KR20200005595A - 항노화 건강식품 및 화장품과 포도 종자 유래 항노화 성분의 제조 방법 - Google Patents
항노화 건강식품 및 화장품과 포도 종자 유래 항노화 성분의 제조 방법 Download PDFInfo
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Abstract
과제: 레스베라트롤 등의 이미 알려진(旣知) 항노화 작용이 기대되는 물질보다도, 우수한 항노화 작용을 구비한 항노화 건강식품 및 화장품과 우수한 항노화 작용을 구비한 포도 종자 유래 항노화 성분의 제조 방법을 제공한다.
해결 수단: 본 발명에 관한 항노화 건강식품 및 항노화 화장품은, 거친 정제(粗精製)로 60중량% 이상의 포도 종자 유래 폴리페놀로 이루어지는 포도 종자 유래 항노화 성분을 포함한다.
해결 수단: 본 발명에 관한 항노화 건강식품 및 항노화 화장품은, 거친 정제(粗精製)로 60중량% 이상의 포도 종자 유래 폴리페놀로 이루어지는 포도 종자 유래 항노화 성분을 포함한다.
Description
본 발명은, 항노화 건강식품 및 화장품과 포도 종자 유래 항노화 성분의 제조 방법에 관한 것으로서, 보다 자세하게는, 레스베라트롤(Resveratrol)보다도 우수한 항노화 작용을 구비한 항노화 건강식품 및 화장품과 우수한 항노화 작용을 구비한 포도 종자 유래 항노화 성분의 제조 방법에 관한 것이다.
노화 방지나 수명 제어에 관한 지금까지의 연구에 의해서, 항노화 작용이 기대되는 화합물로서, 예를 들어 레스베라트롤(트랜스-3, 4', 5-트리히드록시-스틸벤)이 발견되어 있다.
예를 들어, 비특허문헌 1에서는, 출아 효모(Saccharomyces cerevisiae)에 있어서, 레스베라트롤이, 수명을 조절하는, 예쁜고마선충(Caenorhabditis elegans)의 효소의 Sir2를 자극함으로써, 출아 효모의 DNA 안정성을 높이고, 출아 효모의 수명을 70% 연장했다고 하는 연구 결과가 보고되어 있다.
그렇지만, 한편으로, 비특허문헌 2에 기재되어 있는 바와 같이, 레스베라트롤은 수컷 및 암컷 마우스의 수명을 연장시키지 않고, 레스베라트롤은 항노화 작용을 구비하고 있지 않다는 연구 결과도 보고되어 있다.
이와 같이, 항노화 작용이 기대되고 있는 레스베라트롤이지만, 레스베라트롤이 실제로 항노화 작용을 가지고 있는지의 여부는 아직도 확정되어 있지 않다.
Konrad T.Howitz et al., Nature 425, 191∼196 (2003)
Richard A.Miller et al.,Journal of Gerontology： BIOLOGICAL SCIENCES 191∼201 (2010)
상술한 바와 같이, 항노화 작용이 기대되고 있는 레스베라트롤이 실제로 항노화 작용을 구비하고 있는지의 여부에 대해서는 아직도 확정되어 있지 않다.
그 때문에, 레스베라트롤보다도, 더 확실하게 우수한 항노화 작용을 구비한 물질이 요구되고 있다.
본 발명자는, 예의 검토한 결과, 포도 종자 유래 폴리페놀로 이루어지는 추출물이, 레스베라트롤보다도 우수한 항노화 작용을 구비하고 있는 것을 발견했다.
본 발명의 과제는, 항노화 작용이 기대되고 있는 레스베라트롤보다도 우수한 항노화 작용을 구비하는 포도 종자 유래의 항노화 성분 및 그 제조 방법을 제공하고, 이 항노화 성분을 포함하는 항노화 건강식품 및 항노화 화장품을 제공하는 것이다.
청구항 1에 관한 발명은, 거친 정제(粗精製, crude purification)로 60중량% 이상의 포도 종자 유래 폴리페놀로 이루어지는 포도 종자 유래 항노화 성분을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항노화 건강식품 및 화장품에 관한 것이다.
청구항 2에 관한 발명은, (공정 1) 유럽 포도(Vitis vinifera L.), 미국 포도(Vitis labrusca L.), 산포도(Vitis coignetiae L.), 만주 산포도(Vitis amurensis L.) 및 시라가이 포도(Vitis shiragai L.)로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 포도 종자를 전처리(前處理)하고, 최아(催芽) 상태로 한 포도 종자를, 35℃∼60℃에서 건조시키는 공정
(공정 2) 상기 공정 1에 있어서 건조시킨 포도 종자를 분말화하는 공정
(공정 3) 상기 공정 2에서 얻어진 포도 종자 분말을, 물, 에탄올 또는 물과 에탄올의 혼합 용매 중 어느 하나에 침지시켜 포도 종자 유래 폴리페놀을 포함하는 추출 분획(畵分, fraction)을 얻는 공정
(공정 4) 상기 공정 3에서 얻어진 포도 종자 유래 폴리페놀을 포함하는 추출 분획을 건조시키고 분말화하는 공정으로 이루어지는 포도 종자 유래 항노화 성분의 제조 방법에 관한 것이다.
청구항 3에 관한 발명은, 상기 포도 종자가, 아기오르기티코(Agiorgitiko), 비오니에(Viognier), 까베르네 소비뇽(Cabernet Sauvignon), 까베르네 프랑(Cabernet Franc), 가메(Gamay), 까리냥(Carignan), 까르미네르(Carmenere), 시노마브로(Xinomavro), 그르나슈(Grenache), 게뷔르츠트라미너(Gewurztraminer), 케르너(Kerner), 꼴롱바르(Colombard), 코슈(甲州), 설타나(Sultana), 산지오베제(Sangiovese), 샤르도네(Chardonnay), 슈냉 블랑(Chenin Blanc), 쉬라(Syrah), 진판델(Zinfandel), 세미용(Semillon), 소비뇽 블랑(Sauvignon Blanc), 따나(Tannat), 츠바이겔트(Zweigelt), 템프라니요(Tempranillo), 트레비아노(Trebbiano), 네비올로(Nebbiolo), 네로 다볼라(Nero D＇Avola), 바르베라(Barbera), 피노타쥬(Pinotage), 피노 누와(Pinot Noir), 피노 그리(Pinot Gris), 피노 블랑(Pinot Blanc), 쁘띠 베르도(Petit Verdot), 블랙 퀸(Black Queen), 뮈스까 베일리 A(Muscat Bailey A), 말벡(Malbec), 뮬러 트루가우(MullerThurgau), 무르베드르(Mourvedre), 뮈니에(Meunier), 믈롱 드 부르고뉴(Melon de Bourgogne), 메를로(Merlot), 모스카토(Moscato), 야마 소비뇽(Yama Sauvignon), 리슬링(Riesling) 및 루비 까베르네(Ruby Cabernet)로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 와인용 포도 품종의 종자인 것을 특징으로 하는, 청구항 1에 기재된 항노화 건강식품 및 화장품 또는 청구항 2에 기재된 포도 종자 유래 항노화 성분의 제조 방법에 관한 것이다.
청구항 1에 관한 발명에 의하면, 항노화 건강식품 및 화장품이, 거친 정제로 60중량% 이상의 포도 종자 유래 폴리페놀로 이루어지는 포도 종자 유래 항노화 성분을 포함하기 때문에, 우수한 항노화 작용을 구비한 항노화 건강식품 및 화장품을 제공할 수 있다.
청구항 2에 관한 발명에 의하면, 포도 종자 유래 항노화 성분이, (공정 1) 유럽 포도(Vitis vinifera L.), 미국 포도(Vitis labrusca L.), 산포도(Vitis coignetiae L.), 만주 산포도(Vitis amurensis L.) 및 시라가이 포도(Vitis shiragai L.)로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 포도 종자를 전처리하고, 최아 상태로 한 포도 종자를, 35℃∼60℃에서 건조시키는 공정, (공정 2) 상기 공정 1에 있어서 건조시킨 포도 종자를 분말화하는 공정, (공정 3) 상기 공정 2에서 얻어진 포도 종자 분말을, 물, 에탄올 또는 물과 에탄올의 혼합 용매 중 어느 하나에 침지시켜 포도 종자 유래 폴리페놀을 포함하는 추출 분획을 얻는 공정, 및 (공정 4) 상기 공정 3에서 얻어진 포도 종자 유래 폴리페놀을 포함하는 추출 분획을 건조시키고 분말화하는 공정으로 제조되기 때문에, 우수한 항노화 작용을 구비한 포도 종자 유래 항노화 성분을 제조할 수 있다.
청구항 3에 관한 발명에 의하면, 청구항 1에 기재된 항노화 건강식품 및 화장품 또는 청구항 2에 기재된 포도 종자 유래 항노화 성분의 제조 방법에 이용되는 포도 종자가, 아기오르기티코(Agiorgitiko), 비오니에(Viognier), 까베르네 소비뇽(Cabernet Sauvignon), 까베르네 프랑(Cabernet Franc), 가메(Gamay), 까리냥(Carignan), 까르미네르(Carmenere), 시노마브로(Xinomavro), 그르나슈(Grenache), 게뷔르츠트라미너(Gewurztraminer), 케르너(Kerner), 꼴롱바르(Colombard), 코슈(甲州), 설타나(Sultana), 산지오베제(Sangiovese), 샤르도네(Chardonnay), 슈냉 블랑(Chenin Blanc), 쉬라(Syrah), 진판델(Zinfandel), 세미용(Semillon), 소비뇽 블랑(Sauvignon Blanc), 따나(Tannat), 츠바이겔트(Zweigelt), 템프라니요(Tempranillo), 트레비아노(Trebbiano), 네비올로(Nebbiolo), 네로 다볼라(Nero D＇Avola), 바르베라(Barbera), 피노타쥬(Pinotage), 피노 누와(Pinot Noir), 피노 그리(Pinot Gris), 피노 블랑(Pinot Blanc), 쁘띠 베르도(Petit Verdot), 블랙 퀸(Black Queen), 뮈스까 베일리 A(Muscat Bailey A), 말벡(Malbec), 뮬러 트루가우(MullerThurgau), 무르베드르(Mourvedre), 뮈니에(Meunier), 믈롱 드 부르고뉴(Melon de Bourgogne), 메를로(Merlot), 모스카토(Moscato), 야마 소비뇽, 리슬링(Riesling) 및 루비 까베르네(Ruby Cabernet)로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 와인용 포도 품종의 종자이기 때문에, 보다 우수한 항노화 작용을 구비한 항노화 건강식품 및 화장품을 제공할 수 있거나, 혹은 보다 우수한 항노화 작용을 구비한 포도 종자 유래 항노화 성분을 제조할 수 있다.
도 1은, 실시예 1∼3, 비교예 1, 컨트롤(Control)에 있어서 산출한 노화 세포의 양을 도시하는 그래프이다. 도 1a는 7일간 배양한 세포에 있어서의 노화 세포의 양, 도 1b는 14일간 배양한 세포에 있어서의 노화 세포의 양, 도 1c는 21일간 배양한 세포에 있어서의 노화 세포의 양을 도시하고 있다. 또한, 컨트롤에 있어서 산출한 노화 세포의 양을 100%로 하고, 실시예 1∼3 및 비교예 1의 노화 세포의 양은 컨트롤에 있어서의 노화 세포의 양에 대한 비율로 도시하고 있다.
도 2는, 실시예 1∼3, 비교예 1, 컨트롤에 있어서 측정된 미토콘드리아의 양을 도시하는 그래프이다. 도 2a는 7일간 배양한 세포에 있어서의 미토콘드리아의 양, 도 2b는 14일간 배양한 세포에 있어서의 미토콘드리아의 양, 도 2c는 21일간 배양한 세포에 있어서의 미토콘드리아의 양을 도시하고 있다. 또한, 컨트롤에 있어서 산출한 미토콘드리아의 양을 100%로 하고, 실시예 1∼3 및 비교예 1의 미토콘드리아의 양은 컨트롤에 있어서의 미토콘드리아의 양에 대한 비율로 도시하고 있다.
도 3은, 실시예 1∼3, 비교예 1, 컨트롤에 있어서 측정된 일정량의 미토콘드리아가 부담해야 할 일량을 도시하는 그래프이다. 도 3a는 7일간 배양한 세포에 있어서의 일정량의 미토콘드리아가 부담해야 할 일량, 도 3b는 14일간 배양한 세포에 있어서의 일정량의 미토콘드리아가 부담해야 할 일량, 도 3c는 21일간 배양한 세포에 있어서의 일정량의 미토콘드리아가 부담해야 할 일량을 도시하고 있다. 또한, 컨트롤에 있어서 산출한 일정량의 미토콘드리아가 부담해야 할 일량을 100%로 하고, 실시예 1∼3 및 비교예 1의 일정량의 미토콘드리아가 부담해야 할 일량은 컨트롤에 있어서의 일정량의 미토콘드리아가 부담해야 할 일량에 대한 비율로 도시하고 있다.
도 4는, 실시예 1∼3, 비교예 1, 컨트롤에 있어서 측정된 아포토시스(apoptosis) 세포의 양을 도시하는 그래프이다. 도 4a는 7일간 배양한 세포에 있어서의 아포토시스 세포의 양, 도 4b는 14일간 배양한 세포에 있어서의 아포토시스 세포의 양, 도 4c는 21일간 배양한 세포에 있어서의 아포토시스 세포의 양을 도시하고 있다. 또한, 컨트롤에 있어서 산출한 아포토시스 세포의 양을 100%로 하고, 실시예 1∼3 및 비교예 1의 아포토시스 세포의 양은 컨트롤에 있어서의 아포토시스 세포의 양에 대한 비율로 도시하고 있다.
도 5는, 실시예 1∼3, 비교예 1, 컨트롤에 있어서 측정된 네크로시스(necrosis) 세포의 양을 도시하는 그래프이다. 도 5a는 7일간 배양한 세포에 있어서의 네크로시스 세포의 양, 도 5b는 14일간 배양한 세포에 있어서의 네크로시스 세포의 양, 도 5c는 21일간 배양한 세포에 있어서의 네크로시스 세포의 양을 도시하고 있다. 또한, 컨트롤에 있어서 산출한 네크로시스 세포의 양을 100%로 하고, 실시예 1∼3 및 비교예 1의 네크로시스 세포의 양은 컨트롤에 있어서의 네크로시스 세포의 양에 대한 비율로 도시하고 있다.
도 2는, 실시예 1∼3, 비교예 1, 컨트롤에 있어서 측정된 미토콘드리아의 양을 도시하는 그래프이다. 도 2a는 7일간 배양한 세포에 있어서의 미토콘드리아의 양, 도 2b는 14일간 배양한 세포에 있어서의 미토콘드리아의 양, 도 2c는 21일간 배양한 세포에 있어서의 미토콘드리아의 양을 도시하고 있다. 또한, 컨트롤에 있어서 산출한 미토콘드리아의 양을 100%로 하고, 실시예 1∼3 및 비교예 1의 미토콘드리아의 양은 컨트롤에 있어서의 미토콘드리아의 양에 대한 비율로 도시하고 있다.
도 3은, 실시예 1∼3, 비교예 1, 컨트롤에 있어서 측정된 일정량의 미토콘드리아가 부담해야 할 일량을 도시하는 그래프이다. 도 3a는 7일간 배양한 세포에 있어서의 일정량의 미토콘드리아가 부담해야 할 일량, 도 3b는 14일간 배양한 세포에 있어서의 일정량의 미토콘드리아가 부담해야 할 일량, 도 3c는 21일간 배양한 세포에 있어서의 일정량의 미토콘드리아가 부담해야 할 일량을 도시하고 있다. 또한, 컨트롤에 있어서 산출한 일정량의 미토콘드리아가 부담해야 할 일량을 100%로 하고, 실시예 1∼3 및 비교예 1의 일정량의 미토콘드리아가 부담해야 할 일량은 컨트롤에 있어서의 일정량의 미토콘드리아가 부담해야 할 일량에 대한 비율로 도시하고 있다.
도 4는, 실시예 1∼3, 비교예 1, 컨트롤에 있어서 측정된 아포토시스(apoptosis) 세포의 양을 도시하는 그래프이다. 도 4a는 7일간 배양한 세포에 있어서의 아포토시스 세포의 양, 도 4b는 14일간 배양한 세포에 있어서의 아포토시스 세포의 양, 도 4c는 21일간 배양한 세포에 있어서의 아포토시스 세포의 양을 도시하고 있다. 또한, 컨트롤에 있어서 산출한 아포토시스 세포의 양을 100%로 하고, 실시예 1∼3 및 비교예 1의 아포토시스 세포의 양은 컨트롤에 있어서의 아포토시스 세포의 양에 대한 비율로 도시하고 있다.
도 5는, 실시예 1∼3, 비교예 1, 컨트롤에 있어서 측정된 네크로시스(necrosis) 세포의 양을 도시하는 그래프이다. 도 5a는 7일간 배양한 세포에 있어서의 네크로시스 세포의 양, 도 5b는 14일간 배양한 세포에 있어서의 네크로시스 세포의 양, 도 5c는 21일간 배양한 세포에 있어서의 네크로시스 세포의 양을 도시하고 있다. 또한, 컨트롤에 있어서 산출한 네크로시스 세포의 양을 100%로 하고, 실시예 1∼3 및 비교예 1의 네크로시스 세포의 양은 컨트롤에 있어서의 네크로시스 세포의 양에 대한 비율로 도시하고 있다.
이하, 본 발명에 관한 항노화 건강식품 및 화장품과 포도 종자 유래 항노화 성분의 제조 방법에 대해서 설명한다.
또한, 본 명세서에 있어서, 「노화」란, 세포의 배화(倍化) 능력이 저하한 상태나 세포가 G1기(期)에 있어서 불가역적인 증식 정지 상태로 되는 것을 가리킨다. 이들 상태는 세포 주기의 진행을 재촉하는 유전자의 억제와 세포 주기를 저해하는 p16INK4a, p53, 및 그들의 타겟으로 되는 전사 인자 p21CIP1의 발현 상승이 관여하고 있다. 이에 더하여, 노화 세포는, 마이토젠 유도의 세포 증식에 저항성을 갖고, 노화 세포의 거대화와 편평화가 생긴다. 노화 세포는, 노화 관련 산성 β-갈락토시다아제(SA βGal； senescence associated β－galactosidase) 활성과 같은 공통의 생화학적 마커를 나타낸다. 이 노화 현상은 배양 세포로 특징지어진 한편으로, 생체 내에서도 일어나고 있는 것이 증명되어 있다.
본 발명에 관한 항노화 건강식품 및 화장품은, 거친 정제로 60중량% 이상의 포도 종자 유래 폴리페놀로 이루어지는 포도 종자 유래 항노화 성분을 함유한다.
본 발명에 관한 항노화 건강식품 및 화장품에 포함되는 포도 종자 유래 폴리페놀로 이루어지는 포도 종자 유래 항노화 성분은, 이하의 제조 공정으로 얻어진다.
＜공정 1＞
공정 1은, 포도 종자를 전처리하고, 최아 상태로 한 포도 종자를 건조시키는 공정이다.
본 발명에 사용하는 포도 종자의 포도의 종류는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 유럽 포도(Vitis vinifera L.), 미국 포도(Vitis labrusca L.), 산포도(Vitis coignetiae L.), 만주 산포도(Vitis amurensis L.) 및 시라가이 포도(Vitis shiragai L.)로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 포도이다.
그 중에서도, 아기오르기티코(Agiorgitiko), 비오니에(Viognier), 까베르네 소비뇽(Cabernet Sauvignon), 까베르네 프랑(Cabernet Franc), 가메(Gamay), 까리냥(Carignan), 까르미네르(Carmenere), 시노마브로(Xinomavro), 그르나슈(Grenache), 게뷔르츠트라미너(Gewurztraminer), 케르너(Kerner), 꼴롱바르(Colombard), 코슈(甲州), 설타나(Sultana), 산지오베제(Sangiovese), 샤르도네(Chardonnay), 슈냉 블랑(Chenin Blanc), 쉬라(Syrah), 진판델(Zinfandel), 세미용(Semillon), 소비뇽 블랑(Sauvignon Blanc), 따나(Tannat), 츠바이겔트(Zweigelt), 템프라니요(Tempranillo), 트레비아노(Trebbiano), 네비올로(Nebbiolo), 네로 다볼라(Nero D＇Avola), 바르베라(Barbera), 피노타쥬(Pinotage), 피노 누와(Pinot Noir), 피노 그리(Pinot Gris), 피노 블랑(Pinot Blanc), 쁘띠 베르도(Petit Verdot), 블랙 퀸(Black Queen), 뮈스까 베일리 A(Muscat Bailey A), 말벡(Malbec), 뮬러 트루가우(MullerThurgau), 무르베드르(Mourvedre), 뮈니에(Meunier), 믈롱 드 부르고뉴(Melon de Bourgogne), 메를로(Merlot), 모스카토(Moscato), 야마 소비뇽, 리슬링(Riesling) 및 루비 까베르네(Ruby Cabernet) 등의 와인용 포도 품종이 바람직하고, 까베르네 소비뇽, 메를로, 쉬라, 피노 누와가 더욱더 바람직하다.
본 명세서에 있어서, 「최아」란, 포도 종자를, 발아를 시작하는 상태로 하는 것을 말한다. 보다 구체적으로는, 포도 종자의 배아 부분이 약간 융기해서 부풀어 오른 상태를 말한다.
이 융기의 정도는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 최아 전의 포도 종자보다도 배아 부분의 표면이 1㎜∼2㎜ 융기한 상태이다.
또한, 본 발명에 있어서, 포도 종자로부터 싹이 나온 발아 상태의 포도 종자는, 최아 상태의 포도 종자와 비교해서 항노화 작용이 낮은 경향이 있기 때문에, 바람직하지 않다.
본 발명에 있어서, 포도 종자를 최아 상태로 하기 위한 포도 종자의 전처리 방법은 특별히 한정되지 않고, 저온 처리, 온욕 처리, 기계적 파괴 등의 물리적인 방법, 가스(아세틸렌, 에테르, 수소 가스 등) 처리, 옥신(auxin) 처리, 지베렐린(gibberellin) 처리 등의 화학적 방법 등, 종래부터 식물의 종자를 최아 상태로 하기 위해서 이용되고 있는 방법이면 어떠한 방법을 이용해도 좋다.
상술한 바와 같이, 본 발명에 있어서, 포도 종자를 최아 상태로 하기 위한 전처리 방법은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 보다 구체적으로는 이하의 전처리 방법에 의해 포도 종자를 최아 상태로 할 수 있다.
우선, 포도 종자를 30∼60℃의 물에 침지시킨다.
침지 시간은, 한정되는 것은 아니지만, 20∼80시간인 것이 바람직하다.
그 다음에, 30∼60℃의 물에 침지시킨 포도 종자를 끌어올리고, 공기중에서 자연 건조시킨다.
자연 건조의 온도는, 한정되는 것은 아니지만, 10∼50℃가 바람직하다.
자연 건조의 시간은, 한정되는 것은 아니지만, 1∼10시간이 바람직하다.
다음에, 공기중에서 자연 건조시킨 포도 종자를 15∼45℃의 물에 침지시킨다.
침지 시간은, 한정되는 것은 아니지만, 10∼200분인 것이 바람직하다.
그 다음에, 15∼45℃의 물에 침지시킨 포도 종자를 끌어올려 공기중에서 자연 건조시킨다.
자연 건조의 온도는, 한정되는 것은 아니지만, 10∼50℃가 바람직하다.
자연 건조의 시간은, 한정되는 것은 아니지만, 3∼12시간이 바람직하다.
이 포도 종자를 15∼45℃의 물에 침지시키는 공정과 공기중에서 자연 건조시키는 공정을, 자연 건조시킨 후, 포도 종자의 배아 부분이 약간 융기해서 부풀어 오른 상태로 될 때까지 반복하고, 포도 종자를 단속적(斷續的)으로 함수(含水)시킨다.
포도 종자를 자연 건조시킨 후, 포도 종자의 배아 부분이 약간 융기해서 부풀어 오른 상태로 되면, 포도 종자를 꺼내고(취출하고), 잡균을 살상할 정도의 온도(80℃ 이하)에서 2∼5일간 또 포도 종자를 건조시킨다.
또한, 이 건조 시간은, 계절이나 주위의 온도나 습도에 따라서 적당히 변경해도 좋다.
이 최아 처리의 자극에 의해, 포도 종자 내에서는 얇은 페놀층으로부터 페놀 분자가 박리해서 다중 결합을 하여 폴리페놀을 생성한다.
폴리페놀의 일종인 레스베라토르는 분자량 250 정도이지만, 이 새롭게 생성된 성분은 분자량 4000의 성분을 포함하는 큰 고분자 구조를 특징으로 한다.
＜공정 2＞
공정 2는, 공정 1에 있어서 건조시킨 최아 상태의 포도 종자를 분말화하는 공정이다.
분말화의 방법은, 한정되는 것은 아니고, 분쇄기(mill)로 분말화하는 등의 통상의 방법을 이용할 수 있다.
＜공정 3＞
공정 3은, 분말화한 포도 종자를 용매로 추출하는 공정이다.
이 공정 3에 의해, 포도 종자 유래 폴리페놀로 이루어지는 포도 종자 유래 항노화 성분을 얻는다.
용매로서는, 물, 에탄올 또는 물과 에탄올의 혼합 용매를 이용할 수 있다.
추출은, 포도 종자 분말 100중량부에 대해 용매를 50∼1000중량부 더해서 행하면 좋다.
상기에서 설명한 바와 같이, 이 포도 종자 유래 폴리페놀로 이루어지는 포도 종자 유래 항노화 성분은 분자량 4000 전후(3500∼4500)의 고분자 성분을 포함하고 있다.
＜공정 4＞
그 다음에, 공정 3에서 얻어진 포도 종자 유래 폴리페놀로 이루어지는 포도 종자 유래 항노화 성분을 건조시킨 후, 분말화한다.
건조 방법은, 한정되는 것은 아니지만, 감압 건조가 호적(好適)하게 이용된다.
분말화의 방법은, 한정되는 것은 아니고, 분쇄기로 분말화하는 등의 통상의 방법을 이용할 수 있다.
이상의 공정에 의해, 분말화한 포도 종자 유래 폴리페놀로 이루어지는 포도 종자 유래 항노화 성분을 얻을 수 있다.
상술한 공정에 의해 얻어진 포도 종자 유래 항노화 성분은, 거친 정제로 50중량%∼80중량%의 폴리페놀을 함유하고 있다.
우수한 항노화 작용을 가진다는 관점에서, 포도 종자 유래 항노화 성분은, 거친 정제로 60중량% 이상의 폴리페놀을 함유하고 있는 것이 바람직하다.
포도 종자 유래 항노화 성분에 포함되는 폴리페놀은, 각 품종의 포도 종자에 포함되는 폴리페놀이며, 예를 들어 레스베라트롤이나 탄닌 등이 있다.
포도 종자 유래 항노화 성분에 포함되는 폴리페놀 중, 50중량%∼80중량%는 프로안토시아니딘 중합체이다.
상기 성분을 함유하는 포도 종자 유래 항노화 성분이 항노화 작용을 가진다는 것을 본 발명자는 확인했다.
또한, 본 명세서에 있어서, 거친 정제(粗精製)란, 추출한 것을 건조해서 분말화했을 뿐이고 협잡물 등을 포함하고 있으며, 농축 등의 가공이 되어 있지 않은 상태를 가리킨다. 상기 공정 1∼4에서 얻어진 포도 종자 유래 항노화 성분은 거친 정제가 이루어진 것이다.
포도 종자 유래 항노화 성분을 건강식품에 함유시키는 것에 의해, 본 발명의 항노화 건강식품을 얻을 수 있다.
포도 종자 유래 항노화 성분을 건강식품에 함유시키는 것에 의해, 손쉽게 일상적으로 포도 종자 유래 항노화 성분을 섭취하는 것이 가능해진다.
본 발명의 항노화 건강식품은, 예를 들어, 포도당, 과당, 자당, 말토오스, 소르비톨, 스테비오사이드, 루부소사이드, 콘 시럽, 유당, 구연산, 주석산(酒石酸), 사과산, 호박산, 유산, L－아스코르빈산, dl－α－토코페놀, 에리소르빈산 나트륨, 글리세린, 프로필렌 글리콜, 글리세린 지방산 에스테르, 폴리글리세린 지방산 에스테르, 자당 지방산 에스테르, 소르비탄 지방산 에스테르, 프로필렌 글리콜 지방산 에스테르 아라비아검(Arabia gum), 카라기난(Carrageenan), 카제인, 젤라틴, 펙틴, 한천, 비타민 B류, 니코틴산 아미드, 판토텐산 칼슘, 아미노산류, 칼슘염류, 색소, 향료, 보존제 등, 통상의 식품 원료로서 사용되고 있는 첨가제를 적당히 배합해서 상법(常法)에 의해 제조할 수 있다.
포도 종자 유래 항노화 성분을 화장품에 함유시킴으로써, 본 발명의 항노화 화장품을 얻을 수 있다.
화장품에 포도 종자 유래 항노화 성분을 함유시키는 것에 의해, 일상적으로 포도 종자 유래 항노화 성분을 적용하는 것이 가능해진다.
또한, 본 발명에 관한 항노화 화장품에 포함되는 포도 종자 유래 항노화 성분의 형태는 특별히 한정되지 않지만, 피부에 침투하기 쉽다는 관점에서, 다중 층의 마이크로 캡슐형인 것이 바람직하다.
본 발명의 항노화 화장품은, 미백제, 활성 산소 제거제, 항산화제, 자외선 방지제 등, 통상 사용되고 있는 첨가제를 적당히 배합해서 상법에 의해 제조할 수 있다.
본 발명의 항노화 건강식품 및 항노화 화장품에 있어서의 포도 종자 유래 항노화 성분의 섭취량은 한정되는 것은 아니지만, 우수한 항노화 작용을 가진다는 관점에서, 적어도 1일의 섭취량이 50㎎ 이상인 것이 바람직하다.
본 발명의 항노화 건강식품 및 항노화 화장품에 있어서의 포도 종자 유래 항노화 성분의 1일 섭취량이 50㎎ 미만이면, 항노화 작용을 충분히 발휘할 수 없을 우려가 있기 때문에 바람직하지 않다.
또, 본 발명의 항노화 건강식품 및 항노화 화장품에 있어서의 포도 종자 유래 항노화 성분을, 1일당 7500㎎(체중 60킬로그램)을 초과하여 섭취해도 효과의 상승률은 작다.
그 때문에, 본 발명의 항노화 건강식품 및 항노화 화장품에 있어서의 포도 종자 유래 항노화 성분은, 1일당 50㎎∼7500㎎ 섭취하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 항노화 건강식품 및 항노화 화장품에는, 적당히 용도에 따라, 부형제, pH 조정제(調整劑), 방부제, 킬레이트제, 안정화제 등을 배합해도 좋다.
또, 본 발명의 항노화 건강식품 및 항노화 화장품에 포함되는 포도 종자 유래 항노화 성분의 체중 1㎏당 섭취량은, 특별히 한정되지 않지만, 우수한 항노화 작용을 가진다는 관점에서, 예를 들어, 0.8∼125㎎/㎏/일(日)인 것이 바람직하다.
본 발명의 항노화 건강식품 및 항노화 화장품에 있어서의 포도 종자 유래 항노화 성분의 체중 1㎏당 섭취량이 0.8㎎/㎏/일 미만이면, 항노화 작용을 충분히 발휘할 수 없을 우려가 있기 때문에 바람직하지 않다.
또, 본 발명의 항노화 건강식품 및 항노화 화장품에 있어서의 포도 종자 유래 항노화 성분을, 125㎎/㎏/일을 초과하여 섭취해도 그 이상 효과가 바뀌지 않는다.
그 때문에, 본 발명의 항노화 건강식품 및 항노화 화장품에 있어서의 포도 종자 유래 항노화 성분은, 0.8∼125㎎/㎏/일로 섭취하는 것이 바람직하다.
[실시예]
본 발명에 관한 항노화 건강식품 및 화장품과 포도 종자 유래 항노화 성분에 대해서, 이하의 실시예에 근거해서 더욱더 상세하게 설명하겠지만, 본 발명에 관한 항노화 건강식품 및 화장품과 포도 종자 유래 항노화 성분의 제조 방법은, 실시예에 한정되는 것은 아니다.
＜실시예 1： 포도 종자 유래 항노화 성분의 제조＞
까베르네 소비뇽의 종자를 40℃ 전후의 물에 45∼60시간 침지시키고, 그 다음에 이 포도 종자를 끌어올려 실온(25℃ 전후)에서 공기중에 3∼5시간 자연 건조(실내 보관)시켰다.
자연 건조시킨 포도 종자를, 25∼30℃의 물에 60∼80분 침지시키고, 그 다음에 이 포도 종자를 끌어올려 실온(약 25℃)에서 공기중에 3시간 자연 건조(실내 보관)시켰다.
이 30℃ 물에의 침지와 3시간의 자연 건조를 3회 반복하고, 건조시킨 포도 종자를 관찰하면, 약 5∼15%의 포도 종자의 배아 부분이, 약 1㎜ 융기되어 있는 것을 확인했다. 또한, 상기 절차(手順)를 최아 처리라고 칭한다.
포도 종자의 배아 부분의 융기를 확인한 시점에서 최아 처리를 종료하고, 원적외선 건조기로 45℃에서 3일간 포도 종자를 또 건조시켰다.
3일간 포도 종자를 건조시킨 후, 분쇄기를 이용해서 포도 종자를 분말화하고, 포도 종자 분말을 얻었다.
그 다음에, 물 100중량부에 대해 포도 종자 분말을 50중량부 첨가하고, 물에 용해한 분획을 추출하고, 포도 종자 유래 항노화 성분을 얻었다.
얻어진 포도 종자 유래 항노화 성분을 감압 건조시킨 후, 분쇄기로 분말화하고, 분말화한 포도 종자 유래 항노화 성분을 얻었다.
분말화한 포도 종자 유래 항노화 성분에 포함되는 폴리페놀류의 총량을 정량(定量)했다.
폴리페놀의 총량은, AOAC International의 공정법(AOAC official method 952.03, 15th Ed)(폴린-데니스(Folin·Denis)법이라고도 칭한다)를 이용해서 정량했다.
폴린-데니스법은, 알칼리성에 있어서 페놀성 수산기가 인텅스텐산, 몰리브덴산을 환원해서 생기는 청색(700∼770㎚의 파장)을 분광 광도계로 측정하는 것에 의해, 폴리페놀류의 총량을 정량한다.
정량의 결과, 포도 종자 유래 항노화 성분은, 폴리페놀을 69중량% 함유하고 있는 것을 알 수 있었다.
또, 포도 종자 유래 항노화 성분에 포함되는 폴리페놀 중의 71중량%(즉, 포도 종자 유래 항노화 성분의 49중량%)가 프로안토시아니딘 중합체인 것을 확인했다.
이하, 본 실시예에 의해 조제한 포도 종자 유래 항노화 성분을 실시예라고 칭하고, 비교 대상으로서 이용하는 레스베라트롤(SIGMA사제, 제품 번호：R5010)을 비교예라고 칭한다.
이하, 실시예 3∼5에 있어서, 본 발명에 관한 포도 종자 유래 항노화 성분의 항노화 작용을 알아보았다.
＜실시예 2： 정상 인간 섬유아세포(Normal Human Fibroblasts), 실시예, 및 비교예의 조제＞
·정상 인간 섬유아세포의 조제
우선, 각 시험에 사용하는 정상 인간 섬유아세포를 조제했다.
정상 인간 섬유아세포(쿠라보사(倉敷紡績株式會社)제, 제품 번호：KF－4109)를 기면(起眠) 후에 기본 배지(培地)(DMEM(나카라이테스크사(NACALAI TESQUE, INC.）)제, 제품 번호： 08456－65), 10% FBS(BioWest사제, 제품 번호： S1820, Lot No. 516536), 1% 항생 물질(페니실린-스트렙토마이신 혼합 용액(나카라이테스크사제, 제품 번호： 26253－84))) 중에서, CO2 인큐베이터 내(5% CO2, 37℃)에서 필요 세포수에 도달할 때까지 배양했다.
배양 후, 정상 인간 섬유아세포를 트립신/EDTA(2.5그램/1－트립신/1mmol/l－EDTA 용액(나카라이테스크사제, 제품 번호： 32777－44))을 이용해서 박리하고, 세포수를 계측한 후, 세포를 각 시험에 사용했다.
·실시예 및 비교예의 조제
다음에, 실시예 및 비교예를 조제했다.
실시예 및 비교예를 각각 칭량하고, 1%(w/v) 농도로 되도록 기본 배지에 용해했다.
용해 후, 불용성 물질을 제거하기 위해서, 기본 배지에 용해한 실시예 및 비교예를 각각 원심분리(120,000rpm(2,000s－1), 10분)했다.
원심분리 후, 상청(上淸)을 회수하고, 멸균 필터를 이용해서 여과 멸균한 것을 각 시험에 사용했다.
＜실시예 3： 항노화 작용 확인 시험＞
실시예 및 비교예의 항노화 작용을, 세포의 노화 마커로서 널리 이용되고 있는 β－갈락토시다아제(senescence－associated β－galactosidase； SA－β－gal) 활성을 측정하는 것에 의해 확인했다.
SA－β－gal는 노화 세포에 있어서 과잉 발현이 인정되고, 이 노화 마커에 의해 측정된 세포의 노화 현상은, 배양 세포뿐만 아니라, 생체 내에서도 일어나고 있는 것이 확인되고 있다.
항노화 작용 확인 시험에 의해서 확인된 노화 세포의 양은, 항노화 작용의 종합적인 지표로서, 항노화의 효과를 가장 구체적으로 나타낸다.
(시험 절차)
기본 배지에서 조제한 정상 인간 섬유아세포를, 1×104cells/0.1ml/웰로 되도록, 96웰 플레이트(형광 관찰용 블랙 플레이트(스미토모 베이크라이트사(Sumitomo Bakelite Co., Ltd.)제, 제품 번호： MS－8096F))에 파종해서 24시간 배양했다.
배양 후, 배양 상청을 이하의 다른 조건의 배지에서 각각 치환하고, 정상 인간 섬유아세포를 재차 배양했다.
각 배지의 조건은 이하와 같고, 각 조건에서 배양한 세포를 각각 실시예 1∼3, 비교예 1, 및 컨트롤(Control)이라고 칭한다.
실시예 1： 본 발명에 관한 포도 종자 유래 항노화 성분을 0.002중량% 포함하는 기본 배지
실시예 2： 본 발명에 관한 포도 종자 유래 항노화 성분을 0.01중량% 포함하는 기본 배지
실시예 3： 본 발명에 관한 포도 종자 유래 항노화 성분을 0.05중량% 포함하는 기본 배지
비교예 1：레스베라트롤을 0.0023중량% 포함하는 기본 배지
컨트롤： 기본 배지(본 발명에 관한 포도 종자 유래 항노화 성분 및 레스베라트롤을 포함하지 않는다)
이후, 실시예 4∼5에 있어서도, 상기 실시예 1∼3, 비교예 1, 및 컨트롤을 이용했다.
또한, 비교예 1에 있어서의 레스베라트롤의 농도를 0.0023중량%로 한 이유는, 레스베라트롤의 농도를 0.0023중량%보다 크게 하면, 후술하는 네크로시스 측정 시험에 있어서, 네크로시스 세포의 양이 너무 증가해 버려, 정확한 측정이 곤란해지기 때문이다.
정상 인간 섬유아세포를 상기 각 조건에서 각각 최대 21일간 배양했다.
배지는 2∼3일마다 교환했다.
배양 종료후, 배양 상청을 제거한 후, PBS(닛스이 세이야쿠 주식회사(日水製藥株式會社, NISSUI PHARMACEUTICAL CO.,LTD.)제, 제품 번호：05913)로 세포를 2회 세정했다.
세정한 정상 인간 섬유아세포에, 1000배 희석한 Bafilomycin A1을 포함하는 기본 배지를 첨가하고, 60분간, 37℃에서 정상 인간 섬유아세포를 배양했다.
배양 후, 1000배 희석한 SPiDER－β Gal working solution, 및 100배 희석한 핵 염색용 시약인 Hoechist 33342 solution(도진 카가쿠 켄규쇼(同仁化學硏究所, DOJINDO LABORATORIES)사제, 제품 번호： 346－07951)를 포함하는 기본 배지를 배양액에 첨가하고, 30분간, 37℃에서 정상 인간 섬유아세포를 또 배양했다.
배양 후, 기본 배지에서 정상 인간 섬유아세포를 세정했다.
세정 후, 기본 배지를 정상 인간 섬유아세포에 첨가하고, 형광 현미경(키엔스사(KEYENCE CORPORATION)제, 제품명： BZ－X7000) 아래에서 핵 염색(생세포) 및 노화 세포의 염색 화상을 촬영했다.
각 형광 관찰 화상으로부터 노화 세포의 양을 산출했다.
또한, 상기 Bafilomycin A1 및 SPiDER－β Gal working solution은, Cellular Senescence Detection Kit－SPiDER－βGal(도진 카가쿠 켄규쇼사제, 제품 번호： SG03)의 것을 이용했다.
(결과)
도 1은, 실시예 1∼3, 비교예 1, 컨트롤에 있어서 산출한 노화 세포의 양을 도시하는 그래프이다.
도 1a는 7일간 배양한 세포에 있어서의 노화 세포의 양, 도 1b는 14일간 배양한 세포에 있어서의 노화 세포의 양, 도 1c는 21일간 배양한 세포에 있어서의 노화 세포의 양을 도시하고 있다.
또한, 도 1에 있어서, 컨트롤에 있어서의 노화 세포의 양을 100%로 하고, 실시예 1∼3 및 비교예의 노화 세포의 양은 컨트롤에 있어서의 노화 세포의 양에 대한 비율로 도시하고 있다.
7일간 배양한 비교예 1은, 컨트롤과 비교해서, 노화 세포의 양은 519%였다(도 1a 참조).
한편, 컨트롤과 비교해서, 7일간 배양한 실시예 1의 노화 세포의 양은 85%, 실시예 2의 노화 세포의 양은 137%, 실시예 3의 노화 세포의 양은 73%였다(도 1a 참조).
14일간 배양한 비교예 1은, 컨트롤과 비교해서, 노화 세포의 양은 102%였다(도 1b 참조).
한편, 컨트롤과 비교해서, 14일간 배양한 실시예 1의 노화 세포의 양은 11%, 실시예 2의 노화 세포의 양은 9%, 실시예 3의 노화 세포의 양은 7%였다(도 1b 참조).
21일간 배양한 비교예 1은, 컨트롤과 비교해서, 노화 세포의 양은 64%였다(도 1c 참조).
한편, 컨트롤과 비교해서, 21일간 배양한 실시예 1의 노화 세포의 양은 4%, 실시예 2의 노화 세포의 양은 3%, 실시예 3의 노화 세포의 양은 2%였다(도 1c 참조).
이들 결과로부터, 레스베라트롤은, 배양 7일째의 세포에 있어서 컨트롤보다도 노화 세포의 양이 많아, 세포의 노화를 촉진시킨 것을 알 수 있었다. 그 때문에, 레스베라트롤은, 단기적으로 노화를 촉진하는 작용이 있는 것이 생각된다.
또, 배양 21일째의 세포에 있어서는 컨트롤과 비교해서 64% 정도로 노화 세포의 양을 억제하고 있으며, 세포의 노화를 억제하고 있는 것을 알 수 있었다.
한편, 본 발명에 관한 포도 종자 유래 항노화 성분은, 배양 7일째의 세포에 있어서 평균해서 컨트롤과 동일한 정도의 노화 세포의 양을 나타냈지만, 배양 21일째의 세포에 있어서 컨트롤과 비교해서 2%∼4% 정도로 노화 세포의 양을 억제하고 있으며, 레스베라트롤보다도 훨씬 더 강력하게 세포의 노화를 억제하고 있었다.
그 때문에, 본 발명에 관한 포도 종자 유래 항노화 성분은, 레스베라트롤과 비교해도, 우수한 항노화 작용을 구비하고 있으며, 이 포도 종자 유래 항노화 성분을 함유하는 본 발명에 관한 항노화 건강식품 및 화장품도 우수한 항노화 작용을 구비하고 있는 것을 알 수 있었다.
＜실시예 4： 미토콘드리아의 양 및 일정량의 미토콘드리아가 부담해야 할 일량의 측정 시험＞
상기 항노화 작용 확인 시험에 계속해서, 실시예 및 비교예의, 세포 내에 있어서의 미토콘드리아의 양 및 일정량의 미토콘드리아가 부담해야 할 일량에 대한 작용을 확인했다.
종래부터, 레스베라트롤은, 미토콘드리아의 양이나 일정량의 미토콘드리아가 부담해야 할 일량에 작용하는 것에 의해, 그 항노화 작용을 가진다고 생각되고 있기 때문에, 본 발명에 관한 포도 종자 유래 항노화 성분의 미토콘드리아의 양이나 일정량의 미토콘드리아가 부담해야 할 일량에의 작용을 확인했다.
미토콘드리아의 양은, 세포중의 미토콘드리아를 선택적으로 표식(標識)할 수 있는 MitoTracker Mitochondrion－Selective Probes(Invitrogen사제, 제품 번호： M7512)를 이용해서 측정했다.
일정량의 미토콘드리아가 부담해야 할 일량은, MTT 어세이(assay)에 의해 측정했다. MTT 어세이의 대상은, 미토콘드리아의 탈수소 산소 활성뿐이기 때문에, MTT 어세이의 결과는 일정량의 미토콘드리아가 부담해야 할 일량을 반영한다.
(시험 절차)
실시예 2에 있어서 배양한 정상 인간 섬유아세포의 배양 상청을 제거한 후, PBS(닛스이 세이야쿠 주식회사제, 제품 번호： 05913)로 정상 인간 섬유아세포를 2회 세정했다.
세정한 세포에 1000배 희석한 Hoechist 33342 solution(도진 카가쿠 켄규쇼사제, 제품 번호： 346－07951) 및 2000배 희석한 MitoTracker Mitochondrion－Selective Probes(Invitrogen사제, 제품 번호： M7512)를 포함하는 기본 배지를 첨가하고, 30분간, 37℃에서 정상 인간 섬유아세포를 배양했다.
배양 후, 배양 상청을 제거한 후, PBS(닛스이 세이야쿠 주식회사제, 제품 번호： 05913)로 정상 인간 섬유아세포를 2회 세정했다.
세정 후, PBS(닛스이 세이야쿠 주식회사제, 제품 번호： 05913)를 새롭게 정상 인간 섬유아세포에 첨가하고, 형광 현미경(키엔스사제, 제품명： BZ－X7000) 아래에서 핵 염색(생세포) 및 미토콘드리아 염색 화상을 촬영했다.
촬영 후, 형광 플레이트 리더(써모 피셔 사이언티픽사(Thermo Fisher Scientific Inc)제, 제품명： VARIOSKAN FLASH)로 각 형광 강도(Hoechis： 여기 파장 356㎚, 형광 파장 465㎚, MitoTracker： 여기 파장 579㎚, 형광 파장 599㎚)를 측정했다.
형광 강도를 측정한 후, 상청을 제거하고, PBS(닛스이 세이야쿠 주식회사제, 제품 번호： 05913)로 정상 인간 섬유아세포를 1회 세정했다.
정상 인간 섬유아세포를 세정한 후, 0.5㎎/ml의 MTT(Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide(SIGMA사제, 제품 번호： M5655－1G))를 포함하는 PBS로 치환(100μl/웰)하고, 5시간, 37℃에서 반응시켰다.
반응 후, 각 웰에 0.01M의 HCl(SIGMA사제, 제품 번호： 13－1690) 10% SDS(와코 쥰야쿠 코교사(和光純藥工業社, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)제, 제품 번호： 191－07145)를 100μl 첨가하고, 실온에서 24시간 반응시켰다.
반응 후, MTT의 포르마잔을 용해했다.
포르마잔을 용해한 후, 플레이트 리더(써모 피셔 사이언티픽사제, 제품명： VARIOSKAN FLASH)로 흡광도(측정 파장 550㎚, 참조 파장 660㎚)를 측정했다.
(결과)
도 2는, 실시예 1∼3, 비교예 1, 컨트롤에 있어서 측정된 미토콘드리아의 양을 도시하는 그래프이다.
도 2a는 7일간 배양한 세포에 있어서의 미토콘드리아의 양, 도 2b는 14일간 배양한 세포에 있어서의 미토콘드리아의 양, 도 2c는 21일간 배양한 세포에 있어서의 미토콘드리아의 양을 도시하고 있다.
또한, 도 2에 있어서, 컨트롤에 있어서의 미토콘드리아의 양을 100%로 하고, 실시예 1∼3 및 비교예의 미토콘드리아의 양은 컨트롤에 있어서의 미토콘드리아의 양에 대한 비율로 도시하고 있다.
7일간 배양한 비교예 1은, 컨트롤과 비교해서, 미토콘드리아의 양은 191%였다(도 2a 참조).
한편, 컨트롤과 비교해서, 7일간 배양한 실시예 1의 미토콘드리아의 양은 116%, 실시예 2의 미토콘드리아의 양은 126%, 실시예 3의 미토콘드리아의 양은 143%였다(도 2a 참조).
14일간 배양한 비교예 1은, 컨트롤과 비교해서, 미토콘드리아의 양은 228%였다(도 2b 참조).
한편, 컨트롤과 비교해서, 14일간 배양한 실시예 1의 미토콘드리아의 양은 123%, 실시예 2의 미토콘드리아의 양은 128%, 실시예 3의 미토콘드리아의 양은 172%였다(도 2b 참조).
21일간 배양한 비교예 1은, 컨트롤과 비교해서, 미토콘드리아의 양은 246%였다(도 2c 참조).
한편, 컨트롤과 비교해서, 21일간 배양한 실시예 1의 미토콘드리아의 양은 115%, 실시예 2의 미토콘드리아의 양은 124%, 실시예 3의 미토콘드리아의 양은 178%였다(도 2c 참조).
이들 결과로부터, 레스베라트롤은, 미토콘드리아의 양을 증가시키는 작용을 구비하고 있는 것을 알 수 있었다.
또, 본 발명에 관한 포도 종자 유래 항노화 성분도, 미토콘드리아의 양을 증가시키는 작용을 구비하고 있는 것을 알 수 있었다.
도 3은, 실시예 1∼3, 비교예 1, 컨트롤에 있어서 측정된 일정량의 미토콘드리아가 부담해야 할 일량을 도시하는 그래프이다.
도 3a는 7일간 배양한 세포에 있어서의 일정량의 미토콘드리아가 부담해야 할 일량, 도 3b는 14일간 배양한 세포에 있어서의 일정량의 미토콘드리아가 부담해야 할 일량, 도 3c는 21일간 배양한 세포에 있어서의 일정량의 미토콘드리아가 부담해야 할 일량을 도시하고 있다.
또한, 도 3에 있어서, 컨트롤에 있어서의 일정량의 미토콘드리아가 부담해야 할 일량을 100으로 하고, 실시예 1∼3 및 비교예의 일정량의 미토콘드리아가 부담해야 할 일량은 컨트롤에 있어서의 일정량의 미토콘드리아가 부담해야 할 일량에 대한 비율로 도시하고 있다.
7일간 배양한 비교예 1은, 컨트롤과 비교해서, 일정량의 미토콘드리아가 부담해야 할 일량이 22%였다(도 3a 참조).
한편, 컨트롤과 비교해서, 7일간 배양한 실시예 1의 일정량의 미토콘드리아가 부담해야 할 일량은 74%, 실시예 2의 일정량의 미토콘드리아가 부담해야 할 일량은 58%, 실시예 3의 일정량의 미토콘드리아가 부담해야 할 일량은 38%였다(도 3a 참조).
14일간 배양한 비교예 1은, 컨트롤과 비교해서, 일정량의 미토콘드리아가 부담해야 할 일량이 20%였다(도 3b 참조).
한편, 컨트롤과 비교해서, 14일간 배양한 실시예 1의 일정량의 미토콘드리아가 부담해야 할 일량은 77%, 실시예 2의 일정량의 미토콘드리아가 부담해야 할 일량은 63%, 실시예 3의 일정량의 미토콘드리아가 부담해야 할 일량은 34%였다(도 3b 참조).
21일간 배양한 비교예 1은, 컨트롤과 비교해서, 일정량의 미토콘드리아가 부담해야 할 일량이 49%였다(도 3c 참조).
한편, 컨트롤과 비교해서, 21일간 배양한 실시예 1의 일정량의 미토콘드리아가 부담해야 할 일량은 88%, 실시예 2의 일정량의 미토콘드리아가 부담해야 할 일량은 76%, 실시예 3의 일정량의 미토콘드리아가 부담해야 할 일량은 62%였다(도 3c 참조).
이들 결과로부터, 레스베라트롤은, 일정량의 미토콘드리아가 부담해야 할 일량을 감소시키는 작용을 구비하고 있는 것을 알 수 있었다.
또, 본 발명에 관한 포도 종자 유래 항노화 성분도, 일정량의 미토콘드리아가 부담해야 할 일량을 감소시키는 작용을 구비하고 있는 것을 알 수 있었다.
실시예 4의 결과로부터, 본 발명에 관한 포도 종자 유래 항노화 성분은, 미토콘드리아의 양을 증가시키고, 일정량의 미토콘드리아가 부담해야 할 일량을 감소시키는 작용을 구비하고 있는 것을 알 수 있었다.
미토콘드리아의 양이 증가하는 것에 의해, 일정량의 미토콘드리아에 있어서 생산해야 할 ATP의 양(즉, 일량)은 감소한다. 실시예 4에 있어서 확인된 일정한 양의 미토콘드리아가 부담해야 할 일량의 감소는, 미토콘드리아의 양이 증가하고, 일정량의 미토콘드리아당 ATP의 생산량이 감소했기 때문이라고 생각된다.
이것에 의해, 미토콘드리아의 처리 능력에 여유가 생겨, 미토콘드리아에 의한 활성 산소의 생성량이 감소하고, 또한 활성 산소를 제거하는 효소인 슈퍼옥시드 디스무타아제(SOD)의 생성량도 증가하기 때문에, 미토콘드리아 및 세포의 데미지로 이어지는 활성 산소의 양을 저하시킬 수 있다.
활성 산소의 약 90%는 미토콘드리아에 의해서 생성되기 때문에, 본 발명에 관한 포도 종자 유래 항노화 성분에 의해, 미토콘드리아에 의한 활성 산소의 생성량을 감소시킴으로써, 세포 및 세포로 이루어지는 장기 등의 손상을 방지하여, 항노화 작용을 가진다고 생각된다.
＜실시예 5： 아포토시스 및 네크로시스 측정 시험＞
계속해서, 실시예 및 비교예의, 아포토시스 세포의 양 및 네크로시스 세포의 양에 대한 작용을 확인했다.
종래부터, 레스베라트롤은, 아포토시스를 유도하는 것에 의해 항노화 작용을 가진다고 생각되고 있기 때문에, 본 발명에 관한 포도 종자 유래 항노화 성분의 아포토시스 세포의 양에 대한 작용을 확인했다.
이에 더하여, 본 발명에 관한 포도 종자 유래 항노화 성분의, 아포토시스와 동일한 세포사(細胞死)인 네크로시스 세포의 양에 대한 작용도 확인했다.
아포토시스 세포의 양은, 종래부터 아포토시스 마커로서 이용되고 있는 Annexin V를 사용해서 측정했다. 보다 자세하게는, 형광 표식한 Annexin V가, 아포토시스 세포의 표면에 많이 출현하는 포스파티딜세린에 결합하는 성질을 이용해서 아포토시스 세포를 선택적으로 형광 염색하는 것에 의해, 아포토시스 세포의 양을 측정했다.
네크로시스 세포의 양은, 종래부터 네크로시스 마커로서 이용되고 있는 에티듐 호모다이머 Ⅲ(EthD－Ⅲ)를 사용해서 측정했다. 보다 자세하게는, EthD－Ⅲ가 막 불투과성의 핵산 프로브이며, 생세포나 아포토시스 세포는 염색되지 않지만, 네크로시스 세포는 강한 적색으로 염색하는 성질을 이용하는 것에 의해, 네크로시스 세포의 양을 측정했다.
(실험 절차)
실시예 2에 있어서 배양한 정상 인간 섬유아세포의 배양 상청을 제거한 후, PBS(닛스이 세이야쿠 주식회사제, 제품 번호： 05913)로 정상 인간 섬유아세포를 2회 세정했다.
세정한 정상 인간 섬유아세포에 1000배 희석한 Hoechist 33342 solution(도진 카가쿠 켄규쇼사제, 제품 번호： 346－07951), 20배 희석한 FITC－Annexin V, 및 20배 희석한 EthD－Ⅲ를 포함하는 1×Binding Buffer를 첨가하고, 30분간, 37℃에서 정상 인간 섬유아세포를 배양했다.
배양 후, 배양 상청을 제거한 후, 1×Binding Buffer에서 정상 인간 섬유아세포를 2회 세정했다.
세정 후, 새로운 1×Binding Buffer를 정상 인간 섬유아세포에 첨가하고, 형광 현미경 아래에서 핵 염색(생세포), Annexin V 염색(아포토시스), 및 EthD－Ⅲ 염색(네크로시스) 화상을 촬영했다.
촬영한 형광 관찰 화상으로부터 아포토시스 세포의 양 및 네크로시스 세포의 양을 산출했다.
또한, 본 실시예에서 이용한 FITC－Annexin V, EthD－Ⅲ, 및 1×Binding Buffer는, Apoptotic/Necrotic/Healthy Cells Detection Kit(다카라 바이오사(Takara Bio Inc.)제, 제품 번호： D25517)의 것을 이용했다.
(결과)
도 4는, 실시예 1∼3, 비교예 1, 컨트롤에 있어서 측정된 아포토시스 세포의 양을 도시하는 그래프이다.
도 4a는 7일간 배양한 세포에 있어서의 아포토시스 세포의 양, 도 4b는 14일간 배양한 세포에 있어서의 아포토시스 세포의 양, 도 4c는 21일간 배양한 세포에 있어서의 아포토시스 세포의 양을 도시하고 있다.
또한, 도 4에 있어서, 컨트롤에 있어서의 아포토시스 세포의 양을 100%로 하고, 실시예 1∼3 및 비교예의 아포토시스 세포의 양은 컨트롤에 있어서의 아포토시스 세포의 양에 대한 비율로 도시하고 있다.
7일간 배양한 비교예 1은, 컨트롤과 비교해서, 아포토시스 세포의 양은 2184%였다(도 4a 참조).
한편, 컨트롤과 비교해서, 7일간 배양한 실시예 1의 아포토시스 세포의 양은 164%, 실시예 2의 아포토시스 세포의 양은 102%, 실시예 1의 아포토시스 세포의 양은 483%였다(도 4a 참조).
14일간 배양한 비교예 1은, 컨트롤과 비교해서, 아포토시스 세포의 양은 1400%였다(도 4b 참조).
한편, 컨트롤과 비교해서, 14일간 배양한 실시예 1의 아포토시스 세포의 양은 107%, 실시예 2의 아포토시스 세포의 양은 313%, 실시예 1의 아포토시스 세포의 양은 226%였다(도 4b 참조).
21일간 배양한 비교예 1은, 컨트롤과 비교해서, 아포토시스 세포의 양은 4525%였다(도 4c 참조).
한편, 컨트롤과 비교해서, 21일간 배양한 실시예 1의 아포토시스 세포의 양은 59%, 실시예 2의 아포토시스 세포의 양은 558%, 실시예 1의 아포토시스 세포의 양은 668%였다(도 4c 참조).
이들 결과로부터, 레스베라트롤은, 아포토시스 세포의 양을 증가시키는 작용을 구비하고 있는 것을 알 수 있었다.
또, 본 발명에 관한 포도 종자 유래 항노화 성분도, 아포토시스 세포의 양을 증가시키는 작용을 구비하고 있는 것을 알 수 있었다.
도 5는, 실시예 1∼3, 비교예 1, 컨트롤에 있어서 측정된 네크로시스 세포의 양을 도시하는 그래프이다.
도 5a는 7일간 배양한 세포에 있어서의 네크로시스 세포의 양, 도 5b는 14일간 배양한 세포에 있어서의 네크로시스 세포의 양, 도 5c는 21일간 배양한 세포에 있어서의 네크로시스 세포의 양을 도시하고 있다.
또한, 도 5에 있어서, 컨트롤에 있어서의 네크로시스 세포의 양을 100%로 하고, 실시예 1∼3 및 비교예의 네크로시스 세포의 양은 컨트롤에 있어서의 네크로시스 세포의 양에 대한 비율로 도시하고 있다.
7일간 배양한 비교예 1은, 컨트롤과 비교해서, 네크로시스 세포의 양은 125%였다(도 5a 참조).
한편, 컨트롤과 비교해서, 7일간 배양한 실시예 1의 네크로시스 세포의 양은 47%, 실시예 2의 네크로시스 세포의 양은 47%, 실시예 1의 네크로시스 세포의 양은 100%였다(도 5a 참조).
14일간 배양한 비교예 1은, 컨트롤과 비교해서, 네크로시스 세포의 양은 801%였다(도 5b 참조).
한편, 컨트롤과 비교해서, 14일간 배양한 실시예 1의 네크로시스 세포의 양은 109%, 실시예 2의 네크로시스 세포의 양은 108%, 실시예 1의 네크로시스 세포의 양은 95%였다(도 5b 참조).
21일간 배양한 비교예 1은, 컨트롤과 비교해서, 네크로시스 세포의 양은 608%였다(도 5c 참조).
한편, 컨트롤과 비교해서, 21일간 배양한 실시예 1의 네크로시스 세포의 양은 55%, 실시예 2의 네크로시스 세포의 양은 28%, 실시예 1의 네크로시스 세포의 양은 24%였다(도 5c 참조).
이들 결과로부터, 레스베라트롤은, 모든 기간에 있어서 네크로시스 세포의 양을 증가시키는 작용을 구비하고 있는 것을 알 수 있었다.
한편, 본 발명에 관한 포도 종자 유래 항노화 성분은, 네크로시스 세포의 양을 감소시키는 작용을 구비하고 있는 것을 알 수 있었다.
실시예 5의 결과로부터, 본 발명에 관한 포도 종자 유래 항노화 성분은, 아포토시스 세포의 양을 증가시키고, 네크로시스 세포의 양을 감소시키는 작용을 구비하고 있는 것을 알 수 있었다.
아포토시스는, 생체에 불필요한 세포나 유해한 세포에 세포사를 유도하고, 이것을 배제하는 구조이며, 노화해서 기능 부전으로 된 세포를 신속하게 배제하는 것에 의해, 새로운 세포의 생성으로 이어진다. 아포토시스가 건전하게 작동함으로써 노화 세포는 배제되고, 세포 레벨에서의 건전한 세포 증가에 이른다. 건전한 세포로 구성된 장기는 젊은 장기로 된다. 또, 아포토시스는, 자기면역 질환의 메카니즘인 자기(自己)를 공격하는 면역 세포를 제거하는 것으로도 이어지며, 아포토시스가 건전하게 작동함으로써, 자기면역 질환을 저하시키는 것을 기대할 수 있다.
한편, 네크로시스(괴사)는, 세포 내의 효소 등을 사전 처리하는 일없이, 세포가 파열하기 때문에, 효소 등을 포함하는 세포 내용물이 세포 밖으로 방출되어 주변 조직에 염증 반응 등의 악영향을 미친다. 이 악영향은, 세포의 열화를 재촉하여, 나이를 먹을수록 증가하는 체내 염증의 요인으로 된다. 이와 같이, 네크로시스는 주변 조직에 염증 반응 등의 악영향을 미치는 것에 의해, 세포의 손상을 야기한다. 그 때문에, 네크로시스는 세포의 노화를 촉진한다.
따라서, 아포토시스를 촉진하고, 네크로시스를 억제하는 것은, 세포의 노화를 억제하기 위해서 매우 유효하다.
그 때문에, 아포토시스를 촉진하고, 네크로시스를 억제하는 작용을 구비하는 본 발명에 관한 포도 종자 유래 항노화 성분은, 우수한 항노화 작용을 구비하고 있는 것을 알 수 있다.
한편, 레스베라트롤은, 아포토시스뿐만 아니라 네크로시스도 촉진하는 것을 알 수 있었다. 상술한 바와 같이, 세포의 노화를 억제하기 위해서는 네크로시스를 억제할 필요가 있다. 그 때문에, 아포토시스뿐만 아니라 네크로시스도 촉진하는 레스베라트롤은, 본 발명에 관한 포도 종자 유래 항노화 성분보다도 항노화 작용은 낮다고 생각된다.
＜실시예 6：독성 시험＞
본 발명에 관한 포도 종자 유래 항노화 성분의 독성을 확인하기 위해서, 암컷 마우스를 이용하는 급성 경구 독성 시험(한도 시험)(OECD Guidelines for the Testing of Chemicals 420(2001)에 준거)을 실시했다.
(시험 방법)
분말화한 본 발명에 관한 포도 종자 유래 항노화 성분을 주사용 물로 현탁 하고, 100㎎/mL의 시험액을 조제했다.
5주령(週齡)의 ICR계 암컷 마우스를 니혼 에스엘씨 주식회사(Japan SLC,Inc.)로부터 구입하고, 약 1주일의 예비 사육을 행하고, 일반 상태에 이상이 없는 것을 확인한 후, 시험에 사용했다.
시험에 사용하는 암컷 마우스는, 폴리카보네이트제 케이지에 각 5마리 수용하고, 실온(23℃±2℃), 조명 시간 12시간/일로 설정한 사육실에 있어서 사육했다.
사료(니혼 노우산 코교 주식회사(日本農産工業株式會社, Nosan Corporation) 제품명： 라보 MR 스톡(마우스, 랫(rat)용 고형 사료)) 및 음료수(수돗물)는 자유 섭취시켰다.
포도 종자 유래 항노화 성분을 2000㎎/㎏ 투여하는 시험군 및 용매 대조(Control)로서 주사용 물을 투여하는 대조군을 설정하고, 각 군에 대해 각각 5마리의 암컷 마우스를 이용했다.
투여 전에 약 4시간, 시험에 사용하는 암컷 마우스를 절식시켰다.
각 암컷 마우스의 체중을 측정한 후, 시험군에는 시험액, 대조군에는 주사용 물을 각각 20mL/㎏의 투여 용량으로 위관(gastric tube, stomach tube)을 이용해서 강제 단회(單回) 경구 투여했다.
투여 후 14일간, 암컷 마우스를 관찰했다.
투여 당일은 빈번하게(자주) 암컷 마우스를 관찰하고, 투여 다음날(翌日)부터는 1일 1회 암컷 마우스를 관찰했다.
투여 후 7일째 및 투여 후 14일째에 암컷 마우스의 체중을 측정하고, t－검정에 의해 유의(有意) 수준 5%에서 군 사이의 비교를 행했다.
관찰 기간의 종료 후, 모든 암컷 마우스를 부검했다.
(결과)
어느 투여군에 있어서도, 관찰 기간중에 사망예는 없었다.
어느 투여군에 있어서도, 관찰 기간중에 이상은 보이지 않았다.
표 1은, 시험군과 대조군의 체중 변환의 결과를 나타내고 있다.
투여 후 7일째 및 투여 후 14일째의 체중 측정에 있어서, 시험군은 대조군과 비교해서, 체중에 유의 차가 없는 것을 알 수 있었다.
관찰 기간 종료 후의 부검에 있어서, 모든 암컷 마우스에 이상은 보이지 않았다.
체중은, 평균값±표준 편차로 나타냈다(단위： g).
괄호 안에 체중을 측정한 암컷 마우스의 수를 나타냈다.
이들 결과로부터, 암컷 마우스를 이용하는 단회 경구 투여에 있어서, 본 발명에 관한 포도 종자 유래 항노화 성분의 LD50값은, 암컷 마우스에 있어서 2000㎎/㎏를 초과하는 것인 것을 알 수 있었다.
실시예 3∼5의 결과로부터, 본 발명에 관한 포도 종자 유래 항노화 성분은, 미토콘드리아의 양을 증가시키고, 일정량의 미토콘드리아가 부담해야 할 일량을 저감하고, 아포토시스 세포의 양을 증가시키고, 네크로시스 세포의 양을 감소시키는 것에 의해, 우수한 항노화 작용을 구비하고 있는 것을 알 수 있었다.
또, 항노화 작용이 기대되는 레스베라트롤 단체(單體)와 비교한 결과, 본 발명에 관한 포도 종자 유래 항노화 성분은, 레스베라트롤 단체보다도 훨씬 우수한 항노화 작용을 구비하고 있는 것을 알 수 있었다.
이에 더하여, 실시예 6의 결과로부터, 본 발명에 관한 포도 종자 유래 항노화 성분은, 세포 독성이 낮고, 우수한 안전성을 구비하고 있는 것도 알 수 있었다.
그 때문에, 본 발명에 관한 포도 종자 유래 항노화 성분을 포함하는 건강식품 및 화장품은 우수한 항노화 작용과 우수한 안전성을 구비하고 있다.
본 발명에 의하면, 항노화 건강식품 및 화장품이, 거친 정제로 60중량% 이상의 포도 종자 유래 폴리페놀로 이루어지는 포도 종자 유래 항노화 성분을 포함하기 때문에, 우수한 항노화 작용을 구비한 항노화 건강식품 및 화장품을 제공할 수 있다.
그 때문에, 본 발명은, 항노화 작용을 가지는 건강식품 및 화장품으로서 호적하게 이용된다.
Claims (3)
- 거친 정제(crude purification)로 60중량% 이상의 포도 종자 유래 폴리페놀로 이루어지는 포도 종자 유래 항노화 성분을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항노화 건강식품 및 화장품.
- (공정 1) 유럽 포도(Vitis vinifera L.), 미국 포도(Vitis labrusca L.), 산포도(Vitis coignetiae L.), 만주 산포도(Vitis amurensis L.) 및 시라가이 포도(Vitis shiragai L.)로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 포도 종자를 전처리(前處理)하고, 최아(催芽) 상태로 한 포도 종자를, 35℃∼60℃에서 건조시키는 공정
(공정 2) 상기 공정 1에 있어서 건조시킨 포도 종자를 분말화하는 공정
(공정 3) 상기 공정 2에서 얻어진 포도 종자 분말을, 물, 에탄올 또는 물과 에탄올의 혼합 용매 중 어느 하나에 침지시켜 포도 종자 유래 폴리페놀을 포함하는 추출 분획(fraction)을 얻는 공정
(공정 4) 상기 공정 3에서 얻어진 포도 종자 유래 폴리페놀을 포함하는 추출 분획을 건조시키고 분말화하는 공정으로 이루어지는 포도 종자 유래 항노화 성분의 제조 방법. - 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 포도 종자가, 아기오르기티코(Agiorgitiko), 비오니에(Viognier), 까베르네 소비뇽(Cabernet Sauvignon), 까베르네 프랑(Cabernet Franc), 가메(Gamay), 까리냥(Carignan), 까르미네르(Carmenere), 시노마브로(Xinomavro), 그르나슈(Grenache), 게뷔르츠트라미너(Gewurztraminer), 케르너(Kerner), 꼴롱바르(Colombard), 코슈(甲州), 설타나(Sultana), 산지오베제(Sangiovese), 샤르도네(Chardonnay), 슈냉 블랑(Chenin Blanc), 쉬라(Syrah), 진판델(Zinfandel), 세미용(Semillon), 소비뇽 블랑(Sauvignon Blanc), 따나(Tannat), 츠바이겔트(Zweigelt), 템프라니요(Tempranillo), 트레비아노(Trebbiano), 네비올로(Nebbiolo), 네로 다볼라(Nero D＇Avola), 바르베라(Barbera), 피노타쥬(Pinotage), 피노 누와(Pinot Noir), 피노 그리(Pinot Gris), 피노 블랑(Pinot Blanc), 쁘띠 베르도(Petit Verdot), 블랙 퀸(Black Queen), 뮈스까 베일리 A(Muscat Bailey A), 말벡(Malbec), 뮬러 트루가우(MullerThurgau), 무르베드르(Mourvedre), 뮈니에(Meunier), 믈롱 드 부르고뉴(Melon de Bourgogne), 메를로(Merlot), 모스카토(Moscato), 야마 소비뇽(Yama Sauvignon), 리슬링(Riesling) 및 루비 까베르네(Ruby Cabernet)로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 와인용 포도 품종의 종자인 것을 특징으로 하는, 항노화 건강식품 및 화장품 또는 포도 종자 유래 항노화 성분의 제조 방법.
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