JP2021178850A - アポトーシス細胞の量を増加させ、ネクローシス細胞の量を減少させるための健康食品及び化粧品並びにアポトーシス細胞の量を増加させ、ネクローシス細胞の量を減少させるための催芽ブドウ種子由来成分の製造方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】レスベラトロール等の既知の抗老化作用が期待される物質よりも、優れた抗老化作用を備えた抗老化健康食品及び化粧品並びに優れた抗老化作用を備えたブドウ種子由来抗老化成分の製造方法を提供する。【解決手段】本発明に係る抗老化健康食品及び抗老化化粧品は、粗精製で６０重量％以上のブドウ種子由来ポリフェノールからなるブドウ種子由来抗老化成分を含む。【選択図】図１
Description
本発明は、抗老化健康食品及び化粧品並びにブドウ種子由来抗老化成分の製造方法に係り、より詳しくは、レスベラトロールよりも優れた抗老化作用を備えた抗老化健康食品及び化粧品並びに優れた抗老化作用を備えたブドウ種子由来抗老化成分の製造方法に関する。
老化防止や寿命制御に関するこれまでの研究によって、抗老化作用が期待される化合物として、例えばレスベラトロール（トランス-３,４',５-トリヒドロキシ-スチルベン）が見出されている。
例えば、非特許文献１では、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において、レスベラトロールが、寿命を調節する、カエノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）の酵素のＳｉｒ２を刺激することで、出芽酵母のＤＮＡ安定性を高め、出芽酵母の寿命を７０％延長したという研究結果が報告されている。
しかしながら、一方で、非特許文献２に記載されているように、レスベラトロールは雄及び雌マウスの寿命を延長せず、レスベラトロールは抗老化作用を備えていないという研究結果も報告されている。
このように、抗老化作用が期待されているレスベラトロールだが、レスベラトロールが実際に抗老化作用を有しているか否かは未だ確定していない。
Ｋｏｎｒａｄ Ｔ． Ｈｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ４２５， １９１−１９６ （２００３）
Ｒｉｃｈａｒｄ Ａ． Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｙ： ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ １９１−２０１ （２０１０）
叙上の通り、抗老化作用が期待されているレスベラトロールが実際に抗老化作用を備えているか否かについては未だ確定していない。
それゆえに、レスベラトロールよりも、より確実に優れた抗老化作用を備える物質が求められている。
それゆえに、レスベラトロールよりも、より確実に優れた抗老化作用を備える物質が求められている。
本発明者は、鋭意検討の結果、ブドウ種子由来ポリフェノールからなる抽出物が、レスベラトロールよりも優れた抗老化作用を備えていることを見出した。
本発明の課題は、抗老化作用が期待されているレスベラトロールよりも優れた抗老化作用を備えるブドウ種子由来の抗老化成分及びその製造方法を提供し、この抗老化成分を含む抗老化健康食品及び抗老化化粧品を提供することである。
請求項１に係る発明は、粗精製で６０重量％以上の催芽ブドウ種子由来ポリフェノールからなる催芽ブドウ種子由来成分を含むことを特徴とする、アポトーシス細胞の量を増加させ、ネクローシス細胞の量を減少させるための健康食品または化粧品に関する。
請求項２に係る発明は、前記ブドウ種子が、アギオルギティコ（Ａｇｉｏｒｇｉｔｉｋｏ）、ヴィオニエ（Ｖｉｏｇｎｉｅｒ）、カベルネ・ソーヴィニヨン（Ｃａｂｅｒｎｅｔ Ｓａｕｖｉｇｎｏｎ）、カベルネ・フラン（Ｃａｂｅｒｎｅｔ Ｆｒａｎｃ）、ガメ（Ｇａｍａｙ）、カリニャン（Ｃａｒｉｇｎａｎ）、カルメネール（Ｃａｒｍｅｎｅｒｅ）、クシノマヴロ（Ｘｉｎｏｍａｖｒｏ）、グルナッシュ（Ｇｒｅｎａｃｈｅ）、ゲヴュルツトラミネール（Ｇｅｗｕｒｚｔｒａｍｉｎｅｒ）、ケルナー（Ｋｅｒｎｅｒ）、コロンバール（Ｃｏｌｏｍｂａｒｄ）、甲州、サルタナ（Ｓｕｌｔａｎａ）、サンジョベーゼ（Ｓａｎｇｉｏｖｅｓｅ）、シャルドネ（Ｃｈａｒｄｏｎｎａｙ）、シュナン・ブラン（Ｃｈｅｎｉｎ Ｂｌａｎｃ）、シラー（Ｓｙｒａｈ）、ジンファンデル（Ｚｉｎｆａｎｄｅｌ）、セミヨン（Ｓｅｍｉｌｌｏｎ）、ソーヴィニヨン・ブラン（Ｓａｕｖｉｇｎｏｎ Ｂｌａｎｃ）、タナ（Ｔａｎｎａｔ）、ツヴァイゲルト（Ｚｗｅｉｇｅｌｔ）、テンプラニーリョ（Ｔｅｍｐｒａｎｉｌｌｏ）、トレッビアーノ（Ｔｒｅｂｂｉａｎｏ）、ネッビオーロ（Ｎｅｂｂｉｏｌｏ）、ネロ・ダヴォラ（Ｎｅｒｏ Ｄ’Ａｖｏｌａ）、バルベーラ（Ｂａｒｂｅｒａ）、ピノタージュ（Ｐｉｎｏｔａｇｅ）、ピノ・ノワール（Ｐｉｎｏｔ Ｎｏｉｒ）、ピノ・グリ（Ｐｉｎｏｔ Ｇｒｉｓ）、ピノ・ブラン（Ｐｉｎｏｔ Ｂｌａｎｃ）、プチ・ヴェルド（Ｐｅｔｉｔ Ｖｅｒｄｏｔ）、ブラック・クィーン（Ｂｌａｃｋ Ｑｕｅｅｎ）、マスカット・ベーリーＡ（Ｍｕｓｃａｔ Ｂａｉｌｅｙ Ａ）、マルベック（Ｍａｌｂｅｃ）、ミュラー・トゥルガウ（Ｍｕｌｌｅｒ‐Ｔｈｕｒｇａｕ）、ムールヴェードル（Ｍｏｕｒｖｅｄｒｅ）、ムニエ（Ｍｅｕｎｉｅｒ）、ムロン・ド・ブルゴーニュ（Ｍｅｌｏｎ ｄｅ Ｂｏｕｒｇｏｇｎｅ）、メルロー（Ｍｅｒｌｏｔ）、モスカート（Ｍｏｓｃａｔｏ）、ヤマ・ソービニオン、リースリング（Ｒｉｅｓｌｉｎｇ）及びルビー・カベルネ（Ｒｕｂｙ Ｃａｂｅｒｎｅｔ）からなる群より選択される１種以上のワイン用ブドウ品種の種子であることを特徴とする、請求項１に記載のアポトーシス細胞の量を増加させ、ネクローシス細胞の量を減少させるための健康食品または化粧品に関する。
請求項３に係る発明は、（工程１）ヨーロッパブドウ（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ Ｌ．）、アメリカブドウ（Ｖｉｔｉｓ ｌａｂｒｕｓｃａ Ｌ．）、ヤマブドウ（Ｖｉｔｉｓ ｃｏｉｇｎｅｔｉａｅ Ｌ．）、マンシュウヤマブドウ（Ｖｉｔｉｓ ａｍｕｒｅｎｓｉｓ Ｌ．）及びシラガブドウ（Ｖｉｔｉｓ ｓｈｉｒａｇａｉ Ｌ．）からなる群より選択される１種以上のブドウ種子を、３０℃〜６０℃の水に２０〜８０時間浸漬させる工程
（工程２）前記工程１において浸漬させたブドウ種子を引き上げ、空気中で自然乾燥させる工程
（工程３）前記工程２において自然乾燥させたブドウ種子を、１５℃〜４５℃の水に１０〜２００分浸漬させる工程
（工程４）前記工程３において浸漬させたブドウ種子を引き上げ、空気中で自然乾燥させる工程
（工程５）前記工程４において自然乾燥させたブドウ種子の胚芽部分が若干隆起し膨らんだ状態になるまで、前記工程３〜４を繰り返し、ブドウ種子を催芽状態にする工程、
（工程６）催芽状態にしたブドウ種子を、３５℃〜６０℃で乾燥させる工程
（工程７）前記工程６において乾燥させたブドウ種子を粉末化する工程
（工程８）前記工程７で得られたブドウ種子粉末を、水、エタノール又は水とエタノールの混合溶媒のいずれかに浸漬させてブドウ種子由来ポリフェノールを含む抽出画分を得る工程
（工程９）前記工程８で得られたブドウ種子由来ポリフェノールを含む抽出画分を乾燥させ粉末化する工程からなる、アポトーシス細胞の量を増加させ、ネクローシス細胞の量を減少させるための催芽ブドウ種子由来成分の製造方法に関する。
（工程２）前記工程１において浸漬させたブドウ種子を引き上げ、空気中で自然乾燥させる工程
（工程３）前記工程２において自然乾燥させたブドウ種子を、１５℃〜４５℃の水に１０〜２００分浸漬させる工程
（工程４）前記工程３において浸漬させたブドウ種子を引き上げ、空気中で自然乾燥させる工程
（工程５）前記工程４において自然乾燥させたブドウ種子の胚芽部分が若干隆起し膨らんだ状態になるまで、前記工程３〜４を繰り返し、ブドウ種子を催芽状態にする工程、
（工程６）催芽状態にしたブドウ種子を、３５℃〜６０℃で乾燥させる工程
（工程７）前記工程６において乾燥させたブドウ種子を粉末化する工程
（工程８）前記工程７で得られたブドウ種子粉末を、水、エタノール又は水とエタノールの混合溶媒のいずれかに浸漬させてブドウ種子由来ポリフェノールを含む抽出画分を得る工程
（工程９）前記工程８で得られたブドウ種子由来ポリフェノールを含む抽出画分を乾燥させ粉末化する工程からなる、アポトーシス細胞の量を増加させ、ネクローシス細胞の量を減少させるための催芽ブドウ種子由来成分の製造方法に関する。
請求項４に係る発明は、前記ブドウ種子が、アギオルギティコ（Ａｇｉｏｒｇｉｔｉｋｏ）、ヴィオニエ（Ｖｉｏｇｎｉｅｒ）、カベルネ・ソーヴィニヨン（Ｃａｂｅｒｎｅｔ Ｓａｕｖｉｇｎｏｎ）、カベルネ・フラン（Ｃａｂｅｒｎｅｔ Ｆｒａｎｃ）、ガメ（Ｇａｍａｙ）、カリニャン（Ｃａｒｉｇｎａｎ）、カルメネール（Ｃａｒｍｅｎｅｒｅ）、クシノマヴロ（Ｘｉｎｏｍａｖｒｏ）、グルナッシュ（Ｇｒｅｎａｃｈｅ）、ゲヴュルツトラミネール（Ｇｅｗｕｒｚｔｒａｍｉｎｅｒ）、ケルナー（Ｋｅｒｎｅｒ）、コロンバール（Ｃｏｌｏｍｂａｒｄ）、甲州、サルタナ（Ｓｕｌｔａｎａ）、サンジョベーゼ（Ｓａｎｇｉｏｖｅｓｅ）、シャルドネ（Ｃｈａｒｄｏｎｎａｙ）、シュナン・ブラン（Ｃｈｅｎｉｎ Ｂｌａｎｃ）、シラー（Ｓｙｒａｈ）、ジンファンデル（Ｚｉｎｆａｎｄｅｌ）、セミヨン（Ｓｅｍｉｌｌｏｎ）、ソーヴィニヨン・ブラン（Ｓａｕｖｉｇｎｏｎ Ｂｌａｎｃ）、タナ（Ｔａｎｎａｔ）、ツヴァイゲルト（Ｚｗｅｉｇｅｌｔ）、テンプラニーリョ（Ｔｅｍｐｒａｎｉｌｌｏ）、トレッビアーノ（Ｔｒｅｂｂｉａｎｏ）、ネッビオーロ（Ｎｅｂｂｉｏｌｏ）、ネロ・ダヴォラ（Ｎｅｒｏ Ｄ’Ａｖｏｌａ）、バルベーラ（Ｂａｒｂｅｒａ）、ピノタージュ（Ｐｉｎｏｔａｇｅ）、ピノ・ノワール（Ｐｉｎｏｔ Ｎｏｉｒ）、ピノ・グリ（Ｐｉｎｏｔ Ｇｒｉｓ）、ピノ・ブラン（Ｐｉｎｏｔ Ｂｌａｎｃ）、プチ・ヴェルド（Ｐｅｔｉｔ Ｖｅｒｄｏｔ）、ブラック・クィーン（Ｂｌａｃｋ Ｑｕｅｅｎ）、マスカット・ベーリーＡ（Ｍｕｓｃａｔ Ｂａｉｌｅｙ Ａ）、マルベック（Ｍａｌｂｅｃ）、ミュラー・トゥルガウ（Ｍｕｌｌｅｒ‐Ｔｈｕｒｇａｕ）、ムールヴェードル（Ｍｏｕｒｖｅｄｒｅ）、ムニエ（Ｍｅｕｎｉｅｒ）、ムロン・ド・ブルゴーニュ（Ｍｅｌｏｎ ｄｅ Ｂｏｕｒｇｏｇｎｅ）、メルロー（Ｍｅｒｌｏｔ）、モスカート（Ｍｏｓｃａｔｏ）、ヤマ・ソービニオン、リースリング（Ｒｉｅｓｌｉｎｇ）及びルビー・カベルネ（Ｒｕｂｙ Ｃａｂｅｒｎｅｔ）からなる群より選択される１種以上のワイン用ブドウ品種の種子であることを特徴とする、請求項３に記載のアポトーシス細胞の量を増加させ、ネクローシス細胞の量を減少させるための催芽ブドウ種子由来成分の製造方法に関する。
請求項１に係る発明によれば、アポトーシス細胞の量を増加させ、ネクローシス細胞の量を減少させるための健康食品または化粧品が、粗精製で６０重量％以上の催芽ブドウ種子由来ポリフェノールからなる催芽ブドウ種子由来成分を含むため、優れた抗老化作用を備えた健康食品または化粧品を提供することができる。
請求項２に係る発明によれば、前記ブドウ種子が、アギオルギティコ（Ａｇｉｏｒｇｉｔｉｋｏ）、ヴィオニエ（Ｖｉｏｇｎｉｅｒ）、カベルネ・ソーヴィニヨン（Ｃａｂｅｒｎｅｔ Ｓａｕｖｉｇｎｏｎ）、カベルネ・フラン（Ｃａｂｅｒｎｅｔ Ｆｒａｎｃ）、ガメ（Ｇａｍａｙ）、カリニャン（Ｃａｒｉｇｎａｎ）、カルメネール（Ｃａｒｍｅｎｅｒｅ）、クシノマヴロ（Ｘｉｎｏｍａｖｒｏ）、グルナッシュ（Ｇｒｅｎａｃｈｅ）、ゲヴュルツトラミネール（Ｇｅｗｕｒｚｔｒａｍｉｎｅｒ）、ケルナー（Ｋｅｒｎｅｒ）、コロンバール（Ｃｏｌｏｍｂａｒｄ）、甲州、サルタナ（Ｓｕｌｔａｎａ）、サンジョベーゼ（Ｓａｎｇｉｏｖｅｓｅ）、シャルドネ（Ｃｈａｒｄｏｎｎａｙ）、シュナン・ブラン（Ｃｈｅｎｉｎ Ｂｌａｎｃ）、シラー（Ｓｙｒａｈ）、ジンファンデル（Ｚｉｎｆａｎｄｅｌ）、セミヨン（Ｓｅｍｉｌｌｏｎ）、ソーヴィニヨン・ブラン（Ｓａｕｖｉｇｎｏｎ Ｂｌａｎｃ）、タナ（Ｔａｎｎａｔ）、ツヴァイゲルト（Ｚｗｅｉｇｅｌｔ）、テンプラニーリョ（Ｔｅｍｐｒａｎｉｌｌｏ）、トレッビアーノ（Ｔｒｅｂｂｉａｎｏ）、ネッビオーロ（Ｎｅｂｂｉｏｌｏ）、ネロ・ダヴォラ（Ｎｅｒｏ Ｄ’Ａｖｏｌａ）、バルベーラ（Ｂａｒｂｅｒａ）、ピノタージュ（Ｐｉｎｏｔａｇｅ）、ピノ・ノワール（Ｐｉｎｏｔ Ｎｏｉｒ）、ピノ・グリ（Ｐｉｎｏｔ Ｇｒｉｓ）、ピノ・ブラン（Ｐｉｎｏｔ Ｂｌａｎｃ）、プチ・ヴェルド（Ｐｅｔｉｔ Ｖｅｒｄｏｔ）、ブラック・クィーン（Ｂｌａｃｋ Ｑｕｅｅｎ）、マスカット・ベーリーＡ（Ｍｕｓｃａｔ Ｂａｉｌｅｙ Ａ）、マルベック（Ｍａｌｂｅｃ）、ミュラー・トゥルガウ（Ｍｕｌｌｅｒ‐Ｔｈｕｒｇａｕ）、ムールヴェードル（Ｍｏｕｒｖｅｄｒｅ）、ムニエ（Ｍｅｕｎｉｅｒ）、ムロン・ド・ブルゴーニュ（Ｍｅｌｏｎ ｄｅ Ｂｏｕｒｇｏｇｎｅ）、メルロー（Ｍｅｒｌｏｔ）、モスカート（Ｍｏｓｃａｔｏ）、ヤマ・ソービニオン、リースリング（Ｒｉｅｓｌｉｎｇ）及びルビー・カベルネ（Ｒｕｂｙ Ｃａｂｅｒｎｅｔ）からなる群より選択される１種以上のワイン用ブドウ品種の種子であるため、より優れた抗老化作用を備えた健康食品または化粧品を提供することができる。
請求項３に係る発明によれば、催芽ブドウ種子由来成分が、（工程１）ヨーロッパブドウ（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ Ｌ．）、アメリカブドウ（Ｖｉｔｉｓ ｌａｂｒｕｓｃａ Ｌ．）、ヤマブドウ（Ｖｉｔｉｓ ｃｏｉｇｎｅｔｉａｅ Ｌ．）、マンシュウヤマブドウ（Ｖｉｔｉｓ ａｍｕｒｅｎｓｉｓ Ｌ．）及びシラガブドウ（Ｖｉｔｉｓ ｓｈｉｒａｇａｉ Ｌ．）からなる群より選択される１種以上のブドウ種子を、３０℃〜６０℃の水に２０〜８０時間浸漬させる工程、（工程２）前記工程１において浸漬させたブドウ種子を引き上げ、空気中で自然乾燥させる工程、（工程３）前記工程２において自然乾燥させたブドウ種子を、１５℃〜４５℃の水に１０〜２００分浸漬させる工程、（工程４）前記工程３において浸漬させたブドウ種子を引き上げ、空気中で自然乾燥させる工程、（工程５）前記工程４において自然乾燥させたブドウ種子の胚芽部分が若干隆起し膨らんだ状態になるまで、前記工程３〜４を繰り返し、ブドウ種子を催芽状態にする工程、（工程６）催芽状態にしたブドウ種子を、３５℃〜６０℃で乾燥させる工程、（工程７）前記工程６において乾燥させたブドウ種子を粉末化する工程、（工程８）前記工程７で得られたブドウ種子粉末を、水、エタノール又は水とエタノールの混合溶媒のいずれかに浸漬させてブドウ種子由来ポリフェノールを含む抽出画分を得る工程、（工程９）前記工程８で得られたブドウ種子由来ポリフェノールを含む抽出画分を乾燥させ粉末化する工程から製造されるため、優れた抗老化作用を備えた催芽ブドウ種子由来成分を製造することができる。
請求項４に係る発明によれば、前記ブドウ種子が、アギオルギティコ（Ａｇｉｏｒｇｉｔｉｋｏ）、ヴィオニエ（Ｖｉｏｇｎｉｅｒ）、カベルネ・ソーヴィニヨン（Ｃａｂｅｒｎｅｔ Ｓａｕｖｉｇｎｏｎ）、カベルネ・フラン（Ｃａｂｅｒｎｅｔ Ｆｒａｎｃ）、ガメ（Ｇａｍａｙ）、カリニャン（Ｃａｒｉｇｎａｎ）、カルメネール（Ｃａｒｍｅｎｅｒｅ）、クシノマヴロ（Ｘｉｎｏｍａｖｒｏ）、グルナッシュ（Ｇｒｅｎａｃｈｅ）、ゲヴュルツトラミネール（Ｇｅｗｕｒｚｔｒａｍｉｎｅｒ）、ケルナー（Ｋｅｒｎｅｒ）、コロンバール（Ｃｏｌｏｍｂａｒｄ）、甲州、サルタナ（Ｓｕｌｔａｎａ）、サンジョベーゼ（Ｓａｎｇｉｏｖｅｓｅ）、シャルドネ（Ｃｈａｒｄｏｎｎａｙ）、シュナン・ブラン（Ｃｈｅｎｉｎ Ｂｌａｎｃ）、シラー（Ｓｙｒａｈ）、ジンファンデル（Ｚｉｎｆａｎｄｅｌ）、セミヨン（Ｓｅｍｉｌｌｏｎ）、ソーヴィニヨン・ブラン（Ｓａｕｖｉｇｎｏｎ Ｂｌａｎｃ）、タナ（Ｔａｎｎａｔ）、ツヴァイゲルト（Ｚｗｅｉｇｅｌｔ）、テンプラニーリョ（Ｔｅｍｐｒａｎｉｌｌｏ）、トレッビアーノ（Ｔｒｅｂｂｉａｎｏ）、ネッビオーロ（Ｎｅｂｂｉｏｌｏ）、ネロ・ダヴォラ（Ｎｅｒｏ Ｄ’Ａｖｏｌａ）、バルベーラ（Ｂａｒｂｅｒａ）、ピノタージュ（Ｐｉｎｏｔａｇｅ）、ピノ・ノワール（Ｐｉｎｏｔ Ｎｏｉｒ）、ピノ・グリ（Ｐｉｎｏｔ Ｇｒｉｓ）、ピノ・ブラン（Ｐｉｎｏｔ Ｂｌａｎｃ）、プチ・ヴェルド（Ｐｅｔｉｔ Ｖｅｒｄｏｔ）、ブラック・クィーン（Ｂｌａｃｋ Ｑｕｅｅｎ）、マスカット・ベーリーＡ（Ｍｕｓｃａｔ Ｂａｉｌｅｙ Ａ）、マルベック（Ｍａｌｂｅｃ）、ミュラー・トゥルガウ（Ｍｕｌｌｅｒ‐Ｔｈｕｒｇａｕ）、ムールヴェードル（Ｍｏｕｒｖｅｄｒｅ）、ムニエ（Ｍｅｕｎｉｅｒ）、ムロン・ド・ブルゴーニュ（Ｍｅｌｏｎ ｄｅ Ｂｏｕｒｇｏｇｎｅ）、メルロー（Ｍｅｒｌｏｔ）、モスカート（Ｍｏｓｃａｔｏ）、ヤマ・ソービニオン、リースリング（Ｒｉｅｓｌｉｎｇ）及びルビー・カベルネ（Ｒｕｂｙ Ｃａｂｅｒｎｅｔ）からなる群より選択される１種以上のワイン用ブドウ品種の種子であるため、より優れた抗老化作用を備えた催芽ブドウ種子由来成分を製造することができる。
以下、本発明に係る抗老化健康食品及び化粧品並びにブドウ種子由来抗老化成分の製造方法について説明する。
尚、本明細書において、「老化」とは、細胞の倍化能力が低下した状態や細胞がＧ１期において不可逆的な増殖停止の状態となることを指す。これらの状態は細胞周期の進行を促す遺伝子の抑制と細胞周期を阻害するｐ１６ＩＮＫ４ａ、ｐ５３、およびそれらのターゲットとなる転写因子ｐ２１ＣＩＰ１の発現上昇が関与している。加えて、老化細胞は、マイトジェン誘導の細胞増殖に抵抗性を持ち、老化細胞の巨大化と扁平化が生じる。老化細胞は、老化関連酸性β-ガラクトシダーゼ（ＳＡ βＧａｌ；ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）活性のような共通の生化学的マーカーを呈する。この老化現象は培養細胞で特徴付けられた一方で、生体内でも起こっていることが証明されている。
尚、本明細書において、「老化」とは、細胞の倍化能力が低下した状態や細胞がＧ１期において不可逆的な増殖停止の状態となることを指す。これらの状態は細胞周期の進行を促す遺伝子の抑制と細胞周期を阻害するｐ１６ＩＮＫ４ａ、ｐ５３、およびそれらのターゲットとなる転写因子ｐ２１ＣＩＰ１の発現上昇が関与している。加えて、老化細胞は、マイトジェン誘導の細胞増殖に抵抗性を持ち、老化細胞の巨大化と扁平化が生じる。老化細胞は、老化関連酸性β-ガラクトシダーゼ（ＳＡ βＧａｌ；ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）活性のような共通の生化学的マーカーを呈する。この老化現象は培養細胞で特徴付けられた一方で、生体内でも起こっていることが証明されている。
本発明に係る抗老化健康食品及び化粧品は、粗精製で６０重量％以上のブドウ種子由来ポリフェノールからなるブドウ種子由来抗老化成分を含有する。
本発明に係る抗老化健康食品及び化粧品に含まれるブドウ種子由来ポリフェノールからなるブドウ種子由来抗老化成分は、以下の製造工程から得られる。
＜工程１＞
工程１は、ブドウ種子を前処理し、催芽状態にしたブドウ種子を乾燥させる工程である。
工程１は、ブドウ種子を前処理し、催芽状態にしたブドウ種子を乾燥させる工程である。
本発明に使用するブドウ種子のブドウの種類は特に限定されないが、例えば、ヨーロッパブドウ（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ Ｌ．）、アメリカブドウ（Ｖｉｔｉｓ ｌａｂｒｕｓｃａ Ｌ．）、ヤマブドウ（Ｖｉｔｉｓ ｃｏｉｇｎｅｔｉａｅ Ｌ．）、マンシュウヤマブドウ（Ｖｉｔｉｓ ａｍｕｒｅｎｓｉｓ Ｌ．）及びシラガブドウ（Ｖｉｔｉｓ ｓｈｉｒａｇａｉ Ｌ．）からなる群より選択される１種以上のブドウである。
なかでも、アギオルギティコ（Ａｇｉｏｒｇｉｔｉｋｏ）、ヴィオニエ（Ｖｉｏｇｎｉｅｒ）、カベルネ・ソーヴィニヨン（Ｃａｂｅｒｎｅｔ Ｓａｕｖｉｇｎｏｎ）、カベルネ・フラン（Ｃａｂｅｒｎｅｔ Ｆｒａｎｃ）、ガメ（Ｇａｍａｙ）、カリニャン（Ｃａｒｉｇｎａｎ）、カルメネール（Ｃａｒｍｅｎｅｒｅ）、クシノマヴロ（Ｘｉｎｏｍａｖｒｏ）、グルナッシュ（Ｇｒｅｎａｃｈｅ）、ゲヴュルツトラミネール（Ｇｅｗｕｒｚｔｒａｍｉｎｅｒ）、ケルナー（Ｋｅｒｎｅｒ）、コロンバール（Ｃｏｌｏｍｂａｒｄ）、甲州、サルタナ（Ｓｕｌｔａｎａ）、サンジョベーゼ（Ｓａｎｇｉｏｖｅｓｅ）、シャルドネ（Ｃｈａｒｄｏｎｎａｙ）、シュナン・ブラン（Ｃｈｅｎｉｎ Ｂｌａｎｃ）、シラー（Ｓｙｒａｈ）、ジンファンデル（Ｚｉｎｆａｎｄｅｌ）、セミヨン（Ｓｅｍｉｌｌｏｎ）、ソーヴィニヨン・ブラン（Ｓａｕｖｉｇｎｏｎ Ｂｌａｎｃ）、タナ（Ｔａｎｎａｔ）、ツヴァイゲルト（Ｚｗｅｉｇｅｌｔ）、テンプラニーリョ（Ｔｅｍｐｒａｎｉｌｌｏ）、トレッビアーノ（Ｔｒｅｂｂｉａｎｏ）、ネッビオーロ（Ｎｅｂｂｉｏｌｏ）、ネロ・ダヴォラ（Ｎｅｒｏ Ｄ’Ａｖｏｌａ）、バルベーラ（Ｂａｒｂｅｒａ）、ピノタージュ（Ｐｉｎｏｔａｇｅ）、ピノ・ノワール（Ｐｉｎｏｔ Ｎｏｉｒ）、ピノ・グリ（Ｐｉｎｏｔ Ｇｒｉｓ）、ピノ・ブラン（Ｐｉｎｏｔ Ｂｌａｎｃ）、プチ・ヴェルド（Ｐｅｔｉｔ Ｖｅｒｄｏｔ）、ブラック・クィーン（Ｂｌａｃｋ Ｑｕｅｅｎ）、マスカット・ベーリーＡ（Ｍｕｓｃａｔ Ｂａｉｌｅｙ Ａ）、マルベック（Ｍａｌｂｅｃ）、ミュラー・トゥルガウ（Ｍｕｌｌｅｒ‐Ｔｈｕｒｇａｕ）、ムールヴェードル（Ｍｏｕｒｖｅｄｒｅ）、ムニエ（Ｍｅｕｎｉｅｒ）、ムロン・ド・ブルゴーニュ（Ｍｅｌｏｎ ｄｅ Ｂｏｕｒｇｏｇｎｅ）、メルロー（Ｍｅｒｌｏｔ）、モスカート（Ｍｏｓｃａｔｏ）、ヤマ・ソービニオン、リースリング（Ｒｉｅｓｌｉｎｇ）及びルビー・カベルネ（Ｒｕｂｙ Ｃａｂｅｒｎｅｔ）等のワイン用ブドウ品種が好ましく、カベルネ・ソーヴィニヨン、メルロー、シラー、ピノ・ノワールがさらに好ましい。
本明細書において、「催芽」とは、ブドウ種子を、発芽を始める状態にすることをいう。より具体的には、ブドウ種子の胚芽部分が若干隆起し膨らんだ状態をいう。
この隆起の程度は特に限定されないが、例えば、催芽前のブドウ種子よりも胚芽部分の表面が１ｍｍ〜２ｍｍ隆起した状態である。
尚、本発明において、ブドウ種子から芽が出た発芽状態のブドウ種子は、催芽状態のブドウ種子と比較して抗老化作用が低い傾向があるため、好ましくない。
この隆起の程度は特に限定されないが、例えば、催芽前のブドウ種子よりも胚芽部分の表面が１ｍｍ〜２ｍｍ隆起した状態である。
尚、本発明において、ブドウ種子から芽が出た発芽状態のブドウ種子は、催芽状態のブドウ種子と比較して抗老化作用が低い傾向があるため、好ましくない。
本発明において、ブドウ種子を催芽状態にするためのブドウ種子の前処理方法は特に限定されず、低温処理、温浴処理、機械的破壊等の物理的な方法、ガス（アセチレン、エーテル、水素ガス等）処理、オーキシン処理、ジベレリン処理等の化学的な方法等、従来から植物の種子を催芽状態にするために用いられている方法であればいかなる方法を用いても良い。
叙上の通り、本発明において、ブドウ種子を催芽状態にするための前処理方法は特に限定されないが、例えば、より具体的には以下の前処理方法によりブドウ種子を催芽状態にすることができる。
まず、ブドウ種子を３０〜６０℃の水に浸漬させる。
浸漬時間は、限定されるものではないが、２０〜８０時間であることが好ましい。
次いで、３０〜６０℃の水に浸漬させたブドウ種子を引き上げ、空気中で自然乾燥させる。
自然乾燥の温度は、限定されるものではないが、１０〜５０℃が好ましい。
自然乾燥の時間は、限定されるものではないが、１〜１０時間が好ましい。
まず、ブドウ種子を３０〜６０℃の水に浸漬させる。
浸漬時間は、限定されるものではないが、２０〜８０時間であることが好ましい。
次いで、３０〜６０℃の水に浸漬させたブドウ種子を引き上げ、空気中で自然乾燥させる。
自然乾燥の温度は、限定されるものではないが、１０〜５０℃が好ましい。
自然乾燥の時間は、限定されるものではないが、１〜１０時間が好ましい。
次に、空気中で自然乾燥させたブドウ種子を１５〜４５℃の水に浸漬させる。
浸漬時間は、限定されるものではないが、１０〜２００分であることが好ましい。
次いで、１５〜４５℃の水に浸漬させたブドウ種子を引き上げ、空気中で自然乾燥させる。
自然乾燥の温度は、限定されるものではないが、１０〜５０℃が好ましい。
自然乾燥の時間は、限定されるものではないが、３〜１２時間が好ましい。
浸漬時間は、限定されるものではないが、１０〜２００分であることが好ましい。
次いで、１５〜４５℃の水に浸漬させたブドウ種子を引き上げ、空気中で自然乾燥させる。
自然乾燥の温度は、限定されるものではないが、１０〜５０℃が好ましい。
自然乾燥の時間は、限定されるものではないが、３〜１２時間が好ましい。
このブドウ種子を１５〜４５℃の水に浸漬させる工程と空気中で自然乾燥させる工程を、自然乾燥させた後、ブドウ種子の胚芽部分が若干隆起し膨らんだ状態になるまで繰り返し、ブドウ種子を断続的に含水させる。
ブドウ種子を自然乾燥させた後、ブドウ種子の胚芽部分が若干隆起し膨らんだ状態になったら、ブドウ種子を取り出し、雑菌を殺傷する程度の温度（８０℃以下）で２〜５日間さらにブドウ種子を乾燥させる。
尚、この乾燥時間は、季節や周囲の温度や湿度によって適宜変更しても良い。
ブドウ種子を自然乾燥させた後、ブドウ種子の胚芽部分が若干隆起し膨らんだ状態になったら、ブドウ種子を取り出し、雑菌を殺傷する程度の温度（８０℃以下）で２〜５日間さらにブドウ種子を乾燥させる。
尚、この乾燥時間は、季節や周囲の温度や湿度によって適宜変更しても良い。
この催芽処理の刺激により、ブドウ種子内では薄いフェノール層からフェノール分子が剥離して多重結合をしてポリフェノールを生成する。
ポリフェノールの一種であるレスベラトールは分子量２５０ほどであるが、この新たに生成された成分は分子量４０００の成分を含む大きな高分子構造を特徴とする。
ポリフェノールの一種であるレスベラトールは分子量２５０ほどであるが、この新たに生成された成分は分子量４０００の成分を含む大きな高分子構造を特徴とする。
＜工程２＞
工程２は、工程１において乾燥させた催芽状態のブドウ種子を粉末化する工程である。
粉末化の方法は、限定されるものではなく、ミルで粉末化する等の通常の方法を用いることができる。
工程２は、工程１において乾燥させた催芽状態のブドウ種子を粉末化する工程である。
粉末化の方法は、限定されるものではなく、ミルで粉末化する等の通常の方法を用いることができる。
＜工程３＞
工程３は、粉末化したブドウ種子を溶媒で抽出する工程である。
この工程３により、ブドウ種子由来ポリフェノールからなるブドウ種子由来抗老化成分を得る。
溶媒としては、水、エタノール又は水とエタノールの混合溶媒を用いることができる。
抽出は、ブドウ種子粉末１００重量部に対し溶媒を５０〜１０００重量部加えて行えばよい。
上記にて説明したように、このブドウ種子由来ポリフェノールからなるブドウ種子由来抗老化成分は分子量４０００前後（３５００〜４５００）の高分子成分を含んでいる。
工程３は、粉末化したブドウ種子を溶媒で抽出する工程である。
この工程３により、ブドウ種子由来ポリフェノールからなるブドウ種子由来抗老化成分を得る。
溶媒としては、水、エタノール又は水とエタノールの混合溶媒を用いることができる。
抽出は、ブドウ種子粉末１００重量部に対し溶媒を５０〜１０００重量部加えて行えばよい。
上記にて説明したように、このブドウ種子由来ポリフェノールからなるブドウ種子由来抗老化成分は分子量４０００前後（３５００〜４５００）の高分子成分を含んでいる。
＜工程４＞
次いで、工程３で得られたブドウ種子由来ポリフェノールからなるブドウ種子由来抗老化成分を乾燥させた後、粉末化する。
乾燥方法は、限定されるものではないが、減圧乾燥が好適に用いられる。
粉末化の方法は、限定されるものではなく、ミルで粉末化する等の通常の方法を用いることができる。
以上の工程により、粉末化したブドウ種子由来ポリフェノールからなるブドウ種子由来抗老化成分を得ることができる。
次いで、工程３で得られたブドウ種子由来ポリフェノールからなるブドウ種子由来抗老化成分を乾燥させた後、粉末化する。
乾燥方法は、限定されるものではないが、減圧乾燥が好適に用いられる。
粉末化の方法は、限定されるものではなく、ミルで粉末化する等の通常の方法を用いることができる。
以上の工程により、粉末化したブドウ種子由来ポリフェノールからなるブドウ種子由来抗老化成分を得ることができる。
叙上の工程により得られたブドウ種子由来抗老化成分は、粗精製で５０重量％〜８０重量％のポリフェノールを含有している。
優れた抗老化作用を奏するという観点から、ブドウ種子由来抗老化成分は、粗精製で６０重量％以上のポリフェノールを含有していることが望ましい。
ブドウ種子由来抗老化成分に含まれるポリフェノールは、各品種のブドウ種子に含まれるポリフェノールであり、例えばレスベラトロールやタンニン等がある。
ブドウ種子由来抗老化成分に含まれるポリフェノールの内、５０重量％〜８０重量％はプロアントシアニジン重合体である。
上記成分を含有するブドウ種子由来抗老化成分が抗老化作用を奏することを本発明者は確認した。
尚、本明細書において、粗精製とは、抽出したものを乾燥して粉末化しただけであり夾雑物等を含んでおり、濃縮等の加工がされていない状態を指す。上記工程１〜４で得られたブドウ種子由来抗老化成分は粗精製されたものである。
優れた抗老化作用を奏するという観点から、ブドウ種子由来抗老化成分は、粗精製で６０重量％以上のポリフェノールを含有していることが望ましい。
ブドウ種子由来抗老化成分に含まれるポリフェノールは、各品種のブドウ種子に含まれるポリフェノールであり、例えばレスベラトロールやタンニン等がある。
ブドウ種子由来抗老化成分に含まれるポリフェノールの内、５０重量％〜８０重量％はプロアントシアニジン重合体である。
上記成分を含有するブドウ種子由来抗老化成分が抗老化作用を奏することを本発明者は確認した。
尚、本明細書において、粗精製とは、抽出したものを乾燥して粉末化しただけであり夾雑物等を含んでおり、濃縮等の加工がされていない状態を指す。上記工程１〜４で得られたブドウ種子由来抗老化成分は粗精製されたものである。
ブドウ種子由来抗老化成分を健康食品に含有させることで、本発明の抗老化健康食品を得ることができる。
ブドウ種子由来抗老化成分を健康食品に含有させることにより、手軽に日常的にブドウ種子由来抗老化成分を摂取することが可能となる。
本発明の抗老化健康食品は、例えば、ブドウ糖、果糖、ショ糖、マルトース、ソルビトール、ステビオサイド、ルブソサイド、コーンシロップ、乳糖、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸、乳酸、Ｌ−アスコルビン酸、ｄｌ−α−トコフェノール、エリソルビン酸ナトリウム、グリセリン、プロピレングリコール、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステルアラビアガム、カラギーナン、カゼイン、ゼラチン、ペクチン、寒天、ビタミンＢ類、ニコチン酸アミド、パントテン酸カルシウム、アミノ酸類、カルシウム塩類、色素、香料、保存剤等、通常の食品原料として使用されている添加剤を適宜配合して常法により製造することができる。
ブドウ種子由来抗老化成分を健康食品に含有させることにより、手軽に日常的にブドウ種子由来抗老化成分を摂取することが可能となる。
本発明の抗老化健康食品は、例えば、ブドウ糖、果糖、ショ糖、マルトース、ソルビトール、ステビオサイド、ルブソサイド、コーンシロップ、乳糖、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸、乳酸、Ｌ−アスコルビン酸、ｄｌ−α−トコフェノール、エリソルビン酸ナトリウム、グリセリン、プロピレングリコール、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステルアラビアガム、カラギーナン、カゼイン、ゼラチン、ペクチン、寒天、ビタミンＢ類、ニコチン酸アミド、パントテン酸カルシウム、アミノ酸類、カルシウム塩類、色素、香料、保存剤等、通常の食品原料として使用されている添加剤を適宜配合して常法により製造することができる。
ブドウ種子由来抗老化成分を化粧品に含有させることで、本発明の抗老化化粧品を得ることができる。
化粧品にブドウ種子由来抗老化成分を含有させることにより、日常的にブドウ種子由来抗老化成分を適用することが可能となる。
尚、本発明に係る抗老化化粧品に含まれるブドウ種子由来抗老化成分の形態は特に限定されないが、皮膚に浸透しやすいという観点から、多重層のマイクロカプセル状であることが望ましい。
本発明の抗老化化粧品は、美白剤、活性酸素除去剤、抗酸化剤、紫外線防止剤等、通常使用されている添加剤を適宜配合して常法により製造することができる。
化粧品にブドウ種子由来抗老化成分を含有させることにより、日常的にブドウ種子由来抗老化成分を適用することが可能となる。
尚、本発明に係る抗老化化粧品に含まれるブドウ種子由来抗老化成分の形態は特に限定されないが、皮膚に浸透しやすいという観点から、多重層のマイクロカプセル状であることが望ましい。
本発明の抗老化化粧品は、美白剤、活性酸素除去剤、抗酸化剤、紫外線防止剤等、通常使用されている添加剤を適宜配合して常法により製造することができる。
本発明の抗老化健康食品及び抗老化化粧品におけるブドウ種子由来抗老化成分の摂取量は限定されるものではないが、優れた抗老化作用を奏するという観点から、少なくとも１日の摂取量が５０ｍｇ以上であることが望ましい。
本発明の抗老化健康食品及び抗老化化粧品におけるブドウ種子由来抗老化成分の１日の摂取量が５０ｍｇ未満であると、抗老化作用を十分に発揮できない虞があるため望ましくない。
また、本発明の抗老化健康食品及び抗老化化粧品におけるブドウ種子由来抗老化成分を、１日あたり７５００ｍｇ（体重６０キログラム）を超えて摂取しても効果の上昇率は小さい。
それゆえに、本発明の抗老化健康食品及び抗老化化粧品におけるブドウ種子由来抗老化成分は、１日あたり５０ｍｇ〜７５００ｍｇ摂取することが望ましい。
尚、本発明の抗老化健康食品及び抗老化化粧品には、適宜用途に応じて、賦形剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、キレート剤、安定化剤等を配合しても良い。
本発明の抗老化健康食品及び抗老化化粧品におけるブドウ種子由来抗老化成分の１日の摂取量が５０ｍｇ未満であると、抗老化作用を十分に発揮できない虞があるため望ましくない。
また、本発明の抗老化健康食品及び抗老化化粧品におけるブドウ種子由来抗老化成分を、１日あたり７５００ｍｇ（体重６０キログラム）を超えて摂取しても効果の上昇率は小さい。
それゆえに、本発明の抗老化健康食品及び抗老化化粧品におけるブドウ種子由来抗老化成分は、１日あたり５０ｍｇ〜７５００ｍｇ摂取することが望ましい。
尚、本発明の抗老化健康食品及び抗老化化粧品には、適宜用途に応じて、賦形剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、キレート剤、安定化剤等を配合しても良い。
また、本発明の抗老化健康食品及び抗老化化粧品に含まれるブドウ種子由来抗老化成分の体重１ｋｇあたりの摂取量は、特に限定されないが、優れた抗老化作用を奏するという観点から、例えば、０．８〜１２５ｍｇ／ｋｇ／日であることが望ましい。
本発明の抗老化健康食品及び抗老化化粧品におけるブドウ種子由来抗老化成分の体重１ｋｇあたりの摂取量が０．８ｍｇ／ｋｇ／日未満であると、抗老化作用を十分に発揮できない虞があるため望ましくない。
また、本発明の抗老化健康食品及び抗老化化粧品におけるブドウ種子由来抗老化成分を、１２５ｍｇ／ｋｇ／日を超えて摂取してもそれ以上効果が変わらない。
それゆえに、本発明の抗老化健康食品及び抗老化化粧品におけるブドウ種子由来抗老化成分は、０．８〜１２５ｍｇ／ｋｇ／日で摂取することが望ましい。
本発明の抗老化健康食品及び抗老化化粧品におけるブドウ種子由来抗老化成分の体重１ｋｇあたりの摂取量が０．８ｍｇ／ｋｇ／日未満であると、抗老化作用を十分に発揮できない虞があるため望ましくない。
また、本発明の抗老化健康食品及び抗老化化粧品におけるブドウ種子由来抗老化成分を、１２５ｍｇ／ｋｇ／日を超えて摂取してもそれ以上効果が変わらない。
それゆえに、本発明の抗老化健康食品及び抗老化化粧品におけるブドウ種子由来抗老化成分は、０．８〜１２５ｍｇ／ｋｇ／日で摂取することが望ましい。
本発明に係る抗老化健康食品及び化粧品並びにブドウ種子由来抗老化成分について、以下の実施例に基づいてさらに詳細に説明するが、本発明に係る抗老化健康食品及び化粧品並びにブドウ種子由来抗老化成分の製造方法は、実施例に限定されるものではない。
＜実施例１：ブドウ種子由来抗老化成分の製造＞
カベルネ・ソーヴィニヨンの種子を４０℃前後の水に４５〜６０時間浸漬させ、次いでこのブドウ種子を引き上げて室温（２５℃前後）で空気中に３〜５時間自然乾燥（室内保管）させた。
自然乾燥させたブドウ種子を、２５〜３０℃の水に６０〜８０分浸漬させ、次いでこのブドウ種子を引き上げて室温（約２５℃）で空気中に３時間自然乾燥（室内保管）させた。
この３０℃の水への浸漬と３時間の自然乾燥を３回繰り返し、乾燥させたブドウ種子を観察すると、約５〜１５％のブドウ種子の胚芽部分が、約１ｍｍ隆起していることを確認した。尚、上記手順を催芽処理と称する。
ブドウ種子の胚芽部分の隆起を確認した時点で催芽処理を終了し、遠赤外線乾燥機にて４５℃で３日間ブドウ種子をさらに乾燥させた。
３日間ブドウ種子を乾燥させた後、ミルを用いてブドウ種子を粉末化し、ブドウ種子粉末を得た。
カベルネ・ソーヴィニヨンの種子を４０℃前後の水に４５〜６０時間浸漬させ、次いでこのブドウ種子を引き上げて室温（２５℃前後）で空気中に３〜５時間自然乾燥（室内保管）させた。
自然乾燥させたブドウ種子を、２５〜３０℃の水に６０〜８０分浸漬させ、次いでこのブドウ種子を引き上げて室温（約２５℃）で空気中に３時間自然乾燥（室内保管）させた。
この３０℃の水への浸漬と３時間の自然乾燥を３回繰り返し、乾燥させたブドウ種子を観察すると、約５〜１５％のブドウ種子の胚芽部分が、約１ｍｍ隆起していることを確認した。尚、上記手順を催芽処理と称する。
ブドウ種子の胚芽部分の隆起を確認した時点で催芽処理を終了し、遠赤外線乾燥機にて４５℃で３日間ブドウ種子をさらに乾燥させた。
３日間ブドウ種子を乾燥させた後、ミルを用いてブドウ種子を粉末化し、ブドウ種子粉末を得た。
次いで、水１００重量部に対しブドウ種子粉末を５０重量部添加し、水に溶解した画分を抽出し、ブドウ種子由来抗老化成分を得た。
得られたブドウ種子由来抗老化成分を減圧乾燥させた後、ミルにて粉末化し、粉末化したブドウ種子由来抗老化成分を得た。
得られたブドウ種子由来抗老化成分を減圧乾燥させた後、ミルにて粉末化し、粉末化したブドウ種子由来抗老化成分を得た。
粉末化したブドウ種子由来抗老化成分に含まれるポリフェノール類の総量を定量した。
ポリフェノールの総量は、ＡＯＡＣ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌの公定法（ＡＯＡＣ ｏｆｆｉｃｉａｌ ｍｅｔｈｏｄ ９５２．０３、１５ｔｈ Ｅｄ）（フォーリン・デニス（Ｆｏｌｉｎ・Ｄｅｎｉｓ）法とも称す）を用いて定量した。
フォーリン・デニス法は、アルカリ性においてフェノール性水酸基がリンタングステン酸、モリブデン酸を還元して生ずる青色（７００〜７７０ｎｍの波長）を分光光度計で測定することにより、ポリフェノール類の総量を定量する。
定量の結果、ブドウ種子由来抗老化成分は、ポリフェノールを６９重量％含有していることがわかった。
また、ブドウ種子由来抗老化成分に含まれるポリフェノールの内の７１重量％（すなわち、ブドウ種子由来抗老化成分の４９重量％）がプロアントシアニジン重合体であることを確認した。
ポリフェノールの総量は、ＡＯＡＣ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌの公定法（ＡＯＡＣ ｏｆｆｉｃｉａｌ ｍｅｔｈｏｄ ９５２．０３、１５ｔｈ Ｅｄ）（フォーリン・デニス（Ｆｏｌｉｎ・Ｄｅｎｉｓ）法とも称す）を用いて定量した。
フォーリン・デニス法は、アルカリ性においてフェノール性水酸基がリンタングステン酸、モリブデン酸を還元して生ずる青色（７００〜７７０ｎｍの波長）を分光光度計で測定することにより、ポリフェノール類の総量を定量する。
定量の結果、ブドウ種子由来抗老化成分は、ポリフェノールを６９重量％含有していることがわかった。
また、ブドウ種子由来抗老化成分に含まれるポリフェノールの内の７１重量％（すなわち、ブドウ種子由来抗老化成分の４９重量％）がプロアントシアニジン重合体であることを確認した。
以下、本実施例により調製したブドウ種子由来抗老化成分を実施例と称し、比較対象として用いるレスベラトロール（ＳＩＧＭＡ社製、製品番号：Ｒ５０１０）を比較例と称する。
以下、実施例３〜５において、本発明に係るブドウ種子由来抗老化成分の抗老化作用を調べた。
以下、実施例３〜５において、本発明に係るブドウ種子由来抗老化成分の抗老化作用を調べた。
＜実施例２：正常ヒト線維芽細胞、実施例、及び比較例の調製＞
・正常ヒト線維芽細胞の調製
まず、各試験に使用する正常ヒト線維芽細胞を調製した。
正常ヒト線維芽細胞（クラボウ社製、製品番号：ＫＦ−４１０９）を起眠後に基本培地（ＤＭＥＭ（ナカライテスク社製、製品番号：０８４５６−６５）、１０％ＦＢＳ（ＢｉｏＷｅｓｔ社製、製品番号：Ｓ１８２０、Ｌｏｔ Ｎｏ．５１６５３６）、１％抗生物質（ペニシリン−ストレプトマイシン混合溶液（ナカライテスク社製、製品番号：２６２５３−８４）））中で、ＣＯ２インキューベーター内（５％ＣＯ２、３７℃）で必要細胞数に達するまで培養した。
培養後、正常ヒト線維芽細胞をトリプシン／ＥＤＴＡ（２．５グラム／１−トリプシン／１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ溶液（ナカライテスク社製、製品番号：３２７７７−４４））を用いて剥離し、細胞数を計測した後、細胞を各試験に使用した。
・正常ヒト線維芽細胞の調製
まず、各試験に使用する正常ヒト線維芽細胞を調製した。
正常ヒト線維芽細胞（クラボウ社製、製品番号：ＫＦ−４１０９）を起眠後に基本培地（ＤＭＥＭ（ナカライテスク社製、製品番号：０８４５６−６５）、１０％ＦＢＳ（ＢｉｏＷｅｓｔ社製、製品番号：Ｓ１８２０、Ｌｏｔ Ｎｏ．５１６５３６）、１％抗生物質（ペニシリン−ストレプトマイシン混合溶液（ナカライテスク社製、製品番号：２６２５３−８４）））中で、ＣＯ２インキューベーター内（５％ＣＯ２、３７℃）で必要細胞数に達するまで培養した。
培養後、正常ヒト線維芽細胞をトリプシン／ＥＤＴＡ（２．５グラム／１−トリプシン／１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ溶液（ナカライテスク社製、製品番号：３２７７７−４４））を用いて剥離し、細胞数を計測した後、細胞を各試験に使用した。
・実施例及び比較例の調製
次に、実施例及び比較例を調製した。
実施例及び比較例を夫々秤量し、１％（ｗ／ｖ）濃度となるように基本培地に溶解した。
溶解後、不溶性物質を除去するために、基本培地に溶解した実施例及び比較例を夫々遠心分離（１２０，０００ｒｐｍ（２，０００ｓ−１）、１０分）した。
遠心分離後、上清を回収し、滅菌フィルターを用いて濾過滅菌したものを各試験に使用した。
次に、実施例及び比較例を調製した。
実施例及び比較例を夫々秤量し、１％（ｗ／ｖ）濃度となるように基本培地に溶解した。
溶解後、不溶性物質を除去するために、基本培地に溶解した実施例及び比較例を夫々遠心分離（１２０，０００ｒｐｍ（２，０００ｓ−１）、１０分）した。
遠心分離後、上清を回収し、滅菌フィルターを用いて濾過滅菌したものを各試験に使用した。
＜実施例３：抗老化作用確認試験＞
実施例及び比較例の抗老化作用を、細胞の老化マーカーとして広く用いられているβ−ガラクトシダーゼ（ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ；ＳＡ−β−ｇａｌ）活性を測定することにより確認した。
ＳＡ−β−ｇａｌは老化細胞において過剰発現が認められ、この老化マーカーにより測定された細胞の老化現象は、培養細胞だけでなく、生体内でも起こっていることが確認されている。
抗老化作用確認試験によって確認された老化細胞の量は、抗老化作用の総合的な指標として、抗老化の効果を最も具体的に表す。
実施例及び比較例の抗老化作用を、細胞の老化マーカーとして広く用いられているβ−ガラクトシダーゼ（ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ；ＳＡ−β−ｇａｌ）活性を測定することにより確認した。
ＳＡ−β−ｇａｌは老化細胞において過剰発現が認められ、この老化マーカーにより測定された細胞の老化現象は、培養細胞だけでなく、生体内でも起こっていることが確認されている。
抗老化作用確認試験によって確認された老化細胞の量は、抗老化作用の総合的な指標として、抗老化の効果を最も具体的に表す。
（試験手順）
基本培地で調製した正常ヒト線維芽細胞を、１×１０４ｃｅｌｌｓ／０．１ｍｌ／ウェルとなるように、９６ウェルプレート（蛍光観察用ブラックプレート（住友ベークライト社製、製品番号：ＭＳ−８０９６Ｆ））に播種して２４時間培養した。
培養後、培養上清を以下の異なる条件の培地で夫々置換し、正常ヒト線維芽細胞を再度培養した。
基本培地で調製した正常ヒト線維芽細胞を、１×１０４ｃｅｌｌｓ／０．１ｍｌ／ウェルとなるように、９６ウェルプレート（蛍光観察用ブラックプレート（住友ベークライト社製、製品番号：ＭＳ−８０９６Ｆ））に播種して２４時間培養した。
培養後、培養上清を以下の異なる条件の培地で夫々置換し、正常ヒト線維芽細胞を再度培養した。
各培地の条件は以下の通りであり、各条件で培養した細胞を夫々実施例１〜３、比較例１、及びコントロールと称する。
実施例１：本発明に係るブドウ種子由来抗老化成分を０．００２重量％含む基本培地
実施例２：本発明に係るブドウ種子由来抗老化成分を０．０１重量％含む基本培地
実施例３：本発明に係るブドウ種子由来抗老化成分を０．０５重量％含む基本培地
比較例１：レスベラトロールを０．００２３重量％含む基本培地
コントロール：基本培地（本発明に係るブドウ種子由来抗老化成分及びレスベラトロールを含まない）
以降、実施例４〜５においても、上記実施例１〜３、比較例１、及びコントロールを用いた。
尚、比較例１におけるレスベラトロールの濃度を０．００２３重量％とした理由は、レスベラトロールの濃度を０．００２３重量％より大きくすると、後述するネクローシス測定試験において、ネクローシス細胞の量が増えすぎてしまい、正確な測定が困難となるためである。
実施例１：本発明に係るブドウ種子由来抗老化成分を０．００２重量％含む基本培地
実施例２：本発明に係るブドウ種子由来抗老化成分を０．０１重量％含む基本培地
実施例３：本発明に係るブドウ種子由来抗老化成分を０．０５重量％含む基本培地
比較例１：レスベラトロールを０．００２３重量％含む基本培地
コントロール：基本培地（本発明に係るブドウ種子由来抗老化成分及びレスベラトロールを含まない）
以降、実施例４〜５においても、上記実施例１〜３、比較例１、及びコントロールを用いた。
尚、比較例１におけるレスベラトロールの濃度を０．００２３重量％とした理由は、レスベラトロールの濃度を０．００２３重量％より大きくすると、後述するネクローシス測定試験において、ネクローシス細胞の量が増えすぎてしまい、正確な測定が困難となるためである。
正常ヒト線維芽細胞を上記各条件で夫々最大２１日間培養した。
培地は２〜３日毎に交換した。
培養終了後、培養上清を除去した後、ＰＢＳ（日水製薬株式会社製、製品番号：０５９１３）で細胞を２回洗浄した。
洗浄した正常ヒト線維芽細胞に、１０００倍希釈したＢａｆｉｌｏｍｙｃｉｎ Ａ１を含む基本培地を添加し、６０分間、３７℃で正常ヒト線維芽細胞を培養した。
培養後、１０００倍希釈したＳＰｉＤＥＲ−β Ｇａｌ ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、及び１００倍希釈した核染色用試薬であるＨｏｅｃｈｉｓｔ ３３３４２ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（同仁化学研究所社製、製品番号：３４６−０７９５１）を含む基本培地を培養液に添加し、３０分間、３７℃で正常ヒト線維芽細胞を更に培養した。
培養後、基本培地で正常ヒト線維芽細胞を洗浄した。
洗浄後、基本培地を正常ヒト線維芽細胞に添加し、蛍光顕微鏡（キーエンス社製、製品名：ＢＺ−Ｘ７０００）下で核染色（生細胞）及び老化細胞の染色画像を撮影した。
各蛍光観察画像から老化細胞の量を算出した。
尚、上記Ｂａｆｉｌｏｍｙｃｉｎ Ａ１及びＳＰｉＤＥＲ−β Ｇａｌ ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎは、Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ−ＳＰｉＤＥＲ−βＧａｌ（同仁化学研究所社製、製品番号：ＳＧ０３）のものを用いた。
培地は２〜３日毎に交換した。
培養終了後、培養上清を除去した後、ＰＢＳ（日水製薬株式会社製、製品番号：０５９１３）で細胞を２回洗浄した。
洗浄した正常ヒト線維芽細胞に、１０００倍希釈したＢａｆｉｌｏｍｙｃｉｎ Ａ１を含む基本培地を添加し、６０分間、３７℃で正常ヒト線維芽細胞を培養した。
培養後、１０００倍希釈したＳＰｉＤＥＲ−β Ｇａｌ ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、及び１００倍希釈した核染色用試薬であるＨｏｅｃｈｉｓｔ ３３３４２ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（同仁化学研究所社製、製品番号：３４６−０７９５１）を含む基本培地を培養液に添加し、３０分間、３７℃で正常ヒト線維芽細胞を更に培養した。
培養後、基本培地で正常ヒト線維芽細胞を洗浄した。
洗浄後、基本培地を正常ヒト線維芽細胞に添加し、蛍光顕微鏡（キーエンス社製、製品名：ＢＺ−Ｘ７０００）下で核染色（生細胞）及び老化細胞の染色画像を撮影した。
各蛍光観察画像から老化細胞の量を算出した。
尚、上記Ｂａｆｉｌｏｍｙｃｉｎ Ａ１及びＳＰｉＤＥＲ−β Ｇａｌ ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎは、Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ−ＳＰｉＤＥＲ−βＧａｌ（同仁化学研究所社製、製品番号：ＳＧ０３）のものを用いた。
（結果）
図１は、実施例１〜３、比較例１、コントロールにおいて算出した老化細胞の量を示すグラフである。
図１の（ａ）は７日間培養した細胞における老化細胞の量、図１の（ｂ）は１４日間培養した細胞における老化細胞の量、図１の（ｃ）は２１日間培養した細胞における老化細胞の量を示している。
尚、図１において、コントロールにおける老化細胞の量を１００％とし、実施例１〜３及び比較例の老化細胞の量はコントロールにおける老化細胞の量に対する割合で示している。
図１は、実施例１〜３、比較例１、コントロールにおいて算出した老化細胞の量を示すグラフである。
図１の（ａ）は７日間培養した細胞における老化細胞の量、図１の（ｂ）は１４日間培養した細胞における老化細胞の量、図１の（ｃ）は２１日間培養した細胞における老化細胞の量を示している。
尚、図１において、コントロールにおける老化細胞の量を１００％とし、実施例１〜３及び比較例の老化細胞の量はコントロールにおける老化細胞の量に対する割合で示している。
７日間培養した比較例１は、コントロールと比べて、老化細胞の量は５１９％であった（図１の（ａ）参照）。
一方、コントロールと比べて、７日間培養した実施例１の老化細胞の量は８５％、実施例２の老化細胞の量は１３７％、実施例３の老化細胞の量は７３％であった（図１の（ａ）参照）。
１４日間培養した比較例１は、コントロールと比べて、老化細胞の量は１０２％であった（図１の（ｂ）参照）。
一方、コントロールと比べて、１４日間培養した実施例１の老化細胞の量は１１％、実施例２の老化細胞の量は９％、実施例３の老化細胞の量は７％であった（図１の（ｂ）参照）。
２１日間培養した比較例１は、コントロールと比べて、老化細胞の量は６４％であった（図１の（ｃ）参照）。
一方、コントロールと比べて、２１日間培養した実施例１の老化細胞の量は４％、実施例２の老化細胞の量は３％、実施例３の老化細胞の量は２％であった（図１の（ｃ）参照）。
一方、コントロールと比べて、７日間培養した実施例１の老化細胞の量は８５％、実施例２の老化細胞の量は１３７％、実施例３の老化細胞の量は７３％であった（図１の（ａ）参照）。
１４日間培養した比較例１は、コントロールと比べて、老化細胞の量は１０２％であった（図１の（ｂ）参照）。
一方、コントロールと比べて、１４日間培養した実施例１の老化細胞の量は１１％、実施例２の老化細胞の量は９％、実施例３の老化細胞の量は７％であった（図１の（ｂ）参照）。
２１日間培養した比較例１は、コントロールと比べて、老化細胞の量は６４％であった（図１の（ｃ）参照）。
一方、コントロールと比べて、２１日間培養した実施例１の老化細胞の量は４％、実施例２の老化細胞の量は３％、実施例３の老化細胞の量は２％であった（図１の（ｃ）参照）。
これらの結果より、レスベラトロールは、培養７日目の細胞においてコントロールよりも老化細胞の量が多く、細胞の老化を促進させたことがわかった。そのため、レスベラトロールは、短期的に老化を促進する作用があることが考えられる。
また、培養２１日目の細胞においてはコントロールと比較して６４％程度に老化細胞の量を抑制しており、細胞の老化を抑制していることがわかった。
一方、本発明に係るブドウ種子由来抗老化成分は、培養７日目の細胞において平均してコントロールと同じ程度の老化細胞の量を示したが、培養２１日目の細胞においてコントロールと比較して２％〜４％程度に老化細胞の量を抑制しており、レスベラトロールよりもよりはるかに強力に細胞の老化を抑制していた。
それゆえに、本発明に係るブドウ種子由来抗老化成分は、レスベラトロールと比較しても、優れた抗老化作用を備えており、このブドウ種子由来抗老化成分を含有する本発明に係る抗老化健康食品及び化粧品も優れた抗老化作用を備えていることがわかった。
また、培養２１日目の細胞においてはコントロールと比較して６４％程度に老化細胞の量を抑制しており、細胞の老化を抑制していることがわかった。
一方、本発明に係るブドウ種子由来抗老化成分は、培養７日目の細胞において平均してコントロールと同じ程度の老化細胞の量を示したが、培養２１日目の細胞においてコントロールと比較して２％〜４％程度に老化細胞の量を抑制しており、レスベラトロールよりもよりはるかに強力に細胞の老化を抑制していた。
それゆえに、本発明に係るブドウ種子由来抗老化成分は、レスベラトロールと比較しても、優れた抗老化作用を備えており、このブドウ種子由来抗老化成分を含有する本発明に係る抗老化健康食品及び化粧品も優れた抗老化作用を備えていることがわかった。
＜実施例４：ミトコンドリアの量及び一定量のミトコンドリアの負担すべき仕事量の測定試験＞
上記抗老化作用確認試験に続いて、実施例及び比較例の、細胞内におけるミトコンドリアの量及び一定量のミトコンドリアの負担すべき仕事量に対する作用を確認した。
従来から、レスベラトロールは、ミトコンドリアの量や一定量のミトコンドリアの負担すべき仕事量に作用することにより、その抗老化作用を奏すると考えられているため、本発明に係るブドウ種子由来抗老化成分のミトコンドリアの量や一定量のミトコンドリアの負担すべき仕事量への作用を確認した。
上記抗老化作用確認試験に続いて、実施例及び比較例の、細胞内におけるミトコンドリアの量及び一定量のミトコンドリアの負担すべき仕事量に対する作用を確認した。
従来から、レスベラトロールは、ミトコンドリアの量や一定量のミトコンドリアの負担すべき仕事量に作用することにより、その抗老化作用を奏すると考えられているため、本発明に係るブドウ種子由来抗老化成分のミトコンドリアの量や一定量のミトコンドリアの負担すべき仕事量への作用を確認した。
ミトコンドリアの量は、細胞中のミトコンドリアを選択的に標識できるＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｏｎ−Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、製品番号：Ｍ７５１２）を用いて測定した。
一定量のミトコンドリアの負担すべき仕事量は、ＭＴＴアッセイにより測定した。ＭＴＴアッセイの対象は、ミトコンドリアの脱水素酵素活性のみであるため、ＭＴＴアッセイの結果は一定量のミトコンドリアの負担すべき仕事量を反映する。
一定量のミトコンドリアの負担すべき仕事量は、ＭＴＴアッセイにより測定した。ＭＴＴアッセイの対象は、ミトコンドリアの脱水素酵素活性のみであるため、ＭＴＴアッセイの結果は一定量のミトコンドリアの負担すべき仕事量を反映する。
（試験手順）
実施例２において培養した正常ヒト線維芽細胞の培養上清を除去した後、ＰＢＳ（日水製薬株式会社製、製品番号：０５９１３）で正常ヒト線維芽細胞を２回洗浄した。
洗浄した細胞に１０００倍希釈したＨｏｅｃｈｉｓｔ ３３３４２ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（同仁化学研究所社製、製品番号：３４６−０７９５１）及び２０００倍希釈したＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｏｎ−Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、製品番号：Ｍ７５１２）を含む基本培地を添加し、３０分間、３７℃で正常ヒト線維芽細胞を培養した。
培養後、培養上清を除去した後、ＰＢＳ（日水製薬株式会社製、製品番号：０５９１３）で正常ヒト線維芽細胞を２回洗浄した。
洗浄後、ＰＢＳ（日水製薬株式会社製、製品番号：０５９１３）を新たに正常ヒト線維芽細胞に添加し、蛍光顕微鏡（キーエンス社製、製品名：ＢＺ−Ｘ７０００）下で核染色（生細胞）及びミトコンドリア染色画像を撮影した。
撮影後、蛍光プレートリーダー（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、製品名：ＶＡＲＩＯＳＫＡＮ ＦＬＡＳＨ）にて各蛍光強度（Ｈｏｅｃｈｉｓ：励起波長３５６ｎｍ、蛍光波長４６５ｎｍ、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ：励起波長５７９ｎｍ、蛍光波長５９９ｎｍ）を測定した。
実施例２において培養した正常ヒト線維芽細胞の培養上清を除去した後、ＰＢＳ（日水製薬株式会社製、製品番号：０５９１３）で正常ヒト線維芽細胞を２回洗浄した。
洗浄した細胞に１０００倍希釈したＨｏｅｃｈｉｓｔ ３３３４２ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（同仁化学研究所社製、製品番号：３４６−０７９５１）及び２０００倍希釈したＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｏｎ−Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、製品番号：Ｍ７５１２）を含む基本培地を添加し、３０分間、３７℃で正常ヒト線維芽細胞を培養した。
培養後、培養上清を除去した後、ＰＢＳ（日水製薬株式会社製、製品番号：０５９１３）で正常ヒト線維芽細胞を２回洗浄した。
洗浄後、ＰＢＳ（日水製薬株式会社製、製品番号：０５９１３）を新たに正常ヒト線維芽細胞に添加し、蛍光顕微鏡（キーエンス社製、製品名：ＢＺ−Ｘ７０００）下で核染色（生細胞）及びミトコンドリア染色画像を撮影した。
撮影後、蛍光プレートリーダー（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、製品名：ＶＡＲＩＯＳＫＡＮ ＦＬＡＳＨ）にて各蛍光強度（Ｈｏｅｃｈｉｓ：励起波長３５６ｎｍ、蛍光波長４６５ｎｍ、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ：励起波長５７９ｎｍ、蛍光波長５９９ｎｍ）を測定した。
蛍光強度を測定した後、上清を除去し、ＰＢＳ（日水製薬株式会社製、製品番号：０５９１３）で正常ヒト線維芽細胞を１回洗浄した。
正常ヒト線維芽細胞を洗浄した後、０．５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ（Ｔｈｉａｚｏｌｙｌ Ｂｌｕｅ Ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ Ｂｒｏｍｉｄｅ（ＳＩＧＭＡ社製、製品番号：Ｍ５６５５−１Ｇ））を含むＰＢＳに置換（１００μｌ／ウェル）し、５時間、３７℃にて反応させた。
反応後、各ウェルに０．０１ＭのＨＣｌ（ＳＩＧＭＡ社製、製品番号：１３−１６９０）１０％ＳＤＳ（和光純薬工業社製、製品番号：１９１−０７１４５）を１００μｌ添加し、室温にて２４時間反応させた。
反応後、ＭＴＴのホルマゾンを溶解した。
ホルマゾンを溶解した後、プレートリーダー（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、製品名：ＶＡＲＩＯＳＫＡＮ ＦＬＡＳＨ）にて吸光度（測定波長５５０ｎｍ、参照波長６６０ｎｍ）を測定した。
正常ヒト線維芽細胞を洗浄した後、０．５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ（Ｔｈｉａｚｏｌｙｌ Ｂｌｕｅ Ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ Ｂｒｏｍｉｄｅ（ＳＩＧＭＡ社製、製品番号：Ｍ５６５５−１Ｇ））を含むＰＢＳに置換（１００μｌ／ウェル）し、５時間、３７℃にて反応させた。
反応後、各ウェルに０．０１ＭのＨＣｌ（ＳＩＧＭＡ社製、製品番号：１３−１６９０）１０％ＳＤＳ（和光純薬工業社製、製品番号：１９１−０７１４５）を１００μｌ添加し、室温にて２４時間反応させた。
反応後、ＭＴＴのホルマゾンを溶解した。
ホルマゾンを溶解した後、プレートリーダー（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、製品名：ＶＡＲＩＯＳＫＡＮ ＦＬＡＳＨ）にて吸光度（測定波長５５０ｎｍ、参照波長６６０ｎｍ）を測定した。
（結果）
図２は、実施例１〜３、比較例１、コントロールにおいて測定されたミトコンドリアの量を示すグラフである。
図２の（ａ）は７日間培養した細胞におけるミトコンドリアの量、図２の（ｂ）は１４日間培養した細胞におけるミトコンドリアの量、図２の（ｃ）は２１日間培養した細胞におけるミトコンドリアの量を示している。
尚、図２において、コントロールにおけるミトコンドリアの量を１００％とし、実施例１〜３及び比較例のミトコンドリアの量はコントロールにおけるミトコンドリアの量に対する割合で示している。
図２は、実施例１〜３、比較例１、コントロールにおいて測定されたミトコンドリアの量を示すグラフである。
図２の（ａ）は７日間培養した細胞におけるミトコンドリアの量、図２の（ｂ）は１４日間培養した細胞におけるミトコンドリアの量、図２の（ｃ）は２１日間培養した細胞におけるミトコンドリアの量を示している。
尚、図２において、コントロールにおけるミトコンドリアの量を１００％とし、実施例１〜３及び比較例のミトコンドリアの量はコントロールにおけるミトコンドリアの量に対する割合で示している。
７日間培養した比較例１は、コントロールと比べて、ミトコンドリアの量は１９１％であった（図２の（ａ）参照）。
一方、コントロールと比べて、７日間培養した実施例１のミトコンドリアの量は１１６％、実施例２のミトコンドリアの量は１２６％、実施例３のミトコンドリアの量は１４３％であった（図２の（ａ）参照）。
１４日間培養した比較例１は、コントロールと比べて、ミトコンドリアの量は２２８％であった（図２の（ｂ）参照）。
一方、コントロールと比べて、１４日間培養した実施例１のミトコンドリアの量は１２３％、実施例２のミトコンドリアの量は１２８％、実施例３のミトコンドリアの量は１７２％であった（図２の（ｂ）参照）。
２１日間培養した比較例１は、コントロールと比べて、ミトコンドリアの量は２４６％であった（図２の（ｃ）参照）。
一方、コントロールと比べて、２１日間培養した実施例１のミトコンドリアの量は１１５％、実施例２のミトコンドリアの量は１２４％、実施例３のミトコンドリアの量は１７８％であった（図２の（ｃ）参照）。
一方、コントロールと比べて、７日間培養した実施例１のミトコンドリアの量は１１６％、実施例２のミトコンドリアの量は１２６％、実施例３のミトコンドリアの量は１４３％であった（図２の（ａ）参照）。
１４日間培養した比較例１は、コントロールと比べて、ミトコンドリアの量は２２８％であった（図２の（ｂ）参照）。
一方、コントロールと比べて、１４日間培養した実施例１のミトコンドリアの量は１２３％、実施例２のミトコンドリアの量は１２８％、実施例３のミトコンドリアの量は１７２％であった（図２の（ｂ）参照）。
２１日間培養した比較例１は、コントロールと比べて、ミトコンドリアの量は２４６％であった（図２の（ｃ）参照）。
一方、コントロールと比べて、２１日間培養した実施例１のミトコンドリアの量は１１５％、実施例２のミトコンドリアの量は１２４％、実施例３のミトコンドリアの量は１７８％であった（図２の（ｃ）参照）。
これらの結果より、レスベラトロールは、ミトコンドリアの量を増加させる作用を備えていることがわかった。
また、本発明に係るブドウ種子由来抗老化成分も、ミトコンドリアの量を増加させる作用を備えていることがわかった。
また、本発明に係るブドウ種子由来抗老化成分も、ミトコンドリアの量を増加させる作用を備えていることがわかった。
図３は、実施例１〜３、比較例１、コントロールにおいて測定された一定量のミトコンドリアの負担すべき仕事量を示すグラフである。
図３の（ａ）は７日間培養した細胞における一定量のミトコンドリアの負担すべき仕事量、図３の（ｂ）は１４日間培養した細胞における一定量のミトコンドリアの負担すべき仕事量、図３の（ｃ）は２１日間培養した細胞における一定量のミトコンドリアの負担すべき仕事量を示している。
尚、図３において、コントロールにおける一定量のミトコンドリアの負担すべき仕事量を１００とし、実施例１〜３及び比較例の一定量のミトコンドリアの負担すべき仕事量はコントロールにおける一定量のミトコンドリアの負担すべき仕事量に対する割合で示している。
図３の（ａ）は７日間培養した細胞における一定量のミトコンドリアの負担すべき仕事量、図３の（ｂ）は１４日間培養した細胞における一定量のミトコンドリアの負担すべき仕事量、図３の（ｃ）は２１日間培養した細胞における一定量のミトコンドリアの負担すべき仕事量を示している。
尚、図３において、コントロールにおける一定量のミトコンドリアの負担すべき仕事量を１００とし、実施例１〜３及び比較例の一定量のミトコンドリアの負担すべき仕事量はコントロールにおける一定量のミトコンドリアの負担すべき仕事量に対する割合で示している。
７日間培養した比較例１は、コントロールと比べて、一定量のミトコンドリアの負担すべき仕事量が２２％であった（図３の（ａ）参照）。
一方、コントロールと比べて、７日間培養した実施例１の一定量のミトコンドリアの負担すべき仕事量は７４％、実施例２の一定量のミトコンドリアの負担すべき仕事量は５８％、実施例３の一定量のミトコンドリアの負担すべき仕事量は３８％であった（図３の（ａ）参照）。
１４日間培養した比較例１は、コントロールと比べて、一定量のミトコンドリアの負担すべき仕事量が２０％であった（図３の（ｂ）参照）。
一方、コントロールと比べて、１４日間培養した実施例１の一定量のミトコンドリアの負担すべき仕事量は７７％、実施例２の一定量のミトコンドリアの負担すべき仕事量は６３％、実施例３の一定量のミトコンドリアの負担すべき仕事量は３４％であった（図３の（ｂ）参照）。
２１日間培養した比較例１は、コントロールと比べて、一定量のミトコンドリアの負担すべき仕事量が４９％であった（図３の（ｃ）参照）。
一方、コントロールと比べて、２１日間培養した実施例１の一定量のミトコンドリアの負担すべき仕事量は８８％、実施例２の一定量のミトコンドリアの負担すべき仕事量は７６％、実施例３の一定量のミトコンドリアの負担すべき仕事量は６２％であった（図３の（ｃ）参照）。
一方、コントロールと比べて、７日間培養した実施例１の一定量のミトコンドリアの負担すべき仕事量は７４％、実施例２の一定量のミトコンドリアの負担すべき仕事量は５８％、実施例３の一定量のミトコンドリアの負担すべき仕事量は３８％であった（図３の（ａ）参照）。
１４日間培養した比較例１は、コントロールと比べて、一定量のミトコンドリアの負担すべき仕事量が２０％であった（図３の（ｂ）参照）。
一方、コントロールと比べて、１４日間培養した実施例１の一定量のミトコンドリアの負担すべき仕事量は７７％、実施例２の一定量のミトコンドリアの負担すべき仕事量は６３％、実施例３の一定量のミトコンドリアの負担すべき仕事量は３４％であった（図３の（ｂ）参照）。
２１日間培養した比較例１は、コントロールと比べて、一定量のミトコンドリアの負担すべき仕事量が４９％であった（図３の（ｃ）参照）。
一方、コントロールと比べて、２１日間培養した実施例１の一定量のミトコンドリアの負担すべき仕事量は８８％、実施例２の一定量のミトコンドリアの負担すべき仕事量は７６％、実施例３の一定量のミトコンドリアの負担すべき仕事量は６２％であった（図３の（ｃ）参照）。
これらの結果より、レスベラトロールは、一定量のミトコンドリアの負担すべき仕事量を減少させる作用を備えていることがわかった。
また、本発明に係るブドウ種子由来抗老化成分も、一定量のミトコンドリアの負担すべき仕事量を減少させる作用を備えていることがわかった。
また、本発明に係るブドウ種子由来抗老化成分も、一定量のミトコンドリアの負担すべき仕事量を減少させる作用を備えていることがわかった。
実施例４の結果より、本発明に係るブドウ種子由来抗老化成分は、ミトコンドリアの量を増加させ、一定量のミトコンドリアの負担すべき仕事量を減少させる作用を備えていることがわかった。
ミトコンドリアの量が増加することにより、一定量のミトコンドリアにおいて生産すべきＡＴＰの量（すなわち、仕事量）は減少する。実施例４において確認された一定の量のミトコンドリアの負担すべき仕事量の減少は、ミトコンドリアの量が増加し、一定量のミトコンドリアあたりのＡＴＰの生産量が減少したためだと考えられる。
これにより、ミトコンドリアの処理能力に余裕ができ、ミトコンドリアによる活性酸素の生成量が減少し、且つ活性酸素を除去する酵素であるスーパーオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ）の生成量も増えるため、ミトコンドリア及び細胞のダメージにつながる活性酸素の量を低下させることができる。
活性酸素の約９０％はミトコンドリアによって生成されるため、本発明に係るブドウ種子由来抗老化成分により、ミトコンドリアによる活性酸素の生成量を減少させることで、細胞及び細胞からなる臓器等の損傷を防ぎ、抗老化作用を奏すると考えられる。
ミトコンドリアの量が増加することにより、一定量のミトコンドリアにおいて生産すべきＡＴＰの量（すなわち、仕事量）は減少する。実施例４において確認された一定の量のミトコンドリアの負担すべき仕事量の減少は、ミトコンドリアの量が増加し、一定量のミトコンドリアあたりのＡＴＰの生産量が減少したためだと考えられる。
これにより、ミトコンドリアの処理能力に余裕ができ、ミトコンドリアによる活性酸素の生成量が減少し、且つ活性酸素を除去する酵素であるスーパーオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ）の生成量も増えるため、ミトコンドリア及び細胞のダメージにつながる活性酸素の量を低下させることができる。
活性酸素の約９０％はミトコンドリアによって生成されるため、本発明に係るブドウ種子由来抗老化成分により、ミトコンドリアによる活性酸素の生成量を減少させることで、細胞及び細胞からなる臓器等の損傷を防ぎ、抗老化作用を奏すると考えられる。
＜実施例５：アポトーシス及びネクローシス測定試験＞
続いて、実施例及び比較例の、アポトーシス細胞の量及びネクローシス細胞の量に対する作用を確認した。
従来から、レスベラトロールは、アポトーシスを誘導することにより抗老化作用を奏すると考えられているため、本発明に係るブドウ種子由来抗老化成分のアポトーシス細胞の量に対する作用を確認した。
加えて、本発明に係るブドウ種子由来抗老化成分の、アポトーシスと同じ細胞死であるネクローシス細胞の量に対する作用も確認した。
続いて、実施例及び比較例の、アポトーシス細胞の量及びネクローシス細胞の量に対する作用を確認した。
従来から、レスベラトロールは、アポトーシスを誘導することにより抗老化作用を奏すると考えられているため、本発明に係るブドウ種子由来抗老化成分のアポトーシス細胞の量に対する作用を確認した。
加えて、本発明に係るブドウ種子由来抗老化成分の、アポトーシスと同じ細胞死であるネクローシス細胞の量に対する作用も確認した。
アポトーシス細胞の量は、従来からアポトーシスマーカーとして用いられているＡｎｎｅｘｉｎ Ｖを使用して測定した。より詳しくは、蛍光標識したＡｎｎｅｘｉｎ Ｖが、アポトーシス細胞の表面に多く出現するホスファチジルセリンに結合する性質を利用してアポトーシス細胞を選択的に蛍光染色することにより、アポトーシス細胞の量を測定した。
ネクローシス細胞の量は、従来からネクローシスマーカーとして用いられているエチジウムホモダイマーＩＩＩ（ＥｔｈＤ−ＩＩＩ）を使用して測定した。より詳しくは、ＥｔｈＤ−ＩＩＩが膜不透過性の核酸プローブであり、生細胞やアポトーシス細胞は染色されないが、ネクローシス細胞は強い赤色に染色する性質を利用することにより、ネクローシス細胞の量を測定した。
ネクローシス細胞の量は、従来からネクローシスマーカーとして用いられているエチジウムホモダイマーＩＩＩ（ＥｔｈＤ−ＩＩＩ）を使用して測定した。より詳しくは、ＥｔｈＤ−ＩＩＩが膜不透過性の核酸プローブであり、生細胞やアポトーシス細胞は染色されないが、ネクローシス細胞は強い赤色に染色する性質を利用することにより、ネクローシス細胞の量を測定した。
（実験手順）
実施例２において培養した正常ヒト線維芽細胞の培養上清を除去した後、ＰＢＳ（日水製薬株式会社製、製品番号：０５９１３）で正常ヒト線維芽細胞を２回洗浄した。
洗浄した正常ヒト線維芽細胞に１０００倍希釈したＨｏｅｃｈｉｓｔ ３３３４２ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（同仁化学研究所社製、製品番号：３４６−０７９５１）、２０倍希釈したＦＩＴＣ−Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ、及び２０倍希釈したＥｔｈＤ−ＩＩＩを含む１×Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒを添加し、３０分間、３７℃で正常ヒト線維芽細胞を培養した。
培養後、培養上清を除去した後、１×Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒにて正常ヒト線維芽細胞を２回洗浄した。
洗浄後、新たな１×Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒを正常ヒト線維芽細胞に添加し、蛍光顕微鏡下にて核染色（生細胞）、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ染色（アポトーシス）、及びＥｔｈＤ−ＩＩＩ染色（ネクローシス）画像を撮影した。
撮影した蛍光観察画像からアポトーシス細胞の量及びネクローシス細胞の量を算出した。
尚、本実施例で用いたＦＩＴＣ−Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ、ＥｔｈＤ−ＩＩＩ、及び１×Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒは、Ａｐｏｐｔｏｔｉｃ／Ｎｅｃｒｏｔｉｃ／Ｈｅａｌｔｈｙ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製、製品番号：Ｄ２５５１７）のものを用いた。
実施例２において培養した正常ヒト線維芽細胞の培養上清を除去した後、ＰＢＳ（日水製薬株式会社製、製品番号：０５９１３）で正常ヒト線維芽細胞を２回洗浄した。
洗浄した正常ヒト線維芽細胞に１０００倍希釈したＨｏｅｃｈｉｓｔ ３３３４２ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（同仁化学研究所社製、製品番号：３４６−０７９５１）、２０倍希釈したＦＩＴＣ−Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ、及び２０倍希釈したＥｔｈＤ−ＩＩＩを含む１×Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒを添加し、３０分間、３７℃で正常ヒト線維芽細胞を培養した。
培養後、培養上清を除去した後、１×Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒにて正常ヒト線維芽細胞を２回洗浄した。
洗浄後、新たな１×Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒを正常ヒト線維芽細胞に添加し、蛍光顕微鏡下にて核染色（生細胞）、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ染色（アポトーシス）、及びＥｔｈＤ−ＩＩＩ染色（ネクローシス）画像を撮影した。
撮影した蛍光観察画像からアポトーシス細胞の量及びネクローシス細胞の量を算出した。
尚、本実施例で用いたＦＩＴＣ−Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ、ＥｔｈＤ−ＩＩＩ、及び１×Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒは、Ａｐｏｐｔｏｔｉｃ／Ｎｅｃｒｏｔｉｃ／Ｈｅａｌｔｈｙ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製、製品番号：Ｄ２５５１７）のものを用いた。
（結果）
図４は、実施例１〜３、比較例１、コントロールにおいて測定されたアポトーシス細胞の量を示すグラフである。
図４の（ａ）は７日間培養した細胞におけるアポトーシス細胞の量、図４の（ｂ）は１４日間培養した細胞におけるアポトーシス細胞の量、図４の（ｃ）は２１日間培養した細胞におけるアポトーシス細胞の量を示している。
尚、図４において、コントロールにおけるアポトーシス細胞の量を１００％とし、実施例１〜３及び比較例のアポトーシス細胞の量はコントロールにおけるアポトーシス細胞の量に対する割合で示している。
図４は、実施例１〜３、比較例１、コントロールにおいて測定されたアポトーシス細胞の量を示すグラフである。
図４の（ａ）は７日間培養した細胞におけるアポトーシス細胞の量、図４の（ｂ）は１４日間培養した細胞におけるアポトーシス細胞の量、図４の（ｃ）は２１日間培養した細胞におけるアポトーシス細胞の量を示している。
尚、図４において、コントロールにおけるアポトーシス細胞の量を１００％とし、実施例１〜３及び比較例のアポトーシス細胞の量はコントロールにおけるアポトーシス細胞の量に対する割合で示している。
７日間培養した比較例１は、コントロールと比べて、アポトーシス細胞の量は２１８４％であった（図４の（ａ）参照）。
一方、コントロールと比べて、７日間培養した実施例１のアポトーシス細胞の量は１６４％、実施例２のアポトーシス細胞の量は１０２％、実施例１のアポトーシス細胞の量は４８３％であった（図４の（ａ）参照）。
１４日間培養した比較例１は、コントロールと比べて、アポトーシス細胞の量は１４００％であった（図４の（ｂ）参照）。
一方、コントロールと比べて、１４日間培養した実施例１のアポトーシス細胞の量は１０７％、実施例２のアポトーシス細胞の量は３１３％、実施例１のアポトーシス細胞の量は２２６％であった（図４の（ｂ）参照）。
２１日間培養した比較例１は、コントロールと比べて、アポトーシス細胞の量は４５２５％であった（図４の（ｃ）参照）。
一方、コントロールと比べて、２１日間培養した実施例１のアポトーシス細胞の量は５９％、実施例２のアポトーシス細胞の量は５５８％、実施例１のアポトーシス細胞の量は６６８％であった（図４の（ｃ）参照）。
一方、コントロールと比べて、７日間培養した実施例１のアポトーシス細胞の量は１６４％、実施例２のアポトーシス細胞の量は１０２％、実施例１のアポトーシス細胞の量は４８３％であった（図４の（ａ）参照）。
１４日間培養した比較例１は、コントロールと比べて、アポトーシス細胞の量は１４００％であった（図４の（ｂ）参照）。
一方、コントロールと比べて、１４日間培養した実施例１のアポトーシス細胞の量は１０７％、実施例２のアポトーシス細胞の量は３１３％、実施例１のアポトーシス細胞の量は２２６％であった（図４の（ｂ）参照）。
２１日間培養した比較例１は、コントロールと比べて、アポトーシス細胞の量は４５２５％であった（図４の（ｃ）参照）。
一方、コントロールと比べて、２１日間培養した実施例１のアポトーシス細胞の量は５９％、実施例２のアポトーシス細胞の量は５５８％、実施例１のアポトーシス細胞の量は６６８％であった（図４の（ｃ）参照）。
これらの結果より、レスベラトロールは、アポトーシス細胞の量を増加させる作用を備えていることがわかった。
また、本発明に係るブドウ種子由来抗老化成分も、アポトーシス細胞の量を増加させる作用を備えていることがわかった。
また、本発明に係るブドウ種子由来抗老化成分も、アポトーシス細胞の量を増加させる作用を備えていることがわかった。
図５は、実施例１〜３、比較例１、コントロールにおいて測定されたネクローシス細胞の量を示すグラフである。
図５の（ａ）は７日間培養した細胞におけるネクローシス細胞の量、図５の（ｂ）は１４日間培養した細胞におけるネクローシス細胞の量、図５の（ｃ）は２１日間培養した細胞におけるネクローシス細胞の量を示している。
尚、図５において、コントロールにおけるネクローシス細胞の量を１００％とし、実施例１〜３及び比較例のネクローシス細胞の量はコントロールにおけるネクローシス細胞の量に対する割合で示している。
図５の（ａ）は７日間培養した細胞におけるネクローシス細胞の量、図５の（ｂ）は１４日間培養した細胞におけるネクローシス細胞の量、図５の（ｃ）は２１日間培養した細胞におけるネクローシス細胞の量を示している。
尚、図５において、コントロールにおけるネクローシス細胞の量を１００％とし、実施例１〜３及び比較例のネクローシス細胞の量はコントロールにおけるネクローシス細胞の量に対する割合で示している。
７日間培養した比較例１は、コントロールと比べて、ネクローシス細胞の量は１２５％であった（図５の（ａ）参照）。
一方、コントロールと比べて、７日間培養した実施例１のネクローシス細胞の量は４７％、実施例２のネクローシス細胞の量は４７％、実施例１のネクローシス細胞の量は１００％であった（図５の（ａ）参照）。
１４日間培養した比較例１は、コントロールと比べて、ネクローシス細胞の量は８０１％であった（図５の（ｂ）参照）。
一方、コントロールと比べて、１４日間培養した実施例１のネクローシス細胞の量は１０９％、実施例２のネクローシス細胞の量は１０８％、実施例１のネクローシス細胞の量は９５％であった（図５の（ｂ）参照）。
２１日間培養した比較例１は、コントロールと比べて、ネクローシス細胞の量は６０８％であった（図５の（ｃ）参照）。
一方、コントロールと比べて、２１日間培養した実施例１のネクローシス細胞の量は５５％、実施例２のネクローシス細胞の量は２８％、実施例１のネクローシス細胞の量は２４％であった（図５の（ｃ）参照）。
一方、コントロールと比べて、７日間培養した実施例１のネクローシス細胞の量は４７％、実施例２のネクローシス細胞の量は４７％、実施例１のネクローシス細胞の量は１００％であった（図５の（ａ）参照）。
１４日間培養した比較例１は、コントロールと比べて、ネクローシス細胞の量は８０１％であった（図５の（ｂ）参照）。
一方、コントロールと比べて、１４日間培養した実施例１のネクローシス細胞の量は１０９％、実施例２のネクローシス細胞の量は１０８％、実施例１のネクローシス細胞の量は９５％であった（図５の（ｂ）参照）。
２１日間培養した比較例１は、コントロールと比べて、ネクローシス細胞の量は６０８％であった（図５の（ｃ）参照）。
一方、コントロールと比べて、２１日間培養した実施例１のネクローシス細胞の量は５５％、実施例２のネクローシス細胞の量は２８％、実施例１のネクローシス細胞の量は２４％であった（図５の（ｃ）参照）。
これらの結果より、レスベラトロールは、全ての期間においてネクローシス細胞の量を増加させる作用を備えていることがわかった。
一方、本発明に係るブドウ種子由来抗老化成分は、ネクローシス細胞の量を減少させる作用を備えていることがわかった。
一方、本発明に係るブドウ種子由来抗老化成分は、ネクローシス細胞の量を減少させる作用を備えていることがわかった。
実施例５の結果より、本発明に係るブドウ種子由来抗老化成分は、アポトーシス細胞の量を増加させ、ネクローシス細胞の量を減少させる作用を備えていることがわかった。
アポトーシスは、生体に不要な細胞や有害な細胞に細胞死を誘導し、これを排除する仕組みであり、老化して機能不全となった細胞を速やかに排除することにより、新しい細胞の生成につなげる。アポトーシスが健全に作動することで老化細胞は排除され、細胞レベルでの健全な細胞増加に至る。健全な細胞から構成された臓器は若い臓器となる。また、アポトーシスは、自己免疫疾患のメカニズムである自己を攻撃する免疫細胞を除去することにもつながり、アポトーシスが健全に作動することで、自己免疫疾患を低下させることが期待できる。
一方、ネクローシス（壊死）は、細胞内の酵素等を事前処理することなく、細胞が破裂するため、酵素等を含む細胞内容物が細胞外に放出され、周辺組織に炎症反応等の悪影響を及ぼす。この悪影響は、細胞の劣化を促し、加齢するほど増加する体内炎症の要因になる。このように、ネクローシスは周辺組織に炎症反応等の悪影響を及ぼすことにより、細胞の損傷を引き起こす。そのため、ネクローシスは細胞の老化を促進する。
よって、アポトーシスを促進し、ネクローシスを抑制することは、細胞の老化を抑制するために非常に有効である。
それゆえに、アポトーシスを促進し、ネクローシスを抑制する作用を備える本発明に係るブドウ種子由来抗老化成分は、優れた抗老化作用を備えていることがわかる。
一方、レスベラトロールは、アポトーシスだけでなくネクローシスも促進することがわかった。叙上の通り、細胞の老化を抑制するためにはネクローシスを抑制する必要がある。そのため、アポトーシスだけでなくネクローシスも促進するレスベラトロールは、本発明に係るブドウ種子由来抗老化成分よりも抗老化作用は低いと考えられる。
アポトーシスは、生体に不要な細胞や有害な細胞に細胞死を誘導し、これを排除する仕組みであり、老化して機能不全となった細胞を速やかに排除することにより、新しい細胞の生成につなげる。アポトーシスが健全に作動することで老化細胞は排除され、細胞レベルでの健全な細胞増加に至る。健全な細胞から構成された臓器は若い臓器となる。また、アポトーシスは、自己免疫疾患のメカニズムである自己を攻撃する免疫細胞を除去することにもつながり、アポトーシスが健全に作動することで、自己免疫疾患を低下させることが期待できる。
一方、ネクローシス（壊死）は、細胞内の酵素等を事前処理することなく、細胞が破裂するため、酵素等を含む細胞内容物が細胞外に放出され、周辺組織に炎症反応等の悪影響を及ぼす。この悪影響は、細胞の劣化を促し、加齢するほど増加する体内炎症の要因になる。このように、ネクローシスは周辺組織に炎症反応等の悪影響を及ぼすことにより、細胞の損傷を引き起こす。そのため、ネクローシスは細胞の老化を促進する。
よって、アポトーシスを促進し、ネクローシスを抑制することは、細胞の老化を抑制するために非常に有効である。
それゆえに、アポトーシスを促進し、ネクローシスを抑制する作用を備える本発明に係るブドウ種子由来抗老化成分は、優れた抗老化作用を備えていることがわかる。
一方、レスベラトロールは、アポトーシスだけでなくネクローシスも促進することがわかった。叙上の通り、細胞の老化を抑制するためにはネクローシスを抑制する必要がある。そのため、アポトーシスだけでなくネクローシスも促進するレスベラトロールは、本発明に係るブドウ種子由来抗老化成分よりも抗老化作用は低いと考えられる。
＜実施例６：毒性試験＞
本発明に係るブドウ種子由来抗老化成分の毒性を確認するために、雌マウスを用いる急性経口毒性試験（限度試験）（ＯＥＣＤ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｅｓｔｉｎｇ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ４２０（２００１）に準拠）を実施した。
本発明に係るブドウ種子由来抗老化成分の毒性を確認するために、雌マウスを用いる急性経口毒性試験（限度試験）（ＯＥＣＤ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｅｓｔｉｎｇ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ４２０（２００１）に準拠）を実施した。
（試験方法）
粉末化した本発明に係るブドウ種子由来抗老化成分を注射用水で懸濁し、１００ｍｇ／ｍＬの試験液を調製した。
５週齢のＩＣＲ系雌マウスを日本エスエルシー株式会社から購入し、約１週間の予備飼育を行い、一般状態に異常のないことを確認した後、試験に使用した。
試験に使用する雌マウスは、ポリカーボネート製ケージに各５匹収容し、室温（２３℃±２℃）、照明時間１２時間／日に設定した飼育室において飼育した。
飼料（日本農産工業株式会社製、製品名：ラボＭＲストック（マウス、ラット用固形飼料））及び飲料水（水道水）は自由摂取させた。
粉末化した本発明に係るブドウ種子由来抗老化成分を注射用水で懸濁し、１００ｍｇ／ｍＬの試験液を調製した。
５週齢のＩＣＲ系雌マウスを日本エスエルシー株式会社から購入し、約１週間の予備飼育を行い、一般状態に異常のないことを確認した後、試験に使用した。
試験に使用する雌マウスは、ポリカーボネート製ケージに各５匹収容し、室温（２３℃±２℃）、照明時間１２時間／日に設定した飼育室において飼育した。
飼料（日本農産工業株式会社製、製品名：ラボＭＲストック（マウス、ラット用固形飼料））及び飲料水（水道水）は自由摂取させた。
ブドウ種子由来抗老化成分を２０００ｍｇ／ｋｇ投与する試験群及び溶媒対照として注射用水を投与する対照群を設定し、各群につきそれぞれ５匹の雌マウスを用いた。
投与前に約４時間、試験に使用する雌マウスを絶食させた。
各雌マウスの体重を測定した後、試験群には試験液、対照群には注射用水をそれぞれ２０ｍＬ／ｋｇの投与容量で胃ゾンデを用いて強制単回経口投与した。
投与後１４日間、雌マウスを観察した。
投与当日は頻回で雌マウスを観察し、投与翌日からは１日１回雌マウスを観察した。
投与後７日目及び投与後１４日目に雌マウスの体重を測定し、ｔ−検定により有意水準５％で群間の比較を行った。
観察期間の終了後、全ての雌マウスを剖検した。
投与前に約４時間、試験に使用する雌マウスを絶食させた。
各雌マウスの体重を測定した後、試験群には試験液、対照群には注射用水をそれぞれ２０ｍＬ／ｋｇの投与容量で胃ゾンデを用いて強制単回経口投与した。
投与後１４日間、雌マウスを観察した。
投与当日は頻回で雌マウスを観察し、投与翌日からは１日１回雌マウスを観察した。
投与後７日目及び投与後１４日目に雌マウスの体重を測定し、ｔ−検定により有意水準５％で群間の比較を行った。
観察期間の終了後、全ての雌マウスを剖検した。
（結果）
いずれの投与群においても、観察期間中に死亡例はなかった。
いずれの投与群においても、観察期間中に異常は見られなかった。
表１は、試験群と対照群の体重変換の結果を示している。
投与後７日目及び投与後１４日目の体重測定において、試験群は対照群と比べて、体重に有意差がないことがわかった。
観察期間終了後の剖検において、全ての雌マウスに異常は見られなかった。
いずれの投与群においても、観察期間中に死亡例はなかった。
いずれの投与群においても、観察期間中に異常は見られなかった。
表１は、試験群と対照群の体重変換の結果を示している。
投与後７日目及び投与後１４日目の体重測定において、試験群は対照群と比べて、体重に有意差がないことがわかった。
観察期間終了後の剖検において、全ての雌マウスに異常は見られなかった。
括弧内に体重を測定した雌マウスの数を示した。
これらの結果より、雌マウスを用いる単回経口投与において、本発明に係るブドウ種子由来抗老化成分のＬＤ５０値は、雌マウスにおいて２０００ｍｇ／ｋｇを超えるものであることがわかった。
実施例３〜５の結果から、本発明に係るブドウ種子由来抗老化成分は、ミトコンドリアの量を増加させ、一定量のミトコンドリアの負担すべき仕事量を低減し、アポトーシス細胞の量を増加させ、ネクローシス細胞の量を減少させることにより、優れた抗老化作用を備えていることがわかった。
また、抗老化作用が期待されるレスベラトロール単体と比較した結果、本発明に係るブドウ種子由来抗老化成分は、レスベラトロール単体よりもはるかに優れた抗老化作用を備えていることがわかった。
加えて、実施例６の結果から、本発明に係るブドウ種子由来抗老化成分は、細胞毒性が低く、優れた安全性を備えていることもわかった。
それゆえに、本発明に係るブドウ種子由来抗老化成分を含む健康食品及び化粧品は優れた抗老化作用と優れた安全性を備えている。
また、抗老化作用が期待されるレスベラトロール単体と比較した結果、本発明に係るブドウ種子由来抗老化成分は、レスベラトロール単体よりもはるかに優れた抗老化作用を備えていることがわかった。
加えて、実施例６の結果から、本発明に係るブドウ種子由来抗老化成分は、細胞毒性が低く、優れた安全性を備えていることもわかった。
それゆえに、本発明に係るブドウ種子由来抗老化成分を含む健康食品及び化粧品は優れた抗老化作用と優れた安全性を備えている。
本発明によれば、抗老化健康食品及び化粧品が、粗精製で６０重量％以上のブドウ種子由来ポリフェノールからなるブドウ種子由来抗老化成分を含むため、優れた抗老化作用を備えた抗老化健康食品及び化粧品を提供することができる。
それゆえに、本発明は、抗老化作用を有する健康食品及び化粧品として好適に利用される。
それゆえに、本発明は、抗老化作用を有する健康食品及び化粧品として好適に利用される。
Claims (3)
- 粗精製で６０重量％以上のブドウ種子由来ポリフェノールからなるブドウ種子由来抗老化成分を含むことを特徴とする、抗老化健康食品及び化粧品。
- （工程１）ヨーロッパブドウ（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ Ｌ．）、アメリカブドウ（Ｖｉｔｉｓ ｌａｂｒｕｓｃａ Ｌ．）、ヤマブドウ（Ｖｉｔｉｓ ｃｏｉｇｎｅｔｉａｅ Ｌ．）、マンシュウヤマブドウ（Ｖｉｔｉｓ ａｍｕｒｅｎｓｉｓ Ｌ．）及びシラガブドウ（Ｖｉｔｉｓ ｓｈｉｒａｇａｉ Ｌ．）からなる群より選択される１種以上のブドウ種子を前処理し、催芽状態にしたブドウ種子を、３５℃〜６０℃で乾燥させる工程
（工程２）前記工程１において乾燥させたブドウ種子を粉末化する工程
（工程３）前記工程２で得られたブドウ種子粉末を、水、エタノール又は水とエタノールの混合溶媒のいずれかに浸漬させてブドウ種子由来ポリフェノールを含む抽出画分を得る工程
（工程４）前記工程３で得られたブドウ種子由来ポリフェノールを含む抽出画分を乾燥させ粉末化する工程からなるブドウ種子由来抗老化成分の製造方法。 - 前記ブドウ種子が、アギオルギティコ（Ａｇｉｏｒｇｉｔｉｋｏ）、ヴィオニエ（Ｖｉｏｇｎｉｅｒ）、カベルネ・ソーヴィニヨン（Ｃａｂｅｒｎｅｔ Ｓａｕｖｉｇｎｏｎ）、カベルネ・フラン（Ｃａｂｅｒｎｅｔ Ｆｒａｎｃ）、ガメ（Ｇａｍａｙ）、カリニャン（Ｃａｒｉｇｎａｎ）、カルメネール（Ｃａｒｍｅｎｅｒｅ）、クシノマヴロ（Ｘｉｎｏｍａｖｒｏ）、グルナッシュ（Ｇｒｅｎａｃｈｅ）、ゲヴュルツトラミネール（Ｇｅｗｕｒｚｔｒａｍｉｎｅｒ）、ケルナー（Ｋｅｒｎｅｒ）、コロンバール（Ｃｏｌｏｍｂａｒｄ）、甲州、サルタナ（Ｓｕｌｔａｎａ）、サンジョベーゼ（Ｓａｎｇｉｏｖｅｓｅ）、シャルドネ（Ｃｈａｒｄｏｎｎａｙ）、シュナン・ブラン（Ｃｈｅｎｉｎ Ｂｌａｎｃ）、シラー（Ｓｙｒａｈ）、ジンファンデル（Ｚｉｎｆａｎｄｅｌ）、セミヨン（Ｓｅｍｉｌｌｏｎ）、ソーヴィニヨン・ブラン（Ｓａｕｖｉｇｎｏｎ Ｂｌａｎｃ）、タナ（Ｔａｎｎａｔ）、ツヴァイゲルト（Ｚｗｅｉｇｅｌｔ）、テンプラニーリョ（Ｔｅｍｐｒａｎｉｌｌｏ）、トレッビアーノ（Ｔｒｅｂｂｉａｎｏ）、ネッビオーロ（Ｎｅｂｂｉｏｌｏ）、ネロ・ダヴォラ（Ｎｅｒｏ Ｄ’Ａｖｏｌａ）、バルベーラ（Ｂａｒｂｅｒａ）、ピノタージュ（Ｐｉｎｏｔａｇｅ）、ピノ・ノワール（Ｐｉｎｏｔ Ｎｏｉｒ）、ピノ・グリ（Ｐｉｎｏｔ Ｇｒｉｓ）、ピノ・ブラン（Ｐｉｎｏｔ Ｂｌａｎｃ）、プチ・ヴェルド（Ｐｅｔｉｔ Ｖｅｒｄｏｔ）、ブラック・クィーン（Ｂｌａｃｋ Ｑｕｅｅｎ）、マスカット・ベーリーＡ（Ｍｕｓｃａｔ Ｂａｉｌｅｙ Ａ）、マルベック（Ｍａｌｂｅｃ）、ミュラー・トゥルガウ（Ｍｕｌｌｅｒ‐Ｔｈｕｒｇａｕ）、ムールヴェードル（Ｍｏｕｒｖｅｄｒｅ）、ムニエ（Ｍｅｕｎｉｅｒ）、ムロン・ド・ブルゴーニュ（Ｍｅｌｏｎ ｄｅ Ｂｏｕｒｇｏｇｎｅ）、メルロー（Ｍｅｒｌｏｔ）、モスカート（Ｍｏｓｃａｔｏ）、ヤマ・ソービニオン、リースリング（Ｒｉｅｓｌｉｎｇ）及びルビー・カベルネ（Ｒｕｂｙ Ｃａｂｅｒｎｅｔ）からなる群より選択される１種以上のワイン用ブドウ品種の種子であることを特徴とする、請求項１に記載の抗老化健康食品及び化粧品又は請求項２に記載のブドウ種子由来抗老化成分の製造方法。
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