BR112020002163B1 - Alimento saudável e cosmético para aumentar a quantidade de células apoptóticas e diminuir a quantidade de células necróticas e um método de fabricação de um ingrediente derivado de semente de uva forçando a brotação para aumentar a quantidade de células apoptóticas e diminuir a quantidade de células necróticas - Google Patents
Alimento saudável e cosmético para aumentar a quantidade de células apoptóticas e diminuir a quantidade de células necróticas e um método de fabricação de um ingrediente derivado de semente de uva forçando a brotação para aumentar a quantidade de células apoptóticas e diminuir a quantidade de células necróticas Download PDFInfo
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Abstract
É aqui provido alimento saudável e cosmético antienvelhecimento tendo melhor efeito antienvelhecimento do que qualquer substância conhecida esperada como tendo um efeito antienvelhecimento, tal como resveratrol, e um método de fabricação de um ingrediente antienvelhecimento derivado de semente de uva tendo o melhor efeito antienvelhecimento. O alimento saudável antienvelhecimento e o cosmético antienvelhecimento, de acordo com a presente invenção, compreendem um ingrediente antienvelhecimento derivado de semente de uva consistindo de 60% em peso ou mais de polifenol derivado de semente de uva grosseiramente purificado.
Description
[001] A presente invenção refere-se a um alimento saudável e cosmético antienvelhecimento, e um método de fabricação de um ingrediente antienvelhecimento derivado de semente de uva, em particular a um alimento saudável e cosmético antienvelhecimento tendo um melhor efeito antienvelhecimento do que resveratrol, e um método de fabricação de um ingrediente antienvelhecimento derivado de semente de uva tendo o melhor efeito antienvelhecimento.
[002] Estudos anteriores a cerca de prevenção do envelhecimento e controle da vida revelaram que um composto, por exemplo, resveratrol (trans-3, 4', 5-tri-hidroxi- estilbeno) é esperado ter um efeito antienvelhecimento.
[003] Por exemplo, Konrad T. Howitz et al., Nature 425, e 191-196 (2003) relatam que em uma levedura em germinação (Saccharomyces cerevisiae), resveratrol estimulou Sir2 de uma enzima de Caenorhabditis elegans ajustando a extensão de vida a fim de melhorar a estabilidade do DNA da levedura em germinação, estendendo assim a vida da levedura em germinação em 70%.
[004] No entanto, como descrito em Richard A. Miller et al., Journal of Gerontology: BIOLOGICAL SCIENCES 191-201 (2010), foi relatado que resveratrol não estende o tempo de vida de um camundongo macho ou fêmea nem tem qualquer efeito antienvelhecimento.
[005] Consequentemente, embora seja esperado que resveratrol tenha um efeito antienvelhecimento, não foi confirmado se resveratrol realmente tem o efeito antienvelhecimento.
[006] Como descrito acima, não foi confirmado se resveratrol, que se espera ter um efeito antienvelhecimento, realmente tem tal efeito antienvelhecimento.
[007] Consequentemente, existe uma necessidade de uma substância que tenha um efeito antienvelhecimento melhor e mais confiável do que resveratrol.
[008] Após uma consideração diligente, os inventores verificaram que um extrato consistindo de polifenol derivado de semente de uva tinha melhor efeito antienvelhecimento do que resveratrol.
[009] O problema a ser resolvido pela presente invenção é prover um ingrediente antienvelhecimento derivado de semente de uva tendo melhor efeito antienvelhecimento do que resveratrol, esperado ter tal efeito antienvelhecimento, e um método de fabricação de tal ingrediente antienvelhecimento derivado de semente de uva, e prover um alimento saudável antienvelhecimento e um cosmético antienvelhecimento contendo o ingrediente antienvelhecimento.
[0010] A presente invenção, de acordo com um primeiro aspecto, refere-se a um alimento saudável e cosmético antienvelhecimento, compreendendo um ingrediente antienvelhecimento derivado de semente de uva consistindo de 60% em peso ou mais de polifenol derivado de semente de uva grosseiramente purificado.
[0011] A presente invenção, de acordo com um segundo aspecto, refere-se a um método de fabricação de um ingrediente antienvelhecimento derivado de semente de uva, compreendendo: (Etapa 1) pré-tratamento de uma ou mais sementes de uva selecionadas dentre um grupo consistindo de Vitis vinifera L., Vitis labrusca L., Vitis coignetiae L., Vitis amurensis L., e Vitis shiragai L. para forçar a brotação destas sementes de uva e secagem das sementes de uva forçando a brotação a 35oC - 60oC; (Etapa 2) reduzir a pó as sementes de uva secas na Etapa 1; (Etapa 3) obter uma fração extraída contendo polifenol derivado de semente de uva pela imersão das sementes de uva em pó obtidas na Etapa 2 ou em água, etanol, ou um solvente misto de água e etanol; e (Etapa 4) secar e reduzir a pó a fração extraída contendo o polifenol derivado de semente de uva obtida na Etapa 3.
[0012] A presente invenção, de acordo com um terceiro aspecto, refere-se ao alimento saudável e o cosmético antienvelhecimento do primeiro aspecto ou ao método do segundo aspecto, em que a semente de uva é uma semente de um ou mais cultivares de uva de vinho selecionados dentre um grupo consistindo de: Agiorgitiko, Viognier, CabernetSauvignon, Cabernet Franc, Gamay, Carignan, Carmenere, Xinomavro, Grenache, Gewurztraminer, Kerner, Colombard, Koshu, Sultana, Sangiovese, Chardonnay, Chenin Blanc, Syrah, Zinfandel, Semillon, Sauvignon Blanc, Tannat, Zweigelt, Tempranillo, Trebbiano, Nebbiolo, Nero D'Avola, Barbera, Pinotage, Pinot Noir, Pinot Gris, Pinot Blanc, Petit Verdot, Black Queen, Muscat Bailey A, Malbec, Muller- Thurgau, Mourvedre, Meunier, Melon de Bourgogne, Merlot, Moscato, Yama-Sauvignon, Riesling, e Ruby Cabernet.
[0013] De acordo com a presente invenção do primeiro aspecto, o alimento saudável e o cosmético antienvelhecimento compreendem um ingrediente antienvelhecimento derivado de semente de uva consistindo de 60% em peso ou mais de polifenol derivado de semente de uva grosseiramente purificado. Assim, um alimento saudável e cosmético antienvelhecimento tendo bom efeito antienvelhecimento pode ser fornecido.
[0014] De acordo com a presente invenção do segundo aspecto, o ingrediente antienvelhecimento derivado de semente de uva é fabricado por (Etapa 1) pré-tratamento de uma ou mais sementes de uva selecionadas dentre um grupo consistindo de Vitis vinifera L., Vitis labrusca L., Vitis coignetiae L., Vitis amurensis L., e Vitis shiragai L. para forçar a brotação destas sementes de uva e secagem das sementes de uva forçando a brotação a 35oC - 60oC; (Etapa 2) reduzir a pó as sementes de uva secas na Etapa 1; (Etapa 3) obter uma fração extraída contendo polifenol derivado de semente de uva pela imersão das sementes de uva em pó obtidas na Etapa 2 ou em água, etanol, ou um solvente misto de água e etanol; e (Etapa 4) secar e reduzir a pó a fração extraída contendo o polifenol derivado de semente de uva obtida na Etapa 3. Assim, um ingrediente antienvelhecimento derivado de semente de uva tendo bom efeito antienvelhecimento pode ser fabricado.
[0015] De acordo com a presente invenção do terceiro aspecto, a semente de uva usada para o alimento saudável e o cosmético antienvelhecimento do primeiro aspecto ou para o método do segundo aspecto é uma semente de um ou mais cultivares de uva de vinho selecionados dentre um grupo consistindo de Agiorgitiko, Viognier, CabernetSauvignon, Cabernet Franc, Gamay, Carignan, Carmenere, Xinomavro, Grenache, Gewurztraminer, Kerner, Colombard, Koshu, Sultana, Sangiovese, Chardonnay, Chenin Blanc, Syrah, Zinfandel, Semillon, Sauvignon Blanc, Tannat, Zweigelt, Tempranillo, Trebbiano, Nebbiolo, Nero D'Avola, Barbera, Pinotage, Pinot Noir, Pinot Gris, Pinot Blanc, Petit Verdot, Black Queen, Muscat Bailey A, Malbec, Muller-Thurgau, Mourvedre, Meunier, Melon de Bourgogne, Merlot, Moscato, Yama-Sauvignon, Riesling, e Ruby Cabernet. Assim, um alimento saudável e cosmético antienvelhecimento tendo melhor efeito antienvelhecimento pode ser fabricado, ou um ingrediente antienvelhecimento derivado de semente de uva tendo melhor efeito antienvelhecimento pode ser fabricado.
[0016] [Fig. 1] Figura 1 é um gráfico mostrando a quantidade de células senescentes calculada nos Exemplos 13, Exemplo Comparativo 1, e um Controle. (a) Mostra a quantidade das células senescentes em células cultivadas por 7 dias, (b) mostra a quantidade das células senescentes em células cultivadas por 14 dias, e (c) mostra a quantidade das células senescentes em células cultivadas por 21 dias. Adicionalmente, presumindo que a quantidade da célula senescente calculada em um Controle é 100%, as quantidades das células senescentes nos Exemplos 1-3 e Exemplo Comparativo 1 são mostradas em uma razão para a quantidade de célula senescente no Controle.
[0017] [Fig. 2] Figura 2 é um gráfico mostrando a quantidade de mitocôndrias medida nos Exemplos 1-3, Exemplo Comparativo 1, e um Controle. (a) mostra a quantidade das mitocôndrias em células cultivadas por 7 dias, (b) mostra a quantidade das mitocôndrias em células cultivadas por 14 dias, e (c) mostra a quantidade das mitocôndrias em células cultivadas por 21 dias. Adicionalmente, presumindo que a quantidade de mitocôndrias calculada em um Controle é 100%, as quantidades das mitocôndrias nos Exemplos 1-3 e Exemplo Comparativo 1 são mostradas em uma razão para a quantidade de mitocôndria no Controle.
[0018] [Fig. 3] Figura 3 é um gráfico mostrando a carga de trabalho de uma certa quantidade de mitocôndrias medida nos Exemplos 1-3, Exemplo Comparativo 1, e um Controle. (a) mostra a carga de trabalho de uma certa quantidade de mitocôndrias em células cultivadas por 7 dias, (b) mostra a carga de trabalho de uma certa quantidade de mitocôndrias em células cultivadas por 14 dias, e (c) mostra a carga de trabalho de uma certa quantidade de mitocôndrias em células cultivadas por 21 dias. Adicionalmente, presumindo que a carga de trabalho de uma certa quantidade de mitocôndrias calculada em um Controle é 100%, a carga de trabalho de uma certa quantidade de mitocôndrias nos Exemplos 1-3 e Exemplo Comparativo 1 é mostrada em uma razão para a carga de trabalho de uma certa quantidade de mitocôndrias no Controle.
[0019] [Fig. 4] Figura 4 é um gráfico mostrando a quantidade de células apoptóticas medida nos Exemplos 1-3, Exemplo Comparativo 1, e um Controle. (a) mostra a quantidade das células apoptóticas em células cultivadas por 7 dias, (b) mostra a quantidade das células apoptóticas em células cultivadas por 14 dias, e (c) mostra a quantidade das células apoptóticas em células cultivadas por 21 dias. Adicionalmente, presumindo que a quantidade das células apoptóticas calculada em um Controle é 100%, as quantidades das células apoptóticas nos Exemplos 1-3 e Exemplo Comparativo 1 são mostradas em uma razão para a quantidade das células apoptóticas no Controle.
[0020] [Fig. 5] Figura 5 é um gráfico mostrando a quantidade de células necróticas medida nos Exemplos 1-3, Exemplo Comparativo 1, e um Controle. (a) mostra a quantidade das células necróticas em células cultivadas por 7 dias, (b) mostra a quantidade das células necróticas em células cultivadas por 14 dias, e (c) mostra a quantidade das células necróticas em células cultivadas por 21 dias. Adicionalmente, presumindo que a quantidade das células necróticas calculada em um Controle é 100%, as quantidades das células necróticas nos Exemplos 1-3 e Exemplo Comparativo 1 são mostradas em uma razão para a quantidade das células necróticas no Controle.
[0021] Aqui a seguir, um alimento saudável e cosmético antienvelhecimento, e um método de fabricação de um ingrediente antienvelhecimento derivado de semente de uva de acordo com a presente invenção serão especificados.
[0022] Adicionalmente, neste relatório, "envelhecimento" refere-se a um estado em que a capacidade de duplicação de uma célula diminui, ou um estado em que uma célula para irreversivelmente de crescer em fase G1. A supressão de um gene que facilita a progressão do ciclo da célula, e expressão aumentada de genes p16INK4a e p53 inibindo o ciclo da célula e seu fator de transcrição alvo, p21CIP1, estão envolvidas nestes estados. Em adição, uma célula senescente é resistente à proliferação de células induzida por mitógenos, e, assim cresce grande e achata A célula senescente exibe um marcador bioquímico comum, tal como uma atividade de β-galactosidase (SA β Gal) associada à senescência. Embora este fenômeno de envelhecimento tenha sido caracterizado por uma célula cultivada, foi provado que ele ocorre mesmo em um corpo vivo.
[0023] O alimento saudável e cosmético antienvelhecimento, de acordo com a presente invenção, contém um ingrediente antienvelhecimento derivado de semente de uva consistindo de 60% em peso ou mais de polifenol derivado de semente de uva grosseiramente purificado.
[0024] O ingrediente antienvelhecimento derivado de semente de uva consistindo de polifenol derivado de semente de uva contido no alimento saudável e o cosmético antienvelhecimento de acordo com a presente invenção é obtido a partir das seguintes etapas de fabricação.
[0025] Etapa 1 é o pré-tratamento de uma semente de uva para forçar a brotação, e secagem da semente de uva forçando a brotação.
[0026] O tipo de uva para a semente de uva usada na presente invenção é, mas não limitado a, por exemplo, uma ou mais uvas selecionadas dentre um grupo consistindo de Vitis vinifera L., Vitis labrusca L., Vitis coignetiae L., Vitis amurensis L., e Vitis shiragai L.
[0027] Entre outras, a uva preferível é um cultivar de uva de vinho, tal como Agiorgitiko, Viognier, Cabernet Sauvignon, Cabernet Franc, Gamay, Carignan, Carmenere, Xinomavro, Grenache, Gewurztraminer, Kerner, Colombard, Koshu, Sultana, Sangiovese, Chardonnay, Chenin Blanc, Syrah, Zinfandel, Semillon, Sauvignon Blanc, Tannat, Zweigelt, Tempranillo, Trebbiano, Nebbiolo, Nero D'Avola, Barbera, Pinotage, Pinot Noir, Pinot Gris, Pinot Blanc, Petit Verdot, Black Queen, Muscat Bailey A, Malbec, Muller-Thurgau, Mourvedre, Meunier, Melon de Bourgogne, Merlot, Moscato, Yama-Sauvignon, Riesling, e Ruby Cabernet. Em particular, Cabernet Sauvignon, Merlot, Syrah, e Pinot Noir são mais preferíveis.
[0028] Neste pedido, "forçando a brotação" significa forçar uma semente de uva para um estado em que a semente começa a brotar. Mais especificamente, significa o estado em que a porção do embrião da semente de uva fica levemente inchada e intumescida.
[0029] O grau do inchaço é, mas não limitado a, por exemplo, o estado em que a superfície da porção embrionária inchada ficou 1-2 mm mais alta do que a semente de uva antes de forçar a brotação.
[0030] Em adição, na presente invenção, a semente de uva em um estado de brotação em que a semente de uva forma um bruto não é preferível porque ela tem uma baixa tendência a um efeito antienvelhecimento em comparação com a semente de uva em um estado de forçamento de brotação.
[0031] Na presente invenção, um método de pré- tratamento de uma semente de uva para forçar a brotação da semente de uva inclui, mas não é limitado a, quaisquer métodos usados convencionalmente para forçar a brotação de sementes de plantas, por exemplo, métodos físicos tais como processamento em baixa temperatura, processamento em banho quente e destruição mecânica, e métodos químicos tais como processamento com gás (gás acetileno, éter, hidrogênio, etc.), processamento com auxina e processamento com giberelina.
[0032] Como descrito acima, na presente invenção, o método de pré-tratamento da semente de uva para forçar a brotação da semente de uva não é particularmente limitado. Por exemplo, mais especificamente, é possível forçar a brotação da semente de uva pelo método de tratamento seguinte.
[0033] Em primeiro lugar, uma semente de uva é imersa em água a 30-60 °C.
[0034] O tempo de imersão é preferivelmente, mas não limitado a, 20 a 80 horas.
[0035] Em segundo lugar, a semente de uva imersa em água a 30-60 °C é removida da água, e seca naturalmente no ar. A temperatura de secagem natural é preferivelmente, mas não limitado a, 10 a 50 °C. O tempo de secagem natural é preferivelmente, mas não limitado a, 1 a 10 horas.
[0036] Então, a semente de uva seca naturalmente no ar é imersa em água a 15-45 °C.
[0037] O tempo de imersão é preferivelmente, mas não limitado a, 10 a 200 minutos.
[0038] Em segundo lugar, a semente de uva imersa em água a 15-45 °C é removida da água, e seca naturalmente no ar.
[0039] A temperatura de secagem natural é preferivelmente, mas não limitada a, 10 a 50 °C.
[0040] O tempo de secagem natural é preferivelmente, mas não limitado a, 3 a 12 horas.
[0041] A etapa de imersão da semente de uva em água a 15-45 °C e a etapa de secagem da mesma naturalmente no ar (isto é, imersão intermitente da semente de uva em água) são repetidas até que a porção do embrião da semente de uva fique levemente inchada e intumescida após a secagem natural.
[0042] Quando a porção do embrião da semente de uva incha e intumesce levemente, após a secagem natural, a semente de uva é removida e secada adicionalmente por 2 a 5 dias na temperatura suficiente para esterilizar vários germes (80 °C ou menos).
[0043] Este tempo de secagem pode ser apropriadamente mudado dependendo da estação, temperatura ambiente, ou umidade.
[0044] A estimulação de processamento de forçamento de brotação esfolia a molécula de fenol de uma camada fina de fenol na semente de uva. Então, a molécula se multiplica ligada para produzir polifenol.
[0045] Embora um resveratrol, um tipo de polifenol, tenha um peso molecular de cerca de 250, este ingrediente recentemente produzido é caracterizado por uma grande estrutura de polímero contendo o ingrediente do peso molecular de 4000.
[0046] Etapa 2 é a redução a pó da semente de uva em um estado de forçamento de brotação seca na etapa 1.
[0047] O método de reduzir a pó pode utilizar, mas não limitado a, métodos padrão tais como moagem com um moinho.
[0048] Etapa 3 é extração da semente de uva em pó com um solvente.
[0049] Por esta etapa 3, é possível obter um ingrediente antienvelhecimento derivado de semente de uva consistindo de polifenol derivado de semente de uva.
[0050] Água, etanol, ou um solvente misto de água e etanol podem ser usados como um solvente.
[0051] A extração pode ser realizada adicionando 501000 partes em peso de solvente em 100 partes em peso da semente de uva.
[0052] Como descrito acima, o ingrediente antienvelhecimento derivado de semente de uva consistindo de polifenol derivado de semente de uva contém um ingrediente de polímero com um peso molecular de em torno de 4000 (35004500).
[0053] Então, o ingrediente antienvelhecimento derivado de semente de uva consistindo de polifenol derivado de semente de uva obtido na etapa 3 é seco e fornecido.
[0054] Um método de secagem usa preferivelmente, mas não limitado a, secagem por descompressão.
[0055] O método de redução a pó pode utilizar, mas não limitado a, métodos padrão tais como moagem em um moinho.
[0056] As etapas acima podem fornecer um ingrediente antienvelhecimento derivado de semente de uva consistindo de polifenol derivado de uma semente de uva em pó.
[0057] O ingrediente antienvelhecimento derivado de semente de uva obtido pelas etapas acima contém 50-80% em peso de polifenol grosseiramente purificado.
[0058] Do ponto de vista de prover um efeito antienvelhecimento notável, o ingrediente antienvelhecimento derivado de semente de uva contém desejavelmente 60% em peso ou mais de polifenol grosseiramente purificado.
[0059] O polifenol contido no ingrediente antienvelhecimento derivado de semente de uva é polifenol contido na semente de cada cultivar de uva, por exemplo, resveratrol, tanino ou similares.
[0060] 50-80% em peso do polifenol contido no ingrediente antienvelhecimento derivado de semente de uva é polímero de proantocianidina.
[0061] Os inventores confirmaram que o ingrediente antienvelhecimento derivado de semente de uva contendo o ingrediente acima fornece um efeito antienvelhecimento.
[0062] O termo, "grosseiramente purificado", aqui significa um estado em que um extrato é secado e apenas reduzido a pó, as substâncias estranhas permanecendo contidas, e o processamento, tal como concentração, não é realizado. O ingrediente antienvelhecimento derivado de semente de uva obtido nas etapas 1-4 é grosseiramente purificado.
[0063] Ao conter o ingrediente antienvelhecimento derivado de semente de uva no alimento saudável é possível fornecer o alimento saudável antienvelhecimento da presente invenção.
[0064] Com o ingrediente antienvelhecimento derivado de semente de uva contido no alimento saudável, é possível obter o ingrediente antienvelhecimento derivado de semente de uva rapidamente e rotineiramente.
[0065] O alimento saudável antienvelhecimento da presente invenção pode ser fabricado de um modo comum adicionando apropriadamente agentes aditivos usados como uma matéria prima para alimentos comuns, por exemplo, glicose, fructose, sacarose, maltose, sorbitol, esteviosídeo, rubusosídeo, xarope de milho, lactose, ácido de citrato, ácido tartárico, ácido málico, ácido succínico, ácido láctico, ácido L-ascórbico, dl-alfa-tocoferol, eritorbato de sódio, glicerina, propileno glicol, éster de ácido graxo de glicerol, éster de ácido graxo de poliglicerol, éster de ácido graxo de sacarose, éster de ácido graxo de sorbitano, goma arábica de éster de ácido graxo de propileno glicol, caragenano, caseína, gelatina, pectina, ágar, vitamina B, amida de ácido nicotinico, pantotenato de cálcio, aminoácido, sal de cálcio, pigmento, agente aromatizante, e conservante.
[0066] Ao conter o ingrediente antienvelhecimento derivado de semente de uva em cosmético, é possível obter o cosmético antienvelhecimento da presente invenção.
[0067] Com o ingrediente antienvelhecimento derivado de semente de uva contido no cosmético, é possível aplicar o ingrediente antienvelhecimento derivado de semente de uva rotineiramente.
[0068] A forma de um ingrediente antienvelhecimento derivado de semente de uva contido no cosmético antienvelhecimento de acordo com a presente invenção é preferivelmente, mas não limitada a, uma microcápsula tendo uma múltipla camada, do ponto de vista de facilidade de permeação da pele.
[0069] O cosmético antienvelhecimento da presente invenção pode ser fabricado de um modo comum adicionando apropriadamente agentes aditivos comumente usados, tais como um agente de branqueamento, removedor de oxigênio ativo, antioxidante, inibidor de ultravioleta, etc.
[0070] A ingestão do ingrediente antienvelhecimento derivado de semente de uva no alimento saudável e o cosmético antienvelhecimento da presente invenção é preferivelmente de, mas não limitada a, pelo menos 50 mg ou mais de ingestão por dia, do ponto de vista de fornecer um efeito antienvelhecimento notável.
[0071] Se a ingestão do ingrediente antienvelhecimento derivado de semente de uva no alimento saudável e o cosmético antienvelhecimento da presente invenção for menor do que 50 mg por dia, o efeito antienvelhecimento não pode ser exercido de modo suficiente e, assim, a ingestão não é desejável.
[0072] Além disso, mesmo se a ingestão do ingrediente antienvelhecimento derivado de semente de uva no alimento saudável e o cosmético antienvelhecimento da presente invenção for maior do que 7500 mg por dia (por peso corporal de 60 kg), a taxa de aumento do efeito é pequena.
[0073] Portanto, a ingestão do ingrediente antienvelhecimento derivado de semente de uva no alimento saudável e o cosmético antienvelhecimento da presente invenção é preferivelmente de 50-7500 mg por dia.
[0074] Dependendo da aplicação, um excipiente, um ajustador de pH, um conservante, um agente quelante, um estabilizador ou similares podem ser adicionados apropriadamente ao alimento saudável e o cosmético antienvelhecimento da presente invenção.
[0075] Além disso, a ingestão do ingrediente antienvelhecimento derivado de semente de uva contido no alimento saudável e o cosmético antienvelhecimento da presente invenção é preferivelmente, mas não limitado a, por exemplo, 0,8-125 mg/kg/dia, do ponto de vista de fornecer um efeito antienvelhecimento notável.
[0076] Se a ingestão do ingrediente antienvelhecimento derivado de semente de uva no alimento saudável e o cosmético antienvelhecimento da presente invenção é menor do que 0,8 mg/kg/dia, o efeito antienvelhecimento não pode ser exercido de modo suficiente, e, assim, a ingestão não é desejável.
[0077] Igualmente, mesmo se a ingestão do ingrediente antienvelhecimento derivado de semente de uva no alimento saudável e o cosmético antienvelhecimento da presente invenção é maior do que 125 mg/kg/dia, um efeito adicional não pode ser exercido.
[0078] Portanto, a ingestão do ingrediente antienvelhecimento derivado de semente de uva no alimento saudável e o cosmético antienvelhecimento da presente invenção é preferivelmente de 0,8-125 mg/kg/dia.
[0079] O alimento saudável e cosmético antienvelhecimento, e o ingrediente antienvelhecimento derivado de semente de uva de acordo com a presente invenção são descritos em detalhes com base nos seguintes Exemplos, mas um método de fabricar o alimento saudável e o cosmético antienvelhecimento, e o ingrediente antienvelhecimento derivado de semente de uva, de acordo com a presente invenção, não estão limitados aos Exemplos.
[0080] Uma semente de Cabernet Sauvignon foi imersa em água a cerca de 40 °C por 45 a 60 horas, em seguida esta semente de uva foi removida da água e seca naturalmente no ar a temperatura ambiente (cerca de 25 °C) por 3 a 5 horas (armazenada em um quarto).
[0081] A semente de uva seca naturalmente foi imersa em água a 25-30 °C por 60 a 80 minutos, em seguida esta semente de uva foi removida da água e seca naturalmente no ar a temperatura ambiente (cerca de 25 °C) por 3 horas (armazenada em um quarto).
[0082] A imersão em água a 30oC e a secagem natural por 3 horas foram repetidas 3 vezes, em seguida a semente de uva seca foi observada. Foi confirmado que cerca de 5-15% da porção do embrião da semente de uva inchou cerca de 1 mm. Os procedimentos mencionados acima são referidos como processamento de forçamento da brotação.
[0083] O procedimento de forçamento da brotação foi terminado quando a protuberância da porção do embrião da semente de uva foi confirmada, e a semente de uva foi seca adicionalmente a 45 oC durante 3 dias com um secador por radiação no infravermelho distante.
[0084] Após a secagem da semente de uva por 3 dias, a semente foi reduzida a pó com um moinho para produzir pó de semente de uva.
[0085] Subsequentemente, 50 partes em peso de semente de uva foram adicionados em 100 partes em peso de água, e a fração dissolvida em água foi extraída para fornecer um ingrediente antienvelhecimento derivado de semente de uva.
[0086] Após a secagem por descompressão do ingrediente antienvelhecimento derivado de semente de uva obtido, ele foi reduzido a pó em um moinho para fornecer um ingrediente antienvelhecimento derivado de semente de uva em pó.
[0087] A quantidade total de polifenol contido no ingrediente antienvelhecimento derivado de semente de uva em pó foi quantificada.
[0088] A quantificação foi realizada usando o método oficial AOAC International (Método Oficial AOAC 952.03, 15a. Ed.) (também referido como método de Folin-Denis).
[0089] O método de Folin-Denis quantifica a quantidade total de polifenol por medição de cor azul (comprimento de onda de 700-770 nm) com um espectrofotômetro, no qual a cor azul é obtida reduzindo o ácido fosfotúngstico e ácido molibdílico com hidroxila fenólica em condição alcalina.
[0090] Como um resultado da quantificação, foi demonstrado que o ingrediente antienvelhecimento derivado de semente de uva contém 69% em peso de polifenol.
[0091] Igualmente, foi confirmado que 71% em peso do polifenol contido no ingrediente antienvelhecimento derivado de semente de uva (isto é, 49% em peso do ingrediente antienvelhecimento derivado de semente de uva) era um polímero de proantocianidina.
[0092] Aqui a seguir, o ingrediente antienvelhecimento derivado de semente de uva preparado de acordo com este Exemplo é referido como um Exemplo, e o resveratrol (fabricado por SIGMA, número produto: R5010) usado como uma comparação alvo é referido como um Exemplo Comparativo.
[0093] Nos seguintes Exemplos 3-5, o efeito antienvelhecimento do ingrediente antienvelhecimento derivado de semente de uva de acordo com a presente invenção foi examinado.
[0094] Fibroblastos humanos normais foram preparados primeiro para cada teste.
[0095] Subsequente à iniciação, fibroblastos humanos normais (KURABO INDUSTRIES LTD., número produto: KF-4109) foram cultivados em um meio basal (DMEM (Nacalai Tesque, Inc., número produto: 08456-65)), 10% FBS (BioWest, número produto:S1820, Lote No.516536), e 1% de antibiótico (solução mista de penicilina-estreptomicina (Nacalai Tesque, Inc., número produto:26253-84)) em um incubador de CO2 (5% CO2, 37oC) até que um número requerido de células foi obtido.
[0096] Após a cultura, os fibroblastos humanos normais foram liberados por solução de tripsina/EDTA (2,5g/1- tripsina/1mmol/l-EDTA (Nacalai Tesque, Inc., número produto:32777-44), e usados para cada teste após o cálculo do número de células.
[0097] Exemplo e Exemplo Comparativo foram, então, preparados.
[0098] Exemplo e Exemplo Comparativo foram medidos respectivamente e resolvidos em um meio basal para se tornar uma concentração de 1% (peso/volume).
[0099] Após a resolução, Exemplo e Exemplo Comparativo resolvidos em um meio basal foram centrifugados respectivamente (120.000 rpm (2.000s-1), 10 minutos) para remover materiais insolúveis.
[00100] Após a separação centrífuga, o sobrenadante foi coletado, filtrado e esterilizado através de um filtro de esterilização para ser usado em cada teste.
[00101] Efeito antienvelhecimento de Exemplo e Exemplo Comparativo foi testado medindo uma atividade de β- galactosidase (β-galactosidase associada a senescência; SA- β-gal) geralmente usada como marcador de envelhecimento celular.
[00102] Super-expressão de SA-β-gal foi confirmada nas células senescentes. Foi confirmado que um processo de envelhecimento das células medidas pelo marcador de envelhecimento ocorre não apenas nas células cultivadas, mas também em um organismo.
[00103] A quantidade das células senescentes reconhecidas pelo teste para confirmar o efeito antienvelhecimento, mais especificamente indica o efeito antienvelhecimento, como um parâmetro abrangente.
[00104] Fibroblastos humanos normais preparados com um meio basal foram semeados em uma placa de 96 cavidades a fim de obter 1x104 células/0,1 ml/cavidade (placa preta para observação de fluorescência (Sumitomo Bakelite Co., Ltd. Número do produto: MS-8096F)) e cultivados por 24 horas.
[00105] Após a cultura, os sobrenadantes da cultura foram substituídos respectivamente com os meios abaixo com diferentes condições, e fibroblastos humanos normais foram cultivados novamente.
[00106] As condições para cada meio são como a seguir. Cada célula cultivada com meios com cada condição é referida como Exemplos 1-3, Exemplo Comparativo 1, e Controle respectivamente.
[00107] Exemplo 1: um meio basal compreendendo 0,002% em peso de ingredientes antienvelhecimento derivados de semente de uva da presente invenção.
[00108] Exemplo 2: um meio basal compreendendo 0,01% em peso de ingredientes antienvelhecimento derivados de semente de uva da presente invenção.
[00109] Exemplo 3: um meio basal compreendendo 0,05% em peso de ingredientes antienvelhecimento derivados de semente de uva da presente invenção.
[00110] Exemplo Comparativo 1: um meio basal contendo 0,0023% em peso de resveratrol.
[00111] Controle: um meio basal (que não compreende ingredientes antienvelhecimento derivados de semente de uva da presente invenção nem resveratrol).
[00112] Aqui a seguir, os Exemplos 1-3, Exemplo Comparativo 1, e Controle mencionados acima também foram usados nos Exemplos 4-5.
[00113] A concentração de resveratrol no Exemplo Comparativo 1 foi ajustada para ser 0,0023% em peso, porque as células necróticas aumentaram muito de modo que uma medição correta seria difícil em um teste de medição de necrose mencionado abaixo se a concentração de resveratrol é ajustada para ser maior do que 0,0023% em peso.
[00114] Fibroblastos humanos normais foram cultivados respectivamente com as condições por até 21 dias.
[00115] Os meios foram mudados a cada 2 a 3 dias.
[00116] Após a cultura, os sobrenadantes da cultura foram removidos e as células foram lavadas duas vezes com PBS (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd., número produto: 05913).
[00117] Aos fibroblastos humanos normais lavados foi adicionado um meio basal contendo uma bafilomicina diluída 1000 vezes, e os fibroblastos humanos normais foram cultivados a 37oC durante 60 minutos.
[00118] À solução de cultura foi então adicionado um meio basal compreendendo uma solução de trabalho SPiDER-β Gal diluída 1000 vezes e uma solução Hoechist 33342 diluída 100 vezes (DOJINDO LABORATORIES, número produto: 346-07951) como um agente de coloração de núcleos, e fibroblastos humanos normais foram cultivados adicionalmente a 37oC durante 30 minutos.
[00119] Após a cultura, fibroblastos humanos normais foram lavados em um meio basal.
[00120] Após lavagem, o meio basal foi adicionado aos fibroblastos humanos normais, e coloração de núcleos (células vivas) e imagens coloridas das células senescentes foram obtidas por um microscópio de fluorescência (Keyence Corporation, número produto: BZ-X7000).
[00121] A quantidade das células senescentes foi calculada com base nas imagens fluorescentes respectivas.
[00122] As soluções de trabalho de bafilomicina A1 e SPiDER-β Gal eram do kit de detecção de senescência celular SPiDER-βGal (DOJINDO LABORATORIES, número produto: SG03).
[00123] Figura 1 mostra um gráfico indicando a quantidade das células senescentes calculada para Exemplos 1-3, Exemplo Comparativo 1, e Controle.
[00124] Na Figura 1, (a) mostra a quantidade das células senescentes entre células cultivadas por 7 dias, (b) mostra a quantidade das células senescentes entre células cultivadas por 14 dias, e (c) mostra a quantidade das células senescentes entre células cultivadas por 21 dias.
[00125] Na Figura 1, presumindo que a quantidade das células senescentes em um Controle é 100%, as quantidades das células senescentes nos Exemplos 1-3 e Exemplo Comparativo 1 são mostradas em uma razão para a quantidade da célula senescente no Controle.
[00126] A quantidade das células senescentes no Exemplo Comparativo 1 cultivadas por 7 dias foi de 519% em relação ao Controle (ver Figura 1(a)).
[00127] A quantidade das células senescentes no Exemplo 1 cultivadas por 7 dias foi de 85%, a quantidade das células senescentes no Exemplo 2 foi de 137%, e a quantidade das células senescentes no Exemplo 3 foi de 73%, em relação ao Controle (ver Figura 1(a)).
[00128] A quantidade das células senescentes no Exemplo Comparativo 1 cultivadas por 14 dias foi de 102% em relação ao Controle (ver Figura 1(b)).
[00129] A quantidade das células senescentes no Exemplo 1 cultivadas por 14 dias foi de 11%, a quantidade das células senescentes no Exemplo 2 foi de 9%, e a quantidade das células senescentes no Exemplo 3 foi de 7%, em relação ao Controle (ver Figura 1(b)).
[00130] A quantidade das células senescentes no Exemplo Comparativo 1 cultivadas por 21 dias foi de 64% em relação ao Controle (ver Figura 1(c)).
[00131] A quantidade das células senescentes no Exemplo 1 cultivadas por 21 dias foi de 4%, a quantidade das células senescentes no Exemplo 2 foi de 3%, e a quantidade das células senescentes no Exemplo 3 foi de 2%, em relação ao Controle (ver Figura 1(c)).
[00132] De acordo com estes resultados, foi demonstrado que resveratrol tinha mais células senescentes entre as células cultivadas por 7 dias do que o Controle e promoveu o envelhecimento de células. Portanto, é considerado que resveratrol tem o efeito de promover envelhecimento em curto prazo.
[00133] Adicionalmente, foi demonstrado que a quantidade das células senescentes nas células do dia 21 da cultura foi suprimida em torno de 64% em relação ao Controle, suprimindo, assim, o envelhecimento de células.
[00134] Embora os ingredientes antienvelhecimento derivados de semente de uva desta invenção tenham representado quase a mesma quantidade das células senescentes como Controle em células cultivadas por 7 dias na média, ele suprimiu a quantidade das células senescentes nas células do dia 21 da cultura em cerca de 2% a 4% em relação ao Controle, suprimindo assim o envelhecimento de células muito mais do que alcançado com resveratrol.
[00135] Portanto, os ingredientes antienvelhecimento derivados de semente de uva tem melhor efeito antienvelhecimento do que resveratrol, e alimento saudável e cosmético antienvelhecimento compreendendo estes ingredientes antienvelhecimento derivados de semente de uva também tem um efeito antienvelhecimento notável.
[00136] Após o teste para confirmar o efeito antienvelhecimento, um efeito de Exemplo e Exemplo Comparativo para a quantidade de mitocôndrias se uma carga de trabalho de uma certa quantidade de mitocôndrias nas células foi confirmada.
[00137] Convencionalmente, foi considerado que resveratrol tem um efeito em uma quantidade de mitocôndrias ou uma carga de trabalho de uma certa quantidade de mitocôndrias para fornecer seu efeito antienvelhecimento. Consequentemente, o efeito dos ingredientes antienvelhecimento derivados de semente de uva em uma quantidade de mitocôndrias ou uma carga de trabalho de uma certa quantidade de mitocôndrias foi confirmado.
[00138] A quantidade de mitocôndrias foi medida usando sondas tipo Mito Tracker Mitochondrion-Selective Probes (Invitrogen, número produto: M7512) que podem marcar seletivamente mitocôndrias em uma célula.
[00139] A carga de trabalho de uma certa quantidade de mitocôndrias foi medida pelo teste MTT. Visto que o único alvo do teste MTT é a atividade desidrogenase de mitocôndrias, o resultado do teste MTT reflete uma carga de trabalho de uma certa quantidade de mitocôndrias.
[00140] Após remover sobrenadantes da cultura de fibroblastos humanos normais cultivados no Exemplo 2, fibroblastos humanos normais foram lavados duas vezes com PBS (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd., número produto: 05913).
[00141] Às células lavadas foi adicionado um meio basal compreendendo uma solução Hoechist 33342 diluída 1000 vezes (DOJINDO LABORATORIES, número produto: 346-07951) e sondas Mito Tracker Mitochondrion-Selective diluídas 2000 vezes (Invitrogen, número produto: M7512), e fibroblastos humanos normais foram cultivados a 37oC durante 30 minutos.
[00142] Após a cultura, sobrenadantes da cultura foram removidos e fibroblastos humanos normais foram lavados duas vezes com PBS (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd., número produto: 05913).
[00143] Após a lavagem, PBS (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd., número produto: 05913) foi adicionado novamente aos fibroblastos humanos normais, e coloração de núcleos (células vivas) e imagens coradas de mitocôndrias foram tiradas por um microscópio de fluorescência (Keyence Corporation, número produto: BZ-X7000).
[00144] Subsequentemente, cada intensidade de fluorescência foi medida usando um leitor de placa fluorescente (Thermo Fisher Scientific, número produto: VARIOSKAN FLASH) (Hoechis: comprimento de onda de excitação 356 nm, comprimento de onda de fluorescência 465 nm, Mito Tracker: comprimento de onda de excitação 579 nm, comprimento de onda de fluorescência 599 nm).
[00145] Após medir a intensidade de fluorescência, os sobrenadantes foram removidos, e fibroblastos humanos normais foram lavados uma vez com PBS (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd., número produto: 05913).
[00146] Após os fibroblastos humanos normais serem lavados, eles foram substituídos com PBS (100μl/cavidade) compreendendo 0,5mg/ml de MTT (Brometo de tiazolil azul de tetrazólio (SIGMA, número produto: M5655-1G)) e reagidos a 37oC durante 5 horas.
[00147] Subsequentemente, 100 μl de 0,01M HCl (SIGMA, número produto: 13-1690) e 10% SDS (Wako Pure Chemical Corporation, número produto: 191-07145) foram adicionados a cada cavidade e reagidos a temperatura ambiente por 24 horas.
[00148] Após a reação, formazano de MTT foi resolvido.
[00149] Após resolver formazano, absorvância foi medida usando um leitor de placa (Thermo Fisher Scientific, número produto: VARIOSKAN FLASH) (comprimento de onda de medição 550 nm, comprimento de onda de referência 660 nm).
[00150] Figura 2 mostra um gráfico indicando a quantidade de mitocôndrias medida nos Exemplos 1-3, Exemplo Comparativo 1, e Controle.
[00151] Na Figura 2, (a) mostra a quantidade de mitocôndrias em células cultivadas por 7 dias, (b) mostra a quantidade de mitocôndria em células cultivadas por 14 dias, e (c) mostra a quantidade de mitocôndria em células cultivadas por 21 dias.
[00152] Na Figura 2, presumindo que a quantidade das mitocôndrias em um Controle é 100%, as quantidades das mitocôndrias nos Exemplos 1-3 e Exemplo Comparativo 1 são mostradas em uma razão para a quantidade de mitocôndria no Controle.
[00153] No Exemplo Comparativo 1 cultivadas por 7 dias, a quantidade de mitocôndrias foi de 191% em relação ao Controle (ver Figura 2(a)).
[00154] A quantidade de mitocôndrias no Exemplo 1 cultivadas por 7 dias foi de 116% em relação ao Controle, a quantidade de mitocôndrias no Exemplo 2 foi de 126%, e a quantidade de mitocôndrias no Exemplo 3 foi de 143% (ver Figura 2(a)).
[00155] A quantidade de mitocôndrias no Exemplo Comparativo 1 cultivadas por 14 dias foi de 228% em relação ao Controle (ver Figura 2(b)).
[00156] A quantidade de mitocôndrias no Exemplo 1 cultivadas por 14 dias foi de 123%, a quantidade de mitocôndrias no Exemplo 2 foi de 128%, e a quantidade de mitocôndrias no Exemplo 3 foi de 172%, em relação ao Controle (ver Figura 2(b)).
[00157] A quantidade de mitocôndrias no Exemplo 1 cultivadas por 21 dias foi de 246% em relação ao Controle (ver Figura 2(c)).
[00158] A quantidade de mitocôndrias no Exemplo 1 cultivadas por 21 dias foi de 115%, a quantidade de mitocôndrias no Exemplo 2 foi de 124%, e a quantidade de mitocôndrias no Exemplo 3 foi de 178%, em relação ao Controle (ver Figura 2(c)).
[00159] De acordo com estes resultados, foi demonstrado que resveratrol tem um efeito de aumentar a quantidade de mitocôndrias.
[00160] Também foi demonstrado que os ingredientes antienvelhecimento derivados de semente de uva desta invenção tem um efeito de aumentar a quantidade de mitocôndrias.
[00161] Figura 3 mostra um gráfico indicando uma carga de trabalho de uma certa quantidade de mitocôndrias medida nos Exemplos 1-3, Exemplo Comparativo 1, e Controle.
[00162] Na Figura 3, (a) mostra uma carga de trabalho de uma certa quantidade de mitocôndrias em células cultivadas por 7 dias, (b) mostra uma carga de trabalho de uma certa quantidade de mitocôndrias em células cultivadas por 14 dias, e (c) mostra uma carga de trabalho de uma certa quantidade de mitocôndrias em células cultivadas por 21 dias.
[00163] Na Figura 3, presumindo que a carga de trabalho de uma certa quantidade das mitocôndrias em um Controle é 100%, a carga de trabalho de uma certa quantidade das mitocôndrias nos Exemplos 1-3 e Exemplo Comparativo 1 é mostrada em uma razão para a carga de trabalho de uma certa quantidade de mitocôndrias no Controle.
[00164] A carga de trabalho de uma certa quantidade de mitocôndrias foi de 22% em relação ao Exemplo Comparativo 1 cultivadas por 7 dias (ver Figura 3(a)).
[00165] A carga de trabalho de uma certa quantidade de mitocôndrias no Exemplo 1 cultivadas por 7 dias foi de 74%, a carga de trabalho de uma certa quantidade de mitocôndrias no Exemplo 2 foi de 58%, e a carga de trabalho de uma certa quantidade de mitocôndrias foi de 38% no Exemplo 3, em relação ao Controle (ver Figura 3(a)).
[00166] A carga de trabalho de uma certa quantidade de mitocôndrias no Exemplo Comparativo 1 cultivadas por 14 dias foi de 20% em relação ao Controle (ver Figura 3(b)).
[00167] A carga de trabalho de uma certa quantidade de mitocôndrias no Exemplo 1 cultivadas por 14 dias foi de 77%, a carga de trabalho de uma certa quantidade de mitocôndrias no Exemplo 2 foi de 63%, e a carga de trabalho de uma certa quantidade de mitocôndrias no Exemplo 3 foi de 34%, em relação ao Controle (ver Figura 3(b)).
[00168] A carga de trabalho de uma certa quantidade de mitocôndrias no Exemplo Comparativo 1 cultivadas por 21 dias foi de 49% em relação ao Controle (ver Figura3(c)).
[00169] A carga de trabalho de uma certa quantidade de mitocôndrias no Exemplo 1 cultivadas por 21 dias foi de 88%, a carga de trabalho de uma certa quantidade de mitocôndrias no Exemplo 2 foi de 76%, e a carga de trabalho de uma certa quantidade de mitocôndrias no Exemplo 3 foi de 62%, em relação ao Controle (ver Figura3(c)).
[00170] Estes resultados mostraram que resveratrol teve um efeito de diminuir a carga de trabalho de uma certa quantidade de mitocôndrias.
[00171] Além disso, foi demonstrado que o ingrediente antienvelhecimento derivado de semente de uva de acordo com a presente invenção também teve o efeito de diminuir a carga de trabalho de uma certa quantidade de mitocôndrias.
[00172] O resultado de Exemplo 4 mostrou que o ingrediente antienvelhecimento derivado de semente de uva de acordo com a presente invenção teve o efeito de aumentar a quantidade de mitocôndrias e diminuir a carga de trabalho de uma certa quantidade de mitocôndrias.
[00173] Com o aumento na quantidade de mitocôndrias, uma quantidade de ATP (isto é, carga de trabalho) a ser produzida em uma certa quantidade de mitocôndrias diminui. É considerado que a diminuição na carga de trabalho de uma certa quantidade de mitocôndrias, que foi confirmada no Exemplo 4, é devido à quantidade aumentada de mitocôndrias, e, à quantidade diminuída da produção de ATP por certa quantidade de mitocôndrias.
[00174] Isto poupa a capacidade de processamento de mitocôndrias, diminui a produção de oxigênio ativo gerado pelas mitocôndrias, e aumenta a produção de superóxido dismutase (SOD) que é uma enzima para remover oxigênio ativo, reduzindo assim a quantidade do oxigênio ativo que leva a danos de mitocôndrias e células. Visto que cerca de 90% de oxigênio ativo são gerados pelas mitocôndrias, pode ser considerado que a diminuição da quantidade do oxigênio ativo produzido pelas mitocôndrias com o ingrediente antienvelhecimento derivado de semente de uva de acordo com a presente invenção pode proteger células e órgãos, etc. consistindo de células de um dano e ocasionando efeito antienvelhecimento.
[00175] A seguir, um efeito na quantidade de células apoptóticas e na quantidade de células necróticas nos Exemplos e Exemplo Comparativo foi confirmado.
[00176] Convencionalmente, visto que se pensava que resveratrol tinha efeito antienvelhecimento por indução de apoptose, o efeito do ingrediente antienvelhecimento derivado de semente de uva de acordo com a presente invenção na quantidade das células apoptóticas foi confirmado.
[00177] Em adição, um efeito do ingrediente antienvelhecimento derivado de semente de uva de acordo com a presente invenção na quantidade das células necróticas que é a mesma morte celular que a apoptose também foi confirmado.
[00178] A quantidade das células apoptóticas foi medida usando anexina V que foi usada convencionalmente como um marcador de apoptose. Em maiores detalhes, a quantidade das células apoptóticas foi medida por coloração seletiva de modo fluorescente de células apoptóticas por anexina V rotulada de modo fluorescente, usando sua propriedade de que anexina V se liga à fosfatidilserina aparecendo frequentemente em uma superfície das células apoptóticas.
[00179] A quantidade das células necróticas foi medida usando um homodímero de etídeo III (EthD-III) que foi usado convencionalmente como um marcador de necrose. Em maiores detalhes, EthD-III é uma sonda de ácido nucleico impermeável à película e a quantidade das células necróticas foi medida usando sua propriedade de que nem as células viáveis nem as células apoptóticas são coradas, mas células necróticas são coradas em vermelho forte com EthD-III.
[00180] Após remover o sobrenadante da cultura de um fibroblasto humano normal cultivado no Exemplo 2, o fibroblasto humano normal foi lavado duas vezes com PBS (NISSUI PHARMACEUTICAL CO., LTD., número produto: 05913).
[00181] Ao fibroblasto humano normal lavado foram adicionados tampão de ligação 1x contendo uma solução Hoechist 33342 diluída 1000 vezes (DOJINDO LABORATORIES, número produto: 346-079511), FITC-anexina V diluída 20 vezes, e EthD-III diluído 20 vezes. Então, o fibroblasto humano normal foi cultivado a 37oC durante 30 minutos.
[00182] Então, após remover o sobrenadante da cultura, o fibroblasto humano normal foi lavado duas vezes no tampão de ligação 1x.
[00183] Novo tampão de ligação 1x foi adicionado ao fibroblasto humano normal após a lavagem, e imagens de coloração nuclear (célula viável), coloração com anexina V (apoptose), e uma coloração com EthD-III (necrose) foram obtidas por um microscópio de fluorescência.
[00184] A quantidade de células apoptóticas e a quantidade de células necróticas foram calculadas a partir de imagens de observação de fluorescência.
[00185] Além disso, FITC-anexina V, EthD-III e tampão de ligação 1x usados nos Exemplos eram do kit de detecção de células apoptóticas/ necróticas/ saudáveis (Takara Bio, Inc., número produto: D25517).
[00186] Figura 4 é um gráfico mostrando a quantidade de células apoptóticas medida nos Exemplos 1-3, Exemplo Comparativo 1, e um Controle.
[00187] Na Figura 4, (a) mostra a quantidade das células apoptóticas em células cultivadas por 7 dias, (b) mostra a quantidade das células apoptóticas em células cultivadas por 14 dias, e (c) mostra a quantidade das células apoptóticas em células cultivadas por 21 dias. Aqui, na Figura 4, presumindo que a quantidade das células apoptóticas no Controle é 100%, e a quantidade de células apoptóticas nos Exemplos 1-3 e Exemplo Comparativo é mostrada em uma razão para a quantidade das células apoptóticas no Controle.
[00188] Em comparação com o Controle, a quantidade das células apoptóticas cultivadas por 7 dias no Exemplo Comparativo 1 foi de 2184% (ver Figura 4 (a)).
[00189] Por outro lado, em comparação com o Controle, a quantidade das células apoptóticas cultivadas por 7 dias no Exemplo 1 foi de 164%, a quantidade das células apoptóticas no Exemplo 2 foi de 102%, e a quantidade das células apoptóticas no Exemplo 3 foi de 483% (ver Figura 4 (a)).
[00190] Em comparação com o controle, a quantidade das células apoptóticas cultivadas por 14 dias no Exemplo Comparativo 1 foi de 1400% (ver Figura 4 (b)).
[00191] Por outro lado, em comparação com o controle, a quantidade das células apoptóticas cultivadas por 14 dias no Exemplo 1 foi de 107%, a quantidade das células apoptóticas no Exemplo 2 foi de 313%, e a quantidade das células apoptóticas no Exemplo 3 foi de 226% (ver Figura 4 (b)).
[00192] Em comparação com o controle, a quantidade das células apoptóticas no Exemplo Comparativo 1 cultivadas por 21 dias foi de 4525% (ver Figura 4 (c)).
[00193] Por outro lado, em comparação com o controle, a quantidade das células apoptóticas cultivadas por 21 dias no Exemplo 1 foi de 59%, a quantidade das células apoptóticas no Exemplo 2 foi de 558%, e a quantidade das células apoptóticas no Exemplo 3 foi de 668% (ver Figura 4 (c)).
[00194] Estes resultados mostraram que resveratrol tem um efeito de aumentar a quantidade das células apoptóticas.
[00195] Além disso, foi demonstrado que o ingrediente antienvelhecimento derivado de semente de uva de acordo com a presente invenção também tem o efeito de aumentar a quantidade das células apoptóticas.
[00196] Figura 5 é um gráfico mostrando a quantidade de células necróticas medida nos Exemplos 1-3, Exemplo Comparativo 1, e Controle.
[00197] Na Figura 5, (a) mostra a quantidade das células necróticas em células cultivadas por 7 dias, (b) mostra a quantidade das células necróticas em células cultivadas por 14 dias, e (c) mostra a quantidade das células necróticas em células cultivadas por 21 dias. Em adição, na Figura 5, a quantidade de células necróticas no Controle é 100%, e a quantidade das células necróticas dos Exemplos 1-3 e do Exemplo Comparativo é mostrada como como uma porcentagem para a quantidade das células necróticas no Controle.
[00198] Em comparação com o controle, a quantidade das células necróticas cultivadas por 7 dias no Exemplo Comparativo 1 foi de 125% (ver Figura 5 (a)).
[00199] Por outro lado, em comparação com os controles, a quantidade das células necróticas cultivadas por 14 dias no Exemplo 1 foi de 47%, a quantidade das células necróticas no Exemplo 2 foi de 47%, e a quantidade das células necróticas no Exemplo 3 foi de 100% (ver Figura 5 (a)).
[00200] Em comparação com o controle, a quantidade das células necróticas cultivadas por 14 dias no Exemplo Comparativo 1 foi de 801% (ver Figura 5 (b)).
[00201] Por outro lado, em comparação com o controle, a quantidade das células necróticas cultivadas por 14 dias no Exemplo 1 foi de 109%, a quantidade das células necróticas no Exemplo 2 foi de 108%, e a quantidade das células necróticas no Exemplo 3 foi de 95% (ver Figura 5 (b)).
[00202] Em comparação com o controle, a quantidade das células necróticas cultivadas por 21 dias no Exemplo Comparativo 1 foi de 608% (ver Figura 5 (c)).
[00203] Por outro lado, em comparação com o controle, a quantidade das células necróticas cultivadas por 21 dias no Exemplo 1 foi de 55%, a quantidade das células necróticas no exame 2 foi de 28%, e a quantidade das células necróticas no Exemplo 3 foi de 24% (ver Figura 5 (c)).
[00204] Estes resultados mostraram que resveratrol tem um efeito de aumentar a quantidade das células necróticas em todos os períodos.
[00205] Por outro lado, foi demonstrado que o ingrediente antienvelhecimento derivado de semente de uva de acordo com a presente invenção tem o efeito de diminuir a quantidade das células necróticas.
[00206] O resultado do Exemplo 5 mostrou que o ingrediente antienvelhecimento derivado de semente de uva de acordo com a presente invenção tem um efeito de aumentar a quantidade das células apoptóticas e diminuir a quantidade das células necróticas.
[00207] Apoptose é um mecanismo que induz a morte da célula em uma célula prejudicial ou uma célula desnecessária para um organismo, e, remove tais células, levando assim à geração de novas células removendo imediatamente as células envelhecidas e células debilitadas. A apoptose funciona normalmente para remover células senescentes, resultando em aumento das células saudáveis em um nível celular. Um órgão consistindo de células saudáveis é novo.
[00208] Além disso, uma apoptose também leva a remoção de células imunes que causam uma reação autoimune que é um mecanismo de doença autoimune, e, espera-se que ela reduza a doença autoimune por seu funcionamento correto.
[00209] Por outro lado, necrose tem uma influência adversa, tal como reação inflamatória nos tecidos circundantes, visto que as células explodem sem o pré- processamento de uma enzima intracelular, etc., resultando na liberação extracelular de um teor de célula contendo enzima, etc. Esta influência adversa promove deterioração de células e causa inflamação em um corpo que aumenta como envelhecimento. Assim, necrose causa um dano nas células afetando adversamente os tecidos circundantes, tal como reação inflamatória.
[00210] Portanto, necrose promove envelhecimento de células.
[00211] Consequentemente, é extremamente eficaz promover e suprimir necrose, a fim de suprimir envelhecimento de células.
[00212] Por esta razão, é entendido que o ingrediente antienvelhecimento derivado de semente de uva de acordo com a presente invenção tendo um efeito de promover apoptose e suprimir necrose tem um efeito antienvelhecimento notável.
[00213] Por outro lado, foi demonstrado que resveratrol não promove apenas apoptose, mas também necrose.
[00214] Como descrito acima, a supressão de necrose é exigida para suprimir o envelhecimento de células. Portanto, é considerado que resveratrol promove não apenas apoptose, mas também necrose que tem menos efeito antienvelhecimento do que o ingrediente antienvelhecimento derivado de semente de uva de acordo com a presente invenção.
[00215] A fim de confirmar a toxicidade do ingrediente antienvelhecimento derivado de semente de uva de acordo com a presente invenção, um teste de toxicidade oral aguda (teste limite) (com base nas diretrizes OECD para o teste de produtos químicos 420 (2001)) usando camundongos fêmeas foi realizado.
[00216] Ingrediente antienvelhecimento derivado de semente de uva em pó de acordo com a presente invenção foi colocado em suspensão com água para injeção para preparar uma solução de teste de 100 mg/mL.
[00217] Camundongos fêmeas de cinco semanas de idade da linhagem ICR foram adquiridos da Japanese SLC, Inc. e mantidos preliminarmente por cerca de uma semana. Após a confirmação de que não havia nenhuma anormalidade no estado geral, eles foram usados para o teste.
[00218] Cinco camundongos fêmeas a serem usados para o teste foram alojados em uma gaiola de policarbonato, respectivamente e foram mantidos em uma sala ajustada em temperatura ambiente (23oC ± 2oC), e com um tempo de iluminação de 12 horas/dia.
[00219] Os camundongos foram alimentados com ração de laboratório (Nosan Corporation, nome do produto: lab MR stock (um grânulo para camundongos, rato)) e água potável (água da bica).
[00220] Um grupo de teste a ser administrado com 2000mg/kg de ingrediente antienvelhecimento derivado de semente de uva e o grupo de controle a ser administrado com água para injeção como um controle de solvente foram estabelecidos, e cinco camundongos fêmeas foram usados para cada grupo respectivamente.
[00221] Os camundongos fêmeas usados para o teste foram submetidos a jejum por cerca de 4 horas antes da administração.
[00222] Após medir o peso de cada camundongo fêmea, o grupo de teste e o grupo de controle foram forçados a receber a solução de teste administrada por via oral e água para injeção em uma única dose de 20 mL/kg, respectivamente, usando um tubo gástrico.
[00223] Os camundongos fêmeas foram observados por 14 dias após a administração.
[00224] Os camundongos fêmeas foram observados frequentemente no dia da administração e uma vez ao dia a partir do dia seguinte.
[00225] O peso dos camundongos fêmeas foi medido no dia 7 e dia 14 após a administração, e os grupos foram comparados pelo teste t a 5% de nível de significância.
[00226] Todos os camundongos fêmeas foram autopsiados após o término de um período de observação.
[00227] Em qualquer um dos grupos de administração, nenhuma morte foi relatada durante o período de observação.
[00228] Em qualquer um dos grupos de administração, nenhuma anormalidade foi encontrada durante o período de observação.
[00229] Tabela 1 mostra o resultado de mudança de peso do grupo de teste e do grupo de controle.
[00230] Na medição de peso corporal no dia 7 e dia 14 após a administração, foi demonstrado que o grupo de teste não teve uma diferença significativa em peso em comparação com o grupo de controle.
[00231] Nenhuma anormalidade foi encontrada em todos os camundongos fêmeas na autópsia após o término do período de observação. [Tabela 1]
[00232] Peso é mostrado pelo valor médio ± desvio padrão (unidade: g).
[00233] O número dos camundongos fêmeas cujo peso foi medido é mostrado em parênteses.
[00234] Estes resultados mostraram que na administração oral de dose única em camundongos fêmeas, o valor LD50 do ingrediente antienvelhecimento derivado de semente de uva de acordo com o presente pedido excedeu 2000 mg/kg nos camundongos fêmeas.
[00235] Os resultados de Exemplos 3-5 mostraram que o ingrediente antienvelhecimento derivado de semente de uva de acordo com a presente invenção aumenta a quantidade de mitocôndrias, reduz a carga de trabalho de uma certa quantidade de mitocôndrias, aumenta a quantidade de células apoptóticas, e diminui a quantidade de células necróticas, e assim, tem efeito antienvelhecimento notável.
[00236] Além disso, como um resultado da comparação com resveratrol sozinho que se espera ter efeito antienvelhecimento, foi demonstrado que o ingrediente antienvelhecimento derivado de semente de uva de acordo com a presente invenção tinha efeito antienvelhecimento muito mais notável do que resveratrol sozinho.
[00237] Em adição, o resultado de Exemplo 6 mostrou que o ingrediente antienvelhecimento derivado de semente de uva de acordo com a presente invenção tinha menor citotoxidade e segurança notável.
[00238] Assim, o alimento saudável e cosmético contendo o ingrediente antienvelhecimento derivado de semente de uva de acordo com a presente invenção tem efeito antienvelhecimento e segurança surpreendentes.
[00239] De acordo com a presente invenção, visto que o alimento saudável e o cosmético antienvelhecimento contêm o ingrediente antienvelhecimento derivado de semente de uva consistindo de 60% em peso ou mais em peso de polifenol derivado de semente de uva grosseiramente purificado, o alimento saudável e o cosmético antienvelhecimento tendo efeito antienvelhecimento surpreendente podem ser obtidos.
[00240] Portanto, a presente invenção é usada apropriadamente como alimento saudável e cosmético tendo efeito antienvelhecimento.
Claims (3)
1. Alimento saudável e cosmético para aumentar a quantidade de células apoptóticas e diminuir a quantidade de células necróticas, caracterizado pelo fato de que compreende um ingrediente derivado de semente de uva forçando a brotação consistindo de 60% em peso ou mais de polifenol derivado de semente de uva forçando a brotação e grosseiramente purificado.
2. Método de fabricação de um ingrediente derivado de semente de uva forçando a brotação para aumentar a quantidade de células apoptóticas e diminuir a quantidade de células necróticas, caracterizado pelo fato de que compreende: (Etapa 1) imersão de uma ou mais sementes de uva selecionadas dentre um grupo consistindo de Vitis vinifera L., Vitis labrusca L., Vitis coignetiae L., Vitis amurensis L., e Vitis shiragai L. em água entre 30°C e 60°C por 20 a 80 horas; (Etapa 2) remoção da água da semente de uva imersa em dita Etapa 1 e secar a mesma naturalmente no ar; (Etapa 3) imersão da semente de uva seca naturalmente em dita Etapa 2 em água entre 15°C e 45°C por 10 a 100 minutos; (Etapa 4) remoção da água da semente de uva imersa em dita Etapa 3 e secar a mesma naturalmente no ar; (Etapa 5) repetição das ditas Etapas 3 e 4 para forçar a brotação da semente de uva até uma porção de embrião das sementes de uva secas naturalmente em dita Etapa 4 ficarem levemente inchadas e intumescidas; (Etapa 6) secagem da semente de uva forçando a brotação entre 35oC e 60oC; (Etapa 7) redução a pó da semente de uva seca em dita Etapa 6; (Etapa 8) obtenção de uma fração extraída contendo um polifenol derivado de semente de uva por imersão da semente de uva em pó obtida em dita Etapa 7 ou em água, etanol, ou um solvente misto de água e etanol; e (Etapa 9) secagem e redução a pó da fração extraída contendo o polifenol derivado de semente de uva obtido em dita Etapa 8.
3. Alimento saudável e cosmético, de acordo com a reivindicação 1, e o método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizados pelo fato de que dita semente de uva é uma semente de um ou mais cultivares de uva de vinho selecionados dentre um grupo consistindo em: Agiorgitiko, Viognier, CabernetSauvignon, Cabernet Franc, Gamay, Carignan, Carmenere, Xinomavro, Grenache, Gewurztraminer, Kerner, Colombard, Koshu, Sultana, Sangiovese, Chardonnay, Chenin Blanc, Syrah, Zinfandel, Semillon, Sauvignon Blanc, Tannat, Zweigelt, Tempranillo, Trebbiano, Nebbiolo, Nero D'Avola, Barbera, Pinotage, Pinot Noir, Pinot Gris, Pinot Blanc, Petit Verdot, Black Queen, Muscat Bailey A, Malbec, Muller- Thurgau, Mourvedre, Meunier, Melon de Bourgogne, Merlot, Moscato, Yama-Sauvignon, Riesling, e Ruby Cabernet.
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