KR20190115038A - Co2 및 다른 c1 기질의 식물성 영양분, 비료, 바이오자극제로의 미생물적 전환 및 가속화된 토양 탄소 격리를 위한 시스템 - Google Patents

Co2 및 다른 c1 기질의 식물성 영양분, 비료, 바이오자극제로의 미생물적 전환 및 가속화된 토양 탄소 격리를 위한 시스템 Download PDF

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존 리드
질 겔러
소날리 한데
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키버디, 인코퍼레이티드
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Abstract

재생가능한 H2 및 폐기물 CO2 생산자 가스와 같은 가스성 기질 또는 합성가스를 직접적으로 인간 영양에, 또는 식물, 곰팡이 또는 다른 미생물을 위한 영양분으로서, 또는 토양 탄소, 질소 및 다른 미네랄 영양분의 공급원으로서 사용될 수 있는 고단백질 바이오매스로 전환시키는 미생물 및 생물공정이 제공된다. 본원에 기술된 공정에 사용되는 재생가능한 H2는 태양 또는 풍력을 사용한 전기분해에 의해 생성될 수 있다. 본원에 기술된 공정에서 사용된 생산자 가스는 폐기물 급식 원료 및/또는 바이오매스 잔류물, 산업적 공정의 폐가스 또는 천연 가스, 바이오가스 또는 매립 가스의 가스화를 포함하는 공급원으로부터 유래될 수 있다.

Description

CO2 및 다른 C1 기질의 식물성 영양분, 비료, 바이오자극제로의 미생물적 전환 및 가속화된 토양 탄소 격리를 위한 시스템
본 출원은 2017년 2월 3일자로 출원된 미국 가출원 제 62/454,347호의 우선권을 주장하며, 이는 본원에 이의 전문이 참조문헌으로 통합된다.
본 발명은 농업, 구체적으로 특히 유기 식물 및 곰팡이 영양 공급, 동물 사육 및 인간 영양 공급에 적용되는 화학 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 C1 기질 및 기타 무기 유입물로부터 생산된 유기 물질로부터 영양분 및 추출물을 획득하는 방법에 관한 것이고, 이는 농업 특히 유기 경작에서 바이오자극제 및/또는 바이오비료로서 및/또는 동물 사료에서 단백질 및 영양 보충제로서 및/또는 인간에서 영양 성분으로서 사용될 수 있다.
증가하는 식량 요구를 충족시키기 위해서는 지속가능하고 재생가능한 아미노산, 단백질, 비타민 및 기타 영양분의 공급원이 필요하다. 또한 식량 생산 시스템에서의 석탄, 석유 및 천연 가스의 이용에 기초한 물 소비 및 전세계 에너지 소비를 줄이는 것뿐만 아니라 대기로의 이산화탄소 및 기타 온실 가스 (GHG) 배출량을 감소시킬 필요가 존재한다. 전세계 경제에서의 수요 증가는 토지 및 수자원에 대한 압력을 증가시켜왔다. 식품 및 기타 농업적으로 유래된 산물을 생산하기 위해 전통적인 화석 탄화수소 투입에 대한 압력도 역시 가중되어 왔다. 현대 농업을 포함한 많은 산업은 농작물의 생산과 가공을 위한 유입물로서 화석 탄화수소 공급원의 이용가능성에 크게 의존하고 있다. 현행 관행에 대한 비용 효율적인 대안은 토지 이용, 자연 서식지, 물, 화석 자원 수요, 원재료 비용 및 온실 가스 배출에 미치는 상승 압력을 완화하는데 도움이 될 수 있다.
천연의 생화학적 대사 공정을 통해 기체 탄소를 고정하는 생물학적 시스템이 알려져 있다. 고등식물 작물에서 광합성을 기반으로 하는 현재의 농업 시스템은 하나의 분명한 예이다. 조류 시스템도 또한 광합성 반응을 통하여 CO2로부터 식품 및 다른 농업적으로 유래된 산물을 만들기 위해 개발되어 왔다. 또한 광합성을 통해 CO2로부터 순서대로 생산되는 당과 같은 고정된 탄소 급식 원료를 이용하는 종속영양성 반응 및 생산도 존재한다. 따라서 이들 종속영양 반응 및 생산은 광합성에 간접적으로 의존한다. 그러나, 현재의 농업, 축산 및 양식 관행 및 현재 이용되고 있는 광합성으로 유래된 영양분 및 사료는 많은 문제점과 한계를 직면하고 있다.
세계 농업 시스템은 다음의 두 가지 모순된 요구를 충족시키는 도전에 직면하고 있다: (A) 전세계 인구 증가로 인해 2050년까지 93억을 상회하는 수요에 부응하는 식량 생산의 증대, (B) 인간의 건강 및 환경에 미치는 농업의 해로운 영향의 감소 [T. Searchinger, C. Hanson, J. Ranganathan, B. Lipinski, R. Waite, R. Winterbottom, A. Dinshaw, and R. Heimlich, "The great balancing act," World Resources Institute Working Paper, Washington, DC, 2013]. 지난 반세기 동안 출현한 전세계 중산층은 더 나은 단백질 식이 요법을 위한 수요 증가를 부추겼다. 토지 이용 제한, 물 부족, 기후 변화 및 세계 시장에서 사료와 식품 가격의 장기간 인플레이션과 같은 식량 생산에 영향을 주거나 이로부터 초래하는 환경 문제뿐만 아니라 식량 단백질의 점차적인 부족에 대한 우려가 존재한다 [S. Matassa, N. Boon, and W. Verstraete (2015) "Resource recovery from used water: the manufacturing abilities of hydrogen-oxidizing bacteria" Water Research 68: 467-478 (http://view.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25462753)].
현재 사용되는 비료는 주로 무기 및/또는 합성 화합물로 구성된다. 그러나 유기질 비료 및 개량제의 사용에 대한 관심이 커지고 있다. 이러한 유기 물질은 토양 미생물에 의해 방출되는 암모늄, 질산염 및 황산염 이온과 같은 식물 영양분과 함께 토양에 첨가될 수 있다 [Wainwright, M., W. Nevell, and U. Skiba (1985) "Fertilizer potential of some commercially available forms of keratin microbial biomass" Enzyme Microb. Technol. 7: 108-110].
식물 및 곰팡이 영양분의 종합적인 공급원을 제공하는데 추가하여, 유기질 비료는 토양에 유기물로 기여하고, 이는 예를 들면 모래 토양 또는 저활성 점토 토양의 경우 개량제 효과로 인해 물리적, 화학적 및 생물학적 특성의 개선을 나타낸다. 토양 개량에 유용한 비료에는 미세영양분 및 효모, 세균 또는 곰팡이와 같은 유익한 미생물을 포함할 수 있다. 중국 특허 CN1911870은 토양 미생물을 증강시키고, 식물 성장을 촉진하며, 비료 이용 속도를 증가시키고, 질병 및 스트레스에 대한 식물 저항성을 증가시키는 식물 영양분을 기술하고 있다. 이러한 영양분은 Saccharomyces cerevisiae 효모, Lactobacillus plantarum 및 Lactobacillus acidophilus 세균 및 감자 또는 커피 유도체, 포도당, 펩톤, 황산 마그네슘 및 망간, 이칼륨 수소인산염 및 염화나트륨과 같은 기타 성분을 포함한다.
토양, 특히 식물의 근권에서 번성하는 많은 미생물이 존재한다. 상당수의 세균 및 곰팡이 종이 기능적 관련성을 갖고 식물과 함께 총체적 시스템을 구성하는 것은 잘 알려져 있다. 이들은 식물 성장에 미치는 유익한 효과를 발휘할 수 있다. 질소 고정제에 의해 유도된 질소 고정 효과가 콩과 식물뿐만 아니라 비-콩과 식물에도 중요한 것은 밝혀져 왔다. 더욱이, 일부 균주는 식물 성장을 위한 다수의 기능을 가진다. Azospirillum의 유익한 효과는 이의 질소 고정 및 뿌리 발달에 미치는 자극 효과 둘 다로부터 유래할 수 있다. 유사하게, Azotobacter가 질소를 제공할 뿐만 아니라, 다양한 성장-촉진 물질 무엇보다도 인돌 아세트산, 지베렐린 및 비타민 B를 생산하는 것으로 보고되어 왔다. 이들 물질은 뿌리 삼출물의 생산을 적어도 어느 정도 자극한다. 뿌리 삼출물은 다시 Azotobacter 에 의해 암모니아의 근권으로 배출을 자극하여, 토양 질소 함량을 증가시키는 것으로 보고되어 있다. 식물의 삼출물이 주는 효과와 유사한 효과는 유기질 비료에 포함된 유기 탄소에 기인하였다. 적합한 농장 퇴비, 녹색 퇴비 및 다른 유기 퇴비 및 비료의 사용은 Azotobacter에 의한 N2-고정을 증진할 수 있는 것으로 보고되었다. 이것은 질소 고정 반응이 질소 원자들 간 결합을 깨기 위하여 가용 유기 탄소로부터 많은 양의 에너지를 요구하는 점으로 인할 수 있다.
인산염 (P) 및 칼륨 (K)-용해화 세균은 불용성 P를 용해화하고 K를 토양에서 규산염으로부터 방출함으로써 식물에 의한 미네랄 섭취를 증진할 수 있다.
요약하면, 토양 미생물은 토양의 영양분 가용성에 기여할 수 있을뿐만 아니라 토양 입자를 안정적인 응집체에 결합하도록 돕고, 이는 토양 구조를 개선하고 침식 잠재력을 감소시키기 때문에 천연 토양 하위생태계에서 중요한 구성 성분이다.
자연 조건에서 자라는 식물의 대부분은 곰팡이 공생체와 연관된다. 곰팡이 공생 (myororhizal symbiosis)은 생태계의 생물적 및 지구화학적 부분을 연결하여 주변 토양 미세서식지와 뿌리를 연결하는 다리로서 역시 간주될 수 있다. Rhizobacteria는 식물 뿌리를 콜로니화하는 공생체 곰팡이의 능력을 개선하는 "공생체화 헬퍼 세균"으로서 작용할 수 있다.
최근에는, 농업 작물 생산의 지속가능성을 개선하면서 생산성도 증가시키려는 목표로 새로운 전략이 제안되어 왔다. 한 가지 유망한 접근법은 "바이오자극제 (biostimulant)"및/또는 "바이오비료 (biofertilizer)"로도 역시 정의되는 물질 및/또는 미생물의 적용이다 [P. Calvo, L. Nelson, and J. Kloepper (2014) "Agricultural uses of plant biostimulants," Plant and Soil 383(1-): 3-41, 2014. (http://dx.doi.org/10.1007/s11104-014-2131-8)].
미생물 산물의 식물에 적용은 농업적 목적을 위한 통상적인 화학물질과 대비하여 다음을 포함한 여러 이점을 갖는다: (i) 미생물 산물은 지금 사용되는 많은 화학물질보다 더 안전한 것으로 고려되고; (ii) 독성 물질 또는 미생물 자체가 먹이 사슬에 전혀 축적되지 않는다.
최근에는, 토양에 비료의 적용에 추가하여 엽상 식물 비료에 대한 관심이 증가하고 있다. 엽상 사육은 액체 비료를 이들의 잎에 직접적으로 적용함으로써 식물을 키우는 기술이다. 엽상 비료의 적용에서, 질소, 칼륨, 인, 칼슘 및 마그네슘과 같은 기본적인 화학 원소가 식물에 의해 요구되는 것은 인정된다. 다양한 원소의 효율 및 용인성을 증진할 수 있는 동반 화합물이 마찬가지로 매우 중요한 것도 역시 인식된다. 이러한 증진화 화합물은 아미노산, 부착제 및 계면활성제를 포함하며, 대부분이 현대의 엽상 비료에 포함되어 있다 ["Amino acid and soluble protein cocktail from waste keratin hydrolysed by a fungal keratinase of Paecilomyces marquandii"; Veselα, M., and Friedrich (2009) J., Biotechnology and Bioprocess Engineering 14: 84-90].
식물 "바이오자극제"는 때로 잎에 적용 시 또는 토양에 첨가될 때 식물 성장 및/또는 대사에 영향을 주는 비료가 아닌 성분을 말한다. 일부 식물 바이오자극제는 식물 호르몬을 상향 조절하거나 하향 조절하여 작용한다. 식물 바이오자극제는 일반적으로 아미노산, 펩티드 및 단백질 혼합물; 호르몬; 및 휴민 물질의 세 가지 카테고리 중 하나에 속한다.
바이오자극제는 작물 품질 매개변수 및 영양분 효율을 증진하고, 성장률, 광합성 속도, 작물 수확량, 식물 뿌리와 잎의 성장, 비생물적 스트레스 저항성 및 질병 내성을 증가시키고, 재배 토양을 개선하고, 잡초 성장을 대항하는 것으로 보고되어 왔다. 예시적인 식물 바이오자극제는 해초 추출물, 효모 추출물, 휴민산, 아미노산, 살리실산, 바이오고체, 가수분해된 단백질, 규산염 및/또는 합성 화합물을 기초로 하는 조성물을 포함한다. 예시적인 스트레스 요인은 열, 냉기, 가뭄, 마모, 과도한 수분, 염분, 알칼리성 또는 기타 유해한 토양 pH, 영양 결핍, 산화성, 중금속 독성 및 질병 등을 포함한다.
미생물적으로 유래된 바이오자극제 및 바이오비료에 대한 관심이 증가하고 있다. 예를 들면, 고바야시 등은 Saccharomyces cerevisiae 효모 추출물이 무기질 비료와 결합하여 완두 식물의 성장에 미치는 효과를 연구하였다["Effect of yeast extracts on higher plants", Kobayashi et al, Plant and Soil (1980), 57 (1)4: 1-7]. 헝가리 특허 HU9902060은 효모 Saccharomyces에 더하여 미량 원소, 복합화제, 완충제 및 아미노산, 휴민산, 효소, 당류 등과 같은 다수의 기타 영양분를 포함한 식물의 잎과 뿌리를 위한 수용성 비료 조성물을 기술하고 있다.
단백질 가수분해물 (PH)은 폴리펩티드, 올리고펩티드 및 아미노산의 혼합물을 포함하는 식물 바이오자극제의 중요한 카테고리이며, 이는 부분적인 가수분해를 사용하여 단백질성 급식 원료로부터 제조된다 [G. Schaafsma (2009) "Safety of protein hydrolysates, fractions thereof and bioactive peptides in human nutrition" European journal of clinical nutrition 63 (10): 1161-1168 (http://view.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19623200)]. PH는 특히 환경 스트레스 조건 하에서 과수, 작물, 꽃 작물 및 관상용 식물을 포함한 원예 작물 생산성 및 품질에 미치는 유익한 영향으로 인해 관심이 높아지는 주제가 되어 왔다. 이들은 싹 및 뿌리 바이오매스 및 생산성을 증가시키는 것으로 밝혀졌다 [K. Edward, G. Aneta, S. Agnieszka, and W. Renata, "The effect of cultivar type, time of cultivation, and biostimulant treatment on the yield of spinach (spinacia oleracea l.)," pp. 9+, 2013. [온라인]. 입수가능: http://dx.doi.org/10.2478/fhort-2013-0153; Lisiecka et al., 2011; N. Paraðikovic, T. Vinkovic, I. Vinkoviζ Vr
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ek, I. Zuntar, M. Bojic, and Medic-Saric, "Effect of natural biostimulants on yield and nutritional quality: an example of sweet yellow pepper (capsicum annuum l.) plants," J. Sci. Food Agric., vol. 91, no. 12, pp. 2146-2152, Sep. 2011. [온라인]. 입수가능: http://dx.doi.org/10.1002/jsfa.4431; G. Colla, Y. Rouphael, R. Canaguier, E. Svecova, and M. Cardarelli, "Biostimulant action of a plant-derived protein hydrolysate produced through enzymatic hydrolysis," Frontiers in Plant Science, vol. 5, p. 448, 2014. [온라인]. 입수가능: http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fpls.2014.00448; A. Ertani, D. Pizzeghello, O. Francioso, P. Sambo, S. Sanchez-Cortes, and S. Nardi, "Capsicum chinensis l. growth and nutraceutical properties are enhanced by biostimulants in a long-term period: chemical and metabolomic approaches." Frontiers in plant science, vol. 5, 2014. [온라인]. 입수가능: http://view.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25136346). 이들은 원예를 더 지속가능하게 만드는 효과적인 도구이며, 많은 연구가 여러 원예 작물의 성장, 수확량, 산물 품질, 자원 사용 효율 및 환경적 및 화학적 토양 스트레스에 대한 내성에 미치는 PH 적용의 유익을 기록하였다.
PH의 적용은 여러 원예 작물에서 식물 성장 및 거대- 및 미세 영양분 섭취를 촉진하여 작물 생산성을 증가시키는 것으로 나타났다. 채소 및 화훼 작물, 잎 식물 및 잔디의 발아 및 초기 성장을 증진하기 위한 PH로의 종자 코팅도 또한 유망한 응용 분야이다.
아미노산 및 작은 펩티드는 뿌리 및 잎 둘 다에 흡수된 다음 식물로 이전된다. 식물은 기공을 통해 아미노산을 흡수한다. 특정 식물의 경우, 아미노산은 질소의 주요 공급원이다 [Chapin, F. S., L. Moilanen, and K. Kielland (1993) "Preferential use of organic nitrogen for growth by a non-mycorrhizal arctic sedge" Nature 361: 150-153]. 자연에서, 잎 영양 공급은 브로멜리아드 (bromeliad)에서, 특히 착생 식물의 경우 질소 흡수의 매우 중요한 메커니즘이다 [Endres, L. and H. Mercier (2003) "Amino acid uptake and profile in bromeliads with different habits cultivated in vitro" Plant Physiol. Biochem. 41: 181-187]. 단백질 가수분해물 및 엽면 스프레이 형태의 잎 영양 공급은 단백질 합성을 위한 기성품 빌딩 블록을 제공한다.
뿌리/엽면 섭취에 이어서, 아미노산 및 펩티드는 식물의 대사와 발달을 돕기 위해 식물의 도관 시스템 (목질 및 체관)을 통하여 세포에서 세포로 장거리로 운반된다. 여러 부류의 통합 막 단백질은 식물에서 세포막을 통해 아미노산 및 펩티드 운반에 관여한다. 예를 들면, 라이신-히스티딘-유사 운반체 패밀리, 아미노산 투과효소 패밀리 및 프롤린 운반체 패밀리의 구성원은 뿌리를 통한 아미노산 섭취에 직접적인 역할을 담당한다. 아미노산 및 아미드는 대부분의 식물에서 유기 질소의 주요 운반 형태를 나타내며, 이들은 단백질 합성 및 기타 필수 질소 화합물에 직접적으로 사용되거나, 대사될 수 있다.
엽권 및 근권에 서식하는 미생물은 아미노산 및 펩티드을 위해 식물과 경쟁할뿐만 아니라 펩티드를 신호전달 화합물로서 작용할 수 있는 작은 단편으로 가수분해할 수 있는 효소를 분비하여 작물 반응을 조정하기 때문에 PH 적용에 대한 작물 반응에도 역시 영향을 줄 수 있다. 더욱이, 최근 연구는 양상추 상의 식물-유래된 PH의 적용이 N2-고정화, P-가용화 및 인돌 아세트산-생산하는 세균와 같은 바람직한, 자연 발생하는 미생물을 자극하는 것을 보여주었다. 상기 연구는 PH가 식물 성장의 미생물-매개된 증진을 통하여 식물 바이오자극제로서 작용할 수도 있음을 시사한다. 식물 잎 및 뿌리에 PH의 적용은 Fe 및 N 대사 및 영양분 섭취를 개선하고 질산염과 같은 바람직하지 않은 화합물의 농도를 감소시키며 거대- 및 미세 원소 및 물의 이용 효율을 개선하는 것으로 관찰되었다 [M. Cerdαn, A. Sαnchez-Sαnchez, J. D. Jordα, M. Juαrez, and J. Sαnchez-Andreu (2013) "Effect of commercial amino acids on iron nutrition of tomato plants grown under lime-induced iron deficiency," Z. Pflanzenernδhr. Bodenk. 176(6): 859-866 (http://dx.doi.org/10.1002/jpln.201200525); A. Ertani, L. Cavani, D. Pizzeghello, E. Brandellero, A. Altissimo, C. Ciavatta, and S. Nardi (2009) "Biostimulant activity of two protein hydrolyzates in the growth and nitrogen metabolism of maize seedlings" Z. Pflanzenernδhr. Bodenk 172(2): 237-244 (http://dx.doi.org/10.1002/jpln.200800174); M. Halpern, A. Bar-Tal, M. Ofek, D. Minz, T. Muller, and U. Yermiyahu (2015), The Use of Biostimulants for Enhancing Nutrient Uptake. Elsevier, vol. 130, pp. 141-174 (http://dx.doi.org/10.1016/bs.agron.2014.10.001)]. PH가 보충된 식물에서 영양분 섭취 증가가 기인하는 원인은 (A) 토양에서 효소적 및 미생물 활성의 증가, (B) 특히 Cu, Fe, Mn 및 Zn의 경우, 미세영양분 이동성 및 용해도의 개선, (C) 뿌리 밀도, 길이 및 곁 뿌리의 수와 같은 식물의 뿌리 구조에서 변화 및 (D) Fe (III)-킬레이트 환원효소, 질산 환원효소 및 글루타민 합성효소의 활성 증가를 포함한다 [M. Cerdαn, et al. (2013) 상기 문헌; A. Ertani, et al. (2009) 상기 문헌; A. M. Garc
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nez, A. D
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az, M. Tejada, J. Bautista, B. Rodr
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a, E. Revilla, and J. Parrado (2010) "Enzymatic production of an organic soil biostimulant from wheat-condensed distiller solubles: Effects on soil biochemistry and biodiversity" Process Biochemistry 45(7): 1127-1133 (http://dx.doi.org/10.1016/j.procbio.2010.04.005); G. Colla, Y. Rouphael, R. Canaguier, E. Svecova, and M. Cardarelli (2014) "Biostimulant action of a plant-derived protein hydrolysate produced through enzymatic hydrolysis" Frontiers in Plant Science 5: 448 (http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fpls.2014.00448); L. Lucini, Y. Rouphael, M. Cardarelli, R. Canaguier, P. Kumar, and G. Colla (2015) "The effect of a plant-derived biostimulant on metabolic profiling and crop performance of lettuce grown under saline conditions" Scientia Horticulturae 182: 124-133, Jan. 2015 (http://dx.doi.org/10.1016/j.scienta.2014.11.022)]. 아미노산이 미세영양분와 함께 적용될 때, 식물 내부에서 미세영양분의 흡수 및 운반이 용이할 수 있다.
단백질 가수분해물은 질소 대사 및 동화 작용을 자극하는 것으로 나타났다. 식물에서 증가된 질소 동화 작용에 대한 가능한 설명은 아미노산 생합성에 필요한 탄소 골격의 생산 및 에너지 공급에 미치는 PH의 긍정적인 효과일 수 있다.
아미노산과 펩티드는 신호전달 화합물로서 중요한 역할을 담당할 수 있다. 세포막 상의 특이적 수용체는 신호 전달을 위해 펩티드 (유도인자)와 상호작용하여 식물의 형태-생리 학적 및 생화학적 변화를 유도한다. PH는 식물의 식물호르몬 균형에 영향을 미치고, 트립토판과 같은 특이적 펩티드 및 식물호르몬 생합성 전구체의 작용을 통하여 식물의 발달에 영향을 줄 수 있다 [G. Colla, et al. (2014) 상기 문헌]. 다수의 상이한 식물에서 생성 된 생체 활성 펩티드는 호르몬 유사 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다 [Y. Ito, I. Nakanomyo, H. Motose, K. Iwamoto, S. Sawa, N. Dohmae, and H. Fukuda (2006) "Dodeca-CLE peptides as suppressors of plant stem cell differentiation" Science 313(5788): 842-845, (http://dx.doi.org/10.1126/science.1128436); T. Kondo, S. Sawa, A. Kinoshita, S. Mizuno, T. Kakimoto, H. Fukuda, and Y. Sakagami (2006) "A plant peptide encoded by CLV3 identified by in situ MALDI-TOF MS analysis" Science 313(5788): 845-848, Aug. 2006 (http://dx.doi.org/10.1126/science.1128439)]. 식물-유래된 PH는 작물 성능을 개선하였던 옥신 (auxin) 및 지베렐린 (gibberellin)-유사 활성을 유도하는 것으로 보고되어 왔다 [M. Schiavon, A. Ertani, and S. Nardi (2008) "Effects of an alfalfa protein hydrolysate on the gene expression and activity of enzymes of the tricarboxylic acid (TCA) cycle and nitrogen metabolism in zea mays l" Journal of agricultural and food chemistry 56(24): 11 800-11 808 (http://view.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19053364); A. Ertani, et al. (2009) 상기 문헌; G. Colla, et al. (2014) 상기 문헌].
포도 나무에서, 카제인 및 콩으로부터의 PH를 잎에 적용하면 잎에 레스베라트롤의 합성을 책임지는 스틸벤 합성효소 (예로, 레스베라트롤 합성효소)를 인코딩하는 유전자를 상향 조절하는 것으로 보고되었다. 둘 다의 가수분해물은 포도 곰팡이병 (downy mildew)의 원인균인 Plasmopara viticola에 대한 포도나무의 면역력을 증진하는 유도인자로서 작용하는 것으로 입증되었다. 중국 특허 CN1966663 ("복합 미생물 엽상 비료 세균제 및 이의 제조 방법 및 용도")는 Saccharomyces cerevisiae, Lactobacillus plantarum, Mucor racemosus 및 Aspergillus oryzae로 구성된 항균제를 기술하고 있다.
페닐프로파노이드 경로에 관련된 페닐알라닌 (티로신) 암모니아-용균효소의 증가된 유전자 발현과 같은 식물 유래된 PH에 의한 이차 대사의 활성화는 유익한 영양제학적 성질을 유도할 수 있다. 과일 및 채소에서 발견되는 식물화학적 화합물은 이들의 건강에 유익한 성질로 인해 과학자, 식품영양학자 및 생산자들 사이에 상당한 관심을 불러 일으켰다. 식물성 화학물질은 심장 혈관 문제, 허혈성 뇌졸중, 관절염 및 염증성 장뿐만 아니라 일부 암과 같은 만성 질환을 감소 또는 예방할 수 있는 천연 항산화 화합물이다. 여러 연구는 PH의 적용이 일차 및 이차 대사를 변형할 수 있어, 항산화 화합물 (카로티노이드, 폴리페놀, 플라보노이드 등)의 생산 및 축적을 자극하는 점을 발견하였다.
PH는 단백질 공급원 및 단백질 가수분해 방법에 기초하여 분류될 수 있다. PH는 현재 주로 동물- 또는 식물-유래된 원료로부터 공급되고, 일반적으로 화학적 및/또는 효소적 가수분해를 통하여 생산된다. [P. Maini (2006) "The experience of the first biostimulant, based on amino acids and peptides: a short retrospective review on the laboratory researches and the practical results" Fertilitas Agrorum 1(1): 29-43, 2006.; M. Schiavon, et al. (2008) 상기 문헌; M. Halpern, A. Bar-Tal, M. Ofek, D. Minz, T. Muller, and U. Yermiyahu (2015) "The Use of Biostimulants for Enhancing Nutrient Uptake" Elsevier vol. 130, pp. 141-174 (http://dx.doi.org/10.1016/bs.agron.2014.10.001)]. 단백질 공급원과 생산 공정 둘 다는 PH의 화학적 특징에 강하게 영향을 준다. [Cavani, L., C. Ciavatta, and C. Gessa (2003) "Determination of free L- and D- alanine in hydrolysed protein fertilizers by capillary electrophoresis" J. Chromatogr. A 985: 463-469]. 아미노산은 미세영양분에 미치는 킬레이팅 효과를 갖는다 [Koksal, A. I., H. Dumanoglu, N. T. Gunes, and M. Aktas (1999) "The effects of different amino acid chelate foliar fertilizers on yield, fruit quality, shoot growth and Fe, Zn, Cu, Mn content of leaves in Williams pear cultivar (Pyrus communis L.)" Turk. J. Agric. For. 23: 651-658.].
PH는 종종 효소적 가수분해를 통하여 생산된다. 이것은 동물 기관 (예로, 판크레아틴, 펩신), 식물 (예로, 브로멜라인, 피신, 파파인) 또는 미생물 (예로, 알칼라제, 플라보르자임, 케라티나제)로부터 기원할 수 있는 단백질 분해효소가 단백질 가수분해를 촉매하는 곳이다. 단백질 분해효소는 종종 특이적 펩티드 결합을 표적으로 한다 (예로, 판크레아틴은 아르기닌, 라이신, 티로신, 트립토판, 페닐알라닌 및 류신 결합에 인접한 결합에서 아미노산 사슬을 절단하고; 파파인은 아르기닌, 라이신 및 페닐알라닌에 인접하여 절단하고; 펩신은 페닐알라닌 또는 류신 결합이 존재하는 곳에서 절단하고; 케라티나제는 주로 세린 또는 금속 프로테아제이다). 중국 특허 CN19191800은 Saccharomyces cerevisiae 효모 슬러지를 물로 희석하여 에멀전을 획득하고, 이를 파파인, 중성 단백질 분해효소 및 염화나트륨과 혼합한 다음, 혼합물을 가수분해하고, 효소를 불 활성화하며, 최종적으로 획득된 산물을 농축하거나 건조시키는 과정에 의해 제조되는 식물 및 동물용 영양분을 기술하고 있다. 최종 산물은 빠른 흡수 속도의 영양분의 높은 함량을 포함한다.
순수한 화학적 가수분해와 비교하여 아미노산의 구조를 보존하고 에너지를 보존하도록 도울 수 있는 조합된 화학적 및 효소적 가수분해 공정이 개발되어 왔다.
아미노산 및 펩티드에 추가하여, PH는 바이오자극제 작용에 기여할 수 있는 다른 화합물을 포함한다. 이들 화합물에는 지방, 탄수화물, 페놀, 미네랄 원소, 식물호르몬 및 기타 유기 화합물 (예로, 폴리아민)이 포함된다.
농산업 부산물로부터 생성된 PH는 환경적 및 경제적 관점 모두에서 흥미로운 지속가능한 폐기물 처리 의 선택사양을 대표한다 [V. Kasparkova, K. Kolomaznik, L. Burketova, V. Sasek, and L. Simek (2009) "Characterization of low-molecular weight collagen hydrolysates prepared by combination of enzymatic and acid hydrolysis" The Journal of the American Leather Chemists Association 104(2): 46-51, 2009.; J. Pecha, T. F
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rst, K. Kolomazn
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k, V. Friebrovα, and P. Svoboda (2012) "Protein biostimulant foliar uptake modeling: The impact of climatic conditions" AIChE J. 58(7): 2010-2019 (http://dx.doi.org/10.1002/aic.12739); A. Baglieri, V. Cadili, C. Mozzetti Monterumici, M. Gennari, S. Tabasso, E. Montoneri, S. Nardi, and M. Negre (2014) "Fertilization of bean plants with tomato plants hydrolysates. effect on biomass production, chlorophyll content and n assimilation" Scientia Horticulturae 176: 194-199 (http://dx.doi.org/10.1016/j.scienta.2014.07.002)]. Celus, et al. (2007) "Enzymatic Hydrolysis Of Brewer's Spent Grain Proteins And Technofunctional Properties Of The Resulting Hydrolysates" J. Agric. Food Chem. 55(21): 8703-8710)은 알코올 발효 전에 과즙 생산으로부터 생성된 보리 맥아로부터의 불용성 잔류물이고, 양조 산업의 주요한 부산물을 구성하는 양조장 소비 곡물 또는 바가스 (BSG)의 단백질의 효소적 가수분해를 기술하고 있다. 생성된 가수분해물은 이상적인 발포 및 유화제 성질로 인해 식품 및 음료 산업에 사용된다. 스페인 특허 ES2329750 A1 ("양조 폐기물로부터 비료 산물을 얻기 위한 절차")은 과즙의 알코올 발효 후 양조 폐기물로부터 비료를 제조하는 다단계 공정을 기술하고 있다. 이 공정은 폐기물이 알칼리화 되고, 분리되어 액상을 얻은 다음 산 처리에 착수되고, 다시 이로부터 고체상이 분리되고, 마지막으로 효소적 가수분해 또는 산 가수분해로 처리하는 다양한 단계를 포함한다.
유기농 작물의 식용 부분에 이들 산물의 적용을 금지한 유럽 규정 제 354/2014호에 명시된 바와 같이, 식품 안전성의 견지에서 동물-유래된 PH의 연루성에 대한 걱정이 증가하고 있다. 동물-유래된 PH의 펩티드 분자량은 인간에게 BSE/TSE 프리온 전파의 임의의 위험성을 방지하기 위해 10kDa보다 낮아야 한다.
식물에 미치는 바이오자극제 효과에 추가하여, PH 및 단백질성 물질은 또한 더욱 일반적으로 버섯 및 곰팡이에 미치는 영양적 및 바이오자극제 효과를 갖으며 버섯 수확량을 개선할 수 있다[Kurbanoglu, E. B. and O. F. Algur (2002) "The influence of ram horn hydrolyzate on the crop yield of the mushroom Agaricus bisporus" Sci. Hortic. 94: 351-357]. 다수의 주요 재배 버섯 Agaricus bisporus, Coprinus quadrifidus, Lepista nuda 및 Pleurotus ostreatus가 세균을 직접적으로 용균시키고 소모할 수 있는 것으로 알려져 있다. A. bisporus (예로, 버튼, 크리미니, 포르타벨라) 및 P. ostreatus (예로, 굴 버섯)은 가장 널리 재배되는 두 가지의 식용 버섯이다. A. bisporus는 전형적으로 퇴비에서 성장하고, 여기서 퇴비의 미생물 바이오매스 성분은 질소, 탄소 및 미네랄의 공급원으로서 및 예비수로서 작용한다. 단백질이 풍부한 보충제는 버섯 퇴비 (예로, 성장 기질)에 첨가될 때 버섯 수율 (49 내지 61%)을 자극하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 단백질이 풍부한 보충제는 Pro-Fam® H200 FG 가수분해된 콩 단백질, 레모사의 시판되는 보충제, I-이소류신 (ile), 난백 단백질, 아미노 블렌드 HLA-198 가수분해된 유장, 면종자분, 대두분, 건조된 탈지유, 어분, 발아 맥아, 맥주 효모 산물, 카제인, 밀 배아, 해바라기 종자, 옥수수 글루텐 및 땅콩 단백질을 포함한다. [L C. Schisler and J. W. Sinden (1962) 논문 제목, "Nutrient Supplementation of Mushroom Compost at Spawning," Mushroom Science 5: 150-164 and "Nutrient Supplementation of Mushroom Compost at Casing" Mushroom Science 5: 267-280]. 이들 물질을 사용한 수율의 증가는 상대적으로 높은 이들의 질소 농도에 기인한다. 미국 특허 3,942,969는 변성된 단백질성 물질 (예로, 추출물)을 사용하는 버섯용 영양분 조성물을 기술하고 있다. 많은 버섯을 재배하는데 사용되는 천연 리그노셀룰로스는 영양분 함량이 제한되어 있으며, 일반적으로 화학적 및 생물학적 보충제의 형태로 보충을 요구한다. 기저 기질로 보충제를 첨가하는 것은 수율, 영양 및 약용 가치를 증진하기 위해 버섯 재배에서 공통인 관행이 되어왔다. 굴 버섯 (P. ostreatus)은 벼짚, 옥수수 줄기/속대, 식물성 식물 잔류물, 바가스 등을 포함한 다양한 리그노셀룰로스 기질 상에서 재배될 수 있다. 그러나, 이상적인 기질은 급속한 버섯 성장을 위한 질소 (보충제)를 포함해야 하는 것이 밝혀졌다. 질소 영양분 보충과 함께 기질에서 P. ostreatus의 성장은 생산성 및 영양가를 증가시켰다. 버섯 영양 보충에 관한 다른 연구도 역시 질소성 물질에 추가하여 버섯 퇴비에 식물성 지질 (지방성 물질)을 추가하는 것이 유익한 점을 보고하였다 [Schisler, L C. and J. W. Sinden (1966) "Nutrient Supplementation of Mushroom Compost at Casing―VegetabIe Oils" Can. J. BOL 44: 1063-1069; Schisler, L. C. (1967) "Stimulation of Yield 15 in the Cultivated Mushroom by Vegetable Oils" Appl Microbiol 15: 844-850; Schisler, L. C. and T. G. Patton, Jr. (1970) "Stimulation of Yield in the Cultivated Mushroom by Vegetable Oils: Effect of Sterols and Ethyl Linoleate" Agric Food Chem 18: 1102-1103 20].
수많은 비료, 바이오비료 및 시판되는 식물 바이오자극제에도 불구하고, 다양한 필요성에 부응할 수 있는 개선된 산물에 대한 요구가 계속되고 있다. 스트레스 요인에 대한 식물의 내성을 증가시키는 식물 바이오자극제가 필요하다. 경제적 이익이 있는 식물의 번식 속도를 증가시킬 필요가 있다. 현재 입수가능한 시판되는 산물보다 덜 빈번하게 적용될 때 효과적인 식물 바이오자극제 및 과도한 적용이 발생할 경우 식물 손상의 위험을 감소시키는 식물 바이오자극제가 필요하다. 또한 식용 작물의 영양분 이용 효율을 증가시키고 환경으로 침출되는 영양분을 감소시킬 필요가 있다.
곰팡이 및/또는 버섯 성장 증진제가 대규모의 상업적 규모로 사용가능할 필요가 여전히 있다. 세균 및 곰팡이를 포함한 경쟁 미생물의 성장을 자극하지 않으면서 성장하는 버섯 작물에 영양분을 첨가할 수 있는 성장 자극제가 필요하다. 퇴비의 온도를 균사 및 버섯 균사체의 성장을 저해할 수 있는 바람직하지 않게 높은 수준으로 상승시키지 않는 영양 보충제가 필요하다.
동물 또는 식물에서 유래되지 않는 PH와 함께, 최신의 동물 및 식물 유래된 단백질 가수분해물을 증가시킬 필요가 있다. 토양에 탄소가 빠르게 격리될 필요가 있으며, 일반적으로 탄소 중 절반 이상이 퇴비화 공정 동안 CO2 배출로서 손실되는 퇴비화와는 상반되게, 탄소의 대부분 또는 전부가 격리되는 탄소 폐기물 처리 공정이 필요하다 [S. M. Tiquia, T. L. Richard, and M. S. Honeyman (2002) "Carbon, nutrient, and mass loss during composting" Nutrient Cycling in Agroecosystems 62(1): 15-24].
미생물 단백질, 비타민 및 기타 생체분자를 식물 및/또는 곰팡이에 영양분으로서 공급하는 것에 추가하여 인간에 의한 이들 미생물 유래된 영양분의 직접적인 소비도 역시 선택사양이다. 그러나, 직접적인 인간 소비와 관련하여 우려할만한 영역은 영양분의 핵산 함량이다. 인간 영양 공급의 경우 SCP가 식이 요법의 중요한 부분을 구성하면, 효모로부터 유래된 것과 같은 단일 세포 단백질의 핵산 함량은 더 낮은 수준으로 감소되어야 할 수 있다. 국가 단백질 연구협회, 식품영양 위원회의 권장 매일 할당량은 70 킬로그램의 성인 남성의 경우 하루에 65 그램이며, 유엔 시스템의 단백질 자문 단체는 미생물 단백질로부터 매일 섭취하는 핵산의 양은 반드시 하루에 2 그램 미만일 것을 권장한다. 따라서, 이들 판정기준에 따라 SCP가 식이 단백질의 유일한 공급원이라면 단백질 대비 핵산 함량의 비율은 3% 미만이어야 한다. Candida utilis 및 Saccharomyces cerevisiae 종으로부터의 효모 세포와 같은 SCP의 일부 공급원의 핵산 함량은 조단백질 100 그램 당 약 12 내지 15 그램의 핵산일 수 있다. 따라서, 인간 영양 공급을 위해 실질적인 양의 이들 SCP 공급원의 활용을 가능하게 하도록, 핵산 함량을 몇 배로 감소시키는 방법이 개발되어 왔다.
세균, 효모 및 기타 미생물 세포는 종속영양 발효 시스템에서 당 급식 원료를 단백질 및 아미노산과 같은 유용한 유기 화합물로 가공하는데 적용되었다. 그러나, 이러한 시스템에는 유의한 단점이 존재한다. 종속영양 발효는 유기 탄소 영양분에서 성장하고 생산 균주와 경쟁할 수 있는 다른 종속영양 미생물이 주변 환경에 편재하기 때문에 오염에 취약하다. 또한 종속영양 기술은 일반적으로 식량 생산의 최신 방식과의 경쟁이라는 견지에서 한계를 겪는다. 많은 종속영양 시스템에서, 하나는 필수적으로 또 다른 식품 공급원을 만들기 위해 식품 공급원을 사용하는 것이다. 이것은 수많은 부정적인 환경적 영향과 비효율성을 초래할 수 있다.
CO2로부터 단백질 또는 아미노산을 생산하기 위한 독립영양성 미생물 시스템은 원래 인간 우주 비행 프로그램에서 제안되었다 [G. L. Drake, C. D. King, W. A. Johnson and E. A. Zuraw, "Study of life support systems for space missions exceeding one year in duration," NASA, Tech. Rep. SP-134, Apr. 1966].
이제는 상이한 기체 및 액체 기질, 특히 폐기물 기질과 지속가능한 방식으로 생성된 기질 상에서 단백질 합성, 뿐만 아니라 다른 영양분의 합성을 위한 미생물학적 기술을 개발하는데 새로운 관심이 고조되고 있다.
화학독립영양성 미생물은 단백질, 단백질 유래된 산물 및 C1 급식 원료로부터의 다른 영양분의 생산을 위한 광합성 유기체의 연구가 미비한 대안을 대표한다. CO2 및 다른 형태의 무기 탄소를 유기 화합물에 고정하기 위해 화학독립영양 생물에 의해 수행되는 화학합성 반응은 광 복사 에너지보다는 무기 화학물질에 저장된 위치 에너지에 의해 에너지를 얻는다 [J. M. Shively, G. van Keulen, and W. G. Meijer (1998) "Something from almost nothing: carbon dioxide fixation in chemoautotrophs." Annual review of microbiology 52: 191-230 (http://dx.doi.org/10.1146/annurev.micro.52.1.191); A. J. Smith, J. London, and R. Y. Stanier, "Biochemical basis of obligate autotrophy in Blue-Green algae and thiobacilli" (1967) Journal of Bacteriology 94(4): 972-983 (http://jb.asm.org/content/94/4/972.abstract); M. H
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gler, C. O. Wirsen, G. Fuchs, C. D. Taylor, and S. M. Sievert (2005) "Evidence for autotrophic CO2 fixation via the reductive tricarboxylic acid cycle by members of the ε subdivision of proteobacteria" Journal of Bacteriology 187(9): 3020-3027, (http://dx.doi.org/10.1128/jb.187.9.3020-3027.2005); K. M. Scott and C. M. Cavanaugh, "CO2 uptake and fixation by endosymbiotic chemoautotrophs from the bivalve solemya velum" (2007) Applied and Environmental Microbiology 73(4): 1174-1179 (http://dx.doi.org/10.1128/aem.01817-06)]. 화학독립영양 생물에서 발생하는 탄소 고정화 생화학적 경로는 환원성 트리카복실산 회로, 캘빈-벤슨-바샴 회로 [Jessup Shively, Geertje van Kaulen, Wim Meijer (1998) Annu. Rev. Microbiol. 191-230] 및 우드-융달 (Wood-Ljungdahl) 경로를 포함한다 [L. G. Ljungdahl, "The autotrophic pathway of acetate synthesis in acetogenic bacteria," Annual Review of Microbiology, vol. 40, no. 1, pp. 415-450, 1986. [온라인]. 입수가능: http://dx.doi.org/10.1146/annurev.mi.40.100186.002215].
화학독립영양성 유기체는 특히 생물학적 단계가 CO2 고정에 단독으로 한정되는 유기 화학물질로 CO2의 전환의 융합 화학적/생물학적 공정에 잘 맞추어져 있다. 이러한 CO2 고정 단계는 대략적으로 광합성에서 일어나는 암반응에 해당한다. 이러한 융합 화학적/생물학적 접근법은 바이오-기반의 산물 생산을 위한 전통적인 종속영양 또는 광합성 생물공정보다 훨씬 적은 관심을 받아왔다. 그러나, 이러한 융합 접근법에는 CO2 탄소원으로부터 전반적인 생화학 생산 공정에 효율적이고 청정한 전력을 공급하기 위하여, 태양 PV, 태양열, 풍력, 지열, 수력 또는 원자력과 같은 광범위한 무생물적 에너지 전환 기술과 함께 CO2를 고정하는 수십억 년 동안 진화를 통하여 얻은 효소적 능력을 효율적으로 조합하는 능력을 포함하는 다수의 잠재적인 장점이 존재한다.
유사한 범위의 바이오-산물 (단일 세포 단백질 (SCP), 폴리하이드록시 부티레이트 (PHB))은 메탄 산화 세균을 사용하여 메탄 및 천연 가스 급식 원료로부터 획득될 수 있다. 이들은 과거에 본격적인 SCP 생산 시스템으로 실행되었으며 소 및 어류를 위한 단백질이 풍부한 사료 첨가제로 테스트되었던 비교적 잘 연구된 미생물이다. 미생물은 하수 및 분뇨 처리 공장에서 생산된 바이오가스를 활용하기 위해 적용될 수 있다. 메탄 산화 세균는 가치가 낮은 메탄을 생체산물의 공급원으로서 사용되는 미생물 바이오매스로 업그레이드하는 기술을 가능하게 할 수 있다.
CO2 또는 메탄 포함 가스의 고정된 탄소 산물로의 포획 및 전환에서 화학독립영양 또는 메탄영양성 미생물의 특정 적용은 알려져 있다. 그러나, 이전에 보고된 접근법의 많은 부분에서 효율성, 경제적 타당성, 실용성 및 상업적 채택을 제한하는 단점을 겪었다.
매우 큰 규모로 지속가능하게 농업적 성과의 현저한 증가와 관련된 병목 현상을 타개할 필요가 있다. 수평적으로 분포하고 육지와 물에 매우 집중하는 전통적인 농업적 작업과는 상반되는, 소형 버티칼 스테일링의 생물학적 생산이 필요하다. 식품 대비 자연의 갈등 및 토지 이용에 대한 갈등, 그리고 자연 서식지의 파괴를 완화하는 것이 필요하다.
저비용의 합성가스, CO2 및/또는 메탄을, 아미노산, 단백질, 비타민, 비료, 바이오자극제 및 기타 생물학적 영양분을 포함하나 이에 한정되지는 않는 가치가 높은 유기 화학물질로 전환시키는 생물 공정도 필요하다.
통상적이고 측정가능한 반응 용기에서 성장할 수 있고 상업적으로 타당한 방법으로 상업적으로 가능한 유기 탄소 사슬 세트, 특히 4개 이상의 탄소 원자를 생산하는 미생물 세트를 식별할 필요가 있다. 당과 같은 전형적인 유기 탄소 유입에 의해 대사적으로 제한되지 않는 미생물을 식별하는 것도 필요하다. 아미노산, 단백질 및 기타 생물학적 영양분의 합성을 위해, 합성가스, 생산자 가스, 천연 가스, 바이오가스 또는 H2/CO2 가스 혼합물 중간체를 통해 유도되는 탄소와 에너지의 광범위한 무생물적 공급원을 추가적으로 활용할 수 있는 미생물 및 시스템이 필요하다. 이것은 비슷한 종속영양 시스템을 훨씬 초과하는 급식 원료 유연성을 가져올 것이다. 성장 및 탄소 고정을 위해, 합성가스, 생산자 가스에 존재하거나 광범위한 무생물적 재생가능한 및/또는 저-CO2 배출 에너지 기술을 통하여 바로 생성되는 수소와 같은 전자 공여체를 활용할 수 있는 미생물을 식별하고 이용하는 것이 필요하다.
아미노산, 단백질, 비타민 및 기타 생물학적 영양분을 포함하나 이에 한정되지 않는 유기 화학물질의 생산을 위한 시스템, 방법 및 조성물이 저비용 및 지속가능한 급식 원료로부터 제공된다. 일부 구현예에서, 가치가 높은 이들 유기 화합물의 효율적인 생산은 탄소의 폐기물 공급원의 폐기 및/또는 CO2 포획과 함께 연결되어 있고, 이는 추가적인 수익 및/또는 사회적 가치를 생성할 수 있다.
자연 발생하는 또는 조작된 미생물은 CO2 가스, 합성가스, 생산자 가스 및/또는 메탄을 아미노산, 단백질, 비타민 및 기타 생물학적 영양분을 포함하나 이에 한정되지 않는 가치가 높은 중급 내지 긴 탄소 사슬 길이의 분자로 전환하는데 사용된다. 본원에 기재된 기술은 생물학적 가스-화학물질 (GTC) 공정 내에서 합성가스 바이오프로세싱에 사용될 수 있는 새로운 천연 또는 고전적으로 생장된, 및/또는 유전적으로 증진된 미생물 균주의 개발이 개입되어 현재 고등 식물 농작물 또는 동물 공급원으로부터 대량 생산만 되는 다양한 비교적 긴 탄소 사슬 유기 화합물을 생산하고/거나 분비하도록 허용한다.
합성가스 및/또는 CO2와 같은 가스성 탄소원 상에서 바이오매스를 키우고 합성하는 자연적 능력을 갖는, 수소 산화, 일산화탄소 산화 및 크놀가스 미생물을 포함하나 이에 제한되지 않는 미생물의 선택, 육종 및/또는 조작을 위한 방법이 제공되고, 상기 생산 미생물은 가스 재배 하에서 표적 화학적 산물을 합성한다. 본원에 기술된 미생물 및 방법은 석유화학적 산물 및/또는 고등 식물-유래된 아미노산, 단백질 및 다른 생물학적 영양분와 가격면에서 경쟁할 수 있는 생화학물질의 저비용 합성을 가능하게 할 수 있다. 특정 구현예에서, 이들 아미노산, 단백질, 비타민 및 기타 생물학적 영양분은 종속영양성 미생물 또는 미생물 광영양성 합성을 통하여 생산된 아미노산, 단백질, 비타민 및 기타 생물학적 영양분보다 실질적으로 낮은 가격을 갖을 것으로 예측된다.
합성가스 및/또는 가스성 CO2 및/또는 CO2 가스와 H2 가스의 혼합물 및/또는 메탄을, 암모니아, 암모늄 및/또는 요소를 포함하나 이에 한정되지 않는 질소원과 함께 하나 이상의 아미노산, 단백질, 비타민 및/또는 다른 생물학적 영양분으로 전환하는 미생물이 제공된다. 일부 구현예에서, 미생물은 수소-산화 화학독립영양성 미생물, 일산화탄소-산화 미생물, 크놀가스 미생물 및/또는 메탄영양성 미생물 군 중 하나 이상이다. 더욱 광범위하게 크놀가스 미생물, 수소영양성 미생물, 카복시영양성 미생물 및 화학독립영양성 미생물은 생물학적 성장을 지원하기 위해 이들의 유일한 탄소원으로서 CO2 또는 CO를 포획할 수 있다. 메탄영양성 미생물은 유일한 탄소원으로서 CH4를 포획할 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 미생물 성장은 아미노산 및 단백질의 생합성을 포함한다. 크놀가스 미생물 및 다른 수소영양성 미생물은 호흡 및 생화학적 합성을 위해 환원성 전자의 공급원으로서 H2를 사용할 수 있다. 일부 구현예에서, 크놀가스 미생물, 수소영양성 미생물, 카복시영양성 미생물, 기타 화학독립영양성 미생물 및/또는 메탄영양성 미생물은 수용액에 용해된 무기 미네랄과 함께 CO2; CO; H2; CH4 중 하나 이상을 포함하나 이에 한정되지 않는 가스의 흐름 상에서 자란다. 일부 구현예에서, 크놀가스, 수소영양성, 카복시영양성, 화학독립영양성 및/또는 메탄영양성 미생물은 온실 가스 (GHG)를 아미노산 및 단백질 및 비타민 중 하나 이상을 포함하나 이에 한정되지 않는 생체분자로 전환하는데 사용된다.
본원에 개시된 임의의 미생물을 포함하는 조성물도 역시 제공된다. 조성물은 성장 및/또는 생체산물 생산을 위한 영양분를 포함하는 성장 배지에서의 미생물을 포함할 수 있다. 예를 들면, 조성물은 본원에 기술된 바와 같은 가스성 기질이 도입되는 생물반응기 내에 있을 수 있다.
일부 구현예에서, 미생물은 Rhodococcus 또는 Gordonia 속으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 미생물은 Rhodococcus opacus이다. 일부 구현예에서, 미생물은 Rhodococcus opacus (DSM 43205) 또는 Rhodococcus 종 (DSM 3346)이다. 일부 구현예에서, 미생물은 Ralstonia 또는 Cupriavidus 속으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 미생물은 Cupriavidus necator이다. 일부 비제한적인 구현예에서, Cupriavidus necator 의 균주는 DSM 531 또는 DSM 541이다.
일 관점에서, 생산자 가스 또는 합성 가스 또는 H2 및 CO2 및/또는 CO 및/또는 CH4를 포함하는 또 다른 가스 혼합물과 같은 가스성 기질을 아미노산, 단백질 및 다른 생물학적 영양분으로 전환할 수 있는 천연 또는 조작된 미생물이 제공된다. 가스성 기질은 탄소원 및/또는 에너지원으로서 미생물에 의해 사용된다. 일부 구현예에서, 가스성 기질 상에서 성장할 수 있는 미생물은 아미노산, 단백질 또는 다른 생물학적 영양분의 생합성에 필요한 유전자를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드로 형질전환된다. 일부 구현예에서, 아미노산, 단백질, 다른 생물학적 영양분 또는 전체 세포 산물은 미생물 세포 또는 미생물 성장 배지로부터 회수된다. 본원에 기술된 미생물 성장 공정에서 사용될 수 있는 생산자 가스는 폐기물 급식 원료 및/또는 바이오매스 잔류물 급식 원료의 가스화 또는 산업적 공정으로부터의 폐가스 또는 천연 가스 또는 바이오가스의 수증기 개질을 포함하는 공급원으로부터 나올 수 있다.
일 관점에서, 탄소원 및/또는 에너지원으로서 가스성 기질 상에서 성장할 수 있는 비-자연 발생하는 미생물이 제공되며, 여기서 미생물은 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 미생물은 세균 세포이다. 예를 들면, 일부 구현예에서, 세균 세포는 Cupriavidus 종 또는 Ralstonia 종, 예를 들면 이에 한정되지 않지만Cupriavidus necator이다. 일부 비제한적인 구현예에서, 미생물은 Cupriavidus necator DSM 531 또는 DSM 541이다.
일부 구현예에서, 가스성 기질은 탄소원으로서 CO2를 포함한다. 일부 구현예에서, 가스성 기질은 에너지원으로서 H2 및/또는 O2를 포함한다. 일부 구현예에서, 가스성 기질은 생산자 가스, 합성가스 또는 열분해 가스를 포함한다. 일부 구현예에서, 가스성 기질은 H2 및/또는 CO2 및/또는 CO 및/또는 CH4를 포함하는 가스의 혼합물을 포함한다. 일부 구현예에서, 미생물은 기체 기질의 존재 시 미생물의 성장 및 생체산물의 생산에 적합한 조건 하에서 배양될 때 아미노산, 단백질 및 다른 생물학적 영양분을 생산한다.
또 다른 관점에서, 탄소원 및/또는 에너지원으로서 가스성 기질 상에서 성장할 수 있는, 본원에 기술된 바와 같은 미생물을 사용하여 아미노산, 단백질 및 기타 생물학적 영양분을 생산하는 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 미생물은 가스성 기질 및 성장 및 생체산물 생산을 위한 다른 영양분을 포함하는 배양 배지 (예로, 액체 성장 배지)를 포함하는 생물반응기에서 미생물의 성장에 적합한 조건 하에 배양되고, 여기서 미생물은 아미노산, 단백질 및 다른 생물학적 영양분를 생산한다.
일부 구현예에서, 생물반응기에서의 가스성 기질은 H2 및/또는 CO2를 포함한다. 일부 구현예에서, 가스성 기질는 생산자 가스, 합성가스 또는 열분해 가스이다. 일부 구현예에서, 가스성 기질는 천연 가스 또는 바이오가스이다. 일부 구현예에서, 가스성 기질은 도시 고체 폐기물, 블랙 리커, 농업 폐기물, 목재 폐기물, 공급 천연 가스, 바이오가스, 신 가스, 메탄 하이드레이트, 타이어, 석유 코크스, 하수, 분뇨, 스트로, 리그노셀룰로스 에너지 작물, 리그닌, 작물 잔류물, 바가스, 톱밥, 산림 잔류물, 식품 폐기물, 폐 카펫, 폐 플라스틱, 매립 가스 및/또는 리그노셀룰로스 바이오매스로부터 유래된다.
일부 구현예에서, 아미노산, 단백질, 비타민 및/또는 다른 생물학적 영양분은 배양 배지로부터 회수된다.
또 다른 관점에서, 아미노산, 단백질, 비타민 및/또는 다른 생물학적 영양분를 생산하는 미생물 및 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 미생물은 각각 제로 또는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함하고, 탄소원 및/또는 에너지원으로서 가스성 기질 상에서 성장할 수 있고, 아미노산, 단백질, 비타민 및/또는 다른 생물학적 영양분를 생합성하는 자연 또는 비-자연 발생하는 미생물이 제공된다. 일부 구현예에서, 자연 또는 비-자연 발생하는 미생물은 Cupriavidus 종 또는 Ralstonia 종이다. 일부 구현예에서, 미생물은 Cupriavidus necator 또는 Cupriavidus metallidurans이다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 자연 또는 비-자연 발생하는 미생물을 이용하여 아미노산, 단백질, 비타민 및/또는 다른 생물학적 영양분을 생산하는 방법으로서, 상기 미생물은 각각 제로 또는 적어도 하나의 외인성 핵산을 포함하고, 탄소원 및/또는 에너지원으로서 가스성 기질 상에서 성장할 수 있고, 아미노산, 단백질, 비타민 및/또는 다른 생물학적 영양분을 생합성하고, 상기 방법은 가스성 기질 및 성장 및 생체산물 생산을 위한 다른 영양분도 역시 포함하는 배양 배지 (예로, 액체 성장 배지)를 포함하는 생물반응기에서 미생물의 성장 및 아미노산, 단백질, 비타민 및/또는 다른 생물학적 영양분의 생산에 적합한 조건 하에 배양하는 단계를 포함하고, 미생물이 아미노산, 단백질 및 다른 생물학적 영양분를 생산하는, 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 미생물은 산업적 배출 가스로부터 CO2를 포획하고 단백질이 풍부한 바이오매스를 생산하는데 사용된다. 일부 구현예에서, 이러한 단백질이 풍부한 바이오매스는 상품이다. 일부 구현예에서, 단백질이 풍부한 바이오매스는 단일 세포 단백질 (SCP)로서 사용된다. 일부 구현예에서, 단백질이 풍부한 바이오매스는 다음의 응용 분야 중 하나 이상에 사용된다: 비료; 바이오자극제; 바이오비료; 곰팡이 성장 증진제 또는 보충제; 영양분; 성분; 동물 사료 또는 배합 동물 사료; 인간 식품 또는 인간 식품 제형물. 일부 구현예에서, 단백질이 풍부한 바이오매스는 어분 및/또는 다른 동물 단백질의 고단백질 대체물로서 사용되고/거나 식물 비료 산물 및/또는 버섯 및 곰팡이 성장 증진제에 사용된다. 일부 비제한적인 구현예에서, 본 발명은 온실 가스 감소에 및 식물 비료 및/또는 바이오자극제 및/또는 곰팡이 비료 및/또는 영양 보충제 및/또는 인간 식품 성분을 포함하나 이에 한정되지 않는 적용을 위한 고단백질 산물을 생산하는데 사용된다.
일부 구현예에서, 고단백질 산물은 가수분해로 처리된된다. 일부 구현예에서, 가수분해 수율은 단백질이 풍부한 바이오매스에 증기 처리를 적용함으로써 개선된다. 일부 불용성 단백질은 수분의 존재 시 가열하면 덜 내화성 형태로 전환된다[Kida, K., S. Morimura, J. Noda, Y. Nishida, T. Imai, and M. Otagiri (1995) "Enzymatic hydrolysis of the horn and hoof of cow and buffalo" J. Ferment. Bioeng. 80: 478-484].
본 발명의 특정 구현예는 저하된 핵산 함량을 갖는 미생물 단백질 단리물에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 단리물의 핵산 함량은 9 중량% 미만이다. 특정 비제한적인 구현예에서, 단리물의 단백질 당량 비율 (PER)은 1보다 크다.
특정 구현예에서, 효모 SCP의 핵 함량을 감소시키기 위해 개발된 방법과 유사한 방법이 본원에 기술된 바와 같은 원핵 세포에 적용된다. 효모의 핵산은 주로 리보핵산 또는 RNA이다. 특정 구현예에서, 세포의 핵산은 마찬가지로 주로 RNA이고, 본 출원에서 용어 RNA 및 핵산은 때로 상호교환적으로 사용될 것이다. 특정 구현예에서, 핵산 함량 대 단백질의 비율은 3% 미만으로 감소된다. 특정 구현예에서, 핵산 대 단백질의 비율은 당업자 중 하나 및 당해 기술분야의 지식에 의해, 인간 식이에서 단백질 요구량의 실질적인 비율 또는 전부를 제공하는데 안전한 것으로 고려되는 수준으로 감소된다.
본 발명의 특정 구현예는 다른 산업적 발효에서 급식 원료 또는 영양분 공급원으로서 사용되는 미생물 가수분해물에 관한 것이다. 본원에 이의 전문이 참고문헌으로 통합되는 Ummadi, M. and Curic-Bawden, M. (2010) "Use of Protein Hydrolysates in Industrial Starter Culture Fermentations." Protein Hydrolysates In Biotechnology 91-114 참조.
본 발명의 특정 구현예는 스포츠 의약에 적용되는 미생물 단백질 단리물 및/또는 가수분해물에 관한 것이고, 구체적으로 특정 비제한적 구현예에서, 상기 가수분해물의 섭취는 아미노산이 미가공 단백질보다 신속하게 신체에 흡수되도록 허용하고, 이로써 근육 조직으로의 영양분 전달을 극대화한다. 본원에 이의 전문이 참고문헌으로 통합되는 Manninen, Anssi H., "Protein Hydrolysates In Sports And Exercise: A Brief Review" (2004) Journal of Sports Science and Medicine, 3: 60-63, (2004) 참조.
일 관점에서, 식물 및 곰팡이 바이오자극제 및 영양분를 생산하는 방법이 제공된다. 이러한 공정에 의해 생산된 바이오자극제 및 영양분도 역시 제공된다. 일부 구현예에서, 식물 바이오자극제 및/또는 비료를 생산하는 방법으로서, 세균 세포를 가수분해하여 가수분해물을 획득하는 단계 및 가수분해물을 엽면 적용, 토양 아쥬반트로서의 적용 및/또는 토양 비료로서의 적용을 위한 식물 바이오자극제 및/또는 비료로서 제형화하는 단계를 포함하는, 방법이 제공된다. 본원에 기술된 방법에 의해 획득된 식물 바이오자극제 및/또는 비료도 또한 제공된다. 이러한 식물 또는 곰팡이 바이오자극제 및 영양분를 적용함으로써 식물 또는 곰팡이를 재배하는 방법도 또한 제공된다. 이러한 식물 또는 곰팡이로부터 산물을 제조하는 공정도 또한 제공된다. 이러한 식물 또는 곰팡이를 유기체에 급식함으로써 종속영양성 유기체를 키우는 방법도 역시 제공된다. 이러한 종속영양성 유기체로부터 산물을 생산하는 방법도 또한 제공된다.
또 다른 관점에서, 상업용 버섯의 수율 및/또는 생존력을 증가시킬 수 있는 버섯 성장 증진제가 제공된다. 상업용 버섯의 번식을 촉진하면서 식품 공급원으로서 경쟁하는 외래 미생물에 쉽게 접근할 수 없는 버섯 성장 증진제도 또한 제공된다. 또한 제조 및 사용에 경제적인 버섯 성장 증진제도 제공된다. 또한 낮은 농도에서 효과적인 버섯 성장 증진제가 제공된다. 또한 바로 입수가능한, 저비용 및/또는 폐기물 재료로부터 제조된 버섯 성장 증진제도 제공된다. 또한 재생가능한 전력 공급원을 사용하여 쉽게 제조되는 버섯 성장 증진제도 제공된다.
일 관점에서, 하나 이상의 탄소 원자를 포함하는 무기 및/또는 유기 분자를 탄소 고정화 반응 또는 동화적 생합성을 통해 생산된 아미노산, 단백질 및/또는 비타민을 포함하는 유기 분자로 생물학적으로 전환시키는 생물학적 및 화학적 방법으로서, 하나 이상의 탄소 원자를 포함하는 무기 및/또는 유기 분자를 미생물 세포를 유지하는데 적합한 배양 배지에서 미생물 세포를 포함하는 환경 내에 도입하고, 하나 이상의 탄소 원자를 포함하는 무기 및/또는 유기 분자는 성장 및/또는 생합성을 위해 미생물 세포에 의해 탄소원으로서 사용되는, 단계; 하나 이상의 탄소 원자를 포함하는 무기 및/또는 유기 분자를 미생물 세포내에 포함되는 적어도 하나의 탄소 고정화 반응 또는 적어도 하나의 동화적 생합성 경로를 통해 환경 내에서 아미노산, 단백질 및/또는 비타민을 포함하는 유기 분자 산물로 전환시키고, 탄소 고정화 반응 또는 동화적 생합성 경로는 화학적으로 및/또는 전기화학적으로 및/또는 열화학적으로 생성되었고/거나 환경 외부의 적어도 하나의 공급원으로부터 환경에 도입된 전자 공여체 및/또는 전자 수용체에 의해 제공된 화학적 및/또는 전기화학적 에너지에 의해 적어도 부분적으로 구동되는 단계를 포함하고, 미생물 세포는 상기 아미노산, 단백질 및/또는 비타민을 포함하는 바이오매스를 포함하는, 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 유기 분자 산물은 탄소 5개 이상 길이의 탄소 골격을 갖는 화합물을 포함한다. 일부 구현예에서, 환경에서 생산된 아미노산 및/또는 단백질 및/또는 비타민 및/또는 바이오매스는 배양 배지로부터 회수된다.
일부 구현예에서, 탄소원은 단 하나의 탄소 원자를 포함하고, 여기서 상기 전자 공여체 및/또는 단 하나의 탄소 원자를 포함하는 분자는 가스화; 열분해; 수증기 개질; 및 자동개질 중 적어도 하나를 포함하는 유기물에 작용하는 열화학적 공정을 통하여 생성된다. 일부 구현예에서, 탄소원은 단 하나의 탄소 원자를 포함하고, 전자 공여체 및/또는 단 하나의 탄소 원자를 포함하는 유기 분자는 메탄 수증기 개질을 통하여 생성된다. 일부 구현예에서, 가스성 기질은 가스화 및/또는 열분해 및/또는 자동개질 및/또는 수증기 개질로부터 생성된 H2, CO 및 CO2를 포함하는 가스 흐름으로부터 유래되고, 여기서 가스화 및/또는 열분해 및/또는 자동개질 및/또는 수증기 개질로부터의 가스 유출량에서 수소 대 일산화탄소의 비율은 가스 흐름이 미생물에 전달되기 이전에 물 가스 전환 반응을 사용하여 조정된다.
일부 구현예에서, 탄소원은 유기물의 가스화; 생석회, CaO를 생산하는 석회석, CaCO3의 하소화; 메탄 수증기 개질; 연소, 소각 또는 발염; 당의 혐기성 또는 호기성 발효; 메탄영양성 생물공정; 다른 유기체의 호흡, 폐수 처리; 매립 가스, 인산나트륨 생산; 지질학적으로 또는 지열로 생산되거나 배출된 가스; 산 가스, 신 가스 또는 천연 가스; 해수 또는 지표수 또는 지하 수의 기타 물체; 및 대기를 포함하는 하나 이상의 공급원으로부터 포획된 또는 유도된 C1 분자를 포함한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 전자 공여체는 암모니아; 암모늄; 일산화탄소; 디티오나이트; 황 원소; 탄화수소; 수소; 메타이아황산염; 질소 산화물; 아질산염; 소듐 티오설페이트 (Na2S2O3) 또는 칼슘 티오설페이트 (CaS2O3)를 포함하나 이에 한정되지 않은 티오설페이트와 같은 황산염; 황화수소와 같은 황화물; 아황산염; 티오네이트; 티오나이트; 전이 금속 또는 용해된 또는 고체 상에서의 이들의 황화물, 산화물, 칼코겐화물, 할로겐화물, 수산화물, 옥시수산화물, 인산염, 황산염 또는 탄산염; 및 고체 상태 전극 물질에서의 전도 또는 원자가 밴드 전자로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 전자 수용체는 이산화탄소; 산소; 아질산염; 질산염; 제이철 또는 기타 전이 금속 이온; 황산염; 및 고체 상태 전극 물질에서의 원자가 또는 전도 밴드 홀으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 생물학적 전환은 전자 공여체 및/또는 전자 수용체 및/또는 탄소원 및/또는 미생물이 요구하는 미네랄 영양분이 적어도 하나의 유입 화학물질로부터 생성되고/거나 정제되고, 및/또는 탄소 고정 단계에서 나오는 화학물질로부터 재활용되고, 및/또는 다른 산업, 광업, 농업, 하수 또는 폐기물 발생 공정으로부터의 폐기물 흐름으로부터 생성되거나 이에 포함되는 하나 이상의 화학적 전처리 단계가 선행된다.
일부 구현예에서, 전자 공여체 및/또는 전자 수용체는 온실 가스 배출이 낮은 재생가능한, 대체 또는 통상적인 전력 공급원을 사용하여 생성되거나 재활용되고, 여기서 전력 공급원은 광전지, 태양열, 풍력, 수력, 원자력, 지열, 증진된 지열, 해저열, 해양 파력 및 조력 중 적어도 하나로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 전자 공여체 및/또는 전자 수용체는 전기적 그리드 공급이 전기 그리드 수요를 초과하는 기간 동안 그리드 전기를 사용하여 생성되고, 여기서 저장 탱크는 상기 전자 공여체 및/또는 전자 수용체의 생성 및 상기 탄소 고정화 반응에서의 이들의 소모를 완충한다.
일부 구현예에서, 전자 공여체는 메탄 수증기 개질; 석유 정련; 철강 생산; 알루미늄 생산; 망간 생산; 클로로 알칼리 공정; 카본 블랙 제조; 메탄올 합성; 암모니아 합성; 야금 공정; 화학적 공정; 및 전기화학적 공정 중 하나 이상으로부터의 테일 가스로부터 유래된 H2 및/또는 CO 및/또는 메탄을 포함한다.
일부 구현예에서, 수소 분자는 전자 공여체로서 사용되고, 여기서 상기 수소는 물의 전기분해; 물의 열화학적 분해; 염수의 전기분해; 황화 수소의 전기분해 및/또는 열화학적 분해 중 적어도 하나를 사용하는 방법을 통해 생성된다. 일부 구현예에서, 수소 생산을 위한 물의 전기분해는 양성자 교환막 (PEM); KOH와 같은 액체 전해질; 알칼리 전기분해; 고체 중합체 전해질 전기분해; 고압 전기분해; 및 수증기의 고온 전기분해 (HTES) 중 하나 이상을 사용하여 수행된다. 일부 구현예에서, 수소 생산을 위한 물의 열화학적 분해는 철 산화물 순환; 세륨 (Ⅳ) 산화물-세륨 (III) 산화물 순환; 아연-아연 산화물 순환; 황-요오드 순환; 구리-염소 순환; 칼슘-브롬-철 순환; 융합 황 순환 중 하나 이상을 사용하여 수행된다.
일 구현예에서, 미생물 세포는 세균 세포이다. 일부 구현예에서, 미생물은 Cupriavidus 종 또는 Ralstonia 종이다. 일부 구현예에서, 미생물은 Cupriavidus necator 또는 Cupriavidus metallidurans이다. 일부 구현예에서, 미생물 세포는 다음의 속 Cupriavidus 종, Rhodococcus 종, Hydrogenovibrio 종, Rhodopseudomonas 종, Hydrogenobacter 종, Gordonia 종, Arthrobacter 종, Streptomycetes 종 Rhodobacter 종 및/또는 Xanthobacter 중 하나 이상으로부터 선택된 미생물을 포함한다.
일부 구현예에서, 미생물 세포는 미생물의 성장 및 생체산물의 생산에 적합한 조건 하에서 가스성 기질의 존재 시 배양될 때 아미노산 및/또는 단백질 및/또는 비타민 및/또는 바이오매스를 생산한다. 일부 구현예에서, 가스성 기질은 CO2 및/또는 CO 및/또는 CH4를 탄소원으로서 포함한다. 일부 구현예에서, 가스성 기질은 H2를 포함한다. 일부 구현예에서, 가스성 기질은 H2 및/또는 O2를 에너지원으로서 포함한다. 일부 구현예에서, 가스성 기질은 H2 및/또는 CO 및/또는 CH4 중 하나 이상을 포함하는 전자 공여체를 포함한다. 일부 구현예에서, 가스성 기질은 열분해 가스 또는 생산자 가스 또는 합성가스 또는 천연 가스 또는 바이오가스를 포함한다. 일부 구현예에서, 가스성 기질은 H2 및/또는 CO2 및/또는 CO를 포함하는 가스의 혼합물을 포함한다. 일부 구현예에서, 가스성 기질은 도시 고체 폐기물, 블랙 리커, 농업 폐기물, 목재 폐기물, 공급 천연 가스, 바이오가스, 신 가스, 메탄 하이드레이트, 타이어, 석유 코크스, 하수, 분뇨, 스트로, 리그노셀룰로스 에너지 작물, 리그닌, 작물 잔류물, 바가스, 톱밥, 산림 잔류물, 식품 폐기물, 폐 카펫, 폐 플라스틱, 매립 가스, 다시마, 해조류 및/또는 리그노셀룰로스 바이오매스로부터 유래된다.
일 구현예에서, 아미노산 및/또는 단백질 및/또는 비타민 및/또는 바이오매스를 생산하는 방법으로서, 본원에 기술된 바와 같은 미생물을 가스성 기질 및 성장 및 생체산물 생산을 위한 다른 영양분을 포함하는 배양 배지를 포함하는 생물반응기에서, 미생물의 성장 및 아미노산 및/또는 단백질 및/또는 비타민 및/또는 바이오매스의 생산에 적합한 조건 하에 배양하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 미생물은 아미노산 및/또는 단백질 및/또는 비타민 및/또는 바이오매스를 생산하는, 방법이 제공된다.
일부 구현예에서, 미생물은 크놀가스 미생물이다. 일 구현예에서, 가스성 기질은 H2 및/또는 CO2를 포함한다. 일부 구현예에서, 가스성 기질은 열분해 가스 또는 생산자 가스 또는 합성가스이다.
일 구현예에서, 미생물 세포는 전자 공여체로서 수소 분자를 포함하는 화학합성 반응을 통해 상기 아미노산, 단백질 및/또는 비타민을 생산하고, 상기 수소는 저- 또는 무-이산화탄소 배출과 함께 수소를 생산하는 것으로 알려진, 탄소 포획 및 격리 (CCS)가 가능한 메탄 수증기 개질; CCS 가능한 석탄 가스화; 카본 블랙 산물을 생성하는 배르너 공정; CCS 가능한 바이오매스의 가스화 또는 열분해; 및 바이오챠르 보조산물을 생산하는 바이오매스의 열분해 중 하나 이상을 포함하는 전기화학적 또는 열화학적 공정을 통해 생성된다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 탄소 고정화 반응 및 적어도 하나의 동화적 생합성 경로는 아미노산; 펩티드; 단백질; 지질; 다당류; 및/또는 비타민을 포함하는 생체산물의 형성을 유도한다. 일 구현예에서, 적어도 하나의 탄소 고정화 반응 및 적어도 하나의 동화적 생합성 경로는 캘빈 회로 및 아미노산 생합성 경로를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 방법으로 미생물에 의해 생산된 바이오매스 및/또는 유기 분자는 하나 이상의 다른 유기체에게 급식하거나 영양을 공급하는데 사용된다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 방법으로 생산된 아미노산 및/또는 단백질 및/또는 비타민은 식물 바이오자극제 또는 버섯 성장 증진제를 생산하는데 사용된다.
또 다른 관점에서, 본원에 기술된 바와 같은 방법에 따라 생산된 바이오매스, 아미노산, 단백질 및/또는 비타민을 포함하는 식물 바이오자극제가 제공된다. 일 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 식물 바이오자극제를 식물 및/또는 식물이 자라는 토양 및/또는 식물이 자라는데 사용되는 액체 배지에 적용하는 단계; 및 식물을 수확하는 단계를 포함하는, 작물을 처리하는 방법이 제공된다. 일 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 탄소 고정화 반응 또는 동화적 생합성을 통하여 생산된 바이오매스, 아미노산, 단백질 및/또는 비타민을 식물 및/또는 식물이 자라는 토양 및/또는 식물이 성장하는데 사용되는 액체 배지에 적용하는 단계; 및 식물을 수확하는 단계를 포함하는, 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 식물은 농작물이다.
또 다른 관점에서, 본원에 기술된 바와 같은 방법으로 자란 미생물 세포는 용균되고, 이로써 용균물을 생산한다. 일부 구현예에서, 용균물은 에멀전 또는 현탁액을 생산하는데 사용된다. 일부 구현예에서, 용균물은 불용성 및 가용성 분획으로 분리되며, 이들 중 하나 또는 둘 다는 선택적으로 농축되거나 건조될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같이 생산된 용균물, 에멀전, 현탁액 또는 이들의 분획을 포함하는 식물 바이오자극제가 제공된다.
또 다른 관점에서, 본원에 기술된 바와 같은 방법으로 생산된 단백질은 가수분해되고, 이로써 가수분해물을 생산한다. 일 구현예에서, 가수분해 단계는 산 가수분해를 수행하는 것을 포함한다. 일 구현예에서, 가수분해 단계는 단백질을 유리 아미노산 및 올리고펩티드 중 적어도 하나로 가수분해할 수 있는 적어도 하나의 효소를 포함한다. 일 구현예에서, 가수분해 단계는 알칼리 가수분해를 수행하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 가수분해물은 에멀전 또는 현탁액을 생산하는데 사용된다. 일부 구현예에서, 가수분해물은 불용성 및 가용성 분획으로 분리되며, 이들 중 하나 또는 둘 다는 선택적으로 농축되거나 건조될 수 있다. 일부 구현예에서, 가수분해물은 여과되고, 이로써 여과액 (투과액) 및 여과물 (보유물)을 생산한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같이 생산된 가수분해물, 에멀전, 현탁액 또는 이들의 분획, 여과액 또는 여과물을 포함하는 식물 바이오자극제가 제공된다.
또 다른 관점에서, 상기 바이오매스를 가수분해하여 가수분해물을 획득하는 단계; 및 엽면 적용 및/또는 토양 아쥬반트 또는 첨가제로서 적용을 위한 및/또는 식물 성장을 위한 액체 배지에서의 사용을 위한 식물 바이오자극제로서 가수분해물을 제형화하는 단계를 포함하는, 본원에 기술된 바와 같은 방법으로 생산된 바이오매스는 식물 바이오자극제의 생산에 사용된다. 일 구현예에서, 방법은 식물 바이오자극제를 식물 및/또는 식물이 자라는 토양 및/또는 식물이 성장하는데 사용되는 액체 배지에 적용하는 단계; 및 식물을 수확하는 단계를 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 가수분해 단계는 단백질을 유리 아미노산 및 올리고펩티드 중 적어도 하나로 가수분해할 수 있는 적어도 하나의 효소를 포함한다. 일 구현예에서, 가수분해 단계는 산 가수분해를 수행하는 것을 포함한다. 일 구현예에서, 가수분해 단계는 알칼리 가수분해를 수행하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 바이오매스 가수분해물을 포함하는 식물 바이오자극제가 제공된다.
또 다른 관점에서, 용균물을 생산하는 방법으로서, 본원에 기술된 바와 같은 미생물을 생물반응기에서 미생물의 성장에 적합한 조건 하에 배양하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 생물반응기에서 생산된 바이오매스는 수확되어 생물반응기로부터 제거되고, 생물반응기로부터 제거된 상기 바이오매스는 후속적으로 용균되고 이로써 용균물을 생산하는, 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 세포는 균질화에 의해 파열된다. 일부 구현예에서, 용균물은 단백질을 포함하고, 방법은 상기 용균물에서 단백질을 가수분해하고, 이로써 가수분해물을 생산하는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 관점에서, 본원에 기술된 바와 같은 방법으로 자라는 미생물로부터 단리된 단백질 농축물이 제공된다. 일 구현예에서, 단백질 농축물은 약 5% 미만의 핵산을 포함한다. 일 구현예에서, 단백질 농축물은 약 3% 미만의 핵산을 포함한다.
또 다른 관점에서, 본원에 기술된 바와 같이, 하나 이상의 탄소 원자를 포함하는 무기 및/또는 유기 분자를 탄소 고정화 반응 또는 동화적 생합성을 통하여 생산된 아미노산, 단백질 및/또는 비타민을 포함하는 유기 분자로 생물학적으로 전환시키는 방법은 a. 하나 이상의 핵산분해 효소를 포함하는 상기 미생물 세포를 파열하고, 이로써 용해성 핵산, 핵산 분해효소 및 단백질을 포함하고 불용성 세포벽 잔재를 포함하는 혼합물을 생산하는 단계; b. 상기 용해성 핵산, 핵산 분해효소 및 단백질을 상기 핵산이 상기 핵산 분해효소로 가수분해되어 가수분해된 핵산을 생산하는 조건 하에서 상기 불용성 세포벽 잔재로부터 분리하는 단계; c. 상기 단백질을 불용성으로 만드는 단계; 및 d. 상기 불용성 단백질을 상기 가수분해된 핵산을 포함하는 나머지 용해성 물질로부터 분리하는 단계를 포함하는, 농축된 단백질 산물을 생산하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 균질화에 의해 파열된다. 일 구현예에서, 불용성 단백질은 약 5% 미만의 핵산을 포함한다. 일 구현예에서, 불용성 단백질은 약 3% 미만의 핵산을 포함한다.
또 다른 관점에서, 본원에 기술된 바와 같이 생산된 바이오매스 및/또는 유기 분자는 발효를 위한 유기 탄소 및/또는 질소 공급원; 다른 미생물 또는 유기체의 성장을 위한 영양분 공급원; 프리바이오틱; 인간을 위한 영양분 공급원 또는 식품 성분; 동물용 사료; 제조 또는 화학적 공정을 위한 원료 물질 또는 화학 중간체; 제약, 의약 또는 영양적 물질의 공급원; 비료; 토양 첨가제; 토양 안정화제; 토양 아쥬반트; 식물 바이오자극제; 및/또는 버섯 성장 증진제 중 적어도 하나로서의 적용을 갖는다. 일 구현예에서, 비료; 및/또는 토양 첨가제; 및/또는 토양 안정화제; 및/또는 토양 아쥬반트; 및/또는 식물 바이오자극제; 및/또는 버섯 성장 증진제는 토양에 탄소 및/또는 질소를 첨가하여, 이것이 적용되는 토양의 탄소 및/또는 질소 함량을 증가시킨다. 일 구현예에서, 탄소원은 기스성 C1 분자이며, 상기 토양에 첨가된 탄소는 격리된 탄소를 나타내고, 가스성 C1 탄소원부터 토양 탄소까지의 종단 과정은 탄소 격리 공정을 나타낸다. 일 구현예에서, 비료 및 / 또는 바이오자극제는 하이드로포닉, 에어로포닉, 아쿠아포닉으로 또는 버티칼 농장 시스템에서 자라는 작물에 적용된다. 일 구현예에서, 비료 및/또는 바이오자극제는 관비 (fertigation)에 사용된다. 일 구현예에서, 비료 및 / 또는 바이오자극제는 온실, 실내, 및/또는 인공 조명에서 자라는 작물에 적용된다. 일 구현예에서, 미생물 및 다른 유기체의 성장 방법으로서, 본원에 기술된 바와 같이 생산된 영양분 공급원 상의 토양에서 상기 미생물 및 유기체이 성장하는, 방법이 제공된다. 일 구현예에서, 상기 유기 탄소 및/또는 질소원을 사용하여, 시판 효소; 항생제; 아미노산; 단백질; 식물 바이오자극제; 버섯 성장 증진제; 프로바이오틱; 프리바이오틱; 바이오비료; 식품; 식품 성분; 비타민; 지질; 바이오플라스틱; 다당류; 영양제; 및/또는 약제를 포함하는 하나 이상의 생체산물을 생산하는, 발효 방법이 제공된다.
또 다른 관점에서, C1 급식 원료로부터 유기 효소 추출물을 획득하는 방법으로서, 본원에 기술된 바와 같이 하나 이상의 탄소 원자를 포함하는 무기 및/또는 유기 분자를 탄소 고정화 반응 또는 동화적 생합성을 통하여 생산된 아미노산, 단백질 및/또는 비타민을 포함하는 유기 분자로 생물학적으로 전환하는 방법을 포함하고, 여기서 상기 탄소원은 단 하나의 탄소 원자를 포함하며, 상기 방법은 상기 미생물 세포를 기계적 용균; 효소적 용균; pH 조정; 압력의 증가 또는 감소; 온도의 증가 또는 감소; 전기장 또는 전자기장; 초음파; 삼투압의 변화; 및 효소적 가수분해 중 하나 이상으로 처리하고, 이로써 유기 효소 추출물을 생산하는 단계를 추가로 포함하는, 방법이 제공된다.
또 다른 관점에서, 본원에 기술된 바와 같은 방법으로 생산된 바이오매스 및/또는 단백질을 포함하는 버섯 성장 증진제가 제공된다. 일 구현예에서, 버섯 성장을 증진하는 방법으로서, 버섯 성장 증진제를 버섯 퇴비와 조합하는 단계를 포함하는, 방법이 제공된다. 일 구현예에서, 조합된 버섯 퇴비 및 버섯 성장 증진제를 포함하는 버섯 성장 조성물이 제공된다.
본원에 기술된 방법, 시스템, 미생물 및 조성물의 다양한 목적, 특징, 관점 및 장점은 본 발명의 일부 예시적인 구현예의 다음 상세한 설명으로부터 더욱 명백해질 것이다.
본 발명의 비제한적인 구현예는 예로서 첨부 도면을 참조하여 설명될 것이며, 이의 일부는 개략적이고, 일정한 척도로 도시하도록 의도되지 않는다. 명확성을 위해, 모든 구성 요소가 모든 도면에 라벨링되는 것은 아니며, 당업자가 본 발명을 이해할 수 있도록 예시가 필요하지 않은 본 발명의 각각의 구현예의 모든 구성 요소도 도시되지 않는다.
도 1은 OD 및 바이오매스 밀도 간의 상관 관계를 나타낸다.
도 2는 가스 상에서 혈청 병의 Cupriavidus necator의 성장 곡선을 나타낸다.
도 3은 혈청 병에서 가스 상의 Cupriavidus necator의 성장에 대한 시간 경과 시 상부공간 압력의 변화를 나타낸다.
도 4는 혈청병의 Cupriavidus necator의 경우 소비된 H2 몰 당 생산된 건조 바이오매스를 나타낸다.
도 5는 생물반응기에서 H2/CO2/O2 상에서 자란 Cupriavidus necator의 성장 곡선을 나타낸다.
도 6은 상이한 탄소원 상에서 화학영양성 및 유성 미생물의 성장을 나타낸다. 세균 성장은 지시된 일 (괄호) 이후에 650 nm에서 광학 밀도 (OD) 검출을 사용하여 측정되었다. 배지 및 성장 조건은 하기 실시예 섹션에서 설명된다. ND, 미결정됨.
도 7은 가스 상에서 C. necator 를 성장시키는 데 사용되는 생물반응기 및 지지 시스템의 개략도를 나타낸다.
도 8은 증기 후드에서 가스 상에서 C. necator 를 성장시키는 두 개의 20-L 생물반응기를 나타낸다.
도 9는 폭발성 가스 검출 시스템, 질량 유량계, 수준 제어기, 기본 제어 저장조, 배지 첨가 저장조 및 거품 제어 저장조와 함께 20-L 반응기를 작동하는 데 사용되는 애플리콘 (Applikon) 제어기 및 콘솔을 나타낸다.
도 10은 파쇄 이전 (좌측) 갈색이고, 완전한 세포 파손을 갖는 파쇄 이후 (우측) 갈색에서 크림색으로 변한 바이오매스 색상이 되는 C. necator의 바이오매스 슬러리를 나타낸다.
도 11은 H2, CO2 및 O2 가스의 혼합물 상에서 생물반응기에서 자라는 Hydrogenovibrio marinus 균주 DSM 11271를 나타낸다.
도 12는 개략적으로 도식화된 Rhodopseudomonas capsulata 균주 DSM 1710이 자라는데 사용되는 가스 전달 및 배양병 시스템을 나타낸다.
도 13은 R. capsulata의 현미경 사진을 나타낸다.
도 14는 원심분리 이후 회수된 R. capsulata 바이오매스의 펠렛을 나타낸다.
도 15는 성장을 위한 유일한 에너지원 및 탄소원으로서 H2, CO2 및 O2가스의 혼합물 상에서 Xanthobacter autotrophicus 균주 DSM 432가 자라는데 사용된 2 리터 유리 발효기 시스템의 개략도를 나타낸다.
도 16은 개략적으로 도시된, X. autotrophicus가 자라는데 사용된 2 리터 생물반응기의 상부 플레이트를 나타낸다.
도 17은 압력 게이지; 가스 유량계; 안전 및 체크 밸브; 0.2 마이크론 필터; 생물반응기 용기, 센서, 구동기 및 제어기; 콘덴서 및 거품 포집기; 및 유출 배출구를 포함하는 Xanthobacter autotrophicus가 성장하는 반응기 시스템의 개략도를 나타낸다.
도 18은 X. autotrophicus 가 자라는데 사용된 가스 전달 시스템의 개략도를 나타낸다.
도 19는 X. autotrophicus의 경우 OD600 및 세포 건조 중량 (CDW) 사이의 상관 관계를 나타낸다.
도 20은 H2/CO2/O2 상에서 자라는 X. autotrophicus의 성장 곡선을 나타낸다.
도 21은 수용성 세포 현탁액 형태에서 발효 배양액의 알칼리 처리, 이어서 물리적 처리 및 효소적 가수분해에 의해 유기 효소 추출물을 획득하는, 본원에 기술된 방법의 일 구현예의 블록도를 나타낸다.
도 22는 본원에 기술된 바와 같이 고단백질, 저핵산 단리물이 세포로부터 유래되는, 본원에 기술된 방법의 일 구현예의 블록도를 나타낸다.
도 23은 화학독립영양성 일차 생산자와 함께 복합 다단계 생명 유지 시스템 또는 생태계를 개략적으로 나타낸다.
도 24는 바이오자극제, 동물 사료 또는 비료로서 또는 직접적인 인간 영양 공급을 위해 예를 들면 사용될 수 있는, 고단백 식이의 생산을 위한 CO2 + 재생가능한 H2의 사용을 개략적으로 나타낸다.
도 25는 폐기물 CO2 및 피크외 간헐적인 재생가능한 에너지를 고단백질 바이오자극제, 사료, 비료 및/또는 영양분으로 전환시키는 통합 시스템의 개략도를 나타낸다. CO2의 포획 및 소중한 영양분의 생산에 추가하여, 시스템은 비수기 기간 동안 과다한 재생가능한 생성으로부터 그리드 상의 균주를 진정시킨다.
본원에서의 발명은 탄소원 및 에너지원으로서 합성가스 또는 생산자 가스 또는 열분해 가스, H2 및 CO2 가스 혼합물과 같은 가스성 기질을 사용하여, 미생물 시스템에서 아미노산 및 단백질 및 다른 미생물 성분의 생물학적 생산에 관한 것이다. 본 발명은 또한 미생물 아미노산, 단백질 및 다른 바이오매스 성분의 다른 유기체 또는 인간에게 영양분을 급식하거나 영양분을 제공하기 위한 용도에 관한 것이다. 개시된 방법에 따라 제조된 아미노산, 단백질 및 다른 바이오매스 성분은 식품 및 다른 생체-기반의 산물의 생산을 위해 다른 유기체에 의해 소비되고 영양분으로서 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 합성가스, 생산자 가스, 열분해 가스, CO2, 일산화탄소와 같은 탄소-함유 가스 및 수소 가스를 포함하는 이들의 혼합물 상에서 자라는 세균 또는 다른 미생물을 배양하는 단계를 통하여 아미노산, 단백질, 다른 바이오매스 성분을 생산하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 또한 이것은 바이오가스 또는 천연 가스와 같은 메탄을 포함한 가스 혼합물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 가스성 유입으로부터 아미노산, 단백질, 비타민 및 다른 영양분와 같은 유용한 유기 분자로 탄소를 고정하는 방법에 관한 것이다. 본원에 개시된 세균 및/또는 미생물은 본원에 기술된 방법 또는 다른 관점에서의 사용을 위해 유 전적으로 조작될 수 있다. 본원에 기술된 일부 다른 관점에서, 미생물은 유전적으로 조작되지 않고, 예로 야생형이다.
본 발명은 또한 가스로부터 아미노산, 단백질, 비타민 및 다른 영양분와 같은 유용한 유기 분자로 탄소를 고정하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이산화탄소 또는 다른 무기 탄소 공급원 및 무기 화학물질로부터 또는 직접적인 전기적 공급원으로부터의 화학적 에너지를 포함하는 무기 에너지를 상업적 가치가 있는 탄소-기반의 산물, 특히 아미노산, 단백질, 비타민 및 상업적 가치가 있는 다른 영양분으로 전환함을 통하여, 유기체에게 탄소-기반의 산물을 생산하고/거나 유기체에 의한 이의 생산을 증진하는 능력을 부여하는 메커니즘을 기술한다.
본 발명은 또한 인공 생태학, 조작된 영양성 시스템, 폐쇄 생태계, 미세생태계, 연속 배양 시스템, 생물재생 및 폐쇄 루프 생명 유지 시스템에 관한 것이다 (본원에 이들의 전문이 참고문헌으로 통합되는 Freda B. Taub (1974) Closed Ecological Systems Annual Review of Ecology and Systematics 5: 139-160; and E. A. Zuraw (1966) "Study of life support systems for space missions exceeding one year in duration" NASA, Tech. Rep. SP-134).
본 발명은 또한 수소 가스의 용도에 관한 것이다. 수소는 일반적으로 화석 연료의 지속가능한 대안으로서 또는 전기 에너지 저장의 수단으로 간주되어 왔다. 그러나, 이것은 또한 수소-산화 미생물의 배양을 위한 급식 원료 및 일차 에너지원으로서 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 화학독립영양성 미생물, 특히 수소-산화 세균의 기술적 적용에 관한 것이다. 이들은 과거에 단일 세포 단백질 (SCP)의 잠재적인 생산자로 연구되었던 세균의 특수한 군이다 (G. L. Drake, C. D. King, W. A. Johnson, and E. A. Zuraw, "Study of life support systems for space missions exceeding one year in duration," NASA, Tech. Rep. SP-134, Apr. 1966.; R. Repaske and R. Mayer, "Dense autotrophic cultures of Alcaligenes eutrophus" (1976) Applied and environmental microbiology 32(4): 592-597 (http://aem.asm.org/cgi/content/abstract/32/4/592)), and polyhydroxybutyrate (PHB).
본 발명은 또한 미생물 추출물 및 단백질 가수분해물에 관한 것이다. (본원에 이들의 전문이 참고문헌으로 통합되는 미국 특허 3,887,431; 미국 특허 9,416,062; 미국 특허출원 2012/0129695; 유럽 특허출원 EP2,752,399). 또한, 본 발명은 높은 바이오자극제 및 바이오-비료 능력 및 종속영양성 미생물, 곰팡이, 동물 및 식물을 위한 높은 생체-흡수 능력을 갖는 추출물을 획득하는 방법에 관한 것이고, 이들은 유기 경작, 발효, 동물 사료 및 직접적인 인간 영양 공급에 특히 유용하다.
본 발명은 또한 바이오자극제 및 바이오비료에 관한 것이다. 본 발명은 또한 식물 및 곰팡이 영양분, 바이오자극제, 바이오비료를 생산하는 방법 및 이로써 생산된 바이오자극제 및/또는 바이오비료에 관한 것이다. 본 발명은 또한 버섯 성장 증진화 물질에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 바이오자극제, 바이오비료 및/또는 성장 증진화 물질을 적용함으로써 식물 및 곰팡이를 성장시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 식물 및 곰팡이로부터 산물을 제조하는 공정, 이러한 식물 또는 곰팡이를 가축에 급식함으로써 가축을 키우는 공정, 및 이러한 가축으로부터 산물을 생산하는 공정에 관한 것이다. (본원에 이들의 전문이 참고문헌으로 통합되는 Colla, G. et al. (2015) "Protein hydrolysates as biostimulants in horticulture" Scientia Horticulturae 196: 28-38 (http://dx.doi.org/10.1016/j.scienta.2015.08.037); 미국 특허출원 US20120129695; 유럽 특허출원 EP2752399A1; 및 미국 특허출원 4,776,872).
본원에서는 아미노산, 단백질, 비타민 및 다른 생물학적 영양분의 생합성 생산을 위한 방법 및 시스템을 제공한다. 특정 구현예에서, 생산자 가스, 합성 가스, 테일 가스, 열분해, 크놀가스, 천연 가스, 바이오가스 및 H2 및 CO2 및/또는 CO 및/또는 CH4를 포함하는 가스 혼합물을 포함하나 이에 한정되지 않는 가스성 기질 상에서 아미노산, 단백질 및 다른 생물학적 영양분을 생산하는 천연 또는 조작된 미생물이 제공된다. 가스성 기질은 미생물의 성장 및 생체산물의 생합성을 위한 탄소원 및/또는 에너지원 및/또는 전자 공여체 및/또는 전자 수용체의 공급원으로서 작용할 수 있다. 특정 구현예에서, 아미노산, 펩티드, 단백질, 비타민, 및/또는 다른 영양분은 합성가스, 생산자 가스, H2, CO2, CO, H2O, NH3, CH4, CH3OH, HCOH, 우레아 중 하나 이상을 포함하나 이에 한정되지 않는 단순한 C1 및 무기 전구체로부터 합성된다.
또한 합성가스 또는 생산자 가스 및/또는 H2 및/또는 CO2 및/또는 CO 및/또는 CH4 및/또는 다른 폐가스 상에서 성장할 수 있는 야생형 또는 조작된 미생물과 같은 미생물도 제공되고, 이는 리신 및/또는 메티오닌을 포함하나 이에 한정되지 않는 아미노산을 생산할 수 있다.
특정 구현예에서, 아미노산 및/또는 펩티드 및/또는 단백질 및/또는 비타민은 H2, CO2, CO, H2O, NH3, CH4, CH3OH, HCOH, 우레아 중 하나 이상을 포함하나 이에 한정되지 않는 단순한 C1 및 무기 전구체로부터 합성된다. 다른 비제한적인 구현예에서, 아미노산, 및/또는 펩티드 및/또는 단백질 및/또는 비타민은 이에 한정되는 것은 아니지만 당과 같은 복수 탄소의 유기 분자로부터 종속영양으로 생산된다.
일부 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 아미노산 또는 단백질 또는 비타민을 생산하는 방법으로서, 세균 세포를 합성가스 및/또는 생산자 가스 및/또는 가스성 CO2 및/또는 H2 및/또는 CO 및/또는 CH4, 예로 H2 및 CO2 및/또는 CO 및/또는 CH4에 노출하는 단계를 포함하고; 세균 세포는 가스성 CO2 및/또는 다른 C1 분자를 하나 이상의 아미노산 또는 단백질 또는 비타민으로 고정할 수 있고, 미생물은 외인성 핵산을 포함하지 않거나 적어도 제 1 외인성 핵산을 포함하는, 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 세포는 하나 이상의 아미노산 또는 단백질 또는 비타민의 합성을 위한 환원성 등가물 및/또는 대사 에너지의 공급원으로서 가스성 기질을 이용한다. 일부 구현예에서, 미생물은 이의 고유한 기작을 통하여 아미노산 및/또는 단백질 및/또는 비타민을 생산한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 아미노산 및/또는 단백질 및/또는 단백질성 바이오매스 및/또는 비타민을 생산하는 방법으로서, 천연 미생물 균주 또는 조작된 미생물을 생물반응기 또는 용액에서 합성가스 및/또는 생산자 가스 및/또는 CO2 및/또는 H2 가스 및/또는 CO 및/또는 CH4 및/또는 바이오가스 및/또는 천연 가스, 예로 H2 및 CO2 및/또는 CO 및/또는 CH4를 포함하는 급식 원료로 배양하는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 본 발명은 본원에 기술된 조성물 또는 세균 또는 미생물 세포를 포함하는 생물반응기에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 본 발명은 생물반응기를 포함하는 하나 이상의 아미노산, 단백질 또는 영양분의 생산을 위한 시스템으로서, (a) 본원에 기술된 세포를 포함하는 미생물 집단; 및 (b) 합성가스 또는 생산자 가스 및/또는 가스성 CO2 및/또는 H2 및/또는 CO 및/또는 CH4 및/또는 메탄올, 예로 H2 및 CO2 및/또는 CO 및/또는 CH4 및/또는 메탄올을 포함하는 급식 원료의 전달을 허용하는 급식 원료 공급원에 연결된 투입구를 포함하는, 시스템에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 본원에 기술된 조성물의 세포를 포함하는 미생물 집단에서 아미노산, 단백질 또는 다른 영양분을 생산하는 방법으로서, (a) 본원에 기술된 세포 또는 조성물을 포함하는 미생물의 집단을 합성가스 또는 생산자 가스 및/또는 가스성 CO2 및/또는 H2 및/또는 CO 및/또는 CH4 및/또는 메탄올, 예로 H2 및 CO2 및/또는 CO 및/또는 CH4 및/또는 메탄올을 포함하는 급식 원료에서 배양하는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 아미노산, 단백질 또는 다른 영양분을 제조하는 방법으로서, (a) 본원에 기술된 세포를 반응 용기 또는 생물반응기에서 합성가스 또는 생산자 가스 및/또는 가스성 CO2 및/또는 H2 및/또는 CO 및/또는 CH4, 예로 H2 및 CO2 및/또는 CO 및/또는 CH4의 존재 시 배양하고, 세포는 세포의 총 건조 세포 질량의 적어도 10% 이상의 정량으로 하나 이상의 아미노산 또는 단백질 또는 다른 영양분를 생산하고/거나 분비하는, 단계; 및 (b) 하나 이상의 아미노산 또는 단백질 또는 다른 영양분 또는 전체 세포 산물을 반응 용기로부터 분리하는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 방법은 반응 용기 또는 생물반응기로부터의 분리 이후에 하나 이상의 아미노산, 또는 단백질 또는 다른 영양분 또는 전체 세포 산물을 정제하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 또는 단백질 또는 다른 영양분 또는 전체 세포 산물은 또 다른 유기체에게 제공되는 급식 원료 또는 공급 영양분 또는 비료의 성분이거나 이들의 전구체이거나 이들 내에 포함된다. 일부 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 아미노산을 생산하는 방법으로서, 세균 세포, 아르케온 세포 및/또는 다른 미생물 세포를 합성가스 및/또는 가스성 CO2 및/또는 H2 및/또는 CO 및/또는 CH4, 예로 H2 및 CO2 및/또는 CO 및/또는 CH4에 노출하는 단계를 포함하고; 세포는 가스성 CO2 및/또는 다른 C1 탄소원을 하나 이상의 아미노산 및/또는 단백질 및/또는 비타민으로 고정할 수 있고, 화합물은 생물반응기로부터 회수되고, 제 2 이상의 추가적인 반응기 및/또는 공정 단계에 급식되고, 화합물은 비료, 바이오자극제, 성장 보충제, 인간 영영제 또는 비타민 중 하나 이상을 포함하나 이에 한정되지 않는 산물을 생성하도록 후가공되는, 방법에 관한 것이다.
절대 또는 조건부 화학독립영양성 미생물, 특히 화학무기독립영양성 유기체를 하나 이상의 탄소 고정화 공정 단계에서 사용하는 화학적 및 생물학적 공정을 통하여 이산화탄소-함유 기체 흐름 및/또는 대기 이산화탄소 또는 용해되거나, 액화되거나, 화학적으로 결합된 형태로의 이산화탄소로부터 이산화탄소의 포획을 위한 조성물 및 방법이 제공된다. 본 발명은 또한 화학독립영양성 미생물에 의해 무기 탄소를 아미노산 및/또는 단백질 및/또는 비타민 및/또는 바이오매스를 포함하지만 이에 한정되지 않는 중간 또는 최종 화학물질인 유기 화합물로 고정하도록 수행된 화학합성 반응의 화학적 산물의 회수, 가공 및 사용을 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 화학합성 및 화학독립영양성 배양의 유지에 필요한, 화학합성에 필요한 전자 공여체 및 전자 수용체의 제공을 포함하나 이에 한정되지 않는 화학적 영양분의 생성, 가공 및 전달을 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 화학합성 및 화학독립영양성 미생물 성장에 도움이 되는 환경의 유지 및 미사용된 화학적 영양분 및 공정수의 회수 및 재활용을 위한 조성물 및 방법을 제공한다.
본원에서의 특정 구현예의 일 특징은 일산화탄소, 메탄, 메탄올, 포름산 염 또는 포름산을 포함하나 이에 한정되지 않는 C1 탄소원 및/또는 다양한 기화된, 열분해된 또는 수증기 개질된 고정된 탄소 급식 원료 및/또는 메탄 급식 원료로부터 생성된 다양한 합성가스 조성물을 포함하지만 이에 한정되지 않는 C1 화학물질을 포함하는 혼합물의 전환을 위한 전반적인 공정 내에서 C1 화학물질의 더 긴 탄소 사슬 유기 분자 (예로, C2 이상의 길이, 일부 구현예에서 C5 이상 길이의 탄소 사슬 분자)로 전환을 위한 생물 촉매로서 화학영양성 미생물을 사용하는 하나 이상의 공정 단계를 포함하는 것이다. 일부 이러한 구현예에서, 합성가스 또는 공정 가스를 포함하는 C1 또는 액체 형태의 또는 용액에 용해된 C1 화학물질은 펌핑되거나 달리 영양 배지 및 화학영양성 미생물을 포함하는 용기 또는 구획에 첨가된다. 일부 이러한 예에서, 화학영양성 미생물은 C1 화학물질을 더 긴 탄소 사슬 유기 화학물질로 연장하도록 C1 화학물질에 저장된 탄소 및 전자 및/또는 수소 분자로부터의 전자 및 수소 및/또는 고체상 전극 물질에서의 원자가 또는 전도 전자 및/또는 축적되거나 달리 영양분 배지에 제공된 암모니아; 암모늄; 일산화탄소; 디티오나이트; 황 원소; 탄화수소; 메타이아황산염; 질소 산화물; 아질산염; 소듐 티오설페이트 (Na2S2O3) 또는 칼슘 티오설페이트 (CaS2O3)를 포함하나 이에 한정되지 않은 티오설페이트와 같은 황산염; 황화수소와 같은 황화물; 아황산염; 티오네이트; 티오나이트; 전이 금속 또는 용해성 또는 고체 상에서의 이들의 황화물, 산화물, 칼코겐화물, 할로겐화물, 수산화물, 옥시수산화물, 황산염 또는 탄산염을 포함하나 이에 한정되지 않는 전자 공여체의 목록 중 하나 이상을 사용하여 생화학적 합성을 수행한다. 전자 공여체는 화학합성적 호흡 반응에서 전자 수용체에 의해 산화될 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 미생물에 의한 호흡에 사용되는 전자 수용체는 산소, 이산화탄소, 제이철 또는 다른 전이 금속 이온, 질산염, 아질산염, 산소 또는 고체 상태의 전극 재료에서의 홀 중 하나 이상을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 특정 비제한적인 구현예에서, 상기 화학영양성 미생물은 크놀가스 또는 산화수소 미생물이다.
특정 구현예에서, 본 발명은 외인성 핵산을 포함하지 않거나 하나 이상의 외인성 핵산 서열을 포함하는 화학영양성 세균 균주에 관한 것이다. 본 발명은 부분적으로 화학영양성 세균 및 특정한 관련된 미생물이 화학물질, 단백질, 사료, 비료, 단량체, 오일, 연료 및 가스성 및 폐기물 탄소 급식 원료로부터의 다른 생물학적 물질의 경제적 및 대규모 생산에서 예상치 못한 장점을 제공하는 점의 발견으로부터 나온다.
본원에 기술된 미생물에 의해 합성된 단백질, 지질 및 다른 생화학물질은 바이오자극제, 바이오비료 또는 버섯 성장 보충제의 생산을 위한 급식 원료를 포함하나 이에 한정되지 않는 용도; 바이오자극제, 바이오비료, 비료, 동물 사료, 식품, 개인 위생 및 화장품에서 성분으로서 용도에 적용될 수 있다. 일부 구현예에서, 효소적 및 화학적 공정은 비타민, 아미노산 및/또는 단백질을 생산하는데 이용될 수 있다. 일부 구현예는 바이오자극제 및/또는 비료의 생산 방법을 제공한다. 또한, 본원은 개선된 아미노산 및/또는 단백질 수율 및/또는 낮은 생산 비용을 위해 화학영양성 세균을 배양히고/거나 변형하는 방법을 제공한다.
본 발명은 절대 또는 조건부 화학영양성 유기체에서 화학물질, 단량체, 중합체, 아미노산, 단백질, 다당류, 비타민 및 영양제학 또는 약제학적 산물 또는 이들의 중간체를 포함하나 이에 한정되지 않는, 관심있는 탄소 기반의 산물의 생산 및/또는 분비를 부여하는 방법 및 메커니즘에 관한 것이고, 이들 유기체는 이산화탄소 및/또는 다른 형태의 무기 탄소 및/또는 합성가스 및/또는 메탄올과 같은 다른 C1 화합물 및/또는 열분해 가스와 같은 열분해 반응의 액체, 가스성 및 고체 산물을 관심있는 탄소 기반의 산물로 전환하며, 구체적으로는 이러한 유기체의 화학물질, 단량체, 중합체, 아미노산, 단백질, 다당류, 비타민, 동물 사료, 바이오자극제, 비료 및 영양제학 또는 약제학적 산물 또는 이들의 중간체의 상업적 생산을 위한 용도에 관한 것이다. 그러나, 본 발명은 또한 이에 한정되지 않은 당과 같은 복수 탄소 유기 분자 탄소원으로부터 종속 영양으로 상기 산물을 생산하는 방법에 관한 것이다.
일부 구현예에서 본 발명은 하기 화학합성 반응 단계와 일렬로 및/또는 동시에 일어나는 화학적 공정 단계를 위한 조성물 및 방법을 제공하고, 이는 미정제된 미가공 유입 화학물질을 화학합성 탄소 고정화 단계를 지원하는데 적합한 더 정제된 화학물질로 전환하는 단계; 에너지 유입을 화학합성을 유도하는데 사용할 수 있는 화학적 형태로, 구체적으로는 전자 공여체 및 전자 수용체의 형태로 전환하는 단계; 산업적 또는 대기 또는 수생 자원에서 포획된 무기 탄소를 화학 합성 탄소 고정을 지원하는데 적합한 조건 하에서 탄소 고정 단계 또는 공정 단계로 보내는 단계; 화학합성 탄소 고정 단계의 배출 산물을 아미노산 및/또는 단백질 및/또는 비타민 및/또는 바이오매스를 포함하나 이에 한정되지 않는 상기 산물과 함께 저장 및 수송 및 판매에 적합한 형태로 추가로 가공하는 단계이다. 생물학적 화학합성 탄소 고정 단계와 조합된 완전한 화학적, 비생물적 공정 단계는 본 발명의 전반적인 탄소 포획 및 전환 공정을 구성한다. 본 발명은 다른 생명체와 비교하여, 생체촉매로서 화학적 공정 흐름 내에서 화학독립영양성 미생물을 도입하는 독특한 용이성을 이용한다.
본 명세서에서 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 공통적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. Singleton, et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, second ed., John Wiley and Sons, New York (1994), and Hale & Markham, The Harper Collins Dictionary of Biology, Harper Perennial, NY (1991)는 본 발명에 사용된 많은 용어의 일반적인 사전으로의 기술을 제공한다. 본원에 기술된 것과 유사한 또는 동등한 임의의 방법 및 재료가 본원에 기술된 방법, 시스템 및 조성물의 시행 또는 테스트에 사용될 수 있다.
본 발명의 시행은 달리 명시되지 않는 한, 당해 기술분야의 기술 범위에 속하는 분자생물학 (재조합 기법 포함), 미생물학, 세포 생물학 및 생화학의 통상적인 기법을 채용할 것이다. 이러한 기법은 예를 들면 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984; Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al., eds., 1994); PCR: The Polymerase Chain Reaction (Mullis et al., eds., 1994); 및 Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (Kriegler, 1990) 문헌에 완전하게 설명된다.
본원에 제공된 수적 범위는 범위를 정의하는 숫자를 포함한다.
달리 명시되지 않는 한, 핵산은 5' 내지 3' 방향으로 좌측부터 우측으로 기록되고, 아미노산 서열은 아미노 내지 카복시 방향으로 좌측부터 우측까지 각각 기록된다.
정의
"하나 (a)", "하나 (an)" 및 "이의 (the)"는 문맥상 명확하게 진술되지 않는 한, 복수의 대상을 포함하여, 본원에서 명세서 및 청구범위에 사용된 바와 같은 불특정 관사 "하나 (a)", "하나 (an)" 및 "이의 (the)"는 달리 명백하게 명시되지 않는 한 "적어도 하나"를 의미하도록 이해되어야 한다.
본원에서 명세서 및 청구범위에 사용되는 바, 용어 "및/또는"는 이와 같이 결합된 요소의 "둘 중 하나 또는 둘 다", 예로 일부 경우에 결합적으로 존재하고 다른 경우에 이원적으로 존재하는 요소를 의미하도록 이해되어야 한다. 달리 반대로 명백하게 명시되지 않는 한, 구체적으로 식별된 요소와 관련이 있는지의 여부와 상관없이 용어 "및/또는"에 의해 구체적으로 식별된 요소 이외에 다른 요소가 선택적으로 존재할 수 있다. 따라서, 비제한적인 예로서, "포함하는"과 같은 개방된 언어와 조합하여 사용될 때 "A 및/또는 B"에 대한 언급은 일 구현예에서 B가 없는 A (선택적으로 B가 아닌 요소 포함); 또 다른 구현예에서 A가 없는 B (선택적으로 A가 아닌 요소 포함); 보다 또 다른 구현예에서는, A 및 B 둘 다 (선택적으로 다른 요소 포함) 등을 말할 수 있다.
양 및 일시적 지속 기간 등과 같은 측정가능한 값을 언급 할 때 본원에서 사용되 바, 용어 "약"은 특정된 값과 ±20%, ±10%, ±5%, ±1% 또는 ±0.1%의 변동을 포함하도록 의미하고, 이러한 값은 개시된 방법을 수행하거나 개시된 조성물과 관련하여 적절하다.
용어 "아미노산"은 알파-탄소로 지칭되는 탄소에 결합된 아민기 및 카복실기 둘 다를 포함하는 분자를 말한다. 적합한 아미노산은 유기 합성 또는 다른 대사 경로에 의해 제조된 비-자연 발생하는 아미노산뿐만 아니라, 자연 발생하는 아미노산의 D- 및 L-이성질체를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 단일 "아미노산"은 확장된 지방족 또는 방향족 골격 스캐폴드 당 이용가능한 경우, 다수의 측쇄 모이어티를 갖을 수 있다. 달리 문맥상 구체적으로 명시하지 않는 한, 용어 아미노산은 본원에서 사용된 바, 아미노산 유사체를 포함하도록 의도된다.
"동화 작용 (anabolism)"은 살아있는 유기체가 단순한 분자로부터 복잡한 생명 분자를 합성하는 공정을 말한다. 동화적 공정은 펩티드, 단백질, 다당류, 지질 및 핵산을 생산한다. 동화 작용에 필요한 에너지는 아데노신 트리포스페이트 (ATP)와 같은 세포내 에너지 운반체에 의해 공급된다.
"옥신"은 일부 모르포겐 유사한 특징을 갖는 식물 호르몬 (또는 식물 성장 물질)의 부류이다. 옥신은 식물의 생애 주기에서 많은 성장 및 행동 과정의 조정에 중심적인 역할을 하며 식물체 개발에 필수적이다.
"생체흡수"는 물질이 유기체의 조직 및 기관에 의해 흡수되는 과정을 의미한다.
"바이오-자극제"또는 "바이오자극제"는 식물, 예로 농작물의 성장 및 발달을 자극하고, 뿐만 아니라 토양의 미생물학적 활성을 증가시키고 증진할 수 있는 화합물을 말한다.
용어 "바이오매스"는 세포의 성장 및/또는 증식에 의해 생산된 물질을 말한다. 바이오매스는 세포 및/또는 세포내 내용물뿐만 아니라 세포에 의해 분비된 화합물을 포함하나 이에 한정되지 않는 세포외 물질을 포함할 수 있다.
용어 "생물반응기 (bioreactor)" 또는 "발효기 (fermenter)"는 세포가 성장하고 유지되는 폐쇄된 또는 부분적으로 폐쇄된 용기를 말한다. 세포는 액체 현탁액으로 유지될 수 있으나 반드시 그럴 필요는 없다. 일부 구현예에서, 세포는 액체 현탁액으로 유지되기보다, 대안적으로 고체 성장 지지체 물질을 포함하나 이에 한정되지 않는 또 다른 비-액체 기질과 접촉하여, 이 위에 또는 이의 내부에서 성장되고/거나 유지될 수 있다.
"탄소 고정화" 반응 또는 경로는 CO2, CO 및 CH4를 포함하나 이에 한정되지 않는 주변 조건 하에서 가스성인 탄소 형태를 대기 조건 하에서 액체 또는 고체이거나 수용액에서 용해되거나 현탁액으로 유지되는 탄소 기반의 생화학물질로 전환하는 효소적 반응 또는 대사적 경로를 말한다.
"탄소원"은 미생물이 유기 생합성에 필요한 탄소를 유도하는 분자 유형을 의미한다.
"카복시영양성" 미생물은 일산화탄소를 견디거나 산화시킬 수 있는 미생물이다. 바람직한 구현예에서, 카복시영양성 미생물은 탄소원으로서 및/또는 생합성 및/또는 호흡을 위한 환원성 전자의 공급원으로서 CO를 사용할 수 있다.
용어 "촉매"는 분자 또는 거대 분자 구조와 같은 화학적 작용기를 말하며, 촉매는 화학 반응의 완료 시 산물 자체로 변화되거나 달리 변경되거나 소비되지 않으면서, 반응물 또는 반응물들이 산물 또는 산물들로 전환되는 화학 반응이 일어나는 속도를 가속화한다. 촉매는 하나의 화학 반응에 참여한 이후에 변화되지 않기 때문에, 추가의 화학 반응에 참여할 수 있으며, 추가적인 반응물에 작용하여 추가적인 산물을 생성할 수 있다. 화학 반응을 가속화하기 위하여, 촉매는 반응 경로를 교차하는 활성화 에너지 장벽을 감소시켜 반응이 더 낮은 온도에서 또는 주어진 온도에서 더 신속하게 일어나도록 허용한다. 이러한 방식으로, 화학적 평형에 대한 시스템의 더욱 신속한 접근이 달성될 수 있다. 촉매는 단백질 촉매인 효소를 포함한다.
용어 "셀룰로스 재료"는 많은 양의 셀룰로스를 갖는 임의의 물질을 말하고, 이는 일반적으로 수백 내지 수천 개의
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(1->4) 연결된 D-포도당 단량체의 직쇄로 구성되는 식 (C6H10O5)n를 갖는 다당류이다. 셀룰로스 재료의 공급원은 카드보드, 면, 옥수수 찌꺼기, 종이, 목재 칩, 톱밥, 사탕무 펄프, 사탕수수 바가스, 스위치그라스를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
"화학독립영양성 미생물"은 화학적 전자 수용체에 의한 화학적 전자 공여체의 산화에 의해 에너지를 얻고 이산화탄소로부터 유기체가 살고 성장하는데 필요한 모든 유기 화합물을 합성하는 유기체를 말한다.
용어 "CoA" 또는 "보조효소 A"는 지방산 합성 및 산화, 피루베이트 산화, 아세틸 또는 다른 아실기 전달 및 기타 아세틸화에 관여하는 효소를 응축시키는 유기 보조인자를 말한다.
용어 "보조인자"는 효소가 이의 촉매적 활성을 수행하는데 필요한 모든 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 보조인자는 기질로부터 떨어져 있는 임의의 분자이다.
청구범위, 뿐만 아니라 명세서에서, "포함하는", "포함하는", "보유하는", "갖는", "포함하는", "수반하는", "유지하는" 등의 모든 과도기적 어구는, 예로 포함하나 제한적이지 않은 것을 의미하도록 개방된 것으로 이해되어야 한다. 단지 과도기적 어구 "로 구성되는" 및 "필수적으로 구성되는"은 각각 폐쇄된 또는 반-폐쇄된 과도기적 어구이어야 한다.
용어 "배양하는"은 액체 또는 고체 배지에서, 성장에 적합한 조건 하에 세포의 집단, 예로 미생물 세포를 성장시키는 것을 말한다.
용어 "로부터 유래된"은 용어 "로부터 기원한", "로부터 획득된", "로부터 획득가능한", "로부터 단리된" 및 "로부터 제조된"을 포괄하고, 일반적으로 하나의 특정된 물질이 또 다른 특정된 물질에서 이의 기원을 찾고, 또 다른 특정된 자료를 참조하여 설명될 수 있는 특징을 갖는 점을 나타낸다.
"유도인자"는 식물 해충, 질병 또는 상승작용 유기체와 종종 관련되는 외인성 또는 외래 분자이다. 유도인자 분자는 식물 세포막 상에 위치하는 특별한 수용체 단백질에 부착할 수 있다.
"에너지원"은 호기성 호흡에서 산소에 의해 산화되는 전자 공여체 또는 산화된 전자 공여체 및 혐기성 호흡에서 환원되는 전자 수용체의 조합을 말한다.
"토양 (edaphic)"은 특히 살아있는 유기체 및/또는 특정 유형의 토양과 관련된 유기체에 영향을 미치기 때문에 토양의 또는 토양과 관련된을 의미한다.
용어 "리그노셀룰로스 물질"은 셀룰로스, 헤미셀룰로스 및 리그닌으로 구성된 임의의 물질이며, 여기서 탄수화물 중합체 (셀룰로스 및 헤미셀룰로스)는 리그닌에 단단히 결합된다. 리그노셀룰로스 물질은 농업 잔류물 (옥수수 찌꺼기 및 사탕수수 바가스 포함), 대부분의 바이오매스 에너지 작물, 목재 잔류물 (제재소 및 제지 공장 폐기물 포함) 및 도시 폐기물의 실질적인 분획을 포함한다.
용어 "지질"은 비극성 용매 (예로, 클로로포름 및/또는 에테르)에 용해될 수 있고, 물에 대한 용해도가 낮거나 전혀 없는 분자의 카테고리를 말한다. 지질 분자의 소수성 특성은 전형적으로 분자 내에서 긴 사슬 탄화수소 부분의 존재로부터 유도된다. 지질은 다음의 분자 유형, 탄화수소, 지방산 (포화 및 불포화), 지방 알코올, 지방 알데히드, 히드록시 산, 이산, 모노글리세리드, 디글리세리드, 트리글리세리드, 인지질, 스핑고지질, 콜레스테롤 및 스테로이드 호르몬과 같은 스테롤, 지용성 비타민 (예로, 비타민 A, D, E 및 K), 폴리케티드, 테르페노이드 및 왁스를 포함한다.
용어 "용균물"은 세포 용해로부터 나온 세포 내용물의 혼합물 및/또는 용액을 포함하는 액체를 말한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 방법은 세포 용균물에서의 화학물질 또는 화학물질의 혼합물의 정제를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 세포 용균물에서의 아미노산 및/또는 단백질의 정제를 포함한다.
용어 "용균"은 세포질막 및 존재하면 세포의 세포벽의 파열을 말하고, 세포막의 상당 부분이 세포외 공간으로 유출된다. 용균은 전기화학적, 기계적, 삼투성, 열적 또는 바이러스성 수단을 사용하여 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 방법은 생물반응기의 내용물로부터 화학물질 또는 화학물질의 혼합물을 분리하기 위해 본원에 기술된 바와 같은 세포 또는 미생물의 용균를 수행하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 아미노산 또는 아미노산 및/또는 단백질의 혼합물을 생물반응기 또는 세포 성장 배지의 내용물로부터 분리하기 위해 본원에 기술된 세포 또는 미생물의 용균을 수행하는 것을 포함한다.
본 명세서 및 청구범위에서 사용된 바, "또는"은 상기에서 정의된 바와 같이 "및/또는"과 동일한 의미를 갖도록 이해되어야 한다. 예를 들면, 목록에서 항목을 분리할 때, "또는" 또는 "및/또는"은 포괄되는 것으로서, 예로 적어도 하나의 포함, 뿐만 아니라 하나 이상, 다수의 요소 또는 요소의 목록, 선택적으로 목록에 없는 추가적인 항목을 포함하는 것으로서 해석되어야 한다. "단 하나"또는 "정확하게 하나"와 같은 반대로 명백하게 명시된 용어 단 하나, 또는 청구항에서 사용될 때, "구성되는"은 다수의 요소 또는 요소의 목록 중 정확하게 하나의 요소의 포함을 말할 것이다. 일반적으로, 본원에 사용된 바 용어 "또는"은 "둘 중 하나", "하나", "단 하나" 또는 "정확하게 하나"와 같은 배타적인 용어가 선행할 때, 배타적인 대안 (예로, "하나 또는 나머지이나 둘 다는 아닌")을 나타내는 것으로서만 해석되어야 한다. "필수적으로 구성되는"은 청구범위에서 사용될 때, 특허법 분야에서 사용되는 이의 통상적인 의미를 가져야 한다.
"역가"는 미생물 발효 공정에서 단위 부피 당 미생물에 의해 생산되는 물질의 양을 말한다. 예를 들면, 바이오매스 역가는 용액 1 리터 당 생산되는 바이오매스의 그램으로서 표현될 수 있다.
"수율"은 모든 사료 물질이 산물으로 전환되는 경우 생산될 물질의 총량에 대비한 사료 물질 (예를 들면 당)로부터 생산된 산물의 양을 말한다. 예를 들면, 아미노산 수율은 사료 물질의 100%가 아미노산으로 전환되는 경우 이론적인 수율에 대비한 생산된 아미노산의 %로서 표현될 수 있다.
"생산성"은 미생물 발효 공정에서 단위 시간 당 미생물에 의해 생산되는 물질의 양을 말한다. 예를 들면, 바이오매스 생산성은 시간 당 용액 1 리터 당 생산되는 바이오매스의 그램으로서 표현될 수 있다.
"야생형"은 자연에서 발생하는 미생물을 말한다.
"유전자"는 폴리펩티드 생산에 관여하고 코딩 영역뿐만 아니라 개별적 코딩 분절 (엑손) 사이에 개입 서열 (인트론)을 선행하고 후행하는 영역을 포함하는 DNA 분절을 말한다.
본원에 사용된 바 용어 "회수된", "단리된", "정제된" 및 "분리된"은 자연적으로 연관되는 적어도 하나의 성분으로부터 제거된 물질 (예로, 단백질, 핵산 또는 세포)을 말한다. 예를 들면, 이들 용어는 예를 들면 미가공 생물학적 시스템과 같은 이의 고유한 상태에서 발견되는 바과 같은 정상적으로 동반되는 성분이 실질적으로 또는 필수적으로 없는 물질을 말할 수 있다.
"무기독립영양성 미생물 (lithoautotrophic)"은 유기체가 무기 화학적 전자 수용체에 의한 무기 화학적 전자 공여체의 산화를 에너지원으로서의 산화를 이용하는 특이적 유형의 화학독립영양성을 말한다.
용어 "크놀가스 (knallgas)"는 수소 분자 및 산소 가스의 혼합물을 말한다. "크놀가스 미생물"은아데노신-5'-트리포스페이트 (ATP)와 같은 세포내 에너지 운반체를 생성하기 위한 호흡에서 전자 공여체로서 수소 및 전자 수용체로서 산소를 사용할 수 있는 미생물이다. 용어 "산화수소" 및 "산화수소 미생물"은 각각 "크놀가스" 및 "크놀가스 미생물"과 동의어로 사용될 수 있다. 크놀가스 미생물은 일반적으로 NAD+ (및/또는 다른 세포내 환원성 등가물)의 환원에 사용되는 H2로부터 공여된 일부 전자 및 호기성 호흡에 사용되는 H2로부터의 일부 전자를 갖는 수소화효소에 의한 수소 분자를 사용한다. 크놀가스 미생물은 일반적으로 캘빈 회로 또는 역방향 시트르산 회로를 포함하나 이에 한정되지는 않는 경로를 통하여, 독립영양적으로 CO2를 고정한다 ["Thermophilic bacteria", Jakob Kristjansson, Chapter 5, Section III, CRC Press, (1992)].
"화학종속영양성 미생물"은 이산화탄소로부터 유기체가 살고 성장하는데 필요한 모든 유기 화합물을 합성할 수 없고, 성장을 위해 유기 화합물을 이용해야 하는 유기체를 말한다. 종속영양성 유기체는 이들 자신의 음식을 생산할 수 없고, 대신에 식물 또는 동물 물질과 같은 유기 물질을 섭취하고 대사함으로써, 예로 이산화탄소와 같은 무기 공급원으로부터 탄소를 고정하지 않고 음식 및 에너지를 획득한다.
"니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드"는 산화 환원 반응에 관여하는 모든 살아있는 세포에서 발견되는 보조효소이며 전자를 하나의 반응부터 또 다른 반응으로 운반한다. 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드는 두 가지 형태로 존재하는데, 각각 NAD+ 및 NADH로 약칭되는 산화된 및 환원된 형태이다.
"수소산화 미생물"은 세포내 환원성 등가물의 생산을 위해 및/또는 호흡에서 전자 공여체로서 환원된 H2를 이용하는 미생물을 말한다.
"아세토겐"은 혐기성 호흡의 산물로서 아세테이트 및/또는 C4 사슬 길이까지의 다른 짧은 사슬 유기산을 생성하는 미생물을 말한다.
"메타노겐"은 혐기성 호흡의 산물로서 메탄을 생성하는 미생물을 말한다.
"메틸영양성 미생물 (methylotroph)"는 탄소원으로서 및/또는 이들의 성장을 위한 전자 공여자로서, 이에 한정되는 것은 아니지만 메탄올 또는 메탄과 같은 환원된 1개 탄소 화합물을 사용할 수 있는 미생물을 말한다.
"극한 친화성 생물 (extremophile)"은 전형적으로 지구 표면 위에 또는 이의 근처에서 발견되는 대부분의 생명체가 견디는 지구 표면 또는 해양의 조건과 비교하여 물리적 또는 지구화학적 극한 조건 (예로, 높은 또는 낮은 온도, pH 또는 높은 염도)에서 번성하는 미생물을 말한다.
"호열성 생물 (thermophile)"은 라이프가 비교적 높은 온도, 전형적으로 약 45°C 내지 약 122°C에서 번성하는 극한 친화성 생물의 유형을 말한다.
"고열성 생물 (hyperthermophile)"은 라이프가 극단적으로 뜨거운 환경, 전형적으로 약 60°C (약 140°C)에서 번성하는 극한친화성 생물의 유형을 말한다.
"호산성 생물 (acidophile)"은 높은 산성 조건 (보통 pH 2.0 이하) 하에서 번성하는 극한 친화성 생물의 유형을 말한다.
"할로겐 친화성 생물 (halophile)"은 매우 높은 농도의 소금을 갖는 환경에서 번성하는 극한 친화성 생물의 유형을 말한다.
"한냉 미생물 (psychrophile)"은 냉온, 전형적으로 약 10°C 이하에서 성장하고 번식할 수 있는 극한 친화성 생물의 유형을 말한다.
"생산자 가스"는 H2, CO 및 CO2 의 다양한 비율을 포함하고, 전형적으로 표준 조건 하에서 단위 부피 당 천연 가스의 이분의 일 및 10분의 일 사이 범위의 열 값을 갖는 가스 혼합물을 말한다. 생산자 가스는 가스화, 수증기 개질 또는 탄소 기반의 급식 원료의 자동 개질을 포함하여 다양한 급식 원료로부터 다양한 방식으로 생성될 수 있다. H2, CO 및 CO2에 추가하여, 생산자 가스는 생성 공정 및 급식 원료에 의존하여 메탄, 황화수소, 응축가능한 가스, 타르 및 회분을 포함하나 이에 한정되지 않는 다른 성분을 포함할 수 있다. 혼합물에서 N2의 비율은 공기가 반응기에서 산화제로서 사용되는지 여부와 반응 열이 직접적인 연소에 의해 또는 간접적인 열 교환을 통해 제공되는지 여부에 따라 높거나 낮을 수 있다.
"플라보노이드" (또는 바이오플라보노이드) (라틴어로 플라부스 (flavus)는 자연에서 이의 색상인 황색을 의미함)는 식물 및 곰팡이의 이차 대사물의 부류이다. 화학적으로, 플라보노이드는 두 개의 페닐 고리 (A 및 B) 및 헤테로고리상 고리 (C)로 구성된 15개 탄소 골격의 일반 구조를 갖는다. 이러한 탄소 구조는 C6-C3-C6으로 약칭될 수 있다.
"비료"는 토양을 풍부하게 하고 식물에 일반 작물 성장을 위한 하나 이상의 필수 영양분를 제공하는데 사용되는 유기물 또는 무기물, 천연 또는 합성 물질이다. 특정 구현예에서, 용어 비료는 또한 곰팡이 및 버섯 생산을 위한 영양분을 말한다.
"관비"은 비료, 토양 개량제 및 기타 수용성 산물을 관개 시스템에 주입하는 것이다.
용어 "가스화"는 일반적으로 탄소 기반의 물질을 수소, 일산화탄소 및 합성가스, 합성가스 또는 생산자 가스로 불리는 이산화탄소를 포함한 가스 혼합물로 전환하는 고온 공정을 말한다. 공정은 일반적으로 탄소 기반의 물질의 완전 연소를 위해 불충분한 산소가 존재하도록 제어된 산소 및/또는 증기의 첨가와 함께 부분적 연소 및/또는 외부적으로 발생된 열의 적용을 수반한다.
"지베렐린" (GA)은 성장을 조절하고 줄기 연장, 발아, 휴면, 개화, 성 발현, 효소 유도 및 잎과 과일 노화를 포함하는 다양한 발달 과정에 영향을 미치는 식물 호르몬이다.
"글루코시노레이트"는 겨자, 양배추, 양고추냉이와 같은 많은 매운 식물의 천연 성분이다. 이들 식물의 매운 성질은은 식물성 물질을 씹거나 자르거나, 달리 손상될 때 글루코시노레이트로부터 생산된 겨자 오일로 인한다.
용어 "미생물" 및 "미생물 (microbe)"은 현미경적 단세포 생명체를 의미한다.
용어 "분자"는 하나 이상의 원자를 포함하는 물질의 구별된 또는 분간가능한 구조적 단위를 의미하며, 예를 들면 탄화수소, 지질, 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
용어 "유성"은 오일이 풍부하거나 오일을 많은 양으로 생산하는 것을 말한다.
"올리고펩티드"는 비교적 적은 수의 아미노산 잔기, 예를 들면 약 2 내지 약 20개의 아미노산을 포함하는 펩티드를 말한다.
용어 "유기 화합물"은 무기 화합물로 고려되는 카바이드, 탄산염, 탄소의 단순 산화물, 시안화물 및 다이아몬드 및 흑연과 같은 순수한 탄소의 동소체를 제외하고는, 탄소 원자를 포함하는 임의의 가스성, 액체 또는 고체 화합물을 말한다.
파파야 프로테아제 I로도 알려진 "파파인"은 파파야 (Carica papaya) 및 산 파파야 (Vasconcellea cundinamarcensis)에 존재하는 시스테인 프로테아제 (EC 3.4.22.2) 효소이다.
"펩신"은 단백질을 더 작은 펩티드 (예로, 프로테아제)로 분해하는 효소이다. 이것은 위장에서 생산되고, 인간과 다른 많은 동물의 소화계에서 음식의 단백질을 소화하는데 도움이 되는 주요 소화 효소 중 하나이다.
"펩티드"는 사슬 내에 연결된 두 개 이상의 아미노산으로 구성된 화합물로서, 각각의 산의 카복시기는 예를 들면 R-OC-NH-R' 유형의 결합에 의해 다음 아미노기에 결합되고, 약 2 내지 약 50개의 아미노산을 포함한다.
용어 "에 대한 전구체" 또는 "의 전구체"는 최종 산물의 하나 이상의 성분을 생산하는 중간체이다.
용어 "생산하는"은 세포로부터의 화합물의 분비를 포함하여, 세포내 및 세포외에서 화합물의 생산을 모두 포함한다.
"식물권 (phyllosphere)"은 미생물의 서식처로서 식물의 지상부를 총칭하도록 미생물학에서 사용되는 용어이다.
"식물 독성"은 화합물이 식물 성장에 미치는 독성 효과이다. 이러한 손상은 미량 금속, 염도, 살충제, 식물 독소 또는 알레르기성 화학물질을 포함한 광범위한 화합물에 의해 유발될 수 있다.
본원에 사용된 바, "폴리펩티드"는 아미노산으로 구성되고 당업자에 의해 단백질로서 인식되는 조성물을 말한다. 아미노산 잔기에 대한 통상적인 1개 문자 또는 3개 문자 코드가 본원에서 사용된다. 용어 "폴리펩티드"및 "단백질"은 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 말하도록 상호교환적으로 사용된다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 이것은 변형된 아미노산을 포함할 수 있으며, 비-아미노산에 의해 개입될 수 있다. 용어는 또한 자연적으로 또는 개입, 예를 들면 디설파이드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화 또는 표지 성분과의 컨쥬게이션과 같은 임의의 다른 조작 또는 변형에 의해 변형되었던 아미노산 중합체를 포괄한다. 또한, 예를 들면 아미노산의 하나 이상의 유사체 (예를 들면, 비-천연 아미노산 등 포함), 뿐만 아니라 당해 기술분야에 공지된 다른 변형을 포함하는 폴리펩티드도 정의 내에 포함된다.
"근권 (rhizosphere)"는 뿌리 분비 및 관련된 토양 미생물에 의해 직접적으로 영향을 받는 토양의 좁은 지역이다.
"황 산화 미생물"은 세포내 환원성 등가물의 생산을 위해 및/또는 호흡에서 전자 공여체로서 H2S를 포함하나 이에 한정되지 않는 환원된 황을 이용하는 미생물을 말한다.
"합성가스" 또는 "합성 가스"는 생산자 가스와 같이 H2 및 CO를 포함하지만, 메탄올 또는 피셔-트롭쉬 디젤 (이에 한정되는 것은 아님)과 같은 특정한 유형의 화학적 산물을 위해 H2 및 CO 함량 및 비율 및 불순물 수준의 견지에서 더욱 구체적으로 재단되었던 가스 혼합물의 유형을 말한다. 합성가스는 일반적으로 H2, CO 및 CO2를 주요 성분으로 포함하고, 메탄, 액체 석유 가스 또는 바이오가스의 수증기 개질; 또는 바이오매스, 폐유기물, 다양한 중합체, 토탄 및 석탄을 포함하나 이에 한정되지 않는 유기, 가연성, 탄소 기반의 물질의 가스화를 통한 방법을 포함하는 확립된 방법을 통하여 생성될 수 있다. 합성가스의 수소 성분은 물 가스 전환 반응에서 증기와 CO의 반응을 통하여 합성가스 혼합물에서 CO2의 동시적 증가와 함께 증가될 수 있다.
"트립신" (EC 3.4.21.4)은 단백질을 가수분해하는 많은 척추 동물의 소화계에서 발견되는 PA 클랜 슈퍼패밀리로부터의 세린 프로테아제이다. 트립신은 이의 전구효소 형태인 췌장에서 생산되는 트립시노겐이 활성화될 때 소장에서 형성된다. 트립신은 주로 아미노산 리신 또는 아르기닌의 카복실기에서 프로린이 선행할 때를 제외하고는 펩티드 사슬을 절단한다. 이것은 수많은 생명공학적 공정에 사용된다. 이 공정은 공통적으로 트립신 단백질분해 또는 트립신 처리 (trypsinisation)라고 지칭되며, 트립신으로 분해/처리되었던 단백질은 트립신 처리되었던 것으로 말한다. 본원의 특정 구현예는 본원에 기술된 바와 같이 생산된 단백질의 트립신 처리를 이용한다.
본원에 사용된 바, 용어 "폴리뉴클레오티드"는 임의의 길이 및 임의의 삼차원 구조의 및 단일 또는 다중 가닥 (예로, 단일 가닥, 이중 가닥, 삼중 나선 등)의 뉴클레오티드의 중합체 형태를 말하고, 이는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드 및/또는 변형된 뉴클레오티드 또는 염기 또는 이들의 유사체를 포함한 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 변형된 형태를 포함한다. 유전 코드가 축퇴적이기 때문에, 하나 이상의 코돈이 특정한 아미노산을 인코딩하는데 사용될 수 있으며, 본 발명은 특정한 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포괄한다. 핵산 분해효소 저항성을 증가시키는 변형 (예로, 데옥시, 2'-O-Me, 포스포로티오에이트 등)을 포함하여 폴리뉴클레오티드가 원하는 기능성을 사용 조건 하에서 보유하는 한, 임의의 유형의 변형된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체가 사용될 수 있다. 표지는 또한 예를 들면 방사성 또는 비-방사성 표지 또는 앵커, 예로 바이오틴을 검출 또는 포획할 목적으로 도입될 수 있다. 용어 폴리뉴클레오티드는 또한 펩티드 핵산 (PNA)을 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 자연 발생하거나 비-자연 발생할 수 있다. 용어 "폴리뉴클레오티드", "핵산" 및 "올리고뉴클레오티드"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 폴리뉴클레오티드는 RNA, DNA, 또는 둘 다 및/또는 이들의 변형된 형태 및/또는 유사체를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 비-뉴클레오티드 성분에 의해 개입될 수 있다. 하나 이상의 포스포디에스테르 결합은 대안의 연결기로 대체될 수 있다. 이들 대안의 연결기는 인산염이 P(O)S ("티오에이트"), P(S)S ("디티오에이트"), (O)NR.sub.2 ("아미데이트"), P(O)R, P(O)OR', CO 또는 CH.sub.2 ("포름아세탈")로 대체되는 구현예를 포함하나 이에 제한되지 않고, 여기서 각각의 R 또는 R'은 H 또는 선택적으로 에테르 (--O--) 결합을 포함한 치환 또는 미치환된 알킬 (1 내지 20개 C), 아릴, 알케닐, 고리알킬 또는 아르알킬이다. 폴리뉴클레오티드의 모든 결합이 동일할 필요는 없다. 폴리뉴클레오티드는 선형 또는 원형이거나 선형 및 원형 부분의 조합을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바, 용어 "숙주 세포"는 폴리펩티드의 생산을 위한 재조합 발현 벡터가 폴리펩티드의 발현을 위해 형질감염될 수 있는 세포 또는 세포주를 의미한다. 숙주 세포는 단일 숙주 세포의 자손을 포함하며, 자손은 자연적, 우발적 또는 고의적인 돌연변이로 인해 고유한 모세포와 (형태 또는 전체 게놈 DNA 상보성에서) 완벽하게 동일하지는 않을 수 있다. 숙주 세포는 발현 벡터로 생체내에서 형질감염 또는 형질전환된 세포를 포함한다.
용어 "재조합"은 코딩 서열을 돌연변이하여 변형된 폴리펩티드를 생산하고, 코딩 서열을 또 다른 유전자의 코딩 서열과 융합시키고, 상이한 프로모터의 조절 하에 유전자를 배치하고, 이종유래 유기체에서 유전자를 발현시키고, 유전자를 감소된 또는 증가된 수준으로 발현시키고, 이의 자연적 발현 프로파일과는 상이한 방식으로 조건적으로 또는 구성적으로 유전자를 발현시키는 것 등에 의해 이의 서열 또는 발현 특징을 변경하도록 변형되었던 유전 물질 (예로, 핵산, 이들이 인코딩하는 폴리펩티드 및 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 세포)을 말한다. 일반적으로 재조합 핵산, 폴리펩티드, 및 이에 기초한 세포는 사람에 의해 조작되어 자연에서 발견되는 관련 핵산, 폴리펩티드 및 세포와 동일하지 않다. 재조합 세포는 또한 "조작된"이라고도 지칭될 수 있다.
본원에서 사용된 바, "벡터"는 하나 이상의 세포 유형에 핵산을 도입하도록 설계된 폴리뉴클레오티드 서열을 말한다. 벡터는 클로닝 벡터, 발현 벡터, 셔틀 벡터, 플라스미드, 파지 입자 및 카세트 등을 포함한다.
본원에 사용된 바, 용어 "발현"은 유전자의 핵산 서열에 기초하여 폴리펩티드가 생산되는 과정을 말한다. 이 과정에는 전사 및 번역이 둘 다 포함된다.
본원에 사용된 바, "발현 벡터"는 숙주에서 코딩 서열의 발현을 수행할 수 있는 하나 이상의 적합한 조절 서열(들)에 작동가능하게 연결된 DNA 코딩 서열 (예로, 유전자 서열)을 포함하는 DNA 제작물을 말한다. 이러한 조절 서열은 전사를 수행하는 프로모터, 이러한 전사를 조절하는 조건부 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 인코딩하는 서열, 및 전사 및 번역의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 단순하게 잠재적인 게놈 삽입물일 수 있다. 일단 적합한 숙주 내로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과는 독립적으로 복제하고 작용할 수 있거나 경우에 따라 게놈 자체 내로 통합될 수 있다. 플라스미드는 가장 공통적으로 사용되는 발현 벡터의 형태이다. 그러나, 본 발명은 동등한 기능을 제공하고 당해 기술분야에 공지되거나 공지되고 있는 이러한 다른 형태의 발현 벡터를 포함하도록 의도된다.
"프로모터"는 유전자의 전사를 개시하도록 RNA 폴리머라제의 결합에 관여하는 조절 서열을 말한다. 프로모터는 유도성 프로모터 또는 구성적 프로모터일 수 있다. "유도성 프로모터"는 환경 또는 발달 조절 조건 하에서 활성인 프로모터이다.
용어 "작동가능하게 연결된"은 특정된 요소가 효과를 유도하도록 조율하는 것을 허용하는 병렬 또는 배열을 말한다. 예를 들면, 프로모터는 코딩 서열의 전사를 조절하는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다.
"전사 조절 하에"는 폴리뉴클레오티드 서열의 전사가 전사의 개시에 기여하거나 전사를 촉진하는 요소에 작동가능하게 연결된 것에 의존함을 가리키는 당해 기술분야에서 잘 이해된 용어이다.
폴리뉴클레오티드 또는 단백질과 관련하여, 용어 "이종유래" 또는 "외인성"은 특정된 세포, 예로 숙주 세포에서 자연적으로 발생하지 않는 폴리뉴클레오티드 또는 단백질을 말한다. 용어는 자연 발생하는 유전자, 돌연변이된 유전자 및/또는 합성 유전자에 의해 인코딩되는 단백질을 포괄하는 것으로 의도된다. 대조적으로, 폴리뉴클레오티드 또는 단백질과 관련하여 용어 "상동적"은 세포에서 자연적으로 발생하는 폴리뉴클레오티드 또는 단백질을 말한다.
본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본 발명과 관련하여 사용되는 과학적 및 기술적 용어는 당업자가 공통적으로 이해하는 의미를 가져야 한다. 또한, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수의 용어는 복수를 포함하고 복수의 용어는 단수를 포함해야 한다. 본 발명의 방법 및 기술은 일반적으로 당해 기술분야에 공지된 통상적인 방법에 따라 수행된다. 일반적으로, 본원에 기술된 생화학, 효소학, 분자 및 세포 생물학, 미생물학, 유전학 및 단백질 및 핵산 화학 및 하이브리드화와 관련하여 사용되는 명명법은 당해 기술분야에 공지되어 있고 공통적으로 사용된다. 본 발명의 방법 및 기술은 일반적으로 당해 기술분야에 공지된 통상적인 방법에 따라 그리고 달리 명시되지 않는 한 본 명세서 전반에 걸쳐 인용되고 논의된 다양한 일반적 및 보다 구체적인 참고문헌에 기재된 바와 같이 수행된다.
가스성 에너지 및 탄소 기질로부터 아미노산, 단백질 및 기타 생물학적 영양분의 생산
일부 구현예에서, 생산자 가스 또는 H2 및/또는 CO 및/또는 CO2 및/또는 CH4를, 예로 H2 및 CO2 및/또는 CO 및/또는 CH4를 포함하는 가스 혼합물을 아미노산, 단백질 및 다른 생물학적 영양분으로 전환할 수 있는 천연 또는 조작된 미생물이 제공된다. 일부 구현예에서, 생산자 가스 또는 H2 및/또는 CO 및/또는 CO2 및/또는 CH4를, 예로 H2 및 CO2 및/또는 CO 및/또는 CH4를 포함하는 가스 혼합물을 아미노산, 단백질, 비타민 및/또는 다른 생물학적 영양분으로 전환할 수 있는 천연 또는 조작된 미생물이 제공된다. 특정 구현예에서, 비타민 B1, B2 및/또는 B12 중 하나 이상을 포함하나 이에 한정되지 않는 하나 이상의 비타민 B가 생산된다.
일부 구현예에서, 합성가스 및/또는 H2 및 CO2 및/또는 CO 및/또는 CH4 및/또는 다른 폐가스 상에서 성장할 수 있고, 상기 가스를 성장 물질로 사용하여 아미노산, 단백질, 비타민 B를 포함하나 이에 한정되지 않는 비타민 및/또는 다른 생물학적 영양분을 생산할 수 있는 천연 미생물이 제공된다.
일부 구현예에서, 아미노산, 단백질 및 이에 한정되지 않는 비타민 B와 같은 비타민을 포함하나 이에 한정되지 않는 다른 생물학적 영양분의 생산 방법으로서, 생물 반응기 또는 용액에서 합성 가스, 생산자 가스, CO2, 일산화탄소 및 수소 가스를 포함한 이들의 혼합물, H2 및 CO2 및/또는 CO 및/또는 CH4 및/또는 메탄올 또는 메탄을 포함하나 이에 한정되지 않는 가스성 또는 액체 C1 화합물과 같은 탄소-함유 가스를 아미노산, 단백질 및/또는 이에 한정되지 않는 비타민 B와 같은 비타민을 포함하나 이에 한정되지 않는 다른 생물학적 영양분으로 전환시키는 천연 또는 조작된 미생물 균주를 탄소-함유 가스와 조합함으로써 생산하는, 방법이 제공된다.
공정에서 사용된 생산자 가스는 폐기물 급식 원료 및/또는 바이오매스 잔류물 급식 원료의 가스화 또는 산업적 공정으로부터의 폐가스 또는 천연 가스, 바이오가스, 매립 가스, 공급 천연 가스 및/또는 발화된 천연 가스를 포함하나 이에 한정되지 않는 가스를 포함한 메탄의 개질을 포함하는 공급원으로부터 나올 수 있다.
일부 구현예에서, 메탄은 본원에 기술된 조작된 또는 천연 미생물 및 방법을 사용하여 아미노산, 단백질 및/또는 비타민을 포함하나 이에 한정되지 않는 다른 생물학적 영양분으로 전환될 수 있다.
미생물
일부 구현예에서, 본원에 기술된 방법에서 이용되는 미생물은 화학독립영양성 미생물이다. 화학독립영양성 미생물은 광합성을 수행하는 미생물과 같이 빛으로부터 복사 에너지가 아닌 반응을 추진하는 무기 화학물질에 저장된 잠재적인 에너지를 사용하여, CO2 및/또는 다른 형태의 무기 탄소를 유기 화합물에 고정시키는 화학합성 반응을 수행 할 수 있다 [J. M. Shively, G. van Keulen, and W. G. Meijer, "Something from almost nothing: carbon dioxide fixation in chemoautotrophs" (1998) Annual review of microbiology 52: 191-230 (http://dx.doi.org/10.1146/annurev.micro.52.1.191); A. J. Smith, J. London, and R. Y. Stanier" (1967) "Biochemical basis of obligate autotrophy in Blue-Green algae and thiobacilli" Journal of Bacteriology 94(4): 972-983 (http://jb.asm.org/content/94/4/972.abstract); M. H
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gler, C. O. Wirsen, G. Fuchs, C. D. Taylor, and S. M. Sievert (2005) "Evidence for autotrophic CO2 fixation via the reductive tricarboxylic acid cycle by members of the ε subdivision of proteobacteria" Journal of Bacteriology 187(9): 3020-3027 (http://dx.doi.org/10.1128/jb.187.9.3020-3027.2005); K. M. Scott and C. M. Cavanaugh (2007) "CO2 uptake and fixation by endosymbiotic chemoautotrophs from the bivalve solemya velum" Applied and Environmental Microbiology 73(4): 1174-1179 (http://dx.doi.org/10.1128/aem.01817-06)]. 화학독립영양성 미생물에서 일어나는 탄소 고정화 생화학적 경로는 환원성 트리카복실산 회로 및 칼빈-벤슨-바샴 회로 [J. M. Shively, G., et al. (1998), 상기 문헌] 및 우드-융달 경로 [L. G. Ljungdahl (1986) "The autotrophic pathway of acetate synthesis in acetogenic bacteria" Annual Review of Microbiology 40(1): 415-450 (http://dx.doi.org/10.1146/annurev.mi.40.100186.002215)]를 포함한다.
본원에 기술된 임의의 미생물 (예로, 본원에 기술된 하나 이상의 미생물)을 포함하는 조성물도 또한 제공된다.
일부 구현예에서, 미생물은 Hydrogenobacter 속으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 미생물은 Hydrogenobacter thermophilus이다. 일부 구현예에서, 미생물은 역방향 시트르산 회로 또는 역방향 크렙스 회로로도 역시 알려진 역방향 트리카복실산 회로 (rTCA)를 포함한다. [본원에 이들의 전문이 참고문헌으로 통합되는 Miura, A., Kameya, M., Arai, H., Ishii, M. & Igarashi, Y. (2008) "A soluble NADH- dependent fumarate reductase in the reductive tricarboxylic acid cycle of Hydrogenobacter thermophilus TK-6" J Bacteriol 190, 7170-7177, doi:JB.00747-08 [pii] 10.1128/JB.00747-08; Shively, J. M., van Keulen, G. & Meijer, WG (1998) "Something from almost nothing: carbon dioxide fixation in chemoautotrophs" Annu Rev Microbiol. 52: 191-230, doi:10.1146/annurev.micro.52.1.191].
일부 구현예에서, 미생물은 Rhodococcus opacus or Rhodococcus jostii 또는 Rhodococcus sp 이다. 일부 비제한적인 구현예에서, 미생물은 Rhodococcus opacus DSM 43205, DSM 43206, DSM 44193, 및/또는 Rhodococcus sp. DSM 3346이다.
일부 구현예에서, 천연 또는 조작된 균주는 Rhodococcus, Gordonia, Ralstonia 또는 Cupriavidus 속을 포함하나 이에 한정되지 않는 수소를 이용하는 미생물을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 일부 구현예에서, 조성물은 H2/CO 2 및/또는 합성가스 상에서 자연적으로 성장할 수 있는 미생물을 포함하고, 여기서 미생물은 자연적으로 지질을 세포 바이오매스의 50% 이상까지 축적할 수 있다. 일부 구현예에서, 미생물은 지방산 생합성 경로를 따라 높은 탄소 플럭스를 보내는 고유의 능력을 갖는다. 일부 구현예에서, 이러한 형질을 나타내는 미생물은 Rhodococcus opacus (DSM 43205 또는 DSM 43206 또는 DSM 44193)이다.
일부 구현예에서, 미생물은 외인성 유전자 또는 하나 개 이상의 외인성 유전자 (들)을 포함하지 않는 클래스 방선균이다. 일부 구현예에서, 미생물은 Actinobacteria 강 또는 Nocardiaceae 과에 속한다. 일부 구현예에서, 미생물은 외인성 유전자 또는 하나 이상의 외인성 유전자(들)를 포함하지 않는 Corynebacterium, Gordonia, Rhodococcus, Mycobacterium 또는 Tsukamurella 미생물이다. 일부 구현예에서, Nocardiaceae 과의 미생물은 외인성 유전자 또는 하나 이상의 외인성 유전자(들)을 포함하지 않고, 여기서 미생물은 Mycobacterium 속에 속하지 않는다. 일부 구현예에서, 미생물은 외인성 유전자 또는 하나 이상의 외인성 유전자(들)을 포함하지 않는 Rhodococcus 속에 속하고, 일부 구현예에서, 미생물은 Rhodococcus 종, Rhodococcus opacus, Rhodococcus aetherivorans, Rhodococcus aurantiacus; Rhodococcus baikonurensis; Rhodococcus boritolerans; Rhodococcus equi; Rhodococcus coprophilus; Rhodococcus corynebacterioides; Nocardia corynebacterioides (동의어: Nocardia corynebacterioides); Rhodococcus erythropolis; Rhodococcus fascians; Rhodococcus globerulus; Rhodococcus gordoniae; Rhodococcus jostii; Rhodococcus koreensis; Rhodococcus kroppenstedtii; Rhodococcus maanshanensis; Rhodococcus marinonascens; Rhodococcus opacus; Rhodococcus percolatus; Rhodococcus phenolicus; Rhodococcus polyvorum; Rhodococcus pyridinivorans; Rhodococcus rhodochrous; Rhodococcus rhodnii; (동의어: Nocardia rhodnii); Rhodococcus ruber (동의어: Streptothrix rubra); Rhodococcus sp. RHA1; Rhodococcus triatomae; Rhodococcus tukisamuensis; Rhodococcus wratislaviensis (동의어: Tsukamurella wratislaviensis); Rhodococcus yunnanensis; Rhodococcus zopfii 속의 균주이다. 일부 구현예에서, 동물 및/또는 식물 및/또는 인간에게 비-감염성 또는 비-병원성인 Rhodococcus 미생물이 제공된다. 일부 구현예에서, 미생물은 동물 및/또는 식물에게 비-전염성인 Rhodococcus equi 또는 Rhodococcus fascians이다. 일부 구현예에서, 미생물은 Rhodococcus opacus 균주 DSM 번호 43205 또는 43206; 또는 Rhodococcus 종 DSM 3346이다. 일부 구현예에서, 미생물은 Rhodococcus equi 및/또는 Rhodococcus fascians로부터 선택되는 종 이 아닌 Rhodococcus이다.
일부 구현예에서, 미생물은 Corynebacteriumae 아목 또는 Burkholderiaceae 과로부터 유래한다. 일부 구현예에서, 미생물은 대장균이 아니다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 미생물은 동물 및/또는 식물 및/또는 인간에게 병원성이 아니다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 미생물은 단백질을 총 세포 매스의 60% 이상으로 축적할 수 있다. 일부 구현예에서, 미생물은 단백질을 총 세포 매스의 70% 이상으로 축적할 수 있다. 일부 구현예에서, 미생물은 단백질을 총 세포 매스의 80% 이상으로 축적할 수 있다. 일부 비제한적인 구현예에서, 미생물은 Cupriavidus necator DSM 번호 531 또는 541이다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 미생물은 H2/CO 2 및/또는 합성가스 상에서 자연적으로 성장할 수 있고, 미생물은 자연적으로 폴리하이드록시부티레이트 (PHB) 또는 폴리하이드록시알카노에이트 (PHA)를 세포 바이오매스의 50% 이상까지 축적할 수 있다. 일부 구현예에서, 미생물은 아세틸-CoA 대사 중간체를 통해 높은 탄소 플럭스를 유도하는 고유의 능력을 갖으며, 이는 PHA 및 PHB 합성을 포함한 다수의 다른 합성 경로와 함께 아미노산뿐만 아니라 지방산 생합성을 유도할 수 있다. 일부의 구현예에서, 이러한 형질을 나타내는 미생물은 Cupriavidus necator (DSM 531 또는 DSM 541)이다.
일부 비제한적 구현예에서, 천연 또는 조작 된 미생물 균주는 Corynebacterium autotrophicum이다. 일부 비제한적 구현예에서, 천연 또는 조작 된 미생물은 균주는 Corynebacterium autotrophicum 및/또는 Corynebacterium glutamicum이다. 일부 구현예에서, 미생물은 Hydrogenovibrio marinus이다. 일부 구현예에서, 미생물은 Rhodopseudomonas capsulata, Rhodopseudomonas palustris 또는 Rhodobacter sphaeroides이다.
일부 구현예에서, 미생물은 산화수소 또는 크놀가스 균주이다. 일부 구현예에서, 미생물 또는 미생물을 포함하는 조성물은 다음의 크놀가스 미생물 중 하나 이상을 포함한다: Aquifex pyrophilus, Aquifex aeolicus 또는 다른 Aquifex 종; Cupriavidus necator 또는 Cupriavidus metallidurans 또는 다른 Cupriavidus 종; Corynebacterium autotrophicum 또는 다른 Corynebacterium 종; Gordonia desulfuricans, Gordonia polyisoprenivorans, Gordonia rubripertincta, Gordonia hydrophobica, Gordonia westfalica 또는 다른 Gordonia 종; Nocardia autotrophica, Nocardia opaca 또는 다른 Nocardia 종; Rhodobacter sphaeroides, Rhodopseudomonas palustris, Rhodopseudomonas capsulata, Rhodopseudomonas viridis, Rhodopseudomonas sulfoviridis, Rhodopseudomonas blastica, Rhodopseudomonas spheroides, Rhodopseudomonas acidophila 또는 다른 Rhodopseudomonas 종을 포함하나 이에 한정되지 않은 남색 비-황 광합성 세균; Rhodobacter 종, Rhodospirillum rubrum 또는 다른 Rhodospirillum 종; Rhodococcus opacus 또는 다른 Rhodococcus 종; Rhizobium japonicum 또는 다른 Rhizobium 종; Thiocapsa roseopersicina 또는 다른Thiocapsa 종; Pseudomonas facilis, Pseudomonas flava, Pseudomonas putida, Pseudomonas hydrogenovora, Pseudomonas hydrogenothermophila, Pseudomonas palleronii, Pseudomonas pseudoflava, Pseudomonas saccharophila, Pseudomonas thermophile 또는 다른 Pseudomonas 종; Hydrogenomonas pantotropha, Hydrogenomonas eutropha, Hydrogenomonas facilis 또는 다른 Hydrogenomonas 종; Hydrogenobacter thermophiles, Hydrogenobacter halophilus, Hydrogenobacter hydrogenophilus 또는 다른 Hydrogenobacter 종; Hydrogenophilus islandicus 또는 다른 Hydrogenophilus 종; Hydrogenovibrio marinus 또는 다른 Hydrogenovibrio 종; Hydrogenothermus marinus 또는 다른 Hydrogenothermus 종; Helicobacter pylori 또는 다른 Helicobacter 종; Xanthobacter autotrophicus, Xanthobacter flavus 또는 다른 Xanthobacter 종; Hydrogenophaga flava, Hydrogenophaga palleronii, Hydrogenophaga pseudoflava 또는 다른 Hydrogenophaga 종; Bradyrhizobium japonicum 또는 다른 Bradyrhizobium 종; Ralstonia eutropha 또는 다른 Ralstonia 종; Alcaligenes eutrophus, Alcaligenes facilis, Alcaligenes hydrogenophilus, Alcaligenes latus, Alcaligenes paradoxus, Alcaligenes ruhlandii 또는 다른 Alcaligenes 종; Amycolata 종; Aquaspirillum autotrophicum 또는 다른 Aquaspirillum 종; Arthrobacter 균주 11/X, Arthrobacter methylotrophus 또는 다른 Arthrobacter 종; Azospirillum lipoferum 또는 다른 Azospirillum 종; Variovorax paradoxus 또는 다른 Variovorax 종; Acidovorax facilis 또는 다른 Acidovorax 종; Bacillus schlegelii, Bacillus tusciae 또는 다른 Bacillus 종; Calderobacterium hydrogenophilum 또는 다른 Calderobacterium 종; Derxia gummosa 또는 다른 Derxia 종; Flavobacterium autothermophilum 또는 다른 Flavobacterium 종; Microcyclus aquaticus 또는 다른 Microcyclus 종; Mycobacterium gordoniae 또는 다른 Mycobacterium 종; Paracoccus denitrificans 또는 다른 Paracoccus 종; Persephonella marina, Persephonella guaymasensis 또는 다른 Persephonella 종; Renobacter vacuolatum 또는 다른 Renobacter 종; Seliberia carboxydohydrogena 또는 다른 Seliberia 종, Streptomycetes coelicoflavus, Streptomycetes griseus, Streptomycetes xanthochromogenes, Streptomycetes thermocarboxydus 및 다른 Streptomycetes 종; Thermocrinis ruber 또는 다른 Thermocrinis 종; Wautersia 종; Anabaena oscillarioides, Anabaena spiroides, Anabaena cylindrica 또는 다른 Anabaena 종 및 Arthrospira platensis, Arthrospira maxima 또는 다른 Arthrospira 종을 포함하나 이에 한정되지 않는 남세균; Scenedesmus obliquus 또는 다른 Scenedesmus 종, Chlamydomonas reinhardii 또는 다른 Chlamydomonas 종, Ankistrodesmus 종 및 Rhaphidium polymorphium 또는 다른 Rhaphidium 종을 포함하나 이에 한정되지 않는 녹조류; 뿐만 아니라 산화수소 미생물을 포함하는 미생물 컨소시움.
일부 비제한적인 구현예에서, 화학독립영양성 미생물을 포함하는 조성물 및 이의 대사를 이용하는 방법으로서, 메탄 또는 아세트산 또는 부티르산과 같은 짧은 사슬 유기산의 공동생산 없이, 산화수소 반응을 포함하나 이에 제한되지 않는 무기 전자 공여체 및 전자 수용체를 사용하는 ATP의 생성을 위한 에너지 보존 반응에 의해, ATP를 소모하는 생합성 반응 및 세포 유지를 지원하기 위해 ATP를 생산하는, 조성물 및 방법이 제공된다.
전자 공여체 및/또는 탄소원 (예로, 카복시영양성 미생물)으로서 일산화탄소 상에서 성잘할 수 있는 다수의 상이한 미생물이 특성화되어 왔다. 일부 경우에, 카복시영양성 미생물은 또한 전자 공여체로 H2를 사용하고/거나 혼합영양성으로 성장할 수 있다. 일부 경우에, 카복시영양성 미생물은 조건부 화학독립영상성 미생물이다 [본원에 이의 전문이 참고문헌으로 통합되는 Biology of the Prokaryotes, edited by J Lengeler, G. Drews, H. Schlegel, John Wiley & Sons, Jul 10, 2009]. 일부 구현예에서, 미생물 또는 미생물을 포함하는 조성물은 다음의 카복시영양성 미생물 중 하나 이상을 포함한다: Acinetobacter 종; Alcaligenes carboxydus 또는 다른 Alcaligenes 종; Arthrobacter 종; Azomonas 종; Azotobacter 종; Bacillus schlegelii 또는 다른 Bacillus 종; Hydrogenophaga pseudoflava 또는 다른 Hydrogenophaga 종; Pseudomonas carboxydohydrogena, Pseudomonas carboxydovorans, Pseudomonas compransoris, Pseudomonas gazotropha, Pseudomonas thermocarboxydovorans 또는 다른 Pseudomonas 종; Rhizobium japonicum 또는 다른 Rhizobium 종; 및 Streptomyces G26, Streptomyces thermoautotrophicus 또는 다른 Streptomyces 종. 특정 구현예에서, 카복시영양성 미생물이 사용된다. 특정 구현예에서, 화학무기독립영양을 할 수 있는 카복시영양성 미생물이 사용된다. 특정 구현예에서, 호흡 및/또는 생합성에서 전자 공여체로서 H2를 이용할 수 있는 카복시영양성 미생물이 사용된다.
일부 구현예에서, 단일 전자 공여체, 수소 원자의 공급원 및 탄소원으로서 합성가스 상에서 성장할 수 있는 미생물이 제공된다.
일부 구현예에서, 미생물 및 미생물을 포함하는 조성물은 다음 중 하나 이상을 포함하는 절대 및/또는 조건부 화학독립영양성 미생물을 포함한다: Acetoanaerobium 종; Acetobacterium 종; Acetogenium 종; Achromobacter 종; Acidianus 종; Acinetobacter 종; Actinomadura 종; Aeromonas 종; Alcaligenes 종; Alcaliqenes 종; Aquaspirillum 종; Arcobacter 종; Aureobacterium 종; Bacillus 종; Beggiatoa 종; Butyribacterium 종; Carboxydothermus 종; Clostridium 종; Comamonas 종; Dehalobacter 종; Dehalococcoide 종; Dehalospirillum 종; Desulfobacterium 종; Desulfomonile 종; Desulfotomaculum 종; Desulfovibrio 종; Desulfurosarcina 종; Ectothiorhodospira 종; Enterobacter 종; Eubacterium 종; Ferroplasma 종; Halothibacillus 종; Hydrogenobacter 종; Hydrogenomonas 종; Leptospirillum 종; Metallosphaera 종; Methanobacterium 종; Methanobrevibacter 종; Methanococcus 종; Methanococcoides 종; Methanogenium 종; Methanolobus 종; Methanomicrobium 종; Methanoplanus 종; Methanosarcina 종; Methanospirillum 종; Methanothermus 종; Methanothrix 종; Micrococcus 종; Nitrobacter 종; Nitrobacteraceae 종, Nitrococcus 종, Nitrosococcus 종; Nitrospina 종, Nitrospira 종, Nitrosolobus 종; Nitrosomonas 종; Nitrosospira 종; Nitrosovibrio 종; Nitrospina 종; Oleomonas 종; Paracoccus 종; Peptostreptococcus 종; Planctomycetes 종; Pseudomonas 종; Ralstonia 종; Rhodobacter 종; Rhodococcus 종; Rhodocyclus 종; Rhodomicrobium 종; Rhodopseudomonas 종; Rhodospirillum 종; Shewanella 종; Siderococcus 종; Streptomyces 종; Sulfobacillus 종; Sulfolobus 종; Thermothrix 종, Thiobacillus 종; Thiomicrospira 종; Thioploca 종; Thiosphaera 종; Thiothrix 종; Thiovulum 종; 황 산화 미생물; 수소산화 미생물; 철 산화 미생물; 아세토겐; 및 메타노겐; 및 화학독립영양성 미생물을 포함하는 미생물 컨소시엄; 열수 배출구, 지열 배출구, 온천, 냉습수, 지하수층, 소금 호수, 식염수 형성, 광산, 산성 광산 배수, 광산 테일링, 유정, 정유 폐수; 석탄 이음새, 깊은 표면하; 폐수 및 하수 처리장; 지열 발전소, 설파타라 지역 및 토양 중 하나 이상에 고유한 화학독립영양성 미생물; 및 하나 이상의 호열성, 고열성, 호산성, 할로겐 친화성 및 한냉 미생물로부터 선택된 극한 친화성.
일부 구현예에서, 온도, 방사선, 압력, 중력, 진공, 건조, 염도, pH, 산소 장력 및 화학물질과 같은 다양한 환경 매개변수에서 극한을 견딜 수 있는 극한 친화성 생물인 미생물이 제공된다. 이들은 Pyrolobus fumarii 와 같은 고열성 생물; Synechococcus lividis와 같은 호열성 생물; Psychobacter와 같은 중온성 (mesophile) 및 한냉성 생물 및/또는 Thermoproteus 종, Pyrodictium 종, Sulfolobus 종 및 Acidianus 종와 같은 극도의 호열성 황-대사 미생물; Deinococcus radiodurans와 같은 방사선 내성 유기체; 친압성 (piezophile) 및 고압성 (barophile) 미생물과 같은 압력 내성 유기체; Artemia salina와 같은 건조 내성 (xerophile) 미생물를 포함한 건조제 내성 및 무수생존 미생물; 미생물 및 곰팡이; Halobacteriacea 및 Dunaliella salina와 같은 할로겐 친화성 생물을 포함한 염 내성유기체; Natronobacterium, Bacillus firmus OF4, Spirulina 종와 같은 호알칼리성 생물 및 Cyanidium caldarium 및 Ferroplasma 종과 같은 호산성 생물을 포함한 pH 내성 유기체; 순수한 CO2를 견디는 Cyanidium caldarium를 포함한 가스 내성 유기체; 및 Ferroplasma acidarmanus 및 Ralstonia 종과 같은 금속 내성 생물 (metalotolerant)을 포함한 금속 내성 유기체를 포함한다.
특정 구현예에서, 본원에서 제공된 미생물은 진핵 식물, 조류, 남세균, 녹색-황 세균, 녹색 비-황 세균, 남색 황 세균, 남색 비-황 세균, 극한 친화성 생물, 효모, 곰팡이, 프로테오박테리아, 이들의 조작된 유기체 및 합성 유기체로부터 선택된 세포주를 포함한다. 특정 구현예에서, 스피룰리나가 이용된다.
특정 구현예에서, Chloroflexus, Chloronema, Oscillochloris, Heliothrix, Herpetosiphon, Roseiflexus 및 Thermomicrobium 속을 포함하나 이에 한정되지 않는 녹색 비-황 세균이 이용된다.
특정 구현예에서, Chlorobium, Clathrochloris 및 Prosthecochloris 속을 포함하나 이에 한정되지 않는 녹색 황 세균이 사용된다.
특정 구현예에서, Allochromatium, Chromatium, Halochromatium, Isochromatium, Marichromatium, Rhodovulum, Thermochromatium, Thiocapsa, Thiorhodococcus 및 Thiocystis 속을 포함하나 이에 한정되지 않는 남색 황 세균이 사용된다.
특정 구현예에서, Chlorobium, Clathrochloris 및 Prosthecochloris 속을 포함하나 이에 한정되지 않는 남색 비-황 세균이 사용된다.
일부 구현예에서, 미생물은 메탄영양성 및/또는 메틸영양성 생물이다. 일부 구현예에서, 미생물은 Methylococcus 속이다. 일부 구현예에서, 미생물은 Methylococcus capsulatus이다. 일부 구현예에서, 미생물은 메틸영양성 생물이다. 일부 구현예에서, 미생물은 Methylobacterium 속이다. 일부 구현예에서, 미생물은 Methylobacterium zatmanii; Methylobacterium extorquens; Methylobacterium chloromethanicum 종 중 하나 이상으로부터 추출된다. 일부 구현예에서, 미생물이 수소-산화 화학독립영양성 생물 및/또는 카복시영양성 생물 및/또는 메틸영양성 생물및/또는 메탄영양성 생물인 조성물이 제공된다.
특정 구현예에서, 미생물은 자연 발생하는 및/또는 유전적으로 변형되지 않은 (비-GMO) 미생물이고/거나 비-병원성이고/거나 주변 환경에 존재하지 않는 생물공정에 의해 제공된 특이적 환경 조건에 의존한다.
특정 구현예에서, 미생물 또는 미생물의 컨소시엄은 환경 시료로부터 단리되고, 미생물학 분야에 공지된 방법을 사용하여, 수소, CO, 합성가스 및/또는 메탄을 포함하나 이에 한정되지 않는 표적화된 전자 공여체 및 산소, 질산염, 제이철 및/또는 CO2를 포함하나 이에 한정되지 않는 전자 수용체의 존재 시 및 환경 조건 (예로, 온도, pH, 압력, 용존 산소 (DO), 염분, 다양한 불순물 및 오염 물질의 존재 등)에서 성장을 통하여 바람직한 미생물로 농축된다.
일부 구현예에서, 미생물에 의한 생합성 및/또는 호흡에 사용된 전자 공여체는 다음의 환원제, 암모니아; 암모늄; 일산화탄소; 디티오나이트; 황 원소; 수소; 메타이아황산염; 질소 산화물; 아질산염; 소듐 티오설페이트 (Na2S2O3) 또는 칼슘 티오설페이트 (CaS2O3)를 포함하나 이에 한정되지 않은 티오설페이트와 같은 황산염; 황화수소와 같은 황화물; 아황산염; 티오네이트; 및 티오나이트 중 하나 이상을 포함하나 이에 한정되지는 않는다.
일부 구현예에서, 미생물은 ATP를, 이에 한정되지 않는 아세트산 및/또는 부티르산 (2 내지 4개 탄소의 탄소 사슬 길이를 포함하는 짧은 사슬 유기산)과 같은 메탄 또는 짧은 사슬 유기산의 합성이 없이 이에 한정되지 않는 H2 및/또는 CO와 같은 무기 전자 공여체로부터 생산할 수 있다. 일부 비제한적인 구현예에서, 미생물은 CO2가 아닌 전자 수용체로의 호흡에 결합되어, 이에 한정되지 않는 H2 및/또는 CO와 같은 무기 전자 공여체로부터 ATP를 생산한다. 이러한 특정 구현예에서, 전자 수용체는 호흡에 사용되는 전자 공여체와의 반응보다 음성인 깁스 자유 에너지를 갖는 점에서 CO2보다 강한 전자 수용체이다.
일부 구현예에서, 미생물은 합성가스 및/또는 가스성 CO2 및/또는 CO2 가스와 H2 가스의 혼합물 및/또는 CO 및/또는 CH4를 하나 이상의 유기 화합물로 전환할 수 있고, 여기서 미생물에 의해 생산된 유기 화합물의 10 중량% 미만은 메탄이다. 일부 구현예에서, 미생물은 합성가스 및/또는 가스성 CO2 및/또는 CO2 가스와 H2 가스의 혼합물 및/또는 CO 및/또는 CH4를 하나 이상의 유기 화합물로 전환할 수 있고, 여기서 생산된 유기 화합물의 10 중량% 미만은 아미노산을 제외한 4개 이하 탄소의 탄소 사슬 길이를 갖는 유리 유기산 (예로, 중합체 내에 포함되지 않음) 및/또는 유리 유기산의 염이다. 일부 구현예에서, 미생물은 합성가스 및/또는 가스성 CO2 및/또는 CO2 가스와 H2 가스의 혼합물 및/또는 CO 및/또는 CH4를 하나 이상의 유기 화합물로 전환할 수 있고, 여기서 생산된 유기 화합물의 10 중량% 미만은 다음의 아미노산, 알라닌; 트레오닌; 세린; 글리신; 아스파라긴; 아스파라긴산; 시스테인 중 하나 이상을 제외하고 4개 이하 탄소의 탄소 사슬 길이를 갖는 유리 유기산 (예로, 중합체 내에 포함되지 않음) 및/또는 유리 유기산의 염이다.
특정 구현예는 ATP 생산을 위한 에너지 보존 반응에서 이에 한정되는 것은 아니지만 O2와 같은 더욱 전기음성적 전자 수용체를 사용하는 수소산화 및/또는 CO-산화 및/또는 CH4 산화 미생물을 이용한다.
일부 구현예에서, 미생물은 유일한 전자 공여체 및 탄소원으로서 미처리된 조 글리세롤 및/또는 포도당 및/또는 메탄올 및/또는 아세테이트 상에서 성장할 수 있다. 일부 구현예에서, 미생물은 유기 탄소원 상에서 및 무기 전자 공여체 또는 탄소원을 사용하여 혼합영양성으로 성장할 수 있다.
특정 구현예에서, 본원에서 제공된 미생물은 진핵 식물, 조류, 남세균, 녹색-황 세균, 녹색 비-황 세균, 남색 황 세균, 남색 비-황 세균, 극한 친화성 생물, 효모, 곰팡이, 프로테오박테리아, 이들의 조작된 유기체 및 합성 유기체로부터 선택된 세포주를 포함한다.
본원에서의 미생물의 특정 비제한적인 구현예에서, 세포 호흡에 의해 유발되는 검출가능한 산 발생은 존재하지 않는다.
미생물 배양
본원에 기술된 미생물 세포를 성장시키는데 사용되는 액체 배양물은 당해 기술분야에 공지되고 사용되는 배양 용기에 수용될 수 있다. 일부 구현예에서, 생물반응기 용기에서 대규모 생산은 다량의 원하는 분자 및/또는 바이오매스를 생산하는데 사용될 수 있다.
특정 구현예에서, 생물반응기 용기는 배양 환경을 수용하고/거나, 분리하고/거나, 보호하는데 사용된다. 예를 들면, 배양 용기는 아미노산; 펩티드; 단백질; 이에 한정되지 않는 비타민 B1, B2 및 B12와 같은 비타민; 및/또는 다른 영양분 중 하나 이상을 포함하나 이에 한정되지 않는 유기 화합물의 생산을 위해, 일부 비제한적인 구현예에서 사용될 수 있다. 배양 용기는 대규모 미생물 배양의 기술분야에서의 당업자에게 공지된 것을 포함한다. 이러한 배양 용기는 에어리프트 반응기; 생물학적 스크루버 칼럼; 기포 컬럼; 교반 탱크 반응기; 연속 교반 탱크 반응기; 역류, 상향 유동, 확장된 베드 반응기; 다이제스터, 구체적으로는 하수 및 폐수 처리 또는 생물학적 정화의 선행 기술에 공지된 것과 같은 다이제스터 시스템; 트리클 필터, 회전식 생물 접촉기 필터, 회전 디스크, 토양 필터를 포함하나 이에 한정되지 않는 필터; 유동화 베드 반응기; 가스 리프트 발효기; 고정된 세포 반응기; 루프 반응기; 막 바이오필름 반응기; 파추카 (pachuca) 탱크; 충전-베드 반응기; 플러그-유동 반응기; 정적 믹서; 트리클 베드 반응기; 및/또는 수직 샤프트 생물반응기 중 하나 이상을 포함하나 이에 한정되지는 않는다.
유기 화합물, 구체적으로 아미노산, 펩티드, 단백질 및 기타 영양분의 상업적 생산을 목표로 하는 미생물 배양은 전형적으로 생물반응기에서 훨씬 더 큰 규모에서 수행된다 (예로, 생물반응기 부피 500 L, 1,000 L 5,000 L, 10,000 L, 50,000 L, 100,000 L, 1,000,000 L 이상).
특정 구현예에서, 화학독립영양성 및/또는 종속영양성 및/또는 카복시영양성 및/또는 메탄영양성 및/또는 메틸영양성 미생물은 본원에 기술된 방법을 사용하여 생물반응기 내부의 액체 배지에서 자란다.
일부 구현예에서, 미생물을 포함하는 생물반응기는 배양물을 유사 암소 또는 완전 암소에서 유지하는 불투명 재료로 제작된다. 철강 및/또는 다른 금속 합금 및/또는 강화 콘크리트 및/또는 유리 섬유 및/또는 다양한 고강도 플라스틱 재료와 같은 불투명 재료로 제작된 생물반응기는 대량의 작업 부피를 갖도록 설계될 수 있다. 일부 구현예에서, 부피 50,000 리터 이상을 갖는 철강 또는 다른 금속 합금으로 제작된 발효기가 이용된다. 일부 구현예에서, 대기압을 초과하는 양성 상부공간 압력을 포함할 수 있는 생물반응기가 이용된다. 일부 구현예에서, 부피 3,000,000 리터 이상의 계란형 또는 원통형 다이제스터 또는 수직 샤프트 생물반응기가 이용된다. 일부 구현예에서, 미생물을 포함하는 생물반응기는 이의 포함된 액체 부피의 일부 또는 대부분을 빛이 투과하도록 허용하지 않는다. 일부 비제한적인 구현예에서, CO2-고정 단계에 사용된 미생물은 광합성을 하지 않는다. 특정 비제한적인 구현예에서, 생물반응기 설계는 박막으로 배양물을 한정하거나, 일반적으로 광합성과 함께 필요한 모든 부분에 빛이 사용가능하도록 투명한 벽을 갖는다. 일부 구현예에서, 미생물은 빛에 유의한 또는 임의의 노출 없이 배양된다. 이러한 특정 구현예에서, 순수 CO2 소비는 화학독립영양성 대사 및 조건으로 인해 빛의 부재 시 여전히 일어난다. 특정 구현예에서, 인공광으로 전기로 변환하는 것은 CO2 포획 및 전환을 위한 생물학적 시스템에서 요구되지 않는다.
특정 구현예에서, 광 의존성의 결여는 연속적인 CO2 포획 작동을 임의의 인공 조명이 필요없이, 모든 기상 조건에서 밤낮으로 일년 내내를 용이하게 한다.
일부 구현예에서, 미생물은 이에 한정되지 않는 합성가스, 생산자 가스, 테일 가스, 열분해 가스 또는 H2 및 CO2 가스 혼합물와 같은 가스성 탄소원을 포함하는 배지에서 빛의 부재 시, 아미노산, 단백질 또는 다른 영양분 또는 전체 세포 산물의 생산을 위해 성장하고 유지되며, 여기서 이러한 성장은 화학독립영양성 성장으로 알려져 있다.
특정 구현예에서, 시스템 성능의 증가는 수평적 스케일링만이 아닌, 수직적 스케일링에 의해 충족된다. 이것은 CO2 포획을 위해 조류, 남세균, 또는 고등 식물을 이용하는 광영양성 접근법과는 대조적이다. 광합성 시스템을 위해 다양한 수직적 양식 설계가 제안되었지만, 실제적으로 및 경제적으로 말하자면, 광영양성 시스템은 조류의 경우 얕은 연못 또는 광생물반응기에서 수평적으로 확장되어야 한다. 이것은 지리적으로 큰 흔적 및 많은 부정적인 환경 영향을 초래한다.
인공 조명으로 자라는 조류 또는 고등 식물계는 비효율적 광 에너지의 활용 및 전기 에너지로 광 에너지의 비효율적인 변환으로 인해 어려움을 겪는다. 특정 구현예에서, 인공 조명 하에서 자라는 비슷한 조류 또는 고등 식물 배양물은 CO2 포획 및/또는 바이오매스 생산의 견지에서, 본원에 기술된 CO2 포획 및/또는 바이오매스 생산 시스템보다 더 많은 전력을 필요로 할 것이다. 특정 구현예에서, 인공 조명 하에서 자라는 비슷한 조류 또는 고등 식물 배양물은 CO2 포획 및/또는 바이오매스 생산 단위 당 전력의 견지에서, 본원에 기술된 CO2 포획 및/또는 바이오매스 생산 시스템보다 적어도 10배 더 많은 전력을 필요로 할 것이다. 인공 조명 상으로 자라는 조류 또는 고등 식물의 경우, 열 거부 요구량은 전기 입력에 거의 직접적으로 비례한다. 본원에 기술된 방법의 특정 구현예에서, 인공 조명 상에서 성장할 때 CO2 포획 및/또는 바이오매스 생산의 견지에서, 열 거부 요구량은 비슷한 조류 또는 고등 식물계보다 낮다. 특정 구현예에서, 인공 조명 상에서 성장할 때 CO2 포획 및/또는 바이오매스 생산의 견지에서, 열 거부 요구량은 비슷한 조류 또는 고등 식물계보다 적어도 10배 더 낮다.
예시적이지만 비제한적인 구현예에서, 영양분 배지를 포함하는 생물반응기는 생산 세포로 접종된다. 일반적으로, 세포가 배가를 시작하기 전에 지체기가 따라올 것이다. 지체기 이후에, 세포 배가 시간은 감소하고 배양물은 지수적 성장기로 진행된다. 지수적 성장기는 이론에 의해 제한되도록 의도하지는 않지만 질량 이동 한계, 질소 또는 미네랄 공급원을 포함한 영양분의 고갈 또는 억제성 화학물질 농도의 상승 또는 미생물에 의한 정족수 감지으로 인해 유도되는 것으로 생각되는 배가 시간의 증가로 이어진다. 성장 속도는 지연된 다음 배양이 정체기에 진입할 때 중단된다. 특정 구현예에서, 정체기를 선행하는 산술적 성장기가 존재한다. 세포 매스를 수확하기 위하여, 특정 구현예에서 배양물은 지수적 성장기 및/또는 산술적 성장기 및/또는 정체기에서 수확된다.
생물반응기 또는 발효기는 이들의 생리학적 주기의 다양한 단계를 거쳐 세포를 배양하는 데 사용된다. 생물반응기는 세포 성장 곡선의 특정한 단계에서 유지될 수 있는 세포의 배양에 이용된다. 생물반응기의 사용은 화학독립영양성 성장을 배양하는 많은 방식에서 유리하다. 특정 구현예에서, 단백질 또는 단백질 가수분해물을 생산하는데 사용되는 단백질이 풍부한 세포 매스는 액체 현탁액에서 고밀도로 성장한다. 일반적으로, 용존 이산화탄소, 산소 및 수소와 같은 다른 가스뿐만 아니라 다른 용존 영양분, 미량 원소, 온도 및 pH의 조절을 포함하는 성장 조건의 조절은 생물반응기에서 용이해진다. 특정 구현예에서, 아미노산, 펩티드, 단백질, 가수분해물, 추출물 또는 전체 세포 산물을 생산하는데 사용되는 단백질이 풍부한 세포 매스는 생물반응기 내의 액체 현탁액에서 고밀도로 성장하고/거나 고생산성으로 성장한다.
영양분 배지, 뿐만 아니라 가스는 배치 첨가로서 또는 주기적으로 또는 검출된 고갈 또는 프로그램된 설정 값에 반응하여 또는 배양물이 성장하고/거나 유지되는 기간에 걸쳐 연속적으로 생물반응기에 첨가될 수 있다. 특정 구현예에서, 접종 시 생물반응기는 성장 초기에 영양분 배지 및/또는 하나 이상의 가스의 시작 배치로 충전되며, 접종 이후에 추가적인 영양분 배지 및/또는 하나 이상의 가스는 전혀 첨가되지 않는다. 특정 구현예에서, 영양분 배지 및/또는 하나 이상의 가스는 접종 이후에 주기적으로 첨가된다. 특정 구현예에서, 영양분 배지 및/또는 하나 이상의 가스는 접종 이후에 영양분 및/또는 가스의 검출된 고갈에 반응하여 주기적으로 첨가된다. 특정 구현예에서, 영양분 배지 및/또는 하나 이상의 가스는 접종 이후에 연속적으로 첨가된다.
특정 구현예에서, 첨가된 영양분 배지는 임의의 유기 화합물을 포함하지 않는다.
특정 구현예에서, 소량의 미생물 세포 (예로, 접종물)은 설정된 부피의 배양 배지에 첨가되고; 다음으로 배양물은 배양되고; 세포 매스는 지체, 지수적, 감속 및 정체적 성장기를 거쳐 진행된다.
회분식 배양 시스템에서, 미생물이 배양되는 조건 (예로, 영양분 농도, pH 등)은 일반적으로 성장 기간 전체를 통하여 연속적으로 변화한다. 비제한적인 특정 구현예에서, 회분식 배양에 내재된 변동 조건을 회피하고 배양 시스템의 전반적인 생산성을 개선하기 위하여, 단백질 및/또는 비타민 및/또는 다른 영양분의 생산에 사용되는 미생물은 케모스탯 (chemostat)으로 불리는 연속적 배양 시스템에서 성장한다. 이러한 시스템에서, 배양물은 배양물의 부피 [V]를 일정하게 유지하면서 동시에 신선한 배지를 일정한 속도 [F]로 급식함으로써 영구적인 지수적 성장기에서 유지될 수 있다. 특정 구현예에서, 연속 배양 시스템은 세포가 거의 일정하게 유지되는 환경 조건 하에서 배양되는 것을 보장한다. 특정 구현예에서, 세포는 케모스탯 시스템의 사용을 통하여 영구적인 지수적 성장기로 유지된다. 이러한 경우 배양물의 희석 속도 (D)는 미생물의 성장 속도와 동등하고, D = F / V로 주어진다. 연속 배양에서 미생물의 성장 속도는 희석 속도를 변경함으로써 변화될 수 있다. 특정 구현예에서, 미생물의 성장 속도는 희석 속도를 변경함으로써 변화된다. 특정 비제한적인 구현예에서, 세포는 약 0.2 h-1의 희석 속도로 케모스탯에서 성장한다.
특정 구현예에서, 배양물의 생물반응기 내로의 접종은 또 다른 생물반응기에 서식하는 기존의 배양물로부터의 배양물의 이동 또는 배양기에서 상승된 종자 스톡액으로부터의 배양을 포함하나 이에 한정되지 않는 방법에 의해 수행된다. 특정 구현예에서, 균주의 종자 스톡은 분말, 액체, 냉동 또는 냉동건조된 형태뿐만 아니라 임의의 다른 적합한 형태를 포함하나 이에 한정되지 않는 형태로 운반되고, 저장될 수 있으며, 이는 당업자라면 바로 인식할 수 있다. 특정 비제한적인 구현예에서, 예비 세균 배양물은 재가동에 필요할 때까지 대사적으로 비활성인 냉동건조된 상태로 유지된다. 특정 구현예에서, 매우 큰 반응기에서 배양물을 확립 할 때, 배양물은 최종 규모의 용기에 접종하기 이전에 점차적으로 더 큰 중간 규모의 용기에서 성장하고 확립된다.
특정 구현예에서, 생물반응기는 회전식 교반 막대, 블레이드, 임펠러 또는 터빈; 회전, 충돌 또는 순환 용기; 가스 리프트; 살포; 재순환 도관을 통해 용기의 바닥부터 상단으로 배양액의 재순환, 루프 및/또는 정체 믹서를 통한 배양액의 유동 중 하나 이상을 포함하나 이에 한정되지 않는 영양분 배지의 혼합을 가능하게 하는 메커니즘을 갖는다. 배양 배지는 연속적으로 또는 간헐적으로 혼합될 수 있다.
특정 구현예에서, 미생물-함유 영양분 배지는 생물반응기로부터 부분적으로 또는 완벽하게, 주기적으로 또는 연속적으로 제거될 수 있고, 특정 구현예에서는 지수적 성장기에서 세포 배양물을 유지하도록 세포가 없는 신선한 배지로 교환되고/거나 성장 배지에서 고갈된 영양분을 보충하고/거나 억제성 폐기 산물을 제거한다.
생물반응기에서 표준인 포트는 미생물을 구획하는 생물반응기 용기 내로 및/또는 이로부터 가스, 액체, 고체 및/또는 슬러리를 전달하거나, 회수하는데 이용될 수 있다. 많은 생물반응기는 다양한 목적 (예로, 배지 첨가, 가스 첨가, pH 및 DO에 대한 탐침, 시료 채취용 포트)의 다수의 포트를 갖으며, 주어진 포트는 발효가 진행되는 동안 다양한 목적으로 사용될 수 있다. 예를 들면, 포트는 하나의 시점에서 생물반응기에 영양분 배지를 첨가하는 데 사용될 수 있으며, 또 다른 시점에는 시료 채취에 사용될 수 있다. 바람직하게, 시료화 포트의 다중 용도는 오염 또는 침입 종을 성장 환경에 도입하지 않고도 수행될 수 있다. 시료 유동 또는 연속적 시료 채취의 조절을 가능하게 하는 밸브 또는 다른 구동기가 시료화 포트에 제공될 수 있다. 특정 구현예에서, 생물반응기는 배양물 접종에 적합한 적어도 하나의 포트가 장착되어 있고, 배지 또는 가스의 첨가를 포함하는 다른 용도에 추가적으로 작용할 수 있다. 생물반응기 포트는 배양 환경 내에서 가스 조성 및 유속을 조절할 수 있다. 예를 들면, 포트는 가스가 펌핑되는 생물반응기 내로의 가스 유입구로서 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 생물반응기 내로 펌핑될 수 있는 가스는 합성가스, 생산자 가스, 열분해 가스, 수소 가스, CO, CO2, O2, 공기, 공기/CO2 혼합물, 천연 가스, 바이오가스, 메탄, 암모니아, 질소, 아르곤과 같은 비활성 가스, 뿐만 아니라 기타 가스 중 하나 이상을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 일부 구현예에서, 시스템 내로 펌핑된 CO2는 유기물의 가스화로부터의 CO2; 생석회, CaO를 생산하는 석회석, CaCO3의 하소화로부터의 CO2; 암모니아, 메탄올 또는 수소 생산으로부터의 CO2 부산물과 같은 메탄 수증기 개질로부터의 CO2; 연소, 소각 또는 발염로부터의 CO2; 당의 혐기성 또는 호기성 발효의 CO2 부산물; 메탄영양성 생물공정의 CO2 부산물; 폐수 처리로부터의 CO2; 인산나트륨 생산로부터의 CO2 부산물; 지질학적으로 또는 지열로 생산되거나 배출된 CO2; 산 가스 또는 천연 가스로부터 제거된 CO2를 포함하나 이에 한정되지 않는 공급원으로부터 나올 수 있다. 일부 비제한적인 구현예에서, CO2는 산업 배출 가스로부터 제거되거나, 달리 자연적으로 대기로 방출할 수 있는 지질학적 출처로부터 포획되어 왔다. 특정 구현예에서, 탄소원은 해수 또는 지표수 또는 지하수의 다른 물체에 용해된 CO2 및/또는 중탄산 나트륨 및/또는 탄산염이다. 이러한 특정 구현예에서, 무기 탄소는 액상 물에 용해되어 및/또는 고체로서 생물반응기에 도입될 수 있다. 특정 구현예에서, 탄소원은 대기로부터 포획된 CO2이다. 일부 비제한적인 구현예에서, CO2는 이에 제한되지 않지만 CO2 제거 어셈블리 (CDRA)와 같은 장치를 사용하여 폐쇄 루프 생명 유지 시스템의 일부로서 폐쇄된 캐빈으로부터 포획되었고, 이는 예를 들면 국제 우주 정거장 (ISS) 상에서 이용된다.
특정 비제한적인 구현예에서, 이에 제한되지는 않지만 고농도의 에너지원 (예로, H2, H2S, CO 가스) 및/또는 탄소원 (예로, CO2, HCO3 -, CO3 2-) 및/또는 다른 용해된 미네랄을 방출하는 지열 및/또는 열수 배출구와 같은 지질학적 특징은 본원에서 미생물을 위한 영양분 공급원으로서 이용될 수 있다.
특정 구현예에서, 대안의 탄소원으로서 이산화탄소에 추가하여 또는 이산화탄소 대신에 하나 이상의 가스가 용액에 용해되어 배양액에 공급되고/되거나 배양액에 직접적으로 용해되고, 이는 가스성 전자 공여체 및/또는 탄소원 (예로, 수소 및/또는 CO 및/또는 메탄 가스)를 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 특정 구현예에서, 유입 가스는 이에 한정되지 않는 합성가스 (예로, 탄화수소)의 다른 가스 성분 및 불순물; 암모니아; 황화수소; 및/또는 다른 신 가스; 및/또는 O2; 및/또는 미네랄 포함 미립자 및 회분과 같은 다른 전자 공여체 및/또는 전자 수용체 및/또는 탄소원 및/또는 미네랄 영양분을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 하나 이상의 가스는 이에 한정되지 않는 수소, 일산화탄소, 메탄, 황화수소 또는 신 가스 중 하나 이상과 같은 가스성 전자 공여체; 이에 한정되지 않지만 CO2, CO, CH4 중 하나 이상과 같은 가스성 탄소원; 및 공기 (예로, 20.9% 산소) 내에 또는 순수한 O2로서 또는 O2가 풍부한 가스로서, 산소와 같은 전자 수용체를 포함하나 이에 한정되지 않으며, 배양액에 용해된다. 일부 구현예에서, 이들 및 다른 가스의 용액 내의 용해는 발효 공학의 기술분야에서 당업자에게 공지 된 압축기, 유량계 및 유동 밸브의 시스템을 사용하여 달성되며, 이 시스템은 가스를 용액 내에 분산하기 위한 다음의 널리 사용되는 시스템, 살포 장비; 돔형, 관형, 디스크형 또는 도넛형 기하학 구조를 포함하나 이에 한정되지 않는 디퓨저; 거칠거나 미세한 기포 통풍기; 벤츄리 장비 중 하나 이상에 급식한다. 특정 구현예에서, 표면 통기 및/또는 가스 매스 전달은 또한 패들 통풍기 등을 사용하여 수행될 수 있다. 특정 구현예에서, 가스 용해는 기포 크기를 감소시키기 위한 수력 전단 장치뿐만 아니라 임펠러 또는 터빈과의 기계적 혼합에 의해 증진된다. 특정 구현예에서, 가스를 흡수하는 미생물을 보유하는 반응기 시스템을 통과한 이후에, 잔류 가스는 생물반응기로 다시 재순환되거나, 공정 열을 위해 연소되거나, 발염되거나, 지하로 주입되거나, 대기 내로 방출될 수 있다. 본원에서 H2를 전자 공여체로서 이용하는 특정 구현예에서, H2는 배양 배지를 통한 버블링에 의해 또는 액체 배양 배지와 접촉하는 당해 기술분야에 공지된 수소 투과성-물 불투과성 막을 통하여 확산시킴으로써 배양 용기에 급식될 수 있다.
특정 구현예에서, 미생물은 미세호기성 조건 하에 H2 및 CO2 및 다른 용해된 영양분 상에서 자라고 증식한다. 특정 구현예에서, 일산화탄소, 메탄, 메탄올, 포름산 염 또는 포름산을 포함하나 이에 한정되지 않는 C1 탄소원 및/또는 다양한 기화된, 열분해된 또는 수증기 개질된 고정된 탄소 급식 원료로부터 생성된 다양한 합성가스 조성물을 포함하나 이에 한정되지 않는 C1 화학물질을 포함하는 혼합물은 다음의 조건, 호기성, 미세호기성, 무산소성, 혐기성 및/또는 조건부 조건 중 하나 이상 하에서 더 긴 사슬 유기 화학물질 (예로, C2 이상의 길이, 일부 구현예에서 C5 이상 길이의 탄소 사슬 분자)로 생화학적으로 전환된다.
일부 구현예의 배양액에서 조절된 양의 산소는 또한 유지될 수 있고, 특정 구현예에서 산소는 배양액에 급식된 용액에 활발하게 용해되고/거나 배양액에 직접적으로 용해될 것이다. 목표로 하는 DO 수준을 유지하도록 배양액에 공기 또는 산소의 펌핑을 요구하는 특정 호기성 또는 미세호기성 구현예에서, 산소 기포는 혼합 및 산소 전달을 위한 최적 직경으로 배양액 내에 주입될 수 있다.
일부 구현예에서, 미생물은 합성가스, 생산자 가스, 열분해 가스, 바이오가스, 테일 가스, 배출 가스, CO, CO2, H2, 천연 가스, 메탄 및 이들의 혼합물을 포함하나 이에 한정되지 않는 연료 가스를 전환시킨다. 일부 구현예에서, 연료 가스의 열 함량은 표준 입방 피트 (scf) 당 적어도 100 BTU이다. 일부 구현예에서, 미생물을 수용하고 성장시키는데 사용되는 생물반응기는 가스 전달을 위한 미세기포 디퓨저 및/또는 고-전단 임펠러가 장착된다.
생물반응기 내로 가스의 도입 및/또는 가스 유속 상승은 가스 유입구가 액체 배지의 표면 아래에 위치하여 가스가 버블링되거나 배지를 통하여 살포되면 배양물의 혼합을 증진하고 난류를 발생시킬 수 있다. 특정 구현예에서, 혼합은 가스 기포 및/또는 살포 및/또는 액체 배지를 통한 가스 플러깅에 의해 제공되는 난류를 통하여 증진된다. 일부 구현예에서, 생물반응기는 가스 배출 및 압력 방출을 위한 가스 유출 포트를 포함한다. 일부 구현예에서, 가스 유입구 및 유출구는 바람직하게 가스 역류를 방지하도록 체크 밸브를 장착한다.
생물반응기 내에서 화학합성 반응이 일어나는 특정 구현예에서, 하나 이상의 유형의 전자 공여체 및 하나 이상의 유형의 전자 수용체가 펌핑되거나, 달리 볼루스 첨가로서 또는 주기적으로 또는 연속적으로 반응 용기에서 화학독립영양성 생물을 포함하는 영양분 배지에 첨가된다. 세포 호흡에서 전자 공여자부터 전자 수용체로 전자의 이동에 의해 구동되는 화학합성 반응은 무기 이산화탄소 및/또는 다른 용해된 탄산염 및/또는 다른 탄소 산화물을 유기 화합물 및 바이오매스 내에 고정시킨다.
특정 구현예에서, 적합한 미네랄, 염, 비타민, 보조인자, 완충액 및 미생물 성장에 필요한 다른 성분을 포함하는 수용액을 포함하는 배양물 성장 및 생산을 위한 영양분 배지가 사용된다 [Bailey and Ollis, Biochemical Engineering Fundamentals, 2nd ed; pp 383-384 and 620-622; McGraw-Hill: New York (1986)].
특정 구현예에서, 당해 기술분야에 공지된 바와 같은 미생물 배양물의 유지 및 성장에 사용되는 화학물질은 영양분 배지에 포함된다. 특정 구현예에서, 이들 화학물질은 이에 한정되지 않은 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 암모니아, 암모늄 (예로, 염화암모늄 (NH4Cl), 황산암모늄 ((NH4)2SO4)), 질산염 (예로, 질산 칼륨 (KNO3)), 우레아 또는 유기 질소와 같은 질소원; 인산염 (예로, 인산이나트륨 (Na2HPO4), 인산칼륨 (KH2PO4), 인산 (H3PO4), 디티오포스페이트 칼륨 (K3PS2O2), 오르토포스페이트 칼륨 (K3PO4), 인산 이칼륨 (K2HPO4)); 황산염; 효모 추출물; 철 킬레이트; 칼륨 (예로, 인산칼륨 (KH2PO4), 질산칼륨 (KNO3), 요오드칼륨 (KI), 브롬칼륨 (KBr)); 및 기타 무기염, 미네랄 및 미량 영양분 (예로, 염화나트륨 (NaCl), 황산마그네슘 (MgSO4 7H2O) 또는 염화마그네슘 (MgCl2), 염화칼슘 (CaCl2) 또는 탄산 칼슘 (CaCO3), 황산망간 (MnSO4 7H2O) 또는 염화망간 (MnCl2), 염화철 (FeCl3), 황산제이철 (FeSO4 7H2O) 또는 염화제이철 (FeCl.sub.2 4H.sub.2O), 이탄산나트륨 (NaHCO3) 또는 탄산나트륨 (Na2CO3), 황산아연 (ZnSO4) 또는 염화아연 (ZnCl2), 암모늄 몰리브데이트 (NH4MoO4) 또는 소듐 몰리브데이트 (Na2MoO4 2H2O), 황산구리 (CuSO4) 또는 염화구리 (CuCl2 2H2O), 염화 코발트 (CoCl2 6H2O), 염화알루미늄 (AlCl3.6H2O), 염화리튬 (LiCl), 붕산 (H3BO3), 염화니켈 (NiCl2 6H2O), 염화주석 (SnCl2 H2O), 염화바륨 (BaCl2 2H2O), 구리 설레네이트 (CuSeO4 5H2O) 또는 아셀렌산 나트륨 (Na2SeO3), 소듐 메타바나데이트 (NaVO3), 크롬 염. 특정 구현예에서, 쉬레겔 등에 의해 제형화된 미네랄 염 배지 (MSM) ["Thermophilic bacteria", Jakob Kristjansson, Chapter 5, Section III, CRC Press, (1992)]가 사용될 수 있다.
본원에 기술된 관점은 미생물 (예로, 세균 세포)의 성장 및/또는 이로의 생체산물의 발현에 관한 것이다. 본원에 기술된 미생물 (예로, 세균 세포)은 일부 구현예에서 발효 배지를 포함하는 임의의 유형 (농축 또는 최소) 및 임의의 조성의 배지에서 배양될 수 있다. 당업자라면 이해할 수 있는 바와 같이, 일상적인 최적화는 다양한 유형의 배지의 사용을 허용할 것이다. 선택된 배지는 다양한 추가적인 성분이 보충될 수 있다. 보충 성분의 일부 비제한적인 예는 포도당, 항생제, 유전자 유도를 위한 IPTG 및 ATCC 미량 미네랄 보충물을 포함한다. 유사하게, 본원에 기술된 미생물의 배지 및 배양 조건의 다른 관점은 일상적인 실험을 통하여 최적화될 수 있다. 예를 들면, pH 및 온도는 최적화될 수 있는 요인의 비제한적인 예이다. 일부 구현예에서, 배지의 선택, 배지 보충물 및 온도와 같은 요인은 원하는 분자의 생산 수준에 영향을 줄 수 있다. 일부 구현예에서, 보충 성분의 농도 및 양은 최적화될 수 있다. 일부 구현예에서, 배지가 하나 이상의 보충 성분으로 보충되는 빈도 및 배지가 원하는 분자를 수확하기 이전에 배양되는 시간이 최적화된다.
특정 구현예에서, 공정에 진입하는 미처리 폐기물 급식 원료에 존재하는 모든 병원성 미생물은 가스화 및/또는 열분해 및/또는 소각 단계 또는 하나 이상의 C1 포획 및 생물전환 단계를 유도하는 단계를 통하여 살균된다.
특정 구현예에서, 영양분 화학물질 (예로, 전자 공여체, 전자 수용체, 탄소원 및/또는 다양한 미네랄 영양분)의 농도는 생물반응기 내에서 최적의 탄소 흡수 및/또는 고정 및/또는 전환 및/또는 유기 화합물의 생산을 위한 이들 각각의 최적의 수준으로 또는 이와 가깝게 유지되고, 이는 이용된 미생물에 의존하여 달라지지만 미생물 배양의 기술분야의 당업자에게 부당한 실험 없이도 알려져 있거나 결정가능하다.
특정 구현예에서, 다음의 매개변수, 폐기 산물 수준; pH; 온도; 염도; 용존 산소; 용존 이산화탄소 가스; 액체 유속; 교반 속도; 가스 압력 중 하나 이상이 생물반응기에서 모니터링되고/거나 조절된다. 특정 구현예에서, 화학독립영양성 성장에 영향을 미치는 작동 매개변수는 센서 (예로, 용존 산소 탐침 또는 전자 공여체/수용체 농도를 측정하기 위한 산화-환원 탐침)로 모니터링되고/거나 센서로부터의 피드백에 기초하여 수동으로 또는 자동으로 밸브, 펌프 및 교반기를 작동하는 것을 포함하나 이에 한정되지 않는 장비의 사용을 통하여 조절된다. 특정 구현예에서, 도입되는 배양액뿐만 아니라 도입되는 가스의 온도는 이에 한정되지는 않지만 냉각기, 히터 및/또는 열 교환기와 같은 시스템에 의해 조절된다.
특정 구현예에서, 미생물 배양물 및 생물반응기는 세포 집단 및 환경 매개변수 (예로, 세포 밀도, pH, DO, 화학적 농도)가 시간 경과 시 일정한 수준으로 맞추어진 안정 상태에서 영양분 배지 및/또는 바이오매스의 연속적인 유입 및 제거를 사용하여 유지된다. 특정 구현예에서, 일정한 수준은 급식 원료 전환 및/또는 목표로 한 유기 화합물의 생산을 위한 최적의 수준이다. 특정 구현예에서, 세포 밀도는 직접적인 시료 채취, 세포 밀도에 대한 광학 밀도의 상관성에 의해 및/또는 입자 크기 분석기로 모니터링될 수 있다. 특정 구현예에서, 수경 및 바이오매스 보유 시간은 배양액 화학 및 세포 밀도 둘 다의 독립적인 조절을 허용하도록 분리될 수 있다. 특정 구현예에서, 희석 속도는 수경 보유 시간이 바이오매스 보유 시간과 비교하여 상대적으로 낮아서 세포 성장 및/또는 급식 원료 전환 및/또는 유기 화합물의 생산을 위한 고도로 보충된 배양액을 유도하기에 충분히 높게 유지될 수 있다. 특정 구현예에서, 희석 속도는 배양액 및 영양분 보충 및/또는 폐기 산물 제거 그리고 펌핑, 투입 증가 및 희석 속도에 따라 증가하는 요구로 인한 공정 비용 증가 사이의 최적의 기술경제적 트레이드오프 (trade-off)에서 설정된다.
특정 구현예에서, 미생물 배양물의 pH는 조절된다. 특정 구현예에서, pH는 미생물 유지 및/또는 성장 및/또는 급식 원료의 전환 및/또는 유기 화합물의 생산 및/또는 생존을 위한 최적 범위 내에서 조절된다. pH의 감소를 다루기 위해, 특정 구현예에서 중화 단계는 생물반응기 환경에서 직접적으로 수행되거나, 재순환 루프를 통하여 배양 용기 내로 배지를 재순환시키는 단계 이전에 수행될 수 있다. 특정 구현예의 배양액에서의 산 중화는 석회석, 석회, 수산화나트륨, 암모니아, 수산화암모늄, 가성 칼륨, 산화마그네슘, 산화철, 알칼리성 회분 중 하나 이상을 포함하나 이에 한정되지 않는 염기의 첨가에 의해 달성될 수 있다.
특정 구현예에서, 화학독립영양성 미생물의 수용성 현탁액은 하나 이상의 전자 공여체 및 CO2를 원형질로 전환시킨다. 특정 구현예에서, 수소-산화 미생물의 수용성 현탁액은 수소 및 이산화탄소를 미생물 원형질로 전환하는데 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 일산화탄소-산화 미생물의 수용성 현탁액은 일산화탄소 및 수소 및/또는 물을 원형질로 전환하는데 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 메탄-산화 미생물의 수용성 현탁액은 메탄을 원형질로 전환하는데 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 현탁액에서의 미생물은 세균 또는 아르케온이다. 일부 비제한적인 구현예에서, H2 산화 화학독립영양성 미생물의 수용성 현탁액 또는 바이오필름은 일부 다른 용존 미네랄 영양분과 함께 H2 및 CO2를 생화학물질 및 원형질로 전환한다. 특정 구현예에서, 다른 용존 미네랄 영양분은 질소원, 인 공급원 및 칼륨원을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 특정 구현예에서, 생산된 원형질체는 인간 및/또는 다른 동물 및/또는 다른 종속영양성 생물에게 식품의 가치가 있다. 특정 구현예에서, 특정 생화학물질은 영양분 가치 및/또는 다양한 유기 화학 또는 연료 응용에서 가치를 갖는 원형질 및/또는 세포외 배양액으로부터 추출될 수 있다. 특정 구현예에서, 이러한 원형질의 생산을 유도하는 세포내 에너지는 전자 수용체에 의한 전자 공여체의 산화로부터 유래된다. 일부 비제한적인 구현예에서, 전자 공여체는 H2; CO; CH4 중 하나 이상을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 일부 비제한적인 구현예에서, 전자 수용체는 O2 및/또는 CO2을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 특정 비제한적인 구현예에서, 에너지 생성 반응 또는 호흡의 산물은 물을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 특정 구현예에서, 이러한 CO2로부터의 생화학물질 및 원형질의 합성을 유도하는데 사용된 호흡으로부터 유래된 세포내 에너지는 ATP를 포함하나 이에 한정되지 않는 생화학 분자에서 저장되고 운반된다. 본원의 특정 구현예에서 사용된 크놀가스 미생물의 경우, 전자 수용체는 O2 고 호흡 산물은 물이다.
일부 구현예에서, 단백질 상산 및 생산된 아미노산 분자의 분포는 생물반응기 조건의 조절, 영양분 수준의 조절 및/또는 세포의 유전적 변형 중 하나 이상을 통하여 최적화된다. 특정 구현예에서, 아미노산 또는 단백질 또는 다른 영양분 또는 전체 세포 산물에 대한 경로는 특이적 성장 조건 (예로, 질소, 산소, 인, 황, 무기 이온과 같은 미량 미세영양분, 존재하는 경우 일반적으로 영양분 또는 에너지원으로 고려되지 않을 임의의 조절 분자)을 유지함으로써 화학적 산물의 생산을 위해 조절되고 최적화된다. 특정 구현예에서, 용존 산소 (DO)는 미생물의 요구사항에 의존하여 호기성, 미세호기성, 무산소성, 혐기성 또는 조건부 조건에서 배양액을 유지함으로써 최적화될 수 있다. 조건부 환경은 물 컬럼의 층상화에 의해 유발된 호기성 상부층 및 혐기성 하부층을 갖는 환경으로 간주된다. 본원에 개시된 미생물에 의한 아미노산 또는 단백질 또는 다른 영양분 또는 전체 세포 산물의 생합성은, 탄소원 및 에너지원 및 다른 영양분 공급원의 충분한 공급이 제공되면, 지수적 성장기 동안 또는 이후에 세포 배가가 정지된 정체기 동안 발생할 수 있다.
본원에 기술된 생물반응기, 배양 조건, 종속영양성 및 화학영양성 성장, 유지 및 아미노산 또는 단백질 또는 다른 영양분 또는 전체 세포 산물 생산 방법의 특정한 예는 임의의 적합한 방식으로 미생물 성장 및 아미노산 또는 단백질 또는 다른 영양분 또는 전체 세포 생산의 효율을 개선하도록 조합될 수 있다.
전자 공여체 및 수용체
특정 비제한적인 구현예에서, CO2의 생합성적 환원은 물의 전기분해에 의해 생성되는 O2 전자 수용체 및/또는 H2 전자 공여체를 이용한다. 특정 비한정적인 구현예에서, 물의 전기분해에 의해 생성된 O2의 일부 및 H2의 전부는 본원에 기술된 바와 같은 미생물의 수용성 현탁액으로 급식된다. 일부 비제한적인 구현예에서, CO2 몰에 대한 미생물의 수용성 현탁액에 급식된 H2 몰비가 2 : 1 이상이다. O2 전자 수용체와 H2 전자 공여체는 물의 전기분해에 의해 생성되는 특정 비제한적인 구현예에서, 본원에 기술된 미생물의 H2 및 O2에 대한 대사적 요구사항이 모두 충족되고 난 이후에 잔류하는 O2 잉여분이 존재한다. 이러한 특정 구현예에서, 잉여 O2는 인간 및/또는 다른 호기성 생명체 및/또는 뿌리 통기를 위한 수경 재배 시스템에 공급될 수 있고/거나, 가스화 또는 부분적 산화 또는 연소 공정에 사용되고/거나, 화학적 부산물로서 저장되고 판매된다.
전자 공여체로서 수소 분자를 이용하는 특정 구현예에서, 재생가능한 및/또는 CO2 배출 없는 에너지 유입을 사용하여 수소 분자의 생성에서 형성된 화학적 부산물이 존재할 수 있다. 특정 구현예에서, 호흡에 사용된 산화수소 반응은 효소적으로 산화적 인산화에 연결된다. 특정 구현예에서, 이와 같이 형성된 ATP 및/또는 다른 세포내 에너지 운반체는 아미노산 및/또는 단백질의 동화적 합성에 이용된다. 특정 구현예에서, 크놀가스 미생물에 의한 탄소 고정 및 유기 화합물 생산을 위한 최적의 조건을 유지하기 위해 호흡에 필요한 이상으로 수분 분해에 의해 생산된 산소는 상업적 산소 가스 생산의 기술 및 과학 분야에서 알려진 공정 단계를 통하여 판매에 적합한 형태로 가공될 수 있다.
C4보다 더 긴 탄소 사슬 길이를 갖는 유기 분자의 생산은 생물학적으로 지방산 생합성과 같은 동화적 생합성 경로 및 다양한 아미노산 생합성 경로를 통하여 가장 공통적으로 및 효율적으로 달성된다 [C. R. Fischer, D. Klein-Marcuschamer, and G. Stephanopoulos (2008) "Selection and optimization of microbial hosts for biofuels production" Metabolic Engineering 10(6): 295-304 (http://dx.doi.org/10.1016/j.ymben.2008.06.009)]. 특정 구현예는 ATP 생산을 위한 에너지 보존 반응 (예로, 호흡)에서 CO2보다 전기음성인 이에 한정되지는 않지만 O2와 같은 전자 수용체를 사용하는 수소 산화 및/또는 CO-산화 및/또는 CH4 산화 미생물을 적용한다. 예를 들어, 산화수소 반응, 2H2 + O2 -> 2H2O를 ATP 생성에 연결하는 수소영양성 산화수소 또는 크놀가스 미생물은 아세토겐 또는 호흡에서 전자 수용체로서 CO2를 사용하는 메타노겐보다 H2 및/또는 호흡에 소비되는 다른 전자 공여체 당 더 많은 ATP를 생산할 수 있다. 예를 들면, 크놀가스 미생물은 호흡으로 소모된 H2 당 적어도 두 개의 ATP를 생산할 수 있고 [본원에 이의 전문이 참고문헌으로 통합되는, L. Bongers (1970) "Energy generation and utilization in hydrogen bacteria" Journal of bacteriology 104(1): 145-151 (http://jb.asm.org/content/104/1/145.abstract)], 이는 호흡에서 전자 공여체로서 H2 및 전자 수용체로서 CO2를 사용하여, 메탄생성 기전 또는 아세트생성 기전을 거치는 미생물에서 생산될 수 있는 것보다 호흡으로 소모된 H2 당 8배 더 많은 ATP이다. 이러한 이유로, 합성가스 또는 H2로부터의 아미노산 또는 단백질 또는 지방산 생합성 (이에 한정되는 것은 아님)과 같은 동화적 생합성을 위해, 이에 한정되지 않지만 크놀가스 미생물과 같은 호흡 및 ATP 생산에서 더욱 전기음성적인 전자 수용체를 사용할 수 있는 미생물을 사용하는 것은 짧은 사슬 산 또는 알코올 (예로, 아세트산 또는 에탄올)의 생산을 위해 생물학적 GTC 기술학에서 현재 사용되는 것과 같은 아세토겐 또는 메타노젠을 사용하는 것보다 더 효율적일 수 있다. 특정 구현예에서, 호흡에 사용된 산화수소 반응은 효소적으로 산화적 인산화에 연결된다. 특정 구현예에서, 호기성 호흡은 ATP 생산을 위해 본원에 기술된 미생물 세포에 의해 이용된다. 특정 구현예에서, 이와 같이 형성된 ATP 및/또는 다른 세포내 에너지 운반체는 아미노산 및/또는 단백질의 동화적 생합성에 이용된다. 일부 구현예에서, 크놀가스 및/또는 카복시영양성 및/또는 메탄영양성 및/또는 종속영양성 미생물 또는 이들 미생물을 포함하는 조성물이 이용되고, 여기서 미생물은 합성가스 또는 생산자 가스 또는 천연 가스 또는 바이오가스 또는 재생가능한 H2 또는 CO 또는 메탄을 포함한 가스와 조합된 폐기물 CO2를 포함하나 이에 한정되지 않는 탄소-함유 가스 급식 원료로부터 화학물질, 단량체, 중합체, 단백질, 다당류, 비타민, 영양제, 항생제 또는 이들의 약제학약 산물 또는 중간체를 포함하나 이에 한정되지 않는 유용한 관심있는 탄소 기반의 산물의 생합성을 가능하게 하는 하나 이상의 효소를 발현한다. 일부 구현예에서, 이들 관심있는 탄소 기반의 산물은 이에 한정되지 않지만 포도당, 과당 및 다른 당과 같은 유기 다중-탄소 급식 원료로부터 종속영양적으로 생합성될 수 있다. 일부 비제한적인 구현예에서, 미생물 또는 미생물을 포함하는 조성물이 이용되고, 여기서 미생물은 호흡을 통해 하나의 ATP를 생성하도록 4H2 또는 NADH 미만을 필요로 한다. 다른 비제한적인 구현예에서, 미생물 또는 미생물을 포함하는 조성물이 이용되고, 여기서 미생물은 호흡을 통해 소모된 H2 또는 NADH 당 하나 이상의 ATP를 생산한다. 다른 비제한적인 구현예에서, 미생물 또는 미생물을 포함하는 조성물이 이용되고, 여기서 미생물은 호흡을 통해 소모된 H2 또는 NADH 당 적어도 두 개의 ATP 또는 호흡을 통해 소모된 H2 또는 NADH 당 적어도 2.5개의 ATP를 생산한다.
특정 비제한적인 구현예의 추가적인 특징은 이산화탄소 및/또는 다른 C1 급식 원료를 유기 화합물로 고정하도록 화학독립영양성 미생물에 의해 사용된 전자 공여체의 공급원, 생산 또는 재순환을 고려한다. 특정 구현예에서, 이산화탄소 포획 및 탄소 고정에 사용되는 전자 공여체는 광전지, 태양열, 풍력 발전, 수력, 원자력, 지열, 증진된 지열, 해저열, 해양 파력, 조력 발전을 포함하나 이에 한정되지 않는 다수의 상이한 재생가능한 및/또는 저탄소 배출 에너지 기술학으로부터의 전력을 사용하여 전기화학적으로 또는 열화학적으로 생산되거나, 재순환될 수 있다. 화학독립영양성 생물이 자랄 수 있는 많은 환원된 무기 화학물질 (예로, H2, CO, H2S, 제이철, 암모늄, Mn2+)은 광전지, 태양열, 풍력 발전, 수력, 원자력, 지열, 증진된 지열, 해저열, 해양 파력 또는 조력 발전을 포함하나 이에 한정되지 않은 다양한 이산화탄소 배출 없는 또는 저탄소 배출 및/또는 재생가능한 전력원에 의해 강화될 수 있는 당해 기술 및 과학 분야에서 잘 알려진 전기화학적 및/또는 열화학 공정을 사용하여 바로 생산될 수 있다.
재생가능한 에너지원으로부터 수소의 생산은 점차적으로 화석 원료 시스템의 세대를 교체하고 있으며, 에너지 부문의 기술적 진보는 가까운 장래에 녹색 수소 생산의 가격을 낮출 것으로 기대된다. 예를 들면, 상업 및 산업 등급 전해제에 의해 최대 73%의 전기 에너지 효율을 달성되고, 신소재 및 전해제 입체구조에 관한 연구는 96%의 높은 효율을 나타내었다. 특정 구현예는 시판되는 전기분해 기술학을 H2 전자 공여체 및/또는 O2 전자 수용체의 생성을 위해 70% 이상의 전기 에너지 효율로 이용한다. 특정 구현예는 73% 이상의 에너지 효율 및/또는 최대 96%의 에너지 효율을 갖는 전기분해 기술을 사용한다.
전자 공여체로서 수소 분자를 사용하는 특정 구현예에서, H2는, 양성자 교환막 (PEM), KOH와 같은 액체 전해질을 사용한 접근법, 알칼리 전기분해, 고체 중합체 전해질 전기분해, 고압 전기분해, 증기의 고온 전기분해 (HTES)를 포함하나 이에 한정되지 않는 물의 전기분해를 통하여; 산화철 순환, 세륨 (IV) 산화물-산화 세륨 (III) 산화물 순환, 아연-아연 산화물 순환, 황-요오드 순환, 구리-염소 순환, 칼슘-브롬-철 순환, 융합 황 순환을 포함하나 이에 한정되지 않는 방법을 통한 물의 열화학적 분해; 및/또는 황화수소의 전기분해; 및/또는 황화수소의 열화학적 분해를 통하여; 및/또는 탄소 포획 및 격리 (CCS) 가능한 메탄 개질; CCS 가능한 석탄 가스화; 배너 (Kvζrner) 공정 및 카본 블랙 산물을 생성하는 다른 공정; CCS 가능한 가스화 또는 바이오매스의 열분해를 포함하나 이에 한정되지 않는 저- 또는 비-이산화탄소 배출을 갖는 수소를 생산하는 것으로 알려진 다른 전기화학적 또는 열화학적 방법 중 하나 이상을 포함하나 이에 한정되지 않는 화학 및 공정 공학의 기술 및 과학 분야에 잘 알려진 방법에 의해 생성된다. 특정 구현예에서, H2 생성하는 접근법은 저-GHG 공급원으로부터 재생가능한 전기 에너지 및/또는 전력에 의해 구동되는 전기분해를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 특정 구현예에서, 전기분해는 광전지 및/또는 태양열을 포함하나 이에 한정되지 않는 태양력, 풍력, 수력, 원자력, 지열, 증진된 지열, 해저열, 해양 파력, 조력 발전 중 하나 이상에 의해 전력을 공급받는다.
세계적으로 엄청난 풍력 에너지 자원이 존재하고, 이중 낮은 백분율만이 활용된다. 현재의 낮은 이용률은 주로 풍력 자원의 간헐적인 특성에 기인하며, 시간 경과 시 발전량이 달라지며, 대부분의 시간에 에너지 수요를 충족시키지 못한다. 풍력 발전 및 그리드 수요 사이의 공통적인 불일치는 공급 과잉으로 인해 터빈을 내리도록 풍력 발전 단지가 완공되었던 스코틀랜드[http://www.mnn.com/earth-matters/energy/blogs/blown-away-wind-turbines-generate-enough-energy-to-power-every-home-in] 및 풍력이 높고 그리드 수요가 낮은 밤에 전력이 무료로 공급되었던 텍사스주 일부 [http://www.nytimes.com/2015/11/09/business/energy-environment/a-texas-utility-offers-a-nighttime-special-free-electricity.html?_r=2]와 같이 주변 세계로부터의 사례에서 나타난다. 이러한 과제는 본원에서의 특정 구현예에서 공정을 위한 H2 급식 원료를 생성하도록 오프-피크 수요 시간 동안 생산된 풍력을 이용함으로써 해결가능할 수 있다.
현재, 수소는 소위 말하는 "전력 대 가스 (power-to-gas)" 접근법에서 가능한 에너지 저장 시스템으로 점점 더 주목받고 있다. 재생가능한 에너지 생산 (특히 태양력 및 풍력 에너지)의 고유한 불안정성 및 초과 그리드 전력 (오프-피크 에너지)은 물 전기분해를 통한 수소 생산으로 완화될 수 있다. 현재의 대다수 계획에 따르면, 생산된 수소 가스는 다음으로 수요 절정 기간 동안 연료 전지 및/또는 가스 터빈에 의해 다시 전기로 변환될 수 있다. 또는 대안적으로 H2는 가스 그리드 내로 급식되거나, 메탄화를 통해 메탄으로 전환될 수 있다. 또한 수소는 화학적, 석유화학적, 야금학 및 식품 산업의 원재료로서 사용될 수 있다. 특정 구현예들은 H2가 생화학물질, 특히 단백질, 아미노산, 비료 및 바이오자극제를 포함하는 더 광범위한 산물에 사용되도록 함으로써 전력 대 가스 프레임워크 내에 새로운 선택사양을 제공한다. 특정 구현예에서, 초과 그리드 전력 및/또는 오프-피크 에너지를 사용하여 생산된 수소는 수소 이용 미생물에서 일어나는 하나 이상의 대사 경로를 위한 전자 공여체로서 사용된다. 특정 구현예에서, 수소-산화 세균 및/또는 호기성 세균에 의한 미생물 생합성에 필요한 수소 및/또는 산소는 재생가능한 에너지, 특히 오프-피크 전력, 예로 에너지 공급이 수요를 초과할 때 입수가능하고 현재 상황에서는 종종 낭비되는 전력을 사용한 물 전기분해에 의해 생성된다.
특정 구현예에서, H2 및 CO2 가스의 현장 저장은 재생가능한 발전이 전기 수요를 초과하는 기간 동안에만 그리드로부터의 전력의 전환을 가능하게 한다. 특정 구현예에서, 전력은 더 높은 수요의 기간 동안 그리드 내에 통상적으로 유동하도록 허용된다. 특정 구현예에서, 공정은 재생가능한 전력 공급을 교란하지 않지만, 풍력 및 태양력과 같은 재생가능한 발전 성능의 더 완벽한 이용을 가능하게 한다. 특정 구현예는 전력 생성이 그리드 수요 (예로, 오프-피크 풍력 또는 태양력 발전)를 초과하는 기간 동안에도 계속적인 재생가능한 작동 및 발전을 허용한다.
특정 구현예에서, 수소 전자 공여체는 저-또는 비-이산화탄소 배출과 함께 반드시 생성되는 것은 아니다. 그러나, 이러한 특정 구현예에서, 수소는 화학 및 공정 공학 분야에서 공지된 방법을 사용하여 폐기물, 지속가능한 또는 가치가 낮은 에너지원 및/또는 탄소원으로부터 생성된다. 이러한 방법은 이에 한정되지 않지만 도시의 고체 폐기물, 블랙 리커, 농업 폐기물, 목재 폐기물, 공급 천연 가스, 바이오가스, 신 가스, 메탄 하이드레이트, 액체 석유 가스, 석유 코크스, 타이어, 하수, 분뇨, 스트로, 해조류 및 다시마, 가치가 낮은 높은 리그노셀룰로스 바이오매스 중 하나 이상과 같은 급식 원료의 가스화, 열분해, 수증기 개질 또는 자동 열 개질을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 특정 구현예에서, H2 및/또는 CO 및/또는 CO2를 포함하는 합성 가스 또는 생산자 가스는 전자 공여체 및/또는 탄소원으로서 이용된다. 특정 구현예에서, 합성가스 또는 생산자 가스에 포함된 H2 및/또는 CO 및/또는 CO2는 재생가능한 및/또는 저-GHG 에너지원 및 본원에 기술된 공정 중 하나 이상과 같은 전환 공정을 사용하여 생성된 H2로 보충된다.
특정 비제한적인 구현예에서, 폐기물 CO2 감소 및/또는 식품 또는 영양분 공급원으로서 이용될 수 있는 세포 물질의 합성 및/또는 폐기물 우레아의 처리 및 이용 및/또는 다른 생물학적 폐기물이 발생한다.
특정 구현예에서, 합성가스 또는 생산자 가스에서 수소 대 일산화탄소의 비율은 가스가 미생물 배양 물에 전달되기 이전에 물 가스 전환 반응 및/또는 탄소 포획을 통하여 조정될 수 있다. 특정 구현예에서, C1 화합물은 메탄 또는 천연 가스, 구체적으로 공급 천연 가스 또는 달리 발염되거나 대기로 방출될 천연 가스 또는 바이오가스 또는 매립가스의 메탄 수증기 개질을 통하여 생성되고, 합성가스 및/또는 생산자 가스 또는 C1 화합물의 액체 증기로서 미생물의 배양액에 제공되며, 여기서 특정 구현예에서, 합성가스 또는 생산자 가스에서 수소 대 일산화탄소의 비율은 가스가 미생물 배양액에 전달되기 이전에 물 가스 전환 반응 및/또는 탄소 포획을 통하여 조정될 수 있다.
특정 구현예에서, 전자 공여체는 또한 공정 가스; 테일 가스; 증진된 오일 회수 배출구 가스; 공급 천연 가스; 바이오가스; 매립 가스; 및 신 가스 중 하나 이상을 포함하지만 이에 한정되지 않는 오염물 또는 폐기 산물로부터 공급되거나 정제될 수 있다. 특정 구현예에서, H2 및/또는 CH4 및/또는 CO를 포함하는 테일 가스는 전자 공여체 및/또는 탄소의 공급원으로서 사용된다. 특정 구현예에서 정유 공장으로부터의 테일 가스는 전자 공여체 및/또는 탄소의 공급원으로서 사용된다.
산물
일부 구현예에서, 본원에 기술된 미생물은 액체 배양 현탁액 리터 당 적어도 1 mg의 관심있는 탄소 기반의 산물을 생산한다. 일부 예에서, 산물은 미생물에 의해 배양 배지로 분비된다. 다른 예에서, 산물은 발효 과정에서 미생물에 보유된다. 일부 경우에는, 산물은 세포를 용해시키고 산물을 분리시킴으로써 회수될 수 있다. 다른 경우에, 산물은 미생물로부터의 산물의 유의한 제조 또는 정제 없이도 미처리 미생물에서 상업적 가치를 갖을 수 있다.
특정 구현예에서, 액체 현탁액으로부터 세포 매스의 분리가 수행된다. 특정 구현예에서, 이러한 분리는 미생물 배양의 기술 분야에 공지된 방법에 의해 수행된다. 세포 대량 수확 기법의 예는, 예를 들면 국제특허출원 PCT WO08 / 00558; 미국 특허 5,807,722; 미국 특허 5,593,886; 및 미국 특허 5,821,111에 제공되어 있다. 분리는 원심분리법; 응집법; 부유법; 중공 섬유, 나선형 운드 또는 세라믹 필터 시스템을 사용한 여과법; 진공 여과법; 접선 유동 여과법; 정화법; 고정법; 하이드로사이클론 중 하나 이상을 포함하나 이에 한정되지 않는 방법에 의해 수행될 수 있다. 세포 매스는 매트릭스 상에 고정될 수 있는 특정 구현예에서, 중력 침전법 또는 여과법을 포함하나 이에 한정되지 않는 방법에 의해 수확될 수 있으며, 박피 또는 액체 전단력에 의해 성장 기질로부터 분리될 수 있다.
특정 구현예에서, 세포 매스를 제거한 후에 남은 액체는 생물공정의 용해된 화학적 산물 및/또는 미반응 영양분의 제거 및/또는 회수를 위한 시스템으로 펌핑될 수 있다. 특정 구현예에서, 미반응 영양분 및/또는 물은 가능한 정도로 회수되고 재순환되고/거나 특정 구현예에서, 보조산물로서 판매되고/거나 적절하게 처분된다. 특정 구현예에서, 당해 기술분야에 공지된 방법 및 기술을 사용하여 폐기 산물 및/또는 오염물 및/또는 임의의 억제성 및/또는 유해한 화합물의 제거는 물 및/또는 미반응 영양분을 생물반응기(들)로 돌리기 이전에 수행된다.
특정 구현예에서, 유리 및/또는 용해된 유기 분자는 세포 배설 또는 분비 또는 세포 용해를 포함하나 이에 한정되지 않는 방법을 통하여 미생물로부터의 공정 수증기 용액 내로 방출될 수 있다.
특정 구현예에서, 화학적 산물 및/또는 미반응 영양분의 수용액으로부터의 회수 및/또는 재활용은 공정 공학의 기술분야에 공지된 장비 및 기법을 사용하여 달성되고, 특정한 구현예의 화학적 산물을 목표로 할 수 있으며, 이는 용매 추출; 물 추출; 증류; 분별 증류; 시멘트 결합; 화학적 침전; 알칼리 용액 흡수; 활성탄, 이온 교환 수지 또는 분자체 상의 흡수 또는 흡착; 용액 pH 및/또는 산화-환원 전위의 변형; 증발기; 분별 결정화기; 고체/액체 분리기; 나노여과; 역삼투; 및 이들의 모든 조합을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
특정 구현예에서, 화학적 산물 및/또는 미반응 영양분는 다른 유기체의 성장을 지원하는 환경으로 유입된다. 특정 구현예에서, 배출수 및 미반응 영양분은 고등 식물 및/또는 해조류 및/또는 조류를 관개하여 비옥하게 하고, 곰팡이, 효모 및/또는 세균와 같은 종속영양성 생물에게 급식하는데 사용된다. 특정 구현예에서, 생물반응기 배출수로부터의 무기 영양분은 양식 및/또는 수경법에 사용되는 연못 및/또는 기타 구획의 일차 생산을 증가시킬 수 있는 무기 비료로서 작용한다.
특정 화학독립영양성 생물 종에 의해 얻을 수 있는 높은 성장률은 광합성 미생물에 의해 달성될 수 있는 기립 단위 바이오매스 당 탄소 고정 및/또는 바이오매스 생산의 최고 속도와 일치하거나 능가할 수 있다. 특정 구현예에서, 잉여 바이오매스가 생산될 수 있다. 특정 구현예에서, 세포 매스의 잉여 성장은 바이오매스 산물을 생산하도록 시스템으로부터 제거될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포 매스의 잉여 성장은 계속되는 높은 탄소 포획 및 고정 속도 및/또는 급식 원료 전환율을 위해 미생물 배양물에서 바람직한 (예로, 최적의) 미생물 및 세포 밀도를 유지하기 위하여, 시스템으로부터 제거될 수 있다.
바이오매스 산물을 유용한 산물로 가공하는 것을 돕기 위하여, 특정 구현예에서 수확된 미생물 세포는 볼 분쇄법, 공동화 압력, 초음파 분쇄, 균질화 또는 기계적 전단화 중 하나 이상을 포함하나 이에 한정되지는 않는 잘 알려진 방법을 사용하여 깨뜨릴 수 있다.
일부 구현예에서, 수확된 바이오매스는 공정 단계 또는 단계(들)에서 건조될 수 있다. 바이오매스 건조화는 원심분리법, 드럼 건조화, 증발, 냉동건조화, 가열, 분무 건조화, 진공 건조화 및/또는 진공 여과법 중 하나 이상을 포함하나 이에 제한되지는 않는 잘 알려진 기술을 사용하여 수행될 수 있다. 특정 구현예에서, 폐기 열은 바이오매스를 건조하는데 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 탄소 공급원으로서 사용된 배출 가스의 산업적 공급원으로부터의 열 폐기물은 바이오매스를 건조하는데 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기에 논의된 바와 같이 전자 공여체 및/또는 C1 탄소원의 생성으로부터의 열 보조산물은 바이오매스를 건조하는데 사용될 수 있다.
예시적이지만 비제한적인 구현예에서, 영양분 배지를 포함하는 생물반응기는 생산 세포로 접종되고, 일반적으로, 세포가 배가되기 시작하기 이전에 지체기가 이어질 것이다. 지체기 이후에, 세포 배가 시간은 감소하고, 배양물은 지수적 성장기로 진행된다. 지수적 성장기는 이론에 의해 제한되도록 의도하지는 않지만 용존 가스, 질소원 또는 미네랄 공급원을 포함한 영양분의 고갈 또는 억제성 화학물질 농도의 상승 또는 미생물에 의한 정족수 감지으로 인해 유도되는 것으로 생각되는 배가 시간의 증가로 이어진다. 특정 경우에, 특히 호기성 생물공정에서, 연장된 선형 또는 산술적 성장기는 정체기의 개시 이전에 지수적 성장기가 이어질 수 있다. 이러한 산술적 성장기는 O2 제한이 특징이다. 세포 매스를 수확하기 위하여, 특정 구현예에서 배양물은 지수적 성장기에서 및/또는 산술적 성장기 동안 및/또는 정체기에서 늦게 수확된다. 일부 구현예에서, 세포는 지수적 성장기에서 수확된다. 지질 또는 PHB와 같은 탄소 저장의 축적은 일반적으로 탄소원 또는 전자 공급원 (예로, 수소)을 제외하고는 질소원 또는 다른 중요한 영양분의 고갈에 의해 촉발될 수 있다. 이것은 과다한 탄소원 및 에너지원으로부터 생산된 환원된 탄소를 저장하도록 세포에 신호를 보낸다.
예시적이지만 비제한적인 구현예에서, 폐쇄된 배양 용기가 사용되고, 수소, 산소 및 CO2가 용기의 액체 작업 부피의 기저부에 압력 하에서 공급되고; 체임버로 가스의 유동은 체임버 상부공간에서 고정된 H2, O2 및 CO2 농도를 유지하도록 가스 센서에 의해 조절되고; 가스 및 배양 배지는 용기 내에서 기계적 교반에 의해 혼합되어 액체로 가스의 확산을 최대화하고; 수소 및 산소 가스는 물 전기분해 셀에 의해 공급되고, CO2는 폐기물 공급원 또는 캐빈 공기 또는 정산적으로 대기로 방출되는 포인트로부터 포획되고; 공정 흐름은 배양 용기로부터 단백질 및/또는 단백질성 바이오매스 수확 유닛으로 유동하고; 원심분리 작용이 고체를 액체로부터 분리하는데 사용되고; 분리된 액체는 물 재이용 유닛으로 유동하고; 달리 시스템에 축적될 수 있는 바람직하지 않은 임의의 물질이 물 재이용 유닛에서 제거되고; 재이용된 물은 물 전기분해 셀에서 재사용되고; 영양분 배지 (makeup)는 목표로 한 배양 배지 조성을 유지하기 위해 배양 용기에 공급되고; 이러한 특정 구현예에서, 소변은 영양분 공급원 중 하나로서 제공된다; 회수된 탈수 바이오매스는 영양분 및/또는 비료 및/또는 성분 및/또는 식품으로 추가로 가공된다. 이러한 특정 구현예에서, 생물반응기 상부공간으로 버블링되는 미사용 가스는 액체 작업 부피의 기저부로 재순환되고 다시 액체 작업 부피 내로 도입된다. 다른 특정 구현예에서, 새로이 유입된 H2 및/또는 CO2는 작업 부피의 기저부 대신에 생물반응기의 상부공간 내로 직접적으로 급식된 다음, 재순환 시스템을 통하여 다른 상부공간 가스와 함께 재순환 되어, 가스가 액체 작업 부피 내에 용해되고/거나 버블링되는 액체 작업 부피의 기저부로 간다.
특정 구현예에서, 바이오매스는 유용한 생화학물질의 분리 및 생산을 돕기 위하여, 건조 이후에 또는 선행 건조화 단계 없이 추가로 가공된다. 특정 구현예에서, 이러한 추가적인 공정은 미생물 바이오매스로부터 단백질 또는 지질 함량 또는 비타민 또는 다른 목표로 하는 생화학물질의 분리를 수반한다. 특정 구현예에서, 지질의 분리는 헥산, 고리헥산, 에틸 에테르, 알코올 (이소프로판올, 에탄올 등), 트리부틸 인산염, 초임계 이산화탄소, 트리옥틸포스핀 산화물, 이차 및 삼차 아민 또는 프로판을 포함하나 이에 한정되지 않는 하나 이상과 같은 비극성 용매를 지질을 추출하는데 사용함으로써 수행될 수 있다. 특정 구현예에서, 다른 유용한 생화학물질은 클로로포름, 아세톤, 에틸 아세테이트 및 테트라클로로에틸렌 중 하나 이상을 포함하나 이에 한정되지 않는 용매를 사용하여 추출될 수 있다. 특정 구현예에서, 세포 용해가 수행된다.
일부 구현예에서, 아미노산 및/또는 단백질 및/또는 비타민을 생산하는 방법으로서, 생물 반응기 또는 용액에서 아미노산 생합성 경로, 비타민 생합성 경로를 포함하나 이에 한정되지 않는 하나 이상의 생합성 경로, 탄소-함유 가스 및 합성 가스, 생산자 가스, 천연 가스, 바이오가스, CO2, 일산화탄소 및 수소 가스를 포함한 이들의 혼합물 및/또는 메탄올 또는 메탄을 포함하나 이에 한정되지 않는 가스성 또는 액체 C1 화합물과 같은 탄소-함유 가스를 아미노산 및/또는 단백질 및/또는 비타민으로 전환시키는 조작된 또는 천연 미생물을 조합함으로써 생산하는, 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 아미노산 및/또는 단백질 및/또는 비타민은 화학, 화학공학, 미생물학, 농경학 및/또는 식품 과학 분야의 기술 및 과학 분야에 공지된 공정을 사용하여 비료, 바이오자극제, 바이오비료, 미생물 영양분 배지, 버섯 성장 증진제, 배합 동물 사료 및/또는 인간 식품 중 하나 이상에 포함된다. 일부 비제한적인 구현예에서, 미생물은 Cupriavidus necator DSM 531 또는 DSM 541이다. 일부 비제한정적인 구현예에서, 비타민은 비타민 B이고, 보다 구체적으로는 비타민 B1, B2 및/또는 B12이다.
특정 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 아미노산을 생산하는 방법으로서, 세균 세포, 아르케온 세포 및/또는 다른 미생물 세포를 합성가스 및/또는 생산자 가스 및/또는 가스성 CO2 및/또는 천연 가스 및/또는 바이오가스 및/또는 가스성 CO2 및/또는 가스성 H2 및/또는 CO 및/또는 CH4 (예로 H2 및 CO2 및/또는 CO 및/또는 CH4)의 혼합물에 노출하는 단계를 포함하고; 미생물 세포는 가스성 CO2 및/또는 다른 C1 탄소원을 하나 이상의 아미노산 및/또는 단백질 및/또는 비타민으로 고정할 수 있고, 화합물은 생물반응기로부터 회수되고, 제 2 이상의 추가적인 반응기에 급식되고, 비료, 바이오자극제, 바이오비료, 버섯 성장 증진제, 양식 사료, 동물 사료, 식품 성분, 인간 영양제 (예로, 식품 또는 영양 보충제) 또는 비타민 중 하나 이상을 포함하나 이에 한정되지 않는 산물을 생성하도록 후가공되는, 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 조성물은 세균 세포를 포함하며, 세균은 Rhodococcus 속으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 미생물은 Rhodococcus opacus (DSM 43205 또는 43206 또는 44193) 또는 Rhodococcus 종 (DSM 3346)이다. 일부 구현예에서, 세균 세포는 Ralstonia 또는 Cupriavidus 속으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 세균 세포는 Cupriavidus necator 또는 Cupriavidus metallidurans로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 세균 세포은 Corynebacteriumae 아목 또는 Burkholderiaceae 과로부터 유래한다.
일 구현예에서, 합성가스 및/또는 H2 및/또는 CO2 및/또는 CO 및/또는 CH4 (예로, H2 및 CO2 및/또는 CO 및/또는 CH4) 및/또는 다른 폐가스 상에서 성장할 수 있는 야생형 또는 조작된 미생물이 이용되고, 리신을 포함하나 이에 한정되지 않는 아미노산을 생산할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 아미노산, 펩티드, 단백질, 비타민 또는 다른 영양분을 제조하는 방법으로서, (a) 본원에 기술된 세포를 반응 용기 또는 생물반응기에서 합성가스 및/또는 생산자 가스 및/또는 천연 가스 및/또는 바이오 가스 및/또는 가스성 CO2 및/또는 가스성 H2 및/또는 CO 및/또는 CH4 (예로 H2 및 CO2 및/또는 CO 및/또는 CH4)의 존재 시 배양하고, 세포는 세포의 총 건조 세포 질량의 적어도 10% 이상의 정량으로 하나 이상의 아미노산 또는 단백질 또는 다른 영양분를 생산하고/거나 분비하는, 단계; 및 (b) 하나 이상의 아미노산, 펩티드, 단백질, 비타민 또는 다른 영양분 또는 전체 세포 산물을 반응 용기로부터 분리하는 (예로, 반응 용기의 세포 배지로부터 분리하는) 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 방법으로 생산된 하나 이상의 아미노산 또는 단백질 또는 다른 영양분 또는 전체 세포 산물은 대안의 또는 비-통상적인 단백질 및/또는 영양분 공급원으로서 사용된다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 방법으로 생산된 하나 이상의 아미노산 또는 단백질 또는 다른 영양분 또는 전체 세포 산물은 또 다른 유기체에게 제공되는 급식 원료 또는 공급 영양분의 성분이거나 이들의 전구체이거나 이들 내에 포함된다. 특정 비제한적인 구현예에서, 상기 공급 영양분을 소비하는 다른 유형의 유기체는 세균, 아르케온, 효모, 미세조류, 해초, 다시마, 동물 플랑크톤, 곰팡이, 버섯, 식물, 패류 또는 다른 무척추 동물, 어류, 조류 또는 포유동물 중 하나 이상이다.
특정 비제한적인 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같이 생산된 단백질성 바이오매스는 대체 단백질 공급원으로서 사용된다. 특정 구현예에서, 이는 어분 및/또는 카제인 및/또는 유장 및/또는 대두분의 대체물로서 사용된다. 특정 비한정적인 구현예에서, 단백질 산물은 라이신 및/또는 메티오닌이 결핍되지 않는다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같이 생산된 아미노산, 펩티드 및/또는 단백질은 어분, 카제인, 유청 및/또는 대두분 및/또는 다른 식물 단백질 대신에 비료, 바이오자극제, 바이오비료, 버섯 성장 증진제, 배합 사료 및/또는 인간 식품 성분에 사용된다. 특정 비제한적인 구현예에서, 단백질 산물은 임의의 필수 아미노산이 결핍되지 않는다. 특정 비한정적인 구현예에서, 단백질 산물은 라이신 및/또는 메티오닌이 결핍되지 않는다. 특정 제한적인 구현예에서, 단백질성 바이오매스는 유의한 양의 항-영양 인자를 포함하지 않는다. 특정 구현예에서, 단백질성 바이오매스는 고시폴, 글루코시놀레이트, 사포닌 또는 트립신 저해제 중 하나 이상의 유의한 양을 포함하지 않는다.
어분을 포함하나 이에 한정되지 않는 많은 현재의 단백질 및 영양분 공급원은, 예를 들면 물고기를 수확한 물이 오염되기 때문에, 수은 (Hg) 및 납 (Pb)과 같은 중금속뿐만 아니라 다른 독성 화학물질 및 유기물로 오염될 수 있다. 특정 구현예는 어분을 포함하나 이에 한정되지 않는 현재의 단백질 및 기타 영양분 공급원과 비교하여, 중금속 및/또는 독성 유기물을 포함하나 이에 한정되지 않는 것과 같은 독성 오염물의 특히 낮은 수준을 갖는 단백질 산물에 관한 것이다.
고등 식물의 유의한 분획이 사람과 다른 비-반추 동물을 포함하나 이에 한정되지 않는 많은 다른 동물에게 식용가능하지 않다. 이것은 바람직하지 않은 부산물 또는 폐기 산물로의 에너지 및 탄소의 통과, 원하는 산물의 수율 저하 및 폐기물 가공 및 처리에 대한 추가적인 부담을 포함하는 수많은 단점을 초래할 수 있다. 특정 구현예에서, CO2 포획, 바이오매스 생산 및/또는 단백질 생산의 견지에서, 비슷한 고등 식물 작물의 경우보다 더 큰 탄소 및/또는 에너지 플럭스가 목표로 하는 바이오매스 산물로 유도된다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같이 생산된 바이오매스의 식용가능하지 않은 분획 (예로, 인간에 대한) 대비 식용가능한 분획의 비율은 비슷한 고등 식물 작물의 경우보다 더 낮다. 특정 구현예에서, 비슷한 고등 작물의 경우보다 식품 낭비의 양이 더 적다.
생체산물 및/또는 바이오매스 생산을 위한 시스템
일부 비제한적인 구현예는 CO2 및/또는 다른 탄소 폐기물을 생산하는 산업 설비로 생물공정의 배치를 가능하게 하는 비교적 작은 지상 면적을 갖는 생산 설비에 관한 것이다. 특정 비제한적인 구현예에서, 이들 산업 설비는 화석 발전소; 정유 공장; 타르 모래 업그레이드 설비; 천연 가스 또는 석유 시추 작업; 에탄올 증류소; 시멘트 제조; 알루미늄 제조; 염화알칼리 제조; 철강소; 지열 발전소 중 하나 이상을 포함한다. 특정 구현예에서, 소형 수직적 설계는 바이오매스 건조화를 포함하나 이에 한정되지 않는 생산 공정에서 추가로 이용될 수 있는 산업 배출 가스 공급원 및 관련 폐기물 열 옆의 편리한 배치를 허용한다.
특정 구현예에서, 추가적인 실질적인 장점은 생물학적 CO2 포획 및 전환을 위한 일부 다른 시스템과 비교하여 상대적으로 높게 조절되고 포함되는 시스템을 통해 실현된다. 일부 구현예에서, 사용된 생물반응기는 비교적 밀착 제어된 내부 매개변수 (예로, 온도, 압력 등), 유입 및 유출과 함께, 가스 및 액체에 밀착하고, 구조적으로 견고하며, 주변 환경으로부터 고도로 격리되고 절연되어 있다. 이러한 비교적 폐쇄된 시스템은, 일부 구현예에서 실용적인 조류 또는 전통적인 농업 시스템에서의 유기체보다 훨씬 더 많이 크놀가스 및/또는수소영양성 및/또는 카복시영양성 및/또는 화학독립영양성 및/또는 메탄영양성 미생물을 포함하는 배양물을 보호한다. 실용적인 조류 및 전통적인 농업 시스템은 유기체가 주변 환경과 생태계에 직접적으로 노출되는 부득이하게 극도로 개방된 시스템이다. 특정 구현예에서 공정의 비교적 고도로 제어되고 포함된 관점은 실용적인 조류 또는 전통적인 농업 시스템과 비교하여 환경 오염, 질병 또는 해충 및 잡초 위해의 위험성을 크게 감소시킨다. 특정 구현예에서, 공정은 실용적인 조류 또는 전통적인 농업 시스템보다 날씨 및 기후 변수로부터 더욱 절연되어 있다. 특정 구현예에서, 공정은 실용적인 조류 또는 전통적인 농업 시스템에 비해 회분 손실 및/또는 생산성 변화를 감소시킨다.
특정 구현예에서 가스 및 액체 밀착 반응기에 의해 제공되는 높은 봉쇄 및 입력 및 출력에 대한 엄격한 제어 때문에, 특정 구현예에서 물 및 영양분 재활용이 크게 용이해진다. 특정 구현예에서, 물 재활용은 콘덴서를 포함하나 이에 한정되지 않는 생물반응기 배출구의 하류에 적절한 유닛을 추가함으로써 달성된다. 이러한 유형의 장비 및 방법은 물 회수 및 재활용 기술 및 과학 분야에서 잘 알려져 있다. 특정 구현예에서, 증발 손실 및/또는 물 유출 및/또는 영양분 유출 및/또는 주변 지하수 및 수로의 오염은 개방된 조류 또는 전통적인 농업 시스템보다 더 많이 방지된다. 대조적으로, 개방된 조류 시스템 및 전통적인 농업은 높은 증발수 손실을 갖고 농업수 유출에 취약하여, 비료 및 물의 낭비; 호수와 수로의 부영양화; 심지어 "데드존"의 출현 (높게 O2 고갈된 수역)을 유도한다. 고등 식물은 증산에 의해 물을 소실한다. 특정 구현예에서, 물은 증산에 의해 손실되지 않는다. 개방된 조류 및 전통적인 농업 시스템은 또한 비-고유한 유기체의 주변 환경으로 '탈출" 및 유전적 교차 오염에 대한 높은 위험성을 제시한다. 특정 구현예에서, 개방된 조류 및 전통적인 농업 시스템의 경우보다 비-고유한 유기체의 주변 환경으로 '탈출" 및 유전적 교차 오염에 대한 위험성이 더 낮다. 특정 구현예에서, 생물공정에서 살충제, 제초제 또는 항생제를 사용하지 않는다. 특정 구현예는 화학독립영양성 생물이 바이오-기반의 산물 생산에서 광합성 식물, 조류 또는 미생물; 또는 종속영양성 곰팡이, 세균 또는 동물을 대체하는 새로운 유형의 농업을 예시한다. 특정 구현예에서, 이들 바이오-기반의 산물은 통상적인 농업 및/또는 동물 축산의 산물을 보충하거나, 보강하거나, 대체하거나 확장시킨다.
단백질 생산의 최적화 및 특이적 아미노산 분포의 표적화는 생물반응기 조건 및/또는 영양분 수준의 조절 및/또는 세포의 유전적 변형을 통하여 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, 단백질 생산 및 생산된 아미노산 분자의 분포는 생물반응기 조건의 조절, 영양분 수준의 조절, 세포의 유전적 변형 중 하나 이상을 통하여 최적화된다. 특정 구현예에서, 아미노산, 단백질, 비타민 및/또는 다른 영양분으로의 경로 및/또는 보다 일반적으로 생물반응기 시스템의 공간적으로 분리된 영역은 호기성 및 혐기성이다. 본원에 개시된 미생물에 의한 아미노산 또는 단백질 또는 다른 영양분 또는 전체 세포 산물의 생합성은, 탄소원 및 에너지원 및 다른 영양분 공급원의 충분한 공급이 제공되면, 지수적 성장기 동안, 선형의 성장기 또는 이후에 세포 배가가 정지된 정체기 동안 발생할 수 있다.
H2 및/또는 CO2 및/또는 CO 및/또는 CH4를 포함하는 가스성 공급 원료로부터 단백질, 아미노산 및 다른 영양분의 생산을 위한 화학독립영양성 미생물의 용도는, 예를 들면, 2017년 3월 18일자로 제출되고 "MICROORGANISMS AND ARTIFICIAL ECOSYSTEMS FOR THE PRODUCTION OF PROTEIN, FOOD, AND USEFUL CO-PRODUCTS FROM C1 SUBSTRATES"라는 명칭으로 된 국제특허출원 PCT/US17/23110에 기술되어 있다. 본 출원은 본원에 이의 전문이 모든 목적을 위해 참조문헌으로서 통합된다.
크놀가스 미생물의 공학이, 예를 들면 2012년 9월 19일자로 제출되고 "INDUSTRIAL FATTY ACID ENGINEERING GENERAL SYSTEM FOR MODIFYING FATTY ACIDS"라는 명칭으로 된 미국 특허출원 일련번호 13/623,089에 기술되어 있다. 본 출원은 본원에 이의 전문이 모든 목적을 위해 참조문헌으로서 통합된다.
합성가스, 생산자 가스 또는 다른 H2 및 CO2 및/또는 CO 포함 가스 믹스의 중- 내지 고- 탄소 사슬수 또는 동화적 분자로의 전환을 위한 크놀가스 미생물의 용도는 예를 들면, 2012년 10월 26일자로 미국 특허청에 제출되고, "USE OF OXYHYDROGEN MICROORGANISMS FOR NON-PHOTOSYNTHETIC CARBON CAPTURE AND CONVERSION OF INORGANIC AND/OR C1 CARBON SOURCES INTO USEFUL ORGANIC COMPOUNDS"라는 명칭으로 된 특허출원 13 / 643,872에 기술되어 있다. 본 출원은 본원에 이의 전문이 모든 목적을 위해 참조문헌으로서 통합된다.
CO2의 유용한 유기 화학물질로의 전환을 위한 화학영양성 미생물의 용도는 예를 들면, 2010년 5월 12 일자로 제출되고 "BIOLOGICAL AND CHEMICAL PROCESS UTILIZING CHEMOAUTOTROPHIC MICROORGANISMS FOR THE CHEMOSYTHETIC FIXATION OF CARBON DIOXIDE AND/OR OTHER INORGANIC CARBON SOURCES INTO ORGANIC COMPOUNDS, AND THE GENERATION OF ADDITIONAL USEFUL PRODUCTS"라는 명칭으로 된 국제특허출원 PCT/US2010/001402에 기술되어 있다. 본 출원은 본원에 이의 전문이 모든 목적을 위해 참조문헌으로서 통합된다.
일부 구현예의 추가적인 특징은 본원에 기술된 미생물을 가속화된 돌연변이 유발기전 (에로, 자외선 또는 화학적 처리 사용), 유전공학 또는 변형, 혼성화, 합성 생물학 또는 전통적인 선택적 교배를 포함하나 이에 한정되지 않는 인위적인 절차를 통하여 변형시키는 것을 포함한다. 미생물의 가능한 변형은 아미노산 및/또는 단백질 및/또는 효소 및/또는 비타민의 증가된 정량 및/또는 품질을 생산하는 것을 목표로 하는 번형을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
특정 구현예에서, 하나 이상의 외인성 핵산 서열을 포함하는 화학영양성 세균 균주가 이용된다. 본원에 기술된 미생물에 의해 합성된 생화학물질은 석유화학 대체물, 단량체, 중합체의 생산을 위한 공급 원료, 윤활제, 비료, 동물 사료, 식품, 개인 위생 및 화장품에서 성분으로서 용도를 포함하나 이에 한정되지 않는 용도에 적용될 수 있다. 일부 구현예에서, 효소적 및 화학적 공정은 비타민, 아미노산 및/또는 단백질을 생산하는데 이용될 수 있다. 일부 구현예는 비료, 바이오자극제 또는 동물 사료의 생산을 가능하게 한다. 또한, 개선된 아미노산 및/또는 단백질 및/또는 비타민 수율 및/또는 더 낮은 생산 비용을 위해 화학영양성 세균을 배양하고/거나 변형하는 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 미생물 (예로, 세균)은 유전적으로 변형되지 않은 동일한 미생물과 비교하여 비타민 또는 아미노산 분자 또는 단백질 또는 효소의 특정 유형 또는 유형을 더 많이 생산한다.
본원에 기술된 아미노산, 단백질, 비타민, 다른 영양분 및/또는 전체 세포 산물을 위한 생물반응기, 배양 조건, 종속영양성 및 화학영양성 생물 성장, 유지 및 생산 방법의 구체적인 예는 미생물 성장 및 아미노산, 단백질, 비타민, 다른 영양분, 및/또는 전체 세포 생산의 효율을 개선하도록 임의의 적합한 방식으로 조합될 수 있다.
산물의 후-생물 공정 회수 및 용도의 적용
특정 비제한적인 구현예에서, 식물 바이오자극제 및/또는 바이오비료 및/또는 유기질 비료는 본원에서의 공정에 의해 획득된다. 특정 구현예는 아미노산 발효 액체 및/또는 미생물 세포 중 적어도 하나를 식물 바이오자극제 제형물에 첨가하는 것을 포함한다. 특정 비제한적인 구현예에서, 미생물 세포는 그램 음성 및/또는 그램 양성 세균이다. 특정 비제한적인 구현예에서, 미생물 세포는 본원에 기술된 바와 같이 C1 탄소원의 전환을 통하여 획득된다. 바이오자극제 및/또는 비료 및/또는 영양분을 폐기물 및/또는 저-비용 공급 원료로부터 제조하는 비교적 저렴한 방법을 제공하는 것은 특정 구현예의 추가의 목적이다. 특정 구현예에서, 아미노산 및/또는 올리고펩티드 및/또는 저-분자량 펩티드는 C1 탄소원을 포함하나 이에 한정되지 않는 폐기물 및/또는 저-비용 급식 원료로부터 생산된다. 특정 구현예에서, C1 탄소원을 포함하나 이에 한정되지 않는 폐기물 및/또는 저-비용 급식 원료로부터 생산된 영양분은 잎 및/또는 뿌리를 통하여 식물에 의해 쉽게 흡수되고 통화된다. 특정 구현예에서, 흡수된 영양분는 싹, 꽃 또는 과실과 같은 식물 기관로 운반된다 (Gjalakshimi et al. (2004) Bioresource Technology (92): 291-296; Parrado et al. (2008) Bioresource Technology 99: 2312-2318). 특정 구현예에서, 아미노산 및/또는 올리고 펩티드 및/또는 저-분자량 펩티드는 자신의 단백질을 개발하기 위해 식물에 의해 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 이것은 달리 식물 내의 에너지-소모하는 대사 공정 중 하나 이상에서 소비되는 대사 에너지를 절약한다 (Higgings, CF, Payne, JW. (1982) Plant peptides. In: Boulder, D., Parthier, B.,(Eds). Encyclopedia of Plant Physiology, 14A. Springer. 438-458). 특정 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같이 생산된 영양분는 탄소원 및/또는 질소원을 포함하나 이에 한정되지 않는 토양 환경에서 미세 동물에 의해 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 미세-동물은 영양분을 식물 성장 및 활성에 유익한 형태로 전환한다. 마찬가지로, 아미노산, 올리고펩티드, 저-분자량 펩티드 및 본원에 기술된 바와 같이 생산된 다른 영양분은 또한 동물에 의해 이들의 식이에 도입될 때 바로 흡수되고 동화된다.
특정 구현예에서, 미생물 세포는 미생물 세포 매스를 생성하는 산업적 공정의 부산물로서 획득된다. 예를 들면, 산업적 공정은 아미노산, 에탄올, 다른 알코올, 유기산, 지질 및/또는 탄화수소의 생산 및/또는 폐수 처리로부터 선택될 수 있다. 특정 비제한적인 구현예에서, 세포는 소비된 배지에서, 예를 들면 라이신, 트레오닌, 트립토판, 글루탐산, 아르기닌, 히스티딘, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 발린, 글리신, 세린, 시스테인, 타이로신, 알라닌, 아스파라긴산, 프롤린, 아스파라긴 및/또는 글루타민으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산의 생산으로부터 제공된다.
통합된 다중-영양성 양식에서, 하나의 종의 부산물이 또 다른 종의 사료로서 재활용하도록 허용하는 방식으로 여러 종이 다함께 양식된다. 통합된 농업 (특히 수경 재배) 및 양식에서, 연못 또는 재순환 시스템은 해산물 및 다른 유기체 (예로, 어류 및 상추) 둘 다를 사육하는데 사용된다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같이 생산된 단백질 및/또는 다른 영양분는 재순환 시스템; 통합된 다중-영양성 양식; 통합된 농업 및 양식 중 하나 이상에서 상추 및/또는 어류를 사육하는 기법 및 기술학에 사용된다.
일부 구현예에서, 생물반응기는 아미노산 또는 단백질 또는 비타민 또는 기타 관심있는 영양분에 대한 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 내인성 또는 외인성 핵산 서열을 포함하는 미생물을 포함한다. 일부 구현예에서, 시스템은 두 개 이상, 세 개 이상 또는 네 개 이상의 생물반응기를 포함하고, 이들 중 적어도 하나는 아미노산 또는 단백질 또는 비타민 또는 기타 관심있는 영양분에 대한 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 내인성 또는 외인성 핵산 서열을 포함하는 미생물을 포함한다. 일부 구현예에서, 생물반응기의 시스템은 적어도 제 1 및 제 2 생물반응기를 포함하고, 여기서 제 1 생물반응기는 아미노산 또는 단백질 또는 비타민 또는 기타 관심있는 영양분에 대한 경로 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 내인성 또는 외인성 핵산 서열을 포함하는 미생물을 포함하고; 제 2 생물반응기는 상이한 종으로부터 유래한 미생물을 포함하고, 상이한 종로부터의 미생물은 적어도 하나의 외인성 핵산 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 생물반응기의 시스템은 본원에 기술된 바와 같은 미생물을 포함하는 제 1 생물반응기 및 동물 플랭크톤, 곰팡이, 미세조류, 효모 또는 세균 세포를 포함하는 제 2 생물반응기를 포함한다. 일부 구현예에서, 시스템은 본원에 기술된 바와 같은 미생물을 포함하는 제 1 생물반응기 및 다세포 동물 및/또는 양식 및/또는 수경 시스템을 포함하는 제 2 탱크 또는 용기를 포함한다.
특정 비제한적인 구현예에서, 본원에 기술된 미생물은 다른 살아있는 유기체와 공생적 관계 및/또는 영양성 관계로 유지된다. 이러한 관계의 예가 도 23 에 도시되어 있다.
특정 구현예에서, 생화학적 화학 산물 및/또는 소비된 영양분의 수용성 배지 용액으로부터의 회수는 공정 공학의 기술분야에 공지된 장비 및 기법을 사용하여 달성되고, 본원에 기술된 특정한 구현예의 화학적 산물을 목표로 할 수 있으며, 이는 용매 추출; 물 추출; 증류; 분별 증류; 시멘트 결합; 화학적 침전; 알칼리 용액 흡수; 활성탄, 이온 교환 수지 또는 분자체 상의 흡수 또는 흡착; 용액 pH 및/또는 산화-환원 전위의 변형; 증발기; 분별 결정화기; 고체/액체 분리기; 나노여과; 및 이들의 모든 조합을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같이 생산된 바이오매스는 화학, 화학공학 및/또는 식품 과학의 기술 및 과학 분야에서 잘 알려진 방법 및 공정을 사용하여, 비료, 바이오자극제, 바이오비료, 버섯 성장 증진제, 동물 사료 및/또는 인간 영양 적용을 위해 고 단백질 및/또는 고 비타민 및/또는 고 영양분 산물으로 전환된다.
특정 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같이 생산된 바이오매스는 보충적 급식 영양분으로서 사용된다. 특정 구현예에서, 바이오매스는 토양에서 화학적 및 미생물 성질을 회복시키고 및/또는 작물 생산성을 증가시키는데 유기질 비료 재료로서 사용된다.
일부 구현예에서, 미생물에 의해 생산된 아미노산 및/또는 펩티드 및/또는 단백질로부터의 질소 90% 이상이 본원에 기술된 바와 같이 생산된 아미노산 및/또는 펩티드 및/또는 단백질 및/또는 단백질성 바이오매스를 소비하는 다른 미생물, 식물, 곰팡이, 동물 또는 사람에 의해 후속적으로 흡수된다. 일부 구현예에서, 미생물 세포는 또 다른 유기체에 급식하기 이전에 끓여진다. 다른 구현예에서, 세포는 또 다른 유기체에 급식하기 이전에 초음파 처리되거나 달리 용해되거나 파열된다.
특정 구현예에서, 제형물은 고 단백질 균주; 고 오일/지방 균주; 고 탄수화물/다당류 균주 중 하나 이상으로부터의 바이오매스를 조합하여 제조된다. 이러한 특정 구현예에서, 결과로 얻은 제형물은 단독으로 이용되는 균주 콜렉션의 임의의 하위군보다 또 다른 유기체의 영양적 요구사항을 위해 단백질, 오일과 지방 및 탄수화물의 더욱 적절한 균형을 갖는다.
특정 구현예에서, 생물반응기로부터 회수된 바이오매스는 물로 세척되고, 이러한 특정 구현예에서는 희석된 알칼리가 부착 색상 및 미각체를 제거하도록 세척 시 혼입될 수 있다. 특정 구현예에서, 저온 살균 단계가 존재한다. 특정 구현예에서, 저온 살균은 약 5분 동안 약 220OF에서 일어난다. 일부 구현예에서, 미생물 세포는 또 다른 유기체를 비옥하게 하거나 이에 급식하기 이전에 끓여진다.
바이오매스 산물을 유용한 산물로 가공하는 것을 돕기 위하여, 특정 구현예에서 수확된 미생물 세포는 볼 분쇄법, 공동화 압력, 초음파 분쇄, 기계적 전단화, 고압 균질화, 모래 또는 콜로이드 분쇄, 반복된 냉동-해동 순환, 용균성 효소 중 하나 이상을 포함하나 이에 한정되지는 않는 잘 알려진 방법을 사용하여 깨뜨릴 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 또 다른 유기체를 비옥하게 하거나 이에 급식하기 이전에, 볼 분쇄법, 공동화 압력, 초음파 분쇄, 기계적 전단화, 고압 균질화, 모래 또는 콜로이드 분쇄, 반복된 냉동-해동 순환, 용균성 효소 중 하나 이상으로 처리된다.
대부분의 단백질 및 기타 큰 생체분자는 세포내에서 발견되며, 특정 구현예에서 이들 생체분자는 세포내 환경으로부터 추출된다 [Doelle, HW Microbial Process Development (World Scientific, 1994)]. URL https://books.google.com/books?id=_qDabLa-0ukC.]. 일부 단백질은 내부 막 및/또는 미세 구조를 포함하여 세포의 불용성 부분과 구조적으로 연관된다. 종종 이러한 산물을 회수하는 것은 먼저 세포가 파열되거나 파손되어야 한다. 특정 구현예에서, 세포는 파열되거나 파손된다. 세포 파열을 위한 여러 가지 방법이 존재하고, 특정한 세포 유형은 이들 중 하나 이상에 가장 적합할 수 있다. 미생물 (예로, 세균)은 상당한 연약성 내지 매우 탄력성으로 다양하다. 특정 구현예에서, 특정한 세포 유형에 잘 맞는 당업자에게 공지된 세포 파괴 방법은 본원에 기술된 바와 같이 생산된 세포를 개방하여 파손하는데 이용된다.
균질화기 또는 프레스기는 세균와 같은 미생물을 용균하는 데 사용되는 공통적인 장치이다. 프레스기는 세포 현탁액에 가압하고 갑자기 압력을 방출함으로써 세포를 용해시킨다. 이것은 세포를 용해할 수 있는 액체 전단을 생성한다. 특정 구현예에서, 압력 균질화기는 세포 파괴 공정에서 사용된다. 프렌치 압력 세포 프레스기 또는 프렌치 프레스기는 고압 하의 좁은 밸브를 통과시켜 세포의 세포질 막을 파열시키는 장치이다. 가우린 균질화기는 식품 및 유제품, 제약, 석유 및 화학물질을 포함한 많은 산업 분야에서 안정한 에멀전 및 분산액을 만드는데 사용되는 기계이다. 프렌치 프레스기 및 맨톤-가우린 균질화기의 전형적인 작동 압력은 6000 내지 10,000 psi이다. 적절한 용균을 달성하려면 일반적으로 여러 번 (예로, ~ 2 내지 3회) 통과해야 한다. 그러나, 높은 작동 압력은 작동 온도의 상승을 유발한다. 따라서, 압력 세포는 사용하기 전에 종종 냉각된다 (예로, ~ 4°C). 휴즈 프레스기는 수용 체임버의 작은 틈새를 통해 700 내지 5,500 바의 압력으로 세포의 동결된 현탁액을 강압한다. 25 ㎛ 이하의 슬릿 너비가 사용될 수 있다. X-프레스기는 동결된 세포 상에서도 작동하도록 휴즈 프레스기의 변형이다. 이러한 경우 세포는 디스크의 원통형 홀을 통과한다. 이중 플런지 배열은 세포가 여러 번 앞뒤로 통과시켜서 세포 손상을 증가시킨다. X-프레스기는 2,000 내지 6,000 바 이상에서 작동한다.
특정 구현예에서, 다음의 균질화기 또는 프레스기 중 하나 이상이 세포 파열에 사용된다: 가우린; 맨톤-가우린; 프렌치; 차이코프; 휴즈; X-프레스; 및/또는 소르발-리비 분별기. 소르발-리비 분별기는 니들 밸브가 냉각된 질소로 냉각시키기 위한 설비를 갖는 프렌치 프레스기의 변형이다. 특정 구현예에서, 세포는 소르발-리비 분별기에서 1,000 바 초과, 또는 1,700 바 초과, 또는 2,400 바 초과의 압력을 받게 된다. 일부 더 현대적인 균질화기는 종종 연속적이며 구형 모델보다 높은 압력에서 작동될 수 있다. 아베스틴 에멀시플렉스-C5는 대장균 세포를 15,000 psi (100 Mpa)에서 한 번의 통과로 효율적으로 용균시키는 것으로 보고되어 있다. 특정 비제한적인 구현예에서, 아베스틴 에멀시플렉스-C5는 세포를 용해하는데 사용된다. 특정 비제한적인 구현예에서, 세포 용해는 균질화기를 통한 단일 통과로 수행된다. 특정 비제한적인 구현예에서, 세포는 균질화기에서 약 15,000 psi 이상에 노출된다. 특정 비제한적인 구현예에서, 균질화는 다음의 조건, 압력 5000 내지 15000 psig; 균질화기를 통한 1 내지 5회 통과; 온도 32°F 내지 122°F; pH 4.5 내지 6.5 하에서 일어난다.
초음파 및 초음파 분쇄는 가능한 곰팡이를 제외하고 거의 모든 세포 유형의 세포 파열에 적합한 기술로 밝혀져 왔다. 세포는 액체 전단 및 공동화에 의해 용해된다. 문제는 온도를 조절하는 것이다. 이것은 얼음 위에서 현탁액을 유지하고, 낮은 온도를 다시 설정하도록 일시 정지 (10 내지 30초)와 함께 다수 회의 짧은 펄스 (5 내지 10 초)를 사용하여 해결된다. DNA도 역시 초음파 파쇄 동안 전단된다. 특정 구현예에서, DNA 가수분해를 위해 세포 현탁액에 DNase를 첨가할 필요는 없다. 특정 구현예에서, 초음파는 세균 및/또는 아르케온 세포의 파열에 사용된다.
특정 구현예에서, 세포 파열은 고체 표면에 대한 세포 물질의 마쇄에 의해 달성된다. 식물, 효모 및 세균 세포를 포함한 대부분 세포 유형의 효율적인 파열이 비드 분쇄로 입증되어 왔다. 최대 20 리터의 시스템은 40 내지 70 kg/시간의 처리량에서 효모 파열에 대해 90% 이상, 200 kg/시간에서 최대 80%의 보고된 수율로 이용가능하다 [Doelle, HW Microbial Process Development (World Scientific, 1994). URL https://books.google.com/books?id=_qDabLa-0ukC.]. 특정 구현예에서, 하나 이상의 분쇄 방법이 세포 분열을 위해 사용되는데, 페슬 및 모르타르 (연마 분말의 존재 또는 부재 시); 포터-엘베지엠 균질화기; 브라운 균질화기; 비드 분쇄 및/또는 콜로이드 분쇄를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 요인이 가장 효율적 및/또는 비용-효과적인 세포 파열을 위해 최적화되고, 요인은 시스템에서의 체류 시간; 비드의 크기 및 밀도, 뿐만 아니라 정량 및 조성; 회전 속도; 블레이드 및/또는 로터 축의 설계; 세포 농도; 점도; 및 온도를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
특정 구현예에서, 세포의 물리적 및/또는 화학적 및/또는 효소적 용해를 포함하는 비-기계적인 방법은 기계적 방법에 추가하여 또는 추가적인 기계적 방법이 없이 세포 용해에 사용될 수 있다.
삼투압 충격은 세포가 저장성 용액에 현탁될 때 발생하고; 물은 세포 안으로 확산되어 세포가 팽창하여 궁극적으로 파열되도록 한다. 이 기법은 비교적 조용하고 조절가능하다. 전형적인 용액은 예를 들면 1 M 글리세롤, 1 M 슈크로즈, 증류수 또는 단순하게 상청액의 희석물을 포함한다. 특정 비제한적인 구현예에서, 삼투압 충격은 세포 용해 공정의 일부로서 사용된다.
특정 비제한적인 구현예에서, 압력 방출은 세포 용해 공정의 일부로서 사용된다. 특정 구현예에서, 세포 현탁액은 가스 하에서 가압되고, 평형 상태가 된다. 가스 장력은 배양액 및 세포 세포질에서 증가한다. 갑자기 압력을 방출하면, 가스는 용액으로부터 탈착하고 세포 내의 팽창이 이를 폭발시킨다. 이러한 특정 구현예에서, 세포 현탁액은 최대 60 바로 가압된다. 일부 비제한적인 구현예에서, 세포 현탁액은 아질산 산화물의 35 바 이상 하에서 3분 이상 동안 평형화된다. 일부 비제한적인 구현예에서, 세포 현탁액은 질소의 35 바 이상 하에서 3분 이상 동안 평형화된다.
특정 비제한적인 구현예에서, 동결 및 해동은 세포 용해 공정의 일부로서 사용된다. 세포가 냉동된 이후에 해동되면 세포를 관통하는 얼음 결정의 작용으로 인해 종종 세포막이 파열된다. 특정 구현예에서, 한 번 이상의 동결-해동 순환이 이용된다.
특정 구현예에서, 동결 및 마쇄의 조합은 세포 용해 공정의 일부로서 사용된다. 특정 구현예에서, 세포는 예를 들면 이에 한정되는 것은 아니지만 액체 질소를 사용하여 냉동되고, 냉동 세포는 다음으로 상기 기술된 마쇄 및 분쇄 방법 중 하나 이상을 사용하여 분말로 마쇄된다. 특정 구현예에서, 액체 질소로도 역시 냉각되었던 모르타르 및 페슬이 사용된다. 특정 구현예에서, 세포 용균물은 상기 냉동된 마쇄된 분말을 5 부피의 완충액에 첨가함으로써 제조된다.
건조화 또는 탈수는 공통적으로 미생물 세포를 파열하는데 사용되고, 종종 세포를 완충액 작용에 취약하게 만든다. 일부 비제한적인 구현예에서, 건조화 또는 탈수 및/또는 완충액의 작용은 세포 용해 공정의 일부로서 사용된다. 특정 구현예에서, 진공이 공정을 신속하게 하도록 적용될 수 있다. 특정 구현예에서, 냉동건조가 채용되고, 다른 구현예에서는 느린 공기 건조화가 채용될 수 있다. 특정 구현예에서, 휘발성 화학물질로의 건조화가 사용될 수 있다. 아세톤, 에탄올 및 에테르와 같은 시약은 완충액에서의 산물 용해도를 개선할 수 있다. 특정 비제한적인 구현예에서, 아세톤 및/또는 에탄올 및/또는 에테르는 세포 용해 공정의 일부로서 사용된다.
특정 비제한적인 구현예에서, 효소적 용해는 세포 용해 공정의 일부로서 사용된다. 하나 이상의 효소(들)이 특이적 결합을 공격함으로써 세포벽을 용해하는데 사용될 수 있다. 효소적 용해는 예를 들면 세균벽의 펩티도글리칸 층의 소화에 기초할 수 있다. 효소는 일반적으로 특정 상황에서 효소를 거대분자에 컨쥬게이션하고 한외 여과로 회수하는 것이 가능할 수 있지만, 각각의 파열 배치에서 손실된다. 특정 비제한적인 구현예에서, 용해 효소(들)는 거대분자에 컨쥬게이션되고/거나 한외 여과에 의해 회수된다. 공통적으로 사용되는 효소는 난백으로부터 얻는 리소자임이다. 이것은 세포벽에서 뮤라믹 펩티드를 공격하고, 그램 양성 세균 및 그램 음성 세균에 효과적이라고 밝혀져 왔다. 그러나, 그램 음성 세균는 세포벽 외부에 있는 외막을 갖고, 펩티도글리칸 층을 노출하도록 투과화될 필요가 있다. 용해 방법에서 종종 완충액으로서 사용되는 트리스는 외막을 효과적으로 투과화한다. 이러한 효과는 에틸렌디아민 테트라아세테이트 (EDTA) (예로, ~ 1 mM)의 첨가에 의해 증진될 수 있다. EDTA는 막을 안정화하는 마그네슘 이온을 킬레이팅한다. 특정 비제한적인 구현예에서, 하나 이상의 리소자임(들)이 세포 용해 공정의 일부로서 사용된다. 특정 비제한적인 구현예에서, 트리스는 용해 시 완충액으로서 사용된다. 특정 비제한적인 구현예에서, EDTA는 용해 시 킬레이팅제로서 사용된다. 특정 비제한적인 구현예에서, 효소적 용해는 초음파 파쇄와 조합하여 수행된다.
특정 비제한적인 구현예에서, 계면활성제 및/또는 용매 및/또는 다른 화학물질은 세포 용해 공정의 일부로서 사용된다. 양이온성 및 음이온성 계면활성제, 알칼리, 산 및 클로로포름 및 톨루엔과 같은 용매는 세포막의 지질 또는 지질단백질을 손상시키는데 효과적이다. 특정 비제한적인 구현예에서, 양이온성 및/또는 음이온성 계면활성제(들) 및/또는 알칼리(들) 및/또는 산(들) 및/또는 이에 한정되지는 않는 클로로포름 또는 톨루엔과 같은 용매(들)는 세포 용해 공정의 일부로서 사용된다. 이러한 특정 구현예에서, 화학적 제제는 세포 용해 공정으로부터 하류의 최종 산물에서 식물 및/또는 곰팡이 및/또는 동물 및/또는 환경에 독성이거나 유해한 잔류물을 유발하지 않도록 선택된다. 이러한 특정 구현예에서, 당해 기술분야에 잘 공지된 바와 같은 식물 및/또는 곰팡이 및/또는 동물 및/또는 환경에 유해한 효과를 미칠 수 있는 임의의 화학물질의 안전성 수준으로의 제거 공정은 세포 용해 공정으로부터 하류에 실현된다.
폴리믹신, 암포테리신 B 및/또는 나이스타틴과 같은 항생제는 세균 막의 투과성을 증가시키고 용해를 유도할 수 있다. 페니실린-기반의 항생제는 세균 세포벽 합성의 효과적인 억제제이지만, 세포가 여전히 활발한 성장 중에 있는 세포 파열에만 가치가 있다. 특정 비제한적인 구현예에서, 폴리믹신, 암포테리신 B, 나이스타틴 및/또는 페니실린을 포함하나 이에 제한되지 않는 항생제는 세포 용해 공정의 일부로서 사용된다. 이러한 특정 구현예에서, 항생제는 세포 용해 공정으로부터 하류의 최종 산물에서 식물 및/또는 곰팡이 및/또는 동물 및/또는 환경에 독성이거나 유해하고/거나 항생제 저항성 미생물의 의학적 문제를 악화시키지 않을 잔류물을 유발하지 않도록 선택된다.
특정 비제한적인 구현예에서, 박테리오파지는 세포 용해 공정의 일부로서 사용된다. 대부분의 세균 군은 박테리오파지에 민감하다. 파지는 핵산 침투를 위해 세포막을 가수분해하는 효소를 보유한다. 과도한 감염은 용해를 유발할 수 있다. 이러한 구현예에서, 발효 용기 내의 이러한 파지 오염의 재사용은 큰 위험이며, 당업자라면 숙지하는 바와 같이 이러한 오염을 방지하는 단계는 이러한 오염을 예방하도록 실현된다.
임의의 방법에 의해 세포가 파열될 때, 일반적으로 세포 잔재물 분획 및 가용성 세포질 성분 분획이 획득된다. 이들 분획은 이에 한정되지 않지만 원심분리 또는 여과와 같은 방법에 의해 분리될 수 있다. 가용성 세포질 성분 중에는 핵산 및 단백질이 개별적으로 또는 조합하여 존재한다. 실질적인 양의 DNA가 세포 용해에 의해 유리되어 점도가 증가될 수 있다. 특정 비제한적인 구현예에서, DNase (예로, ~ 1 mg/mL)가 첨가되어 용해된 제조물의 점도를 감소시킨다. 세포 용해 이후, 등전점 침전법에 의한 단백질의 회수는 특정 구현예에서 바람직하지 않은 핵산 함량을 갖는 단백질성 산물을 유도할 수 있다. 특정 구현예에서, 단백질성 물질의 핵산 함량을 감소시키거나 제거하기 위한 당해 기술분야에 공지된 측정이 착수된다.
특정 구현예에서, 세포 물질로부터의 추출물이 획득된다. 이러한 특정 구현예에서, 추출물은 유기 추출물이다. 이러한 특정 구현예에서, 추출물은 효소 추출물이다. 이러한 방법에 의해 획득되거나 획득가능한 세포 추출물이 제공된다. 일부 구현예에서, 세포 추출물 (예로, 유기 추출물)은 농업, 동물 급식 및/또는 직접적인 인간 영양 공급에 사용된다.
본원에 기술된 바와 같이, 발현 배양물 및/또는 배양액은 본원에 개시된 생물공정을 통해 획득된 세포 현탁액을 말하고, 이는 미생물 성장 및 생산을 위해 C1 탄소원 및/또는 유기 탄소원을 사용할 수 있다. 보다 구체적으로는, 배양물 및/또는 배양액은 미생물 세포 및/또는 이들 대사의 산물 및/또는 단백질, 수용성 B-복합 비타민, 다른 비타민, 인산염, 이에 한정되지 않지만 칼륨, 황, 마그네슘, 칼슘 및/또는 나트륨과 같은 미네랄, 포화 및/또는 불포화 지방산, 레시틴, 세팔린, 글리코겐, 트레할로스, 글루칸 및/또는 만난과 같은 탄수화물, 에틸 알코올, 이산화탄소, 에스테르, 알데히드, 케톤 및 고급 알코올 등 중 하나 이상을 포함하나 이에 한정되지 않을 수 있는 미소비된 영양분을 포함한다. 이들 잔류물은 생물반응기로부터 나오면서 바로, 건조화 또는 농축 없이 또는 물이 제거된 이후 농축된 액체 또는 고체 형태로, 수용액에 현탁되고/거나 용해될 수 있다. 남은 물은 예를 들면 이에 한정되지 않지만 여과, 침강 또는 원심분리와 같은 임의의 통상적인 방법에 의해 분리될 수 있다.
미국 특허출원 2003/022357은 Saccharomyces 속의 효모 세포 및 폐수 저장 또는 처리 공장으로부터의 슬러지를 기초로 한 생물학적 비료를 기술하고 있고, 이의 제조를 위해 효모 세포는 자기장을 적용함으로써 활성화된다. 본원의 특정 비제한적인 구현예에서, C1 급식 원료 상에서 자라는 미생물 세포는 자기장을 적용함으로써 활성화된다. 미국 특허출원 US2002/187900는 가축 분뇨와 조합된 전자기적으로 활성화된 Saccharomyces 속의 효모 세포를 포함하는 생물학적 비료를 기술하고 있고, 미국 특허출원 US2002 / 187552는 조류 분뇨와 조합된 전자기적으로 활성화된 Saccharomyces 세포를 또한 포함하는 생물학적 비료를 개시하고 있다. 본원의 일부 비제한적인 구현예에서, H2, CO2, CO 및 CH4 중 하나 이상을 포함하나 이에 한정되지 않는 가스성 기질 상에서 성장하였던 미생물 세포는 전자기적으로 활성화된다. 특정 구현예에서, 세포는 소 및/또는 조류 분뇨 및/또는 기타 분뇨 및/또는 식물, 해초 및/또는 다시마 및/또는 동물로부터의 폐기 산물로부터의 추출물을 포함하나 이에 한정되지 않는, 하나 이상의 다른 성분과 조합된다.
단백질 가수분해
특정 비제한적인 구현예에서, 본원에 기술된 미세유기체 (미생물) 세포로부터의 유기 추출물은 유리 아미노산, 올리고펩티드 및/또는 고 분자량의 다른 펩티드를 포함하는 가수분해된 상태의 거의 모든 단백질 함량, 뿐만 아니라 초기의 전체 세포 물질의 실질적으로 모든 영양분를 포함한다. 이러한 특정 구현예에서, 추출물은 바이오비료 및/또는 바이오자극제의 높은 성능뿐만 아니라 곰팡이 및/또는 동물 및/또는 식물에 대한 더 큰 생체-흡수 성능을 갖는다. 특정 구현예에서, 이러한 추출된 산물은 유기 경작 및/또는 동물 사육 및/또는 수경 재배에, 및/또는 가축 및/또는 양식을 위한 높은 영양가를 갖는 첨가제로서, 및/또는 종속영양성 미생물 및/또는 거대 유기체의 성장을 위한 영양분으로서 및/또는 직접적인 인간 소비를 위한 영양분으로서 유용하다.
특정 비제한적인 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 미생물 세포는 가수분해물을 획득하도록 가수분해된다. 다양한 예시적인 구현예에서, 식물 바이오자극제를 생산하는 방법은 미생물 세포를 가수분해하여 가수분해물을 획득하는 단계 및 가수분해물을 엽면 적용, 토양 아쥬반트로서의 적용 및/또는 토양 비료로서의 적용을 위한 식물 바이오자극제 및/또는 싱물 영양분 및/또는 비료로서 제형화하는 단계를 포함한다. 특정 비제한적인 구현예에서, 가수분해물은 채소 및 꽃 작물, 관엽 식물 및 잔디의 발아 및 초기 성장을 증진하기 위한 종자 코팅에 사용된다. 특정 비제한적인 구현예는 식물 바이오자극제 및/또는 비료를 생산하는 방법으로서, 예로 본원에 기술된 바와 같이 자란 미생물 세포를 가수분해하여 가수분해물을 획득하는 단계 및 가수분해물을 엽면 적용, 토양 아쥬반트로서의 적용 및/또는 토양 비료로서의 적용을 위한 식물 바이오자극제로서 제형화하는 단계를 포함하는, 방법을 포함한다. 특정 비제한적인 구현예에서, 미생물 세포를 가수분해하는 것은 약 1 내지 약 30 중량%의 고체 함량을 갖는 세포 크림을 가수분해하는 것을 포함한다. 일부 비제한적인 구현예에서, 미생물 세포를 가수분해하는 것은 약 0.12 내지 약 4 중량%의 질소 함량을 갖는 세포 크림을 가수분해하는 것을 포함한다. 미생물 세포는 가수분해에 의해 가공되어 미가공 세포 또는 부분적으로 용해된 세포와 비교하여 훨씬 감소된 점도를 갖는 더 짧은 사슬 화합물을 수득할 수 있다. 다른 세포를 사용하는 것이 가능한 한편, 미생물 세포 (바람직하게는 원핵 세포, 더욱 바람직하게는 세균 또는 진정세균 세포)는 본원에 기술된 바와 같이 특정 구현예에 따라 식물 바이오자극제 및/또는 곰팡이 영양분을 제조하는데 채용된다. 아민-함유 화합물은 식물 또는 동물 세포를 가수분해함으로써 획득될 수 있다. 본원에서 미생물 세포가 가수분해되는 예시적인 방법은 또한 식물 바이오자극제로서 작용할 수 있는 펩티도글리칸, 지질다당류, 지방, 지질, 비타민, 탄수화물, 페놀, 미네랄 원소, 식물 호르몬, 아민-함유 화합물 및 폴리아민과 같은 생체-활성 화합물을 수득할 수 있다.
미생물 세포의 가수분해는 세포 성분을 짧은 사슬 또는 단일 화합물로 실질적으로 용해시키는 임의의 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 대안적으로, 부분적 가수분해는 더 적은 에너지 집약적이고 더 짧은 가수분해 기간을 이용함으로써 세포로부터 식물 바이오자극제 및/또는 비료를 생산하는데 이용될 수 있다.
미생물 세포가 이러한 효소적 가수분해에 순응하는 구현예에서 효소적 가수분해가 채용될 수 있다. 특정 비제한적인 구현예에서, 미생물 세포을 가수분해하는 것은 효소적 가수분해를 수행하는 것을 포함한다. 최종 효소 가수분해 이후에, "유기 효소 추출물"이라고 지칭될 수 있는 산물이 획득된다. 유기 효소는 농업, 축산 및/또는 인간 영양 공급과 같은 목적으로서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 유기 효소 추출물은 농업, 동물 사육 및/또는 종속영양성 발효의 적용에 사용된다. 특정 구현예에서, 유기 효소 추출물은 유기 경작에서, 아미노산, 올리고펩티드 및 저분자량을 갖는 펩티드의 특별한 조성이 주어지면 바이오자극제로서 및/또는 바이오비료로서 사용될 수 있고, 이는 식물 및/또는 토양 유기체에 의한 이들 분자의 흡수를 가능하게 한다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 방법에 따라 생산되고 작물에 적용되는 바이오자극제는 다음의 성과, 증진된 작물 품질 매개변수 및/또는 영양분 효율; 성장 속도 증가; 광합성 속도 증가; 작물 수확량 증가; 식물 뿌리와 잎의 성장 증가; 비생물적 스트레스 내성 증가; 질병 내성 증가; 토질 개선; 더 작은 잡초 성장 중 하나 이상을 제공한다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 방법에 따라 생산된 바이오자극제는 상기 바이오자극제가 적용된 작물에 의한 영양분 이용 효율을 증가시키고/거나, 작물이 심어진 영역으로부터 환경 내로 영양분 침출을 감소시킨다. 특정 비제한적인 구현예에서, 본원에 기술된 방법에 따라 생산된 바이오자극제는 식물의 스트레스 요인에 대한 내성을 증가시키고/거나, 식물의 번식 속도를 증가시키고/거나, 현재까지 시판된 산물보다 용량 당 더 큰 효능을 갖고/거나, 과도한 적용이 발생하면 현재까지 시판된 산물과 비교하여 식물 손상의 위험성을 감소시킨다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 단백질 가수분해물 또는 유기 추출물은 N2 고정화, P 가용화 및 인돌 아세트산 생산 세균와 같은 바람직한, 자연 발생하는 토양 미생물을 자극한다. 특정 비제한적인 구현예에서, 자극된 미생물은 Azospirillum 종 및/또는 Azotobacter 종을 포함한다. 특정 구현예에서, 유기 효소 추출물은 곰팡이 (예로, 버섯)을 위한 영양분 또는 보충제로서 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 유기 효소 추출물은 동물 사료로서, 보다 구체적으로는 가축 사료 (소, 양, 염소 등) 및/또는 양식 및/또는 곤충 (예로, 벌) 또는 다른 무척추 동물 (예로, 레드웜) 및/또는 종속영양성 발효 및/또는 애완 동물 또는 반려 동물 및/또는 직접적인 인간 소비를 위해 고부가가치를 갖는 영양적 첨가물로서 사용될 수 있다.
특정 구현예에서, 추출물은 가수분해된 형태로 실질적으로 모든 출발 단백질을 포함한다. 특정 비제한적인 구현예에서, 출발 단백질의 90 중량% 이상은 가수분해된 형태, 예로 유리 아미노산, 올리고펩티드 및 고분자량을 갖는 기타 펩티드의 형태로이다. 특정 비제한적인 구현예에서, 가수분해 공정에 진입하는 배양물에서 세포로부터의 실질적으로 모든 영양분는 가수분해물에 포함된다. 특정 구현예에서, 유기물의 액체 용액 또는 현탁액으로부터의 세포외 영양분도 또한 산물에 포함된다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 방법에 의해 획득되거나 획득가능한 가수분해물 및/또는 유기 효소 추출물이 제공된다. 특정 구현예에서, 추출물은 단백질이, 예를 들면 주로 펩티드 (예로, 10,000 달톤 미만의 저분자량을 갖는 올리고펩티드 및 펩티드) 및 유리 아미노산의 형태로 풍부하다. 특정 구현예에서, 유리 아미노산은 높은 생체흡수를 갖는다. 특정 구현예에서, 추출물은 탄수화물을 포함한다. 본원에 기술된 바와 같은 효소를 채용함으로써, 식물 바이오자극제를 가수분해에서 강한 산 또는 염기의 대안을 사용하여 획득하는 것이 가능하다. 다양한 예시적인 구현예에서, 미생물 (예로, 세균) 세포의 효소적 가수분해는 임의의 적합한 효소 또는 효소 조성물을 사용하여 수행될 수 있다.
특정 비제한적인 구현예에서, 미생물은 미생물 (예로, 세균) 단백질을 유리 아미노산 및/또는 짧은 펩티드로 가수분해할 수 있는 적어도 하나의 효소로 가수분해된다. 특정 구현예에서, 효소적 가수분해는 정제된 효소로 가수분해하는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 효소적 가수분해는 효소 및 효소가 제조된 배지의 혼합물로 가수분해하는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 효소적 가수분해는 식물 및/또는 동물 효소 및/또는 세균 및/또는 아르케온 및/또는 곰팡이 기원의 효소로 가수분해하는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 효소적 가수분해는 식물, 동물, 세균, 아르케온 및/또는 곰팡이 기원의 하나 이상의 효소(들)의 혼합물로 가수분해하는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 가수분해 효소는 본원에 기술된 바와 같은 미생물 균주에 의해 생산된다. 특정 구현예에서, 가수분해 효소는 C1 기질 및/또는 H2 및/또는 합성가스의 급식 원료로부터 생산된다. 예시적인 구현예에서, 세균 세포는 프로테아제, 리파제 및 아밀라제 중 하나 이상으로 가수분해될 수 있다. 특정 구현예에서, 효소적 가수분해는 미생물, 식물, 곰팡이 및/또는 동물 기원의 하나 이상의 단백질 분해효소(들)을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 알칼리성 프로테아제의 사용을 포함한다. 특정 구현예에서, 효소적 가수분해는 판크레아틴, 파파인, 브로멜라인, 피신, 세균 프로테아제, 곰팡이 프로테아제, Bacillus 종 알칼라제 2.4L, Bacillus B. licheniformis 및/또는 Subtilisin carlesberg에 의해 생산된 중성 프로테아제, B. lentus로부터의 에스페라제, B. amyloliquifacus로부터의 뉴트라제, Bacillus 종으로부터의 프로타맥스, B. thermoproteolyticus로부터의 테로라이신/테롤라제, Aspergillus oryzae로부터의 플라보자임, B. subtilis로부터의 프로테아제 N, 트립신, 키모트립신, 케라티나제, 펩신, 섭틸리신 및/또는 레닌으로부터 선택된 적어도 하나의 효소로 가수분해하는 것을 포함한다. 당업자라면 잘 이해할 바와 같이, 판크레아틴은 소화 효소, 프로테아제, 리파제 및 아밀라제의 혼합물을 포함한다.
미생물 (예로, 세균) 세포를 효소적으로 가수분해하는 것은 임의의 적합한 조건 하에 임의의 적합한 양으로 효소 및 세균 세포를 배합하는 것을 포함할 수 있다. 일반적으로, 반응물의 정량, 반응 조건 및 반응 단계의 순서는 이상적인 효소 활성을 달성하도록 선택된다. 특정 구현예에서, 효소적 가수분해의 압력, 온도, pH 및 시간의 조건은 효소 활성의 최대 또는 적합한 수준이 달성되는 조건이다. 특정 구현예에서, 효소적 가수분해를 수행하는 것은 효소 및 세균 세포를 미생물 (예로, 세균) 세포의 질소 함량 100 g 당 약 0.1 내지 약 10 g의 효소 범위의 중량비로 배합하는 것을 포함한다. 또 다른 특정 구현예에서, 효소적 가수분해는 아조카제인 검정법을 사용하여 약 70,000 단위의 활성을 갖는 효소 원액의 0.05% 내지 0.5% 부피 농도를 사용하여 수행된다. 다양한 예시적인 구현예에서, 임의의 적합한 방법은 미생물 (예로, 세균) 세포의 효소적 가수분해 효율을 개선하는데 채용될 수 있다. 특정 구현예에서, 효소적 가수분해는 효소 및 미생물 세포를 조합하고, 임의의 적합한 방법으로 조합 된 효소 및 미생물 세포를 교반하는 것을 포함한다. 효소 처리는 예를 들면, 온도 조절 및 교반을 갖는 반응기와 같은 당업자에게 공지된 임의의 적합한 장치에서 수행될 수 있다.
상기에 나타낸 바와 같이, 가수분해는 임의의 적합한 조건 하에서 수행될 수 있지만, 다양한 예시적인 구현예에서 가수분해는 pH 2 내지 약 10의 범위에서 수행될 수 있다. 특정 구현예에서, 효소적 가수분해는 pH 4 내지 12의 범위에 속하는 pH 조건 하에서 수행된다. 다른 구현예에서, 가수분해는 pH 5 내지 9.5의 범위 내에서 또는 pH 6 내지 8 사이에서, 또는 pH 7에서 수행된다. 각각의 유형의 효소 가수분해는 이의 최적 pH에서 가수분해되고, 최적의 pH는 원하는 가수분해 속도 및 정도에 따라 달라질 수 있음을 이해해야 한다. 특정 상세한 구현예에서, pH 값은 예를 들면 수산화 암모늄 또는 수산화 칼륨과 같은 염기를 첨가함으로써 효소적 가수분해 동안 일정하게 유지되고, 다른 구현예에서 pH는 산을 첨가하여 유지된다. 다양한 예시적인 구현예에서, 가수분해는 15.5℃ 내지 55℃의 온도에서 2 내지 120시간 범위의 기간 동안 수행될 수 있다. 특정 구현예에서, 효소적 가수분해는 10℃ 내지 80℃ 범위의 온도 조건 하에 수행되고, 다른 구현예에서는 10℃ 내지 65℃ 범위 또는 10℃ 내지 55℃ 범위의 온도 하에서 수행된다.
특정 구현예에서, 효소적 가수분해를 수행하는 것은 촉매의 존재 하에 효소 및 미생물 세포를 반응시키는 것을 포함한다. 비균질한 촉매, 균질한 촉매 및/또는 전기촉매와 같은 효소 또는 효소들의 효율을 개선하는 임의의 촉매가 채용될 수 있다. 이러한 특정 구현예에서, 촉매는 철, 구리, 코발트, 니켈, 붕소, 마그네슘, 칼슘 및 이에 한정되지 않지만 란타늄과 같은 희토류 금속 중 적어도 하나를 포함한다. 특정 구현예에서, 효소적 가수분해는 전류가 인가되는 동안 효소 및 미생물 세포를 반응시키는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 효소적 가수분해는 미생물 세포를 효소적으로 가수분해하기 이전 및/또는 이 동안에 미생물 세포에 전류로 처리하는 것을 포함한다. 전류는 임의의 적합한 방법에 의해 및 임의의 적합한 조건 하에서 세포에 적용될 수 있다. 전류를 인가하기 위한 예시적인 방법 및 조건은 예를 들면 본원에 이의 전문이 참고문헌으로 통합되는 Tokuda, et al. (2006) "Effects of electrical pre-treatment on the hydrolysis of agricultural Wastes," J. Brewing Soc. Jap., 101(10): 769-775에 기술되어있다. 다양한 예시적인 구현예에서, 전류는 1 내지 60분의 기간 동안 2 V 내지 120 V의 양으로 인가된다.
본원의 방법의 다양한 예시적인 구현예는 미생물 (예로, 세균) 세포를 효소적으로 가수분해하기 이전에 전처리를 추가로 포함할 수 있다. 효소를 이용한 미생물 단백질 가수분해의 효율은 다양한 전처리 방법을 사용하여 개선될 수 있다. 이러한 전처리 방법은 세포의 구조를 분해하고, 이에 따라 효소에 의한 가수분해의 속도 및 정도를 증가시키는 것으로 여겨진다. 단백질 가수분해의 효율을 증가시킴으로써, 더 적은 양의 효소를 사용하여 가수분해를 수행하거나 주어진 양의 효소로 보통 요구되는 시간보다 더 적은 시간 내에 가수분해를 수행하는 것이 가능하다. 사용된 효소의 양의 감소는 생산 비용을 실질적으로 감소시킬 수 있기 때문에, 더 적은 효소를 사용하여 가수분해를 수행하는 것이 특히 바람직하다.
특정 구현예에서, 효소적 가수분해를 수행하는 것은 미생물 세포를 효소적으로 가수분해하기 이전에 미생물 (예로, 세균) 세포를 약산 또는 약염기로 처리하는 것을 포함한다. 다양한 예시적인 구현예에서, 약산성 전처리는 배양액을 이에 한정되지 않지만 염산 또는 황산과 같은 산을 사용하여 pH 3 내지 5 범위로 조정함으로써 수행된다. 특정 구현예에서, 약산성 전처리는 100℃ 내지 130℃의 온도에서 0.25시간 내지 10시간 동안 수행될 수 있다. 다양한 예시적인 구현예에서, 약염기성 전처리는 미생물 세포를 이에 한정되지는 않지만 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아와 같은 염기를 사용하여 pH 9 내지 12 범위로 조정함으로써 수행된다. 특정 구현예에서, 약염기성 전처리는 100℃ 내지 130℃의 온도에서 0.25시간 내지 10시간 동안 수행될 수 있다. 특정 구현예에서, 효소적 가수분해는 미생물 세포를 효소적으로 가수분해하기 이전 및/또는 이 동안에 미생물 세포에 초음파 진동을 처리하는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 효소적 가수분해는 미생물 세포를 효소적으로 가수분해하기 이전에 미생물 세포에 초임계 물 및/또는 초임계 이산화탄소를 처리하는 것을 포함한다.
특정 구현예는 "원-포트 (one-pot)" 합성을 통하여 가수분해물 또는 유기 효소 추출물을 획득하는 방법을 포함한다. 본 발명의 문맥에서, 용어 표현 "원-포트"는 중간물 분리 단계 없이 절차가 수행되는 것을 의미한다. 특정 구현예에서, 세포 배양액의 물리적 처리는 상 분리 없이 초고기압 및 고온에서 발생하는데, 여기서 세포 배양액은 효소적 가수분해를 거치기 이전에 농축된 염기로 처리된다. 특정 구현예에서, 세포 배양액은 특정 비제한적인 구현예에서, (a) 세포 현탁액을 포함하는 배양액에 이의 pH를 조절하도록 농축된 염기를 첨가하는 단계; (b) 단계 (a)에서 얻은 혼합물을 초고기압 및 고온으로 처리하는 단계; 및 (c) 단계 (b)에서 얻은 혼합물을 효소적 가수분해하여 유기 효소 추출물을 획득하는 단계를 포함하는, "원-포트" 합성의 유형에 착수된다. 특정 구현예에서, 단계 (a)의 알칼리 처리는 수산화암모늄, 수산화칼륨 및/또는 수산화칼슘 중 하나 이상으로부터 선택된 적합한 염기를 사용한다. 특정 구현예에서, 염기는 농축된 형태로 사용되어 반응 부피를 과도하게 증가시키는 것, 가열, 농축화 등에 의한 에너지 비용, 뿐만 아니라 설비 비용을 증가시킬 것을 피한다. 특정 구현예에서, 이러한 농도는 후속적인 효소적 가수분해를 위한 원하는 pH 범위에 따라 선택된다. 일부 비제한적인 구현예에서, 약 28 중량%의 수산화암모늄이 사용되고 다른 경우에는 대략 10 M 수산화칼륨이 사용된다.
특정 구현예에서, 배양액의 알칼리 처리 이후에, 혼합물의 물리적 처리는 초고기압 및/또는 고온에서 시행된다. 특정한 비제한적인 구현예에서, 102 kPa 내지 141 kPa의 압력이 온도 증가 시 단계 (b)에서 적용된다. 일부 특정 구현예에서는 90℃ 내지 140℃의 온도가 물리적 처리에 사용된다. 일부 특정 구현예에서, 102 kPa 내지 141 kPa의 압력이 단계 (b)에서 90℃ 내지 140℃의 온도에서 적용된다. 이러한 물리적 처리는 예를 들면 고압멸균기 (autoclave)와 같은 당업자라면 선택할 임의의 적합한 장치에서 수행된다.
특정 구현예에서, 효소적 처리는 물리적 처리 이후에 수행된다. 특정 구현예에서, 물리적 처리 이후 및 효소적 처리 이전에, 처리될 혼합물이 사용될 효소에 대해 최적의 pH 값을 갖도록 농축된 염기 및/또는 산이 첨가된다. 특정 구현예에서, 단계 (c)의 효소적 가수분해에 사용되는 하나 이상의 효소는 미생물, 식물, 곰팡이 또는 동물 기원의 단백질 분해효소이다. 특정 구현예에서, 단계 (c)의 효소적 가수분해는 2시간 내지 48시간 동안 40℃ 내지 70℃의 온도 및 pH 8 내지 11에서 시행된다. 특정 구현예에서, 원-포트 합성은 공정 단순성을 증가시키고/거나, 비용을 감소시키고/거나, 비슷한 다중-포트 공정보다 오염이 적다.
효소의 유무에 관계 없이 미생물 (예로, 세균) 세포의 가수분해는 충분한 열 및 압력 조건과 조합하여 산 또는 알칼리 가수분해의 적용을 통하여 달성될 수 있다. 특정 비제한적인 구현예에서, 미생물 세포를 가수분해하는 것은 산 가수분해를 수행하는 것을 포함한다. 이러한 특정 구현예에서, 산 가수분해는 미생물 세포를 포함하는 조성물의 pH를 황산, 염산, 인산, 탄산, 붕산, 아세트산, 프로피온산 및 시트르산으로부터 선택된 적어도 하나의 제제로 조정하는 것을 포함한다. 다양한 예시적인 구현예에서, 산 가수분해는 미생물 세포 크림의 pH를 약 0.5 내지 약 5로 조정함으로써 수행된다. 이러한 특정 구현예에서, 산 가수분해는 미생물 (예로, 세균) 세포를 포함하는 조성물의 pH를 조정하고, pH 조정된 조성물을 30℃ 내지 200℃의 온도로 약 10분 내지 약 48시간 동안 가열하는 것을 포함한다. 이러한 특정 구현예에서, 산 가수분해는 미생물 (예로, 세균) 세포를 포함하는 조성물의 pH를 조정하고, pH 조정된 조성물을 압력 하에 가열하는 것을 포함한다. 특정 비제한적인 구현예에서, 미생물 세포를 가수분해하는 것은 알칼리 가수분해를 수행하는 것을 포함한다. 이러한 특정 구현예에서, 알칼리 가수분해를 수행하는 것은 미생물 세포를 포함하는 조성물의 pH를 pH 약 8 내지 약 14로 조정하는 것을 포함한다. 이러한 특정 구현예에서, 알칼리 가수분해는 미생물 세포를 포함하는 조성물의 pH를 수산화칼륨, 수산화나트륨, 산화칼슘, 산화마그네슘 및 암모니아로부터 선택된 적어도 하나의 제제로 조정하는 것을 포함한다. 이러한 특정 구현예에서, 알칼리 가수분해는 미생물 (예로, 세균) 세포를 포함하는 조성물의 pH를 조정하고, pH 조정된 조성물을 30℃ 내지 200℃의 온도로 약 10분 내지 약 48시간 동안 가열하는 것을 포함한다. 이러한 특정 구현예에서, 알칼리 가수분해는 미생물 (예로, 세균) 세포를 포함하는 조성물의 pH를 조정하고, pH 조정된 조성물을 압력 하에 가열하는 것을 포함한다. 본원에 기술된 바와 같은 산 또는 알칼리 가수분해 기법은 일반적으로 가용화물 및 세포벽 잔재물을 포함하는 가수분해물을 수득한다.
단일 세포 단백질 및 미생물 단백질 단리물
본 발명의 특정 구현예는 저하된 핵산 함량을 갖는 단일 세포 단백질 (SCP) 및/또는 미생물 단백질 단리물에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 핵산이 비교적 없지만 여전히 양호한 영양가 및 허용가능한 식용 (예로, 소비) 품질을 제공하는 단백질 산물이 제공된다. 특정 구현예에서, 핵산 함량은 9 중량% 미만으로 감소된다. 특정 구현예에서, RNA 함량은 인간 소비에 대한 세계 보건기구 [WHO] 지침을 충족하도록 감소된다. 특정 구현예에서, SCP의 RNA 함량은 건조 중량의 2% 미만이고; 일부 구현예에서는 건조 중량의 1% 미만이다. 특정 구현예에서, 단백질 100 그램 당 핵산 2 내지 3 그램를 포함하는 세포 물질을 생산하는 핵산 감소 공정이 포함된다. 특정 비제한적인 구현예에서, 세포 단리물의 단백질 당량 비율 (PER)은 1 이상이다. 특정 비제한적인 구현예에서, 중량%의 견지에서 세포 단리물의 조성은 65% 내지 85% 이상의 단백질; 0.5% 내지 9% 핵산; 7% 내지 15% 지질; 1% 내지 5% 회분; 및 5%내지 20% 탄수화물 및/또는 기타 N-유리, 비-지질 유기물이다.
특정 구현예에서, 세포는 프로테아제를 불활성화하고 이들이 단백질 분해를 정지시키는 온도에 놓이지만, 이는 여전히 RNase (RNA-소화 효소)가 리보좀 RNA를 분해하도록 허용한다. 이러한 특정 구현예에서, 이 온도는 적어도 약 64℃이다. 이러한 특정 구현예에서, 이러한 RNA 소화의 작은 산물은 세포벽을 통해 배양액으로 확산되어 최종 SCP 산물로부터 제거된다. 이러한 특정 구현예에서, 이러한 RNA 제거 단계는 생물반응기와 유체 연결되는 RNA 감소 용기에서 발생한다. 이러한 특정 구현예에서, 배양물은 생물반응기로부터 연속적으로 수확된다. 이러한 특정 구현예에서, RNA 함량이 감소된 이후에, 세포 매스는 대부분의 액체가 진공에 의해 제거되는 큰 이동 필터를 거쳐 퍼진다. 이러한 특정 구현예에서, 이것은 고 단백질 물질의 얇은 시트, 예를 들면 핵산 함량이 낮은 고 단백질 물질의 얇은 시트를 남긴다.
본원에서의 특정 구현예의 세포 단리물은 세포를 파열하고 세포벽 잔류물을 제거하는 단계를 수반하는 공정에 의해 제조될 수 있다. 이러한 특정 구현예에서, 이러한 세포 파열은 알칼리 배지에서 수행된다. 특정 구현예에서, 핵산 함량의 감소는 단편이 단백질로부터 멀리 세포로부터 확산될 수 있는 크기의 단편으로 세포 내의 핵산을 가수분해함으로써 달성될 수 있다.
효모를 포함하는 다수의 상이한 미생물에 존재하는 핵산분해 효소가 핵산 분자를 작은 단편으로 가수분해하거나 분해하는 것으로 알려져있다. 효소적 방법에 의한 핵산의 가수분해는 pH 및 온도의 견지에서 화학적 가수분해 방법의 경우에 일반적으로 필요한 것보다 훨씬 더 완만한 조건의 사용을 허용하며, 여기서 pH는 7에 근접하고, 온도는 주변 온도에 더 근접하여 더 완만하다. 특정 구현예에서, 완만한 조건은 산 또는 알칼리 저항성 장비에 대한 필요성을 생략한다. 특정 구현예에서, 비슷한 화학적 가수분해 방법보다 단백질의 영양적 품질을 더 잘 보존하는 효소적 공정 및 완만한 조건이 이용된다. 핵산 분해효소의 여러 공급원은 문헌에 기술되어 왔다. 본원에서의 특정 구현예는 당업자에게 공지된 핵산 중합체의 가수분해를 위한 핵산 분해효소(들)를 이용한다. 특정 구현예에서, 이러한 핵산 분해효소(들)는 아미노산 및/또는 작은 펩티드가 가수분해된 핵산과 함께 세포로부터 공동-확산함으로써 단백질 회수의 감소를 초래할 수 있는 프로테아제와 같은 이차 효소 시스템이 없다. 특정 구현예에서, 핵산 분해효소 제조물은 핵산 감소 공정으로부터 유래된 산물에 바람직하지 않은 선호를 제공하지 않는다. 특정 구현예에서, 사용된 핵산 분해효소 제조물은 시판되어 입수가능하다. 특정 구현예에서, 핵산 분해효소는 식품 등급이다. 특정 구현예에서, 효모로부터의 핵산 분해효소는 핵산 분자를 작은 단편으로 분해하는데 사용된다. 특정 구현예에서, 내인성 및/또는 외인성 핵산 분해효소는 핵산 분자를 작은 단편으로 분해하는데 사용된다.
일부 구현예에서, 단백질 단리물을 제조하는 방법으로서, 내인성 핵산 분해효소가 핵산을 가수분해하는데 사용되어 핵산 단편이 예로 단백질의 침전에 의해 단백질로부터 분리될 수 있는, 방법이 제공된다. 또한 세포내 핵산의 가수분해가 자가-함유된 및/또는 내인성 핵산 분해효소를 활성화하여 불용성 핵산 중합체를 가용성 핵산으로 전환하는 다단계 가열 공정에 의해 달성될 수 있음이 당해 기술분야에 공지되어 있다. 특정 구현예에서, 다단계 가열 공정은 자가-함유된 및/또는 내인성 핵산 분해효소를 활성화하여 불용성 핵산 중합체를 가용성 핵산으로 전환하는데 사용된다. 특정 구현예에서, 세포 용균물은 가용성 세포 부분에 포함된 내인성 핵산 분해효소가 세포에 존재하는 핵산을 가용성 형태로 분해하는 방식으로 배양된다.
핵산은 또한 세포를 외부의 핵산 분해효소에 노출시킴으로써 가수분해될 수 있다. 특정 구현예에서, 세포 및/또는 세포 용균물은 외부의 (외인성) 핵산 분해효소에 노출된다.
핵산 분해효소는 특정 pH 이상에서 가용성 분획 내에 추출가능한 것으로 알려져 있다. 특정 구현예에서, 핵산 분해효소는 pH 4 이상에서 가용성이다. 특정 구현예에서, 핵산 분해효소는 pH 5.5 이상에서 가용성이다. 특정 구현예에서, 핵산 분해효소 추출을 위한 pH는 적절한 가용성 핵산 분해효소 수율에서 최소의 알칼리 첨가 및/또는 염 함량에 대해 최적화된다. 특정 구현예에서, 핵산 분해효소는 이것이 가용성이지만 불활성인 pH에서 추출되고, 이의 활성이 요구되고, pH가 저하되어 핵산 분해효소 활성을 회복되는 시점까지 불활성 상태로 유지된다.
특정 구현예에서, 세포 균주는 증가된 핵산 분해효소 활성을 위해 개선되고/거나 조작된다. 특정 구현예에서, 세포의 핵산 분해효소 함량은 유전적 및/또는 환경적 조작에 의해 증가된다. 특정 구현예에서, 균주는 RNA를 적절하게 감소시키도록 내인성 핵산 분해효소를 초과하는 추가적인 핵산 분해효소를 필요로 한다. 특정 구현예에서, 이러한 추가적인 핵산 분해효소는 외부 공급원으로부터 및/또는 증가된 내부 핵산 분해효소를 위한 균주의 선택적인 개발에 의해 제공된다.
핵산 분해효소는 일반적으로 최대 응집체 활성 (예로, 활성 효소의 수로 곱한 개별 활성 효소 당 전환율)을 위한 최적의 pH 및 온도를 갖는 것으로 알려져 있다. 반응 속도는 온도에 따라 증가하지만, 불활성화된 효소의 분율도 역시 일반적으로 온도가 증가함에 따라 증가한다. 이들 두 가지 상반되는 효과는 일반적으로 효소가 특정 온도 범위 내에서 최대의 활성을 나타내는 결과를 가져온다. 특정 구현예에서, 이러한 최적도는 당업자에게 공지된 표준 실험 방법에 따라 확인되고 사용된다.
특정 구현예에서, 핵산 분해효소에 의한 RNA 분해를 위한 배양 시간이 최적화된다.
핵산 중합체 및 단백질은 특정 pH 이하에서 공동-침전되어 핵단백질 혼합물을 생산하는 것으로 알려져있다. 특정 구현예에서, 용균물이 노출되는 pH는 핵단백질 혼합물의 형성을 피하도록 이러한 pH 이상으로 유지된다.
Chargaff, Vol. I, The Nucleic Acids는 1 N HCl의 작용에 의해 100℃에서 1시간 동안, 또는 0.1 N NaOH의 작용에 의해 100℃에서 리보핵산 (RNA)이 가수분해될 수 있는 점을 진술하고 있다. 특정 구현예에서, 세포 파열에 의해 방출된 미생물 세포질 성분에 산성 또는 알칼리 조건을 적용하면 핵산의 가수분해를 유도한다. 특정 구현예에서, HCl 또는 NaOH가 RNA의 가수분해에 사용된다. 특정 비제한적인 구현예에서, RNA는 약 1시간 동안 약 100℃에서 약 1 N HCl 또는 약 0.1 N NaOH를 사용하여 가수분해된다.
특정 구현예에서, 핵산 중합체의 가수분해 이후, 두 개의 분획이 획득되는데, 하나의 분획은 감소된 핵산 함량을 포함하는 고체를 포함하고, 나머지 분획은 용해된 핵산 단편 및 다른 확산가능한 물질을 포함하는 주변 배지이다. 특정 구현예에서, 단백질은 가수분해된 용해된 핵산으로부터 분리되도록 불용성이 된다. 특정 구현예에서, 불용성 단백질 분획은 가용성 핵산을 포함하는 분획으로부터 분리된다. 특정 구현예에서, pH, 시간, 온도 및/또는 농도를 포함하나 이에 한정되지 않는 반응 조건은 핵산의 낮은 함량 및 허용가능한 단백질 수율을 갖는 단백질 산물을 회수하도록 최적화되고/거나, 허용가능한 핵산 함량에서의 단백질 수율을 최대화하도록 최적화된다. 특정 구현예는 또한 핵산 함량이 낮고 세포벽 잔재물이 없는 단백질을 제조하는 방법을 포함한다. 이러한 특정 구현예에서, 내인성 핵산 분해효소를 포함하나 이에 한정되지 않는 핵산 분해효소는 핵산을 용해하는데 사용된다. 도 22에 제공된 도면은 이러한 특정한 관점의 공정 구현예의 블록도이다.
단백질 가수분해물 및 이들의 용도
가수분해물은 세포 배양에 대한 보충제로서 생명공학 산업에서 사용되어 왔다 [M. S. Ummadi and M. Curic-Bawden (2010) "Use of protein hydrolysates in industrial starter culture fermentations," in Protein Hydrolysates in Biotechnology, V. K. Pasupuleti and A. L. Demain, Eds. Springer Netherlands, pp. 91-114 (http://dx.doi.org/10.1007/978-1-4020-6674-0_6)]. 본 발명의 특정 구현예는 다른 산업적 발효 및 공정에서 급식 원료 또는 영양분 공급원으로서 사용되는, 본원에 기술된 바와 같이 생산된 미생물 가수분해물에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같이 생산된 가수분해물은 세포 배양물에서 보충제로서 사용된다.
단백질 가수분해물은 이의 소비가 아미노산이 미가공 단백질보다 신속하게 신체에 흡수되도록 허용하여 근육 조직에 영양분 전달을 최대화하기 때문에 스포츠 의약에서의 특별한 적용이 발견되었다 [Manninen, Anssi H. (2004) "Protein Hydrolysates In Sports And Exercise: A Brief Review" Journal of Sports Science and Medicine 3: 60-63]. 본원에서 본 발명의 특정 구현예는 스포츠 의학에 적용되는 미생물 단백질 단리물 및/또는 가수분해물 및/또는 추출물에 관한 것이며, 특정 비제한적인 구현예에서, 상기 단리물 및/또는 가수분해물 및/또는 추출물의 소비는 아미노산이 미가공 단백질보다 신속하게 신체에 흡수되도록 허용하여 근육 조직에 영양분 전달을 최대화한다. 특정 구현예에서, 가수분해물 및/또는 단리물 및/또는 추출물은 항산화제 및/또는 L-아스파라긴산 및/또는 망간 및/또는 셀레늄이 풍부하다. 특정 구현예는 개 또는 말과 같은 포유동물을 위한 식품을 포함하나 이에 한정되지 않는 애완동물 사료에서의 미생물 단백질 단리물 및/또는 가수분해물 및/또는 추출물의 사용에 관한 것이다.
본원에 기술된 유기 효소 추출물 및/또는 가수분해물을 농작물에 적용하는 방법은 예를 들면 토양에 직접적으로 또는 잎을 통해 또는 관비에 의한 적용과 같은 임의의 통상적인 기법에 의해 수행 될 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 방법에 따라 생산된 가수분해물 바이오자극제의 적용은 상기 바이오 자극제를 투여받는 식물의 일차 및/또는 이차 대사의 변형을 유도한다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 방법에 따라 생산된 가수분해물 바이오자극제의 적용은 상기 바이오 자극제를 투여받은 식물에서 이에 한정되지 않지만 카로티노이드, 폴리페놀 및/또는 플라보노이드와 같은 항산화제 화합물의 생산 및 축적을 자극한다. 아미노산 및 펩티드에 추가하여, 본원에 기술된 특정 구현예에 따라 제조된 가수분해물은 지방, 지질, 비타민, 탄수화물, 페놀, 미네랄 원소, 식물 호르몬, 폴리아민 및 기타 유기 화합물을 포함하는, 바이오자극제 작용에 기여할 수 있는 다른 화합물을 포함한다.
또한, 본원에 기술된 가수분해물은 대안적으로 안정화를 위한 농축 및/또는 분리의 추가 단계를 거칠 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 방법은 가수분해 이후에 가수분해물을 농축하여 농축된 가수분해물을 획득하는 추가 단계를 포함한다. 특정 구현예에서 농축된 가수분해물은 건조물의 적어도 40 중량%, 다른 구현예에서는 건조물의 적어도 50 중량%, 다른 구현예에서는 건조물의 50 내지 55 중량% 이상을 갖는다. 이러한 농도는 당해 기술분야에 공지된 임의의 통상적인 방법에 의해, 예를 들면 가열함으로써 및 항온 수조 또는 역삼투를 갖는 회전 증발기 또는 임의의 다른 적합한 장치를 사용함으로써 달성될 수 있다.
또 다른 특정 구현예에서, 상기 방법은 단백질 가수분해에 이어지는 추가 단계(들)를 포함하고, 여기서 가수분해 이후에 획득된 단백질 가수분해물은 분리에 착수되어 (i) 가용성 가수분해물 분획 및 (ii) 고체상, 불용성 가수분해 분획을 획득한다. 이러한 분리는 당해 기술분야에 공지된 임의의 통상적인 고체-액체 분리 방법, 예를 들면 데칸 터 또는 기타 적합한 산업적 장비를 이용한 여과 또는 원심분리과 같은 방법에 의해 시행될 수 있다. 본원에 기술된 방법의 다양한 구현예에서, 가수분해물을 제형화하는 것은 가수분해물의 액체 및 고체 분획물 둘 다를 수집하는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 가수분해물은 바이오자극제 및/또는 비료로서 그대로 적용될 수 있다. 예를 들면, 가수분해물을 제형화하는 것은 단순히 가수분해물의 모든 분획을 수집하여 가수분해물의 조합된 액체 또는 고체 분획을 작물에 식물 바이오자극제 및/또는 비료로서 적용하는 것을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 가수분해물을 제형화하는 것은 가수분해물의 액체 및 고체 분획을 분리하고 식물 바이오자극제 및/또는 비료로서 액체 분획 및/또는 고체 분획을 보유하는 것을 포함한다. 다른 구현예에서, 가수분해물은 옆면 및 토양 적용을 위한 가용성 및 불용성 분획으로 각각 분리될 수 있다. 특정 구현예에서, 가용성 가수분해물 분획은 실제적으로 가수분해된 출발 단백질 모두를 포함하고, 특정 구현예에서는 90 중량%를 초과한다. 특정 구현예에서, 불용성 분획은 수분 또는 증기 처리의 존재 시 가열의 작용을 통해 감소된다.
특정 구현예에서, 가용성 가수분해물 분획은 농업 및 축산의 목적에 적합한 조성물, 보다 구체적으로 저분자량을 갖는 유리 아미노산, 올리고펩티드 및 펩티드의 특별한 조성이 주어지면 유기 경작에서의 바이오자극제 및/또는 바이오비료로서의 조성물이 제공된다.
특정 구현예에서, 가수분해물은 또한 동물 사료, 보다 구체적으로는 가축 (소, 양, 염소 등)의 동물 사료 또는 양식 또는 곤충 (예로, 벌) 또는 다른 무척추 동물 (예로, 벌레) 또는 종속영양성 미생물 (예로, 효모, 대장균) 또는 애완 동물 또는 반려 동물 또는 직접적인 인간 소비를 위해 고부가가치를 갖는 영양적 첨가물로서 사용될 수 있다.
선택적으로, 가용성 가수분해물 분획은 추가의 농축을 거칠 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 기술된 바와 같은 액체-고체 분리에 이어서, 가용성 가수분해물 분획은 농축된 가용성 가수분해물 분획을 획득하기 위하여 추가의 농축 단계에 착수된다. 특정 구현예에서 농축된 가용성 가수분해물 분획은 건조물의 적어도 40 중량%, 특정 구현예에서 및 다른 구현예에서는 건조물의 적어도 50 중량%, 또는 건조물의 50 내지 55 중량% 이상을 갖는다. 이러한 농도는 당해 기술분야에 공지된 임의의 통상적인 방법에 의해, 예를 들면 가열 및 항온 수조 또는 역삼투를 갖는 회전 증발기 또는 임의의 다른 적합한 장치를 사용한 진공에 의해 수행될 수 있다. 특정 구현예의 농축된 가용성 가수분해물은 이를 농업 및 축산의 목적에 적합하게 만드는 조성물 갖고, 구체적으로 특정 구현예에서, 이것은 유기 경작에서, 아미노산, 올리고펩티드 및 저분자량을 갖는 펩티드의 특별한 조성이 주어지면 바이오자극제로서 및/또는 바이오비료로서 사용될 수 있고, 이는 식물 및/또는 토양 유기체에 의한 이들 분자의 흡수를 가능하게 한다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 단백질 가수분해물 또는 유기 추출물은 N2 고정화, P 가용화 및 인돌 아세트산 생산 세균와 같은 바람직한, 자연 발생하는 토양 미생물을 자극한다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 방법에 따라 생산된 아미노산은 식물 미세영양분에 대한 킬레이팅 효과를 갖는다. 특정 구현예에서, 농축된 가용성 가수분해물은 곰팡이 (예로, 버섯)의 성장을 위한 영양분 또는 보충제로서 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 이것은 또한 동물 사료, 보다 구체적으로는 가축 (소, 양, 염소 등)의 동물 사료 또는 양식 (예로, 어류, 패류) 또는 곤충 (예로, 벌) 또는 다른 무척추 동물 (예로, 레드웜) 또는 종속영양성 미생물 (예로, 효모, 대장균) 또는 애완 동물 또는 반려 동물 또는 직접적인 인간 영양 공급을 위한 영양적 첨가물로서 사용될 수 있다.
식물 바이오자극제 및 비료
상기 기술된 바와 같이 획득된 가수분해물의 고체 분획은 고체 형태로 또는 수용성 배지와 같은 적합한 용매에 재용해시킨 이후에 식물 바이오자극제 및/또는 비료로서 작물에 적용될 수 있다. 특정 구현예에서, 가수분해물의 불용성 분획은 최종 건조화 공정을 거쳐 수분 함량 10 내지15 중량% 이하를 갖는 페이스트 또는 분말 형태의 고체를 획득할 수 있다. 이러한 건조화 공정은 예를 들면 열풍 순환 오븐을 사용하거나, 냉동 건조화에 의한 것과 같은 임의의 통상적인 방법에 의해 수행될 수 있다. 건조된 또는 미건조된 가용성 가수분해물은 동물 사료, 보다 구체적으로는 가축 (소, 양, 염소 등)의 동물 사료 또는 양식 (예로, 어류, 패류) 또는 곤충 (예로, 벌) 또는 다른 무척추 동물 (예로, 레드웜) 또는 종속영양성 미생물 (예로, 효모, 대장균) 또는 애완 동물 또는 반려 동물 또는 직접적인 인간 소비를 위해 고부가가치를 갖는 영양적 첨가물로서 사용될 수 있다.
특정 비제한적인 구현예에서, 가수분해물의 고체 분획은 과립화되고, 고체 분획을 과립화하는 것은 사료 펠렛화기, 핀 혼합기, 디스크 펠렛화기, 드럼 펠렛화기 및 압축 과립화기로부터 선택된 장치를 사용하는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 고체 분획을 과립화하는 것은 약 0.25 mm 내지 약 5 mm의 크기를 갖는 과립을 획득하는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 고체 분획은 수용성 배지에 분산되거나 용해된다.
과립화된 산물은 농작물에 그대로 적용하거나, 용매를 첨가하여 액체로 재구성한 다음 작물에 적용될 수 있다. 특정 구현예에서, 가수분해물을 제형화하는 것은 가수분해물의 액체 및 고체 분획 중 하나만을 수집하는 것을 포함한다. 예를 들면, 가수분해물을 제형화하는 것은 가수분해물을 고체 및 액체 분획으로 분리하고 이러한 분획 중 하나만을 보유하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 경우에, 액체 또는 고체 분획은 식물 바이오자극제 및/또는 비료로서 작물에 적용될 수 있다. 가수분해물을 제형화하는 것은 또한 가수분해물의 고체 분획 및 액체 분획 중 하나 및 나머지 분획의 일부만을 수집하는 것을 포함할 수 있다. 대안적으로, 가수분해물을 제형화하는 것은 가수분해물의 고체 분획 및 액체 분획 중 일부만을 수집하는 것을 포함할 수 있다.
본원에 기술된 방식으로 생산된 식물 바이오자극제는 아미노산-함유 식물 바이오자극제 및/또는 비료로서 카테고리화될 수 있다. 유기질 비료 또는 분뇨는 전통적으로 모든 식물 및 동물 재료를 포함하며 이들 비료의 가치 (바이오자극제 또는 바이오비료 관점을 무시함)는 주로 이들의 탄소 (C), 질소 (N), 인 (P) 및 칼륨 (K) 함량에 의존한다. 일반적인 유기질 비료는 어분, 가금류, 소 및 돼지 배설물, 면종자분, 볏짚 및 기타 농업 폐기 산물이 포함한다. 본원에서의 특정 구현예에서, 새로운 종류의 비-식물, 비-동물 기반의 유기질 비료가 유도된다. 특정 구현예에서, 유기질 비료는 추가적으로 바이오자극제 및/또는 바이오비료이다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 미생물 공정에서 생산된 영양분는 다중배양이 실행되는 연못을 비옥하게 하는데 사용된다. 특정 구현예에서, 영양분은 쌀을 포함하나 이에 한정되지 않는 식물 작물을 비옥하게 하는데 사용된다.
특정 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같이 획득된 가수분해물은 엽면 살포용 액체 산물 및/또는 토양 살포용 건조 산물로 제형화된다. 일부 비제한적인 구현예에서, 가수분해물을 제형화하는 것은 가수분해물을 킬레이팅하지 않고 및/또는 가수분해물로부터 아미노산을 분리하지 않고 제형화하는 것을 포함한다. 특정 비제한적인 구현예에서, 식물 바이오자극제는 건조물 기준으로 약 0.5 중량% 내지 약 15 중량%의 총 질소 함량 및/또는 약 2 중량% 내지 약 100 중량%의 총 고체 함량을 갖는다. 특정 구현예에서, 식물 바이오자극제의 pH는 약 2 내지 약 10이다.
특정 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같이 생산된 바이오자극제 및/또는 바이오비료 및/또는 가수분해물에 포함된 질소는 이 물질이 단백질, 핵산, 클로로필 등 중 하나 이상의 생산에 적용되는 식물에 의해 사용된다. 특정 구현예에서, 이러한 적용된 질소원은 식물 및/또는 곰팡이 및/또는 미생물의 대사적 활성을 증진한다.
특정 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같이 생산된 바이오자극제 및/또는 바이오비료 및/또는 가수분해물에 포함된 탄소는 토양 미생물에 의해 세포 매스를 생산하고/거나, 호흡을 위해 및/또는 N2를 고정하고/거나, 인산염의 용해화를 증진하고/거나, 인돌아세트산-생산하는 세균을 자극하는데 사용된다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같이 생산된 바이오자극제 및/또는 바이오비료 및/또는 가수분해물에 포함된 탄소는 토양에 격리되고/거나 토양의 탄소 함량을 증가시킨다. 이러한 구현예에서, CO2가 달리 대기로 방출하는 CO2 공급원으로부터 포획되거나, CO2가 대기로부터 포획되는 곳에서, 본원에 기술된 방법은 탄소가 토양 탄소로서 격리되는 탄소 포획 및 격리의 형태로 고려될 수 있다. 본원에서의 특정 구현예는 폐기 탄소 및 다른 원소의 가치있는 바이오매스 또는 용균물, 가수분해물, 단백질, 펩티드, 비타민 및/또는 아미노산과 같은 생체 기반의 산물로 지속가능한 전환을 나타낸다. 특정 구현예에서, 유입 탄소의 더 많은 분율이 퇴비로 유입된 유기 탄소의 전환보다 최종 비료 또는 바이오자극제 산물에 잔존한다. 특정 구현예에서, 유입 탄소의 절반 미만이 최종 비료 또는 바이오자극제 산물로의 전환 시 CO2방출로서 손실된다. 특정 구현예에서, 유입 탄소의 10% 미만이 최종 비료 또는 바이오자극제 산물로의 전환 시 CO2방출로서 손실된다.
특정 구현예에서, 본원에서의 방법은 획득된 식물 바이오자극제 및/또는 비료에 추가적인 성분을 혼합하는 것을 포함한다. 이러한 추가적인 성분은 가수분해 동안 및/또는 제형화 동안 및/또는 제형화 이후에 첨가될 수 있다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 방부제가 식물 바이오자극제에 첨가되고, 이는 시트르산, 벤조산, 프로필렌 글리콜, 프로피온산, 소르브산, 황산아연, 황산철, 황산구리 및 염화은으로부터 선택되는 적어도 하나의 구성원을 포함한다. 특정 구현예는 적어도 하나의 비료 또는 식물성 거대-영양분을 식물 바이오자극제에 첨가하는 것을 포함하고, 여기서 비료 또는 식물 거대-영양분은 질소, 칼륨, 인, 철, 구리, 아연, 붕소, 망간, 몰리브덴 및 마그네슘으로부터 선택되는 적어도 하나의 원소를 포함한다. 특정 구현예는 제초제, 살충제 및 살진균제로부터 선택되는 적어도 하나의 조성물을 식물 바이오자극제에 첨가하는 것을 포함하고, 여기서 적어도 하나의 조성물은 티오파네이트 메틸, 클로로탈로닐, 캡탄, 피페랄린, 페나리몰, 메타락실, 트리포린, 에톡시 티알디아졸, 파이레틴, 알지사이드, 오리잘린, 알드질아리폴리에톡시에탄올, 글리포세이트 및 나프탈렌으로부터 선택된다. 특정 다른 구현예는 제형물이 유기질 비료 및/또는 유기질 바이오자극제로 고려되고 유기질 비료 및/또는 바이오자극제가 적용되는 작물이 적절한 규제에 의해 유기농으로 재배된 것으로 고려되도록, 제초제, 살충제, 살진균제 또는 합성 비료를 제형물에 전혀 첨가하지 않는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 식물 바이오자극제를 작물에 적용하는 방법이 제공된다. 본원에서의 식물 바이오자극제 및/또는 비료가 적용될 수 있는 작물은 구체적으로 제한되지 않지만, 예시적인 작물은 식량 작물 및 관상용 작물을 포함할 수 있다. 예시적인 식량 작물은 과일, 채소, 괴경 및 곡물을 포함할 수 있다. 예시적인 관상용 작물은 잔디, 나무, 관목 및 꽃이 포함할 수 있다. 특정 구현예는 본원에 기술된 바와 같이 생산된 식물 바이오자극제를 작물에 적용하는 것을 포함하는, 작물을 처리하는 공정을 나타낸다. 특정 비제한적인 구현예는 본원에 기술된 바와 같이 생산된 식물 바이오자극제가 1,000 평방피트 당 약 0.001 내지 약 3.0 lb의 질소량으로 적용되는 공정을 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같이 생산된 식물 바이오자극제 및/또는 비료는 작물에 적용된다. 특정 구현예에서, 식물 바이오자극제 및/또는 비료를 작물에 적용하는 것은 식물 바이오자극제 및/또는 비료 및 제초제, 살충제 및 살진균제로부터 선택된 적어도 하나의 조성물을 작물에 적용하는 것을 포함한다. 다른 구현예에서, 식물 바이오자극제 및/또는 비료를 작물에 적용하는 것은 식물 바이오자극제 및/또는 비료를 적용하고, 임의의 합성 제초제, 살충제 및 살진균제를 작물에 적용하지 않는 것을 포함한다. 이러한 특정 구현예에서, 식물 바이오자극제 및/또는 비료를 작물에 적용하는 것은 적절한 규제에 따라 유기농 식품으로 자격을 얻는데 필요한 요구사항에 따라 작물을 재배하는 맥락에서 시행된다.
일부 구현예에서, 농산물 및/또는 소비자 산물 및/또는 공산물을 제조하는 방법으로서, 본원에 기술된 방법에 의해 식물 바이오자극제 및/또는 비료 및/또는 곰팡이 보충물을 제조하는 단계; 본원에 기술된 바와 같이 생산된 식물 바이오자극제 및/또는 비료 및/또는 곰팡이 보충물을 작물에 적용하는 단계; 및 농작물을 획득하도록 작물을 수확하는 단계; 및 특정 경우에 소비자 또는 공산물을 획득하도록 농산물을 가공하는 단계를 포함하는, 방법이 제공된다. 이러한 특정 구현예에서, 작물은 식용 작물이다. 이러한 특정 구현예에서, 식용 작물은 과일, 야채, 결절 및 곡물 중에서 선택된 적어도 하나를 포함한다. 농산물의 예는 브로콜리, 콜리플라워, 글로브 아티초크, 완두콩, 콩, 케일, 콜라드그린, 시금치, 아루 굴라, 비트 그린, 보크쵸이, 샤드, 초이섬, 순무 그린, 상추, 양상추, 겨자, 그린, 워터크레스, 마늘파, 가이란, 부추, 양배추 새싹, 케이퍼, 콜라비, 셀러리, 대황, 카돈, 중국 셀러리, 레몬그라스, 아스파라거스, 죽순, 갈란갈, 생강, 대두, 녹두, 우라드, 당근, 비트, 래디쉬, 무우, 순무, 우엉, 양파, 샐루트, 부추, 마늘, 강낭콩, 렌즈 콩 및 눈콩과 같은 채소류; 토마토, 오이, 스쿼시, 주키니, 호박, 멜론, 고추, 가지, 토마토, 크리스토펜, 오크라, 빵과일, 아보카도, 블랙 커런트, 레드 커런트, 구스베리, 구아바, 루쿠마, 칠리 페퍼, 석류, 키위, 포도, 크랜베리, 블루베리, 오렌지, 레몬, 라임, 자몽, 블랙베리, 라즈베리, 보이젠베리, 파인애플, 무화과, 멀베리, 헤지애플, 사과, 로즈힙 및 딸기와 같은 과일류; 아몬드, 피칸, 호두, 브라질 너트, 캔들너트, 캐슈너트, 제비나 너트, 말-밤, 마카다미아 너트, 말라바 밤, 몽곤고, 땅콩, 파인너트 및 피스타치오와 같은 견과류; 감자, 고구마, 카사바, 참마 및 달리아와 같은 괴경; 옥수수, 쌀, 밀, 보리, 수수, 기장, 귀리, 호밀, 삼백초, 포니오, 메밀 및 퀴노아와 같은 곡류 또는 곡물을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 다른 구현예에서, 작물은 관상용 작물이다. 이러한 특정 구현예에서, 관상용 작물은 잔디, 나무, 관목 및 꽃으로부터 선택된 하나 이상의 구성원을 포함한다. 다른 구현예에서, 작물은 버섯 또는 곰팡이이다. 곰팡이 작물의 예는 Agaricus bisporus (버튼, 크리미니 및 포르트벨라), Coprinus quadrifidus, Lepista nuda 및 Pleurotus ostreatus (굴 버섯)를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 단백질 가수분해물은 버섯 또는 곰팡이에 적용된다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 전체 세포 바이오매스 (예로, 비용해된 세포)는 세균를 용해하고 소비하는 능력을 갖는 버섯 또는 곰팡이에 급식된다. 이러한 특정 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같이 생산된 세균 세포를 용해하고 소비하는 버섯은 Agaricus bisporus, Coprinus quadrifidus, Lepista nuda 및 Pleurotus ostreatus 중 하나 이상을 포함한다.
버섯이 수확되기 직전에 자외선 노출은 FDA 일 허용치의 두 배 이상의 비타민 D2 함량, 예로 비타민 D의 채식 공급원을 만들 수 있는 것으로 알려져 있다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같이 생산된 버섯은 자외선에 노출되어 높은 비타민 D2 함량의 결과를 가져온다.
특정 구현예에서, 산물, 작물 또는 다른 식물의 수율을 증가시키는 방법이 제공된다. 특정 구현예에서, 산물, 작물 또는 다른 식물의 수확량은 동일한 조건 하에서 자라지만 바이오자극제를 적용하지 않은 동일한 유형의 식물과 비교하여 본원에 기술된 바와 같이 생산된 바이오자극제 또는 비료를 받는 식물의 성장 계절에 걸쳐 적어도 5%, 또는 적어도 10%, 또는 적어도 40%로 증가된다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같이 생산된 비료 및/또는 바이오자극제의 사용은 작물 수확량을 성장 계절에 걸쳐 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% 또는 55% 또는 55% 이상으로 증가시킨다.
본원에서의 특정 구현예는 이에 한정되지 않지만 우레아 질산염, 질산 암모늄, 질산 칼슘 암모늄 및/또는 다른 질산염 또는 암모늄 비료와 같은 통상적인 화학적 질소 비료의 사용에서 감소 또는 제거를 가능하게 한다. 특정 비제한적인 구현예에서, 이러한 통상적인 화학적 질소 비료의 사용은 본원에 기술된 바와 같이 생산된 비료 및/또는 바이오자극제의 적용을 통하여 산물, 작물 또는 다른 식물의 동일한 수확량을 유지하면서, 감소되거나 제거될 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 비료 및/또는 바이오자극제의 적용은 적어도 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50%로 통상적인 화학적 질소 비료의 감소를 동반할 수 있다. 이러한 특정 구현예에서, 통상적인 화학적 질소 비료의 감소는 50% 이상 또는 최대 100% (예로, 완벽하게 제거됨)일 수 있다.
특정 구현예에서, 본원에 기술된 조성물은 토양 유기물을 두 배 이상으로 배가할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 본원에 기술된 조성물은 토양 유기물을 최대 약 140% 또는 약 150% 이상으로 증가시킬 수 있다. 다른 구현예에서, 이것은 토양 유기물의 초기 수준에 따라 토양 유기물을 약 40% 내지 약 150%로 증가시킬 수 있다.
식용 산물
소비자 산물의 예는 감자칩, 옥수수칩, 잼, 젤리, 아침 시리얼, 빵, 쿠키, 케이크, 크래커, 밀가루, 단백질 분말, 단백질 바, 스포츠 및/또는 에너지 음료, 단백질 쉐이크 및/또는 스무디와 같은 가공된 식품, 동물 사료, 애완 동물 사료 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본원에 가술된 바와 같은 농산물을 이러한 소비자 산물로 가공하는 능력은 당업자의 능력에 속한다.
일부 구현예에서, 영양적 산물 및/또는 식품 성분 및/또는 식품을 제조하는 방법이 제공된다. 특정 구현예에서, 고 단백질 및/또는 고 비타민 성분은 본원에 기술된 미생물 세포로부터 유래된다. 특정 구현예에서, 상기 산물에는 동물성 단백질 또는 지방이 없다. 특정 구현예에서, 고 단백질 및/또는 고 비타민 성분은 유제품, 유제품 대체 산물, 육류, 육류 대체물 및/또는 인조 육류, 제빵 산물, 과자, 건강 및 단백질 바, 단백질 분말, 스포츠 및/또는 에너지 음료 및/또는 단백질 쉐이크 및/또는 스무디를 포함하나 이에 한정되지 않는 식용 산물 내로의 도입된다. 특정 구현예에서, 고 단백질 및/또는 고 비타민 성분은 육류 및/또는 인조 육류로의 도입을 위한 텍스쳐를 갖는다. 특정 구현예에서, 고 단백질 성분은 쇠고기 패티의 고기 증얄제로서 사용될 수 있다.
특정 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 미생물 세포 및/또는 유기물은 채식주의 또는 식물성 식품의 생산에 이용된다. 특정 구현예에서, 이들은 유기농 식품 및/또는 무-살충제 및/또는 무-제초제 및/또는 무-항진균제 및/또는 무-항생제 및/또는 유전적으로 변형되지 않은 (비-GMO) 식품의 생산에 이용된다. 특정 구현예에서, 이들은 지역적으로 생산된 식품에서 이용된다. 특정 구현예에서, 이들은 프로바이오틱 식품 또는 프리바이오틱 식품 또는 영양적 산물에 이용된다.
특정 비제한적인 구현예에서, 단백질 가수분해는 수행되지 않는다. 이들 비제한적인 구현예에서, 저온 살균, 비교적 전체 단백질 및/또는 방부제 첨가의 조합은, 버섯 성장 증진제로서 적용될 때 지연된 영양분 방출 성질 및/또는 경쟁 미생물을 방해하는 성질 및/또는 버섯 기질에서 바람직하지 않은 온도 상승을 방지하는 성질을 나타내는 버섯 성장 산물을 제공한다.
본 발명은 이의 적용에서 상세한 설명에 기술되거나 도면에 예시된 구성 요소의 구성 및 배열의 세부 사항에 제한되지 않는다. 본 발명은 다른 구현예가 가능하고 다양한 방식으로 실행되거나 수행될 수 있다. 또한, 본원에 사용된 어구 및 용어는 설명의 목적을 위한 것이며, 제한적으로 간주되어서는 안된다. 본원에서 "포함하는 (including)", "포함하는 (comprising)" 또는 "갖는", "포함하는 (containing)", "수반하는" 및 이의 변형의 사용은 이후에 열거된 항목 및 이들의 등가물뿐만 아니라 추가적인 항목을 포괄하도록 의미한다.
본 발명은 다음의 실시예에 의해 추가로 설명되며, 이는 결코 더 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 출원 전체에 걸쳐 인용된 모든 참고문헌 (참고 문헌, 발행된 특허, 공개된 특허출원 및 계류 중인 특허출원 포함)의 전체 내용은 본원에 참고문헌으로, 특히 본원에 상기 언급된 교시의 경우 명시적으로 통합된다. 그러나, 모든 참고문헌의 인용이 해당 참조문헌이 선행 기술임을 인정하도록 의도하지는 않는다.
본 발명의 다른 특징은 다음의 실시예에 대한 설명의 과정에서 자명해질 것이다. 다음의 구현예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명을 제한하려는 것은 아니다.
실시예
실시예 1
Cupriavidus necator 균주 DSM 531는 성장을 위한 유일한 에너지원 및 탄소원으로서 H2 및 CO2 및 O2 가스의 혼합물 상에서 배양되었다.
다음의 프로토콜은 가스 밀착 혈청병에서 가스의 혼합물을 사용하여 수행된 실험을 위해 진행되었다.
실험 접종물: 또 다른 H2 재배된 혈청병 배양액으로부터 채취한 부피로 5%.
초기 H2 재배된 혈청병 배양액에는 용원성 배양액 (LB) 재배된 Cupriavidus necator 접종물로부터의 5% 접종이 순서대로 주어졌고, 원래의 LB 배양으로부터의 접종 이후에 H2/CO2/O2 가스 믹스 상에서 ~ 약 72시간 배양되었다. 원래의 LB 배양 접종물은 -80°C에 보관된 글리세롤 원액으로부터 회수되었다.
가스 상에서 혈청병 성장은 160 mL의 마개가 있고 밀봉된 휘튼 유리 혈청병 (VWR 제품번호 16171-385)에서 수행되었다. 액체 배지의 부피는 20 mL이었다. 병은 휘튼 수동 크림퍼 (VWR # 80078-996)를 사용하여 고무 마개 (VWR # 100483-774) 및 알루미늄 밀봉 (VWR # 89047-008)으로 막았다. Thermophilic Bacteria, CRC Press, Boca Raton, FL, Jacob K. Kristjansson, ed., 1992, p.87, 표 4 + 1 mL 접종물 (즉, 5% 접종물)에 기술된 바와 같이, 20 mL 작업 부피는 19 mL의 최소염 배지 (MSM)를 포함하였다.
MSM을 병에 분배하고 가스성 화합물을 다음과 같이 첨가하였다: 멸균 MSM을 무균 조건 하에서 병 내으로 이동시켰다. 5% 가스 배양된 접종물을 무균 조건 하에 병에 접종하고, 병을 고무 마개로 막고 밀봉하였다. 가스 혼합물을 15 psig에서 배분기를 통해 병에 첨가하였다. 가스 믹스를 첨가한 이후, 밀봉을 알루미늄으로 크림핑하여 혈청병을 밀봉하였다. 다음으로, 병을 진탕 플라스크 배양기에 두었다.
다음의 실험 결과는 30℃, 250 RPM에서 배양된 16개의 혈청병 (14개 실험 사본, 2개 대조군)으로부터 얻었다. 모두 16개의 혈청병은 상기에서 기술한 바와 같이 배분기를 사용하여 67% H2, 24% 공기 (4.8% O2), 9% CO2 가스 믹스와 동시에 퍼지되었다. 배분기를 관통하는 가스 조성물은 혈청병을 연결하기 전에 가스 크로마토 그래피 (GC)를 사용하여 검증되었다. 병은 7개의 시점에서 분석을 위해 소비되었다. 2개의 음성 대조군은 각각 T0 및 마지막 시점에서 소비되었다. 음성 대조군 병은 실험 병에서 접종물을 뺀 실험 병과 동일한 준비물이었고, 병 상부공간으로부터 임의의 오염 및/또는 비생물적 손실 또는 가스의 누출을 검출하는 데 사용되었다. 가스 상부공간 압력 판독 시료는 액체 배지로의 임의의 비생물적 CO2 및 H2 흡착 및/또는 누출로 인한 가스 손실을 관찰하도록 음성 대조군에서 채취되었다.
시료화 및 분석 절차
모든 시료는 병 실험을 위해 주사기와 바늘을 사용하여 무균 조건 하에서 채취되었다. 광학 밀도 (OD)는 Beckman Coulter DU720 UV/Vis 분광광도계를 이용하여 650 ㎚에서 100 uL 시료을 사용하여 측정되었다.
각각의 시점에서 1 내지 3개의 실험 사본 병이 분석을 위해 소비되었다. 혈청병 내의 가스 소비는 바늘에 연결된 압력 게이지를 사용하여 측정되었다. 상부공간 가스 압력은 각각의 소비된 병에 대해 측정되었고, 상부공간 가스의 시료는 가스 크로마토 그래피 (GC) 분석을 위한 가스 밀착 주사기에 의해 채취되었다. GC에 의한 가스 상부공간 시료의 분석은 가스 밀착 주사기를 통해 GC에 주입된 상부공간 가스의 100 uL 시료을 사용하였다. 혈청병 내의 H2, CO2, O2 및 N2의 가스 상부공간 함량을 각 시점에서 정량화하였다. 배양액을 시료화하기 위해, 혈청병의 격막을 EtOH로 닦아내고, 병의 전체 액체 함량을 병 압력을 사용하여 30 mL 주사기로 회수하였다. 650 μM에서 OD 측정을 위해 100 μL의 시료를 피펫으로 얻었다. 시료는 12,000 G로 15분 동안 4℃에서 원심분리하였다. 펠렛은 10 mL 멸균 PBS에 재현탁하였고, 볼텍싱하여 사전 측정된 0.45m 필터를 통해 진공 여과하였다. 필터는 건조시키고 필터 + 바이오매스 보유물의 중량을 측정하여 바이오매스 건조 중량을 결정하였다. 건조 중량은 막 필터 (0.45 m) 상에서 수집된 세포에 대해 24시간 동안 60°C에서 건조하고, 데시케이터에서 실온으로 냉각시키며 계량함으로써 결정되었다. 이러한 건조 및 재계량 순환은 중량이 일정하게 유지될 때까지 계속되었다. OD 및 바이오매스 밀도 (부피 당 건식 세포 중량) 간의 상관 관계가 개발되었다.
OD 및 바이오매스 밀도 간의 상관 관계는 도 1에 나타낸다. 이러한 실험의 성장 곡선은 도 2에 나타낸다. 개별 실험 사본에 대해 측정된 OD는 다이아몬드 기호로 나타내고, 평균 OD는 실선으로 표시된다. 지수적 성장은 9시간 내지 30시간 사이에 일어났다. 성장하는 배양물에 의한 가스 소비로 인해 시간 경과 시 상부공간 가스 압력이 변화하는 것을 도 3에 나타낸다.
상부공간 가스에 대해 이상 가스 법칙 (PV = nRT)을 가정하면, 시료 시점에서의 온도 변화를 설명하는 총 가스 몰수가 계산되었다. 각각의 병의 상부공간에서 각각의 가스의 비율은 GC에 의해 측정되었다. 가스 상부공간 결과 및 측정된 건조 중량을 사용하여, 소비된 H2 몰 대비 세포 중량의 비율이 결정되었다. 도 4는 각각의 병에 대한 상부공간 압력 측정 및 GC 분석에 의해 결정된 바와 같이, 소비된 각각의 병의 측정된 건조 바이오매스를 소비된 H2 몰에 대해 좌표화하여 나타낸다. 이들 결과는 소비된 H2 몰 당 7.2 내지 6.7 그램의 건조 세포 매스 또는 H2 그램 당 3.3 내지 3.6 그램의 세포 매스가 합성되는 것을 나타낸다.
실시예 2
Cupriavidus necator 균주 DSM 531는 성장을 위한 유일한 에너지원 및 탄소원으로서 H2, CO2 및 O2 가스의 혼합물 상에서 리터 당 38 그램의 건조 세포 밀도로 배양되었다.
다음의 프로토콜은 교반된 탱크 생물반응기에서 H2, CO2 및 O2를 포함하는 가스의 혼합물을 사용하여 수행된 실험을 위해 진행되었다.
장치: 배양은 PEEK 헤드플레이트를 갖는 맞춤-제작형 500 mL 유리 발효기를 사용하여 회분식으로 재배되었다. 온도 및 pH는 시판되는 제어기 (Electrolab, Fermac 360, 영국)로 조절되고 모니터링되었다. 280 mL/분으로 자기 교반 막대 및 연속적인 재순환의 조합을 혼합에 사용하였다. 재순환은 반응기의 바닥 액체 섹션으로부터 나와서 분무기를 통해 상부공간로 돌아가면서 거품을 조절하거나 역방향으로 전개되어 상부공간 가스 및 거품을 배양액의 바닥으로 재순환시킬 수 있었다. 가스 공급은 압축된 H2, 압축된 CO2 및 수용 공기로부터 이루어지며, 각각 20 psi로 조절되었다. H2 및 공기는 가스의 상대 분율을 설정하는 유동 분배기 (Matheson G2-4D151-E401/E401, 20 psi)로 전달되었다. 다음으로 H2/공기 가스 믹스는 가변 면적 유량계를 통해 각각의 발효기로 전달되었고, 동일한 H2/공기 조성물의 각각의 발효조로의 유동 속도는 유량계의 니들 밸브에 의해 조정될 수 있었다. CO2 가스는 분리되어 각각의 발효조의 개별 가변 면적 유량계로 전달되었다. CO2 및 H2/공기 라인은 발효기로 전달되는 단일 라인으로 연결된다. 압력 게이지는 발효기로의 가스 전달 압력을 모니터링하는데 사용되었다. 가스는 4개의 2 마이크론 확산 스톤 (p/n KEG592, http://morebeer.com/products/diffusion-stone-2-micron-oxygen.html)을 통해 발효기 배양액 내로 혼합되고, 콘덴서를 통해 반응기로부터 거품-오버플로 병으로, 다음으로 배기 시스템으로 배출되었다.
배지: 이러한 실험에 사용된 배지는 실시예 1에 기술된다. pH 조절은 2 N NH4OH 또는 2 N NaOH로 수행되었다. 2 N NH4OH는 5 M NH4OH, Fluke 318612 (4℃에서 유지) (120 mL)로부터 제조되었고, milliQ-H2O (180 mL)에서 고압멸균되었다.
독립영양성으로 제조된 접종물: Cupriavidus necator DSM 531 접종물은 H2/CO2/O2 재배된 혈청병 배양액으로부터 채취되었다. 혈청병의 접종물은 DSMZ 531 균주의 경우 -80°C에서 저장된 보존된 0.5 mL 글리세롤 원액으로부터 순서대로 준비되었다. 재생 배양은 살시예 1에 기술된 혈청병 프로토콜에 따라 가스 밀착 혈청병에서 20 mL 최소 염 배지 (MSM)에 0.5 mL 글리세롤 원액을 첨가하면서 H2/CO2/O2 가스 믹스 상에서 시작하였다. 다음으로 초기 혈청병을 H2/CO2/O2 가스 상부공간 하에 2개의 혈청병에 1 mL 내지 20 mL 신선한 MSM으로 계대 배양하였다. 이들 혈청병은 30°C, 250 RPM에서 배양되었다. 가스 상에서 글리세롤 원액으로부터의 초기 재생은 2일이 걸렸고, 계대배양은 하루가 더 걸려 성장하였다. 두 개의 혈청병 배양물은 생물반응기를 위한 접종물로서 제공되었다. 접종물의 광학 밀도 (OD)뿐만 아니라 DNA 분석을 위한 시료를 가져왔다. 가스 배양된 접종물은 OD ~ 1을 가졌다. 발효기는 접종되어 초기 OD ~ 0.1을 얻었다. 다른 말로 하면, 혈청병 배양액은 1 : 10의 비율로 생물반응기에서 희석되었다. 접종물은 60 mL 주사기를 사용하여 혈청병부터 생물반응기로 이동되었다. 접종 이후, T0 OD를 측정하였다. 일반적으로 모든 OD 측정은 Beckman Coulter DU720 UV/Vis 분광 광도계로 수행되었다.
발효기 작동:
염기 첨가 - pH는 2 N NH4OH로 조절되었다.
거품 조절 - 거품이 1/2 이상의 상부공간을 채우고, 상부공간 분무기 또는 재순환에 의해 조절되지 않으면, 다음으로 거품 방지제가 사용되었다. (A8011, Sigma Antifoam C Emulsion, http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a8011?lang=en&region=US)
영양염 수정 - NH4OH의 염기 첨가에 의해 제공된 질소 영양분에 추가하여, 전개 동안 다른 미네랄 영양분이 첨가되어 성장을 연장하고 임의의 미네랄 영양분 제한이 발생하는 것을 방지하였다.
도 5는 이러한 프로토콜에 따라 H2/CO2/O2 가스 기질 상에서 자란 크놀가스 미생물 Cupriavidus necator의 성장 곡선의 예를 나타낸다. y 축 단위는 650 nm에서 측정된 광학 밀도 (OD)이고, x 축은 일 단위로 측정된 시간이다. 650 nm에서 측정된 최종 OD는 132이었고, 최종 건조 바이오매스 밀도는 H2/CO2/O2 가스 기질에서의 성장으로부터 38 그램/리터이었다. 지수적 성장기는 하루 반 동안 지속되었지만, 바이오매스는 5일 동안 가동 정지 시점에도 여전히 선형 속도로 축적되었다.
실시예 3
접종 및 성장 조건
Rhodococcus 속 및 Cupriavidus 속으로부터의 유기체는 상이한 탄소원 상에서 성장하는 이들의 능력에 대해 테스트되었다 (도 6). 30oC에서 LB 아가 플레이트 상에서 자란 균주의 콜로니는 10% (v/v)의 지시된 배지 (예로, 종속영양성 또는 화학독립영양성)를 포함하는 플라스트 내에 3 내지 20일 동안 30oC 및 250 rpm에서 이동되었다. R. opacus 균주 DSM 44193는 40 g/L 포도당이 보충된 MSM 배지 (1 L 배지 A: 1 L 당 9 g Na2HPO4.12H2O, 1.5 g H2PO4, 1.0 g NH4Cl 및 0.2 g MgSO4.7H2O; 10 mL 배지 B: 100 mL 당 50 mg 제이철 암모늄 시트레이트 및 100 mg CaCl2; 10 mL 배지C: 100 mL 당 5 g NaHCO3; 및 1 mL 미량 미네랄 용액: 1 L 당 100 mg ZnSO4.7H2O, 30 mg MnCl2.4H2O, 300 mg H3BO3, 200 mg CoCl2.6H2O, 10 mg CuCl2.2H2O, 20 mg NiCl2.6H2O 및 30 mg Na2MoO4.2H2O) 상에서 650 nm에서 광학 밀도 (OD)에 의해 측정된 바와 같이 종속영양성 성장 조건 하에서만 성장을 나타내었다. R. opacus 균주 DSM 43205는 종속영양성 조건 하에서 OD = 9.0에 도달하는 동일한 성장 속도를 보였다. 균주 DSM 43205는 또한 화학독립영양성 조건 (66.7% H2, 9.5% CO2, 5% O2 및 18.8% N2가 보충된 MSM 배지) 상에서 성장할 수 있었다. Rhodococcus 종 (DSM 3346)은 종속영양성 조건 및 화학독립영양성 조건 (DSMZ 배지 81: 화학무기영양성 성장을 위한 1 L의 미네랄 배지: 1 L 당 2.9 g Na2HPO4.2H2O, 2.3 g KH2PO4, 1.0 g NH4Cl, 0.5 g MgSO4.7H2O, 0.5 g NaHCO3, 0.01 g CaCl2.H2O 및 0.05g Fe(NH4) 시트레이트; 및 80% H2, 10% CO2 및 10% O2이 보충된 5 mL 미량 미네랄 용액) 하에서 성장을 나타내었다. Cupriavidus necator (DSM 531)는 종속영양성 및 화학독립영양성 조건 (균주 DSM 43205에 대해 기술된 배지) 하에서 성장할 수 있었다 (도 6).
실시예 4
일군의 실험에서 30℃에서 LB 아가 플레이트에서 자란 Rhodococcus 균주의 콜로니는 지시된 성장 배지 및 가스 혼합물을 포함하는 가스 밀착 혈청병으로 이동되었다. (원래의 LB 배양 접종물은 -80°C에 보관된 글리세롤 원액으로부터 미리 회수되었다). 가스 상에서 혈청병 성장은 160 mL의 마개가 있고 밀봉된 휘튼 유리 혈청병 (VWR 제품번호 16171-385)에서 수행되었다. 액체 배지의 부피는 10 내지 20 mL이었다. 병은 휘튼 수동 크림퍼 (VWR # 80078-996)를 사용하여 고무 마개 (VWR # 100483-774) 및 알루미늄 밀봉 (VWR # 89047-008)으로 막았다. 무균 성장 배지를 무균 조건 하에서 병으로 옮겼다. 접종물은 무균 조건 하에 병에 도입되었고, 병을 고무 마개로 막고 밀봉하였다. 가스 혼합물은 병에 첨가되었다. 가스 믹스를 첨가한 이후, 밀봉을 알루미늄으로 크림핑하여 혈청병을 밀봉하였다. 다음으로, 병을 진탕 플라스크 배양기에 두었다. 병은 30°C, 250 RPM에서 배양되었다. 모든 시료는 주사기와 바늘을 사용하여 무균 조건 하에서 채취되었다. 성장은 650 nm에서 분광광도계로 광학 밀도 (OD)를 측정하여 평가하였다.
상기에 기술된 절차 이후에, Rhodococcus opacus 균주 DSM 43205는 다음의 배지, 66.7% H2, 9.5% CO2, 5% O2 및 18.8% N2를 포함한 가스 혼합물이 보충된 MSM 배지 (1 L 배지 A: 1 L 당 9 g Na2HPO4.12H2O, 1.5 g H2PO4, 1.0 g NH4Cl 및 0.2 g MgSO4.7H2O; 10 mL 배지 B: 100 mL 당 50 mg 제이철 암모늄 시트레이트 및 100 mg CaCl2; 10 mL 배지C: 100 mL 당 5 g NaHCO3; 및 1 mL 미량 미네랄 용액: 1 L 당 100 mg ZnSO4.7H2O, 30 mg MnCl2.4H2O, 300 mg H3BO3, 200 mg CoCl2.6H2O, 10 mg CuCl2.2H2O, 20 mg NiCl2.6H2O 및 30 mg Na2MoO4.2H2O)에서 화학독립영양성 조건 하에서 성장을 나타내었다. 액체 부피는 20 mL이었고, 가스 상부공간 부피는 140 mL이었다.
Rhodococcus 종 DSM 3346은 화학독립영양성 조건 하에서 다음의 배지, DSMZ 배지 81 (화학무기영양성 성장을 위한 1 L의 미네랄 배지: 1 L 당 2.9 g Na2HPO4.2H2O, 2.3 g KH2PO4, 1.0 g NH4Cl, 0.5 g MgSO4.7H2O, 0.5 g NaHCO3, 0.01 g CaCl2.2H2O 및 0.05g Fe(NH4) 시트레이트; 및 80% H2, 10% CO2 및 10% O2이 보충된 5 mL 미량 미네랄 용액) 성장을 나타내었다. 액체 부피는 10 mL이었고, 가스 상부공간 부피는 150 mL이었다.
세포는 72시간 후에 수확되었고, 각각의 균주에 의해 생산된 트리아실글리세롤 (TAG)과 같은 중성 지질에 포함된 지방산의 프로파일을 가스 크로마토그래피 및 질량분광측정법 (GC/MS)에 의해 측정 하였다.
실시예 5
또 다른 실험에서, R. opacus 균주 DSM 43205는 성장을 위한 유일한 에너지원 및 탄소원으로서 H2 및 CO2 및 O2 가스의 혼합물 상에서 1 L 병으로 배양되었다. 접종물은 -80℃에 저장된 물 + MSM 원액 분량으로부터 회수되었다. 사용된 배지는 상기 기술된 바와 같이 MSM이었다. -80℃에서 저장된 원액으로부터의 분량은 작은 혈청병의 MSM (20 ml)에 접종되었다. 가스 상에서 혈청병 성장은 상기에서 기술한 바와 같이 67% H2, 24% 공기 (4.8% O2), 9% CO2로 구성된 가스 혼합물과 함께 160 mL의 마개가 있고 밀봉된 휘튼 유리 혈청병에서 수행되었다. 병은 진탕 플라스크 배양기에 넣고, 30℃, 250 RPM으로 배양되었다.
대략 72시간의 성장 이후, 고밀도 계대배양 접종물을 원심분리하고 신선한 MSM에서 재현탁함으로써 가스 혈청병 배양으로부터 제조하였다. 고밀도 접종물은 가스의 유입 및 유출을 허용하는 두 개의 밸브를 갖는 가스 밀착 캡을 갖는 1 리터 유리병의 100 mL MSM에 접종되었다. 다음의 비율 H2: 71%; O2: 4.2%; N2: 15.8%; CO2: 9.0%의 가스 혼합물이 1 리터 병의 상부공간에 제공되었다.
가스 첨가 이후에, 밀봉된 1 리터 병은 진탕 플라스크 배양기에서 28℃, 200 RPM으로 배양되었다. 가스는 하루에 한 번 교체되었다. 650 nm에서 최종 OD가 OD = 1.27에 도달할 때까지 배양물은 가스에서 성장하였다.
최종 배양액의 균주를 검증하기 위해 1 리터 병의 가스에서 성장한 후 최종 회수된 세포에서 DNA 시퀀싱을 수행하였다. 16S rRNA 서열은 27F 및 800R 프라이머를 사용하여 결정되었다. 둘 다의 프라이머 모두에서 최상의 BLAST 히트는 각각 Rhodococcus 종 Rhodococcus opacus, Rhodococcus wrastislaviensis, GenBank 번호 EU127452.1, AB032565.1 및 AY940038.1로서 확인되었다.
실시예 6
다수의 산화수소 종은 공개적으로 입수가능하거나, 본원에 기술된 기법을 사용하여 단리될 수 있다. 예를 들면, 적어도 238개의 상이한 Rhodococcus 균주 및 적어도 55개의 상이한 Cupriavidus 균주가 공개된 DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) 균주 기탁물, 뿐만 아니라Hydrogenovibrio, Rhodopseudomonas, Hydrogenobacter, Xanthobacter 및 Hydrogenothermus를 포함하는 산화수소 미생물을 포함하는 많은 다른 속으로부터의 균주로부터 입수가능하다. 산화수소 균주는 또한 농축 방법을 사용하여 토양 시료 또는 지열 유체 시료로부터 단리와 같은 일상적인 공정에 의해 획득될 수 있다. 청구된 화학합성 조건 하에서 산화수소 성장 및 아미노산 및 단백질을 포함하지만 이에 한정되지 않는 탄소수 C5 이상의 화합물을 포함하는 유기 화합물을 생산하는 능력에 대해 균주를 테스트하는 것은 당해 기술분야에서 일상적이다. 예를 들어, 탄소원으로서 CO2를 사용하여 산화수소 하에서 성장하는 Rhodococcus 균주의 능력은 상기 실시예에서 기술된 바와 같이 수행될 수 있었다. 탄소원으로 CO2를 사용하는 산화수소 (크놀가스) 조건 하에서 성장하는 다른 방법은 "Thermophilic bacteria", Jakob Kristjansson, Chapter 5, Section III, CRC Press, 1992, pp. 86-88에 설명되어 있으며 광범위한 속으로부터 얻은 매우 다양한 균주에서 잘 작동하는 것으로 밝혀졌다. 산화수소 종에 의해 화학합성으로 생산된 화합물과 같은 유기 화합물의 생산의 평가도 역시 당해 기술분야에서 일상적이다. 예를 들면, 가스 크로마토그래피 및 질량 분광분석법 (GC/MS)은 실시예 5에 기술된 바와 같이 사용될 수 있다. 다른 방법으로는 Waltermann et al. (2000)"Rhodococcus opacus strain PD630 as a new source of high-value single-cell oil Isolation and characterization of triacylglycerols and other storage lipids" Microbiology 146: 1143-1149에 기술된 바와 같이, 지질 추출법, 박층 크로마토그래피 (TLC), 가스 크로마토그래피 (GC), 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 및 질량 분광분석법 (MS)을 포함한다.
실시예 7
대안적으로, 5 킬로그램의 바이오매스 (건조 중량)가 유일한 에너지원 및 탄소원으로서 H2 및 CO2 및 O2 가스의 혼합물 상에서 자란 Cupriavidus necator 균주 DSM 531에 의해 생산되었다. 이러한 바이오매스로부터 헥산 용해성 오일을 추출하고 분석하였다. 다음의 프로토콜은 교반 탱크 생물반응기에서 H2, CO2 및 O2 급식 원료로부터 바이오매스를 생산한 다음 바이오매스로부터 오일을 추출하는데 사용하였다.
장치: C. necator 배양물은 Applikon Biotechnology (Applikon)로부터의 20 리터 반응기 두 개를 사용하여 회분식으로 배양되었 (도 7 및 도 8).
생물반응기: 각각의 생물반응기는 엘라스토머 밀봉을 갖는 스테인레스 헤드플레이트를 갖는 지지 스탠드에 설치된 유리 용기로 구성된다. 헤드플레이트는 다수의 급식 통과물 (feed-through)의 포트를 갖고, 모두는 반응기 내외로의 가스 누출을 방지하도록 엘라스토머 밀봉을 갖고 있었다. 이들 급식 통과물은 써모웰, pH 탐침, 용존 산소 탐침, 가스 유입구, 액체 유입구, 가스 배출구, 액체 시료화 포트 등이 모두 헤드 플레이트에 설치되도록 허용하였다.
생물반응기 센서: 써모웰에 위치한 온도 탐침은 온도를 모니터링하고 가열기를 제어하도록 하는데 사용되었다. pH 탐침은 pH를 모니터링하고, 필요하면 반응기에 높거나 낮은 pH 완충 용액의 첨가를 조절하는데 사용되었다. 거품 센서는 거품 방지제의 첨가를 제어하는데 사용되었다. 용존 산소 탐침은 반응기 액체의 산소 수준을 측정하는데 사용되었으며 교반을 제어하거나 반응기로의 가스 유동을 개방/폐쇄하는 데 사용될 수 있었다. 모든 센서는 생물반응기 제어기/제어대에 의해 전력이 공급되고, 제어되며, 이에 입력을 제공하였다.
교반: 교반기가 완벽한 밀봉을 갖는 상부판 및 자기 커플링을 통과한다. 교반기는 교반 샤프트의 외부 부분에 맞는 별도의 품목인 외부 모터를 가졌다. 모터 속도는 회전 속도를 정밀하게 제어할 수 있는 외부 제어기에 의해 조절되었다.
가열/냉각: 반응기는 외부 전기 가열 담요에 의해 가열되었고, 이는 생물반응기 시스템 제어기를 통해 Pt 100 온도 탐침에 의해 제어되는 폐쇄 루프 비례적-일체-분리형 제어기 (PID)를 사용하였다. 온도를 유지하기 위해 교반기 모터에 의해 배지가 과열되는 것을 방지하기 위해 냉각 핑거가 배관되었다.
생물반응기 설치대: 생물반응기 시스템은 금속 삼각대 홀더에 설치되었다. 클램프 또는 체인을 사용하여 이 삼각대를 연기 후드 내부에 위치한 스트럿 설치대에 부착하여 반응기사 넘어지는 것을 방지하였다. 전체 삼각대 및 반응기 설치를 이차 봉쇄를 제공하도록 얕은 플라스틱 용기에 두었다.
생물반응기 및 지지 시스템의 개략도가 도 7에 도시된다. 두 개의 20 리터 생물반응기는 도 8에 도시된 바와 같이 연기 후드에 위치하였다. 생물반응기는 수소 가스의 방출을 포함하도록 연기 후드 내부에 설치되었다. 모든 조절 및 가스원은 연기 후드뿐만 아니라 가스 실린더, 반응기 조절기, 질량 유량계, 수소 센서 및 가스 조절 밸브의 외부에 위치하였다. 도 8에는 에너지 및 탄소의 유일한 공급원으로서 H2, CO2 및 O2 가스 상에서 C. necator의 성장 동안 사용되는 두 개의 20 리터 반응기를 나타낸다.
제어기/제어대: 생물반응기 시스템 제어기/제어대에는 생물반응기 시스템을 제어하고 작동하는 구성 요소가 포함되어 있었다. 이들 유닛은 센서 입력을 기반으로 전력, 온도 조절, 교반 제어, 센서로부터 수신된 입력, 급식 펌프 (산, 염기, 거품 제거기 및 추가적인영양분)의 켜기 및 끄기를 제공하였고, 솔레노이드 밸브 및 로터미터로 가스 유동을 켜거나 끄는데 사용되었다. 모든 스테인레스스틸 부품이 부족함으로 인해, 이들 유닛은 수소 누출의 위험을 최소화하기 위해 수소를 조절하는 데 사용되지 않았다. 제어기/제어대 유닛은 누출 사고 시 수소에 대한 노출을 최소화하고, 작업자가 생물반응기 주변에서 직접적으로 작업하는 데 소요되는 시간을 최소화하도록 생물반응기로부터 떨어진 외부에 위치하였다. 도 9는 반응기를 작동하는데 사용된 Applikon 제어기 및 제어대를 나타낸다. 도 9에는 제어기, 제어대, 교반기 조절, 폭발성 가스 검출 시스템, 질량 유량계, 레벨 제어기, 베이스 조절 저장조, 배지 첨가 저장조 및 거품 조절 저장조가 포함된다. 반응기 제어기 모두는 후드 외부에 위치하였다.
가스 전달: 상부판를 통과한 스파저 설정을 통하여 가스가 생물반응기 하부로 전달되었다. 반응기 바로 외부에 위치한 밸브는 각각의 반응기에서 분리하여 가스 유동을 수동으로 차단하게 하였다. 반응기로 배관된 가스 공급 라인은 가능한 오염을 최소화하기 위해 반응기 헤드에 0.2 마이크론 필터가 설치된 유연한 스테인레스 스틸 라인이었다. 후드 외부에 위치한 질량 유량계는 반응기로의 유속을 조절하는데 사용되었다. 실린더 및 질량 유량계 사이의 라인은 가스의 수동 및 자동 차단 둘 다를 위한 수동 및 솔레노이드 밸브 둘 다를 가졌다. 솔레노이드 밸브는 실험실 또는 후드에서 수소가 감지될 때 가스 유동을 자동으로 차단하는 폭발성 가스 센서에 연결되었다.
가스 저장: 가스 캐비닛은 수소 실린더를 저장하는데 사용되었다. 가스 캐비닛은 제자리에 장착되었으며 환기구 및 스프링클러가 포함되었다. 캐비닛에는 기존 실린더와 새로운 실린더를 쉽게 교체할 수 있도록 다수의 실린더를 저장하기에 충분한 공간을 포함하였다.
안전 조절: 폭발성 가스 검출기가 실험실에서 수소의 존재를 결정하는데 사용되었다. 다수의 센서가 실험실 및 후드 주변의 전략적 위치에 배치되었다. 이들 가스 검출기는 수소가 감지되면 가스 전달 라인의 솔레노이드 밸브를 차단하여 반응기로의 가스 흐름을 차단하도록 구성되었다.
연동 펌프: 추가적인 연동 펌프가 후드에 위치하였다. 이러한 펌프는 회분 처리의 시작 시 반응기에 신선한 배지를 이동하는 데 사용되었으며 회분 처리의 종결 시 배지와 바이오매스를 제거하는 데 사용되었다.
배지 저장: 플라스틱 카보이 또는 유리병을 사용하여 신선한 배지를 저장하고 회분 처리 후 바이오매스를 회수하였다.
배지: 이러한 실험에 사용된 MSM 배지는 Thermophilic Bacteria, CRC Press, Boca Raton, FL, Jacob K. Kristjansson, ed., 1992, p. 87, Table 4에 기술되어 있다.
접종물: Cupriavidus necator 접종물은 DSMZ 531 균주의 경우 -80℃에서 저장된 보존된 0.5 mL 글리세롤 원액으로부터 제조되었다. 재생 배양은 살시예 1에 기술된 혈청병 프로토콜에 따라 가스 밀착 혈청병에서 20 mL 최소 염 배지 (MSM)에 0.5 mL 글리세롤 원액을 첨가하면서 H2/CO2/O2 가스 믹스 상에서 시작하였다. 접종물은 생체안전성 캐비닛 내부에서 멸균 트랜스퍼 캡 어셈블리가 장착된 단일 무균 배지 병에 조합되는, 다수의 용기에 제공되었다. 접종물의 OD 및 스트렉이 수집되었다. 다음으로, 접종물은 멸균 전달 배관 및 연동 펌프를 사용하여 반응기로 이동되었다. 반응기를 접종한 이후에, 회분의 출발 OD를 시료 어셈블리를 사용하여 수집하였다.
배지 제조 및 첨가: 모든 배지는 20 리터 규모에 필요한 많은 양을 제외하고는, 호열성 세균, CRC Press, Boca Raton, FL, Jacob K. Kristjansson, ed., 1992, p. 87, Table 4에 제공된 레시피를 사용하여 제조되었다. 주요 배지 성분 (A)은 멸균 액체 트랜스퍼 캡 및 필터 어셈블리가 장착된 20 리터 Nalgene 카보이에서 제조되었다. 배지는 카보이에서 고압 멸균하였고, 오염을 피하기 위해 멸균 배관 및 연동 펌프를 사용하여 고압멸균된 반응기로 이동되었다. 더 작은 배지 성분 (B 및 D)은 큰 저장조에서 준비되었고, 격막을 사용하여 반응기 내로 직접적으로 일회용 무균 0.2 마이크론 필터를 통해 주사함으로써 무균화되었다. 격막을 사용하면 반응기의 개방을 피할 수 있으므로 오염의 위험이 최소화되었다. 제 4의 더 작은 배지 성분 (C)는 A와 유사한 방식으로 처리되었으며, 멸균 트랜스퍼 캡이 장착된 더 큰 저장조가 고압 멸균된 배지로 준비되었고, 배지가 무균 배관 및 연동 펌프를 사용하여 이동되었다.
생물반응기 준비 및 시운전: 새로 접종된 회분을 시작하기 이전에, 생물반응기가 고압 멸균으로 준비되었다. 반응기 상부판는 제자리에 장착되었다. 이동 라인을 연결하고 클램핑하고, 말단을 호일로 덮어 고압 멸균 테이프로 밀봉하였다. 유입 가스를 멸균하기 위해 0.2 마이크론 필터를 스파저의 가스 입구에 연결하였다. 통풍구 라인을 클램핑하고 호일로 밀봉하였다. 써모웰, 콘덴서, 거품 수준 탐침, 냉각 코일, 시료화 장치, 조정가능한 액체 유입 튜브 및 용존 산소 탐침가 장착되었다. pH 탐침용 포트를 덮고 호일로 밀봉하였다. 다음으로 반응기를 건조 순환을 사용하여 131℃에서 60분 동안 고압 멸균하였다. pH 탐침은 신속한 연소, 에탄올 및 자외선의 조합으로 멸균되었다. 생물반응기를 고압 멸균하고 실온으로 냉각시켰으며, 반응기와 탐침 둘 다가 생체안전성 캐비닛 내에 있는 동안 pH 탐침을 반응기에 삽입하였다. 다음으로 반응기를 후드 내에 장착되었고, 예로 냉각 라인, 트랜스퍼 라인, 전자 제어기, 히터, 교반 모터 등이 모두 연결되었다. 가능한 한 신속하게 배지 A를 반응기에 이전하여 pH 탐침가 건조되는 시간을 최소화하였다. 온도 조절 및 교반을 켜고, 필요하면 냉각수도 넣었다. 일단 배지의 온도가 원하는 온도에 도달하면, 배지 성분 B, C 및 D를 상기 기술된 방법을 통해 반응기로 이동시켰다. 다음으로 pH 조절이 시작되었다.
생물반응기 접종: 상기에 기술된 바와 같이 신선한 접종을 수행하였다. 다수의 실험에서 이전의 회분으로부터의 배지 및 바이오매스는 연동 펌프를 통해 전형적으로 1 리터 미만의 잔류 부피를 제외하고는 제거되었고, 이는 다음 회분을 접종하는 데 사용되었다. 이전 회분으로부터의 잔류 부피와 함께 접종할 때, 배양액의 대부분을 제거한 후, 실온에서 멸균 배지 A를 생물반응기로 이동시켰고, 가열을 켜놓았다. 다음으로 나머지 배지 성분 B, C 및 D가 상기에 기술된 방법을 통해 이동되었다. 다음으로 가스 유동이 시동되고, 교반이 시동되며, pH 조절기를 시동하였다. 이 시점에서 전개가 시작된 것으로 간주되었고 시작 OD가 수집되었다. 반응기가 작동 온도에 도달한 이후 냉각이 시동되었다.
가스 조성 및 유속: 사용된 가스 조성은 섹션 5에서 규정한 조성이었다. 비율은 질량 유량 조절기를 사용하여 조절되었다. 가스 유속은 총 가스 유량의 0.05 내지 0.3 VVM 범위이었다. 전형적인 유속은 주말 동안 0.05 VVM이었고, 두 개의 반응기가 작동하고 거품이 조절되는 주 동안 0.2 VVM이었다. 거품 조절기를 사용하지 않은 실험에서는 0.05 내지 0.075 VVM의 전형적인 값이 거품을 폼을 관리가능한 수준으로 감소시키는데 사용되었다.
pH 조절: 수산화암모늄 (2.0 M)이 생물반응기에서 배지의 pH를 조절하는데 사용되었다. 수산화암모늄 용액은 멸균 트랜스퍼 캡과 필터 어셈블리가 장착된 2 리터 배지 병에 MilliQ 물 1200 mL를 고압 멸균하고 생체안전성 캐비닛 내부에 필터-무균화된 5.0 M 수산화 암모늄 800 mL을 첨가함으로써 준비되었다. 수산화암모늄은 pH 탐침 신호를 사용하여 생물반응기 제어기에 의해 조절된 연동 펌프를 통해 반응기 내에 자동으로 이동되었다.
영양분 첨가/수정: 사용된 영양분 수정 용액은 초기 배지에 사용된 것과 동일하지만 정량이 상이하였다. 전개 동안 미네랄 영양분가 첨가되어 성장을 연장하고 임의의 미네랄 영양분 한계가 발생하는 것을 방지하였다. 수정 용액은 주사기를 사용하고 0.2 마이크론 필터를 통해 멸균하여 반응기에 직접적으로 첨가되거나, 연동 펌프를 사용하여 반응기에 연결되어 있는 무균 배관을 통해 첨가되었다. 총 반응기 부피는 또한 대략 15.5 L의 작업 부피를 유지하기 위해 반응기 배지 및 바이오매스의 적은 부분을 제거함으로써 정기적으로 (전형적으로 매일) 수동으로 조정되었다. 이것은 안정적인 혼합 동역학을 유지하고 오버플로를 방지하기 위해 영양분 수정으로부터의 물 첨가 및 세포 호흡에 의한 물 생성을 보상하도록 시행되었다.
시료화: 배지 용액의 작은 분량이 정기적인 간격으로 생물반응기로부터 액체 시료 어셈블리를 통해 수집되었다. 이들은 에펜도르프 생체광측정기 플러스에서 OD600 측정을 수행할 뿐만 아니라 DNA 분석을 위해 마이크로원심분리된 시료를 제공하는데 사용되었다. 원심분리된 시료은 10분 동안 10000 rpm에서 처리되었고, 제거되어 -20°C에서 저장되었다.
거품 조절: 대략 OD 15에 도달한 이후 거품이 상부공간를 채우기 시작하였고, 제어되지 않으면 0.2 VVM의 가스 유속이 사용되었을 때 거품이 2 리터 오버 플로우 저장소를 밤새 채우게 될 것이다. 거품 센서는 거품의 존재를 확인하고, 실리콘 기반의 거품 방지제의 에멀전 용액을 전달하는 펌프를 시동하는데 사용되었다. 가스 유속 및 교반기 속도는 과도한 거품 형성을 방지하기 위해 필요에 따라 회분 11 및 12에서 조정되었다. 0.05 VVM 내지 0.075 VVM의 가스 유속에서, 생물반응기는 거품 방지제 없이 작동될 수 있었다. 그러나, 거품은 상부공간를 채우고, 소량이 가스 유출구를 통해 거품 오버플로 용기 내로 유동을 유발할 것이다.
회분 처리 동안, 온도, pH 및 OD가 모니터링되고 기록되었다. 세포 순도는 스트렉 플레이트를 사용하여 모니터링되었다. C. necator 를 사용하여 20 리터 규모로 총 9회 회분이 수행되었다. 회분의 최종 광학 밀도 (OD)는 전형적으로 30 내지 50이었다. 이들 20 리터 회분의 결과는 표 1에 요약되어 있다.
표 1.
3 리터 및 20 리터 규모의 C. necator 에 대한 일련의 회분 전개 결과.
Figure pct00012
8개의 회분이 39 이하의 최종 OD에 도달하였고, 더 낮은 가스 유동으로 전개된 회분 (# 11)은 OD 30을 달성하였으며, 낮은 교반 속도에 제한된 회분 (# 5)은 OD 6.7에 도달하였다. 달성된 최고 OD는 회분 # 7에서 50이었다. 배양된 모든 바이오매스는 배양액으로부터 원심분리되었다.
바이오매스 원심분리 및 저장: Beckman Coulter 알레그라 X-12R 원심분리기를 사용하여 회분 전개로부터 수확된 배양액을 원심분리하여 바이오매스를 회수하였다. 알레그라-12R은 -10°C로 냉각되며 3,750 rpm 가능한 SX4750 스윙형 버킷 로터가 장착되어 있으며 3 L 용량을 갖는다. 회분 이후에, 바이오매스 및 배지는 생물반응기 외부로 연동 펌프를 사용하여 10 리터 폴리프로필렌 젤리 캔에 이동되었다. 바이오매스와 배지의 젤리 캔은 원심분리될 때까지 냉장고에 보관되었다. 바이오매스는 네 개의 750 mL 폴리카보네이트 원심분리 병으로 분리되어 한 번에 3 리터씩 원심 분리되었다. 원심분리기는 4℃에서 30분 동안 3,750 rpm으로 작동되었다. 상청액을 버리고 폐기하기 전에 표백제로 멸균되었다. 단일 회분에 대한 탈수된 바이오매스를 조합하여 폴리프로필렌 병으로 냉장고에서 보관하였다.
실시예 8
Cupriavidus necator 균주의 습윤 바이오매스로부터 세포 파열 및 오일 추출
본 발명자는 습윤 세포 재료의 시료로부터 효율적인 오일 추출이 세포 용해, 이어지는 하기 기술된 이소프로판올/헥산 오일 추출 절차를 사용하여 획득될 수 있는 점을 결정하였다. 이러한 절차를 이용하여, 미생물 오일이 획득되는 유일한 탄소원으로서 CO2로 재배된 C. necator 바이오매스로부터 조 헥산 추출물을 회수하였다.
습윤 바이오매스의 수분 함량을 추정하도록, 두 개의 빈 바이알이 표지되었고, 이들의 중량이 기록되었으며, 습윤 바이오매스 1 g이 각각의 바이알에 할당되었고, 진공 오븐 (바인더 안전성 진공 오븐, 모델 VDL 115-9030-0040)을 사용하여 60oC에서 12시간 동안 건조되었다. 통계적으로 유의한 숫자를 갖기 위해, 시료는 두 벌이 전개되었다.
용매 헥산 및 2-프로판올을 사용한 지질 추출을 위한 공정 매개변수 및 작동 조건을 연구하도록, 10 g (A1) 및 9.4 g (A2)의 습윤 바이오매스가 33.5 mL 및 31.5 mL의 2-프로판올에 각각 혼합되었다. 다음으로, 세포 현탁액은 250 mL 비이커로 이동시키고, 비이커는 얼음 수조에 유지되었으며, 회분식 모드에서 20분 동안 초음파 파쇄되었다. 습윤 바이오매스는 완벽한 세포 파열, 세포 용해를 위해 2-프로판올로 초음파 파쇄되었고, 미생물 세포로부터 오일을 회수하였다. QSonica Q700 초음파 분쇄기가 사용되었다. 초음파 분쇄 동안 온도 변화를 기록하도록 온도 탐침을 비이커에 담구었다. 초음파 분쇄기 또는 초음파를 사용한 세포의 파열은 세포 용해의 매우 공통적인 방법이고, 초음파는 20 kHz 내지 수 기가헤르쯔의 주파수를 갖는 주기적 음압파이다. 저압 주기 동안, 고강도 초음파는 액체에서 작은 진공 기포를 생성한다. 기포가 더 이상 에너지를 흡수할 수 는 부피에 도달하면, 고압 주기 동안 결과로 얻은 전단력으로 인해 격렬하게 파괴되어 세포 외투가 파손된다. 도 10에 나타낸 바와 같이, 완벽한 세포 파열 이후에 바이오매스의 색상은 갈색에서 크림색으로 바뀌었다. 초음파 파쇄 이전의 바이오매스 슬러리는 도 10에서 좌측에, 초음파 파쇄 이후에는 우측에서 나타난다. 초기 바이오매스 현탁액은 점성이었지만 초음파 파쇄 이후, 아마도 거대분자 전단력 효과로 인해 시료의 점도가 감소되었다.
2-프로판올에서의 초음파 파쇄로 인한 세포 용해 이후에, 각각 33.5 mL와 31.5 mL의 헥산을 A1 및 A2에 넣고 60oC에서 1시간 동안 배양하였다. 혼합물을 100 rpm으로 교반하였다. 1시간의 반응 시간 이후에 시료는 원심분리 튜브로 이동되었고 탁상 원심분리기 (Eppendorf centrifuge R)를 사용하여 3200 g에서 15분 동안 원심분리하였다. 헥산, 2-프로판올 및 용해된 오일, 지질 및 중합체의 혼합물인 상청액은 Rotavap 플라스크 내로 이동되었고, 회전 증발기 (Rotavap R-210/215)를 사용하여 60oC에서 증류되었다. 헥산 및 2-프로판올은 60oC 및 200 mbar 미만의 진공 압력에서 증발시켰다. 헥산 및 2-프로판올을 증발시킨 이후, 약 4 그램의 황색 오일을 회수하였다.
회분 습윤 바이오매스 추출 당 200 g 내지 250 g
소규모 추출 결과가 확인된 이후에, 더 큰 규모의 추출 작업이 시작되었다. 4 kg의 습윤 C. necator 바이오매스가 추출을 위해 20 회분 (회분 당 0.2 kg)로 분할되고, 각각의 회분이 진탕 플라스크로 이동되었다. 각각의 플라스크에 이소프로판올 650 mL을 첨가하였다. 습식 바이오매스 1.5 g 당 2-프로판올 용매 5 mL을 사용하였다. 바이오매스는 2-프로판올과 잘 혼합되어 균일한 현탁액을 만들었다.
균일한 현탁액을 만든 후, 초음파 파쇄를 사용하여 세포를 용해시켰다. QSonica Q700 초음파 분쇄기는 완벽한 세포 파열을 위해 연속 모드에서 작동되었다. 초음파 분쇄기의 플로우셀을 혼에 부착시키고 튜브를 플로우셀의 유입구 및 배출구 포트에 연결시켰다. 플로우셀의 유입구 튜브는 연동 펌프를 통과시켰고, 바이오매스 현탁액을 포함하는 플라스크에 담구는 한편, 플로우셀의 배출구 배관은 동일한 플라스크에서 순환을 허용하도록 배치되었다. 완벽한 세포 용해를 수행하기 위해, 습윤 바이오매스 그램 당 1 내지 1.2 kJ의 에너지가 소비되었다. 초음파 분쇄 동안 온도 변화를 기록하도록 온도 탐침을 시료 비이커에 담구었다.
4kg 유입으로 제조된 20개 부분 각각을 1분 초음파 파열 사이에 30초 간격으로 30분 동안 100% 진폭에서 회분식 모드로 초음파 처리하였다.
2-프로판올로 초음파 분쇄 이후, 습윤 바이오매스 그램 당 헥산 5 mL이 첨가되었고, 다음으로 시료는 60℃에서 1시간 동안 쿠너 진탕기 X를 사용하여 배양되었다. 헥산 650 mL을 각각의 회분에 첨가한 다음, 60℃에서 60분 동안 배양되었다.
시료는 원심분리 튜브로 이동되었고 에펜도르프 원심분리기 R을 사용하여 3200 g에서 15분 동안 원심분리되었다. 바이오매스의 각각의 회분은 4 Х 400 mL 에펜도르프 원심분리기 R 튜브에 분배되었다. 원심분리기 회전 속도는 4000 rpm으로 설정되었으며, 이는 18 cm 로터 반경의 경우 3200 g와 동등하다.
세포 펠렛을 분리한 이후, 유기 추출물 예로 상청액은 회전 증발기 (Rotavap) 혼합 플라스크로 이동되었다. Rotavap은 헥산 및 2-프로판올로부터 오일 및 중합체를 분리하는데 사용되었다. 헥산 및 2-프로판올은 60oC 및 200 내지 100 mbar에서 증발되었고, 오일 용매가 건조되었다. 헥산 및 2-프로판올은 60oC에서 가열 수조에 의해 가열되었다.
대규모 추출을 위해, 최적의 증류 조건이 100 mbar의 진공 압력 및 60oC 물 가열 수조에 도달하였고, 헥산 및 2-프로판올을 증발시킨 이후에 그러나 황색 중합체/오일 혼합물이 혼합 플라스크 내에 남았다. 오일을 황색 중합체로부터 분리하도록, 헥산을 재적용한 다음 중합체를 원심분리기로 분리하였다.
중합체/오일/헥산 혼합물은 60℃에서 10분 동안 재가열되었고, 원심분리 튜브로 옮기고 3200 rpm으로 5분 동안 회전시켰다. 재가열 및 원심분리 후, 오일이 분리되었고, 단리되어 분석되었다. 오일 추출물은 야자유의 주요 성분인 팔미트산을 포함하여 주로 포화 및 단일-불포화 C16 및 C18 지방산을 포함하는 것으로 밝혀졌다. 약 1 kg의 건조 바이오매스에 해당하는 4 kg의 습윤 C. necator 바이오매스로부터 80 g의 조 헥산 추출물 (예로, 헥산 용해성 오일)이 회수되었다.
본 섹션에서 기술된 방법에 따라, 총 약 230 mL의 오일이 수소, 전자 및 탄소의 유일한 공급원으로 H2 및 CO2로부터 생산된 Cupriavidus necator 의 다양한 시료로부터 추출되었다. 이것은 약 210 그램의 오일에 해당한다. 이 중 약 160 mL (140 g)의 오일이 본 섹션에서 설명된 20 리터 회분 전개에 의해 생성된 시료로부터 추출되었으며, 나머지는 H2/CO2 기질 상에서 다른 연속식 및 회분식 전개로부터 나왔다.
오일 추출 후 남은 잔류 바이오매스는 PHB 및 단백질이 높은 것으로 밝혀졌다.
실시예 9
합성가스 또는 이의 성분으로 구성된 급식 원료로부터 아미노산의 생산.
Cupriavidus necator 균주 DSM 531 및 DSM 541은 H2/CO2/O2 가스 혼합물 및 미네랄 염 발효 배지를 사용하여 배양되었다. 배양은 66.7% H2, 9.5% CO2, 5% O2 및 18.8% N2이 보충된 혈청병에서 20 mL MSM 배지 (1 L 배지 A: 1 L 당 9 g Na2HPO4.12H2O, 1.5 g H2PO4, 1.0 g NH4Cl 및 0.2 g MgSO4.7H2O; 10 mL 배지 B: 100 mL 당 50 mg 제이철 암모늄 시트레이트 및 100 mg CaCl2; 10 mL 배지C: 100 mL 당 5 g NaHCO3; 및 1 mL 미량 미네랄 용액: 1 L 당 100 mg ZnSO4.7H2O, 30 mg MnCl2.4H2O, 300 mg H3BO3, 200 mg CoCl2.6H2O, 10 mg CuCl2.2H2O, 20 mg NiCl2.6H2O 및 30 mg Na2MoO4.2H2O)에 30°C 및 200 rpm으로 96시간 동안 재배되었다.
성장 배지에서 라이신 검출을 위해, 세포 (OD = 0.1) 1 mL이 원심분리 (10,000 rpm, 실온에서 5분)에 의해 분리되었고, 상청액 (200 마이크로리터)가 추가로 여과되었다 (0.22 미크론). 상청액의 시료를 수집하고, 표 2에 나타낸 바와 같이, 라이신, 타이로신 및 페닐알라닌을 포함한 아미노산과 같은 아미노-포함 화합물의 분비에 대해 분석하였다.
표 2. C. necator 로부터 분비된 아미노-포함 화합물.
Figure pct00013
라이신은 6개 탄소 분자이고, 타이로신 및 페닐알라닌은 9개 탄소 분자이다. C. necator 균주 DSM541는 C. necator 균주 DSM531와 비교하여 배지에 높은 농도의 라이신, 타이로신 및 페닐알라닌을 분비하는 것으로 관찰되었다. 분석은 200 μL의 무균 여과 발효 배지에서 수행되었다. 화합물을 분리하고 세척 및 유도체화 키트 (예로, EZ-FaaST (Phenomenex))를 사용하여 유도체로 만들고, 이어서 액체 크로마토그래피-질량 분광분석기로 세균 균주에 의해 배지 내로 분비된 화합물을 분리하여 확인하였다 (표 2). DSM 541로부터의 배지에서 확인된 라이신의 수준은 DSM 531보다 125배 높았다.
실시예 10
Hydrogenovibrio marinus 균주 DSM 11271는 성장을 위한 유일한 에너지원 및 탄소원으로서 H2, CO2 및 O2 가스의 혼합물 상에서 리터 당 8 그램 이상의 건조 세포 밀도로 배양되었다 (도 11). 다음의 프로토콜은 교반된 탱크 생물반응기에서 H2, CO2 및 O2를 포함하는 가스의 혼합물을 사용하여 수행된 실험을 위해 진행되었다.
장치: PEEK 상부판; 0.2 μm 필터로 가스 전달용 배관에 연결된 하나의 다공성 유리 프릿을 갖는 스파지 튜브; 수정 전달을 위한 격막 포트; 무균 시료화 어셈블리로 바닥까지 딥 튜브; 가스 배출구 상에 0.2 μm 필터를 갖는 오버플로 용기로의 배관을 통해 연결된 콘덴서; 멸균 주사기에 맞춘 루어를 갖는 베이스 전달용 포트 및 베이스 전달용 배관; 접지 탐침; 거품 방지제 전달용 포트; pH/온도 탐침; 산화/환원 탐침 (ORP)을 갖는 맞춤 제작된 500 mL 유리 발효기를 사용하여 회분식으로 배양되었다. 시판되는 제어기 (Electrolab, Fermac 360, 영국)을 사용하여 온도는 37oC로 및 pH는 6.5로 조절되었다. 목표 온도는 반응기 바닥 상의 가열 패드 및 냉각수용 일체형 유리 자켓에 의해 유지되었다. pH를 6 N NH4OH를 사용하여 6.5로 유지하였다. 반응기를 교반 플레이트 (VWR 12365-344) 상에 놓고 자기 교반 막대 (십자형, VWR 'spinplus'# 58947-828)를 혼합에 사용 하였다. 상기 교반 플레이트는 300 내지 400 RPM으로 설정되었다. 생물반응기로의 가스 유속은 1VVM이었다. 가스 공급은 압축된 H2, 압축된 CO2 및 수용 공기로부터 이루어지며, 각각 20 psi로 조절되었다. H2 및 CO2는 가스의 상대 분율을 설정하는 유동 분배기 (Matheson G2-4D151-E401/E401, 20 psi)로 전달되었다. 공기는 가변 면적 유량계 (Key Instruments 1G03_R5)로 전달되었다. 유량 조절기로부터의 H2/CO2 가스 믹스를 공기 중에 티잉한 다음 가변 면적 유량계를 통해 발효기로 전달하였다. 압력 게이지는 발효기로의 가스 전달 압력을 모니터링하는데 사용되었다. 유입 가스는 0.2 μm 필터 (Pall, p/n 4251)를 통과한 다음 하나의 다공성 파이렉스 프릿 (40 내지 60 μm, 시그마-알드리치 CLS3953312-C)을 통해 발효 배양액 내로 분산되었고, 콘덴서 (재킷화 및 냉각됨)를 통해 반응기로부터 2 L 거품-오버플로 병으로 배출된 다음 또 다른 0.2 μm 필터 (Pall, p/n 4251)를 통하고, 최종적으로 배기 시스템으로 배출되었다. CO2 유동은 최소값 c.l. = 5 (c.l. = 유동 중심선)으로 설정되었고, 다른 가스들은 목표로 한 가스 조성을 달성하도록 설정되고, 유량계 표에 따라 계산하고, GC에 의해 조성을 측정하고, 조정 및 재 측정하였다. 사용된 c.l. H2 = 25, c.l. 공기 = 45는 CO2/O2/H2의 비율 각각 11/6.3/59를 갖는 가스 믹스를 제공한다. 유입 및 유출 라인에서 O2의 계속적인 모니터링은 폭시 탐침을 사용하여 시행되었다. 때로 가스 시료를 GC 분석 (1 L 호일백에서, skcinc.com p/n 262-01)을 위해 수집하였다.
배지: 기본 배지 1 L는 2.0 g K2HPO4, 1.0 g KH2PO4, 5.0 g (NH4)2SO4, 29.3 g NaCl, 0.2 g MgSO4-7H20, 10.0 mg CaCl2, 10.0 mg FeSO4.7H2O, 0.6 mg NiSO4.7H2O 및 2.0 mL 미량 원소 용액을 포함하였다. 미량 원소 용액은 Thermophilic Bacteria, CRC Press, Boca Raton, FL, Jacob K. Kristjansson, ed., 1992, p. 87, Table 4로부터 참조하였다.
독립영양성 미생물 접종물: 10% 접종 가스-배양된 접종물이 액체 배지 50 mL을 포함하는 마개를 갖는 두 개의 500 mL 병에 준비되었다. 61.5 mL 부피의 접종물, OD600 0.75를 딥 튜브를 통해 액체 레벨 아래로 주입하여 상부공간에서의 분산을 막았다. 접종 후 여과된 공기로 라인을 플러싱하여 딥 튜브 내의 포집된 접종물을 제거하였다.
발효기 작동: 염기 첨가 - pH를 6N NH4OH로 조절하였고; 영양분 수정 - NH4OH의 염기 첨가에 의해 제공된 질소 영양분에 추가하여, 배양액 OD = 3일 때 0.2 g의 FeSO4.7H2O가 첨가되었고, 배양액 OD = 10일 때 2 g의 MgSO4.7H2O가 첨가되었다. 유입되는 O2는 약 5%인 것으로 측정되었고, 유출되는 O2는 3 내지 4% 범위이었다. 시료는 25 mL 병을 갖는 무균 시료화 시스템을 사용하여 반응기 바닥로 연장된 튜브에서 가져왔다. DNA 시퀀싱 결과는 H. marinus를 검증하였고, 전체 실험 통하여 매일 스트레킹된 한천 플레이트 상에 배양하면서 오염이 전혀 관찰되지 않았다.
표 3은 실험 전개 동안 다양한 시점에서 측정된 세포 건조 중량 (CDW) 밀도를 나타낸다. CDW 밀도는 5일 동안 8 그램/리터를 초과하였다. 다양한 시점에서 시료화된 바이오매스의 백분율로서 클로로포름/메탄올 용해성 지질 및 헥산 용해성 지질의 함량도 역시 표 3에 나타낸다. 지질은 상기 기술된 방법을 사용하여 GC/MS에 의해 분석되었고, 길이 14 내지 20개 탄소의 범위의 지방산을 포함하는 것으로 밝혀졌다.
표 3
Figure pct00014
가스 상에서 H. marinus의 성장 동안 다양한 시점에서 측정된 세포 건조 중량 (CDW) 밀도. 시료화된 바이오매스의 백분율로서 클로로포름/메탄올 용해성 지질 및 헥산 용해성 지질의 함량 각각도 역시 제공된다.
실시예 11
Rhodopseudomonas capsulata 균주 DSM 1710는 성장을 위한 유일한 에너지원 및 탄소원으로서 H2, CO2 및 O2 가스의 혼합물 상에서 OD 4.5로 배양되었다. 다음의 프로토콜은 연속 가스 유동이 급식된 1 L 밀봉된 병에서 H2, CO2 및 O2를 포함하는 가스의 혼합물을 사용하여 수행된 실험을 위해 진행되었다.
장치: 배양은 배양병으로서 사용하기 위해 용도 변경된, 1 리터 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC) 용매 전달 병을 포함하는 맞춤 제작된 시스템을 사용하여 회분식으로 재배되었다. 이들 1 리터 배양병은 가스 탱크 시스템인 가스 믹서; 필터 (0.2 마이크론); 유량계; 및 가습기로부터 가스를 연속적으로 급식하였다. 이러한 가스 전달 및 배양 병 시스템은 도 12에 개략적으로 도시되어 있다. 가스는 다공성 유리 프릿을 사용하여 용액으로 배분되고 혼합되었다. 배양병은 액체 배지 200 mL를 포함하였고, 빛이 배지를 통과하지 못하도록 알루미늄 호일로 감쌌다. 배양기 병을 수조에 담금으로써 온도가 조절되었다. pH는 배지에 화학물질 완충액을 포함하는 것 이상으로 조절되지 않았다. 가스는 0.2 마이크론 필터를 통해 배양병으로부터 배출되었고, 전체 시스템은 연기 후드 내부에 설치되었다. 가스 급식은 압축된 H2 및 CO2 가스 혼합물 및 압축된 O2의 별도 탱크로부터 이루어졌다. 실험을 위한 목표로 한 가스 혼합물은 10% O2, 5% CO2 및 85% H2이었다. H2/CO2 가스 탱크 믹스의 유량계는 25로 설정되었고 O2 탱크의 유량계는 34로 설정되었다. 이것은 GC (Shimadzu GC-8A, TCD 검출기 및 Alltech CTR I 컬럼)로 측정한 바와 같이 10.5 % O2, 5% CO2, 84.5% H2의 기체 혼합물을 생성하였으며, 이는 실험을 수행하기 위한 목표 혼합물에 충분히 근접한 것으로 고려되었다.
배지: 970 mL: DI 물; 20 mg Na2.EDTA; 12 mg FeSO4.7H2O; 200 mg MgSO4.7H2O; 75 mg CaCl2.2H2O; 1 g NaCl; 1 g (NH4)2SO4; 1 mg 티아민 HCl; 15 μg 바이오틴; 1 mL 미량 원소 용액. 미량 원소 용액: 250 mL DI 물; 700 mg H3BO3; 398 mg MnSO4.H2O; 188 mg Na2MoO4.2H2O; 60 mg ZnSO4.7H2O; 10 mg Cu(NO3)2. 고압 멸균하기 전에 pH를 7.2로 조정하였다. 고압 멸균 이후에, 1.2 g KH2PO4 및 1.8 g K2HPO4을 갖는 30 mL 멸균 용액을 첨가하였다. 다시 pH는 7.2로 재조정되었다.
접종물: 250 rpm의 교반으로 광종속영양으로 자란 R. capsulata 배양물로부터 제공된 10% 접종물. Wall, JD, Johansson, BC, Gest, H., 1977에서 주어진 RCVB 배지. 질소 대사에 결함이 있는 Rhodopseudomonas capsulata 의 다형질 돌연변이체. Arch. Microbiol. 115: 259-263; 짙은 녹색을 띤 접종물의 광종속영양성 성장에 사용되었다. 이러한 광종속영양으로 자란 배양액은 순서대로 -80oC에 보관된 균주의 글리세롤 원액으로부터 출발하였다.
작동: 10% 접종물은 출발 OD 0.15를 유도하였다. 가스 위에서 8일 동안 성장 이후에, OD는 4.5에 도달하였다. OD는 Beckman Coulter DU720 UV/Vis 분광광도계를 이용하여 650 ㎚에서 측정되었다. 화학독립영양으로 증식된 배양물의 색상은 진한 적색이었다. 배양액의 습윤 마운트는 Axioskop 연구 현미경 (Zeiss, Germany)과 함께 위상차 광학을 사용하여 관찰되었다. 영상화 및 데이터 저장을 위해 PictureFrame (Optronics; Galeta, CA) 소프트웨어를 사용하여 MacroFIRE 장치 (Optronics; Galeta, CA)로 현미경 사진을 생성하였다. R. capsulata의 현미경 사진은 도 13에 나타낸다. 화학종속영양성 성장 이후에, 배양액이 10,000 G로 15분 동안 4oC에서 원심분리되었다. 다음으로 상청액을 버리고, 바이오매스 펠렛을 일시적으로 -20oC에서 저장한 다음 동결 건조시켰다. 원심분리 후 회수된 R. capsulata 바이오매스 펠렛의 사진을 도 14 에 나타내었다. 총 2.59g의 습윤 바이오매스가 이러한 방식으로 생합성을 위한 수소, 전자 및 탄소의 유일한 공급원으로서 H2 및 CO2 에서 자란 R. capsulata의 단일 1 리터 병으로부터 회수되었다. 지질은 추출되었고, 상기 기술된 방법을 사용하여 GC/MS에 의해 분석되었으며, 주로 길이가 16 내지 18개의 탄소인 지방산을 포함하는 것으로 밝혀졌다.
실시예 12
Hydrogenobacter thermophilus DSM 6534는 성장을 위한 유일한 에너지원 및 탄소원으로서 H2 및 CO2 및 O2 가스의 혼합물 상에서 1 L 가스 밀착 병으로 배양되었다. 가스 상부공간 하의 혈청병에서의 H. thermophilus DSM 6534의 살아있는 배양물을 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ)으로부터 받았다. Hydrogenobacter thermophilus DSM 6534는 rTCA CO2 고정 주기를 포함하는 것으로 알려져 있다. 이러한 살아있는 배양물은 "호열성 세균", Jakob Kristjansson, 5 장, III 절, CRC Press, 1992, pp. 86-88에 주어진 MSM 배지를 포함한 160 mL 혈청병에 H2 : CO2 : O2의 8 : 1 : 1 대기 하에 10% 접종물을 제공하는데 사용되었다. 접종 후 600 nm에서 초기 OD 0.03이었다. 혈청병의 온도는 가열된 수조에 혈청병을 침지함으로써 70oC로 유지되었다. 교반은 적용되지 않았다. 배지가 탁해지는 것이 관찰되고, 65시간 이후에 OD가 0.354로 측정되었는데 10배 이상의 증가이었다. 다음으로, 혈청병은 120 mL MSM 배지 및 H2 : CO2 : O2의 8 : 1 : 1 대기를 포함하는 1 리터 가스 밀착 병에서 10% 접종물로서 계대배양되었다. 배양병은 수조를 사용하여 70oC에서 유지되었고, 교반되지 않았다. 64시간에 걸쳐 가스 상부공간는 한 번 교체되었고, OD는 0.25로 증가되었다. 다음 24시간 동안 OD는 0.42로 증가하였다. 상부공간 가스를 다시 교체하고, 이틀 후 OD가 0.56으로 측정되었다. 1 mL의 배양액이 DNA 추출 및 시퀀싱을 위해 시료화되었다. 16S rRNA 서열을 결정하였고, 최상단 BLAST 히트는 Hydrogenobacter thermophilus TK-6 균주로서 확인되었다. 배양액은 1 리터 병으로부터 가져왔고, 4oC에서 15분 동안 10,000 g에서 원심분리되었다. 원심분리 후에 얻은 습윤 바이오매스의 펠렛은 212 mg이었다. 습윤 바이오매스의 헥산 추출은 상기 실시예에 기술된 바와 같이 수행되었다. 습윤 바이오 매스로부터 15.2 mg의 헥산 용해성 지질이 회수되거나, 습윤 바이오매스 중량의 7.2%가 헥산 용해성 지질로 구성되었다. 지질은 추출되었고, 상기 기술된 방법을 사용하여 GC/MS에 의해 분석되었으며, 20개 탄소 사슬 길이를 갖는 지방산의 비교적 높은 비율을 갖는 것으로 밝혀졌다.
실시예 13
Xanthobacter autotrophicus 균주 DSM 432는 성장을 위한 유일한 에너지원 및 탄소원으로서 H2, CO2 및 O2 가스의 혼합물 상에서 리터 당 14 그램의 건조 세포 밀도로 배양되었다. 다음의 프로토콜은 교반된 탱크 생물반응기에서 H2, CO2 및 O2를 포함하는 가스의 혼합물을 사용하여 수행된 실험을 위해 진행되었다.
장치: 도 16에 개략적으로 도시된 상부판를 갖는 도 15에 개략적으로 도시된 2 리터 유리 발효기를 사용하여 배양을 회분식으로 성장시켰다. 온도 및 pH는 pH 및 온도 탐침 및 시판되는 제어기로 조절되고 모니터링되었다. pH는 2N NaOH의 자동 첨가를 통하여 조정되었다. 생물반응기의 포트는 영양분 보충제 및 거품 방지제의 공급; 접종물; 베이스; 신선한 배지의 전달; 및 무균 시료화에 이용가능하였다. 교반은 터빈에 의해 제공되고, 가스는 유리 프릿을 통해 스파징된다. 반응기 시스템은 도 17에 개략적으로 도시되어 있다. 이것은 압력 게이지; 가스 유량계; 안전 및 체크 밸브; 0.2 마이크론 필터; 생물반응기 용기, 센서, 구동기 및 제어기; 콘덴서 및 거품 포집기; 및 유출 배출구를 포함하였다. 가스 공급은 압축된 H2, 압축된 CO2 및 수용 공기로부터 이루어지며, 각각 20 psi로 조절되었다. 가스 전달 시스템의 개략도가 도 18에 도시된다. H2 및 CO2는 가스의 상대 분율을 설정하는 유동 분배기 (Matheson G2-4D151-E401/E401, 20 psi)로 전달되었다. 유량 조절기에 사용된 설정은 c.l. H2 = 35; c.l CO2=10; 및 c.l 공기=55이었다. 이것은 GC (Shimadzu GC-8A, TCD 검출기 및 Alltech CTR I 컬럼)로 측정한 바와 같이 64% H2, 11% CO2, 5.4% O2의 반응기로 전달된 가스 믹스를 유도하였다.
배지: 이러한 실험에 사용된 MSM 배지는 Thermophilic Bacteria, CRC Press, Boca Raton, FL, Jacob K. Kristjansson, ed., 1992, p. 87, Table 4에 기술되어 있다.
접종물: Xanthobacter autotrophicus 균주 DSM 432 접종물이 -80oC에 저장된 단일 글리세롤 원액 바이알로부터 출발하여 1 L 가스 밀착 병의 200 mL MSM으로 이동되었다. H2/CO2/O2 상부공간의 가스 압력은 10 psig이었다. 배양병은 30℃에서 150 rpm으로 교반되었다.
발효기 작동: 접종 전에 1.3 리터의 MSM을 생물반응기 용기로 옮겼다. NaOH를 사용하여 pH를 6.8로 조정하였다. 온도는 30oC로 설정하고 500 RPM으로 교반하였다. 무균 시료화 어셈블리를 통해 시료는 OD 및 지질 분석을 위해 매일 두 번 수집되었다. 모든 OD 측정은 Beckman Coulter DU720 UV/Vis 분광 광도계로 수행되었다. 매일 일회의 시료가 매일 한 번 현미경 하에 검사하여 세포 형태를 확인하였다. 모든 배양액 시료를 12,000 g에서 원심분리하였다. 상청액 1 mL는 NH4 + 분석을 위해 -20oC에서 보관되었다. 습윤 바이오매스 펠렛을 일시적으로 -80oC에서 저장한 다음 동결 건조시켰다.
OD600 및 CDW (mg/ml) 간의 상관 관계는 도 19에 나타낸다. 이러한 상관 관계에 대한 선형 피팅은 R2 = 0.957를 갖는 CDW = 0.9944*(OD600) + 0.4101이었다. 도 20은 이러한 프로토콜에 따라 H2/CO2/O2 가스 기질 상에서 자란 크놀가스 미생물 Xanthobacter autotrophicus의 성장 곡선을 나타낸다. 600 nm에서 측정된 최종 OD는 14.8이었고, 최종 CDW는 H2/CO2/O2 가스 기질에서의 성장으로부터 13.8 그램/리터이었다. 전개의 개시 시 지수적 성장의 짧은 기간 이후에, 바이오매스는 6일째 실행이 종료될 때까지 대략 선형 속도로 축적되었다. 지질이 추출되었고, 상기 기술된 방법을 사용하여 GC/MS에 의해 분석되었으며, 길이가 18개 탄소인 지방산의 비교적 높은 비율을 갖는 것으로 밝혀졌다.
실시예 14
화학독립영양성 생물 스크리닝
균주는 알모레의 Vacu-Quick 병 시스템을 사용하여 플레이트 상의 화학독립영양성에 대해 먼저 스크리닝되었다. 다음으로 유망한 균주를 액체 배양물에서 테스트하였다.
최소 염 배지 (MSM)를 상기 기술된 바와 같이 제조하였고, 아가로스 (1.5 %) 플레이트에 무균적으로 조합하여 첨가하였다. 다음의 속으로부터 나온 162개의 후보 균주가 테스트되었다: Cupriavidus; Xanthobacter; Dietzia; Gordonia; Mycobacterium; Nocardia; Pseudonocardia; Arthrobacter; Alcanivorax; Rhodococcus; Streptomyces; Rhodopseudomonas; Rhodobacter; 및 Acinetobacter. 각각의 균주는 최소 염기 배지 (MSM) + 아가로스 (1.5%) 플레이트 상에 스트레킹되었다. 다음으로 각각의 플레이트 모두를 알모레의 Vacu-Quick 병 시스템에 넣었다. 체임버의 습도를 유지하고 배양 동안 플레이트가 건조되는 것을 방지하도록 각각의 체임버 바닥에 멸균된 물로 적신 멸균 페이퍼 타월을 놓았다. 플레이트로 채워진 가스 밀착 체임버는 비우고, H2:CO2:공기 (70/10/20) 가스 혼합물이 공급되었다. 가스는 성장을 위한 유일한 에너지원 및 탄소원을 제공하였다. 가스 체임버를 30℃에서 7 내지 10일 동안 배양하였고, 매일 신선한 가스 믹스를 퍼지하였다. 화학독립영양성 성장/콜로니를 나타내는 플레이트의 경우, 콜로니를 찍어낸 다음 새로운 최소염 배지 (MSM) + 아가로스 (1.5%) 플레이트 상에 스트레킹하였고, H2 및 CO2 및 공기 (70/10/20)가 공급된 알모레의 VACU-Quick 병 시스템에서 이차 배양이 이어졌다. 이차 배양에서 강한 콜로니 성장을 나타내는 균주는 다음으로 액체 미네랄 염 배지 (MSM)에서 화학?립영양성 테스트에 착수되었다. 실험은 견고한 네오프렌 고무 마개 (Wheaton Science Products, No.:224100331)로 덮여 알루미늄 캡으로 크림핑된, 5 mL의 작업 부피를 갖는 (Cheamlass CLS-4209-10, 혐기성, 18 x 150 mm) 헌게이트 튜브에서 수행되었다. 고효율 스크리닝을 위해 설계된 가스 배분기를 사용하여 H2:CO2:공기 (70/10/20)의 가스 믹스로 관을 퍼징하였다. 튜브는 매일 신선한 가스 믹스로 퍼징되었다. 튜브는 Multitron Pro Infors HT 진탕기에서 45 각도, 600 rpm으로 30oC에서 96시간 동안 배양되었다. 600 nm에서 광학 밀도는 분광광도계 (Genesys 10S, UV-Vis 분광광도계, Thermo Scientific)로 24시간 마다 측정되었다. 다음의 세균 균주는 크놀가스 믹스 상에서 화학독립영양성인 것으로서 확인되었다: Arthrobacter methylotrophus DSM 14008; Rhodococcus opacus DSM 44304; Rhodococcus opacus DSM 44311; Xanthobacter autotrophicus DSM 431; Rhodococcus opacus DSM 44236; Rhodococcus ruber DSM 43338; Rhodococcus opacus DSM 44315; Cupriavidus metallidurans DSM 2839; Rhodococcus aetherivorans DSM 44752; Gordonia desulfuricans DSM 44462; Gordonia polyisoprenivorans DSM 44266; Gordonia polyisoprenivorans DSM 44439; Gordonia rubripertincta DSM 46039; Rhodococcus percolatus DSM 44240; Rhodococcus opacus DSM 43206; Gordonia hydrophobica DSM 44015; Rhodococcus zopfii DSM 44189; Gordonia westfalica DSM 44215, Xanthobacter autotrophicus DSM 1618; Xanthobacter autotrophicus DSM 2267; Xanthobacter autotrophicus DSM 3874; Streptomycetes coelicoflavus DSM 41471; Streptomycetes griseus DSM 40236; Streptomycetes sp. DSM 40434; Streptomycetes xanthochromogenes DSM 40111; Streptomycetes thermocarboxydus DSM 44293; Rhodobacter sphaeroides DSM 158.
유일한 탄소원 및 에너지원으로서 크놀가스 혼합물을 사용하여 액체 MSM 배지에서 배양된 크놀가스 균주에 대한 완전한 대략적 분석이 수행되었다. C. necator DSM 531 및 DSM 541은 산술적 성장기 동안 채취한 시료의 경우 중량 기준으로 70% 초과 및 80% 초과의 총 단백질을 축적하는 것으로 밝혀졌다. C. necator DSM 531과 DSM 541 둘 다는 또한 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B12을 포함한 비타민을 합성하는 것으로 밝혀졌다.
실시예 15
C. necator DSM 531 용균물 제조
Cupriavidus necator 균주 DSM 531는 성장을 위한 에너지원 및 탄소원으로서 멸균 MSMG 배지 (최소염 배지 + 40 g/L D-포도당) 상에서 배양되었고, 세포는 용해되었다.
다음의 프로토콜은 C. necator 균주 DSM 531 바이오매스 생산 및 용균물 제조를 위해 진행되었다.
실험 균주 바이오매스 생산: 균주 글리세롤 원액으로부터 얻은 72시간의 접종물로 부피 1%, 이어서 균주 바이오매스 생산을 위한 120시간 배양으로 부피 10%.
C. necator 균주의 초기 성장은 1.5 mL 글리세롤 원액으로부터 500 mL 삼각 플라스크 (VWR # 10536-926)의 160 mL MSMG 배지 내에 진탕기 배양기 (New Brunswick Scientific, 시리즈 25 배양기 진탕기, 플로어 모델)로 72시간 동안 30℃, 250 rpm으로 종자 배양되었다. 균주는 영양분 배양액 (NB) 아가 플레이트, SpectraMax M5 분광광도계 상의 600 nm 광학 밀도 및 1000배 렌즈 확대로 현미경 Labomed iVu3100 상의 형태 검사로 조사되었다.
종자 원액은 20 mL의 MSMG 배지 200 mL을 포함하는 2 L 얼렌메이어 플라스크 (VWR # 10545-844)에 이동시켜, 160 mL 종자 원액으로부터 총 8개의 2 L 플라스크를 얻었다. 2 L 플라스크를 배양기 진탕기에서 30℃, 250 rpm으로 120시간 동안 배양하였다. 균주는 수확 시 영양분 배양액 (NB) 아가 플레이트 상의 스트레킹, 분광광도계 상의 600 nm에서 광학 밀도, pH 측정 및 1000배 렌즈 확대로 현미경 상에 형태 검사에 의해 모니터링되었다.
배양액은 빈 무게의 무균 250 mL 원심분리 병 (Fisher Scientific # 05 564 1)에 옮기고, 원심분리기 (Sorvall Evolution RC)에서 8000 rpm, 4℃, 20분으로 회전시켰다. 배양액을 버리고, 펠렛을 빈 무게의 멸균된 50 mL 팔콘 튜브 (VWR # 89039-656)로 옮겼다. 펠렛을 -80℃에서 보관하였다.
C. necator DSM 531 균주의 세포 건조 중량 측정이 또한 수확 시점에 조사되었다. 2L 플라스크의 수확 이전에 각각의 플라스크로부터의 배양액 10 mL이 빈 무게의 멸균 50 mL 팔콘 튜브로 이동되었다. 튜브를 원심 분리기 (Eppendorf)에 12000 rpm, 4°C, 5분으로 두었다. 배양액을 버리고, 습윤 펠렛을 -80℃에서 2시간 동안 냉동시켰다. 냉동된 펠렛은 동결건조기 (Virtis Benchtop, -62.6℃, 56 mTorr)에 18시간 동안 두었다.
160 mL MSMG 배지에서 글리세롤 원액을 75시간 동안 종자 배양한 후, OD600을 0.792, pH = 7.34에서 측정하였다. 배양액은 유백색 모양이었다. 미접종된 MSMG 배지는 또한 음성 대조군인 NB 아가 플레이트 상에서 스트레킹되었다.
플라스크 당 200 mL MSMG 배지에서 종자 원액 20 mL으로부터 2 L 플라스크 내에 113시간 동안 계대배양되었다. 각각의 2L 플라스크로부터의 세포는 NB 아가 플레이트 상에 스트레킹되었고, 현미경 상에서 1000배 확대로 관찰되었다. 시각적으로 균주 순도는 약 99.9%로 결정되었다.
2L 플라스크의 C. necator 배양물은 밀봉 캡이 달린 멸균 250 mL 원심분리기 병에서 8000 rpm, 4℃, 20분의 원심분리를 통해 수확되었다. 배양액을 버리고, 습윤 펠렛을 조합하여 -80℃에서 보관하였다. 수확 시점의 평균은 OD 600 = 19.9 및 pH = 6.2 내지 6.3이었다. 배양액에서 습윤 펠렛의 무게 및 농도가 측정되었다.
수확 이전에 각각의 2 L 플라스크로부터의 배양액 10 mL이 세포 건조 중량 측정을 위해 빈 무게의 팔콘 튜브로 이동되었다.
용해된 세포 추출물 제조
30 g 습윤 세포 펠렛을 실온에서 15분 동안 해동시켰다. 30 g의 멸균 MilliQ 물을 첨가하였다. 균질한 용액이 생산될 때까지 튜브를 격렬하게 볼텍싱하였다. 세포 용액은 각각 10 g을 포함하는 6 내지 50 mL 팔콘 튜브에 분할하고 1/8 인치 테이퍼 마이크로팁 탐침 (# 101-148-070)을 갖는 Branson 초음파 분쇄기 250을 사용하여 얼음물 수조에서 초음파 처리되었다. 탐침은 튜브 바닥의 1 cm 이내로 낮추었다. 전력은 1분 총 초음파 처리 시간과 함께 40 내지 60% 출력으로 천천히 상승되었다. 마이크로팁 및 세포 용액 둘 다는 약 10분 동안 냉각되었다. 1분의 주기를 이들 사이에 10분의 냉각 시간을 갖으며 2회 더 초음파 처리를 반복하였다.
용균된 세포 추출물의 단백질 측정
브래드포드 분석은 용균된 세포 추출물, 맑은 용균물 및 분자량 컷오프 (MWCO) 필터 막을 통과한 투과물에서 단백질 농도를 결정하는 데 사용되었다.
5 uL 시료 및 BSA 표준 (BIO-RAD # 5000201)을 투명한 96-웰 평면바닥 플레이트에 첨가하였다. BSA 농도 범위는 150 ug/mL 내지 600 ug/mL이다. 후속적으로, 250 uL 1x 염료 시약 (쿠마시블루 G250, BIO-RAD # 5000201)을 플레이트의 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트는 실온에서 300 rpm으로 30분 동안 플레이트 진탕기 상에 배치되고, 이어서 SpectraMax M5 분광광도계로 595 nm에서의 흡광도를 판독하였다.
가수분해물 제조
본 프로토콜에 따라 생성된 세포 용균물은 당해 기술분야에 잘 공지된 화학적 및 효소적 가수분해 방법에 적용된다.
실시예 16
프로테아제 입증 실험
미생물 (예로, 곰팡이 P. marquandii)은 호기성 침지 조건 하에서 적합한 배지에서 배양되어 프로테아제 (예로, 케라티나제)를 합성한다.
세포외 액체는 농축되고 부분적으로 정제되어 효소 분말을 생산한다. 효소 분말의 평균 활성을 측정한다.
케라티나제의 경우, 후프 및 혼 기질이 양성 대조군으로서 마쇄되고, 체로 거른 다음 케라틴 분말의 가수분해가 50℃ 및 pH 8.0에서 0.75 내지 3.00 g/L의 농도로 케라티나제의 처리에 의해 수행된다 (효소/기질 비율 1:67 내지 1:17로). 이것은 케라티나제 효소의 활성에 대한 양성 대조군으로서 작용한다.
실험을 위해, H2/CO2 상에서 자란 Cupriavidus necator 또는 또 다른 미생물로부터 냉동건조된 미생물 바이오메스 분말이 50℃ 및 pH 8.0에서 0.75 내지 3.00 g/L의 농도로 케라티나제의 처리에 의해 가수분해된다 (효소/기질 비율 1:67 내지 1:17로).
가수분해 반응은 최대 6시간 동안 진행된다. 배양 동안 케라틴 또는 단백질 분해가 측정되고 용존 질소 분율로서 표현된다. 또한, 가용성 단백질의 양의 증가 및 액상의 총 유리 아미노산의 증가가 기록된다. 가수분해물의 유리 아미노산 조성 또한 결정된다. 크예달 방법으로 측정된 용액의 질소 함량은 건조분 (케라틴 또는 미생물)의 총 질소 함량에 대한 백분율로 표현된다. 가용화된 원래의 바이오매스에서 N-함량 일부가 결정된다. 공시료 (효소 없음)와 비교한 단백질 가용화의 증진이 결정된다. 단백질 가용화에 미치는 프로테아제 효소의 상이한 농도의 효과가 결정된다. 시간의 함수로서 용해성 단백질 증가가 측정되고 효소 반응의 시간 경과가 결정된다.
이전에 식물에 미치는 긍정적인 효과가 밝혀진 아미노산이 측정된다. 획득된 가수분해물의 아미노산 함량 (총 함량의 %)의 비교는 문헌에 기술된 단백질 가수분해물의 조성과 비교된다.
양성 대조군으로서 P. marquandii의 케라티나제를 후프 및 혼 기질에 적용하면 4,000 mg/L 이상의 가수분해물에서 효소 농도와 유리 아미노산 농도에 따라 5시간에 4 g/L 내지 5 g/L의 가용성 단백질이 획득될 것으로 예상된다.
추적 실험에서, 단백질이 풍부한 바이오매스를 수증기, 이어서 효소적 가수분해로 처리하여 테스트된다. 수증기 전처리 유무에 따른 질소의 용해화가 비교된다. 수증기 전처리된 단백질이 풍부한 바이오매스 대비 수증기 처리되지 않은 물질의 프로테아제에 의한 가수분해의 시간 경과를 비교한다. 기질로부터 용액으로 방출된 단백질, 펩티드 및 아미노산의 양은 수증기 처리된 및 처리되지 않은 것 사이에 비교된다. P. marquandii의 케라티나제를 수증기 처리되었던 분말화된 후프 및 혼 기질에 적용하는 양성 대조군에서, 케라틴 질소의 98% 가용화가 예상된다.
유사한 실험이 C1 탄소원을 포함하나 이에 한정되지 않는 기질 상에서 자란 Streptomyces 종을 포함하나 이에 한정되지 않는 본원에 기술된 균주로부터의 프로테아제를 테스트하여 수행된다.
실시예 17
효소적 PH 공정
도 21은 수용성 세포 현탁액 형태에서 배양액이 알칼리 처리, 이어서 물리적 처리 및 효소적 가수분해를 거쳐서 직접적으로 유기 효소 추출물을 획득하는, 본원에 기술된 방법의 일 구현예의 블록도를 나타낸다. 일부 경우에, 농축 및/또는 분리 및/또는 건조의 추가 단계가 수행되어 다양한 유기 효소 추출물 산물을 제공한다. 이러한 접근법의 실험적 테스트에서, 본 발명의 방법에 의해 획득된 추출물의 펩티드 프로파일이 결정된다.
실험은 도 21에 도시된 블록도에 따라 수행된다. 배양액 500 mL에서 건조물의 백분율은 10 내지 11% w/w 및 w/v의 목표로 측정된다. 배양액에서 세포의 화학적 조성 (예로, % C, H, O, N, P, K, S)도 역시 결정된다. 배양액은 개방된 반응기에서 교반하면서 (60 내지 80 RPM) pH 9.6이 되도록 첨가된 28% NH3로 처리된다.
알칼리 처리 후, 혼합물을 고압멸균기에서 115kPa의 압력 및 120℃의 온도로 20분 동안 처리한다. 이렇게 얻은 용액을 수산화 칼륨 10 M로 pH 9.2로 조정한다. 이 pH 9.2 용액은 항온 수조에서 교반하면서 (60 내지 80 rpm) 55°C로 유지되고, 0.3% v/v의 섭틸리신이 (아조카세인 검정에 따라 70,000 단위의 활성을 갖는 프로테아제 원액으로부터) 첨가된다. pH는 28% 암모니아로 유지된다. 이들 가수분해 조건은 24시간 동안 유지된다. 결과로 얻은 가수분해물은 24시간째 수집되고, 화학적 조성 (예로, % C, H, O, N, P, K, S)도 역시 결정된다. 가수분해의 질소 및 유기물 수율이 결정된다.
가수분해물의 부피를 측정한 후, 70℃의 항온 수조를 갖는 회전 증발기에서 가수분해물을 5배 농축하여 농축된 가수분해물을 얻는다. 건조물의 중량%는 농도에 따라 측정되며, 건조물의 50 내지 55 중량%를 목표로 한다. 실험은 이 농축된 가수분해물이 안정한 시럽의 형태를 취하는지 여부를 테스트한다.
또 다른 부피의 가수분해물을 측정하고 4000 G에서 30분 동안 원심분리한다. 가용성 가수분해 분획으로 불리는 상청액의 부피 및 불용성 가수분해 분획이라 불리는 펠렛의 중량을 구한다. 각각의 건조물 함량뿐만 아니라 둘 다의 분획에서 건조물의 화학적 조성 (예로, % C, H, O, N, P, K, S)도 역시 결정된다. 각각의 분획의 유기물 수율이 결정된다. 각각의 분획의 아미노산 조성, 뿐만 아니라 이의 펩티드 프로파일도 또한 확립된다. 300 Da 미만의 크기를 갖는 펩티드는 유리 아미노산 및 작은 펩티드와 관련된다. 이러한 유리 아미노산 및 작은 펩티드의 함량이 결정된다.
가용성 가수분해물의 농도를 측정하고 부피 및 유기물 w/w %를 측정한다. 가용성 가수분해물 농도가 관찰된다 (예로, 시럽과 유사한지 여부). 불용성 가수분해물 분획을 90℃에서 건조시키고, 최종 중량 및 수분 함량을 측정한다.
실시예 18
핵산이 감소된 단백질 추출물
고압 균질화는 본 발명에 따라 배양된 세포에 적용된다. 조건은 내인성 핵산 분해효소의 활성을 유지하고, 수확될 단백질을 보존하고, 임의의 성분을 부여하지 않으면서 대부분의 세포를 파열시키는 견지에서 최적의 조건을 확인하도록 테스트된다. 다음의 균질화 매개변수가 테스트된다: 5,000 내지 15,000 psig의 압력; 32°F 내지 122°F의 온도 및 pH 4.5 내지 6.5; 1 내지 5회의 균질화기 통과. 파열된 세포 (균질물)는 희석되고, 가온되거나 냉각되고, 가공 및 핵산 분해효소 및 단백질 추출 능력을 증진하도록 필요에 따라 pH가 조정될 수 있다. 균질물은 pH 5.5 이상으로 조정되고, 특히 pH 8 내지 11 범위가 5 내지 60분 동안 40°F 내지 140°F의 온도에서 테스트된다. 목적은 핵산 분해효소, 단백질 및 기타 알칼리 용해성 물질을 추출하는 것이다. 균질물은 원심분리 및/또는 여과에 의해 불용성 세포벽 잔류물 및 알칼리성 추출물이라고 지칭되는 가용성 추출물로 분리된다. 내인성 핵산 분해효소의 추출 및 이용에 영향을 미치는 요인은 핵산 분해효소 함량, pH, 가공 온도, 반응 시간, 기질 농도, 활성인자 및 저해제이다. 이들 요인은 상호작용하여 단백질 조성 및 수율에 영향을 미치고, 단백질 수율을 극대화하고/거나 핵산 오염을 최소화하도록 최적화된다. 세포벽 잔류물로부터 글리칸 산물을 개발하려는 시도는 1972년 11월 29일자로 일련번호 310,452로 제출된 효모 글리칸 및 이의 제조 방법이라는 명칭으로 된 특허출원에 기술된 효모 글리칸 산물과 유사하게 수행된다. 베이커의 효모 글리칸은 효모 Saccharomyces cerevisiae의 분쇄되고, 세척되고, 저온 살균되고, 건조된 세포벽이다. 이것은 주로 건조 고체 기준으로 85% 이상인 긴 사슬 탄수화물로 구성된다. 탄수화물은 대략 2 : 1의 비율로 글리칸 및 만난 단위로 구성된다. 이것은 샐러드 드레싱, 냉동 디저트 유사품, 사워 크림 유사품, 치즈 맛 및 사워 크림 맛 스낵 딥에서 유화제 및 유화제 염 및 안정제와 증점제 및 텍스처라이저로서 사용될 수 있다.
세포벽 잔류물의 분리 후, 남은 가용성 잔류물을 배양하여 내인성 핵산 분해효소가 핵산 중합체를 분해하도록 허용한다. 테스트된 배양 조건은 40° 내지 60°C, pH 5 내지 8 및 15 내지 120분의 시간의 범위를 갖을 것이다. 단백질은 원심분리로 분리된다. 핵산 분해효소 반응 단계의 종결 시, 시스템은 단백질 슬러지의 원심분리 속도를 증가시려고 다양한 방법으로 처리된다. CaCl2 고형분의 0.1 내지 1.0 중량%가 단백질의 회수를 촉진하도록 테스트된다. 테스트된 원심분리 조건은 pH 4 내지 7 및 4° 내지 90°C의 온도 범위를 갖을 것이다. 내인성 핵산 분해효소 반응의 완료 후 및 원심분리 전에 염화칼슘 첨가가 원심분리 속도 또는 처리량을 유의하게 개선하는지 여부를 테스트한다. 일 가능한 구현예의 블록도가 도 22에 제공된다.
핵산 분해효소 반응 혼합물은 원심분리에 의해 저 RNA-단백질 슬러지 분획 및 가용성 세포질 성분 분획으로 분리된다. 가용성 세포질 성분 분획이 조성에 대해 테스트된다. 핵산 단편, 일부 단백질 및 단백질 단편, 글리코겐 및 비타민을 포함한 많은 대사 중간체를 포함할 것으로 예상된다. 가용성 세포질 성분은 총 미생물 분획의 소중한 부분을 구성할 것으로 예상되며 효모 추출물 또는 산성 유청과 유사한 응용 분야를 가질 것으로 예상된다.
불용성 단백질 분획의 물 세척은 맛에 미치는 효과를 테스트한다. 추가적인 진공 탈수 단계를 테스트한 후 분말로 건조시킨다. 테스트된 진공 조건은 20 내지 28 인치 Hg, T = 120oF 내지 200oF에서, 10 내지 60분 동안의 범위이다. 최종 건조 단계에 진입하는 고체 함량은 5% 내지 25% 고체 범위에서 테스트된다. 테스트된 건조 방법은 분무 건조화, 드럼 건조화, 동결 건조화 등을 포함한다.
분말의 조성이 테스트된다. 무-세포 조성물 및 생존 세포의 부재가 검증된다. 대략적인 분석은 단백질, 핵산 (목표 약 3% 미만), 지질, 회분, 탄수화물, 섬유, 기타 바이오매스의 건조 고형분 기준으로 한 중량으로 조성을 확립하도록 수행된다. 비타민 및 미네랄 함량도 마찬가지로 결정된다.
실시예 19
Cupriavidus necator 로부터 단백질의 제조
본 발명의 방법에 따라 H2 및 CO2 상에서 자란 바이오매스에는 세 번의 물 세척이 제공되고, 필요하면 11 중량%의 고형물로 원심분리하여 농축된다.
45 파운드의 C. necator 고형분을 포함한 50 갤런의 현탁액을 45°F로 냉각시키고 8,000 PSIG의 압력으로 균질화한 후 바로 45°F로 냉각시킨다. 균질화는 총 3회 반복되었다. 균질물을 물로 150 갤런 부피의 물로 희석하고, 식품 등급 알칼리 시약인 수산화나트륨을 pH 9.5에 도달할 때까지 첨가한다. 재료는 15분 동안 교반한 다음 원심분리한다. 불용성 잔류물 (세포벽 잔재물)이 제거된다. 균질물 고형물의 초기 양이 알칼리 추출물 용해성 바이오매스 및 불용성 바이오매스의 균질화, 추출 및 분리 이후에 회수와 함께 계량된다. 알칼리 추출물은 하나의 정상 염산의 첨가에 의해 pH 6.0으로 조정되고, 122°F로 가온된다. 추출물은 내인성 핵산 분해효소가 핵산을 분해할 수 있도록 pH 6.0에서 1시간 동안 약하게 흔들어 준다.
비교를 위한 동시적 전개는 알칼리 추출물을 pH 7; 50℃에서; 2 시간 동안 외인성 핵산 분해효소로 처리하는 것을 수반한다. 외인성 핵산 분해효소는 맥아 발아로부터 추출되어 18 파운드의 C. necator 추출물 고형분 당 9 파운드의 맥아 발아 추출물 고형분의 속도로 사용된다.
비교를 위한 다른 동시적 전개: 1) 저온, 고 알칼리 공정을 사용하여 RNA를 감소시킨다. 이 공정에서 균질물로부터의 알칼리 추출물을 NaOH로 pH 12로 조정하고 60℃에서 2시간 동안 가열한다. 단백질은 시스템을 pH 4.5로 조정한 후 단리된다. 2) 고온, 저 알칼리 공정을 사용하여 RNA를 감소시킨다. 이 공정에서 균질물로부터의 알칼리 추출물을 pH 10.5로 조정하고 80℃에서 4시간 동안 가열한다. 단백질은 시스템을 pH 4.5로 조정한 후 단리된다.
배양 종결 시 37.5 g의 염화칼슘을 첨가한다. 단백질 현탁액을 175°F로 가온하고, 원심분리하여 단백질 슬러지 및 산 유청을 수득한다. 각각의 분획에서 건조 고형물의 중량을 측정한다. 단백질 슬러지는 2배 용량의 물로 희석하고, 온도를 175°F로 유지하면서 다시 원심 분리함으로써 세척하고, pH는 6.0으로 유지한다. 건조 고형분 기준으로, 세척된 고형분의 양과 함께 세척된 단백질 슬러지의 양이 측정된다. 세척된 단백질 슬러지는 175℉, pH 6에서 20% 고형물로 진공 (28 인치 Hg)에서 농축되고 분무 건조된다. 수분%, 조단백질 (NX 6.25)%, 핵산%, 지질%, 회분%, 탄수화물% (차이)를 포함하는 분무 건조된 산물의 조성을 측정하였다.
상기 기술된 다양한 방법에 의해 핵산 함량이 감소되었던 분획화되지 않은 C. necator 및 단리된 C. necator 단백질의 영양적 품질이 비교된다. 분획화되지 않은 바이오매스는 물로 세 번 세척하고 분무 건조된다.
필수 아미노산 함량은 모든 시료에 대해 결정된다. 함량은 FAO 단백질 요구량 위원회 (1957b)의 "FAO 영양적 연구 No. 16"에서 인용된 것과 비교되며, 테스트용 래트가 자라기 위한 아미노산 요구사항을 충족하거나 초과할 수 있는 방법을 결정하도록 분석된다.
단백질 당량 비율 또는 PER은 카제인 기준선에 대해 결정된다 (PER = 2.5). 급식 테스트는 식이에서 10% 수정된 단백질 수준을 사용한 래트로 수행된다. A.O.A.C. p. 800, 11th Edition (1970)의 공식 분석 방법에 발표된 테스트 절차에 따른다. 일부 테스트는 RNA를 감소시키는 시도가 없는 분획화되지 않은 C. necator 바이오매스를 사용하여 수행된다.
분획화되지 않은 바이오매스 대비 단백질 단리물의 PER 및 RNA 함량을 비교한다. 배타적으로 내인성 핵산 분해효소를 사용하여 제조된 단리물은 또한 외인성 핵산 분해 소를 사용하여 제조된 단리물 및 더 강력한 알칼리 공정을 사용하여 제조된 단리물 균주와도 비교된다.
실시예 20
PH에서의 바이오자극제 효과의 테스트
트리카복실산 순환에서 작용하는 효소를 코딩하는 유전자의 전사 양상에 미치는 PH의 효과는 역전사 중합효소 연쇄 반응을 통해 분석된다. 연구된 효소를 인코딩하는 유전자들의 전사체 축적이 PH 처리에 의해 상향 조절되는지 여부를 결정하도록 연구된다. 효소적 활성도 마찬가지로 테스트한다. 동일한 접근법이 태닝 잔류물의 가수분해로부터 유래된 것과 같은 대조군 PH 산물의 바이오자극제 효과를 입증하는데 사용된다.
실시예 21
바이오자극제 생산 및 테스트
본원에 기재된 바와 같은 C1 공급 원료로부터 생산된 박테리아 세포 크림은 막 여과에 의해 단리된다. 세포 크림의 총 고체 함량 및 총 질소 함량이 측정된다. 목표로 하는 양은 각각 대략 8 중량% 및 0.8 중량%이다. 점도도 마찬가지로 측정된다. 대략 300 mL의 세포 크림에 황산을 첨가하여 세포 크림의 pH를 3.5로 조정한다. 가수분해는 pH 조절된 세포 크림을 500 mL의 얼렌메이어 플라스크에 채우고, 호일로 덮어서 16 lbs 압력 하에서 24시간 동안 128℃에서의 고압 멸균기에 배치함으로써 수행된다. 가수분해 이후에, 세포 크림 (가수분해물)의 점도가 다시 측정된다. 이것은 가용물과 불용물의 명확한 분리로 크게 감소될 것으로 예상된다. 냉각 후, 가수분해물을 20 마이크론 종이 필터로 여과하고 가용성 분획을 추가의 분석을 위해 수집 하였다. 가용성 분획의 전체 고형분 함량 및 총 질소 함량을 측정한다. 가용성 분획은 대조군 처리와 비교하여 시간 경과 시 싹 밀도 변화를 측정함으로써 잔디에서 식물 호르몬 반응을 유도하는 이의 능력에 대해 테스트된다. 70일 실험 기간 동안, 온실에서의 잔디 플롯은 물, 황산 암모늄 또는 가용성 분획으로 격주로 엽면 처리된다. 황산 암모늄과 가용성 분획 둘 다는 1,000 평방피트 당 0.05 lbs의 질소량으로 적용된다. 잔디 발아 밀도는 0일, 44일 및 70일째 측정된다. 가용성 분획으로 처리된 잔디는 대조구 처리와 비교하여 0일부터 70일째까지의 발아 밀도의 통계적으로 유의한 (p <0.05) 증가에 대해 테스트되었다.
실시예 22
래디쉬의 성장에 미치는 산업 미생물 세포 매스 및 가수분해물의 효과향
실험은 적색 래디쉬 (Raphanus salivus) 버라이어티 챔피언의 성장과 수확량에 대한 상이한 비료 처리의 효과를 측정하도록 설계되었다. 종자는 분무 베드에서 발아시키고, 물이끼, 펄라이트 및 버미큘라이트를 각각 20 : 5 : 5의 비율로 포함하는 직경 6 인치의 포트에 이식한다. 포트는 주 당 3일 200 mL의 물을 준다. 발아 기간 동안에는 비료가 제공되지 않는다. 처리 비료는 이식하는 당일에 적용된다. 처리는 비료가 없는 음성 대조군, 양성 대조군, 황산암모늄을 갖는 실험군, 시판되는 9-3-6 비료를 갖는 실험군 및 프로테아제 및 파파인에 의한 가수분해로 얻은 가수분해물을 포함한다. 가수분해물은 높은 및 낮은 정량 (예로, 110 kg N/헥타르 및 28kg N/헥타르)으로 적용된다. 양성 대조군은 높은 정량 (예로, 110kg N/헥타르)과 매칭하는데 적용된다. 질소의 높은 비율, 예로 110kg/ha는 래디쉬 생산의 요구량을 충족할 것으로 예상된다. 질소의 낮은 비율, 예로 28 kg/ha는 N에 대한 요구량 미만일 것으로 예상된다. 각각의 처리는 완전히 무작위화된 블록 설계에서의 4개 사본에 적용된다.
가수분해물은 본 발명에 따른 C1 급식 사료로부터 생산된 SCP 배양액 (ca. 10% 총 고형분)을 포함할 수 있다. 단백질성 배양액은 파파인 (리퀴파놀® T-100, Enzyme Development Corporation, New York, N.Y.) 및 세균 프로테아제 (엔제코® 알칼리성 프로테아제 L660 Enzyme Development Corporation, New York, N.Y.)를 각각 첨가하기 전에 30% 수산화칼륨으로 pH 7 또는 9로 조정함으로써 가수분해된다.. 세포 크림은 교반기에 의해 일정하게 교반하면서 총 24시간 동안 가수분해되고, 온도는 수조에서 60℃로 유지된다. 효소는 가수분해물을 120°C에서 5분 동안 고압 멸균함으로써 변성된다.
모든 비료 처리에 대한 래디쉬 중량을 비료가 없는 것과 비교한다. 황산암모늄 및 대조군 9-3-6의 비교는 인 또는 칼륨에 대해 충족되지 않은 요구사항이 있는지 여부를 테스트한다. 차이가 없으면 P 및 K의 수준이 적절한 점을 지지한다. 프로테아제 및 파파인 가수분해물로의 낮은 N 처리는 높은 N 처리와 비교된다. 낮은 질소의 경우는 더 적은 질소로 높은 수확량이 가능한지 및 래디쉬 생산을 위한 질소 사용의 효율이 통계적으로 더 높은지 여부를 확인하기 위해 테스트된다. 개선된 효율은 바이오자극제 효과를 반영하며, 가수분해된 세포 크림이 더 낮은 영양분 유입으로 뿌리 작물 생산을 증가시킬 잠재력을 갖는 점을 지지한다.
실시예 23
수경법 시스템의 가수분해물 테스트
본 실험의 목적은 미생물 유래된 PH가 래프트 부유 수경법 시스템에서 자란 양상추의 성장 및 질소 흡수를 증진시킬 수 있는지 여부를 결정하는 것이다
부유 래프트 또는 DWC (심수 배양)는 특정 유형의 채소, 특히 양상추의 대량 생산에 맞추어져 있다. 양상추 묘목은 보통 식물의 뿌리를 수용하기 위해 여러 개의 구멍을 잘라낸 대형 폴리스티렌 시트로 제작되는 부유 래프트에 배치된다.
청정한 산소가 포함된 물이 필수적이다. 식물 뿌리는 산소가 무겁게 공급된다. 뿌리 자체는 항상 물 속에 잠겨있다. 흙 입자는 식물의 흰 뿌리에 부착되어 식물 뿌리가 식물이 성숙하고 성장하게 할 필수 산소와 미네랄을 흡수하지 못하도록 방해하기 때문에 제거할 필요가 있다.
부유하는 래프트 시스템은 일정한 간격으로 많은 공기 스톤을 사용하여 무겁게 식물 뿌리에 산소 공급한다. 이 지역에 들어가는 물은 이제까지 고체 대부분이 없어야 한다. 식물 뿌리는 청결하고 흰색을 띠어야 한다. 양상추는 신속하게 자라고 수확이 쉽게 이루어져야 한다.
전체 및 감소된 수경 영양분 용액 농도를 사용하여, PH의 주간 엽면 적용은 신선한 바이오매스, SPAD 인덱스 및 N 섭취에 대해 테스트된다. PH의 물로의 도입도 마찬가지로 테스트된다.
SPAD 인덱스는 잎의 녹색 및 두께를 결정하도록 두 개의 파장에서 잎을 통한 광 투과를 측정하는 기구를 사용하여 결정된다. 적외선 범위의 투과는 잎 두께와 관련된 측정을 제공하고, 적색광 범위의 파장은 녹색을 결정하는 데 사용된다. 두 개의 파장의 투과율은 CCI 또는 대안적으로 SPAD 인덱스라고 지칭되는 클로로필 함량 인덱스를 제공한다. CCI는 선형 척도이고, SPAD는 로그 척도이다. 이들 기구 및 척도는 매우 높은 수준을 제외하고는 클로로필 함량에 대한 클로로필 화학 테스트와 상관되는 것으로 나타났다. 클로로필 함량 측정기는 질소 스트레스 및 황 스트레스를 포함하는 영양분 식물 스트레스 측정에 공통적으로 사용된다.
실시예 24
버섯 성장 증진제 제형물
버섯 성장 증진제는 본원에 기술된 방법에 따라 이에 한정되는 것은 아나지만 C. necator와 같은 본원에 기술된 바와 같은 고단백질 세포에 의해 생산된다. 성장 및 수확 이후, 세포 매스는 이의 수분 함량이 13 중량% 이하가 되도록 탈수되고 건조된다.
건조된 바이오매스 입자 크기는 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 표준화된다. 입자 크기의 집중 분포가 최적화된 평균 크기에서 생성된다. 최적의 평균 크기는 버섯 퇴비를 통한 적절한 분배 및 영양분 이용가능성을 제공하도록 결정되고, 세균 또는 외래 곰팡이와 같은 경쟁 미생물에 의한 입자의 신속한 활용을 가능하게 할 수 있는 너무 많은 영양분이 사용되지 못하도록 한다. 이러한 제조 공정의 단계에서, 건조 입자 산물을 분석하여 산물에 주로 -10 + 30 미국 표준 메쉬 (플러스 또는 마이너스 5%) 이하의 입자가 포함되는 점을 검증한다. 산물은 임의의 생존가능한 오염 유기체의 존재에 대해 테스트된다.
산물의 탄수화물 함량은 실험적으로 테스트된다. 탄수화물은 일반적으로 원하지 않는 외래 미생물의 핵심 성장자극제이기 때문에 낮은 탄수화물 산물이 목표가 된다. 따라서 낮은 탄수화물은 이러한 유기체의 증식을 제한한다. 특정 비제한적인 구현예에서, 탄수화물은 제거되어 단위 중량 당 단백질 함량 및 결과로 얻은 효능을 추가로 증가시킨다.
산물이 상기 표준을 충족하면, 믹서 유닛 (Forberg Model C200-SS-2D 또는 등가물)으로 이동된다. 믹서 유닛에서 산물은 방부제와 결합된다. 바람직한 방부제는 구리-포함, 카바메이트, 페놀성 및 항생제 화합물을 포함하며, 이의 구체적인 예는 다음과 같다:
1. 구리-포함 물질 - 황산구리 단독 또는 석회와의 조합.
2. 카바메이트 물질 - 메틸1-(부틸카바모일)-2-벤즈이미다졸카바메이트; 아연 에틸렌비스디티오카바메이트.
3. 페놀성 물질 - o-페닐페놀; o-벤질파라-클로로페놀 및 이들의 염.
4. 항생제 물질 - 스트렙토마이신; 테라마이신.
선택된 제제는 퇴비 중에 외래 미생물 활성으로부터 산물을 보존하는데 효과적인 양으로 첨가되지만, 버섯 균사체에 의한 이의 활용을 방해하지는 못한다.
남은 공정 단계는 바람직하게는 연속 모드로 수행된다. 다음 단계는 산물을 저온 살균하는 것이다. 저온 살균을 달성하기 위해, 산물은 건조기 장치 (Nara Paddle Dryer Model 1.6W 또는 등가물)에서 가열된다. 건조기는 대략 5분 동안 주변 온도부터 220°F까지 산물의 온도를 상승시키도록 작동된다. 나라 패들 드라이어 모델 1.6W를 사용하여, 이것은 대략 325°F에서 95 psi 수증기를 주입하여 발생한다. 저온 살균은 다음 목적을 달성하는 것을 목표로 한다: (1) 적어도 로그 3으로 식물성 세균 및 몰드 플레이트 계의 감소; (2) 중온성 세균 포자의 불활성화; 및 (3) 리포옥시게나제의 불활성화. 그러나, 상기 기술된 열량은 산물을 실질적으로 변성하기에 충분하지 않도록 의도된다. 저온 살균은 증식 전개 동안 외래 미생물에 의한 초기 및 원치않는 열 생생의 가능성을 줄이도록 의도된다. 살아있는 미생물의 저온 살균 전후 수준이 결정된다.
저온 살균이 완료된 후, 산물은 진동식 유동화된 베드 컨베이어 (Jeffrey Dresser Industries, Model IXIO TMV 또는 등가물)로 구성된 냉각기/증발기 유닛으로 이동된다. 냉각기/증발기 유닛은 2500 CFM에서 주변의 여과된 공기를 사용하여 산물 온도를 220oF부터 100oF까지 대략 1 내지 2 분 내에 낮춘다. 이러한 방식으로 냉각시킨 후, 산물의 수분 수준을 측정한다. 이 단계에서 목표 수분 수준은 약 7.5%이다. 산물의 수분 함량은 저온 살균/냉각 단계 동안 산물의 온도 프로파일뿐만 아니라 상기 기술된 공정 동안 측정되고 추적된다.
상기 기술된 바와 같이 산물으로부터 물의 증발은 세균 포자를 포함하여 저온 살균 동안 살균되지 않은 미생물에 의한 부패를 방지하도록 의도된다. 1 내지 2분 내의 100oF로의 급속 냉각은 단백질 변성을 방지하도록 의도되고, 단백질 변성은 산물이 고온에서 유지되는 시간의 양에 비례한다.
결과로 얻은 최종 버섯 성장 증진제 산물은 실질적으로 변성되지 않은 단백질 물질을 포함하도록 의도된다. 변성은 단백질의 3차 또는 4차 구조의 변형을 수반하며, 결과적으로 단백질의 물리적 및 생물학적 성질이 변화된다. 본원에서 사용된 바 용어 "실질적으로 변성되지 않은"은 "PDI" 또는 "단백질 분산성 인덱스"로 불리는 인덱스에 의해 반영된다. PDI를 측정하는 것은 물로 세포 산물을 추출하고 크예달 분석을 사용하여 추출된 부분을 분석하는 것을 수반한다. 크예달 분석을 시행할 때, 산물은 조합된 질소를 황산암모늄으로 전환시키는 농축된 H2SO4로 소화된다. 다음으로, 결과로 얻은 용액을 알칼리 물질로 처리하여, 암모니아를 유리시킨다. 유리된 암모니아의 양은 표준 산으로 적정하여 결정된다. 다음으로 적정 결과를 사용하여 산물에서 질소량을 계산할 수 있다. PDI를 계산하기 위해, AOCS 방법 Ba 10-65에 제공된 공식이 사용된다. 본원에서, "실질적으로 변형되지 않은" 단백질은 PDI가 50 이상인 단백질을 특징으로 한다. PDI 분석은 산물에 대해 수행되고, PDI 또는 대략 11.4를 갖는 것으로 보고된 포름알데히드 변성된 대두 재료를 사용하여 시판되는 산물과 비교된다. 단백질, 수분, 지방, 회분, 조섬유, 탄수화물의 함량을 포함하여 버섯 성장 증진제의 대략적 분석이 수행된다. 칼로리 함량도 역시 결정된다.
버섯 성장 증진제는 제조 직후에 사용되거나, 나중에 사용하기 위해 건조하고 시원한 장소에 백에 담아 저장된다. 사용 시, 산물은 퇴비와 균일하게 배합되며, 바람직하게는 버섯 재배의 산란기에 배합된다. 배합된 퇴비/성장 증진제 산물은 14일 산란 진행 동안 75 내지 85°F의 온도 범위 내에서 유지된다. 이 범위 외부의 온도, 특히 90oF 초과하는 온도는 수율 및 품질의 실질적인 손실을 유도할 수 있다. 최적의 결과를 위해 퇴비에 첨가된 버섯 성장 증진제의 중량 백분율은 테스트를 통해 결정된다. 퇴비의 3.5% 건조 중량의 최적 성장 증진제 중량을 목표로 하거나, 보다 광범위하게 퇴비의 2 내지 5% (건조 중량) 범위를 목표로 한다.
실시예 25
버섯 성장 증진제 테스트
테스트에 사용된 퇴비는 닭 분뇨 (20,000 lb.), 면화 외피 (15,000 lb.), 황산칼륨 (700 lb.), 우레아 (300 lb.), 대두 분리물 (3,500 lb.) 및 면종자분 (7,000 lb.)과 결합된 밀짚 (46,700lb)으로부터 제조된다. 완성된 퇴비는 8 인치 깊이의 트레이에 놓고 트레이 당 4 파운드의 면종자 식물성 오일과 함께 저온 살균한다. 저온 살균 후, A. bisporus 버섯 포자의 트레이 당 4.2 파운드가 C1 기질 상에 성장한 단백질성 세포 매스로부터 상기와 같이 제조된 보충제 물질과 조합하여 2 내지 6 중량% 범위의 첨가물과 함께 퇴비에 첨가된다. 양성 대조군은 시판되는 콩 단백질 기반의 제형물이다. 음성 대조군은 퇴비에 보충제가 전혀 첨가되지 않는다. 백분율 보완은 평방피트 당 6.5 파운드의 퇴비 건조물에 기초한다. 모든 보충제는 표준 메쉬를 사용하여 유사한 입자 크기를 갖도록 테스트된다.
보충제를 첨가한 후, 물을 다음으로 트레이에 첨가하여 내용물의 수분 함량 수준을 대략 70%까지 올립니다. 다음으로, 트레이는 90 내지 95%의 상대 습도를 갖는 제어된 환경실에 배치된다. 퇴비 온도는 78 내지 82°F 사이로 유지된다. 포자 성장 13일째, 토양을 부드럽게 하는 1.75 인치 층이 퇴비 표면에 도포되고 용량까지 물을 준다. 다음으로 트레이가 제어된 환경실 (65° 내지 73°F; 10,000 ppm CO2)에서 13일 동안 유지되고, 이어서 60°F 및 800 ppm CO2로 급격한 공기 온도 및 CO2 변화로 버섯의 결실을 유도한다. 다음으로 트레이는 생산실에 배치하고 매주 4회 세척을 위해 수확된다. 관련된 기간 (a) 1 단계 퇴비화 - 56일; (b) 2 단계 퇴비화 - 6일; (c) 포자 산란 - 13일; (d) 사례 보유 - 13일; 및 (e) 수확 - 32일과 같다. 버섯의 평균 총 수확량 (kg/m2)이 실험 및 조절을 위해 결정된다.
실시예 26
육류 대체물을 위한 식품 가공
상기 기술된 바와 같이 생산된 감소된 핵산 함량을 갖는 고단백질 산물 (HPP)은 식품 성분으로서 사용된다.
제조:
1. 필요한 양의 HPP를 계량하고, 호바트 믹싱볼에 둔다.
2. HPP에 대한 대략 3 : 2의 비율로 물을 측정하고 대략 1 : 60의 비율로 물에 카라멜 색상을 첨가한다. 속도 I에서 믹서를 설정한다.
3. 호바트 믹서를 켜고 혼합하면서 호바트 믹싱볼의 HPP에 카라멜 색상의 물을 매우 천천히 첨가한다. 재료를 잘 혼합한다.
4. 고기 분쇄기 (예로, 호바트 부착)을 통해 배합된 재료를 압출하고 압출된 HPP를 건조기 트레이 또는 팬에 걸러낸다. 압출된 HPP는 압출기에서 나오는대로 원하는 길이로 절단할 수 있거나, 긴 가닥으로 모으고 건조시킨 후에 원하는 크기로 줄일 수 있다.
5. 대류 오븐에서 압출된 물질을 약 10%의 수분 함량으로 건조시킨다. 건조되고 텍스처를 갖는 HPP는 a) 실온에서 1 내지 2시간 동안 물 (과량)로 재수화하거나, b) 과량의 온수 (100 내지 140℉)로 1시간 동안 재수화함으로써 식품 산물 적용에서 추가의 용도를 위해 재수 화된다. 텍스쳐를 갖는 HPP에 대한 물 흡수율이 결정된다.
실시예 27
템페 생산을 위한 성장 증진제로서의 테스트 및 오카라를 갖는 테스트 제형물
오카라 (Okara) 두유/두부 제조 후 발생하는 대두 기반의 부산물이다. 이것은 상대적으로 단백질 함량이 높다. 오카라는 템퍼 스타터를 사용하여 곰팡이 Rhizopus oligosporus로 발효시킴으로써 템페 (Tempeh)로 전환되거나, 현미, 밀 불구어 (Bulgur), 대두 및 기타 콩과 식물 및 곡류 조합과 같은 성분을 사용하여 프레스 케이크 템페로 전환될 수 있다.
본 실험에서는, 본 발명의 세포 및/또는 이들의 추출물 및/또는 가수분해물이 오카라 기질과 조합하여 R. oligosporus의 성장 증진제로서 사용될 수 있는지 여부를 테스트한다. 또한, 성장 증진제로 생산된 결과적인 템페가 음성 대조군을 능가하는, 이에 한정되는 것은 아니지만 영양가와 같은 우수한 특징을 갖는지 여부도 테스트한다.
본 실험은 또한 세포, 추출물 및/또는 가수분해물이 오카라 단독으로 또는 현미, 밀 불구루, 대두 및 기타 콩과 식물 및 곡류 조합과 같은 기타 성분과 조합하여 프레스 케이크 템페의 생산에 사용될 수 있는지 여부를 테스트한다.
실시예 28
본원에 기술된 특정 구현예는 탄소 고정에 필요한 H2를 생산하도록 태양 및 바람과 같은 간헐적인 재생가능한 전원 공급원을 대체한다. CO2 공급원은 발전소와 같은 산업적 출처이다. 전기분해기는 일반적으로 낮은 전력 수요와 높은 재생가능한 전력 공급의 기간 동안 전력을 소비한다. 이러한 낮은 수요 및 높은 재생가능한 생성의 기간 동안, 재생가능한, CO2 배출이 없는 전기 공급의 함량은 텍사스, 스코틀랜드 및 독일과 같은 지역에서 최대 95%까지 도달할 수 있다. 따라서, 사실상 전해분해기는 물로부터 H2 생산을 위해 CO2 배출이 없는 전력을 사용하고, 임의의 CO2 집약적인 전력이라면 거의 사용하지 않을 것이다. 이러한 지역에서, 높은 재생가능한 전력 공급 및 낮은 그리드 수요 기간은 대략 50%의 시간에서 발생하므로 전기분해기는 대략 50%의 시간 동안 작동할 것으로 예상된다. 현장에서 H2 및 CO2 탱크 저장은 산업적 공급원으로부터의 CO2 생산 및 전기분해기로부터의 H2 생산 사이의 시간대의 차이를 완충하고, 이들 가스 둘 다를 CO2 고정화 생물공정으로 연속적으로 유동하게 한다. 화학독립영양성 크놀가스 미생물은 CO2, H2, 미네랄 영양분 (예로, NPK)를 고단백질 바이오매스로 전환시킨다. 이러한 단백질이 풍부한 바이오매스는 식물을 위한 바이오자극제 또는 버섯의 성장 보충제 또는 동물 사료 또는 인간을 위한 직접적인 영양분으로서 전환될 수 있다 (도 23 및 도 24). 전기분해기로부터의 O2는 미세호기성 크놀가스 생물공정의 요구량을 초과할 것이다. 이러한 잉여 O2는 유닛의 열 효율을 증가시키고, 유닛으로부터 나오는 배출 가스 흐름에서 CO2 농도를 증가시키기 위하여 순수한 가스 부산물로서 판매되거나 (도 25), 기타 화석 연소 또는 전원 유닛에 다시 급식될 수 있다. 증가된 CO2 농도는 탄소 포획 단계를 용이하게 한다.
탄소 중성을 달성하기 위해, 시스템은 바람직하게 높은 간헐적인 재생가능한 전력 생성을 갖는 지역에 위치한다. 전기분해기 유닛은 낮은 전력 수요와 재생가능한 전력 과잉공급 기간 동안에만 전력을 소비한다. 이것은 간헐적인 재생가능한 에너지로 인한 전기적 그리드 상의 균주를 진정시킬 것이다 (도 25). 비수기 동안 CO2의 포획, 소중한 영양분의 생산 및 과다한 재생가능한 생성으로부터 그리드 상의 균주의 진정에 추가하여, 시스템은 또한 재생가능한 성능이 심지어 비수기 동안에도 생성을 유지하도록 허용함으로써 재생가능한 성능을 완벽하게 활용할 수 있게 한다. 전기분해기 기술에 주요한 최신 응용은 높은 전력 수요 및 낮은 재생가능한 전력 공급 기간 동안 재생 가능한 전력의 공급 과잉 기간 동안 생산된 H2를 그리드 전력으로 전환하는 것이며, 사실상 H2로부터 전기로의 가치 사슬을 돌리는 것이다. H2 및 CO2는 단백질로 전환되고, 이로부터 식물, 버섯, 동물 및 인간의 영양분은 사실상 H2로부터의 가치 사슬을 계속 더 높입니다.
본 발명의 상세한 바람직한 구현예는 당업자가 본 발명의 전체 범위를 실행할 수 있도록 충분히 자세하게 본원에 설명되었다. 그러나, 이들 구현예는 예시적인 것이며, 구체적으로 기술되지 않은 본 발명의 많은 가능한 변형이 여전히 본 발명의 범위 및 첨부된 청구범위에 속하는 점을 이해해야 한다.
전술한 발명은 이해의 명료성의 목적으로 도시 및 실시예에 의해 일부 자세하게 설명되었지만, 당업자에게는 첨부된 청구범위에서 묘사되는 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않고도 특정 변경 및 변형이 실행될 수 있음이 자명할 것이다. 따라서, 상세한 설명은 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 고려되어서는 안된다.
본원에 제공된 설명은 단지 예로서 추가된 것이며 본 발명의 범위를 어떤 방식으로든 제한하도록 의도되지 않는다. 보다 일반적으로, 당업자라면 본원에 기술된 모든 매개변수, 치수, 재료 및 구성이 예시적인 것으로 의도되고, 실제적 매개변수, 치수, 재료 및/또는 구성은 특이적 적용 또는 본 발명의 교시가 사용되는 적용에 의존할 것임을 바로 이해할 것이다. 본원에서 수적인 제한 또는 범위가 진술된 곳에서, 종결점이 포함된다. 또한, 수적인 제한 또는 범위 내의 모든 수치 및 하위범위는 명시적으로 작성된 것처럼 상세하게 포함된다. 당업자라면 일상적인 실험만을 사용하여 본원에 기술된 본 발명의 상세한 구현예에 대한 많은 등가물을 인식하거나, 확증할 수 있을 것이다. 다양한 변화, 변형, 부가 및 차감이 가능한다. 또한, 본원에 기술된 많은 단계들이 순서대로 순열될 수 있고, 많은 단계들이 추가되거나 삭제될 수 있다. 따라서, 전술한 구현예는 단지 예로서 제시되고, 첨부된 청구범위 및 이의 등가물의 범위 내에서, 본 발명은 구체적으로 설명되고 청구된 것과 다르게 실행될 수 있음을 이해해야 한다.
본 발명은 본원에 기술된 각각의 개별적인 특징, 시스템, 품목, 재료, 키트 및/또는 방법에 관한 것이다. 또한, 이러한 특징, 시스템, 품목, 재료, 키트 및/또는 방법이 서로 불일치하지 않는 경우, 둘 이상의 이러한 특징, 시스템, 품목, 재료, 키트 및/또는 방법의 임의의 조합은 본 발명의 범위 내에 포함된다.
본원에 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허출원은 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허출원이 구체적으로 및 개별적으로 참고문헌으로 통합되는 것을 가리키는 것처럼 모든 목적으로 및 동일한 정도로 본원에 이들의 전문이 참고문헌으로 통합된다.

Claims (79)

  1. 하나 이상의 탄소 원자를 포함하는 무기 및/또는 유기 분자의 탄소 고정화 반응 또는 동화적 생합성을 통하여 생산된 아미노산, 단백질 및/또는 비타민을 포함하는 유기 분자로의 생물학적 전환을 위한 생물학적 및 화학적 방법으로서,
    하나 이상의 탄소 원자를 포함하는 무기 및/또는 유기 분자를 미생물 세포를 유지하는데 적합한 배양 배지에서의 미생물 세포를 포함하는 환경 내로 도입하고,
    상기 하나 이상의 탄소 원자를 포함하는 무기 및/또는 유기 분자는 상기 미생물 세포에 의해 성장 및/또는 생합성을 위한 탄소원으로서 사용되는, 단계;
    상기 하나 이상의 탄소 원자를 포함하는 무기 및/또는 유기 분자를 상기 미생물 세포 내에 포함된 적어도 하나의 탄소 고정화 반응 또는 적어도 하나의 동화적 생합성 경로를 통해 환경 내에서 아미노산, 단백질 및/또는 비타민을 포함하는 유기 분자 산물로 전환시키고,
    상기 탄소 고정화 반응 또는 동화적 생합성 경로가 화학적 및/또는 전기화학적 및/또는 열화학적으로 생성되었고/거나 환경 외부의 적어도 하나의 공급원으로부터 환경 내로 도입된 전자 공여체 및/또는 전자 수용체에 의해 제공된 화학적 및/또는 전기화학적 에너지에 의해 적어도 부분적으로 구동되는, 단계를 포함하고,
    상기 미생물 세포는 상기 아미노산, 단백질 및/또는 비타민을 포함하는 바이오매스를 포함하는, 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 미생물 세포는 세균 세포인, 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 미생물 세포는 미생물의 성장 및 생체산물의 생산에 적합한 조건 하에서 가스성 기질의 존재 시 배양될 때 아미노산 및/또는 단백질 및/또는 비타민 및/또는 바이오매스를 생산하는, 방법.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 가스성 기질은 CO2 및/또는 CO 및/또는 CH4를 탄소원으로서 포함하는, 방법.
  5. 제 3항에 있어서, 상기 가스성 기질은 H2를 포함하는, 방법.
  6. 제 3항에 있어서, 상기 가스성 기질은 H2 및/또는 O2를 에너지원으로서 포함하는, 방법.
  7. 제 3항에 있어서, 상기 가스성 기질은 H2 및/또는 CO 및/또는 CH4 중 하나 이상을 포함하는 전자 공여체를 포함하는, 방법.
  8. 제 3항에 있어서, 상기 가스성 기질은 열분해 가스 또는 생산자 가스 또는 합성가스 또는 천연 가스 또는 바이오가스를 포함하는, 방법.
  9. 제 3항에 있어서, 상기 가스성 기질은 H2 및/또는 CO2 및/또는 CO를 포함하는 가스의 혼합물을 포함하는, 방법.
  10. 제 1항에 있어서, 상기 미생물은 Cupriavidus 종 또는 Ralstonia 종인, 방법.
  11. 제 1항에 있어서, 상기 미생물은 Cupriavidus necator 또는 Cupriavidus metallidurans인, 방법.
  12. 제 1항에 있어서, 상기 미생물에 의해 생산된 상기 바이오매스 및/또는 유기 분자는 하나 이상의 다른 유기체에게 급식하거나 영양을 제공하는데 사용되는, 방법.
  13. 제 1항에 있어서, 상기 아미노산 및/또는 단백질 및/또는 비타민은 식물 바이오자극제 또는 버섯 성장 증진제를 생산 하는데 사용되는, 방법.
  14. 제 1항에 따라 생산된 바이오매스, 아미노산, 단백질 및/또는 비타민을 포함하는 식물 바이오자극제.
  15. 제 14항에 따른 식물 바이오자극제를 식물 및/또는 식물이 자라는 토양 및/또는 식물이 성장하는데 사용되는 액체 배지에 적용하는 단계; 및 상기 식물을 수확하는 단계를 포함하는, 작물을 처리하는 방법.
  16. 제 1항에 있어서, 상기 환경에서 생산된 바이오매스, 아미노산, 단백질 및/또는 비타민을 식물 및/또는 식물이 자라는 토양 및/또는 식물이 성장하는데 사용되는 액체 배지에 적용하는 단계; 및 상기 식물을 수확하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  17. 제 15항 또는 제 16항에 있어서, 상기 식물은 농작물인, 방법.
  18. 제 1항에 있어서, 상기 미생물 세포가 용균되고, 이로써 용균물을 생산하는, 방법.
  19. 제 18항에 있어서, 상기 용균물은 에멀전 또는 현탁액을 생산하는데 사용되는, 방법.
  20. 제 18항에 있어서, 상기 용균물은 불용성 및 가용성 분획으로 분리되는, 방법.
  21. 제 20항에 있어서, 상기 불용성 및/또는 가용성 분획은 농축되거나 건조되는, 방법.
  22. 제 18항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 따른 용균물, 에멀전, 현탁액 또는 이들의 분획을 포함하는, 식물 바이오자극제.
  23. 제 1항에 있어서, 상기 단백질은 가수분해되고, 이로써 가수분해물을 생산하는, 방법.
  24. 제 23항에 있어서, 상기 가수분해물은 에멀전 또는 현탁액을 생산하는데 사용되는, 방법.
  25. 제 23항에 있어서, 상기 가수분해물은 불용성 및 가용성 분획으로 분리되는, 방법.
  26. 제 25항에 있어서, 상기 불용성 및/또는 가용성 분획은 농축되거나 건조되는, 방법.
  27. 제 22항에 있어서, 상기 가수분해물을 여과되고, 이로써 여과액 및 여과물을 생산하는, 방법.
  28. 제 23항 내지 제 27항 중 어느 한 항에 따른 가수분해물, 에멀전, 현탁액, 이들의 분획, 여과액 또는 여과물을 포함하는, 식물 바이오자극제.
  29. 제 1항에 있어서, 상기 바이오매스는, 가수분해물을 획득하기 위해 상기 바이오매스를 가수분해하는 단계; 및 엽면 적용 및/또는 토양 아쥬반트 또는 첨가제로서 적용을 위한 및/또는 식물 성장을 위한 액체 배지에서의 사용을 위한 식물 바이오자극제로서 상기 가수분해물을 제형화하는 단계를 포함하는, 식물 바이오자극제의 생산에 사용되는, 방법.
  30. 제 29항에 따른 방법에 의해 획득된 식물 바이오자극제.
  31. 제 29항에 있어서, 상기 식물 바이오자극제를 식물 및/또는 식물이 자라는 토양 및/또는 식물이 성장하는데 사용되는 액체 배지에 적용하는 단계; 및 상기 식물을 수확하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  32. 제 29항에 있어서, 상기 가수분해하는 단계는 단백질을 유리 아미노산 및 올리고펩티드 중 적어도 하나로 가수분해할 수 있는 적어도 하나의 효소를 포함하는, 방법.
  33. 제 29항에 있어서, 상기 가수분해하는 단계는 산 가수분해를 수행하는 것을 포함하는, 방법.
  34. 제 29항에 있어서, 상기 가수분해하는 단계는 알칼리 가수분해를 수행하는 것을 포함하는, 방법.
  35. 제 3항에 있어서, 상기 미생물은 크놀가스 (knallgas) 미생물인, 방법.
  36. 제 35항에 있어서, 상기 가스성 기질은 H2 및/또는 CO2를 포함하는, 방법.
  37. 제 36항에 있어서, 상기 가스성 기질은 열분해 가스 또는 생산자 가스 또는 합성가스인, 방법.
  38. 제 3항에 있어서, 상기 가스성 기질은 도시 고체 폐기물, 블랙 리커, 농업 폐기물, 목재 폐기물, 공급 천연 가스, 바이오가스, 사워 가스, 메탄 하이드레이트, 타이어, 석유 코크스, 하수, 분뇨, 스트로, 리그노셀룰로스 에너지 작물, 리그닌, 작물 잔류물, 바가스, 톱밥, 산림 잔류물, 식품 폐기물, 폐 카펫, 폐 플라스틱, 매립 가스, 다시마, 해조류 및/또는 리그노셀룰로스 바이오매스로부터 유래되는, 방법.
  39. 제 1항에 있어서, 환경에서 생산된 아미노산 및/또는 단백질 및/또는 비타민 및/또는 바이오매스는 배양 배지로부터 회수되는, 방법.
  40. 제 1항에 있어서, 상기 탄소원은 단 하나의 탄소 원자를 포함하고, 상기 전자 공여체 및/또는 단 하나의 탄소 원자를 포함하는 분자는 가스화; 열분해; 수증기 개질; 및 자동개질 중 적어도 하나를 포함하는 유기물에 작용하는 열화학적 공정을 통하여 생성되는, 방법.
  41. 제 1항에 있어서, 상기 탄소원은 단 하나의 탄소 원자를 포함하고, 상기 전자 공여체 및/또는 단 하나의 탄소 원자를 포함하는 유기 분자는 메탄 수증기 개질을 통하여 생성되는, 방법.
  42. 제 40항 또는 제 41항에 있어서, 상기 가스성 기질은 가스화 및/또는 열분해 및/또는 자동개질 및/또는 수증기 개질로부터 생성된 H2, CO 및 CO2를 포함하는 가스 흐름으로부터 유래되고, 상기 가스화 및/또는 열분해 및/또는 자동개질 및/또는 수증기 개질로부터의 가스 유출량에서 상기 수소 대 일산화탄소의 비율은 상기 가스 흐름이 상기 미생물에 전달되기 이전에 물 가스 전환 반응을 사용하여 조정되는, 방법.
  43. 제 1항에 있어서, 상기 미생물 세포는 다음의 속 Cupriavidus 종, Rhodococcus 종, Hydrogenovibrio 종, Rhodopseudomonas 종, Hydrogenobacter 종, Gordonia 종, Arthrobacter 종, Streptomycetes 종 Rhodobacter 종 및/또는 Xanthobacter 중 하나 이상으로부터 선택된 미생물을 포함하는, 방법.
  44. 제 1항에 있어서, 암모니아; 암모늄; 일산화탄소; 디티오나이트; 황 원소; 탄화수소; 수소; 메타이아황산염; 질소 산화물; 아질산염; 소듐 티오설페이트 (Na2S2O3) 또는 칼슘 티오설페이트 (CaS2O3)를 포함하나 이에 한정되지 않은 티오설페이트와 같은 황산염; 황화수소와 같은 황화물; 아황산염; 티오네이트; 티오나이트; 전이 금속 또는 용해된 또는 고체 상에서의 이들의 황화물, 산화물, 칼코겐화물, 할로겐화물, 수산화물, 옥시수산화물, 인산염, 황산염 또는 탄산염; 및 고체 상태 전극 물질에서의 전도 또는 원자가 밴드 전자로부터 선택된 하나 이상의 전자 공여체를 포함하는, 방법.
  45. 제 1항에 있어서, 이산화탄소; 산소; 아질산염; 질산염; 제이철 또는 기타 전이 금속 이온; 황산염; 및 고체 상태 전극 물질에서의 원자가 또는 전도 밴드 홀으로부터 선택된 하나 이상의 전자 수용체를 포함하는, 방법.
  46. 제 1항에 있어서, 상기 생물학적 전환은 전자 공여체 및/또는 전자 수용체 및/또는 탄소원 및/또는 미생물이 요구하는 미네랄 영양분이 적어도 하나의 유입 화학물질로부터 생성되고/거나 정제되고, 및/또는 탄소 고정 단계에서 나오는 화학물질로부터 재활용되고, 및/또는 다른 산업, 광업, 농업, 하수 또는 폐기물 발생 공정으로부터의 폐기물 흐름으로부터 생성되거나 이에 포함되는 하나 이상의 화학적 전처리 단계가 선행되는, 방법.
  47. 제 1항에 있어서, 상기 전자 공여체 및/또는 전자 수용체는 온실 가스 배출이 낮은 재생가능한, 대체 또는 통상적인 전력 공급원을 사용하여 생성되거나 재활용되고, 상기 전력 공급원은 광전지, 태양열, 풍력, 수력, 원자력, 지열, 증진된 지열, 해저열, 해양 파력 및 조력 중 적어도 하나로부터 선택되는, 방법.
  48. 제 1항에 있어서, 상기 전자 공여체 및/또는 전자 수용체는 전기적 그리드 공급이 전기 그리드 수요를 초과하는 기간 동안 그리드 전기를 사용하여 생성되고, 저장 탱크는 상기 전자 공여체 및/또는 전자 수용체의 생성 및 상기 탄소 고정화 반응에서의 이들의 소모를 완충하는, 방법.
  49. 제 7항에 있어서, 상기 전자 공여체는 메탄 수증기 개질; 석유 정련; 철강 생산; 알루미늄 생산; 망간 생산; 클로로 알칼리 공정; 카본 블랙 제조; 메탄올 합성; 암모니아 합성; 야금 공정; 화학적 공정; 및 전기화학적 공정 중 하나 이상으로부터의 테일 가스로부터 유래된 H2 및/또는 CO 및/또는 메탄을 포함하는, 방법.
  50. 제 1항에 있어서, 상기 탄소원은 유기물의 가스화; 생석회, CaO를 생산하는 석회석, CaCO3의 하소화; 메탄 수증기 개질; 연소, 소각 또는 발염; 당의 혐기성 또는 호기성 발효; 메탄영양성 생물공정; 다른 유기체의 호흡, 폐수 처리; 매립 가스, 인산나트륨 생산; 지질학적으로 또는 지열로 생산되거나 배출된 가스; 산성 가스, 신 가스 또는 천연 가스; 해수 또는 표면 또는 지하 수의 기타 물체; 및 대기를 포함하는 하나 이상의 공급원으로부터 포획된 또는 유도된 C1 분자를 포함하는, 방법.
  51. 제 1항에 있어서, 유기 분자 산물은 5개 이상의 탄소 길이의 탄소 골격을 갖는 화합물을 포함하는, 방법.
  52. 제 1항에 있어서, 전자 공여체로서 수소 분자를 포함하고, 상기 수소는 물의 전기분해; 물의 열화학적 분해; 염수의 전기분해; 황화 수소의 전기분해 및/또는 열화학적 분해 중 적어도 하나를 사용하는 방법을 통해 생성되는, 방법.
  53. 제 52항에 있어서, 수소 생산을 위한 물의 전기분해는 양성자 교환막 (PEM); KOH와 같은 액체 전해질; 알칼리 전기분해; 고체 중합체 전해질 전기분해; 고압 전기분해; 및 수증기의 고온 전기분해 (HTES) 중 하나 이상을 사용하여 수행되는, 방법.
  54. 제 52항에 있어서, 수소 생산을 위한 물의 열화학적 분해는 철 산화물 순환; 세륨 (Ⅳ) 산화물-세륨 (III) 산화물 순환; 아연-아연 산화물 순환; 황-요오드 순환; 구리-염소 순환; 칼슘-브롬-철 순환; 융합 황 순환 중 하나 이상을 사용하여 수행되는, 방법.
  55. 제 1항에 있어서, 상기 미생물 세포는 전자 공여체로서 수소 분자를 포함하는 화학합성 반응을 통해 상기 아미노산, 단백질 및/또는 비타민을 생산하고, 상기 수소는 저- 또는 무-이산화탄소 배출과 함께 수소를 생산하는 것으로 알려진, 탄소 포획 및 격리 (CCS)가 가능한 메탄 수증기 개질; CCS 가능한 석탄 가스화; 카본 블랙 산물을 생성하는 배르너 공정; CCS 가능한 바이오매스의 가스화 또는 열분해; 및 바이오챠르 보조산물을 생산하는 바이오매스의 열분해 중 하나 이상을 포함하는 전기화학적 또는 열화학적 공정을 통해 생성되는, 방법.
  56. 아미노산 및/또는 단백질 및/또는 비타민 및/또는 바이오매스를 생산하는 방법으로서, 제 1항에 따른 미생물을 가스성 기질 및 성장 및 생체산물 생산을 위한 다른 영양분을 포함하는 배양 배지를 포함하는 생물반응기에서, 상기 미생물의 성장 및 아미노산 및/또는 단백질 및/또는 비타민 및/또는 바이오매스의 생산에 적합한 조건 하에 배양하는 단계를 포함하고, 상기 미생물은 아미노산 및/또는 단백질 및/또는 비타민 및/또는 바이오매스를 생산하는, 방법.
  57. 용균물을 생산하는 방법으로서, 제 1항에 따른 미생물을 생물반응기에서 상기 미생물의 성장에 적합한 조건 하에 배양하는 단계를 포함하고, 상기 생물반응기에서 생산된 바이오매스는 수확되어 상기 생물반응기로부터 제거되고, 상기 생물반응기로부터 제거된 상기 바이오매스는 후속적으로 용균되고 이로써 용균물을 생산하는, 방법.
  58. 제 57항에 있어서, 상기 용균물은 단백질을 포함하고, 상기 방법은 상기 용균물에서 단백질을 가수분해하여 가수분해물을 생산하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  59. 제 1항의 미생물 세포로부터 분리된 단백질 농축물.
  60. 제 59항에 있어서, 약 5% 미만의 핵산을 갖는 단백질 농축물.
  61. 제 60항에 있어서, 약 3% 미만의 핵산을 갖는 단백질 농축물.
  62. 제 1항에 있어서, a. 하나 이상의 핵산분해 효소를 포함하는 상기 미생물 세포를 파열하고, 이로써 용해성 핵산, 핵산 분해효소 및 단백질을 포함하고 불용성 세포벽 잔재물을 포함하는 혼합물을 생산하는 단계; b. 상기 용해성 핵산, 핵산 분해효소 및 단백질을 상기 핵산이 상기 핵산 분해효소로 가수분해되어 가수분해된 핵산을 생산하는 조건 하에서 상기 불용성 세포벽 잔재물로부터 분리하는 단계; d. 상기 단백질을 불용성으로 만드는 단계; 및 e. 상기 불용성 단백질을 상기 가수분해된 핵산을 포함하는 나머지 용해성 물질로부터 분리하는 단계를 포함하는, 농축된 단백질 산물을 생산하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  63. 제 62항에 있어서, 상기 불용성 단백질은 약 5% 미만의 핵산을 포함하는, 방법.
  64. 제 62항에 있어서, 상기 불용성 단백질은 약 3% 미만의 핵산을 포함하는, 방법.
  65. 제 57항 또는 제 62항에 있어서, 상기 세포는 균질화에 의해 파열되는, 방법.
  66. 제 1항에 있어서, 적어도 하나의 탄소 고정화 반응 및 적어도 하나의 동화적 생합성 경로는 아미노산; 펩티드; 단백질; 지질; 다당류; 및/또는 비타민을 포함하는 생체산물의 형성을 유도하는, 방법.
  67. 제 66항에 있어서, 상기 적어도 하나의 탄소 고정화 반응 및 적어도 하나의 동화적 생합성 경로는 캘빈 사이클 및 아미노산 생합성 경로를 포함하는, 방법.
  68. 제 1항에 있어서, 상기 바이오매스 및/또는 유기 분자는 발효를 위한 유기 탄소 및/또는 질소 공급원; 다른 미생물 또는 유기체의 성장을 위한 영양분 공급원; 프리바이오틱; 인간을 위한 영양분 공급원 또는 식품 성분; 동물용 사료; 제조 또는 화학적 공정을 위한 원료 물질 또는 화학 중간체; 제약, 의약 또는 영양적 물질의 공급원; 비료; 토양 첨가제; 토양 안정화제; 토양 아쥬반트; 식물 바이오자극제; 및/또는 버섯 성장 증진제 중 적어도 하나로서의 적용 (application)을 갖는, 방법.
  69. 제 68항에 있어서, 상기 비료; 및/또는 토양 첨가제; 및/또는 토양 안정화제; 및/또는 토양 아쥬반트; 및/또는 식물 바이오자극제; 및/또는 버섯 성장 증진제는 토양에 탄소 및/또는 질소를 첨가하여, 이것이 적용되는 토양의 탄소 및/또는 질소 함량을 증가시키는, 방법.
  70. 제 68항에 있어서, 상기 탄소원은 가스성 C1 분자이며, 상기 토양에 첨가된 탄소는 격리된 탄소를 나타내고, 가스성 C1 탄소원부터 토양 탄소까지의 종단 과정은 탄소 격리 공정을 나타내는, 방법.
  71. 제 68항에 있어서, 상기 비료 및 / 또는 바이오자극제는 하이드로포닉, 에어로포닉, 아쿠아포닉으로 또는 버티칼 농장 시스템에서 성장하는 작물에 적용되는, 방법.
  72. 제 68항에 있어서, 상기 비료 및/또는 바이오자극제는 관비 (fertigation)에 사용되는, 방법.
  73. 제 68항에 있어서, 상기 비료 및 / 또는 바이오자극제는 온실, 실내, 및/또는 인공 조명에서 자라는 작물에 적용되는, 방법.
  74. C1 급식 원료로부터 유기 효소 추출물을 획득하는 방법으로서, 제 1항의 방법을 포함하고, 상기 탄소원은 단 하나의 탄소 원자를 포함하며, 상기 방법은 상기 미생물 세포를 기계적 용균; 효소적 용균; pH 조정; 압력의 증가 또는 감소; 온도의 증가 또는 감소; 전기장 또는 전자기장; 초음파; 삼투압의 변화; 및 효소적 가수분해 중 하나 이상으로 처리하고, 이로써 유기 효소 추출물을 생산하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  75. 제 1항의 방법으로 생산된 상기 바이오매스 및/또는 단백질을 포함하는 버섯 성장 증진제.
  76. 버섯 성장을 증진하는 방법으로서, 제 75항의 진드기 성장 증진제를 버섯 퇴비와 조합하는 단계를 포함하는, 방법.
  77. 제 76항의 조합된 버섯 퇴비 및 버섯 성장 증진제를 포함하는 버섯 성장 조성물.
  78. 미생물 및 다른 유기체의 성장 방법으로서, 제 68 항에 따른 영양분 공급원 상의 토양에서 상기 미생물 및 유기체가 성장하는, 방법.
  79. 제 68항에 있어서, 상기 발효는 상기 유기 탄소 및/또는 질소원을 사용하여, 시판 효소; 항생제; 아미노산; 단백질; 식물 바이오자극제; 버섯 성장 증진제; 프로바이오틱; 프리바이오틱; 바이오비료; 식품; 식품 성분; 비타민; 지질; 바이오플라스틱; 다당류; 영양제; 및/또는 약제를 포함하는 하나 이상의 생체산물을 생산하는, 방법.
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