BR112019015945A2 - Conversão microbiana de co2 e outros substratos de c1 em bioestimulantes, fertilizantes e nutrientes veganos e sistemas para o sequestro acelerado de carbono do solo - Google Patents

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Abstract

conversão microbiana de co2 e outros substratos de c1 em bioestimulantes, fertilizantes e nutrientes veganos e sistemas para o sequestro acelerado de carbono do solo trata-se de microrganismos e bioprocessos que convertem substratos gasosos, como h2 renovável e gás residual de produção de co2 ou syngas em biomassa de alto teor de proteína que pode ser usada diretamentepara nutrição humana ou como nutriente para plantas, fungos ou outros microrganismos, ou como fonte de carbono do solo, nitrogênio e outros nutrientes minerais. o h2 renovável utilizado nos processos aqui descritos podem ser gerados por eletrólise com uso de energia solar ou eólica. o gás de produção utilizado nos processos aqui descritos pode ser derivado de fontes que incluem a gaseificação de matéria-prima residual e/ou resíduos de biomassa, gás residual de processos industriais ou gás natural, biogás ou gás de aterro.

Description

“CONVERSÃO MICROBIANA DE CO2 E OUTROS SUBSTRATOS DE C1 EM BIOESTIMULANTES, FERTILIZANTES E NUTRIENTES VEGANOS E SISTEMAS PARA O SEQUESTRO ACELERADO DE CARBONO DO SOLO”
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS [0001] O presente pedido reivindica o benefício do Pedido de Provisório n° U.S. 62/454.347 depositado em 3 de fevereiro de 2017 que é incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade.
CAMPO DA INVENÇÃO [0002] A invenção refere-se ao campo da química aplicada à agricultura, especificamente à nutrição orgânica de plantas e fungos, alimentação animal e nutrição humana. Em particular, a invenção refere-se a um método para obter nutrientes e extratos de material orgânico produzido a partir de substratos C1 e outros insumos inorgânicos, que podem ser utilizados como bioestimulantes e/ou biofertilizantes na agricultura, particularmente agricultura orgânica e/ou como proteína e suplementos nutricionais na alimentação de animais e/ou como ingredientes na nutrição humana.
ANTECEDENTES [0003] Fontes sustentáveis e renováveis de aminoácidos, proteínas, vitaminas e outros nutrientes são necessários para ajudar a atender às crescentes necessidades alimentares. Há, também, a necessidade de reduzir a quantidade de dióxido de carbono e outras emissões de gases de efeito estufa (GEE) para a atmosfera, bem como reduzir o consumo de água e consumo de energia global baseado na utilização de carvão, petróleo e gás em sistemas de produção de alimentos. O aumento da demanda na economia global aumentou a pressão sobre a terra e os recursos hídricos. O aumento da pressão também foi colocado em insumos de hidrocarbonetos fósseis tradicionais para a produção de alimentos e outros produtos derivados da agricultura. Muitas indústrias, incluindo a agricultura moderna, dependem
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2/229 fortemente da disponibilidade de fontes de hidrocarbonetos fósseis como insumo para a produção e processamento de culturas. Alternativas econômicas às atuais práticas incumbentes poderíam ajudar a mitigar a pressão ascendente sobre o uso da terra, habitats naturais, água, demanda de recursos fósseis, custos de matérias-primas e emissões de gases de efeito estufa.
[0004] Sistemas biológicos que fixam carbono gasoso através de processos metabólicos bioquímicos naturais são conhecidos. O atual sistema agrícola, que se base em fotossíntese em plantações mais altas, é um exemplo óbvio. Sistemas de algas também foram desenvolvidos para criar alimentos e outros produtos derivados da agricultura a partir de CO2 através de reações fotossintéticas. Há, também, reações e produções heterotróficas utilizando matérias-primas fixas de carbono, como o açúcar, que por sua vez são produzidas a partir do CO2 por meio de fotossíntese. Desse modo, essas reações e produções heterotróficas dependem indiretamente da fotossíntese. No entanto, vários problemas e limitações enfrentam as atuais práticas agrícolas, pecuárias e de aquicultura, e os nutrientes e alimentos derivados da fotossíntese atualmente utilizados.
[0005] Os sistemas agrícolas do mundo enfrentam desafios para atender a duas necessidades contraditórias: (A) aumentar a produção de alimentos para atender à demanda criada à medida que a população global se eleva a mais de 9,3 bilhões até 2050 e (B) reduzir os impactos deletérios da agricultura sobre a saúde humana e o ambiente [T. Searchinger, C. Hanson, J. Ranganathan, B. Lipinski, R. Waite, R. Winterbottom, A. Dinshaw, e R. Heimlich, “The great balancing act,” World Resources Institute Working Paper, Washington, DC, 2013.]. A emergente classe média global ao longo do último meio século tem alimentado a crescente demanda por dietas com maior teor de proteína. Há preocupações sobre o aumento da escassez de proteínas alimentares, bem como problemas ambientais que impactam ou resultam da produção de alimentos, como limitações do uso da terra, escassez de água, mudança climática e a inflação de longo prazo dos alimentos e
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3/229 alimentos no mercado mundial [S. Matassa, N. Boon, e W. Verstraete (2015) “Resource recovery from used water: the manufacturing abilities of hydrogenoxidizing bacteria” Water Research 68:467 a 478 (http://view.ncbi. nlm.nih.qov/pubmed/25462753)1.
[0006] Os fertilizantes em uso atual são compostos principalmente de compostos inorgânicos e/ou sintéticos. No entanto, há um interesse crescente no uso de fertilizantes e condicionadores orgânicos. Tais materiais orgânicos podem ser adicionados ao solos, com nutrientes vegetais como íons de amônio, nitrato e sulfato sendo liberados pela ação da microflora do solo [Wainwright, M., W. Nevell, e II. Skiba (1985) “Fertilizer potential of some commercially available forms of keratin microbial biomass” Enzyme Microb. Technol. 7:108 a 110], [0007] Além de fornecer uma fonte abrangente de nutrientes vegetais e fúngicos, os fertilizantes orgânicos contribuem com matéria orgânica para o solo, que, para solos arenosos ou argilosos de baixa atividade, por exemplo, representa uma melhoria nas propriedades físicas, químicas e biológicas devido a um efeito condicionador. Os fertilizantes úteis para o condicionamento do solo podem conter micronutrientes e microrganismos benéficos, como leveduras, bactérias ou fungos. A Patente chinesa n° CN1911870 descreve um nutriente vegetal que aumenta os microrganismos do solo, promove o crescimento das plantas, aumenta a taxa de utilização de fertilizantes e aumenta a resistência das plantas às doenças e ao stress. Este nutriente compreende levedura de Saccharomyces cerevisiae, bactéria Lactobacillus plantarum e Lactobacillus acidophilus e outros componentes tais como derivados de batata ou café, glicose, peptona, magnésio e sulfato de manganês, hidrogenofosfato dipotássico e cloreto de sódio.
[0008] Há microrganismos abundantes que prosperam no solo, especialmente na rizosfera das plantas. Sabe-se que várias espécies bacterianas e fúngicas consideráveis possuem uma relação funcional e constitui um sistema holístico com plantas. Estas têm capacidade para exercer
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4/229 efeitos benéficos sobre o crescimento das plantas. Revelou-se que o efeito da fixação de nitrogênio induzida por fixadores de nitrogênio não é apenas significativo para leguminosas como também para não leguminosas. Além disso, algumas cepas têm múltiplas funções para o crescimento das plantas. O efeito benéfico do Azospirillum pode derivar tanto da sua fixação de nitrogênio como do efeito estimulante no desenvolvimento das raízes. Do mesmo modo, relatouse que Azotobacter não só fornece nitrogênio como também produz uma variedade de substâncias promotoras do crescimento, entre eles de ácido acético indol, giberelinas e vitaminas B. Essas substâncias estimulam, pelo menos em algum grau, a produção de exsudatos radiculares. Os exsudatos radiculares, por sua vez, estimulam a excreção de amônia na rizosfera por Azotobacter, aumentando assim o teor de nitrogênio no solo. Um efeito similar àqueles conferidos pelos exsudatos vegetais tem sido atribuído ao carbono orgânico contido no fertilizante orgânico. Relatou-se que o uso de estercos adequados, adubos verdes e outros adubos orgânicos e fertilizantes podem melhorar a fixação de N2 por Azotobacter. Isso pode ser devido ao fato de que a reação de fixação do nitrogênio exige uma boa quantidade de energia do carbono orgânico disponível para quebrar as ligações entre os átomos de nitrogênio.
[0009] As bactérias de solubilização de fosfato (P) e de potássio (K) podem aumentara absorção mineral pelas plantas solubilizando o P insolúvel e liberando K do silicato no solo.
[0010] Em resumo, os microrganismos do solo são componentes importantes no subecossistema natural do solo, pois não apenas contribuem para a disponibilidade de nutrientes no solo, como também ajudam a ligar partículas do solo em agregados estáveis, que melhoram a estrutura do solo e reduzem o potencial de erosão.
[0011] A maioria das plantas que crescem em condições naturais estão associadas a micorrizas fúngicas. A simbiose micorrízica, ao ligar as porções bióticas e geoquímicas do ecossistema, também
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5/229 pode ser considerada como uma ponte que liga a raiz aos microambientes do solo circundante. As rizobactérias podem atuar como “bactérias auxiliares da micorrização”, o que aprimora a capacidade dos fungos micorrízicos de colonizar as raízes das plantas.
[0012] Recentemente, novas estratégias têm sido propostas com o objetivo de melhorar a sustentabilidade da produção agrícola e, ao mesmo tempo, aumentar a produtividade. Uma abordagem promissora é a aplicação de substâncias e/ou microrganismos definidos também como “bioestimulantes” e/ou “biofertilizantes” [P. Calvo, L. Nelson, e J. Kloepper (2014) “Agricultural uses of plant biostimulants,” Plant and Soil 383(1-):3 a 41, 2014. (http://dx.doi.Org/10.1007/sl 1104-014-2131 -8)].
[0013] A aplicação de produtos microbianos às plantas tem várias vantagens sobre os químicos convencionais para fins agrícolas, incluindo: (i) produtos microbianos são considerados mais seguros do que muitos dos produtos químicos atualmente em uso; (ii) nem substâncias tóxicas nem os próprios micróbios são acumulados na cadeia alimentar.
[0014] Recentemente, além da aplicação de fertilizantes no solo, um interesse crescente tem se concentrado nos fertilizantes foliares. A alimentação foliar é uma técnica de alimentação de plantas através da aplicação de fertilizante líquido diretamente em suas folhas. Na aplicação de fertilizantes foliares, reconhece-se que não apenas os elementos químicos básicos como nitrogênio, potássio, fósforo, cálcio e magnésio são exigidos pelas plantas. Além disso, é reconhecido que os compostos presentes, que podem aumentar a eficiência e aceitabilidade de vários elementos, são também de grande importância. Esses compostos melhoradores incluem aminoácidos, adesivos e tensoativos, muitos dos quais estão incluídos em fertilizantes foliares modernos [“Amino acid and soluble protein cocktail from waste keratin hydrolysed by a fungal keratinase of Paecilomyces marquandii', Veselá, M., e Friedrich (2009) J., Biotechnology and Bioprocess Engineering 14:84 a 90], [0015] Os “bioestimulantes” de plantas se referem, às
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6/229 vezes, a outros componentes além de fertilizantes que afetam o crescimento e/ou o metabolismo das plantas na aplicação foliar ou quando adicionados ao solo. Alguns bioestimulantes de plantas operam regulando ou regulando negativamente os hormônios vegetais. Os bioestimulantes de plantas geralmente se enquadram em uma de três categorias: aminoácidos, peptídeos e misturas de proteínas; hormônios; e substâncias húmicas.
[0016] Relatou-se que os bioestimulantes aumentam os parâmetros de qualidade da cultura e a eficiência dos nutrientes, aumentam as taxas de crescimento, a taxa fotossintética, o rendimento das culturas, o crescimento de raízes e folhas das plantas, a tolerância ao estresse abiótico e a tolerância a doenças, melhoram os solos cultivados e combatem o crescimento de plantas daninhas. Os exemplos de bioestimulantes de plantas incluem composições à base de extrato de algas marinhas, extrato de levedura, ácidos húmicos, aminoácidos, ácido salicílico, biossólidos, proteínas hidrolisadas, silicato e/ou compostos sintéticos. Estressores exemplificativos incluem calor, frio, seca, desgaste, excesso de umidade, salinidade, alcalinidade ou outro pH adverso do solo, deficiência de nutrientes, toxicidade oxidativa, de metais pesados, doenças e outros.
[0017] Há um interesse crescente em bioestimulantes e biofertilizantes derivados de microrganismos. Por exemplo, Kobayashi et al. estudou o efeito de um extrato de levedura Saccharomyces cerevísiae combinado com um fertilizante inorgânico sobre o crescimento de plantas de ervilha [“Effect of yeast extracts on higher plants”, Kobayashi et al, Plant and Soil (1980), 57 (1)4:1-7;]. A Patente Húngara HU9902060 descreve uma composição aquosa de fertilizante para as folhas e raízes de plantas contendo a levedura Saccharomyces, além de oligoelementos, agentes complexantes, agentes de tamponamento e uma série de outros nutrientes tais como aminoácidos, ácidos húmicos, enzimas, açúcares, etc.
[0018] Hidrolisados de proteína (PHs) são uma categoria importante de bioestimulantes de plantas que compreendem uma
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7/229 mistura de polipeptídeos, olipeptídeos e aminoácidos, que são fabricados a gados proteináceos proteicas com o uso e hidrólise parcial [G. Schaafsma (2009) “Safety of protein hydrolysates, fractions thereof and bioactive peptides in human nutrition” European journal of clinical nutrition 63 (10):1.161 a 1.168 (http://view.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19623200)]. PHs têm sido objeto de crescente interesse devido aos seus impactos benéficos na produtividade e qualidade das culturas hortícolas, incluindo árvores frutíferas, vegetais, flores e plantas ornamentais, especialmente sob condições de estresse ambiental. Verificou-se que aumentam a biomassa e produtividade da parte aérea e da raiz [K. Edward, G. Aneta, S. Agnieszka, e W. Renata, “The effect of cultivar type, time of cultivation, and biostimulant treatment on the yield of spinach (spinacia oleracea I.),” páginas 9+, 2013. [Online], Disponível:
http://dx.doi.org/10.2478/fhort-2013-0153; Lisiecka et al., 2011; N. Paradikovic, T. Vinkovic, I. Vinkovic Vrcek, I. Zuntar, M. Bojic, e Medic-Saric, “Effect of natural biostimulants on yield and nutritional quality: an example of sweet yellow pepper (capsicum annuum I.) plants,” J. Sci. Food Agric., volume 91, n° 12, páginas 2146 a 2152, Setembro de 2011. [Online], Disponível: http://dx.doi.org/10.1002/jsfa.4431; G. Colla, Y. Rouphael, R. Canaguier, E. Svecova, e M. Cardarelli, “Biostimulant action of a plant-derived protein hydrolysate produced through enzymatic hydrolysis,” Frontiers in Plant Science, vol. 5, p. 448, 2014. [Online], Disponível:
http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fpls.2014.00448; A. Ertani, D. Pizzeghello, 0. Francioso, P. Sambo, S. Sanchez-Cortes, e S. Nardi, “Capsicum chinensis I. growth and nutraceutical properties are enhanced by biostimulants in a long-term period: chemical and metabolomic approaches.” Frontiers in plant science, vol. 5, 2014. [Online], Disponível:
http://view.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25136346). São ferramentas eficazes para tornar a horticultura mais sustentável e muitos estudos de pesquisa documentaram os benefícios das aplicações de PH no crescimento, rendimento, qualidade do produto, eficiência do uso de recursos e tolerância a estresses
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8/229 ambientais e químicos do solo de várias culturas hortícolas.
[0019] Aplicações de PHs têm demonstrado promover o crescimento vegetativo e a absorção de macro e micronutrientes em várias culturas hortícolas, resultando em aumento da produtividade das culturas. O revestimento de sementes com PHs para melhorar a germinação e o crescimento inicial de colheitas de vegetais e flores, plantas de folhagem e gramíneas também são uma aplicação promissora.
[0020] Aminoácidos e pequenos peptídeos são absorvidos pelas raízes e pelas folhas e depois translocados na planta. As plantas absorvem aminoácidos através dos estômatos. Para certas plantas, os aminoácidos são a principal fonte de nitrogênio [Chapin, F. S., L. Moilanen, e K. Kielland (1993) “Preferential use of organic nitrogen for growth by a nonmycorrhizal arctic sedge” Nature 361:150 a 153], Na natureza, a nutrição foliar é um mecanismo muito importante de captação de nitrogênio em bromélias, especialmente para as epífitas [Endres, L. e H. Mercier (2003) “Amino acid uptake and profile in bromeliads with different habits cultivated in vitro Plant Physiol. Biochem. 41: 181 a 187], A nutrição foliar na forma de hidrolisado de proteína e aspersão foliar fornece blocos de construção prontos para a síntese de proteínas.
[0021] Após a captação da raiz/foliar, os aminoácidos e os peptídeos são transportados de célula para célula e em longas distâncias através do sistema vascular da planta (xilema e floema) em apoio ao metabolismo e desenvolvimento da planta. Várias classes de proteínas integrais de membrana estão envolvidas no transporte de aminoácidos e peptídeos através de membranas celulares em plantas. Por exemplo, membros da família de transportadores semelhantes a lisina-histidina, família de aminoácidos permease e transportadores de prolina exercem uma função direta na absorção de aminoácidos através das raízes. Aminoácidos e am idas representam na maioria das plantas a principal forma de transporte para o nitrogênio orgânico, e podem ser usados diretamente para a síntese de proteínas e outros compostos
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9/229 nitrogenados essenciais ou metabolizados.
[0022] Microrganismos que vivem na filosfera e rizosfera também podem afetar a resposta da cultura à aplicação de PH não só porque estão competindo com plantas por aminoácidos e peptídeos, como também porque são enzimas secretas que podem hidrolisar peptídeos em pequenos fragmentos que podem atuar como compostos sinalizadores, modulando a resposta da cultura. Além disso, estudos recentes mostraram que a aplicação de um PH derivado de plantas na alface estimulou microrganismos desejáveis que ocorrem naturalmente, como a fixação de N2, solubilização de P e bactérias produtoras de ácido indolacético. As constatações acima sugerem que os HPs também podem atuar como bioestimulantes de plantas através de uma potencialização mediada por microrganismos no crescimento das plantas. Observou-se que a aplicação de PHs a folhas e raízes de plantas aprimora o metabolismo de Fe e N e a absorção de nutrientes, reduzir a concentração de compostos indesejáveis, como nitratos, e melhorar a eficiência de macro e microelementos e utilização de água [M. Cerdán, A. Sánchez-Sánchez, J. D. Jordá, M. Juárez, e J. Sánchez-Andreu (2013) “Effect of commercial amino acids on iron nutrition of tomato plants grown under lime-induced iron deficiency,” Z. Pflanzenernahr. Bodenk. 176(6):859 a 866 (http://dx.doi.org/10.1002/jpln.201200525); A. Ertani, L. Cavani, D. Pizzeghello, E. Brandellero, A. Altíssimo, C. Ciavatta, e S. Nardi (2009) “Biostimulant activity of two protein hydrolyzates in the growth and nitrogen metabolism of maize seedlings” Z Pflanzenernahr. Bodenk 172(2):237-244 (http://dx.doi.org/10.1002/jpln.200800174); M. Halpern, A. Bar-Tai, M. Ofek, D. Minz, T. Muller, e II. Yermiyahu (2015), The Use of Biostimulants for Enhancing Nutrient Uptake. Elsevier, volume 130, páginas 141 a 174 (http://dx.doi.Org/10.1016/bs.aqron.2014.10.001)]. As causas atribuídas à elevada absorção de nutrientes nas plantas suplementadas com PH incluem (A) um aumento na atividade enzimática e microbiana do solo, (B) aprimora na mobilidade de micronutrientes e solubilidade, particularmente para Cu, Fe, Mn e
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Zn, (C) mudanças na arquitetura das raízes, tais como na densidade da raiz, comprimentos e número de raízes laterais e, (D) aumento das atividades de Fe (III) - quelato redutase, nitrato redutase e glutamina sintetase [M. Cerdán, et al. (2013) supra', A. Ertani, et al. (2009) supra', A. M. García-Martínez, A. Diaz, M. Tejada, J. Bautista, B. Rodríguez, C. Santa Maria, E. Revilla, e J. Parrado (2010) “Enzymatic production of an organic soil biostimulant from wheat-condensed distiller solubles: Effects on soil biochemistry and biodiversity” Process Biochemistry 45(7):1.127 a 1.133 (http://dx.doi.Org/10.1016/j.procbio.2010.04.005); G. Colla, Y. Rouphael, R. Canaguier, E. Svecova, e M. Cardarelli (2014) “Biostimulant action of a plantderived protein hydrolysate produced through enzymatic hydrolysis” Frontiers in Plant Science 5:448 (http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fpls.2014.00448); L. Lucini, Y. Rouphael, M. Cardarelli, R. Canaguier, P. Kumar, e G. Colla (2015) “The effect of a plant-derived biostimulant on metabolic profiling and crop performance of lettuce grown under saline conditions” Scientia Horticulturae 182:124 a 133, Jan. 2015 (http://dx.doi.Org/10.1016/i.scienta.2014.11.022)1. Quando os aminoácidos são aplicados em conjunto com micronutrientes, a absorção e o transporte de micronutrientes dentro da planta podem ser facilitados.
[0023] Demonstrou-se que os hidrolisados de proteínas estimulam o metabolismo e a assimilação do nitrogênio. Uma possível explicação para o aumento da assimilação de nitrogênio nas plantas pode ser o efeito positivo das PHs na produção de esqueletos de carbono e o suprimento de energia necessário para a biossíntese de aminoácidos.
[0024] Aminoácidos e peptídeos podem exercer uma função importante como compostos de sinalização. Receptores específicos em membranas celulares interagem com peptídeos (elicitores) para a transdução de sinal, conduzindo a alterações morfofisiológicas e bioquímicas em plantas. Os PHs podem influenciar o equilíbrio fito-hormonal da planta e impactar o desenvolvimento da planta através da ação de peptídeos específicos e
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11/229 precursores da biossíntese de fito-hormônios, como o triptofano [G. Colla, et al. (2014) supra]. Constatou-se que os peptídeos bioativos produzidos em várias plantas diferentes foram têm atividades semelhantes a hormônios [Y. Ito, I. Nakanomyo, H. Motose, K. Iwamoto, S. Sawa, N. Dohmae, e H. Fukuda (2006) “Dodeca-CLE peptides as suppressors of plant stem cell differentiation” Science 313(5788):842-845, (http://dx.doi.org/10.1126/science.1128436); T. Kondo, S. Sawa, A. Kinoshita, S. Mizuno, T. Kakimoto, H. Fukuda, e Y. Sakagami (2006) “A plant peptide encoded by CLV3 identified by in situ MALDI-TOF MS analysis” Science 313(5.788):845 a 848, agosto de 2006 (http://dx.doi.Org/10.1126/science. 1128439)1. Relatou-se que os PHs derivados de plantas provocam atividades semelhantes a auxina e giberelina que aprimoram o desempenho da cultura [M. Schiavon, A. Ertani, e S. Nardi (2008) “Effects of an alfalfa protein hydrolysate on the gene expression and activity of enzymes of the tricarboxylic acid (TCA) cycle and nitrogen metabolism in zea mays I” Journal of agricultural and food chemistry 56(24):11 800 a 11 808 (http://view.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19053364); A. Ertani, et al. (2009) supra,', G. Colla, et al. (2014) supra].
[0025] Na videira, relatou-se que a aplicação foliar de PHs de caseina e genes regulados pela soja codificam a enzima estilbeno sintase responsável pela biossíntese do resveratrol em folhas (ou seja, resveratrol sintase). Provou-se que ambos os hidrolisados atuam como eliciadores para aumentar a imunidade da videira contra Plasmopara vitícola, o agente causal do míldio da videira. A Patente Chinesa CN1966663(“Composite Microorganism Foliage Fertilizer Bacteria Agent And Its Producing Method And Use”) descreve um agente antimicrobiano que consiste em Saccharomyces cerevisiae, Lactobacillus plantarum, Mucor racemosus e Aspergillus oryzae.
[0026] A ativação do metabolismo secundário por PHs derivados de plantas, como o aumento da expressão gênica da enzima fenilalanina (tirosina) amônia-liase envolvida na via de fenilpropanoides, pode resultar em propriedades nutracêuticas benéficas. Os compostos fitoquímicos
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12/229 encontrados em frutas e vegetais têm gerado interesse significativo entre os cientistas, nutricionistas e produtores de alimentos, devido às suas propriedades benéficas para a saúde. Os fitoquímicos são compostos antioxidantes naturais com capacidade para reduzir ou prevenir doenças crônicas, como problemas cardiovasculares, acidente vascular cerebral isquêmico, artrite e intestino inflamatório, bem como alguns tipos de câncer. Vários estudos constataram que a aplicação de PHs pode modificar o metabolismo primário e secundário, estimulando a produção e o acúmulo de compostos antioxidantes (carotenoides, polifenóis, flavonoides, etc.).
[0027] Os PHs podem ser classificados com base na fonte de proteína e no método de hidrólise de proteínas. Atualmente, os PHs têm origem principalmente em matérias-primas derivadas de animais ou vegetais e geralmente são produzidos por meio de hidrólise química e/ou enzimática. [P. Maini (2006) “The experience of the first biostimulant, based on amino acids and peptides: a short retrospective review on the laboratory researches and the practical results” Fertilitas Agrorum 1 (1 ):29 a 43, 2006.; M. Schiavon, et al. (2008) supra', M. Halpern, A. Bar-Tai, M. Ofek, D. Minz, T. Muller, e II. Yermiyahu (2015) “The Use of Biostimulants for Enhancing Nutrient Uptake” Elsevier volume 130, páginas 141 a 174 (http://dx.doi.org/10.1016/bs.agron.2014.10.001)]. Tanto a fonte de proteína quanto o processo de produção afetam fortemente as características químicas dos PHs. [Cavani, L, C. Ciavatta, e C. Gessa (2003) “Determination of free L- and D- alanine in hydrolysed protein fertilizers by capillary electrophoresis” J. Chromatogr. A 985: 463 a 469], Os aminoácidos têm um efeito quelante sobre os micronutrientes [Koksal, A. I., H. Dumanoglu, N. T. Gunes, e M. Aktas (1999) “The effects of different amino acid chelate foliar fertilizers on yield, fruit quality, shoot growth and Fe, Zn, Cu, Mn content of leaves in Williams pear cultivar (Pyrus communis L.)” Turk. J. Agric. For. 23: 651-658.].
[0028] Os PHs são frequentemente produzidos por hidrólise enzimática. É quando as enzimas proteolíticas, que podem se originar de órgãos animais (por exemplo, pancreatina, pepsina), plantas (por exemplo,
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13/229 bromelina, ficina, papaina) ou microrganismos (alcalase, flavourzima, queratinases), catalisam a hidrólise de proteínas. Frequentemente, as enzimas proteolíticas têm como alvo ligações peptídicas específicas (por exemplo, a pancreatina corta a cadeia de aminoácidos nas ligações adjacentes à arginina, lisina, tirosina, triptofano, ligações de fenilalanina e leucina; cortes de papaína adjacentes à arginina, lisina e fenilalanina; cortes de pepsina onde há ligação fenilalanina ou leucina; as queratinases são principalmente serina ou metaloproteinases). A Patente Chinesa CN19191800 descreve um nutriente para plantas e animais que é preparado diluindo a lama de levedura Saccharomyces cerevisiae em água para obter uma emulsão, misturando isto com papaína, proteinase neutra e cloreto de sódio, depois hidrolisando a mistura, inativando as enzimas e finalmente concentrando ou secar o produto obtido. O produto final contém um alto teor de nutrientes de taxa de absorção rápida.
[0029] Foram desenvolvidos processos hidrolíticos combinados químicos e enzimáticos que podem ajudar a preservar a estrutura de aminoácidos e conservar energia em relação à hidrólise química pura.
[0030] Além de aminoácidos e peptídeos, os PHs contêm outros compostos que podem contribuir para a ação bioestimulante. Esses compostos incluem gorduras, hidratos de carbono, fenóis, elementos minerais, fito-hormônios e outros compostos orgânicos (por exemplo, poliaminas).
[0031] Os PHs gerados a partir de subprodutos agroindustriais representam uma opção para o descarte sustentável de resíduos, o que é interessante do ponto de vista ambiental e econômico [V. Kasparkova, K. Kolomaznik, L. Burketova, V. Sasek, e L. Simek (2009) “Characterization of low-molecular weight collagen hydrolysates prepared by combination of enzymatic and acid hydrolysis” The Journal of the American Leather Chemists Association 104(2):46 a 51, 2009.; J. Pecha, T. Fürst, K. Kolomaznik, V. Friebrová, e P. Svoboda (2012) “Protein biostimulant foliar uptake modeling: The impact of climatic conditions” AIChE J. 58(7):2010 a 2019
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14/229 (http://dx.doi.org/10.1002/aic.12739); A. Baglieri, V. Cadili, C. Mozzetti Monterumici, M. Gennari, S. Tabasso, E. Montoneri, S. Nardi, e M. Negre (2014) “Fertilization of bean plants with tomato plants hydrolysates, effect on biomass production, chlorophyll content and n assimilation” Scientia Horticulturae 176:194 a 199 (http://dx.doi.orq/10.1016/j.scienta.2O14.07.002)1. Celus, et al. (2007) “Enzymatic Hydrolysis Of Brewer’s Spent Grain Proteins And Technofunctional Properties Of The Resulting Hydrolysates” J. Agric. Food Chem. 55(21):8.703 a 8.710) descrevem a hidrólise enzimática de proteínas do grão ou bagaço usado (BSG), que é o resíduo insolúvel do malte de cevada resultante da produção de mosto antes da fermentação alcoólica, e que constitui o principal subproduto da fermentação alcoólica, indústria cervejeira. Os hidrolisados resultantes, devido às suas propriedades espumantes e emulsionantes ideais, são utilizados nas indústrias de alimentos e bebidas. A Patente espanhola n° ES2329750 A1 (“Procedure For Obtaining Fertilizer Products From Brewing Waste”) descreve um processo de várias etapas para fazer um fertilizante a partir de resíduos de cerveja após a fermentação alcoólica do mosto. Esse processo inclui várias fases em que o resíduo é alcalinizado, separado para obter uma fase líquida, que é, em seguida, submetido a um tratamento ácido e do qual, por sua vez, uma fase sólida é separada, e que é finalmente submetido a hidrólise enzimática ou hidrólise ácida.
[0032] Há uma preocupação crescente com as implicações dos PHs derivados de animais em termos de segurança alimentar, conforme manifestado pelo Regulamento Europeu No. 354/2014, que proíbe a aplicação desses produtos nas partes comestíveis de cultivos orgânicos. O peso molecular do peptídeo de PHs derivados de animais deve ser menor que 10 kDa para evitar qualquer risco de transmissão de prion BSE/TSE para humanos.
[0033] Além do efeito bioestimulante nas plantas, os PHs e os materiais proteináceos mais geralmente também podem ter um efeito nutricional e bioestimulante em cogumelos e fungos e melhorar o rendimento de cogumelos [Kurbanoglu, E. B. e O. F. Algur (2002) “The influence of ram chifre
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15/229 hydrolyzate on the crop yield of the mushroom Agaricus bisporus” Sci. Hortic. 94: 351 a 357.]. Um número dos principais cogumelos cultivados, Agaricus bisporus, Coprinus quadrifidus, Lepista nuda e Pleurotus ostreatus, são conhecidos por serem com capacidade para lisar e consumindo bactérias diretamente. A. bisporus (viz. botão, champignon e cogumelo portabella) e P. ostreatus (cogumelos ostra) são os dois cogumelos mais amplamente cultivados para alimentação. A. bisporus é tipicamente cultivada em composto, em que o componente de biomassa microbiana do composto serve como uma fonte de nitrogênio, carbono e minerais, e como uma reserva de água. Constatou-se que suplementos ricos em proteínas estimulam a produção de cogumelos (49 a 61 %) quando adicionados ao composto de cogumelos (isto é, substrato de crescimento). Tais suplementos ricos em proteínas incluem: hidrolisado de proteína de soja H200 F Pro-Fam®, suplemento comercial de Remo, Lisoleucina (ila), proteína de clara de ovo, amino mistura HLA-198 de soro de leite hidrolisado, farinha de semente de algodão, farinha de soja, leite desnatado seco, farinha de peixe, brotos de malte, produtos de levedura de cerveja, caseína, gérmen de trigo, semente de girassol, glúten de milho e proteína de amendoim. [L C. Schisler e J. W. Sinden (1962) nos artigos intitulados “Nutrient Supplementation of Mushroom Compost at Spawning,” Mushroom Science 5:150 a 164 e “Nutrient Supplementation of Mushroom Compost at Casing” Mushroom Science 5:267 a 280], Aumentos no rendimento com o uso desses materiais são atribuídos às suas concentrações relativamente altas de nitrogênio. A Patente n° 3.942.969 descreve uma composição de nutriente para cogumelos com o uso de um material proteináceo desnaturado (isto é, extrato). As lignoceluloses naturais usadas para cultivar muitos cogumelos têm um teor de nutrientes limitado e geralmente exigem suplementações na forma de suplementos químicos e biológicos. A adição de suplementos com substrato basal tem sido uma prática comum no cultivo de cogumelos para aumentar o rendimento, os valores nutricionais e medicinais. O cogumelo-ostra (P. ostreatus) pode ser cultivado em vários substratos lignocelulósicos, incluindo palha de arroz, caules/espigas de
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16/229 milho, resíduos vegetais, bagaço, etc. No entanto, verificou-se que o substrato ideal deve conter nitrogênio (suplemento) para o rápido crescimento de cogumelos. O crescimento de P. ostreatus em substratos com suplementação de nutrientes nitrogenados aumentou a produtividade e o valor nutricional. Outras pesquisas sobre suplementação de cogumelos também relataram, além dos materiais nitrogenados, que há benefício para a adição de lipídios vegetais (materiais graxos) ao composto de cogumelos Schisler, L C. e J. W. Sinden (1966) “Nutrient Supplementation of Mushroom Compost at Casing—Vegetable Oils” Can. J. BOL 44:1.063 a 1.069; Schisler, L C. (1967) “Stimulation of Yield 15 in the Cultivated Mushroom by Vegetable Oils” Appl Microbiol 15:844 a 850; Schisler, L. C. e T. G. Patton, Jr. (1970) “Stimulation of Yield in the Cultivated Mushroom by Vegetable Oils: Effect of Sterols and Ethyl Linoleate” Agric Food Chem 18:1.102 a 1.103 20], [0034] Apesar dos numerosos fertilizantes, biofertilizantes e bioestimulantes de plantas comercialmente disponíveis, continua a haver uma demanda de produtos melhorados com capacidade para atender a uma variedade de necessidades. Há a necessidade de bioestimulantes de plantas que aumentem a tolerância das plantas aos estressores. Há uma necessidade de aumentar a taxa reprodutiva de plantas de interesse econômico. Há uma necessidade de bioestimulantes de plantas que sejam eficazes quando aplicados com menos frequência do que os produtos comerciais que estão atualmente disponíveis e para os bioestimulantes de plantas que oferecem um risco reduzido de lesão da planta se ocorrerem aplicações excessivas. Há, também, uma necessidade de aumentar a eficiência no uso de nutrientes das culturas alimentares e reduzir a lixiviação de nutrientes para o meio ambiente.
[0035] Ainda há uma necessidade de um promotor de crescimento de fungos e/ou cogumelos utilizáveis em uma grande escala comercial. São necessários estimulantes do crescimento que possam adicionar nutrientes à cultura de cogumelos em crescimento sem estimular o crescimento de microrganismos competidores, incluindo bactérias e fungos. Há uma
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17/229 necessidade de suplementos nutricionais que não elevem a temperatura do composto a níveis indesejavelmente elevados que possam inibir o crescimento de micélio de ova e cogumelo.
[0036] Há uma necessidade de aumentar os hidrolisados de proteína de origem animal e vegetal, com os PHs que não são derivados de animais ou plantas. Há também uma necessidade de sequestro acelerado de carbono no solo, e há uma necessidade de processamento de resíduos de carbono onde a maior parte ou todo o carbono é sequestrado, ao contrário da compostagem onde geralmente metade ou mais do carbono é perdido como emissões de CO2 durante o processo de formação de composto [S. M. Tiquia, T. L. Richard, e M. S. Honeyman (2002) “Carbon, nutrient, and mass loss during composting” Nutrient Cycling in Agroecosystems 62(1): 15 a 24], [0037] Além de fornecer proteína microbiana, vitaminas e outras biomoléculas como nutrientes para as plantas e/ou fungos, o consumo direto desses nutrientes derivados de microrganismos pelos seres humanos também é uma opção. No entanto, uma área possível de preocupação com relação ao consumo humano direto é o conteúdo de ácido nucléico dos nutrientes. Para nutrição humana, o conteúdo de ácido nucléico da proteína de célula única, como derivado de levedura, pode precisar ser reduzido a um nível mais baixo, caso o SCP compreenda uma porção significativa da dieta. A Bolsa Diária Recomendada do Conselho de Alimentos e Nutrição do Conselho Nacional de Pesquisa para proteína é de 65 gramas por dia para um macho adulto de 70 kg, e o Grupo Consultivo de Proteína do Sistema das Nações Unidas recomenda que a quantidade de ácido nucléico ingerida por dia proteína deve ser inferior a dois gramas por dia. Portanto, de acordo com esses critérios, a razão entre 0 conteúdo de ácido nucléico e a proteína deve ser menor que 3%, caso a SCP seja a única fonte de proteína na dieta. O teor de ácido nucléico de algumas fontes de SCP, tais como células de levedura das espécies Candida utilis e Saccharomyces cerevisiae, pode ser de cerca de 12 a 15 gramas de ácido nucléico por 100 gramas de proteína bruta. Assim, para permitir a utilização de
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18/229 uma quantidade substancial destas fontes de PCS para a nutrição humana, foram desenvolvidos métodos para reduzir várias vezes o conteúdo de ácido nucleico.
[0038] Bactérias, leveduras e outras células microbianas foram aplicadas para processar matérias-primas de açúcar em compostos orgânicos úteis, tais como proteínas e aminoácidos em sistemas de fermentação heterotrófica. No entanto, há desvantagens significativas para esses sistemas. As fermentações heterotróficas são vulneráveis à contaminação devido ao fato de que outros microrganismos heterotróficos que podem crescer em nutrientes de carbono orgânico e competir com uma linhagem de produção são onipresentes no meio ambiente. As tecnologias heterotróficas também sofrem geralmente limitações em termos de competição com os modos atuais de produção de alimentos. Em muitos sistemas heterotróficos, um é essencialmente com o uso de uma fonte de alimento para fazer outra fonte de alimento. Isso pode causar inúmeros impactos ambientais negativos e ineficiências.
[0039] Sistemas microbianos autotróficos para a produção de proteínas ou aminoácidos a partir de CO2 foram originalmente propostos no programa de voo espacial humano [G. L. Drake, C. D. King, W. A. Johnson, e E. A. Zuraw, “Study of life support systems for space missions exceeding one year in duration,” NASA, Tech. Rep. SP-134, abril de 1966], [0040] Agora, há um interesse renovado em desenvolver tecnologias microbiológicas para a síntese de proteínas, bem como a síntese de outros nutrientes, em diferentes substratos gasosos e líquidos, particularmente substratos de resíduos e substratos gerados de forma sustentável.
[0041] Os microrganismos quimioautotróficos representam uma alternativa pouco explorada aos organismos fotossintéticos para a produção de proteínas, produtos derivados de proteínas e outros nutrientes das matérias primas de C1. As reações quimiossintéticas realizadas
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19/229 pelos quimioautotróficos para a fixação de CO2 e outras formas de carbono inorgânico, a compostos orgânicos, são alimentadas por energia potencial armazenada em substâncias químicas inorgânicas, e não pela energia radiante da luz [J. M. Shively, G. van Keulen, e W. G. Meijer (1998) “Something from almost nothing: carbon dioxide fixation in chemoautotrophs.” Annual review of microbiology 52:191 a 230 (http://dx.doi.Org/10.1146/annurev.micro.52.1.191); A. J. Smith, J. London, e R. Y. Stanier, “Biochemical basis of obligate autotrophy in Blue-Green algae and thiobacilli” (1967) Journal of Bacteriology 94(4):972 a 983 (http://ib.asm.Org/content/94/4/972.abstract): M. Hügler, C. 0. Wirsen, G. Fuchs, C. D. Taylor, e S. M. Sievert (2005) “Evidence for autotrophic CO2 fixation via the reductive tricarboxylic acid cycle by members of the ε subdivision of proteobacteria” Journal of Bacteriology 187(9):3.020 a 3.027, (http://dx.doi.Org/10.1128/jb. 187.9.3020-3027.2005): K. M. Scott e C. M. Cavanaugh, “CO2 uptake and fixation by endosymbiotic chemoautotrophs from the bivalve solemya velum” (2007) Applied and Environmental Microbiology 73(4):1174-1179 (http://dx.doi.Org/10.1128/aem.01817-06)]. As vias bioquímicas de fixação de carbono que ocorrem nos quimioautótrofos incluem o ciclo de ácido tricarboxílico redutivo, o ciclo de Calvin-Benson-Bassham [Jessup Shively, Geertje van Kaulen, Wim Meijer (1998) Annu. Rev. Microbiol. 191-230], e a via Wood-Ljungdahl [L. G. Ljungdahl, “The autotrophic pathway of acetate synthesis in acetogenic bacteria,” Annual Review of Microbiology, volume 40, n° 1, páginas 415 a 450, 1986. [Online], Disponível:
http://dx.d0i.0rg/l 0.1146/annurev.mi.40.100186.002215], [0042] Os organismos quimioautotróficos são particularmente adequados para processos químicos/biológicos híbridos para a conversão de CO2 em produtos químicos orgânicos, em que o passo biológico é limitado apenas à fixação de CO2. Essa etapa de fixação de CO2 corresponde aproximadamente à reação escura que ocorre na fotossíntese. Esta abordagem química/biológica híbrida recebeu muito menos atenção do que os bioprocessos heterotróficos ou fotossintéticos mais tradicionais para a produção de produtos
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20/229 de base biológica. No entanto, há uma série de potenciais vantagens de tal abordagem híbrida, incluindo a capacidade de combinar eficientemente as capacidades enzimáticas obtidas através de bilhões de anos de evolução na fixação de CO2 com uma ampla gama de tecnologias de conversão de energia abiótica, como solar fotovoltaica, solar térmica, do vento, geotérmica, hidroelétrica, ou nuclear, a fim de alimentar de forma eficiente e limpa o processo de produção bioquímica geral a partir da fonte de carbono CO2.
[0043] Uma gama semelhante de bioprodutos (proteína de célula única (SCP), poli-hidroxibutirato (PHB)) também pode ser obtida a partir de metano e gás natural com o uso bactérias oxidantes de metano. Estes são microrganismos relativamente bem estudados, que no passado foram implementados em sistemas de produção de SCP em grande escala, e testados como aditivo alimentar rico em proteínas para bovinos e peixes. Os microrganismos podem ser aplicados para utilizar o biogás produzido em estações de tratamento de esgoto e esterco. As bactérias oxidantes de metano podem permitir tecnologias para a atualização de metano de baixo valor para a biomassa microbiana usada como fonte de bioprodutos.
[0044] Determinadas aplicações de microrganismos quimioautotróficas ou metanotróficas na captura e na conversão de CO2 ou gases que contêm metano para produtos de carbono fixos são conhecidos. No entanto, muitas das abordagens anteriormente relatadas sofreram deficiências que limitaram sua eficácia, viabilidade econômica, praticidade e adesão ao mercado.
[0045] Há uma necessidade de romper o gargalo associado ao aumento significativo dos produtos agrícolas de forma sustentável, em uma escala muito grande. Há uma necessidade de produção biológica com escala vertical compacta, em oposição às operações agrícolas tradicionais que escalam horizontalmente e são altamente intensivas em terra e água. Há uma necessidade de mitigar o conflito entre comida e natureza, e conflitos sobre o uso da terra e a destruição de habitats naturais.
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21/229 [0046] Há a necessidade de um bioprocesso que converta syngas, CO2 e/ou metano de baixo custo em químicos orgânicos de maior valor, incluindo, mas não se limitando a, aminoácidos, proteínas, vitaminas, fertilizantes, bioestimulantes e outros nutrientes biológicos.
[0047] Há uma necessidade de identificar um conjunto de microrganismos que podem crescer em vasos de reação contidos convencionais e escaláveis e que produzem conjuntos comercialmente viáveis de cadeias de carbono orgânico, em particular sobre quatro átomos de carbono de comprimento num método comercialmente viável. Há uma necessidade de identificar microrganismos que não são limitados metabolicamente por insumos típicos de carbono orgânico, como o açúcar. Há uma necessidade de microrganismos e sistemas que possam adicionalmente usar syngas, gás de produção, gás natural, biogás ou uma ampla gama de fontes abióticas de carbono e energia, dirigidas através de um intermediário de mistura de gás H2/CO2 para a síntese de aminoácidos, proteínas e outros nutrientes biológicos. Isso resultará em uma flexibilidade de matéria-prima que excede em muito os sistemas heterotróficos comparáveis. Há a necessidade de identificar e usar microrganismos que possam utilizar doadores de elétrons, como hidrogênio, presentes em syngas, gás de produção, ou prontamente gerados por uma ampla gama de tecnologias abióticas de energia de baixa emissão de CO2 e/ou renovável abiótica para proliferação e fixação de carbono.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO [0048] Os sistemas, métodos e composições são fornecidos para a produção de produtos químicos orgânicos, incluindo, porém sem limitação aminoácidos, proteínas, vitaminas e outros nutrientes biológicos, de matérias-primas de baixo custo e sustentáveis. Em algumas modalidades, a produção eficiente desses compostos orgânicos de alto valor está acoplada ao descarte de fontes de água de carbono e/ou com a captura de CO2, que pode gerar receita e/ou valor social adicionais.
[0049] Microrganismos de ocorrência natural ou
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22/229 modificados são usados para converter gás CO2, syngas, gás produtor e/ou metano em moléculas de cadeia de carbonos de comprimento médio a longo de valor superior, incluindo, porém sem limitação aminoácidos, proteínas, vitaminas e outros nutrientes biológicos. A tecnologia descrita no presente documento permite o desenvolvimento de novas cepas melhoradas natural ou classicamente e/ou aprimoradas geneticamente de microrganismos que podem ser usadas para bioprocessamento de syngas dentro de processos biológicos de gás em produto químico (GTC) para produzir e/ou secretar várias compostos orgânicos de cadeia de carbono relativamente longa que são gotejados e produzidos atualmente apenas a granel de culturas agrícolas de culturas agrícolas de planta ou fontes animais superiores.
[0050] Os métodos são fornecidos para a seleção, melhoria e/ou modificação de microrganismos, incluindo, porém sem limitação, oxidação por hidrogênio, oxidação por monóxido de carbono e microrganismos de Knallgas, com uma capacidade para cultivar e sintetizar biomassa em fontes gasosas de carbono, tais como syngas e/ou CO2, de modo que os microrganismos de produção sintetizem produtos químicos alvejados sob cultivo de gás. Os microrganismos e métodos descritos no presente documento podem possibilitar a síntese de baixo custo de produtos bioquímicos que podem concorrer em preço com produtos petroquímicos e/ou aminoácidos derivados de plantas mais altas, proteínas e outros nutrientes biológicos. Em determinadas modalidades, prevê-se que esses aminoácidos, proteínas, vitaminas e outros nutrientes biológicos têm um preço substancialmente inferior a aminoácidos, proteínas, vitaminas e outros nutrientes biológicos produzidos através da síntese heterotrófica ou fototrófica microbiana.
[0051 ] São fornecidos microrganismos que convertem syngas e/ou CO2 gasoso e/ou uma mistura de gás CO2 e gás H2 e/ou metano, junto de uma fonte de nitrogênio, incluindo, porém sem limitação amônia, amônio e/ou uréia, em um ou mais aminoácidos, proteínas, vitaminas e/ou outros nutrientes biológicos. Em algumas modalidades, o microrganismo é um ou mais
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23/229 dentre o seguinte grupo: um microrganismo quimioautotrófico de oxidação por hidrogênio, um microrganismo de oxidação por monóxido de carbono, um microrganismo de knallgas, e/ou um microrganismo metanotrófica. Os micróbios de Knallgas, hidrogenotróficos, carboxidotróficos e quimioautotróficos mais amplamente, podem capturar CO2 ou CO como sua única fonte de carbono para sustentar o crescimento biológico. Os metanotróficos podem capturar CPU como sua única fonte de carbono. Em algumas modalidades, esse crescimento microbiano inclui a biossíntese de aminoácidos e proteínas. Os micróbios de Knallgas e outros hidrogenotróficos podem usar H2 com uma fonte para reduzir elétrons para síntese de respiração e de produto químico. Em algumas modalidades, os microrganismos de knallgas, hidrogenotróficos, carboxidotróficos, outros microrganismos quimioautototróficos e/ou metanotróficos são cultivados em uma corrente de gases, incluindo, porém sem limitação, um ou mais dentre o seguinte: CO2; CO; H2; CPU; junto de minerais inorgânicos dissolvidos em solução aquosa. Em algumas modalidades, os microrganismos de knallgas, hidrogenotrófico, carboxidotrófico, quimioautotrófico e/ou metanotrófico são utilizados para converter gases de efeito estufa (GHGs) em biomoléculas, incluindo, porém sem limitação, um ou mais dentre o seguinte: aminoácidos e proteínas e vitaminas.
[0052] Além disso, são fornecidas composições que incluem qualquer um dentre os microrganismos revelados no presente documento. As composições podem incluir os microrganismos em um meio de crescimento que inclui nutrientes para crescimento e/ou produção de bioproduto. Por exemplo, a composição pode estar dentro de um biorreator no qual os substratos gasosos, conforme descrito no presente documento, são introduzidos.
[0053] Em algumas modalidades, o microrganismo é escolhido a partir dos gêneros Rhodococcus ou Gordonia. Em algumas modalidades, o microrganismo é Rhodococcus opacus. Em algumas modalidades, o microrganismo é Rhodococcus opacus (DSM 43205) ou
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Rhodococcus sp. (DSM 3346). Em algumas modalidades, o microrganismo é escolhido a partir do gênero Ralstonia ou Cupriavidus. Em algumas modalidades, o microrganismo é Cupriavidus necator. Em algumas modalidades não limitativas, a cepa de Cupriavidus necator é DSM 531 ou DSM 541.
[0054] Em um aspecto, é fornecido que um microrganismo natural ou modificado que tem capacidade para converter um substrato gasoso, tal como gás produtor ou gás de síntese ou outra mistura de gás que contém H2 e CO2 e/ou CO, e/ou Chh em aminoácidos, proteínas e outros nutrientes biológicos. O substrato gasoso é usado pelo microrganismo como uma fonte de carbono e/ou de energia e/ou de energia. Em algumas modalidades, os microrganismos que têm capacidade para crescer em um substrato gasoso são transformados com um polinucleotídeo que codifica um gene que é necessário para biossíntese de um aminoácido, proteína ou outro nutriente biológico. Em algumas modalidades, um aminoácido, proteína, outro nutriente biológico ou um produto de célula inteira e recuperado das células microbianas ou de um meio de crescimento microbiano. O gás produtor, que pode ser usado nos processos de crescimento microbiano descritos no presente documento, pode partir das fontes que incluem gaseificação de matéria-prima residual e/ou matéria-prima residual de biomassa ou gás residual de processos industriais ou reformação a vapor de gás natural ou biogás.
[0055] Em um aspecto, é fornecido um microrganismo de ocorrência não natural que tem capacidade para crescer em um substrato gasoso como uma fonte de carbono e/ou de energia e/ou de energia, e em que o microrganismo inclui pelo menos um ácido nucleico exógeno. Em algumas modalidades, o microrganismo é uma célula bacteriana. Por exemplo, em algumas modalidades, a célula bacteriana é uma Cupriavidus sp. ou Ralstonia sp., por exemplo, porém sem limitação, Cupriavidus necator. Em algumas modalidades não limitativas, o microrganismo é Cupriavidus necator DSM 531 ou DSM 541.
[0056] Em algumas modalidades, o substrato gasoso
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25/229 inclui CO2 como uma fonte de carbono. Em algumas modalidades, o substrato gasoso inclui H2 e/ou O2 como uma fonte de energia. Em algumas modalidades, o substrato gasoso inclui gás produtor, syngas ou gás de pirólise. Em algumas modalidades, 0 substrato gasoso inclui uma mistura de gases que compreende H2 e/ou CO2 e/ou CO e/ou Chh. Em algumas modalidades, o microrganismo produz aminoácidos, proteínas e outros nutrientes biológicos quando cultivados na presença do substrato de gás sob condições adequadas para a crescimento do microrganismo e produção de bioprodutos.
[0057] Em outro aspecto, são fornecidos métodos para produzir aminoácidos, proteínas e outros nutrientes biológicos com o uso de um microrganismo conforme descrito no presente documento que tem capacidade para crescer em um substrato gasoso como uma fonte de carbono e/ou de energia e/ou de energia. Em algumas modalidades, um microrganismo conforme descrito no presente documento é cultivado em um biorreator que inclui um substrato gasoso e um meio de cultura (por exemplo, um meio líquido de crescimento) que inclui outros nutrientes para crescimento e produção de bioproduto, sob condições que são adequadas para crescimento do microrganismo, em que o microrganismo produz aminoácidos, proteínas e outros nutrientes biológicos.
[0058] Em algumas modalidades, o substrato gasoso no biorreator inclui H2 e/ou CO2. Em algumas modalidades, o substrato gasoso é gás produtor, syngas ou gás de pirólise. Em algumas modalidades, o substrato gasoso é um gás natural ou biogás. Em algumas modalidades, o substrato gasoso é derivado de resíduos sólidos urbanos, lixívia negra, resíduos agrícolas, resíduos de madeira, gás natural ocioso, biogás, gás ácido, hidratos de metano, pneus, coque de petróleo, esgoto, esterco, palha, culturas energéticas lignocelulósicas, lignina, resíduos de culturas, bagaço, pó de serra, resíduos florestais, resíduos alimentares, carpetes residuais, resíduos plásticos, gás de aterro e/ou biomassa lignocelulósica.
[0059] Em algumas modalidades, aminoácidos,
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26/229 proteínas, vitaminas e/ou outros nutrientes biológicos são recuperados do meio de cultura.
[0060] Em outro aspecto, são fornecidos microrganismos e métodos para produzir aminoácidos, proteínas, vitaminas e/ou outros nutrientes biológicos. Em algumas modalidades, um microrganismo de ocorrência natural ou não natural é fornecido, sendo que o microrganismo inclui zero ou pelo menos um ácido nucleico exógeno, respectivamente, e tem capacidade para cultivar um substrato gasoso como uma fonte de carbono e/ou de energia e/ou de energia, e em que o dito microrganismo biossintetiza aminoácidos, proteínas, vitaminas e/ou outros nutrientes biológicos. Em algumas modalidades, o microrganismo de ocorrência natural ou não natural é uma Cupriavidus sp. ou Ralstonia sp. Em algumas modalidades, o microrganismo é Cupriavidus necatorou Cupriavidus metallidurans. Em algumas modalidades, é fornecido um método para produzir aminoácidos, proteínas, vitaminas e/ou outros nutrientes biológicos que a utilização de um microrganismo de ocorrência natural ou não natural conforme descrito no presente documento, em que o microrganismo inclui zero ou pelo menos um ácido nucleico exógeno, respectivamente, e que tem capacidade para crescer em um substrato gasoso como uma fonte de carbono e/ou de energia e/ou de energia e que biossintetiza aminoácidos, proteínas, vitaminas e/ou outros nutrientes biológicos, incluindo cultivar o microrganismo de ocorrência natural ou não natural em um biorreator que inclui um substrato gasoso e um meio de cultura (por exemplo, um meio líquido de crescimento), que também inclui outros nutrientes para crescimento e/ou produção de bioproduto, sob condições que são adequadas para crescimento do microrganismo e produção de aminoácidos, proteínas, vitaminas, e/ou outros nutrientes biológicos, e em que o microrganismo produz os aminoácidos, proteínas, vitaminas e/ou outros nutrientes biológicos.
[0061] Em algumas modalidades, os microrganismos descritos no presente documento são usados para capturar CO2 dos gases de queima industriais e produzir uma biomassa rica em proteína. Em algumas
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27/229 modalidades, essa biomassa rica em proteína é uma comodidade. Em algumas modalidades, a biomassa rica em proteína é usada como uma proteína de célula única (SCP). Em algumas modalidades, a biomassa rica em proteína é usada em uma ou mais dentre as seguintes aplicações: fertilizante; bioestimulante; biofertilizante; potencializador ou suplemento de crescimento fúngico; nutriente; ingrediente; alimentação animal ou dentro de uma formulação de alimentação animal; alimento humano ou dentro de uma formulação de alimento para seres humanos. Em algumas modalidades, a biomassa rica em proteína é usada como um substituto de alto teor de proteína para farinha de peixe e/ou outra proteína animal, e/ou é usado em produtos fertilizante vegetal e/ou potencializadores de crescimento de cogumelo e de fungos. Em algumas modalidades não limitativas, a presente invenção é usada tanto para redução de GHG e para produzir produtos alto teor de proteína para aplicações incluindo, porém sem limitação, fertilizantes vegetais e/ou bioestimulantes e/ou fertilizantes fúngicos e/ou suplementos nutricionais e/ou ingredientes de alimento para seres humanos.
[0062] Em algumas modalidades, o produto alto teor de proteína é submetido à hidrólise. Em algumas modalidades, o rendimento da hidrólise é aprimorado pela aplicação de tratamento a vapor à biomassa rica em proteína. Algumas proteínas insolúveis são convertidas em uma forma menos refrativa mediante o aquecimento da umidade [Kida, K., S. Morimura, J. Noda, Y. Nishida, T. Imai, e M. Otagiri (1995) “Enzymatic hydrolysis of the horn and hoof of cow and buffalo” J. Ferment. Bioeng. 80:478 a 484.].
[0063] Determinadas modalidades da presente divulgação referem-se a um isolado de proteína microbiana com teor de ácido nucleico diminuído. Em determinadas modalidades, o teor de ácido nucleico do isolado abaixo de 9% em peso. Em determinadas modalidades não limitativas, a Razão de Equivalência de Proteína (PER) do isolado é maior que 1.
[0064] Em determinadas modalidades, métodos semelhantes aos desenvolvidos para reduzir o teor de ácido nucleico de SCP de levedura são aplicados a células procarióticas conforme descrito no presente
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28/229 documento. O ácido nucleico da levedura é principalmente ácido ribonucleico ou RNA. Em determinadas modalidades, o ácido nucleico de células também é primariamente RNA, e no presente pedido, os termos RNA e ácido nucleico serão usados algumas vezes de maneira intercambiável. Em determinadas modalidades, a razão entre o teor de ácido nucleico e proteína é reduzido até menos que três por cento. Em determinadas modalidades, a razão entre ácido nucleico e proteína é reduzida até um nível considerado seguro para fornecer uma proporção substancial, ou todas as exigências de proteína em uma dieta humana, por uma pessoa versada na técnica e conhecimento na técnica.
[0065] Determinadas modalidades da presente divulgação referem-se a hidrolisados microbianos usados como uma fonte de matéria-prima ou de nutrientes em outras fermentações industriais. Umrnadi, M. e Curic-Bawden, M. (2010) “Use of Protein Hydrolysates in Industrial Starter Culture Fermentations.” Protein Hydrolysates In Biotechnology 91 a 114, que é incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade.
[0066] Determinadas modalidades da presente divulgação referem-se a isolados de proteína microbiana e/ou hidrolisados com aplicação em medicina de esporte e especificamente, em determinadas modalidades não limitativas, o consumo do dito hidrolisado permite que aminoácidos sejam absorvidos pelo copo mais rápido que proteínas intactas, maximizando, assim, a entrega de nutriente a tecidos musculares. Manninen, Anssi H., “Protein Hydrolysates In Sports And Exercise: A Brief Review” (2004) Journal of Sports Science and Medicine, 3:60-63, (2004), que é incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade.
[0067] Em um aspecto, os métodos são fornecidos para produzir bioestimulantes e nutrientes vegetais e fúngicos. Os bioestimulantes e nutrientes produzidos por tal processo também são fornecidos. Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para produzir bioestimulantes e/ou fertilizante vegetais, incluindo hidrolisar células bacterianas para obter um hidrolisado e formular o hidrolisado como um bioestimulante e/ou
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29/229 fertilizante vegetal para aplicação foliar, aplicação com um adjuvante de solo e/ou aplicação como um fertilizante de solo. Os bioestimulantes e/ou fertilizantes vegetais obtidos pelos métodos descritos no presente documento também são fornecidos. São fornecidos, também, métodos para cultivar plantas ou fungos aplicando-se tais bioestimulantes vegetais ou fúngicos e nutrientes. São fornecidos, também, processos para preparar produtos de tais plantas ou fungos. São fornecidos, também, métodos para elevar organismos heterotróficos alimentando-se o organismo com tais plantas ou fungos. São fornecidos, também, métodos para produzir produtos de tais organismos heterotróficos.
[0068] Em outro aspecto, os potencializadores de crescimento de cogumelo com capacidade para crescer o rendimento e/ou por meio debilidade de cogumelos comerciais são fornecidos. São fornecidos, também, potencializadores de crescimento de cogumelo que são menos acessíveis são menos acessíveis para completar microrganismos estranhos como uma fonte alimento, ao mesmo tempo que contribuem para a propagação de cogumelos comerciais. São fornecidos, também, potencializadores de crescimento de cogumelo que são econômicos de fabricar e usar. São fornecidos, também, potencializadores de crescimento de cogumelo que são eficazes a baixos níveis de concentração. São fornecidos, também, potencializadores de crescimento de cogumelo que são fabricados a partir de materiais prontamente disponíveis de baixo custo e/ou residuais. São fornecidos, também, potencializadores de crescimento de cogumelo que são facilmente fabricados com o uso de fontes de energia renovável.
[0069] Em um aspecto, é fornecido um método biológico e químico para a conversão biológica de moléculas inorgânicas e/ou orgânicas que contêm um ou mais átomos de carbono, em moléculas orgânicas que compreendem aminoácidos, proteínas e/ou vitaminas produzidas através de uma reação de fixação de carbono ou biossíntese anabólica que compreende: introduzir moléculas inorgânicas e/ou orgânicas que contêm um ou mais átomos de carbono, em um ambiente que compreende células de microrganismo em um
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30/229 meio de cultura que é adequado para manter as células de microrganismo; em que as moléculas inorgânicas e/ou orgânicas que contêm um ou mais átomos de carbono são usadas como uma fonte de carbono pelas células de microrganismo para crescimento e/ou biossíntese; converter as moléculas inorgânicas e/ou orgânicas que contém um ou mais átomos de carbono nos produtos de molécula orgânica que compreende aminoácidos, proteínas e/ou vitaminas dentro do ambiente por meio de um reação de fixação de carbono ou pelo menos uma via biossintética anabólica contida dentro das células de microrganismo; e que a reação de fixação de carbono ou via biossintética anabólica é acionada pelo menos parcialmente por energia química e/ou eletroquímica fornecida por doadores de elétrons e/ou aceitadores de elétrons que foram gerados quimicamente e/ou eletroquimicamente e/ou termoquimicamente e/ou são introduzidos no ambiente de pelo menos uma fonte externa ao ambiente e em que as células de microrganismo compreendem biomassa que compreendem os ditos aminoácidos, proteínas e/ou vitaminas. Em algumas modalidades, os produtos de moléculas orgânicas compreendem compostos com cadeias principais de carbono com cinco carbonos ou mais. Em algumas modalidades, aminoácidos e/ou proteínas e/ou vitaminas e/ou biomassa produzidos no ambiente são recuperados do meio de cultura.
[0070] Em algumas modalidades, a fonte de carbono contém apenas um átomo de carbono, e em que ditos dadores de elétrons e/ou moléculas que contêm apenas um átomo de carbono são gerados através de um processo termoquímico que age sobre a matéria orgânica que compreende pelo menos um dentre: gaseificação; pirólise; reforma a vapor; e autorreforma. Em algumas modalidades, a dita fonte de carbono contém apenas um átomo de carbono, e em que ditos dadores de elétrons e/ou moléculas orgânicas que contêm apenas um átomo de carbono são gerados através da reforma a vapor de metano. Em algumas modalidades, o substrato gasoso é derivado de uma corrente de gás que compreende H2, CO e CO2 que são gerados a partir da gaseificação e/ou pirólise e/ou autorreforma e/ou reforma a vapor, em que a
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31/229 razão entre hidrogênio e monóxido de carbono na saída de gás proveniente de gaseificação e/ou pirólise e/ou autorreforma e/ou reforma a vapor é ajustada com o uso da reação de mudança de gás de água antes da corrente de gás ser entregue aos microrganismos.
[0071] Em algumas modalidades, a dita fonte de carbono compreende uma molécula C1 capturada ou dirigida a partir de uma ou mais fontes que compreendem: a gaseificação da matéria orgânica; a calcinação de calcário, CaCOs, para produzir cal viva, CaO; reforma a vapor de metano; combustão, incineração ou queima; fermentação anaeróbica ou aeróbica de açúcar; um bioprocesso metanotrófico; respiração de outros organismos, tratamento de águas residuais; gás de aterro, produção de fosfato de sódio; gases geologicamente ou geotermicamente produzidos ou emitidos; gás ácido, gás ácido ou gás natural; água do mar ou outras massas de águas superficiais ou subterrâneas; e a atmosfera.
[0072] Em algumas modalidades, um ou mais doadores de elétrons são selecionados a partir de: amônia; amônio; monóxido de carbono; ditionita; enxofre elementar; hidrocarbonetos; hidrogênio; metabissulfetos; óxido nítrico; nitretos; sulfatos, tais como tiossulfatos incluindo, porém sem limitação, tiossulfato de sódio (Na2S20s) ou tiossulfato de cálcio (CaS2Os); sulfetos, tais como sulfeto de hidrogênio; sulfetos; tionato; tionita; metais de transição ou sulfetos, óxidos, clacogenetos, haletos, hidróxidos, oxihidróxidos, fosfatos, sulfatos ou carbonates dos mesmos, em fases dissolvidas ou sólidas; e elétrons de banda de condução ou valência em materiais de eletrodo de estado sólido. Em algumas modalidades, um ou mais aceitadores de elétrons são selecionados a partir de: dióxido de carbono; oxigênio; nitretos; nitratos; ferro férrico ou outros íons de metal de transição; sulfatos; e furos de banda de valência ou de condução em materiais de eletrodo em estado sólido.
[0073] Em algumas modalidades, a conversão biológica é precedida por uma ou mais etapas de pré-processamento químico nas quais doadores de elétrons e/ou aceitadores de elétrons e/ou fontes de
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32/229 carbono e/ou nutrientes minerais exigidos pelo microrganismo, são gerados e/ou refinados de pelo menos um produto químico de entrada e/ou são reciclados de produtos químicos que surgem da etapa de fixação de carbono e/ou são gerados, ou contidos em, de correntes de resíduos de outros processos industriais, de mineração agrícolas, de saneamento ou geradores de resíduos.
[0074] Em algumas modalidades, os doadores de elétrons e/ou aceitadores de elétrons são gerados ou reciclados com o uso de fontes renováveis, alternativas ou convencionais de energia que têm baixas emissões de gás do efeito estufa, e em que as ditas fontes de energia são selecionados a partir de pelo menos uma dentre energia fotovoltaica, térmica solar, energia eólica, nuclear, geotérmica, geotérmica intensificada, térmica oceânica, energia da onda do oceano e energia da maré Em algumas modalidades, os doadores de elétrons e/ou aceitadores de elétrons são gerados com o uso de eletricidade de rede elétrica durante períodos em que o fornecimento da rede elétrica excede a demanda de rede elétrica, e em que os tanques de armazenamento tampam a geração dos ditos doadores de elétrons e/ou aceitador de elétrons e o consumo comum dos mesmos na dita reação de fixação de carbono.
[0075] Em algumas modalidades, os doadores de elétrons compreendem H2 e/ou CO e/ou metano derivados de um gás de saída de um ou mais dentre: reformação de vapor de metano; refinação de petróleo; produção de aço; produção de alumínio; produção de manganês; processo de cloro-álcali; fabricação de negro de carbono; síntese de metanol; síntese de amônia; processos metalúrgicos; processos químicos; e processos eletroquímicos.
[0076] Em algumas modalidades, o hidrogênio molecular é utilizado como um doador de elétrons, seno que o dito hidrogênio é gerado por meio de um método com o uso de pelo menos um dentre os seguintes: eletrólise de água; separação termoquímica de água; eletrólise de salmoura; eletrólise e/ou separação termoquímica de sulfeto de hidrogênio. Em
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33/229 algumas modalidades, eletrólise de água para a produção de hidrogênio é realizada com o uso de um ou mais dentre: Membranas de Troca de Prótons (PEM); eletrólitos líquidos, tais como KOH; eletrólise alcalina; eletrólise de eletrólito de polímero sólido; eletrólise de alta pressão; e eletrólise de alta temperatura de vapor (HTES). Em algumas modalidades, a separação termoquímica de água para a produção de hidrogênio é realizada com o uso de um ou mais dentre: o ciclo de óxido de ferro; ciclo de cério(IV) óxido-cério(lll) óxido; ciclo de zinco zinco-óxido; ciclo de enxofre-iodeto; ciclo de cobre-cloro; ciclo de cálcio-brometo-ferro; ciclo de enxofre híbrido.
[0077] Em uma modalidade, a célula de microrganismo é uma célula bacteriana. Em algumas modalidades, o microrganismo é um Cupriavidus sp. ou Ralstonia sp. Em algumas modalidades, o microrganismo é Cupriavidus necator ou Cupriavidus metallidurans. Em algumas modalidades, as células de microrganismo compreendem microrganismos selecionados a partir de um ou mais dentre os seguintes gêneros: Cupriavidus sp., Rhodococcus sp., Hydrogenovibrio sp., Rhodopseudomonas sp., Hydrogenobacter sp., Gordonia sp., Arthrobacter sp., Streptomycetes sp. Rhodobacter sp. e/ou Xanthobacter.
[0078] Em algumas modalidades, as células de microrganismo produzem aminoácidos e/ou proteína e/ou vitaminas e/ou biomassa quando cultivados na presença de um substrato gasoso sob condições adequadas para crescimento do microrganismo e produção de bioprodutos. Em algumas modalidades, o substrato gasoso compreende CO2 e/ou CO e/ou CPU como uma fonte de carbono. Em uma modalidade, o substrato gasoso compreende H2. Em uma modalidade, o substrato gasoso compreende H2 e/ou O2 como uma fonte de energia. Em algumas modalidades, o substrato gasoso compreende doadores de elétrons incluindo um ou mais dentre H2 e/ou CO e/ou CH4. Em algumas modalidades, o substrato gasoso compreende gás de pirólise ou gás produtor ou syngas ou gás natural ou biogás. Em algumas modalidades, o substrato gasoso compreende uma mistura de gases que compreende H2 e/ou
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C02 e/ou CO. Em algumas modalidades, o substrato gasoso é derivado de resíduos sólidos urbanos, lixípor meio de negra, resíduos agrícolas, resíduos de madeira, gás natural ocioso, biogás, gás ácido, hidratos de metano, pneus, coque de petróleo, esgoto, esterco, palha, culturas energéticas lignocelulósicas, lignina, resíduos de culturas, bagaço, pó de serra, resíduos florestais, resíduos alimentares, carpetes residuais, resíduos plásticos, gás de aterro, alga kelp, alga marinha e/ou biomassa lignocelulósica.
[0079] Em uma modalidade, é fornecido um método para produzir aminoácidos e/ou proteína e/ou vitaminas e/ou biomassa que compreende cultivar um microrganismo conforme descrito no presente documento em um biorreator que compreende um substrato gasoso e um meio de cultura que compreende outros nutrientes para crescimento e produção de bioproduto, sob condições que são adequadas para crescimento dos microrganismo e produção de aminoácidos e/ou proteína e/ou vitaminas e/ou biomassa, sendo que o dito microrganismo produz aminoácidos e/ou proteína e/ou vitaminas e/ou biomassa.
[0080] Em algumas modalidades, os microrganismos são microrganismos de knallgas. Em uma modalidade, o substrato gasoso compreende H2 e/ou CO2. Em algumas modalidades, o substrato gasoso é gás de pirólise ou gás produtor ou syngas.
[0081] Em uma modalidade, as células de microrganismo produzem os ditos aminoácidos, proteínas e/ou vitaminas por meio de uma reação quimiossintética que compreende hidrogênio molecular como um doador de elétrons, sendo que o dito hidrogênio é gerado por meio de processos eletroquímicos termoquímicos conhecidos por produzir hidrogênio com baixas emissões ou nenhuma emissão de dióxido de carbono que compreendem um ou mais dentre: reformação de vapor de metano possibilitada por captura e sequestro de carbono (CCS); gaseificação de carvão possibilidade por CCS; o processo Kvaerner e outros processos que geram um produto de negro de carbono; gaseificação possibilitada por CCS ou pirólise de biomassa;
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35/229 e pirólise de biomassa que produzem um coproduto de biocarvão.
[0082] Em algumas modalidades, pelo menos uma reação de fixação de carbono e pelo menos uma via biossintética anabólica resulta na formação de bioprodutos incluindo pelo menos um dentre: aminoácidos; peptídeos; proteínas; lipídeos; polissacarídeos; e/ou vitaminas. Em uma modalidade, a pelo menos uma reação de fixação de carbono e pelo menos uma via biossintética anabólica compreende o Ciclo de Calvin e uma via de biossíntese de aminoácido.
[0083] Em algumas modalidades, biomassa e/ou moléculas orgânicas produzidas pelos microrganismos em um método, conforme descrito no presente documento, são usadas para alimentar ou fornecer nutrição a um ou mais outros organismos. Em algumas modalidades, os aminoácidos e/ou proteínas e/ou vitaminas produzidas em um método, conforme descrito no presente documento, são usados para produzir um bioestimulante vegetal ou potencializador de crescimento de cogumelo.
[0084] Em outro aspecto, é fornecido um bioestimulante vegetal que compreende biomassa, aminoácidos, proteínas e/ou vitaminas produzidas de acordo com um método, conforme descrito no presente documento. Em uma modalidade, é fornecido um método para tratar uma safra que compreende aplicar um bioestimulante vegetal, conforme descrito no presente documento, a uma planta e/ou ao solo no qual uma planta é cultivada e/ou ao meio líquido usado para cultivar uma planta; e colher a planta. Em uma modalidade, é fornecido um método que compreende aplicar a biomassa, aminoácidos, proteínas e/ou vitaminas produzidas através de uma reação de fixação de carbono ou biossíntese anabólica, conforme descrito no presente documento, a uma planta e/ou ao solo no qual uma planta é cultivada e/ou ao meio líquido usado para crescer uma planta; e colher a planta. Em algumas modalidades, a planta é uma safra agrícola.
[0085] Em outro aspecto, as células de microrganismo cultivadas em um método, conforme descrito no presente documento, são
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36/229 lisadas, desse modo, produzindo um lisado. Em algumas modalidades, o lisado é usado para produzir uma emulsão ou suspensão. Em algumas modalidades, o lisado é separado em frações insolúveis e solúveis, qualquer uma ou as duas podem ser concentradas opcionalmente ou secas. Em algumas modalidades, é fornecido um bioestimulante vegetal que compreende uma emulsão, suspensão de lisado ou fração do mesmo produzida conforme descrito no presente documento.
[0086] Em outro aspecto, as proteínas produzidas em um método, conforme descrito no presente documento, são hidrolisadas, desse modo, produzindo um hidrolisado. Em uma modalidade, a hidrólise compreende realizar uma hidrólise ácida. Em uma modalidade, a hidrólise compreende pelo menos uma enzima que tem capacidade para hidrolisar proteínas em pelo menos um dentre aminoácidos e oligopeptídeos livres. Em uma modalidade, a hidrólise compreende realizar uma hidrólise alcalina. Em algumas modalidades, o hidrolisado é usado para produzir uma emulsão ou suspensão. Em algumas modalidades, o hidrolisado é separado em frações insolúveis e solúveis, qualquer uma ou as duas podem ser concentradas opcionalmente ou secas. Em algumas modalidades, o hidrolisado é filtrado, desse modo, produzindo um filtrado (permeado) e um filtreto (retentado; resíduo). Em algumas modalidades, é fornecido um bioestimulante vegetal que compreende um hidrolisado, emulsão, suspensão, fração, filtrado ou filtreto do mesmo produzido, conforme descrito no presente documento.
[0087] Em outro aspecto, a biomassa produzida em um método, conforme descrito no presente documento, é usada para produção de um bioestimulante vegetal que compreende: hidrolisar a dita biomassa a fim de obter um hidrolisado; e formular o hidrolisado como um bioestimulante vegetal para aplicação foliar e/ou aplicação como um adjuvante de solo e/ou aditivo para uso em um meio líquido par acrescimento de planta. Em uma modalidade, o método inclui adicionalmente aplicar o bioestimulante vegetal a uma plana e/ou a um solo no qual uma planta é cultivada e/ou ao meio líquido usado para cultivar
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37/229 uma planta; e colhera planta. Em uma modalidade, a hidrólise compreende pelo menos uma enzima que tem capacidade para hidrolisar proteínas em pelo menos um dentre aminoácidos e oligopeptídeos livres. Em uma modalidade, a hidrólise compreende realizar uma hidrólise ácida. Em uma modalidade, a hidrólise compreende realizar uma hidrólise alcalina. Em algumas modalidades, um é fornecido bioestimulante vegetal que compreende uma biomassa hidrolisado, conforme descrito no presente documento.
[0088] Em outro aspecto, um método é fornecido para produzir um lisado que compreende cultivar um microrganismo, conforme descrito no presente documento, em um biorreator sob condições que são adequados par acrescimento do microrganismo, sendo que a biomassa produzida no dito biorreator é colhido e removido do biorreator, em que a dita biomassa removida do biorreator é lisada subsequentemente, desse modo, produzindo um lisado. Em algumas modalidades, as células são rompidas por homogeneização. Em algumas modalidades, o lisado compreende proteínas, e o método compreende adicionalmente hidrolisar proteínas no dito lisado, desse modo, produzindo um hidrolisado.
[0089] Em outro aspecto, é fornecido um concentrado de proteína que é isolado de um microrganismo cultivado em um método, conforme descrito no presente documento. Em uma modalidade, o concentrado de proteína contém menos que cerca de 5% de ácido nucleico. Em uma modalidade, o concentrado de proteína contém menos que cerca de 3% de ácido nucleico.
[0090] Em outro aspecto, um método conforme descrito no presente documento para a conversão biológica de moléculas inorgânicas e/ou orgânicas que contêm um ou mais átomos de carbono, em moléculas orgânicas que compreendem aminoácidos, proteínas, e/ou vitaminas produzidas através de uma reação de fixação de carbono ou biossíntese anabólica, compreende adicionalmente produzir um produto de proteína concentrado, compreender as etapas de: a. romper as ditas células de
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38/229 microrganismo, sendo que as ditas células compreendem uma ou mais enzimas nucleases, desse modo, produzindo uma mistura que compreende ácido nucleico solúvel, nuclease e proteína e que compreende dejetos de parede celular insolúvel; b. separar o ácido nucleico solúvel, a nuclease e a proteína dos dejetos de parede celular insolúvel sob condições nas quais o ácido nucleico é hidrolisado com a nuclease, desse modo produzindo ácido nucleico hidrolisado; d. tornar a proteína insolúvel; e e. separar a proteína insolúvel dos materiais solúveis restantes que compreendem o ácido nucleico hidrolisado. Em algumas modalidades, as células são rompidas por homogeneização. Em uma modalidade, a proteína insolúvel compreende menos que cerca de 5% de ácido nucleico. Em uma modalidade, a proteína insolúvel compreende menos que cerca de 3% de ácido nucleico.
[0091] Em outro aspecto, biomassa e/ou moléculas orgânicas produzidas conforme descrito no presente documento têm uma aplicação como pelo menos um dentre: uma fonte de carbono e/ou nitrogênio orgânico para fermentações; uma fonte de nutrientes para o crescimento de outros micróbios ou organismos; um prebiótico; uma fonte de nutrientes ou um ingrediente de alimentos para seres humanos; uma alimentação para animais; como uma matéria-prima ou intermediário químico para processos de fabricação ou químicos; fontes de substâncias farmacêuticas, medicinais ou nutricionais; um fertilizante; aditivo de solo; um estabilizador de solo; adjuvante de solo; bioestimulante vegetal; e/ou um potencializador de crescimento de cogumelo. Em uma modalidade, o fertilizante e/ou aditivo de solo; e/ou estabilizador de solo; e/ou adjuvante de solo; e/ou bioestimulante vegetal; e/ou potencializador de crescimento de cogumelo adiciona carbono e/ou nitrogênio ao solo, resultando em um aumento no teor de carbono e/ou de nitrogênio do solo ao qual é aplicado. Em uma modalidade, a fonte de carbono é uma molécula de C1 gasosa, e em que o carbono adicionado ao solo representa carbono sequestrado, e o processo de ponta a ponta da fonte de carbono C1 gasoso a o carbono de solo representa um processo de sequestro de carbono. Em uma modalidade, o fertilizante e/ou
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39/229 bioestimulante é aplicado a uma safra que é cultivada de maneira hidropônica, aeropônica, aquapônica ou em um sistema vertical de fazenda. Em uma modalidade, o fertilizante e/ou bioestimulante é usado em fertigação. Em uma modalidade, o fertilizante e/ou bioestimulante é aplicado a uma safra que é cultivada em uma estufa, internamente e/ou com o uso de iluminação artificial. Em uma modalidade, é fornecido um método para crescimento de micróbios e outros organismos, sendo que os ditos micróbios e organismos são cultivados no solo em uma fonte de nutrientes produzida, conforme descrito no presente documento. Em uma modalidade, um método de fermentação é fornecido, com o uso das ditas fontes de carbono orgânico e/ou de nitrogênio para produzir um ou mais bioprodutos que compreende: uma enzima comercial; um antibiótico; um aminoácido; uma proteína; um bioestimulante vegetal; um potencializador de crescimento de cogumelo; um probiótico; um prebiótico; um biofertilizante; um alimento; um ingrediente de alimento; uma vitamina; um lipídeo; um bioplástico; um polissacarídeo; um produto neutracêutico; e/ou um produto farmacêutico.
[0092] Em outro aspecto, um método é fornecido para obter um extrato de enzima orgânico de matéria-prima C1 que compreende um método para a conversão biológica de moléculas inorgânicas e/ou orgânicas que contém um ou mais átomos de carbono, em moléculas orgânicas que compreendem aminoácidos, proteínas e/ou vitaminas produzidas através de uma reação de fixação de carbono ou biossíntese anabólica, conforme descrito no presente documento, sendo que a dita fonte de carbono compreende apenas um átomo de carbono, sendo que o dito método compreende adicionalmente submeter as ditas células de microrganismo a um ou mais dentre: lise mecânica; lise enzimática; um ajuste de pH; um aumento ou diminuição em pressão; um aumento ou diminuição em temperatura; campos elétricos ou eletromagnéticos; ultrassom; uma mudança em osmolaridade; e hidrólise enzimática, desse modo produzindo um extrato de enzima orgânico.
[0093] Em outro aspecto, é fornecido um potencializador de crescimento de cogumelo que compreende biomassa e/ou
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40/229 proteína produzida em um método, conforme descrito no presente documento. Em uma modalidade, é fornecido um método para intensificar o crescimento de cogumelo que compreende combinar o potencializador de crescimento de cogumelo com composto de cogumelo. Em uma modalidade, é fornecida uma composição de crescimento de cogumelo que compreende o cogumelo composto de cogumelo combinado e potencializador de crescimento de cogumelo.
[0094] Vários objetos, recursos, aspectos e vantagens dos métodos, sistemas, microrganismos, e composições descritos no presente documento ficarão mais evidentes a partir da descrição detalhada a seguir de algumas modalidades exemplificativas da invenção.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0095] As modalidades não limitativas da presente invenção serão descritas a título de exemplo com referência às Figuras anexas, dentre as quais algumas são esquemáticas e não estão destinadas a serem desenhadas em escala. A título de objetividade, nem todos os componentes são identificados em todas as Figuras, tampouco são mostrados todos os componentes de cada modalidade da invenção quando a ilustração não for necessária, a fim de permitir que as pessoas versadas na técnica entendam a invenção.
[0096] A Figura 1 retrata a correlação entre OD e densidade de biomassa.
[0097] A Figura 2 retrata uma curva de crescimento para Cupriavidus necatorem garrafas com soro em gás.
[0098] A Figura 3 retrata a mudança na pressão na folga de fechamento ao longo do tempo ou crescimento de Cupriavidus necator em gás nas garrafas com soro.
[0099] A Figura 4 retrata a biomassa seca produzida por moles de H2 consumidos para Cupriavidus necator em garrafas com soro.
[0100] A Figura 5 retrata uma curva de crescimento
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41/229 para Cupriavidus necator cultivado sob H2/CO2/O2 em um biorreator.
[0101] A Figura 6 demonstra o crescimento de microrganismos quimiotróficos e oleaginosos em diferentes fontes de carbono. O crescimento bacteriano foi medido com o uso de detecção de densidade óptica (OD) a 650 nm após os dias indicados (em parênteses). As condições do meio e de crescimento são descritas na seção Exemplos, infra. ND, não realizado.
[0102] A Figura 7 mostra um diagrama esquemático de biorreatores e sistemas de suporte usados para cultivar C. necator sob gás.
[0103] A Figura 8 mostra dois biorreatores de 20 I que são cultivados em C. necator sob gás em uma capela fumê.
[0104] A Figura 9 mostra controladores de Applikon e consoles que foram usados para operar reatores de 20 litros junto de um sistema de detecção de gás explosivo, fluxômetros de massa, controladores de nível, reservatórios de controle de base, reservatório de adição de meio e reservatório de controle de espuma.
[0105] A Figura 10 mostra uma pasta fluida de biomassa de C. necator antes da sonicação (esquerda) com uma cor marrom, e após sonicação, com rompimento celular completo (direita), em que a cor da biomassa foi de marrom para creme.
[0106] A Figura 11 mostra a cepa Hydrogenovibrio marinus cepa DSM 11271 crescendo em um biorreator em uma mistura de gases H2, CO2 e O2.
[0107] A Figura 12 mostra um sistema de garras de entrega e de cultura de gás usados para cultivar a cepa Rhodopseudomonas capsulata DSM 1710, diagramada esquematicamente.
[0108] A Figura 13 mostra um micrográfico da R. capsulata.
[0109] A Figura 14 mostra um pélete de biomassa de R. capsulata recuperado após centrifugação.
[0110] A Figura 15 mostra um diagrama esquemático
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42/229 de um sistema fermentador de vidro de dois litros usado para crescer cepa Xanthobacter autotrophicus DSM 432 em uma mistura de gases H2, CO2 e O2 como a única fonte de energia e carbono para mistura.
[0111] A Figura 16 mostra a placa frontal do biorreator de dois litros usados para cultivar X. autotrophicus, ilustrados esquematicamente.
[0112] A Figura 17 mostra um diagrama esquemático de um sistema de reator para cultivar Xanthobacter autotrophicus, incluindo: manômetros; gás fluxômetros; válvulas segurança e de retenção; filtros de 0,2 micron; o vaso de biorreator, sensores, atuadores e controladores; um condensador e armadilha de espuma; e respiradouro de saída.
[0113] A Figura 18 mostra um diagrama esquemático do sistema de entrega de gás usado para cultivar X. autotrophicus.
[0114] A Figura 19 retrata a correlação entre OD600 e peso seco celular (CDW) para X. autotrophicus.
[0115] A Figura 20 retrata a curva de crescimento para X. autotrophicus cultivados em H2/CO2/O2.
[0116] A Figura 21 mostra um diagrama de blocos de uma modalidade de um método descrito no presente documento, com tratamento alcalino de caldo de fermentação na forma de uma suspensão de célula aquosa, seguida por um tratamento físico por um tratamento físico e hidrólise enzimática para obter um extrato de enzima orgânico.
[0117] A Figura 22 mostra um diagrama de blocos de uma modalidade de um método descrito no presente documento, por meio do qual um isolado de baixo teor de ácido nucleico, de alto teor de proteína é derivado das células, conforme descrito no presente documento.
[0118] A Figura 23 mostra esquematicamente um sistema de suporte de vida de múltiplos estágios de composite ou sistema ecológico com um produtor primário quimioautotrófico.
[0119] A Figura 24 mostra esquematicamente o uso
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43/229 de CO2 + H2 renovável para produção de farelo de alto teor de proteína, que pode ser usado, por exemplo, como um bioestimulante, alimentação de animal ou fertilizante ou para nutrição humana direta.
[0120] A Figura 25 mostra um diagrama esquemático de um sistema integrado que converter CO2 residual e energia fora de pico intermitente renovável em bioestimulante de alto teor de proteína, alimentação, fertilizante e/ou nutrientes. Além da captura de CO2 e produção de nutrientes valiosos, o sistema libera a cepa na grade a partir da geração renovável em excesso durante período de baixa demanda.
DESCRIÇÃO DETALHADA [0121] A divulgação no presente documento se refere à produção biológica de aminoácidos e proteínas e outros constituintes de biomassa, em um sistema microbiano, com o uso de um substrato gasoso, tais como misturas de gás de síntese ou gás produtor ou gás de pirólise ou H2 e CO2, como uma fonte de carbono e de energia. A divulgação também se refere ao uso de aminoácidos microbianos, proteínas e outros constituintes de biomassa para alimentar ou fornecer nutrientes a outros organismos ou seres humanos. Os aminoácidos, proteínas e outros constituintes de biomassa produzidos de acordo com os métodos revelados podem ser consumidos e usados como nutrientes por outros organismos para a produção de alimentos e outros produtos com base biológica.
[0122] A presente divulgação também se refere a composições e métodos para produzir aminoácidos, proteínas e outros constituintes de biomassa através do cultivo de bactérias ou outros microrganismos que crescem em gases que contêm carbono, tais como syngas, gás produtor, gás de pirólise, CO2, monóxido de carbono e misturas do mesmo gás que contém hidrogênio. Além disso, isso se refere a misturas de gás que contêm metano, tais como biogás ou gás natural. A presente divulgação referese adicionalmente a métodos para fixar carbono de entrada gasosa a moléculas orgânicas únicas, tal como aminoácidos, proteínas, vitaminas e outros
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44/229 nutrientes. As bactérias e/ou microrganismos revelados no presente documento podem ser modificadas geneticamente para uso nos métodos ou outros aspectos descritos no presente documento. Em alguns outros aspectos descritos no presente documento, os microrganismos não são modificados geneticamente, isto é, são do tipo selvagem.
[0123] A presente divulgação refere-se adicionalmente a métodos para fixar carbono de gás em moléculas orgânicas úteis, tais como aminoácidos, proteínas, vitaminas e outros nutrientes. A divulgação descreve adicionalmente a mecanismos para conferir a um organismo a capacidade para produzir e/ou intensificar a produção por um organismo de produtos à base de carbono, através da conversão de dióxido de carbono ou outras fontes de carbono inorgânicos e energia inorgânica, incluindo energia química de um produto químico inorgânico, ou diretamente de uma fonte elétrica, em produtos à base de carbono de valor comercial e, em particular, aminoácidos, proteínas, vitaminas e outros nutrientes de valor comercial.
[0124] A presente divulgação refere-se adicional a ecologias artificiais, sistemas tráficos modificados, sistemas ecológicos fechados, microssomos, sistemas de cultura contínua, sistemas de suporte vital de ciclo fechado biorregenerativos (Freda B. Taub (1974) Closed Ecological Systems Annual Review of Ecology and Systematics 5:139 a 160; e. A. Zuraw (1966) “Study of life support systems for space missions exceeding one year in duration” NASA, Tech. Rep. SP-134, que são incorporados no presente documento a título de referência em sua totalidade).
[0125] A presente divulgação refere-se adicionalmente a usos de gás hidrogênio. O hidrogênio foi considerado de modo geral como uma alternativa sustentável a combustíveis fósseis ou como um meio de armazenamento de energia elétrica. No entanto, também pode ser usado como uma matéria-prima e fonte de energia primária para o cultivo de microrganismos de oxidação por hidrogênio.
[0126] A presente divulgação refere-se
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45/229 adicionalmente à aplicação de tecnologia de microrganismos quimioautototróficos e, particularmente, bactérias de oxidação por hidrogênio. Estes são um grupo especial de bactérias que foram estudados no passado, como produtores potenciais de proteína de célula única (SCP) (G. L. Drake, C. D. King, W. A. Johnson, e. A. Zuraw, “Study of life support systems for space missions exceeding one year in duration,” NASA, Tech. Rep. SP-134, abril de 1966.; R. Repaske e R. Mayer, “Dense autotrophic cultures of Alcaligenes eutrophus (1976) Applied e environmental microbiology 32(4):592 a 597 (http://aem.asm.Org/cgi/content/abstract/32/4/592)), e poli-hidroxibutirato (PHB).
[0127] A presente divulgação refere-se adicionalmente a extratos microbianos e hidrolisados de proteína. (Patente n° U.S. 3.887.431; Patente n° U.S. 9.416.062; Pedido de Patente U.S. 2012/0129695; Pedido de Patente n° E.P. 2.752.399; são incorporados no presente documento a título de referência em sua totalidade). A divulgação também se refere a obtenção de extratos com alta capacidade de biofertilizante e/ou bioestimulante e alta capacidade de bioabsorção para microrganismos heterotróficos, fungos, animais e plantas de modo que sejam especialmente úteis para criação orgânica, fermentações, alimentação de animais e nutrição de ser humano direto.
[0128] A presente divulgação refere-se adicional a bioestimulantes e biofertilizantes. A divulgação também se refere a métodos para produzir nutrientes, bioestimulantes, biofertilizantes e os bioestimulantes e/ou biofertilizantes produzidos pelos mesmos. A divulgação também se refere a materiais de intensificação de crescimento de cogumelo. A divulgação também se refere a métodos para cultivar plantas e fungos aplicando-se tais bioestimulantes, biofertilizantes e/ou materiais de intensificação de crescimento. A divulgação se refere adicionalmente a processos para preparar produtos a partir de tais plantas e fungos, elevando ao gado alimentando-se gado tais plantas ou fungos o gado e produzindo-se produtos de gado. (Colla, G. et al. (2015) “Protein hydrolysates as biostimulants in horticulture” Scientia
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Horticulturae 196:28 a 38 (http://dx.doi.Org/10.1016/j.scienta.2015.08.037); Pedido n°U.S. US20120129695; Pedido n°E.P. 2752399A1; e a Patente n°U.S. 4.776.872, que são incorporados no presente documento a título de referência em sua totalidade).
[0129] No presente documento são fornecidos métodos e sistemas para produção biossintética de aminoácidos, proteínas, vitaminas e outros nutrientes biológicos. Em determinadas modalidades, são fornecidos microrganismos naturais ou modificados são fornecidos que produzem aminoácidos, proteínas e outros nutrientes biológicos, em um substrato gasoso, incluindo, porém sem limitação, gás produtor, syngas, gás de saída, pirólise, knallgas, gás natural, biogás e misturas de gás que contêm H2 e CO2, e/ou CO e/ou CPU. O substrato gasoso pode servidor como uma fonte de carbono e/ou de energia e/ou de energia e/ou uma fonte de doadores de elétrons e/ou aceitadores de elétrons para crescimento dos microrganismos e biossíntese de bioprodutos. Em determinadas modalidades, aminoácidos, peptídeos, proteínas, vitaminas e/ou outros nutrientes são sintetizados a partir de precursores de C1 simples e inorgânicos incluindo, porém sem limitação um ou mais dentre o seguinte: syngas, gás produtor, H2, CO2, CO, H2O, NH3, CPU, CH3OH, HCOH, uréia.
[0130] São fornecidos, também, microrganismos, tais como um microrganismo do tipo selvagem ou modificados que podem ser cultivados em syngas, ou gás produtor e/ou PI2 e/ou CO2 e/ou CO e/ou CPU e/ou outros gases residuais, que podem produzir aminoácidos incluindo, porém sem limitação, lisina e/ou metionina.
[0131] Em determinadas modalidades, os aminoácidos, e/ou peptídeos, e/ou proteínas e/ou vitaminas são sintetizados de precursores de C1 simples e inorgânicos incluindo, porém sem limitação, um ou mais dentre o seguinte: PI2, CO2, CO, H2O, NPI3, CPU, CPI3OPI, HCOPH, uréia. Em outras modalidades não limitativas, aminoácidos e/ou peptídeos e/ou proteínas e/ou vitaminas são produzidos de maneira heterotrófica a partir de moléculas
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47/229 orgânicas de múltiplos carbonos, tais como, porém sem limitação, açúcares.
[0132] Em algumas modalidades, a divulgação se refere a um método para produzir um ou mais aminoácidos ou proteínas ou vitaminas que compreende expor uma célula bacteriana ao syngas e/ou gás produtor e/ou CO2 e/ou H2 e/ou CO e/ou CPU gasoso, por exemplo, PI2 e CO2, e/ou CO, e/ou CPU; em que a célula bacteriana tem capacidade para fixar CO2 gasoso e/ou outras moléculas C1 em um ou mais aminoácidos ou proteínas ou vitaminas, e em que o microrganismo não compreende um ácido nucleico exógeno ou compreende pelo menos um primeiro ácido nucleico exógeno. Em algumas modalidades, a célula utiliza o substrato gasoso (ou substratos gasosos) como uma fonte para reduzir equivalentes e/ou energia metabólica para a síntese de um ou mais aminoácidos ou proteínas ou vitaminas. Em algumas modalidades, o microrganismo através de seu maquinário nativo produz aminoácidos e/ou proteínas e/ou vitaminas.
[0133] Em algumas modalidades, a divulgação se refere a um método para produzir aminoácidos e/ou proteínas e/ou biomassa proteinácea e/ou vitaminas, em que o método compreende cultivar uma cepa de microrganismo natural ou um microrganismo modificado em um biorreator ou solução com uma matéria-prima que compreende syngas e/ou gás produtor e/ou CO2 e/ou PI2 gás e/ou CO e/ou CPU e/ou biogás e/ou gás natural, por exemplo, PI2 e CO2, e/ou CO e/ou CPU. Em algumas modalidades, a divulgação se refere a um biorreator que compreende a composição ou células bacterianas ou microbianas descritas no presente documento. Em algumas modalidades, a divulgação se refere a um sistema para a produção de um ou mais aminoácidos, proteínas ou nutrientes que compreende um biorreator que compreende: (a) uma população de microrganismos que compreende uma célula descrita no presente documento; e (b) uma entrada conectada a uma fonte de matéria-prima que permite a entrega de uma matéria-prima que compreende syngas ou gás produtor e/ou CO2 e/ou PI2 e/ou CO gasoso e/ou CPU e/ou metanol, por exemplo, PI2 e CO2, e/ou CO, e/ou CPU e/ou metanol.
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48/229 [0134] Em algumas modalidades, a divulgação se refere a um método para produzir am inoácidos ou proteínas ou outros nutrientes em uma população de microrganismos que compreendem a célula da composição descrita no presente documento, sendo que o método compreende: cultivar uma população de microrganismos que compreendem a célula ou a composição descrita no presente documento em uma matéria-prima que compreende syngas ou gás produtor e/ou CO2 gasoso e/ou H2 e/ou CO e/ou Chh e/ou metanol, por exemplo, H2 e CO2, e/ou CO, e/ou ChU e/ou metanol.
[0135] Em algumas modalidades, a divulgação se refere a um método para produzir um ou mais aminoácidos ou proteínas ou outros nutrientes que compreende (a) cultivar uma célula descrita no presente documento em um vaso de reação ou biorreator na presença de syngas ou gás produtor e/ou CO2 gasoso e/ou H2 e/ou CO e/ou Chh, por exemplo, H2 e CO2, e/ou CO, e/ou Chh, em que a célula produz e/ou secreta um ou mais aminoácidos ou proteínas ou outros nutrientes em uma quantidade igual ou maior que pelo menos 10% da massa celular seca total da célula; e (b) separar o um ou mais aminoácidos ou proteínas ou outros nutrientes ou um produto completo de célula do vaso de reação. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente purificar o um ou mais aminoácidos ou proteínas ou outros nutrientes ou produtos completos de célula após a separação do vaso de reação ou biorreator. Em algumas modalidades, o um ou mais aminoácidos ou proteínas ou outros nutrientes ou produtos completos de célula são componentes, ou precursores ou estão incluídos dentro de uma alimentação ou fornecimento de nutriente ou fertilizante fornecido a outro organismo. Em algumas modalidades, a divulgação se refere a um método para produzir um ou mais aminoácidos que compreende expor uma célula bacteriana, célula de arquea, e/ou outra célula microbiana a syngas e/ou CO2 gasoso e/ou H2 e/ou CO e/ou Chh, por exemplo, H2 e CO2, e/ou CO e/ou Chh; em que a célula tem capacidade para fixar CO2 gasoso e/ou outra fontes de carbono C1 a um ou mais aminoácidos e/ou proteínas e/ou vitaminas; em que os compostos são recuperados do biorreator
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49/229 ou mais reatores e/ou etapas de processo adicionais em que os compostos são pós-processados para gerar produtos incluindo, porém sem limitação, um ou mais dentre: fertilizante, bioestimulante, suplemento de crescimento, nutrição humana ou vitaminas.
[0136] As composições e métodos são fornecidos para a captura de dióxido de carbono de dióxido de correntes de gás que contém carbono e/ou dióxido de carbono atmosférica ou dióxido de carbono em forma dissolva, liquefeita ou ligada quimicamente através de um processo químico e biológico que utiliza microrganismos quimioautototróficos obrigatórios ou facultativos e particularmente organismos quimiolitoautotróficos, em uma ou mais etapas de processos de fixação de carbono. A divulgação também fornece composições e métodos para a recuperação, processamento e uso dos produtos químicos de reações quimiossintéticas realizadas por quimioautotróficos para fixar carbono inorgânico em compostos orgânicos que são produtos químicos intermediários acabados, incluindo, porém sem limitação, aminoácidos e/ou proteína e/ou vitaminas e/ou biomassa. A divulgação também fornece composições e métodos para a geração, processamento e entrega de nutrientes químicos necessários para quimiossíntese e manutenção de culturas quimioautotróficas, incluindo, porém sem limitação, a provisão de doadores de elétrons e aceitadores de elétrons necessários para quimiossíntese. A divulgação também fornece composições e métodos para a manutenção de um ambiente condutor para crescimento de quimiossíntese e quimioautotrófico, e a recuperação e reciclagem de nutrientes químicos não usados e água de processo.
[0137] Um recurso de determinadas modalidades no presente documento é a inclusão de uma ou mais etapas de processo que utiliza microrganismos quimiotróficos como um biocatalisador para conversão de produtos químicos C1 em moléculas orgânicas de cadeia de carbono mais longa (isto é, C2 ou mais longa, e em algumas modalidades, C5 ou mais longa, moléculas de cadeia de carbono), dentro de um processo geral para a conversão
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50/229 de fontes de carbono C1, incluindo, porém sem limitação, monóxido de carbono, metano, metanol, formato ou ácido fórmico e/ou misturas que contém produtos químicos C1 incluindo, porém sem limitação, várias composições de syngas geradas a partir de matérias-primas e/ou metano matérias-primas de carbono fixo gaseificadas, pirolisadas ou reformadas por vapor. Em algumas dessas modalidades, syngas que contém C1 ou gás de processo ou produtos químicos C1 em uma forma líquida a ou dissolvidos em solução são bombeados ou, de outro modo, adicionados a um vaso ou confinamento que contém meios de nutriente e microrganismos quimiotróficos. Em alguns desses casos, microrganismos quimiotróficos realizam síntese bioquímica para alongar produtos químicos C1 em produtos químicos orgânicos de cadeia de carbono mais longa com o uso do carbono e elétrons armazenados no produto químico de C1 e/ou elétrons e hidrogênio de hidrogênio molecular e/ou materiais de eletrodo de estado sólido e/ou um ou mais dentre a lista a seguir de doadores de elétrons bombeados ou, de outro modo, fornecidos aos meios de nutriente, incluindo porém sem limitação: amônia; amônio; monóxido de carbono; ditionita; enxofre elementar; hidrocarbonetos; metabissulfetos; óxido nítrico; nitretos; sulfatos, tais como tiossulfatos incluindo, porém sem limitação, tiossulfato de sódio (Na2S20s) ou tiossulfato de cálcio (CaS2Os); sulfetos, tais como sulfeto de hidrogênio; sulfetos; tionato; tionita; metais de transição ou sulfetos dos mesmos, óxidos, calcogênios, haletos, hidróxidos, oxi-hidróxidos, sulfatos ou carbonates, em fases solúveis ou sólidas. Os doadores de elétrons podem ser oxidados por aceitadores de elétrons em uma reação respiratória quimiossintética. Em determinadas modalidades, aceitadores de elétrons que são usados para respiração pelos microrganismos descritos no presente documento incluem, porém sem limitação, uma ou mais dentre o seguinte: oxigênio, dióxido de carbono, ferro férrico ou outros íons de metal de transição, nitratos, nitretos, oxigênio ou furos em materiais de eletrodo em estado sólido. Em determinadas modalidades não limitativas, o dito microrganismo quimiotrófico é um microrganismo de Knallgas ou oxi-hidrogênio.
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51/229 [0138] Em determinadas modalidades, a divulgação se refere a cepas bacterianas quimiotróficas que não compreendem um ácido nucleico exógeno ou que compreendem uma ou mais sequências de ácidos nucleicos exógenos. A presente invenção surge, em parte, da constatação de que bactérias quimiotróficas e microrganismos particulares relacionados fornecem vantagens não previstas na produção econômica e em larga escala de produtos químicos, proteínas, alimentações, fertilizantes, monômeros, óleos, combustíveis e outras substância biológicas de matérias-primas de carbono gasoso e residual.
[0139] As proteínas, lipídeos e outros produtos bioquímicos sintetizados pelos microrganismos descritos no presente documento podem ser aplicados a usos incluindo, porém sem limitação: matériaprima para a produção de bioestimulantes, biofertilizantes ou suplementos de crescimento de cogumelo; e como ingredientes em bioestimulantes, biofertilizantes, fertilizantes, alimentação animal, alimentos, cuidados pessoas e produtos cosméticos. Em algumas modalidades, processos enzimáticos e químicos podem ser utilizados para produzir vitaminas, aminoácidos e/ou proteínas. Algumas modalidades fornecem métodos para a produção de bioestimulantes e/ou fertilizantes. Além disso, a divulgação fornece métodos para cultivar e/ou modificar bactérias quimiotróficas para rendimento aprimorado de aminoácido e/ou rendimento de proteína e/ou custos mais baixos de produção.
[0140] A divulgação se refere a métodos e mecanismos para conferir produção e/ou secreção de produtos à base de carbono de interesse, incluindo, porém sem limitação produtos químicos, monômeros, polímeros, aminoácidos, proteínas, polissacarídeos, vitaminas e produtos neutracêuticos ou farmacêuticos ou intermediários dos mesmos, em organismos quimiotróficos obrigatórios ou facultativos de modo que esses organismos convertam dióxido de carbono e/ou outras formas de carbono inorgânico e/ou syngas e/ou outros compostos C1, tais como metanol e/ou os
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52/229 produtos líquidos, gasoso e sólidos de reações pirolíticas, tais como gás de pirólise e/ou óleo, em produtos à base de carbono de interesse e, em particular, o uso de tais organismos para a produção comercial de produtos químicos, monômeros, polímeros, aminoácidos, proteínas, polissacarídeos, vitaminas, alimentações para animal, bioestimulantes, fertilizantes e produtos neutracêuticos ou farmacêuticos ou intermediários do mesmos. No entanto, a presente divulgação também se refere a métodos para produzir os ditos produtos de maneira heterotrófica a partir de fontes de carbono moleculares orgânicas de múltiplos carbonos, tais como, porém sem limitação, açúcares.
[0141] Em algumas modalidades, a divulgação também fornece composições e métodos para etapas de processo químico que ocorrem em série e/ou em paralelo com as etapas de reação quimiossintética: convertem produtos químicos de entrada crus não refinados em produtos químicos refinados mais refinados que são adequados para sustentar a etapa de fixação de carbono quimiossintético; que convertem entradas de energia em uma forma química que pode ser usada para acionar quimiossíntese, e especificamente em energia química na forma de doadores de elétrons e aceitadores de elétrons; que direcionam carbono inorgânico direto capturado de fontes aquáticas ou industriais ou atmosféricas à etapa de fixação de carbono ou etapas do processo sob condições que são adequadas para sustentar fixação de carbono quimiossintético; que processam adicionalmente os produtos de saída das etapas de fixação de carbono quimiossintético em uma forma adequada para armazenamento, remessa e venda, com os ditos produtos incluindo porém sem limitação aminoácidos e/ou proteínas e/ou vitaminas e/ou biomassa. As etapas de processo abiótico completamente químicos combinadas com as etapas de fixação de carbono quimiossintéticas biológicas constituem a captura de carbono geral e o processo de conversão da presente invenção. A presente invenção utiliza a facilidade exclusiva de integrar microrganismos quimioautototróficos dentro de uma correte de processo químico como um biocatalisador, em comparação a outras formas vidas.
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53/229 [0142] Salvo quando definido de outro modo no presente documento, todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o significado conforme entendido comumente pelas pessoas de habilidade comum na técnica à quais a presente invenção pertence. Singleton, et al., Dictionary of Microbiologia and Molecular Biology, segunda edição John Wiley e Sons, Nova Iorque (1994), e Hale & Markham, The Harper Collins Dictionary of Biology, Harper Perennial, NY (1991) fornecem à pessoa de habilidade comum na técnica um dicionário geral de muitos termos usados na presente invenção. Quaisquer métodos e materiais semelhantes ou equivalentes àquele descritos no presente documento podem ser usados na prática ou teste dos métodos, sistemas e composições descritos no presente documento.
[0143] A prática da presente invenção empregará, salvo quando indicado de outro modo, técnicas convencionais de biologia molecular (incluindo técnicas recombinantes), microbiologia, biologia celular e bioquímica, que são abrangidas pela técnica. Tais técnicas são explicadas completamente na literatura, por exemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edição (Sambrook et al., 1989); Oligonucleotide Synthesis (Μ. J. Gait, edição 1984; Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al., edições 1994); PCR: The polimerase Chain Reaction (Mullis et al., edições, 1994); e Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (Kriegler, 1990).
[0144] As faixas fornecidas no presente documento incluem os números que definem a faixa.
[0145] Salvo quando indicado de outro modo, ácidos nucleicos estão escritos da esquerda para a direita na orientação 5' a 3'; sequências de aminoácidos são escritas da esquerda para a direita na orientação amino para carbóxi, respectivamente.
DEFINIÇÕES [0146] “Um”, “uma”, “o” “a” incluem referências ao plural, salvo quando o contexto indicar claramente de outro modo, então, os artigos indefinidos “um”, “uma”, “o” “a”, conforme usado no presente documento
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54/229 no relatório descritivo e nas reivindicações, salvo quando indicado claramente de outro modo, devem ser entendidos como significando “pelo menos um(a)”.
[0147] O sintagma “e/ou”, conforme usado no presente documento no relatório descritivo e nas reivindicações, devem ser entendidos como significando “qualquer um ou ambos” dos elementos então em conjunto, isto é, elementos que estão presentes em conjunto em alguns casos e presentes separados em outros casos. Outros elementos diferentes dos elementos especificamente identificados pela oração “e/ou” podem estar opcionalmente presentes, estejam relacionados ou não relacionados aos elementos especificamente identificados salvo quando indicado claramente de outro modo. Desse modo, como um exemplo não limitative, uma referência a “A e/ou B”, quando usada em combinação de linguagem em aberto, tais como “compreendendo” pode se referir, em uma modalidade, um A sem B (opcionalmente, incluindo elementos diferentes de B); em outra modalidade, a B sem A (opcionalmente, incluindo elementos diferente de A); ainda em outra modalidade, tanto a A quanto B (opcionalmente incluindo outros elementos); etc.
[0148] O termo “cerca de”, conforme usado no presente documento, quando há referência a um valor mensurável, tal como uma quantidade, uma duração temporal e semelhante deve significar variações de ±20%, ±10%, ±5%, ±1% ou ±0,1% do valor especificado, uma vez que tais variações são adequadas para realizar os métodos revelados ou em combinação com uma composição revelada.
[0149] O termo “aminoácido” se refere a uma molécula que contém tanto um grupo amina quanto um grupo carboxila que são ligados a um carbono, que é denominado de alfa-carbono. Os aminoácidos adequados incluem, sem limitação, tanto os D- e L-isômeros dos aminoácidos de ocorrências natural, assim como aminoácidos de ocorrências natural preparados por síntese orgânica ou outras vias metabólicas. Em algumas modalidades, um único “aminoácido” pode ter múltiplas porções químicas de cadeia lateral, conforme disponível por um arcabouço de cadeia principal
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55/229 aromática ou alifática estendida. Salvo quando o contexto indica de especificamente de outro modo, o termo aminoácido, conforme usado no presente documento, está destinado a incluir análogos de aminoácido.
[0150] O “anabolismo” se refere ao processo pelo qual organismos vivos sintetizam moléculas complexas de vida a partir de formas mais simples. Os processos anabólicos produzem peptídeos, proteínas, polissacarídeos, lipídeos e ácidos nucleicos. A energia exigida para anabolismo é fornecida por carreadores de energia intracelular, tal como trifosfato de adenosina (ATP).
[0151] As “auxinas” são uma classe de hormônios vegetais (ou substâncias de crescimento de planta) com algumas características tipo morfogênicas. As auxinas têm uma função central em coordenação de muitos processos de crescimento e comportamentais no ciclo de vida da planta e são essenciais para o desenvolvimento do corpo da planta.
[0152] A “bioabsorção” se refere ao processo por meio do qual substâncias são absorvidas pelos tecidos e órgãos de organismos.
[0153] “Bioestimulantes” ou “bioestimulante” se refere a compostos com capacidade para estimular o crescimento do desenvolvimento de plantas, por exemplo, safras agrícolas, assim como aumentar e intensificar atividade microbiológica do solo.
[0154] O termo “biomassa” se refere a um material produzido pelo crescimento e/ou propagação de células. A biomassa pode conter células e/ou teores intracelulares assim como material extracelular, incluindo, porém sem limitação, compostos secretados por uma célula.
[0155] O termo “biorreator” ou “fermentador” se refere a um vaso fechado ou parcialmente fechado no qual as células crescem e são mantidas. As células podem estar, porém não necessariamente, retidas em suspensão líquida. Em algumas modalidades, em vez de serem mantidas em suspensão líquida, as células podem ser cultivadas e/ou mantidas alternativamente em contato com, sobre, ou dentro de outro substrato não líquido
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56/229 incluindo, porém sem limitação, um material de suporte de crescimento sólida.
[0156] O termo reação ou via “de fixação de carbono” se refere a reações enzimáticas ou vias metabólicas que convertem formas de carbono que são gasosas sob condições ambientes, incluindo, porém sem limitação CO2, CO e Chh, em produtos à base de carbono bioquímicos que são líquidos ou sólidos sob condições ambiente ou que são dissolvidos ou retidos na suspenção em na solução aquosa.
[0157] “A fonte de carbono” se refere aos tipos de moléculas dos quais um microrganismo deriva o carbono necessário para biossíntese orgânica.
[0158] Os microrganismos “carboxidotróficos” que podem tolerar ou oxidar monóxido de carbono. Em modalidades preferenciais, um microrganismo carboxidotrófico pode utilizar CO coo uma fonte de carbono e/ou como uma fonte de reduzir elétrons para biossíntese e/ou respiração.
[0159] O termo “catalisador” se refere a um ator químico, tal como uma molécula ou estrutura macromolecular, que acelera a velocidade na qual uma reação química ocorre quando um reagente ou reagentes é convertido em um produto ou produtos, ao mesmo tempo que o catalisador não se torna um produto por si só, ou, de outro modo, mudado ou consumido na conclusão da reação química. Após um catalisador participar de uma reação química, devido ao fato de que permanece inalterado, este pode participar de reações químicas adicionais, que atuam sobre reagentes adicionais para criar produtos adicionais. A fim de acelerar uma reação química, um catalisador diminui a barreira de energia de ativação por toda a via de reação permitindo este ocorra a uma temperatura mais fria ou mais rápida em uma determinada temperatura. Dessa maneira, uma abordagem mais rápida do sistema ao equilíbrio química pode ser alcançada. Catalisadores incluem enzimas, que são catalisadores de proteína.
[0160] O termo “material celulósico” se refere a qualquer material com uma alta quantidade de celulose, que é um polissacarídeo
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57/229 que tem a fórmula (CeHwOsjn, que consiste geralmente em uma cadeia linear de centenas a milhares de monômeros de D-glicose ligados a β (1—>4). As fontes de material celulósico incluem, porém sem limitação, papelão, algodão, palha de milho, papel, lascas de madeira, pó-de-serra, polpa de Beterraba-sacarina, bagaços de cana-de-açúcar e gramínea.
[0161] “O quimioautotrófico” se refere a organismos que obtém energia pela oxidação de doadores de elétrons químicos por aceitadores de elétrons químicos e sintetizam todos os compostos orgânicos necessários pelo organismo para viver e crescer a partir do dióxido de carbono.
[0162] O termo “CoA” ou “coenzima A” se refere a um cofator orgânico para condensar enzimas envolvidas em síntese e oxidação de ácido graxo, oxidação por piruvato, transferência de grupo acetila ou outra acila e em outra acetilação.
[0163] O termo “cofator” inclui todas as moléculas necessárias por uma enzima para realizar a atividade catalítica do mesmo. Em algumas modalidades, o cofator é qualquer parte de molécula do substrato.
[0164] Nas reivindicações, assim como no relatório descritivo, todos os sintagmas transicionais tais como “que compreende”, “que inclui”, “transportar”, “que tem”, “que contém”, “que envolve”, “que retém” e semelhantes devem ser entendidos como em aberto, isto é, com significando incluindo, porém sem limitação. Apenas os sintagmas transicionais “que consiste em” e “que consiste essencialmente em” devem ser sintagmas transicionais fechados ou semifechados, respectivamente.
[0165] O termo “cultivar” se refere a cultivar uma população de células, por exemplo, células microbianas, sob condições adequadas para crescimento, em um meio líquido ou sólido.
[0166] O termo “derivado de” abrange os termos “originado de”, “obtido de”, “obtenível de”, “isolado de” e “criado de” e, de modo geral, indica que um material especificado tem sua origem em outro material especificado ou tem recursos que podem ser descritos com referência a outro
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58/229 material especificado.
[0167] “Elicitadores” são moléculas extrínsecas ou estranhas muitas vezes associadas a pragas de planta, doenças ou organismos sinérgicos. Moléculas elicitadoras podem se fixar a proteínas receptoras especiais localizadas nas membranas de células vegetais.
[0168] A “fonte de energia” se refere ou ao doador de elétrons que é oxidado por oxigênio em respiração aeróbica ou a combinação de doador de elétrons que é oxidado e aceitador elétron que é reduzido na respiração anaeróbica.
[0169] Os meios “edáficos” do solo ou em relação ao mesmo, especialmente uma vez que afeta organismos vivos e/ou que está associado a um tipo particular de solo.
[0170] O termo “material lignocelulósico” é qualquer material composto de celulose, hemicelulose e lignina em que os polímeros carboidratos (celulose e hemiceluloses) são ligados de modo firme à lignina. Os materiais lignocelulósicos incluem resíduos agrícolas (incluindo palha de milho e bagaços de cana-de-açúcar), safras de energia de maioria de biomassa, resíduos de madeira (incluindo, serraria e descartes de moinho de papel) e uma fração substancial de resíduo municipal.
[0171] Os termos “lipídeos” se referem a uma categoria de moléculas que podem ser dissolvidas em solventes não polares (tais como s clorofórmio e/ou éter) e que também têm baixa ou nenhuma solubilidade em água. O caráter hidrofóbico de moléculas de lipídeos resulta tipicamente da presença de seções de hidrocarboneto de cadeia longa dentro da molécula. Os lipídeos incluem os seguintes tipos de molécula: hidrocarbonetos, ácidos graxos (saturados e insaturados), álcoois graxos, aldeídos graxos, ácidos hidróxis, diácidos, monoglicerídeos, diglicerídeos, triglicerídeos, fosfolipídeos, esfingolipídeos, esteróis, tais como colesterol e hormônios esteroide, vitaminas solúveis em gordura (tais como vitaminas A, D, E e K), policetídeos, terpenoides e ceras.
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59/229 [0172] O termo “lisado” se refere ao líquido que contém uma mistura e/ou uma solução de teores de célula que resultam de lise celular. Em algumas modalidades, os métodos descritos no presente documento compreendem uma purificação de produtos químicos ou mistura de produtos químicos em um lisado celular. Em algumas modalidades, os métodos compreendem uma purificação de aminoácidos e/ou proteína em um lisado celular.
[0173] O termo “lise” se refere à ruptura da membrana plasmática e caso presente, a parede celular de uma célula de modo que uma quantidade significante de material intracelular escape para o espaço extracelular. A lise pode ser realizada como uso de meios eletroquímicos, mecânico, osmótico, térmico ou viral. Em algumas modalidades, os métodos descritos no presente documento compreendem realizar uma lise de células ou microrganismos, conforme descrito no presente documento, afim de separar um produto químico ou mistura de produtos químicos dos teores de um biorreator. Em algumas modalidades, os métodos compreendem realizar uma lise de células ou microrganismos descritos no presente documento a fim de separar um aminoácido ou mistura de aminoácidos e/ou proteínas dos teores de um biorreator ou meio de proliferação celular.
[0174] Conforme usado no presente documento no relatório descritivo e nas reivindicações, “ou” deve ser entendido como tendo o mesmo significando que “e/ou” conforme definido acima. Por exemplo, quando se separar os itens em uma lista, “ou” ou “e/ou” devem ser interpretados como sendo inclusivos, isto é, a inclusão de pelo menos um, porém também incluindo mais de um, dentre vários ou uma lista de elementos e, opcionalmente, itens não listados adicionais. Apenas termos indicados claramente de outro modo, tais como “apenas um dentre” ou “exatamente um dentre” ou, quando usado nas reivindicações, “que consiste em”, se referirão à inclusão de exatamente um elemento dentre vários ou uma lista de elementos. De modo geral, o termo “ou”, conforme usado no presente documento, deve ser interpretado apenas como
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60/229 indicativo de alternativas exclusivas (isto é, “um(a) ou o outro(a) porém não os dois (as duas)”) quando antecedido de termos de exclusividade, tais como “ou”, “uma(a) dentre”, “apenas um(a) entre” ou “exatamente um(a) dentre” “que consiste essencialmente em”, quando usado nas reivindicações, deve ter seu significado comum conforme usado no campo das leis de patente.
[0175] “Titulação” se refere à quantidade de uma substância produzida por um microrganismo por volume unitário em um processo de fermentação microbiano. Por exemplo, titulação de biomassa pode ser expresso como gramas de biomassa produzida por litro de solução.
[0176] “Rendimento” se refere a uma quantidade de um produto produzido a partir de um material de alimentação (por exemplo, açúcar) em relação à quantidade total da substância que é produzida caso todas as substâncias de alimentação tenham sido convertidas no produto. Por exemplo, o rendimento de aminoácidos pode ser expresso como % de aminoácido produzido em relação a um rendimento teóricos caso 100% da substância de alimentação foram convertidos em aminoácido.
[0177] “Produtividade” se refere à quantidade de uma substância produzida por um microrganismo por volume unitário por tempo unitário em um processo de fermentação microbiano. Por exemplo, produtividade de biomassa pode ser expresso como gramas de biomassa produzida por litro de solução por solução.
[0178] “Tipo selvagem” se refere a um microrganismo conforme ocorre na natureza.
[0179] Um “gene” se refere a um segmento de DNA que é envolvido na produção de um polipeptídeo e inclui regiões antecedentes e após as regiões de codificação assim como sequências intervenientes (introns) entre segmentos de codificação individuais (éxons).
[0180] Os termos “recuperado(a)”, “isolado(a)”, “purificado(a)” e “separado(a)”, conforme usado no presente documento, se referem a um material (por exemplo, uma proteína, ácido nucleico ou célula) que
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61/229 é removido de pelo menos um componente ao qual é associado naturalmente. Por exemplo, esses termos podem se referir a um material que é substancial ou essencialmente livre de componentes que normalmente acompanham o mesmo conforme encontrado em seu estado nativo, tal como, por exemplo, um sistema biológico intacto.
[0181] “Litoautotrófico” se refere a um tipo específico de quimioautotrofia em que o organismo utiliza a oxidação de doadores de elétrons químicos inorgânicos por aceitadores de elétrons químicos inorgânicos como uma fonte de energia.
[0182] O termo “knallgas” se refere à mistura de hidrogênio molecular e gás oxigênio. Um “microrganismo de Knallgas” é um micróbio que pode usar hidrogênio como um doador de elétrons e oxigênio como um aceitador de elétron na respiração para a geração de carreadores de energia intracelular, tal como Adenosina-5'-trifosfato (ATP). Os termos “oxi-hidrogênio” e “microrganismo de oxi-hidrogênio” podem ser usados de maneira sinônima com “Knallgas” e “microrganismo de Knallgas”, respectivamente. Os microrganismos de Knallgas usam, de modo geral, hidrogênio molecular por meio de hidrogenases, com alguns dos elétrons doados de H2 que é utilizado para a redução de NAD+ (e/ou outros equivalentes redutores intracelulares) e alguns dos elétrons de H2 que são usados para respiração aeróbica. Os microrganismos de Knallgas fixam geralmente fixam o CO2 de maneira autotrófica, através de vias incluindo, porém sem limitação, o Ciclo Calvin ou o ciclo ácido cítrico reverso [“Thermophilic bacteria”, Jakob Kristjansson, Capítulo 5, Seção III, CRC Press, (1992)].
[0183] “Heterotrófico” se refere a organismos que não podem sintetizar todos os compostos orgânicos necessários pelo organismo para viver e crescer de dióxido de carbono, e que precisam utilizar compostos orgânicos para crescer. Os organismos heterotróficos não podem produzir seu próprio alimento e, em vez disso, obtêm alimento e energia absorvendo-se e metabolizando-se substâncias orgânicas, tal como matéria vegetal ou animal,
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62/229 isto é, em vez de fixar carbono de fontes inorgânicas, tais com dióxido de carbono.
[0184] O “dinucleótido de nicotinamida e adenina” é uma coenzima encontrada em todas as células que estão envolvidos em reações indox, transportando elétrons de uma reação para outra. O dinucleótido de nicotinamida e adenina existem em duas formas: formas oxidadas e reduzidas abreviadas como NAD+ e NADH, respectivamente.
[0185] “Oxidante hidrogênio” se refere a um microrganismo que utiliza H2 reduzido como um doador de elétrons para a produção de equivalentes redutores intracelulares e/ou em respiração.
[0186] “Acetogênio” se refere a um microrganismo que gera acetato e/ou outros ácidos orgânicos de cadeia curta até comprimento de cadeia C4 como um produto de respiração anaeróbica.
[0187] “Metanogênio” se refere a um microrganismo que gera metano como um produto de respiração anaeróbica.
[0188] O “metilótrofo” se refere a um microrganismo que pode usar compostos de um carbono reduzido, tal como, porém sem limitação, metanol ou metano, com uma fonte de carbono e/ou como um doador de elétrons para crescimento do mesmo.
[0189] “Extremófilo” se refere a um microrganismo que funciona em condições física ou geoquimicamente extremas (por exemplo, alta ou baixa temperatura, pH ou alta salinidade) em comparação a condições na superfície da Terra ou no oceano que são tolerado tipicamente ou do oceano que são toleradas tipicamente pela maioria das formas de vida na superfície da vida ou próximo da mesma.
[0190] “Termófilo” se refere a um tipo de extremófilo que funciona em temperatura relativamente altas para a vida, tipicamente a cerca de 45 °C a cerca de 122 °C.
[0191] “Hipertermófilo” se refere a um tipo de extremófilo que funciona em ambientes extremamente quentes para a vida,
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63/229 tipicamente cerca de 60 °C (140 °F) ou superior.
[0192] “Acidófilo” se refere a um tipo de extremófilo que funciona sob condições altamente ácidas (normalmente a pH 2,0 ou abaixo).
[0193] “Halófilo” se refere a um tipo de extremófilo que funciona em ambiente com concentrações muito altas de sal.
[0194] “Psicrófilo” se refere a um tipo de extremófilo com capacidade de crescimento e reprodução em temperaturas frias, tipicamente cerca de 10 °C e inferior.
[0195] “Gás produtor” se refere a uma mistura de gás que contém várias proporções de H2, CO e CO2 e que tem valor de calor em uma faixa tipicamente entre meio e um décimo do gás natural por volume unitário sob condições padrão. O gás produtor pode gerado de várias maneiras a partir de uma variedade de matérias-primas, incluindo gaseificação, reformação por vapor ou autorreforma de matérias-primas à base de carbono. Além disso de H2, CO e CO2, os gases produtores podem conter outros constituintes incluindo porém sem limitação metano, sulfeto de hidrogênio, gases condensáveis, alcatrões e cinzas dependendo do processo de geração e matéria-prima. A proporção de N2 na mistura pode ser alta ou baixa dependendo da possibilidade de ar ser usado como um oxidante no reator ou não e caso o calor para a reação seja fornecido por combustão direta ou através de troca de calor indireta.
[0196] “Flavonoides” (ou bioflavonoides) (da palavra em latim flavus que significa amarelo, sua cor natural) são uma classe metabolites secundários de planta e de fungos. Em termos químicos, os flavonoides têm a estrutura geral de um esqueleto de 15 carbonos, que consiste em dois anéis fenila (A e B) e anel heterocíclico (C). Essa estrutura de carbono pode ser abreviada C6-C3-C6.
[0197] O “fertilizante” é uma substância sintética orgânica ou inorgânica, natural ou sintética que é usada para enriquecer o solo e fornecer plantas com um ou mais nutrientes essenciais para crescimento vegetal comum. Em determinadas modalidades, o termo fertilizante também se
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64/229 refere a nutrientes para fungos e a produção de cogumelos.
[0198] A “fertigação” é a injeção de fertilizantes, emendas do solo e outros produtos solúveis em água em um sistema de irrigação.
[0199] O termo “gaseificação” se refere a um processo de temperatura geralmente alta que converte materiais à base de carbono em uma mistura de gases incluindo hidrogênio, monóxido de carbono e dióxido de carbono denominado de gás de síntese, syngas ou gás produtor. O processo envolve geralmente combustão parcial e/ou a aplicação de calor gerado externamente junto da adição controlada de oxigênio e/ou vapor de modo que oxigênio insuficiente esteja presente para combustão completa do material à base de carbono.
[0200] “Giberelinas” (GAs) são hormônios de planta que regulam o crescimento e influenciam vários processos de desenvolvimento, incluindo alongamento do caule, germinação, dormência, floração, expressão sexual, indução enzimática e senescência de folha e de fruta.
[0201] “Glucosinolatos” são componentes naturais de muitas plantas pungentes, tais como mostarda, repolho e rábano. A pungência dessas plantas é devido a óleos mostrada produzidos a partir de glicosinolatos quando o material vegetal é mastigado, cortado ou, de outro modo, danificado.
[0202] Os termos “microrganismo” e “micróbio” significam formas de vida microscópicas unicelulares.
[0203] O termo “molécula” significa qualquer unidade estrutural distinta ou distinguível da matéria que compreende um ou mais átomos e inclui, por exemplo, hidrocarbonetos, lipídeos, polipeptídeos e polinucleotídeos.
[0204] O termo “oleaginoso(a)” se refere a algo que é rico em óleo ou produz óleo em altas quantidades.
[0205] O “oligopeptídeo” se refere a um peptídeo que contém um número relativamente pequeno de resíduos aminoácidos, por
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65/229 exemplo, cerca de 2 a cerca de 20 aminoácidos.
[0206] O termo “composto orgânico” se refere a qualquer composto químico líquido, sólido ou gasoso que contém átomos de carbono, com as seguintes exceções que são consideradas inorgânicas: carbetos, carbonates, óxidos simples de carbono, cianetos e alótropos de carbono puro, tais como diamante e grafite.
[0207] “Papaína”, também conhecida como proteinase I do mamão é uma enzima cisteíno-protease (EC 3.4.22.2) presente no mamão (Carica papaya) e no mamão da montanha (Vasconcellea cundinamarcensis).
[0208] A “pepsina” é uma enzima que quebra proteínas em peptídeos menores (isto é, uma protease). Esta é produzida no estômago e é uma dentre as principais enzimas digestivas nos sistemas digestivos de seres humanos e muitos outros animais, onde ajuda a digerir as proteínas no alimento.
[0209] “Peptídeo” é um composto que consiste em dois ou mais aminoácidos ligados em uma cadeia, o grupo carboxila de cada ácido que é unido ao grupo amino doo próximo dia por uma ligação do tipo ROC-NH-R’, por exemplo, cerca de 2 a cerca de 50 aminoácidos.
[0210] O termo “precursor a” ou “precursor de” é um intermediário em direção à produção de um ou mais dentre os componentes de um produto acabado.
[0211] O termo “que produz” inclui tanto a produção de compostos de maneira intracelular quanto extracelular, incluindo a secreção de compostos da célula.
[0212] “Filoesfera” é um termo usado em microbiologia para se referir às porções acima do solo das plantas como um habitat para microrganismos.
[0213] “Fitotoxicidade” é um efeito tóxico de um composto no crescimento da planta. Tais danos podem ser causados por uma
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66/229 ampla variedade de compostos, incluindo metais-traço, salinidade, pesticidas, fitotoxinas ou aleloquímicos.
[0214] Conforme usado no presente documento, “polipeptídeo” se refere a uma composição compreendida de aminoácidos e reconhecida como uma proteína pelas pessoas versadas na técnica. O código convencional de uma letra ou de três letras para resíduos de aminoácido é usado no presente documento. Os termos “polipeptídeo” e “proteína” são usados de maneira intercambiável no presente documento para se referir aos polímeros de aminoácidos de qualquer comprimento. O polímero pode ser linear ou ramificado, pode compreender aminoácidos modificados e podem ser interrompidos por não aminoácidos. Os termos também abrangem um aminoácido polímero que foi modificado naturalmente ou por intervenção; por exemplo, formação de ligação de dissulfeto, glicosilação, lipadação, acetilação, fosforilação ou qualquer outra manipulação ou modificação, tal como conjugação com um componente de identificação. Além disso, são abrangidos pela definição, por exemplo, os polipeptídeos que contêm um ou mais análogos de um aminoácido (incluindo, por exemplo, aminoácidos não naturais etc.), assim como outras modificações conhecidas na técnica.
[0215] A “rizosfera” é a região estreita do solo que é influenciada diretamente por secreções da raiz e associadas a microrganismos do solo.
[0216] “Oxidante de enxofre” se refere a microrganismos que utilizam compostos que contêm enxofre reduzido incluindo, porém sem limitação, H2S como doadores de elétrons para a produção de equivalentes redutores intracelulares e/ou em respiração.
[0217] “Syngas” ou “gás de síntese” se refere a um tipo de mistura de gás que, como gás produtor, contém H2 e CO, porém que foi adaptado mais especificamente em termos de teor de H2 e CO e razão e níveis de impurezas para a síntese de um tipo particular de produto químico, tal como porém sem limitação metanol ou diesel fischer-tropsch. O syngas contém
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67/229 geralmente H2, CO, e CO2 como componentes principal e pode ser gerado através de métodos estabelecidos incluindo: reformação por vapor de metano, gás de petróleo líquido ou biogás; ou através de gaseificação de qualquer material orgânico inflamável à base de carbono, incluindo porém sem limitação biomassa, matéria orgânica residual, vários polímeros, turfa e carvão. O componente de hidrogênio de syngas pode ser aumentado através da reação de CO com vapor na reação de comutação entre água e gás, com um aumento concomitante em CO2 na mistura de syngas.
[0218] “Tripsina” (EC 3.4.21.4) é uma serina protease da superfamília do clã PA, encontrada no sistema digestivo de muito vertebrados onde hidrosila as proteínas. A tripsina é formada no intestino delgado quando sua forma de pró-enzima, o tripsinogênio produzido pelo pâncreas, é ativada. A tripsina oliva as cadeias de peptídeo principalmente no lado carboxila dos aminoácidos lisina ou arginina, exceto quando nenhum é seguido por prolina. Está é usada para inúmeros processos biotecnológicos. O processo é denominados normalmente de proteólise de tripsina ou tripsinização, e as proteínas que foram digeridas/tratadas com tripsina foram tripsinizadas. Determinadas modalidades no presente documento utilize tripsinização de proteínas produzidas conforme descrito no presente documento.
[0219] Conforme usado no presente documento, o termo “polinucleotídeo” se refere a uma forma polimérica de nucleotídeos com qualquer comprimento e qualquer estrutura tridimensional e de única ou dupla fita (por exemplo, de única fita, de dupla fita, tripla-helicoidal etc.), que contém desoxirnbonucleotídeos, ribonucleotídeos e/ou formas análogas ou modificadas de desoxirnbonucleotídeos ou ribonucleotídeos, incluindo nucleotídeos ou bases modificados ou análogos do mesmo. Devido ao fato de que o código genético é degenerado, mais de um códon pode ser usado para codificar um aminoácido particular, e a presente invenção abrange polinucleotídeos que codificam uma sequência de aminoácidos particulares. Qualquer tipo de nucleotídeo modificado ou análogo de nucleotídeo pode ser usado, desde que o polinucleotídeo retenha
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68/229 a funcionalidade desejada sob condições de uso, incluindo modificações que aumentam a resistência da nuclease (por exemplo, desóxi, 2'-0-Me, fosforotioatos etc.). As identificações também podem ser incorporadas a título de detecção ou captura, por exemplo, identificações ou âncoras radioativas ou não radioativas, por exemplo, biotina. O termo polinucleotídeo também inclui ácidos nucleicos de peptídeo (PNA). Os polinucleotídeos podem ser de ocorrências natural ou de ocorrência não natural. Os termos “polinucleotídeo”, “ácido nucleico” e “oligonucleotídeo” são usados presente documento de maneira intercambiável. Os polinucleotídeos podem conter RNA, DNA, ou os dois, e/ou formas modificadas e/ou análogos dos mesmos. Uma sequência de nucleotídeos pode ser interrompida por componentes não nucleotídeos. Uma ou mais ligações de fosfodiéster podem ser substituídas por grupos de ligação alternativos. Esses grupos de ligação alternativos incluem, porém sem limitação, modalidades em que o fosfato é substituído por P(O)S (“tioato”), P(S)S (“ditioato”), (O)NR.sub.2 (“amidato”), P(O)R, P(O)OR', CO ou CH.sub.2 (“formacetal”), em que cada R ou R' é independentemente H ou alquila substituída ou não substituída (1-20 C) contendo opcionalmente uma ligação de éter (--O--), arila, alquenila, cicloalquila, cicloalquenila ou araldila. Nem todas as ligações em um polinucleotídeo precisam ser idênticas. Os polinucleotídeos podem ser lineares ou circulares ou compreendem uma combinação de porções lineares ou circulares.
[0220] Conforme usado no presente documento, o termo “célula hospedeira” se refere a uma célula ou linhagem celular na qual um vetor de expressão para produção de um polipeptídeo pode ser transferida para expressão do polipeptídeo. As células hospedeiras incluem progênie de uma única célula hospedeira, e a progênie pode não ser necessariamente idêntica (em morfologia ou em complemento de DNA genômico total) à célula parental original devido a mutação natural, acidental ou deliberada. Uma célula hospedeira inclui células submetidas à transfecção ou transformação in vivo com um vetor de expressão.
[0221] O termo “recombinante” se refere a um
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69/229 material genético (isto é, ácidos nucleicos, os polipeptídeos que codificam e vetores e células que compreendem tais polinucleotídeos) que foram modificados a fim de alterar as características de sequência ou de expressão, tal como submetendo-se à mutação as sequências de codificação para produzir um polipeptídeo alterado, fundir a sequência de codificação à de outro gene, colocar um gene sob o controle de um promotor diferente, expressar um gene em um organismo heterólogo, expressar um gene a níveis diminuídos ou elevados, expressar um gene de maneira condicional constitutivamente diferente de seu perfil de expressão natural e semelhantes. De modo geral, os ácidos nucleicos recombinantes, polipeptídeos e células com base nos mesmos foram manipulados pelo homem de modo que não sejam idênticos a ácidos nucleicos, polipeptídeos e células relacionados encontrados na natureza. Uma célula recombinante também pode ser denominada de “modificada”.
[0222] Conforme usado no presente documento, um “vetor” se refere a uma sequência de polinucleotídeos projetada para introduzir ácidos nucleicos em um ou mais tipos de célula. Os vetores incluem vetores de clonagem, vetores de expressão, vetores bifuncionais, plasmídeos, partículas de fago, cassetes e semelhantes.
[0223] Conforme usado no presente documento, o termo “expressão” se refere ao processo pelo qual um polipeptídeo é produzido com base na sequência de ácido nucleico de um gene. O processo inclui tanto transcrição quanto tradução.
[0224] Conforme usado no presente documento, “vetor de expressão” se refere a um construto de DNA que contém uma sequência de codificação de DNA (por exemplo, sequências de genes) que é ligada de maneira operacional a uma ou mais sequências de controle adequadas com capacidade para efetuar expressão da sequência de codificação em um hospedeiro. Tais sequências de controle incluem um promotor para efetuar a transcrição, uma sequência de operadores opcionais para controlar tal transcrição, uma sequência codifica sítios de ligação de ribossoma de mRNA
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70/229 adequados e sequências que controlam o término da transcrição e da tradução. O vetor pode ser um plasmídeo, uma partícula de fago ou simplesmente um inserto genômico potencial. Uma vez transformado em um hospedeiro adequado, o vetor pode replicar e funcionar independentemente do genoma independente ou pode, em alguns exemplos, se integrar no próprio genoma. O plasmídeo é a forma mais usada normalmente do vetor de expressão. No entanto, a invenção está destinada a incluir outras tais formas de vetores de expressão que servem funcionam como funções equivalentes e que são ou ficam conhecidas na técnica.
[0225] Um “promotor” se refere a uma sequência reguladora que está envolvida na polimerase de RNA de ligação para iniciar a transcrição de um gene. Um promotor pode ser um promotor induzível ou um promotor constitutivo. Um “promotor induzível” é um promotor que está ativo sob condições reguladoras ambientais ou de desenvolvimento.
[0226] O termo “ligado de maneira operacional” se refere a uma justa posição ou disposição dos elementos especificados que permitem que funcionem em conjunto para causar um efeito Por exemplo, um promotor é ligado de maneira operacional a uma sequência de codificação caso controle a transcrição da sequência de codificação.
[0227] “Sob controle transcricional” é um termo bem entendido na técnica que indica que a transcrição de uma sequência de polinucleotídeos depende de estar ligado de maneira operacional a um elemento que contribui para a iniciação ou da transcrição ou promove a mesma.
[0228] O termo “heterólogo” ou “exógeno”, com referência a um polinucleotídeo ou proteína, se refere a um polinucleotídeo ou proteína que não ocorre naturalmente em uma célula especificada, por exemplo, uma célula hospedeira. Entende-se que o termo abrange proteínas que são codificadas por genes de ocorrência natural, genes mutantes e/ou genes sintéticos. Em contrapartida, o termo “homólogo”, com referência a um polinucleotídeo ou proteína, se refere a um polinucleotídeo ou proteína que
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71/229 ocorre naturalmente na célula.
[0229] Salvo quando definido de outro modo no presente documento, os termos científicos e técnicos usados em combinação coma presente devem ter os significados que são entendidos comumente pelas pessoas de habilidade comum na técnica. Além disso, salvo quando exigido de outro modo pelo contexto, os termos singulares devem incluir pluralidades e termos plurais devem incluir o singular. Os métodos e técnicas da presente divulgação são realizados geralmente de acordo com métodos convencionais bem conhecidos na técnica. De modo geral, nomenclaturas usadas em combinação e técnicas de bioquímica, enzimologia, biologia molecular e celular, microbiologia, genética e proteína e química e hibridização de ácido nucléico descrito no presente documento são aquelas bem conhecidas e comumente usadas na técnica. Os métodos e técnicas da presente divulgação são realizados geralmente realizados de acordo com os métodos convencionais bem conhecidos na técnica e, conforme descrito em várias referências gerais e mais específicas que são citados e discutidos por todo o presente relatório descritivo salvo quando indicado de outro modo.
PRODUÇÃO DE AMINOÁCIDOS, PROTEÍNAS E OUTROS NUTRIENTES BIOLÓGICOS DE SUBSTRATOS GASOSOS DE ENERGIA E CARBONO [0230] Em algumas modalidades, são fornecidos microrganismos naturais ou modificados que têm capacidade para converter gás produtor ou uma mistura de gás que contém H2 e/ou CO e/ou CO2 e/ou CPU, por exemplo, H2 e CO2, e/ou CO, e/ou CPU, em aminoácidos, proteínas e outros nutrientes biológicos. Em algumas modalidades, são fornecidos microrganismos naturais ou modificados que têm capacidade para converter gás produtor ou uma mistura de gás que contém PI2 e/ou CO e/ou CO2 e/ou CPU, por exemplo, PI2 e CO2, e/ou CO, e/ou CPU, em aminoácidos, proteínas, vitaminas e/ou outros nutrientes biológicos. Em determinadas modalidades uma ou mais B vitamina são produzidas, incluindo porém sem limitação uma ou mais dentre as seguintes:
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72/229 vitamina B1, B2 e/ou B12.
[0231] Em algumas modalidades, é fornecido um microrganismo natural que tem capacidade para cultivar syngas e/ou hhe CO2, e/ou CO e/ou Chh e/ou outros gases residuais e que têm capacidade para produzir aminoácidos, proteínas, vitaminas, incluindo porém sem limitação vitaminas B e/ou outros nutrientes biológicos com o uso dos ditos gases como um substrato cultivado.
[0232] Em algumas modalidades, é fornecido um método para produzir aminoácidos, proteínas e outros nutrientes biológicos incluindo, porém sem limitação vitaminas, tais como porém sem limitação, vitaminas B, combinando-se, em um biorreator ou solução, um gás que contém carbono e um microrganismo de cepa natural ou modificada que converte um gás que contém carbono, tal como syngas, gás produtor, CO2, monóxido de carbono e misturas dos mesmos que contêm gás hidrogênio; H2 e CO2 e/ou CO e/ou CH4; e/ou compostos C1, gasosos ou líquidos, incluindo porém sem limitação metanol ou metano, em aminoácidos, proteínas, e/ou outros nutrientes biológicos incluindo porém sem limitação, vitaminas, tais como porém sem limitação, vitaminas B.
[0233] O gás produtor usado no processo pode partir de fontes que incluem gaseificação de matéria-prima residual e/ou matéria-prima residual de biomassa ou gás residual de processos industriais ou remoção de gases que contêm metano incluindo, porém sem limitação, gás natural, biogás, gás de aterro sanitário, gás natural ocioso e/ou gás queimado natural.
[0234] Em algumas modalidades, metano pode ser convertido em aminoácidos, proteínas e/ou outros nutrientes biológicos incluindo, porém sem limitação, vitaminas, com o uso de microrganismos e métodos modificados e naturais descritos no presente documento.
MICRORGANISMOS [0235] Em algumas modalidades, os microrganismos utilizados nos métodos descritos no presente documento são quimioautotróficos.
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Os quimioautotróficos têm capacidade para realizar reações quimiossintéticas que fixam o CO2, e/ou outras formas de carbono inorgânico, a compostos orgânicos, com o uso de energia potencial armazenada em produtos químicos inorgânicos para acionar a reação, em vez de energia radiante de luz conforme em microrganismos que realizam fotossíntese [J. M. Shively, G. van Keulen, e W. G. Meijer, “Something from almost nothing: carbon dioxide fixation in chemoautotrophs” (1998) Annual review of microbiology 52:191 a 230 (http://dx.doi.Org/10.1146/annurev.micro.52.1.191); A. J. Smith, J. London, e R. Y. Stanier” (1967) “Biochemical basis of obligate autotrophy in Blue-Green algae and thiobacilli” Journal of Bacteriology 94(4):972 a 983 (http://jb.asm.Org/content/94/4/972.abstract); M. Hügler, C. 0. Wirsen, G. Fuchs, C. D. Taylor, e S. M. Sievert (2005) “Evidence for autotrophic CO2 fixation via the reductive tricarboxylic acid cycle by members of the ε subdivision of proteobacteria” Journal of Bacteriology 187(9):3.020 a 3.027 (http://dx.doi.Org/10.1128/jb.187.9.3020-3027.2005); K. M. Scott e C. M. Cavanaugh (2007) “CO2 uptake and fixation by endosymbiotic chemoautotrophs from the bivalve solemya velum” Applied and Environmental Microbiology 73(4):1.174 a 1.179 (http://dx.doi.org/10.1128/aem.01817-06)]. As vias bioquímicas de fixação de carbono que ocorrem nos quimioautótrofos incluem ο ciclo de ácido tricarboxílico redutivo e o ciclo de Calvin-Benson-Bassham [J. M. Shively, G., etal. (1998), supra], e a via Wood-Ljungdahl [L. G. Ljungdahl (1986) “The autotrophic pathway of acetate synthesis in acetogenic bacteria” Annual Review of Microbiology 40(1):415 a 450 (http://dx.d0i.0rg/l 0.1146/annurev.mi.40.100186.002215)].
[0236] As composições que compreendem qualquer um dentre os microrganismos descritos no presente documento (por exemplo, um ou mais microrganismos descritos no presente documento) também são fornecidos.
[0237] Em algumas modalidades, o microrganismo é selecionado a partir do gênero Hydrogenobacter. Em algumas modalidades, o
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74/229 microrganismo é Hydrogenobacter termophilus. Em algumas modalidades, ο microrganismo contém o ciclo de ácido tricarboxílico reverso (rTCA), também conhecido como o ciclo ácido cítrico reverso ou o ciclo de Krebs reverso. [Miura, A., Kameya, M., Arai, H., Ishii, M. & Igarashi, Y. (2008) “A soluble NADHdependent fumarate reductase in the reductive tricarboxylic acid cycle of Hydrogenobacter thermophilus TK-6” J Bacteriol 190, 7.170 a 7.177, doi:JB.00747-08 [pii] 10.1128/JB.00747-08; Shively, J. M., van Keulen, G. & Meijer, W. G. (1998) “Something from almost nothing: carbon dioxide fixation in chemoautotrophs” Annu Rev Microbiol 52:191 a 230, doi:10.1146/annurev.micro.52.1.191; incorporados no presente documento a título de referência em sua totalidade.].
[0238] Em algumas modalidades, o microrganismo é Rhodococcus opacus ou Rhodococcus jostii ou Rhodococcus sp. Em algumas modalidades não limitativas, o microrganismo é Rhodococcus opacus DSM 43205, DSM 43206, DSM 44193 e/ou Rhodococcus sp. DSM 3346.
[0239] Em algumas modalidades, a cepa natural ou modificada inclui, porém sem limitação, hidrogênio que utiliza micróbios incluindo, porém sem limitação, os gêneros Rhodococcus, Gordonia, Ralstonia ou Cupriavidus. Em algumas modalidades, a composição compreende um microrganismo que pode ser cultivado naturalmente em H2/CO2 e/ou syngas e em que o microrganismo pode acumular naturalmente lipídeo a 50% ou mais da biomassa celular em peso. Em algumas modalidades, os microrganismos têm uma capacidade nativa de enviar um alto fluxo de carbono até a trajetória de biossíntese de ácido graxo. Em algumas modalidades, o microrganismo que exibem essa característica é Rhodococcus opacus (DSM 43205 ou DSM 43206 ou DSM 44193).
[0240] Em algumas modalidades, o microrganismo é da classe Actinobacteria que não compreende genes exógenos ou um ou mais genes exógenos. Em algumas modalidades, o microrganismo é da classe Actinobacteria ou da família Nocardiaceae. Em algumas modalidades, o
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75/229 microrganismo é um microrganismo Corynebacterium, Gordonia, Rhodococcus, Mycobacterium ou Tsukamurella que não compreende genes exógenos genes ou um ou mais genes exógenos. Em algumas modalidades, o microrganismo da família Nocardiaceae que não compreende genes exógenos ou um ou mais genes exógenos, em que o microrganismo não é do gênero Mycobacterium. Em algumas modalidades, o microrganismo é do gênero Rhodococcus que não compreende genes exógenos ou um ou mais genes exógenos e em algumas modalidades, o microrganismo é uma cepa das espécies Rhodococcus sp., Rhodococcus opacus, Rhodococcus aetherivorans, Rhodococcus aurantiacus., Rhodococcus baikonurensis', Rhodococcus boritolerans', Rhodococcus equi; Rhodococcus coprophilus; Rhodococcus corynebacterioides; Nocardia corynebacterioides (synonym: Nocardia corynebacterioides)', Rhodococcus erythropolis; Rhodococcus fascians; Rhodococcus globerulus; Rhodococcus gordoniae; Rhodococcus jostii; Rhodococcus koreensis; Rhodococcus kroppenstedtii; Rhodococcus maanshanensis; Rhodococcus marinonascens; Rhodococcus opacus; Rhodococcus percolatus; Rhodococcus phenolicus; Rhodococcus polivorum; Rhodococcus pyridinivorans; Rhodococcus rhodochrous; Rhodococcus rhodnii; (synonym: Nocardia rhodnii); Rhodococcus ruber (synonym: Streptothrix rubra)', Rhodococcus sp. RHA1; Rhodococcus triatomae; Rhodococcus tukisamuensis; Rhodococcus wratislaviensis (synonym: Tsukamurella wratislaviensis)', Rhodococcus yunnanensis; Rhodococcus zopfii. Em algumas modalidades, é fornecido um microrganismo Rhodococcus que é não infecioso ou não patogênico a animais e/ou plantas e/ou seres humanos. Em algumas modalidades, o microrganismo é Rhodococcus equi ou Rhodococcus fascians que é não infecioso a animais e/ou plantas. Em algumas modalidades, o microrganismo é uma cepa Rhodococcus opacus DSM número 43205 ou 43206; ou Rhodococcus sp. DSM número 3346. Em algumas modalidades, o microrganismo é Rhodococcus que não é uma espécie selecionada a partir de Rhodococcus equi e/ou Rhodococcus fascians.
[0241] Em algumas modalidades, o microrganismo é
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76/229 da subordem corynebacterineae ou da família burkholderiaceae. Em algumas modalidades, o microrganismo não é E. coli.
[0242] Em algumas modalidades, um microrganismo, conforme descrito no presente documento, não é patogênico a animais e/ou plantas e/ou seres humanos.
[0243] Em algumas modalidades, um microrganismo, conforme descrito no presente documento, pode acumular proteína em até mais de 60% da massa celular total. Em algumas modalidades, o microrganismo pode acumular a proteína em até 70% da massa celular total. Em algumas modalidades, o microrganismo pode acumular a proteína em até 80% da massa celular total. Em algumas modalidades não limitativas, o microrganismo é Cupriavidus necator DSM número 531 ou 541.
[0244] Em algumas modalidades, um microrganismo, conforme descrito no presente documento, pode crescer naturalmente sob H2/CO2 e/ou syngas, e o microrganismo pode acumular naturalmente polihidroxibutirato (PHB) ou poli-hidroxialcanoato (PHA) em 50% ou mais da biomassa celular em peso. Em algumas modalidades, o microrganismo tem uma capacidade nativa para direcionar um alto fluxo de carbono através do intermediário metabólico acetil-CoA, que pode causar biossíntese de ácido graxo, junto de várias outras vias sintéticas incluindo síntese de PHA e PHB, assim como aminoácidos. Em algumas modalidades, o microrganismo que exibe esses traços é Cupriavidus necator (DSM 531 ou DSM 541).
[0245] Em algumas modalidades não limitantes, o microrganismo natural ou a cepa modificada é Corynebacterium autotrophicum. Em algumas modalidades não limitativas, o microrganismo natural ou modificado é Corynebacterium autotrophicum e/ou Corynebacterium glutamicum. Em algumas modalidades, o microrganismo é Hydrogenovibrio marinus. Em algumas modalidades, o microrganismo é Rhodopseudomonas capsulata, Rhodopseudomonas palustris ou Rhodobacter sphaeroides.
[0246] Em algumas modalidades, o microrganismo é
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77/229 um oxi-hidrogênio ou cepa de knallgas. Em algumas modalidades, os microrganismos ou uma composição que compreende microrganismos, compreende um ou mais dentre os seguintes microrganismos de knallgas: Aquifex pyrophilus, Aquifex aeolicus, ou outro Aquifex sp.; Cupriavidus necator ou Cupriavidus metallidurans ou outro Cupriavidus sp.; Corynebacterium autotrophicum ou outro Corynebacterium sp.; Gordonia desulfurícans, Gordonia polyisoprenivorans, Gordonia rubripertincta, Gordonia hydrophobica, Gordonia westfalica, ou outro Gordonia sp.; Nocardia autotrophica, Nocardia opaca, ou outro Nocardia sp.; bactérias roxas fotossintéticas de não enxofre, incluído, porém sem limitação, Rhodobacter sphaeroides, Rhodopseudomonas palustris, Rhodopseudomonas capsulata, Rhodopseudomonas viridis, Rhodopseudomonas sulfoviridis, Rhodopseudomonas blastica, Rhodopseudomonas spheroides, Rhodopseudomonas acidophila, ou outro Rhodopseudomonas sp.; Rhodobacter sp., Rhodospiríllum rubrum, ou outro Rhodospirillum sp.; Rhodococcus opacus ou outro Rhodococcus sp.; Rhizobium japonicum ou outro Rhizobium sp.; Thiocapsa roseopersicina ou outro Thiocapsa sp.; Pseudomonas facilis, Pseudomonas fiava, Pseudomonas putida, Pseudomonas hydrogenovora, Pseudomonas hydrogenothermophila, Pseudomonas palleronii, Pseudomonas pseudoflava, Pseudomonas saccharophila, Pseudomonas thermophile, ou outro Pseudomonas sp.; Hydrogenomonas pantotropha, Hydrogenomonas eutropha, Hydrogenomonas facilis, ou outro Hydrogenomonas sp.; Hydrogenobacter thermophiles, Hydrogenobacter halophilus, Hydrogenobacter hydrogenophilus, ou outro Hydrogenobacter sp.; Hydrogenophilus islandicus ou outro Hydrogenophilus sp.; Hydrogenovibrio marinus ou outro Hydrogenovibrio sp.; Hydrogenothermus marinus ou outro Hydrogenothermus sp.; Helicobacter pylori ou outro Helicobacter sp.; Xanthobacter autotrophicus, Xanthobacter flavus, ou outro Xanthobacter sp.; Hydrogenophaga fiava, Hydrogenophaga palleronii, Hydrogenophaga pseudoflava, ou outro Hydrogenophaga sp.; Bradyrhizobium japonicum ou outro Bradyrhizobium sp.; Ralstonia eutropha ou outro Ralstonia
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78/229 sp.; Alcaligenes eutrophus, Alcaligenes facilis, Alcaligenes hydrogenophilus, Alcaligenes latus, Alcaligenes paradoxus, Alcaligenes ruhlandii, ou outro Alcaligenes sp.; Amycolata sp.; Aquaspirillum autotrophicum ou outro Aquaspirillum sp.; cepa Arthrobacter'WX, Arthrobacter methylotrophus, ou outro Arthrobacter sp.; Azospirillum lipoferum ou outro Azospirillum sp.; Variovorax paradoxus ou outro Variovorax sp.; Acidovorax facilis, ou outro Acidovorax sp.; Bacillus schlegelii, Bacillus tusciae, outro Bacillus sp.; Calderobacterium hydrogenophilum ou outro Calderobacterium sp.; Derxia gummosa ou outro Derxia sp.; Flavobacterium autothermophilum ou outro Flavobacterium sp.; Microcyclus aquaticus ou outro Microcyclus sp.; Mycobacterium gordoniae ou outro Mycobacterium sp.; Paracoccus denitrificans ou outro Paracoccus sp.; Persephonella marina, Persephonella guaymasensis, ou outro Persephonella sp.; Renobacter vacuolatum ou outro Renobacter sp.; Seliberia carboxydohydrogena ou outro Seliberia sp., Streptomycetes coelicoflavus, Streptomycetes griseus, Streptomycetes xanthochromogenes, Streptomycetes thermocarboxydus, e outro Streptomycetes sp.; Thermocrinis ruber ou outro Thermocrinis sp.; Wautersia sp.; cianobactérias incluindo, porém sem limitação, Anabaena oscillarioides, Anabaena spiroides, Anabaena cylindrica, ou outro Anabaena sp., e Arthrospira platensis, Arthrospira maxima, ou outro Arthrospira sp.; algas verdes, incluindo, porém sem limitação, Scenedesmus obliquus ou outro Scenedesmus sp., Chlamydomonas reinhardii ou outro Chlamydomonas sp., Ankistrodesmus sp., e Rhaphidium polymorphium ou outro Rhaphidium sp; assim como vários microrganismos que incluem microrganismos de oxigênio.
[0247] Em algumas modalidades não limitativas que compreendem as composições e métodos para usar metabolismo quimioautotrófico são fornecidos para produzir ATP para o suporte de ATP que consome reações biossintética e manutenção celular, sem a coprodução de metano ou ácidos orgânicos de cadeia curta, tais como ácido butírico por meio de reações de conservação de energia para a produção de ATP, que usam doadores de elétrons e aceitadores de elétrons inorgânicos, incluindo porém sem
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79/229 limitação a reação de oxi-hidrogênio.
[0248] Foram caracterizados vários microrganismos diferentes que podem crescer em sob monóxido de carbono como um doador de elétrons e/ou fonte de carbono (isto é, microrganismos carboxidotróficos). Em alguns casos, os microrganismos carboxidotróficos também podem usar H2 como um doador de elétrons e/ou crescem de maneira mixotrófica. Em alguns casos, os microrganismos carboxidotróficos são quimiolitoautotróficos facultativos [Biology of the Prokaryotes, editado por J Lengeler, G. Drews, Η. Schlegel, John Wiley & Sons, 10 de julho 2009, é incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade.]. Em algumas modalidades, os microrganismos ou composições que compreendem microrganismos compreendem um ou mais dentre os seguintes microrganismos carboxidotróficos: Acinetobacter sp.; Alcaligenes carboxidus ou outro Alcaligenes sp.; Arthrobacter sp.; Azomonas sp.; Azotobacter sp.; Bacillus schlegelii ou outro Bacillus sp.; Hydrogenophaga pseudoflava ou outro Hydrogenophaga sp.; Pseudomonas carboxydohydrogena, Pseudomonas carboxidovorans, Pseudomonas compransoris, Pseudomonas gazotropha, Pseudomonas termocarboxidovorans ou outro Pseudomonas sp.; Rhizobium japonicum ou outro Rhizobium sp.; e Streptomyces G26, Streptomyces thermoautrophicus ou outros Streptomyces sp. Em determinadas modalidades, um microrganismo carboxidotrófico é usado. Em determinadas modalidades, um microrganismo carboxidotrófico que tem capacidade para quimiolitoautotrofia é usado. Em determinadas modalidades, um microrganismo carboxidotrófico que pode utilizar H2 como um doador de elétrons em respiração e/ou biossíntese é usado.
[0249] Em algumas modalidades, são fornecidos microrganismos que podem crescer sob syngas como o único doador de elétrons, fonte de hidrogênio átomos e fonte de carbono.
[0250] Em algumas modalidades, os microrganismos ou composições que compreendem os microrganismos compreendem
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80/229 microrganismos necessários obrigatórios e/ou facultativos quimioautototróficos incluindo um ou mais dentre o seguinte: Acetoanaerobium sp.; Acetobacterium sp.; Acetogenium sp.; Achromobacter sp.; Acidianus sp.; Acinetobacter sp.; Actinomadura sp.; Aeromonas sp.; Alcaligenes sp.; Alcaliqenes sp.; Aquaspirillum sp.; Arcobacter sp.; Aureobacterium sp.; Bacillus sp.; Beggiatoa sp.; Butyribacterium sp. ; Carboxidotermus sp.; Clostridium sp.; Comamonas sp.; Dehalobacter sp.; Dehalococcoide sp.; Dehalospirillum sp.; Desulfobacterium sp.; Desulfomonile sp.; Desulfotomaculum sp.; Desulfovibrio sp.;
Deenxofreosarcina sp.; Ectothiorhodospira sp.; Enterobacter sp.; Eubacterium sp.; Ferroplasma sp.; Halothibacillus sp.; Hydrogenobacter sp.;
Hydrogenomonas sp.; Leptospirillum sp. ; Metallosphaera sp. ; Metanobacterium sp.; Metanobrevibacter sp.; Metanococcus sp.; Metanococcoides sp.; Metanogenium sp.; Metanolobus sp.; Metanomicrobium sp.; Metanoplanus sp.; Metanosarcina sp.; Metanospiríllum sp.; Metanotermus sp.; Metanothrix sp.; Micrococcus sp.; Nitrobacter sp.; Nitrobacteraceae sp., Nitrococcus sp., Nitrosococcus sp.; Nitrospina sp., Nitrospira sp., Nitrosolobus sp.; Nitrosomonas sp.; Nitrosospira sp.; Nitrosovibrio sp.; Nitrospina sp.; Oleomonas sp.; Paracoccus sp.; Peptostreptococcus sp.; Planctomycetes sp.; Pseudomonas sp.; Ralston ia sp.; Rhodobacter sp.; Rhodococcus sp.; Rhodocyclus sp.; Rhodomicrobium sp.; Rhodopseudomonas sp.; Rhodospirillum sp.; Shewanella sp.; Siderococcus sp.; Streptomyces sp.; Sulfobacillus sp.; Sulfolobus sp.; termothrix sp., Thiobacillus sp.; Thiomicrospira sp.; Thioploca sp.; Thiosphaera sp.; Thiothrix sp.; Thiovulum sp.; oxidantes de enxofre; oxidantes de hidrogênio; oxidantes de ferro; acetogênio; e metanogênios; conjuntos de microrganismos que incluem quimioautotróficos; quimioautotróficos nativos a pelo menos um dentre os respiradouros de respiradouros hidrotérmicos, respiradouros geotérmicos, fontes térmicas, emanações frias, aquíferos subterrâneos, lagos salgados, formações salinas, minas, drenagem ácida da mina, rejeitos, poços de petróleo, águas residuais de refinaria, reservas de carvão, subsuperfície profunda; água residual e usinas de tratamento de esgoto; usinas de força
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81/229 geotérmica, campos de sulfatara e solos; e extremófilos selecionados a partir de um ou mais dentre termófilos, hipertermófilos, acidófilos, halófilos e psicrófilos.
[0251] Em algumas modalidades, são fornecidos microrganismos que são extremófilos que podem resistir a condições extremas em vários parâmetros ambientais, tais como temperatura, radiação, pressão, gravidade, vácuo, dessecação salinidade, pH, tensão de oxigênio e produtos químicos. Estes incluem hipertermófilos, tais como as Pyrolobus fumarii; termófilos, tais como Synechococcus lividis; mesófilos e psicrófilos, tais como Psychrobacter, e/ou metabolizadores de enxofre extremamente termofílicos, tais como termoproteus sp., Pyrodictium sp., Sulfolobus sp., e Acidianus sp.; organismos tolerantes à radiação, tais como Deinococcus radiodurans; organismos tolerantes à pressão incluindo piezófilos ou barófilos; organismos tolerantes a dessecamento e anidrobióricos incluindo xerófilos, tais como Artemia salina', micróbios e fungos; organismos tolerantes a sal incluindo halófilos, tais como Halobacteriacea e Dunaliella salina', organismos tolerantes a pH incluindo alcalófilos, tais como Natronobacterium, Bacillus firmus OF4, Spirulina spp., e acidófilos tais como Cyanidium caldarium e Ferroplasma sp; organismos tolerantes a gás, que toleram CO2 puro incluindo Cyanidium caldarium; e organismos tolerante a metal incluindo metalotolerantes, tais como Ferroplasma acidarmanus e Ralstonia sp..
[0252] Em determinadas modalidades, os microrganismos fornecidos no presente documento compreendem uma linhagem celular selecionadas a partir de plantas eucarióticas, algas, cianobactérias, bactérias veres de enxofre, bactérias verdes de não enxofre, bactérias roxas de enxofre, bactérias roxas de não enxofre, extremófilos, levedura, fungos, proteobacteria, organismos modificados dos mesmos e organismos sintéticos. Em determinadas modalidades, Spirulina é utilizada.
[0253] Em determinadas modalidades, são utilizadas bactérias verdes de não enxofre que incluem, porém sem limitação, os seguintes gêneros: Chloroflexus, Chloronema, Oscillochlorís, Heliothrix, Herpetosiphon,
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Roseiflexus e Thermomicrobium.
[0254] Em determinadas modalidades, são usadas bactérias verdes de enxofre que incluem, porém sem limitação, os seguintes gêneros: Chlorobium, Clathrochloris e Prosthecochlorís.
[0255] Em determinadas modalidades, são usadas bactérias roxas de enxofre são usadas que incluem, porém sem limitação, os seguintes gêneros: Allochromatium, Chromatium, Halochromatium, Isochromatium, Marichromatium, Rhodovulum, termochromatium, Thiocapsa, Thiorhodococcus e Thiocystis.
[0256] Em determinadas modalidades, são usadas bactérias roxas de não enxofre que incluem, porém sem limitação, os seguintes gêneros: Phaeospirillum, Rhodobaca, Rhodobacter, Rhodomicrobium, Rhodopila, Rhodopseudomonas, Rhodothalassium, Rhodospiríllum, Rodovibrio e Roseospira.
[0257] Em algumas modalidades, o microrganismo é um metanotrófo e/ou a metilotrófo Em algumas modalidades, o microrganismo está no gênero Metilococcus. Em algumas modalidades, o microrganismo é Metilococcus capsulatus. Em algumas modalidades, o microrganismo é um metilotrófo. Em algumas modalidades, o microrganismo está no gênero Metilobacterium. Em algumas modalidades, o microrganismo é extraído de um ou mais dentre as seguintes espécies: Metilobacterium zatmanii; Metilobacterium extorquens', Metilobacterium cloromethanicum. Em algumas modalidades, são fornecidas composições em que o microrganismo é um quimioautotrófico e/ou um carboxidotrófico e/ou um metilotrófico e/ou metanotrófico oxidante de hidrogênio.
[0258] Em determinadas modalidades, os microrganismos são microrganismos de ocorrências natural e/ou não modificados geneticamente (não GMO) e/ou não patogênicos e/ou dependem das condições ambientais específicas fornecidas pelo bioprocessos que estão ausentes do ambiente circundante.
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83/229 [0259] Em determinadas modalidades, os microrganismos ou conjunto de microrganismos são isolados de amostras ambientais e enriquecidos com microrganismos desejados com o uso de métodos conhecidos na técnica de microbiologia através do crescimento na presença de doadores de elétrons direcionados, incluindo porém sem limitação um ou mais dentre: hidrogênio, CO, syngas e/ou metano e aceitadores de elétrons incluindo, porém sem limitação um ou mais dentre oxigênio, nitrato, ferro férrico e/ou CO2 e condições ambientais (por exemplo, temperatura, pH, pressão, oxigênio dissolvido (DO), salinidade, a presença de várias impurezas e poluentes etc.).
[0260] Em algumas modalidades, os doadores de elétrons utilizados em biossíntese e/ou respiração pelos microrganismos incluem, porém sem limitação um ou mais dentre os seguintes agentes de redução: amônia; amônio; monóxido de carbono; ditionita; enxofre elementar; hidrogênio; metabissulfetos; óxido nítricos; nitretos; sulfatos, tais como tiossulfatos, incluindo porém sem limitação tiossulfato de sódio (Na2S20s) ou tiossulfato de cálcio (CaS2Os); sulfetos, tais como sulfeto de hidrogênio; sulfetos; tionato; e tionita.
[0261] Em algumas modalidades, o microrganismo pode produzir ATP de um doador de elétrons inorgânico, tais como, porém sem limitação, H2 e/ou CO sem a síntese de metano ou ácidos orgânicos de cadeia curta, tal como, porém sem limitação, ácido acético e/ou ácido butírico (ácidos orgânicos de cadeia curta que compreendem comprimentos de cadeia de carbono de dois a quatro carbonos). Em algumas modalidades não limitativas, o microrganismo produz ATP de um doador de elétrons inorgânico, tal como, porém sem limitação, H2 e/ou CO acoplado em respiração com um aceitador de elétrons diferente de CO2. Em determinadas tais modalidades, o aceitador de elétron é um aceitador de elétron mais forte que CO2 no sentido de ter uma energia livre de Gibbs mais negativa de reação com o doador de elétrons usado na respiração.
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84/229 [0262] Em algumas modalidades, o microrganismo tem capacidade de converter syngas, e/ou CO2 gasoso e/ou uma mistura de gás CO2 e H2 gás e/ou CO e/ou ChUem um ou mais compostos orgânicos, em que menor que 10% em peso dos compostos orgânicos produzidos pelo microrganismo é metano. Em algumas modalidades, o microrganismo tem capacidade para converter syngas e/ou CO2 gasoso e/ou uma mistura de gás CO2 e gás H2 e/ou CO, e/ou Chhem um ou mais ou mais compostos orgânicos, em que menos que 10% em peso dos compostos orgânicos produzidos são ácidos orgânicos livres (isto é, não incluídos em um polímero), e/ou sais de ácidos orgânicos livres, que têm comprimento de cadeia de carbono de quatro carbonos ou menos, excluindo aminoácidos. Em algumas modalidades, os microrganismo têm capacidade para converter syngas e/ou CO2 gasoso e/ou uma mistura de gás CO2 e gás H2 e/ou CO e/ou Chh, em um ou mais compostos orgânicos, em que menos que 10% em peso dos compostos orgânicos produzidos são ácidos orgânicos livres (isto é, não incluídos um polímero) e/ou sais de ácidos orgânicos livres que têm comprimento de cadeia de carbono de quatro carbonos ou menos, excluindo um ou mais dentre os seguintes aminoácidos: alanina; treonina; serina; glicina, asparagina; ácido aspártico; cisteína.
[0263] Determinadas modalidades utilizam microrganismos oxidantes de hidrogênio e/ou oxidante de CO e/ou Chh que usam mais aceitadores de elétrons eletronegativos em reações conservadoras de energia para produção de ATP, tais como porém sem limitação O2.
[0264] Em algumas modalidades, os microrganismo têm capacidade para crescerem em glicerol e/ou glicose e/ou metanol e/ou acetato cru não tratado como o doador de elétrons único e fonte de carbono. Em algumas modalidades, o microrganismo pode crescer de maneira mixotrófica em uma fonte de carbono orgânica e com o uso de um doador de elétrons inorgânico ou uma fonte de carbono.
[0265] Em determinadas modalidades, os
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85/229 microrganismos fornecidos no presente documento compreendem uma linhagem celular selecionadas a partir de plantas eucarióticas, algas, cianobactérias, bactérias veres de enxofre, bactérias verdes de não enxofre, bactérias roxas de enxofre, bactérias roxas de não enxofre, extremófilos, levedura, fungos, proteobacteria, organismos modificados dos mesmos e organismos sintéticos.
[0266] Em determinadas modalidades, não limitativas de microrganismos no presente documento, não há acidogênese detectável causada por respiração celular.
CULTURAS MICROBIANAS [0267] As culturas líquidas usadas para crescer células de microrganismo descritas no presente documento podem ser alojadas em vasos de cultura conhecidos e usados na técnica. Em algumas modalidades, a produção em larga escala em um vaso de biorreator pode ser usada para produzir grandes quantidades de uma molécula e/ou biomassa desejada.
[0268] Em determinadas modalidades, os vasos de biorreator são usados para conter, isolar e/ou proteger o ambiente de cultura. Por exemplo, os vasos de cultura podem ser usados sem algumas modalidades não limitativas para a produção de compostos orgânicos incluindo, porém sem limitação, um ou mais dentre o seguinte: aminoácidos; peptídeos; proteínas; vitaminas, tais como porém sem limitação vitamina B1, B2 e B12; e/ou outros nutrientes. Os vasos de cultura incluem aqueles que são conhecidos penas pessoas versadas na técnica de cultura microbiana em larga escala. Tais vasos de cultura incluem mas não estão limitados a um ou mais dos seguintes: reatores de transporte aéreo; colunas de purificação biológica; colunas de bolhas; reatores de tanque agitados; reatores contínuos de tanque agitado; reatores em contracorrente, fluxo ascendente e leito expandido; digestores e, em particular, sistemas digestores, tais como conhecidos nas técnicas anteriores de tratamento ou biorremediação de águas residuais e águas residuais; filtros incluindo, entre outros, filtros de gotejamento, filtros de contato biológicos rotativos, discos
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86/229 rotativos, filtros de solo; reatores de leito fluidizado; fermentadores de elevação de gás; reatores de células imobilizadas; reatores de loop; reatores de biofilme de membrana; tanques de pachuca; reatores de leito fixo; reatores de fluxo pistonado; misturadores estáticos; reatores de leito gotejante; e/ou biorreatores de eixo vertical.
[0269] A cultura microbiana almejada na produção comercial de compostos orgânicos e especificamente aminoácidos. peptídeos. proteínas e outros nutrientes é realizada tipicamente em biorreatores de escala muito maior (por exemplo, volumes de biorreator 500 I. 1.000 I 5.000 I. 10.000 I. 50.000 I. 100.000 I. 1.000.000 I e maiores).
[0270] Em determinadas modalidades, microrganismos quimioautotrófico e/ou heterotrófico e/ou carboxidotrófico e/ou metanotrófico e/ou metilotrófico microrganismos são cultivados no meio líquido no interior de um biorreator com o uso de métodos descritos no presente documento.
[0271] Em algumas modalidades, o biorreator que contém os microrganismos é construído a partir de materiais opacos que mantêm a cultura em escuridão completa ou quase completa. Os biorreatores construídos a partir de materiais opacos, tais como aço e/ou outras ligas metálicas e/ou concreto reforçado e/ou vibra de vidro e/ou vários materiais plásticas de alta resistência podem ser projetados para ter grandes volumes de trabalho. Em algumas modalidades, são utilizados fermentadores construídos a partir de aço ou outras ligas metálicas que têm 50.000 litros de volume mais. Em algumas modalidades, biorreatores com capacidade para conter pressões positivas de folga de fechamento acima da pressão ambiente são utilizadas. Em algumas modalidades, são utilizados digestores cilíndricos ou em formato de ovo ou biorreatores de haste vertical 3.000.000 litros de volume e mais. Em algumas modalidades, o biorreator que compreende o microrganismo não permite que luz penetre em parte ou em grande parte do volume de líquido contido. Em determinadas modalidades não limitativas, o microrganismo usado na etapa de
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87/229 fixação de CO2 não é fotossintética. Em determinadas modalidades não limitativas, o projeto de biorreator não confina a cultura em camadas finas ou tem paredes transparentes ou tem paredes transparentes de modo que haja luz disponível em todas as partes, conforme é geralmente necessário com fotossíntese. Em algumas modalidades, o microrganismo é cultivado sem qualquer exposição ou significativa à luz. Em determinadas modalidades, o consumo líquido de CO2 ainda ocorre na ausência de luz de luz devido a metabolismo e condições quimioautotróficas. Em determinadas modalidades, a conversão de eletricidade em luz artificial não é necessária em um sistema biológico captura e conversão de CO2.
[0272] Em determinadas modalidades, a falta de instalações de dependência de luz facilita as operações de captura de CO2 contínua, dia e noite, ciclo de um ano, em todas as condições climáticas, sem a necessidade de qualquer iluminação artificial.
[0273] Em algumas modalidades, os microrganismos são cultivados e mantidos e para a produção de aminoácidos, ou proteínas, ou outros nutrientes ou produtos completos de célula em um meio que contém uma fonte gasosa de carbono, tal como porém sem limitação syngas, gás produtor, gás de saída, gás de pirólise ou misturas de gás H2 e CO2 na ausência de luz; em que tal crescimento é conhecido como quimioautotrófico.
[0274] Em determinadas modalidades, um aumento na capacidade do sistema é atendido por escalonamento vertical, em vez que apenas escalonamento horizontal. Isso se opõe às abordagens fototróficas com o uso de algas, cianobacterias ou plantas superiores para captura de CO2. Embora vários esquemas de criação verticais tenham sido propostos para sistemas fotossintéticos, em termos práticos e econômicos, os sistemas fototróficos precisam se expandir horizontalmente, por exemplo, em lagoas rasas lagoas ou fotobiorreatores no caos de algas. Isso resulta em grandes pegadas geográficas e em muitos impactos ambientais negativos ambientais.
[0275] Um sistema de algas ou de plantas mais altas
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88/229 cultivado com iluminação artificial é desafiado pela utilização ineficiente de energia de luz e por conversão ineficiente de energia elétrica em energia de luz. Em determinadas modalidades, uma cultura comparável de plantas altas ou de algas cultivada sob iluminação artificial exigirá mais energia elétrica do que captura de CO2 e/ou sistema de produção de biomassa descrito no presente documento, em termos de captura de CO2 e/ou produção de biomassa. Em determinadas modalidades, uma cultura comparável de plantas altas ou de algas cultivada sob iluminação artificial exigirá pelo menos fez vezes mais energia elétrica do que a captura de CO2 e/ou o sistema de produção de biomassa descrito no presente documento, em termos de potência por unidade de captura de CO2 e/ou produção de biomassa. Para algas ou plantas mais altas cultivadas sob iluminação artificial, a exigências de rejeição de calor está quase em proporção direta à entrada elétrica. Em determinadas modalidades dos métodos descritos no presente documento, as exigências de rejeição de calor são mais baixas do que para um sistema comparável de algas ou de plantas mais altas, em termos de captura de CO2 e/ou produção de biomassa quando cultivado em iluminação artificial. Em determinadas modalidades, as exigências de rejeição de calor são pelo menos dez vezes menor do que para um sistema comparável de algas ou de plantas mais altas, em termos de captura de CO2 e/ou produção de biomassa quando cultivadas sob iluminação artificial.
[0276] Em uma modalidade exemplificativa, porém não limitante, um biorreator que contém meio nutriente é inoculado com células de produção. De modo geral, as mesmas seguirão uma fase de atraso antes de as células começarem a duplicar. Após a fase de atraso, o tempo de duplicação de célula diminui, e a cultura passa para fase logarítmica. A fase logarítmica é seguida eventualmente por um aumento do tempo de duplicação, embora sem limitação teórica, isso é considerado como resultante ou de uma limitação de transferência de massa, depleção de nutrientes incluindo fontes de nitrogênio ou minerais ou uma elevação na concentração de produtos químicos inibidores ou captação de quórum pelos micróbios. O crescimento desacelera e, em seguida,
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89/229 para quando a cultura na fase estacionária. Em determinadas modalidades, há uma fase de crescimento aritmético que antecede a fase estacionária. A fim de colher a massa celular, a cultura em determinadas modalidades é colhida na fase logarítmica e/ou na fase aritmética e/ou na fase estacionária.
[0277] O biorreator ou fermentador é usado para cultivar células através das várias fases de seu ciclo fisiológico. Um biorreator é utilizado para o cultivo de células, que pode ser mantido em fases particulares na curva de crescimento dos mesmos. O uso biorreatores de muitas maneiras é vantajoso para cultivar crescimento quimioautotrófico. Para determinada modalidades, massa celular rica em proteína que é usada para produzir proteínas ou hidrolisados de proteína é cultivada sob altas densidades em suspensão líquida. De modo geral, o controle de condições de crescimento, incluindo o controle de dióxido de carbono dissolvido, oxigênio e outros gases, tais como hidrogênio, assim como outros nutrientes dissolvidos, elementostraço, temperatura e pH é facilitado em um biorreator. Para determinadas modalidades, massa celular rica em proteína, que é usada para produzir aminoácidos, peptídeos, proteínas, hidrolisados, extrai ou produtos completos de célula é cultivado sob altas densidades e/ou cultivados em latas produtividades, em suspensão líquida dentro de um biorreator.
[0278] Os meios de nutriente, assim como gases, podem ser adicionados ao biorreator ou como uma adição por batelada ou periodicamente ou em resposta a uma depleção detectada ou ponto de definição programado, ou continuamente durante o período, a cultura é cultivada e/ou mantida. Para determinadas modalidades, o biorreator na inoculação é preenchido com uma batelada de iniciação de meios de nutriente e/ou um ou mais gases no início de crescimento e sem meios de nutriente adicionais e/ou um ou mais gases são adicionados após inoculação. Para determinadas modalidades, os meios de nutriente e/ou um ou mais gases são adicionados periodicamente após inoculação. Para determinadas modalidades, os meios de nutriente e/ou um ou mais gases são adicionados após a inoculação em resposta
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90/229 a uma depleção detectada de nutriente e/ou gás. Para determinadas modalidades, os meios de nutriente e/ou um ou mais gases são adicionados continuamente após inoculação.
[0279] Para determinadas modalidades, os meios de nutriente adicionados não contêm nenhum composto orgânico.
[0280] Em determinadas modalidades, uma pequena quantidade de células de microrganismo (isto é, um inóculo) é adicionada a um volume definido do meio de cultura; a cultura é, em seguida, incubada; e a massa celular passa através fases de atraso, exponencial, de declaração e estacionária de crescimento.
[0281] Em sistemas de cultura em batelada, as condições (por exemplo, concentração de nutriente, pH etc.) sob as quais o microrganismo é cultivado geralmente mudam de maneira contínua através do período de crescimento. Em determinadas modalidades não limitativas, a fim de evitar flutuar condições inerentes em culturas em batelada e aprimorar a produtividade geral do sistema de cultura, os microrganismos que são usados para a produção de proteína e/ou vitaminas e/ou outros nutrientes são cultivados em um sistema de cultura contínuo denominado de quimioestato. Em tais sistemas, a cultura pode ser mantida em uma fase exponencial perpetuai de crescimento alimentando-se a mesma com meio fresco a uma taxa constante [F] ao mesmo tempo que o volume [V] da constante de cultura é mantida. Em determinadas modalidades, um sistema de cultura contínua garante que as células sejam cultivadas sob condições ambientais que permanecem quase constantes. Em determinadas modalidades, as células são mantidas em uma fase exponencial perpetuai através do uso de um sistema de quimoestato. Em tal caso, a taxa de diluição (D) da cultura é igual à taxa de cultura do microrganismo, e é fornecida por: D = F/V. A taxa de crescimento de um microrganismo em cultura contínua pode ser mudada alterando-se a taxa de diluição. Em determinadas modalidades, a taxa de crescimento do microrganismo é mudada alterando-se a taxa de diluição. Em determinadas
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91/229 modalidades não limitativas, as células são cultivadas em um quimioestato a uma taxa de diluição de cerca de 0,2 h’1.
[0282] Em determinadas modalidades, a inoculação da cultura no biorreator é realizada por métodos incluindo porém sem limitação transferência de cultura de uma cultura existente que persente em outro biorreator ou incubação de um estoque de sementes elevado em um incubador. Em determinadas modalidades, o estoque de sementes da cepa pode ser transportado e armazenado em formas incluindo, porém sem limitação um forma em pó, líquida, congelada ou liofilizada assim como qualquer outra forma adequada, que pode ser reconhecida prontamente por uma pessoa versada na técnica. Em determinadas modalidades não limitativas, as culturas bacterianas reservadas são mantidas em um estado metabolicamente inativo, liofilizado necessário para reiniciação. Em determinadas modalidades, durante o estabelecimento de um cultura em um reator muito maior, as culturas são cultivadas e estabelecidas em vasos de escala intermediária progressivamente maior antes da inoculação do vaso em larga escala.
[0283] Para determinadas modalidades, os biorreatores têm mecanismos para possibilitar a mistura dos meios de nutriente que incluem, porém sem limitação, um ou mais dentre o seguinte: barras de agitação por giro, lâminas, impulsores ou turbinas; vasos de giro, sacudimento ou virada; elevações de gás, aspersão; recirculação de caldo do fundo do recipiente até o topo por meio de um conduíte de recirculação, fluindo o caldo através de um ciclo e/ou misturadores estáticos. Os meios de cultura podem ser misturados contínua ou intermitentemente.
[0284] Em determinadas modalidades, o meio de nutriente que contém microrganismo pode ser removido do biorreator parcial ou completamente, periódica ou continuamente, e em determinadas modalidades é substituído por meio fresco livre de células para manter a cultura celular em uma fase de crescimento exponencial e/ou para reabastecer os nutrientes depletados no meio de crescimento e/ou remover produtos residuais inibidores.
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92/229 [0285] As portas que são padrão em biorreatores podem ser utilizadas para entregar ou retirar gases, líquidos, sólidos e/ou pastas fluidas em e/ou do vaso de biorreator que confinam os micróbios. Muitos biorreatores têm múltiplas portas para diferente propósitos para diferentes propósitos (por exemplo, portas para adição de meio, adição de gás, sondas para pH e DO e amostragem), e uma determinada porta pode ser usada para vários propósitos durante o curso de um percurso de fermentação. Como exemplo, uma porta pode ser usada para adicionar meios de nutriente ao biorreator em um momento, e em outro momento e pode ser usado para amostragem. De preferência, os múltiplos usos de uma porta de amostragem podem ser realizados sem introduzir espécies de contaminação ou invasivas no ambiente de crescimento. Uma válvula ou controle de habilitação de atuador do fluxo de amostra ou amostragem contínua pode ser fornecido a uma porta de amostragem. Para determinadas modalidades, os biorreatores são equipados com pelo menos uma porta adequada para cultivar a inoculação que pode servir adicionalmente para outros usos incluindo a adição de meios ou gás. As portas de biorreator possibilitam o controle da composição de gás e taxa de fluxo no ambiente de cultura. Por exemplo, as portas podem ser usadas como entradas de gás no através do biorreator através das quais os gases são bombeados.
[0286] Para algumas modalidades, os gases que podem ser bombeados em um biorreator incluem, porém sem limitação, um ou mais dentre o seguinte: syngas, gás produtor, gás de pirólise, gás hidrogênio, ar CO, CO2, O2, misturas de ar/CO2, gás natural, biogás, metano, amônia, nitrogênio, gases nobres, tais como argônio, assim como outros gases. Em algumas modalidades, o CO2 bombeado no sistema pode partir de fontes incluindo, porém sem limitação: CO2 da gaseificação de matéria orgânica; CO2 do cálculo de calcário, CaCOs, a fim de produzir cal viva, CaO; CO2 da reformação de vapor de metano, tal como o subproduto da produção de CO2 de amônia, metanol ou hidrogênio; CO2 de combustão, incineração ou queima controlada de gases; subproduto de CO2 de fermentação anaeróbica ou aeróbica
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93/229 de açúcar; subproduto de CO2 de um bioprocesso metanotrófico; CO2 do tratamento de água residual; subproduto de CO2 de produção de sódio fosfato; geologicamente ou geotermicamente produzidos ou emitidos CO2; CO2 removido de gás ácido ou gás natural. Em determinadas modalidades não limitativas, o CO2 foi removido de um gás de queima industrial ou interceptados de uma fonte geológica que é emitido naturalmente, de outro modo, atmosfera. Em determinadas modalidades, a fonte de carbono é CO2 e/ou bicarbonate e/ou carbonato dissolvidos na água do mar ou outros corpos de água na superfície ou água subterrânea. Em determinadas modalidades, o carbono inorgânico pode ser introduzido ao biorreator dissolvido em água líquido e/ou como um sólido. Em determinadas modalidades, a fonte de carbono é CO2 capturada da atmosfera. Em determinadas modalidades não limitativas, o CO2 foi capturado de uma cabine fechada de um sistema de suporte vital de ciclo fechado, o uso de tal equipamento tal como, porém sem limitação, um conjunto de remoção de CO2 (CDRA), que é utilizado, por exemplo, na International Space Station (ISS).
[0287] Em determinadas modalidades não limitativas, os recursos geológicos, tais como, porém sem limitação, respiradouros geotérmicos e/ou hidrotérmicos que emitem altas concentrações de fontes de energia (por exemplo, gases H2, H2S, CO) e/ou fontes de carbono (por exemplo, CO2, HCO3·, CO32·) e/ou outros minerais dissolvidos podem ser utilizados como fontes de nutriente para os microrganismos no presente documento.
[0288] Em determinadas modalidades, um ou mais gases além do dióxido de carbono ou no lugar de dióxido de carbono como uma fonte de carbono alternativa, são ou dissolvidos na solução e fornecidos ao caldo de cultura e/ou dissolvidos diretamente no caldo de cultura, incluindo porém sem limitação doadores de elétrons gasosos e/ou fontes de carbono (por exemplo, gás hidrogênio e/ou CO e/ou metano). Em determinadas modalidades, gases de entrada podem incluir outros doadores de elétrons e/ou aceitadores de elétrons e/ou fontes de carbono e/ou nutrientes minerais, tais como, porém sem limitação, outros constituintes de gás e impurezas de syngas (por exemplo,
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94/229 hidrocarbonetos); amônia; sulfeto de hidrogênio; e/ou outros gás ácido; e/ou O2; e/ou partículas que contêm mineral e cinza.
[0289] Em determinadas modalidades, um ou mais gases são dissolvidos no caldo de cultura, incluindo, porém sem limitação, doadores de elétrons gasosos, tais como, porém sem limitação, um ou mais dentre o seguinte: hidrogênio, monóxido de carbono, metano, sulfeto de hidrogênio ou outros gases ácidos; fontes gasosa de carbono, tais como, porém sem limitação um ou mais dentre o seguinte: CO2, CO, ChU; e aceitadores de elétrons, tais como porém sem limitação, oxigênio, ou dentro de ar (por exemplo, 20,9% de oxigênio) ou como O2 puro ou como um gás enriquecido com O2. Em algumas modalidades, a dissolução desses e de outros gases na solução é alcançada com o uso de sistemas de compressor, fluxômetros e válvulas de fluxo conhecidos pela uma pessoa versada na técnica de engenharia de fermentação, que a alimentação em um ou mais dentre os seguintes são sistemas para dispersar gás na solução: aspergir equipamento; difusores incluindo, porém sem limitação, geometrias de domo, tubular, de disco ou rosca, aeradores de bolha fina; equipamento venturi. Em determinadas modalidades, a areação de superfície e/ou transferência de massa de gás também podem ser realizadas com o uso de aerador de pá e semelhantes. Em determinadas modalidades, a dissolução de gás é intensificada por mistura mecânica com um impulsor ou turbina, assim como dispositivos de cisalhamento hidráulico a fim de reduzir o tamanho da bolha. Em seguida da passagem através do sistema de reator que retém microrganismos que absorvem os gases, em determinadas modalidades, os gases residuais podem ou ser recirculados de volta ao biorreator ou queimados para processar calor ou queimados ou injetados no subsolo ou liberados na atmosfera. Em determinadas modalidades no presente documento que utiliza H2 como um doador de elétrons, com H2 o vaso de cultura pode ser alimentado ou por borbulhamento do mesmo através do meio de cultura ou por difusão do mesmo através de uma membrana permeável a hidrogênio ou impermeável a água conhecida na técnica que faz interface com o meio de
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95/229 cultura líquido.
[0290] Em determinadas modalidades, os microrganismos crescem e se multiplicam em H2 e CO2 e outros nutrientes dissolvidos sob condições microaeróbicas. Em determinadas modalidades, um produto químico de C1, tal como, porém sem limitação monóxido de carbono, metano, metanol, formato ou ácido fórmico, e/ou misturas que contêm produtos químicos C1 incluindo porém sem limitação várias composições de syngas gerados a partir de várias matérias-primas de carbono fixo gaseificadas, pirolisadas ou reformadas a vapor são convertidas bioquimicamente em produtos químicos orgânicos de cadeia mais longa (isto é, C2 ou mais longa e, em algumas modalidades, moléculas de cadeia de carbono C5 ou mais longa) sob um ou mais dentre as seguintes condições: condições aeróbicas, microaeróbicas, anóxicas, aneaeróbicas e/ou facultativas.
[0291] Uma quantidade controlada de oxigênio também pode ser mantida no caldo de cultura de algumas modalidades, e em determinadas modalidades, o oxigênio será dissolvido ativamente na solução com a qual o caldo de cultura foi alimentado e/ou dissolvido diretamente no caldo de cultura. Em determinadas modalidades aeróbicas ou microaeróbicas que exigem o bombeamento de ar ou oxigênio no caldo de cultura a fim de manter níveis de DO alvejados, as bolhas de oxigênio podem ser injetados no caldo em um diâmetro ideal para mistura e transferência de oxigênio.
[0292] Em algumas modalidades, os microrganismos convertem um gás combustível, incluindo porém sem limitação syngas, gás produtor, gás de pirólise, biogás, gás residual, gás de queima, CO, CO2, H2, gás natural, metano e misturas dos mesmos. Em algumas modalidades, o teor de calor do gás combustível é pelo menos 100 BTU por litro (I) (pé cúbico padrão) (scf). Em algumas modalidades, um biorreator que é usado para conter e cultivar os microrganismos é equipado com difusores de bolha fina e/ou impulsores de alto cisalhamento para entrega de gás.
[0293] A introdução e/ou elevação da taxa de fluxo de
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96/229 em um biorreator pode intensificar mistura a cultura e produzir turbulência, caso o gás entrada seja posicionado abaixo da superfície do meio líquido de modo que o gás borbulhe ou seja aspergido para cima até o meio. Em determinadas modalidades, a mistura é intensificada através de turbulência fornecida por bolhas de e/ou aspersão e/ou tampo por gás par acima através do meio líquido. Em algumas modalidades, um biorreator compreende portas de saída de gás para escape de gás e liberação de pressão. Em algumas modalidades, as entradas e saídas de gás são, de preferência, equipadas com válvulas de retenção para impedir que o gás refluxe.
[0294] Em determinadas modalidades em que as reações quimiossintéticas ocorrem dentro do biorreator, um ou mais tipos de doador de elétrons e um ou mais tipos de aceitador de elétrons são bombeados ou, de outro modo, adicionados ou como uma adição de bolo, ou periodicamente ou continuamente ao meio de nutriente que contém organismos quimioautotróficos no vaso de reação. A reação quimiossintética, acionada pela transferência de elétrons do doador de elétrons ao aceitador de elétrons na respiração celular, fixa o dióxido de carbono inorgânico e/ou outros carbonates dissolvidos e/ou outros óxidos de carbono em compostos orgânicos e biomassa.
[0295] Em determinadas modalidades, é usado um meio de nutriente para crescimento de cultura e produção que compreende uma solução aquosa que contém materiais adequados, sais, vitaminas, cofatores, tamponamentos e outros componentes necessários para crescimento microbiano, conhecidos pelas pessoas versadas na técnica [Bailey e Ollis, Biochemical Engineering Fundamentals, 2^ edição; páginas 383 a 384 e 620 a 622; McGraw-Hill: New York (1986)].
[0296] Em determinadas modalidades, os produtos químicos usados para manutenção e crescimento de culturas microbianas, conforme conhecido na técnica são incluídos nos meios de nutriente. Em determinadas modalidades, esses produtos químicos podem incluir, porém sem limitação um ou mais dentre o seguinte: fontes de nitrogênio, tais como amônia,
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97/229 amônio (por exemplo, cloreto de amônio (NhhCI), sulfato de amônio ((NH4)2SO4)), nitrato (por exemplo, nitrato de potássio (KNO3)), uréia ou em fonte de nitrogênio orgânica; fosfato (por exemplo, fosfato dissódico (Na2HPO4), fosfato de potássio (KH2PO4), ácido fosfórico (H3PO4), ditiofosfato de potássio (K3PS2O2), ortofosfato de potássio (K3PO4), fosfato de dispotássio (K2HPO4)); sulfato; extrato de levedura; ferro quelado; potássio (por exemplo, fosfato de potássio (KH2PO4), nitrato de potássio (KNO3), cloreto de potássio (Kl), brometo de potássio (KBr)); e outros sais inorgânicos, minerais e nutrientes-traço (por exemplo, cloreto de sódio (NaCI), sulfato de magnésio (MgSCM 7H2O) ou cloreto de magnésio (MgCl2), cloreto de cálcio (CaCl2) ou carbonato de cálcio (CaCOs), sulfato de manganês (MnSCM 7H2O) ou cloreto de manganês (MnCte), cloreto férrico (FeCIs), sulfato ferroso (FeSO4 7H2O) ou cloreto ferroso (FeCl.sub.2 4H.sub.2O), bicarbonate de sódio (NaHCOs) ou carbonato de sódio(Na2CO3), sulfato de zinco (ZnSCM) ou cloreto zinco (ZnCl2), molibdato de amônio (NH4MOO4) ou molibdato de sódio (Na2MoO4 2H2O), sulfato de cobre (CuSCM) ou cloreto de cobre (CuCl2 2H2O), cloreto de coblato (C0CI2 6H2O), cloreto de alumínio (AICI3.6H2O), cloreto de lítio (LiCI), ácido bórico (H3BO3), cloreto de níquel N1CI2 6H2O), cloreto de estanho (SnCl2 H2O), cloreto de bário (BaCl2 2H2O), selenato de cobre (CuSeO4 5H2O) ou selenite de sódio (Na2SeOs), metavanadato de sódio (NaVOs), sais de cromo). Em determinadas modalidades, 0 meio de sais minerais (MSM) formulado por Schlegel et al pode ser usado [“Thermophilic bacteria”, Jakob Kristjansson, Capítulo 5, Seção III, CRC Press, (1992)].
[0297] Os aspectos descritos no presente documento se referem ao crescimento e/ou à expressão de bioprodutos com microrganismos (por exemplo, células bacterianas). Os microrganismos (por exemplo, células bacterianas) descritos no presente documento podem ser cultivados em algumas modalidades em meios de qualquer tipo (rico ou mínimo), incluindo meio de fermentação e qualquer composição. Conforme é entendido por qualquer pessoa de habilidade comum na técnica, a otimização rotineira
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98/229 permite o uso de uma variedade de tipos de meios. O meio selecionado pode ser suplementado com vários componentes adicionais. Alguns exemplos não limitativos de componentes suplementares incluem glicose, antibióticos, IPTG para indução de gene e Suplemento de Mineral-Traço ATCC. De modo semelhante, outros aspectos do meio e condições de crescimento dos microrganismos descritos no presente documento podem ser otimizados através de experimentação de rotina. Por exemplo, o pH e temperatura são exemplos não limitativos de fatores que podem ser otimizados. Em algumas modalidades, os fatores, tais como escolha de meios, suplementos de meios e temperatura podem influenciar nos níveis de produção de uma molécula desejada. Em algumas modalidades, a concentração e quantidade de um componente de suplemento podem ser otimizadas. Em algumas modalidades, a frequência com a qual os meios são suplementados com um ou mais componentes suplementares, e o período de tempo em que os meios são cultivados antes da colheita da molécula desejada é otimizada.
[0298] Em determinadas modalidades, todos os microrganismos patogênicos presentes em matérias-primas de resíduo bruto que entram no processo são exterminados através de uma etapa de gaseificação e/ou pirólise e/ou incineração ou que levam a uma ou mais etapas de captura e de bioconversão de C1.
[0299] Em determinadas modalidades, a concentrações de produtos químicos de nutriente (por exemplo, doadores de elétrons, aceitadores de elétrons, fontes de carbono e/ou vários nutrientes minerais) são mantidos dentro do biorreator próximo de ou em níveis ideais respectivos para absorção de e/ou fixação e/ou conversão de carbono ideal e/ou produção de compostos orgânicos, o que varia dependendo do microrganismo utilizado, porém é conhecido ou determinável sem experimentação indevida pela pessoa de habilidade comum na técnica de cultivar microrganismos.
[0300] Em determinadas modalidades, um ou mais dentre os seguintes parâmetros são monitorados e/ou controlados no biorreator:
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99/229 níveis de produto residual; pH; temperatura; salinidade; oxigênio dissolvido; dióxido de gás carbono dissolvido; taxas de fluxo líquido; taxa de agitação; pressão de gás. Em determinadas modalidades, os parâmetros operacionais que afetam crescimento quimioautotrófico são monitorados com sensores (por exemplo, sonda de oxigênio dissolvido ou sonda de redução de oxidação para calibrar concentrações de doador/aceitador de elétrons) e/ou são controlados ou manualmente ou automaticamente com base na retroalimentação dos sensores através do uso de equipamento incluindo, porém sem limitação válvulas de atuação, bobas e agitadores. Em determinadas modalidades, a temperatura do caldo de entrada assim como de gases de entrada é regulada por sistemas, tais como, porém sem limitação, resfriadores, aquecedores e/ou trocadores de calor.
[0301] Em determinadas modalidades, a cultura microbiana e biorreação é mantida com o uso de fluxo contínuo e remoção do meio de nutriente e/ou biomassa, em um estado estável em que a população de célula e parâmetros ambientais (por exemplo, densidade celular, pH, DO, concentrações químicas) são direcionadas em um nível constante ao longo do tempo. Em determinadas modalidades, o nível constante é um nível ideal para conversão de matéria-prima e/ou produção de compostos orgânicos direcionados. Em determinadas modalidades, as densidades de célula podem ser monitoradas por amostragem direta, por uma correlação de densidade óptica a densidade de célula e/ou com um analisador de tamanho de partícula. Em determinadas modalidades, os tempos de retenção de biomassa e hidráulica podem ser desacoplados de modo a permitir controle independente do tanto da química do caldo quanto da densidade de célula. Em determinadas modalidades, as taxas de diluição podem ficar altas o suficiente de modo que o tempo de retenção hidráulico seja relativamente baixa em comparação ao tempo de retenção de biomassa, o que resulta em um caldo altamente reabastecido para proliferação celular e/ou conversão e/ou produção de matéria-prima dos compostos orgânicos. Em determinadas modalidades, as taxas de diluição são definidas em uma troca tecnicoeconômica entre caldo de cultura e
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100/229 reabastecimento de nutriente e/ou remoção de produto residual e custos de processo aumentados de bombeamento, entradas aumentadas e outras demandas que surgem com taxas de diluição.
[0302] Em determinadas modalidades, o pH da cultura microbiana é controlado. Em determinadas modalidades, o pH é controlado dentro de uma faixa ideal para manutenção microbiana e/ou crescimento e/conversão de matéria-prima e/ou produção e/ou sobrevivência de compostos orgânicos. A fim de tratar de uma diminuição em pH, em determinadas modalidades, uma etapa de neutralização pode ser realizada diretamente no ambiente de biorreator ou antes de reciclar os meios de volta para o vaso de cultura através de um ciclo de recirculação. A neutralização de ácido no caldo de determinadas modalidades pode ser realizada pela adição de bases, incluindo porém sem limitação um ou mais dentre o seguinte: calcário, cal, hidróxido de sódio, amônia, hidróxido de amônio, potassa cáustica, óxido de magnésio, óxido de ferro, cinza alcalina.
[0303] Em determinadas modalidades, uma suspensão aquosa de microrganismos quimioautototróficos converte um ou mais doadores de elétrons e CO2 em protoplasma. Em determinadas modalidades, uma suspensão aquosa de microrganismos oxidantes de hidrogênio pode ser usada para converter hidrogênio e dióxido de carbono em protoplasma microbiano. Em determinadas modalidades, uma suspensão aquosa de microrganismos oxidantes de monóxido de carbono pode ser usada para converter monóxido de carbono e hidrogênio e/ou água em protoplasma. Em determinadas modalidades, uma suspensão aquosa de microrganismos oxidantes de metano pode ser usada para converter metano em protoplasma. Em determinadas modalidades, o microrganismo em suspensão é uma bactéria ou uma arquea. Em determinadas modalidades não limitativas, uma suspensão aquosa ou biofilme de microrganismos quimioautototróficos oxidantes de H2 converte H2 e CO2, junto de alguns outros nutrientes minerais dissolvidos, em produtos bioquímicos e protoplasma. Em determinadas modalidades, os outros
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101/229 nutrientes minerais dissolvidos incluem, porém sem limitação, uma fonte de nitrogênio, uma fonte de fósforo e uma fonte de potássio. Em determinadas modalidades, o protoplasma produzido tem valor alimentar para seres humanos e/ou outros animais e/ou outros heterotróficos. Em determinadas modalidades, determinados produtos bioquímicos podem ser extraídos do protoplasma e/ou caldo extracelular, que têm valor nutricional e/ou valor em uma variedade de aplicações de química orgânica ou de combustível. Em determinadas modalidades, a energia intracelular para acionar essa produção de protoplasma é derivada da oxidação de um doador de elétrons por um aceitador de elétrons. Em determinadas modalidades não limitativas, o doador de elétrons inclui, porém sem limitação, um ou mais dentre o seguinte: H2; CO; CPU. Em determinadas modalidades não limitativas, o aceitador de elétrons inclui, porém sem limitação O2 e/ou CO2. Em determinadas modalidades não limitativas, o produto da reação de geração de energia ou respiração, inclui, porém sem limitação, água. Em determinadas modalidades, a energia intracelular derivada de respiração usada para acionar essa síntese de produtos bioquímicos e protoplasma de CO2 é armazenado e é transportado em moléculas bioquímicas incluindo, porém sem limitação, ATP. Para os micróbios de knallgas usados em determinadas modalidades no presente documento, o aceitador de elétrons é O2 e o produto de respiração é água.
[0304] Em algumas modalidades, a produção de proteína e distribuição das moléculas de aminoácido produzidas é otimizada através de um ou mais dentre o seguinte: controle de condições de biorreator, controle de níveis de nutrientes e/ou modificações genéticas das células. Em determinadas modalidades, as rotas até os aminoácidos, ou proteínas ou outros nutrientes, ou produtos completos de célula são controladas e otimizadas para a produção de produtos químicos mantendo-se condições de crescimento específicas (por exemplo, níveis de nitrogênio, oxigênio, fósforo, enxofre, micronutrientes-traço, tais como íons inorgânicos e caso presente quaisquer moléculas regulatórias que podem não ser considerados geralmente um
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102/229 nutriente ou fonte de energia). Em determinadas modalidades, o oxigênio dissolvido (DO) pode ser otimizado mantendo-se o caldo e condições facultativas aeróbicas, microaeróbicas, anóxicas, anaeróbicas ou facultativas, dependendo das exigências dos microrganismos. Um ambiente facultativo é considerado como um que tem camadas superiores aeróbicas e camadas inferiores anaeróbicas causadas por estratificação da coluna de água. A biossíntese dos aminoácidos ou proteínas ou outros nutrientes ou produtos completos de célula pelos micróbios revelados no presente documento pode ocorrer durante a fase logarítmica ou após isso durante a fase estacionária quando a duplicação celular tiver parado, desde haja fornecimento o suficiente de carbono e energia e outras fontes de nutriente.
[0305] Os exemplos específicos de biorreatores, condições de cultura, crescimento heterotrófico e quimiotrófico, manutenção e aminoácidos ou proteínas ou outros nutrientes ou métodos de produção de produto celular descritos no presente documento podem ser combinados de qualquer maneira adequada a fim de aprimorar a eficiência do crescimento microbiano e aminoácido ou proteína ou outro nutriente ou outra produção de célula.
DOADORES E ACEITADORES DE ELÉTRONS [0306] Em determinadas modalidades não limitativas, a redução biossintética de CO2 utiliza aceitador de elétrons de O2 e/ou doador de elétrons de H2 que são gerados pela eletrólise de água. Em determinadas modalidades não limitativas, parte do O2 gerado por eletrólise de água e uma suspensão aquosa de microrganismos é alimentada com ο H2 conforme descrito no presente documento. Em determinadas modalidades não limitativas, a razão molar entre H2 com a qual uma suspensão aquosa de microrganismos foi alimentada e os moles de O2 é maior que 2:1. Em determinadas modalidades não limitativas em que o aceitador de elétrons de O2 e o doador de elétrons de H2 são gerados pela eletrólise de água, um excesso de O2 restante após todas as exigências metabólicas para H2 e O2 dos microrganismos descritos no
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103/229 presente documento foram atendias. Em determinadas modalidades, seres humanos e/ou outras formas de vida aeróbicas e/ou sistemas hidropônicos podem ser alimentados com ο O2 excedente para aeração de raiz e/ou é usado em uma gaseificação ou oxidação parcial ou processo de combustão e/ou é armazenado e vendido como um coproduto químico.
[0307] Em determinadas modalidades que utilizam hidrogênio molecular como um doador de elétrons, pode haver um coproduto químico formado na geração de hidrogênio molecular com o uso de uma entrada de energia livre de demissão de CO2 e/ou renovável. Em determinadas modalidades, a reação de oxi-hidrogênio usada na respiração é ligada de maneira enzimática à fosforilação oxidativa. Em determinadas modalidades, o ATP e/ou outros carreadores de energia intracelular então formados são utilizados na síntese anabólica de aminoácidos e/ou proteínas. Em determinadas modalidades, 0 oxigênio produzido por separação e água além do necessário para respiração a fim de manter ideais condições para fixação de carbono e produção de composto orgânico pelos microrganismos de knallgas pode ser processado em uma forma adequada para venda através de etapas de processo conhecida na técnica ciência de produção de gás oxigênio comercial.
[0308] A produção de moléculas orgânicas com comprimentos de cadeia de carbono mais longos que C4 é realizada mais comum e eficientemente através de vias biossíntese anabólica, tais como biossíntese de ácido graxo [C. R. Fischer, D. Klein-Marcuschamer and G. Stephanopoulos (2008) “Selection and optimization of microbial hosts for biofuels production” Metabolic Engineering 10(6):295-304 (http://dx.doi.Org/10.1016/j.ymben.2008.06.009)] e várias vias biossintéticas de aminoácidos. Determinadas modalidades aplicam microrganismos oxidantes de hidrogênio e/ou oxidante de CO e/ou CPU que usam aceitadores de elétrons mais eletronegativos que CO2 em reações conservadoras de energia para produção de ATP (por exemplo, respiração), tais como porém sem limitação O2. Por exemplo, micróbios hidrogenotróficos de oxi-hidrogênio ou knallgas que se
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104/229 acoplam à reação de oxi-hidrogênio, 2 H2 + O2 -> 2 H2O para a ATP produção, pode produzir ATP por H2 e/ou outro doador de elétrons consumidos para respiração, mais do que acetógenos ou metanógenos que usam CO2 como um aceitador de elétrons na respiração. Por exemplo, os microrganismos de knallgas podem produzir pelo menos dois ATP por H2 consumido na respiração [L. Bongers (1970) “Energy generation e utilization in hidrogênio bacteria” Journal of bacteriology 104(1):145-151 (http://jb.asm.Org/content/104/1/145.abstract), que é incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade], que é oito vezes maior que ATP produzido por H2 consumido na respiração do que o que foi produzido nos microrganismos que submetem metanogênese ou acetogênese, com o uso de H2 como doador de elétrons e CO2 como aceitador de elétrons na respiração. Por esse motivo, o uso de microrganismos que podem utilizar mais aceitadores de elétrons eletronegativos na respiração e na produção de ATP, tais como porém sem limitação micróbios de knallgas, para biossíntese anabólica, tais como porém sem limitação, aminoácido ou proteína ou biossíntese de ácido graxo de syngas ou H2, pode ser mais eficientes do que usar acetogênios ou metanogênios, tais como aqueles que são usados atualmente em tecnologias de GTC biológico para a produção de ácidos ou álcoois de cadeia curta (por exemplo, ácido acético ou etanol). Em determinadas modalidades, a reação de oxi-hidrogênio usada na respiração é ligada de maneira enzimática à fosforilação oxidativa. Em determinadas modalidades, respiração aeróbica é utilizada pelas células de microrganismo descritas no presente documento para a produção de ATP. Em determinadas modalidades, o ATP e/ou outros carreadores de energia intracelular então formados são utilizados na biossíntese anabólica de aminoácidos e/ou proteínas. Em algumas modalidades, um microrganismo de knallgas e/ou carboxidotrófico e/ou metanotrófico e/ou heterotrófico ou uma composição que compreende esses microrganismos é utilizada, sendo que o microrganismo expressa uma ou mais enzimas que possibilitam biossíntese de produtos à base de carbono úteis de interesse incluindo, porém sem limitação, produtos químicos, monômeros,
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105/229 polímeros, proteínas, polissacarídeos, vitaminas, produtos nutracêuticos, antibióticos ou produtos farmacêuticos ou intermediários do mesmo de um matéria-prima gasosa que contém carbono, incluindo porém sem limitação syngas ou gás produtor ou gás natural ou biogás ou CO2 residual combinado com H2 renovável ou CO ou gases que contêm metano. Em algumas modalidades, esses ditos produtos à base de carbono de interesse podem ser biossintetizados de maneira heterotrófica de uma matéria-prima de múltiplos carbono orgânicos, tais como, porém sem limitação glicose, frutose e outros açúcares. Em algumas modalidades não limitativas, um microrganismo ou uma composição que compreende um microrganismo é utilizado, sendo que o microrganismo exige menos 4H2 ou NADH para produzir um ATP através de respiração. Em outras modalidades não limitativas, um microrganismo ou uma composição que compreende um microrganismo é utilizada, sendo que o microrganismo produz mais que um ATP por H2 ou NADH consumido através de respiração. Em outras modalidades não limitativas, um microrganismo ou uma composição que compreende um microrganismo é utilizada, sendo que o microrganismo produz pelo menos dois ATPs por H2 ou NADH consumido através da respiração, ou pelo menos 2,5 ATP por H2 ou NADH consumido através de respiração.
[0309] Um recurso adicional de determinadas modalidades não limitativas em se refere à fonte, produção ou reciclagem dos doadores de elétrons usados pelos microrganismos quimioautototróficos para fixar dióxido de carbono e/ou outras matérias-primas de C1 em compostos orgânicos. Os doadores de elétrons usados para dióxido de captura de carbono e fixação de carbono podem ser produzidos ou reciclados em determinadas modalidades eletroquimicamente ou termoquimicamente com o uso de energia de várias diferente tecnologia de energia de baixa emissão de carbono e/ou renováveis incluindo, porém sem limitação: energia fotovoltaica, térmica solar, energia eólica, hidroelétrica, nuclear, geotérmica, geotérmica intensificada, térmica oceânica, ondomotriz, maremotroiz. Muitos dos produtos químicos
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106/229 inorgânicos reduzidos sob os quais quimioautotróficos podem ser cultivados (por exemplo, H2, CO, H2S, ferro ferroso, amônio, Mn2+) podem ser produzidos mais prontamente com o uso de processos eletroquímicos e/ou termoquímicos bem conhecidos na técnica e ciência de engenharia química de que podem ser potencializados por uma variedade de fontes renováveis e/ou de baixa emissão de carbono livre de emissão de dióxido de carbono de potência incluindo porém sem limitação energia fotovoltaica, térmica solar, energia eólica, hidroelétrica, nuclear, geotérmica, geotérmica intensificada, térmica oceânica, ondomotriz, maremotroiz.
[0310] A produção de hidrogênio de fontes de energia renovável está gradualmente substituindo gradualmente a geração de sistemas de matéria-prima fóssil, e espera-se que os avanços técnicos no setor de energia diminuem os preços de produção de hidrogênio ecológico em um futuro próximo. Por exemplo, eficiências de energia elétrica de até 73% já são obtidos por eletrolisadores de grau comercial e industrial, e pesquisadores em novos materiais e novas configurações de eletrolisador mostraram possíveis eficiências tão altas quanto 96%. Determinadas modalidades utilizam tecnologia de eletrólise comercialmente disponível com elétrica maior que 70% para a geração de doador de elétrons de H2 e/ou aceitador de elétrons de O2. Determinadas modalidades usam tecnologias de eletrólise com 73% ou maior eficiência de energia e/ou até 96% de eficiência de energia ou maior.
[0311] Em determinadas modalidades que usam hidrogênio molecular como um doador de elétrons, ο H2 é gerado por métodos bem conhecidos na técnica e na ciência engenharia química e de processo, incluindo, porém sem limitação, um ou mais dentre o seguinte: através de eletrólise de água incluindo, porém sem limitação, abordagens que usam membranas de troca de prótons (PEM), eletrólitos líquidos, tais como KOH, eletrólise alcalina, eletrólise de eletrólito de polímero sólido, eletrólise de alta pressão, eletrólise de alta temperatura de vapor (HTES); e/ou através da separação termoquímica da água através de métodos incluindo, porém sem
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107/229 limitação, o ciclo de óxido de ferro, ciclo de cério(IV) óxido-cério(lll) óxido, ciclo de zinco zinco-óxido, ciclo de enxofre-iodeto, ciclo de cobre-cloro, ciclo de cálciobrometo-ferro, ciclo de enxofre híbrido; e/ou eletrólise de sulfeto de hidrogênio; e/ou separação termoquímica de sulfeto de hidrogênio; e/ou outros processos eletroquímicos ou termoquímicos conhecidos por produzir hidrogênio com baixas ou altas emissões de dióxido de carbono incluindo porém sem limitação: reforma de metano possibilitada por sequestro e captura de carbono (CCS); gaseificação de carvão possibilitada por CCS; o processo Kvaerner e outros processos que geram um produto de negro de carbono; gaseificação possibilitada por CCS ou pirólise de biomassa. Em determinadas modalidades, a abordagem para gerar H2 inclui, porém sem limitação, eletrólise alimentada por energia elétrica renovável e/ou eletricidade de uma fonte de baixo GHG. Em determinadas modalidades, a eletrólise é alimentada por um ou mais dentre o seguinte: solar, incluindo porém sem fotovoltaica; térmica solar; energia eólica; hidroelétrica; nuclear; geotérmica; geotérmica intensificada; térmica oceânica; ondomotriz; maremotroiz.
[0312] Mundialmente há enormes recursos de energia eólica, da qual apenas uma pequena porcentagem é utilizada. A baixa utilização atual é principalmente atribuída à natureza intermitente de recursos eólicos, que resultam na geração de eletricidade variável ao longo do tempo, e sob utilização de capacidade para atender à demanda de energia durante muitas horas. A não compatibilidade comum entre o fornecimento de energia eólica e demanda da rede elétrica é manifestada em exemplos ao redor do mundo, tal como na Escócia em que parques eólicos são pagos para desligar as turbinas devido à alimentação excessiva [http://www.mnn.com/earth-matters/energy/blogs/blownaway-wind-turbines-generate-enough-energy-to-power-every-home-in], e em partes do Texas onde a eletricidade foi fornecida gratuitamente à noite quando a energia eólica é alta e a demanda de rede elétrica é baixa [http://www.nytimes.eom/2015/11/09/business/energy-environment/a-texasutility-offers-a-nighttime-special-free-electricity.html?_r=2]. Esse desafio pode
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108/229 ser solucionável utilizando-se energia eólica produzida durante horas de demanda fora de pico para produzir matéria-prima de H2 para o processo em determinadas modalidades no presente documento.
[0313] Atualmente, o hidrogênio é considerado cada vez mais como um sistema de armazenamento de energia possível na abordagem então chamada “energia-para-gás”. A incapacidade inerente da produção de energia renovável (particularmente, solar e energia eólica) e eletricidade de rede elétrica (energia fora do pico) pode ser mitigada pela produção de hidrogênio através de eletrólise em água. De acordo com esquemas atuais, o gás hidrogênio produzido pode, então, ser convertido de volta em eletricidade, por células de combustível e/ou turbinas de gás, durante períodos de demanda de pico. Alternativamente, o a rede de gás pode ser alimentada com H2 ou este pode ser convertido em metano por meio de metanação. Além disso, o hidrogênio pode ser usado como uma matéria-prima nas industriais química, petroquímica metalúrgica e alimentícia. Determinadas modalidades fornecem novas opções dentro da armação energia-para-gás, possibilitando-se que ο H2 seja usado em uma faixa mais ampla de produtos, incluindo produtos bioquímicos e, em particular, proteínas, aminoácidos, fertilizantes e bioestimulantes. Em determinadas modalidades, hidrogênio produzido com o uso de eletricidade excessiva de rede elétrica e/ou energia fora de pico é usada como um doador de elétrons para um ou mais vias metabólicas que ocorrem em microrganismos que utilizam hidrogênio. Em determinadas modalidades, o hidrogênio e/ou o oxigênio necessários para a biossíntese microbiana por bactérias oxidantes de hidrogênio e/ou bactérias aeróbicas é gerada por eletrólise de água com o uso de energia renovável e, em particular, eletricidade fora do pico, isto é, energia elétrica disponível quando o fornecimento de energia excede a demanda e que, na atual situação, é muitas vezes desperdiçada.
[0314] Em determinadas modalidades, armazenamento no local de gases H2 e CO2 possibilita o desvio de energia na rede elétrica apenas durante períodos quando a geração renovável excede a
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109/229 demanda elétrica. Em determinadas modalidades, permite-se que a energia flua normalmente na rede elétrica durante período de maior demanda. Em determinadas modalidades, o processo não prejudica alimentação de energia renovável, porém, de preferência, possibilita uma utilização mais completa capacidade de geração renovável, tal como, porém sem limitação, eólica e solar. Determinadas modalidades permitem operação renovável e geração continuadas até mesmo durante períodos quando a geração elétrica excede a demanda da rede elétrica (por exemplo, geração de energia eólica ou solar fora do pico).
[0315] Em determinadas modalidades, hidrogênio doadores de elétrons não são gerados necessariamente com baixas ou altas emissões de dióxido de carbono. No entanto, em determinadas tais modalidades, o hidrogênio é gerado a partir de fontes residuais, sustentáveis de baixo valor de energia e/ou carbono com o uso de métodos conhecidos na técnica de engenharia química e de processo. Tais métodos incluem porém, sem limitação, a gaseificação, pirólise, reforma a vapor, ou reforma autotérmica de matéria-prima, tais como, mas não limitados a um ou mais dos seguintes: resíduos sólidos urbanos, lixívia negra, resíduos agrícolas, resíduos de madeira, gás natural encalhado, biogás, gás ácido, hidratos de metano, gás liquefeito de petróleo, coque de petróleo, pneus, esgoto, esterco, palha, alga marinha e alga marinha, e biomassa altamente lignocelulósica de baixo valor em geral. Em determinadas modalidades, um gás de síntese ou gás produtor que contém H2 e/ou CO e/ou CO2 é utilizado como um doador de elétrons e/ou como uma fonte de carbono. Em determinadas modalidades, ο H2 e/ou CO e/ou CO2 contido em um syngas ou gás produtor é suplementado por H2 gerado com o uso de uma fonte de energia renovável e/ou de baixo GHG e processo de conversão, tal como um ou mais dentre os descritos no presente documento.
[0316] Em determinadas modalidades não limitativas, a redução de CO2 residual ocorre e/ou a síntese de material celular que pode ser utilizada como uma fonte de alimento ou de nutrição e/ou o descarte e utilização
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110/229 de ureia residual ocorre e/ou outros desperdícios biológicos.
[0317] Em determinadas modalidades, a razão entre hidrogênio e monóxido de carbono no syngas ou gás produtor pode ser ajustada através da reação de comutação entre água e gás e/ou captura de carbono, antes de o gás ser entregue à cultura microbiana. Em determinadas modalidades, os compostos C1 são gerados através de reformação de vapor de metano de metano ou gás natural, e particularmente gás natural ocioso, ou gás natural que seria, de outro modo, queimado ou liberado para a atmosfera ou biogás ou gás de aterro e fornecido como um syngas e/ou gás produtor ou vapor de líquido dos compostos C1 à cultura de microrganismos, em que em determinadas modalidades, a razão entre hidrogênio e monóxido de carbono no syngas ou gás produtor pode ser ajustada através da reação de comutação entre água e gás e/ou captura de carbono, antes de o gás ser entregue à cultura microbiana.
[0318] Os doadores de elétrons em determinadas modalidades também pode ser oriundos ou refinados a partir de poluentes ou produtos residuais incluindo, porém sem limitação, um ou mais dentre o seguinte: gás de processo; gás de saída; gás de respiradouro de recuperação de óleo intensificado; gás natural ocioso; biogás; gás de aterro; e gases ácidos. Em determinadas modalidades, um gás de saída que contém H2 e/ou CPU e/ou CO é usado como uma fonte de doador de elétrons e/ou carbono. Em determinadas modalidades gases residuais de uma refinaria de óleo são usados como uma fonte de doadores de elétrons e/ou carbono.
PRODUTOS [0319] Em algumas modalidades, os microrganismos descritos no presente documento produzem pelo menos 1 mg de produto à base de carbono de interesse por litro de suspensão de cultura líquida. Em alguns exemplos, o produto é secretado pelo microrganismo no meio de cultura. Em outros exemplos, o produto é retido no microrganismo no curso de fermentação. Em alguns casos, o produto pode ser recuperado lisando-se as células e
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111/229 separando-se o produto. Em outros casos, o produto pode ter valor comercial no microrganismo intacto sem preparação ou purificação significativa do produto do microrganismo.
[0320] Em determinadas modalidades, a separação de massa celular da suspensão líquida é realizada. Em determinadas modalidades, essa separação é realizada por é realizada por métodos conhecidos na técnica de cultura microbiana. Os exemplos de técnicas de colheita de massa celular são fornecidos, por exemplo, no Pedido de Patente n° W008/00558; Patente n° U.S. 5.807.722; Patente n° U.S. 5.593.886; e Patente n° U.S. 5.821.111. A separação pode ser realizada por um ou mais métodos incluindo, porém sem limitação: centrifugação; floculação; flutuação; filtração com o uso de um sistema membranoso, de fibra oca, de enrolamento em espiral ou de filtro cerâmico; filtração a vácuo; filtração de fluxo tangencial; clareamento; decantação; hidrociclone. Em determinadas modalidades em que a massa celular pode ser imobilizada em uma matriz, a mesma pode ser colhida por métodos incluindo, porém sem limitação, sedimentação ou filtração por gravidade e separado do substrato de crescimento raspando-se ou forças de cisalhamento líquido.
[0321] Em determinadas modalidades, a sobra de líquido em seguida da remoção de massa celular pode ser bombeada para um sistema para remoção e/ou recuperação de produtos químicos dissolvidos do bioprocesso e/ou nutrientes reagidos. Em determinadas modalidades, os nutrientes e/ou água não reagidos são recuperados e reciclados o quanto possível e/ou em determinadas modalidades vendidos como um coproduto e/ou apropriadamente livre do mesmo. Em determinadas modalidades, a remoção de produtos e/ou contaminantes residuais e/ou quaisquer compostos inibidores e/ou deletérios, com o uso de métodos e tecnologias conhecidas na técnica, é realizada antes de retornar água e/ou nutrientes não reagidos ao biorreator/biorreatores.
[0322] Em determinadas modalidades, moléculas
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112/229 orgânicas livres e/ou dissolvidas podem ser liberadas na solução de corrente de processo dos microrganismos através dos métodos incluindo, porém sem limitação, excreção de celular ou secreção ou lise celular.
[0323] Em determinadas modalidades, a recuperação e/ou reciclagem de produtos químicos e/ou nutrientes não reagidos da solução aquosa podem ser realizados com o uso de equipamentos e técnicas conhecidos na técnica de engenharia de processo e direcionados para os produtos químicos de modalidades particulares, incluindo porém sem limitação: extração de solvente; extração de água; destilação; destilação fracionária; cimentação; precipitação química; absorção de solução alcalina; absorção ou adsorção em carbono ativado, resina de troca de íons ou peneira molecular; modificação do pH solução e/ou potencial de redução por oxidação; evaporadores; cristalizadores fracionários; separadores sólido/líquido; nanofiltração; osmose reversa; e todas as combinações dos mesmos.
[0324] Em determinadas modalidades, os produtos químicos e/ou nutrientes não reagidos fluem no ambiente que sustenta o crescimento de outros organismos. Em determinadas modalidades, a água efluente e nutrientes não reagidos são usados para irrigar e fertilizar plantas mais altas e/ou algas marinhas e/ou algas e/ou para alimentar organismos heterotróficos, tais como fungos, levedura e/ou bactérias. Em determinadas modalidades, os nutrientes inorgânicos do efluente de biorreator funcionam como um fertilizante inorgânico que pode aumentar a produção primária de uma lagoa e/ou outros confinamentos usados em aquicultura e/ou hidropônicos.
[0325] A alta taxa de crescimento obtenível por determinadas espécies quimioautotróficas permitem que sejam compatíveis ou ultrapassem as taxas mais altas de fixação de carbono e/ou produção de biomassa por unidade autônoma de biomassa que pode ser obtida por micróbios fotossintéticos. Em determinadas modalidades, a biomassa excedente pode ser produzida. Em determinadas modalidades, o crescimento excedente de massa celular pode ser removido do sistema a fim de produzir um produto de biomassa.
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Em algumas modalidades, o crescimento excedente de massa celular pode ser removido do sistema a fim de manter uma população microbiana desejável (por exemplo, desejável) e densidade de célula na cultura microbiana para altas taxas de captura e fixação de carbono e/ou taxas de conversão de matéria-prima.
[0326] A fim auxiliar no processamento do produto de biomassa em produtos de biomassa, células microbianas colhidas em determinadas modalidades podem ser rompidas até abertura com o uso de métodos bem conhecidos incluindo, porém sem limitação, um ou mais dentre o seguinte: moagem em esfera, pressão de cavitação, sonicação, homogeneização ou cisalhamento mecânico.
[0327] A biomassa colhida em algumas modalidades pode ser seca em uma etapa ou etapas de processo. A secagem de biomassa pode ser realizada em determinadas modalidades com o uso de tecnologias bem conhecidas, incluindo porém sem limitação, um ou mais dentre o seguinte: centrifugação, secagem em tambor, evaporação, liofilização, aquecimento, secagem por aspersão, secagem por aspersão e/ou filtração a vácuo. Em determinadas modalidades, o calor residual pode ser usado na secagem da biomassa. Em determinadas modalidades, calor residual da fonte industrial do gás de queima usado como uma fonte de carbono pode ser usado na secagem da biomassa. Em determinadas modalidades, o coproduto de calor da geração de doadores de elétrons e/ou fonte de carbono C1, conforme discutido acima pode ser usado para secar a biomassa.
[0328] Em uma modalidade exemplificativa, porém não limitativa, um biorreator que contém meio de nutriente é inoculado com células de produção; geralmente, estas seguirão uma fase de atraso antes que as células comecem a duplicar. Após a fase de atraso, o tempo de duplicação de célula diminui, e a cultura passa para fase logarítmica. A fase logarítmica é seguida eventualmente por um aumento do tempo de duplicação que, embora não haja intenção de limitação teórica, é considerado como resultante ou de uma depleção de nutrientes incluindo gases dissolvidos, fonte de nitrogênio ou fontes
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114/229 minerais ou um aumento na concentração de produtos químicos inibidores ou captação de quórum pelos micróbios. Em determinados casos, e particularmente, em bioprocessos aeróbicos, uma fase de crescimento prolongado linear ou aritmético pode seguir a fase logarítmica, antes do início da fase estacionária. Esse fase de crescimento aritmético é característica da limitação de O2. A fim de colher massa celular, a cultura em determinadas modalidades é colhida tare na fase logarítmica ou durante a fase aritmética ou na fase estacionária. Em algumas modalidades, as células são colhidas na fase logarítmica. O acúmulo de armazenamento de carbono, tais como lipídeos ou PHB pode ser acionado geralmente pela depleção da fonte de nitrogênio ou outro nutriente-chave, com exceção da fonte de carbono ou de elétron (por exemplo, hidrogênio). Isso sinaliza as células para armazenar carbono reduzido produzido a partir das fontes de carbono e de energia excessivas.
[0329] Em uma modalidade exemplificativa, porém não limitativa, um vaso de cultura fechada é usado e hidrogênio, oxigênio e CO2 são fornecidos sob pressão ao vaso na base do volume de trabalho de líquido; o fluxo de gases até a câmara é controlado por sensores de gás a fim de manter concentrações fixas de H2, O2 e CO2 na folga de fechamento da câmara; os gases e meio de cultura são misturados por agitação mecânica no vaso a fim de minimizar a difusão de gás no líquido; os gases hidrogênio e oxigênio são fornecidos por uma célula de eletrólise de água e o CO2 é capturado a partir de uma fonte residual ou de um ar de cabine ou de uma fonte pontual normalmente emitida na atmosfera; o vapor do processo fluir do vaso de cultura até uma unidade de colheita de proteína e/ou de biomassa proteinácea; uma ação centrífuga é usada para separar os sólidos do líquido; o líquido separado flui até uma unidade de recuperação de água; quaisquer substâncias indesejáveis que podem, de outro modo, se acumular no sistema são removidas na unidade de recuperação de água; a água recuperada é reutilizada na célula de eletrólise de água; a formação do nutriente é fornecida ao vaso de cultura para manter uma composição de meio de cultura direcionada; em determinadas modalidades,
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115/229 urina é fornecida como uma das fonte de nutrientes; a biomassa desidratada recuperada é processada adicionalmente em nutrientes e/ou fertilizante e/ou ingredientes e/ou alimento. Em determinadas modalidades, os gases não utilizados que borbulham na folga de fechamento de biorreator são recirculados de volta para a base do volume de trabalho de líquido e introduzidos de volta na mesma no volume de trabalho de líquido. Em determinadas outras modalidades, a folga de fechamento do biorreator é alimentada diretamente com H2 e/ou CO2 recentemente inseridos, e não na base do volume de trabalho e, em seguida, esses gases são recirculam junto de outros na folga de fechamento através do sistema de recirculação, até a base do volume de trabalho de líquido, onde os gases são dissolvidos e/ou borbulhados no volume de trabalho de líquido.
[0330] Em determinadas modalidades, a biomassa é processada adicionalmente em seguida da secagem ou, sem uma etapa anterior de secagem a fim de auxiliar a separação e produção de produtos bioquímicos úteis. Em determinadas modalidades, esse processamento adicional envolve a separação do teor de proteína ou de lipídeo teor ou vitaminas ou outros produtos bioquímicos direcionados da biomassa microbiana. Em determinadas modalidades, a separação dos lipídeos pode ser realizada com o uso de solventes não polares a fim de extrair os lipídeos, tais como, porém sem limitação um ou mais dentre: hexano, ciclo-hexano, éter etílico, álcool (isopropanol, etanol etc.), fosfato de tributila, dióxido de carbono supercrítico, óxido de trioctilfosfina, aminas secundárias e terciárias ou propano. Em determinadas modalidades, outros produtos bioquímicos úteis podem ser extraídos com o uso de solventes, incluindo, porém sem limitação, um ou mais dentre: clorofórmio, acetona, acetato de etila e tetracloroetileno. Em determinadas modalidades, a lise celular é realizada.
[0331] Em algumas modalidades, os métodos são fornecidos para produzir aminoácidos e/ou proteínas e/ou vitaminas combinando-se, em um biorreator ou solução, uma ou mais vias biossintéticas incluindo, porém sem limitação, uma via biossintética de aminoácido, uma via
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116/229 biossintética de vitamina, um gás que contém carbono e um microrganismo modificado ou natural que converte um gás que contém carbono, tal como syngas, gás produtor, gás natural, biogás, CO2, monóxido de carbono e misturas dos mesmos contendo gás hidrogênio; e/ou compostos C1, gasoso ou líquidos ou, incluindo porém sem limitação metanol ou metano, em aminoácidos e/ou proteínas e/ou vitaminas. Em algumas modalidades, os aminoácidos e/ou proteínas e/ou vitaminas estão incluídos em um ou mais dentre um fertilizante, bioestimulante, biofertilizante, meios de nutriente microbiano, potencializador de crescimento de cogumelo, uma formulação de alimentação animal, e/ou produto de alimento humano, com o uso de processos conhecidos na técnica e ciência da química, engenharia química, microbiologia, agronomia e/ou ciência de alimentos. Em algumas modalidades não limitativas, o microrganismo é Cupriavidus necator DSM 531 ou DSM 541. Em algumas modalidades não limitativas, a vitamina é uma vitamina B e, mais particularmente, vitaminas B1, B2 e/ou B12.
[0332] Em determinadas modalidades, são fornecidos os métodos para produzir um ou mais aminoácidos que compreendem expor uma célula bacteriana e/ou célula de arquea e/ou outra célula microbiana ao syngas e/ou gás produtor e/ou CO2 gasoso e/ou gás natural e/ou biogás e/ou a mistura de CO2 gasoso e/ou H2 gasoso e/ou CO e/ou CPU (por exemplo, PI2 e CO2 e/ou CO e/ou CPU); em que a célula microbiana tem capacidade para fixar CO2 gasoso e/ou outras fontes de carbono C1 em um ou mais aminoácidos e/ou proteína e/ou vitaminas; em que os compostos são recuperados do biorreator e um segundo reator adicional, ou mais reatores, são alimentados com os mesmos em que os compostos são pós-processados para gerar produtos incluindo, porém sem limitação, um ou mais dentre o seguinte: fertilizante, bioestimulante, biofertilizante, potencializador de crescimento de cogumelo, alimentação de aquicultura, alimentação animal, ingredientes de alimento, nutrição humana (por exemplo, suplemento alimentar ou nutricional) ou vitaminas. Em algumas modalidades, a composição compreende uma célula bacteriana, sendo que as
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117/229 bactérias são escolhidas a partir do gênero Rhodococcus. Em determinadas modalidades, as células bacterianas são Rhodococcus opacus (DSM 43205 ou 43206 ou 44193) ou Rhodococcus sp (DSM 3346). Em algumas modalidades, a célula bacteriana é escolhida a partir do gênero Ralstonia ou Cupriavidus. Em algumas modalidades, a célula bacteriana é Cupriavidus necator ou Cupriavidus metallidurans. Em algumas modalidades, a célula bacteriana é da subordem corynebacterineae ou da família burkholderiaceae.
[0333] Em uma modalidade, é utilizado um microrganismo do tipo selvagem ou modificado que tem capacidade para ser cultivado sob syngas e/ou uma mistura de H2 e/ou CO2, e/ou CO e/ou CPU (por exemplo, PI2 e CO2 e/ou CO, e/ou CPU) e/ou outros gases residuais e tem capacidade para produzir aminoácidos incluindo, porém sem limitação lisina.
[0334] Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para fabricar um ou mais aminoácidos, peptídeos, proteínas, vitaminas ou outros nutrientes que compreendem (a) cultivar uma célula descrita no presente documento em um vaso de reação ou biorreator na presença de syngas e/ou gás produtor e/ou gás natural e/ou biogás e/ou a mistura de CO2 gasoso e/ou PI2 gasoso e/ou CO e/ou CPU (por exemplo, PI2 e CO2, e/ou CO e/ou CPU), em que a célula produz e/ou secreta um ou mais aminoácidos, ou proteínas, ou outros nutrientes em uma quantidade igual ou maior que pelo menos 10% da massa celular seca total da célula; e (b) separar o um ou mais aminoácidos, peptídeos, proteínas, vitaminas ou outros nutrientes e/ou um produto celular inteiro do vaso de reação (por exemplo, separar do meio de cultura no vaso de reação).
[0335] Em algumas modalidades, o um ou mais aminoácidos ou proteínas ou outros nutrientes ou produtos completos de célula produzidos em um método descrito no presente documento são usados com uma proteína e/ou fonte de nutrientes alternativa ou não convencional. Em algumas modalidades, 0 um ou mais aminoácidos ou proteínas ou outros nutrientes ou produtos completos de célula produzidos em um método, conforme descrito no
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118/229 presente documento, são componentes ou precursores a ou estão incluídos em um fornecimento de alimentação ou de nutrientes provido a outro organismo. Em determinadas modalidades não limitativas esse outro tipo de organismo que consome o dito nutriente é um ou mais dentre o seguinte: bactérias, arquea, levedura, microalgas, algas marinhas, kelp, zooplâncton, fungo, cogumelo, planta, marisco ou outros inveteráveis, peixe, peixes ou mamíferos.
[0336] Em determinadas modalidades não limitativas, a biomassa proteinácea produzida, conforme descrito no presente documento, é usada como uma fonte de proteína alternativa. Em determinadas modalidades, é usada como um reabastecimento para farelo de peixe e/ou caseína e/ou soro e/ou farelo se soja. Em determinadas modalidades não limitativas, os produtos de proteína não são deficientes em lisina e/ou metionina. Em determinadas modalidades, aminoácidos, peptídeos e/ou proteínas produzidos conforme descrito no presente documento são usados em fertilizante, bioestimulante, biofertilizante, potencializador de crescimento de cogumelo, formulações de alimentação e/ou ingredientes de alimento humano no lugar de farelo de peixe, caseína, soro e/ou farelo de soja e/ou outras proteínas vegetais. Em determinadas modalidades não limitativas, os produtos de proteína não são deficientes em quaisquer aminoácidos essenciais. Em determinadas modalidades não limitativas, os produtos de proteína não são deficientes em lisina e/ou metionina. Em determinadas modalidades não limitativas, a biomassa proteinácea não contém quantidades significativas de fatores antinutricionais. Em determinadas modalidades, a biomassa proteinácea não contém quantidade significativas de um ou mais dentre o seguinte: gossipol, glicosinolatos, saponinas ou inibidores de tripsina.
[0337] Várias fontes atuais de proteína e nutrientes incluindo, porém sem limitação, farelo de peixe podem ser contaminadas com metas pesados, tais como mercúrio (Hg) e ou chumbo (Pb), assim como outros produtos químicos tóxicos e orgânicos, devido ao fato de que, por exemplo, a água da qual os peixes são colhidos está contaminada. Determinadas
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119/229 modalidades se referem a produtos de proteína com níveis especialmente baixos de contaminantes tóxicos, tais como, porém sem limitação, metal pesado e/ou orgânicos tóxicos, em comparação a fontes atuais de proteína e outros nutrientes, incluindo, porém sem limitação, farelo de peixe.
[0338] Uma fração significativa de plantas mais altas não é comestível para muitos animais diferentes, incluindo porém sem limitação, seres humanos e outros não ruminantes. Isso pode resultar em inúmeras desvantagens incluindo a canalização de energia e carbono em subprodutos indesejáveis ou produtos residuais, diminuição do rendimento de produtos desejados e adição de mais cargas para processamento de descarte de resíduos. Em determinadas modalidades, um fluxo maior de carbono e/ou energia é direcionado a produtos de biomassa direcionados para uma safra de plantas mais altas comparáveis, em termos de captura de CO2, produção de biomassa e/ou produção de proteína. Em determinadas modalidades, a razão entre fração não comestível (por exemplo, a um ser humano) versus fração comestível da biomassa produzida, conforme descrito no presente documento, é menor para uma safra de plantas mais altas comparáveis. Em determinadas modalidades, há uma quantidade inferior de desperdício de alimento para safras de plantas mais altas comparáveis.
SISTEMAS PARA BIOPRODUTO E/OU PRODUÇÃO DE BIOMASSA [0339] Determinadas modalidades não limitativas se referem a instalações de produção que têm uma área de ocupação relativamente pequena, possibilitando colocação do bioprocesso com instalações industriais que produzem CO2 e/ou outros desperdícios de carbono. Em determinadas modalidades não limitativas, essas instalações industriais incluem um ou mais dentre o seguinte: usinas de força a fóssil; refinarias de óleo; instalações de aprimoramento de areia de alcatrão; operações de perfuração de gás natural ou de petróleo; destiladores de etanol; fabricações de álcool; fabricações de alumínio, fabricações de cloro-álcali, aplicações de aço; usinas de força
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120/229 geotérmicas. Em determinadas modalidades, um modelo vertical compacto permite a colocação conveniente próxima de fontes de gás de queima industriais e calor residual associado que pode ser utilizado adicionalmente no processo de produção, incluindo, porém sem limitação, na secagem de biomassa.
[0340] As vantagens práticas adicionais são concretizadas em determinadas modalidades por meio de um sistema controlado de maneira relativamente alta e contido em comparação a alguns sistemas alternativos para captura e conversão de CO2 biológica. Em algumas modalidades, os biorreatores usados são herméticos são estanques a gás e a líquido, estruturalmente robustos, altamente isolados e isolados do ambiente externo, com parâmetros internos controlados de maneira relativamente firme (por exemplo, temperatura, pressão etc.), entradas e saídas. Esse sistema relativamente fechado protege a cultura, que em algumas modalidades compreende microrganismos de knallgas e/ou hidrogenotrófico e/ou carboxidotrófico e/ou quimioautotrófico e/ou metanotrófico, até um grau muito maior que os organismos em sistemas agrícolas ou de algas tradicionais práticos. Os sistemas agrícolas ou de algas tradicionais práticos são, por necessidade, sistemas extremamente abertos, que os organismos são expostos diretamente ao ambiente e ecossistemas circundantes. O aspecto controlado e contido de maneira relativamente alta do processo em determinadas modalidades reduz consideravelmente os riscos de contaminação ambiental, doença ou praga e riscos às ervas em comparação a sistemas agrícolas ou de algas tradicionais práticos. Em determinadas modalidades, o processo é mais isolado de variáveis meteorológicas climáticas do que sistemas agrícolas ou de algas tradicionais práticos. Em determinadas modalidades, o processo tem perda em batelada e/ou variações de produtividade reduzidas em comparação a sistemas agrícolas ou de algas tradicionais práticos.
[0341] Devido à alta contenção fornecida pelos biorreatores estanques a gás e líquidos em determinadas modalidades e controle rígido sobre entradas e saídas, a reciclagem em água e nutriente em
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121/229 determinadas modalidades é consideravelmente facilitada. Em determinadas modalidades, a reciclagem de água é obtida adicionando-se as unidades apropriadas a jusante das saídas de biorreator incluindo, porém sem limitação, condensadores. Tais tipos de equipamento e métodos são bem conhecidos na técnica e ciência de reciclagem e recuperação de água. Em determinadas modalidades, as perdas evaporativas e/ou esgotamento de água e/ou esgotamento de nutriente e/ou contaminação de água do solo e vias fluviais circundantes são impedidas até um grau maior do que sistemas agrícolas ou de algas tradicionais práticos. Em contrapartida, sistemas agrícolas ou de algas abertos têm alta perdas evaporativas de água e estão propensos a esgotamento agrícola, o que causa desperdício de fertilizante e água; eutroficação de lagos e vias fluviais; e até mesmo o surgimento de “zonas ociosas” (corpos de água altamente depletados de O2). Plantas mais altas perdem água por transpiração. Em determinadas modalidades, não há perda de água por transpiração. Sistemas agrícolas ou de algas tradicionais abertos também apresentam um alto risco para que um organismo não nativo “escape” no ambiente e contaminação cruzada genética. Em determinadas modalidades, há um risco de o organismo não nativo “escapar” no ambiente circundante ou contaminação cruzada genética inferior a sistemas agrícolas ou de algas tradicionais abertos. Em determinadas modalidades, não há uso de pesticidas, herbicidas ou antibióticos no bioprocesso. Determinadas modalidades representam um novo tipo de agricultura em que os organismos quimioautotróficos substituem plantas fotossintéticas, algas ou microrganismos; ou fungos, bactérias ou animais heterotróficos; na produção de produtos com base biológica. Em determinadas modalidades, esses produtos com base biológica suplementam, aumentam, substituem ou expandem os produtos de agricultura convencional e/ou criação de gado.
[0342] A otimização da produção de proteína e o direcionamento de distribuições de aminoácido específica podem ser obtidos por controle de condições de biorreator e/ou níveis de nutrientes e/ou através de
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122/229 modificações genéticas das células. Em algumas modalidades, a produção de proteína e distribuição das moléculas de aminoácido produzidas é otimizada através de um ou mais dentre o seguinte: controle de condições de biorreator, controle de níveis de nutrientes, modificações genéticas das células. Em determinadas modalidades, vias até os aminoácidos, proteínas, vitaminas e/ou outros nutrientes e/ ou regiões separadas de maneira mais geralmente especial de um sistema de biorreator que são aeróbicos e anaeróbicos. A biossíntese dos aminoácidos ou proteínas ou outros nutrientes, produtos completos de célula pelos micróbios revelados no presente documento pode ocorrer durante a fase logarítmica, fase linear ou após isso durante a fase estacionária quando a duplicação celular tiver parado, desde haja fornecimento o suficiente de carbono e energia e outras fontes de nutriente.
[0343] O uso de microrganismos quimioautototróficos para a produção de proteínas, aminoácidos e outros nutrientes de matériasprimas gasosas que compreendem H2 e/ou CO2 e/ou CO e/ou Chh é descrito, por exemplo, no Pedido de Patente Internacional recebido em 18 de março 2017 sob o na PCT/US17/23110 e intitulado MICROORGANISMS AND ARTIFICIAL ECOSYSTEMS FOR THE PRODUCTION OF PROTEIN, FOOD AND USEFUL CO-PRODUCTS FROM C1 SUBSTRATES. Esse pedido é incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade qualquer fim.
[0344] A engenharia de microrganismos de knallgas é descrita, por exemplo, no Pedido de Patente Número de Série 13/623.089, depositado em 19 de setembro de 2012 e intitulado “INDUSTRIAL FATTY ACID ENGINEERING GENERAL SYSTEM FOR MODIFYING FATTY ACIDS”. Esse pedido é incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade qualquer fim.
[0345] O uso de microrganismos de knallgas para a conversão de syngas, gás produtor ou outras misturas que contêm gás H2 e CO2 e/ou CO em moléculas de número de cadeia de carbono médio a alto ou anabólicas é descrito, por exemplo, em um pedido de patente depositado no
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Escritório de Patentes e de Marcas Registradas dos Estados Unidos no dia 26 de outubro de 2012 sob o número 13/643.872 e intitulado USE OF OXYHYDROGEN MICROORGANISMS FOR NON-PHOTOSYNTHETIC CARBON CAPTURE AND CONVERSION OF INORGANIC AND/OR C1 CARBON SOURCES INTO USEFUL ORGANIC COMPOUNDS. Esse pedido é incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade qualquer fim.
[0346] O uso de microrganismos quimiotróficos para a conversão de CO2 em produtos químicos orgânicos úteis é descrito, por exemplo, no Pedido PCT n° PCT/US2010/001402, depositado em 05/12/2010 e intitulado BIOLOGICAL AND CHEMICAL PROCESS UTILIZING CHEMOAUTOTROPHIC MICROORGANISMS FOR THE CHEMOSYTHETIC FIXATION OF CARBON DIOXIDE AND/OR OTHER INORGANIC CARBON SOURCES INTO ORGANIC COMPOUNDS, AND THE GENERATION OF ADDITIONAL USEFUL PRODUCTS. Esse pedido é incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade qualquer fim.
[0347] Um recurso adicional de algumas modalidades inclui modificar microrganismos descritos no presente documento através de procedimentos artificiais incluindo, porém sem limitação mutagênese acelerada (por exemplo, com o uso de tratamentos leves ou químicos ultravioletas), engenharia ou modificação genética, hibridização, biologia sintética ou melhoria seletiva tradicional. As modificações possíveis dos microrganismos incluem, porém sem limitação, aquelas direcionadas a produzir quantidade adequada e/ou qualidade de aminoácidos e/ou proteína e/ou enzimas e/ou vitaminas.
[0348] Em determinadas modalidades, são utilizadas as cepas bacterianas quimiotróficas que compreendem uma ou mais sequências de ácidos nucleicos exógenos. Os produtos bioquímicos sintetizados pelos microrganismos descritos no presente documento podem ser aplicados a usos incluindo, porém sem limitação, substitutos petroquímicos, monômeros, matériaprima para a produção de polímeros, lubrificantes, como ingredientes em
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124/229 fertilizantes, alimentação animal, alimentos, cuidados pessoas e produtos cosméticos. Em algumas modalidades, processos enzimáticos e químicos podem ser utilizados para produzir vitaminas, aminoácidos e/ou proteínas. Algumas modalidades possibilitam a produção de fertilizantes, bioestimulantes ou alimentações de animal. Além disso, os métodos são fornecidos para cultivar e/ou modificar bactérias quimiotróficas para rendimento aprimorado de aminoácido e/ou proteína e/ou vitamina e/ou custos de produção inferiores. Em algumas modalidades, um microrganismo modificado geneticamente (por exemplo, bactéria) produz mais de um determinado tipo ou tipos de vitamina ou aminoácido molécula ou proteína ou enzima em comparação ao mesmo microrganismo que não é modificado geneticamente.
[0349] Os exemplos específicos de biorreatores, condições de cultura, crescimento heterotrófico e quimiotrófico, manutenção e métodos de produção para aminoácidos, proteínas, vitaminas, outros nutrientes e/ou produtos completos de célula, descritos no presente documento, podem ser combinados de qualquer maneira adequada a fim de aprimorar eficiências de crescimento microbiano e aminoácido, proteína, vitamina, outro nutriente, e/ou produção de célula inteira.
RECUPERAÇÃO PÓS-BIOPROCESSO DE PRODUTOS E APLICAÇÕES DE USO [0350] Em determinadas modalidades não limitativas, um bioestimulante vegetal e/ou biofertilizante e/ou fertilizante orgânico é obtido por um processo no presente documento. Determinadas modalidades compreendem adicionar pelo menos um dentre uma fermentação de aminoácido e/ou células microbianas a uma formulação vegetal bioestimulante. Em determinadas modalidades não limitativas, as células microbianas são bactérias gram-negativas e/ou gram-positivas. Em determinadas modalidades não limitativas, as células microbianas são obtidas através da conversão de fonte de carbono C1, conforme descrito no presente documento. Um objeto adicional de determinadas modalidades é fornecer um método relativamente não dispendioso
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125/229 para preparar uma bioestimulante e/ou fertilizante e/ou nutrientes de matériasprimas residuais e/ou de baixo custo. Em determinadas modalidades, os aminoácidos e/ou oligopeptídeos e/ou peptídeos de baixo peso molecular são produzidos a partir de matérias-primas residuais e/ou de baixo custo incluindo, porém sem limitação, fontes de carbono C1. Em determinadas modalidades, os nutrientes produzidos a partir de matérias-primas residuais e/ou de baixo custo, incluindo, porém sem limitação, fontes de carbono C1, são facilmente absorvidos e assimilados por plantas, através das folhas e/ou as raízes. Em determinadas modalidades, os nutrientes absorvidos são transportados para os órgãos da planta, tais como brotos, flores ou frutos, por exemplo (Gjalakshimi et al. (2004) Bioresource Technology (92):291 a 296; Parrado et al. (2008) Bioresource Technology 99:2.312 a 2.318). Em determinadas modalidades, os aminoácidos e/ou oligopeptídeos e/ou peptídeos de baixo peso molecular podem ser usados por uma planta para desenvolver suas próprias proteínas. Em determinadas modalidades, isso poupa energia metabólica que, de outro modo, seria gasta em um ou mais dentre os processos metabólicos que consomem energia dentro da planta (Higgings, C.F., Payne, J.W. (1982) Plant peptides. In: Boulder, D., Parthier, B.,(Eds). Encyclopedia of Plant Physiology, 14A. Springer. 438 a 458). Em determinadas modalidades, os nutrientes produzidos, conforme descrito no presente documento podem ser usados por microfauna no ambiente edáfico, incluindo, porém sem limitação, como um carbono e/ou fonte de nitrogênio. Em determinadas modalidades, a microfauna converte nutrientes em formas benéficas para crescimento e atividade da planta. De igual modo, os aminoácidos, oligopeptídeos, peptídeos de baixo peso molecular e outros nutrientes produzidos, conforme descrito no presente documento, também estão absorvidos prontamente e assimilados por animais quando incorporados na dieta dos mesmos.
[0351] Em determinadas modalidades, as células microbianas são obtidas como um subproduto de um processo industrial que gera massa de célula microbiana. Por exemplo, o processo industrial pode ser
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126/229 selecionado a partir da produção de aminoácidos, etanol, outros álcoois, ácidos orgânicos, lipídeos e/ou hidrocarbonetos, e/ou tratamento de água residual. Em determinadas modalidades não limitativas, as células são fornecidas em meios gastos da produção de pelo menos um aminoácido, por exemplo, selecionado a partir de lisina, treonina, triptofano, ácido glutâmico, arginina, histidina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, valina, glicina, serina, cisteína, tirosina, alanina, ácido aspártico, prolina, asparagina e/ou glutamina.
[0352] Em Aquicultura Multitrófica Integrada, diversas espécies são elevadas de maneira que permita que um subproduto da espécie seja reciclado como alimentação para outras espécies. Em agricultura (especialmente, hidropônico) e aquicultura integradas, lagoas ou sistemas de recirculação são usados para elevar tanto frutos do mar quanto outros organismos (por exemplo, peixe e alface). Em determinadas modalidades, a proteína e/ou outros nutrientes produzidos, conforme descrito no presente documento, são usados em técnicas e tecnologias para a elevação de alface e/ou peixe dentro um ou mais dentre o seguinte: sistemas de recirculação; aquicultura multitrófica integrada; agricultura e aquicultura integrada.
[0353] Em algumas modalidades, biorreatores compreendem um microrganismo que compreende pelo menos uma sequência de ácido nucleicos endógenos ou exógenos que codifica uma enzima de via para um aminoácido, ou proteína, vitamina outro nutriente de interesse. Em algumas modalidades, o sistema compreende dois ou mais, três ou mais ou quatro ou mais biorreatores, dentre os quais pelo menos um compreende um microrganismo, que compreende pelo menos uma sequência de ácido nucleicos exógenos ou endógenos que codifica uma enzima de via para um aminoácido ou proteína ou vitamina ou outro nutriente de interesse. Em algumas modalidades, o sistema de biorreatores compreende pelo menos a primeiro e segundo reatores, em que o primeiro biorreator compreende um microrganismo, que compreende pelo menos uma sequência de ácido nucleicos exógenos ou endógenos que codifica uma enzima de via a um aminoácido ou proteína ou
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127/229 vitamina ou outro nutriente de interesse; e em que o segundo biorreator compreende um microrganismo derivado de uma espécie diferente, em que o microrganismo de uma espécie diferente pode compreender pelo menos uma sequência de ácido nucleicos exógenos. Em algumas modalidades, o sistema de biorreatores compreende um primeiro biorreator que compreende um microrganismo, conforme descrito no presente documento, e um segundo biorreator que compreende um zooplâncton, fungos, microalgas, levedura ou célula bacteriana. Em algumas modalidades, o sistema compreende um primeiro biorreator que compreende um microrganismo, conforme descrito no presente documento, e um segundo tanque ou vaso que compreende um animal multicelular e/ou um sistema de aquicultura e/ou hidropônico.
[0354] Em determinadas modalidades não limitativas, os microrganismos descritos no presente documento são mantidos em uma relação simbiótica e/ou uma relação trófica com outros organismos vivos. Um exemplo de tal relação é ilustrada na Figura 23.
[0355] Em determinadas modalidades, a recuperação de produtos químicos biossintéticos e/ou nutrientes gastos da solução aquosa de caldo pode realizada com o uso de equipamento e técnicas conhecido na técnica do engenharia de processo e direcionado aos produtos químicos de modalidades particulares descritos no presente documento, incluindo, porém sem limitação: extração de solvente; extração de água; destilação; destilação fracionária; cimentação; precipitação química; absorção de solução alcalina; absorção ou adsorção em carbono ativado, resina de troca de íons ou peneira molecular; modificação da solução de pH e/ou potencial de redução por oxidação, evaporadores, cristalizadores fracionários, separadores sólido/líquido, nanofiltração e todas as combinações dos mesmos.
[0356] Em algumas modalidades, a biomassa produzida conforme descrito no presente documento é convertida em uma alta proteína e/ou alta vitamina e/ou alto produto de nutriente para fertilizante, bioestimulante, biofertilizante, potencializador de crescimento de cogumelo,
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128/229 alimentação animal e/ou aplicação de nutrição humana, com o uso de métodos e processos bem conhecidos na técnica e ciência de química, engenharia química e/ou ciência de alimentos.
[0357] Em determinadas modalidades, a biomassa produzida, conforme descrito no presente documento, é usada como um nutriente de alimentação suplementar. Em determinadas modalidades, a biomassa é usada como um material de fertilizante orgânico para restaurar propriedades químicas e microbianas em sólidos e/ou para aumentar produtividade da safra.
[0358] Em algumas modalidades, mais de 90% do nitrogênio dos aminoácidos e/ou peptídeos e/ou proteína produzidos pelos microrganismos são absorvidos subsequentemente por outros microrganismos, plantas, fungos, animal ou pessoas que consomem os aminoácidos e/ou peptídeos e/ou proteínas e/ou biomassa proteinácea produzidos conforme descrito no presente documento. Em algumas modalidades, as células microbianas são submetidas à ebulição antes da alimentação para outro organismo. Em outras modalidades, as células são sonicadas ou, de outro modo lisadas, ou rompidas antes da alimentação para outro organismo.
[0359] Em determinadas modalidades, as formulações são produzidas combinando biomassa de um ou mais dentre os seguintes grupos: cepas de alta proteína; cepas de alto teor de óleo/gordura; cepas de alto teor de carboidrato/polissacarídeo. Em determinadas modalidades, a formulação resultante tem um equilíbrio de proteína, óleos e gordura e carboidratos para a direta de exigências nutricionais de outro organismo mais apropriado que qualquer subgrupo de coleta da cepa utilizada sozinha.
[0360] Em determinadas modalidades, a biomassa recuperada do biorreator é lavada com água, e em determinadas modalidades álcali diluído pode ser incorporado na lavagem para remover corpos aderente de cor e gosto. Em determinadas modalidades, há uma etapa de pasteurização. Em determinadas modalidades, a pasteurização ocorre em cerca de 104,44 °C (220
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129/229 °F) durante cinco minutos. Em algumas modalidades, as células microbianas são submetidas à ebulição antes da fertilização ou alimentação para outro organismo.
[0361 ] A fim de auxiliar no processamento do produto de biomassa em produtos úteis, as células microbianas colhidas em determinadas modalidades podem ser rompidas até abertura com o uso de métodos bem conhecidos incluindo, porém sem limitação, um ou mais dentre o seguinte: moagem em esfera, pressão por cavitação, sonicação, cisalhamento mecânico, homogeneização de alta pressão, areia ou moinho coloidal, ciclos repetidos de congelamento-degelo, enzimas líticas. Em algumas modalidades, as células são submetidas a um ou mais dentre o seguinte: moagem em esfera, pressão por cavitação, sonicação, cisalhamento mecânico, homogeneização de alta pressão, areia ou moinho coloidal, ciclos repetidos de congelamento-degelo, enzimas líticas antes de fertilização ou da alimentação de outro organismo.
[0362] A maioria das proteínas e outras biomoléculas grandes são encontradas na célula e, em determinadas modalidades, essas biomoléculas são extraídas do ambiente intracelular [Doelle, H. W. Microbial Process Development (World Scientific, 1994). URL https://books.google.com/books?id=_qDabLa-OukC.]. Algumas proteínas estão associadas estruturalmente a partes insolúveis da célula, incluindo membranas internas e/ou ultraestrutura. Muitas vezes, a recuperação desses produtos exige primeiramente que a célula seja rompida ou quebrada. Em algumas modalidades, as células são rompidas ou quebradas. Pode haver muitos métodos para rompimento celular e tipos de célula particulares podem ser mais bem adequados a um ou mais dos mesmos. Os microrganismos (por exemplo, bactérias) varam de bastante frágeis até altamente resilientes. Em determinadas modalidades, um método de rompimento de célula conhecido por uma pessoa versada na técnica por ser bem adequado a um tipo de célula particular é utilizado para quebrar até abertura as células produzidas, conforme descrito no presente documento.
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130/229 [0363] Os homogeneizadores ou prensas são um dispositivo comum usado para lisar microrganismos, tais como bactérias. As prensas lisam células pressurizando-se a suspensão de célula e liberando repentinamente a pressão. Isso cria uma capacidade de cisalhamento líquido para lisar células. Em determinadas modalidades, um homogeneizador por pressão é usado pelo processo de rompimento de célula. A prensa de célula de por pressão French, ou prensa French, é um aparelho usado para romper a membrana de plasma de células passando-se as mesmas através de uma válvula estreita sob alta pressão. O Homogeneizador Gaulin é uma máquina usada para criar emulsões estáveis e dispersões em muitas indústrias incluindo alimentícia de laticínios, farmacêuticas, petrolífera e química. As pressões típicas de operação para a prensa French e homogeneizador Manton-Gaulin são 41,37 a 68,95 MPa (6.000 a 10.000 psi). São necessárias geralmente múltiplas passadas (por exemplo, ~2 a 3) para obter a lise adequada. As pressões altas de operação, no entanto, resultando em uma elevação em temperaturas operacionais. Portanto, as células de pressão são muitas vezes resfriadas (por exemplo, ~4 °C) antes de usar. A prensa de Hughes força uma suspensa congelada de células em uma lacuna pequena em uma câmara de recebimento a pressões de 70 a 550 MPa (700 a 5.500 bar). As larguras de fenda até 25 pm podem ser usadas. A Prensa X é uma a modificação da Prensa Hughes pelo fato de que também trabalha em células congeladas. Nesse caso, as células são passadas através de um furo cilíndrico em um disco. Uma disposição de êmbolo dupla permite que as células sejam passadas para frente e para trás diversas vezes a fim de aumentar os danos à célula. As prensas X operam acima de 200 a 600 MPa (2.000 a 6.000 bar).
[0364] Em determinadas modalidades, um ou mais dentre os homogeneizadores ou prensas são usados para rompimento de célula: Gaulin; Manton-Gaulin; French; Chaikoff; Hughes; prensa X; e/ou Fracionador Sorvall-Ribi. O Fracionador Sorvall-Ribi é uma modificação ou a Prensa French na qual a válvula de agulha tem facilidade para ser resfriada com nitrogênio frio.
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Em determinadas modalidades, as células são submetidas a uma pressão maior que 100 Mpa (1.000 bar) ou maior que 170 Mpa (1.700 bar) ou maior que 240 Mpa (2.400 bar) em um fracionador Sorvall-Ribi. Alguns homogeneizadores mais modernos são muitas vezes contínuos e podem ser operados em pressões maiores do que modelos mais antigos. Relata-se que um Avestin Emulsiflex-C5 é lisa eficientemente células de E. coli células em uma passagem a 100 Mpa (15.000 psi). Em determinadas modalidades não limitativas, um Avestin Emulsiflex-C5 é usado para lisar células. Em determinadas modalidades não limitativas, a lise celular é realizada em uma única passagem através de um homogeneizador. Em determinadas modalidades não limitativas, as células são expostas a cerca de 1500 Mpa (15.000 psi) ou mais em um homogeneizador. Em determinadas modalidades não limitativas, a homogeneização ocorre sob as seguintes condições: pressão 34,7 a 103,42 Mpa (5000 a 15.000 psig); 1 a 5 passadas através do homogeneizador; temperatura 0 a 50 °C (32 °F a 122 °F); pH 4,5 a 6,5.
[0365] Constatou-se que ultrassom e sonicação são uma técnica adequada para rompimento de célula de quase todo tipo de célula, com a possível exceção de fungos. As células são lisadas por cisalhamento e cavitação líquida. Um desafio é controlar a temperatura. Isso endereçado mantendo-se a suspensão em gelo e com o uso de vários pulsos (5 a 10 s) com pauses (10 a 30 s) a fim de restabelecer uma baixa temperatura. O DNA também é cisalhado durante sonicação. Em determinadas modalidades, não é necessário adicionar DNase à suspensão celular para a hidrólise de DNA. Em determinadas modalidades, o ultrassom é usado no rompimento de células bacterianas e/ou de arquea.
[0366] Em determinadas modalidades, o rompimento de célula é realizado triturando-se material celular contra superfícies sólidas. O rompimento eficiente da maioria dos tipos células foi demonstrado com moinhos de microesfera, incluindo células vegetais, de levedura e bacterianas. Sistemas de até 20 litros são disponíveis com rendimentos relatados maiores que 90%
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132/229 para rompimento de levedura com produtividades de 40 a 70 kg/h e até 80% a 200 kg/h [Doelle, H. W. Microbial Process Development (World Scientific, 1994). URL https://books.google.com/books?id=_qDabLa-0ukC.]. Em determinadas modalidades, um ou mais métodos de moagem sã usados para rompimento de célula incluindo porém sem limitação: pilão e almofariz (com ou sem pós abrasivos); homogeneizador Potter-Elvehjiem; homogeneizador Braun; moinhos de microesfera e/ou moinhos coloidais. Em determinadas modalidades um ou mais fatores são otimizados para o rompimento de célula mais eficiente e/ou econômico incluindo porém sem limitação: tempo de permanência no sistema; tamanho e densidade de microesferas, assim como quantidade e composição; velocidade de rotor; modelo de lâminas e/ou eixo geométrico de rotor; concentração de célula; viscosidade; e temperatura.
[0367] Em determinadas modalidades, métodos não mecânicos podem ser usados para lise celular, além de métodos mecânicos ou sem métodos mecânicos adicionais, que compreendem lise física e/ou química e/ou enzimática de células.
[0368] O choque osmótico ocorrer quando uma célula e suspensa em solução hipotônica; a água se difundirá na célula, forçando o mesmo para expandir e, ao final, estourar. A técnica é relativamente suave e controlável. As soluções técnicas incluem, por exemplo, glicerol 1 M, sacarose 1 M, água destilada ou simplesmente a diluição do sobrenadante. Em determinadas modalidades não limitativas, o choque osmótico é usado como parte de um processo de lise celular.
[0369] Em determinadas modalidades não limitativas, liberação de pressão é usada como parte de um processo de lise celular. Em determinadas modalidades, a suspensão celular é pressurizada sob um gás e deixada para equilibrar. A tensão de gás aumenta no caldo e no citoplasmo celular. Na liberação repentina da pressão, o gás dessorve da solução e a expansão dentro das células faz com que as mesmas explodam. Em determinadas modalidades, a suspensão celular é pressurizada em até 36 Mpa
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133/229 (60 bar). Em determinadas modalidades não limitativas, a suspensão celular é equilibrada sob 3,5 Mpa (35 bar), ou maior, de óxido nitroso por 3 minutos ou mais. Em outras modalidades não limitativas, a suspensão celular é equilibrada sob 3,5 Mpa (35 bar), ou maior, de nitrogênio por 3 minutos ou mais.
[0370] Em determinadas modalidades não limitativas, congelamento e desgelo de pressão é usada como parte de um processo de lise celular. O congelamento das células após o desgelo rompe, muitas vezes, membranas através da ação de cristais de gelo, o que perfura a célula. Em determinadas modalidades, um ou mais ciclos de congelamento-desgelo é utilizado, [0371] Em determinadas modalidades, uma combinação de congelamento e trituração é usado como parte de um processo de lise celular. Em determinadas modalidades, as células são congeladas com o uso, por exemplo, porém sem limitação, de nitrogênio líquido, e as células congeladas são, então, trituradas até um pó com o uso de uma ou mais dentre as abordagens de trituração e de moagem descritas acima. Em determinadas modalidades, são usados um almofariz e pilão que também foram resfriados com nitrogênio líquido. Em determinadas modalidades, um lisado de célula é preparado adicionando-se o dito pó triturado congelado a 5 volumes de tampão.
[0372] A secagem ou dessecação é usada comumente para romper células microbianas, o que geralmente toma as mesmas suscetíveis à ação do tampão. Em determinadas modalidades não limitativas, a secagem ou dessecação e/ou a ação de tampões é usada como parte de um processo de lise celular. Em determinadas modalidades, vácuo pode ser aplicado para agilizar o processo. Em determinadas modalidades, a liofilização pode ser empregada e, em outras modalidades, desacelerar secagem de ar. Em determinadas modalidades, a secagem com produtos químicos voláteis pode ser usada. O reagentes, tais como acetona, etanol e éter podem aprimorar a solubilidade de produto no tampão. Em determinadas modalidades não limitativas, a acetona e/ou etanol e/ou éter é usada como parte de um
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134/229 processo de lise celular.
[0373] Em determinadas modalidades não limitativas, a lisa enzimática é usada como parte de um processo de lise celular. Uma ou mais enzima (ou enzimas) podem ser usadas para lisar as paredes celulares atacando-se ligações específicas. A lise enzimática pode se basear, por exemplo, na digestão da camada de peptidoglicano de uma célula bacteriana. A enzima é geralmente perdida em cada batelada de rompimento, embora seja possível, em determinadas, situações, conjugar a enzima a uma macromolécula e recuperar a mesma por ultrafiltração. Em determinadas modalidades não limitativas, a enzima lítica (ou enzimas líticas) são conjugadas a uma macromolécula e/ou recuperada por ultrafiltração. Uma enzima comumente usada é lisozima, que é obtida a partir de clara de ovo. A mesma ataca peptídeos em paredes celulares forma consideradas eficazes com bactérias gram-positivas e gram-negativas. No entanto, bactérias gram-negativas têm uma membrana externa que é externa à parede celular e precisa ser permeabilizado para expor a camada de peptidoglicano. Tris, muitas vezes usados como um tampão em métodos de lise permeabilizar com eficácia membranas externas. Esse efeito pode ser potencializado pela adição de tetra-acetato de etilenodiamina (EDTA) (por exemplo, ~1 mM). EDTA quela os íons de magnésio que estabilizam as membranas. Em determinadas modalidades não limitativas, uma ou mais lisozima (ou lisozimas) são usadas como parte de um processo de lise celular. Em determinadas modalidades não limitativas, Tris é usado como um tampão em lise. Em determinadas modalidades não limitativas, EDTA é usado como um agente quelante em lise. Em determinadas modalidades não limitativas, a lisa enzimática é realizada em combinação de sonicação.
[0374] Em determinadas modalidades não limitativas, os detergentes e/ou solventes e/ou outros produtos químicos são usados como parte de um processo de lise celular. Os detergentes catiônicos e aniônicos, álcalis, ácidos e solventes, tais como clorofórmio e tolueno, são eficazes em causar danos ao lipídeo ou lipoproteína da membrana celular. Em determinadas
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135/229 modalidades não limitativas, detergente catiônica e/ou aniônico (detergentes catiônicas e/ou aniônicos) e/ou álcali (ou álcalis) e/ou ácido (ou ácidos) e/ou solvente (ou solventes), tais como, porém sem limitação, clorofórmio ou tolueno são usados como parte de um processo de lise celular. Em determinadas modalidades, o agente químico é escolhido de modo a resultar em nenhum resíduo que seja tóxico ou nocivos a plantas e/ou fungos e/ou animais e/ou o ambiente no produto final a jusante do processo de lise celular. Em determinadas modalidades, um processo para a remoção até níveis seguros de quaisquer produtos químicos que possam ser nocivos plantas e/ou fungos e/ou animais e/ou ao ambiente, tais como são bem conhecidos na técnica, são implantados a jusante do processo de lise celular.
[0375] Antibióticos, tais como as polimixinas, anfotericina B e/ou nistatina, aumentam a permeabilidade de membranas bacterianas e podem induzir a lise. Os antibióticos a base de penicilina são inibidores eficazes de síntese de parede de célula bacteriana, porém tem valor apenas para rompimento de célula quando as células ainda estão em crescimento ativo. Em determinadas modalidades não limitativas, os antibióticos, incluindo porém sem limitação, uma ou mais dentre polimixinas, anfotericina B, nistatina e/ou penicilina são usados como parte de um processo de lise celular. Em determinadas modalidades, o antibiótico é escolhido de modo a não resultar em resíduos no produto final a jusante do processo de lise celular que são tóxicos ou nocivos a plantas e/ou fungos e/ou animais e/ou ao ambiente e/ou que podem exacerbar o problema médico de microrganismos resistentes a antibiótico.
[0376] Em determinadas modalidades não limitativas, um bacteriófago é usado como parte de um processo de lise celular. A maioria dos grupos de bactérias são sensíveis a bacteriófago. Os fagos transportam uma enzima que hidrolisa membranas celulares para penetração do ácido nucleico. Uma infecção pesada pode resultar em lise. Em tais modalidades, a reciclagem de tal contaminação de fago no vaso de fermentação é um grande risco, e as etapas para prevenir tal contaminação que são conhecidos por uma pessoa
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136/229 versada na técnica são implantadas a fim de prevenir tal contaminação.
[0377] Quando as células são rompidas por qualquer método, uma fração de dejetos celulares e uma fração constituinte citoplasmática solúvel are obtidas de modo geral. Essas frações podem ser separadas por métodos, tais com, porém sem limitação, centrifugação ou filtração. Dentre os constituintes citoplasmáticos estão o ácido nucleico e a proteína, ou individualmente ou em conjugação. As quantidades substanciais de DNA podem ser liberadas por lise celular, aumentando viscosidade. Em determinadas modalidades não limitativas, a DNase (por exemplo, ~1 mg/ml) é adicionada para reduzir a viscosidade da preparação lisada. Após a lise celular, a recuperação da proteína por precipitação isoelétrica pode resultar em um produto proteináceo que tem um teor de ácidos nucleicos que é indesejável em determinadas modalidades. Em determinadas modalidades, as medidas bem conhecidas na técnica para reduzir ou eliminar o teor de ácido nucleico de material proteináceo são realizadas.
[0378] Em determinadas modalidades, os extratos do material celular são obtidos. Em determinadas modalidades, os extratos são extratos orgânicos. Em determinadas tais modalidades, os extratos são extratos de enzima. Os extratos obtidos ou obteníveis por tais métodos são fornecidos. Em algumas modalidades, os extratos de célula (por exemplo, extratos orgânicos) são usados em agricultura, alimentação de animal e/ou nutrição humana direta.
[0379] Conforme descrito no presente documento, a cultura de expressão e/ou caldo se refere à suspensão celular obtida através dos bioprocessos revelados no presente documento, que pode usar fontes de carbono C1 e/ou fontes de carbono orgânicos para crescimento microbiano e produção. Mais particularmente, cultura e/ou caldo inclui células de microrganismo e/ou os produtos do metabolismo e/ou nutrientes não consumidos que podem incluir, porém sem limitação, uma ou mais dentre o seguinte: proteína, vitaminas de complexo B solúvel em água, outras vitaminas,
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137/229 fosfatos, minerais, tais como, porém sem limitação potássio, enxofre, magnésio, cálcio e/ou sódio, ácidos graxos saturados e/ou insaturados, lecitina, cefalinas, carboidrato, tais como glicogênio, trealose, glicano e/ou mannan, álcool etílico, dióxido de carbono, ésteres, aldeídos, cetonas e álcoois superiores etc.. Esses resíduos podem ser suspensos e/ou dissolvidos na solução aquosa, exatamente como saem do biorreator, sem secagem ou concentração ou em uma forma líquida ou forma sólida após a água ter sido removida. A água restante pode ser separada por qualquer método convencional, tal como, porém sem limitação filtração, sedimentação ou centrifugação, por exemplo.
[0380] O Pedido de Patente n° 2003/022357 descreve um fertilizante biológico com base em células de leveduras do gênero Saccharomyces e lodo de armazenamento de água residual ou usinas de tratamento, para cujas células de levedura de fabricação são ativadas aplicandose um campo magnético. Em determinadas modalidades não limitativas no presente documento, as células de microrganismo cultivadas em matériasprimas C1 são ativadas aplicando-se um campo magnético. O Pedido de Patente no0 U.S. US2002/187900 descreve um fertilizante biológico que compreende células de levedura ativadas de maneira eletromagnéticas do gênero Saccharomyces combinado com esterco de gado, e Pedido de Patente n° U.S. US2002/187552 revela um fertilizante biológico que também compreende células de Saccharomyces ativadas de maneira eletromagnéticas, combinadas com esterco de pássaro. Em determinadas modalidades não limitativas no presente documento, as células de microrganismo que foram cultivadas em substratos gasosos incluindo, porém sem limitação, um ou mais dentre H2, CO2, CO e CH4 são ativadas de maneira eletromagnética. Em determinadas modalidades, as células são combinadas com um ou mais ingredientes, incluindo, porém sem limitação, esterco de gato e/ou de pássaro e/ou outros estercos e/ou extratos de plantas, algas marinhas e/ou kelp e/ou produtos de resíduo animal.
HIDRÓLISE DE PROTEÍNA
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138/229 [0381] Em determinadas modalidades não limitativas, os extratos orgânicos de células (microbianas) de microrganismo, conforme descrito no presente documento, contém quase todo o teor de proteína em um estado hidrolisado que compreende um ou mais dentre aminoácidos livres, oligopeptídeos e/ou outros peptídeos de maior peso molecular, assim como substancialmente todos os nutrientes de todo o material celular inicial. Em determinadas modalidades, os extratos têm alta capacidade de biofertilizante e/ou bioestimulante, assim como maior capacidade de bioabsorção para fungos e/ou animais e/ou plantas. Em determinadas modalidades, esses produtos extraídos são úteis em criação orgânica, e/ou em alimentação animal e/ou em criação hidropônica e/ou com aditivos com alto valor nutricional para gado e/ou aquicultura, e/ou como nutrientes para a proliferação de microrganismos e/ou macrorganismos heterotróficos e/ou as nutrientes para consumo humano direto.
[0382] Em determinadas modalidades não limitativas, as células microbianas, conforme descrito no presente documento, são hidrolisadas para obter um hidrolisado. Em várias modalidades, os métodos para produzir bioestimulantes vegetais incluem hidrolisar células microbianas a fim de obter um hidrolisado e formular o hidrolisado como bioestimulante vegetal e/ou nutriente de planta e/ou fertilizante para aplicação foliar e/ou aplicação como um adjuvante de solo e/ou aplicação como um fertilizante de solo. Em determinadas modalidades não limitativas, o hidrolisado é usado em peliculizações de semente a fim de potencializar germinação e o crescimento precoce de safras vegetais e de flor, plantas de folhagem e gramas de turfa. Determinadas modalidades não limitativas inclui um método para produzir um bioestimulante e/ou fertilizante vegetal que compreende: hidrolizar células microbianas, por exemplo, cultivado, conforme descrito no presente documento, a fim de obter um hidrolisado; e formular o hidrolisado como o bioestimulante vegetal para aplicação foliar ou aplicação como um adjuvante de solo ou aplicação em peliculizações de semente. Em determinadas modalidades não limitativas, a hidróilise das células microbianas compreende hidrolisar um creme de célula que tem um teor de
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139/229 sólidos de cerca de 1 a cerca de 30 por cento em peso. Em determinadas modalidades não limitativas, a hidrólise das células microbianas compreende hidrolisar um creme de célula que tem um teor de nitrogênio de cerca de 0,12 a cerca de 4 por cento em peso. As células microbianas podem ser processadas por hidrólise a fim de gerar compostos de cadeia mais curta com viscosidade muito reduzida em comparação a células intactas ou células parcialmente lisadas. Embora seja possível usar outras células, as células microbianas (de preferência, células procarióticas e com mais preferência, células bacterianas ou eubacterianas) são empregadas para preparar bioestimulantes vegetais e/ou nutrientes fúngicos de acordo com determinadas de acordo com determinadas modalidades, conforme descrito no presente documento. Compostos que contêm amina podem ser obtidos hidrolisando-se células animais ou vegetais. Os métodos exemplificativos no presente documento nos quais células microbianas são hidrolisadas também podem gerar compostos bioativos, tais como peptidoglicanos, lipopolissacarídeos, gorduras, lipídeos, vitaminas, carboidratos, fenóis, elementos minerais, fito-hormônios, compostos que contêm amina e poliaminas que podem atuar como bioestimulantes vegetais.
[0383] A hidrólise de células microbianas pode ser realizada por qualquer método conhecido que lisa substancialmente componentes celulares em compostos únicos ou de cadeia curta. Alternativamente, uma hidrólise parcial pode ser utilizada para produzir um bioestimulante e/ou fertilizante vegetal de células utilizando-se um período de hidrólise mais curto e que gaste menos energia.
[0384] A hidrólise enzimática pode ser empregada em modalidades na qual as células microbianas estão propensas a tal hidrólise enzimática. Em determinadas modalidades não limitativas, a hidrólise de células microbianas compreende realizar hidrólise enzimática. Após hidrólise enzimática finais, obtém-se um produto que pode ser denominado de “extrato de enzima orgânico”. A enzima orgânica pode ser usada como tal com finalidade nutrição agrícola, gados e/ou humana. Em algumas modalidades, o extrato de enzima
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140/229 orgânico descrito no presente documento é usado em aplicações de agricultura, alimentação animal e/ou fermentações heterotróficas. Em determinadas modalidades, o extrato de enzima orgânico pode ser usado como um bioestimulante e/ou como um biofertilizante em agricultura orgânica, visto sua composição especial de aminoácidos, oligopeptídeos e peptídeos que têm um baixo peso molecular, o que possibilita a absorção dessas moléculas por plantas e/ou organismos do solo. Em determinadas modalidades, os bioestimulantes produzidos de acordo com os métodos descritos no presente documento e aplicados a safras entregam um ou mais dentre os seguintes resultados: parâmetros aprimorados de qualidade da safra e/ou eficiência do nutriente; taxa aumentada de crescimento; taxa fotossintética aumentada; rendimento aumentada de safra; crescimento aumentado de raízes e folhas de planta; tolerância a estresse abiótico aumentado; tolerância aumentada a doenças; qualidade aprimorada do solo; menos crescimento da regra. Em determinadas modalidades, os bioestimulantes produzidos de acordo com os métodos descritos no presente documento aumentam a eficiência de uso de nutriente por safras às quais o dito bioestimulante foi aplicado e/ou reduzem lixiviação de nutrientes no ambiente de campos onde as safras são plantadas. Em determinadas modalidades não limitativas, os bioestimulantes produzidos de acordo com os métodos descritos no presente documento aumenta a tolerância de plantas a estressores e/ou aumentam a taxa reprodutiva de plantas e/ou têm uma eficácia por dose melhor que os produtos comerciais presentemente disponíveis e/ou oferecem um risco reduzido de lesão à planta caso sobreaplicações ocorram em comparação aos produtos comerciais disponíveis presentemente. Em determinadas modalidades, o hidrolisado de proteína ou extrato orgânico descrito no presente documento estimula microrganismos de solo desejáveis de ocorrência natural, tais como bactérias produtoras de ácido indolacético de fixação N2 e de solubilização em P. Em determinadas modalidades não limitativas, os microrganismos estimulados incluem Azospiríllum sp. e/ou Azotobacter sp.. Em determinadas modalidades, o extrato
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141/229 de enzima orgânico pode ser usado como um nutriente ou suplemento para fungos (por exemplo, cogumelos). Em determinadas modalidades, o extrato de enzima orgânico pode ser usado como um aditivo nutricional com um valor alto adicionado como alimentação animal, mais particularmente, para alimentação de gado (pecuária, ovelha, cabras etc.) e/ou para aquicultura e/ou para insetos (por exemplo, abelhas) ou outros invertebrados (por exemplo, minhocas vermelhas) e/ou para fermentações heterotróficas e/ou para animais domésticos ou de estimação e/ou para consumo humano direto.
[0385] Em determinadas modalidades, o extrato contém substancialmente todo dentre proteína inicial em uma forma hidrolisada. Em determinadas modalidades não limitativas, mais de 90% da proteína inicial em peso está em uma forma hidrolisada, por exemplo, na forma de livre aminoácidos, oligopeptídeos e outros peptídeos que têm peso molecular mais alto. Em determinadas modalidades não limitativas, substancialmente todos os nutrientes das células na cultura que entra no processo de hidrólise estão contidos no hidrolisado. Em determinadas modalidades, os nutrientes extracelulares da solução líquida ou suspensão de matéria orgânica também estão incluídos no produto. Em algumas modalidades, um hidrolisado e/ou extrato de enzima orgânico obtido ou obtenível por um método, conforme descrito no presente documento, é fornecido. Em determinadas modalidades, o extrato é rico em proteínas, por exemplo, na grande parte na forma de peptídeos (por exemplo, oligopeptídeos e peptídeos que têm um baixo peso molecular sob 10.000 Daltons) e aminoácidos livres. Em determinadas modalidades, os aminoácidos livres têm uma alta bioabsorção. Em determinadas modalidades, o extrato contém carboidratos. Empregando-se tais enzimas, conforme descrito no presente documento, é possível obter bioestimulantes de planta com o uso de alternativas para ácido forte ou base em hidrólise. Em várias modalidades exemplificativas, a hidrólise enzimática de microrganismo (por exemplo, bacterianas) as células podem ser realizadas com o uso de qualquer composição adequada de enzima ou enzimática.
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142/229 [0386] Em determinadas modalidades não limitativas, os microrganismos são hidrolisados com pelo menos uma enzima que tem capacidade para hidrolisar proteínas microbianas (por exemplo, bacterianas) em aminoácidos livres e/ou peptídeos curtos. Em determinadas modalidades, a hidrólise enzimática compreende hidrolisar com uma enzima purificada. Em determinadas modalidades, a hidrólise enzimática compreende hidrolisar com uma mistura de uma enzima e um meio no qual a enzima foi preparada. Em determinadas modalidades, a hidrólise enzimática compreende hidrolisar com uma enzima de origem vegetal e/ou animal e/ou bacteriana e/ou de arquea e/ou fúngica. Em determinadas modalidades, a enzimática compreende hidrolisar com uma mistura de uma ou mais enzimas de origem vegetal, animal, bacteriana, de arquea e/ou fúngica. Em determinadas modalidades, a enzima hidrolítica é produzida por uma cepa de microrganismo, conforme descrito no presente documento. Em determinadas modalidades, a enzima hidrolítica é produzida a partir de matéria-prima de substratos C1 e/ou H2 e/ou syngas. Em modalidades exemplificativas, as células bacterianas podem ser hidrolisadas com um ou mais dentre proteinases, lipases e amilases. Em determinadas modalidades, a hidrólise enzimática compreende uma ou mais enzimas proteolíticas de origem microbiana, vegetal, fúngica e/ou animal. Em determinadas modalidades, o método inclui uso de uma proteinase alcalina. Em determinadas modalidades, a hidrólise enzimática compreende hidrolisar com pelo menos uma enzima selecionada a partir de pancreatina, papaína, bromelaína, ficina, proteinase bacteriana, proteinase fúngica, uma proteinase neutra produzida a partir de Bacillus sp. Alcalase 2.4L, Bacillus B. licheniformis e/ou Subtilisin carlesberg, Esperase de B. lentus, Nutrase de B. amyloliquifacus, Protamex de Bacillus sp., Therolysin/therolase de B. termoproteolyticus, Flavouzyme de Aspergillus oryzae, Protease N de B. subtilis, tripsina, quimotripsina, queratinase, pepsina, subtilisina e/ou renina. Conforme será bem entendido por uma pessoa de habilidade comum na técnica, pancreatina inclui uma mistura de enzimas digestivas, proteinases, lipases e amilases.
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143/229 [0387] A hidrólise enzimática de células microbianas (por exemplo, bacterianas) pode incluir combinar uma enzima e células bacterianas em qualquer quantidade adequada sob quaisquer condições adequadas. De modo geral, as quantidades de reagentes, condições de reação e sequências de etapas de reação são selecionadas a fim de obter a atividade de enzima ideal. Em determinadas modalidades, as condições de pressão, temperatura, pH e tempo da hidrólise enzimática são aquelas nas quais um nível máximo ou adequado de atividade enzima é alcançado. Em determinadas modalidades, a realização de hidrólise enzimática compreende combinar uma enzima e as células bacterianas em uma razão ponderai em uma faixa de cerca de 0,1 a cerca de 10 g de enzima por 100 g de teor de nitrogênio de células microbianas (por exemplo, bacterianas). Em outra modalidade particular, a hidrólise enzimática é realizada com o uso de uma concentração de 0,05% a 0,5% em volume de solução-mãe de enzima com uma atividade de cerca de 70.000 unidades com o uso do ensaio de azocaseína. Em várias modalidades exemplificativas, qualquer método adequado pode ser empregado para aprimorara e eficiência da hidrólise enzimática das células microbianas (por exemplo, bacterianas). Em determinadas modalidades, a hidrólise enzimática compreende combinar uma enzima e as células microbianas e agitar a enzima e células microbianas combinadas por qualquer método adequado. O tratamento enzimático pode ser realizado em qualquer dispositivo adequado conhecido por uma pessoa versada na técnica, tal como um reator com controle de temperatura e agitação, por exemplo.
[0388] Conforme indicado acima, a hidrólise pode ser realizada sob quaisquer condições adequadas, no entanto, em várias modalidades exemplificativas, a hidrólise pode ser realizada em pHs e uma faixa de 2 a cerca de 10. Em determinadas modalidades, a hidrólise enzimática é realizada sob condições de pH dentro da faixa de pH 4 a 12. Em outras modalidades, a hidrólise é realizada dentro da faixa de pH de 5 a 9,5 ou entre pH 6 e 8 ou em um pH 7. Deve-se entender que cada tipo de enzima hidrolisa
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144/229 por conta própria pH ideal, e o pH ideal pode variar dependendo da taxa e da extensão de hidrólise desejada. Em determinadas modalidades particulares, o valor de pH é mantido constante durante a hidrólise enzimática adicionando-se uma base, tal como, por exemplo, hidróxido de amônio ou hidróxido de potássio e, em outras modalidades, o pH é mantido adicionando-se um ácido. Em várias modalidades exemplificativas, a hidrólise pode ser realizada a uma de 15,5 °C a 55 °C e por um período em uma faixa de 2 a 120 horas. Em determinadas modalidades, a hidrólise enzimática é realizada sob condições de temperatura em uma faixa de 10 °C a 80 °C e, em outras modalidades, sob temperaturas em uma faixa de 10 a 65 °C ou 10 a 55 °C.
[0389] Em determinadas modalidades, a realização da hidrólise enzimática compreende reagir uma enzima e as células microbianas na presença de um catalisador. Qualquer catalisador que aprimora a eficiência da enzima ou enzimas pode ser empregado, tais como catalisadores heterogêneos, catalisadores homogêneos e/ou eletrocatalisadores. Em determinadas modalidades, o catalisador compreende pelo menos um dentre ferro, cobre, cobalto, níquel, boro, magnésio, cálcio e metais terrosos raros, tais como, porém sem limitação, lantânio. Em determinadas modalidades, a hidrólise enzimática compreende reagir uma enzima e as células microbianas ao mesmo que a corrente elétrica é aplicada. Em determinadas modalidades, a hidrólise enzimática compreende tratar as células microbianas com corrente elétrica antes e/ou durante hidrólise enzimática das células microbianas. A corrente elétrica pode ser aplicada a células por qualquer método adequado e sob quaisquer condições adequadas. Os métodos e condições exemplificativos para aplicar corrente elétrica são descritos, por exemplo, em Tokuda, et al. (2006) “Effects of electrical pre-treatment on the hydrolysis of agricultural Wastes,” J. Brewing Soc. Jap., 101(10): 769 a 775, que é incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade. Em várias modalidades exemplificativas, corrente elétrica é aplicada em uma quantidade de 2 V a 120 V por períodos de 1 a 60 minutos.
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145/229 [0390] Várias modalidades exemplificativas dos métodos no presente documento podem incluir adicionalmente um prétratamento antes da hidrólise enzimática das células microbianas (por exemplo, bacterianas). A eficiência de hidrólise de proteína microbiana com o uso de enzimas pode ser aprimorada com o uso de vários métodos de pré-tratamento. Acredita-se que tais métodos de pré-tratamento degradam a estrutura das células e, desse modo, aumenta a taxa e extensão de hidrólise por uma enzima. Aumentando-se a eficiência de hidrólise de proteína, é possível realizar a hidrólise com o uso de menos enzimas ou realizar hidrólise em menos tempo do que seria necessário normalmente com uma quantidade determinada de enzima. É particularmente desejável realizar hidrólise com o uso de menos enzima, uma vez que uma redução na quantidade de enzimas usadas pode reduzir substancialmente os custos de produção.
[0391] Em determinadas modalidades, a realização de hidrólise enzimática compreende tratar as células microbianas (por exemplo, bacterianas) com um ácido brando ou uma base branda antes de hidrolisar enzimaticamente as células microbianas. Em várias modalidades exemplificativas, um pré-tratamento de ácido brando é realizado ajustando-se o pH do caldo para uma faixa de 3 a 5 com o uso de um ácido tal como, porém sem limitação, ácido clorídrico ou ácido sulfúrico. Em determinadas modalidades, o pré-tratamento de ácido brando pode ser realizado a uma temperatura de 100 °C a 130 °C por um período de 0,25 horas a 10 horas. Em várias modalidades exemplificativas, um pré-tratamento de base branda é realizado ajustando-se o pH das células bacterianas de 9 a 12 com o uso de uma base, tal como, porém sem limitação, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio ou amônia. Em determinadas modalidades, o pré-tratamento de base branda pode ser realizado a uma temperatura de 100 °C a 130 °C por um período de 0,25 horas a 10 horas. Em determinadas modalidades, a hidrólise enzimática compreende tratar as células microbianas com vibração ultrassônica antes e/ou durante hidrólise enzimática das células microbianas. Em determinadas
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146/229 modalidades, a hidrólise enzimática compreende tratar as células microbianas com água supercrítica e/ou dióxido de carbono supercrítico antes de hidrolisar enzimaticamente as células microbianas.
[0392] Determinadas modalidades incluem um método para obter um hidrolisado ou extrato de enzima orgânico através de uma síntese de “etapa única”. No contexto da invenção, a expressão de “etapa única” significa que o procedimento é realizado sem etapas de separação intermediárias. Em determinadas modalidades, o tratamento físico da célula caldo ocorre, sem separação de fase, em uma pressão superatmosférica e alta temperatura, em que a caldo de célula é tratado com uma base concentrada antes de se submeter a uma hidrólise enzimática. Em determinadas modalidades, o caldo de célula é submetido a um tipo de síntese de “etapa única” que, em determinadas modalidades não limitativas, compreende as etapas de: (a) adicionar uma base concentrada ao caldo que compreende uma suspensão celular a fim de ajustar o pH do mesmo; (b) submeter a mistura obtida na etapa (a) para uma pressão superatmosférica e alta temperatura; e (c) submeter a mistura obtida na etapa (b) a uma hidrólise enzimática para obter um extrato de enzima orgânico. Em determinadas modalidades, o tratamento alcalino da etapa (a) usa uma base adequada selecionada a partir de um ou mais dentre hidróxido de amônio, hidróxido de potássio e/ou hidróxido de cálcio. Em determinadas modalidades, a base é usada em forma concentrada a fim de evitar o aumento do volume de reação excessivamente, algo que aumentaria os custos de energia por aquecimento, concentração etc., assim como os custos de equipamento. Em determinadas modalidades, essa concentração é selecionada, de acordo com a faixa de pH desejada para a hidrólise enzimática subsequente. Em determinadas modalidades não limitativas, o hidróxido de amônio em aproximadamente 28% em peso é usado e em outras modalidades hidróxido de potássio a aproximadamente 10 M é usado.
[0393] Em determinadas modalidades, após o tratamento alcalino do caldo, o tratamento físico da mistura conduzido a uma
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147/229 pressão superatmosférica e/ou alta temperatura. Em uma modalidade não limitativa particular, uma pressão de 102 kPa a 141 kPa é aplicada na etapa (b) em uma temperatura elevada. Em algumas modalidades particulares, uma temperatura de 90 °C a 140 °C é usada no tratamento físico. Em algumas modalidades particulares, uma pressão de 102 kPa a 141 kPa é aplicada a uma temperatura de 90 °C a 140 °C na etapa (b). Esse tratamento físico é realizado em qualquer dispositivo adequado por uma pessoa versada na técnica, tal como uma autoclave, por exemplo.
[0394] Em determinadas modalidades, o tratamento enzimático é realizado após o tratamento físico. Em determinadas modalidades, após o tratamento físico e antes do tratamento enzimático, uma base concentrada e/ou ácido são adicionados de modo que a mistura a ser tratada tem um valor de pH ideal para que a enzima seja usada. Em determinadas modalidades uma ou mais enzimas usadas na hidrólise enzimática da etapa (c) é uma enzima proteolítica de origem microbiana, vegetal, fúngica e/ou animal. Em uma modalidade particular, uma hidrólise enzimática da etapa (c) é conduzida a uma temperatura de 40 °C a 70 °C e um pH de 8 a 11 por um período de 2 horas a 48 horas. Em determinadas modalidades, a síntese em única etapa aumenta a simplicidade do processo e/ou diminui o gasto e/ou é menos poluente que os processos de múltiplas etapas comparáveis.
[0395] A hidrólise de células microbianas (por exemplo, bacterianas), com ou sem a assistência de enzimas pode ser realizada com a aplicação de ácido ou hidrólise de álcali em combinação com condições suficientes de calor e pressão. Em determinadas modalidades não limitativas, a hidrólise das células microbianas compreende realizar hidrólise ácida. Em determinadas modalidades, a hidrólise ácida compreende ajustar um pH de uma composição que compreende as células microbianas com pelo menos um agente selecionado a partir de ácido sulfúrico, ácido clorídrico, ácido fosfórico, ácido carbônico, ácido bórico, ácido acético, ácido propiônico e ácido cítrico. Em várias modalidades exemplificativas, a hidrólise ácida é realizada ajustando-se
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148/229 pH de um creme de célula microbiana e urn pH de cerca de 0,5 a cerca de 5. Em determinadas modalidades, a hidrólise ácida compreende ajustar um pH de uma composição que compreende as células microbianas (por exemplo, bacterianas) e aquecer a composição de pH ajustado a uma temperatura de 30 °C a 200 °C por períodos de tempo de cerca de 10 minutos a cerca de 48 horas. Em determinadas modalidades, a hidrólise ácida compreende ajustar o pH de uma composição que compreende as células microbianas (por exemplo, bacterianas) e o aquecimento da composição de pH ajustado sob pressão. Em determinadas modalidades não limitativas, a hidrólise das células microbianas compreende realizar hidrólise alcalina. Em determinadas modalidades, a realização hidrólise alcalina compreende ajustar o pH de uma composição que compreende as células microbianas a um pH de cerca de 8 a cerca de 14. Em determinadas modalidades, a hidrólise alcalina compreende ajustar o pH de uma composição que compreende as células microbianas com pelo menos um agente selecionado a partir de hidróxido de potássio, hidróxido de sódio, cálcio óxido, óxido de magnésio e amônia. Em determinadas modalidades, a hidrólise alcalina compreende ajustar o pH de uma composição que compreende as células microbianas (por exemplo, bacterianas) e aquecer a composição de pH ajustado a uma temperatura de 30 °C a 200 °C por períodos de cerca de 10 minutos a cerca de 48 horas. Em determinadas modalidades, a hidrólise alcalina compreende ajustar o pH de uma composição que compreende as células microbianas (por exemplo, bacterianas) e o aquecimento da composição de pH ajustado sob pressão. Tais técnicas de hidrólise ácida ou alcalina, conforme descrito no presente documento, geralmente geram um hidrolisado incluindo dejetos de produtos solúveis e de parede celular.
PROTEÍNA DE CÉLULA ÚNICA E ISOLADOS DE PROTEÍNA MICROBIANA [0396] Determinadas modalidades da presente divulgação referem-se a um isolado de proteína de proteína única (SCP) e/ou de proteína microbiana com teor de ácido nucleico diminuído. Em algumas
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149/229 modalidades, é fornecido um produto de proteína que é relativamente livre de ácido nucleico, porém que ainda fornece bom valor nutricional e qualidade de alimentação (isto é, consumo) aceitável. Em determinadas modalidades, o teor de ácido nucleico é reduzido até menos que 9% em peso. Em determinadas modalidades, o teor de RNA é reduzido a fim de atender às diretrizes da Organização Mundial da Saúde [OMS] para consumo humano. Em determinadas modalidades, o teor de RNA da SCP é menor que 2% em peso seco; em algumas modalidades, está abaixo de 1% em peso seco. Em determinadas modalidades, está incluído um processo de redução de ácido nucleico que produz material celular que contém dois a três gramas de ácido nucleico, ou menos, por 100 gramas de proteína. Em determinadas modalidades não limitativas, a Razão de Equivalência de Proteína (PER) do isolado de células é maior que 1. Em determinadas modalidades não limitativas, a composição do isolado de células em termos de porcentagem em peso é 65% a 85% de proteína, ou mais; 0,5% a 9% de ácido nucleico; 7% a 15% de lipídeo; 1% a 5% de cinzas; e 5% a 20% de carboidrato e/ou outra matéria orgânica não lipídica livre de N.
[0397] Em determinadas modalidades, as células são submetidas a uma temperatura que inativa proteinases e impede que as mesmas rompam proteínas, porém ainda permite que a RNase (enzimas digestivas de RNA) rompa o RNA ribossômico. Em determinadas modalidades, essa temperatura é pelo menos cerca de 64 °C. Em determinadas modalidades, os pequenos produtos dessa digestão de RNA são difundidos através das paredes celulares no caldo de cultura e, então, são removidas no produto final de SCP. Em determinadas modalidades, essa etapa de remoção de RNA ocorre em um vaso de redução de RNA em conexão fluida com o biorreator. Em determinadas modalidades, a cultura é colhida continuamente do biorreator. Em determinadas modalidades, após o teor de RNA ter sido reduzido, a massa celular é espalhada em um filtro grande em movimento através do qual a maior parte do líquido é extraída a vácuo. Em determinadas modalidades, isso deixa para trás uma folha fina de material de alto teor de proteína, por exemplo, uma folha fina de material
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150/229 de alto teor de proteína que tem baixo teor de ácido nucleico.
[0398] O isolado de células de determinadas modalidades no presente documento pode ser produzido por um processo que envolve romper as células e remover o resíduo de parede celular. Em determinadas modalidades, esse rompimento de célula é realizado em um meio alcalino. Em determinadas modalidades, a redução do teor de ácido nucleico pode ser realizada pela hidrólise do ácido nucleico dentro da célula a fragmentos de tal tamanho para que os fragmentos possam ser difundidos da célula na direção contrária à proteína.
[0399] Sabe-se que a enzima nuclease, que está presente em vários microrganismos diferentes, incluindo levedura, hidrolisa ou rompe as moléculas de ácido nucleico em fragmentos menores. A hidrólise dos ácidos nucleicos por métodos enzimáticos permite o uso de condições em termos de pH e temperatura muito mais brandas do que aquelas necessárias geralmente para métodos químicos de hidrólise, em que mais brando é considerado como pH mais próximo de 7 e a temperatura mais próxima da temperatura ambiente, respectivamente. Em determinadas modalidades, as condições brandas obviam a necessidade de um equipamento resistente a ácido ou a álcali. Em determinadas modalidades, são utilizados um processo enzimático e condições brandas que melhor preservam a qualidade nutricional de proteínas do que os métodos químicos comparáveis de hidrólise. Diversas fontes de nuclease foram descritas na literatura. Determinadas modalidades no presente documento utilizam nuclease (ou nucleases) para a hidrólise de polímeros de ácido nucleico que são bem conhecidos pelas pessoas de habilidade comum na técnica. Em determinadas modalidades, tal nuclease (ou nucleases) são livres de sistemas de enzima secundária, tal como proteinase, o que pode causar uma diminuição na recuperação de proteína pela codifusão de aminoácidos e/ou peptídeos pequenos fora da célula junto dos ácidos nucleicos hidrolisados. Em determinadas modalidades, a preparação de nuclease não contribui para um sabor indesejável aos produtos derivados do processo de
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151/229 redução de ácido nucleico. Em determinadas modalidades, a preparação de nuclease usada está comercialmente disponível. Em determinadas modalidades, a nuclease está em um grau alimentício. Em determinadas modalidades, a nuclease da levedura é usada para romper moléculas de ácido nucleico em fragmentos pequenos. Em determinadas modalidades, uma nuclease endógena e/ou exógena é utilizada para romper moléculas de ácido nucleico em fragmentos pequenos.
[0400] Em algumas modalidades, um processo é fornecido para produzir um isolado de proteínas no qual uma nuclease endógena é usada para hidrolisar o ácido nucleico de modo que os fragmentos de ácido nucleico possam ser separados da proteína, por exemplo, por precipitação da proteína. Além disso, é conhecido na técnica que a hidrólise de ácidos nucleicos dentro de uma célula pode ser realizada por um processo de aquecimento de múltiplas etapas para ativar uma nuclease autocontida e/ou endógena para converter polímero de ácido nucleico insolúvel em ácidos nucleicos solúveis. Em determinadas modalidades, um processo de aquecimento de múltiplas etapas é usado para ativar uma nuclease autocontida e/ou endógena para converter polímero de ácido nucleico insolúvel em ácidos nucleicos solúveis. Em determinadas modalidades, o lisado de célula é incubado de tal maneira que uma nuclease endógena contida na porção solúvel degrade o ácido nucleico presente na célula em uma forma solúvel.
[0401] O ácido nucleico também pode ser hidrolisado expondo-se a célula a uma nuclease externa. Em determinadas modalidades, a célula e/ou lisado de célula é exposta a uma nuclease externa (exógena).
[0402] As nucleases são conhecidas como extraíveis na fração solúvel acima de um determinado pH. Em determinadas modalidades, a nuclease é solúvel em um pH maior que 4. Em determinadas modalidades, a nuclease é solúvel em um pH maior que 5,5. Em determinadas modalidades, o pH para extração de nuclease é otimizado para adição mínima de álcali e/ou teor de sal no rendimento de nuclease solúvel adequado. Em determinadas
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152/229 modalidades, a nuclease é extraída a um pH em que a nuclease é solúvel, porem inativa e é mantida em um estado inativo até que a atividade da mesma seja necessária, nesse ponto, o pH é diminuído para retomar a atividade da nuclease.
[0403] Em determinadas modalidades, uma cepa de célula é aprimorada e/ou modificada para atividade de nuclease aumentada. Em determinadas modalidades, o teor de nuclease das células é aumentado por manipulação genética e/ou ambiental. Em determinadas modalidades, as cepas exigem nuclease adicional além da nuclease endógena para reduzir adequadamente o RNA. Em determinadas modalidades, essa nuclease adicional é fornecida ou de uma fonte externa e/ou por desenvolvimento seletivo de cepas para nuclease interna aumentada.
[0404] As nucleases são conhecidas por ter geralmente um pH e temperatura ideais para máxima atividade agregada (isto é, taxa de conversão por enzima ativa individual multiplicada pelo número de enzimas ativas). A taxa de reação aumenta com a temperatura; no entanto, a fração de enzimas que são inativadas também aumenta geralmente com a temperatura crescente. Esses dois efeitos antagônicos resultam geralmente na enzima que exibem atividade máxima dentro de uma determinada de faixa de temperaturas. Em determinadas modalidades, esse ideal é identificado e usado seguindo os métodos experimentais conhecidos pela pessoa versada na técnica.
[0405] Em determinadas modalidades, o tempo de incubação para rompimento de RNA por nucleases é otimizado.
[0406] Os polímeros e proteínas de ácido nucleico são conhecidos por coprecipitar abaixo de um determinado de pH, produzindo uma mistura de nucleoproteínas. Em determinadas modalidades, o pH ao qual o lisado é exposto é mantido acima desse pH de modo a evitar a formação de uma mistura de nucleoproteínas.
[0407] Chargaff, in Vol. I, The Nucleic Acids, declara que o ácido ribonucleico (RNA) pode ser hidrolisado pela adição de HCI 1 N por um hora a 100 °C ou pela ação de NaOH 0,1 N a 100 °C. Em determinadas
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153/229 modalidades, a aplicação de condições ácidas ou alcalinas aos constituintes citoplasmáticas microbianas liberada por ruptura de célula resulta na hidrólise do ácido nucleico. Em determinadas modalidades, o HCI ou NaOH é utilizado para a hidrólise de RNA. Em determinadas modalidades não limitativas, o RNA é hidrolisado com o uso de cerca de HCI 1 N ou cerca de NaOH 0,1 N a cerca de 100° C para aproximadamente 1 hora.
[0408] Em determinadas modalidades, após a hidrólise de polímeros de ácido nucleico, duas frações são obtidas: uma fração compreende sólidos que contêm um teor reduzido de ácido nucleico; e a outra fração é o meio circundante que contém fragmentos de ácido nucleico dissolvidos e outro material difusível. Em determinadas modalidades, a proteína se toma insolúvel de modo a se separar do ácido nucleico hidrolisado e dissolvido. Em determinadas modalidades, uma fração de proteína insolúvel é separada de uma fração que contém ácido nucleico solúvel. Em determinadas modalidades, as condições de reação, incluindo porém sem limitação, pH, tempo, temperatura e/ou concentração, são otimizadas para recuperar um produto de proteína que te um baixo teor de ácido nucleico e um rendimento de proteína aceitável e/ou são otimizados para maximizar o rendimento de proteína a um teor de ácido nucleico aceitável. Determinadas modalidades também compreendem um método para produzir proteína de baixo teor de ácido nucleico e livres de dejetos de parede celular. Em determinadas modalidades, uma nuclease é usada para solubilizar ácido nucleico incluindo, porém sem limitação uma nuclease endógena. O desenho fornecido na Figura 22 é um diagrama de blocos de uma modalidade do processo desse aspecto particular.
HIDROLISADOS DE PROTEÍNA E USOS DAS MESMAS [0409] Os hidrolisados foram usados na indústria da biotecnologia como um suplemento a culturas celulares [M. S. Ummadi e M. Curic-Bawden (2010) “Use of protein hydrolysates in industrial starter culture fermentations,” in Protein Hydrolysates in Biotechnology, V. K. Pasupuleti e A. L. Demain, Edições Springer Netherlands, páginas 91 a 114
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154/229 (http://dx.doi.Org/10.1007/978-1 -4020-6674-0_6)]. Determinadas modalidades da presente divulgação referem-se a hidrolisados microbianos produzidos, conforme descrito no presente documento, usados como uma fonte de matériaprima ou nutriente em outras fermentações e bioprocessos industriais. Em determinadas modalidades, os hidrolisados produzidos, conforme descrito no presente documento, são usados como um suplemento em culturas celulares.
[0410] O hidrolisado de proteínas encontrou aplicação especial em medicina esportiva devido ao fato de que o consumo do mesmo permite que os aminoácidos sejam absorvidos pelo corpo mais rapidamente do que proteínas intactas, desse modo, maximizando a entrega de nutriente a tecidos musculares [Manninen, Anssi H. (2004) “Protein Hydrolysates In Sports And Exercise: A Brief Review” Journal of Sports Science and Medicine 3:60 a 63], Determinadas modalidades da presente divulgação no presente documento se referem a isolados de proteína microbiana e/ou hidrolisados e/ou extratos com aplicação em medicina esportiva e especificamente, em determinadas modalidades não limitativas, o consumo do dito isolado e/ou hidrolisado e/ou extrato permite que os aminoácidos sejam absorvidos pelo corpo mais rapidamente do que as proteínas intactas, desse modo, maximizando a entrega de nutriente a tecidos musculares. Em determinadas modalidades, o hidrolisado e/ou isolado e/ou extrato é rico em antioxidantes e/ou ácido L-aspártico e/ou manganês e/ou selênio. Determinadas modalidades se referem ao uso dos isolados de proteína microbiana e/ou hidrolisados e/ou extraídos em alimento de animais de estimação, incluindo, porém sem limitação, alimentos para mamíferos, tais como cachorros ou cavalos.
[0411] O método para aplicar o extrato de enzima orgânico e/ou hidrolisado descrito no presente documento a uma safra agrícola pode ser realizado por qualquer técnica convencional tal como, por exemplo, aplicação direta ao solo ou por meio das folhas ou por fertigação. Em determinadas modalidades, a aplicação do hidrolisado bioestimulante produzido de acordo com os métodos descritos no presente documento resulta na
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155/229 modificação do metabolismo primário e/ou secundário das plantas que recebem o dito bioestimulante. Em determinadas modalidades, a aplicação de hidrolisado bioestimulante produzida de acordo com os métodos descritos no presente documento estimula a produção e acúmulo de compostos antioxidante, tal como porém sem limitação, carotenoides, polifenóis e/ou flavonoides nas plantas que recebem o dito bioestimulante. Além dos aminoácidos e peptídeos, os hidrolisados produzidos, de acordo com determinadas modalidades, descritos no presente documento contêm outros compostos que podem contribuir para a ação de bioestimulante incluindo gorduras, lipídeos, vitaminas, carboidratos, fenóis, elementos minerais, fito-hormônios, poliaminas, e outros compostos orgânicos.
[0412] Além disso, um hidrolisado descrito no presente documento pode se submeter alternativamente a etapa adicional (ou adicionais) de concentração e/ou separação para estabilização. Em determinadas modalidades, o método descrito no presente documento compreende etapas adicionais após hidrólise em que o hidrolisado é submetido à concentração para obter um hidrolisado concentrado. O hidrolisado concentrado em determinadas modalidades tem pelo menos 40% em peso de matéria seca, em outras modalidades pelo menos 50% em peso de matéria seca e em outras modalidades 50 a 55% em peso de matéria seca ou superior. Essa concentração pode ser obtida por qualquer método convencional conhecido na técnica, tal como, por exemplo, por aquecimento e com o uso de um evaporador giratório com um banho termostático ou osmose reversa ou qualquer outro dispositivo adequado.
[0413] Em outra modalidade particular, o método compreende etapa adicional (ou etapas adicionais) após a hidrólise de proteína, em que a hidrolisado de proteína obtido após hidrólise é submetido à separação a fim de obter: (i) uma fração de hidrolisado solúvel, e (ii) uma fase sólida, fração de hidrolisado insolúvel. Essa separação pode ser realizada por qualquer método de separação sólido-líquido convencional conhecido na técnica, tal como, por exemplo, por filtração ou centrifugação com o uso de decantador ou
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156/229 outro equipamento industrial. Em várias modalidades dos métodos descritos no presente documento, a formação do hidrolisado inclui coletar frações tanto líquidas quanto sólidas do hidrolisado. Em determinadas modalidades, o hidrolisado pode ser aplicado conforme é, como um bioestimulante e/ou fertilizante. Por exemplo, a formação do hidrolisado pode incluir coletar simplesmente todas as frações do hidrolisado e aplicar as frações líquidas ou sólidas combinadas do hidrolisado às safras como um bioestimulante e/ou fertilizante vegetal. Em outras modalidades, a formação do hidrolisado compreende separar frações líquidas e sólidas do hidrolisado e reter a fração líquida e/ou a fração sólida como o bioestimulante e/ou fertilizante vegetal. Em outras modalidades, o hidrolisado pode ser separado em frações solúveis e insolúveis para aplicações foliares e no solo, respectivamente. Em determinadas modalidades, a fração de hidrolisado solúvel contém virtualmente toda a proteína hidrolisada inicial, e em determinadas modalidades mais que 90% em peso. Em determinadas modalidades, a fração insolúvel é reduzida através da ação do aquecimento na presença de tratamento por umidificação ou a vapor.
[0414] Em determinadas modalidades, a fração de hidrolisado solúvel fornece uma composição adequada para propósitos agrícola e de gado, e mais particularmente, como um bioestimulante e/ou biofertilizante em agricultura orgânica visto a composição especial do mesmo de aminoácidos livres, oligopeptídeos e peptídeos com um peso molecular baixo.
[0415] Em determinadas modalidades, o hidrolisado pode ser usado como um aditivo nutricional com um valor alto adicionado para alimentação animal, mais particularmente, alimentação animal para gado (pecuária, ovelha, cabras etc.), ou aquicultura, ou insetos (por exemplo, abelhas) ou invertebrados (por exemplo, minhocas) ou microrganismos heterotróficos (por exemplo, levedura; E. coli), ou para animais domésticos ou animais de estimação ou para consumo humano direto.
[0416] Opcionalmente, a fração de hidrolisado solúvel pode ser submetida à concentração. Em determinadas modalidades, em seguida
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157/229 de uma etapa de separação líquido-sólido, conforme descrito acima, a fração de hidrolisado solúvel é submetida a uma etapa adicional de concentração a fim de obter uma fração de hidrolisado solúvel concentrada. A fração de hidrolisado solúvel concentrada tem pelo menos 40% em peso de matéria seca em determinadas modalidades, e em outras modalidades pelo menos 50% em peso de matéria seca ou 50 a 55% em peso de matéria seca, ou superior. Essa concentração pode ser realizada por qualquer método convencional conhecido na técnica, tal como, por exemplo, por aquecimento e vácuo com o uso de u evaporador giratório com um banho termostático ou osmose reversa ou qualquer outro dispositivo adequado. O hidrolisado solúvel concentrado de determinadas modalidades tem uma composição o que o toma adequado para propósitos agrícola e de gado; em particular, em algumas modalidades, pode ser usado como um bioestimulante e/ou biofertilizante em agricultura orgânica dada sua composição especial de aminoácidos, oligopeptídeos e peptídeos com um baixo peso molecular, o que possibilita a absorção dessas moléculas por microrganismos vegetais e/ou no solo. Em determinadas modalidades, o hidrolisado de proteína ou extrato orgânico descrito no presente documento estimula microrganismos de solo desejáveis de ocorrência natural, tais como bactérias de produção de ácido indolacético de fixação de N2 e de solubilização em P. Em determinadas modalidades, os aminoácidos produzidos de acordo com os métodos descritos presente documento têm um efeito quelante em micronutrientes vegetais. Em determinadas modalidades, o hidrolisado solúvel concentrado pode ser usado como um nutriente ou suplemento para cultivar fungos (por exemplo, cogumelos). Em determinadas modalidades, o mesmo pode ser usado como um aditivo nutricional para alimentação animal, mais particularmente, alimentação animal para gado (pecuária, ovelhas, cabras, etc.), ou aquicultura (por exemplo, peixes, frutos do mor) ou insetos (por exemplo, abelhas) ou invertebrados (por exemplo, minhocas vermelhas), ou para microrganismos heterotróficos (por exemplo, levedura; E. coli), ou para animais domésticos ou de estimação ou para nutrição humana direta.
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BIOESTIMULANTES E FERTILIZANTES VEGETAIS [0417] A fração sólida do hidrolisado obtido, conforme descrito, acima pode ser aplicada a culturas como um bioestimulante vegetal e/ou fertilizante, seja na forma sida ou depois de ser redissolvida em um solvente adequado, tal como um meio aquoso. Em determinadas modalidades, a fração insolúvel do hidrolisado pode sofrer um processo de secagem final para obter um sólido na forma de uma pasta ou um pó, com um teor de humidade de 10 a 15% em peso, ou inferior. Tal processo de secagem pode ser realizado por qualquer método convencional, tal como com o uso de fornos de circulação de ar quente, ou por secagem por congelação, por exemplo. O hidrolisado insolúvel seco ou não seco pode ser utilizado como um aditivo nutricional de alto valor agregado para alimentação animal, mais particularmente, ração animal para gado (gado bovino, ovino, caprino, etc.) ou aquicultura (por exemplo, peixe de barbatana, marisco), ou insetos (por exemplo, abelhas) ou invertebrados (por exemplo, minhocas vermelhas), ou para microrganismos heterotróficos (por exemplo, levedura; E. coli), ou para animais domésticos ou animais de estimação, ou para consumo humano direto.
[0418] Em determinadas modalidades não limitativas, a fração sólida do hidrolisado é granulada, em que a granulação da fração sólida compreende o uso de um aparelho selecionado a partir de peletizadores de alimentação, misturadores de pinos, peletizadores de disco, peletizadores de tambor e granuladores de compactação. Em determinadas modalidades, a granulação da fração sólida compreende a obtenção de grânulos com um tamanho de cerca de 0,25 mm a cerca de 5 mm. Em determinadas modalidades, a fração sólida é dispersa ou dissolvida em um meio aquoso.
[0419] O produto granulado pode ser aplicado às safras como tal, ou pode ser reconstituído como um líquido por adição de um solvente e depois aplicado às safras. Em determinadas modalidades, a formulação do hidrolisado inclui coletar apenas uma das frações líquida e sólida do hidrolisado. Por exemplo, a formação do hidrolisado pode incluir separar o
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159/229 hidrolisado em frações sólida e líquida e reter apenas uma dentre tais frações. Nesse caso, a fração líquida ou sólida pode ser aplicada às culturas como um bioestimulante da planta e/ou fertilizante. A formulação do hidrolisado também pode incluir a coleta de toda a fração sólida e a fração líquida do hidrolisado e apenas uma porção da outra fração. Alternativamente, a formulação do hidrolisado pode incluir a recolha de apenas um poro de cada uma da fração sólida e a fração líquida do hidrolisado.
[0420] Um bioestimulante vegetal produzido da maneira aqui descrita pode ser categorizado como um bioestimulante vegetal contendo aminoácidos e/ou fertilizante. Entende-se que os fertilizantes orgânicos ou estrume tradicionalmente incluem todos os materiais vegetais e animais, e que seu valor fertilizante (negligenciando aspectos bioestimulantes ou biofertilizantes) é principalmente dependente de seus respectivos carbono (C), nitrogênio (N), fósforo (P) e teores de potássio (K). Os fertilizantes orgânicos comuns incluem farinha de peixe, aves de capoeira, esterco de vaca e porco, farelo de algodão, palha de arroz e outros resíduos agrícolas. Em certas formas de realização no presente documento descritas, é derivado de um novo tipo de fertilizante orgânico não vegetal, não animal. Em determinadas modalidades, o fertilizante orgânico é adicionalmente um bioestimulante e/ou biofertilizante. Em determinadas modalidades, os nutrientes produzidos no processo microbiano no presente documento descrito são utilizados para fertilizar as lagoas onde é implementada uma policultura. Em determinadas modalidades, os nutrientes são utilizados para fertilizar culturas de plantas, incluindo, porém sem limitação, arroz.
[0421] Em determinadas modalidades, o hidrolisado obtido como no presente documento descrito é formulado como um produto líquido para aplicação foliar e/ou como um produto seco para aplicação no solo. Em determinadas modalidades não limitativas, a formulação do hidrolisado compreende formular sem quelar o hidrolisado e/ou sem separar aminoácidos do hidrolisado. Em determinadas modalidades não limitativas, o bioestimulante
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160/229 vegetal tem um teor total de nitrogênio de cerca de 0,5 % em peso a cera de 15% em peso com base em matéria seca e/ou um teor total de sólidos de cerca de 2% em peso a cerca de 100% em peso. Em determinadas modalidades, o pH do bioestimulante vegetal é cerca de 2 a cerca de 10.
[0422] Em determinadas modalidades, o nitrogênio contínuo no bioestimulante e/ou biofertilizante e/ou hidrolisado produzido, conforme descrito no presente documento, é usado por plantas às quais o material é aplicado na produção de uma ou mais dentre a seguinte: proteínas, ácidos nucleicos clorofilas etc. Em determinadas modalidades, essa fonte de nitrogênio aplicada intensifica a atividade metabólica de plantas e/ou fungos e/ou microrganismos.
[0423] Em determinadas modalidades, o carbono contido no bioestimulante e/ou biofertilizante e/ou hidrolisado produzido, conforme descrito no presente documento, é usado por microrganismos do solo para produzir massa celular e/ou para respiração e/ou para fixar N2 e/ou para intensificar a solubilização de fosfato e/ou estimular bactérias de produção de ácido indolacético. Em determinadas modalidades, o carbono contido no bioestimulante e/ou biofertilizante e/ou hidrolisado produzido, conforme descrito no presente documento, é sequestrado no solo e/ou aumenta o teor de carbono do solo. Em tais modalidades, quando o CO2 é capturado de uma fonte CO2 que, de outro modo, emite para a atmosfera, ou em que o CO2 é capturado da atmosfera, os métodos descritos no presente documento podem ser considerados uma forma de captura de carbono e sequestro quando o carbono é sequestrado como carbono de solo. Determinadas modalidades no presente documento representam uma conversão sustentável de carbono residual e outros elementos em de valor ou produtos com base biológica, tias como lisado, hidrolisado, proteínas, peptídeos, vitaminas e/ou aminoácidos. Em determinadas modalidades, permanece no produto fertilizante ou de biofertilizante final uma fração de carbono de entrada maior do que em uma conversão de carbono orgânico inserido no composto. Em determinadas modalidades, menos que
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161/229 metade do carbono inserido é perdido como emissões de CO2 na conversão em um produto final fertilizante ou bioestimulante. Em determinadas modalidades, menos que 10% do carbono inserido é perdido como emissões de CO2 na conversão em um produto final fertilizante ou bioestimulante.
[0424] Em determinadas modalidades, os métodos no presente documento incluem misturar componentes adicionais com os bioestimulantes e/ou fertilizante vegetais. Tais componentes adicionais podem ser adicionados durante hidrólise e/ou durante formulação e/ou após formulação. Em determinadas modalidades, pelo menos um conservante é adicionado ao bioestimulante vegetal, que compreende pelo menos um membro selecionado a partir de ácido cítrico, ácido benzoico, propilenoglicol, ácido propiônico, ácido sórbico, sulfato de zinco, sulfato de ferro, sulfato de cobre e cloreto de prata. Determinadas modalidades compreendem adicionar pelo menos um fertilizante e/ou macronutriente vegetal ao bioestimulante vegetal, sendo que o fertilizante ou macronutriente vegetal compreende pelo menos um elemento selecionado partir de nitrogênio, potássio, fósforo, ferro, cobre, zinco, boro, manganês, cálcio, molibdênio e magnésio. Determinadas modalidades compreendem adicionar pelo menos uma composição selecionada a partir de herbicidas, pesticidas e fungicidas ao bioestimulante vegetal, em que pelo menos uma composição é selecionada a partir de tiofanato metila, clorotalonila, captana, piperalina, fenarimol, metalaxila, triforina, etóxi tialdiazol, piretina, algicida, orizalina, aldxilaripolietoxietanol, glifosato e naftaleno. Determinadas outras modalidades compreendem a adição de nenhum herbicida, pesticidas, fungicidas ou fertilizantes sintéticos para a formulação, de modo que a formulação seja considerada um fertilizante orgânico e/ou bioestimulante orgânico e que as safras às quais o fertilizante e/ou bioestimulante orgânico são aplicados, sejam consideradas para cultivadas organicamente por entidades reguladoras relevantes.
[0425] Em algumas modalidades, os métodos são fornecidos para aplicar para os bioestimulantes vegetais descritos no presente
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162/229 documento às safras. As safras às quais os bioestimulantes e/ou fertilizante vegetais no presente documento podem ser aplicados não são particularmente limitados; no entanto, as safras exemplificativas podem incluir safras alimentares e safras ornamentais. As safras alimentares exemplificativas podem incluir frutas, vegetais, tubérculos e grãos. As safras ornamentais exemplificativas podem incluir grama de turfa, árvores, arbustos e flores. Determinadas modalidades representam um processo para tratar uma safra que compreende aplicar um bioestimulante vegetal produzido conforme descrito no presente documento a uma safra. Determinadas modalidades não limitativas compreendem um processo em que o bioestimulante vegetal produzido, conforme descrito no presente documento, é aplicado em uma quantidade de cerca de 0,454 g a 1,36 kg (0,001 a cerca de 3,0 Ibs) de nitrogênio por 92,9 metros quadros (1.000 pés quadrados). Em determinadas modalidades, um bioestimulante vegetal e/ou um fertilizante produzidos conforme descrito no presente documento são aplicados a uma safra. Em determinadas modalidades, aplicação do bioestimulante e/ou fertilizante vegetal à safra compreende aplicar o bioestimulante e/ou fertilizante vegetal e pelo menos uma composição selecionada a partir dos herbicidas, pesticidas e fungicidas à safra. Em outras modalidades, a aplicação do bioestimulante e/ou fertilizante vegetal à safra compreende aplicar o bioestimulante e/ou fertilizante vegetal e não aplicar quaisquer herbicidas sintéticos, pesticidas e fungicidas à safra. Em determinadas modalidades, a aplicação do bioestimulante e/ou fertilizante vegetal à safra é feita no contexto de cultivar safras de acordo com as exigências necessárias para qualificar alimentos orgânicos de acordo com as entidades reguladores relevantes.
[0426] Em algumas modalidades, é fornecido um processo para produzir um produto agrícola e/ou um produto para consumidor e/ou um produto industrial que compreende: preparar bioestimulantes e/ou fertilizante vegetais e/ou suplementos fúngicos pelos métodos descritos no presente documento; aplicar o bioestimulante e/ou fertilizante vegetal e/ou
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163/229 suplemento fúngico produzido conforme descrito no presente documento a uma safra; e colher a safra a fim de obter o produto agrícola; e em determinados casos processar adicionalmente o produto agrícola a fim de obter o produto de consumidor ou industrial. Em determinadas modalidades, a safra é uma safra alimentar. Em determinadas modalidades, a safra de alimentos compreende pelo menos um membro selecionado a partir de uma fruta, um vegetal, um tubérculo e um grão. Os exemplos de produtos agrícolas incluem, porém sem limitação, vegetais tais como brócolis, couve-flor, alcachofra, ervilha, feijão, couve, couve, espinafre, rúcula, beterraba, bok choy, acelga, choi sum, nabo, endívia, alface, mostarda, verduras, agrião, cebolinha alho, gai lan, alho-poró, couve de bruxelas, alcaparras, couve-rábano, aipo, ruibarbo, cardo, aipo chinês, capimlimão, aspargos, brotos de bambu, galanga, gengibre, soja, feijão mung, urad, cenouras, nabo, beterrabas, rabanetes, rutabagas, nabos, bardanas, cebolas, cebolas, alho-poró, alho, vagem, lentilhas e ervilhas; frutas, tais como tomates, pepinos, abóbora, abobrinhas, abóboras, melão, pimentão, berinjela, tomatillos, christophene, quiabo, fruta-pão, abacate, groselha, groselha, groselha, goiaba, goiaba, lucuma, pimenta, romã, kiwis, uvas, oxicoco, mirtilo, laranja, limão, lima, toranja, amora silvestre, framboesa, amoreira, ananás, figueira, amora, maçã viva, maçã, rosa mosqueta e morango; nozes, tais como amêndoas, pecãs, nozes, castanhas do Brasil, castanhas de caju, castanhas de caju, nozes de gevuina, castanhas-da-índia, nozes de macadâmia, castanhas malabar, mongongo, amendoim, pinhões e pistácios; tubérculos tais como batatas, batatadoce, mandioca, inhame e dálias; e cereais ou grãos tais como milho, arroz, trigo, cevada, sorgo, painço, aveia, centeio, triticale, fonio, trigo mourisco e quinoa. Em outras modalidades, a safra é uma safra ornamental. Em determinadas modalidades, a safra ornamental compreende pelo menos um membro selecionado a partir de grama de turfa, uma árvore, um arbusto e uma flor. Em outras modalidades, a safra é um cogumelo ou fungo. Os exemplos de safras fúngicas incluem, porém sem limitação: Agaricus bisporus (botão, champignon e cogumelo portabella), Coprinus quadrifidus, Lepista nuda e Pleurotus ostreatus
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164/229 (cogumelos de ostra). Em determinadas modalidades, um hidrolisado de proteína, conforme descrito no presente documento, é aplicado a um cogumelo ou fungo. Em determinadas modalidades, com a biomassa celular inteira (isto é, células não lisadas), conforme descrito no presente documento, os cogumelos ou fungos são alimentados, que têm a capacidade para lisar e consumir bactérias. Em determinadas modalidades, os cogumelos que lisam e consumem células bacterianas produzidos conforme descrito no presente documento incluem um ou mais dentre o seguinte: Agaricus bisporus, Coprinus quadrifidus, Lepista nuda e Pleurotus ostreatus.
[0427] Sabe-se que exposição à luz UV imediatamente antes de que os cogumelos serem colhidos pode criar teor de vitamina D2 maior que duas vezes o valor diário da FDA - isto é, uma fonte dietética vegana de vitamina D. Em determinadas modalidades, os cogumelos produzidos conforme descrito no presente documento são expostas a UV de modo que o alto teor de vitamina D2 teor resulte.
[0428] Em determinadas modalidades, os métodos são fornecidos para aumentar o rendimento da produção, das safras ou de outras plantas Em determinadas modalidades, o rendimento da produção, safras ou de outras plantas é aumento em pelo menos 5% ou em pelo menos 10% ou em pelo menos 40% em relação a uma temporada de cultivo em plantas que recebem bioestimulante ou fertilizante produzido, conforme descrito no presente documento, em comparação ao mesmo tipo de planta cultivada sob as mesmas condições, porém sem aplicação do bioestimulante. Em determinadas modalidades, o uso de fertilizantes e/ou bioestimulantes produzidos, conforme descrito no presente documento, aumenta o rendimento de safra em pelo menos cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, ou 55%, ou maior que 55% em relação a uma temporada de cultivo.
[0429] Determinadas modalidades no presente documento possibilitam a redução ou eliminação no uso de fertilizantes químicos convencionais de nitrogênio, tais como, porém sem limitação, nitrato de uréia,
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165/229 nitrato de amônio, nitrato de cálcio-amônio e/ou outros fertilizantes de nitrato ou amônio. Em determinadas modalidades não limitativas, o uso de tais fertilizantes de nitrogênio químico convencionais podem ser reduzidos ou eliminados, ao mesmo tempo que é retido o mesmo rendimento de produção, safras ou outras plantas, através da aplicação de fertilizante e/ou bioestimulante produzido, conforme descrito no presente documento. Em determinadas modalidades, a aplicação do fertilizante e/ou bioestimulante, conforme descrito no presente documento, pode ser acompanhada por uma redução de fertilizante químico convencional de nitrogênio em pelo menos cerca de 5%, 10%, 20%, 30%, 40% ou 50%. Em determinadas modalidades, a redução de fertilizante químico convencional de nitrogênio pode ser maior que 50% ou até 100% (isto é, totalmente eliminados).
[0430] Em determinadas modalidades, as composições descritas no presente documento podem ser maiores que o dobro ou mais da matéria orgânica de solo. Em outra modalidade, as composições descritas no presente documento podem aumentar a matéria orgânica de solo em até cerca de 140% ou cerca de 150% ou mais. Em outras modalidades, pode aumentar a matéria orgânica de solo em cerca de 40% a cerca de 150%, dependendo do nível inicial da matéria orgânica de solo.
PRODUTOS ALIMENTARES [0431] Os exemplos de produtos de consumidor incluem, porém sem limitação alimentos processados, tais como fatias de batatas, fatias de milho, marmeladas, geleias, cereais do café-da-manhã, pães, biscoitos, bolos, bolachas, farinha, pós de proteína, barras de proteína, bebidas esportivas e/ou de energia, batidas de proteína e/ou vitamínicos, alimentação animal, ração etc. A capacidade de processar produtos agrícolas, conforme descrito no presente documento, em tais produtos de consumidor está dentro das capacidades das pessoas versadas na técnica.
[0432] Em algumas modalidades, os processos são fornecidos para produzir um produto nutricional e/ou um ingrediente alimentar
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166/229 e/ou um item alimentar. Em determinadas modalidades, um ingrediente de alto teor de vitamina e/ou de alto teor de proteína é derivado das células de microrganismo descritos no presente documento. Em determinadas modalidades, o produto não te proteína ou gordura animal. Em determinadas modalidades, o ingrediente de vitamina de alto teor de proteína e/ou de alto teor de vitamina é incorporado em produtos alimentares, incluindo, porém sem limitação, produtos laticínios, produtos de substituição de carne, produtos de carne, produtos de substituição de carne e/ou de imitação de carne, produtos de padaria, confeitaria, barras saudáveis e de proteína, pós de proteína, bebidas esportivas e/ou energia e/ou batidas de proteína e/ou vitamínicos. Em determinadas modalidades, o ingrediente de vitamina de alto teor de proteína e/ou de alto teor de vitamina é texturizado para incorporação em produtos de carne e/ou produtos de imitação de carne. Em determinadas modalidades, o ingrediente de alto teor de proteína pode ser usado como um extensor de carne em fatias de carne.
[0433] Em determinadas modalidades, as células de microrganismo e/ou matéria orgânica, conforme descrito no presente documento, são utilizadas na produção de um produto alimentício vegetariano ou vegano. Em determinadas modalidades, estes são utilizados na produção de um produto de alimento orgânico e/ou produto alimentado livre de pesticida e/ou livre de herbicida e/ou livre de fungicida e/ou livre de antibiótico e/ou não modificado geneticamente (non-GMO). Em determinadas modalidades, são utilizados em um produto alimentício. Em determinadas modalidades, os utilizados em um produto alimentício probiótico ou em um produto alimentício prebiótico ou nutricional.
[0434] Em determinadas modalidades não limitativas, a hidrólise de proteína não é realizada. Nessas modalidades não limitativas, uma combinação de pasteurização, proteínas relativamente inteiras e/ou adição de conservante de agente fornece um produto de crescimento de cogumelo que exibe propriedades de liberação de nutriente atrasado e/ou propriedades que
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167/229 prejudicam os microrganismos competitivos e/ou propriedades que impedem elevação de temperatura indesejável no substrato de cogumelo, quando aplicado como um potencializador de crescimento de cogumelo.
[0435] A presente invenção não é limitada na aplicação da mesma aos detalhes de construção e a disposição de componentes apresentada na descrição ou ilustradas nos desenhos. A invenção é passível de outras modalidades e pode ser praticada ou realizada de várias maneiras. Além disso, a fraseologia e terminologia usadas no presente documento servem a título de descrição e não devem ser considerados como limitativos. O uso de “incluindo”, “compreendendo”, ou “tendo”, “contendo”, “envolve” e variações dos mesmos no presente documento deve abranger os itens listados após isso e equivalentes dos mesmos assim como itens adicionais.
[0436] A presente invenção é ilustrada adicionalmente pelos Exemplos a seguir, que de maneira alguma deve ser interpretada como adicionalmente limitativa. Todo o conteúdo de todas as referências (incluindo referência da literatura, patentes expeditas, pedidos de patente publicados e pedidos de patente copendentes) citados por todo o presente pedido são incorporados expressamente no presente documento a título de referência, em particular, para o ensinamento indicado acima. No entanto, a citação de qualquer referência não está destinada a ser uma admissão de que a referência é de técnica anterior.
[0437] Outros recursos da invenção ficarão evidentes no curso da descrição a seguir dos exemplos. Os exemplos a seguir estão destinados a ilustrar, porém não limitar, a invenção.
EXEMPLOS
EXEMPLO 1 [0438] A cepa Cupriavidus necator DSM 531 foi cultivada em uma mistura de gases H2 e CO2 e O2 como a única fonte de energia e carbono para crescimento.
[0439] O protocolo a seguir foi seguido para
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168/229 experimentos realizados com o uso de uma mistura de gases em fracos de soro estanques a gás.
[0440] Inóculo experimental: 5% em volume, obtido de outra cultura em frasco de soro cultivado H2.
[0441 ] A cultura em frasco de soro cultivado H2 inicial, por sua vez, recebeu 5% de inoculação de um inóculo de Cupriavidus necator cultivado em caldo de lisogenia (LB), e cultivado ~72 horas em uma mistura de gás H2/CO2/O2 em seguida da inoculação da cultura cultivada em LB original. O inóculo cultivado em LB original foi recuperado do estoque de glicerol armazenado a -80 °C.
[0442] O crescimento em frasco de soro em gás foi realizado em garrafas de vidro Wheaton de 160 ml com soro com batente e vedados (número de produto VWR 16171-385). Volume de meio líquido foi 20 ml. Os garrafas foram tampados com um batente de borracha (VWR n° 100483774) e vedação de alumínio (VWR n° 89047-008) com o uso de um alicate crimpador Wheaton operado à mão (VWR n° 80078-996). O volume de trabalho a 20 ml incluiu um Meio de Sais Mínimos de 19 ml (MSM), conforme descrito em Thermophilic Bacteria, CRC Press, Boca Raton, FL, Jacob K. Kristjansson, ed., 1992, página 87, Tabela 4 + 1 ml de inóculo (isto é, 5% de inóculo).
[0443] O MSM foi dispensado nos garrafas e os compostos gasosos foram adicionados de acordo com o seguinte: o MSM Estéril foi transferido em garrafas sob condições estéreis. 5% de inóculo cultivado em gás foi inoculado nas garrafas sob condições estéreis, e as garrafas foram tampadas com batentes de borracha e vedadas. Uma mistura de gás foi adicionada a 0,1 MPa (15 psig) às garrafas através de um coletor. Após a mistura de gás ter sido adicionada, a vedação foi fechada com alumínio para vedar as garrafas com soro. Em seguida, as garrafas foram colocadas em um incubador de frasco.
[0444] Os resultados experimentais a seguir foram obtidos de 16 garrafas com soro (14 réplicas experimentais, 2 controles)
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169/229 incubados a 30 °C, 250 RPM. Todas as 16 garrafas com soro foram purgadas simultaneamente com uma mistura de gás a 67% de H2, 24% de ar (4,8% de O2), 9% de CO2 com o uso de um coletor, conforme descrito acima. A composição de gás percorreu através do coletor foi confirmada com o uso de cromatografia gasosa (GC) antes de conectar as garrafas com soro. As garrafas foram sacrificadas para análise em 7 instantes do tempo. Os dois controles negativos foram sacrificados em TO e no último instante do tempo, respectivamente. As garrafas de controle negativo tiveram preparação idêntica às garrafas experimentais menos o inóculo e foram usadas para detectar qualquer contaminação e/ou perda ou vazamento abiótico de gás da folga de fechamento da garrafa. As leituras da pressão de folga de fechamento de gás amostras foram obtidas em controles negativos para observar qualquer sorção abiótica de CO2 & H2 no meio líquido e/ou para qualquer perda de gás devido a vazamento.
AMOSTRAGEM E PROCEDIMENTOS ANALÍTICO [0445] Todas as amostras foram obtidas sob condições estéreis com o uso de seringas e agulhas para experimentos em garrafa. A densidade óptica (OD) foi medida com o uso do espectrofotômetro Beckman Coulter DU720 UV/Vis a 650 nm com o uso de amostras de 100 microlitros.
[0446] Em cada instante do tempo uma a três garrafas replicadas experimentais foram sacrificadas para análise. O consumo gasoso dentro das garrafas com soro foi medido com o uso de um manômetro conectado a uma agulha. A pressão de gás na folga de fechamento foi medida para cada garrafa sacrificada, e uma amostra do gás na folga de fechamento foi obtida por uma seringa estanque a gás para análise por cromatografia gasosa (GC). A análise de amostras da folga de fechamento com gás por GC usou uma amostra de 100 pl de gás na folga de fechamento injetado na GC por meio de uma seringa estanque a gás. O teor da folga de fechamento com gás de H2, CO2, O2 e N2 na garrafas com soro foi quantificado em cada instante do tempo. Para amostrar o
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170/229 caldo, o septo da garrafa com soro foi limpo com EtOH e todo o teor líquido da garrafa foi retirado em uma seringa de 30 ml, com o uso da pressão de garrafa. 100 pl da amostra foi foram removidos por pipeta para a medição de OD a 650 nm. As amostras foram centrifugadas a 12.000 G por 15 minutos a 4 °C. Os péletes foram suspensos novamente em 10 ml de PBS estéril, submetidos a vórtice e filtrados a vácuo através de filtros de 0,45 pm pré-ponderados. Os filtros foram secos, e o filtro + retentado de biomassa foi ponderado para determinar o peso seco de biomassa. Os pesos secos foram determinadas para células coletadas nos filtros de membrana (0,45 pm) por meio de secagem a 60 °C por 24 horas e de resfriamento à temperatura ambiente em um dessecador e ponderação. Esse ciclo de secagem e reponderação foi continuado até que o peso permanecesse constante. Uma correlação foi desenvolvida entre OD e densidade de biomassa (peso celular seco por volume).
[0447] A correlação entre OD e densidade de biomassa é mostrada na Figura 1. A curva de crescimento para esse experimento é mostrada na Figura 2. A OD medida para réplicas experimentais individuais é representada por símbolos de diamante, e a OD é representada pela linha sólida. O crescimento logarítmico ocorreu entre 9 e 30 horas. A mudança na pressão do gás na folga de fechamento ao longo do tempo devido ao consumo dos gases pela cultura em crescimento é mostrada na Figura 3.
[0448] Adotando-se a lei do gás ideal (PV = nRT) para os gases na folga de fechamento, os moles totais de gases foram calculados, considerando a variação de temperatura em pontos de amostra. A proporção de cada gás respectivo na folga de fechamento de cada garrafa foi determinada por GC. Com o uso dos resultados da folga de fechamento com gás e dos pesos secos medidos, a proporcionalidade entre o peso celular e os moles de H2 consumidos foi determinada. A Figura 4 mostra a biomassa seca medida para cada garrafa sacrificada, plotada em relação aos mols de H2 consumidos, conforme determinado pela medição de pressão na folga de fechamento e análise por GC para cada garrafa respectiva. Esses resultados indicaram que
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171/229 entre 6,7 a 7,2 gramas de massa celular seca foram sintetizados por mol de H2 consumido, ou 3,3 a 3,6 gramas de massa celular por grama de H2.
EXEMPLO 2 [0449] A cepa Cupriavidus necator DSM 531 foi cultivada a 38 gramas por litro de densidade de célula seca em uma mistura de gases H2, CO2 e O2 com a fonte única de energia e carbono para crescimento.
[0450] O protocolo a seguir foi seguido para experimentos realizados com o uso de uma mistura de gases incluindo H2, CO2 e O2 em um biorreator de tanque agitado.
[0451] Aparelho: A cultura foi cultivada em batelada, com o uso de um fermentador de vidro de 500 ml fabricado de maneira personalizada com placa frontal PEEK. A temperatura e o pH forma controlados e monitorados um controlador comercial (Electrolab, Fermac 360, Reino Unido). Uma combinação de barras de agitação magnética e reciclagem contínua a 280 ml/min foram usadas para mistura. A reciclagem pode ser ou retirada da seção líquida de fundo do reator e retornada à folga de fechamento através de aspersores para controlar a formação de espuma ou pode percorrer em reverso para reciclar 0 gás na folga de fechamento e espuma no fundo do caldo. O fornecimento de gás foi de H2 comprimido, CO2 comprimido e ar residencial, cada um regulado a 0,14 MPa (20 psi). Ο H2 e o ar foram entregues a um proporcionador de fluxo (Matheson G2-4D151-E401/E401,0,14 MPa (20 psi)), o que definiu a fração relativa dos gases. Em seguida, a mistura de gás FE/ar foi entregue a cada fermentador através de um fluxômetro de área variável; a taxa de fluxo a cada fermentador da mesma composição de FE/ar pode ser ajustada pela válvula de agulha do fluxômetro. O gás CO2 foi separado e entregue a fluxômetros de área variável individuais em cada fermentador. As linhas de CO2 e H2/ar se alinham em uma linha única entregue ao fermentador. Um manômetro foi usado para monitorar a pressão de entrega de gás ao fermentador. O gás foi misturado no caldo de fermentador por meio de quatro pedras de difusão de 2 microns (p/n KEG592, http://morebeer.com/products/diffusion-stone-2-micron
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172/229 oxygen.html) e exaurido do reator por meio de um condensador para uma garrafa de transbordamento de espuma, em seguida, a um sistema de exaustão.
[0452] Meio: O meio usado para esse experimento é descrito o Exemplo 1. O controle de pH foi realizado com NhhOH 2N ou NaOH 2N. Ο NH4OH 2N foi preparado a partir de NH4OH 5M, Fluke 318612 (mantida a 4 °C) (120 ml) e milliQ-hW esterilizado em autoclave (180 ml).
[0453] Inóculo preparado de maneira autotrófica: o inóculo Cupriavidus necator DSM 531 foi obtido da cultura em garrafa com suro cultivado H2/CO2/O2. O inóculo para as garrafas com soro foi, por sua vez, preparado a partir de 0,5 ml de estoques de glicerol armazenados a - 80 °C para a cepa DSMZ 531. As culturas de reavivamento foram iniciadas em uma mistura de gás H2/CO2/O2 de acordo com o protocolo de garrafa com soro descrita no Exemplo 1, com 0,5 ml de estoque de glicerol adicionados a 20 ml do meio de sais mínimos (MSM) em uma garrafa com soro estanque a gás. Em seguida, essa garrafa com soro inicial foi subcultivada, 1 ml a 20 ml de MSM fresco, em 2 garrafas com soro sob a folga de fechamento padrão com gás H2/CO2/O2. Essas garrafas com soro foram incubadas a 30 °C, 250 RPM. O reavivamento inicial do estoque de glicerol em gás levou 2 dias e a subculture levou outro dia pare crescer. As duas culturas de garrafa com soro forem fornecidas como inóculo pare o biorreator. A densidade óptica (OD) do inóculo foi obtida assim como uma amostre pare análise de DNA. O inóculo cultivado em gás teve uma OD de ~1. O fermentador foi inoculado pare fornecer uma OD inicial a ~ 0,1. Em oures palavras, a garrafa com soro caldo foi diluída no biorreator a uma razão de 1:10. O inóculo foi transferido das garrafas com soro biorreator com o uso de uma seringa de 60 ml. Após a inoculação, uma OD T0 foi obtida. De modo geral, todas as medições de O D forem realizadas com um espectrofotômetro Beckman Coulter DU720 UV/Vis.
OPERAÇÃO DE FERMENTADOR:
[0454] Adição de base - pH foi controlado com NH4OH 2N.
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173/229 [0455] Controle de espuma - Caso a formação de espuma tenha preenchido uma folga de fechamento maior que % e não tenha sido controlada por aspersão ou recirculação de folga de fechamento, então, o antiespumante foi usado. (A8011, Sigma Antifoam C Emulsion, http://www.siqmaaldrich.com/cataloq/product/siqma/a8011?lanq=en&reqion=US ) [0456] Emenda de nutriente - Além do nutriente de nitrogênio fornecido pela adição de base de NhhOH, outros nutrientes minerais foram adicionados durante o percurso de modo a prolongar o crescimento e impedir quaisquer limitações de nutriente mineral e impedir que quaisquer limitações de nutriente mineral ocorram.
[0457] A Figura 5 fornece um exemplo de uma curva de crescimento para o microrganismo de Knallgas Cupriavidus necator cultivado no substrato de gás H2/CO2/O2 de acordo com esse protocolo. A unidade de eixo geométrico y é a densidade óptica (OD) medida a 650 nm e o eixo geométrico x é medido por tempo em dias. A OD final medida a 650 nm foi 132 e a densidade de biomassa seca final foi 38 gramas/litro do crescimento no substrato de gás H2/CO2/O2. O crescimento logarítmico durou o primeiro dia e dia meio, no entanto, ainda havia acúmulo de biomassa em uma taxa linear no término do percurso durante o quinto dia.
EXEMPLO 3
INOCULAÇÃO E CONDIÇÕES DE CRESCIMENTO [0458] Os organismos do gênero Rhodococcus e do gênero Cupriavidus foram testados quanto à capacidade dos mesmos de crescer nas diferentes fontes de carbono (Figura 6). As colônias de cepas cultivadas em placas de ágar em LB a 30 °C oram transferidas em frascos que contêm 10% (v/v) dos meios indicados (isto é, heterotrófico ou quimioautotrófico) por 3 a 20 dias a 30 °C e 250 rpm. A cepa R. opacus DSM 44193 exibiu crescimento apenas sob condições de crescimento heterotrófico, conforme medido por densidade óptica (OD) a 650 nm em meio MSM (Meio A de 1 I: 9 g de Na2HPO4.12H2O, 1,5
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174/229 g de H2PO4, 1,0 g de NH4CI e 0,2 g de MgSCM.ZhbO por 11;10 ml de Meio B :50 mg de citrato de amônioférrico e 100 mg de CaCL por 100 ml; 10 ml de Meio C :5 g de NaHCOs por 100 ml; e 1 ml de Solução de Mineral-Traço: 100 mg de ZnSO4.7H2O, 30 mg de MnCl2.4H2O, 300 mg de H3BO3, 200 mg de COCI2.6H2O, 10 mg de CUCI2.2H2O, 20 mg de NÍCI2.6H2O e 30 mg de Na2MoO4.2H2O por 1 I) suplementado com 40g/l de glicose. A cepa R. opacus DSM 43205 mostrou taxas de decrescimento idênticas sob condições heterotróficas atingindo O.D = 9,0. A cepa DSM 43205 também pôde crescer em condições quimioautotróficas (meio MSM suplementado com 66,7% de H2, 9,5% de CO2, 5% de O2 e 18,8% de N2). Rhodococcus sp. (DSM 3346) exibiu crescimento sob condições heterotróficas e condições quimioautotróficas (Meio DSMZ 81: 1 I de Meio Mineral para crescimento quimiolitotrófico : 2,9 g de Na2HPO4.2H2O, 2,3 g de KH2PO4, 1,0 g de NH4CI, 0,5 g de MgSO4.7H2O, 0,5 g de NaHCOs, 0,01 de g de CaCI2.H2O e 0,05 g de citrato de Fe(NH4) por 1 I; e 5 ml de Solução de Mineral-Traço, suplementado com 80% de H2, 10% de CO2 e 10% de O2). Cupriavidus necator (DSM 531) pôde crescer sob condições heterotróficas e quimioautotróficas (meio descrito para Cepa DSM 43205) (Figura 6).
EXEMPLO 4 [0459] Em um grupo de experimentos, as colônias de cepas Rhodococcus cultivadas em placas de ágar em LB a 30 °C foram transferidas em fracos de soro estanques a gás que contêm o meio de crescimento e misturas de gás. (O inóculo cultivado em LB original foi recuperado anteriormente do estoque de glicerol armazenado em -80 °C). O crescimento em frasco de soro em gás foi realizado em garrafas de vidro Wheaton de 160 ml com soro com batente e vedados (número de produto VWR 16171-385). Volume de meio líquido foi 10 a 20 ml. As garrafas foram tampadas com um batente de borracha (VWR n° 100483-774) e vedação de alumínio (VWR n° 89047-008) com o uso de um alicate crimpador Wheaton operado à mão (VWR n° 80078-996). O meio de crescimento estéril foi transferido em garrafas sob condições estéreis. O inóculo foi introduzido em garrafas sob condições estéreis, e as garrafas foram
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175/229 tampadas com batentes de borracha e vedados. Uma mistura de gás foi adicionada às garrafas. Após a mistura de gás ter sido adicionada, a vedação foi fechada com alumínio para vedar os garrafas com soro. Em seguida, as garrafas foram colocadas em um incubador de frasco. As garrafas foram incubadas a 30 °C, 250 RPM. Todas as amostras foram obtidas sob condições estéreis com o uso de seringas e agulhas. O crescimento foi avaliado por medição de densidade óptica (OD) em um espectrofotômetro a 650 nm.
[0460] Em seguida do procedimento descrito acima, a cepa Rhodococcus opacus DSM 43205 exibiu crescimento sob condições quimioautotróficas no seguinte meio: meio MSM (1 I de Meio A: 9 g de Na2HPO4.12H2O, 1,5 g de H2PO4, 1,0 g de NH4CI e 0,2 g de MgSO4.7H2O por 1 I; 10 ml de Meio B: 50 mg de citrato de amônio férrico e 100 mg de CaCI2 por 100 ml; 10 ml de Meio C: 5 g de NaHCOs por 100 ml; e 1 ml de Solução de Mineral-Traço: 100 mg de ZnSO4.7H2O 30 mg de MnCI2. 4H2O, 300 mg de H3BO3, 200 mg de COCI2.6H2O, 10 mg de CuCI2.2H2O, 20 mg de NÍCI2.6H2O e 30 mg de Na2MoO4.2H2O por 1 I), suplementado com uma mistura de gás que conteve 66,7% de H2, 9,5% de CO2, 5% de O2 e 18,8% de N2. O volume de líquido foi 20 ml e a folga de fechamento com gás volume foi 140 ml.
[0461] A Rhodococcus sp. DSM 3346 exibiu crescimento sob condições quimioautotróficas no seguinte meio: Meio de DSMZ 81 (1 I de Meio Mineral para crescimento quimiolitotrófico: 2,9 g de Na2HPO4.2H2O, 2,3 g de KH2PO4, 1,0 g de NH4CI, 0,5 g de MgSO4.7H2O, 0,5 g de NaHCOs, 0,01 g de CaCI2.2H2O e 0,05 g de citrato de Fe(NH4) por 1 I; e 5 ml de Solução de Mineral-Traço), suplementado com uma mistura de gás que conteve 80% de H2, 10% de CO2 e 10% de O2. O volume de líquido foi 10 ml e a folga de fechamento com gás volume foi 150 ml.
[0462] As células foram colhidas após 72 horas, e os perfis de ácidos graxos contidos em líquidos neutros, tais como triacilglicerol (TAG), produzido por cada cepa foram determinados por cromatografia gasosa e espectrometria de massa (GC/MS).
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EXEMPLO 5 [0463] Em outro experimento, a cepa R. opacus DSM 43205 foi cultivada em uma mistura de gases H2 e CO2 e O2 como fontes únicos de energia e carbono para crescimento e uma garrafa de um litro. O inóculo foi recuperado de uma alíquota de estoque de água + MSM armazenado a - 80 °C. O meio usado foi MSM, conforme descrito acima. Uma alíquota do estoque armazenada a -80 °C foi inoculada em MSM (20 ml) em uma garrafa com soro pequena. O crescimento de frasco de soro e gás foi realizado, conforme descrito acima, em uma garrafa com soro de 160 ml de vidro Wheaton com batente e vedada, com uma mistura de gás que consiste em 67% de H2, 24% de ar (4,8% de O2), 9% de CO2. A garrafa foi colocada em um incubador de frasco de agitação e incubado a 30 °C, 250 RPM.
[0464] Em seguida a aproximadamente 72 horas de crescimento, um inóculo de subculture de alta densidade foi preparado a partir da cultura em garrafa com suro de gás centrifugando-se e ressuspendendo-se em MSM fresco. O inóculo de alta densidade foi inoculado em 100 ml de MSM em uma garrafa de vidro de 1 I com uma tampa estanque a gás, que tem duas válvulas que permitirem influxo e efluxo de gás. A misture de gás na seguinte razão foi fornecida à folga de fechamento da garrafa de 1 I: H2: 71%; O2: 4,2%; N2: 15,8%; CO2: 9,0%.
[0465] Após a adição de gás, a garrafa de um litro vedada foi colocada em um incubador de fresco de agitação a 28 °C e 200 rpm. Os gases forem renovados uma vez por dia. A cultura cresceu sob gás até que uma OD final a 650 nm tivesse atingido uma OD = 1,27.
[0466] O sequenciamento de DNA foi realizado nas células finais recuperadas após o crescimento sob gás na garrafa de 1 I pare confirmar a identidade de cepa da cultura final. As sequências de rRNA 16S forem determinadas com o uso de iniciadores 27F e 800R. Com ambos os iniciadores, as ocorrências do BLAST orem identificadas como Rhodococcus sp., Rhodococcus opacus, Rhodococcus wrastislaviensis, GenBank numbers
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EU 127452.1, AB032565.1 eAY940038.1, respectivamente.
EXEMPLO 6 [0467] Inúmeras espécies de oxi-hidrogênio estão publicamente disponíveis ou podem ser isoladas com o uso de técnicas que são descritas no presente documento. Por exemplo, pelo menos 238 cepas diferentes de Rhodococcus e pelo menos 55 cepas diferentes de Cupriavidus estão disponíveis a partir de depositories públicos de cepas DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) assim como cepas de muitos outros gêneros que incluem microrganismos de oxi-hidrogênio incluindo Hydrogenovibrio, Rhodopseudomonas, Hydrogenobacter, Xanthobacter e Hydrogenotermus. As cepas de oxi-hidrogênio também podem ser obtidas por processos rotineiros, tais como isolamento de amostras do solo ou amostras de fluido geotérmico com o uso de métodos de enriquecimento. O teste das cepas para crescimento de oxi-hidrogênio e a capacidade para produzir composto orgânico incluindo aqueles com de carbono C5 ou maior incluindo, porém sem limitação, aminoácidos e proteínas sob as condições quimiossintéticas que são rotineiros na técnica. Por exemplo, a capacidade de uma cepa Rhodococcus de crescer sob condições de oxi-hidrogênio com o uso de CO2 como uma fonte de carbono pode ser realizada, conforme descrito acima nos Exemplos anteriores. Outros métodos para crescimento sob condições de oxi-hidrogênio (knallgas) com o uso de CO2 como uma fonte de carbono são descritos em “Thermophilic bacteria,” Jakob Kristjansson, Capítulo 5, Seção III, CRC Press, 1992, páginas 86 a 88 e funcionam bem com uma ampla variedade de cepas extraídas de uma ampla variedade de gêneros. A avaliação da produção de compostos orgânicos, tais como aqueles produzidos de maneira quimiossintética por espécies de oxihidrogênio, também é rotineira na técnica. Por exemplo, a cromatografia gasosa e espectrometria de massa (GC/MS) podem ser usadas, conforme descrito no Exemplo 5. Outros métodos incluem extração de lipídeo, cromatografia de camada fina (TLC), cromatografia gasosa (GC), cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) e espectrometria de massa (MS), conforme descrito em
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Waltermann et al. (2000) “Rhodococcus opacus strain PD630 as a new source of high-value single-cell oil? Isolation and characterization of triacylglycerols and other storage lipids” Microbiology 146:1.143 a 1.149.
EXEMPLO 7 [0468] Aproximadamente, cinco quilogramas de biomassa (peso seco) foram produzidos pela cepa Cupriavidus necator DSM 531 cultivada em uma mistura de gases H2, CO2, e O2, conforme a única fonte de energia e carbono para crescimento. A partir dessa biomassa um óleo solúvel em hexano foi extraído e analisado. O protocolo a seguir foi usado na produção da biomassa de matérias-primas de H2, CO2, e O2 em biorreatores de tanque agitado e, em seguida, extrair o óleo da biomassa.
[0469] Aparelho: As culturas C. necator foram cultivadas em batelada, com o uso de reatores de 20 litros da Applikon Biotechnology (Applikon) (Figura 7 e Figura 8).
[0470] O biorreator: Cada biorreator consistiu em um vaso de vidro montando em um estande de suporte com uma placa frontal de aço inoxidável que tem uma vedação elastomérica. A placa frontal teve portas para inúmeros condutores de passagem, dentre os quais todas tiveram uma vedação elastomérica para impedir vazamento de gás dentro ou fora do reator. Esses condutores de passagem permitiram que poços termométricos, sondas de pH, sondas de oxigênio dissolvido, entradas de gás, entradas de líquido, saídas de gás, portas de amostragem de líquido entre outros fossem montados na placa frontal.
[0471] Os sensores de biorreator: Uma sonda de temperatura localizada em um poço termométrico foi usada para monitorar a temperatura e permitir o controle de um aquecedor. A sonda de pH foi usada para monitorar o pH e, caso necessário, controlar a adição de soluções tamponadas de pH superior ou inferior. Um sensor de espuma foi usado para controlar a adição de antiespumante. Uma sonda de oxigênio dissolvida foi usada para medir os níveis de oxigênio no líquido do reator e pode ser usada
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179/229 para controlar a agitação ou abrir/fechar o fluxo de gás para o reator. Todos os sensores foram pulverizados, controlados pelo controlador/console de biorreator e forneceram entradas aos mesmos.
[0472] Agitação: Um agitador passou através da placa frontal com uma vedação completa e resfriamento magnético. O agitador teve um motor externo que foi um item separado que se encaixa ao redor da porção externa da haste de agitação. A velocidade de motor foi controlada por um controlador externo que permitiu controle preciso das velocidades de rotação.
[0473] Aquecimento/Resfriamento: O reator foi aquecido por um cobertor de aquecimento elétrico externo, que usou um controlador de ciclo fechado proporcional-integral-derivado (PID) controlado pela sonda de temperatura Pt 100 por meio do controlador de sistema biorreator. A fim de manter temperaturas, um dedo de resfriamento também foi encanado para impedir o superaquecimento da meios pelo motor agitador.
[0474] Montagem do Biorreator: Os sistemas de biorreator foram montados em retentores de tripé de metal. Braçadeiras e correntes foram usadas para ficar esse tripé às montagens de escora localizadas no interior de uma capela fumê a fim de impedir que o reator seja derrubado. A preparação inteira do tripé e reator foi colocada em um recipiente plástico oco para fornecer recipiente secundário.
[0475] Um diagrama esquemático dos biorreatores e sistemas de suporte é mostrado Figura 7. Os dois biorreatores de 20 I foram localizados em uma capela fumê, conforme mostrado na Figura 8. Os biorreatores forma instalados no interior de uma capela fumê para conter liberações de gás hidrogênio. Todos os controles e fontes de gás foram localizados fora da capela fumê assim como os cilindros de gás, controladores de reator, fluxômetros de massa, sensores de hidrogênio e válvulas de controle de gás. São mostrados na Figura 8 dois reatores de 20 litros em uso durante crescimento de C. necator sob os gases H2, CO2 e O2 como a única fonte de energia e de carbono.
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180/229 [0476] Controlador/Console: O controlador/console de sistema de biorreator conteve os componentes que controlaram e operaram o sistema de biorreator. Essas unidades forneceram o pó, controle de temperatura, controle de agitação, entradas recebidas dos sensores, ligação e desligamento das bombas de alimentação (ácido, base, antiespumante e nutrientes adicionais) com base em entradas de sensor e foram usados para ligar/desligar os fluxos de gás com válvulas solenoides e rotâmetros. Devido à falta de todos os componentes de aço inoxidável, essas unidades não foram usadas para controlar o hidrogênio para minimizar o risco de vazamentos de hidrogênio. As unidades de controlador/console foram localizadas fora da capela na direção contrária aos biorreatores para minimizar a exposição ao hidrogênio no caso de um vazamento e para minimizar o tempo que os operadores gastam trabalhando diretamente ao redor dos biorreatores. A Figura 9 mostra os controladores Applikon e consoles que foram usados para operar os reatores. Estão incluídos na Figura 9 os controladores, consoles, controles agitadores, sistema de detecção de gás explosivo, fluxômetros de massa, controladores de nível, reservatórios de controle de base, reservatório de adição de meio e reservatório de controle de espuma. Todos os controles de reator foram localizados fora da capela.
[0477] Entrega de Gás: O gás foi entregue à porção inferior do biorreator através de uma preparação de aspersor que passou através da placa frontal. Uma válvula localizada imediatamente fora do reator possibilitou que o fluxo de gás fosse desligado manualmente em cada reator separadamente. A linha de alimentação de gás encanada ao reator foi uma linha de aço inoxidável flexível com um filtro de 0,2- micron instalado no cabeçote do reator para minimizar possível contaminação. Os fluxômetros de massa localizados fora da capela foram usados para controlar as taxas de fluxo para os reatores. As linhas entre os cilindros e fluxômetros de massa tiveram válvulas tanto manuais quanto solenoides para desligamento tanto manual quanto automático dos gases. As válvulas solenoides foram conectadas a sensores de
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181/229 gás explosivos que desligam automaticamente os fluxos de gás quando o foi detectado no laboratório ou na capela.
[0478] Armazenamento de gás: Um gabinete de gás foi usado para armazenar os cilindros de hidrogênio. O gabinete de gás foi montado no lugar inclui ventilação e irrigadores. O gabinete incluiu espaço o suficiente para armazenar múltiplos cilindros a fim de permitir fácil comutação entre um cilindro velho para novo.
[0479] Controles de Segurança: Detectores de gás explosivos foram usados para determinar a presença de hidrogênio no laboratório. Múltiplos sensores foram localizados em posições estratégicas ao redor do laboratório na capela. Esses detectores de gás foram configurados para desligar as válvulas solenoides nas linhas de entrega de gás caso o hidrogênio tivesse sido detectado, o que desliga o fluxo de gás até os reatores.
[0480] Bomba peristáltica: Uma bomba peristáltica adicional foi localizada na capela. Essa bomba foi usada para transferir meio fresco nos reatores no início de um percurso de batelada e usado para remover os meios e biomassa no término de um percurso de batelada.
[0481] Armazenamento em meio: Galões plásticos ou garrafas de vidro foram usados para armazenar a meio fresco e a biomassa recuperada após um percurso de batelada.
[0482] Meio: O meio MSM usado para esse experimento é descrito em Thermophilic Bacteria, CRC Press, Boca Raton, FL, Jacob K. Kristjansson, edição, 1992, página 87, Tabela 4.
[0483] Inóculo: Cupriavidus necator inóculo foi preparada a partir de 0,5 ml de estoques de glicerol armazenados a - 80 °C para a cepa DSMZ 531. As culturas de reavivamento foram iniciadas em uma mistura de gás H2/CO2/O2 de acordo com o protocolo de garrafa com soro descrita no Exemplo 1, com 0,5 ml de estoque de glicerol adicionados a 20 ml do meio de sais mínimos (MSM) em uma garrafa com soro estanque a gás. O inóculo foi fornecido em múltiplos recipientes, que foram combinados no interior de um
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182/229 gabinete de biossegurança em uma garrafa de meio estéril única equipada com um conjunto de tampa de transferência estéril. Uma OD e faixa do inóculo foi obtida. Em seguida, o inóculo foi transferida no reator com o uso de tubulação de transferência estéril e uma bomba peristáltica. Após a inoculação do reator, uma OD de iniciação da batelada foi obtida com o uso do conjunto de amostra.
[0484] Preparação e adição de meio: Todo o meio foi preparado com o uso das receitas fornecidas em Thermophilic Bacteria, CRC Press, Boca Raton, FL, Jacob K. Kristjansson, ed., 1992, p. 87, Tabela 4, com exceção de quantidades maiores exigidas para uma escala de 20 litros. O componente de meio principal (A) foi preparado em 20 litros de galões Nalgene equipados com conjuntos de tampa e filtro de transferência de líquido estéril. O meio foi esterilizado em autoclave nos galões e transferidos aos reatores em autoclave com o uso de tubulação estéril e bombas peristálticas para evita a contaminação. Os componentes de meio menor (B e D) foram preparados em reservatórios grandes e forma esterilizados colocando-se as soluções em seringas através de um filtro de uso único estéril de 0,2 micron diretamente no reator com o uso dos septos. O uso dos septos minimizou o risco de contaminação uma vez que permitiu que a abertura do reator fosse evitada. Um quarto componente de meio menor (C) foi manipulado semelhantemente ao A pelo fato de que um reservatório maior equipado com uma tampa de transferência estéril foi preparado com meio, esterilizado em autoclave e o meio foi transferido com o uso de tubulação estéril e uma bomba peristáltica.
[0485] Preparação de iniciação de biorreator: Antes de iniciar bateladas recentemente inoculadas, o biorreator foi preparado para esterilização em autoclave. A placa frontal do reator foi montada no lugar. As linhas de transferência foram conectadas, presas e o término foi coberto com folha e vedados com fita de autoclave. O filtro de 0,2 micron foi conectado à entrada de gás do aspersor a fim de esterilizar os gases de entrada. Uma linha de respiradouro foi presa e vedados com folha. O poço termométrico, condensador, sonda de nível de espuma, serpentina de resfriamento, aparelho
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183/229 de amostragem, tubo de extração de líquido ajustável e sonda de oxigênio dissolvida foram instaladas. A porta para a sonda de pH foi coberta e vedada com folha. Em seguida, o reator foi esterilizado em autoclave por 60 minutos a 131 °C com um ciclo seco. A sonda de pH foi esterilizada com uma combinação de flambagem rápida, etanol e luz UV. Após o biorreator ter esterilizado em autoclave e resfriado à temperatura ambiente, a sonda de pH foi inserida no reator ao mesmo tempo que o reator e sonda estiveram no interior de um gabinete de biossegurança. Em seguida, o reator foi montado na capela; isto é, linhas de resfriamento, linhas de transferência, controles eletrônicos, aquecedor, motor de agitação etc. foram todos conectados. O mais rápido possível, o componente de meio A foi transferido no reator a fim de minimizar o período de tempo em que a sonda de pH foi seca. O controle de temperatura e a agitação foram desligados e, caso necessário, a água de resfriamento também. Uma vez que a temperatura do meio atingiu a temperatura desejada, os componentes de meio B, C, e D foram transferidos no reator por meio dos métodos descritos acima. Em seguida, o controle de pH foi iniciado.
[0486] Biorreator de inoculação: A inoculação fresca foi realizada, conforme descrito acima. Em vários percursos, o meio e a biomassa da batelada anterior foram removidos por meio da bomba peristáltica com exceção de um volume residual, tipicamente menos de um litro, que foi usado para inocular a próxima batelada. Durante a inoculação com volume residual da batelada anterior, após a remoção do volume aparente da cultura, o componente de meio estéril A à temperatura ambiente foi transferida no biorreator e o aquecimento foi ligado. Em seguida, o resto dos componentes de meio B, C e D foram transferidos por meio dos métodos descritos acima. Em seguida, o fluxo de gás foi ligado, a agitação aumentada e o controle de pH ligado. Nesse instante, a execução foi considerada como iniciada e uma OD inicial foi obtida. Após o reator ter atingido a temperatura operacional, o resfriamento foi ligado.
[0487] A Composição de Gás e Taxas de Fluxo: As
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184/229 composições de gás usado foram aquelas especificadas na seção 5. As razões foram controladas com o uso de controladores de fluxo de massa. As taxas de fluo de gás estavam em uma faixa de 0,05 a 0,3 WM de fluxo total de gás. As taxas típicas de fluxo foram 0,05 de WM ao longo dos finais de semana e 0,2 de WM durante a semana quando ambos os reatores estiverem em operação tiverem controle de espuma. Nos percursos que não usam controle de espuma, os valores típicos de 0,05 a 0,075 WM foram usados para reduzir a espuma a níveis manipuláveis.
[0488] Controle de pH: Hidróxido de amônio (2,0 M) foi usado para controlar o pH do meio no biorreator. A solução de hidróxido de amônio foi preparada por esterilizando-se 1.200 ml de água MilliQ em autoclave em uma garrafa de meio de 2 litros equipado com uma tampa de transferência estéril e conjunto de filtro e adicionando-se 800 ml de hidróxido de amônio a 5,0 M esterilizado por filtro no interior de um gabinete de biossegurança. O hidróxido de amônio foi transferido automaticamente no reator por meio da bomba peristáltica, que foi controlado pelo controlado de biorreator com o uso do sinal de sonda de pH.
[0489] Adição/Emenda de Nutriente: As soluções de emenda de nutriente usadas foram iguais àquelas usadas para o meio inicial, no entanto, com diferentes quantidades. Os nutrientes minerais foram adicionados durante a execução de modo a prolongar crescimento e impedir que quaisquer limitações minerais de nutriente ocorram. As soluções de emenda foram adicionadas ou diretamente no reator com o uso de uma seringa e com esterilização de um filtro de 0,2 micron ou adicionado através de tubulação estéril que permaneceu conectado ao reator com o uso de uma bomba peristáltica. O volume total do reator também foi ajustado manualmente regularmente (tipicamente todo dia) removendo-se porções pequenas dos meios de reator e biomassa a fim de manter um volume de trabalho de aproximadamente 15,5 I. Isso foi realizado para compensar as adições de água das emendas de nutriente e geração de água pela respiração celular a fim de manter cinética de mistura
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185/229 estável e impedir sobrefluxo.
[0490] Amostragem: Pequenas alíquotas da solução de meio foram obtidas em intervalos regulares do biorreator por meio do conjunto de amostra de líquido. Estas foram usadas para realizar as medições OD600 em um Eppendorf Biofotometer Plus assim como fornecer as amostras microfundidas para análise de DNA. As amostras microfundidas foram giradas a 10.000 rpm por 10 min e decantadas e armazenadas a -20 °C.
[0491 ] O controle de espuma: Após atingir uma OD de aproximadamente 15, a espuma começa a preencher folga de fechamento, e caso não controlado, a espuma preenchería facilmente o reservatório de transbordamento de 2 litros de um dia para o outro quando as taxas de fluxo de gás de 0,2 de WM são usadas. Um sensor de espuma foi usado para determinar a presença de espuma e ligar uma bomba que entrega uma solução de emulsão de antiespumante à base de silicone. As taxas de fluxo de gás e velocidades de agitador foram ajustadas conforme necessário em bateladas 11 e 12 para impedir o acúmulo de espuma excessiva. Nas taxas de fluxo de gás de 0,05 WM a 0,075 WM, os biorreatores puderam ser operados sem antiespumante. No entanto, a espuma preenche a folga de fechamento; o que faz com que uma pequena quantidade flua no recipiente de transbordamento de espuma por meio da saída de gás.
[0492] Durante as bateladas, a temperatura, pH e OD são monitoradas e registradas. A pureza de célula foi monitorada com o uso método de riscado em placas. Um total de 9 bateladas na escala de 20 litros como uso de 0. necator foi realizado. As densidades ópticas finais (ODs) das bateladas estavam tipicamente entre 30 e 50. Os resultados dessas bateladas de 20 litros são resumidos na Tabela 1.
TABELA 1.
RESULTADOS DE UMA SÉRIE DE EXECUÇÕES EM BATELADA PARA OU C. NECATOR EM UMA ESCALA DE 3 LITROS E 20 LITROS.
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186/229
Batelada Escala Reator Data de início Data de término OD inicial OD Final Duração (H) Faixa de fluxo de gás total (WM) Faixa de gás de agitação (rpm) Inoculante
1 3 I 9/4 9/6 0,63 28 57,7 0,1 a 0,5 850 240 ml de C. necator cultivado sob gás das garrafas de soro
2 3 I 9/9 9/13 2,96 32,4 103 0,2 a 1 900 ~200 ml da batelada 1
3 3 I 9/16 9/20 5 40 99,9 0,2 a 1 1.000 a 1.200 ~200 ml da batelada 2
4 20 I A 9/23 10/3 0,94 42 248 0,1 a 0,3 600 a 800 ~600 ml da batelada 3
5 20 I B 10/1 10/9 1,1 6,7 188 0,05 a 0,2 200 ~650 ml da batelada 4
6 20 I A 10/4 10/11 0,085 42 165 0,05 a 0,2 800 a 900 -400 ml C. necator cultivado sob açúcar dos frascos
7 20 I B 10/11 10/18 1,2 50 168 0,05 a 0,2 200 a 850 -500 ml da batelada 6
8 20 I A 10/11 10/18 2,1 42,5 167 0,05 a 0,2 800 a 980 <1 Ida batelada 6
9 20 I B 10/18 10/25 3,5 49,4 165 0,05 a 0,2 750 a 850 < 1 Ida batelada 7
10 20 I A 10/18 10/24 1,9 39,2 143 0,05 a 0,2 800 a 950 <1 Ida batelada 8
H (SI) 20 I A 11/1 11/7 2,34 29,2 143 0,04 a 02 800 a 850 -750 ml da batelada 12
12 20 I B 10/25 11/5 0,56 37,3 264 0,05 a 0,1 500 a 750 <500 ml da batelada 10
[0493] Oito das bateladas atingiram uma OD final superior a 39, uma que foi executada com fluxos de gás inferiores (n° 11) atingiu
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187/229 uma OD de 30, e uma batelada que foi limitada a baixas taxas de agitação (n° 5) atingiu apenas uma OD de 6,7. A OD mais alta alcançada foi 50 na batelada n °7. Toda a biomassa que cresceu foi centrifugada fora do caldo de cultura.
[0494] Centrifugação e Armazenamento de Biomassa: Uma centrífuga Beckman Coulter Allegra X-12R foi usada para centrifugar o caldo colhido de um percurso de batelada para recuperar a biomassa. A refrigeração Allegra-12R até -10 °C e é equipada com um rotor de balde oscilante SX4750 com capacidade para 3.750 rpm e tem uma capacidade de 3 I. Após uma batelada, a biomassa e o meio foram transferidos fora de um biorreator com o uso de uma bomba peristáltica em polipropileno galões para combustível de 10 I. Os galões para combustível de biomassa e meio foram armazenados em um refrigerador até que fossem centrifugados. A biomassa foi centrifugada em 3 litros em uma repartição de tempo entre quatro garrafas centrífugas de policarbonato de 750 ml. A centrífuga foi operada 3.750 rpm a 4 °C por 30 minutos. O sobrenadante foi removido de decantação e esterilizado com alvejamento antes do descarte. A biomassa desidratada para uma única batelada foi combinada e armazenada em garrafas de polipropileno em um refrigerador.
EXEMPLO 8
RUPTURA E EXTRAÇÃO DE CÉLULA DE ÓLEOS DE BIOMASSA MOLHADA DA CEPA CUPRIAVIDUS NECATOR [0495] Determ inou-se que a extração de óleo eficiente de amostras de material celular molhado pode ser obtida com o uso de uma lise celular seguida por um procedimento de extração de isopropanol/hexano descrito abaixo. Com o uso desse procedimento, um extrato de hexano cru foi recuperado a partir da biomassa C. necator cultivada a partir de CO2 como a única fonte de carbono da qual um óleo microbiano foi obtido.
[0496] A fim de estimar o teor de umidificação da biomassa molhada, dois fracos vazios foram identificados, e 1 grama de biomassa molhada foi alocada em cada um dos frascos e secos por 12 horas a
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188/229 °C com o uso de forno a vácuo (Binder Safety Vacuum Oven, Model VDL 1159030-0040). A fim de ter números estatisticamente significativos, as amostras foram executadas em duplicata.
[0497] A fim de estudar os parâmetros de processo e as condições de operação para extração de lipídeos com o uso dos solventes hexano e 2-propanol, 10 g (A1) e 9,4 g (A2) de biomassa molhada foram misturados em 33,5 ml e 31,5 ml de 2- Propanol respectivamente. Em seguida, a suspensão celular foi transferida em béqueres de 250 ml, e os béqueres foram mantidos em um banho de gelo e foram submetidos à sonicação em um modo de batelada por 20 minutos. A biomassa molhada foi sonicada com 2-propano para rompimento celular completo, lise celular e a fim de recuperar óleos das células microbianas. Um sonicador QSonica Q700 foi usado. Uma sonda de temperatura foi imersa no béquer a fim de registrar a mudança na temperatura durante sonicação. O rompimento de células com o uso de ondas de sonicador ou de sondas de ultrassom é um método muito comum de lise celular; ultrassom é uma onda de pressão sonora cíclica com frequências de 20 kHz até diversos gigahertz. Durante o ciclo de baixa pressão, ondas ultrassônicas de alta intensidade criam bolhas de vácuo pequenas no líquido. Quando as bolhas obtêm um volume no qual não podem mais absorver energia, estas entram em colapso violentamente durante um ciclo de alta pressão e as forças de cisalhamento resultantes para remover o envelope celular. Conforme mostrado na Figura 10, após um rompimento celular completo, a cor da biomassa foi de marrom para creme. A pasta fluida de biomassa antes da sonicação é mostrada à esquerda na Figura 10, e após a sonicação à direita. A suspenção de biomassa inicial foi viscosa, porém após a sonicação, a viscosidade da amostra diminuiu, talvez devido ao efeito de cisalhamento macromolecular.
[0498] Em seguida da celular devido á sonicação em 2-propanol, 33,5 ml e 31,5 ml de hexano foram adicionados em A1 e A2 respectivamente e incubados a 60 °C durante uma hora. A mistura foi agitada a 100 rpm. Após um período de reação de uma hora, as amostras foram
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189/229 transferidas em tubos centrífugos a 3.200 g por 15 minutos com o uso de uma centrífuga de mesa (Eppendorf centrífugo R). O sobrenadante, que é a mistura de hexano, 2-propanol e óleos dissolvidos, lipídeos e polímeros, foi transferido em um frasco Rotavap e destilado a 60 °C com o uso de um evaporador giratório (Rotavap R-210/215). O hexano e 2-propanol foi evaporado a 60 °C e a pressões de vácuo inferiores a 200 mbar. Após a evaporação de hexano e 2-propanol, aproximadamente 4 gramas de óleo amarelos foram recuperados.
EXTRAÇÃO DE BIOMASSA MOLHADA DE 200 G A 250 GRAMA POR BATELADA [0499] Após os resultados de extração de pequena escala terem sido confirmados, o trabalho de extrações em larga escala começaram. 4 kg de biomassa de C. necator molhada foram divididos em 20 bateladas (0,2 kg por batelada) para extração, e cada batelada foi transferida para um frasco de agitação. A cada frasco foram adicionados 650 ml de isopropanal. 5 ml de solvente de 2-propanol foi usado a cada 1,5 grama de biomassa molhada. A biomassa foi bem misturada com 2-propanol a fim de criar uma suspensão uniforme.
[0500] Após criar uma suspensão uniforme, a sonicação foi usada para lisar as células. Um sonicador QSonica Q700 foi operado em modo contínuo para rompimento celular completo. A célula de fluxo do sonicador foi fixada à sirene, e os tubos foram conectados às portas de entrada e saída da célula de fluxo. A tubulação de entrada na célula de fluxo passou através de uma bomba peristáltica e foi imersa no frasco que contém a suspensão de biomassa, ao passo que a tubulação de saída da célula de fluxo foi colocada no mesmo frasco para permitir circulação. Afim de realizar uma lise celular completa, 1 a 1,2 kJ de energia por grama de biomassa molhada foi dissipada. Uma sonda de temperatura foi imersa no béquer de amostra para registrar a mudança na temperatura durante sonicação.
[0501] Cada uma das 20 porções produzidas a partir da entrada de 4 kg foi sonicada em modo de batelada a 100% de amplitude por
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190/229 minutos com intervalos de 30 segundos entre cada 1 minute de estouro de sonicação.
[0502] Após sonicação com 2-propanol, 5 ml de hexano por grama de biomassa molhada foi adicionada, em seguida, as amostras foram incubadas com o uso de Kuhner Shaker X a 60 °C por uma hora. 650 ml de hexano foram adicionados a cada batelada que, em seguida, foram incubados por 60 minutos a 60 °C.
[0503] As amostras foram transferidas em tubos centrífugos e foram centrifugados com o uso de uma centrífuga Eppendorf R a 3.200 g por 15 minutos. Cada batelada da biomassa foi distribuída em 4x400 ml de tubos centrífugos Eppendorf R. A velocidade de rotação da centrífuga foi definida a 4.000 rpm, o que é equivalente a 3.200 g para o raio de rotor de 18 cm.
[0504] Após a separação do pélete de célula, os extratos orgânicos, isto é, sobrenadante foram transferidos a um frasco de mistura de evaporador giratório (Rotavap). O Rotavap foi usado para separar os óleos e polímeros de hexano e 2-propanol. O hexano e 2-propanol foram evaporados a 60 °C e 200 a 100 mbar, e o óleo seco do solvente. O hexano e 2propanol foram aquecidos por meio de um banho térmico a 60 °C.
[0505] Para extração em larga escala, condições ideais de destilação forma atingidas a uma pressão de vácuo de 100 mbar e banho térmico com água a 60 °C; no entanto, após evaporar hexano e 2propanol, a mistura de polímeros amarelos/óleos foi deixada no interior do frasco de mistura. A fim de separar os óleos dos polímeros amarelos, o hexano foi reaplicado e os polímeros foram, em seguida, separados por uma centrífuga.
[0506] A mistura polímero/óleo/hexano foi reaquecida a 60 °C por 10 minutos, transferida até o tubo centrífugo e girada a 3.200 rpm por 5 minutos. Após o reaquecimento e centrifugação, óleo foi separado e foi isolado e analisado. Constatou-se que o extrato de óleo contém, na maior parte, C16 e C18 ácidos graxos saturados ou monoinsaturados incluindo ácido
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191/229 palmítico - um constituinte primário de óleo de palma. A partir de 4 kg da biomassa de C. necator molhada, que correspondeu a cerca de 1 kg de biomassa seca, 80 gramas de extrato de hexano cru (isto é, óleos solúveis em hexano) foram recuperadas.
[0507] O total, cerca de 230 ml de óleo fora extraídas de várias amostras de Cupriavidus necator produzidas de H2 e CO2 com uma fonte única de hidrogênio, elétrons e carbonos, de acordo com métodos descritos na presente seção. Isso corresponde a cerca de 210 gramas de óleo. Desse total, cerca de 160 ml (140 gramas) do óleo foram extraídos a partir das amostras geradas pela batelada de 20 litros descrita nessa seção, e o restante, foi de outras execuções contínuas ou em batelada em substratos de H2/CO2.
[0508] Constatou-se que a biomassa residual deixada após a extração de óleo é alta em PHB e proteína.
EXEMPLO 9
PRODUÇÃO DE AMINOÁCIDOS DA MATÉRIA-PRIMA QUE CONSISTE EM UM SYNGAS OU COMPONENTES DOS MESMOS.
[0509] As cepas Cupriavidus necator DSM 531 e DSM 541 foram cultivadas como uso de uma mistura de gás H2/CO2/O2 gás e meio de fermentação de sal mineral. A cultura foi cultivada por 96 horas em 20 ml de meio MSM (Meio A 1 I: 9 g de Na2HPO4.12H2O, 1,5 g de H2PO4, 1,0 g de NH4CI e 0,2 g de MgSO4.7H2O por 1 I; 10 ml de Meio B: 50 mg de citrato de amônio férrico e 100 mg de CaCl2 por 100 ml; 10 ml de Meio C :5g de NaHCOs por 100 ml; e 1 ml de Solução de Mineral-traço:100 mg de ZnSO4.7H2O, 30 mg de MnCl2.4H2O, 300 mg de H3BO3, 200 mg de C0CI2.6H2O, 10 mg de CUCI2.2H2O, 20 mg de NÍCI2.6H2O e 30 mg de Na2MoO4.2H2O por 1 I) em uma garrafa com soro suplementado com 66,7% H2, 9,5% CO2, 5% O2 e 18,8% N2 a 30 °C e 200 rpm.
[0510] Para detecção de lisina nos meios de crescimento, 1 ml das células (O.D = 0,1) foram separados por centrifugação (10,000 rpm, 5 minutos à temperatura ambiente) e o sobrenadante (200 microlitros) foi filtrado adicionalmente (0,22 micron). As amostras dos
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192/229 sobrenadantes foram coletados e analisados para secreção de compostos que contêm amino, tais como aminoácidos incluindo lisina, tirosina e fenilalanina, conforme mostrado na Tabela 2.
TABELA 2. COMPOSTOS QUE CONTÊM AMINO
SECRETADO DE C. NECATOR.
Composto Amostra em branco DSMZ 531: C. Nectar DSMZ 541: C. Nectar
μπΊοΙ/Ι μπΊοΙ/Ι Diferença em vezes
Glu Ácido glutâmico 0,1952 11,556 40,614 3,5
Sar Sarcosina 1,7232 2,5708 36,4692 14,2
Ser Serina 1,7688 7,9428 35,8164 4,5
Gly Glicina 9,4757 10,3272 35,0351 3,4
Ala Alanina 0,6504 5,996 32,3436 5,4
Thr Treonina 0,216 5,4152 22,9456 4,2
Vai Valina 0,0984 4,182 21,5904 5,2
lie Isoleucina 0,0272 2,1476 14,0068 6,5
Om Omitina 0,9324 10,4876 13,056 1,2
HIS Histidina 0,99 2,3816 12,0852 5,1
Arg Arginina 0,2988 0,4112 9,3428 22,7
Phe Fenilalanina 0,1 3,4216 8,6652 2,5
Lys Lisina 0,1012 0,063 7,9088 125,5
Tyr Tirosina 0,386 2,9448 7,3972 2,5
Cit Citosina 0,3332 0,6572 6,8248 10,4
Asp Ácido Aspártico 2,1964 3,2776 4,6132 1,4
Gin Glutamina 0,1412 1,2548 4,2944 3,4
Pro Prolina 0,0477 1,2567 4,1107 3,3
Leu Leucina 0,054 2,5558 3,7205 1,5
Trp Triptofano 0,0352 0,9464 2,7072 29
Met Metionina 0,0156 1,3944 1,614 1,2
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193/229
Tpr Tpr 0,034 0,5208 0,8052 1,5
B-Ala B-Alanina 0 2,0904 0,6688 0,3
SAM S-Adenosilmetiona 0 0 0,5604
SAH S- Adenosiltomocisteína 1,194 2,3232 0,2812 0,1
MetSo Sulfóxido de metiona 0,0128 0,3696 0,2528 0,7
Hcy- PCA Hcy-PCA 0,024 0,1944 0,2344 1,2
a-AAA a-AAA 0,0096 0,2008 0,1492 0,7
APA APA 0 0,0248 0,134 5,4
Pur Puracina 0,1912 15,0568 0,128 0,0
CysPSA Cys-PSA 0,0392 0,7148 0,1272 0,2
GSHPCA GSH-PCA 0,0056 0,0052 0,0468 9,0
Spd Spd 0,0652 0,0728 0,0444 0,6
3-His 3-His 0,0264 0,0384 0,0276 0,7
Cy2 Cy2 0,0364 0,0628 0,0128 0,2
Cth Cth 0,0072 0,0072 0,0124 1,7
CysGtyPCA Cys-Gty-PCA 0,0002 0,01 0,0112 1,1
Erg Erg 0,0076 0,0512 0,0084 0,2
Hcy2 Hcy2 0,0116 0,00 0,0048 0,6
[0511] A lisina é uma molécula de seis carbono, e tirosina e fenilalanina são moléculas de nove carbonos. Observou-se que a cepa C. necator DSM541 secretou concentrações mais altas de lisina, tirosina e fenilalanina no meio em comparação à cepa C. necator DSM531. As análises foram realizadas em 200 μΙ de meio de fermentação filtrado estéril. Os compostos foram isolados e derivados com o uso de um kit de limpeza e de derivatização (por exemplo, EZ-FaaST (Phenomenex) seguido por cromatografia
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194/229 líquida-espectrometria de massa para separar a identificar compostos que foram secretados pelas cepas bacterianas no meio (Tabela 2). Os níveis de lisina constatados nos meios de DSM 541 foram 125 vezes maiores que DSM 531.
EXEMPLO 10 [0512] A cepa Hydrogenovibrio marinus DSM 11271 foi cultivada até mais que oito gramas por litro de densidade de célula seca em uma mistura de H2, CO2 e O2 gases como a única fonte de energia e carbono para crescimento (Figura 11). O protocolo a seguir foi seguido para experimentos realizados com o uso de uma mistura de gases incluindo H2, CO2 e O2 em um biorreator de tanque agitado.
[0513] Aparelho: A cultura foi cultivada em batelada, com o uso do fermentador de vidro de 500 ml fabricado de maneira personalizada com placa frontal PEEK; um tubo de aspersão que tem uma frita de vidro porosa, conectada à tubulação para entrega de gás com um filtro de 0,2 pm; uma porta de septo para entrega da emenda; um tubo de imersão ao fundo com conjunto de amostragem asséptica, um condensador conduzido por meio de tubulação a um vaso de transbordamento com um filtro de 0,2 pm na saída de gás; uma porta para entrega de base e tubulação para entrega de base com um encaixe luer a uma seringa estéril; uma sonda de aterramento; uma porta para entrega de antiespumante; uma sonda de pH/temperatura; uma sonda oxidação/redução (ORP). Uma temperatura foi controlada a 37 °C, e o pH a 6,5 com o uso de um controlador comercial (Electrolab, Fermac 360, Reino Unido). A temperatura-alvo também foi mantida por um bloco de aquecimento no fundo do reator, e uma camisa de vidro integral para resfriar água. O pH foi mantido a 6,5 com o uso de NH4OH 6N. O reator estava disposto em uma placa de agitação (VWR 12365-344) e uma barra de agitação magnética (formato cruzado, VWR ‘spinplus’ n° 58947-828) foi usada para mistura. A placa de agitação foi definida a 300 a 400 RPM. A taxa de fluxo de gás no biorreator foi 1 WM. O fornecimento de gás foi de H2 comprimido, CO2 comprimido e ar residencial, cada um regulado a 0,14 MPa (20 psi). Ο H2 e CO2 e o ar foram entregues a um proporcionador de
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195/229 fluxo (Matheson G2-4D151-E401/E401, 0,14 MPa (20 psi)), o que definiu a fração relativa dos gases. O ar foi entregue a um fluxômetro de área variável (Key Instruments 1G03_R5). A mistura de gás de H2/CO2 do proporcionador de fluxo foi alinhada no ar e, em seguida, entregue ao fermentador através de um fluxômetro de área variável. Um manômetro foi usado para monitorar a pressão de entrega de gás ao fermentador. O gás de entrada fluiu através de um filtro de 0,2 pm (Pali, p/n 4251) e, em seguida, foi disperso no caldo de fermentador por meio de uma frita porosa pyrex (40-60 pm, Sigma-Aldrich CLS3953312-C) e exaurido do reator por meio de um condensador (encamisado e resfriado) a uma garrafa de transbordamento de espuma de 2 I, em seguida, através de outro filtro de 0,2 pm (Pali, p/n 4251) e, por fim, a um sistema de exaustão. O fluxo de CO2 foi definido como c.l. mínima =5 (c.l.=linha central de flutuação), e os outros gases foram definidos para obter a composição de gás-alvo, calcular de acordo com as tabelas de fluxômetro, medir composição por GC e ajustar e medir novamente, c.l. usada H2= 25, ar de c.l. =45 para fornecer uma mistura de gás que tem proporções respectivas de CO2/O2/H2 de 11/6,3/59. O monitoramento contínuo de O2 em linhas influentes e efluentes foi feito com o uso de uma sonda Foxi. Amostras de gás ocasionais foram obtidas por análise de GC (em bolsas de folha de 1 I, skcinc.com p/n 262-01).
[0514] Meio: Um litro do meio basal conteve 2,0 g de K2HPO4, 1,0 g de KH2PO4, 5,0 g de (NFk^SCU, 29,3 g de NaCI, 0,2 g de MgSO47H2O, 10,0 mg de CaCl2, 10,0 mg de FeSO4.7H2O, 0,6 mg de NÍSO4.7H2O e 2,0 ml de solução de elemento-traço. A solução de elemento-traço foi obtida a partir de Thermophilic Bacteria, CRC Press, Boca Raton, FL, Jacob K. Kristjansson, ed., 1992, página 87, Tabela 4.
[0515] Inóculo autotrófico: Uma inóculo cultivado sob gás com 10% de inoculação foi preparado em garrafas de 500 ml com batentes que contêm 50 ml de meio líquido. Um volume de 61,5 ml de inóculo, OD600 0,75, foi injetado no biorreator por meio de um tubo de imersão até abaixo do nível de líquido a fim de impedir a dispersão na folga de fechamento. A linha foi
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196/229 nivelada com ar filtrado após inoculação a fim de remover o inóculo aprisionado no tubo de imersão.
[0516] Operação de Fermentador: A Adição de Base - pH foi controlada com NH4OH 6N; emenda de nutriente - Além do nutriente de nitrogênio fornecido por adição de base de NH4OH, 0,2 gramas de FeSO4.7H2O foram adicionados quando o caldo OD=3, e 2 gramas MgSO4.7H2O quando o caldo teve OD=10. Ο O2 influente foi medido como aproximadamente 5%, e o efluente O2 esteve em uma faixa de 3 a 4%. As amostras foram retiradas de um tubo que se estende até o fundo do reator com o uso de um sistema de amostra asséptica com garrafas de 25 ml. Os resultados de sequenciamento de DNA confirmam H. marinus e não observou-se crescimento de contaminação nas placas de ágar que foram riscadas durante execução.
[0517] A Tabela 3 mostra a densidade de peso seco celular (CDW) medida em vários momentos durante a execução. A densidade de CDW atingiu mais de oito gramas/litro durante o dia 5. O teor de lipídeo solúvel em clorofórmio/metanol e lipídeo solúvel em hexano, respectivamente, como uma porcentagem da biomassa amostrada em vários momentos também é fornecida na Tabela 3. Os lipídeos foram analisados por GC/MS com o uso dos métodos descritos acima e constatou-se que os mesmos contêm e ácidos graxos em uma faixa de 14 a 20 carbonos de comprimento.
TABELA 3
extraível por c/m (%) Extraível por hexano(%)
ID de amostra Dias Vol. (ml) CDW(g/l) OD n Média Sd Média sd
T3 2,78 25 4,556 7.068 2 19,34 11,12 6,88 0,72
T4 3,79 25 6,776 11.824 3 18,42 2,83 8,12 0,43
T5 4,79 25 7,492 14.18 3 20,59 6,31 8,99 2,39
T6 5,79 25 8,296 13 3 24,13 6,07 8,26 1,53
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197/229 [0518] A densidade do peso seco de célula (CDW) medida em vários momentos durante o crescimento de H. marinus em gás. 0 lipídeo solúvel de teor de clorofórmio/metanol, e o lipídeo solúvel em hexano, respectivamente, como uma porcentagem da biomassa amostrada também é fornecida.
EXEMPLO 11 [0519] A cepa Rhodopseudomonas capsulata DSM 1710 foi cultivada a uma OD de 4,5 em uma mistura de gases H2, CO2 e O2 como a única fonte de energia e carbono para crescimento. O protocolo a seguir foi seguido para experimentos realizados com o uso de uma mistura de gases incluindo H2, CO2 e O2 em uma garrafa vedada de um litro alimentada com um fluxo contínuo de gases.
[0520] Aparelho: A cultura foi cultivada em batelada, com o uso de um sistema fabricado de maneira personalizada que compreende garrafas de entrega de solvente em cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) de um litro, que obtiveram um novo propósito para uso como garrafas de cultura. Essas garrafas de cultura de um litro foram alimentadas continuamente com gases de um tanque de sistema de gás; misturadores de gás; filtros (0,2 micron); fluxômetros; e umectantes. Esse sistema de entrega de gás e garrafas de cultura é ilustrado esquematicamente na Figura 12. Os gases foram distribuídos e misturados em uma solução com o uso de um encaixe de vidro poroso. As garrafas de cultura contiveram 200 ml de meio líquido e foram envolvidas em folha de alumínio para impedir que a luz penetrasse os meios. A temperatura foi controlada imergindo-se as garrafas de cultura em um banho de água. O pH não foi controlado além da inclusão de tampões químicos nos meios. O gás foi emitido das garrafas de cultura através de um filtro de 0,2 micron e todo o sistema foi instalado no interior de uma capela fumê. O fornecimento de gás foi de uma mistura de gás H2 e CO2 comprimido, e um tanque separado de O2 comprimido. A mistura-alvo de gás para o experimento foi 10% de O2, 5% de CO2 e 85% de H2. O fluxômetro da mistura de tanque de gás H2/CO2 foi definida
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198/229 como 25 e aquela do tanque de O2 foi definida como 34. Isso resultou em uma mistura de gás de 10,5% de O2, 5% de CO2 e 84,5% de H2, conforme medido por GC (Shimadzu GC-8A, detector TCD e coluna Alltech CTR I), que foi considerada próxima o suficiente à mistura-alvo para conduzir o experimento.
[0521] Meio: 970 ml de água Dl; 20 mg de Na2.EDTA; 12 mg de FeSO4.7H2O; 200 mg de MgSO4.7H2O; 75 mg de CaCl2.2H2O; 1 g de NaCI; 1 g de (ΝΗ4)2δθ4; 1 mg de HCI de tiamina; 15 pg de biotina; 1 ml solução de elemento-traço. Solução de elemento-traço: 250 ml de água Dl; 700 mg de H3BO3; 398 mg de Μηδθ4.Η2θ; 188 mg de Na2MoO4.2H2O; 60 mg de ZnSO4.7H2O; 10 mg de Cu(NOs)2. O pH foi ajustado a 7,2 antes da esterilização em autoclave. Após a esterilização em autoclave ter adicionado 30 ml de solução estéril com 1,2 g de KH2PO4 e 1,8 g de K2HPO4. O pH foi reajustado de volta para pH = 7,2.
[0522] O inóculo: Um inóculo de 10% fornecido de cultura de R. capsulata cultivado de maneira foto-heterotrófica em vez com agitação de 250 rpm. Os meios de RCVB fornecidos em: Wall, J.D., Johansson, B. C., Gest, H., 1977. A pleiotropic mutant of Rhodopseudomonas capsulata defective in nitrogen metabolism. Arch. Microbiol. 115:259 a 263; foram usados para crescimento foto-heterotrófico do inóculo que teve uma cor verde-escuro. Esse inóculo cultivado de maneira foto-heterotrófica foi iniciada, por sua vez, de um estoque de glicerol da cepa armazenada a -80 °C.
[0523] Operação: o inóculo a 10% resultou em uma OD inicial de 0,15. Após oito dias de crescimento em gás, a OD atingiu 4,5. A OD foi medida com o uso de um espectrofotômetro Beckman Coulter DU720 UV/Vis a 650 nm. A cor da cultura cultivada de quimioautotrófica foi vermelho escuro. Montagens úmidas da cultura foram observadas com o uso de óptica de contraste de fase com o uso de óptica de contraste de fase com um microscópio de pesquisa Axioskop (Zeiss, Alemanha). Os micrográficos foram gerados com um dispositivo MacroFIRE (Optronics; Galeta, CA) com o uso do software PictureFrame (Optronics; Galeta, CA) para imageamento e armazenamento de
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199/229 dados. Um micrográfico da R. capsulata é mostrada na Figura 13. O crescimento quimioautotrófico a seguir, a cultura foi centrífuga foi centrifugada a 10.000 G por 15 minutos e 4 °C. Em seguida, o sobrenadante foi vertido, e os péletes de biomassa foram armazenados temporariamente a -20 °C e, em seguida, liofilizado. Uma foto de um pélete de biomassa de R. capsulata recuperada após centrifugação é mostrada na Figura 14. Um total de 2,59 gramas de biomassa molhada foi recuperada dessa maneira de uma única garrafa de um litro de R. capsulata cultivado sob H2 e CO2 como a única fonte de hidrogênio, elétrons e carbono para biossíntese. Os lipídeos foram extraídos e analisados por GC/MS com o uso dos métodos descritos acima, e constatou-se que os mesmos contêm ácidos graxos que foram tiveram primariamente 16 ou 18 carbonos de comprimento.
EXEMPLO 12 [0524] Hydrogenobacter termophilus DSM 6534 foi cultivado em uma garrafa estanque a gás de um litro em uma mistura de gases H2 e CO2 e O2 como fontes únicas de energia e carbono para crescimento. Uma cultura viva de H. termophilus DSM 6534 em uma garrafa com soro sob uma folga de fechamento com gás foi recebida de Deutsche Sammlung von Mikroorganismoen und Zellkulturen (DSMZ). Sabe-se que Hydrogenobacter termophilus DSM 6534 contém o ciclo de fixação de rTCA CO2. Essa cultura viva foi usada para fornecer um inóculo a 10% a uma garrafa de 160 ml com soro que contém os meios MSM fornecidos em “Thermophilic bacteria,” Jakob Kristjansson, Capítulo 5, Seção III, CRC Press, 1992, páginas 86 a 88 sob uma atmosfera H2:CO2:O2 de 8:1:1. A OD inicial a 600 nm após a inoculação foi 0,03. A temperatura da garrafa com soro foi mantida a 70 °C imergindo-se a garrafa com soro em um banho de água aquecida. Nenhuma agitação foi aplicada. Observou-se que os meios se tomem túrbidos, e após 65 horas a OD foi medida como 0,354 - um aumento maior que dez vezes. Em seguida, essa garrafa com soro foi subcultivada como um inóculo a 10% em uma garrafa estanque a gás de um litro que contém 120 ml de meios MSM e 8:1:1 atmosfera de H2:CO2:O2. A
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200/229 garrafa de cultura foi mantida a 70 °C com o uso de um banho de água e não foi agitada. Ao longo do curso de 64 horas, a folga de fechamento com gás foi refrescada uma vez, e a OD aumentou para a 0,25. Ao longo das próximas 24 horas, a OD aumentou para 0,42. Os gases na folga de fechamento foram refrescados novamente e dois dias depois a OD foi medida a 0,56. 1 ml de caldo de cultura foi amostrado para extração e sequenciamento de DNA. A sequência 16S rRNA foi determinada, e a ocorrência superior do BLAST foi identificada como cepa Hydrogenobacter termophilus TK-6. O caldo de cultura então obtido foi removido da garrafa de um litro e centrifugada a 10.000 g por 15 minutos a 4 °C. O pélete de biomassa molhada resultante após centrifugação teve 212 mg de peso. Uma extração de hexano da biomassa molhada foi realizada, conforme descrito no Exemplo acima. 15,2 mg do lipídeos solúveis em hexano foram recuperados da biomassa molhada ou 7,2% do peso de biomassa molhada compreenderam lipídeos solúveis em hexano. Os lipídeos foram extraídos e analisados por GC/MS com ouso dos métodos descritos acima, e constatou-se que os mesmo têm uma proporção relativamente alta de ácidos graxos com comprimentos de cadeia de 20 carbono.
EXEMPLO 13 [0525] A cepa Xanthobacter autotrophicus DSM 432 foi cultivada a 14 gramas por litro densidade de célula seca em uma mistura de gases H2, CO2 e O2 como a fonte única de energia e carbono para crescimento. O protocolo a seguir foi aderido para um experimento realizado com o uso de uma mistura de gases incluindo H2, CO2 e O2 em um biorreator de tanque agitado.
[0526] Aparelho: A cultura foi cultivada em batelada, com o uso de um fermentador de vidro de dois litros ilustrados esquematicamente na Figura 15 com uma placa frontal ilustrada esquematicamente na Figura 16. A temperatura e pH forma controlados e monitorados com pH e sonda de temperaturas e um controlador comercial. O pH foi ajustado através da adição automática de NaOH 2 N. As portas no biorreator
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201/229 estavam disponíveis para o fornecimento de suplementos de nutriente e antiespumantes; entrega de inóculo; base; meio fresco; e amostragem asséptica. A agitação foi fornecida por uma turbina e gases foram aspergidos através de uma frita de vidro. O sistema de reator é ilustrado esquematicamente na Figura 17. Este compreendeu manômetros; gás fluxômetros; válvulas de segurança e de retenção; filtros de 0,2 microns; o vaso de biorreator, sensores, atuadores e controladores; um condensador e armadilha de espuma; e respiradouro de saída. O fornecimento de gás foi de H2 comprimido, CO2 comprimido e ar residencial, cada um regulado a 0,14 MPa (20 psi). Um esquemático do sistema de entrega de gás é mostrado na Figura 18. Ο H2 e CO2 e o ar foram entregues a um proporcionador de fluxo (Matheson G2-4D151-E401/E401, 0,14 MPa (20 psi)), o que definiu a fração relativa dos gases. As definições usadas no proporcionador de fluxo foram a c.l. H2 = 35; c.l 002=10; e c.l ar =55. Esse resultou em uma mistura de gás que é entregue ao biorreator de 64% de H2,11 % de CO2, 5,4% de O2, conforme medido por GO (Shimadzu GC-8A, TCD detector e coluna Alltech CTR I).
[0527] Meio: O meio MSM usado para esse experimento é descrito em Thermophilic Bacteria, CRC Press, Boca Raton, FL, Jacob K. Kristjansson, edição, 1992, página 87, Tabela 4.
[0528] Inóculo: O inóculo da cepa Xanthobacter autotrophicus DSM 432 foi iniciado de um único frasco de estoque de glicerol a -80 °C que foi transferido em 200 ml de MSM em uma garrafa estanque a gás de um litro. A pressão do gás da folga de fechamento com H2/CO2/O2 foi 0,07 MPa (10 psig). A garrafa de cultura foi agitada a 150 rpm a 30 °C.
[0529] A operação de fermentador: Antes da inoculação, 1,3 litro de f MSM foi transferido no vaso de biorreator. O pH foi ajustado para 6,8 com o uso de NaOH. A temperatura foi definida a 30 °C, e a agitação a 500 RPM. A amostras foram obtidas duas vezes por dia para OD e a análise de lipídeo foi através de conjunto de amostragem asséptica. Todas as medições de OD foram realizadas com um espectrofotômetro Beckman Coulter
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DLI720 UV/Vis. Uma vez por dia, as amostras foram examinadas sob o microscópio uma vez por dia para verificar a morfologia da célula. Todas as amostras de caldo de foram centrifugadas a 12.000 g. 1 ml do sobrenadante foi armazenado para análise de NH4+ a -20 °C. Os péletes de biomassa molhada foram armazenados temporariamente a -80 °C e, em seguida, liofilizados.
[0530] A correlação entre ODeoo e CDW (mg/ml) é mostrada na Figura 19. O ajuste linear a essa correlação foi CDW = 0,9944*(ODeoo) + 0,4101 com um R2=0,957. A Figura 20 mostra a curva de crescimento para os microrganismos de Knallgas Xanthobacter autotrophicus cultivado no substrato de gás H2/CO2/O2 de acordo com esse protocolo. O OD final medida a 600 nm foi de 14,8 e o CDW final foi 13,8 gramas/litro do a partir do cultivo sob substrato de gás H2/CO2/O2. Após um período de crescimento logarítmico no início da execução, a acumulou uma taxa aproximadamente linear até o término da execução no dia seis. Os lipídeos foram extraídos e analisados por GC/MS com ouso dos métodos descritos acima, e constatou-se que os mesmo têm uma proporção relativamente alta de ácidos graxos que tem 18 carbonos de comprimento.
EXEMPLO 14
TRIAGEM DE CEPA QUIMIOAUTOTRÓFICA [0531] As cepas foram tríadas primeiramente para quimioautotrofia em placas com o uso do sistema de jarras Vacu-Quick de Almore. Em seguida, as cepas promissoras foram testadas em cultura líquida.
[0532] Um meio de sais mínimos (MSM) foi preparado, conforme descrito acima, e combinado e adicionado em placas de agarose (1,5%) de maneira aséptica. 162 cepas candidatas extraídas dos gêneros a seguir foram testadas: Cupriavidus', Xanthobacter, Dietzia', Gordonia', Mycobacterium·, Nocardia', Pseudonocardia', Arthrobacter, Alcanivorax', Rhodococcus', Streptomyces', Rhodopseudomonas', Rhodobacter e Acinetobacter. Cada cepa foi riscada em uma placa de meio de sais mínimos (MSM) + agarose (1,5%). Em seguida, todas as respectivas placas foram
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203/229 colocadas em um sistema de jarros Vacu-Quick da Almore. No fundo de cada câmara foi colocado um papel-toalha encharcado com água estéril a fim de manter a umidade na câmara e impedir que as placas sequem durante incubação. Em seguida, as câmaras estanques a gás preenchidas com placas foram evacuadas; seguida pelo fornecimento de uma mistura de gás hLOCteAr (70/10/20). Os gases forneceram a única fonte de energia e carbono para crescimento. As câmaras de gás foram incubadas a 30 °C por 7 a 10 dias, purgando mistura de gás frasco todo dia. Para placas que exibiram crescimento/colônias quimioautotróficas, as colônias foram colhidas, em seguida, riscadas em placas de meio de sais mínimos fresco (MSM) + agarose (1,5%) seguidas por uma segunda incubação nos sistemas de jarros Vacu-Quick da Almore alimentado com H2 e CO2 e ar (70/10/20). As cepas que exibem forte crescimento de colônia intenso nessa segunda incubação foram, em seguida, submetidas a teste quimioautotrófico no meio de sais minerais líquidos (MSM). Os experimentos foram realizados em (Chemglass CLS-4209-10, anaeróbico, 18 x 150 mm) tubos Hungate com volume de trabalho de 5 ml, tampados com batentes de borracha de neopreno sólidos (Wheaton Science Products, No.:224100331), selado com uma tampa de alumínio. Os tubos foram purgados com uma mistura de gás de H2:CO2:Ar (70/10/20) com o uso de um coletor de gás projetado para triagem de alta produtividade. Os tubos forma purgados com mistura de gás frasco todos os dias. Os tubos forma incubados em um agitador Multitron Pro Infers HT em um ângulo de 45°, a 600 rpm e 30 °C por 96 horas. A densidade óptica a 600 nm foi medida por espectrofotômetro (Genesys 10S, espectrofotômetro UV-Vis, Thermo Scientific) a cada 24 horas. As cepas bacterianas a seguir foram identificadas como sendo quimioautotróficas na mistura de knallgas: Arthrobacter metilotrophus DSM 14008; Rhodococcus opacus DSM 44304; Rhodococcus opacus DSM 44311; Xanthobacter autotrophicus DSM 431; Rhodococcus opacus DSM 44236; Rhodococcus ruber DSM 43338; Rhodococcus opacus DSM 44315; Cupriavidus metallidurans DSM 2839; Rhodococcus aetherivorans DSM 44752; Gordonia deenxofreicans DSM
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44462; Gordonia poliisoprenivorans DSM 44266; Gordonia poliisoprenivorans DSM 44439; Gordonia rubripertincta DSM 46039; Rhodococcus percolatus DSM 44240; Rhodococcus opacus DSM 43206; Gordonia hidrophobica DSM 44015; Rhodococcus zopfii DSM 44189; Gordonia westfalica DSM 44215, Xanthobacter autotrophicus DSM 1618; Xanthobacter autotrophicus DSM 2267; Xanthobacter autotrophicus DSM 3874; Streptomycetes coelicoflavus DSM 41471; Streptomycetes griseus DSM 40236; Streptomycetes sp. DSM 40434; Streptomycetes xanthochromogenes DSM 40111; Streptomycetes termocarboxidus DSM 44293; Rhodobacter sphaeroides DSM 158.
[0533] A análise completamente próxima foi realizada na cepa de knallgass cultivada em meios MSM líquidos com uma mistura de knallgas como a única fonte de carbono e de energia. Constatou-se que C. necator DSM 531 e DSM 541 acumuladas em mais de 70% e mais de 80% total da proteína em peso para amostras obtidas durante a fase de crescimento aritmética. Constatou-se que tanto C. necator DSM 531 quanto DSM 541 sintetizam vitaminas incluindo vitamina B1, vitamina B2 e vitamina B12.
EXEMPLO 15
PREPARAÇÃO DE LISADO DE C. NECATOR DSM 531 [0534] A cepa Cupriavidus necator DSM 531 foi cultivada em meio MSMG estéril (meio de sais mínimos + 40g/l de D-Glucose) com a fonte de energia e carbono para crescimento e as células forma lisadas.
[0535] O protocolo a seguir foi seguido para produção de biomassa da cepa C. necator DSM 531 e preparação de lisado.
[0536] A produção de biomassa da cepa experimental: 1% em volume para semeadura de 72 horas, obtidas do estoque de glicerol de cepa, seguido por 10% em volume para cultura de 120 horas para a produção de biomassa da cepa.
[0537] O crescimento inicial da cepa C. necator foi semeado do estoque de glicerol de 1,5 ml em 160 ml de meio MSMG em um frasco Erlenmeyer de 500 ml (VWR n° 10536 a 926) em um incubador de
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205/229 agitação (New Brunswick Scientific, Agitador Incubador de Série 25, Modelo de Chão) por 72 horas, 30 °C, 250 rpm. A cepa foi verificada por placa de ágar em Caldo Nutriente (NB), densidade óptica a 600 nm em espectrofotômetro SpectraMax M5, e verificação de morfologia em um microscópio Labomed iVu3100 em ampliação de lente de 1000x.
[0538] 20 ml do estoque de semeadura foi transferido a um frasco Erlenmeyer 2 I (VWR n° 10545-844) que contém 200 ml do meio MSMG, resultando um total de 8 frascos de 2 I do estoque de sementes de 160 ml. Os frascos de 2 I foram incubados no agitador incubador a 30 °C, 250 rpm por 120 horas. A cepa foi monitorada riscando-se em placa de ágar de Caldo de Nutriente (NB), a densidade óptica 600 nm no espectrofotômetro, medição de pH e verificação de morfologia no microscópio em uma ampliação por lente de 10OOx mediante colheita.
[0539] O caldo de cultura foi transferido a garrafas centrífugas estéreis de 250 ml de peso de tara (Fisher Scientific n° 05 564 1) e girado em uma centrífuga (Sorvall Evolution RC) a 8.000 rpm, 4 °C, 20 minutos. O caldo foi decantado, e os péletes foram transferidos para um tubo Falcon estéreis de 50 ml de peso de tara (VWR n° 89039-656). Os péletes foram armazenados a -80 °C.
[0540] A medição de peso seco celular da cepa C. necator DSM 531 também foi explorada no tempo de colheita. Antes da colheita de frascos 2 I, 10 ml de caldo de cultura de cada frasco foram transferidos tubos Falcon estéreis de 50 ml de peso de tara. Os tubos foram colocados em um centrífugo (Eppendorf) a 12.000 rpm, 4 °C, 5 minutos. O caldo foi decantado, e os péletes molhados foram congelados a -80 °C por 2 horas. Os péletes congelados foram colocados em um liofilizador (Virtis Benchtop, -62,6 °C, 7,46 Pa (56 mTorr)) por 18 horas.
[0541] Após 75 horas de semeadura do estoque de glicerol em 160 ml de meio MSMG, ODeoofoi medida a 0,792, pH = 7,34. O caldo de cultura teve uma aparência leitosa. O meio MSMG não inoculado também foi
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206/229 riscado em uma placa ágar NB que serve como um controle negativo.
[0542] Após 113 horas de subculture em 2 I de 20 ml de estoque de semeadura em 200 ml de meio MSMG por fresco. As células de cada fresco de 2 I forem riscada em uma placa de ágar NB e observadas em uma ampliação de 1000x de microscópio. A pureza da cepa foi determinada visualmente ao redor de 99,9%.
[0543] A cultura de C. necator em frescos de 2 I foi colhida por meio de centrifugação a 8.000 rpm, 40, 20 minutos em garrafas centrífugas de 250 ml estéreis com tampas de vedação. O caldo foi decantado e os péletes molhados forem combinados e armazenados a - 80 °C. Na colheita, ODeoo em tempo médio = 19,9 e pH = 6,2 a 6,3. Peso e concentração de péletes molhados no caldo de cultura forem medidos.
[0544] Antes da colheita, 10 ml de caldo de cultura de cada fresco de 2 I forem transferidos a tubos Falcon de peso de tare pare medições celulares de peso seco.
PREPARAÇÃO DE EXTRATO CELULAR LISADOS [0545] Um pélete celular molhado de 30g foi removido por desgelo à temperatura ambiente por 15 min. 30g de água estéril MilliQ forem adicionados. O tubo foi submetido à vórtice até uma vigorosamente até que uma solução homogênea fosse produzida. A solução celular foi dividida em tubos Falcon de 6 a 50 ml de peso seco celular quer contêm 10 g cada, e submetidos à sonicação em um banho de água gelada com o uso de um Branson Sonifier 250 com uma sonda de microponta afunilada 0,03 cm (1/8 polegada) (n° 101148-070). A sonda foi diminuída até 1 cm do fundo do tubo. A potência foi ajustada lentamente a uma saída a 40 a 60% com um tempo de sonicação total de 1 minuto. Permitiu-se que tanto a microponta quanto a solução de célula solução resfriassem a cerca de 10 min. A sonicação foi repetida com dois ou mais ciclos de com tempo de resfriamento de 1 minuto com 10 minutos entre os mesmos.
MEDIÇÃO DE PROTEÍNAS DE EXTRATO DE CÉLULA
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LISADAS [0546] O ensaio Bradford foi usado para determinar concentrações de proteína no célula extrato lisado inteiro, lisado transparente e permeados que passaram através de membranas de filtro (MWCO) de Corte de Peso Molecular.
[0547] As amostras 5 μΙ e padrões BSA (BIO-RAD n° 5000201) foram adicionadas a uma placa de fundo plana de 96 poços transparentes. As concentrações de BSA estão em uma faixa de 150 pg/ml a 600 pg/ml. Subsequentemente, 250 pl reagente de Corante 1x (Comassie Blue G250, BIO-RAD n° 5000201) foram adicionados a cada cavidade da placa. A placa foi colocada em um agitador de placa por 30 minutos à temperatura ambiente, 300 rpm, seguido por leitura de absorvência a 595 nm em espectrofotômetro SpectraMax M5.
PREPARAÇÃO DE HIDROLISADO [0548] O lisado celular gerado, de acordo com esse protocolo, é submetido a métodos químicos e de hidrólise enzimática bem conhecidos na técnica.
EXEMPLO 16
EXPERIMENTOS DE DEMONSTRAÇÃO DE PROTEASE [0549] O microrganismo (por exemplo, fungus P. marquandii) é cultivado em um meio adequado sob condições submersas aeróbicas sintetiza uma proteinase (por exemplo, queratinase).
[0550] O líquido extracelular é concentrado e parcialmente purificado para produzir um pó de enzima. A atividade média do pó de enzima é determinada.
[0551] Para uma queratinase, um substrato de casca e chifre é triturado e peneirado, como um controle positivo, em seguida, a hidrólise do pó de queratina é realizada por tratamento a queratinase em concentrações de 0,75 a 3,00 g/l a 50 °C e pH 8,0 (razão de enzima/substrato de 1:67 a 1:17). Isso serve como um controle positivo para atividade da enzima
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208/229 queratinase.
[0552] Para o experimento, um pó de biomassa microbiana liofilizado da Cupriavidus necator ou outro microrganismo cultivado em H2/CO2 é hidrolisado por tratamento com a queratinase em concentrações de 0,75 a 3,00 g/l a 50 °C e pH 8,0 (razão enzima/substrato de 1:67 a 1:17).
[0553] A reação de hidrólise é seguida por até 6 horas. Durante a incubação, a degradação de queratina ou proteína é medida e expressa como a fração de nitrogênio solubilizado. Além disso, o aumento na quantidade de proteínas solúveis e o aumento dos aminoácidos livres na fase líquida é registrado. A composição de aminoácido livres do hidrolisado também é determinada. O teor de nitrogênio na solução, medido pelo método Kjeldahl, é expresso como uma porcentagem do total teor de nitrogênio no farelo seco (de queratina ou microbiano). A porção do teor de N na original biomassa que é solubilizada é determinada. A potencialização da solubilização da proteína em comparação a uma amostra branca (sem a enzima) é determinada. O efeito de concentrações diferentes de proteinase enzima em solubilização de proteína é determinado. O aumento da proteína solúvel como uma função de tempo é medido e um curso de tempo da reação enzimática é determinado.
[0554] Aminoácidos cujo efeito foi constatado anteriormente como positivo são medidos. Uma comparação do teor de aminoácidos (em % do total) do hidrolisado obtido é comparada à composição de hidrolisados de proteína descritos na literatura.
[0555] Como um controle positivo, espera-se que a aplicação da queratinase de P. marquandii a caso substrato em pó de caso e chifre obtenha 4 g/l a 5 g/l de proteína solúvel em 5 horas, dependendo da concentração de enzima e uma concentração de aminoácido livre no hidrolisado maior que 4.000 mg/l.
[0556] Em experimentos de acompanhamento, o tratamento de biomassa rica em proteína por vapor seguido por hidrólise enzimática é testado. A solubilização do nitrogênio com e sem pré-tratamento a
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209/229 vapor são comparados. O curso de tempo de hidrólise pela proteinase de biomassa rica em proteína pré-tratada com vapor versus material não tratado por vapor. As quantidades de proteína, peptídeo e aminoácidos liberados do substrato na solução são comparadas entre os casos tratados e não tratados por vapor. Em um controle positivo, espera-se que a aplicação da queratinase de P. marquandii ao substrato em pó de casco e chifre que foi tratado por vapor, 98% de solubilização de queratina nitrogênio.
[0557] Experimentos análogos são realizados testando proteinases das cepas descritas no presente documento, incluindo, porém sem limitação, Streptomyces sp., cultivado em substratos incluindo, porém sem limitação, fontes de carbono C1.
EXEMPLO 17
PROCESSO DE PH ENZIMÁTICO [0558] A Figura 21 mostra o diagrama de blocos de uma modalidade do método descrito no presente documento, em que o caldo de cultura na forma de uma suspensão de célula aquosa é submetido ao tratamento alcalino, seguido por um tratamento físico e hidrólise enzimática a fim de obter diretamente um extrato de enzima orgânico. Em alguns casos, etapas adicionais de concentração e/ou separação e/ou de secagem são realizadas fornecendo uma variedade de produtos de extrato de enzima orgânico. Em testes experimentais dessa abordagem, o perfil de peptídeo doe extratos obtidos pelo método da invenção é determinado.
[0559] Um experimento é realizado de acordo com o diagrama de blocos mostrado na Figura 21. A porcentagem da matéria seca em 500 ml de caldo de cultura é determinada com um alvo de 10 a 11% p/p e p/v. A composição química de células no caldo também é determinada (por exemplo, % C, Η, O, N, P, K, S). O caldo de cultura é tratado em um reator de vidro aberto com 28% de NH3 adicionado para fornecer um pH de 9,6, durante agitação (60 a 80 rpm).
[0560] Após o tratamento com alcalina, uma mistura é
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210/229 submetida a uma pressão de 115 kPa e uma temperatura de 120 °C por 20 minutos em uma autoclave. A solução então obtida é ajustada para um pH 9,2 com hidróxido de potássio 10 M. Essa solução a pH 9,2 é mantida a 55 °C em um banho termostático durante agitação (60 a 80 rpm) e 0,3% em v/v de Subtilisina é adicionado (de uma solução-mãe de proteinase de 70.000 unidades de atividade por ensaio de azocaseína). O pH é mantido com 28% de amônia. Essas condições de hidrólise são mantidas por 24 horas. O hidrolisado resultante é coletado em 24 horas, e a composição química determinada (por exemplo, % C, Η, O, N, P, K, S). O rendimento de nitrogênio e matéria orgânica da hidrólise são determinados.
[0561] Um volume do hidrolisado é medida e, em seguida, o hidrolisado é concentrado 5 vezes em um evaporador giratório com um banho termostático a 70 °C, desse modo, obtendo um hidrolisado concentrado. A porcentagem em peso da matéria seca pé medida após a concentração, com 50 a 55% em peso da matéria seca alvejada. O experimento testa se esse hidrolisado concentrado assumirá a forma de um xarope estável.
[0562] Outro volume do hidrolisado é medido e centrifugado a 4.000 G por 30 minutos. O volume da de hidrolisado solúvel denominada de sobrenadante e o peso da fração de hidrolisado insolúvel denominada pélete forma obtidos. O teor de matéria seca de cada uma é determinado assim como as composições químicas da matéria seca em ambas as frações (por exemplo, % C, Η, O, N, P, K, S). O rendimento de matéria orgânica de cada fração é determinado. A composição de aminoácido de cada fração também é estabelecida assim como seu perfil de peptídeo. Os peptídeos com um tamanho abaixo de 300 Da se referem a aminoácidos livres e peptídeos pequenos. O teor de tais aminoácidos livres e peptídeos pequenos são determinados.
[0563] A concentração do hidrolisado solúvel é determinada, e o volume e matéria orgânica % em p/p é medida. A consistência do hidrolisado solúvel é observada (por exemplo, semelhantemente a um
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211/229 xarope). A fração de hidrolisado insolúvel é seca a 90 °C, e o peso final medido e teor de umidificação.
EXEMPLO 18
EXTRATO DE PROTEÍNAS COM ÁCIDO NUCLEICO REDUZIDO [0564] A homogeneização de alta pressão é aplicada a células cultivadas de acordo com a presente invenção. As condições são testadas a fim de identificar um ideal em termos de romper uma maioria das células ao mesmo tempo que retém atividade de nuclease endógena; preservando proteínas a serem colhidas e não conferindo quaisquer sabores negativos. Os parâmetros de homogeneização são testados: pressões de 34,47 a 103,42 MPa (5.000 a 15.000 psig); temperaturas de 0 a 50 °C (32°F a 122°F) e pH de 4,5 a 6,5; com I a 5 passadas através do homogeneizador. As células rompidas (homogenado) podem ser diluídas, amornecidas ou resfriadas e o pH foi ajustado conforme necessário a fim de intensificar o processamento e extratibilidade de nuclease e de proteína. O homogenado é ajustado a um pH maior que 5,5 e, especialmente, a faixa de pH entre 8 e 11 é testada; para 5 a 60 minutos e a uma temperatura de 0,28 °C a 0,97 °C (40 °F a 140°F). O objetivo é extrair a nuclease, proteína e outros materiais solúveis em álcali. O homogenado é separado por centrifugação e/ou filtração em um resíduo de parede celular insolúvel e um extrato solúvel, denominado de extrato alcalino. Os fatores que afetem a extração e utilização da nuclease endógena são: teor de nuclease, pH, temperatura de processamento, tempo de reação, concentração de substrato, ativadores e inibidores. Esses fatores podem interagir para afetar a composição e rendimento de proteína e são otimizados para maximizar rendimento de proteína e/ou minimizar a contaminação de ácido nucleico. Uma tentativa de desenvolver um produto de glicano do resíduo de parede celular é realizada, análoga ao produto de glicano de levedura descrito o pedido de patente intitulado Yeast Glycan and Process of Making Same Número de Série 310.452, depositado em 29 de novembro de 1972. O glicano de
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212/229 levedura de Baker são as paredes celulares cominutivas, lavas, pasteurizadas e secas da levedura, Saccharomyces cerevisiae. O mesmo é composto principalmente de carboidratos de cadeia longa, não menor que 85 por cento em uma base sólida seca. O carboidrato é composto de unidades de glicano e mannan em uma razão de aproximadamente 2:1. Este pode ser usado como um emulsificador ou sal e estabilizador e espessante e texturizador de emulsificador peliculizações de sala, análogos de sobremesa congeladas, análogos de creme azedo, imersões de lanche com base de queijo e azedo-creme.
[0565] Após a separação do resíduo de parede celular, o restante solúvel é incubado para permitir que a nuclease endógena rompa polímeros de ácido nucleico. As condições de incubação testadas estarão em uma faixa de 40 ° a 60 °C, um pH de 5 a 8 e por um tempo de 15 a 120 minutos. A proteína é separada pela centrifugação. No término do estágio de reação de nuclease, o sistema é tratado de várias maneiras para tentar aumentar a taxa de centrifugação da pasta de proteína. 0,1 a 1,0% em peso de sólidos de CaCh é testado para agilizar recuperação da proteína. As condições de centrifugação testarem a faixa do pH de 4 a 7 e uma temperatura de 4o a 90 °C. Testa-se a possibilidade de a adição de cloreto de cálcio após a conclusão da reação endógena de nuclease e antes da centrifugação, aprimora significativamente a taxa da centrifugação ou produtividade. Um diagrama de blocos de uma modalidade possível é fornecido na Figura 22.
[0566] A mistura de reação de nuclease é separada pela centrifugação em uma fração de pasta de baixo teor proteína de RNA, e uma fração de constituintes citoplasmáticos solúveis. A fração de constituintes citoplasmáticos solúveis é testada quanto à composição. Espera-se conter os fragmentos de ácido nucleico, alguns fragmentos de proteína e proteína, glicogênio e muitos intermediários metabólicos incluindo vitaminas. Espera-se que os constituintes citoplasmáticos solúveis constituem uma fração valiosa da fração microbiana total, e espera-se ter aplicações semelhantes como o soro de extrato de levedura ou ácido.
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213/229 [0567] A lavagem com água da fração de proteína insolúvel é testada para efeito no sabor. Uma etapa de desidratação a vácuo adicional é testada seguida por secagem a um pó. As condições a vácuo testada estão em uma faixa de 50,8 cm a 71,12 cm (20 a 28 polegadas) Hg, a T = 48,49 °C a 93,33 °C (120 °F a 200 °F), por 10 a 60 minutos. Os teores sólidos que entram na etapa de secagem final são testados em relação a uma faixa de 5% a 25% de sólidos. Os métodos de secagem testados compreendem: secagem por aspersão, secagem em tambor, liofilização e semelhantes.
[0568] A composição do pó e testada. A composição livre de células e a ausência de células viáveis são confirmadas. Uma análise próxima é realizada para estabilizar a composição em peso em uma base sólida seca de: proteína; ácido nucleico (alvejando menos de cerca de 3%); lipídeo; cinzas; carboidratos; fibra; outra biomassa. O teor de vitamina e mineral também são determinados.
EXEMPLO 19
PREPARAÇÃO DE PROTEÍNAS A PARTIR DA CUPRIAVIDUS NECATOR [0569] A biomassa cultivada em H2 e CO2, de acordo com os métodos da presente invenção, recebe três lavagens de água e foram espessas, caso necessário, por centrifugação a 11 % de sólidos em peso.
[0570] 220,24 litros (50 galões) dessa suspensão que contém 20,41 kg (45 libras) de sólidos de C. necator são resfriados a 7,22 °C (45 °F) e submetidos à homogeneização em uma pressão de 55,16 Mpa (8.000 PSIG) e imediatamente resfriados a 7,22 °C (45 °F). A homogeneização é repetida para um total de três passadas. O homogenado é diluído a um volume de 660,73 litros (150 galões) com água, e um Hidróxido de Sódio de reagente alcalino de grau alimentar é adicionado até que obtenha-se um pH 9,5. O material é agitado por 15 minutos e, e seguida, centrifugado. O resíduo insolúvel (dejetos de parede celular) é removido. A quantidade inicial de sólidos de homogenado é ponderado, junto da recuperação após homogeneização,
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214/229 extração e separação, da biomassa solúvel em extrato de álcali e biomassa insolúvel. O extrato de álcali é ajustado a um pH 6,0 pela adição de um ácido clorídrico normal e amornecido a 50 °C (122°F). O extrato é submetido à agitação branda por uma hora a um pH 6,0 a fim de permitir que a nuclease endógena digira o ácido nucleico.
[0571] Uma execução paralela para comparação envolve tratar um extrato alcalina com uma nuclease exógena a pH 7; 50 °C; por 2 horas. A nuclease exógena é extraída de frutos de malte e usada na taxa de 4,08 kg (9 Ibs) de sólidos de fruto de malte extrato por 87,16 kg (18 Ibs) de sólidos de extrato de C. necator.
[0572] Outras execuções paralelas para comparação: 1) usar uma baixa temperatura, processo com alto teor de álcali para reduzir RNA. Nesse processo, o extrato de álcali do homogenado é ajustado a um pH 12 com NaOH e aquecido por 2 horas a 60 °C. A proteína é isolada após ajuste do sistema a um pH 4,5. 2) uso de um processo de baixo teor de álcali de alta temperatura a fim de reduzir RNA. Nesse processo, o extrato de álcali do homogenado é ajustado a um pH 10,5 e aquecido por 4 horas a 80 °C. A proteína é isolada após ajustar o sistema a um pH 4,5.
[0573] No término da incubação, 37,5 gramas de cloreto de cálcio são adicionados. A suspensão de proteína e amornecida a 79,44 °C (175 °F) e centrifugada para gerar pasta de proteína e soro ácido. O peso de sólidos secos em cada fração respectiva é medida. A pasta de proteína é lavada diluindo-se com dois volumes de água e, novamente centrifugar ao mesmo tempo que a temperatura é mantida a 79,44 °C (175 °F), e o pH é mantida em 6,0. Em uma base sólida seca, a quantidade de pasta de proteína lavada é medida, ao longo da quantidade de sólidos de lavagem. A pasta de proteína lavada é concentrada in vacuo (71,12 centímetros (28 polegadas) de Hg) a 79,44 °C (175 °F), pH 6, a 20% de sólidos e seco por aspersão. A composição do produto seco por aspersão é determinada incluindo: % de umidificação, % de proteína crua (N X 6,25), % de ácido nucleico, % de lipídeo, % de cinzas, % de
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215/229 carboidrato (por diferença).
[0574] A qualidade nutricional de C. necator não fracionado e de proteína de C. necator isolado, nos quais o teor de ácido nucleico foi reduzido por vários métodos descritos acima, é comparada. A biomassa não fracionada é lavada três vezes com água e seca por aspersão.
[0575] O teor de aminoácido essencial é determinado para todas as amostras. O teor é comparado contra aqueles citado pelo Comitê FAO de Exigências de Proteínas (1957b) “FAO Nutritional Studies No. 16”, e é analisado para determinar como pode atender ou exceder exigência de aminoácido para cultivar ratos de teste.
[0576] A Razão de Equivalência de Proteína ou PER é determinada em relação à linha de base da caseína (PER = 2,5). Os testes de alimentação são realizados com ratos com o uso de um nível de 10% de proteínas corrigidas na dieta. O procedimento de teste publicado em Official Methods of Analysis of the A.O.A.C. p. 800, 11a Edição (1970) é seguido. Alguns testes são realizados com o uso da biomassa de C. necator sem tentativa de reduzir o RNA.
[0577] O teor de PER e RNA de biomassa não fracionada versus isolado de proteínas é comparado. O isolado produzido exclusivamente com o uso da nuclease endógena também é comparado ao isolado produzido com o uso de nuclease exógena, e com os isolados produzidos com o uso um processo de álcali mais intenso.
EXEMPLO 20
TESTE DE EFEITO BIOESTIMULANTE EM PH [0578] O efeito do PH no padrão de transição de codificação de genes para as enzimas que funcionam no ciclo de ácido tricarboxílico é analisado por meio de reação em cadeia da polimerase de transcrição reversa. O acúmulo de transcrito da codificação de genes para as enzimas estudadas é estudado para determinar se as mesmas são reguladas de maneira ascendente pelo tratamento de PH. As atividades de enzima também
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216/229 são testadas. A mesma abordagem é usada para verificar os efeitos bioestimulantes de um produto de PH de controle, tal como um derivado de hidrólise de resíduos de escurecimento.
EXEMPLO 21
PRODUÇÃO E TESTE DE BIOESTIMULANTE [0579] Um creme de célula bacteriana produzido a partir da matéria-prima C1, conforme descrito no presente documento, é isolado pela fiItração por membrana. O teor de sólidos total e o teor de nitrogênio de total do creme de célula são medidos. As quantidades alvejadas são aproximadamente 8% em peso e 0,8% em peso respectivamente. A viscosidade também é medida. O ácido sulfúrico é adicionado a aproximadamente 300 ml do creme de célula a fim de ajustar o pH do creme de célula a 3,5. A hidrólise é realizada carregando-se o creme celular de pH ajustado em um frasco de Erlenmeyer 500 ml, coberto com uma folha e colocado em uma autoclave a 128 °C. Por 24 horas sob 7,26 kg (16 Ibs) de pressão. Após a hidrólise, a viscosidade do creme de célula (hidrolisado) é medida novamente. Espera-se que esta seja reduzida consideravelmente, com uma separação clara de subprodutos solúveis e produtos insolúveis. Após o resfriamento, o hidrolisado é filtrado através de um filtro de papel de 20 microns e a fração solúvel coletada para análise adicional. O teor de sólidos total e do nitrogênio total da fração solúvel são medidos. A fração solúvel é testada quanto à sua capacidade de elicitar uma resposta de fito-hormônio em grama de turfa medindo-se a mudança de densidade de broto ao longo do tempo em comparação a tratamentos de controle. Durante um teste de 70 duas, as plotagens de grama de turfa em uma estufa são tratadas de maneira foliar a cada duas semanas ou com água, sulfato de amônio ou a fração solúvel. Tanto o sulfato de amônio quanto a fração solúvel são aplicados em uma quantidade de 0,02 kg (0,05 Ibs) de nitrogênio por 92,9 metros quadrados (1.000 pés quadrados). Densidades de broto de turfa são medidos no dia 0, dia 44 e dia 70. A grama de turfa tratada com a fração solúvel é testada quanto ao aumento estatisticamente significativo (p<0,05) na densidade do broto do dia 0 ao dia 70
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217/229 em comparação aos tratamentos de controle.
EXEMPLO 22
EFEITO DE MASSA CELULAR MICROBIANA INDUSTRIAL E HIDROLISADOS MEDIANTE O CRESCIMENTO DE RABANETES [0580] Um teste é elaborado para medir o efeito de diferentes tratamentos de fertilizante mediante o crescimento e rendimento de rabanetes vermelhos (Raphanus salivus) variedade Champion. As sementes são germinadas em um leito de nebulização e transplantado em portes de 15,24 cm (6 polegadas) de diâmetro que contêm carvão de musgo, perlita e vermiculita em uma razão 20:5:5, respectivamente. Os potes são hidratados com 200 ml três por semana. Nenhum fertilizante é fornecido durante o período de germinação. Os fertilizantes de tratamento são aplicados no mesmo dia que o transplante. Os tratamentos incluem um controle negativo sem fertilizante, controles positivos, um com sulfato de amônio e outro com um fertilizante comercial 9-3-6 e hidrolisados resultantes de hidrólise por proteinase e papaína. Os hidrolisados são aplicados em quantidades altas e baixas (por exemplo, 0,011 kg N/m2 (110 kg N/ha) e 0,0028 kg N/m2 (28 kg N/ha)). O controle positivo é aplicado em altas quantidades correspondentes (por exemplo, 0,011 kg N/m2 (110 kg N/ha)). Espera-se que a alta taxa de nitrogênio, por exemplo, 0,011 kg/m2 (110 kg/ha) atenda às exigências de produção de rabanete. Espera-se que a baixa taxa de nitrogênio, por exemplo, 0,0028 kg N/m2 (28 kg N/ha) esteja abaixo da exigência para N. Cada tratamento é aplicado a quadro réplicas em um modelo em bloco randomizado completamente.
[0581] O hidrolisado é obtido a partir do caldo de cultura de SCP (aproximadamente 10% de total de sólidos) produzido a partir de matéria-prima C1 de acordo com a presente invenção. O caldo proteináceo é hidrolisado ajustando-se o pH a 7 ou 9 com 30% de hidróxido de potássio antes de adicionar papaína (Liquipanol® T-100, Enzyme Development Corporation, Nova Iorque, N.Y.) e proteinase bacteriana (Protease Alcalina Enzeco® L660
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Enzyme Development Corporation, Nova Iorque, N.Y.), respectivamente. Os cremes celulares são hidrolisado para um total de 24 horas com agitação constante fornecida para uma agitador e temperatura mantidos a 60 °C em um banho de água. As enzimas são desnaturadas esterilizando-se em autoclave hidrolisados por 5 minutos a 120 °C.
[0582] Os pesos de rabanete para todos os tratamentos com são comparados sem fertilizante. A comparação de sulfato de amônio e os controle 9-3-6 testam se há qualquer exigência não atendida para fósforo ou potássio. Uma falta de diferença sustenta que os níveis de P e K são adequados. Os tratamentos com baixo teor de N com hidrolisado de Protease e Papaína são comparados aos tratamentos com alto tepor de N. Os casos com baixo teor de N são testados para verificar se são possíveis altos rendimentos com menos nitrogênio, e caso a eficiência do uso de nitrogênio para a produção de rabanete é estatisticamente mais alta. Uma eficiência aprimorada reflete um efeito bioestimulante e confirma que esse creme de célula hidrolisado tem potencial para aumentar produção de safra de raiz com entradas de nutrientes inferiores.
EXEMPLO 23
TESTE DE HIDROLISADO EM SISTEMA HIDROPÔNICOS [0583] A meta desse experimento é determinar se o uso de PH derivados de micróbios pode potencializar o crescimento e a absorção de N de alface cultivado em um sistema hidropônico de flutuação em jangada.
[0584] Jangada flutuante ou DWC (cultura em água profunda) é situada em relação à produção em massa de determinados tipos de vegetais, em particular, alface. As mudas de alface são colocadas em uma jangada flutuante, normalmente, produzida a partir de uma folha grande de poliestireno em que um número de furos são cortados para acomodar as raízes das plantas.
[0585] A água oxigenada limpa é essencial. As raízes
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219/229 de planta são oxigenadas pesadamente. As raízes por si só estão imersas em água o tempo todo. As partículas sujas precisam ser eliminadas uma vez que a sujeira aderirá às raízes brancas da planta e bloco das raízes plantas a partir da absorção do oxigênio vital e minerais que possibilitarão que a planta madure e cresça.
[0586] O sistema de jangada flutuante usa várias pedras de ar em intervalos regulares para oxigenar pesadamente as raízes de planta. A água que entra nessa área deve agora ser livre da maioria dos sólidos. As raízes de planta devem ter aparência limpa e branca. No presente documento, a alface deve crescer rapidamente e a colheita realizada facilmente.
[0587] Com o uso de concentrações de solução nutriente hidropônico reduzido, aplicações foliares semanais de PH são testadas para impactar a biomassa fresca, índice de SPAD e absorção de N. A introdução do PH à água também é testada.
[0588] O índice de SPAD é determinado com o uso de um instrumento que mede a transmissão de luz através de uma folha, em dois comprimentos de onda, a fim de determinar verdor e a espessura das folhas. A transmissão na faixa infravermelha fornece uma medição relacionada à espessura da folha, e um comprimento de onda na faixa de luz vermelha é usado para determinar o verdor. A razão entre a transmissão dos dois comprimentos de onda fornece um índice de teor de clorofila que é denominado de CCI ou alternativamente com um índice de SPAD. CCI é uma escala linear, e SPAD é uma escala logarítmica. Mostrou-se que esses instrumentos e escalas se correlacionam a testes químicos de clorofila para o teor de clorofila, exceto em altos níveis. Os metros de teor de clorofila são usados comumente para medição de estresse de planta de nutriente que inclui estresse de nitrogênio e estresse de enxofre.
EXEMPLO 24
FORMULAÇÃO DE POTENCIALIZADOR DE CRESCIMENTO DE COGUMELO
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220/229 [0589] Um potencializador de crescimento de cogumelo é produzido por uma célula de alto teor de proteína conforme descrito no presente documento, tal como, porém sem limitação C. necator, de acordo com os métodos revelados acima. Após o crescimento e colheita, a massa celular é desidratada e seca de modo que o teor de água da mesma não seja maior 13% em peso de umidificação.
[0590] O tamanho de partícula de biomassa seca é padronizado com o uso de métodos conhecidos por uma pessoa versada na técnica. Uma distribuição focada dos tamanhos de partícula é gerada em um tamanho médio otimizado. O tamanho médio ideal é determinado de modo a fornecer distribuição adequada através do composto de cogumelo e disponibilidade de nutriente, embora não tome os nutrientes disponíveis também, o que pode possibilitar a rápida utilização das partículas competindose microrganismos, tais como moldes de bactérias ou estranhos. Nesse estágio, no processo de fabricação, o produto de partícula seca é analisado para confirmar que o produto contém primariamente partículas não maiores ou menos que — 1680 + 595 microns (I0 + 30 mesh (peneira) padrão U.S. (mais ou menos 5%.) O produto também é testado quanto à presença de organismos viáveis contam inantes.
[0591] O teor de carboidrato do produto é experimentalmente testado. Um produto de baixo teor de carboidrato é alvejado uma vez que os carboidratos são geralmente um estimulante para o crescimento para microrganismos estranhos indesejados. Portanto, os carboidratos baixos limitam a propagação de tais organismos. Em determinadas modalidades não limitativas, os carboidratos são removidos de modo a aumentar adicionalmente o teor de proteína e potência resultante do produto por peso unitário.
[0592] Caso o produto atenda aos padrões acima, o mesmo é transferido a uma unidade de mistura (Forberg Model C200-SS-2D ou equivalente). Na unidade de mistura, o produto é combinado com um agente conservante. Os agentes conservantes preferenciais incluem compostos
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221/229 antibióticos que contêm cobre, carbamato, fenólico e antibiótico cujos exemplos específicos são o seguinte:
[0593] 1. Materiais que Contêm Cobre - Sulfato de
Cobre sozinho ou em combinação com cal.
[0594] 2. Materiais de Carbamato - Metila I (butilcarbamoil)-2-benzimidazolcarbamato; etilenobisditiocarbamato de zinco.
[0595] 3. Materiais Fenólicos- o-Fenilfenol; oBenziLpara-clorofenol e sais dos mesmos.
[0596] 4. Materiais Antibióticos - Estreptomina;
Terramicina.
[0597] Os agentes selecionados são adicionados em uma quantidade eficaz para preservar o produto contra atividade de micróbios estranhos enquanto estiverem no composto, porém, nem tanto a fim de impedir a utilização do mesmo pelo micélio de cogumelo.
[0598] As etapas de processo restantes são realizadas, de preferência, em um modo contínuo. A próxima etapa envolve pasteurizar o produto. A fim de realizar a pasteurização, o produto é aquecido em um aparelho de secagem (Secador de Pá Nara Modelo 1,6W ou equivalente). O secador é operador para elevar a temperatura do produto de um nível ambiente a 104,4 °C (220 °F) em aproximadamente 5 minutos. Como o uso do Secador de Pá Nara Modelo 1,6W, isso ocorrerá através da injeção de 0,66 MPa (95 psi) de vapor a aproximadamente 162,78 °C (325° F). A pasteurização está destinada a alcançar os seguintes objetivos: (1) a redução de bactérias vegetativas e contra de placa de molde por pelo menos três registros; (2) a inativação de esporos bacterianos mesófilos; e (3) a inativação de lipoxigenase. No entanto, a quantidade descrita acima de calor está destinada a ser insuficiente para desnaturar substancialmente o produto. A pasteurização está destinada a reduzir a possibilidade de geração de calor precoce e indesejada por microrganismos estranhos durante a execução por processamento. Os níveis de pré-pasteurização e pós-pasteurização de microrganismos vivos são
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222/229 determinados.
[0599] Após a pasteurização ser concluída, o produto é transferida a uma unidade de resfriamento/evaporadora que consiste em um transportador de leito fluidizado de vibração (Jeffrey Dresser Industries, Model IXIO TMV ou equivalente) A unidade de resfriamento/evaporadora usa ar ambiente filtrado a 2500 CFM para diminuir a temperatura do produto de 104,44 °C (220 °F) a 37,78 °C (100 °F) em aproximadamente um a dois minutos. Após o resfriamento dessa maneira, o nível de umidificação do produto é medido. O nível de umidificação alvejado nesse estágio é aproximadamente 7,5%. O teor de umidificação do produto é medido e acompanhado durante os processos descritos acima assim como o perfil de temperatura do produto durante as fases de pasteurização/resfriamento.
[0600] A evaporação da água do produto conforme descrito acima está destinada a impedir refugo por microrganismos não exterminados durante a pasteurização, incluindo esporos bacterianos. O resfriamento rápido a 37,78 °C (100 °F) em 1 a 2 minutos está destinado a impedir a desnaturação de proteína - desnaturação de proteína é proporcional ao espaço de tempo que um produto é mantida sob uma alta temperatura.
[0601] O produto potencializador de crescimento de cogumelo final resultante está destinado a ser compreendido de materiais de proteína substancialmente desnaturados. A desnaturação envolve uma modificação da estrutura terciária ou quaternária de uma proteína, com mudança resultante às propriedades físicas e biológicas da proteína. O termo “substancialmente desnaturado”, conforme usado no presente documento, é refletido por um índice denominado “PDI” ou “índice de polidispersidade de proteína”. A obtenção de medições de PDI envolve extrair o produto de célula com água e analisar a porção extraída com o uso de análise Kjeldahl. Na condução de análise Kjeldahl, o produto é digerido com H2SO4 concentrado o que converte nitrogênio combinado no produto em sulfato de amônio. Em seguida, a solução resultante é tratada com materiais alcalinos, causando a
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223/229 liberação de amônia. A quantidade de amônia liberada é determinada por titulação com ácido padrão. Os resultados da titulação podem, então, ser usados para calcular a quantidade de nitrogênio no produto. A fim de calcular o PDI, a fórmula fornecido no método AOCS Ba 10-65 é usada. No presente pedido, uma proteína “substancialmente desnaturada” é caracterizada como aquela que tem um PDI não menor que 50. A análise de PDI é realizada no produto e comparada ao produto comercialmente disponível com o uso de material de soja desnaturado porformaldeído; relatado como tendo um PDI de aproximadamente 11,4. A análise próxima do potencializador de crescimento de cogumelo é realizada incluindo o teor de proteína, umidificação, gordura, cinzas, cru, fibra, carboidratos. O teor calórico também é determinado.
[0602] O potencializador de crescimento de cogumelo é usado imediatamente após a preparação ou ensacados e armazenado em uma localização seca fria para posterior uso. Em uso, o produto é combinado uniformemente com composto, de preferência, na fase de desova de cultivo de cogumelos. O produto potencializador do composto/crescimento é mantido dentro de uma faixa de temperatura de 23,89 °C a 26,67 °C (75 a 85 °F) durante um processamento de ova de 14 dias. As temperaturas fora dessa faixa, especialmente acima 32,22 °C (de 90 °F) podem resultar em perdas substanciais de rendimento e qualidade. A porcentagem em peso de potencializador de crescimento de adicionado ao composto para resultados ideais é determinada através de teste. Um peso de potencializador de crescimento ideal de 3,5% peso seco do composto é alvejado ou mais amplamente uma faixa de 2 a 5% (peso seco) do composto.
EXEMPLO 25
TESTE DE POTENCIALIZADOR DE CRESCIMENTO DE COGUMELO [0603] O composto usado nos testes é preparado a partir de graveto de trigo (21,18 kg (46.700 lb)) combinados com esterco de frango (9,07 kg (20.000 lb.)), cascos de semente de algodão (6,8 kg (15.000 lb.)),
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224/229 sulfato de potássio (317,51 kg (700 lb)), ureia (136,08 kg (300 lb)), divisões de soja (1,59 kg (3,500 lb)) e farelo de semente de algodão (3,18 kg (7,000 lb)). O composto completo é colocado em bandejas de 20,32 centímetros (8 polegadas) de profundidade com quatro libras de óleo vegetal de semente de algodão por bandeja e pasteurizados. Após a pasteurização, 1,91 kg (4,2 libras) por bandeja de ovas de cogumelo de A. bisporus é adicionado ao composto em combinação com os materiais suplementares, preparados conforme acima de massa celular proteinácea em substrato C1, em adições em uma faixa de 2 a 6% porcentagem em peso. O controle positivo é uma formulação comercial à base de proteína de soja. O controle negativo não tem suplemento adicionado ao composto. A suplementação em porcentagem se baseia em 2,95 kg (6.5 Ib) da matéria seca de compostos por metro quadrado (pé quadrado). Todos os suplementos são testados de modo que tenham um tamanho de partícula semelhante com o uso de peneiras padrão.
[0604] Após a adição dos suplementos, a água é, em seguida, adicionada às bandejas a fim de elevar o nível de umidificação do teor a aproximadamente 70%. Em seguida, as bandejas são colocadas em uma sala de ambiente controlado que tem uma umidade relativa de 90 a 95%. As temperaturas compostas são mantidas entre 25,56 a 27,78 °C (78° a 82° F). Após 13 dias de crescimentos de ovas, uma camada de 4,45 centímetros (1,75 polegada) de amolecer o solo é aplicada à superfície de composto e desidratada conforme possível. As bandejas são mantidas em salas de ambiente controlado 18,33 °C a 22,78 °C (65° a 73° F.; 10.000 ppm de CO2) por 13 dias seguida por uma temperatura de ar a abrupto e deslocamento de CO215,56 °C (60 °F) e 800 ppm de CO2; para causar frutificação dos cogumelos. As bandejas são, então, colocadas em salas de produção e colhidos para quatro nivelamentos semanais. O período de tempo envolvido é de acordo com o seguinte: (a) fase I formação de composto-56 dias; (b) fase II formação de composto—6 dias; (c) processamento de ovas-13 dias; (d) retenção de invólucro -13 dias; e (e) colheita -32 dias. O rendimento total médio em kg/m2 de cogumelos é determinado para
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225/229 os experimentos e controles.
EXEMPLO 26
PROCESSAMENTO DE ALIMENTO PARA SUBSTITUTO DE CARNE [0605] Um produto de alto teor de proteína (HPP) com teor reduzido de ácido nucleico produzido conforme descrito acima é usado como um ingrediente alimentar.
[0606] Preparação:
[0607] 1. Pesar a quantidade exigida de HPP e colocar em uma tigela de mistura de Hobart.
[0608] 2. Medir a água em uma razão entre aproximadamente 3:2 em reação a HPP, e adicionar coloração caramelo é água em uma razão entre aproximadamente 1:60. Definir o misturador na Velocidade I.
[0609] 3. Ligar o misturador Hobart e adicionar água com cor de caramelo ao HPP na tigela de mistura Hobart muito lentamente, durante a mistura. Misturar bem o material [0610] 4. Extrusar o material mesclador através de um triturador de carne, (por exemplo, fixação Hobart) e prender o HPP extrudado em uma bandeja ou panela do secador. O HPP extrudado pode ser cortado no comprimento desejado uma vez que surge da extrusora, ou pode ser coletada como fitas longas e reduzidos até tamanho desejado após secagem.
[0611] 5. Secar o material extrudado em um forno convencional a uma teor de umidificação de cerca de 10%. O HPP seco extrudado é reidratado para uso adicional nas aplicações de produto alimentar por meio de, a) reidratação em água (excessiva) à temperatura ambiente por 1 a 2 horas, ou por, b) reidratação em água morna excessiva 37,78 °C a 60 °C (100 a 140 °F) por 1 hora. A razão entre absorção água e HPP texturizado é determinado.
EXEMPLO 27
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226/229
TESTE COMO POTENCIALIZADOR DE CRESCIMENTO PARA PRODUTO DE TEMPEH E FORMULAÇÕES-TESTE COM OKARA [0612] Okara é um subproduto com base em feijãosoja que surge após fabricação de leite de soja/fabricação de tofu. Este tern urn teor de proteína relativamente alto. Okara pode ser convertido em Tempeh fermentando-se com o fungo Rhizopus oligosporus, com o uso de iniciador de tempeh, ou convertido para pressionar tempehs de bloco com o uso de ingredientes, tais como arroz marrom, triguilho, sojas e outras combinações de legume e grão.
[0613] Nesse experimento, testa-se se as células, e/ou seus extratos e/ou hidrolisados da presente invenção podem ser usadas como um potencializador de crescimento para R. oligosporus em combinação com substrato de okara. Além disso, testa-se se o tempeh resultante produzido com o potencializador de crescimento tem características superiores, tais como porém sem limitação valor nutricional, sobre o controle negativo.
[0614] Esse experimento também testa se as células, extratos e/ou hidrolisados podem ser usados com okara apenas ou em combinação com outros ingredientes, tais como arroz marrom, triguilho, sojas e outros legume e combinações de grão, na produção de tempehs de bolo de prensa.
EXEMPLO 28 [0615] Determinadas modalidades descritas no presente documento estimulam fontes renováveis de pó, tais como solar e vento, para produzir ο H2 exigido para fixação de carbono. A fonte de CO2 é uma fonte industrial, tal como uma usina de força. Os eletrolisadores extraem pó durante períodos de demanda elétrica durante períodos de baixa demanda elétrica e alta fonte de alimentação de potência renovável. Durante tais períodos de baixa demanda e alta geração renovável, o teor livre de emissão de CO2 renovável da alimentação elétrica pode atingir até 95% em regiões tais Texas, Escócia e Alemanha. Desse odo, em funcionamento, o eletrolisador extrai energia livre de
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227/229 emissões de CO2 para a produção de H2 da água e utilizará pouca, se houver, energia com muito CO2. Em tais regiões, os períodos de fonte de alimentação renovável e baixa demanda de rede elétrica ocorrem aproximadamente 50% do tempo e, então, espera-se que o eletrolisador opere aproximadamente 50% do tempo. O armazenamento em tanque de H2 e CO2 no local tampam a diferença em temporização entre produção de CO2 da fonte industrial e produção de H2 do eletrolisador, 0 que possibilita um fluxo contínuo de ambos esses gases bi bioprocesso de fixação de CO2. O quimioautotrófico micróbios de knallgas converte CO2, H2, e nutrientes minerais (isto é, NPK) biomassa de alta proteína. Essa biomassa rica em proteína pode ser convertida em bioestimulantes para plantas, ou crescimento para cogumelos ou alimentação animal ou nutrição direta para seres humanos (Figura 23 e Figura 24). O2 do eletrolisador excederá as exigências do bioprocesso de knallgas microaeróbica. Esse O2 excedente pode ser vendido como um coproduto de gás puro (Figura 25), ou alimentado de volta para uma combustão fóssil ou unidade de energia a fim de aumentar a eficiência térmica da unidade e aumentar a concentração de CO2 na corrente de gás de queima que surge da unidade. A concentração aumentada de CO2 facilita a etapa de captura de carbono.
[0616] A fim de obter a neutralidade de carbono, o sistema é, de preferência, localizado nas regiões com geração de energia renovável intermitente. A unidade de eletrolisador apenas extrai energia durante períodos de baixa demanda elétrica e sobrealimentação de energia renovável. Isso aliviará a tensão na rede elétrica causada por energia renovável intermitente (Figura 25). Além da captura de CO2, a produção de nutrientes valiosos, e a liberação de tensão na rede elétrica de geração renovável excessiva durante períodos de baixa demanda, o sistema também possibilita mais utilização completa de capacidade renovável permitindo-se que os produtos renováveis mantenham a geração durante período de banda demanda. Uma aplicação principal de corrente para tecnologia de eletrolisador deve converter ο H2 produzido durante período de sobrealimentação de potência renovável, retornar
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228/229 para a eletricidade da rede durante período de alta demanda elétrica e fonte de alimentação renovável baixa - em funcionamento retornar para a cadeia de valor de H2 para eletricidade. H2 e CO2 são convertidos em proteína e, então, em nutrientes para plantas, cogumelos, animais e seres humanos - em funcionamento continuando adicionalmente até a cadeia de valor do H2.
[0617] As modalidades preferenciais da presente invenção foram rescritas no presente documento de maneira detalhadamente suficiente para possibilitar que uma pessoa versada na técnica pratique o escopo completo da invenção. No entanto, deve-se entender que essas modalidades são ilustrativas e que muitas variações possíveis da presente invenção, que não foram descritas especificamente, ainda são abrangidas pelo escopo da presente invenção nas reivindicações anexas.
[0618] Embora a invenção supracitada tenha sido descrita em alguns detalhes a título de ilustração e de exemplo para tonar claro o entendimento, ficará evidente para as pessoas versadas na técnica que determinadas mudanças e modificações podem ser praticadas sem haver afastamento do espírito e do escopo da invenção, que são delineados nas reivindicações anexas. Portanto, a descrição deve ser interpretada como limitativa do escopo da invenção.
[0619] As descrições fornecidas no presente documento são adicionadas apenas a título de exemplo e não de limitação, de qualquer maneira, do escopo da presente invenção. De modo geral, as pessoas versadas na técnica entenderão que todos os parâmetros, dimensões, materiais e configurações descritas no presente documento devem ser exemplificativas e que os reais parâmetros, dimensões, materiais e/ou configurações dependerão da aplicação específica ou de aplicações para as quais os ensinamentos da presente invenção são usados. Quando um limite ou faixa numérica é declarada no presente documento, os números inicial ao final são incluídos. Além disso, todos os valores e subfaixas dentro de um limite numérico estão incluídos especificamente como se escritos explicitamente. As pessoas versadas na
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229/229 técnica reconhecerão, ou poderão confirmar, usando nada mais que experimento rotineiro, muitos equivalentes às modalidades específicas da invenção descrita no presente documento. Muitas variações, modificações, adições e subtrações são possíveis. Além disso, muitas etapas descritas no presente documento podem ser trocadas de ordem e muitas etapas podem ser adicionadas ou removidas. Portanto, deve-se entender que as modalidades anteriores são apresentadas a título de exemplo apenas e que, dentro do escopo das reivindicações anexas e equivalentes às mesmas, a invenção pode ser praticada de outro modo além do descrito e reivindicado especificamente.
[0620] A presente invenção se refere a cada recurso, sistema, artigo material, kit e/ou método individual descrito no presente documento. Além disso, qualquer combinação de dois ou mais desses recursos, sistemas, artigos, materiais, kits e/ou métodos, caso tais recursos, sistemas, artigos, materiais, kits e/ou métodos não são mutuamente inconsistentes, está incluída dentro do escopo da presente invenção.
[0621] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente citadas no presente documento são incorporadas a título de referência no mesmo para qualquer fim e igual a se cada publicação, patente ou pedido de patente individual fosse indicada específica ou individualmente como incorporada a título de referência.

Claims (79)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Método biológico e químico para a conversão biológica de moléculas inorgânicas e/ou orgânicas que contêm um ou mais átomos de carbono em moléculas orgânicas que compreendem aminoácidos, proteínas e/ou vitaminas produzidas através de uma reação de fixação de carbono ou biossíntese anabólica, caracterizado pelo fato de que compreende:
    introduzir moléculas inorgânicas e/ou orgânicas que contêm um ou mais átomos de carbono em um ambiente que compreende células de microrganismos em um meio de cultura que é adequado para a manutenção das células de microrganismos;
    em que as moléculas inorgânicas e/ou orgânicas que contêm um ou mais átomos de carbono são utilizadas como fonte de carbono pelas células de microrganismos para crescimento e/ou biossíntese;
    converter as moléculas inorgânicas e/ou orgânicas que contêm um ou mais átomos de carbono nos produtos de molécula orgânica que compreendem aminoácidos, proteínas e/ou vitaminas no meio ambiente através de pelo menos uma reação de fixação de carbono ou pelo menos uma via biossintética anabólica contida no interior das células de microrganismos;
    em que a reação de fixação de carbono ou a via biossintética anabólica são pelo menos parcialmente acionadas por energia química e/ou eletroquímica fornecida por dadores de elétrons e/ou aceitadores de elétrons que foram gerados quimicamente e/ou eletroquimicamente e/ou termoquimicamente e/ou são introduzidos no ambiente a partir de pelo menos uma fonte externa ao ambiente, e em que as células de microrganismos compreendem biomassa que compreende os ditos aminoácidos, proteínas e/ou vitaminas.
  2. 2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita célula de microrganismos é uma célula bacteriana.
  3. 3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as ditas células de microrganismos produzem aminoácidos e/ou
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    2/13 proteínas e/ou vitaminas e/ou biomassa quando cultivadas na presença de um substrato gasoso sob condições adequadas para o crescimento do microrganismo e a produção de bioprodutos.
  4. 4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o dito substrato gasoso compreende CO2 e/ou de CO e/ou CHU como uma fonte de carbono.
  5. 5. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que 0 dito substrato gasoso compreende H2.
  6. 6. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que 0 dito substrato gasoso compreende H2 e/ou O2 como uma fonte de energia.
  7. 7. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que 0 dito substrato gasoso compreende dadores de elétrons que incluem um ou mais dentre H2 e/ou de CO e/ou Chk.
  8. 8. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que 0 dito substrato gasoso compreende gás de pirólise ou gás de produção ou syngas ou gás natural ou biogás.
  9. 9. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que 0 dito substrato gasoso compreende uma mistura de gases que compreende H2 e/ou CO2 e/ou CO.
  10. 10. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que 0 dito microrganismo é Cupriavidus sp. ou Ralstonia sp.
  11. 11. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que 0 dito microrganismo é Cupriavidus necator ou Cupriavidus metallidurans.
  12. 12. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita biomassa e/ou moléculas orgânicas produzidas pelos ditos microrganismos são utilizadas para alimentar ou fornecer nutrição a um ou mais outros organismos.
  13. 13. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado
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    3/13 pelo fato de que os ditos aminoácidos e/ou proteínas e/ou vitaminas são utilizados para produzir um bioestimulante vegetal ou um promotor de crescimento de cogumelos.
  14. 14. Bioestimulante vegetal caracterizado pelo fato de que compreende biomassa, aminoácidos, proteínas e/ou vitaminas produzidas de acordo com a reivindicação 1.
  15. 15. Método para tratamento de uma cultura caracterizado pelo fato de que compreende a aplicação de um bioestimulante vegetal, de acordo com a reivindicação 14, a uma planta e/ou ao solo no qual uma planta é cultivada e/ou a um meio líquido utilizado para cultivar uma planta; e a colheita da planta.
  16. 16. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente a aplicação da biomassa, dos aminoácidos, das proteínas e/ou das vitaminas produzidas no ambiente a uma planta e/ou ao solo no qual uma planta é cultivada e/ou a um meio líquido utilizado para cultivar uma planta; e a colheita da planta.
  17. 17. Método, de acordo com a reivindicação 15 ou 16, caracterizado pelo fato de que a planta é uma cultura agrícola.
  18. 18. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as ditas células de microrganismos são lisadas, produzindo assim um lisado.
  19. 19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o dito lisado é utilizado para produzir uma emulsão ou uma suspensão.
  20. 20. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o dito lisado é separado em frações solúveis e insolúveis.
  21. 21. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a dita fração insolúvel e/ou solúvel é concentrada ou seca.
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    4/13
  22. 22. Bioestimulante vegetal caracterizado pelo fato de que compreende um lisado, uma emulsão, uma suspensão ou uma fração dos mesmos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 21.
  23. 23. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as ditas proteínas são hidrolisadas, produzindo assim um hidrolisado.
  24. 24. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o dito hidrolisado é utilizado para produzir uma emulsão ou uma suspensão.
  25. 25. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o dito hidrolisado é separado em frações solúveis e insolúveis.
  26. 26. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a dita fração insolúvel e/ou solúvel é concentrada ou seca.
  27. 27. Método, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o dito hidrolisado é filtrado, produzindo assim um filtrado e uma torta de filtração.
  28. 28. Bioestimulante vegetal caracterizado pelo fato de que compreende um hidrolisado, uma emulsão, uma suspensão, uma fração, um filtrado ou uma torta de filtração dos mesmos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 27.
  29. 29. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita biomassa é utilizada para a produção de um bioestimulante vegetal que compreende: hidrolisar a dita biomassa para obter um hidrolisado; e formular o hidrolisado como um bioestimulante vegetal para aplicação foliar e/ou aplicação como um adjuvante ou aditivo de solo e/ou para uso em meio líquido para o cultivo das plantas.
  30. 30. Bioestimulante vegetal caracterizado pelo fato de que é obtido pelo método, de acordo com a reivindicação 29.
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    5/13
  31. 31. Método, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente a aplicação do bioestimulante vegetal a uma planta e/ou ao solo no qual uma planta é cultivada e/ou a um meio líquido utilizado para cultivar uma planta; e a colheita da planta.
  32. 32. Método, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que a dita hidrólise compreende pelo menos uma enzima que é capaz de hidrolisar proteínas em pelo menos um dos aminoácidos e oligopetídeos livres.
  33. 33. Método, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que a dita hidrólise compreende a realização de hidrólise ácida.
  34. 34. Método, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que a dita hidrólise compreende a realização de hidrólise alcalina.
  35. 35. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que os ditos microrganismos são microrganismos de Knallgas.
  36. 36. Método, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o dito substrato gasoso compreende H2 e/ou CO2.
  37. 37. Método, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que 0 dito substrato gasoso é 0 gás de pirólise ou 0 gás produtor ou 0 syngas.
  38. 38. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que 0 dito substrato gasoso é derivado de resíduos sólidos urbanos, lixívia negra, resíduos agrícolas, resíduos de madeira, gás natural ocioso, biogás, gás ácido, hidratos de metano, pneus, coque de petróleo, esgoto, esterco, palha, culturas energéticas lignocelulósicas, lignina, resíduos de culturas, bagaço, pó de serra, resíduos florestais, resíduos alimentares, carpetes residuais, resíduos plásticos, gás de aterro, alga kelp, algas marinhas e/ou biomassa lignocelulósica.
  39. 39. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado
    Petição 870190073854, de 01/08/2019, pág. 25/34
    6/13 pelo fato de que aminoácidos e/ou proteínas e/ou vitaminas e/ou biomassa produzidos no ambiente são recuperados do meio de cultura.
  40. 40. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita fonte de carbono contém apenas um átomo de carbono, e em que ditos dadores de elétrons e/ou moléculas que contêm apenas um átomo de carbono são gerados através de um processo termoquímico que age sobre a matéria orgânica que compreende pelo menos um dentre: gaseificação; pirólise; reforma a vapor; e autorreforma.
  41. 41. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita fonte de carbono contém apenas um átomo de carbono, e em que ditos dadores de elétrons e/ou moléculas orgânicas que contêm apenas um átomo de carbono são gerados através da reforma a vapor de metano.
  42. 42. Método, de acordo com as reivindicações 40 e 41, caracterizado pelo fato de que o substrato gasoso é derivado de uma corrente de gás que compreende H2, CO e CO2 que são gerados a partir da gaseificação e/ou pirólise e/ou autorreforma e/ou reforma a vapor, em que a razão entre hidrogênio e monóxido de carbono na saída de gás proveniente de gaseificação e/ou pirólise e/ou autorreforma e/ou reforma a vapor é ajustada com 0 uso da reação de mudança de gás de água antes da corrente de gás ser entregue aos microrganismos.
  43. 43. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as células de microrganismos compreendem microrganismos selecionados dentre um ou mais dos seguintes gêneros: Cupriavidus sp., Rhodococcus sp., Hydrogenovibrio sp., Rhodopseudomonas sp., Hydrogenobacter sp., Gordonia sp., Arthrobacter sp., Streptomycetes sp., Rhodobacter sp. e/ou Xantobacter.
  44. 44. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende um ou mais dadores de elétrons selecionados dentre: amônia; amônio; monóxido de carbono; ditionita; enxofre elementar;
    Petição 870190073854, de 01/08/2019, pág. 26/34
    7/13 hidrocarbonetos; hidrogênio; metabissulfitos; óxido nítrico; nitritos; sulfatos, como tiossulfatos que incluem, porém sem limitação, tiossulfato de sódio (Na2Ô2O3) ou tiossulfato de cálcio (CAS2O3); sulfetos como sulfeto de hidrogênio; sulfitos; tionato; tionita; metais de transição ou sulfetos dos mesmos, óxidos, calcogenetos, halogenetos, hidróxidos, oxi-hidróxidos, fosfatos, sulfatos ou carbonatos, em fases dissolvidas ou sólidas; e elétrons de banda de condução ou de valência em materiais de eletrodo de estado sólido.
  45. 45. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende um ou mais aceitadores de elétrons selecionados dentre: dióxido de carbono; oxigênio; nitritos; nitratos; ferro férrico ou outros tons de metais de transição; sulfatos; e orifícios de banda de valência ou de condução em materiais de eletrodo de estado sólido.
  46. 46. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita conversão biológica é precedida por uma ou mais etapas de pré-processamento químico nos quais os doadores de elétrons e/ou aceitadores de elétrons e/ou fontes de carbono e/ou nutrientes minerais requeridos pelo microrganismo são gerados e/ou refinados a partir de pelo menos um produto químico de entrada e/ou são reciclados a partir de produtos químicos emergentes da etapa de fixação de carbono e/ou são gerados a partir de correntes de resíduos de outros processos industriais, de mineração, agrícolas, de esgoto ou de geração de resíduos, ou estão contidos nelas.
  47. 47. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os dadores de elétrons e/ou aceitadores de elétrons são gerados ou são reciclados com 0 uso de fontes de energia renováveis, alternativas ou convencionais com baixa emissão de gases de efeito de estufa e em que as ditas fontes de energia são selecionadas dentre pelo menos uma energia fotovoltaica, energia térmica solar, energia eólica, energia hidroelétrica, energia nuclear, energia geotérmica, energia geotérmica melhorada, energia térmica oceânica, energia das ondas oceânicas e energia da força das marés.
  48. 48. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado
    Petição 870190073854, de 01/08/2019, pág. 27/34
    8/13 pelo fato de que os dadores de elétrons e/ou aceitadores de elétrons são gerados com o uso de eletricidade proveniente da rede elétrica durante períodos em que a oferta da rede elétrica excede a procura da rede elétrica, e em que os tanques de armazenagem amortecem a geração dos ditos dadores de elétrons e/ou aceitadores de elétrons e o seu consumo na dita reação de fixação de carbono.
  49. 49. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que os ditos dadores de elétrons compreendem H2 e/ou CO e/ou metano derivados de um gás residual proveniente de um ou mais dentre: reforma a vapor de metano; refinamento de petróleo; produção de aço; produção de alumínio; produção de manganês; 0 processo de cloroalquila; fabricação de negro de fumo; síntese de metanol; síntese de amônia; processos metalúrgicos; processos químicos; e processos eletroquímicos.
  50. 50. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita fonte de carbono compreende uma molécula C1 capturada ou dirigida a partir de uma ou mais fontes que compreendem: a gaseificação da matéria orgânica; a calcinação de calcário, CaCOa, para produzir cal viva, CaO; reforma a vapor de metano; combustão, incineração ou queima; fermentação anaeróbica ou aeróbica de açúcar; um bioprocesso metanotrófico; respiração de outros organismos, tratamento de águas residuais; gás de aterro, produção de fosfato de sódio; gases geologicamente ou geotermicamente produzidos ou emitidos; gás ácido, gás ácido ou gás natural; água do mar ou outras massas de águas superficiais ou subterrâneas; e a atmosfera.
  51. 51. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os produtos de moléculas orgânicas compreendem compostos com cadeias principais de carbono com cinco carbonos ou mais.
  52. 52. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende hidrogênio molecular como dador de elétrons, em que 0 dito hidrogênio é gerado por um método que utiliza pelo menos um dentre os seguintes: eletrólise de água; divisão termoquímica da água; eletrólise de salmoura; eletrólise e/ou divisão termoquímica de sulfeto de hidrogênio.
    Petição 870190073854, de 01/08/2019, pág. 28/34
    9/13
  53. 53. Método, de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo fato de que a eletrólise da água para a produção de hidrogênio é realizada com o uso de um ou mais dentre: membranas de troca de prótons (PEM); eletrólitos líquidos como KOH; eletrólise alcalina; eletrólise de eletrólito de polímero sólido; eletrólise de alta pressão; e eletrólise de vapor a alta temperatura (HTES).
  54. 54. Método, de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo fato de que a divisão termoquímica da água para a produção de hidrogênio é realizada com o uso de um ou mais dentre os seguintes: ciclo de óxido de ferro; ciclo de óxido de cério(lV)-óxido-cério(lll); ciclo de óxido de zinco e zinco; ciclo de iodo e enxofre; ciclo de cobre e cloro; ciclo cálcio-bromo-ferro; ciclo de enxofre híbrido.
  55. 55. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as ditas células de microrganismos produzem os ditos aminoácidos, proteínas e/ou vitaminas através de uma reação quimiossintética que compreende o hidrogênio molecular como doador de elétrons, em que o hidrogênio é gerado por processos eletroquímicos ou termoquímicos conhecidos por produzir hidrogênio com baixa ou nenhuma emissão de dióxido de carbono compreendendo um ou mais dentre: reforma a vapor de metano possibilitada por captura e sequestro de carbono (CCS); gaseificação de carvão possibilitada por CCS; o processo de Kvaerner e outros processos que geram um produto de negro de carbono; gaseificação ou pirólise de biomassa possibilitadas por CCS; e pirólise de biomassa que produz um coproduto de biocarvão.
  56. 56. Método para a produção de aminoácidos e/ou proteína e/ou vitaminas e/ou biomassa caracterizado pelo fato de que compreende cultivar de um microrganismo, de acordo com a reivindicação 1, em um biorreator que compreende um substrato gasoso e um meio de cultura que compreende outros nutrientes para o cultivo e a produção de bioproduto, sob condições que são adequadas para o cultivo do microrganismo e a produção de aminoácidos e/ou proteína e/ou vitaminas e/ou biomassa, em que o dito microrganismo produz
    Petição 870190073854, de 01/08/2019, pág. 29/34
    10/13 aminoácidos e/ou proteína e/ou vitaminas e/ou biomassa.
  57. 57. Método para a produção de um lisado caracterizado pelo fato de que compreende o cultivo de um microrganismo, de acordo com a reivindicação 1, em um biorreator sob condições adequadas para o cultivo do microrganismo, em que a biomassa produzida no dito biorreator é colhida e removida do biorreator, em que a dita biomassa removida do biorreator é subsequentemente lisada, produzindo assim um lisado.
  58. 58. Método, de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de que o dito lisado compreende proteínas, sendo que o dito método compreende adicionalmente a hidrólise de proteínas no dito lisado, produzindo desse modo um hidrolisado.
  59. 59. Concentrado proteico caracterizado pelo fato de que é isolado das células de microrganismos, de acordo com a reivindicação 1.
  60. 60. Concentrado proteico, de acordo com a reivindicação
    59, caracterizado pelo fato de que tem menos de cerca de 5% de ácido nucleico.
  61. 61. Concentrado proteico, de acordo com a reivindicação
    60, caracterizado pelo fato de que tem menos de cerca de 3% de ácido nucleico.
  62. 62. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente a produção de um produto proteico concentrado que compreende as etapas de: a. romper as ditas células de microrganismos, em que as ditas células compreendem uma ou mais enzimas nuclease, produzindo assim uma mistura que compreende ácido nucleico solúvel, nuclease e proteína e que compreende detritos de parede celular insolúveis; b. separar o ácido nucleico solúvel, a nuclease e a proteína dos detritos da parede celular insolúveis em condições nas quais o ácido nucleico é hidrolisado com a nuclease, produzindo desse modo ácido nucleico hidrolisado; d. tornar a proteína insolúvel; e e. separar a proteína insolúvel dos materiais solúveis restantes que compreendem o ácido nucleico hidrolisado.
  63. 63. Método, de acordo com a reivindicação 62, caracterizado pelo fato de que a proteína insolúvel compreende menos de cerca
    Petição 870190073854, de 01/08/2019, pág. 30/34
    11/13 de 5% de ácido nucleico.
  64. 64. Método, de acordo com a reivindicação 62, caracterizado pelo fato de que a proteína insolúvel compreende menos de cerca de 3% de ácido nucleico.
  65. 65. Processo, de acordo com a reivindicação 57 ou 62, caracterizado pelo fato de que as células são rompidas por homogeneização.
  66. 66. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma reação de fixação de carbono e pelo menos uma via biossintética anabólica resultam na formação de bioprodutos que incluem pelo menos um dentre: aminoácidos; peptídeos; proteínas; lipídios; polissacarídeos; e/ou vitaminas.
  67. 67. Método, de acordo com a reivindicação 66, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma reação de fixação de carbono e a pelo menos uma via biossintética anabólica compreendem o ciclo de Calvin e uma via de biossíntese de aminoácidos.
  68. 68. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita biomassa e/ou moléculas orgânicas têm aplicação como pelo menos uma dentre: uma fonte de carbono e/ou de nitrogênio orgânico para fermentações; uma fonte de nutrientes para o cultivo de outros micróbios ou organismos; um prebiótico; uma fonte de nutrientes ou ingrediente alimentar para seres humanos; um alimento para animais; como matéria-prima ou intermediário químico para fabricação ou processos químicos; fontes de substâncias farmacêuticas, medicinais ou nutricionais; um fertilizante; aditivo do solo; um estabilizador de solo; adjuvante do solo; bioestimulante vegetal; e/ou um potenciador de crescimento de cogumelos.
  69. 69. Método, de acordo com a reivindicação 68, caracterizado pelo fato de que o dito fertilizante e/ou aditivo do solo; e/ou estabilizador do solo; e/ou adjuvante do solo; e/ou bioestimulante vegetal; e/ou potenciador de crescimento de cogumelos adiciona carbono e/ou nitrogênio ao solo, resultando em um aumento do teor de carbono e/ou nitrogênio do solo ao
    Petição 870190073854, de 01/08/2019, pág. 31/34
    12/13 qual é aplicado.
  70. 70. Método, de acordo com a reivindicação 68, caracterizado pelo fato de que a dita fonte de carbono é uma molécula C1 gasosa, em que o carbono adicionado ao solo representa carbono sequestrado, e o processo de ponta a ponta da fonte de carbono C1 gasoso ao carbono do solo representa um processo de sequestro de carbono.
  71. 71. Método, de acordo com a reivindicação 68, caracterizado pelo fato de que o dito fertilizante e/ou bioestimulante é aplicado a uma cultura que é cultivada hidroponicamente, aeroponicamente, aquaponicamente ou em um sistema de exploração vertical.
  72. 72. Método, de acordo com a reivindicação 68, caracterizado pelo fato de que o dito fertilizante e/ou bioestimulante é usado na fertirrigação.
  73. 73. Método, de acordo com a reivindicação 68, caracterizado pelo fato de que o dito fertilizante e/ou bioestimulante é aplicado a uma cultura que é cultivada em uma estufa, em um ambiente fechado e/ou com o uso de iluminação artificial.
  74. 74. Método para a obtenção de um extrato de enzima orgânica a partir da matéria-prima de C1 caracterizado pelo fato de que compreende o método, de acordo com a reivindicação 1, em que a dita fonte de carbono compreende apenas um átomo de carbono, em que o dito método compreende adicionalmente submeter as ditas células de microrganismos a um ou mais dentre: lise mecânica; lise enzimática; ajuste de pH; aumento ou diminuição de pressão; aumento ou diminuição de temperatura; campos elétricos ou eletromagnéticos; ultrassonografia; alteração de osmolaridade; e hidrólise enzimática, produzindo assim um extrato de enzima orgânica.
  75. 75. Potencializador de crescimento de cogumelos caracterizado pelo fato de que compreende a dita biomassa e/ou proteína produzidas no método, de acordo com a reivindicação 1.
  76. 76. Método para potencializar o crescimento de cogumelos
    Petição 870190073854, de 01/08/2019, pág. 32/34
    13/13 caracterizado pelo fato de que compreende combinar o dito potencializador de crescimento de cogumelos, de acordo com a reivindicação 75, com composto de cogumelos.
  77. 77. Composição de crescimento de cogumelos caracterizada pelo fato de que compreende a combinação do dito composto de cogumelos e do dito potencializador de crescimento de cogumelos, de acordo com a reivindicação 76.
  78. 78. Método para o cultivo de micróbios e outros organismos caracterizado pelo fato de que os ditos micróbios e organismos são cultivados no solo na dita fonte nutrientes, de acordo com a reivindicação 68.
  79. 79. Método, de acordo com a reivindicação 68, caracterizado pelo fato de que as ditas fermentações, com o uso das ditas fontes de carbono orgânico e/ou nitrogênio, produzem um ou mais bioprodutos que compreendem: uma enzima comercial; um antibiótico; um aminoácido; uma proteína; um bioestimulante vegetal; um potencializador de crescimento de cogumelos; um probiótico; um prebiótico; um biofertilizante; um alimento; um ingrediente alimentar; uma vitamina; um lipídio; um bioplástico; um polissacarídeo; um agente neutracêutico; e/ou um fármaco.
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