
  27. a. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드; 및
    b. 분비 신호 서열, 펩티드 링커 서열, 친화성 태그, 막횡단 도메인, 세포 표면 체류 서열, 번역후 변형을 위한 기질 인식 서열, 단백질-단백질 상호작용을 통해 응집하는 단백질의 다량체성 구조를 생성하는 다량체화 도메인, 반감기 연장 폴리펩티드 모이어티, 조직 국재화 및 항체의 항원 결합 부위를 변경시키기 위한 폴리펩티드 서열, 동일하거나 상이한 표적에 결합하는 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 1종 이상의 추가의 폴리펩티드, 및 동일하거나 상이한 표적에 결합하는 1종 이상의 추가의 아피머 (Affimer) 폴리펩티드 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 추가의 아미노산 서열
    을 포함하는 융합 단백질.
  28. 제27항에 있어서, Fc 도메인 또는 그의 부분, 알부민 단백질 또는 그의 부분, 알부민-결합 폴리펩티드 모이어티, 트랜스페린 또는 그의 부분, 트랜스페린-결합 폴리펩티드 모이어티, 피브로넥틴 또는 그의 부분, 또는 피브로넥틴-결합 폴리펩티드 모이어티로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 반감기 연장 폴리펩티드 모이어티를 포함하는 융합 단백질.
  29. 제28항에 있어서, Fc 도메인 또는 그의 부분이 FcN 결합을 보유하는 것인 폴리펩티드.
  30. 제28항에 있어서, Fc 도메인 또는 그의 부분이 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM 또는 그의 하위부류 (이소형), 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 또는 IgA2로부터의 것인 폴리펩티드.
  31. 제28항에 있어서, Fc 도메인 또는 그의 부분이 C1q 결합, 보체 의존성 세포독성 (CDC), 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC); 포식작용; B 세포 수용체의 하향 조절, 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 이펙터 기능을 보유하는 것인 폴리펩티드.
  32. 제20항에 있어서, 반감기 연장 폴리펩티드 모이어티가 단백질의 혈청 반감기를 단백질로부터의 그의 부재에 비해 적어도 5배 증가시키는 것인 폴리펩티드.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 아피머 폴리펩티드인 폴리펩티드.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산.
  35. 제34항에 따른 핵산을 포함하는 벡터.
  36. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드의 집단을 포함하며, 여기서 상기 집단 내의 적어도 2개의 개별적 폴리펩티드가 상이한 이종 펩티드 삽입을 포함하는 것인 라이브러리.
  37. 제36항에 따른 폴리펩티드의 집단을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산의 집단을 포함하는 라이브러리.
  38. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드, 제34항에 따른 핵산, 또는 제36항 또는 제37항에 따른 라이브러리를 포함하는 숙주 세포.
  39. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 의료에 사용하기 위한 폴리펩티드.
  40. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 의약의 제조에 사용하기 위한 폴리펩티드.
  41. (i) 이종 펩티드 삽입을 포함하는 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 제공하고;
    (ii) 상기 폴리펩티드를 관심 구조와 접촉시키고;
    (iii) 폴리펩티드 및 관심 구조 사이의 회합을 모니터링하는 것
    을 포함하며;
    여기서 폴리펩티드와 관심 구조의 회합이 펩티드를 상기 구조에 결합할 수 있는 후보 펩티드로서 확인하는 것인, 관심 구조에 결합할 수 있는 펩티드를 확인하는 방법.
  42. 스캐폴드 단백질로서의 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드의 용도.
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