KR20190126119A - 미세입자 분류 장치 및 지연 시간 결정 방법 - Google Patents

미세입자 분류 장치 및 지연 시간 결정 방법 Download PDF

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Abstract

미세입자 분류 장치는, 유로를 통해 흐르는 미세입자들을 검출하는 검출 유닛; 유로의 에지 부분 상에 제공된 오리피스로부터 방출된 미세입자들을 포함하는 액적을 촬상하는 촬상 디바이스; 액적들에 전하를 인가하는 충전 유닛; 및 미세입자들이 검출 유닛에 의해 검출된 시간으로부터 촬상 디바이스에 의해 촬상된 이미지 영역의 세기의 합이 최대치에 도달하는 시간까지를 지연 시간으로서 결정하여, 미세입자들이 검출 유닛에 의해 검출된 후에 지연 시간이 경과하고 나서 충전 유닛이 미세입자들에 전하를 인가하는 것을 가능하게 하는 제어 유닛을 포함한다.

Description

미세입자 분류 장치 및 지연 시간 결정 방법
관련 출원과의 상호 참조
본원은 그 명세서 및 도면이 전체적으로 본원에 참조로 포함된, 2017년 4월 11일자 출원된 미국 가출원 번호 62/484,153호를 우선권 주장하는 가출원이 아닌 특허 출원이다.
본 기술은 미세입자 분류 장치 및 미세입자 분류 장치에서의 지연 시간 결정 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 기술은 지연 시간을 자동으로 결정하는 미세입자 분류 장치 등에 관한 것이다.
관련 기술에서, 세포들과 같은 미세입자들의 특성들을 광학적으로, 전기적으로, 또는 자기적으로 검출하고, 다음에 미리 결정된 특성들을 갖는 미세입자들만 분리하여 수집하는 미세입자 분류 장치(예를 들어, 유세포분석기(flow cytometer))가 있다.
유세포분석기에서 세포 분리 시, 먼저, 액적 스트림(droplet stream)(세포들을 포함하는 샘플 유체 및 시스 유체(sheath fluid)의 층류(laminar flow))이 유세포(flow cell)들 내에 형성된 오리피스로부터 발생되고, 유체 스트림이 오리피스에 진동을 가함으로써 액적들 내에 만들어지고, 전하가 액적들에 인가된다. 또한, 오리피스로부터 방출된 세포들을 포함하는 액적들의 이동 방향은 전기적으로 제어되고 원하는 특성들을 갖는 타깃 세포들 및 다른 비타깃 세포들이 별개의 수집 용기들 내에 수집된다.
예를 들어, 일본 미심사 특허 출원 공개 번호 2010-190680호는 마이크로칩형 유세포분석기로서, 미세입자들을 포함하는 유체가 흐르는 유로, 및 칩의 외부 공간으로 유로를 통해 흐르는 유체를 방출하는 오리피스가 그 위에 설치되어 있는 마이크로칩; 오리피스 내의 액적들 내로 유체를 만들고 그들을 방출하는 진동 요소; 방출된 액적들에 전하를 인가하는 전기 충전 수단; 유로를 통해 흐르는 미세입자들의 광학적 특성들을 검출하는 광학 검출 수단; 이동하는 액적들을 삽입하기 위해 서로 대향하여 설치된 전극 쌍; 및 대향하는 전극들 사이에 통과하는 액적들을 수집하는 2개 이상의 용기를 포함하는 미세입자 분류 장치를 개시하고 있다.
또한, 일본 미심사 특허 출원 공개(PCT 출원의 번역문) 번호 2007532874호는 액적들이 유체로부터 브레이크 오프하는 위치(이후, 브레이크-오프 포인트라고 함)에 보조 조명 및 검출 유닛을 배치함으로써 액적들이 의도된 유로 내로 분류되었는지를 확인할 수 있는 유세포분석기의 동작 시에 제어가 수행되는 방법을 개시하고 있다. 브레이크-오프 포인트를 이 방식으로 알아냄으로써, 세포들 등을 포함하는 액적들이 브레이크-오프 포인트에 도달할 때까지 세포들 등인 미세입자들이 검출되는 때로부터의 지연 시간을 알아내는 것이 가능하고, 지연 시간에 기초하여 검출된 미세입자들을 포함하는 액적들에 전하를 인가하는 것이 가능하다.
그러나, 브레이크-오프 포인트는 액적들 등의 방출 조건들에 따라 변동하므로, 지연 시간도 변동한다. 또한, 단지 브레이크-오프 포인트를 알아냄으로써 미세입자들을 포함하는 액적들에 전하를 인가하는 정확한 타이밍을 충분히 알아내기가 어렵다. 그러므로, 정확한 전하가 미세입자들을 포함하는 액적들에 인가되지만, 결국, 액적들이 원하는 수집 용기에 할당되는지를 사용자들이 시각적으로 판별하고 또는 준비 시에 전하가 인가되는 액적들을 관찰하지 않음으로써 이루어지는 방법들이 주로 채택되었다. 이러한 방법들은 사용자가 기술의 숙달을 갖는 요구하고, 신뢰성 및 안정성에 문제들이 있다.
그러므로, 전하를 액적들에 자동으로, 간단히, 그리고 정확하게 인가할 수 있는 미세입자 분류 장치를 제공하는 것이 바람직하다.
한 실시예에서, 미세입자 분류 장치가 개시된다. 미세입자 분류 장치는 유로를 통해 흐르는 미세입자들을 검출하도록 구성된 검출기 및 미세입자들 중 적어도 하나를 포함하는 액적의 이미지를 획득하도록 구성된 촬상 디바이스를 포함하고 액적은 유로 상에 제공된 오리피스로부터 방출된다. 미세입자 분류 장치는 제어기를 추가로 포함한다. 제어기는 이미지를 획득하도록 촬상 디바이스를 제어하도록 구성되고, 여기서 이미지는 제1 및 제2 이미지 영역을 갖고 제1 및 제2 이미지 영역은 각각 복수의 서브-영역을 갖는다. 제어기는 추가로 상기 서브-영역들 각각에 대한 이미지 밝기의 세기를 결정하고 제1 이미지 영역 및 제2 이미지 영역 각각의 세기의 합을 획득하기 위해 제1 및 제2 이미지 영역들 각각 내의 서브-영역들 각각에 대한 이미지 밝기의 세기를 더하도록 구성된다. 제어기는 추가로 제1 및 제2 이미지 영역들의 세기의 합을 검사하고 세기 특성들의 최대 합을 식별함으로써 지연 시간을 결정하고 지연 시간에 기초하여 액적들에 전하를 인가하는 타이밍을 설정하도록 구성된다.
또 하나의 실시예에서, 제1 및 제2 이미지 영역들 각각의 세기의 합은 복수의 상이한 시간에서 결정된다. 또 다른 실시예에서 복수의 상이한 시간은 액적 클럭 사이클에 기초하고 3개의 액적 클럭 사이클에 걸친다. 또 다른 실시예에서 각각의 액적 클럭 사이클은 360도로 이루어지고 복수의 상이한 시간은 20도 간격들에서 발생한다. 또 다른 실시예에서 복수의 상이한 시간은 40도 간격들에서 발생한다. 또 다른 실시예에서, 복수의 상이한 시간은 60도 간격들에서 발생한다.
또 하나의 실시예에서, 이미지는 복수의 서브-영역을 갖는 제3 이미지 영역을 추가로 포함하고, 제어기는 부가적으로 제3 이미지 영역 내의 서브-영역들 각각에 대한 이미지 밝기의 세기를 결정하도록 구성된다. 제어기는 또한 제3 이미지 영역의 세기의 합을 획득하기 위해 제3 이미지 영역 내의 서브-영역들 각각에 대한 이미지 밝기의 세기를 더하고 제3 이미지 영역의 세기의 합을 검사함으로써 지연 시간을 결정하도록 구성된다.
또 하나의 실시예에서, 세기 특성의 최대 합은 제1 이미지 영역 비(first image region ratio):
Figure pct00001
를 계산함으로써 결정된다.
또 하나의 실시예에서, 제1 이미지 영역은 마지막으로 부착된 액적과 연관된다. 또 다른 실시예에서, 제1 이미지 영역은 액적 스트림 내의 마지막으로 부착된 액적 이후의 액적과 연관된다. 또 다른 실시예에서, 제2 이미지 영역은 제1 이미지 영역에 인접하고 제3 이미지 영역은 제2 이미지 영역 또는 제1 이미지 영역에 인접한다.
또 하나의 실시예에서, 세기 특성의 최대 합은 제2 이미지 영역의 세기의 합, 제3 이미지 영역의 세기의 합 중 어느 하나, 또는 둘 다를 최소화함으로써 결정된다. 또 다른 실시예에서, 세기 특성의 최대 합은 제1 이미지 영역의 세기의 합을 최대화함으로써 결정된다.
한 실시예에서, 유로를 통해 흐르는 미세입자들을 검출하도록 구성된 검출기, 미세입자들 중 적어도 하나를 포함하는 액적의 이미지를 획득하도록 구성된 촬상 디바이스 - 액적은 액적 스트림을 생성하는 유로 상에 제공된 오리피스로부터 방출됨 -, 및 제어기를 포함하는 미세입자 분류 장치가 개시된다. 제어기는 이미지를 획득하도록 촬상 디바이스를 제어하도록 구성되고, 이미지는 제1 복수의 서브-영역을 갖는 제1 이미지 영역, 제2 복수의 서브-영역을 갖는 제2 이미지 영역, 및 제3 복수의 서브-영역을 갖는 제3 이미지 영역을 포함한다. 제어기는 또한 복수의 상이한 시간에서 이미지를 획득하고 복수의 상이한 시간 각각에 대해, 제1 복수의 서브-영역 각각, 제2 복수의 서브-영역 각각, 및 제3 복수의 서브-영역 각각에 대한 밝기의 세기를 결정하도록 구성된다. 제어기는 추가로 제1 이미지 영역 세기의 합을 획득하기 위해 제1 복수의 서브-영역 각각에 대한 밝기의 세기, 제2 이미지 영역 세기의 합을 획득하기 위해 제2 복수의 서브-영역 각각에 대한 밝기의 세기, 및 제3 이미지 영역 세기의 합을 획득하기 위해 제3 복수의 서브-영역 각각에 대한 밝기의 세기를 더함으로써, 복수의 상이한 시간 각각에서 제1 이미지 영역 세기의 합, 제2 이미지 영역 세기의 합, 및 제3 이미지 영역 세기의 합을 획득하도록 구성된다. 제어기는 추가로 검출기가 유로를 통해 흐르는 미세입자들을 검출한 시간으로부터 세기 특성의 최대 합을 결정함으로써 제1 이미지 영역 세기의 합이 최대치에 있는 시간까지의 지연 시간을 결정하고 지연 시간에 기초하여 액적들에 전하를 인가하는 타이밍을 설정하도록 구성된다.
또 하나의 실시예에서, 지연 시간은 액적 클럭 사이클에 기초하고, 전하는 마지막으로 부착된 액적에 인가되고, +1 액적 클럭 사이클은 마지막으로 부착된 액적에 대한 지연 시간을 획득하기 위해 지연 시간에 더해진다.
도 1은 마이크로칩형 유세포분석기로서 구성된 본 기술의 실시예에 따른 미세입자 분류 장치(유세포분석기)의 분류 시스템의 구성을 도시한 개략도이고;
도 2a 및 2b는 유세포분석기에 설치될 수 있는 마이크로칩의 예를 도시한 개략도들이고;
도 3a 내지 3c는 마이크로칩의 오리피스의 구성을 도시한 개략도들이고;
도 4는 유세포분석기에서 지연 시간을 결정하는 방법을 도시한 흐름도이고;
도 5a 내지 5d는 대강의 지연 시간 결정 단계를 도시하는, 유세포분석기의 액적 카메라에 의해 촬상된 액적들의 이미지들의 예인 설명도들이고;
도 6a 내지 6c는 설명도들로서, 도 6a는 예시적인 액적 이미지이고, 도 6b는 예시적인 교정(calibration) 이미지이고, 도 6c는 액적 클럭과 관련한 LED 스트로브 및 교정 스트로브의 예시적인 표현이고;
도 7a 내지 7d는 복수의 이미지 영역을 결정하는 제1 방법을 도시한 예시적인 이미지들로서, 도 7a 및 7b는 액적 이미지들을 나타내고, 도 7c는 교정 이미지를 나타내고, 도 7d는 액적 클럭과 관련한 LED 스트로브 및 교정 스트로브를 나타내고;
도 8a 내지 8d는 복수의 이미지 영역을 결정하는 제2 방법을 도시한 예시적인 이미지들로서, 도 8a 및 8b는 액적 이미지들을 나타내고, 도 8c는 교정 이미지를 나타내고, 도 8d는 액적 클럭과 관련한 LED 스트로브 및 교정 스트로브를 나타내고;
도 9는 지연 시간 결정 단계(제1 지연 시간 결정 방법)의 예를 도시한 설명도로서, 수평 축이 지연 시간이고, 좌측 상의 수직 축이 유세포분석기의 액적 카메라에 의해 촬상된 액적들의 이미지들의 세기의 합이고, 우측 상의 수직 축이 S1 비인 그래프이고;
도 10은 지연 시간 결정 단계(제2 지연 시간 결정 방법)의 예를 도시한 설명도로서, 수평 축이 지연 시간이고 수직 축이 유세포분석기의 액적 카메라에 의해 촬상된 액적들의 이미지들의 세기의 합인 그래프이고;
도 11은 지연 시간 결정 단계(제3 지연 시간 결정 방법)의 예를 도시한 설명도로서, 수평 축이 지연 시간이고, 수직 축이 유세포분석기의 액적 카메라에 의해 촬상된 액적들의 이미지들의 세기의 합인 그래프이고;
도 12는 유세포분석기에서 미세입자들을 분류하는 방법(미세입자 분류 단계)을 도시한 흐름도이다.
이후, 도면을 참조하여 본 기술을 실현하기 위해 선호되는 실시예들의 설명이 주어질 것이다. 또한, 아래에 설명되는 실시예들은 본 기술의 대표적 실시예의 예를 나타내고, 본 기술의 범위는 이 예에 따라 좁게 해석되지 않아야 한다. 설명은 다음의 순서로 주어질 것이다.
1. 본 기술에 따른 미세입자 분류 장치의 장치 구성
1-1 충전 유닛
1-2 마이크로칩
1-3 검출 유닛
1-4 액적 카메라
1-5 편향 플레이트
1-6 수집 용기
1-7 제어 유닛 또는 유사한 것
2. 본 기술에 따른 미세입자 분류 장치에서의 지연 시간 결정 방법
2-1 미세입자 검출 단계 S1
2-2 액적 방출 단계 S2
2-3 액적 촬상 단계 S3
2-4 방출 빈도 결정 단계 S4
2-5 대강의 지연 시간 결정 단계 S5
2-6 이미지 영역 결정 단계 S6
2-7 미세한 지연 시간 결정 단계 S7
2-7-1 제1 미세한 지연 시간 결정 방법
2-7-2 제2 미세한 지연 시간 결정 방법
2-7-3 제3 미세한 지연 시간 결정 방법
2-8 미세입자 분류 단계 S8
2-8-1 미세입자 검출 단계
2-8-2 액적 방출 및 전하 인가 단계
1. 본 기술에 따른 미세입자 분류 장치의 장치 구성
도 1은 마이크로칩형 유세포분석기로서 구성된 본 기술의 실시예에 따른 미세입자 분류 장치(1)(이후 "유세포분석기(1)"라고도 함)의 분류 시스템의 구성을 도시한 개략도이다.
1-1 충전 유닛
유세포분석기(1)는 마이크로칩(2) 상에 형성된 오리피스(21)로부터 방출된 액적들에 전하를 인가하는 충전 유닛(charge unit)(11)을 구비한다. 액적들의 충전은 충전 유닛(11)에 전기적으로 접속된 전극들 또는 여기 레이저(도시 안됨)와 같은 충전 장치(12)에 의해 수행된다. 충전 장치(12)는 마이크로칩(2) 내에 제공된 입구(도시 안됨)를 통해 액적들에 접근할 수 있다. 또한, 전극들이 샘플 유체 또는 유로 아래로 펌프되는 시스 유체와 전기적 접촉하도록 마이크로칩(2) 상의 위치에 삽입되기에 충분한다. 유사하게, 샘플 유체 또는 유로 아래로 펌프되는 시스 유체에 레이저에 대한 접근을 허용하기 위해 여기 레이저가 마이크로칩(2) 상의 위치에 있는 것으로 충분하다.
유세포분석기(1)에서, 충전 유닛(11)은 샘플 유체 내에 포함된 미세입자들이 아래에 설명되는 검출 유닛(3)에 의해 검출된 후에 지연 시간이 경과하고 나서 미세입자들을 포함하는 액적들에 전하를 인가하는 것이 가능하다. 여기서, 용어 "지연 시간"은 미세입자들이 검출 유닛(3)에 의해 검출된 시간으로부터 액적들이 미세입자들을 포함하는 유체로부터 형성될 때까지의 지연 시간을 지칭한다. 바꾸어 말하면, "지연 시간"은 미세입자들이 검출 유닛(3)에 의해 검출된 시간으로부터 미세입자들을 포함하는 액적들이 충전 유닛(11)에 의해 그에 인가된 전하를 가질 때까지의 필요한 시간을 지칭한다. 본 기술에서, 용어 "지연 시간"은 미세입자들이 검출 유닛(3)에 의해 검출된 시간으로부터, 아래에 설명되는 액적 카메라(4)에 의해 촬상된 이미지 정보에서 자동으로 설정되는, 이미지 영역 내의 세기가 최대치에 도달하는 시간까지의 기간을 지칭한다.
1-2 마이크로칩
도 2a 및 2b 및 도 3a 내지 3c는 유세포분석기(1)에 설치될 수 있는 마이크로칩(2)의 예를 도시한다.
도 2a는 상부 표면의 개략도를 도시하고, 도 2b는 도 2a에서의 선 ⅡB-ⅡB에 대응하는 단면 개략도를 도시한다. 또한, 도 3a 내지 3c는 마이크로칩(2)의 오리피스(21)의 구성을 개략적으로 도시하고, 도 3a는 상부 표면 개략도를 도시하고, 도 3b는 단면 개략도를 도시하고, 도 3c는 전방 표면 개략도를 도시한다. 도 3b는 도 2a에서의 선 ⅢB-ⅢB에 따른 단면에 대응한다.
마이크로칩(2)은 샘플 유로(22)를 형성하기 위해 함께 접착된 기판 층들(2a 및 2b)로 형성된다. 금속 몰드를 사용하여 열가소성 수지의 사출 성형을 통해 기판 층들(2a 및 2b)로부터 샘플 유로(22)의 형성을 수행하는 것이 가능하다. 열가소성 수지용으로, 폴라카보네이트, 폴리메틸 메타크릴레이트 수지(PMMA), 사이클릭 폴리올레핀, 폴리에틸렌, 폴리스티렌, 폴리프로필렌 및 폴리메틸 디실라잔(PDMS)과 같은 마이크로칩으로서 관련 기술에서 일반적으로 사용되는 플라스틱들이 채택될 수 있다.
샘플 유체는 유체 전달 접속기 부분으로부터 샘플 입구(23)에 도입되고, 유체 전달 접속기 부분으로부터 시스 입구(sheath inlet)(24)에 도입된 시스 유체와 병합하고, 샘플 유로(22)를 통해 전달된다. 2개의 방향으로 분리되고 전달된 후에, 시스 입구(24)로부터 도입된 시스 유체는, 병합 부분에서 샘플 입구(23)로부터 도입된 샘플 유체와 병합하고, 시스 유체는 2개의 방향으로부터 샘플 유체를 삽입하도록 샘플 유체와 병합한다. 그러므로, 병합 부분에서, 시스 유체 층류의 중심에서, 샘플 층류가 배치되는 3차원 층류가 형성된다.
참조 번호(25)는 클로깅 또는 버블들이 샘플 유로(22)에서 발생할 때 샘플 유로(22)에 음압(negative pressure)을 가하기 위한 흡입 유로를 나타내고, 이는 일시적으로 흐름이 클로깅 또는 버블들을 해결하기 위해 역으로 흐르게 한다. 흡입 유로(25)의 한 단부 상에, 액체 전달 접속기 부분을 통해 진공 펌프와 같은 음압 소스에 접속된 흡입 출구(251)가 형성되고, 다른 단부는 연통 홀(252) 내의 샘플 유로(22)에 접속된다.
3차원 층류에서, 층류 폭은 유체 전달 방향에 대한 그 수직 단면의 표면적이 유체 전달 방향에서의 업스트림으로부터 다운스트림까지 점차적으로 또는 단계적으로 작아지도록 형성된 제한기 부분((261)(도 2a 및 도 2b 참조) 및 (262)(도 3a 내지 도 3c 참조))에서 제한된다. 이 다음에, 3차원 층류는 유로의 한 측 상에 제공된 오리피스(21)로부터 유체 스트림으로 되고(도 1 참조), 방출된다. 도 1에서, 오리피스(21)로부터의 유체 스트림의 방출 방향은 Y 축의 양의 방향으로 나타내진다.
샘플 유로(22)의 오리피스(21)와의 접속 부분은 직선으로 형성된 직선 부분(27)이다. 직선 부분(27)은 오리피스(21)로부터의 유체 스트림이 Y 축의 양의 방향으로 직선으로 배출되도록 기능한다.
오리피스(21)로부터 배출된 유체 스트림은 칩 여기 유닛에 의해 오리피스(21)에 가해진 진동에 의해 액적들로 변형된다. 오리피스(21)는 기판 층들(2a 및 2b)의 단부 면 방향에서 개방되고, 노치 부분(211)이 그 개방 위치와 기판 층 단부 면 사이에 제공된다. 노치 부분(211)은 노치 부분(211)의 직경 L이 오리피스(21)의 개구 직경(1)보다 크도록 오리피스(21)의 개방 부분과 기판 단부 면 사이의 기판 층들(2a 및 2b)을 노칭함으로써 형성된다(도 3c 참조). 노치 부분(211)의 직경 L은 오리피스(21)로부터 방출된 액적들의 이동을 방해하지 않도록 오리피스(21)의 개구 직경(1)의 2배 이상이게 형성하는 것이 바람직하다.
1-3 검출 유닛
도 1에서의 참조 번호(3)는 광원(31)으로부터 방출된 레이저 L1의 조사를 통해 세포들과 같은 미세입자들로부터 방출된 측정 타깃 광을 검출하는 검출 유닛을 나타낸다. 검출 유닛(3)은 샘플 유로(22)의 제한기 부분(261)(도 2a 및 2b 참조)과 제한기 부분(262)(도 3a 내지 3c 참조) 사이에서 세포들의 특성 검출을 수행한다. 그러나, 특성 검출은 특정하게 제한되지 않는데, 예를 들어, 광학 검출이 사용되는 경우에, 3차원 층류의 중심에서 샘플 유로(22) 내에 단일 행으로 배열된 유체 전달된 세포들에 대한 레이저 L1(도 1 참조)의 조사로 인해 세포들로부터 방출된 산란 광과 형광 광이 검출 유닛(3)에 의해 검출된다.
광의 조사 및 검출을 위해, 레이저 광원 외에, 콘덴싱 렌즈, 이색성 미러 또는 대역 통과 필터와 같은 세포들 상에 레이저를 콘덴스하고 조사하는 조사 시스템들이 또한 구성될 수 있다. 검출 시스템은 예를 들어, PMT(광전 증배관), 또는 CCD 또는 CMOS 디바이스와 같은 촬상 디바이스에 의해 구성된다.
검출 유닛(3)의 검출 시스템에 의해 검출된 측정 타깃 광은 측정 광의 조사로 인해 세포들로부터 방출된 광이고, 예를 들어, 전방 산란된 광, 측방 산란된 광, 레일레이 산란, 또는 미(Mie) 산란과 같은 산란된 광, 형광 광 등일 수 있다. 이들 측정 타깃 광은 전기적 신호로 변환되어, 제어 유닛(7)에 출력되고, 세포들의 광학 특성 판별에 이용된다.
또한, 검출 유닛(3)은 또한 세포들의 특성들을 자기적으로 또는 전기적으로 검출할 수 있다. 이 경우에, 미세전극들이 마이크로칩(2)의 샘플 유로(22) 내에 서로 대향하여 배치되고, 저항 값, 용량 값, 인덕턴스 값, 임피던스, 전극들 간의 전계의 변화 값, 또는 자화, 자계의 변화 등이 측정된다.
1-4 액적 카메라
도 1에서의 참조 번호(4)는 CCD 카메라, CMOS 센서 등과 같은 마이크로칩(2)의 오리피스(21)로부터 방출된 액적 D를 촬상하는 액적 카메라인, 본 기술의 촬상 디바이스의 예를 나타낸다. 액적 카메라(4)는 촬상된 액적 D의 이미지의 초점 조정을 수행하는 것이 가능하도록 설계된다. 유세포분석기(1)에서, 브레이크-오프 포인트 근처의 액적들이 광원(41)으로부터 방출된 스트로브 L2에 의해 촬상된다. 스트로브 L2는 다수의 광원(41)으로부터의 복수의 상이한 유형의 스트로브들을 포함할 수 있다. 예를 들어, 하나의 스트로브 L2는 브레이크-오프 포인트에 있고 그 근처에 있는 액적들의 액적 이미지를 획득하기 위해 충분한 광을 제공하는 LED 스트로브를 포함할 수 있다. 부가적으로, 또 하나의 스트로브 L2는 액적들 내의 미세입자들을 여기하는 교정 스트로브를 포함할 수 있다. 교정 스트로브에 의해 제공된 미세입자들의 여기는 액적 카메라가 미세입자들의 위치를 나타내는 교정 이미지를 획득하게 하고 아래에 설명되는 것과 같이, 그들 세기의 합을 결정하기 위해 사용된다. 일반적으로, LED 스트로브는 교정 스트로브들로 인한 미세입자들로부터의 방출은 희미하기 때문에 교정 스트로브보다 훨씬 짧고, 그러므로 더 긴 교정 스트로브가 양질의 교정 이미지를 얻는 데 필요하다. 예를 들어, LED 스트로브 길이는 액적 클럭 사이클의 약 2%일 수 있고 교정 스트로브는 액적 클럭 사이클의 약 50%일 수 있다.
또한, 유세포분석기(1)에서, 새로운 마이크로 칩으로 교환된 마이크로칩, 또는 외부 환경(온도 등) 변화로 인해, 액적 형성 파라미터들(시스 압력, 액적 빈도, 압전 구동 압력 등)을 변화시킬 필요가 있는 경우가 있다. 이 경우에, 미세입자들이 검출 유닛(3)에 의해 검출된 후에 미세입자들을 포함하는 액적들에 전하가 인가될 때까지의 시간(이후, 이 시간은 지연 시간이라고도 함)을 조정하는 것이 필요하다. 액적 카메라(4)는 액적 D를 촬상하기 위해, 또한 아래에 설명되는 제어 유닛(7)이 지연 시간을 결정하는 것을 가능하게 하도록 기능한다.
보다 구체적으로, 액적 카메라(4)는 아래에 설명되는 제어 유닛(7)이 지연 시간을 결정할 수 있도록 액적 D의 복수의 이미지를 복수의 상이한 시간에서 촬상하는 것을 가능하게 하도록 설계된다. 또한, 용어 "지연 시간"은 미세입자들이 검출 유닛(3)에 의해 검출된 시간으로부터, 액적 카메라(4)에 의해 촬상된 액적들의 이미지 정보의 복수의 항목을 비교함으로써 계산된 이미지 영역 내의 세기가 최대치에 도달하는 시간까지의 기간을 지칭한다. 또한, 용어 "복수의 상이한 시간"은 예를 들어, 각각의 시간을 지칭하며, 그 사이의 간격은 진동 요소(13)가 오리피스(21)에 가하는 진동 주파수의 역수의 시간이다(바꾸어 말하면, 액적들 D 각각의 방출 간격 시간).
또한, 제어 유닛(7)이 지연 시간을 결정할 수 있기 위해서, 액적 카메라(4)는 미세입자들이 검출 유닛(3)에 의해 검출된 시간으로부터 지연 시간이 경과한 후에 미리 결정된 시간 내에서 액적 D의 복수의 이미지를 촬상할 수 있도록 설계된다. 또한, 용어 "미리 결정된 시간"은 액적들 D 각각의 방출 간격 시간보다 짧은 시간을 지칭한다.
또한, 액적 카메라(4)는 제어 유닛(7)이 아래에 설명되는 액적들 D의 최적의 방출 빈도를 결정할 수 있도록 Y 축을 따라 양의 방향 또는 음의 방향으로 이동가능하도록 설계될 수 있다.
또한, 액적 카메라(4)에 의해 촬상된 이미지들은 디스플레이와 같은 디스플레이 유닛 상에 디스플레이되고, 사용자가 오리피스(21)에서 액적 D의 형성 상태(액적의 크기, 형상, 간격 등)를 확인할 수 있게 하는데 또한 사용된다.
1-5 편향 플레이트
도 1에서의 참조 번호들(51 및 52)은 오리피스(21)로부터 배출되고 액적 카메라(4)에 의해 촬상된 액적 D를 삽입하기 위해 서로 대향하여 배치된 한 쌍의 편향 플레이트들을 나타낸다.
편향 플레이트들(51 및 52)은 액적들에 인가된 전하에의 전기력을 사용하여 오리피스(21)로부터 방출된 액적들의 이동 방향을 제어하는 전극들을 포함하도록 구성된다. 또한, 편향 플레이트들(51 및 52)은 또한 액적 D에 인가된 전하에의 전기력을 사용하여 오리피스(21)로부터 방출된 액적 D의 이동 방향을 제어한다. 도 1에서, 편향 플레이트들(51 및 52)의 반대 방향은 X 축 방향으로 나타내진다.
1-6 수집 용기
유세포분석기(1)에서, 액적 D는 편향 플레이트들(51 및 52)의 반대 방향(X 축 방향)으로 연이어 배치된 복수의 수집 용기(611, 612, 62, 또는 63) 중 하나에 의해 수용된다. 수집 용기들(611, 612, 62, 또는 63)은 또한 실험용으로 보통 사용되는 플라스틱 튜브들 또는 유리 튜브들일 수 있다. 그러나, 수집 용기들(611, 612, 62, 또는 63)의 수는 특정하게 제한되지 않고, 여기서, 4개가 배치되는 경우가 예시된다. 오리피스(21)로부터 방출된 액적 D는 편향 플레이트들(51과 52) 간의 전기력의 유무, 또는 대안적으로 그 크기에 따라 4개의 수집 용기(611, 612, 62, 또는 63) 중 하나 내로 안내되고 그 안에 수집된다.
수집 용기들(611, 612, 62, 및 63)은 교환가능한 방식으로 수집 용기(도시 안됨)로서 사용하기 위해 용기 내에 배치된다. 수집 용기(도시 안됨)로서 사용하기 위한 용기는 오리피스(21)로부터 액적 D의 방출 방향(Y 축 방향)에 및 편향 플레이트들(51 및 52)의 반대 방향(X 축 방향)에 직교하는 방향(Z 축 방향)으로 이동가능하도록 구성된 Z 축 스테이지(도시 안됨) 상에 배치된다.
1-7 제어 유닛 또는 유사한 것
위에 설명된 구성 외에, 유세포분석기(1)는 검출 유닛(3)에 의해 검출된 세포들 등의 특성 판별을 위한 데이터 분석 유닛, 샘플 유체 및 시스 유체를 담는 탱크 부분, 통상적인 유세포분석기가 구비되는 위에 설명된 구성들 각각을 제어하는 제어 유닛(7) 등을 구비한다.
제어 유닛(7)은 CPU, 메모리, 하드 디스크 등을 구비하는 통상적인 컴퓨터에 의해 구성될 수 있고, 하드 디스크 상에는 OS, 다음에 설명되는 지연 시간 결정 방법과 관련한 각각의 단계를 실행하는 프로그램 등이 저장된다.
2. 본 기술에 따른 미세입자 분류 장치에서의 지연 시간 결정 방법
2-1 미세 입자 검출 단계 S1
도 4는 유세포분석기(1)에서의 지연 시간 결정 단계를 도시한 흐름도이다. 지연 시간 결정 단계는 "미세입자 검출 단계 S1", "액적 방출 단계 S2", "액적 촬상 단계 S3", "방출 빈도 결정 단계 S4", "이미지 영역 결정 단계 S5", 및 "지연 시간 결정 단계 S6"의 프로세스들을 포함한다. 또한, "미세입자 분류 단계 S7"의 프로세스는 또한 위에 설명된 지연 시간 결정 단계들 후에 실행될 수 있다. 설명이 아래에 각각의 프로세스에 대해 이루어질 것이다.
먼저, 미세입자 검출 단계 S1에서, 제어 유닛(7)은 유체 전달 접속기 부분에 신호를 출력하고 샘플 유체 및 시스 유체의 유체 전달을 시작한다. 또한, 검출 유닛(3)은 예를 들어, 레이저 L1의 조사에 의해 샘플 유로(22)에서 샘플 내에 포함된 미세입자들을 검출한다. 또한, 본 단계 S1 및 아래에 설명되는 단계들 S2 내지 S6은 검출 유닛(3)이 타깃 세포들 등을 검출한 때로부터 충전 유닛(11)이 세포들 등을 포함하는 액적들에 전하를 인가할 때까지의 지연 시간을 결정하기 위한 교정 프로세스이다. 그러므로, 산업용 사용을 위한 입자들과 같은 교정 비드들, 선명한 형상 등을 미세입자들로서 미리 사용하는 것이 선호된다.
2-2 액적 방출 단계 S2
액적 방출 단계 S2에서, 진동 요소(13)는 오리피스(21)에 진동을 가하고, 액적 D는 오리피스(21)로부터 방출되고, 액적들 D는 폐기 유체 입구 내에 수집되고, 유체를 배치하는 것이 가능하다(도 4 참조).
2-3 액적 촬상 단계 S3
액적 촬상 S3에서, 제어 유닛(7)은 액적 카메라(4)에 신호를 출력하고, 신호를 수신한 액적 카메라(4)는 방출되고 스트로브 L2에 의해 스트로브된 액적 D를 촬상한다(도 4 참조). 액적 카메라(4)는 아래에 설명되는 액적 클럭의 간격과 동일하거나 그보다 짧은 간격으로 이미지들을 촬상할 수 있다.
도 5a-5c를 참조하면, 액적 카메라(4)는 액적 이미지(501) 및 교정 이미지(511)을 촬상할 수 있다. 도 5a에 도시된 액적 이미지(501)을 획득하기 위해, LED 스트로브(503)가 스트로브 L2로서 방출된다. 도 5b에 도시된 교정 이미지(511)을 획득하기 위해, 미세입자들을 여기하는 교정 스트로브(513)가 스트로브 L2로부터 방출된다. 위에 설명된 것과 같이, LED 스트로브(503)는 일반적으로 교정 스트로브(513)보다 짧다. 도 5c는 액적 클럭(500)과 관련하여, LED 스트로브(503)와 교정 스트로브(513) 간의 타이밍의 차이의 예시적인 실시예를 도시한다.
이 때, 예를 들어, 제어 유닛(7)은 액적 카메라(4)에 신호를 출력하고 신호를 수신한 액적 카메라(4)를 X 축 방향 또는 Y 축 방향으로 이동시킬 수 있다. 또한, 제어 유닛은 액적 카메라(4)에 의한 액적 D의 이미지들의 촬상에서 Z 축 방향으로 초점 조정을 수행할 수 있다. 예를 들어, 제어 유닛(7)은 액적 카메라(4)에 의해 촬상된 이미지에서의 콘트라스트 비가 미리 결정된 범위 내에 들 때까지 초점 조정을 수행할 수 있다.
2-4 방출 빈도 결정 단계 S4
방출 빈도 결정 단계 S4에서, 제어 유닛(7)은 액적 카메라(4)를 미리 결정된 위치로 이동시키고 액적 카메라(4)에 의해 촬상된 이미지 정보에 기초하여 액적들 D의 방출 빈도를 조정한다(도 4 참조). 그러나, 위에 설명된 미리 결정된 위치는 특정하게 제한되지 않고, 그것은 오리피스 직경 및 구동 압력과 같은 방출 조건들에 따라 미리 설정된 위치일 수 있다.
또한, 제어 유닛(7)은 액적들 D가 Y 축 방향으로 형성을 시작하는 위치(이후 브레이크-오프 포인트라고 함)가 오리피스(21)에 가장 가까운 방출 빈도이도록 액적들 D의 최적의 방출 빈도를 결정한다. 또한, 본 단계 S4는 또한 아래에 설명되는 단계 S5 다음에 실행될 수 있다.
이 방식으로, 유세포분석기(1)에서, 최적의 방출 빈도는 브레이크-오프 포인트에 기초하여 제어 유닛(7)에 의해 결정되기 때문에, 액적 빈도를 수동으로 설정한다는 사용자의 번거로움을 해결하는 것이 가능하다.
2-5 대강의 지연 시간 결정 단계
대강의 지연 시간 결정 단계 S5에서, 제어 유닛(7)은 미세입자들이 검출 유닛(3)에 의해 검출된 시간으로부터 액적 카메라(4)에 의해 촬상된 액적 D의 이미지 정보의 복수의 항목을 비교함으로써 액적 D의 대강의 지연 시간을 결정한다(도 4 참조).
용어 "대강의 지연 시간(rough delay time))"은 여기서 미세한 지연 시간이 아래에 설명되는 지연 시간 단계 S7에 의해 결정될 때까지의 기간인, 본 단계 S5에 의해 지연 시간으로서 임시로 처리되는 시간을 지칭한다. 보다 구체적으로, 용어 "대강의 지연 시간"은 미세입자들이 검출 유닛(3)에 의해 검출된 시간으로부터 액적의 복수의 상이한 시간에서 취해진 교정 이미지(들)의 세기의 합이 (아래에 설명되는) 미리 결정된 영역 내의 최대치에 도달하는 시간까지의 기간을 지칭한다. 대안적으로, 이것은 복수의 상이한 시간에서 액적 카메라(4)에 의해 촬상된 액적 D의 복수의 교정 이미지를 비교함으로써 계산된, 미리 결정된 영역 내의 다수의 밝은 스폿이 최대치에 도달할 때에 의해 결정될 수 있다. 또한, 용어 "복수의 상이한 시간"은 특정하게 제한되지 않지만, 예를 들어, 각각의 시간을 지칭하며, 그 사이의 간격은 진동 요소(13)가 오리피스(21)에 가하는 진동 주파수의 역수의 시간이다(바꾸어 말하면, 액적들 D 각각의 방출 간격 시간을 지칭하며, 이하에서는 "액적 클럭"으로 지칭한다).
도 5a 내지 5d는 유세포분석기(1)의 액적 카메라(4)에 의해 촬상된 액적의 이미지들의 예들을 도시한 사진들이고, 상이한 시간들에서 촬상된 이미지들을 나타낸다(도 5a 내지 5d 참조). 보다 구체적으로, 도 5a 내지 5d는 미세입자가 검출 유닛(3)에 의해 검출된 시간(T0)에서 액적 카메라(4)에 의해 촬상된 액적 D가 제1 액적으로서 설정될 때 검출된 미세입자들이 그 안에 포함되는 액적들이 어느 것인지를 도시하는 사진 도면들이다. 또한, 각각의 사진 도면은 또한 복수의 촬상된 이미지가 함께 통합된 도면들일 수 있다.
도 5a 내지 5d에서, 용어 "섹션 1"은 이미지 P에서 미리 설정된 미리 결정된 영역을 지칭한다.
제어 유닛(7)은 액적 클럭의 간격으로 액적 카메라(4)에 의해 촬상된 액적 D의 복수의 이미지를 비교하고, 시간 T0으로부터 "섹션 1" 내의 세기의 합의 수(또는 밝은 스폿들의 수)가 최대치에 도달할 때까지의 시간을 대강의 지연 시간으로서 예비적으로 결정한다. 또한, 용어 "세기의 합"은 아래에 더 상세히 논의될 것이다. 부가적으로, "밝은 스폿"은 액적 카메라(4)에 의해 촬상된 액적 D의 이미지 내의 미리 결정된 임계치보다 더 높은 밝기를 갖는 화소들을 지칭하고, 레이저 L2에 의해 조사된 여기된 액적 D 내에 포함된 미세입자들의 이미지 정보의 항목이다.
도 5a 내지 5d에서, 본 기술의 예로서, 용어 "밝은 스폿"은 T0에서 오리피스(21)로부터 방출되고 액적 카메라(4)에 의해 촬상된 액적 D가 제1 액적로서 설정될 때, 30번째 내지 33번째 액적들이 방출될 때 액적 카메라(4)에 의해 촬상된 이미지들을 지칭한다. 예를 들어, 30번째 액적은 N=30으로 나타낸 사진 도면이다(도 5a 참조).
도 5a 내지 5d에 도시한 예에서, 제어 유닛(7)은 "섹션 1" 내의 밝은 스폿들 B의 수가 최대치에 도달하는 N=32의 이미지 정보(도 5c 참조)에 기초하여 32번째 액적 내에 포함된 미세입자들을 판별한다. 바꾸어 말하면, 제어 유닛(7)은 액적 클럭의 간격으로 액적 카메라(4)에 의해 촬상된 액적 D의 복수의 이미지를 비교하고, 미세입자들이 검출된 시간으로부터 32번째 액적이 방출되는 시간까지의 대강의 지연 시간을 대강의 지연 시간으로서 예비적으로 결정할 수 있다.
이 방식으로, 유세포분석기(1)에서, 복수의 상이한 시간과 관련하여 "섹션 1" 내의 이미지 정보 내의 세기의 합(또는 밝은 스폿들의 수)을 비교함으로써 지연 시간으로서 대강의 지연 시간을 예비적으로 결정하는 것이 가능하다.
2-6 이미지 영역 결정 단계 S6
이미지 영역 결정 단계 S6에서, 제어 유닛(7)은 액적 카메라(4)에 의해 촬상된 액적 D의 이미지 정보를 분석함으로써 복수의 이미지 영역을 결정한다. 한 실시예에서, 제어 유닛(7)은 액적 카메라(4)에 의해 촬상된 액적 이미지들(601)을 분석함으로써 복수의 이미지 영역을 결정한다.
용어 "복수의 이미지 영역"은 여기서 그 세기가 이미지들의 복수의 항목을 비교함으로써 계산된, 아래에 설명되는 것과 같이, 측정되고 드롭 지연 결정되고 복수의 상이한 시간에서 액적 카메라(4)에 의해 촬상된 액적 D의 세기 정보가 최대치에 도달하는 액적 이미지(601)의 영역들을 지칭한다. 또한, 용어 "복수의 상이한 시간"은 특정하게 제한되지 않지만, 예를 들어, 각각의 시간을 지칭하며, 그 사이의 간격은 진동 요소(13)가 오리피스(21)에 가하는 진동 주파수의 역수의 시간이다(바꾸어 말하면, 액적들 D 각각의 방출 간격 시간을 지칭하고, 이하에서는 "액적 클럭"으로 지칭한다).
복수의 이미지 영역을 결정하는 2가지 방법이 있다. 제1 방법은 액적들 D의 하부 에지를 검출하는 것과 관련되고 제2 방법은 액적들 D의 상부 에지를 검출하는 것과 관련된다. 보다 특정적으로, 제1 방법에서, 마지막으로 부착된 액적의 하부 에지 및 첫째로 분리된 액적의 하부 에지가 검출된다. 도 7a 내지 도 7c는 주어진 시간에 액적 이미지들(701, 702)(도 7a 및 7b) 및 교정 이미지들(711)(도 7c)의 예들을 도시한 사진들이고 제1 방법에 따른 복수의 이미지 영역을 결정하는 프로세스를 나타낸다. 보다 구체적으로, 도 7a에서, 마지막으로 부착된 액적(720)의 하부 에지 및 첫째로 분리된 액적(722)의 하부 에지가 도시된다. 마지막으로 부착된 액적(720)의 하부 에지와 첫째로 분리된 액적(722)의 하부 에지 사이의 거리에 의해 정해진 영역은 복수의 이미지 영역 중 하나인 최저 이미지 영역 S2이다. 마지막으로 부착된 액적(720)의 하부 에지와 첫째로 분리된 액적(722)의 하부 에지 사이의 이 거리는 일반적으로 이미지 영역 높이, 또는 이 특정한 경우에, S2 이미지 영역 높이(740)라고 할 수 있다. 한 실시예에서, 다른 이미지 영역들은 다음과 같이 결정된다. S2 이미지 영역 높이(740)가 측정되고, 동일한 거리가 최저 이미지 영역 S2 바로 위의, 2개의 더 많은 이미지 영역 S1 및 S0을 생성하기 위해 적용된다. 바람직하게는, 중간 이미지 영역은 (S1 이미지 영역 높이(742)를 갖는) S1로 라벨링되고 최고 이미지 영역은 (S0 이미지 영역 높이(744)를 갖는) S0으로 라벨링된다. 그러므로, 각각의 이미지 영역 S0, S1, S2는 동일한 이미지 영역 높이(740, 742, 744)를 갖는다. 도 7b는 도시된 3개의 이미지 영역 S0, S1, S2를 갖는 액적 이미지(702)을 도시하고 도 7c는 도시된 3개의 이미지 영역 S0, S1, S2를 또한 갖는, 도 7b의 교정 이미지(611)을 도시한다. 또 하나의 실시예에서, S2 이미지 영역 높이가 (위에 논의된 것과 같이) 결정된 후에 S1 이미지 영역 높이 및 S2 이미지 영역 높이가 각각 마지막으로 부착된 액적(720) 위의 2개의 부착된 액적 각각에 대한 하부 에지를 결정함으로써 개별적으로 결정된다. 그러므로, 본 실시예에서, S2, S1, 및 S0 이미지 영역 높이들(740, 742, 및 744)은 반드시 동일한 거리를 차지하지 않는다. 이미지 영역 높이들을 결정하기 위한 2개의 별개의 실시예로서 설명되었지만, 그들은 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들어, S2 및 S1 이미지 영역 높이들(740, 742)은 각각 제2 실시예에서 설명된 방법을 통해 개별적으로 일 수 있지만 S0 이미지 영역은 S2 및 S1 이미지 영역 높이들(740, 742)의 이미지 영역 높이를 복제함으로써 결정된다. 복수의 이미지 영역을 결정하는 제1 방법은 액적 스트림이 빠른 위성을 포함할 때 선호된다. 빠른 위성은 위성(730)이 궁극적으로 위성(730) 전의 액적들(즉, 도 7a 및 7b 내의 위성 아래의 액적)과 조합할 때이다. 이 방법을 사용하여 복수의 이미지 영역을 결정하는 것은 그것이 궁극적으로 조합하는 액적을 갖는 이미지 영역 내의 위성(730)을 포함한다. 또한, 도 7d는 제1 방법에 대한 액적 클럭(600)과 관련하여 LED 스트로브(603)와 교정 스트로브(613)의 한 실시예를 도시한다. 도 7d에 도시한 것과 같이, 본 예시적인 실시예에서의 교정 스트로브(613)와 LED 스트로브(603)는 동시에 종료하고, LED(603) 스트로브는 교정 스트로브(613)보다 짧다.
도 8a 내지 도 8c는 복수의 이미지 영역을 결정하는 제2 방법을 도시한다. 특히, 복수의 이미지 영역을 결정하는 제2 방법에서, 첫째로 분리된 액적(820)과 둘째로 분리된 액적(822)의 상부 에지가 검출된다. 도 8a에서, 첫째 및 둘째로 분리된 액적들(820, 822)의 상부 에지가 도시된다. 둘째로 분리된 액적(822)의 상부 에지와 첫째로 분리된 액적(822)의 상부 에지 사이의 거리에 의해 정해진 영역은 복수의 이미지 영역 중 하나인 최저 이미지 영역 S2이다. 둘째로 분리된 액적(822)의 상부 에지와 첫째로 분리된 액적(822)의 상부 에지 사이의 거리는 일반적으로 이미지 영역 높이, 또는 이 특정한 경우에, S2 이미지 영역 높이(840)라고 할 수 있다. 한 실시예에서, 다른 이미지 영역들은 다음과 같이 결정된다. S2 이미지 영역 높이(840)가 측정되고, 동일한 거리가 최저 이미지 영역 S2 바로 위의, 2개의 더 많은 이미지 영역 S1 및 S0을 생성하기 위해 적용된다. 바람직하게는, 중간 이미지 영역은 (S1 이미지 영역 높이(842)를 갖는) S1로 라벨링되고 최고 이미지 영역은 (S0 이미지 영역 높이(844)를 갖는) S0으로 라벨링된다. 그러므로, 각각의 이미지 영역 S0, S1, S2는 동일한 이미지 영역 높이(840, 842, 844)를 갖는다. 도 8b는 도시된 3개의 이미지 영역 S0, S1, S2를 갖는 액적 이미지(802)을 도시하고 도 8c는 도시된 3개의 이미지 영역 S0, S1, S2를 또한 갖는, 도 8b의 교정 이미지(811)을 도시한다. 또 하나의 실시예에서, S2 이미지 영역 높이(840)가 (위에 논의된 것과 같이) 결정된 후에 S1 이미지 영역 높이(842) 및 S2 이미지 영역 높이(844)가 각각 마지막으로 부착된 액적의 상부 에지 및 마지막으로 부착된 액적 위의 액적의 상부 에지를 결정함으로써 개별적으로 결정된다. 그러므로, 본 실시예에서, S2, S1, 및 S0 이미지 영역 높이들(840, 842, 및 844)은 반드시 동일한 거리를 차지하지 않는다. 이미지 영역 높이들을 결정하기 위한 2개의 별개의 실시예로서 설명되었지만, 그들은 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들어, S2 및 S1 이미지 영역 높이들(840, 842)은 각각 제2 실시예에서 설명된 방법을 통해 개별적으로 일 수 있지만 S0 이미지 영역은 제1 실시예에서 설명된 방법을 통해 S2 및 S1 이미지 영역 높이들(840, 842)의 이미지 영역 높이를 복제함으로써 결정된다. 복수의 이미지 영역을 결정하는 제2 방법은 액적 스트림이 느린 위성을 포함할 때 선호된다. 느린 위성은 위성이 궁극적으로 위성 다음의 액적들(즉, 도 8a 및 8b 내의 위성 위의 액적)과 조합할 때이다. 이 방법을 사용하여 복수의 이미지 영역을 결정하는 것은 그것이 궁극적으로 조합하는 액적을 갖는 이미지 영역 내의 위성(830)을 포함한다. 또한, 도 8d는 제2 방법에 대한 액적 클럭(600)과 관련하여 LED 스트로브(603)와 교정 스트로브(613)의 한 실시예를 도시한다. 도 7d에 도시한 것과 같이, 본 예시적인 실시예에서의 교정 스트로브(613)와 LED 스트로브(603)는 동시에 시작하고, LED 스트로브(603)는 교정 스트로브(613)보다 짧다.
2-7 미세한 지연 시간 결정 단계
도 4에 도시한 지연 시간 결정 단계 S7에서, 먼저, 제어 유닛(7)은 액적 카메라(4)에 의해 촬상된 액적 D의 복수의 이미지 영역에 기초하여 위에 설명된 인접한 정보를 참조한다. 도 8 내지 도 10을 참조하여 방법이 아래에 설명된다. 또한, 인접한 정보는 복수의 이미지 영역 내의 세기의 합과 관련된 정보이다.
2-7-0 일반적인 미세한 지연 시간 결정 단계들
첫째, 교정 이미지들의 배경 세기가 LED 스트로브도 교정 레이저도 여기되지 않는 이미지를 획득함으로써 결정된다. 본질적으로, 배경 세기는 광원은 없지만 존재할 수 있는 임의의 배경 광에 대한 이미지이다.
둘째, 액적들의 교정 이미지들이 미리 설정된 지연 시간에서 취해지고 누적된다. 복수의 교정 이미지가 카메라에 의해 찍힌다. 액적들 내의 비드들의 형광성이 약할 때, 복수의 액적 이미지가 최종 교정 이미지를 획득하도록 집합될 수 있다. 임의의 수의 교정 이미지들이 최종 교정 이미지를 획득하도록 집합될 수 있다. 교정 이미지들의 집합은 더 밝은 스폿들을 갖게 측정될 교정 이미지를 획득하는 데 도움을 준다.
셋째, 배경 세기가 (그것이 단일 교정 이미지인지 또는 다수의 교정 이미지의 집합인지에 따라) 교정 이미지으로부터 빼진다. 단일 배경 세기의 합이 빼질 수 있거나, 집합된 교정 이미지들의 수로 곱해진 배경 세기의 합이 빼질 수 있다.
넷째, 교정 이미지가 (그것이 단일 교정 이미지인지 또는 다수의 교정 이미지의 집합인지에 따라) 획득된 후에 이미지 영역들 각각의 세기의 합이 결정된다. 이 프로세스에서, 각각의 이미지 영역은 복수의 이미지 영역 서브-영역으로 나누어진다. 예를 들어, 이미지 영역은 교정 이미지 내의 각각의 화소에 의해 정해진 서브-영역들을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 서브-영역들은 형상이 직사각형(예를 들어, 정사각형)이지만, 3개 이상의 변을 갖는 기타 기하학적 형상이 적절하다. 유사하게, 서브-영역들이 모두 동일한 면적을 가질 수 있지만, 본 방법은 서브-영역들이 모두 동일한 면적들을 갖는 방법들로 제한되지 않는다. 각각의 서브 영역이 설정되고 나서, 각각의 개별적인 서브-영역의 세기가 결정된다. 예를 들어, 서브-영역은 카메라가 화소당 8비트의 데이터에 대해 가능하게 사용될 때 0 내지 255의 세기 범위를 가질 수 있다. 대안적으로, 화소당 10비트의 데이터를 가능하게 하는 카메라는 0 내지 1024의 세기 범위를 가질 것이다. 세기는 교정 이미지에 기초하여 측정된다. 각각의 개별적인 서브-영역의 세기가 결정되고 나서, 이미지 영역 내의 모든 서브-영역들의 세기들이 합이 개별적인 서브-영역 세기들을 합함으로써 결정된다. 이 프로세스는 각각의 이미지 영역이 세기 값의 그 자신의 합을 갖도록 각각의 이미지 영역에 대해 반복된다. 각각의 이미지 영역(S0, S1, 및 S2)에 대한 세기 값의 이 합이 그래프 상에 플롯된다.
다섯째, 새로운 지연 시간이 선택되고, 선행 문단들의 제2 내지 제4 단계들이 반복된다. 이 단계 자체는 다음에 이미지 영역들 각각에 대한 세기 값의 합이 2개 이상의 지연 시간에 대해 결정될 때까지 반복된다. 한 실시예에서, 세기들의 합이 결정되는 2개 이상의 지연 시간은 복수의 지연 시간 값에 걸친다. 예를 들어, 2개 이상의 지연 시간은 3개 또는 5개의 완전한 지연 시간 기간 모두에 걸친다. 또 하나의 실시예에서, 세기의 합들이 결정되는 2개 이상의 지연 시간은 등가 간격들에 있다. 예를 들어, 지연 시간 기간이 360도일 때, 세기의 합들이 결정되는 각각의 지연 시간은 20도만큼 분리된다. 이 예에서 세기의 합들이 결정되는 55개의 총 지연 시간이 3개의 완전한 지연 시간의 기간에 대해 그렇게 이루어질 때 발생할 것이다(예를 들어, 지연 시간들: 30, 30+20°, 30+40°, ... , 33). 대안적인 실시예에서, 세기의 합들이 결정되는 지연 시간들은 40도, 60도, 또는 90도만큼 분리된다. 세기의 합들이 결정되는 각각의 지연 시간에서, S0, S1, 및 S2에 대한 세기의 합이 그래프 상에 플롯된다. 이러한 그래프들의 예들이 (아래에 상세히 논의되는) 도 8-10에 도시된다. 3개의 완전한 지연 시간 기간이 플롯되는 방법들에 대해, 세기의 합들이 결정되는 제1 지연 시간은 위에 결정된 대강의 지연 시간보다 적은 하나의 완전한 지연 시간 기간에 있을 수 있다. 예를 들어, 대강의 지연 시간이 30이면, 이 반복 프로세스는 지연 시간 29에서 시작하고 각각의 연속 간격으로 이미지 영역들의 세기의 합들을 계속 측정할 것이다(즉, 20도 간격들이 선택될 때: 지연 시간 29, 29+20°, 29+40°, ... , 32). 그러나, 당신은 또한 대강의 지연 시간보다 적은 2개의 지연 시간에서 시작하고 3개의 지연 기간에 대해 진행할 것이다(즉, 대강의 지연 시간보다 큰 하나의 지연 시간까지). 대강의 지연 시간이 그 범위 내에 포함되는 한, 대강의 지연 시간 주위의 임의의 범위가 허용가능하다.
마지막으로, 각각의 이미지 영역에 대한 세기의 합들 각각이 (위에 논의된 것과 같이) 결정되고 그래프 상에 플롯되고 미세한 지연 시간이 아래의 방법들 중 하나를 사용하여 결정된다.
2-7-1 제1 미세한 지연 시간 결정 방법
먼저, 지연 시간이 모든 3개의 이미지 영역 S0, S1, S2의 세기의 합을 참조하여 결정되는, 제1 지연 시간 결정 방법에 대해 도 9를 참조하여 설명이 이루어질 것이다.
도 9는 3개의 드롭 지연 시간의 기간에 걸쳐, 각각의 이미지 영역 S0, S1, S2에 대한 세기 측정들의 합의 그래픽 표현이다. x-축은 드롭 지연 시간(910)을 나타내고, 좌측 상의 y-축은 세기의 합(911)을 나타내고, 우측 상의 y-축은 S1 비(912)를 나타낸다(아래에 설명됨). 도 9에서, 선(900)은 영역 S0에 대한 다양한 드롭 지연 시간들에서의 세기의 합을 나타내고, 선(901)은 영역 S1에 대한 다양한 드롭 지연 시간들에서의 세기의 합을 나타내고, 선(902)은 영역 S2에 대한 다양한 드롭 지연 시간들에서의 세기의 합을 나타내고, 선(905)은 S1 비를 나타낸다(아래에 설명됨).
다음에, S1 비가 결정된다. S1 비는 다음의 식을 사용하여 결정된다:
Figure pct00002
S1 비 식에서, S1은 주어진 드롭 지연 시간에서의 이미지 영역 S1의 세기의 합을 나타내고, S2는 주어진 드롭 지연 시간에서의 이미지 영역 S2의 세기의 합을 나타내고, S0은 주어진 드롭 지연 시간에서의 이미지 영역 S0의 세기의 합을 나타낸다. S1 비는 세기의 합이 상기 단계에서 측정되는 각각의 드롭 지연 시간에 대해 측정되고, 그 결과들이 도 9에 선(905)으로서 그래프 상에 플롯된다.
이것으로부터, 최적의 드롭 지연 시간의 추정이 S1 비가 최대화되는 드롭 지연 시간을 결정함으로써 결정될 수 있다. 이것은 도 9의 그래프를 검토함으로써 달성될 수 있다. 대안적으로, 선(905)으로 표시된 S1 비 값들의 플롯이 다항식 근사를 사용하여 근사화될 수 있다. 한 실시예에서, 6차 다항식 근사가 선(905)으로 표시된 S1 비 값들의 세트를 최상으로 맞추는 식을 결정하기 위해 사용된다. 근사로부터, S1 비에 대한 최대 값이 수학적으로 결정될 수 있고, 여기서 S1 비에 대한 최대 값이 최적의 지연 시간을 나타낸다.
상기에 따라, 유세포분석기(1)에서, 제어 유닛(7)은 액적들의 각각의 이미지 영역 S0, S1, S2의 세기의 합에 관한 인접한 정보를 참조함으로써 지연 시간을 계산한다. 이 방식으로, 유세포분석기(1)에서, 최적의 드롭 지연 시간은 마지막으로 부착된 액적이 최대 수의 비드들을 포함하는 점에서의 드롭 지연을 나타낼 것이고, 동시에, 전자와 후자 액적들은 최소 수의 비드들을 포함한다. 그러므로, 액적들에 전하를 정확하고 자동으로 인가하는 것이 가능하다.
또한, 본 단계 S7의 예인 제1 지연 시간 결정 방법은 샘플 내에 포함된 미세입자들의 검출이 마이크로칩(2)에서 수행되고 액적 D에의 전하의 인가가 공기 중에서 수행되는 경우에 선호적으로 사용된다. 바꾸어 말하면, 샘플들의 속도는 마이크로칩(2) 내부에서와 공기 중 사이에서 변화하고, 그러므로 전하가 샘플에 인가되는 타이밍을 조정하는 것이 필요한 경우에, 제1 지연 시간 결정 방법을 사용하여 지연 시간을 결정하는 것이 특히 효과적이다.
2-7-2 제2 미세한 지연 시간 결정 방법
다음에, 지연 시간이 이미지 영역들 S0 및 S2의 세기들의 합의 최소를 구함으로써 결정되는, 제2 지연 시간 결정 방법에 대해 도 10을 참조하여 설명이 이루어질 것이다. 이 방법에서, 단계들 모두가 제1 방법(단계 2-7-1)에서와 동일하게 수행되지만, 여기서 최적의 드롭 지연 값이 이미지 영역들 S0 및 S2가 조합될 때 세기 값들의 합의 최소를 구함으로써 결정된다. 도 10에서, 선(1000)은 영역 S0의 세기의 측정된 합들을 나타내고 선(1002)은 영역 S2의 세기의 측정된 합들을 나타낸다.
2-7-3 제3 미세한 지연 시간 결정 방법
다음에, 지연 시간이 이미지 영역 S1의 세기들의 합의 최대치를 구함으로써 결정되는, 제3 지연 시간 결정 방법에 대해 도 11을 참조하여 설명이 이루어질 것이다. 이 방법에서, 단계들 모두가 제1 방법(단계 2-7-1)에서와 동일하게 수행되지만, 여기서 최적의 드롭 지연 값이 이미지 영역 S1의 세기 값들의 합의 최대치를 구함으로써 결정된다. 도 11에서, 선(1101)은 영역 S1의 세기의 측정된 합들을 나타낸다.
2-7-4 대안적인 특징들
상기 단계들은 검출된 입자들의 최대 수가 마지막으로 부착된 액적(즉, 이미지 영역 S1) 내에 있을 때를 결정하는 방법들을 설명한다. 이들 실시예에서, (S8에서 아래에 상세히 논의되는) 미세입자 분류 단계는 입자들이 마지막으로 부착된 액적 내에 위치할 때 액적 내의 입자들에 전하를 인가하고 전하가 인가된 입자들은 다음에 이 전하에 기초하여 분류된다. 그러나, 배경 잡음 또는 다른 문제들로 인해, 더 선명하고 더 높은 품질의 교정 이미지들이 액적 스트림 내의 대안적인 위치들에서 획득될 수 있다. 그것이 이 경우이고, 미세한 드롭 지연 시간이 마지막으로 부착된 액적 내에 위치하지 않은 입자들의 세트에 의해 결정되면, 입자들이 마지막으로 부착된 액적 내에 위치할 때를 결정하기 위해 필요한 미세한 지연 시간이 취득된 미세한 지연 시간으로부터 지연 시간들을 간단히 가산 또는 감산함으로써 결정될 수 있다. 예를 들어, 미세한 지연 시간이 마지막으로 부착된 액적로부터의 2개의 액적 업스트림인 액적 내의 입자들의 수를 최대화함으로써 결정되면, 계산된 미세한 지연 시간은 단지 입자들이 마지막으로 부착된 액적 내에 위치할 때에 대한 미세한 지연 시간을 결정하기 위해 그에 더해지는 2개의 지연 시간을 가질 필요가 있다. 한 실시예에서, 최고 품질 교정 이미지들이 획득되고 마지막으로 부착된 액적이 이미지 영역 S2로서 정해지고, 그 위의 액적은 이미지 영역 S1이고, 그 위의 액적은 이미지 영역 S0이고, 여기서 미세한 지연 시간이 이미지 영역 S1 내의 세기의 합을 최대화함으로써 결정된다. 본 실시예에서, (액적 내의 원하는 입자들의 수에 대응하는) 이미지 영역 S1에서의 세기의 합을 최대화하는 미세한 지연 시간이 결정되고 나서, 하나의 지연 시간이 마지막으로 부착된 액적 내의 원하는 입자들의 수를 최대화하기 위한 지연 시간을 얻기 위해 그에 간단히 더해진다.
2-8 미세입자 분류 단계 S8
도 11은 세포들과 같은 미세입자들이 유세포분석기(1)에서 분류되는 단계 S8을 도시한 흐름도이다. 미세입자 분류 단계 S8에서, 유세포분석기(1)는 위에 설명된 단계들 S1 내지 S7에서 결정된 지연 시간에 기초하여 세포들과 같은 미세입자들을 포함하는 액적들의 분류를 수행한다. 궤적 방향 판별 단계는 "미세입자 검출 단계 S-8-1" 및 "액적 방출 및 전하 인가 단계 S-8-2"의 프로세스들을 포함한다. 아래에 각각의 프로세스에 대해 설명될 것이다.
2-8-1 미세입자 검출 단계
먼저, 본 단계 S-*-1에서, 검출 유닛(3)은 미세입자들을 검출한다. 검출 방법은 위에 설명된 단계 S1에서의 프로세스와 동일한 방식으로 수행될 수 있다.
2-8-2 액적 방출 및 전하 인가 단계 S-8-2
다음에, 본 단계 S-8-2에서, 세포들과 같은 미세입자들이 검출 유닛(3)에 의해 검출된 시간으로부터 결정된 지연 시간이 경과하고 나서, 제어 유닛(7)은 미세입자들을 포함하는 액적들에 대해 전하 인가를 수행하기 위해 충전 유닛(11)에 신호를 출력한다(도 11 참조). 또한, 충전 유닛(11)은 액적들에 전하를 인가한다.
다양한 수정들, 조합들, 부조합들 및 변경들이 그들이 첨부된 청구범위 또는 그것의 등가물들의 범위 내에 있는 한, 설계 요건들 및 다른 인자들에 따라 이루어질 수 있다는 것을 본 기술 분야의 통상의 기술자들은 이해하여야 한다.

Claims (20)

  1. 미세입자 분류 장치로서,
    유로를 통해 흐르는 미세입자들을 검출하도록 구성된 검출기;
    상기 미세입자들 중 적어도 하나를 포함하는 액적(droplet)의 이미지를 획득하도록 구성된 촬상 디바이스 - 상기 액적은 상기 유로 상에 제공된 오리피스로부터 방출됨 -; 및
    제어기
    를 포함하고, 상기 제어기는,
    상기 이미지를 획득하도록 상기 촬상 디바이스를 제어하고 - 상기 이미지는 제1 및 제2 이미지 영역을 가지며, 상기 제1 및 제2 이미지 영역은 각각 복수의 서브-영역을 가짐 -;
    상기 서브-영역들 각각에 대한 이미지 밝기의 세기를 결정하고;
    상기 제1 이미지 영역 및 상기 제2 이미지 영역 각각의 세기의 합을 획득하기 위해 상기 제1 및 제2 이미지 영역들 각각 내의 상기 서브-영역들 각각에 대한 상기 이미지 밝기의 세기를 더하고;
    상기 제1 및 제2 이미지 영역들의 세기의 합을 검사하고 세기 특성들의 최대 합을 식별함으로써 지연 시간을 결정하고;
    상기 지연 시간에 기초하여 상기 액적들에 전하를 인가하는 타이밍을 설정하도록
    구성되는 미세입자 분류 장치.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제1 및 제2 이미지 영역들 각각의 세기의 합은 복수의 상이한 시간에서 결정되는 미세입자 분류 장치.
  3. 제2항에 있어서, 상기 복수의 상이한 시간은 액적 클럭 사이클에 기초하고 3개의 액적 클럭 사이클에 걸치는 미세입자 분류 장치.
  4. 제3항에 있어서, 각각의 액적 클럭 사이클은 360도로 이루어지고, 상기 복수의 상이한 시간은 20도 간격들에서 발생하는 미세입자 분류 장치.
  5. 제3항에 있어서, 각각의 액적 클럭 사이클은 360도로 이루어지고, 상기 복수의 상이한 시간은 40도 간격들에서 발생하는 미세입자 분류 장치.
  6. 제3항에 있어서, 각각의 액적 클럭 사이클은 360도로 이루어지고, 상기 복수의 상이한 시간은 60도 간격들에서 발생하는 미세입자 분류 장치.
  7. 제1항에 있어서, 상기 이미지는 복수의 서브-영역을 갖는 제3 이미지 영역을 추가로 포함하고, 상기 제어기는 부가적으로
    상기 제3 이미지 영역 내의 상기 서브-영역들 각각에 대한 이미지 밝기의 세기를 결정하고;
    상기 제3 이미지 영역의 세기의 합을 획득하기 위해 상기 제3 이미지 영역 내의 상기 서브-영역들 각각에 대한 상기 이미지 밝기의 세기를 더하도록 구성되고;
    상기 지연 시간은 상기 제3 이미지 영역의 세기의 합을 검사함으로써 추가로 결정되는 미세입자 분류 장치.
  8. 제7항에 있어서, 세기 특성의 상기 최대 합은 제1 이미지 영역 비(first image region ratio):
    Figure pct00003
    를 계산함으로써 결정되는 미세입자 분류 장치.
  9. 제8항에 있어서, 상기 제1 이미지 영역은 마지막으로 부착된 액적과 연관되는 미세입자 분류 장치.
  10. 제9항에 있어서, 상기 제2 이미지 영역은 상기 제1 이미지 영역에 인접하고, 상기 제3 이미지 영역은 상기 제2 이미지 영역 또는 상기 제1 이미지 영역에 인접하는 미세입자 분류 장치.
  11. 제8항에 있어서, 상기 제1 이미지 영역은 액적 스트림 내의 마지막으로 부착된 액적 이후의 액적과 연관되는 미세입자 분류 장치.
  12. 제11항에 있어서, 상기 제2 이미지 영역은 상기 제1 이미지 영역에 인접하고, 상기 제3 이미지 영역은 상기 제2 이미지 영역 또는 상기 제1 이미지 영역에 인접하는 미세입자 분류 장치.
  13. 제7항에 있어서, 세기 특성의 상기 최대 합은 상기 제2 이미지 영역의 세기의 합, 상기 제3 이미지 영역의 세기의 합 중 어느 하나, 또는 둘 다를 최소화함으로써 결정되는 미세입자 분류 장치.
  14. 제7항에 있어서, 세기 특성의 상기 최대 합은 상기 제1 이미지 영역의 세기의 합을 최대화함으로써 결정되는 미세입자 분류 장치.
  15. 미세입자 분류 장치로서,
    유로를 통해 흐르는 미세입자들을 검출하도록 구성된 검출기;
    상기 미세입자들 중 적어도 하나를 포함하는 액적의 이미지를 획득하도록 구성된 촬상 디바이스 - 상기 액적은 액적 스트림을 생성하는 상기 유로 상에 제공된 오리피스로부터 방출됨 -; 및
    제어기
    를 포함하고, 상기 제어기는,
    상기 이미지를 획득하도록 상기 촬상 디바이스를 제어하고 - 상기 이미지는 제1 복수의 서브-영역을 갖는 제1 이미지 영역, 제2 복수의 서브-영역을 갖는 제2 이미지 영역, 및 제3 복수의 서브-영역을 갖는 제3 이미지 영역을 포함함 -;
    복수의 상이한 시간에서 상기 이미지를 획득하고;
    상기 복수의 상이한 시간 각각에 대해, 상기 제1 복수의 서브-영역 각각, 상기 제2 복수의 서브-영역 각각, 및 상기 제3 복수의 서브-영역 각각에 대한 밝기의 세기를 결정하고;
    제1 이미지 영역 세기의 합을 획득하기 위해 상기 제1 복수의 서브-영역 각각에 대한 상기 밝기의 세기, 제2 이미지 영역 세기의 합을 획득하기 위해 상기 제2 복수의 서브-영역 각각에 대한 상기 밝기의 세기, 및 제3 이미지 영역 세기의 합을 획득하기 위해 상기 제3 복수의 서브-영역 각각에 대한 상기 밝기의 세기를 더함으로써, 상기 복수의 상이한 시간 각각에서 제1 이미지 영역 세기의 합, 제2 이미지 영역 세기의 합, 및 제3 이미지 영역 세기의 합을 획득하고;
    상기 검출기가 상기 유로를 통해 흐르는 미세입자들을 검출한 시간으로부터 세기 특성의 최대 합을 결정함으로써 상기 제1 이미지 영역 세기의 합이 최대치에 있는 시간까지의 지연 시간을 결정하고;
    상기 지연 시간에 기초하여 상기 액적들에 전하를 인가하는 타이밍을 설정하도록
    구성되는 미세입자 분류 장치.
  16. 제15항에 있어서, 상기 제1 이미지 영역은 상기 액적 스트립의 마지막으로 부착된 액적과 연관되는 미세입자 분류 장치.
  17. 제15항에 있어서, 상기 제1 이미지 영역은 상기 액적 스트립의 마지막으로 부착된 액적 이후의 액적과 연관되는 미세입자 분류 장치.
  18. 제17항에 있어서, 상기 지연 시간은 액적 클럭 사이클에 기초하고;
    상기 전하는 상기 마지막으로 부착된 액적에 인가되고;
    +1 액적 클럭 사이클은 상기 마지막으로 부착된 액적에 대한 상기 지연 시간을 획득하기 위해 상기 지연 시간에 더해지는 미세입자 분류 장치.
  19. 제15항에 있어서, 상기 복수의 상이한 시간은 액적 클럭 사이클에 기초한 간격들에서 발생하고;
    상기 액적 클럭 사이클은 360도로 이루어지고, 상기 복수의 상이한 시간은 3개의 액적 클럭 사이클에 걸치는 20도 또는 40도 간격들에서 발생하는 미세입자 분류 장치.
  20. 제19항에 있어서, 세기 특성의 상기 최대 합은 제1 이미지 영역 세기 비의 합(first image region sum of intensity ratio):
    Figure pct00004
    을 사용하여 결정되는 미세입자 분류 장치.
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