KR20190115005A - 표적화된 키메라 단백질 및 이의 용도 - Google Patents

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KR20190115005A
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니콜라이 클레이
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오리오니스 바이오사이언시스 엔브이
유니버시테이트 젠트
브이아이비 브이지더블유
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Abstract

본 발명은 부분적으로, SIRP1α를 인식하여 이에 결합하는 적어도 하나의 표적화 모이어티를 포함하는 키메라 단백질, 및 진단제 및 치료제로서의 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 키메라 단백질을 포함하는 약제학적 조성물 및 다양한 질환의 치료시 이의 용도에 관한 것이다.

Description

표적화된 키메라 단백질 및 이의 용도
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2017년 2월 6일자로 출원된 미국 가특허원 제62/454,993호의 이익 및 이에 대한 우선권을 청구하며, 이의 내용은 이의 전문이 본원에 참고로 포함된다.
분야
본 발명은 부분적으로 SIRP1α를 인식하여 이에 결합하는 적어도 하나의 표적화 모이어티(targeting moiety)를 포함하는 키메라 단백질(chimeric protein) 및 진단제 및 치료제로서 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 키메라 단백질을 포함하는 약제학적 조성물 및 암을 포함하는 다양한 질환의 치료시 이들의 용도에 관한 것이다.
서열 목록
본 출원은 EFS-Web을 통해 ASCII 형식으로 제출된 서열 목록을 함유하며 이의 전문은 본원에 참고로 포함된다. 2018년 1월 31일자로 생성된, 상기 ASCII 카피는 ORN-027PC-서열_Listing_ST25.txt로 명명되며 크기는 282,624 바이트이다.
배경
암은 세계적으로 매년 거의 7백만명의 사망을 유발하는 세계적인 건강 위해요소(challenge)이며, 지금까지 의약에서 주요 진전에도 불구하고 크게 치료불가능한 것으로 입증되었다. 실망스럽게도, 암은 면역 검출 및 파괴를 피하기 위한 전략을 개발함으로써 질환에 대한 신체의 주요 보호를 회피하는 전략을 발달시키는 것으로 여겨진다. 예를 들면, 암 세포가 대식구에 의한 식세포작용을 회피하는 하나의 메카니즘은 대식구에서 억제성 수용체에 관여하는 CD47, 즉, 신호 조절 단백질 α-1(SIRP1α)의 상향조절을 통한다. 구체적으로, 암 세포상의 CD47과 SIRP1α 사이의 상호작용은 암 세포의 식세포작용을 억제하는 "먹지 마시오(don't eat me)" 신호를 제공한다. Myc 종양유전자는 Myc의 활성을 촉진하는 강력한, 생체내 종양 성장에 연루되어온 면역 억제성 메카니즘인, 암 세포내에서 CD47의 발현을 유도한다.
세포 종양유전자의 Myc 계열의 활성화는 사람 암에서 가장 일반적인 종양 사건(oncogenic event) 중 하나이다. Myc 단백질 계열은 서열-특이적인 전사 인자로서 기능하는 것으로 여겨지는 3개의 고도로 관련된 핵 인단백질(c-Myc, N-Myc, 및 L-Myc)을 암호화한다. Myc 단백질은 성장, 증식, 세포자멸사(apoptosis), 물질대사, 분화, 자가-재생, 및 혈관형성을 포함하는 생물학적 공정에 중요한 다양한 유전자를 활성화시킨다. 암 세포내에서 고활성 Myc 단백질을 억제하기 위한 노력에도 불구하고, 이러한 종양유전자는 치료학적 표적화에 대해 현저히 내성인 상태로 남아있다. 또한, 증거는 활성 Myc 단백질이 다양한 암 약물에 대해 종양 내성을 촉진시킴을 시사하고 있다.
따라서, Myc-구동된 암을 포함하는, 암을 효과적으로 표적화할 수 있는 신규한 치료제에 대한 요구가 남아있다.
다양한 양태에서, 본 발명은 SIRP1α에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 표적화 모이어티를 갖는 키메라 단백질에 관한 것이다. 다양한 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 예를 들면, 목적한 부위에 대식구 세포를 직접 또는 간접적으로 모집하는데 있어서의 용도를 갖는다. 다양한 구현예에서, 키메라 단백질은 또한 신호전달제(signaling agent), 예컨대, 제한없이, 인터페론, 인터루킨, 및 종양 괴사 인자를 포함하며, 이는 변형되어 활성을 약화시킬 수 있다. 다양한 구현예에서, 키메라 단백질은 목적한 다른 표적(예컨대, 항원, 수용체)에 결합하는 추가의 표적화 모이어티를 포함한다. 일 구현예에서, 목적한 다른 표적(예컨대, 항원, 수용체)은 종양 세포 상에서 나타난다. 다른 구현예에서, 목적한 다른 표적(예컨대, 항원, 수용체)은 면역 세포 상에서 나타난다. 일부 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 면역 세포(예컨대, 대식구)를 작용 부위(예를 들면, 비-제한적인 예로서, 종양 미세환경)에 직접 또는 간접적으로 모집할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 대식구에 의해 표적 세포(예컨대, 종양 세포)의 식세포작용을 촉진시킨다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 다양한 질환 또는 장애, 예를 들면, 암, 감염, 면역 장애, 및 다른 질환 및 장애의 치료시 용도가 확인되어 있으며, 본 발명은 다양한 치료 방법을 포함한다.
도 1a 및 1b는 항-마우스 Sirp1α VHH를 사용한 결합 검정을 나타낸다. 도 1a에서, 항-쥐 SIRP1α VHH의 일련의 희석물을 쥐 SIRP1α를 발현하는 세포에서 FACS-기반한 mSIRPA 결합 검정에서 시험하였다. 형광성 강도의 기하 평균을 플롯팅하였다. 도 1b에서, 항-쥐 SIRP1α VHH의 일련의 희석물을 쥐 CD47-쥐 SIRPα 결합 검정에서 시험하였다. 3회 측정의 평균 -/+ 표준 편차를 플롯팅하였다.
도 2a 및 2b는 항-마우스 Sirp1α VHH/사람 IFN Q124R 키메라를 사용한 B16 생체내(in vivo) 연구를 나타낸다. 도 2a에서, 종양 성장을 PBS 대조군과 비교하였다. 항-마우스 Sirp1α VHH/사람 IFN Q124R 키메라는 하부 곡선이며 PBS는 상부 곡선이다. 도 2b에서, 도 2a의 종양 연구의 마우스에서 다양한 안전성 매개변수를 평가하였다: 백혈구 세포수("wbc"), 림프구 수("ly"), 호중구 수("ne"), 단핵구 수("mo"), 적혈구 수("rbc"), 헤모글로빈("hb"); 헤모그릿(hemocrit)("hct"), 혈소판("plt"), 및 평균 혈소판 용적("mpv"). 각각의 세트에서, 좌측 바아(bar)는 PBS이고 우측 바아는 항-마우스 Sirp1α VHH/사람 IFN Q124R이다.
도 3은 100 ng/ml 키메라로 자극되고(또는 자극되지 않고 남음) 포스포 STAT1에 대해 염색된 B16 세포를 나타낸다. 데이타는 평균 형광성 강도로서 플롯팅된다. 항-쥐 Sirp1α VHH/항-쥐 PD-L1 VHH/사람 IFN Q124R 및 변형된 사람 IFN 알파 Q124R(표적화되지 않은 IFNQ124R 대조군)에 대한 항-Bcll10 VHH의 일특이적인 융합체를 분석하였다.
상세한 설명
본 발명은 부분적으로 신호 조절 단백질 α-1(SIRP1α)을 특이적인 인식하여 이에 결합하는 표적화 모이어티를 갖는 표적화된 키메라 단백질의 발견을 기반으로 한다. 일부 구현예에서, 키메라 단백질은 다중특이적이며 하나 이상의 표적화 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 단백질은 또한 하나 이상의 수용체에 대해 감소된 친화성을 지닌 변형된 신호전달제(예컨대, 인터페론)를 포함한다. 다양한 구현예에서, 키메라 단백질은 치료학적 작용에 필요한 부위(예컨대, 종양 또는 종양 미세환경)에 면역 세포, 예를 들면, 대식구에 결합하여 이를 직접 또는 간접적으로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 키메라 단백질은 대식구에 의해 종양 세포의 식세포작용을 유도하고/하거나 향상시킨다. 본 발명의 키메라 단백질은 유리한 치료학적 특성 및 감소된 부작용을 나타낸다.
표적화된 키메라 단백질
다양한 구현예에서, 본 발명은 신호 조절 단백질 α-1(SIRP1α)을 특이적으로 인식하여 이에 결합하는 표적화 모이어티를 포함하는 표적화된 키메라 단백질에 관한 것이다. SIRP1α(또한 SIRPα로 공지됨)는 억제성(SIRPα), 활성화(SIRPβ), 비신호전달(SIRPγ) 및 가용성(SIRPδ) 구성원을 포함하는 세포 면역 수용체의 계열에 속한다. SIRP1α는 대식구, 과립구, 골수성 수지 세포(DC), 비만 세포, 및 이들의 전구체, 예를 들면, 조혈 줄기 세포를 포함하는, 골수 세포 상에서 주로 발현된다. SIRP1α는 광범위하게 발현된 막횡단 당단백질(transmembrane glycoprotein) CD47과 상호작용하여 식세포작용을 조절하는 억제성 수용체로서 작용한다. 특히, 표적 세포 상에서 발현된 CD47에 의한 대식구 상의 SIRP1α의 결합은 표적 세포의 식세포작용을 부정적으로 조절하는 억제성 신호를 생성한다.
다양한 구현예에서, 본 발명은 대식구에서 SIRP1α를 구체적으로 인식하여 이에 결합하는 표적화 모이어티를 포함하는 표적화된 키메라 단백질에 관한 것이다.
다양한 구현예에서, 본 발명은 단핵구에서 SIRP1α를 특이적으로 인식하여 이에 결합하는 표적화 모이어티를 포함하는 표적화된 키메라 단백질에 관한 것이다.
다양한 구현예에서, 본 발명은 TMA(종양 관련 대식구)에서 SIRP1α을 특이적으로 인식하여 이에 결합하는 표적화 모이어티를 포함하는 표적화된 키메라 단백질에 관한 것이다.
다양한 구현예에서, 본 발명은 cDC2 및 pDC를 포함하나 이에 한정되지 않는, 수지 세포상에서 SIRP1α를 특이적으로 인식하여 이에 결합하는 표적화 모이어티를 포함하는 표적화된 키메라 단백질에 관한 것이다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 SIRP1α를 인식하는 인식 도메인(recognition domain)을 갖는 표적화 모이어티를 포함한다. 일 구현예에서, 인식 도메인은 SIRP1α 상에 존재하는 하나 이상의 선형 에피토프를 인식한다. 본원에 사용된 바와 같은, 선형 에피토프는 SIRP1α 상에 존재하는 아미노산의 임의의 연속 서열을 지칭한다. 다른 구현예에서, 인식 도메인은 SIRP1α 상에 존재하는 하나 이상의 구조적 에피토프를 인식한다. 본원에 사용된 바와 같은, 구조 에피토프는 항원 인식 도메인에 의해 인식될 수 있는 특징 및/또는 형상 및/또는 3차 구조를 지닌 3차원 표면을 형성하는 아미노산(이는 비연속일 수 있다)의 하나 이상의 단면을 지칭한다.
일부 구현예에서, 키메라 단백질은 SIRP1α의 완전한 길이 및/또는 성숙한 형태 및/또는 동형 및/또는 스플라이스 변이체 및/또는 단편 및/또는 다른 천연적으로 발생하거나 합성인 유사체, 변이체, 또는 돌연변이체에 결합할 수 있는 표적화 모이어티를 포함한다. 일 구현예에서, SIRP1α는 사람 SIRP1α이다. 다양한 구현예에서, 키메라 단백질은 단량체성, 이량체성, 이종이량체성, 다량체성 및 관련 형태를 포함하는, 사람 SIRP1α의 임의의 형태에 결합할 수 있는 표적화 모이어티를 포함한다. 일 구현예에서, 표적화 모이어티는 SIRP1α의 단량체성 형태에 결합한다. 다른 구현예에서, 표적화 모이어티는 SIRP1α의 이량체 형태에 결합한다.
일 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 사람 SIRP1α 상에 존재하는 하나 이상의 에피토프(epitope)를 인식하는 인식 도메인을 지닌 표적화 모이어티를 포함한다. 일 구현예에서, 표적화 모이어티는 신호 펩타이드 서열을 지닌 사람 SIRP1α을 인식하는 인식 도메인을 포함한다. 신호 펩타이드 서열(밑줄쳐짐)을 지닌 예시적인 사람 SIRP1α 폴리펩타이드는 하기에 제공된다:
Figure pct00001
일 구현예에서, 표적화 모이어티는 신호 펩타이드 서열없이 사람 SIRP1α를 인식하는 인식 도메인을 포함한다. 신호 펩타이드 서열이 없는 예시적인 사람 SIRP1α 폴리펩타이드는 하기에 제공된다:
Figure pct00002
일 구현예에서, 표적화 모이어티는 사람 SIRP1α 동형 2를 암호화하는 폴리펩타이드를 인식하는 인식 도메인을 포함한다:
Figure pct00003
일 구현예에서, 표적화 모이어티는 사람 SIRP1α 동형 4를 암호화하는 폴리펩타이드를 인식하는 인식 도메인을 포함한다:
Figure pct00004
다양한 구현예에서, 본 발명의 표적화 모이어티는 이의 항체 또는 유도체와 같이, 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 단백질-기반 제제일 수 있다. 일 구현예에서, 표적화 모이어티는 항체를 포함한다. 다양한 구현예에서, 항체는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 완전한 길이의 다량체성 단백질이다. 각각의 중쇄는 하나의 가변 영역(예컨대, VH) 및 적어도 3개의 불변 영역(예컨대, CH1, CH2 및 CH3)을 포함하며, 각각의 경쇄는 하나의 가변 영역(VL) 및 하나의 불변 영역(CL)을 포함한다. 가변 영역은 항체의 특이성을 결정한다. 각각의 가변 영역은 4개의 상대적으로 보존된 골격 영역(FR)에 의해 플랭킹된(flanked) 상보성 결정 영역(CDR)으로 또한 공지된 3개의 초가변 영역을 포함한다. CDR1, CDR2, 및 CDR3로 지칭된 3개의 CDR은 항체 결합 특이성에 기여한다. 일부 구현예에서, 항체는 키메라 항체이다. 일부 구현예에서, 항체는 사람화된 항체이다.
일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 항체 유도체 또는 양식을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질의 표적화 모이어티는 미국 특허 또는 특허 공보 제US 7,417,130호, 제US 2004/132094호, 제US 5,831,012호, 제US 2004/023334호, 제US 7,250,297호, 제US 6,818,418호, 제US 2004/209243호, 제US 7,838,629호, 제US 7,186,524호, 제US 6,004,746호, 제US 5,475,096호, 제US 2004/146938호, 제US 2004/157209호, 제US 6,994,982호, 제US 6,794,144호, 제US 2010/239633호, 제US 7,803,907호, 제US 2010/119446호, 및/또는 제US 7,166,697호에 기술된 바와 같이, 단일-도메인 항체, 재조합 중쇄 만의 항체(heavy-chain-only antibody: VHH), 단일 쇄 항체(single-chain antibody: scFv), 상어 중쇄만의 항체(shark heavy-chain-only antibody: VNAR), 미세단백질(시스테인 노트 단백질(cysteine knot protein), 노틴(knottin)), 다르핀(DARPin); 테트라넥틴; 아피보디(Affibody); 트랜스보디(Transbody); 안티칼린; 아드넥틴(AdNectin); 아필린(Affilin); 마이크로보디(Microbody); 펩타이드 앱타머(peptide aptamer); 알테라제; 가소성 항체; 필로머(phylomer); 스트라도보디(stradobody); 막시보디(maxibody); 에비보디(evibody); 피노머(fynomer), 아르마딜로 반복 단백질(armadillo repeat protein), 쿠니츠 도메인(Kunitz domain), 아비머(avimer), 아트리머(atrimer), 프로보디, 임뮤노보디, 트리오맵(triomab), 트로이보디(troybody); 펩보디(pepbody); 박시보디(vaccibody), 유니보디(UniBody); 아피머(Affimer), 두오보디(DuoBody), Fv, Fab, Fab', F(ab')2, 펩타이드 모사체 분자(peptide mimetic molecule), 또는 합성 분자이며 이들의 내용은 이들의 전문이 본원에 참고로 포함된다. 또한 Storz MAbs. 2011 May-Jun; 3(3): 310-317을 참고한다.
일 구현예에서, 표적화 모이어티는 예를 들면, VHH 항체를 생산하는 유기체, 예를 들면, 낙타, 상어로부터의 VHH, 또는 설계된 VHH와 같은 단일-도메인 항체를 포함한다. VHH는 천연적으로 발생하는 중쇄 항체의 독특한 구조적 및 기능적 특성을 함유하는 항체-유래된 치료학적 단백질이다. VHH 기술은 경쇄를 결여하는 낙타로부터의 완전한 기능성 항체를 기반으로 한다. 이러한 중쇄 항체는 단일 가변 도메인(VHH) 및 2개의 불변 도메인(CH2 및 CH3)을 함유한다. VHH는 나노바디(NANOBODY) 또는 나노바디즈(NANOBODIES)의 상표명 하에 상업적으로 이용가능하다.
일 구현예에서, 표적화 모이어티는 VHH를 포함한다. 일부 구현예에서, VHH는 사람화된 VHH 또는 낙타화된 VHH이다.
일부 구현예에서, VHH는 완전한 사람 VH 도메인, 예컨대, HUMABODY(Crescendo Biologics, 영국 캠브릿지 소재)을 포함한다. 일부 구현예에서, 완전한 사람 VH 도메인, 예컨대, HUMABODY는 1가, 2가, 또는 3가이다. 일부 구현예에서, 완전한 사람 VH 도메인, 예컨대, HUMABODY는 일- 또는 다중 특이적, 예를 들면, 일특이적, 이특이적, 또는 삼특이적이다. 예시적인 완전한 사람 VH 도메인, 예컨대, HUMABODIES는 예를 들면, 제WO 2016/113555호 및 제WO2016/113557호에 기술되어 있으며, 이의 전체 개시내용은 참고로 포함된다.
예를 들면, 일부 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 하나 이상의 항체, 항체 유도체 또는 양식, 펩타이드 또는 폴리펩타이드, VHH, 또는 SIRP1α에 특이적으로 결합하는 융합 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 단백질은 SIRP1α에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 유도체인 표적화 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 단백질은 SIRP1α에 특이적으로 결합하는 낙타 중쇄 항체(VHH)인 표적화 모이어티를 포함한다.
일부 구현예에서, 키메라 단백질은 4개의 "골격 영역" 또는 FR 및 3개의 "상보성 결정 영역" 또는 CDR을 갖는 단일 아미노산 쇄를 포함하는 VHH인 표적화 모이어티를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은, "골격 영역" 또는 "FR"은 CDR 사이에 위치한 가변 도메인내 영역을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은, "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"은 항원성 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 아미노산 서열을 함유하는 VHH내 가변 영역을 지칭한다. 다양한 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 적어도 하나의 CDR1, CDR2, 및/또는 CDR3 서열을 포함하는 가변 도메인을 갖는 VHH를 포함한다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 표적화 모이어티는 SIRP1α을 인식하여 이에 결합하는 것으로 알려진 중쇄, 경쇄, 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역, 상보성 결정 영역(CDR), 및 골격 영역 서열의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
다양한 구현예에서, 본 기술은 본원에 기술된 SIRP1α 표적화 모이어티의 임의의 천연 또는 합성 유사체, 돌연변이체, 변이체, 대립형질, 동족체 및 상동기관(ortholog)(본원에서 종합적으로 "유사체"로서 지칭한다)의 용도를 고려한다. 다양한 구현예에서, SIRP1α 표적화 모이어티의 아미노산 서열은 또한 아미노산 유사체, 아미노산 유도체, 또는 다른 비-전통적인 아미노산을 포함한다.
다양한 구현예에서, 키메라 단백질은 본원에 개시된 서열 중 임의의 하나에 대해 적어도 60% 동일한 서열을 포함하는 표적화 모이어티를 포함한다. 예를 들면, 키메라 단백질은 본원에 개시된 서열 중 어느 것에 대해 적어도 약 60%, 적어도 약 61%, 적어도 약 62%, 적어도 약 63%, 적어도 약 64%, 적어도 약 65%, 적어도 약 66%, 적어도 약 67%, 적어도 약 68%, 적어도 약 69%, 적어도 약 70%, 적어도 약 71%, 적어도 약 72%, 적어도 약 73%, 적어도 약 74%, 적어도 약 75%, 적어도 약 76%, 적어도 약 77%, 적어도 약 78%, 적어도 약 79%, 적어도 약 80%, 적어도 약 81%, 적어도 약 82%, 적어도 약 83%, 적어도 약 84%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 동일한(예컨대, 본원에 개시된 서열 중 어느 하나에 대해 약 60%, 또는 약 61%, 또는 약 62%, 또는 약 63%, 또는 약 64%, 또는 약 65%, 또는 약 66%, 또는 약 67%, 또는 약 68%, 또는 약 69%, 또는 약 70%, 또는 약 71%, 또는 약 72%, 또는 약 73%, 또는 약 74%, 또는 약 75%, 또는 약 76%, 또는 약 77%, 또는 약 78%, 또는 약 79%, 또는 약 80%, 또는 약 81%, 또는 약 82%, 또는 약 83%, 또는 약 84%, 또는 약 85%, 또는 약 86%, 또는 약 87%, 또는 약 88%, 또는 약 89%, 또는 약 90%, 또는 약 91%, 또는 약 92%, 또는 약 93%, 또는 약 94%, 또는 약 95%, 또는 약 96%, 또는 약 97%, 또는 약 98%, 약 99% 또는 약 100% 서열 동일성) 서열을 포함하는 표적화 모이어티를 포함할 수 있다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 SIRP1α를 인식하여 이에 결합하는 것으로 알려진 임의의 표적화 모이어티 서열과 관련하여 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 표적화 모이어티를 포함한다. 다양한 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 SIRP1α를 인식하여 이에 결합하는 것으로 알려진 임의의 표적화 모이어티 서열과 관련하여 1개, 또는 2개, 또는 3개, 또는 4개, 또는 5개, 또는 6개, 또는 7개, 또는 8개, 또는 9개, 또는 10개, 또는 15개, 20개, 30개, 40개, 또는 50개 아미노산 돌연변이를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 표적화 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 돌연변이는 치환, 삽입, 결실, 및 트렁케이션(truncation)으로부터 독립적으로 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환이며, 보존성 및/또는 비-보존성 치환을 포함할 수 있다.
"보존적 치환"은 예를 들면, 관련된 아미노산 잔기의 극성, 전하, 크기, 용해도, 소수성, 친수성, 및/또는 양극성 특성에서의 유사성을 기반으로 이룰 수 있다. 20개의 천연적으로 발생하는 아미노산은 다음의 6개의 표준 아미노산 그룹으로 그룹화될 수 있다:(1) 소수성: Met, Ala, Val, Leu, Ile;(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr; Asn, Gln;(3) 산성: Asp, Glu;(4) 염기성: His, Lys, Arg;(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro; 및(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
본원에 사용된 바와 같은, "보존적 치환"은 상기 나타낸 6개의 표준 아미노산 그룹의 동일한 그룹 내에 나열된 또 다른 아미노산에 의한 아미노산의 교환으로 정의된다. 예를 들면, Asp의 Glu에 의한 교환은 이러하게 변형된 폴리펩타이드내 하나의 음성 전하를 보유한다. 또한, 글리신 및 프롤린은 α-나선을 방해하는 이들의 능력을 기반으로 서로에 대해 치환될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, "비-보존적 치환"은 상기 나타낸 6개의 표준 아미노산 그룹(1) 내지(6)의 상이한 그룹내에 나열된 다른 아미노산에 의한 아미노산의 교환으로 정의된다.
다양한 구현예에서, 치환은 또한 비-전통적인 아미노산을 포함할 수 있다. 예시적인 비-전통적인 아미노산은 셀레노시스테인, 피롤라이신, N-포르밀메티오닌 β-알라닌, GABA 및 δ-아미노레불린산, 4-아미노벤조산(PABA), 일반적인 아미노산의 D-이성체, 2,4-디아미노부티르산, α-아미노 이소부티르산, 4-아미노부티르산, Abu, 2-아미노 부티르산, γ-Abu, ε-Ahx, 6-아미노 헥사노산, Aib, 2-아미노 이소부티르산, 3-아미노 프로피온산, 오르니틴, 노를루이신, 노르발린, 하이드록시프롤린, 사르코신, 시트룰린, 호모시트룰린, 시스테산(cysteic acid), t-부틸글리신, t-부틸알라닌, 페닐글리신, 사이클로헥실알라닌, β-알라닌, 플루오로-아미노산, 디자이너(designer) 아미노산, 예를 들면, β 메틸 아미노산, Cα-메틸 아미노산, N α-메틸 아미노산, 및 아미노산 유사체를 일반적으로 포함하지만 이에 제한되지 않을 수 있다.
다양한 구현예에서, 아미노산 돌연변이는 표적화 모이어티의 CDR(예컨대, CDR1, CDR2 또는 CDR3 영역) 내에 존재할 수 있다. 다른 구현예에서, 아미노산 변경은 표적화 모이어티의 골격 영역(FR)(예컨대, FR1, FR2, FR3, 또는 FR4 영역)에 존재할 수 있다.
아미노산 서열의 변형은 당해 분야에서 임의의 공지된 기술, 예컨대, 부위-지시된 돌연변이유발 또는 PCR 기반한 돌연변이유발을 사용하여 달성할 수 있다. 이러한 기술은 예를 들면, 문헌: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y., 1989 및 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y., 1989에 기술되어 있다.
다양한 구현예에서, 돌연변이는 SIRP1α를 특이적으로 인식하여 이에 결합하는 본 발명의 키메라 단백질의 능력을 실질적으로 감소시킨다. 다양한 구현예에서, 돌연변이는 SIRP1α에 특이적으로 결합하며 SIRP1α를 기능적으로 조절(예컨대, 부분적으로 또는 완전히 중화)하지 않는 본 키메라 단백질의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는다.
다양한 구현예에서, SIRP1α의 완전한 길이 및/또는 성숙한 형태 및/또는 동형(isoform) 및/또는 스플라이스 변이체 및/또는 단편 및/또는 단량체성 및/또는 이량체성 형태 및/또는 임의의 다른 천연적으로 발생하는 또한 합성 유사체, 변이체, 또는 돌연변이체에 대한 본 키메라 단백질의 결합 친화성은 평형 해리 상수(KD)로 기술될 수 있다. 다양한 구현예에서, 본 키메라 단백질은 SIRP1α의 완전한 길이 및/또는 성숙한 형태 및/또는 동형(isoform) 및/또는 스플라이스 변이체 및/또는 단편 및/또는 임의의 다른 천연적으로 발생하는 또는 합성 유사체, 변이체, 또는 돌연변이체에 약 1 uM 미만, 약 900 nM, 약 800 nM, 약 700 nM, 약 600 nM, 약 500 nM, 약 400 nM, 약 300 nM, 약 200 nM, 약 100 nM, 약 90 nM, 약 80 nM, 약 70 nM, 약 60 nM, 약 50 nM, 약 40 nM, 약 30 nM, 약 20 nM, 약 10 nM, 또는 약 5 nM, 또는 약 1 nM의 KD로 결합하는 표적화 모이어티를 포함한다.
다양한 구현예에서, 본 키메라 단백질은 목적한 항원에 결합하지만 이를 기능적으로 조절하지 않는 표적화 모이어티, 즉, SIRP1α를 포함한다. 예를 들면, 다양한 구현예에서, 키메라 단백질의 표적화 모이어티는 항원을 단순히 표적화하지만 항원이 가진 생물학적 효과를 실질적으로 기능적으로 조절(예컨대, 실질적으로 억제, 감소 또는 중화)하지 않는다. 다양한 구현예에서, 본 키메라 단백질의 표적화 모이어티는 이의 생물학적 활성에 대해 중요한 항원 부위(예컨대, 항원의 활성 부위)로부터 물리적으로 분리되는 에피토프에 결합한다.
다른 구현예에서, 본 키메라 단백질은 목적한 항원에 결합하지만 이를 기능적으로 조절하는 표적화 모이어티, 즉, SIRP1α를 포함한다. 예를 들면, 다양한 구현예에서, 키메라 단백질의 표적화 모이어티는 항원, 즉, SIRP1α를 표적화하며, 항원이 가진 생물학적 효과를 기능적으로 조절(예컨대, 억제, 감소 또는 중화)한다. 기능성 조절과 함께 이러한 결합은 본 키메라 단백질이 효과기 항원을 통해 필요한 부위에 활성 면역 세포를 직접 또는 간접적으로 모집하는데 사용되는 방법을 포함하는 본 발명의 다양한 구현예에서의 용도를 찾을 수 있다.
예를 들면, 다양한 구현예에서, 본 키메라 단백질은 종양을 감소시키거나 제거하는 방법에서 종양 세포에 SIRP1α를 통해 대식구를 직접 또는 간접적으로 모집하는데 사용될 수 있다(예컨대, 본 키메라 단백질은 항-SIRP1α 항원 인식 도메인을 갖는 표적화 모이어티 및 종양 항원 또는 수용체에 대해 지시된 인식 도메인(예컨대, 항원 인식 도메인)을 갖는 표적화 모이어티를 포함할 수 있다). 증거는 종양 세포가 SIRP1α에 관여하는 CD47을 흔히 상향조절함으로써 식세포작용을 피함을 나타낸다. 따라서, 다양한 구현예에서, 종양 세포에 대식구를 직접 또는 간접적으로 모집하고 SIRP1α의 억제 활성을 기능적으로 억제, 감소 또는 중화시킴으로써 대식구에 의한 종양 세포의 식세포작용을 생성시키는 것이 바람직할 수 있다. 다양한 구현예에서, 본 키메라 단백질은 대식구에 의한 종양 세포 또는 임의의 다른 바람직하지 않은 세포의 식세포작용을 향상시킨다.
본 키메라 단백질을 포함하는 치료제
신호전달제와의 키메라 및 융합
다양한 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 하나 이상의 신호전달제와의 키메라 또는 융합물의 일부이다. 따라서, 본 발명은 예를 들면, SIRP1α에 대한 표적화 모이어티 및 하나 이상의 신호전달제를 포함하는 키메라 또는 융합 단백질을 제공한다.
다양한 구현예에서, 신호전달제는 이의 수용체 중 하나 이상에 대해 감소된 친화성 또는 활성을 가지도록 변형되며, 이는 키메라 또는 융합 단백질의 활성(효능 작용 또는 길항작용 포함)의 약화를 허용하고/하거나 키메라 또는 융합 단백질의 비-특이적인 신호전달 또는 바람직하지 않는 격리(sequestration)을 방지한다. 다양한 구현예에서, 신호전달제는 이의 야생형 형태에서 길항성이며 이의 길항 활성을 약화시키는 하나 이상의 돌연변이를 지닌다. 다양한 구현예에서, 신호전달제는 하나 이상의 돌연변이로 인하여 길항성인데, 예컨대, 효능성 신호전달제는 길항성 신호전달제로 전환되며, 이러한 전환된 신호전달제는 임의로, 또한 이의 길항 활성을 약화시키는 하나 이상의 돌연변이를 지닌다(예컨대, 제WO 2015/007520호에 기술된 바와 같음, 이의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다).
따라서, 다양한 구현예에서, 신호전달제는 하나 이상의 돌연변이를 갖는 신호전달제의 변형된(예컨대, 돌연변이체) 형태이다. 다양한 구현예에서, 변형(예컨대, 돌연변이)은 변형된 신호전달제가 신호전달제의 변형되지 않거나 돌연변이되지 않은, 즉, 야생형 형태에 비해(예컨대, 야생형 형태 대 변형되거나 돌연변이 형태에서 동일한 신호전달제를 비교하여) 약화된 활성 중 하나 이상, 예를 들면, 감소된 결합 친화성, 감소된 내인 활성, 및 감소된 특이적인 생물활성 중 하나 이상을 가지도록 한다. 일부 구현예에서, 결합 또는 친화성을 약화시키거나 감소시키는 돌연변이는 결합 또는 활성을 실질적으로 감소시키거나 제거하는 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 결합 또는 친화성을 약화시키거나 감소시키는 돌연변이는 결합 또는 활성을 실질적으로 감소시키거나 제거하는 돌연변이의 것과는 상이하다. 결과적으로, 다양한 구현예에서, 돌연변이는 신호전달제가 돌연변이되지 않은, 즉, 야생형 신호전달제에 비해(예컨대, 야생형 형태 대 변형된(예컨대, 돌연변이체) 형태에서 동일한 신호전달제를 비교하여) 개선된 안정성, 예컨대, 감소된 전신 독성, 감소된 부작용, 및 감소된 오프-표적 효과(off-target effect)를 갖도록 한다.
본원에 기술된 바와 같이, 제제는 하나 이상의 변형, 예컨대, 돌연변이로 인하여 증진된 안전성을 가질 수 있다. 다양한 구현예에서, 증진된 안정성은 본 키메라 단백질이 보다 낮은 독성(예컨대, 전신계 독성 및/또는 조직/기관-관련 독성); 및/또는 적어지거나 실질적으로 제거된 부작용; 및/또는 증가된 내성, 적어지거나 실질적으로 제거된 부작용; 및/또는 감소되거나 실질적으로 제거된 오프-표적 효과; 및/또는 증가된 치료학적 창(therapeutic window)을 제공함을 의미한다.
다양한 구현예에서, 신호전달제는 이의 수용체 중 하나 이상에 대해 이의 결합 친화성 또는 활성을 감소시키는 하나 이상의 돌연변이를 갖도록 변형된다. 일부 구현예에서, 신호전달제는 변형되어 수용체에 대해 결합 친화성 또는 활성을 실질적으로 감소시키거나 제거하는 하나 이상의 돌연변이를 갖도록 변형된다. 일부 구현예에서, 야생형 신호전달제에 의해 제공된 활성은 수용체에서 효능작용(예컨대, 치료요법의 부위에서 세포 효과의 활성화)이다. 예를 들면, 야생형 신호전달제는 이의 수용체를 활성화시킬 수 있다. 이러한 구현예에서, 돌연변이는 수용체에서 감소되거나 제거된 활성화 활성을 가지도록 변형된 신호전달제를 생성할 수 있다. 예를 들면, 돌연변이는 변형된 신호전달제를 생성하여 감소된 활성화 신호를 표적 세포에 전달할 수 있거나 활성화 신호를 제거할 수 있다. 일부 구현예에서, 야생형 신호전달제에 의해 제공된 활성은 수용체에서 길항작용(예컨대, 치료요법 부위에서 세포 효과의 차단 또는 약화(dampening))이다. 예를 들면, 야생형 신호전달제는 수용체를 길항하거나 억제할 수 있다. 이러한 구현예에서, 돌연변이는 변형된 신호전달제를 생성함으로써 수용체에서 감소되거나 제거된 길항 활성을 갖는다. 예를 들면, 돌연변이는 변형된 신호전달제를 생성함으로써 감소된 억제 신호를 표적 세포로 전달할 수 있거나 억제 신호를 제거할 수 있다. 다양한 구현예에서, 신호전달제는 하나 이상의 돌연변이로 인하여 길항성인데, 예컨대, 효능성 신호전달제는 길항성 신호전달제(예컨대, 이의 전문이 본원에 참고로 포함된, 제WO 2015/007520호에 기술된 바와 같이)로 전환되며, 이러한 전환된 신호전달제는, 임의로, 또한 하나 이상의 이의 수용체에 대한 이의 결합 친화성 또는 활성을 감소시키거나 하나 이상의 이의 수용체에 대한 결합 친화성 또는 활성을 실질적으로 감소시키거나 제거하는 하나 이상의 돌연변이를 지닌다.
일부 구현예에서, 수용체에서 감소된 친화성 또는 활성은 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 표적화 모이어티(예컨대, SIRP1α에 대한 표적화 모이어티 또는 본원에 기술된 임의의 다른 표적화 모이어티)와의 부착에 의해 회복될 수 있다. 다른 구현예에서, 수용체에서 감소된 친화성 또는 활성은 하나 이상의 표적화 모이어티의 활성에 의해 실질적으로 회복될 수 없다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 이들의 신호전달제가 수용체에서 결합 친화성 또는 활성을 약화시키거나 제거하는 돌연변이를 가지므로 오프-표적 효과를 감소시킨다. 다양한 구현예에서, 부작용에 있어서 이러한 감소는 예를 들면, 야생형 신호전달제에 비해 관찰된다. 다양한 구현예에서, 신호전달제는 표적화 모이어티(들)이 실질적인 활성화에 요구되는 잃어버린/불충분한 결합(예컨대, 제한 및/또는 결합활성(avidity)이 없는)을 보완하므로, 표적 세포에서 활성이다. 다양한 구현예에서, 변형된 신호전달제는 치료학적 활성 부위에서 도중에(en route) 실질적으로 불활성이며 바람직하지 않은 부작용을 크게 감소시키는 특이적으로 표적화된 세포형에서 실질적으로 이의 효과를 갖는다.
일부 구현예에서, 신호전달제는 하나의 수용체(즉, 치료학적 수용체)에 대한 결합 또는 친화성을 약화시키거나 감소시키는 하나 이상의 돌연변이 및 제2 수용체에서 결합 또는 활성을 실질적으로 감소시키거나 제거하는 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 이러한 구현예에서, 이러한 돌연변이는 동일한 또는 상이한 위치에 존재할 수 있다(즉, 동일한 돌연변이 또는 다중 돌연변이). 일부 구현예에서, 하나의 수용체에서 결합 및/또는 활성을 감소시키는 돌연변이(들)은 다른 수용체에서 실질적으로 감소시키거나 제거하는 돌연변이(들)과는 상이하다. 일부 구현예에서, 하나의 수용체에서 결합 및/또는 활성을 감소시키는 돌연변이(들)은 다른 수용체에서 실질적으로 감소시키거나 제거하는 돌연변이(들)와 동일하다. 일부 구현예에서, 본 키메라 단백질은 치료학적 수용체에서 결합 및/또는 활성을 약화시켜 보다 조절된, 온-표적 치료학적 효과(on-target therapeutic effect)(예컨대, 야생형 신호전달제에 비해)를 허용하는 돌연변이 및 다른 수용체에서 결합 및/또는 활성을 실질적으로 감소시키거나 제거하여 부작용을 감소시키는(예컨대, 야생형 신호전달제에 비해) 돌연변이 둘 다를 갖는 변형된 신호전달제를 갖는다.
일부 구현예에서, 결합 또는 활성의 실질적인 감소 또는 제거는 표적화 모이어티(예컨대, SIRP1α에 대한 표적화 모이어티 또는 본원에 기술된 임의의 다른 표적화 모이어티)로 실질적으로 회복될 수 없다. 일부 구현예에서, 결합 또는 활성의 실질적인 감소 또는 제거는 표적화 모이어티로 회복될 수 있다. 다양한 구현예에서, 제2의 수용체에서 실질적으로 감소하거나 제거되는 결합 또는 활성은 또한 다른 수용체에 의해 매개되는 유해한 효과를 방지할 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 다른 수용체에서의 결합 또는 활성의 실질적인 감소 또는 제거는 치료 작용 부위로부터 치료학적 키메라 단백질의 감소되거나 제거된 격리가 존재하므로 치료학적 효과를 증진시킨다. 예를 들면, 일부 구현예에서, 이는 다른 수용체에서 손실에 대해 보완하는 본 키메라 단백질의 고 용량의 필요성을 배제한다. 용량을 감소시키는 이러한 능력은 또한 부작용의 보다 낮은 가능성을 제공한다.
다양한 구현예에서, 변형된 신호전달제는 신호전달제가 하나 이상의 이의 수용체에 대해, 감소된, 실질적으로 감소된, 또는 제거된 친화성, 예컨대, 결합(예컨대, KD) 및/또는 활성화(예를 들면, 변형된 신호전달제가 예를 들면, KA 및/또는 EC50으로서 측정가능한, 이의 수용체의 효능제인 경우) 및/또는 억제(예를 들면, 변형된 신호전달제가 예를 들면, KI 및/또는 IC50으로서 측정가능한, 이의 수용체의 길항제인 경우)를 갖도록 하는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 다양한 구현예에서, 신호전달제의 수용체에서 감소된 친화성은 활성(효능작용 또는 길항작용 포함)의 약화를 허용한다. 이러한 구현예에서, 변형된 신호전달제는 야생형 신호전달제에 비해 수용체에 대해 약 1%, 또는 약 3%, 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 10% 내지 20%, 약 20% 내지 40%, 약 50%, 약 40% 내지 60%, 약 60% 내지 80%, 약 80% 내지 100%의 친화성을 갖는다. 일부 구현예에서, 결합 친화성은 야생형 신호전달제에 비해 적어도 약 2배 더 낮거나, 약 3배 더 낮거나, 약 4배 더 낮거나, 약 5배 더 낮거나, 약 6배 더 낮거나, 약 7배 더 낮거나, 약 8배 더 낮거나, 약 9배 더 낮거나, 적어도 약 10배 더 낮거나, 적어도 약 15배 더 낮거나, 적어도 약 20배 더 낮거나, 적어도 약 25배 더 낮거나, 적어도 약 30배 더 낮거나, 적어도 약 35배 더 낮거나, 적어도 약 40배 더 낮거나, 적어도 약 45배 더 낮거나, 적어도 약 50배 더 낮거나, 적어도 약 100배 더 낮거나, 적어도 약 150배 더 낮거나, 또는 약 10 내지 50배 더 낮거나, 약 50 내지 100배 더 낮거나, 약 100 내지 150배 더 낮거나, 약 150 내지 200배 더 낮거나, 200배 더 낮다.
키메라 단백질이 하나의 수용체에서 결합을 감소시키고 제2의 수용체에서 결합을 실질적으로 감소시키거나 제거하는 돌연변이를 갖는 변형된 신호전달제를 포함하는 구현예에서, 하나의 수용체에 대한 변형된 신호전달제의 결합 친화성에 있어서의 약화 또는 감소는 다른 수용체에 대한 친화성에 있어서의 실질적인 감소 또는 제거 미만이다. 일부 구현예에서, 하나의 수용체에 대한 변형된 신호전달제의 결합 친화성에 있어서 약화 또는 감소는 다른 수용체에 대한 친화성에 있어서의 실질적인 감소 또는 제거보다 약 1%, 또는 약 3%, 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 또는 약 95% 미만이다. 다양한 구현예에서, 실질적인 감소 또는 제거는 약화 또는 감소보다 결합 친화성 및/또는 활성에 있어서의 보다 큰 감소를 지칭한다.
다양한 구현예에서, 변형된 신호전달제는 예컨대, 야생형 신호전달제와 비교하여, 신호전달제의 내인성 활성을 약 75%, 또는 약 70%, 또는 약 60%, 또는 약 50%, 또는 약 40%, 또는 약 30%, 또는 약 25%, 또는 약 20%, 또는 약 10%, 또는 약 5%, 또는 약 3%, 또는 약 1%까지 감소시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 변형된 신호전달제는 신호전달제가 이의(이들의) 수용체(들)에 대해 표적화 모이어티(들)의 결합 친화성보다 더 낮은 이의 수용체에 대해 감소된 친화성을 갖도록 하는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 결합 친화성 차이는 동일한 세포 상의 신호전달제/수용체와 표적화 모이어티/수용체 사이에 존재한다. 일부 구현예에서, 이러한 결합 친화성 차이는 신호전달제, 예컨대, 돌연변이된 신호전달제가 국재화된 온-표적 효과를 가지고 야생형 신호전달제로 관찰되는 부작용을 기반으로 하는 오프-표적 효과를 최소화시킨다. 일부 구현예에서, 이러한 결합 친화성은 적어도 약 2배, 또는 적어도 약 5배, 또는 적어도 약 10배, 또는 적어도 약 15배 더 낮거나, 또는 적어도 약 25배, 또는 적어도 약 50배 더 낮거나, 또는 적어도 약 100배, 또는 적어도 약 150배이다.
수용체 결합 활성은 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 측정할 수 있다. 예를 들면, 친화성 및/또는 결합 활성은 Brecht et al.(1993)에 기술된 바와 같이, 결합 데이타의 스캐차드 플롯 분석(Scatchard plot analysis) 및 컴퓨터-핏팅(computer-fitting)(예컨대, Scatchard, 1949)에 의해 또는 유동 통과 조건 하에서 반사율계의 간섭 분광법(reflectometric interference spectroscopy)에 의해 평가할 수 있으며, 이들 모두의 전체 내용은 참고로 본원에 포함된다.
다양한 구현예에서, 신호전달제는 면역-조절제, 예컨대, 인터루킨, 인터페론, 및 종양 괴사 인자 중 하나 이상이다.
일부 구현예에서, 신호전달제는 예를 들면 IL-1; IL-2; IL-3; IL-4; IL-5; IL-6; IL-7; IL-8; IL-9; IL-10; IL-11; IL-12; IL-13; IL-14; IL-15; IL-16; IL-17; IL-18; IL-19; IL-20; IL-21; IL-22; IL-23; IL-24; IL-25; IL-26; IL-27; IL-28; IL-29; IL-30; IL-31; IL-32; IL-33; IL-35; IL-36 또는 이의 단편, 변이체, 유사체, 또는 계열 구성원을 포함하는, 인터루킨 또는 변형된 인터루킨이다. 인터루킨은 림프구, 단핵구, 및 대식구에 의해 합성된 다중기능성 사이토킨의 그룹이다. 공지된 기능은 면역 세포(예컨대, T 헬퍼 세포, B 세포, 호산구(eosinophil), 및 림프구)의 증식, 호중구 및 T 림프구의 화학주성, 및/또는 인터페론의 억제를 자극하는 것을 포함한다. 인터루킨 활성은 당해 분야에 공지된 검정을 사용하여 측정할 수 있다: Matthews et al., in Lymphokines 및 인터페론s: A Practical Approach, Clemens et al., eds, IRL Press, Washington, D.C. 1987, pp. 221-225; 및 Orencole & Dinarello(1989) 사이토킨 1, 14-20.
일부 구현예에서, 신호전달제는 인터페론 또는 인터페론의 변형된 버젼, 예를 들면 제I형, 제II형, 및 제III형이다. 예시적인 인터페론은 예를 들면, 인터페론-α-1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 13, 14, 16, 17, 및 21, 인터페론-β, 인터페론-γ, 인터페론 κ, 인터페론 ε, 인터페론 τ, 및 인터페론 ω를 포함한다.
일부 구현예에서, 신호전달제는 종양 괴사 인자(TNF) 또는 종양 괴사 인자(TNF)의 변형된 버젼 또는 TNF 계열내 단백질, 예를 들면, 그러나 이에 한정되지 않는 TNF-α, TNF-β, LT-β, CD40L, CD27L, CD30L, FASL, 4-1BBL, OX40L, 및 TRAIL을 포함한다.
본원에 기술된 야생형 신호전달제의 아미노산 서열은 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 따라서, 다양한 구현예에서 변형된 신호전달제는 본원에 기술된 신호전달제의 공지된 야생형 아미노산 서열과 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 61%, 또는 적어도 약 62%, 또는 적어도 약 63%, 또는 적어도 약 64%, 또는 적어도 약 65%, 또는 적어도 약 66%, 또는 적어도 약 67%, 또는 적어도 약 68%, 또는 적어도 약 69%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 71%, 또는 적어도 약 72%, 또는 적어도 약 73%, 또는 적어도 약 74%, 또는 적어도 약 75%, 또는 적어도 약 76%, 또는 적어도 약 77%, 또는 적어도 약 78%, 또는 적어도 약 79%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 81%, 또는 적어도 약 82%, 또는 적어도 약 83%, 또는 적어도 약 84%, 또는 적어도 약 85%, 또는 적어도 약 86%, 또는 적어도 약 87%, 또는 적어도 약 88%, 또는 적어도 약 89%, 또는 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 91%, 또는 적어도 약 92%, 또는 적어도 약 93%, 또는 적어도 약 94%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 96%, 또는 적어도 약 97%, 또는 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 서열 동일성(예컨대, 약 60%, 또는 약 61%, 또는 약 62%, 또는 약 63%, 또는 약 64%, 또는 약 65%, 또는 약 66%, 또는 약 67%, 또는 약 68%, 또는 약 69%, 또는 약 70%, 또는 약 71%, 또는 약 72%, 또는 약 73%, 또는 약 74%, 또는 약 75%, 또는 약 76%, 또는 약 77%, 또는 약 78%, 또는 약 79%, 또는 약 80%, 또는 약 81%, 또는 약 82%, 또는 약 83%, 또는 약 84%, 또는 약 85%, 또는 약 86%, 또는 약 87%, 또는 약 88%, 또는 약 89%, 또는 약 90%, 또는 약 91%, 또는 약 92%, 또는 약 93%, 또는 약 94%, 또는 약 95%, 또는 약 96%, 또는 약 97%, 또는 약 98%, 또는 약 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
다양한 구현예에서 변형된 신호전달제는 본원에 기술된 신호전달제의 임의의 아미노산 서열과 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 61%, 또는 적어도 약 62%, 또는 적어도 약 63%, 또는 적어도 약 64%, 또는 적어도 약 65%, 또는 적어도 약 66%, 또는 적어도 약 67%, 또는 적어도 약 68%, 또는 적어도 약 69%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 71%, 또는 적어도 약 72%, 또는 적어도 약 73%, 또는 적어도 약 74%, 또는 적어도 약 75%, 또는 적어도 약 76%, 또는 적어도 약 77%, 또는 적어도 약 78%, 또는 적어도 약 79%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 81%, 또는 적어도 약 82%, 또는 적어도 약 83%, 또는 적어도 약 84%, 또는 적어도 약 85%, 또는 적어도 약 86%, 또는 적어도 약 87%, 또는 적어도 약 88%, 또는 적어도 약 89%, 또는 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 91%, 또는 적어도 약 92%, 또는 적어도 약 93%, 또는 적어도 약 94%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 96%, 또는 적어도 약 97%, 또는 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 서열 동일성(예컨대, 약 60%, 또는 약 61%, 또는 약 62%, 또는 약 63%, 또는 약 64%, 또는 약 65%, 또는 약 66%, 또는 약 67%, 또는 약 68%, 또는 약 69%, 또는 약 70%, 또는 약 71%, 또는 약 72%, 또는 약 73%, 또는 약 74%, 또는 약 75%, 또는 약 76%, 또는 약 77%, 또는 약 78%, 또는 약 79%, 또는 약 80%, 또는 약 81%, 또는 약 82%, 또는 약 83%, 또는 약 84%, 또는 약 85%, 또는 약 86%, 또는 약 87%, 또는 약 88%, 또는 약 89%, 또는 약 90%, 또는 약 91%, 또는 약 92%, 또는 약 93%, 또는 약 94%, 또는 약 95%, 또는 약 96%, 또는 약 97%, 또는 약 98%, 또는 약 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
다양한 구현예에서, 변형된 신호전달제는 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 돌연변이는 치환, 삽입, 결실, 및 트렁케이션으로부터 독립적으로 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환이며, 본원의 어딘가에 기술된 보존적 및/또는 비-보존적 치환을 포함할 수 있다.
다양한 구현예에서, 치환은 또한 본원의 어딘가에 기술된 바와 같은 비-전통적인 아미노산을 포함할 수 있다.
본원에 기술된 바와 같은, 변형된 신호전달제는 하나 이상의 수용체에서 친화성 및/또는 활성에 영향을 미치는 돌연변이를 지닌다. 다양한 구현예에서, 치료학적 수용체, 예컨대, 이를 통해 목적한 치료학적 효과가 매개되는(예컨대, 효능작용 또는 길항작용) 수용체에서 감소된 친화성 및/또는 활성이 존재한다. 다양한 구현예에서, 변형된 신호전달제는 수용체, 예컨대, 이를 통해 목적한 치료학적 효과가 매개되지 않는(예컨대, 결합의 복잡성(promiscuity)의 결과로서) 친화성 및/또는 활성을 실질적으로 감소시키거나 제거하는 돌연변이를 지닌다. 본원에 기술된 바와 같은 임의의 신호전달제의 수용체는 당해 분야에 공지되어 있다.
수용체에서 감소된 친화성 및/또는 활성(예컨대, 효능성)을 제공하는 예시적인 돌연변이는 제WO 2013/107791호 및 제PCT/EP2017/061544호(예컨대, 인터페론과 관련하여), 제WO 2015/007542호(예컨대, 인터루킨과 관련하여), 및 제WO 2015/007903호(예컨대, TNF와 관련하여)에서 발견되며, 이들 각각의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다. 치료학적 수용체에서 감소된 친화성 및/또는 활성(예컨대, 길항성)을 제공하는 예시적인 돌연변이는 제WO 2015/007520호에서 발견되며, 이의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다.
일부 구현예에서, 변형된 신호전달제는 신호전달제가 제I형 사이토킨 수용체, 제II형 사이토킨 수용체, 케모킨 수용체, 종양 괴사 인자 수용체(TNFR) 상과(superfamily)내 수용체, TGF-베타 수용체, 면역글로불린(Ig) 상과내 수용체, 타이로신 키나제 상과내 수용체에 대해 감소된 친화성 및/또는 활성을 가지도록 하는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
다양한 구현예에서, 신호전달제에 대한 수용체는 제I형 사이토킨 수용체이다. 제I형 사이토킨 수용체는 당해 분야에 공지되어 있고 IL2(베타-소단위), IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL9, IL11, IL12, GM-CSF, G-CSF, LIF, CNTF에 대한 수용체, 및 또한 트롬보포이에틴(TPO), 프롤락틴, 및 성장 호르몬에 대한 수용체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예시적인 제I형 사이토킨 수용체는 GM-CSF 수용체, G-CSF 수용체, LIF 수용체, CNTF 수용체, TPO 수용체, 및 제I형 IL 수용체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
다양한 구현예에서, 신호전달제에 대한 수용체는 제II형 사이토킨 수용체이다. 제II형 사이토킨 수용체는 이종 소단위로 구성된 다량체성 수용체이며, 주로 인터페론에 대한 수용체이다. 이러한 계열의 수용체는 인터페론-α, 인터페론-β 및 인터페론-γ, IL10, IL22, 및 조직 인자를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예시적인 제II형 사이토킨 수용체는 IFN-α 수용체(예컨대, IFNAR1 및 IFNAR2), IFN-β수용체, IFN-γ 수용체(예컨대, IFNGR1 및 IFNGR2), 및 제II형 IL 수용체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
다양한 구현예에서, 신호전달제에 대한 수용체는 G 단백질-커플링된 수용체이다. 케모킨 수용체는 7개의 막횡단 구조를 지니고 신호 변환을 위해 G-단백질에 커플링된 G 단백질-커플링된 수용체이다. 케모킨 수용체는 CC 케모킨 수용체, CXC 케모킨 수용체, CX3C 케모킨 수용체, 및 XC 케모킨 수용체(XCR1)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예시적인 케모킨 수용체는 CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CCR10, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR3B, CXCR4, CXCR5, CSCR6, CXCR7, XCR1, 및 CX3CR1을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
다양한 구현예에서, 신호전달제에 대한 수용체는 TNFR 계열 구성원이다. 종양 괴사 인자 수용체(TNFR) 계열 구성원은 연장된 분자(elongated molecule)를 생성하는 CXXCXXC의 코어 모티프(core motif) 주변의 3개의 이황화물 결합으로 형성된 시스테인이 풍부한 도메인(cystein-rich domain: CRD)을 공유한다. 예시적인 종양 괴사 인자 수용체 계열 구성원은: CDl 20a(TNFRSFlA), CD 120b(TNFRSFlB), 림프독소 베타 수용체(LTBR, TNFRSF3), CD 134(TNFRSF4), CD40(CD40, TNFRSF5), FAS(FAS, TNFRSF6), TNFRSF6B(TNFRSF6B), CD27(CD27, TNFRSF7), CD30(TNFRSF8), CD137(TNFRSF9), TNFRSFlOA(TNFRSFlOA), TNFRSFlOB,(TNFRSFlOB), TNFRSFlOC(TNFRSFlOC), TNFRSFlOD(TNFRSFlOD), RANK(TNFRSFI lA), 오스테오프로테게린(TNFRSFl IB), TNFRSF12A(TNFRSF12A), TNFRSF13B(TNFRSF13B), TNFRSF13C(TNFRSF13C), TNFRSF14(TNFRSF14), 신경 성장 인자 수용체(NGFR, TNFRSF16), TNFRSF17(TNFRSF17), TNFRSF18(TNFRSF18), TNFRSF19(TNFRSF19), TNFRSF21(TNFRSF21), 및 TNFRSF25(TNFRSF25)를 포함한다. 일 구현예에서, TNFR 계열 구성원은 CD120a(TNFRSF1A) 또는 TNF-R1이다. 다른 구현예에서, TNFR 계열 구성원은 CD 120b(TNFRSFlB) 또는 TNF-R2이다.
다양한 구현예에서, 신호전달제에 대한 수용체는 TGF-베타 수용체이다. TGF-베타 수용체는 단일 통과 세린/트레오닌 키나제 수용체이다. TGF-베타 수용체는 TGFBR1, TGFBR2, 및 TGFBR3을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
다양한 구현예에서, 신호전달제에 대한 수용체는 Ig 상과 수용체이다. 면역글로불린(Ig) 상과내 수용체는 면역글로불린과 구조적 상동성을 공유한다. Ig 상과내 수용체는 인터루킨-1 수용체, CSF-1R, PDGFR(예컨대, PDGFRA 및 PDGFRB), 및 SCFR를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
다양한 구현예에서, 신호전달제에 대한 수용체는 타이로신 키나제 상과 수용체이다. 타이로신 키나제 상과내 수용체는 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 20개의 아과(subfamily)로 그룹화된, 약 58개의 공지된 수용체 타이로신 키나제(RTK)가 존재한다. 타이로신 키나제 상과내의 수용체는 FGF 수용체 및 이들의 다양한 동형, 예를 들면, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, 및 FGFR5를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, 변형된 신호전달제는 인터페론 α이다. 이러한 구현예에서, 변형된 IFN-α 제제는 IFN-α/β 수용체(IFNAR), 즉, IFNAR1 및/또는 IFNAR2 쇄에 대해 감소된 친화성 및/또는 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, 변형된 IFN-α 제제는 IFN-α/β 수용체(IFNAR), 즉, IFNAR1 및/또는 IFNAR2 쇄에 대해 실질적으로 감소되거나 제거된 친화성 및/또는 활성을 갖는다.
인터페론 α의 돌연변이체 형태는 당해 분야의 기술자에게 공지되어 있다. 예시적인 구현예에서, 변형된 신호전달제는 서열 번호: 46의 아미노산 서열을 갖는 대립형질 형태 IFN-α2a이다.
예시적인 구현예에서, 변형된 신호전달제는 서열 번호: 47의 아미노산 서열을 갖는 대립형질 형태 IFN-α2b(아미노산 23번 위치에서의 IFN-α2a와는 상이함)이다.
일부 구현예에서, 상기 IFN-α2 돌연변이체(IFN-α2a 또는 IFN-α2b)는 144 내지 154번 위치에서의 하나 이상의 아미노산, 예를 들면, 148번, 149번 및/또는 153번 아미노산 위치에서 돌연변이된다. 일부 구현예에서, IFN-α2 돌연변이체는 L153A, R149A, 및 M148A로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 이러한 돌연변이체는 예를 들면, 제WO2013/107791호 및 Piehler et al.,(2000) J. Biol. Chem, 275:40425-33에 기술되어 있고, 이들 모두의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다.
일부 구현예에서, IFN-α2 돌연변이체는 IFNAR1에 대해 감소된 친화성 및/또는 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, IFN-α2 돌연변이체는 제WO2010/030671호에 기술된 바와 같이, F64A, N65A, T69A, L80A, Y85A, 및 Y89A로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 포함하며, 이의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다.
일부 구현예에서, IFN-α2 돌연변이체는 제WO2008/124086호에 기술된 바와 같은, K133A, R144A, R149A, 및 L153A로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 포함하며, 이의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다.
일부 구현예에서, IFN-α2 돌연변이체는 제WO2015/007520호 및 제WO2010/030671호에 기술된 바와 같은, R120E 및 R120E/K121E로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 포함하며, 이의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다. 이러한 구현예에서, 상기 IFN-α2 돌연변이체는 야생형 IFN-α2 활성을 길항한다. 이러한 구현예에서, 이러한 돌연변이체 IFN-α2는 IFNAR1에 대해 감소된 친화성 및/또는 활성을 가지지만, IFNR2의 친화성 및/또는 활성은 보유된다.
일부 구현예에서, 사람 IFN-α2 돌연변이체는 (1) 이론에 얽메이려는 의도없이, 길항 효과를 생성하는, R120E 및 R120E/K121E로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이 및 (2) 이론에 얽메이려는 의도없이, 예를 들면, IFNAR2에서 약화된 효과를 허용하는 K133A, R144A, R149A, 및 L153A로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일 구현예에서, 사람 IFN-α2 돌연변이체는 R120E 및 L153A를 포함한다.
일부 구현예에서, 사람 IFN-α2 돌연변이체는 제WO 2013/059885호에 개재된 바와 같은 L15A, A19W, R22A, R23A, L26A, F27A, L30A, L30V, K31A, D32A, R33K, R33A, R33Q, H34A, D35A, Q40A, D114R, L117A, R120A, R125A, K134A, R144A, A145G, A145M, M148A, R149A, S152A, L153A, 및 N156A로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 포함하며, 이의 전체 개시내용은 본원에 참고로 포함된다. 일부 구현예에서, 사람 IFN-α2 돌연변이체는 제WO 2013/059885호에 개시된 바와 같은 돌연변이 H57Y, E58N, Q61S, 및/또는 L30A를 포함한다. 일부 구현예에서, 사람 IFN-α2 돌연변이체는 제WO 2013/059885호에 개시된 바와 같은 돌연변이 H57Y, E58N, Q61S, 및/또는 R33A를 포함한다. 일부 구현예에서, 사람 IFN-α2 돌연변이체는 제WO 2013/059885호에 개시된 바와 같은 돌연변이 H57Y, E58N, Q61S, 및/또는 M148A를 포함한다. 일부 구현예에서, 사람 IFN-α2 돌연변이체는 제WO 2013/059885호에 개시된 바와 같은 돌연변이 H57Y, E58N, Q61S, 및/또는 L153A를 포함한다. 일부 구현예에서, 사람 IFN-α2 돌연변이체는 제WO 2013/059885호에 개시된 바와 같은 돌연변이 N65A, L80A, Y85A, 및/또는 Y89A를 포함한다. 일부 구현예에서, 사람 IFN-α2 돌연변이체는 제WO 2013/059885호에 개시된 바와 같은 돌연변이 N65A, L80A, Y85A, Y89A, 및/또는 D114A를 포함한다. 일부 구현예에서, 사람 IFN-α2 돌연변이체는 R144X1, A145X2, 및 R33A로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 포함하며, 여기서 X1은 A, S, T, Y, L, 및 I로부터 선택되고, 여기서 X2는 G, H, Y, K, 및 D로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 변형된 신호전달제는 인터페론 β이다. 이러한 구현예에서, 변형된 IFN-β 제제는 IFN-α/β수용체(IFNAR), 즉, IFNAR1 및/또는 IFNAR2 쇄에 대해 감소된 친화성 및/또는 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, 변형된 인터페론 β 제제는 IFN-α/β 수용체(IFNAR), 즉, IFNAR1 및/또는 IFNAR2 쇄에 대해 실질적으로 감소되거나 제거된 친화성 및/또는 활성을 갖는다.
일 구현예에서, 변형된 신호전달제는 인터페론 β이다. 이러한 구현예에서, 변형된 인터페론 β 제제는 IFN-α/β수용체(IFNAR), 즉, IFNAR1 및/또는 IFNAR2 쇄에 대해 감소된 친화성 및/또는 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, 변형된 인터페론 β 제제는 IFN-α/β 수용체(IFNAR), 즉, IFNAR1 및/또는 IFNAR2 쇄에 대해 실질적으로 감소되거나 제거된 친화성 및/또는 활성을 갖는다.
예시적인 구현예에서, 변형된 신호전달제는 IFN-β이다. 다양한 구현예에서, IFN-β는 IFN-β의 기능적 유도체, 유사체, 전구체, 동형, 스플라이스 변이체, 또는 단편을 포함한다. 다양한 구현예에서, IFN-β는 임의의 종(species)으로부터 유래된 IFN-β를 포함한다. 일 구현예에서, 키메라 단백질은 마우스 IFN-β의 변형된 버젼을 포함한다. 다른 구현예에서, 키메라 단백질은 사람 IFN-β의 변형된 버젼을 포함한다. 사람 IFN-β는 166개 아미노산 잔기를 포함하는 분자량이 약 22 kDa인 폴리펩타이드이다. 사람 IFN-β의 아미노산 서열은 서열 번호: 48이다.
일부 구현예에서, 사람 IFN-β는 사람 IFN-β의 글리코실화된 형태인 IFN-β-1a이다. 일부 구현예에서, 사람 IFN-β는 Met-1 결실 및 Cys-17 내지 Ser 돌연변이를 갖는 사람 IFN-β의 비-글리코실화된 형태인 IFN-β-1b이다.
다양한 구현예에서, 변형된 IFN-β는 IFNAR의 IFNAR1 소단위에 대한 이의 결합 또는 이의 친화성을 감소시키는 하나 이상의 돌연변이를 갖는다. 일 구현예에서, 변형된 IFN-β는 IFNAR1에서 감소된 친화성 및/또는 활성을 갖는다. 다양한 구현예에서, 변형된 IFN-β는 사람 IFN-β이며 F67, R71, L88, Y92, I95, N96, K123, 및 R124 위치에서 하나 이상의 돌연변이를 갖는다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 돌연변이는 F67G, F67S, R71A, L88G, L88S, Y92G, Y92S, I95A, N96G, K123G, 및 R124G로부터 선택된 치환이다. 일 구현예에서, 변형된 IFN-β는 F67G 돌연변이를 포함한다. 일 구현예에서, 변형된 IFN-β는 K123G 돌연변이를 포함한다. 일 구현예에서, 변형된 IFN-β는 F67G 및 R71A 돌연변이를 포함한다. 일 구현예에서, 변형된 IFN-β는 L88G 및 Y92G 돌연변이를 포함한다. 일 구현예에서, 변형된 IFN-β는 Y92G, I95A, 및 N96G 돌연변이를 포함한다. 일 구현예에서, 변형된 IFN-β는 K123G 및 R124G 돌연변이를 포함한다. 일 구현예에서, 변형된 IFN-β는 F67G, L88G, 및 Y92G 돌연변이를 포함한다. 일 구현예에서, 변형된 IFN-β는 F67S, L88S, 및 Y92S 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 변형된 IFN-β는 IFNAR의 IFNAR2 소단위에 대한 이의 결합 또는 이의 친화성을 감소시키는 하나 이상의 돌연변이를 갖는다. 일 구현예에서, 변형된 IFN-β는 IFNAR2에서 감소된 친화성 및/또는 활성을 갖는다. 다양한 구현예에서, 변형된 IFN-β는 사람 IFN-β이고 W22, R27, L32, R35, V148, L151, R152, 및 Y155 위치에서 하나 이상의 돌연변이를 갖는다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 돌연변이는 W22G, R27G, L32A, L32G, R35A, R35G, V148G, L151G, R152A, R152G, 및 Y155G로부터 선택된 치환이다. 일 구현예에서, 변형된 IFN-β는 W22G 돌연변이를 포함한다. 일 구현예에서, 변형된 IFN-β는 L32A 돌연변이를 포함한다. 일 구현예에서, 변형된 IFN-β는 L32G 돌연변이를 포함한다. 일 구현예에서, 변형된 IFN-β는 R35A 돌연변이를 포함한다. 일 구현예에서, 변형된 IFN-β는 R35G 돌연변이를 포함한다. 일 구현예에서, 변형된 IFN-β는 V148G 돌연변이를 포함한다. 일 구현예에서, 변형된 IFN-β는 R152A 돌연변이를 포함한다. 일 구현예에서, 변형된 IFN-β는 R152G 돌연변이를 포함한다. 일 구현예에서, 변형된 IFN-β는 Y155G 돌연변이를 포함한다. 일 구현예에서, 변형된 IFN-β는 W22G 및 R27G 돌연변이를 포함한다. 일 구현예에서, 변형된 IFN-β는 L32A 및 R35A 돌연변이를 포함한다. 일 구현예에서, 변형된 IFN-β는 L151G 및 R152A 돌연변이를 포함한다. 일 구현예에서, 변형된 IFN-β는 V148G 및 R152A 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 변형된 IFN-β는 다음의 돌연변이 중 하나 이상을 갖는다: R35A, R35T, E42K, M62I, G78S, A141Y, A142T, E149K, 및 R152H. 일부 구현예에서, 변형된 IFN-β는 다음의 돌연변이 중 하나 이상을 갖는다: C17S 또는 C17A와 함께 R35A, R35T, E42K, M62I, G78S, A141Y, A142T, E149K, 및 R152H.
일부 구현예에서, 변형된 IFN-β는 다음의 돌연변이 중 하나 이상을 갖는다: 본원에 기술된 임의의 다른 IFN-β 돌연변이와 함께 R35A, R35T, E42K, M62I, G78S, A141Y, A142T, E149K, 및 R152H.
사람 IFN-β의 결정 구조는 공지되어 있고 Karpusas et al.,(1998) PNAS, 94(22): 11813-11818에 기술되어 있다. 구체적으로, 사람 IFN-β의 구조는 5개의 α-나선(즉, A, B, C, D, 및 E) 및 이들 나선을 연결하는 4개의 루프(loop) 영역(즉, AB, BC, CD, 및 DE 루프)를 포함하는 것으로 나타났다. 다양한 구현예에서, 변형된 IFN-β는 IFNAR과 같은 치료학적 수용체에서 이의 결합 친화성 또는 활성을 감소시키는 A, B, C, D, E 나선 및/또는 AB, BC, CD, 및 DE 루프내 하나 이상의 돌연변이를 갖는다. 예시적인 돌연변이는 제WO2000/023114호 및 제US20150011732호에 기술되어 있고, 이의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다. 예시적인 구현예에서, 변형된 IFN-β는 15, 16, 18, 19, 22, 및/또는 23번 아미노산 위치에서 알라닌 치환을 포함하는 사람 IFN-β이다. 예시적인 구현예에서, 변형된 IFN-β는 28 내지 30, 32, 및 33번 아미노산 위치에서 알라닌 치환을 포함하는 사람 IFN-β이다. 예시적인 구현예에서, 변형된 IFN-β는 36, 37, 39, 및 42번 아미노산 위치에서 알라닌 치환을 포함하는 사람 IFN-β이다. 예시적인 구현예에서, 변형된 IFN-β는 64 및 67번 아미노산 위치에서 알라닌 치환 및 68번 위치에서 세린 치환을 포함하는 사람 IFN-β이다. 예시적인 구현예에서, 변형된 IFN-β는 71 내지 73번 아미노산 위치에서 알라닌 치환을 포함하는 사람 IFN-β이다. 예시적인 구현예에서, 변형된 IFN-β는 92, 96, 99, 및 100번 아미노산 위치에서 알라닌 치환을 포함하는 사람 IFN-β이다. 예시적인 구현예에서, 변형된 IFN-β는 128, 130, 131, 및 134번 아미노산 위치에서 알라닌 치환을 포함하는 사람 IFN-β이다. 예시적인 구현예에서, 변형된 IFN-β는 149, 153, 156, 및 159번 아미노산 위치에서 알라닌 치환을 포함하는 사람 IFN-β이다. 일부 구현예에서, 돌연변이체 IFNβ는 서열 번호: 48 및 W22에서의 돌연변이를 포함하고, 이러한 돌연변이는 글리신(G), 알라닌(A), 루이신(L), 이소루이신(I), 메티오닌(M), 및 발린(V)으로부터 선택된 지방족 소수성 잔기이다.
일부 구현예에서, 돌연변이체 IFNβ는 서열 번호: 48 및 R27에서의 돌연변이를 포함하며, 이러한 돌연변이는 글리신(G), 알라닌(A), 루이신(L), 이소루이신(I), 메티오닌(M), 및 발린(V)으로부터 선택된 지방족 소수성 잔기이다.
일부 구현예에서, 돌연변이체 IFNβ는 서열 번호: 48 및 W22에서의 돌연변이를 포함하고, 이러한 돌연변이는 글리신(G), 알라닌(A), 루이신(L), 이소루이신(I), 메티오닌(M), 및 발린(V) 및 R27에서의 돌연변이로부터 선택된 지방족 소수성 잔기이며, 이러한 돌연변이는 글리신(G), 알라닌(A), 루이신(L), 이소루이신(I), 메티오닌(M), 및 발린(V)로부터 선택된 지방족 소수성 잔기이다.
일부 구현예에서, 돌연변이체 IFNβ는 서열 번호: 48 및 L32에서의 돌연변이를 포함하고, 이러한 돌연변이는 글리신(G), 알라닌(A), 이소루이신(I), 메티오닌(M), 및 발린(V)으로부터 선택된 지방족 소수성 잔기이다.
일부 구현예에서, 돌연변이체 IFNβ는 서열 번호: 48 및 R35에서의 돌연변이를 포함하고, 이러한 돌연변이는 글리신(G), 알라닌(A), 루이신(L), 이소루이신(I), 메티오닌(M), 및 발린(V)으로부터 선택된 지방족 소수성 잔기이다.
일부 구현예에서, 돌연변이체 IFNβ는 서열 번호: 48 및 L32에서의 돌연변이를 포함하고, 이러한 돌연변이는 글리신(G), 알라닌(A), 이소루이신(I), 메티오닌(M), 및 발린(V) 및 R35에서의 돌연변이로부터 선택된 지방족 소수성 잔기이며, 이러한 돌연변이는 글리신(G), 알라닌(A), 루이신(L), 이소루이신(I), 메티오닌(M), 및 발린(V)으로부터 선택된 지방족 소수성 잔기이다.
일부 구현예에서, 돌연변이체 IFNβ는 서열 번호: 48 및 F67에서의 돌연변이를 포함하고, 이러한 돌연변이는 글리신(G), 알라닌(A), 루이신(L), 이소루이신(I), 메티오닌(M), 및 발린(V)으로부터 선택된 지방족 소수성 잔기이다.
일부 구현예에서, 돌연변이체 IFNβ는 서열 번호: 48 및 R71에서의 돌연변이를 포함하고, 이러한 돌연변이는 글리신(G), 알라닌(A), 루이신(L), 이소루이신(I), 메티오닌(M), 및 발린(V)으로부터 선택된 지방족 소수성 잔기이다.
일부 구현예에서, 돌연변이체 IFNβ는 서열 번호: 48 및 F67에서의 돌연변이를 포함하고, 이러한 돌연변이는 글리신(G), 알라닌(A), 루이신(L), 이소루이신(I), 메티오닌(M), 및 발린(V) 및 R71에서의 돌연변이로부터 선택된 지방족 소수성 잔기이고, 이러한 돌연변이는 글리신(G), 알라닌(A), 루이신(L), 이소루이신(I), 메티오닌(M), 및 발린(V)으로부터 선택된 지방족 소수성 잔기이다.
일부 구현예에서, 돌연변이체 IFNβ는 서열 번호: 48 및 L88에서의 돌연변이를 포함하고, 이러한 돌연변이는 글리신(G), 알라닌(A), 이소루이신(I), 메티오닌(M), 및 발린(V)으로부터 선택된 지방족 소수성 잔기이다.
일부 구현예에서, 돌연변이체 IFNβ는 서열 번호: 48 및 Y92에서의 돌연변이를 포함하고, 이러한 돌연변이는 글리신(G), 알라닌(A), 루이신(L), 이소루이신(I), 메티오닌(M), 및 발린(V)으로부터 선택된 지방족 소수성 잔기이다.
일부 구현예에서, 돌연변이체 IFNβ는 서열 번호: 48 및 F67에서의 돌연변이(이러한 돌연변이는 글리신(G), 알라닌(A), 루이신(L), 이소루이신(I), 메티오닌(M), 및 발린(V)으로부터 선택된 지방족 소수성 잔기이다) 및 L88에서의 돌연변이(이러한 돌연변이는 글리신(G), 알라닌(A), 이소루이신(I), 메티오닌(M), 및 발린(V)으로부터 선택된 지방족 소수성 잔기이다) 및 Y92에서의 돌연변이(이러한 돌연변이는 글리신(G), 알라닌(A), 루이신(L), 이소루이신(I), 메티오닌(M), 및 발린(V)으로부터 선택된 지방족 소수성 잔기이다)를 포함한다.
일부 구현예에서, 돌연변이체 IFNβ는 서열 번호: 48 및 L88에서의 돌연변이(이러한 돌연변이는 글리신(G), 알라닌(A), 이소루이신(I), 메티오닌(M), 및 발린(V)으로부터 선택된 지방족 소수성 잔기이다) 및 Y92에서의 돌연변이(이러한 돌연변이는 글리신(G), 알라닌(A), 루이신(L), 이소루이신(I), 메티오닌(M), 및 발린(V)으로부터 선택된 지방족 소수성 잔기이다)를 포함한다.
일부 구현예에서, 돌연변이체 IFNβ는 서열 번호: 48 및 I95에서의 돌연변이(이러한 돌연변이는 글리신(G), 알라닌(A), 루이신(L), 메티오닌(M), 및 발린(V)으로부터 선택된 지방족 소수성 잔기이다) 및 Y92에서의 돌연변이(이러한 돌연변이는 글리신(G), 알라닌(A), 루이신(L), 이소루이신(I), 메티오닌(M), 및 발린(V)으로부터 선택된 지방족 소수성 잔기이다)를 포함한다.
일부 구현예에서, 돌연변이체 IFNβ는 서열 번호: 48 및 N96에서의 돌연변이(이러한 돌연변이는 글리신(G), 알라닌(A), 루이신(L), 이소루이신(I), 메티오닌(M), 및 발린(V)으로부터 선택된 지방족 소수성 잔기이다) 및 Y92에서의 돌연변이(이러한 돌연변이는 글리신(G), 알라닌(A), 루이신(L), 이소루이신(I), 메티오닌(M), 및 발린(V)으로부터 선택된 지방족 소수성 잔기이다)를 포함한다.
일부 구현예에서, 돌연변이체 IFNβ는 서열 번호: 48 및 Y92에서의 돌연변이(이러한 돌연변이는 글리신(G), 알라닌(A), 루이신(L), 이소루이신(I), 메티오닌(M), 및 발린(V)으로부터 선택된 지방족 소수성 잔기이다) 및 I95에서의 돌연변이(이러한 돌연변이는 글리신(G), 알라닌(A), 루이신(L), 메티오닌(M), 및 발린(V)으로부터 선택된 지방족 소수성 잔기이다) 및 N96에서의 돌연변이(이러한 돌연변이는 글리신(G), 알라닌(A), 루이신(L), 이소루이신(I), 메티오닌(M), 및 발린(V)으로부터 선택된 지방족 소수성 잔기이다)를 포함한다.
일부 구현예에서, 돌연변이체 IFNβ는 서열 번호: 48 및 K123에서의 돌연변이를 포함하고, 이러한 돌연변이는 글리신(G), 알라닌(A), 루이신(L), 이소루이신(I), 메티오닌(M), 및 발린(V)으로부터 선택된 지방족 소수성 잔기이다.
일부 구현예에서, 돌연변이체 IFNβ는 서열 번호: 48 및 R124에서의 돌연변이를 포함하고, 이러한 돌연변이는 글리신(G), 알라닌(A), 루이신(L), 이소루이신(I), 메티오닌(M), 및 발린(V)으로부터 선택된 지방족 소수성 잔기이다.
일부 구현예에서, 돌연변이체 IFNβ는 서열 번호: 48 및 K123에서의 돌연변이(이러한 돌연변이는 글리신(G), 알라닌(A), 루이신(L), 이소루이신(I), 메티오닌(M), 및 발린(V)으로부터 선택된 지방족 소수성 잔기이다) 및 R124에서의 돌연변이(이러한 돌연변이는 글리신(G), 알라닌(A), 루이신(L), 이소루이신(I), 메티오닌(M), 및 발린(V)으로부터 선택된 지방족 소수성 잔기이다)를 포함한다.
일부 구현예에서, 돌연변이체 IFNβ는 서열 번호: 48 및 L151에서의 돌연변이를 포함하고, 이러한 돌연변이는 글리신(G), 알라닌(A), 이소루이신(I), 메티오닌(M), 및 발린(V)으로부터 선택된 지방족 소수성 잔기이다.
일부 구현예에서, 돌연변이체 IFNβ는 서열 번호: 48 및 R152에서의 돌연변이를 포함하고, 이러한 돌연변이는 글리신(G), 알라닌(A), 루이신(L), 이소루이신(I), 메티오닌(M), 및 발린(V)으로부터 선택된 지방족 소수성 잔기이다.
일부 구현예에서, 돌연변이체 IFNβ는 서열 번호: 48 및 L151에서의 돌연변이(이러한 돌연변이는 글리신(G), 알라닌(A), 이소루이신(I), 메티오닌(M), 및 발린(V)으로부터 선택된 지방족 소수성 잔기이다) 및 R152에서의 돌연변이(이러한 돌연변이는 글리신(G), 알라닌(A), 루이신(L), 이소루이신(I), 메티오닌(M), 및 발린(V)으로부터 선택된 지방족 소수성 잔기이다)를 포함한다.
일부 구현예에서, 돌연변이체 IFNβ는 서열 번호: 48 및 V148에서의 돌연변이를 포함하고, 이러한 돌연변이는 글리신(G), 알라닌(A), 루이신(L), 이소루이신(I), 및 메티오닌(M)으로부터 선택된 지방족 소수성 잔기이다.
일부 구현예에서, 돌연변이체 IFNβ는 서열 번호: 48 및 V148에서의 돌연변이(이러한 돌연변이는 글리신(G), 알라닌(A), 루이신(L), 이소루이신(I), 메티오닌(M), 및 발린(V)으로부터 선택된 지방족 소수성 잔기이다) 및 R152에서의 돌연변이(이러한 돌연변이는 글리신(G), 알라닌(A), 루이신(L), 이소루이신(I), 메티오닌(M), 및 발린(V)으로부터 선택된 지방족 소수성 잔기이다)를 포함한다.
일부 구현예에서, 돌연변이체 IFNβ는 서열 번호: 48 및 Y155에서의 돌연변이를 포함하고, 이러한 돌연변이는 글리신(G), 알라닌(A), 루이신(L), 이소루이신(I), 메티오닌(M), 및 발린(V)으로부터 선택된 지방족 소수성 잔기이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 (a) 서열 번호: 48의 아미노산 서열 및 W22 위치에서의 돌연변이를 갖는 변형된 IFN-β(여기서 돌연변이는 지방족 소수성 잔기이다); 및 (b) 하나 이상의 표적화 모이어티를 포함하는 키메라 단백질에 관한 것이며, 상기 표적화 모이어티는 목적한 항원 또는 수용체(예컨대, Clec9A)에 특이적으로 결합하는 인식 도메인을 포함하며, 이러한 변형된 IFN-β 및 하나 이상의 표적화 모이어티는 하나 이상의 링커(linker)에 임의로 연결된다. 다양한 구현예에서 W22 위치에서의 돌연변이는 G, A, L, I, M, 및 V로부터 선택된 지방족 소수성 잔기이다. 다양한 구현예에서 W22 위치에서의 돌연변이는 G이다.
추가의 예시적인 IFNβ 돌연변이체는 제PCT/EP2017/061544호에서 제공되며, 이의 전체 개시내용은 본원에 참고로 포함된다.
일부 구현예에서, 변형된 신호전달제는 인터페론 γ이다. 이러한 구현예에서, 변형된 인터페론 γ 제제는 인터페론-감마 수용체(IFNGR), 즉, IFNGR1 및 IFNGR2 쇄에 대해 감소된 친화성 및/또는 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, 변형된 인터페론 γ 제제는 인터페론-감마 수용체(IFNGR), 즉, IFNGR1 및/또는 IFNGR2 쇄에 대해 실질적으로 감소되거나 제거된 친화성 및/또는 활성을 갖는다.
일부 구현예에서, 변형된 신호전달제는 컨센수스(consensus) 인터페론이다. 컨센수스 인터페론은 수개의 사람 비-대립형질성 IFN-α 아형의 서열을 스캐닝하여 각각의 상응하는 위치에서 가장 흔히 관찰된 아미노산을 지정함으로써 생성된다. 컨센수스 인터페론은 166개 아미노산 중 20개에서 IFN-α2b와 상이하며(88% 상동성), IFN-β와의 비교는 아미노산 위치의 30% 이상에서 동일성(identity)을 나타낸다. 다양한 구현예에서, 컨센수스 인터페론은 다음의 서열 번호: 49의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 컨센수스 인터페론은 서열 번호: 50의 아미노산 서열을 포함하며, 이는 서열 번호: 49의 아미노산 서열과 하나의 아미노산에 의해 상이한데, 즉, 서열 번호: 50은 서열 번호: 49의 초기 메티오닌 잔기를 결여한다.
다양한 구현예에서, 컨센수스 인터페론은 신호전달제로서 컨센수스 인터페론의 변형된 버젼, 즉, 컨센수스 인터페론 변이체를 포함한다. 다양한 구현예에서, 컨센수스 인터페론 변이체는 컨센수스 인터페론의 기능성 유도체, 유사체, 전구체, 동형, 스플라이스 변이체, 또는 단편을 포함한다.
일 구현예에서, 컨센수스 인터페론 변이체는 미국 특허 제4,695,623호, 제4,897,471호, 제5,541,293호, 및 제8,496,921호에 개시된 컨센수스 인터페론 변이체로부터 선택되며, 이의 모두의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다. 예를 들면, 컨센수스 인터페론 변이체는 미국 특허 제4,695,623호, 제4,897,471호, 및 제5,541,293호에 개시된 바와 같은 IFN-CON2 또는 IFN-CON3의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 컨센수스 인터페론 변이체는 IFN-CON2(서열 번호: 51)의 아미노산 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 컨센수스 인터페론 변이체는 IFN-CON3(서열 번호: 52)의 아미노산 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 컨센수스 인터페론 변이체는 미국 특허 제8,496,921호에 개시된 변이체 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들면, 컨센수스 변이체는 서열 번호: 53의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, 컨센수스 인터페론 변이체는 서열 번호: 54의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 컨센수스 인터페론 변이체는 PEG화(PEGylated) 될 수 있는데, 즉, PEG 모이어티를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 컨센수스 인터페론 변이체는 서열 번호: 54의 S156C 위치에 부착된 PEG 모이어티를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 가공된 인터페론은 서열 Glu-Glu-Phe-Gly-Asn-Gln(서열 번호: 275)내 대략 41번 위치에서 Asp가 삽입되어 Glu-Glu-Phe-Asp-Gly-Asn-Gln(서열 번호: 276)(이는 IFN-α2a 서열에 비해 서열의 재번호매김을 야기하였다) 및 다음의 Arg23Lys, Leu26Pro, Glu53Gln, Thr54Ala, Pro56Ser, Asp86Glu, Ile104Thr, Gly106Glu, Thr110Glu, Lys117Asn, Arg125Lys, 및 Lys136Thr의 돌연변이를 지닌 사람 IFN-α2a의 변이체이다. 컨센수스 인터페론을 기술하는 모든 구현예는 이러한 가공된 인터페론에 동등하게 적용된다.
다양한 구현예에서, 컨센수스 인터페론 변이체는 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 돌연변이는 치환, 삽입, 결실, 및 트렁케이션(truncation)으로부터 독립적으로 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환이며, 보존적 및/또는 비-보존적 치환을 포함할 수 있다.
다양한 구현예에서, 치환은 또한 비-전통적인 아미노산(예컨대, 셀레노시스테인, 피롤라이신, N-포르밀메티오닌 β-알라닌, GABA 및 δ-아미노레불린산, 4-아미노벤조산(PABA), 일반적인 아미노산의 D-이성체, 2,4-디아미노부티르산, α-아미노 이소부티르산, 4-아미노부티르산, Abu, 2-아미노 부티르산, γ-Abu, ε-Ahx, 6-아미노 헥산산, Aib, 2-아미노 이소부티르산, 3-아미노 프로피온산, 오르니틴, 노르루이신, 노르발린, 하이드록시프롤린, 사르코스메(sarcosme), 시트룰린, 호모시트룰린, 시스테산, t-부틸글리신, t-부틸알라닌, 페닐글리신, 사이클로헥실알라닌, β-알라닌, 플루오로-아미노산, 설계자(designer) 아미노산, 예를 들면, 일반적으로 β 메틸 아미노산, C α-메틸 아미노산, N α-메틸 아미노산, 및 아미노산 유사체)을 포함할 수 있다.
다양한 구현예에서, 컨센수스 인터페론은 하나 이상의 돌연변이를 가지도록 변형된다. 일부 구현예에서, 돌연변이는 컨센수스 인터페론 변이체가 돌연변이되지 않은, 예컨대, 컨센수스 인터페론(예컨대, 서열 번호: 49 또는 50의 아미노산 서열을 갖는 컨센수스 인터페론)의 양생형 형태에 비해, 하나 이상의 약화된 활성, 예를 들면, 감소된 결합 친화성, 감소된 내인성 활성, 및 감소된 특이적인 생물활성 중의 하나 이상을 갖도록 한다. 예를 들면, 돌연변이되지 않은, 예컨대, 컨센수스 인터페론의 야생형 형태에 비해 약화된 활성, 예를 들면, 감소된 결합 친화성, 감소된 내인성 활성, 및 감소된 특이적인 생물활성 중 하나 이상은 치료학적 수용체, 예를 들면, IFNAR에서 존재할 수 있다. 결과적으로, 다양한 구현예에서, 돌연변이는 컨센수스 인터페론 변이체가 돌연변이되지 않은, 예컨대, 컨센수스 인터페론의 야생형 형태에 비해 감소된 전신계 독성, 감소된 부작용, 및 감소된 오프-표적 효과를 가지도록 한다.
다양한 구현예에서, 컨센수스 인터페론은 변형되어 치료학적 수용체, 예를 들면, IFNAR에서 이의 결합 친화성 또는 활성을 감소시키는 돌연변이를 갖는다. 일부 구현예에서, 컨센수스 인터페론에 의해 제공된 활성은 치료학적 수용체에서의 효능작용(예컨대, 치료요법 부위에서 세포 효과의 활성화)이다. 예를 들면, 컨센수스 인터페론은 치료학적 수용체를 활성화시킬 수 있다. 이러한 구현예에서, 돌연변이는 컨센수스 인터페론 변이체를 생성하여 치료학적 수용체에서 감소된 활성화 활성을 갖는다.
일부 구현예에서, 치료학적 수용체에서 감소된 친화성 또는 활성은 표적화 모이어티(예컨대, SIRPα)와의 부착에 의해 회복될 수 있다. 다른 구현예에서, 치료학적 수용체에서 감소된 친화성 또는 활성은 표적화 모이어티와의 부착에 의해 실질적으로 회복될 수 없다. 다양한 구현예에서, 본 발명의 치료학적 키메라 단백질은 컨센수스 인터페론 변이체가 치료학적 수용체에서 결합 친화성 또는 활성을 약화시킨 돌연변이를 가지므로 오프-표적 효과를 감소시킨다. 다양한 구현예에서, 이는 예를 들면, 야생형 컨센수스 인터페론으로 관찰된 부작용을 감소시킨다. 다양한 구현예에서, 컨센수스 인터페론 변이체는 치료학적 활성 부위에 대해 도중에(en route) 실질적으로 불활성이며 원하지 않는 부작용을 크게 감소시키는 특이적으로 표적화된 세포형에서 실질적으로 이의 효과를 갖는다.
다양한 구현예에서, 컨센수스 인터페론 변이체는 컨센수스 인터페론 변이체가 하나 이상의 치료학적 수용체에 대해 약화되거나 감소된 친화성, 예컨대, 결합(예컨대, KD) 및/또는 활성화(예를 들면, KA 및/또는 EC50로서 측정가능)를 갖도록 하는 하나 이상의 돌연변이를 갖는다. 다양한 구현예에서, 치료학적 수용체에서 감소된 친화성은 치료학적 수용체로부터의 활성 및/또는 신호전달의 약화를 허용한다.
다양한 구현예에서, 컨센수스 인터페론 변이체는 IFNAR의 IFNAR1 소단위에 대한 이의 결합 또는 이의 친화성을 감소시키는 하나 이상의 돌연변이를 갖는다. 일 구현예에서, 컨센수스 인터페론 변이체는 IFNAR1에서 감소된 친화성 및/또는 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, 컨센수스 인터페론 변이체는 IFNAR의 IFNAR2 소단위에 대한 이의 결합 또는 이의 친화성을 감소시키는 하나 이상의 돌연변이를 갖는다. 일부 구현예에서, 컨센수스 인터페론 변이체는 IFNAR1 및 IFNAR2 소단위 둘 다에 대한 이의 결합 또는 이의 친화성을 감소시키는 하나 이상의 돌연변이를 갖는다.
일부 구현예에서, 컨센수스 인터페론 변이체는 IFNAR1에 대한 이의 결합 또는 이의 친화성을 감소시키는 하나 이상의 돌연변이 및 IFNAR2에 대한 결합 또는 이의 친화성을 실질적으로 감소시키거나 제거하는 하나 이상의 돌연변이를 갖는다. 일부 구현예에서, 이러한 컨센수스 인터페론 변이체를 지닌 키메라 단백질은 표적-선택적인 IFNAR1 활성(예컨대, IFNAR1 활성은 표적화 모이어티, 예컨대, SIRPα를 통한 표적화를 경우하여 회복가능하다)을 제공할 수 있다.
일부 구현예에서, 컨센수스 인터페론 변이체는 IFNAR2에 대한 이의 결합 또는 이의 친화성을 감소시키는 하나 이상의 돌연변이 및 IFNAR1에 대한 결합 또는 이의 친화성을 실질적으로 감소시키거나 제거하는 하나 이상의 돌연변이를 갖는다. 일부 구현예에서, 이러한 컨센수스 인터페론 변이체를 지닌 키메라 단백질은 표적-선택적인 IFNAR2 활성(예컨대, IFNAR2 활성은 표적화 모이어티, 예컨대, SIRPα를 통한 표적화를 경유하여 회복가능하다)을 제공할 수 있다.
일부 구현예에서, 컨센수스 인터페론 변이체는 IFNAR1에 대한 이의 결합 또는 이의 친화성을 감소시키는 하나 이상의 돌연변이 및 IFNAR2에 대한 이의 결합 또는 이의 친화성을 감소시키는 하나 이상의 돌연변이를 갖는다. 일부 구현예에서, 이러한 컨센수스 인터페론 변이체를 지닌 키메라 단백질은 표적-선택적인 IFNAR1 및/또는 IFNAR2 활성(예컨대, IFNAR1 및/또는 IFNAR2 활성은 표적화 모이어티, 예컨대, SIRPα를 통한 표적화를 경유하여 회복가능하다)을 제공할 수 있다.
일부 구현예에서, 컨센수스 인터페론은 서열 번호: 50을 참고로, 145 내지 155번 위치에서의 하나 이상의 아미노산, 예를 들면, 아미노산 위치 149, 150 및/또는 154번에서 돌연변이를 갖도록 변형된다. 일부 구현예에서, 컨센수스 인터페론은 서열 번호: 50을 참고로, 145 내지 155번 위치에서 하나 이상의 아미노산, 예를 들면, 아미노산 위치 149, 150 및/또는 154번에서 돌연변이를 갖도록 변형되며, 이러한 치환은 임의로 소수성이고 알라닌, 발린, 루이신, 및 이소루이신으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 컨센수스 인터페론 돌연변이체는 M149A, R150A, 및 L154A로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 포함하며, 서열 번호: 50을 참고한다.
일 구현예에서, 컨센수스 인터페론은 서열 번호: 50을 참고로, 아미노산 위치 121에서 돌연변이(즉, K121)를 갖도록 변형된다. 일 구현예에서, 컨센수스 인터페론은 서열 번호: 50을 참고로, K121E 돌연변이를 포함한다.
다양한 구현예에서, 변형된 신호전달제는 사이토킨, 성장 인자, 및 호르몬의 변형된 버젼으로부터 선택된다. 이러한 사이토킨, 성장 인자, 및 호르몬의 예시적인 예는 림포킨, 모노킨, 전통적인 폴리펩타이드 호르몬, 예컨대, 사람 성장 호르몬, N-메티오닐 사람 성장 호르몬, 및 소 성장 호르몬; 부갑상선 호르몬; 티록신; 인슐린; 프로인슐린; 렐락신; 프로렐락신; 당단백질 호르몬, 예를 들면, 모낭 자극 호르몬(FSH); 갑상선 자극 호르몬(TSH); 및 황체형성 호르몬(LH); 간 성장 인자; 섬유아세포 성장 인자; 프롤락틴; 태반 락토겐; 종양 괴사 인자-α 및 종양 괴사 인자-β; 뮬레리안-억제 물질(mullerian-inhibiting substance); 마우스 고나도트로핀-관련 펩타이드; 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 성장 인자; 인테그린; 트롬보포이에틴(TPO); 신경 성장 인자, 예컨대, NGF-α; 혈소판-성장 인자; 형질전환 성장 인자(TGF), 예컨대, TGF-α 및 TGF-β; 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II; 골 유도 인자; 인터페론, 예를 들면, 인터페론-α, 인터페론-β 및 인터페론-γ(및 인터페론 제I형, 제II형, 및 제III형), 콜로니 자극 인자(CSF), 예컨대, 대식구-CSF(M-CSF); 과립구-대식구-CSF(GM-CSF); 및 과립구-CSF(G-CSF); 인터루킨(IL), 예를 들면, IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, 및 IL-18; 종양 괴사 인자, 예를 들면, TNF-α 또는 TNF-β; 및 다른 폴리펩타이드 인자, 예를 들면, LIF 및 키트 리간드(kit ligand: KL)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본원에 사용된 바와 같은, 사이토킨, 성장 인자, 및 호르몬은 천연 공급원으로부터 수득되거나 재조합 세균, 진균 또는 포유동물 세포 배양 시스템 및 사이토킨의 천연 서열의 생물학적으로 활성인 등가물로부터 생산된 단백질을 포함한다.
일부 구현예에서, 변형된 신호전달제는 형질전환 성장 인자(TGF), 예를 들면, TGF-α 및 TGF-β(및 TGF-β1, TGF-β2, 및 TGF-β3를 포함하는 TGF-β의 다양한 아형을 포함하는 이의 아형), 내피 성장 인자(EGF), 인슐린-유사 성장 인자, 예를 들면, 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II, 섬유아세포 성장 인자(FGF), 헤레굴린, 혈소판-유래된 성장 인자(PDGF), 혈관 내피 성장 인자(VEGF)로부터 선택되나, 이에 한정되지 않는 성장 인자의 변형된 버젼이다.
일 구현예에서, 성장 인자는 섬유아세포 성장 인자(FGF)의 변형된 버젼이다. 예시적인 FGF는 FGF1, FGF2, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9, FGF10, FGF11, FGF12, FGF13, FGF14, 쥐 FGF15, FGF16, FGF17, FGF18, FGF19, FGF20, FGF21, FGF22, 및 FGF23을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, 변형된 신호전달제는 혈관 내피 성장 인자(VEGF)이다. VEGF는 생리학적으로 뿐만 아니라 병리학적 혈관형성에서 중요한 역활을 하고, 혈관 투과능을 조절하며 VEGF 수용체를 발현하는 세포에서 성장 인자로서 작용할 수 있는 강력한 성장 인자이다. 추가의 기능은 특히 대식구 계통 및 내피 세포에서 세포 이동(migration)의 자극을 포함한다. 성장 인자의 VEGF 계열의 수개의 구성원 뿐만 아니라 적어도 3개의 수용체(VEGFR-1, VEGFR -2, 및 VEGFR-3)도 존재한다. VEGF 계열의 구성원은 하나 이상의 VEGFR 유형에 결합하여 이를 활성화시킬 수 있다. 예를 들면, VEGF-A는 VEGFR-1 및 -2에 결합하지만, VEGF-C는 VEGFR-2 및 -3에 결합할 수 있다. VEGFR-1 및 -2 활성화는 혈관형성을 조절하지만 VEGFR-3 활성화는 림프혈관형성(lymphangiogenesis)과 관련된다. 주요 전-혈관형성 신호는 VEGFR-2의 활성화로부터 생성된다. VEGFR-1 활성화는 혈관형성에서 부정적인 역활과 가능하게 관련된 것으로 보고되어 왔다. VEGFR-1 신호전달은 골수-유래된 VEGFR-1 양성 세포(골 속에서 프레전이성 자리(premetastatic niche)의 형성에 기여함)를 경유한 생체내(in vivo) 종양의 진행에 중요한 것이 또한 보고되었다. VEGF-A 지시된/중화하는 치료학적 항체를 기반으로 하는 수개의 치료요법이 주로 혈관형성에 의존하는 다양한 사람 종양의 치료시 사용하기 위해 개발되었다. 그러나 이들은 부작용이 있다. 이는 이들이 일반적으로, 비-세포/조직 특이적인 VEGF/VEGFR 상호작용 억제제로서 작동하는 것을 고려하면 놀라운 일이 아닐 수 있다. 따라서, VEGF(예컨대, VEGF-A)/VEGFR-2 억제를 특이적인 표적 세포(예컨대, 종양 혈관화 내피 세포)로 제한하는 것이 바람직할 수 있다.
일부 구현예에서, VEGF는 VEGF-A, VEGF-B, VEFG-C, VEGF-D, 또는 VEGF-E 및 VEGF-A의 다양한 동형, 예를 들면, VEGF121, VEGF121b, VEGF145, VEGF165, VEGF165b, VEGF189, 및 VEGF206을 포함하는 이의 동형이다. 일부 구현예에서, 변형된 신호전달제는 VEGFR-1(Flt-1) 및/또는 VEGFR-2(KDR/Flk-1)에 대한 감소된 친화성 및/또는 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, 변형된 신호전달제는 VEGFR-1(Flt-1) 및/또는 VEGFR-2(KDR/Flk-1)에 대해 실질적으로 감소되거나 제거된 친화성 및/또는 활성을 갖는다. 일 구현예에서, 변형된 신호전달제는 VEGFR-2(KDR/Flk-1)에 대해 감소된 친화성 및/또는 활성 및/또는 VEGFR-1(Flt-1)에 대해 실질적으로 감소되거나 제거된 친화성 및/또는 활성을 갖는다. 이러한 구현예는 예를 들면, 허혈-관련 질환(이론에 얽메이지 않고, 내피 세포 기능 및 혈관형성에 대한 VEGFR-2의 효과에 의해 매개됨)의 상처 치유 방법 또는 치료에서의 용도를 찾는다. 다양한 구현예에서, 암 및 전-염증성 활성에 연결된, VEGFR-1(Flt-1)에 대한 결합은 회피된다. 다양한 구현예에서, VEGFR-1(Flt-1)는 데코이 수용체(decoy receptor)를 작용시키므로 이러한 수용체에서 친화성을 실질적으로 감소시키거나 제거하며 치료제의 봉쇄를 피한다. 일 구현예에서, 변형된 신호전달제는 VEGFR-1(Flt-1)에 대해 실질적으로 감소되거나 제거된 친화성 및/또는 활성을 가지고/가지거나 VEGFR-2(KDR/Flk-1)에 대해 실질적으로 감소되거나 제거된 친화성 및/또는 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, VEGF는 VEGF-C 또는 VEGF-D이다. 이러한 구현예에서, 변형된 신호전달제는 VEGFR-3에 대해 감소된 친화성 및/또는 활성을 갖는다. 대안적으로, 변형된 신호전달제는 VEGFR-3에 대해 실질적으로 감소되거나 제거된 친화성 및/또는 활성을 갖는다.
전혈관형성 치료요법(proangiogenic therapy)은 또한 다양한 질환(예컨대, 허혈성 심장 질환, 출혈 등)에서 중요하며, VEGF-기반 치료요법을 포함한다. VEGFR-2의 활성화는 전혈관형성성(내피 세포에서 작용)이다. VEFGR-1의 활성화는 염증 세포(예를 들면, 대식구 포함)의 이동의 자극을 유발할 수 있으며 염증 관련된 초혈관 투과성을 초래한다. VEFGR-1의 활성화는 또한 골수 관련 종양 자리 형성(bone marrow associated tumor niche formation)을 촉진할 수 있다. 따라서, VEGFR-2 활성화에 대해 선택적인 VEGF 기반 치료요법은 이러한 경우 바람직할 수 있다. 또한, 예컨대, 내피 세포에 대한 세포 특이적인 표적화가 바람직할 수 있다.
일부 구현예에서, 변형된 신호전달제는 VEGFR-2에 대해 감소된 친화성 및/또는 활성(예컨대, 길항)을 가지고/가지거나VEGFR-1에 대해 실질적으로 감소되거나 제거된 친화성 및/또는 활성을 갖는다. 종양 내피 세포 마커(예컨대, PSMA 및 기타)에 결합하는 표적화 모이어티를 경유한 종양 혈관구조 내피 세포에 표적화되는 경우, 이러한 작제물은 이러한 마커-양성 세포에서 특이적으로 VEGFR-2 활성화를 억제하지만, 도중에 및 표적 세포(활성이 제거된 경우)에서 VEGFR-1를 활성화시키지 않으므로, 예를 들면, 염증 반응의 유도를 제거한다. 이는 VEGF-A 중화 치료요법과 비교하여 많은 종양 유형에 대해 보다 선택적이고 안정한 항-혈관형성 치료요법을 제공할 수 있다.
일부 구현예에서, 변형된 신호전달제는 VEGFR-2에 대해 감소된 친화성 및/또는 활성(예컨대, 효능성)을 가지고/가지거나 VEGFR-1에 대해 실질적으로 감소되거나 제거된 친화성 및/또는 활성을 갖는다. 혈관 내피 세포에 대한 표적화를 통해, 이러한 작제물은, 일부 구현예에서, 염증 반응의 VEGFR-1 관련 유도를 유발하지 않고, 혈관형성을 촉진한다. 따라서, 이러한 작제물은 VEGFR-2 뿐만 아니라 VEGR-1의 전신계 활성화에 의해 유발된 부작용의 실질적으로 감소된 위험을 지닌 표적화된 전혈관형성 효과를 가질 수 있다.
예시적인 구현예에서, 변형된 신호전달제는 VEGF165이며, 이는 서열 번호: 55의 아미노산 서열을 갖는다.
다른 예시적인 구현예에서, 변형된 신호전달제는 VEGF165b이고, 이는 서열 번호: 56의 아미노산 서열을 갖는다.
이러한 구현예에서, 변형된 신호전달제는 아미노산 I83번에서 돌연변이(예컨대, I83에서 치환 돌연변이, 예컨대, I83K, I83R, 또는 I83H)를 갖는다. 이론에 얽메이려는 의도없이, 이러한 돌연변이는 감소된 수용체 결합 친화성을 생성할 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 제9,078,860호를 참고하며, 이의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다.
일부 구현예에서, 변형된 신호전달제는 사람 융모성 고나도트로핀(chorionic gonadotropin), 고나도트로핀 방출 호르몬, 안드로겐, 에스트로겐, 갑상선-자극 호르몬, 모낭-자극 호르몬, 황체화 호르몬, 프롤락틴, 성장 호르몬, 부신피질자극 호르몬, 항이뇨 호르몬, 옥시토신, 갑상선자극 호르몬-방출 호르몬, 성장 호르몬 방출 호르몬, 코르티코트로핀-방출 호르몬, 소마토스타틴, 도파민, 멜라토닌, 타이록신, 칼시토닌, 부갑상선 호르몬, 글루코코르티코이드, 무기질대사코로티코이드(mineralocorticoid), 아드레날린, 노르아드레날린, 프로게스테론, 인슐린, 글루카곤, 아밀린, 칼시트리올, 칼시페롤, 심방-나트륨이뇨인자 펩타이드, 가스트린, 세크레틴, 콜레시스토키닌, 뉴로펩타이드 Y, 그렐린, PYY3-36, 인슐린-유사 성장 인자(IGF), 렙틴, 트롬보포이에틴, 에리트로포이에틴(EPO), 및 안지오텐시노겐으로부터 선택되나, 이에 한정되지 않는 호르몬의 변형된 버젼이다.
일부 구현예에서, 변형된 신호전달제는 TNF-α이다. TNF는 세포 성장, 분화, 세포자멸사, 종양형성, 바이러스 복제, 자가면역성, 면역 세포 기능 및 트래피킹(trafficking), 염증, 및 패혈성 쇼크의 조절을 포함하는, 많은 다양한 기능을 지닌 다면발현성 사이토킨이다. 이는 표적 세포 상의 2개의 명백한 막 수용체: TNFR1(p55) 및 TNFR2(p75)에 결합한다. TNFR1은 매우 광범위한 발현 패턴을 나타내지만 TNFR2는 림프구, Treg, 내피 세포, 특정의 뉴우런, 소교세포, 심장 근세포 및 간엽성 줄기 세포의 특정 집단에서 우선적으로 발현된다. 매우 명백한 생물학적 경로는 또한 일부 오버랩(overlap)이 있지만, 수용체 활성화에 대한 반응시 활성화된다. 일반적으로, 이론에 얽메이지 않고, TNFR1 신호전달은 세포자멸사(세포 사멸)의 유도와 관련되며 TNFR2 신호전달은 세포 생존 신호의 활성화(예컨대, NFkB 경로의 활성화)와 관련된다. TNF의 투여는 전신계적으로 독성이며, 이는 TNFR1 맞물림(engagement)에 주로 기인한다. 그러나, TNFR2의 활성화는 광범위한 활성과 관련되며, TNFR1과 관련하여, TNF 기반 치료제를 개발하는 맥락에서, TNF 표적화 및 활성에 걸친 제어가 중요하다.
일부 구현예에서, 변형된 신호전달제는 TNFR1 및/또는 TNFR2에 대해 감소된 친화성 및/또는 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, 변형된 신호전달제는 TNFR1 및/또는 TNFR2에 대한 실질적으로 감소되거나 제거된 친화성 및/또는 활성을 갖는다. TNFR1은 대부분의 조직 속에서 발현되며, 세포 사멸 신호전달에 관련되지만, 대조적으로, TNFR2는 세포 생존 신호전달에 관련된다. 따라서, 암을 치료하는 방법과 관련된 구현예에서, 변형된 신호전달제는 TNFR1에 대해 감소된 친화성 및/또는 활성을 갖고/갖거나 TNFR2에 대해 실질적으로 감소되거나 제거된 친화성 및/또는 활성을 갖는다. 이러한 구현예에서, 키메라 단백질은 이에 대한 세포자멸사가 요구되는 세포, 예컨대, 종양 세포 또는 종양 혈관조직 내피 세포에 대해 표적화될 수 있다. 예를 들면, 신경변성 장애의 치료를 위한 신경생성에서, 세포 생존을 촉진하는 방법에 관한 구현예에서, 변형된 신호전달제는 TNFR2에 대해 감소된 친화성 및/또는 활성 및/또는 TNFR1에 대해 실질적으로 감소되거나 제거된 친화성 및/또는 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, 기술된 다른 방식의, 본 키메라 단백질은, 사멸 또는 생존 신호의 선호를 허용하는 변형된 TNF-α 제제를 포함한다.
일부 구현예에서, 키메라 단백질은 TNFR1에 대한 감소된 친화성 및/또는 활성을 갖고/갖거나 TNFR2에 대한 실질적으로 감소되거나 제거된 친화성 및/또는 활성을 갖는 변형된 TNF를 갖는다. 일부 구현예에서, 이러한 키메라는 야생형 TNF와 비교하여 세포자멸사의 보다 강력한 유도인자 및/또는 TNFR1에 대한 감소된 친화성 및/또는 활성을 유발하는 돌연변이(들) 만을 지닌 키메라이다. 일부 구현예에서, 이러한 키메라는 종양 세포 사멸 또는 종양 혈관조직 내피 세포 사멸(예컨대, 암의 치료시)을 유도하는데 있어서의 용도를 발견한다. 또한, 일부 구현예에서, 이러한 키메라는 TNFR2를 경유한 Treg 세포의 활성화를 피하거나 감소시키므로, 생체내에서 TNFR1-매개된 항종양 활성을 추가로 뒷받침한다.
일부 구현예에서, 키메라 단백질은 TNFR2에 대한 감소된 친화성 및/또는 활성을 갖고/갖거나 TNFR1에 대한 실질적으로 감소되거나 제거된 친화성 및/또는 활성을 갖는 변형된 TNF를 갖는다. 일부 구현예에서, 이러한 키메라는 일부 세포형에서 세포 생존의 보다 강력한 활성인자이며, 이는 제한없이, 신경형성의 자극을 포함하는, 다양한 질환 설정에서 구체적인 치료학적 목적일 수 있다. 또한, 이러한 TNFR2-선호 키메라는 또한 자가면역 질환(예컨대, 크론(Crohn's), 당뇨병, MS, 결장염 등 및 본원에 기술된 많은 다른 것)의 치료에 유용하다. 일부 구현예에서, 키메라는 자가-반응성 T 세포에 대해 표적화된다. 일부 구현예에서, 키메라는 Treg 세포 활성화 및 세포독성 T 세포의 간접적인 억제를 촉진한다.
일부 구현예에서, 키메라는 예컨대, TNFR2의 활성화 및/또는 회피 TNFR1(예컨대, TNFR2에 대한 감소된 친화성 및/또는 활성을 갖는 변형된 TNF 및/또는 TNFR1에 대한 실질적으로 감소되거나 제거된 친화성 및/또는 활성)에 의해, 자가-반응성 T 세포의 사멸을 유발한다. 이론에 얽메이지 않고, 이러한 자가-반응성 T 세포는 예컨대, NFkB 경로 활성/신호전달 변경에 의해 변경된 이들의 세포자멸사/생존 신호를 갖는다. 일부 구현예에서, 키메라는 NFκB 경로에서 병변 또는 변형을 갖는 자가반응성 T 세포의 사멸을 유발하며, 이는 이들의 세포 사멸(세포자멸사)/생존 신호전달 특성 및, 임의로, 특정의 사멸-유도 신호(예컨대, TNFR2 활성화)에 대한 변경된 민감성의 불균형에 기저를 이룬다.
일부 구현예에서, TNFR-2 기반 키메라는 특히 자가면역 질환, 다양한 심장 질환, 탈-수초화 및 신경변성 장애, 및 감염성 질환을 포함하는, 질환에서 추가의 치료학적 적용을 갖는다.
일 구현예에서, 야생형 TNF-α는 서열 번호: 57의 아미노산 서열을 갖는다.
이러한 구현예에서, 변형된 TNF-α 제제는 감소된 수용체 결합 친화성을 지닌 변형된 TNF-α를 생산하는 하나 이상의 아미노산 위치 29, 31, 32, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 145, 146 및 147번에서 돌연변이를 갖는다. 예를 들면, 미국 특허 제7,993,636호를 참고하며, 이의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다.
일부 구현예에서, 변형된 사람 TNF-α 모이어티는 예를 들면, 제WO/2015/007903호에 기술된 바와 같이 하나 이상의 아미노산 위치 R32, N34, Q67, H73, L75, T77, S86, Y87, V91, I97, T105, P106, A109, P113, Y115, E127, N137, D143, A145, 및 E146에서 돌연변이를 가지며, 상기의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다(사람 TNF 서열에 따른 번호매김, 진뱅크(Genbank) 수탁 번호 BAG70306, 버젼 BAG70306.1 Gl: 197692685). 일부 구현예에서, 변형된 사람 TNF-α 모이어티는 L29S, R32G, R32W, N34G, Q67G, H73G, L75G, L75A, L75S, T77A, S86G, S86T, Y87Q, Y87L, Y87A, Y87F, Y87H, V91G, V91A, I97A, I97Q, I97S, T105G, P106G, A109Y, P113G, Y115G, Y115A, E127G, N137G, D143N, A145G, A145R, A145T, E146D, E146K, 및 S147D로부터 선택된 치환 돌연변이를 갖는다. 일부 구현예에서, 사람 TNF-α 모이어티는 Y87Q, Y87L, Y87A, Y87F, 및 Y87H로부터 선택된 돌연변이를 갖는다. 다른 구현예에서, 사람 TNF-α 모이어티는 I97A, I97Q, 및 I97S로부터 선택된 돌연변이를 갖는다. 추가의 구현예에서, 사람 TNF-α 모이어티는 Y115A 및 Y115G로부터 선택된 돌연변이를 갖는다. 일부 구현예에서, 사람 TNF-α 모이어티는 E146K 돌연변이를 갖는다. 일부 구현예에서, 사람 TNF-α 모이어티는 Y87H 및 E146K 돌연변이를 갖는다. 일부 구현예에서, 사람 TNF-α 모이어티는 Y87H 및 A145R 돌연변이를 갖는다. 일부 구현예에서, 사람 TNF-α 모이어티는 R32W 및 S86T 돌연변이를 갖는다. 일부 구현예에서, 사람 TNF-α 모이어티는 R32W 및 E146K 돌연변이를 갖는다. 일부 구현예에서, 사람 TNF-α 모이어티는 L29S 및 R32W 돌연변이를 갖는다. 일부 구현예에서, 사람 TNF-α 모이어티는 D143N 및 A145R 돌연변이를 갖는다. 일부 구현예에서, 사람 TNF-α 모이어티는 D143N 및 A145R 돌연변이를 갖는다. 일부 구현예에서, 사람 TNF-α 모이어티는 A145T, E146D, 및 S147D 돌연변이를 갖는다. 일부 구현예에서, 사람 TNF-α 모이어티는 A145T 및 S147D 돌연변이를 갖는다.
일부 구현예에서, 변형된 TNF-α 제제는 제WO2008/124086호에 기술된 바와 같은 N39Y, S147Y, 및 Y87H로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 가지며, 이의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다.
일부 구현예에서, 변형된 사람 TNF-α 모이어티는 제PCT/IB2016/001668호에 기술된 바와 같은 수용체 선택성을 제공하는 돌연변이를 가지며, 이의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다. 일부 구현예에서, TNF에 대한 돌연변이는 TNF-R1 선택성이다. 일부 구현예에서, TNF-R1 선택성인 TNF에 대한 돌연변이는 R32, S86, 및 E146 위치 중 하나 이상에 있다. 일부 구현예에서, TNF-R1 선택성인 TNF에 대한 돌연변이는 R32W, S86T, 및 E146K 중 하나 이상이다. 일부 구현예에서, TNF-R1 선택성인 TNF에 대한 돌연변이는 R32W, R32W/S86T, R32W/E146K 및 E146K 중 하나 이상이다. 일부 구현예에서, TNF에 대한 돌연변이는 TNF-R2 선택성이다. 일부 구현예에서, TNF-R2 선택성인 TNF에 대한 돌연변이는 A145, E146, 및 S147 위치 중 하나 이상이다. 일부 구현예에서, TNF-R2 선택성인 TNF에 대한 돌연변이는 A145T, A145R, E146D, 및 S147D 중 하나 이상이다. 일부 구현예에서, TNF-R2 선택성인 TNF에 대한 돌연변이는 A145R, A145T/S147D, 및 A145T/E146D/S147D 중 하나 이상이다.
일 구현예에서, 변형된 신호전달제는 TNF-β이다. TNF-β는 LT-β(LT-α1β2)를 지닌 동형삼량체(homotrimer) 또는 이종삼량체(heterotrimer)를 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 변형된 신호전달제는 TNFR1 및/또는 TNFR2 및/또는 헤르페스 바이러스 도입 매개인자(HEVM) 및/또는 LT-βR에 대해 실질적으로 감소되거나 제거된 친화성 및/또는 활성을 갖는다.
일 구현예에서, 야생형 TNF-β는 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 갖는다.
이러한 구현예에서, 변형된 TNF-β 제제는 106 내지 113번 위치에서의 하나 이상의 아미노산에서 돌연변이를 포함할 수 있으며, 이는 TNFR2에 대해 감소된 수용체 결합 친화성을 지닌 변형된 TNF-β를 생산한다. 일 구현예에서, 변형된 신호전달제는 106 내지 113번 아미노산 위치에서 하나 이상의 치환 돌연변이를 갖는다. 예시적인 구현예에서, 치환 돌연변이는 Q107E, Q107D, S106E, S106D, Q107R, Q107N, Q107E/S106E, Q107E/S106D, Q107D/S106E, 및 Q107D/S106D로부터 선택된다. 다른 구현예에서, 변형된 신호전달제는 106 내지 113번 위치에서 약 1 내지 약 3개의 아미노산의 삽입을 갖는다.
일부 구현예에서, 변형된 제제는 제WO 2015/007903호 및 제PCT/IB2016/001668호에 기술된 바와 같은 단일 쇄 삼량체 버젼일 수 있는 TNF 계열 구성원(예컨대, TNF-알파, TNF-베타)이며, 이의 전체 내용은 참고로 포함된다.
일부 구현예에서, 변형된 제제는 TNFR1에서 감소된 친화성 및/또는 활성, 즉, 길항 활성(예컨대, 하나 이상의 돌연변이의 결과인 천연 길항 활성 또는 길항 활성, 참고: 예컨대, 제WO 2015/007520호, 이의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다)을 갖는 TNF 계열 구성원(예컨대, TNF-알파, TNF-베타)이다. 이러한 구현예에서, 변형된 제제는 또한 TNFR2에 대해 또한, 임의로 실질적으로 감소되거나 제거된 친화성 및/또는 활성을 갖는 TNF 계열 구성원(예컨대, TNF-알파, TNF-베타)이다. 일부 구현예에서, 변형된 제제는 TNFR2에서 감소된 친화성 및/또는 활성, 즉, 길항 활성(예컨대, 하나 이상의 돌연변이의 결과인 천연 길항 활성 또는 길항 활성, 참고: 예컨대, 제WO 2015/007520호, 이의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다)을 갖는 TNF 계열 구성원(예컨대, TNF-알파, TNF-베타)이다. 이러한 구현예에서, 변형된 제제는 또한 임의로, TNFR1에 대해 실질적으로 감소되거나 제거된 친화성 및/또는 활성을 갖는 TNF 계열 구성원(예컨대, TNF-알파, TNF-베타)이다. 이러한 구현예의 작제물은 예를 들면, 세포 특이적인 방식으로 TNF 반응을 약화시키는 방법에서의 용도가 발견된다. 일부 구현예에서, 길항 TNF 계열 구성원(예컨대, TNF-알파, TNF-베타)은 제WO 2015/007903호에 기술된 바와 같은 단일 쇄 삼량체 버젼이다.
일 구현예에서, 변형된 신호전달제는 TRAIL이다. 일부 구현예에서, 변형된 TRAIL 제제는 DR4(TRAIL-RI) 및/또는 DR5(TRAIL-RII) 및/또는 DcR1 및/또는 DcR2에 대해 감소된 친화성 및/또는 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, 변형된 TRAIL 제제는 DR4(TRAIL-RI) 및/또는 DR5(TRAIL-RII) 및/또는 DcR1 및/또는 DcR2에 대해 실질적으로 감소되거나 제거된 친화성 및/또는 활성을 갖는다.
일 구현예에서, 야생형 TRAIL은 서열 번호: 59의 아미노산 서열을 갖는다.
이러한 구현예에서, 변형된 TRAIL 제제는 아미노산 위치 T127-R132, E144-R149, E155-H161, Y189-Y209, T214-1220, K224-A226, W231, E236-L239, E249-K251, T261-H264 및 H270-E271(사람 서열을 기반으로 한 번호매김, 진뱅크(Genbank) 수탁 번호 제NP _003801호, 버젼 10 NP _003801.1, Gl: 4507593; 상기 참고)에서 돌연변이를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 변형된 TRAIL 제제는 TRAIL-R1에 대해 이의 친화성 및/또는 활성을 실질적으로 감소시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 이러한 구현예에서, 변형된 TRAIL 제제는 TRIL-R2에 특이적으로 결합할 수 있다. 예시적인 돌연변이는 하나 이상의 아미노산 위치 Y189, R191, Q193, H264, I266, 및 D267에서 돌연변이를 포함한다. 예를 들면, 돌연변이는 Y189Q, R191K, Q193R, H264R, I266L 및 D267Q 중 하나 이상일 수 있다. 일 구현예에서, 변형된 TRAIL 제제는 돌연변이 Y189Q, R191K, Q193R, H264R, I266L 및 D267Q를 포함한다.
일부 구현예에서, 변형된 TRAIL 제제는 TRAIL-R2에 대해 이의 친화성 및/또는 활성을 실질적으로 감소시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 이러한 구현예에서, 변형된 TRAIL 제제는 TRIL-R1에 특이적으로 결합할 수 있다. 예시적인 돌연변이는 하나 이상의 아미노산 위치 G131, R149, S159, N199, K201, 및 S215에서 돌연변이를 포함한다. 예를 들면, 돌연변이는 G131R, R149I, S159R, N199R, K201H, 및 S215D 중 하나 이상일 수 있다. 일 구현예에서, 변형된 TRAIL 제제는 돌연변이 G131R, R149I, S159R, N199R, K201H, 및 S215D를 포함한다. 추가의 TRAIL 돌연변이는 예를 들면, Trebing et al.,(2014) Cell Death 및 Disease, 5:e1035에 기술되어 있으며, 이의 전체 개시내용은 본원에 참고로 포함된다.
일 구현예에서, 변형된 신호전달제는 TGFα이다. 이러한 구현예에서, 변형된 TGFα 제제는 상피 성장 인자 수용체(EGFR)에 대해 감소된 친화성 및/또는 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, 변형된 TGFα 제제는 상피 성장 인자 수용체(EGFR)에 대해 실질적으로 감소되거나 제거된 친화성 및/또는 활성을 갖는다.
일 구현예에서, 변형된 신호전달제는 TGFβ이다. 이러한 구현예에서, 변형된 신호전달제는 TGFBR1 및/또는 TGFBR2에 대해 감소된 친화성 및/또는 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, 변형된 신호전달제는 TGFBR1 및/또는 TGFBR2에 대해 실질적으로 감소되거나 제거된 친화성 및/또는 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, 변형된 신호전달제는 임의로, 이론에 얽메이지 않고, TGF-베타 수용체에 대한 리간드의 저장기로서 작용할 수 있는, TGFBR3에 대해 감소되거나 실질적으로 감소되거나 제거된 친화성 및/또는 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, TGFβ는 TGFBR2보다 TGFBR1를 또는 TGFBR1보다 TGFBR2를 선호할 수 있다. 유사하게, LAP는, 이론에 얽메이지 않고, TGF-베타 수용체에 대한 리간드의 저장기로서 작용할 수 있다. 일부 구현예에서, 변형된 신호전달제는 TGFBR1 및/또는 TGFBR2에 대해 감소된 친화성 및/또는 활성 및/또는 잠복기 관련 펩타이드(Latency Associated Peptide: LAP)에 대해 실질적으로 감소되거나 제거된 친화성 및/또는 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, 이러한 키메라는 카무라티-엥겔만병(Camurati-Engelmann disease), 또는 부적절한 TGFβ 신호전달과 관련된 다른 질환에서의 용도가 발견된다.
일부 구현예에서, 변형된 제제는 하나 이상의 TGFBR1, TGFBR2, TGFBR3에서 감소된 친화성 및/또는 활성, 즉, 길항 활성(예컨대, 하나 이상의 돌연변이의 결과인 천연 길항 활성 또는 길항 활성, 참고: 예컨대, 제WO 2015/007520호, 이의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다)을 갖는 TGF 계열 구성원(예컨대, TGFα, TGFβ)이다. 이러한 구현예에서, 변형된 제제는 또한, 임의로, 하나 이상의 TGFBR1, TGFBR2, TGFBR3에서 실질적으로 감소되거나 제거된 친화성 및/또는 활성을 갖는, TGF 계열 구성원(예컨대, TGFα, TGFβ)이다.
일부 구현예에서, 변형된 제제는 TGFBR1 및/또는 TGFBR2에서 감소된 친화성 및/또는 활성, 즉, 길항 활성(예컨대, 하나 이상의 돌연변이의 결과인 천연 길항 활성 또는 길항 활성, 참고: 예컨대, 제WO 2015/007520호, 이의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다)을 갖는 TGF 계열 구성원(예컨대, TGFα, TGFβ)이다. 이러한 구현예에서, 변형된 제제는 또한 임의로, TGFBR3에서 실질적으로 감소되거나 제거된 친화성 및/또는 활성을 갖는 TGF 계열 구성원(예컨대, TGFα, TGFβ)이다.
일 구현예에서, 변형된 신호전달제는 인터루킨이다. 일 구현예에서, 변형된 신호전달제는 IL-1이다. 일 구현예에서, 변형된 신호전달제는 IL-1α 또는 IL-1β이다. 일부 구현예에서, 변형된 신호전달제는 IL-1R1 및/또는 IL-1RAcP에 대하여 감소된 친화성 및/또는 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, 변형된 신호전달제는 IL-1R1 및/또는 IL-1RAcP에 대해 실질적으로 감소되거나 제거된 친화성 및/또는 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, 변형된 신호전달제는 IL-1R2에 대해 감소된 친화성 및/또는 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, 변형된 신호전달제는 IL-1R2에 대해 실질적으로 감소되거나 제거된 친화성 및/또는 활성을 갖는다. 예를 들면, 일부 구현예에서, 본 변형된 IL-1 제제는 IL-1R2에서 상호작용을 피하므로 실질적으로 치료제에 대한 데코이(decoy) 및/또는 싱크(sink)로서의 이의 기능을 실질적으로 감소시킨다.
일 구현예에서, 야생형 IL-1β는 서열 번호: 60의 아미노산 서열을 갖는다.
IL1은 전염증성 사이토킨 및 중요한 면역계 조절인자이다. 이는 CD4 T 세포 반응의 강력한 활성인자이며, Th17 세포의 비율 및 IFNγ 및 IL-4 생산 세포의 확장을 증가시킨다. IL-1은 또한 CD8+ T 세포의 강력한 조절인자이며, 항원-특이적인 CD8+ T 세포 확장, 분화, 말초로의 이동 및 기억을 향상시킨다. IL-1 수용체는 IL-1R1 및 IL-1R2를 포함한다. IL-1R1에 대한 결합 및 이를 통한 신호전달은 이에 의해 IL-1이 많은 이의 생물학적(및 병리학적) 활성을 매개하는 메카니즘을 구성한다. IL1-R2는 데코이 수용체로서 기능함으로써, IL-1R1을 통한 상호작용 및 신호전달에 대한 IL-1 이용능을 감소시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 변형된 IL-1은 IL-1R1에 대해 감소된 친화성 및/또는 활성(예컨대, 효능 활성)을 갖는다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-1은 IL-1R2에 대한 실질적으로 감소되거나 제거된 친화성 및/또는 활성을 갖는다. 이러한 구현예에서, 회복가능한 IL-1/IL-1R1 신호전달 및 IL-R2에서 치료학적 키메라의 손실의 예방 및 따라서 필요한(예컨대, 야생형 또는 IL-R1에 대한 약화 돌연변이만을 지닌 키메라에 비해) IL-1의 용량에서의 감소가 존재한다. 이러한 작제물은 예를 들면, 면역계를 자극하여 항암 반응을 증가시킴을 포함하는, 예를 들면, 암을 치료하는 방법에서의 용도가 발견된다.
일부 구현예에서, 변형된 IL-1은 IL-1R1에 대해 감소된 친화성 및/또는 활성(예컨대, 길항 활성, 예컨대, 하나 이상의 돌연변이의 결과인 천연 길항 활성 또는 길항 활성, 참고: 예컨대, 제WO 2015/007520호, 이의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다)을 갖는다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-1는 IL-1R2에 대해 실질적으로 감소되거나 제거된 친화성 및/또는 활성을 갖는다. 이러한 구현예에서, 변형된 IL-1은 IL-1R2에 대해 실질적으로 감소되거나 제거된 친화성 및/또는 활성을 갖는다. 이러한 구현예에서, 회복가능하지 않은 IL-1/IL-1R1 신호전달 및 IL-R2에서 치료학적 키메라의 손실의 방지 및 따라서 요구되는 IL-1의 용량에 있어서의 감소(야생형 또는 IL-R1에 대해 약화 돌연변이만을 지닌 키메라에 대해)가 존재한다. 이러한 작제물은 예를 들면, 면역계를 억제함을 포함하는, 예를 들면, 자가면역 질환의 치료 방법에서의 용도가 발견된다.
이러한 구현예에서, 변형된 신호전달제는 제I형 IL-1R에 대해 감소된 결합 친화성 및 감소된 생물학적 활성을 지닌 변형된 사람 IL-1β를 생산하는 아미노산 52 내지 54번의 결실을 갖는다. 참고: 예를 들면, 이의 전체 내용이 본원에 참고로 포함된, WO 1994/000491. 일부 구현예에서, 변형된 사람 IL-1β는 예를 들면, 제WO2015/007542호 및 제WO/2015/007536호에 기술된 바와 같이, IL-1R에 감소된 결합을 나타내는, A117G/P118G, R120X, L122A, T125G/L126G, R127G, Q130X, Q131G, K132A, S137G/Q138Y, L145G, H146X, L145A/L147A, Q148X, Q148G/Q150G, Q150G/D151A, M152G, F162A, F162A/Q164E, F166A, Q164E/E167K, N169G/D170G, I172A, V174A, K208E, K209X, K209A/K210A, K219X, E221X, E221 S/N224A, N224S/K225S, E244K, N245Q(여기서 X는 아미노산내 임의의 변화, 예컨대, 비-보존적 변화일 수 있다)로부터 선택된 하나 이상의 치환 돌연변이를 가지며, 상기 공보의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다(사람 IL-1β 서열을 기반으로 하는 번호매김, 진뱅크 수탁 번호 제NP_000567호, 버젼 NP-000567.1 , Gl: 10835145). 일부 구현예에서, 변형된 사람 IL-1β는 R120A, R120G, Q130A, Q130W, H146A, H146G, H146E, H146N, H146R, Q148E, Q148G, Q148L, K209A, K209D, K219S, K219Q, E221S 및 E221K로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 가질 수 있다. 일 구현예에서, 변형된 사람 IL-1β는 돌연변이 Q131G 및 Q148G를 포함한다. 일 구현예에서, 변형된 사람 IL-1β는 돌연변이 Q148G 및 K208E를 포함한다. 일 구현예에서, 변형된 사람 IL-1β는 돌연변이 R120G 및 Q131G를 포함한다. 일 구현예에서, 변형된 사람 IL-1β는 돌연변이 R120G 및 H146A를 포함한다. 일 구현예에서, 변형된 사람 IL-1β는 돌연변이 R120G 및 H146N을 포함한다. 일 구현예에서, 변형된 사람 IL-1β는 돌연변이 R120G 및 H146R을 포함한다. 일 구현예에서, 변형된 사람 IL-1β는 돌연변이 R120G 및 H146E를 포함한다. 일 구현예에서, 변형된 사람 IL-1β는 돌연변이 R120G 및 H146G를 포함한다. 일 구현예에서, 변형된 사람 IL-1β는 돌연변이 R120G 및 K208E를 포함한다. 일 구현예에서, 변형된 사람 IL-1β는 돌연변이 R120G, F162A, 및 Q164E를 포함한다.
일 구현예에서, 변형된 신호전달제는 IL-2이다. 이러한 구현예에서, 변형된 신호전달제는 IL-2Rα 및/또는 IL-2Rβ 및/또는 IL-2Rγ에 대해 감소된 친화성 및/또는 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, 변형된 신호전달제는 IL-2Rβ 및/또는 IL-2Rγ에 대해 감소된 친화성 및/또는 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, 변형된 신호전달제는 IL-2Rα에 대해 실질적으로 감소되거나 제거된 친화성 및/또는 활성을 갖는다. 이러한 구현예는 예를 들면, 변형된 IL-2가 IL-2Rβ 및/또는 IL-2Rγ에 대해 효능성인 경우, 암의 치료와 관련될 수 있다. 예를 들면, 본 작제물은 CD8+ T 세포(이는 항암 효과를 제공할 수 있다)의 약화된 활성화를 선호할 수 있으며, 이는 IL2 수용체 β 및 γ를 가지며 Tregs(이는 면역 억제성, 전-종양 효과(pro-tumor effect)를 제공할 수 있다)를 선호하지 않고, 이는 IL2 수용체 α, β 및 γ를 갖는다. 또한, 일부 구현예에서, IL-2Rα에 비한 IL-2Rβ 및/또는 IL-2Rγ에 대한 선호도는 폐 부종과 같은 IL-2 부작용을 피한다. 또한, IL-2-기반 키메라는 예를 들면, 변형된 IL-2가 IL-2Rβ 및/또는 IL-2Rγ에서 길항성(예컨대, 하나 이상의 돌연변이의 결과인 천연 길항 활성 또는 길항 활성, 참고: 예컨대, 제WO 2015/007520호, 이의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다)인 경우, 질환(예컨대, 자가면역 질환)의 치료에 유용하다. 예를 들면, 본 작제물은 CD8+ T 세포의 약화된 억제(및 따라서 면역 반응의 약화)를 선호할 수 있으며, 이는 IL2 수용체 β 및 γ를 가지며 IL2 수용체 α, β 및 γ를 갖는 Tregs를 선호하지 않는다. 대안적으로, 일부 구현예에서, IL-2를 지닌 키메라는 Tregs의 활성화 및 따라서 면역 억제, 및 CD8+ T 세포의 비선호의 활성화를 선호한다. 예를 들면, 이러한 작제물은 질환 또는 면역 억제로부터 유리할 수 있는 질환, 예컨대, 자가면역 장애의 치료에서 용도가 발견된다.
일부 구현예에서, 키메라 단백질은 CD8+ T 세포에 대해 지시된 본원에 기술된 바와 같은 표적화 모이어티 뿐만 아니라 IL-2Rβ 및/또는 IL-2Rγ에 대한 감소된 친화성 및/또는 활성 및/또는 IL-2Rα에 대해 실질적으로 감소되거나 제거된 친화성 및/또는 활성을 갖는 변형된 IL-2 제제도 갖는다. 일부 구현예에서, 이러한 작제물은 표적화된 CD8+ T 세포 활성을 제공하고 Treg 세포에 대해 일반적으로 비활성이다(또는 실질적으로 감소된 활성을 갖는다). 일부 구현예에서, 이러한 작제물은 야생형 IL-2(예컨대, 이론에 얽메이지 않고, Tregs를 자극하지 않음으로써)와 비교하여 향상된 면역 자극 효과를 갖지만, IL-2와 관련된 전신계 독성을 제거하거나 감소시킨다.
일 구현예에서, 야생형 IL-2는 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 갖는다.
이러한 구현예에서, 변형된 IL-2 제제는 아미노산 L72(L72G, L72A, L72S, L72T, L72Q, L72E, L72N, L72D, L72R, 또는 L72K), F42(F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R, 또는 F42K) 및 Y45(Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R 또는 Y45K)에서 하나 이상의 돌연변이를 갖는다. 이론에 얽메이지 않고, 이러한 변형된 IL-2 제제는 고-친화성 IL-2 수용체에 대해 감소된 친화성을 가지며 야생형 IL-2와 비교하여, 중간-친화성 IL-2 수용체에 대한 친화성을 보존한다. 참고: 예를 들면, 미국 특허 공보 제2012/0244112호, 이의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다.
일부 구현예에서, 변형된 IL-2 제제는 아미노산 R38, F42, Y45, 및 E62에서 하나 이상의 돌연변이를 갖는다. 예를 들면, 변형된 IL-2 제제는 R38A, F42A, Y45A, 및 E62A 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-2 제제는 C125에서 돌연변이를 포함할 수 있다. 예를 들면, 돌연변이는 C125S일 수 있다. 이러한 구현예에서, 변형된 IL-2 제제는 예를 들면, 이의 전체 개시내용이 본원에 참고로 포함된, Carmenate et al.(2013) The Journal of Immunology, 190:6230-6238에 기술된 바와 같이, IL-2Rα에 대해 실질적으로 감소된 친화성 및/또는 활성을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, R38, F42, Y45, 및/또는 E62에서 돌연변이를 지닌 변형된 IL-2 제제는 CD8+ T 세포 및 NK 세포를 포함하지만 Treg 세포를 포함하지 않는 효과기 세포의 확장을 유도할 수 있다. 일부 구현예에서, R38, F42, Y45, 및/또는 E62에서 돌연변이를 지닌 변형된 IL-2 제제는 야생형 IL-2 제제보다 독성이 더 적다. IL-2Rα에 대해 실질적으로 감소된 친화성 및/또는 활성을 지닌 변형된 IL-2 제제를 포함하는 키메라 단백질은 예를 들면, 종양학에서의 응용이 발견될 수 있다.
다른 구현예에서, 변형된 IL-2 제제는 예를 들면, 이의 전체 개시내용이 본원에 참고로 포함된, 제WO2016/025385호에 기술된 바와 같은, IL-2Rβ에 대해 실질적으로 감소된 친화성 및/또는 활성을 가질 수 있다. 이러한 구현예에서, 변형된 IL-2 제제는 Treg 세포의 확장을 유도할 수 있지만 CD8+ T 세포 및 NK 세포와 같은 효과기 세포의 확장은 유도하지 않을 수 있다. IL-2Rβ에 대해 실질적으로 감소된 친화성 및/또는 활성을 지닌 변형된 IL-2 제제를 포함하는 키메라 단백질은 예를 들면, 자가면역 질환의 치료시 응용을 발견할 수 있다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-2 제제는 아미노산 N88, D20, 및/또는 A126에서 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 예를 들면, 변형된 IL-2 제제는 하나 이상의 N88R, N88I, N88G, D20H, Q126L, 및 Q126F를 포함할 수 있다.
다양한 구현예에서, 변형된 IL-2 제제는 D109 또는 C125에서 돌연변이를 포함할 수 있다. 예를 들면, 돌연변이는 D109C 또는 C125S일 수 있다. 일부 구현예에서, D109 또는 C125에서 돌연변이를 지닌 변형된 IL-2는 PEG 모이어티에 대한 부착을 위해 활용될 수 있다.
일 구현예에서, 변형된 신호전달제는 IL-3이다. 일부 구현예에서, 변형된 신호전달제는 IL-3 수용체에 대해 감소된 친화성 및/또는 활성을 가지며, 이는 일반적인 베타(베타 c 또는 CD131) 소단위와 쌍을 이룬 유일한 알파 쇄를 지닌 이종이량체이다. 일부 구현예에서, 변형된 신호전달제는 IL-3 수용체에 대해 실질적으로 감소되거나 제거된 친화성 및/또는 활성을 가지며, 이는 일반적인 베타(베타 c 또는 CD131) 소단위와 쌍을 이룬 유일한 알파 쇄를 지닌 이종이량체이다.
일 구현예에서, 변형된 신호전달제는 IL-4이다. 이러한 구현예에서, 변형된 신호전달제는 제1형 및/또는 제2형 IL-4 수용체에 대해 감소된 친화성 및/또는 활성을 갖는다. 이러한 구현예에서, 변형된 신호전달제는 제1형 및/또는 제2형 IL-4 수용체에 대해 실질적으로 감소되거나 제거된 친화성 및/또는 활성을 갖는다. 제1형 IL-4 수용체는 일반적인 γ쇄를 지닌 IL-4Rα 소단위로 구성되며 IL-4에 특이적으로 결합한다. 제2형 IL-4 수용체는 IL-13Rα1으로서 알려진 상이한 소단위에 결합한 IL-4Rα를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 신호전달제는 제2형 IL-4 수용체에 대해 실질적으로 감소되거나 제거된 친화성 및/또는 활성을 갖는다.
일 구현예에서, 야생형 IL-4는 서열 번호: 62의 아미노산 서열을 갖는다.
이러한 구현예에서, 변형된 IL-4 제제는 아미노산 R121(R121A, R121D, R121E, R121F, R121H, R121I, R121K, R121N, R121P, R121T, R121W), E122(E122F), Y124(Y124A, Y124Q, Y124R, Y124S, Y124T) 및 S125(S125A)에서 하나 이상의 돌연변이를 갖는다. 이론에 얽메이지 않고, 이러한 변형된 IL-4 제제는 제1형 수용체에 의해 매개된 활성을 유지하지만 다른 수용체에 의해 매개된 생물학적 활성을 유의적으로 감소시키는 것으로 여겨진다. 참고: 예를 들면, 이의 전체 내용이 본원에 참고로 포함된 미국 특허 제6,433,157호.
일 구현예에서, 변형된 신호전달제는 IL-6이다. IL-6은 리간드-결합 IL-6R 쇄(CD126), 및 신호-변환 성분 gp130을 포함하는 세포-표면 제I형 사이토킨 수용체 복합체를 통해 신호전달한다. IL-6은 또한 가용성 형태의 IL-6R(sIL-6R)에 결합할 수 있으며, 이는 IL-6R의 세포외 부위이다. sIL-6R/IL-6 복합체는 뉴우런의 신경돌기 성장(outgrowth) 및 및 생존에 관여할 수 있으므로, 재수초형성을 통한 신경 재생시 중요할 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 변형된 신호전달제는 IL-6R/gp130 및/또는 sIL-6R에 대해 감소된 친화성 및/또는 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, 변형된 신호전달제는 IL-6R/gp130 및/또는 sIL-6R에 대해 실질적으로 감소되거나 제거된 친화성 및/또는 활성을 갖는다.
일 구현예에서, 야생형 IL-6은 서열 번호: 63의 아미노산 서열을 갖는다.
이러한 구현예에서, 변형된 신호전달제는 아미노산 58, 160, 163, 171 또는 177에서 하나 이상의 돌연변이를 갖는다. 이론에 얽메이지 않고, 이러한 변형된 IL-6 제제는 IL-6R알파에 대해 감소된 결합 친화성 및 감소된 생물학적 활성을 나타낸다. 참고: 예를 들면, 이의 전체내용이 본원에 참고로 포함된 제WO 97/10338호.
일 구현예에서, 변형된 신호전달제는 IL-10이다. 이러한 구현예에서, 변형된 신호전달제는 IL-10 수용체-1 및 IL-10 수용체-2에 대해 감소된 친화성 및/또는 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, 변형된 신호전달제는 IL-10 수용체-1 및 IL-10 수용체-2에 대해 실질적으로 감소되거나 제거된 친화성 및/또는 활성을 갖는다.
일 구현예에서, 변형된 신호전달제는 IL-11이다. 이러한 구현예에서, 변형된 신호전달제는 IL-11Rα 및/또는 IL-11Rβ 및/또는 gp130에 대해 감소된 친화성 및/또는 활성을 갖는다. 이러한 구현예에서, 변형된 신호전달제는 IL-11Rα 및/또는 IL-11Rβ 및/또는 gp130에 대해 실질적으로 감소되거나 제거된 친화성 및/또는 활성을 갖는다.
일 구현예에서, 변형된 신호전달제는 IL-12이다. 이러한 구현예에서, 변형된 신호전달제는 IL-12Rβ1 및/또는 IL-12Rβ2에 대해 감소된 친화성 및/또는 활성을 갖는다. 이러한 구현예에서, 변형된 신호전달제는 IL-12Rβ1 및/또는 IL-12Rβ2에 대해 실질적으로 감소되거나 제거된 친화성 및/또는 활성을 갖는다.
일 구현예에서, 변형된 신호전달제는 IL-13이다. 이러한 구현예에서, 변형된 신호전달제는 IL-4 수용체(IL-4Rα) 및 IL-13Rα1에 대해 감소된 친화성 및/또는 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, 변형된 신호전달제는 IL-4 수용체(IL-4Rα) 또는 IL-13Rα1에 대해 실질적으로 감소되거나 제거된 친화성 및/또는 활성을 갖는다.
일 구현예에서, 야생형 IL-13은 서열 번호: 64의 아미노산 서열을 갖는다.
이러한 구현예에서, 변형된 IL-13 제제는 아미노산 13, 16, 17, 66, 69, 99, 102, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 112, 113 및 114번에서 하나 이상의 돌연변이를 갖는다. 이론에 얽메이지 않고, 이러한 변형된 IL-13 제제는 감소된 생물학적 활성을 나타내는 것으로 여겨진다. 참고: 예를 들면, 이의 전체 내용이 본원에 참고로 포함된 제WO 2002/018422호.
일 구현예에서, 변형된 신호전달제는 IL-18이다. 일부 구현예에서, 변형된 신호전달제는 IL-18Rα 및/또는 IL-18Rβ에 대해 감소된 친화성 및/또는 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, 변형된 신호전달제는 IL-18Rα 및/또는 IL-18Rβ에 대해 실질적으로 감소되거나 제거된 친화성 및/또는 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, 변형된 신호전달제는 IL-18Rα 제II형에 대해 실질적으로 감소되거나 제거된 친화성 및/또는 활성을 가지며, 이는 신호전달에 요구되는 TIR 도메인을 결여한 IL-18Rα의 동형이다.
일 구현예에서, 야생형 IL-18은 서열 번호: 65의 아미노산 서열을 갖는다.
이러한 구현예에서, 변형된 IL-18 제제는 이의 전체 내용이 본원에 참고로 포함된 제WO/2015/007542호에 기술된 바와 같이, Y37-K44, R49-Q54, D59-R63, E67-C74, R80, M87-A97, N 127-K129, Q139-M149, K165-K171, R183 및 Q190-N191로부터 선택된 아미노산 또는 아미노산 영역내에 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다(사람 IL-18 서열을 기반으로 한 번호매김, 진뱅크 수탁 번호 제AAV38697호, 버젼 AAV38697.1, Gl: 54696650).
일 구현예에서, 변형된 신호전달제는 IL-33이다. 이러한 구현예에서, 변형된 신호전달제는 ST-2 수용체 및 IL-1RAcP에 대해 감소된 친화성 및/또는 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, 변형된 신호전달제는 ST-2 수용체 및 IL-1RAcP에 대해 실질적으로 감소되거나 제거된 친화성 및/또는 활성을 갖는다.
일 구현예에서, 야생형 IL-33은 서열 번호: 66의 아미노산 서열을 갖는다.
이러한 구현예에서, 변형된 IL-33 제제는 이의 전체 내용이 본원에 참고로 포함된 제WO/2015/007542호에 기술된 바와 같이, I113-Y122, S127-E139, E144-D157, Y163-M183, E200, Q215, L220-C227 및 T260-E269로부터 선택된 아미노산 또는 아미노산 영역내 하나 이상의 돌연변이을 포함할 수 있다(사람 서열을 기반으로 한 번호매김, 진뱅크 수탁 번호 제NP_254274호, 버젼 NP_254274.1, Gl:15559209).
일 구현예에서, 변형된 신호전달제는 상피 성장 인자(EGF)이다. EGF는 강력한 성장 인자의 계열의 구성원이다. 구성원은 EGF, HB-EGF, 및 다른 것들, 예를 들면, TGF알파, 암피레굴린, 뉴레굴린, 에피레굴린, 베타셀룰린을 포함한다. EGF 계열 수용체는 EGFR(ErbB1), ErbB2, ErbB3 및 ErbB4를 포함한다. 이들은 동종이량체 및/또는 이종이량체 수용체 아형으로서 기능할 수 있다. 상이한 EGF 계열 구성원은 다양한 수용체 아형에 대해 차등적인 선택성을 나타낸다. 예를 들면, EGF는 ErbB1/ErbB1, ErbB1/ErbB2, ErbB4/ErbB2 및 일부 다른 이종이량체성 아형과 관련된다. HB-EGF는 또한 ErbB4/4와 연합되지만, 유사한 양식을 갖는다. EGF(EGF-유사) 성장 인자 신호전달의 조절은 긍정적으로 또는 부정적으로, 고려할 수 있는 치료학적 이익이 있다. 예를 들면, EGFR 신호전달의 억제는 EGFR 신호전달이 주요 성장 촉진 신호를 구성하는 다양한 암의 치료시 이익이 있다. 대안적으로, EGFR 신호전달의 자극은 예를 들면, 상처 치유(급성 및 만성), 경구 점막염(방사선 치료요법을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 각종 암 치료요법의 주요 부작용)을 촉진하는데 있어서 치료학적 이익이 있다.
일부 구현예에서, 변형된 신호전달제는 ErbB1, ErbB2, ErbB3, 및/또는 ErbB4에 대해 감소된 친화성 및/또는 활성을 갖는다. 이러한 구현예는 예를 들면, 상처를 치료하는 방법에서 용도를 찾는다. 일부 구현예에서, 변형된 신호전달제는 하나 이상의 ErbB1, ErbB2, ErbB3, 및 ErbB4에 결합하며 수용체의 활성을 길항한다. 이러한 구현예에서, 변형된 신호전달제는 수용체의 활성이 약화된 양식으로 길항되도록 하는 ErbB1, ErbB2, ErbB3, 및/또는 ErbB4에 대한 감소된 친화성 및/또는 활성을 갖는다. 이러한 구현예는 예를 들면, 암의 치료시 용도를 찾는다. 일 구현예에서, 변형된 신호전달제는 ErbB1에 대해 감소된 친화성 및/또는 활성을 갖는다. ErbB1은 키나제 억제제의 치료학적 표적이며 - 이들은 매우 선택적이 아니므로(예컨대, 게피티닙, 에를로티닙, 아파티닙, 브리가티닙 및 이코티닙) 대부분 부작용을 갖는다. 일부 구현예에서, 약화된 길항 ErbB1 신호전달은 보다 정확하며 EGF에 대한 수용체를 표적화하는 다른 제제보다 부작용을 거의 갖지 않는다.
일부 구현예에서, 변형된 신호전달제는 ErbB1에 대해 감소된 친화성 및/또는 활성(예컨대, 길항, 예컨대, 하나 이상의 돌연변이의 결과인 천연의 길항 활성 또는 길항 활성, 참고: 예컨대, 이의 전체 내용이 본원에 참고로 포함된, 제WO 2015/007520호) 및/또는 ErbB4 또는 이것이 상호작용할 수 있는 다른 아형에 대해 실질적으로 감소되거나 제거된 친화성 및/또는 활성을 갖는다. 표적화 모이어티를 경유한 특정 표적화를 통하여, 억제-관련 부작용과 잠재적으로 관련된 다른 수용체에 관여하지 않지만, ErbB1/ErbB1 수용체 활성의 세포-선택적인 억제(길항작용, 예컨대, 하나 이상의 돌연변이의 결과인 천연의 길항 활성 또는 길항 활성, 참고: 예컨대, 이의 전체 내용이 본원에 참고로 포함된 제WO 2015/007520호)가 달성될 수 있다. 따라서, 체내 모든 세포형에서 EGFR 활성을 억제하는, EGFR 키나제 억제제와는 대조적으로, 이러한 작제물은 감소된 부작용으로 세포-선택적인(예컨대, 수용체의 증폭, 과발현 등으로 인한 활성화된 EGFR 신호전달을 지닌 종양 세포) 항-EGFR(ErbB1) 약물 효과를 제공할 수 있다.
일부 구현예에서, 변형된 신호전달제는 ErbB4 및/또는 이것이 상호작용할 수 있는 다른 아형에 대해 감소된 친화성 및/또는 활성(예컨대, 효능작용)을 갖는다. 표적화 모이어티를 통한 특정 표적 세포에 대한 표적화를 통해, ErbB1 신호전달의 선택적인 활성화가 달성된다(예컨대, 상피 세포). 이러한 작제물은 일부 구현예에서, 특히 만성 상태의 치료 및 치료제의 국소 적용(예컨대, 전신 상처 치유) 이외의 적용에 대해 감소된 부작용을 지닌 상처의 치료(상처 치유 촉진)시 용도가 발견된다.
일 구현예에서, 변형된 신호전달제는 인슐린 또는 인슐린 유사체이다. 일부 구현예에서, 변형된 인슐린 또는 인슐린 유사체는 인슐린 수용체 및/또는 IGF1 또는 IGF2 수용체에 대해 감소된 친화성 및/또는 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, 변형된 인슐린 또는 인슐린 유사체는 인슐린 수용체 및/또는 IGF1 또는 IGF2 수용체에 대해 실질적으로 감소되거나 제거된 친화성 및/또는 활성을 갖는다. 인슐린 수용체에서 약화된 반응은 당뇨병, 비만, 대사 장애 등을 제어하도록 하지만 IGF1 또는 IGF2 수용체로부터의 떨어지는 것은 전-암 효과(pro-cancer effect)를 피한다.
일 구현예에서, 변형된 신호전달제는 인슐린-유사 성장 인자-I 또는 인슐린-유사 성장 인자-II(IGF-1 또는 IGF-2)이다. 일 구현예에서, 변형된 신호전달제는 IGF-1이다. 이러한 구현예에서, 변형된 신호전달제는 인슐린 수용체 및/또는 IGF1 수용체에 대해 감소된 친화성 및/또는 활성을 갖는다. 일 구현예에서, 변형된 신호전달제는 IGF1 수용체에 결합하여 수용체의 활성을 길항한다. 이러한 구현예에서, 변형된 신호전달제는 수용체의 활성이 약화된 양식으로 길항되도록 하는 IGF1 수용체에 대해 감소된 친화성 및/또는 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, 변형된 신호전달제는 인슐린 수용체 및/또는 IGF1 수용체에 대해 실질적으로 감소되거나 제거된 친화성 및/또는 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, 변형된 신호전달제는 수용체의 활성이 약화된 양식으로 길항되도록 하는 IGF2 수용체에 대해 감소된 친화성 및/또는 활성을 갖는다. 일 구현예에서, 변형된 신호전달제는 인슐린 수용체에 대해 실질적으로 감소되거나 제거된 친화성 및/또는 활성을 가지며 따라서 인슐린 신호전달을 방해하지 않는다. 다양한 구현예에서, 이는 암 치료에 적용된다. 다양한 구현예에서, 본 제제는 IR 동형 A가 암 치료에 대해 내성을 유발하는 것을 방지할 수 있다.
일부 구현예에서, 변형된 신호전달제는 EPO이다. 다양한 구현예에서, 변형된 EPO 제제는 야생형 EPO 또는 본원에 기술된 다른 EPO 기반 제제에 비해 EPO 수용체(EPOR) 수용체 및/또는 에피린 수용체(EphR)에 대해 감소된 친화성 및/또는 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, 변형된 EPO 제제는 EPO 수용체(EPOR) 수용체 및/또는 Eph 수용체(EphR)에 대해 실질적으로 감소되거나 제거된 친화성 및/또는 활성을 갖는다. 예시적인 EPO 수용체는 EPOR 동종이량체 또는 EPOR/CD131 이종이량체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, EPO 수용체로서 베타-일반적인 수용체(βcR)가 포함된다. 예시적인 Eph 수용체는, EPHA1, EPHA2, EPHA3, EPHA4, EPHA5, EPHA6, EPHA7, EPHA8, EPHA9, EPHA10, EPHB1, EPHB2, EPHB3, EPHB4, EPHB5, 및 EPHB6을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 변형된 EPO 단백질은 EPO 단백질이 하나 이상의 상이한 EPO 수용체 또는 Eph 수용체(예컨대, EPOR-EPHB4, EPOR-βcR-EPOR을 포함하나, 이에 한정되지 않는 이종이량체, 이종삼량체 등)를 포함하는 수용체에 대해 감소된 친화성을 갖도록 하는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 또한, NEPOR을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 이의 전체 내용이 본원에 참고로 포함된 유럽 특허 공보 제2492355호의 수용체가 제공된다.
일부 구현예에서, 사람 EPO는 서열 번호: 67의 아미노산 서열을 갖는다(처음 27개 아미노산은 신호 펩타이드이다).
일부 구현예에서, 사람 EPO 단백질은 서열 번호: 68의 서열을 갖는 166개 아미노산 잔기의 당단백질인 EPO의 성숙한 형태(신호 펩타이드는 분열제거된다)이다.
사람 EPO 단백질의 구조는 나선 A, B, C, 및 D를 포함하는 4개의 나선 다발을 포함하는 것으로 예측된다. 다양한 구현예에서, 변형된 EPO 단백질은 생물활성에 대해 중요한 EPO 단백질의 4개 영역, 즉, 아미노산 잔기 10-20, 44-51, 96-108, 및 142-156 내에 위치한 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 돌연변이는 잔기 11-15, 44-51, 100-108, 및 147-151에 위치한다. 이러한 잔기는 나선 A(Val11, Arg14, 및 Tyr15), 나선 C(Ser100, Arg103, Ser104, 및 Leu108), 나선 D(Asn147, Arg150, Gly151, 및 Leu155), 및 A/B 연결 루프(잔기 42-51)에 대해 국재화된다. 일부 구현예에서, 변형된 EPO 단백질은 아미노산 41-52와 아미노산 147, 150, 151, 및 155 사이의 잔기내 돌연변이를 포함한다. 이론에 얽메이지 않고, 이러한 잔기의 돌연변이는 수용체 결합 및 시험관내 생물학적 활성 둘 다에 있어서 실질적인 효과를 갖는다. 일부 구현예에서, 변형된 EPO 단백질은 11, 14, 15, 100, 103, 104, 및 108번 잔기에서 돌연변이를 포함한다. 이론에 얽메이지 않고, 이러한 잔기의 돌연변이는 수용체 결합 활성에 있어서 중간 효과 및 시험관내 생물학적 활성에 있어서 훨씬 더 큰 효과를 갖는다. 예시적인 치환은 Val11Ser, Arg14Ala, Arg14Gln, Tyr15lle, Pro42Asn, Thr44lle, Lys45Asp, Val46Ala, Tyr51Phe, Ser100Glu, Ser100Thr, Arg103Ala, Ser104lle, Ser104Ala, Leu108Lys, Asn147Lys, Arg150Ala, Gly151Ala, 및 Leu155Ala 중 하나 이상을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, 변형된 EPO 단백질은 생물활성 및 비결합을 가져오는 돌연변이, 예컨대, Eliot, et al. Mapping of the Active Site of Recombinant Human Erythropoietin January 15, 1997; Blood: 89(2)에 나열된 것을 포함하며, 이의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다.
일부 구현예에서, 변형된 EPO 단백질은 수용체 접촉시 포함되는 EPO 단백질의 표면 잔기를 포함하는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 이론에 얽메이지 않고, 이러한 표면 잔기의 돌연변이는 단백질 폴딩(folding)에 영향을 미침으로써 일부 생물학적 활성을 보유하는 경향이 거의 없다. 돌연변이될 수 있는 예시적인 표면 잔기는 147 및 150번 잔기를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예시적인 구현예에서, 돌연변이는 N147A, N147K, R150A 및 R150E 중 하나 이상을 포함하는 치환이다.
일부 구현예에서, 변형된 EPO 단백질은 잔기 N59, E62, L67, 및 L70에서 하나 이상의 돌연변이, 및 이황화물 결합 형성에 영향을 미치는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 이론에 얽메이지 않고, 이러한 돌연변이는 폴딩에 영향을 미치고/미치거나 묻힌 위치(buried position) 속에 있는 것으로 예측되므로 생물학적 활성에 간접적으로 영향을 미치는 것으로 여겨진다.
일 구현예에서, 변형된 EPO 단백질은 수용체 결합을 유의적으로 감소시키는 K20E 치환을 포함한다. 참고: 이의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된 Elliott, et al.,(1997) Blood, 89:493-502.
본 발명의 키메라 EPO 단백질에 포함될 수 있는 추가의 EPO 돌연변이는 예를 들면, 이의 전체 내용이 본원에 참고로 포함된, Elliott, et al.,(1997) Blood, 89:493-502 및 이의 전체 내용이 본원에 참고로 포함된 Taylor et al.,(2010) PEDS, 23(4): 251-260에 개시되어 있다.
일 구현예에서, 본 키메라 단백질은 본원에 기술된 임의의 변형된 또는 돌연변이체 신호전달제와 함께, (i) SIRP1α에 대한 표적화 모이어티 및 (ii) 종양 세포에 대해 지시된 표적화 모이어티를 갖는다. 일 구현예에서, 본 키메라 단백질은 대식구에서 SIRP1α에 대해 지시된 표적화 모이어티 및 종양 세포에서 PD-L1 또는 PD-L2에 대해 지시된 제2의 표적화 모이어티를 갖는다.
다양한 구현예에서, 신호전달제는 독소 또는 독성 효소이다. 일부 구현예에서, 독소 또는 독성 효소는 식물 및 세균으로부터 유래된다. 예시적인 독소 또는 독성 효소는 디프테리아 독소, 슈도모나스 독소, 안트락스 독소, 리보소옴-불활성화 단백질(RIP), 예를 들면, 리신 및 사포린, 모덱신, 아브린, 겔로닌, 및 포크 위드(poke weed) 항바이러스 단백질을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 추가의 독소는 Mathew et al.,(2009) Cancer Sci 100(8): 1359-65에 개시된 것을 포함하며, 이의 전체 개시내용은 본원에 참고로 포함된다. 이러한 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 세포-형 특이적인 방식으로 세포 사멸을 유도하기 위해 활용될 수 있다. 이러한 구현예에서, 독소는 변형, 예컨대, 돌연변이되어 본원의 다른 신호전달제와 함께 기술된 바와 같이, 약화된 효과에 대한 독소의 친화성 및/또는 활성을 감소시킬 수 있다.
신호전달제와의 다중-특이적인 키메라 및 융합
다양한 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 신호전달제 및/또는 하나 이상의 추가의 표적화 모이어티(즉, SIRP1α에 대하여 지시된 표적화 모이어티 외에)를 포함한다. 따라서, 본 발명은 하나 이상의 신호전달제, SIRP1α에 대한 표적화 모이어티, 및/또는 하나 이상의 추가의 표적화 모이어티를 포함하는 키메라 또는 융합 단백질을 제공한다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 2개의 상이한 세포(예컨대, 시냅스를 제조하기 위한) 또는 동일한 세포(예컨대, 보다 농축된 신호전달제 효과를 수득하기 위한)를 표적하는 표적화 모이어티를 갖는다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 다중특이적인데, 즉, 키메라 단백질은 2개 이상의 표적(예컨대, 항원, 또는 수용체, 또는 에피토프)을 인식하여 이에 결합하는 인식 도메인(예컨대, 항원 인식 도메인)을 갖는 2개 이상의 표적화 모이어티를 포함한다. 이러한 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 동일한 항원 또는 상이한 항원에서 또는 상이한 수용체에서 2개 이상의 에피토프를 인식하여 이에 결합하는 인식 도메인을 갖는 2개 이상의 표적화 모이어티를 포함할 수 있다. 다양한 구현예에서, 이러한 다중-특이적인 키메라 단백질은 증가된 결합활성(avidity) 및/또는 개선된 선택성과 같은 유리한 특성을 나타낸다. 일 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 2개의 표적화 모이어티를 포함하고 이특이적인데, 즉, 동일한 항원 또는 상이한 항원 또는 상이한 수용체에서 2개의 에피토프에 결합하여 이를 인식한다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 다중특이적인 키메라 단백질은 본원에 기술된 바와 같은 항체 또는 항체 유도체인 각각의 표적화 모이어티를 지닌 2개 이상의 표적화 모이어티를 포함한다. 예시적인 구현예에서, 본 발명의 다중특이적인 키메라 단백질은 SIRP1α에 대한 항원 인식 도메인을 포함하는 적어도 하나의 항체 또는 항체 유도체(예컨대, VHH) 및 종양 항원에 대한 인식 도메인을 포함하는 하나의 항체 또는 항체 유도체를 포함한다.
다양한 구현예에서, 본 다중특이적인 키메라 단백질은 상이한 항원 또는 수용체를 표적화하는 2개 이상의 표적화 모이어티를 가지며, 하나의 표적화 모이어티는 이의 항원 또는 수용체에 대해 약화될 수 있는데, 예컨대, 표적화 모이어티는 이의 항원 또는 수용체에 낮은 친화성 또는 결합활성으로 결합한다(예를 들면, 다른 표적화 모이어티가 이의 항원 또는 수용체에 대한 이의 것에 대해 갖는 친화성 또는 결합활성보다 낮은 친화성 또는 결합활성에서를 포함, 예를 들면, 결합 친화성들 사이의 차이는 약 10배, 또는 25배, 또는 50배, 또는 100배, 또는 300배, 또는 500배, 또는 1000배, 또는 5000배일 수 있고; 예를 들면, 보다 낮은 친화성 또는 결합활성 표적화 모이어티는 이의 항원 또는 수용체에 중간- 내지 높은-nM 또는 낮은- 내지 중간-μM 범위에서 결합할 수 있으나 보다 높은 친화성 또는 결합활성 표적화 모이어티는 이의 항원 또는 수용체에 중간- 내지 높은-pM 또는 낮은- 내지 중간-nM 범위에서 결합할 수 있다). 예를 들면, 일부 구현예에서, 본 다중특이적인 키메라 단백질은 무차별한(promiscuous) 항원 또는 수용체에 대해 지시된 약화된 표적화 모이어티를 포함하며, 이는 목적한 세포에 대한 표적화를 증진시키며(예컨대, 다른 표적화 모이어티를 통해) 치료요법에 대해 표적화되지 않은 것(예컨대, 이러한 구현예에서 제공된 것보다 더 높은 친화성에서 무차별한 항원 또는 수용체에 결합함으로써)을 포함하는, 다수 유형의 세포에 걸쳐 효과를 방지한다.
본 발명의 다중특이적인 키메라 단백질은 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 작제할 수 있다. 예를 들면, 이의 전체 내용이 본원에 참고로 포함된 미국 특허 제9,067,991호, 미국 특허 공보 제20110262348호 및 제WO 2004/041862호를 참고한다. 예시적인 구현예에서, 2개 이상의 표적화 모이어티를 포함하는 본 발명의 다중특이적인 키메라 단백질은 예를 들면, 아미노산 잔기를 이의 전체 내용이 본원에 참고로 포함된, Blattler et al., Biochemistry 24,1517-1524 및 EP294703에 기술된 바와 같은 유기 유도체화제와 반응시킴으로써, 화학적 가교결합에 의해 작제할 수 있다. 다른 예시적인 구현예에서, 2개 이상의 표적화 모이어티를 포함하는 다중특이적인 키메라 단백질은 유전적 융합, 즉, 개개 표적화 모이어티의 폴리펩타이드를 포함하는 단일 폴리펩타이드를 작제함으로써 작제한다. 예를 들면, SIRP1α에 대한 항원 인식 도메인을 지닌 제1 항체 또는 항체 유도체(예컨대, VHH) 및 종양 항원에 대한 인식 도메인을 지닌 제2의 항체 또는 항체 유도체를 암호화하는 단일의 폴리펩타이드 작제물이 형성될 수 있다. 2가 또는 다가 VHH 폴리펩타이드 작제물을 생산하는 방법은, 이의 전체 내용이 본원에 참고로 포함된, PCT 특허원 제WO 96/34103호에 개시되어 있다. 추가의 예시적인 구현예에서, 본 발명의 다중특이적인 키메라 단백질은 링커를 사용하여 작제할 수 있다. 예를 들면, SIRP1α에 대한 항원 인식 도메인을 지닌 제1 항체 또는 항체 유도체(예컨대, VHH)의 카복시-말단은 종양 항원에 대한 인식 도메인을 지닌 제2의 항체 또는 항체 유도체의 아미노-말단에 연결될 수 있다(또는 역으로). 사용될 수 있는 예시적인 링커는 본원에 기술되어 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 다중특이적인 키메라 단백질의 특징은 링커의 사용없이 서로 직접 연결되어 있다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 다중-특이적인 키메라 단백질은 SIRP1α 및 하나 이상의 면역 세포에서 발견된 하나 이상의 항원을 인식하여 이에 결합하며, 이는 거핵구(megakaryocyte), 혈소판, 적혈구, 비만 세포, 호염기구, 호중구, 호산구, 단핵구, 대식구, 천연 킬러 세포, T 림프구(예컨대, 세포독성 T 림프구, T 헬퍼 세포, 천연 킬러 T 세포), B 림프구, 혈장 세포, 수지 세포, 또는 이의 서브세트(subset)를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 키메라 단백질은 목적한 항원에 특이적으로 결합하며 하나 이상의 면역 세포를 효과적으로 직접 또는 간접적으로 모집한다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 다중-특이적인 키메라 단백질은 SIRP1α 및 종양 세포에서 발견된 하나 이상의 항원을 인식하여 이에 결합한다. 이러한 구현예에서, 본 키메라 단백질은 종양 세포 또는 종양 미세환경에 면역 세포(예컨대, 대식구)를 직접 또는 간접적으로 모집할 수 있다. 이러한 구현예에서, 본 키메라 단백질은 대식구에 의한 종양 세포의 식균 작용을 향상시킨다.
일부 구현예에서, 본 키메라 단백질은 종양의 면역 공격을 위하여 면역 세포의 균형을 이동시킴을 포함하는 방법에서 사용될 수 있거나 용도를 찾을 수 있다. 예를 들면, 본 키메라 단백질은 종양을 사멸시키고/시키거나 억제시키는 세포(예컨대, 항-종양 대식구(예컨대, M1 대식구), T 세포, 세포독성 T 림프구, T 헬퍼 세포, 천연 킬러(NK) 세포, 천연 킬러 T(NKT) 세포, B 세포, 및 수지 세포)를 위하여 및 종양을 보호하는 세포(예컨대, 골수-유래된 억제인자 세포(myeloid-derived suppressor cell: MDSC), 조절성 T 세포(Treg); 종양 관련 호중구(TAN), M2 대식구, 종양 관련 대식구(TAM), 또는 이의 서브세트)와는 반대로 임상의 중요 부위에 면역 세포의 비를 이동시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 본 키메라 단백질은 효과기 T 세포 대 조절성 T 세포의 비를 증가시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 다중-특이적인 키메라 단백질은 종양 세포와 관련된 표적(예컨대, 항원 또는 수용체)에 특이적으로 결합하는 인식 도메인을 갖는 표적화 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 종양 세포를 직접 또는 간접적으로 모집한다. 예를 들면, 일부 구현예에서, 종양 세포의 모집은 종양 세포를 식균작용하고/하거나, 사멸시키고/시키거나 억제할 수 있는 하나 이상의 효과기 세포(예컨대, 대식구)에 대한 것이다.
종양 세포, 또는 암 세포는 세포 또는 조직의 제어되지 않는 성장 및/또는 세포 생존에 있어서 비정상적인 증가 및/또는 체 기관 및 시스템의 정상 기능화를 방해하는 세포자멸사의 억제를 지칭한다. 예를 들면, 종양 세포는 양성 및 악성 암, 용종(polyp), 과형성(hyperplasia)뿐만 아니라 휴면 상태의 종양 또는 미소전이(micrometastasis)를 포함한다. 예시적인 종양 세포는 다음의 세포를 포함하나 이에 한정되지 않는다: 기저 세포 암종, 담즙관 암; 방광암; 골암; 뇌 및 중추 신경계 암; 유방암; 복막의 암; 경부암; 융모막암; 결장 및 직장 암; 연결 조직암; 소화계의 암; 자궁내막 암; 식도암; 눈암(eye cancer); 두경부의 암; 위암(위장 암 포함); 교아세포종; 간 암종; 간세포암; 상피내 신생물; 신장 또는 신 암; 후두암; 백혈병; 간암; 폐암(예컨대, 소-세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암종, 및 폐의 편평 암종); 흑색종; 골수종; 신경아세포종; 구강암(입술, 혀, 입, 및 인두); 난소암; 췌장암; 전립샘암; 망막모세포종; 횡문근육종; 직장암; 호흡계의 암; 타액선 암종; 육종; 피부암; 편평 세포암; 위암; 고환 암; 갑상선 암; 자궁 또는 자궁내막 암; 비뇨계의 암; 음문암; 호지킨 림프종(Hodgkin lymphoma) 및 비-호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma)을 포함하는 림프종뿐만 아니라, B-세포 림프종(저 등급/여포성 비-호지킨 림프종(NHL); 소 림프구성(SL) NHL; 중간 등급/여포성 NHL; 중간 등급의 확산성 NHL; 고 등급의 면역아세포성 NHL; 고 등급의 림프아구성 NHL; 고 등급의 작은 비-절단된 세포(high grade small non-cleaved cell) NHL; 벌키 질환(bulky disease) NHL; 외투 세포 림프종(mantle cell lymphoma); AIDS-관련 림프종; 및 발덴스트롬 거대글로불린혈증(Waldenstrom's Macroglobulinemia); 만성 림프성 백혈병(CLL); 급성 림프모구성 백혈병(ALL); 모발 세포 백혈병; 만성 골수아구성 백혈병; 뿐만 아니라 다른 암종 및 육종; 및 이식 후 림프구증식성 장애(PTLD) 뿐만 아니라, 모반증과 관련된 비정상적인 혈관 증식, 부종(예컨대, 뇌 종양과 관련된 것), 및 메이그 증후군(Meigs' syndrome)을 포함한다.
종양 세포, 또는 암 세포는 또한 암종, 예컨대, 다양한 아형, 예를 들면, 선암종, 기저 세포 암종, 편평 세포 암종, 및 이행 세포 암종), 육종(예를 들면, 골 및 연 조직 포함), 백혈병(예를 들면, 급성 골수성, 급성 림프아구성, 만성 골수, 만성 림프아구성, 및 모발 세포 포함), 림프종 및 골수종(예를 들면, 호지킨 및 비-호지킨 림프종, 경쇄, 비-분비성, MGUS, 및 형질세포종), 및 중추 신경계 암(예를 들면, 뇌(예컨대, 신경교종(예컨대, 별아교세포종, 희소돌기아교세포종, 및 뇌실막종), 수막종, 뇌하수체 선종, 및 신경종, 및 척수 종양(예컨대, 수막종 및 신경섬유종)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
예시적인 종양 항원은 MART-1/Melan-A, gp100, 디펩티딜 펩티다제 IV(DPPIV), 아데노신 데아미나제-결합 단백질(ADAbp), 사이클로필린 b, 결장직장 관련 항원(CRC)-0017-1A/GA733, 암배아 항원(CEA) 및 이의 면역원성 에피토프 CAP-1 및 CAP-2, etv6, aml1, 전립샘 특이적인 항원(PSA) 및 이의 면역원성 에피토프 PSA-1, PSA-2, 및 PSA-3, 전립샘-특이적인 막 항원(PSMA), T-세포 수용체/CD3-제타 쇄, MAGE-계열의 종양 항원(예컨대, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, MAGE-A12, MAGE-Xp2(MAGE-B2), MAGE-Xp3(MAGE-B3), MAGE-Xp4(MAGE-B4), MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-C4, MAGE-C5), GAGE-계열의 종양 항원(예컨대, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7, GAGE-8, GAGE-9), BAGE, RAGE, LAGE-1, NAG, GnT-V, MUM-1, CDK4, 타이로시나제, p53, MUC 계열, HER2/neu, p21ras, RCAS1, α-페토단백질, E-카드헤린, α-카테닌, β-카테닌, γ-카테닌, p120ctn, gp100 Pmel117, PRAME, NY-ESO-1, cdc27, 선종성 결장 폴립증 단백질(APC), 포드린(fodrin), 콘넥신(Connexin) 37, Ig-유전형, p15, gp75, GM2 및 GD2 강글리오시드, 바이러스 생성물, 예를 들면, 사람 파필로마 바이러스 단백질, Smad 계열의 종양 항원, lmp-1, NA, EBV-암호화된 핵 항원(EBNA)-1, 뇌 글리코겐 포스포릴라제, SSX-1, SSX-2(HOM-MEL-40), SSX-1, SSX-4, SSX-5, SCP-1 CT-7, c-erbB-2, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD37, CD56, CD70, CD74, CD138, AGS16, MUC1, GPNMB, Ep-CAM, PD-L1, PD-L2, PMSA, 및 BCMA(TNFRSF17)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 다양한 구현예에서, 키메라 단백질은 하나 이상의 이러한 종양 항원에 결합하는 표적화 모이어티를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 다중-특이적인 키메라 단백질은 SIRP1α 뿐만 아니라 종양 세포상의 항원도 인식하여 이에 결합한다. 일부 구현예에서, 다중-특이적인 키메라 단백질은 종양 세포 또는 종양 미세환경으로 대식구를 직접 또는 간접적으로 모집한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 다중-특이적인 키메라 단백질은 T 세포와 관련된 표적(예컨대, 항원 또는 수용체)에 특이적으로 결합하는 인식 도메인을 갖는 표적화 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 T 세포를 직접 또는 간접적으로 모집한다. 일 구현예에서, 항원 인식 도메인은 효과기(effector) T 세포에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 항원 인식 도메인은 효과기 T 세포를, 예컨대, 일부 구현예에서, 치료학적 부위(예컨대, 치료학적 효과를 위해 조절될 하나 이상의 질환 세포 또는 세포를 지닌 부위)에 직접 또는 간접적으로 모집한다. 예시적인 효과기 T 세포는 세포독성 T 세포(예컨대, αβ TCR, CD3+, CD8+, CD45RO+); CD4+ 효과기 T 세포(예컨대, αβ TCR, CD3+, CD4+, CCR7+, CD62Lhi, IL-7R/CD127+); CD8+ 효과기 T 세포(예컨대, αβ TCR, CD3+, CD8+, CCR7+, CD62Lhi, IL-7R/CD127+); 효과기 기억 T 세포(예컨대, CD62Llow, CD44+, TCR, CD3+, IL-7R/CD127+, IL-15R+, CCR7low); 중심 기억 T 세포(예컨대, CCR7+, CD62L+, CD27+; 또는 CCR7hi, CD44+, CD62Lhi, TCR, CD3+, IL-7R/CD127+, IL-15R+); CD62L+ 효과기 T 세포; 조기 효과기 기억 T 세포(CD27+ CD62L-) 및 말기 효과기 기억 T 세포(CD27- CD62L-)(각각 TemE 및 TemL)를 포함하는 CD8+ 효과기 기억 T 세포(TEM); CD127(+)CD25(low/-) 효과기 T 세포; CD127(-)CD25(-) 효과기 T 세포; CD8+ 줄기 세포 기억 효과기 세포(TSCM)(예컨대, CD44(저)CD62L(고)CD122(고)sca(+)); TH1 효과기 T-세포(예컨대, CXCR3+, CXCR6+ 및 CCR5+; 또는 αβ TCR, CD3+, CD4+, IL-12R+, IFNγR+, CXCR3+), TH2 효과기 T 세포(예컨대, CCR3+, CCR4+ 및 CCR8+; 또는 αβ TCR, CD3+, CD4+, IL-4R+, IL-33R+, CCR4+, IL-17RB+, CRTH2+); TH9 효과기 T 세포(예컨대, αβ TCR, CD3+, CD4+); TH17 효과기 T 세포(예컨대, αβ TCR, CD3+, CD4+, IL-23R+, CCR6+, IL-1R+); CD4+CD45RO+CCR7+ 효과기 T 세포, ICOS+ 효과기 T 세포; CD4+CD45RO+CCR7(-) 효과기 T 세포; 및 IL-2, IL-4 및/또는 IFN-γ를 분비하는 효과기 T 세포를 포함한다.
목적한 예시적인 T 세포 항원은, 예를 들면(및 적용가능한 경우, 세포외 도메인 포함): CD8, CD3, SLAMF4, IL-2Rα, 4-1BB/TNFRSF9, IL-2 Rβ, ALCAM, B7-1, IL-4 R, B7-H3, BLAME/SLAMFS, CEACAM1, IL-6 R, CCR3, IL-7 Rα, CCR4, CXCRl/IL-S RA, CCR5, CCR6, IL-10Rα, CCR 7, IL-l0Rβ, CCRS, IL-12 Rβ1, CCR9, IL-12 Rβ 2, CD2, IL-13 Rα1, IL-13, CD3, CD4, ILT2/CDS5j, ILT3/CDS5k, ILT4/CDS5d, ILT5/CDS5a, 루테그린 α 4/CD49d, CDS, 인테그린 α E/CD103, CD6, 인테그린 α M/CD 11b, CDS, 인테그린 αX/CD11c, 인테그린 β 2/CDlS, KIR/CD15S, CD27/TNFRSF7, KIR2DL1, CD2S, KIR2DL3, CD30/TNFRSFS, KIR2DL4/CD15Sd, CD31/PECAM-1, KIR2DS4, CD40 리간드/TNFSF5, LAG-3, CD43, LAIR1, CD45, LAIR2, CDS3, 류코트리엔 B4-R1, CDS4/SLAMF5, NCAM-L1, CD94, NKG2A, CD97, NKG2C, CD229/SLAMF3, NKG2D, CD2F-10/SLAMF9, NT-4, CD69, NTB-A/SLAMF6, 일반적인 γ 쇄/IL-2 Rγ, 오스테오폰틴, CRACC/SLAMF7, PD-1, CRTAM, PSGL-1, CTLA-4, RANK/TNFRSF11A, CX3CR1, CX3CL1, L-셀렉틴, CXCR3, SIRP β1, CXCR4, SLAM, CXCR6, TCCR/WSX-1, DNAM-1, 티모포이에틴, EMMPRIN/CD147, TIM-1, EphB6, TIM-2, Fas/TNFRSF6, TIM-3, Fas 리간드/TNFSF6, TIM-4, Fcγ RIII/CD16, TIM-6, TNFR1/TNFRSF1A, 그래눌라이신, TNF RIII/TNFRSF1B, TRAIL Rl/TNFRSFlOA, ICAM-1/CD54, TRAIL R2/TNFRSF10B, ICAM-2/CD102, TRAILR3/TNFRSF10C, IFN-γR1, TRAILR4/TNFRSF10D, IFN-γ R2, TSLP, IL-1 R1 및 TSLP R을 포함한다. 다양한 구현예에서, 키메라 단백질은 하나 이상의 이러한 예시적인 T 세포 항원에 결합하는 표적화 모이어티를 포함한다.
비-제한적인 예로서, 다양한 구현예에서, 본 키메라 단백질은 T 세포 상에서 발현된 체크포인트 마커(checkpoint marker)에 대해 지시된 표적화 모이어티, 예컨대, PD-1, CD28, CTLA4, ICOS, BTLA, KIR, LAG3, CD137, OX40, CD27, CD40L, TIM3, 및 A2aR 중 하나 이상을 갖는다.
일부 구현예에서, 본 발명의 다중-특이적인 키메라 단백질은 B 세포와 관련된 표적(예컨대, 항원 또는 수용체)에 특이적으로 결합하는 인식 도메인을 가진 표적화 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 B 세포를, 예컨대, 일부 구현예에서, 치료학적 부위(예컨대, 치료학적 효과를 위해 조절될 하나 이상의 질환 세포 또는 세포를 지닌 부위)에 직접 또는 간접적으로 모집한다. 예시적인 목적한 B 세포 항원은, 예를 들면, CD10, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD37, CD38, CD39, CD40, CD72, CD73, CD74, CDw75, CDw76, CD77, CD78, CD79a/b, CD80, CD81, CD82, CD83, CD84, CD85, CD86, CD89, CD98, CD126, CD127, CDw130, CD138 및 CDw150을 포함한다. 다양한 구현예에서, 키메라 단백질은 이러한 예시적인 B 세포 항원 중 하나 이상에 결합하는 표적화 모이어티를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 다중-특이적인 키메라 단백질은 천연 킬러 세포와 관련된 표적(예컨대, 항원 또는 수용체)에 특이적으로 결합하는 인식 도메인을 갖는 표적화 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 천연 킬러 세포를, 예컨대, 일부 구현예에서, 치료학적 부위(예컨대, 치료학적 효과를 위해 조절될 하나 이상의 질환 세포 또는 세포를 지닌 부위)에 직접 또는 간접적으로 모집한다. 예시적인 목적한 천연 킬러 세포 항원은 예를 들면, TIGIT, 2B4/SLAMF4, KIR2DS4, CD155/PVR, KIR3DL1, CD94, LMIR1/CD300A, CD69, LMIR2/CD300c, CRACC/SLAMF7, LMIR3/CD300LF, Kir1알파, DNAM-1, LMIR5/CD300LB, Fc-엡실론 RII, LMIR6/CD300LE, Fc-γRl/CD64, MICA, Fc-γRIIB/CD32b, MICB, Fc-γ RIIC/CD32c, MULT-1, Fc-γ RIIA/CD32a, Nectin-2/CD112, Fc-γ RIII/CD16, NKG2A, FcRH1/IRTA5, NKG2C, FcRH2/IRTA4, NKG2D, FcRH4/IRTA1, NKp30, FcRH5/IRTA2, NKp44, Fc-수용체-유사 3/CD16-2, NKp46/NCR1, NKp80/KLRF1, NTB-A/SLAMF6, Rae-1, Rae-1α, Rae-1β, Rae-1 델타, H60, Rae-1 엡실론, ILT2/CD85j, Rae-1γ, ILT3/CD85k, TREM-1, ILT4/CD85d, TREM-2, ILT5/CD85a, TREM-3, KIR/CD158, TREML1/TLT-1, KIR2DL1, ULBP-1, KIR2DL3, ULBP-2, KIR2DL4/CD158d 및 ULBP-3을 포함한다. 다양한 구현예에서, 키메라 단백질은 이러한 예시적인 NK 세포 항원 중 하나 이상에 결합하는 표적화 모이어티를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 다중-특이적인 키메라 단백질은 대식구/단핵구와 관련된 표적(예컨대, 항원 또는 수용체)에 특이적으로 결합하는 인식 도메인을 가진 표적화 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 대식구/단핵구를, 예컨대, 일부 구현예에서, 치료학적 부위(예컨대, 치료학적 효과를 위해 조절될 하나 이상의 질환 세포 또는 세포를 지닌 부위)에 직접 또는 간접적으로 모집한다. 예시적인 목적한 대식구/단핵구 항원은, 예를 들면 SIRP1a, B7-1/CD80, ILT4/CD85d, B7-H1, ILT5/CD85a, 일반적인 β 쇄, 인테그린 α 4/CD49d, BLAME/SLAMF8, 인테그린 α X/CDllc, CCL6/C10, 인테그린 β 2/CD18, CD155/PVR, 인테그린 β 3/CD61, CD31/PECAM-1, 라텍신, CD36/SR-B3, 류코트리엔 B4 R1, CD40/TNFRSF5, LIMPIIISR-B2, CD43, LMIR1/CD300A, CD45, LMIR2/CD300c, CD68, LMIR3/CD300LF, CD84/SLAMF5, LMIR5/CD300LB, CD97, LMIR6/CD300LE, CD163, LRP-1, CD2F-10/SLAMF9, MARCO, CRACC/SLAMF7, MD-1, ECF-L, MD-2, EMMPRIN/CD147, MGL2, 엔도글린/CD105, 오스테오액티빈/GPNMB, Fc-γ RI/CD64, 오스테오폰틴, Fc-γ RIIB/CD32b, PD-L2, Fc-γ RIIC/CD32c, Siglec-3/CD33, Fc-γ RIIA/CD32a, SIGNR1/CD209, Fc-γ RIII/CD16, SLAM, GM-CSF Rα, TCCR/WSX-1, ICAM-2/CD102, TLR3, IFN-γ Rl, TLR4, IFN-감마 R2, TREM-l, IL-l RII, TREM-2, ILT2/CD85j, TREM-3, ILT3/CD85k, TREML1/TLT-1, 2B4/SLAMF 4, IL-10 Rα, ALCAM, IL-10 Rβ, 아미노펩티다제N/ANPEP, ILT2/CD85j, 일반적인 β 쇄, ILT3/CD85k, Clq R1/CD93, ILT4/CD85d, CCR1, ILT5/CD85a, CCR2, CD206, 인테그린 α 4/CD49d, CCR5, 인테그린 α M/CDll b, CCR8, 인테그린 α X/CDllc, CD155/PVR, 인테그린 β 2/CD18, CD14, 인테그린 β 3/CD61, CD36/SR-B3, LAIR1, CD43, LAIR2, CD45, 류코트리엔 B4-R1, CD68, LIMPIIISR-B2, CD84/SLAMF5, LMIR1/CD300A, CD97, LMIR2/CD300c, CD163, LMIR3/CD300LF, 응고 인자 III/조직 인자, LMIR5/CD300LB, CX3CR1, CX3CL1, LMIR6/CD300LE, CXCR4, LRP-1, CXCR6, M-CSF R, DEP-1/CD148, MD-1, DNAM-1, MD-2, EMMPRIN/CD147, MMR, 엔도글린/CD105, NCAM-L1, Fc-γ RI/CD64, PSGL-1, Fc-γ RIIIICD16, RP105, G-CSF R, L-셀렉틴, GM-CSF Rα, Siglec-3/CD33, HVEM/TNFRSF14, SLAM, ICAM-1/CD54, TCCR/WSX-1, ICAM-2/CD102, TREM-l, IL-6 R, TREM-2, CXCRl/IL-8 RA, TREM-3 및 TREMLl/TLT-1을 포함한다. 다양한 구현예에서, 키메라 단백질은 이러한 예시적인 대식구/단핵구 항원 중 하나 이상에 결합하는 표적화 모이어티를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 다중-특이적인 키메라 단백질은 수지 세포와 관련된 표적(예컨대, 항원 또는 수용체)에 특이적으로 결합하는 인식 도메인을 갖는 표적화 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 수지 세포를, 예컨대, 일부 구현예에서, 치료학적 부위(예컨대, 치료학적 효과를 위해 조절될 하나 이상의 질환 세포 또는 세포를 지닌 부위)에 직접 또는 간접적으로 모집한다. 예시적인 목적한 수지 세포 항원은, 예를 들면, CLEC9A, XCR1, RANK, CD36/SRB3, LOX-1/SR-E1, CD68, MARCO, CD163, SR-A1/MSR, CD5L, SREC-1, CL-Pl/COLEC12, SREC-II, LIMPIIISRB2, RP105, TLR4, TLR1, TLR5, TLR2, TLR6, TLR3, TLR9, 4-IBB 리간드/TNFSF9, IL-12/IL-23 p40, 4-아미노-1,8-나프탈리미드, ILT2/CD85j, CCL21/6Ckine, ILT3/CD85k, 8-옥소-dG, ILT4/CD85d, 8D6A, ILT5/CD85a, A2B5, 루테그린 α 4/CD49d, Aag, 인테그린 β2/CD18, AMICA, 란게린, B7-2/CD86, 류코트리엔 B4 Rl, B7-H3, LMIR1/CD300A, BLAME/SLAMF8, LMIR2/CD300c, Clq R1/CD93, LMIR3/CD300LF, CCR6, LMIR5/CD300LB CCR7, LMIR6/CD300LE, CD40/TNFRSF5, MAG/Siglec-4-a, CD43, MCAM, CD45, MD-1, CD68, MD-2, CD83, MDL-1/CLEC5A, CD84/SLAMF5, MMR, CD97, NCAMLl, CD2F-10/SLAMF9, 오스테오액티빈 GPNMB, Chern 23, PD-L2, CLEC-1, RP105, CLEC-2, CLEC-8, Siglec-2/CD22, CRACC/SLAMF7, Siglec-3/CD33, DC-SIGN, DCE205, Siglec-5, DC-SIGNR/CD299, Siglec-6, DCAR, Siglec-7, DCIR/CLEC4A, Siglec-9, DEC-205, Siglec-10, Dectin-1/CLEC7A, Siglec-F, Dectin-2/CLEC6A, SIGNR1/CD209, DEP-1/CD148, SIGNR4, DLEC, SLAM, EMMPRIN/CD147, TCCR/WSX-1, Fc-γ R1/CD64, TLR3, Fc-γ RIIB/CD32b, TREM-1, Fc-γ RIIC/CD32c, TREM-2, Fc-γ RIIA/CD32a, TREM-3, Fc-γ RIII/CD16, TREML1/TLT-1, ICAM-2/CD102 및 바닐로이드 R1을 포함한다. 다양한 구현예에서, 키메라 단백질은 이러한 예시적인 DC 항원 중 하나 이상에 결합하는 표적화 모이어티를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 다중-특이적인 키메라 단백질은 거핵구, 혈소판, 적혈구, 비만 세포, 호염기구, 호중구, 호산구, 또는 이의 서브세트로부터 선택되거나 이에 한정되지 않는 면역 세포와 관련된 표적(예컨대, 항원 또는 수용체)에 특이적으로 결합하는 인식 도메인을 갖는 표적화 모이어티을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 인식 도메인은 거핵구, 혈소판, 적혈구, 비만 세포, 호염기구, 호중구, 호산구, 또는 이의 서브세트를 예컨대, 일부 구현예에서, 치료학적 부위(예컨대, 치료학적 효과를 위해 조절될 하나 이상의 질환 세포 또는 세포를 지닌 부위)에 직접 또는 간접적으로 모집한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 다중-특이적인 키메라 단백질은 거핵구 및/또는 혈소판과 관련된 표적(예컨대, 항원 또는 수용체)에 특이적으로 결합하는 인식 도메인을 갖는 표적화 모이어티를 포함한다. 예시적인 목적한 거핵구 및/또는 혈소판 항원은 예를 들면, GP IIb/IIIa, GPIb, vWF, PF4, 및 TSP를 포함한다. 다양한 구현예에서, 키메라 단백질은 이러한 예시적인 거핵구 및/또는 혈소판 항원 중 하나 이상에 결합하는 표적화 모이어티를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 다중-특이적인 키메라 단백질은 적혈구와 관련된 표적(예컨대, 항원 또는 수용체)에 특이적으로 결합하는 인식 도메인을 갖는 표적화 모이어티를 포함한다. 예시적인 목적한 적혈구 항원은 예를 들면, CD34, CD36, CD38, CD41a(혈소판 당단백질 IIb/IIIa), CD41b(GPIIb), CD71(트랜스페린 수용체), CD105, 글리코포린 A, 글리코포린 C, c-키트(kit), HLA-DR, H2(MHC-II), 및 레서스 항원(Rhesus antigen)을 포함한다. 다양한 구현예에서, 키메라 단백질은 이러한 예시적인 적혈구 항원 중 하나 이상에 결합하는 표적화 모이어티를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 다중-특이적인 키메라 단백질은 비만 세포와 관련된 표적(예컨대, 항원 또는 수용체)에 특이적으로 결합하는 인식 도메인을 가진 표적화 모이어티를 포함한다. 예시적인 목적한 비만 세포 항원은 예를 들면, SCFR/CD117, FcεRI, CD2, CD25, CD35, CD88, CD203c, C5R1, CMAI, FCERIA, FCER2, TPSABI를 포함한다. 다양한 구현예에서, 키메라 단백질은 이러한 비만 세포 항원 중 하나 이상에 결합하는 표적화 모이어티를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 다중-특이적인 키메라 단백질은 호염구와 관련된 표적(예컨대, 항원 또는 수용체)에 특이적으로 결합하는 인식 도메인을 갖는 표적화 모이어티를 포함한다. 예시적인 목적한 호염구 항원은 예를 들면, FcεRI, CD203c, CD123, CD13, CD107a, CD107b, 및 CD164를 포함한다. 다양한 구현예에서, 키메라 단백질은 이러한 호염구 항원 중 하나 이상에 결합하는 표적화 모이어티를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 다중-특이적인 키메라 단백질은 호중구와 관련된 표적(예컨대, 항원 또는 수용체)에 특이적으로 결합하는 인식 도메인을 갖는 표적화 모이어티를 포함한다. 예시적인 목적한 호중구 항원은 예를 들면, 7D5, CD10/CALLA, CD13, CD16(FcRIII), CD18 단백질(LFA-1, CR3, 및 p150, 95), CD45, CD67, 및 CD177를 포함한다. 다양한 구현예에서, 키메라 단백질은 이러한 호중구 항원 중 하나 이상에 결합하는 표적화 모이어티를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 다중-특이적인 키메라 단백질은 호산구와 관련된 표적(예컨대, 항원 또는 수용체)에 특이적으로 결합하는 인식 도메인을 갖는 표적화 모이어티를 포함한다. 예시적인 목적한 호산구 항원은 예를 들면, CD35, CD44 및 CD69를 포함한다. 다양한 구현예에서, 키메라 단백질은 이러한 호산구 항원 중 하나 이상에 결합하는 표적화 모이어티를 포함한다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 다중-특이적인 키메라 단백질은 당해 분야의 기술자에게 공지된 적절한 항원 또는 세포 표면 마커에 특이적으로 결합하는 인식 도메인을 갖는 표적화 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 또는 세포 표면 마커는 조직-특이적인 마커이다. 예시적인 조직-특이적인 마커는 내피 세포 표면 마커, 예를 들면, ACE, CD14, CD34, CDH5, ENG, ICAM2, MCAM, NOS3, PECAMl, PROCR, SELE, SELP, TEK, THBD, VCAMI, VWF; 평활근 세포 표면 마커, 예를 들면, ACTA2, MYHIO, MYHI 1, MYH9, MYOCD; 섬유아세포(기질) 세포 표면 마커, 예를 들면, ALCAM, CD34, COLlAl, COL1A2, COL3A1, FAP, PH-4; 상피 세포 표면 마커, 예를 들면, CDID, K6IRS2, KRTIO, KRT13, KRT17, KRT18, KRT19, KRT4, KRT5, KRT8, MUCI, TACSTDI; 신생혈관형성 마커, 예를 들면, CD13, TFNA, 알파-v 베타-3(αVβ3), E-셀렉틴; 및 지방세포 표면 마커, 예를 들면, ADIPOQ, FABP4, 및 RETN을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 다양한 구현예에서, 키메라 단백질은 이러한 항원 중 하나 이상에 결합하는 표적화 모이어티를 포함한다. 다양한 구현예에서, 키메라 단백질의 표적화 모이어티는 이러한 항원을 갖는 세포 중 하나 이상에 결합한다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 다중-특이적인 키메라 단백질은 체크포인트 마커에 대해 지시된 하나 이상의 표적화 모이어티, 예컨대, 하나 이상의 PD-1/PD-L1 또는 PD-L2, CD28/CD80 또는 CD86, CTLA4/ CD80 또는 CD86, ICOS/ICOSL 또는 B7RP1, BTLA/HVEM, KIR, LAG3, CD137/CD137L, OX40/OX40L, CD27, CD40L, TIM3/Gal9, 및 A2aR를 포함한다.
비-제한적 예로서, 다양한 구현예에서, 본 키메라 단백질은 (i) T 세포 상에서 발현된 체크포인트 마커, 예컨대, 하나 이상의 PD-1, CD28, CTLA4, ICOS, BTLA, KIR, LAG3, CD137, OX40, Cd27, CD40L, TIM3, 및 A2aR에 대해 지시된 표적화 모이어티를 가지며 (ii) 표적화 모이어티는 본원에 기술된 변형된(예컨대, 돌연변이체) 신호전달제와 함께, 종양 세포에 대해 지시된다.
다양한 구현예에서, 본 다중-특이적인 키메라 단백질은 PD-1에 대해 지시된 하나 이상의 표적화 모이어티를 갖는다. 일부 구현예에서, 키메라 단백질은 PD-1 폴리펩타이드에 선택적으로 결합하는 하나 이상의 표적화 모이어티를 갖는다. 일부 구현예에서, 키메라 단백질은 PD-1 폴리펩타이드에 선택적으로 결합하는 하나 이상의 항체, 항체 유도체 또는 양식, 펩타이드 또는 폴리펩타이드, 또는 융합 단백질을 포함한다.
일 구현예에서, 표적화 모이어티는 항-PD-1 항체 펨브롤리주맙(aka MK-3475, KEYTRUDA), 또는 이의 단편을 포함한다. 펨브롤리주맙 및 다른 사람화된 항-PD-1 항체는 Hamid, et al.(2013) New England Journal of Medicine 369(2): 134-44, 미국 제8,354,509호, 및 제WO 2009/114335호에 개시되어 있으며, 이의 전체 개시내용은 본원에 참고로 포함된다. 예시적인 구현예에서, 본원에 제공된 방법에서 사용하기 위한 펨블롤리주맙 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호: 69의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및/또는 서열 번호: 70의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일 구현예에서, 표적화 모이어티는 항-PD-1 항체, 니볼루맙(aka BMS-936558, MDX-1106, ONO-4538, OPDIVO), 또는 이의 단편을 포함한다. 니볼루맙(클론 5C4) 및 PD-1에 특이적으로 결합하는 다른 사람 모노클로날 항체는 미국 제8,008,449호 및 제WO 2006/121168호에 개시되어 있고, 이의 전체 개시내용은 본원에 참고로 포함된다. 예시적인 구현예에서, 니볼루맙 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호: 71의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및/또는 서열 번호: 72의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일 구현예에서, 표적화 모이어티는 항-PD-1 항체 피딜리주맙(aka CT-011, hBAT 또는 hBAT-1), 또는 이의 단편을 포함한다. 피딜리주맙 및 다른 사람화된 항-PD-I 모노클로날 항체(monoclonal antibody)는 미국 제2008/0025980호 및 제WO 2009/101611호에 개시되어 있으며, 이의 전체 개시내용은 본원에 참고로 포함된다. 예시적인 구현예에서, 본원에 제공된 방법엣 사용하기 위한 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 미국 제2008/0025980호(미국 제2008/0025980호의 서열 번호: 15(서열 번호: 73); 미국 제2008/0025980호의 서열 번호: 16(서열 번호: 74); 미국 제US 2008/0025980호의 서열 번호: 17(서열 번호: 75); 및 미국 제2008/0025980호의 서열 번호: 18(서열 번호: 76))의 서열 번호: 15 내지 18로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및/또는 미국 제2008/0025980호의 서열 번호: 20-24(미국 제2008/0025980호의 서열 번호: 20(서열 번호: 77); 미국 제2008/0025980호의 서열 번호: 21(서열 번호: 78); 미국 제2008/0025980호의 서열 번호: 22(서열 번호: 79); 미국 제2008/0025980호의 서열 번호: 23(서열 번호: 80); 및 미국 제US 2008/0025980호의 서열 번호: 24(서열 번호: 81))로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다.
일 구현예에서, 표적화 모이어티는 미국 제US 2008/0025980호의 서열 번호: 18을 포함하는 경쇄(서열 번호: 76) 및 미국 제US 2008/0025980호의 서열 번호: 22를 포함하는 중쇄(서열 번호: 79)를 포함한다.
일 구현예에서, 표적화 모이어티는 AMP-514(aka MEDI-0680)를 포함한다.
일 구현예에서, 표적화 모이어티는 pd-l2-Fc 융합 단백질 AMP-224를 포함하며, 이는 제WO2010/027827호 및 제WO 2011/066342호에 개시되어 있고, 이의 전체 개시내용은 본원에 참고로 포함된다. 이러한 구현예에서, 표적화 모이어티는 제WO2010/027827호의 서열 번호: 4를 포함하는 표적화 도메인(서열 번호: 82) 및/또는 제WO2010/027827호의 서열 번호: 83을 포함하는 B7-DC 융합 단백질(서열 번호: 83)를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 표적화 모이어티는 펩타이드 AUNP 12 또는 미국 제2011/0318373호 또는 제8,907,053호에 개시된 임의의 다른 펩타이드를 포함한다. 예를 들면, 표적화 모이어티는 (서열 번호: 84)의 서열을 갖는 AUNP 12(즉, 화합물 8 또는 미국 제2011/0318373호의 서열 번호: 49)를 포함할 수 있다.
Figure pct00005
일 구현예에서, 표적화 모이어티는 미국 제2014/0044738호에 개시된 바와 같은, 항-PD-1 항체 1E3, 또는 이의 단편을 포함하며, 이의 전체 개시내용은 본원에 참고로 포함된다. 예시적인 구현예에서, 본원에 제공된 방법에서 사용하기 위한 1E3 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호: 85의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및/또는 서열 번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일 구현예에서, 표적화 모이어티는 미국 제2014/0044738호에 개시된 바와 같은 항-PD-1 항체 1E8, 또는 이의 단편을 포함하며, 이의 전체 개시내용은 본원에 참고로 포함된다. 예시적인 구현예에서, 본원에 제공된 방법에서 사용하기 위한 1E8 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및/또는 서열 번호: 88의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일 구현예에서, 표적화 모이어티는 이의 전체 개시내용이 본원에 참고로 포함된, 미국 제2014/0044738호에 개시된 바와 같은, 항-PD-1 항체 1H3, 또는 이의 단편을 포함한다. 예시적인 구현예에서, 본원에 제공된 방법에서 사용하기 위한 1H3 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호: 89의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및/또는 서열 번호: 90의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일 구현예에서, 표적화 모이어티는 예를 들면, 이의 전체 개시내용이 본원에 참고로 포함된, 미국 제8,907,065호 및 제WO 2008/071447호에 개시된 바와 같은 PD-1에 대해 지시된 VHH를 포함한다. 예시적인 구현예에서, PD-1에 대한 VHH는 미국 제8,907,065호의 서열 번호: 347-351(미국 제8,907,065호의 서열 번호: 347(서열 번호: 91); 미국 제8,907,065호의 서열 번호: 348(서열 번호: 92); 미국 제8,907,065호의 서열 번호: 349(서열 번호: 93); 미국 제8,907,065호의 서열 번호: 350(서열 번호: 94); 및 미국 제8,907,065호의 서열 번호: 351(서열 번호: 95))을 포함한다.
일 구현예에서, 표적화 모이어티는 이의 전체 내용이 본원에 참고로 포함된, 미국 제2011/0271358호 및 제WO2010/036959호에 개시된 바와 같은 항-PD-1 항체, 또는 이의 단편 중 어느 하나를 포함한다. 예시적인 구현예에서, 본원에 제공된 방법에서 사용하기 위한 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 미국 제2011/0271358호의 서열 번호: 25 내지 29(미국 제2011/0271358호의 서열 번호: 25(서열 번호: 96); 미국 제2011/0271358호의 서열 번호: 26(서열 번호: 97); 미국 제2011/0271358호의 서열 번호: 27(서열 번호: 98); 미국 제2011/0271358호의 서열 번호: 28(서열 번호: 99); 및 미국 제2011/0271358호의 서열 번호: 29(서열 번호: 100))로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및/또는 미국 제2011/0271358호의 서열 번호: 30-33(미국 제2011/0271358호의 서열 번호: 30(서열 번호: 101); 미국 제2011/0271358호의 서열 번호: 31(서열 번호: 102); 미국 제2011/0271358호의 서열 번호: 32(서열 번호: 103); 및 미국 제2011/0271358호의 서열 번호: 33(서열 번호: 104))으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
다양한 구현예에서, 본 다중-특이적인 키메라 단백질은 TSR-042(Tesaro, Inc.), REGN2810(Regeneron Pharmaceuticals, Inc.), PDR001(Novartis Pharmaceuticals), 및 BGB-A317(BeiGene Ltd.)로부터 선택된, PD-1, 또는 이의 항체 단편에 대해 지시된 하나 이상의 항체를 포함한다.
다양한 구현예에서, 본 다중-특이적인 키메라 단백질은 PD-L1에 대해 지시된 하나 이상의 표적화 모이어티를 갖는다. 일부 구현예에서, 키메라 단백질은 PD-L1 폴리펩타이드에 선택적으로 결합하는 하나 이상의 표적화 모이어티를 갖는다. 일부 구현예에서, 키메라 단백질은 PD-L1 폴리펩타이드에 선택적으로 결합하는 하나 이상의 항체, 항체 유도체 또는 양식, 펩타이드 또는 폴리펩타이드, 또는 융합 단백질을 포함한다.
일 구현예에서, 표적화 모이어티는 항-PD-L1 항체 MEDI4736(아카 두르발루맙(aka durvalumab)), 또는 이의 단편을 포함한다. MEDI4736은 PD-L1에 대해 선택적이고 PD-1 및 CD80 수용체에 대한 PD-L1의 결합을 차단한다. 본 발명에 제공된 방법에서 사용하기 위한 MEDI4736 및 이의 항원-결합 단편은 중쇄 및 경쇄 또는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. MEDI4736의 서열은 제WO/2016/06272호에 개시되어 있으며, 이의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다. 예시적인 구현예에서, 본원에 제공된 방법에 사용하기 위한 MEDI4736 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호: 105의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및/또는 서열 번호: 106의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
예시적인 구현예에서, 본원에 제공된 방법에서 사용하기 위한 MEDI4736 또는 이의 항원-결합 단편은 제WO/2016/06272호의 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(서열 번호: 107); 및/또는 제WO/2016/06272호의 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(서열 번호: 108)을 포함한다.
일 구현예에서, 표적화 모이어티는 항-PD-L1 항체 아테졸리주맙(아카 MPDL3280A, RG7446), 또는 이의 단편을 포함한다. 예시적인 구현예에서, 본원에 제공된 방법에서 사용하기 위한 아테졸리주맙 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호:109의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및/또는 서열 번호: 110의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일 구현예에서, 표적화 모이어티는 항-PD-L1 항체 아벨루맙(아카 MSB0010718C), 또는 이의 단편을 포함한다. 예시적인 구현예에서, 본원에 제공된 방법에서 사용하기 위한 아벨루맙 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호: 111의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및/또는 서열 번호: 112의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일 구현예에서, 표적화 모이어티는 이의 전체 개시내용이 본원에 참고로 포함된, 미국 제2013/0309250호 및 제WO2007/005874호에 개시된 바와 같은 항-PD-L1 항체 BMS-936559(aka 12A4, MDX-1105), 또는 이의 단편을 포함한다. 예시적인 구현예에서, 본원에 제공된 방법에서 사용하기 위한 BMS-936559 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호: 113의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및/또는 서열 번호: 114의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일 구현예에서, 표적화 모이어티는 이의 전체 개시내용이 본원에 참고로 포함된, 미국 제2013/0309250호 및 제WO2007/005874호에 개시된 바와 같은 항-PD-L1 항체 3G10, 또는 이의 단편을 포함한다. 예시적인 구현예에서, 본원에 제공된 방법에서 사용하기 위한 3G10 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호: 115의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및/또는 서열 번호: 116의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일 구현예에서, 표적화 모이어티는 이의 전체 개시내용이 본원에 참고로 포함된 미국 제2013/0309250호 및 제WO2007/005874호에 개시된 바와 같은, 항-PD-L1 항체 10A5, 또는 이의 단편을 포함한다. 예시적인 구현예에서, 본원에 제공된 방법에서 사용하기 위한 10A5 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호: 117의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및/또는 서열 번호: 118의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일 구현예에서, 표적화 모이어티는 이의 전체 개시내용이 본원에 참고로 포함된 미국 제2013/0309250호 및 제WO2007/005874호에 개시된 바와 같은, 항-PD-L1 항체 5F8, 또는 이의 단편을 포함한다. 예시적인 구현예에서, 본원에 제공된 방법에서 사용하기 위한 5F8 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호: 119의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및/또는 서열 번호: 120의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일 구현예에서, 표적화 모이어티는 이의 전체 개시내용이 본원에 참고로 포함된 미국 제2013/0309250호 및 제WO2007/005874호에 개시된 바와 같은, 항-PD-L1 항체 10H10, 또는 이의 단편을 포함한다. 예시적인 구현예에서, 본원에 제공된 방법에서 사용하기 위한 10H10 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호: 121의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및/또는 서열 번호: 122의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일 구현예에서, 표적화 모이어티는 이의 전체 개시내용이 본원에 참고로 포함된 미국 제2013/0309250호 및 제WO2007/005874호에 개시된 바와 같은, 항-PD-L1 항체 1B12, 또는 이의 단편을 포함한다. 예시적인 구현예에서, 본원에 제공된 방법에서 사용하기 위한 1B12 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호: 123의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및/또는 서열 번호: 124의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일 구현예에서, 표적화 모이어티는 이의 전체 개시내용이 본원에 참고로 포함된 미국 제2013/0309250호 및 제WO2007/005874호에 개시된 바와 같은, 항-PD-L1 항체 7H1, 또는 이의 단편을 포함한다. 예시적인 구현예에서, 본원에 제공된 방법에서 사용하기 위한 7H1 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호: 125의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및/또는 서열 번호: 126의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일 구현예에서, 표적화 모이어티는 이의 전체 개시내용이 본원에 참고로 포함된 미국 제2013/0309250호 및 제WO2007/005874호에 개시된 바와 같은, 항-PD-L1 항체 11 E6, 또는 이의 단편을 포함한다. 예시적인 구현예에서, 본원에 제공된 방법에서 사용하기 위한 11E6 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호: 127의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및/또는 서열 번호: 128의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일 구현예에서, 표적화 모이어티는 이의 전체 개시내용이 본원에 참고로 포함된 미국 제2013/0309250호 및 제WO2007/005874호에 개시된 바와 같은, 항-PD-L1 항체 12B7, 또는 이의 단편을 포함한다. 예시적인 구현예에서, 본원에 제공된 방법에서 사용하기 위한 12B7 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호: 129의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및/또는 서열 번호: 130의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일 구현예에서, 표적화 모이어티는 이의 전체 개시내용이 본원에 참고로 포함된 미국 제2013/0309250호 및 제WO2007/005874호에 개시된 바와 같은, 항-PD-L1 항체 13G4, 또는 이의 단편을 포함한다. 예시적인 구현예에서, 본원에 제공된 방법에서 사용하기 위한 13G4 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호: 131의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및/또는 서열 번호: 132의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일 구현예에서, 표적화 모이어티는 이의 전체 개시내용이 본원에 참고로 포함된 미국 제2014/0044738호에 개시된 바와 같은, 항-PD-L1 항체 1E12, 또는 이의 단편을 포함한다. 예시적인 구현예에서, 본원에 제공된 방법에서 사용하기 위한 1E12 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호: 133의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및/또는 서열 번호: 134의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일 구현예에서, 표적화 모이어티는 이의 전체 개시내용이 본원에 참고로 포함된 미국 제2014/0044738호에 개시된 바와 같은, 항-PD-L1 항체 1F4, 또는 이의 단편을 포함한다. 예시적인 구현예에서, 본원에 제공된 방법에서 사용하기 위한 1F4 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호: 135의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및/또는 서열 번호: 136의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일 구현예에서, 표적화 모이어티는 이의 전체 개시내용이 본원에 참고로 포함된 미국 제2014/0044738호에 개시된 바와 같은, 항-PD-L1 항체 2G11, 또는 이의 단편을 포함한다. 예시적인 구현예에서, 본원에 제공된 방법에서 사용하기 위한 2G11 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호: 137의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및/또는 서열 번호: 138의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일 구현예에서, 표적화 모이어티는 이의 전체 개시내용이 본원에 참고로 포함된 미국 제2014/0044738호에 개시된 바와 같은, 항-PD-L1 항체 3B6, 또는 이의 단편을 포함한다. 예시적인 구현예에서, 본원에 제공된 방법에서 사용하기 위한 3B6 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호: 139의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및/또는 서열 번호: 140의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일 구현예에서, 표적화 모이어티는 이의 전체 개시내용이 본원에 참고로 포함된 미국 제2014/0044738호 및 제WO2012/145493호에 개시된 바와 같은, 항-PD-L1 항체 3D10, 또는 이의 단편을 포함한다. 예시적인 구현예에서, 본원에 제공된 방법에서 사용하기 위한 3D10 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호: 141의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및/또는 서열 번호: 142의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일 구현예에서, 표적화 모이어티는 이의 전체 개시내용이 본원에 참고로 포함된 미국 제2011/0271358호 및 제WO2010/036959호에 개시된 바와 같은, 항-PD-L1 항체 중 어느 하나를 포함한다. 예시적인 구현예에서, 본원에 제공된 방법에서 사용하기 위한 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 미국 제2011/0271358호의 서열 번호: 34 내지 38로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(미국 제2011/0271358호의 서열 번호: 34(서열 번호: 143); 미국 제2011/0271358호의 서열 번호: 35(서열 번호: 144); 미국 제2011/0271358호의 서열 번호: 36(서열 번호: 145); 미국 제2011/0271358호의 서열 번호: 37(서열 번호: 146); 및 미국 제2011/0271358호의 서열 번호: 38(서열 번호: 147)); 및/또는 미국 제2011/0271358호의 서열 번호: 39 내지 42로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄(미국 제2011/0271358호의 서열 번호: 39(서열 번호: 148); 미국 제2011/0271358호의 서열 번호: 40(서열 번호: 149); 미국 제2011/0271358호의 서열 번호: 41(서열 번호: 150); 및 미국 제2011/0271358호의 서열 번호: 42(서열 번호: 151))를 포함한다.
일 구현예에서, 표적화 모이어티는 이의 전체 개시내용이 본원에 참고로 포함된 제WO 2011/066389호, 미국 제8,779,108호, 및 미국 제2014/0356353호에 개시된 바와 같은, 항-PD-L1 항체 2.7A4, 또는 이의 단편을 포함한다. 예시적인 구현예에서, 본원에 제공된 방법에서 사용하기 위한 2.7A4 또는 이의 항원-결합 단편은 제WO 2011/066389호의 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(서열 번호: 152); 및/또는 제WO 2011/066389호의 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(서열 번호: 153)을 포함한다.
일 구현예에서, 표적화 모이어티는 이의 전체 개시내용이 본원에 참고로 포함된 제WO 2011/066389호, 미국 제8,779,108호, 및 미국 제2014/0356353호에 개시된 바와 같은, 항-PD-L1 항체 2.9D10, 또는 이의 단편을 포함한다. 예시적인 구현예에서, 본원에 제공된 방법에서 사용하기 위한 2.9D10 또는 이의 항원-결합 단편은 제WO 2011/066389호의 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(서열 번호: 154); 및/또는 제WO 2011/066389호의 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(서열 번호: 155)을 포함한다.
일 구현예에서, 표적화 모이어티는 이의 전체 개시내용이 본원에 참고로 포함된 제WO 2011/066389호, 미국 제8,779,108호, 및 미국 제2014/0356353호에 개시된 바와 같은, 항-PD-L1 항체 2.14H9, 또는 이의 단편을 포함한다. 예시적인 구현예에서, 본원에 제공된 방법에서 사용하기 위한 2.14H9 또는 이의 항원-결합 단편은 제WO 2011/066389호의 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(서열 번호: 156); 및/또는 제WO 2011/066389호의 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(서열 번호: 157)을 포함한다.
일 구현예에서, 표적화 모이어티는 이의 전체 개시내용이 본원에 참고로 포함된 제WO 2011/066389호, 미국 제8,779,108호, 및 미국 제2014/0356353호에 개시된 바와 같은, 항-PD-L1 항체 2.20A8, 또는 이의 단편을 포함한다. 예시적인 구현예에서, 본원에 제공된 방법에서 사용하기 위한 2.20A8 또는 이의 항원-결합 단편은 제WO 2011/066389호의 서열 번호: 32의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(서열 번호: 158); 및/또는 제WO 2011/066389호의 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(서열 번호: 159)을 포함한다.
일 구현예에서, 표적화 모이어티는 이의 전체 개시내용이 본원에 참고로 포함된 제WO 2011/066389호, 미국 제8,779,108호, 및 미국 제2014/0356353호에 개시된 바와 같은, 항-PD-L1 항체 3.15G8, 또는 이의 단편을 포함한다. 예시적인 구현예에서, 본원에 제공된 방법에서 사용하기 위한 3.15G8 또는 이의 항원-결합 단편은 제WO 2011/066389호의 서열 번호: 42의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(서열 번호: 160); 및/또는 제WO 2011/066389호의 서열 번호: 47의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(서열 번호: 161)을 포함한다.
일 구현예에서, 표적화 모이어티는 이의 전체 개시내용이 본원에 참고로 포함된 제WO 2011/066389호, 미국 제8,779,108호, 및 미국 제2014/0356353호에 개시된 바와 같은, 항-PD-L1 항체 3.18G1, 또는 이의 단편을 포함한다. 예시적인 구현예에서, 본원에 제공된 방법에서 사용하기 위한 3.18G1 또는 이의 항원-결합 단편은 제WO 2011/066389호의 서열 번호: 52의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(서열 번호: 162); 및/또는 제WO 2011/066389호의 서열 번호: 57의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(서열 번호: 163)을 포함한다.
일 구현예에서, 표적화 모이어티는 이의 전체 개시내용이 본원에 참고로 포함된 제WO 2011/066389호, 미국 제8,779,108호, 및 미국 제2014/0356353호에 개시된 바와 같은, 항-PD-L1 항체 2.7A4OPT, 또는 이의 단편을 포함한다. 예시적인 구현예에서, 본원에 제공된 방법에서 사용하기 위한 2.7A4OPT 또는 이의 항원-결합 단편은 제WO 2011/066389호의 서열 번호: 62의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(서열 번호: 164); 및/또는 제WO 2011/066389호의 서열 번호: 67의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(서열 번호: 165)을 포함한다.
일 구현예에서, 표적화 모이어티는 이의 전체 개시내용이 본원에 참고로 포함된 제WO 2011/066389호, 미국 제8,779,108호, 및 미국 제2014/0356353호에 개시된 바와 같은, 항-PD-L1 항체 2.14H90PT, 또는 이의 단편을 포함한다. 예시적인 구현예에서, 본원에 제공된 방법에서 사용하기 위한 2.14H90PT 또는 이의 항원-결합 단편은 제WO 2011/066389호의 서열 번호: 72의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(서열 번호: 166); 및/또는 제WO 2011/066389호의 서열 번호: 77의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(서열 번호: 167)을 포함한다.
일 구현예에서, 표적화 모이어티는 이의 전체 개시내용이 본원에 참고로 포함된 제WO 2016/061142호에 개시된 바와 같은, 항-PD-L1 항체 중 임의의 하나를 포함한다. 예시적인 구현예에서, 본원에 제공된 방법에서 사용하기 위한 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 제WO2016/061142호의 서열 번호: 18, 30, 38, 46, 50, 54, 62, 70, 및 78로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(제WO2016/061142호의 서열 번호: 18(서열 번호: 168); 제WO2016/061142호의 서열 번호: 30(서열 번호: 169); 제WO2016/061142호의 서열 번호: 38(서열 번호: 170); 제WO2016/061142호의 서열 번호: 46(서열 번호: 171); 제WO2016/061142호의 서열 번호: 50(서열 번호: 172); 제WO2016/061142호의 서열 번호: 54(서열 번호: 173); 제WO2016/061142호의 서열 번호: 62(서열 번호: 174); 제WO2016/061142호의 서열 번호: 70(서열 번호: 175); 및 제WO2016/061142호의 서열 번호: 78(서열 번호: 176)); 및/또는 제 WO2016/061142호의 서열 번호: 22, 26, 34, 42, 58, 66, 74, 82, 및 86로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄(제WO2016/061142호의 서열 번호: 22(서열 번호: 177); 제WO2016/061142호의 서열 번호: 26(서열 번호: 178); 제WO2016/061142호의 서열 번호: 34(서열 번호: 179); 제WO2016/061142호의 서열 번호: 42(서열 번호: 180); 제WO2016/061142호의 서열 번호: 58(서열 번호: 181); 제WO2016/061142호의 서열 번호: 66(서열 번호: 182); 제WO2016/061142호의 서열 번호: 74(서열 번호: 183); 제WO2016/061142호의 서열 번호: 82(서열 번호: 184); 및 제WO2016/061142호의 서열 번호: 86(서열 번호: 185))를 포함한다.
일 구현예에서, 표적화 모이어티는 이의 전체 개시내용이 본원에 참고로 포함된 제WO 2016/022630호에 개시된 바와 같은, 항-PD-L1 항체 중 임의의 하나를 포함한다. 예시적인 구현예에서, 본원에 제공된 방법에서 사용하기 위한 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 제WO2016/022630호의 서열 번호: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 및 46로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(제WO2016/022630호의 서열 번호: 2(서열 번호: 186); 제WO2016/022630호의 서열 번호: 6(서열 번호: 187); 제WO2016/022630호의 서열 번호: 10(서열 번호: 188); 제WO2016/022630호의 서열 번호: 14(서열 번호: 189); 제WO2016/022630호의 서열 번호: 18(서열 번호: 190); 제WO2016/022630호의 서열 번호: 22(서열 번호: 191); 제WO2016/022630호의 서열 번호: 26(서열 번호: 192); 제WO2016/022630호의 서열 번호: 30(서열 번호: 193); 제WO2016/022630호의 서열 번호: 34(서열 번호: 194); 제WO2016/022630호의 서열 번호: 38(서열 번호: 195); 제WO2016/022630호의 서열 번호: 42(서열 번호: 196); 및 제WO2016/022630호의 서열 번호: 46(서열 번호: 197)); 및/또는 제WO2016/022630호의 서열 번호: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 및 48로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄(제WO2016/022630호의 서열 번호: 4(서열 번호: 198); 제WOO2016/022630호의 서열 번호: 8(서열 번호: 199); 제 WO2016/022630호의 서열 번호: 12(서열 번호: 200); 제WO2016/022630호의 서열 번호: 16(서열 번호: 201); 제WO2016/022630호의 서열 번호: 20(서열 번호: 202); 제WO2016/022630호의 서열 번호: 24(서열 번호: 203); 제WO2016/022630호의 서열 번호: 28(서열 번호: 204); 제WO2016/022630호의 서열 번호: 32(서열 번호: 205); 제WO2016/022630호의 서열 번호: 36(서열 번호: 206); 제WO2016/022630호의 서열 번호: 40(서열 번호: 207); 제WO2016/022630호의 서열 번호: 44(서열 번호: 208); 및 제WO2016/022630호의 서열 번호: 48(서열 번호: 209))을 포함한다.
일 구현예에서, 표적화 모이어티는 이의 전체 개시내용이 본원에 참고로 포함된 제WO 2015/112900호에 개시된 바와 같은, 항-PD-L1 항체 중 임의의 하나를 포함한다. 예시적인 구현예에서, 본원에 제공된 방법에서 사용하기 위한 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 제WO2015/112900호의 서열 번호: 38, 50, 82, 및 86으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(제WO2015/112900호의 서열 번호: 38(서열 번호: 210); 제WO2015/112900호의 서열 번호: 50(서열 번호: 211); 제WOWO2015/112900호의 서열 번호: 82(서열 번호: 212); 및 제WO2015/112900호의 서열 번호: 86(서열 번호: 213)); 및/또는 제WO2015/112900호의 서열 번호: 42, 46, 54, 58, 62, 66, 70, 74 및 78로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄(제WOWO2015/112900호의 서열 번호: 42(서열 번호: 214); 제WO2015/112900호의 서열 번호: 46(서열 번호: 215); 제WO2015/112900호의 서열 번호: 54(서열 번호: 216); 제WO2015/112900호의 서열 번호: 58(서열 번호: 217); 제WO2015/112900호의 서열 번호: 62(서열 번호: 218); 제WO2015/112900호의 서열 번호: 66(서열 번호: 219); 제WO2015/112900호의 서열 번호: 70(서열 번호: 220); 제WO2015/112900호의 서열 번호: 74(서열 번호: 221); 및 제WO2015/112900호의 서열 번호: 78(서열 번호: 222))을 포함한다.
일 구현예에서, 표적화 모이어티는 이의 전체 개시내용이 본원에 참고로 포함된 제WO 2010/077634호 및 미국 제8,217,149호에 개시된 바와 같은, 항-PD-L1 항체 중 임의의 하나를 포함한다. 예시적인 구현예에서, 본원에 제공된 방법에서 사용하기 위한 항-PD-L1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 제WO2010/077634호의 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(서열 번호: 223); 및/또는 제WO2010/077634호의 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(서열 번호: 224)을 포함한다.
일 구현예에서, 표적화 모이어티는 이의 전체 내용이 본원에 참고로 포함된, 미국 제20120039906호에 개시된 바와 같은 CNCM 기탁 번호 제CNCM I-4122호, 제CNCM I-4080호 및 제CNCM I-4081호 하에 이용가능한 하이브리도마로부터 수득될 수 있는 항-PD-L1 항체 중 임의의 하나를 포함한다.
일 구현예에서, 표적화 모이어티는 예를 들면, 이의 전체 내용이 본원에 참고로 포함된, 미국 제US 8,907,065호 및 제WO2008/071447호호에 개시된 바와 같은 PD-L1에 대해 지시된 VHH를 포함한다. 예시적인 구현예에서, PD-1에 대한 VHH는 미국 제8,907,065호의 서열 번호: 394 내지 399(미국 제8,907,065호의 서열 번호: 394(서열 번호: 225); 미국 제8,907,065호의 서열 번호: 395(서열 번호: 226); 미국 제8,907,065호의 서열 번호: 396(서열 번호: 227); 미국 제8,907,065호의 서열 번호: 397(서열 번호: 228); 미국 제8,907,065호의 서열 번호: 398(서열 번호: 229); 및 미국 제8,907,065호의 서열 번호: 399(서열 번호: 230))를 포함한다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 다중-특이적인 키메라 단백질은 PD-12에 대해 지시된 하나 이상의 표적화 모이어티를 갖는다. 일부 구현예에서, 키메라 단백질은 PD-L2 폴리펩타이드에 선택적으로 결합하는 하나 이상의 표적화 모이어티를 갖는다. 일부 구현예에서, 키메라 단백질은 PD-L2 폴리펩타이드에 선택적으로 결합하는 하나 이상의 항체, 항체 유도체 또는 양식, 펩타이드 또는 폴리펩타이드, 또는 융합 단백질을 포함한다.
일 구현예에서, 표적화 모이어티는 이의 전체 내용이 본원에 참고로 포함된, 미국 제US 8,907,065호 및 제WO2008/071447호호에 개시된 바와 같은 PD-L1에 대해 지시된 VHH를 포함한다. 예시적인 구현예에서, PD-1에 대한 VHH는 미국 제8,907,065호의 서열 번호: 449 내지 455(미국 제8,907,065호의 서열 번호: 449(서열 번호: 231); 미국 제8,907,065호의 서열 번호: 450(서열 번호: 232); 미국 제8,907,065호의 서열 번호: 451(서열 번호: 233); 미국 제8,907,065호의 서열 번호: 452(서열 번호: 234); 미국 제8,907,065호의 서열 번호: 453(서열 번호: 235); 미국 제8,907,065호의 서열 번호: 454(서열 번호: 236); 및 미국 제8,907,065호의 서열 번호: 455(서열 번호: 237))를 포함한다.
일 구현예에서, 표적화 모이어티는 이의 전체 내용이 본원에 참고로 포함된, 미국 제2011/0271358호 및 제WO2010/036959호에 개시된 바와 같은 항-PD-L2 항체 중 임의의 하나를 포함한다. 예시적인 구현예에서, 본원에 제공된 방법에서 사용하기 위한 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 미국 제2011/0271358호의 서열 번호: 43 내지 47로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(미국 제2011/0271358호의 서열 번호: 43(서열 번호: 238); 미국 제2011/0271358호의 서열 번호: 44(서열 번호: 239); 미국 제2011/0271358호의 서열 번호: 45(서열 번호: 240); 미국 제2011/0271358호의 서열 번호: 46(서열 번호: 241); 및 미국 제2011/0271358호의 서열 번호: 47(서열 번호: 242)); 및/또는 미국 제2011/0271358호의 서열 번호: 48 내지 51로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄(서열 번호: 243); 미국 제2011/0271358호의 서열 번호: 49(서열 번호: 244); 미국 제2011/0271358호의 서열 번호: 50(서열 번호: 245); 및 미국 제2011/0271358호의 서열 번호: 51(서열 번호: 246))를 포함한다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 표적화 모이어티는 본원에 개시된 임의의 서열에 대해 적어도 약 60%, 적어도 약 61%, 적어도 약 62%, 적어도 약 63%, 적어도 약 64%, 적어도 약 65%, 적어도 약 66%, 적어도 약 67%, 적어도 약 68%, 적어도 약 69%, 적어도 약 70%, 적어도 약 71%, 적어도 약 72%, 적어도 약 73%, 적어도 약 74%, 적어도 약 75%, 적어도 약 76%, 적어도 약 77%, 적어도 약 78%, 적어도 약 79%, 적어도 약 80%, 적어도 약 81%, 적어도 약 82%, 적어도 약 83%, 적어도 약 84%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 동일한(예컨대, 본원에 개시된 서열 중 임의의 것과 약 60%, 또는 약 61%, 또는 약 62%, 또는 약 63%, 또는 약 64%, 또는 약 65%, 또는 약 66%, 또는 약 67%, 또는 약 68%, 또는 약 69%, 또는 약 70%, 또는 약 71%, 또는 약 72%, 또는 약 73%, 또는 약 74%, 또는 약 75%, 또는 약 76%, 또는 약 77%, 또는 약 78%, 또는 약 79%, 또는 약 80%, 또는 약 81%, 또는 약 82%, 또는 약 83%, 또는 약 84%, 또는 약 85%, 또는 약 86%, 또는 약 87%, 또는 약 88%, 또는 약 89%, 또는 약 90%, 또는 약 91%, 또는 약 92%, 또는 약 93%, 또는 약 94%, 또는 약 95%, 또는 약 96%, 또는 약 97%, 또는 약 98%, 약 99% 또는 약 100% 서열 동일성) PD-1, PD-L1, 및/또는 PD-L2를 표적화하는 서열을 포함할 수 있다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 표적화 모이어티는 본원에 개시된 PD-1, PD-L1, 및/또는 PD-L2를 표적화하는 중쇄, 경쇄, 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역, 상보성 결정 영역(CDR), 및 골격 영역의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2에 선택적으로 결합하거나 이를 표적화하는 추가의 항체, 항체 유도체 또는 양식, 펩타이드 또는 폴리펩타이드, 또는 융합 단백질은 제WO 2011/066389호, 미국 제2008/0025980호, 미국 제2013/0034559호, 미국 제8,779,108호, 미국 제2014/0356353호, 미국 제8,609,089호, 미국 제2010/028330호, 미국 제2012/0114649호, 제WO2010/027827호, 제WO2011/066342호, 미국 제 8,907,065호, 제WO2016/062722호, 제WO2009/101611호, 제WO2010/027827호, 제WO 2011/066342호, 제WO2007/005874호, 제WO2001/014556호, 미국 제2011/0271358호, 제WO2010/036959호, 제WO2010/077634호, 미국 제8,217,149호, 미국 제2012/0039906호, 제WO2012/145493호, 미국 제2011/0318373호, 미국 특허 제8,779,108호, 미국 제20140044738호, 제WO2009/089149호, 제WO2007/00587호, 제WO2016061142호, 제WO2016/02263호, 제WO2010/077634호, 및 제WO2015/112900호에 개시되어 있으며, 이의 전체 개시내용은 본원에 참고로 포함된다.
일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 케모킨과 같은 천연 리간드이다. 본 발명의 키메라 단백질에 포함될 수 있는 예시적인 케모킨은 CCL1, CCL2, CCL4, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9, CCL10, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CL17, CCL18, CCL19, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CLL25, CCL26, CCL27, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCL17, XCL1, XCL2, CX3CL1, HCC-4, 및 LDGF-PBP를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예시적인 구현예에서, 표적화 모이어티는 수지 세포 수용체 XCR1을 인식하여 이에 결합하는 케모킨인 XCL1일 수 있다. 다른 예시적인 구현예에서, 표적화 모이어티는 CCL1이며, 이는 CCR8을 인식하여 이에 결합하는 케모킨이다. 다른 예시적인 구현예에서, 표적화 모이어티는 CCL2이며, 이는 CCR2 또는 CCR9를 인식하여 이에 결합하는 케모킨이다. 다른 예시적인 구현예에서, 표적화 모이어티는 CCL3이며, 이는 CCR1, CCR5, 또는 CCR9를 인식하여 이에 결합하는 케모킨이다. 다른 예시적인 구현예에서, 표적화 모이어티는 CCL4이며, 이는 CCR1 또는 CCR5 또는 CCR9를 인식하여 이에 결합하는 케모킨이다. 다른 예시적인 구현예에서, 표적화 모이어티는 CCL5이며, 이는 CCR1 또는 CCR3 또는 CCR4 또는 CCR5를 인식하여 이에 결합하는 케모킨이다. 다른 예시적인 구현예에서, 표적화 모이어티는 CCL6이며, 이는 CCR1을 인식하여 이에 결합하는 케모킨이다. 다른 예시적인 구현예에서, 표적화 모이어티는 CCL7이며, 이는 CCR2 또는 CCR9를 인식하여 이에 결합하는 케모킨이다. 다른 예시적인 구현예에서, 표적화 모이어티는 CCL8이며, 이는 CCR1 또는 CCR2 또는 CCR2B 또는 CCR5 또는 CCR9를 인식하여 이에 결합하는 케모킨이다. 다른 예시적인 구현예에서, 표적화 모이어티는 CCL9이며, 이는 CCR1을 인식하여 이에 결합하는 케모킨이다. 다른 예시적인 구현예에서, 표적화 모이어티는 CCL10이며, 이는 CCR1을 인식하여 이에 결합하는 케모킨이다. 다른 예시적인 구현예에서, 표적화 모이어티는 CCL11이며, 이는 CCR2 또는 CCR3 또는 CCR5 또는 CCR9를 인식하여 이에 결합하는 케모킨이다. 다른 예시적인 구현예에서, 표적화 모이어티는 CCL13이며, 이는 CCR2 또는 CCR3 또는 CCR5 또는 CCR9를 인식하여 이에 결합하는 케모킨이다. 다른 예시적인 구현예에서, 표적화 모이어티는 CCL14이며, 이는 CCR1 또는 CCR9를 인식하여 이에 결합하는 케모킨이다. 다른 예시적인 구현예에서, 표적화 모이어티는 CCL15이며, 이는 CCR1 또는 CCR3을 인식하여 이에 결합하는 케모킨이다. 다른 예시적인 구현예에서, 표적화 모이어티는 CCL16이며, 이는 CCR1, CCR2, CCR5, 또는 CCR8을 인식하여 이에 결합하는 케모킨이다. 다른 예시적인 구현예에서, 표적화 모이어티는 CCL17이며, 이는 CCR4를 인식하여 이에 결합하는 케모킨이다. 다른 예시적인 구현예에서, 표적화 모이어티는 CCL19이며, 이는 CCR7 인식하여 이에 결합하는 케모킨이다. 다른 예시적인 구현예에서, 표적화 모이어티는 CCL20이며, 이는 CCR6을 인식하여 이에 결합하는 케모킨이다. 다른 예시적인 구현예에서, 표적화 모이어티는 CCL21이며, 이는 CCR7을 인식하여 이에 결합하는 케모킨이다. 다른 예시적인 구현예에서, 표적화 모이어티는 CCL22이며, 이는 CCR4를 인식하여 이에 결합하는 케모킨이다. 다른 예시적인 구현예에서, 표적화 모이어티는 CCL23이며, 이는 CCR1을 인식하여 이에 결합하는 케모킨이다. 다른 예시적인 구현예에서, 표적화 모이어티는 CCL24이며, 이는 CCR3을 인식하여 이에 결합하는 케모킨이다. 다른 예시적인 구현예에서, 표적화 모이어티는 CCL25이며, 이는 CCR9를 인식하여 이에 결합하는 케모킨이다. 다른 예시적인 구현예에서, 표적화 모이어티는 CCL26이며, 이는 CCR3을 인식하여 이에 결합하는 케모킨이다. 다른 예시적인 구현예에서, 표적화 모이어티는 CCL27이며, 이는 CCR10을 인식하여 이에 결합하는 케모킨이다. 다른 예시적인 구현예에서, 표적화 모이어티는 CCL28이며, 이는 CCR3 또는 CCR10을 인식하여 이에 결합하는 케모킨이다. 다른 예시적인 구현예에서, 표적화 모이어티는 CXCL1이며, 이는 CXCR1 또는 CXCR2를 인식하여 이에 결합하는 케모킨이다. 다른 예시적인 구현예에서, 표적화 모이어티는 CXCL2이며, 이는 CXCR2 인식하여 이에 결합하는 케모킨이다. 다른 예시적인 구현예에서, 표적화 모이어티는 CXCL3이며, 이는 CXCR2를 인식하여 이에 결합하는 케모킨이다. 다른 예시적인 구현예에서, 표적화 모이어티는 CXCL4이며, 이는 CXCR3B를 인식하여 이에 결합하는 케모킨이다. 다른 예시적인 구현예에서, 표적화 모이어티는 CXCL5이며, 이는 CXCR2를 인식하여 이에 결합하는 케모킨이다. 다른 예시적인 구현예에서, 표적화 모이어티는 CXCL6이며, 이는 CXCR1 또는 CXCR2를 인식하여 이에 결합하는 케모킨이다. 다른 예시적인 구현예에서, 표적화 모이어티는 CXCR1 또는 CXCR2를 인식하여 이에 결합하는 케모킨이다. 다른 예시적인 구현예에서, 표적화 모이어티는 CXCL9이며, 이는 CXCR3를 인식하여 이에 결합하는 케모킨이다. 다른 예시적인 구현예에서, 표적화 모이어티는 CXCL10이며, 이는 CXCR3을 인식하여 이에 결합하는 케모킨이다. 다른 예시적인 구현예에서, 표적화 모이어티는 CXCL11이며, 이는 CXCR3 또는 CXCR7을 인식하여 이에 결합하는 케모킨이다. 다른 예시적인 구현예에서, 표적화 모이어티는 CXCL12이며, 이는 CXCR4 또는 CXCR7을 인식하여 이에 결합하는 케모킨이다. 다른 예시적인 구현예에서, 표적화 모이어티는 CXCL13이며, 이는 CXCR5를 인식하여 이에 결합하는 케모킨이다. 다른 예시적인 구현예에서, 표적화 모이어티는 CXCL16이며, 이는 CXCR6을 인식하여 이에 결합하는 케모킨이다. 다른 예시적인 구현예에서, 표적화 모이어티는 LDGF-PBP이며, 이는CXCR2를 인식하여 이에 결합하는 케모킨이다. 다른 예시적인 구현예에서, 표적화 모이어티는 XCL2이며, 이는 XCR1을 인식하여 이에 결합하는 케모킨이다. 다른 예시적인 구현예에서, 표적화 모이어티는 CX3CL1이며, 이는 CX3CR1을 인식하여 이에 결합하는 케모킨이다.
다양한 구현예에서, 본 키메라 단백질은 다양한 조합의 표적화 모이어티를 포함한다. 예시적인 구현예에서, 본 키메라 단백질은 2개의 표적화 모이어티를 포함할 수 있으며, 여기서 표적화 모이어티 둘 다는 항체 또는 이의 유도체이다. 다른 예시적인 구현예에서, 본 키메라 단백질은 2개의 표적화 모이어티를 포함할 수 있으며, 여기서 표적화 모이어티 둘 다는 세포 수용체에 대한 천연 리간드이다. 추가의 예시적인 구현예에서, 본 키메라 단백질은 2개의 표적화 모이어티를 포함할 수 있으며, 여기서 표적화 모이어티 중 하나는 항체 또는 이의 유도체이고, 다른 표적화 모이어티는 세포 수용체에 대한 천연의 리간드이다.
다양한 구현예에서, 본 키메라 단백질의 인식 도메인은 목적한 표적(예컨대, 항원, 수용체)을 기능적으로 조절(비-제한적으로, 부분적으로 또는 완전히 중화)하는데, 예컨대, 항원이 가진 생물학적 효과를 실질적으로 억제하거나, 감소시키거나, 중화한다. 예를 들면, 다양한 인식 도메인이 예를 들면, 종양을 지닌 환자의 면역계를 활성적으로 억제중이거나, 억제하는 능력을 가진 하나 이상의 종양 항원에 대해 지시될 수 있다. 예를 들면, 일부 구현예에서, 본 키메라 단백질은 면역 억제성 신호(예컨대, 체크포인트 억제제), 예를 들면, TIM-3, BTLA, PD-1, CTLA-4, B7-H4, GITR, 갈렉틴(galectin)-9, HVEM, PD-L1, PD-L2, B7-H3, CD244, CD160, TIGIT, SIRPα, ICOS, CD172a, 및 TMIGD2 중 하나 이상을 기능적으로 조절한다. 예를 들면, 일부 구현예에서, 본 키메라 단백질은 면역 억제성 신호의 전파, 비-제한적인 예로서, PD-1과 PD-L1 또는 PD-L2의 결합 및/또는 CTLA-4와 AP2M1, CD80, CD86, SHP-2, 및 PPP2R5A 중 하나 이상의 결합을 파괴하고/하거나, 감소시키고/시키거나, 억제하기 위해 가공된다.
다양한 구현예에서, 본 키메라 단백질의 인식 도메인은 목적한 표적(예컨대, 항원, 수용체)에 결합하나 이를 기능적으로 조절하지 않는데, 예컨대, 인식 도메인은 결합 항체이거나 결합 항체일 수 있다. 예를 들면, 다양한 구현예에서, 인식 도메인은 항원 또는 수용체를 단순히 표적화하지만 항원 또는 수용체가 가진 생물학적 효과를 실질적으로 억제하거나, 감소시키거나 기능적으로 조절하지 않는다. 예를 들면, 상기 기술된 보다 작은 항체 양식 중 일부(예컨대, 예를 들면, 완전한 항체와 비교하여)는 접근하기 어려운 에피토프를 표적화하는 능력을 가지며 보다 큰 스펙트럼의 특수한 결합 부위를 제공한다. 다양한 구현예에서, 인식 도메인은 이의 생물학적 활성(예컨대, 항원의 활성 부위)에 대해 중요한 항원 또는 수용체 부위로부터 물리적으로 분리되는 에피토프에 결합한다.
이러한 비-중화 결합은 본 발명의 다양한 구현예, 예를 들면 본 키메라 단백질이 본원에 기술된 것들 중 임의의 것과 같이, 효과기 항원을 통해 필요한 부위에 활성 면역 세포를 직접 또는 간접적으로 모집하는데 사용되는 방법에서의 용도가 발견된다. 예를 들면, 다양한 구현예에서, 본 키메라 단백질은 종양을 감소시키거나 제거하는 방법(예컨대, 키메라 단백질은 항-CD8 인식 도메인 및 종양 항원에 대해 지시된 인식 도메인을 포함할 수 있다)에서 종양 세포에 대해 CD8을 통해 세포독성 T 세포를 직접 또는 간접적으로 모집하는데 사용될 수 있다. 이러한 구현예에서, CD8을 발현하는 세포독성 T 세포를 직접 또는 간접적으로 모집하지만 CD8 활성을 기능적으로 조절하지 않는 것이 바람직할 수 있다. 대조적으로, 이러한 구현예에서, CD8 신호전달은 종양 감소 또는 제거 효과의 중요한 부분이다. 추가의 예로서, 종양을 감소시키거나 제거하는 다양한 방법에서, 본 키메라 단백질은 CLEC9A을 통해 수지 세포(DC)를 직접 또는 간접적으로 모집하는데 사용된다(예컨대, 키메라 단백질은 항-CLEC9A 인식 도메인 및 종양 항원에 대해 지시된 인식 도메인을 포함할 수 있다). 이러한 구현예에서, CLEC9A를 발현하는 DC를 직접 또는 간접적으로 모집하지만, CLEC9A 활성을 기능적으로 조절하지 않는 것이 바람직할 수 있다. 대조적으로, 이러한 구현예에서, CLEC9A 신호전달은 종양 감소 또는 제거 효과의 중요한 부분이다.
다양한 구현예에서, 본 키메라 단백질의 인식 도메인은 예컨대, 수지 세포에서 XCR1에 결합한다. 예를 들면, 일부 구현예에서, 인식 도메인은 XCL1 또는 비-중화 항-XCR1 제제 중 모두 또는 일부를 포함한다.
다양한 구현예에서, 본 키메라 단백질의 인식 도메인은 면역 조절성 항원(예컨대, 면역 조절성 또는 면역 억제성)에 결합한다. 다양한 구현예에서, 면역 조절성 항원은 4-1BB, OX-40, HVEM, GITR, CD27, CD28, CD30, CD40, ICOS 리간드; OX-40 리간드, LIGHT(CD258), GITR 리간드, CD70, B7-1, B7-2, CD30 리간드, CD40 리간드, ICOS, ICOS 리간드, CD137 리간드 및 TL1A 중 하나 이상이다. 다양한 구현예에서, 이러한 면역 조절성 항원은 종양 세포에서 발현된다. 다양한 구현예에서, 본 키메라 단백질의 인식 도메인은 이러한 면역 조절성 항원에 결합하나 이를 기능적으로 조절하지 않으므로 이들의 잠재적인 종양 감소 또는 제거 능력의 감소 또는 손실없이 이러한 항원을 발현하는 세포의 모집을 허용한다.
다양한 구현예에서, 본 키메라 단백질의 인식 도메인은 중화 활성을 갖는 2개의 인식 도메인을 포함하거나, 비-중화 활성을 갖는 2개의 인식 도메인을 포함하거나, 비-중화(예컨대, 결합) 활성을 갖는 2개의 인식 도메인을 포함하거나, 중화 활성을 갖는 하나의 인식 도메인 및 비-중화(예컨대, 결합) 활성을 갖는 하나의 인식 도메인을 포함하는 키메라 단백질의 맥락에 있을 수 있다.
다양한 구현예에서, 다중-특이적인 키메라 단백질은 비-세포 구조의 일부인 표적(예컨대, 항원, 수용체)에 특이적으로 결합하는 인식 도메인을 갖는 표적화 모이어티를 갖는다. 일부 구현예에서, 항원 또는 수용체는 완전한 세포 또는 세포 구조의 필수 성분이 아니다. 일부 구현예에서, 항원 또는 수용체는 세포외 항원 또는 수용체이다. 일부 구현예에서, 표적은 DNA 또는 RNA, 예를 들면, 괴사성 종양 세포로부터 방출된 DNA 또는 콜레스테롤과 같은 세포외 침착물을 포함하는, 핵산을 포함하나, 이에 제한되지 않는 비-단백질성, 비-세포 마커이다.
일부 구현예에서, 목적한 표적(예컨대, 항원, 수용체)은 기질 또는 세포외 매트릭스(ECM) 또는 이와 관련된 마커의 비-세포 성분 중 일부이다. 본원에 사용된 바와 같이, 기질은 조직 또는 기관의 연결성 및 억제성 골격을 지칭한다. 기질은 세포, 예를 들면, 섬유아세포/근섬유아세포, 신경교, 상피, 지방, 면역, 혈관, 평활근, 및 면역 세포와 함께 세포외 매트릭스(ECM) 및 세포외 분자의 편집(compilation)을 포함할 수 있다. 다양한 구현예에서, 목적한 표적(예컨대, 항원, 수용체)은 기질의 비-세포 성분의 일부, 예를 들면, 세포외 매트릭스 및 세포외 분자이다. 본원에 사용된 바와 같은, ECM은 모든 조직 및 기관내에 존재하는 비-세포 성분을 지칭한다. ECM은 단백질, 당단백질, 프로테오글리칸, 및 다당류를 포함하나, 이에 한정되지 않는 생화학적으로 명확한 성분의 큰 수집물로 구성된다. ECM의 이러한 성분은 일반적으로 인접한 세포에 의해 생산되며 배출작용(exocytosis)을 통해 ECM내로 분비된다. 일단 분비되면, ECM 성분은 흔히 응집하여 거대분자의 복잡한 네트워크를 형성한다. 다양한 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 ECM의 임의의 성분에 위치한 표적(예컨대, 항원 또는 수용체 또는 비-단백질성 분자)을 인식하는 표적화 모이어티를 포함한다. ECM의 예시적인 성분은 프로테오글리칸, 비-프로테오글리칸 다당류, 섬유, 및 다른 ECM 단백질 또는 ECM 비-단백질, 예컨대, 다당류 및/또는 지질, 또는 ECM 관련된 분자(예컨대, 단백질 또는 비-단백질, 예컨대, 다당류, 핵산 및/또는 지질)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 ECM 프로테오그리칸 상의 표적(예컨대, 항원, 수용체)을 인식한다. 프로테오글리칸은 글리코실화된 단백질이다. 기본적인 프로테오글리칸 단위는 하나 이상의 공유결합으로 부착된 글리코스아미노글리칸(GAG) 쇄를 지닌 코어 단백질(core protein)을 포함한다. 프로테오글리칸은 양으로 하전된 나트륨 이온(Na+)을 끌어들이는 순 음성 전하(net negative charge)를 가지며 이는 삼투압을 통해 물 분자를 끌어들여, ECM 및 수화된 잔류 세포를 유지한다. 프로테오글리칸은 또한 ECM내에서 성장 인자를 트랩(trap)하여 저장하는 것을 도울 수 있다. 본 발명의 키메라 단백질에 의해 표적화될 수 있는 예시적인 프로테오글리칸은 헤파린 설페이트, 콘드로이틴 설페이트, 및 케라틴 설페이트를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일 구현예에서, 표적화 모이어티는 하이알루론산과 같은 비-프로테오글리칸 다당류에서 표적(예컨대, 항원, 수용체)을 인식한다.
일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 ECM 섬유 상에서 표적(예컨대, 항원, 수용체)을 인식한다. ECM 섬유는 콜라겐 섬유 및 엘라스틴 섬유를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 콜라겐 또는 콜라겐 섬유에서 하나 이상의 에피토프를 인식한다. 콜라겐은 ECM에서 가장 풍부한 단백질이다. 콜라겐은 원섬유성 단백질로서 ECM내에 존재하며 잔류 세포에 구조적 지지체를 제공한다. 하나 이상의 구현예에서, 표적화 모이어티는 ECM내에 존재하는 다양한 유형의 콜라겐, 예를 들면, 이에 제한되지 않는, 원섬유성 콜라겐(I, II, III, V, XI형), 패시트(facit) 콜라겐(IX, XII, XIV형), 단쇄 콜라겐(VIII, X형), 기저막 콜라겐(IV형), 및/또는 콜라겐 VI, VII, 또는 XIII형을 인식하여 이에 결합한다. 엘라스틴 섬유는 조직에 탄성을 제공함으로써 필요한 경우 이들이 신장된 후 이들의 원래 상태로 되돌아오도록 한다. 일부 구현예에서, 표적 모이어티는 엘라스틴 또는 엘라스틴 섬유 상의 하나 이상의 에피토프를 인식한다.
일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 하나 이상의 ECM 단백질, 예를 들면, 이에 한정되지 않는 테나신(tenascin), 피브로넥틴, 피브린, 라미닌, 또는 니도겐/엔탁틴을 인식한다.
일 구현예에서, 표적화 모이어티는 테나신을 인식하여 이에 결합한다. 당단백질의 테나신(TN) 계열은 적어도 4개의 구성원인, 테나신-C, 테나신-R, 테나신-X, 및 테나신 W를 포함한다. 테나신 단백질의 주요 구조는 동일한 연속적인 서열내에 정돈된 수개의 일반적인 모티프를 포함한다: 아미노-말단 헵태드 반복체(heptad repeat), 상피 성장 인자(EGF)-유사 반복체, 피브로넥틴 제III형 도메인 반복체, 및 카복실-말단 피브리노겐-유사 구형 도메인. 각각의 단백질 구성원은 EGF-유사 및 피브로넥틴 제III형 반복체의 수 및 특성에 있어서 대표적인 변이와 관련되어 있다. 동형 변이체는 또한 테나신-C와 관련하여 특히 존재한다. 테나신-C의 27개 이상의 스플라이스 변이체 및/또는 동형은 공지되어 있다. 특수한 구현예에서, 표적화 모이어티는 테나신-CA1을 인식하여 이에 결합한다. 유사하게, 테나신-R은 또한 다양한 스플라이스 변이체 및 동형을 갖는다. 테나신-R은 일반적으로 이량체 또는 삼량체로서 존재한다. 테나신-X는 테나신 계열의 가장 큰 구성원이며 삼량체로서 존재하는 것으로 알려져 있다. 테나신-W는 삼량체로서 존재한다. 일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 테나신 단백질 상의 하나 이상의 에피토프를 인식한다. 일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 테나신 단백질의 단량체성 및/또는 이량체성 및/또는 삼량체성 및/또는 육량체성 형태를 인식한다.
일 구현예에서, 표적화 모이어티는 피브로넥틴을 인식하여 이에 결합한다. 피브로넥틴은 세포를 ECM 상의 콜라겐 섬유와 연결시켜, 세포가 ECM을 통해 이동하도록 하는 당단백질이다. 인테그린에 대한 결합시, 피브로넥틴은 폴딩되지 않아서 기능성 이량체를 형성한다. 일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 피브로넥틴의 단량체성 및/또는 이량체성 형태를 인식한다. 일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 피브로넥틴 상의 하나 이상의 에피토프를 인식한다. 예시적인 구현예에서, 표적화 모이어티는 피브로넥틴 세포외 도메인 A(EDA) 또는 피브로넥틴 세포외 도메인 B(EDB)를 인식한다. 상승된 수준의 EDA는 건선, 류마티스 관절염, 당뇨병, 및 암을 포함하는 다양한 질환 및 장애와 관련되어 있다. 일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 EDA 동형을 함유하는 피브로넥틴을 인식하며 키메라 단백질을 암 세포를 포함하는 질환이 있는 세포에 대해 표적화하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 EDB 동형을 함유하는 피브로넥틴을 인식한다. 다양한 구현예에서, 이러한 표적화 모이어티는 키메라 단백질을 종양 신생혈관형성을 포함하는 종양 세포에 대해 표적화하기 위해 이용될 수 있다.
일 구현예에서, 표적화 모이어티는 피브린을 인식하여 이에 결합한다. 피브린은 ECM의 매트릭스 네트워크에서 흔히 발견되는 다른 단백질 물질이다. 피브린은 피브리노겐이 중합되도록 하는 피브리노겐 상의 프로테아제 트롬빈의 작용에 의해 형성된다. 일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 피브린 상의 하나 이상의 에피토프를 인식한다. 일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 피브린의 단량체성 형태 뿐만 아니라 중합된 형태도 인식한다.
일 구현예에서, 표적화 모이어티는 라미닌을 인식하여 이에 결합한다. 라미닌은 기본 라미나의 주요 성분이며, 이는 세포 및 기관에 대한 단백질 네트워크 토대이다. 라미닌은 α-쇄, β-쇄, 및 γ-쇄를 함유하는 이종삼량체성 단백질이다. 일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 라미닌 상의 하나 이상의 에피토프를 인식한다. 일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 라미닌의 단량체성, 이량체성 형태 뿐만 아니라 삼량체성 형태도 인식한다.
일 구현예에서, 표적화 모이어티는 질소 또는 엔탁틴을 인식하여 이에 결합한다. 니도겐/엔탁틴은 고도로 보존된, 황산염화된 당단백질의 계열이다. 이들은 기저막의 주요 구조적 성분을 구성하며 기저막에서 라미닌 및 콜라겐 IV 네트워크와 연결되도록 기능한다. 이러한 계열의 구성원은 니도겐-1 및 니도겐-2를 포함한다. 다양한 구현예에서, 표적화 모이어티는 니도겐-1 및/또는 니도겐-2 상의 에피토프를 인식한다.
다양한 구현예에서, 표적화 모이어티는 본원에 기술된 임의의 표적(예컨대, ECM 단백질)에 존재하는 에피토프를 인식하는 항원 인식 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, 항원-인식 도메인은 단백질 상에 존재하는 하나 이상의 선형 에피토프를 인식한다. 본원에 사용된 바와 같은, 선형 에피토프는 단백질 상에 존재하는 아미노산의 임의의 연속 서열을 지칭한다. 다른 구현예에서, 항원-인식 도메인은 단백질 상에 존재하는 하나 이상의 구조적 에피토프를 인식한다. 본원에 사용된 바와 같은, 구조 에피토프는 항원 인식 도메인에 의해 인식될 수 있는 특징 및/또는 형상 및/또는 3차 구조를 지닌 3차원 표면을 형성하는 아미노산의 하나 이상의 구획(section)(이는 불연속성일 수 있다)을 지칭한다.
다양한 구현예에서, 표적화 모이어티는 본원에 기술된 표적(예컨대, ECM 단백질) 중 어느 하나의 완전한 길이 및/또는 성숙한 형태 및/또는 동형 및/또는 스플라이스 변이체 및/또는 단편 및/또는 임의의 다른 천연적으로 발생하거나 합성인 유사체, 변이체, 또는 돌연변이체에 결합할 수 있다. 다양한 구현예에서, 표적화 모이어티는 본원에 기술된 임의의 형태의 단백질, 예를 들면, 단량체성, 이량체성, 삼량체성, 사량체성, 이종이량체성, 다량체성 및 관련 형태에 결합할 수 있다. 다양한 구현예에서, 표적화 모이어티는 본원에 기술된 단백질의 임의의 해독후 변형된 형태, 예를 들면, 글리코실화되고/되거나 인산화된 형태에 결합할 수 있다.
다양한 구현예에서, 표적화 모이어티는 세포외 분자, 예를 들면, DNA를 인식하는 항원 인식 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 DNA를 인식하는 항원 인식 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, DNA는 괴사성 또는 세포자멸사성 종양 세포 또는 다른 질환이 있는 세포로부터의 세포외 공간으로 흐른다.
다양한 구현예에서, 표적화 모이어티는 죽상경화판(atherosclerotic plaque)과 관련된 하나 이상의 비-세포 구조를 인식하는 항원 인식 도메인을 포함한다. 2개 유형의 죽상경화성 플라크가 알려져 있다. 피브로-지질(피브로-지방) 플라크는 동맥의 내막 아래의 지질-함유 세포(lipid-laden cell)의 축적을 특징으로 한다. 내피 아래에서는 플라크의 죽상경화성 코어를 덮는 섬유성 캡(fibrous cap)이 존재한다. 코어는 상승된 조직 콜레스테롤 및 콜레스테롤 에스테르 함량, 피브린, 프로테오글리칸, 콜라겐, 엘라스틴 및 세포 부스러기를 지닌 지질-함유 세포(대식구 및 평활근 세포)를 포함한다. 발달한 플라크에서, 플라크의 중심 코어는 일반적으로 세포외 콜레스테롤 침착물(죽은 세포로부터 방출됨)을 포함하며, 이는 빈, 침-유사 틈(needle-like cleft)을 지닌 콜레스테롤 결정의 부위를 형성한다. 플라크의 주변에는 보다 젊은 포말 세포(foamy cell) 및 모세관이 존재한다. 섬유성 플라크는 또한 동맥의 벽 내에 내막 아래에 국재화되어 벽의 비후화 및 확장 및 때때로 근육층의 일부 위축과 함께 관강의 반점이 많은 국재화된 협소화를 야기한다. 섬유성 플라크는 콜라겐 섬유(호산구성), 칼슘(친헤마톡실린성(hematoxylinophilic)) 및 지질-함유 세포의 침전물을 함유한다. 일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 이러한 플라크의 하나 이상의 비-세포 성분, 예를 들면, 피브린, 프로테오글리칸, 콜라겐, 엘라스틴, 세포 부스러기, 및 칼슘 또는 기타 무기물 침착물 또는 침전물을 인식하여 이에 결합한다. 일부 구현예에서, 세포 부스러기는 죽은 세포로부터 방출된 핵산, 예컨대, DNA 또는 RNA이다.
다양한 구현예에서, 표적화 모이어티는 신경변성 질환과 관련된 뇌 플라크내에서 발견된 하나 이상의 비-세포 구조를 인식하는 항원 인식 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 알츠하이머 질환을 지닌 환자의 뇌에서 발견된 아밀로이드 플라크내에 위치하는 하나 이상의 비-세포 구조를 인식하여 이에 결합한다. 예를 들면, 표적화 모이어티는 아밀로이드 플라크의 주요 성분인, 펩타이드 아밀로이드 베타를 인식하여 이에 결합한다. 일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 헌팅톤 질환을 지닌 환자에서 발견된 뇌 플라크내에 위치한 하나 이상의 비-세포 구조를 인식하여 이에 결합한다. 다양한 구현예에서, 표적화 모이어티는 다른 신경변성 또는 근골격 질환, 예를 들면, 루이소체 치매(Lewy body dementia) 및 봉입체 근염(inclusion body myositis)과 관련된 플라크에서 발견된 하나 이상의 비-세포 구조를 인식하여 이에 결합한다.
링커 및 기능성 그룹
다양한 구현예에서, 본 키메라 단백질은 하나 이상의 기능성 그룹, 잔기, 또는 모이어티를 포함할 수 있다. 다양한 구현예에서, 하나 이상의 기능성 그룹, 잔기, 또는 모이어티는 본원에 기술된 임의의 신호전달제 또는 표적화 모이어티(예컨대, SIRP1α)에 부착되거나 유전적으로 융합된다. 일부 구현예에서, 이러한 기능성 그룹, 잔기 또는 모이어티는 본 발명의 키메라 단백질에 대한 하나 이상의 목적한 특성 또는 기능성을 부여한다. 이러한 기능성 그룹 및 이들을 본 키메라 단백질에 도입하는 기술은 당해 분야에 알려져 있다. 예를 들면, Remington's 약제학적 Sciences, 16th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa.(1980)을 참고한다.
다양한 구현예에서, 본 키메라 단백질은 다른 제제에 접합되고/되거나 융합되어 반감기를 연장하거나 달리는 약력학적 및 약동학적 특성을 개선시킨다. 일부 구현예에서, 본 키메라 단백질은 하나 이상의 PEG, XTEN(예컨대, rPEG로서), 폴리시알산(POLYXEN), 알부민(예컨대, 사람 혈청 알부민 또는 HAS), 엘라스틴-유사 단백질(ELP), PAS, HAP, GLK, CTP, 트랜스페린 등과 융합되거나 접합될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 키메라 단백질은 항체 또는 항체 단편, 예를 들면, Fc 단편과 융합되거나 접합될 수 있다. 예를 들면, 키메라 단백질은 사람 면역글로불린(Ig) G의 Fc 도메인의 N-말단 또는 C-말단에 융합될 수 있다. 다양한 구현예에서, 각각의 개개 키메라 단백질은 이의 전체 내용이 본원에 참고로 포함된, BioDrugs(2015) 29:215-239에 기술된 하나 이상의 제제에 융합된다.
일부 구현예에서, 기능성 그룹, 잔기, 또는 모이어티는 적합한 약리학적으로 허용되는 중합체, 예를 들면, 폴리(에틸렌글리콜)(PEG) 또는 이의 유도체(예를 들면, 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 또는 mPEG)를 포함한다. 일부 구현예에서, PEG 모이어티의 부착은 SIRP1α 결합 단백질의 반감기를 증가시키고/시키거나 면역원성을 감소시킨다. 일반적으로, 페길화(pegylation)의 임의의 적합한 형태, 예를 들면, 항체 및 항체 단편(단일 도메인 항체, 예를 들면, VHH를 포함하나 이에 한정되지 않는다)에 대해 당해 분야에 사용된 페길화가 사용될 수 있다; 참고: 예를 들면, 이의 전체 내용이 본원에 참고로 포함된, Chapman, Nat. Biotechnol., 54, 531-545(2002); Veronese 및 Harris에 의한, Adv. Drug Deliv. Rev. 54, 453-456(2003), Harris 및 Chess에 의한, Nat. Rev. Drug. Discov., 2,(2003) 및 제WO04060965호. 단백질의 페길화를 위한 다양한 시약이 또한 예를 들면, Nektar Therapeutics(미국 소재)으로부터 상업적으로 이용가능하다. 일부 구현예에서, 부위-지시된 페길화를 특히 시스테인-잔기(참고: 예를 들면, Yang et al., Protein Engineering, 16, 10, 761-770(2003), 이의 전체 내용은 본원에 참고로 포함됨)를 통해 사용된다. 예를 들면, 이러한 목적을 위해, PEG는 본 발명의 키메라 단백질에서 천연적으로 발생하는 시스테인 잔기에 부착될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 PEG의 부착을 위한 하나 이상의 시스테인 잔기를 적합하게 도입하도록 변형되거나, PEG의 부착을 위한 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 아미노산 서열은 당해 분야에 공지된 기술을 사용하여, 본 키메라 단백질의 아미노- 및/또는 카복시-말단에 융합될 수 있다.
일부 구현예에서, 기능성 그룹, 잔기, 또는 모이어티는 N-연결되거나 O-연결된 글리코실화를 포함한다. 일부 구현예에서, N-연결되거나 O-연결된 글리코실화는 공-해독성(co-translational) 및/또는 해독후 변형의 일부로서 도입된다.
일부 구현예에서, 기능성 그룹, 잔기, 또는 모이어티는 하나 이상의 검출가능한 표지 또는 다른 신호-생성 그룹 또는 모이어티를 포함한다. 이들을 부착하고, 사용하며 검출하기에 적합한 표지 및 기술은 당해 분야에 공지되어 있으며, 형광성 표지(예를 들면, 플루오레세인, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리트린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데하이드, 및 플루오레스카민(fluorescamine) 및 형광성 금속, 예를 들면, Eu 또는 란탄 족으로부터의 다른 금속), 인광성 표지, 화학발광성 표지 또는 생물발광성 표지(예를 들면, 루미날, 이소루미날, 써로매틱 아크리듐 에스테르(theromatic acridinium ester), 이미다졸, 아크리디늄 염, 옥살레이트 에스테르, 디옥세탄 또는 GFP 및 이의 유사체), 방사성-동위원소, 금속, 금속 킬레이트 또는 금속성 양이온 또는 다른 금속 또는 생체내, 시험관내 또는 발생부위내(in situ) 진단 및 영상화에서 사용하기에 특히 적합한 다른 금속 또는 금속성 양이온뿐만 아니라 발색단 및 효소(예를 들면, 말레이트 데하이드로게나제, 스타필로코쿠스 뉴클레아제, 델타-스테로이드 이소머라제, 효모 알코올 데하이드로게나제, 알파-글리세로포스페이트 데하이드로게나제, 트리오스 포스페이트 이소머라제, 바이오틴아비딘 퍼옥시다제, 서양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타제, 아스파라기나제, 글루코즈 옥시다제, 베타-갈락토시다제, 리보뉴클레아제, 우레아제, 카탈라제, 글루코즈-VI-포스페이트 데하이드로게나제, 글루코아밀라제 및 아세틸콜린 에스테라제)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 다른 적합한 표지는 NMR 또는 ESR 분광법을 사용하여 검출할 수 있다. 본 발명의 이러한 표지된 VHH 및 폴리펩타이드는 특정 표지의 선택에 따라서, 시험관내, 생체내 또는 발생부위내 검정(그 자체로 공지된 면역검정, 예를 들면, ELISA, RIA, EIA 및 다른 "샌드위치 검정" 등을 포함함)뿐만 아니라 생체내 진단 및 영상화 목적으로도 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 기능성 그룹, 잔기, 또는 모이어티는 키메라 단백질에 부착되거나 유전적으로 융합된 태그(tag)를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 키메라 단백질은 단일의 태그 또는 다수의 태그를 포함할 수 있다. 태그는 예를 들면, 펩타이드, 당, 또는 SIRP1α 또는 목적한 임의의 다른 항원, 예를 들면, 종양 항원에 대한 본 키메라 단백질의 결합을 억제하거나 방지하지 않는 DNA 분자일 수 있다. 다양한 구현예에서, 태그는 적어도 약 3 내지 5개 아미노산 길이, 5 내지 8개의 아미노산 길이, 8 내지 12개의 아미노산 길이, 12 내지 15개의 아미노산 길이, 또는 15 내지 20개의 아미노산 길이일 수 있다. 예시적인 태그는 예를 들면, 미국 특허 공보 제US2013/0058962호에 기술되어 있다. 일부 구현예에서, 태그는 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST) 및 히스티딘(His) 태그와 같은 친화성 태그이다. 일 구현예에서, 본 키메라 단백질은 His 태그를 포함한다.
일부 구현예에서, 기능성 그룹, 잔기, 또는 모이어티는 예를 들면, 하나 이상의 금속 또는 금속성 양이온을 킬레이트하기 위한 킬레이팅 그룹을 포함한다. 적합한 킬레이팅 그룹은 예를 들면, 디에틸-에네트리아미노펜타아세트산(DTPA) 또는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, 기능성 그룹, 잔기, 또는 모이어티는 특이적 결합 쌍의 일부분인 기능성 그룹, 예를 들면, 바이오틴-(스트렙트)아비딘 결합 쌍을 포함한다. 이러한 기능성 그룹은 본 발명의 키메라 단백질을 즉, 결합 쌍의 형성을 통해 결합쌍의 다른 1/2에 결합되는 다른 단백질, 폴리펩타이드 또는 화학적 화합물에 연결시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 키메라 단백질은 바이오틴에 접합될 수 있고, 아비딘 또는 스트렙타비딘에 접합된 다른 단백질, 폴리펩타이드, 화합물 또는 담체에 접합될 수 있다. 예를 들면, 이러한 접합된 본 키메라 단백질은 예를 들면, 진단 시스템에서 리포터(reporter)로서 사용될 수 있으며, 여기서 검출가능한 신호-생성제는 아비딘 또는 스트렙타비딘에 접합된다. 이러한 결합 쌍은 예를 들면, 또한 본 발명의 키메라 단백질을 약제학적 목적에 적합한 담체를 포함하는 담체에 결합시키는데 사용될 수 있다. 하나의 비-제한적 예는 Cao and Suresh, Journal of Drug Targeting, 8, 4, 257(2000)에 기술된 리포좀 제형이다. 이러한 결합 쌍을 또한 사용하여 치료학적으로 활성인 제제를 본 발명의 키메라 단백질에 연결할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 키메라 단백질은 임의로 하나 이상의 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 표적화 모이어티 및 신호전달제를 연결시키는 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 신호전달제내에 링커를 포함한다(예컨대, 단일 쇄 TNF의 경우, 이는 2개의 링커를 포함함으로써 삼량체를 생성할 수 있다).
일부 구현예에서, 본원에 기술된 임의의 링커에 단일 뉴클레오타이드 서열로서 연결된 본 키메라 단백질을 암호화하는 벡터가 제공되며 이러한 키메라 단백질을 제조하는데 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 링커 길이는 표적화 모이어티 및 신호전달제를 이들의 수용체에 결합시키는데 효율적이도록 한다. 예를 들면, 일부 구현예에서, 링커 길이는 표적화 모이어티 및 신호전달제 중 하나가 동일한 세포 상의 수용체에 효율적으로 결합할 뿐만 아니라 다른 표적화 모이어티를 다른 세포에 효율적으로 결합하도록 한다. 예시적인 세포의 쌍은 본원의 어딘가에 제공된다.
일부 구현예에서 링커 길이는 동일한 세포상의 수용체에 대한 표적화 모이어티 및 신호전달제 중 하나의 결합 부위 사이의 최소 거리와 적어도 동일하다. 일부 구현예에서 링커 길이는 동일한 세포 상의 표적화 모이어티와 신호전달제 중 하나의 결합 부위 사이의 최소 길이의 적어도 2배, 또는 적어도 3배, 또는 적어도 4배, 또는 5배, 또는 10배, 또는 20배, 또는 25배, 또는 50배이다.
본원에 기술된 바와 같은, 링커 길이는 동일한 세포 상의 수용체에 대한 표적화 모이어티 및 신호전달제 중 하나의 효율적인 결합을 허용하며, 결합은 순차적, 예를 들면, 표적화 모이어티/수용체 결합에 이은 신호전달제/수용체 결합이다.
일부 구현예에서, 단일 키메라 상에 2개의 링커가 존재하며, 각각은 신호전달제를 표적화 모이어티에 연결한다. 다양한 구현예에서, 링커는 어느 세포의 조정도 방지하는 입체 장애없이 질환 세포 및 효과기 세포를 갖는 부위의 형성을 허용하는 길이를 갖는다.
본 발명은 다양한 링커 서열의 사용을 고려한다. 다양한 구현예에서, 링커는 천연적으로 발생하는 다중-도메인 단백질일 수 있거나 예를 들면, 이의 전체 내용이 본원에 참고로 포함된, 문헌: Chichili et al.,(2013), Protein Sci. 22(2):153-167, Chen et al.,(2013), Adv Drug Deliv Rev. 65(10):1357-1369에 기술된 바와 같은 실험적 링커이다. 일부 구현예에서, 링커는 이의 전체 내용이 본원에 참고로 포함된, 문헌: Chen et al.,(2013), Adv Drug Deliv Rev. 65(10):1357-1369 및 Crasto et al.,(2000), Protein Eng. 13(5):309-312에 기술된 것과 같은 링커 설계 데이타베이스 및 컴퓨터 프로그램을 사용하여 설계할 수 있다. 다양한 구현예에서, 링커는 기능성일 수 있다. 예를 들면, 제한없이, 링커는 폴딩 및/또는 안전성을 증진시키고/시키거나, 발현을 증진시키고/시키거나, 약동학을 증진시키고/시키거나, 본 키메라 단백질의 생물활성을 증진시키도록 작용할 수 있다.
일부 구현예에서, 링커는 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 링커는 약 100개 미만의 아미노산 길이이다. 예를 들면, 링커는 약 100개, 약 95개, 약 90개, 약 85개, 약 80개, 약 75개, 약 70개, 약 65개, 약 60개, 약 55개, 약 50개, 약 45개, 약 40개, 약 35개, 약 30개, 약 25개, 약 20개, 약 19개, 약 18개, 약 17개, 약 16개, 약 15개, 약 14개, 약 13개, 약 12개, 약 11개, 약 10개, 약 9개, 약 8개, 약 7개, 약 6개, 약 5개, 약 4개, 약 3개, 또는 약 2개 미만의 아미노산 길이일 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 링커는 약 100개 이상의 아미노산 길이이다. 예를 들면, 링커는 약 100개, 약 95개, 약 90개, 약 85개, 약 80개, 약 75개, 약 70개, 약 65개, 약 60개, 약 55개, 약 50개, 약 45개, 약 40개, 약 35개, 약 30개, 약 25개, 약 20개, 약 19개, 약 18개, 약 17개, 약 16개, 약 15개, 약 14개, 약 13개, 약 12개, 약 11개, 약 10개, 약 9개, 약 8개, 약 7개, 약 6개, 약 5개, 약 4개, 약 3개, 또는 약 2개 이상의 아미노산 길이이다. 일부 구현예에서, 링커는 굴곡성이다. 다른 구현예에서, 링커는 강직성이다.
일부 구현예에서, 링커는 2개의 표적화 모이어티를 서로 연결시키고 이러한 링커는 짧은 길이를 가지며, 링커는 표적화 모이어티 및 신호전달제를 연결시키고 이러한 링커는 2개의 표적화 모이어티를 연결시키는 링커보다 더 길다. 예를 들면, 2개의 표적화 모이어티 및 링커를 연결시키는 링커 사이의 아미노산 길이에 있어서의 차이는 약 100개, 약 95개, 약 90개, 약 85개, 약 80개, 약 75개, 약 70개, 약 65개, 약 60개, 약 55개, 약 50개, 약 45개, 약 40개, 약 35개, 약 30개, 약 25개, 약 20개, 약 19개, 약 18개, 약 17개, 약 16개, 약 15개, 약 14개, 약 13개, 약 12개, 약 11개, 약 10개, 약 9개, 약 8개, 약 7개, 약 6개, 약 5개, 약 4개, 약 3개, 또는 약 2개 아미노산일 수 있다.
다양한 구현예에서, 링커는 실질적으로 글리신 및 세린 잔기(예컨대, 약 30%, 또는 약 40%, 또는 약 50%, 또는 약 60%, 또는 약 70%, 또는 약 80%, 또는 약 90%, 또는 약 95%, 또는 약 97% 글리신 및 세린)를 포함한다. 예를 들면, 일부 구현예에서, 링커는 (Gly4Ser)n이고 여기서 n은 약 1 내지 약 8, 예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8이다(서열 번호: 247 내지 서열 번호: 254). 일 구현예에서, 링커 서열은 GGSGGSGGGGSGGGGS(서열 번호: 255)이다. 추가의 예시적인 링커는 서열 LE, GGGGS(서열 번호: 247), (GGGGS)n(n=1-4)(서열 번호: 247 내지 서열 번호: 250), (Gly)8(서열 번호: 256), (Gly)6(서열 번호: 257), (EAAAK)n(n=1-3)(서열 번호: 258 내지 서열 번호: 260), A(EAAAK)nA(n = 2-5)(서열 번호: 261 내지 서열 번호: 264), AEAAAKEAAAKA(서열 번호: 261), A(EAAAK)4ALEA(EAAAK)4A(서열 번호: 265), PAPAP(서열 번호: 266), KESGSVSSEQLAQFRSLD(서열 번호: 267), EGKSSGSGSESKST(서열 번호: 268), GSAGSAAGSGEF(서열 번호: 269), 및 (XP)n(여기서 X는 임의의 아미노산, 예컨대, Ala, Lys, 또는 Glu이다)이다. 다양한 구현예에서, 링커는 GGS이다.
일부 구현예에서, 링커는 GGGSE(서열 번호: 270), GSESG(서열 번호: 271), GSEGS(서열 번호: 272), GEGGSGEGSSGEGSSSEGGGSEGGGSEGGGSEGGS(서열 번호: 273), 및 4개의 아미노산 간격마다 무작위로 위치한 G, S, 및 E 중 하나 이상이다.
일부 구현예에서, 링커는 항체(예컨대, 소부류(예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4, 및 IgA1 및 IgA2)을 포함하는, IgG, IgA, IgD, 및 IgE)의 힌지(hinge) 영역이다. 다양한 구현예에서, 링커는 항체(예컨대, 소부류(예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4, 및 IgA1 및 IgA2)를 포함하는 IgG, IgA, IgD, 및 IgE)의 힌지 영역이다. IgG, IgA, IgD, 및 IgE 부류 항체에서 발견된 힌지 영역은 굴곡성 스페이서로서 작용하여, Fab 부위가 공간내에서 자유로이 이동하도록 한다. 불변 영역과는 대조적으로, 힌지 도메인은 구조적으로 다양하여, 서열 및 길이 둘 다에 있어 면역글로불린 및 소부류 중에서 다양하다. 예를 들면, 힌지 영역의 길이 및 굴곡성은 IgG 소부류 중에서 다양하다. IgG1의 힌지 영역은 아미노산 216 내지 231를 포함하며, 이는 자유롭게 굴곡성이므로, Fab 단편은 대략 이들의 대칭 축을 회전할 수 있으며 2개의 중쇄간 이황화물 브릿지 중 첫번째에서 중앙에 있는 구체내에서 이동할 수 있다. IgG2는 12개의 아미노산 잔기 및 4개의 이황화물 브릿지를 지닌, IgG1보다 더 짧은 힌지를 갖는다. IgG2의 힌지 영역은 글리신 잔기를 결여하며, 비교적 짧고, 과외의 중쇄간 이황화물 브릿지에 의해 안정화된, 강직성 폴리-프롤린 이중 나선을 함유한다. 이러한 특성은 IgG2 분자의 굴곡성을 제한한다. IgG3은 이의 유일하게 연장된 힌지 영역(IgG1 힌지와 같이 약 4배 길다)에 의해 다른 소부류와는 상이하며, 62개의 아미노산(21개의 프롤린 및 11개의 시스테인을 포함)을 함유하며, 굴곡성 폴리-프롤린 이중 나선을 형성한다. IgG3에서, Fab 단편은 Fc 단편과는 비교적 멀리 떨어져서, 보다 큰 굴곡성의 분자를 제공한다. IgG3내 연장된 힌지는 또한 다른 소부류와 비교하여 이의 보다 큰 분자량에 관여한다. IgG4의 힌지 영역은 IgG1의 영역보다 더 짧으며 이의 굴곡성은 IgG1와 IgG2 사이의 중간이다. 힌지 영역의 굴곡성은 IgG3>IgG1>IgG4>IgG2의 순서로 크게 감소한다.
결정적 연구에 따라서, 면역글로불린 힌지 영역은 기능적으로 3개 영역으로 추가로 세분될 수 있다: 상부 힌지 영역, 코어 영역, 및 하부 힌지 영역. 참고: Shin et al., 1992 Immunological Reviews 130:87. 상부 힌지 영역은 CH1의 카복실 말단으로부터 운동을 제한하는 힌지내 제1 잔기, 일반적으로 2개의 중쇄 사이에 쇄간 이황화물 결합을 형성하는 제1 시스테인 잔기까지의 아미노산을 포함한다. 상부 힌지 영역의 길이는 항체의 분절 굴곡성과 상호 관련된다. 코어 힌지 영역은 중간 이황화물 브릿지를 함유하고, 하부 힌지 영역은 CH2 도메인의 아미노 말단 끝은 결합시키고 CH2내 확인된 잔기를 포함한다. 위와 동일(Id.). 야생형 사람 IgG1의 코어 힌지 영역은 서열 Cys-Pro-Pro-Cys(서열 번호: 274)을 포함하며, 이는 이황화물 결합 형성에 의해 이량체화되는 경우, 피봇(pivot)으로서 작용함으로써 굴곡성을 부여하는 것으로 여겨진 사이클릭 옥타펩타이드를 생성한다. 다양한 구현예에서, 본 링커는 임의의 항체(예컨대, 소부류(예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4, 및 IgA1 및 IgA2)를 포함하는 IgG, IgA, IgD, 및 IgE)의 1개, 또는 2개, 또는 3개의 상부 힌지 영역, 코어 영역, 및 하부 힌지 영역을 포함한다. 힌지 영역은 또한 하나 이상의 글리코실화 부위를 함유할 수 있으며, 이는 다수의 구조적으로 명확한 유형의 탄수화물 부착용 부위를 포함한다. 예를 들면, IgA1은 힌지 영역의 17-아미노-산 분절내에 5개의 글리코실화 부위를 함유함으로써, 장 프로테아제에 대한 힌지 영역 폴리펩타이드의 내성을 부여하며, 이는 분비성 면역글로불린에 대한 유리한 특성으로 고려된다. 다양한 구현예에서, 본 발명의 링커는 하나 이상의 글리코실화 부위를 포함한다. 다양한 구현예에서, 링커는 사람 IgG4 항체의 힌지-CH2-CH3 도메인이다.
경우에 따라, 본 키메라 단백질은 CH2 및 CH3 도메인 중 하나 또는 둘 다, 및 임의로 힌지 영역을 포함하는 항체 Fc 영역에 연결될 수 있다. 예를 들면, Fc 영역에 대해 단일 뉴클레오타이드 서열로서 연결된 본 키메라 단백질을 암호화하는 벡터는 이러한 폴리펩타이드를 제조하는데 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 링커는 합성 링커, 예를 들면, PEG이다.
다양한 구현예에서, 링커는 기능성일 수 있다. 예를 들면, 제한없이, 링커는 본 키메라 단백질의 폴딩 및/또는 안전성을 증진시키고/시키거나, 발현을 증진시키고/시키거나, 약동학을 증진시키고/시키거나 생물활성을 증진시키기 위해 기능할 수 있다. 다른 예에서, 링커는 키메라 단백질을 특수한 세포형 또는 위치에 표적화하기 위해 기능할 수 있다.
키메라 단백질의 변형 및 생산
다양한 구현예에서, 본 키메라 단백질은 VHH인 표적화 모이어티(예컨대, SIRP1α)를 포함한다. 다양한 구현예에서, VHH는 특정의 생물학적 공급원 또는 특정의 제조 방법에 제한되지 않는다. 예를 들면, VHH는 일반적으로: (1) 천연적으로 발생하는 중쇄 항체의 VHH 도메인의 단리에 의해; (2) 천연적으로 발생하는 VHH 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드의 발현에 의해; (3) 천연적으로 발생하는 VHH 도메인의 "사람화"에 의해 또는 이러한 사람화 VHH 도메인을 암호화하는 핵산의 발현에 의해; (4) 임의의 동물 종으로부터, 포유동물 종, 예를 들면, 사람으로부터 천연적으로 발생하는 VH 도메인의 "카멜화(camelization)"에 의해, 또는 이러한 카멜화된 VH 도메인을 암호화하는 핵산의 발현에 의해; (5) 당해 분야에 기술된 바와 같은 "도메인 항체" 또는 "Dab"의 "카멜화"에 의해, 또는 이러한 카멜화된 VH 도메인을 암호화하는 핵산을 발현에 의해; (6) 당해 분야에 공지된 단백질, 폴리펩타이드 또는 다른 아미노산 서열을 제조하기 위한 합성 또는 반-합성 기술에 의해; (7) 당해 분야에 공지된 핵산 합성을 위한 기술을 사용하는 VHH를 암호화하는 핵산을 제조한 후, 이렇게 수득된 핵산을 발현함에 의해; 및/또는 (8) 앞서의 하나 이상의 임의의 조합에 의해 수득될 수 있다.
일 구현예에서, 키메라 단백질은 사람 SIRP1α에 대해 지시된 천연적으로 발생하는 중쇄 항체의 VHH 도메인에 상응하는 VHH를 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 VHH 서열은 일반적으로 카멜리드(Camelid)의 종을 SIRP1α 분자로 적합하게 면역화시킴으로써(즉, SIRP1α에 대해 지시된 면역 반응 및/또는 중쇄 항체를 상승시키기 위하여), 카멜리드로부터의 적합한 생물학적 샘플(예를 들면, 혈액 샘플, 또는 B-세포의 임의의 샘플)을 수득함으로써, 및 임의의 적합하게 공지된 기술을 사용하여, 샘플로부터 출발하여 SIRP1α에 대해 지시된 VHH 서열을 생성함으로써 생성하거나 수득할 수 있다. 일부 구현예에서, SIRP1α에 대한 천연적으로 발생하는 VHH 도메인은 카멜리드 VHH 서열의 천연 라이브러리를 예를 들면, SIRP1α 또는 이의 적어도 일부분, 단편, 항원성 결정인자 또는 에피토프를 당해 분야에 공지된 하나 이상의 스크리닝 기술을 사용하여 스크리닝함으로써, 카멜리드 VHH 서열의 천연 라이브러리로부터 수득할 수 있다. 이러한 라이브러리 및 기술은 제WO9937681호, 제WO0190190호, 제WO03025020호 및 제WO03035694호에 기술되어 있으며, 이의 전체 내용이 본원에 참고로 포함된다. 일부 구현예에서, 천연의 VHH 라이브러리로부터 유래된 개선된 합성 또는 반-합성 라이브러리, 예를 들면, 이의 내용이 본원에 참고로 포함된, 제WO0043507호에 기술된 바와 같은, 랜덤 돌연변이유발 및/또는 CDR 셔플링과 같은 기술에 의해 천연의 VHH 라이브러리로부터 수득된 VHH 라이브러리를 사용할 수 있다. 일부 구현예에서, SIRP1α에 대해 지시된 VHH 서열을 수득하기 위한 다른 기술은 중쇄 항체를 발현할 수 있는(즉, SIRP1α에 대해 지시된 면역 반응 및/또는 중쇄 항체를 상승시키기 위하여)) 유전자삽입 포유동물을 적합하게 면역화시키고, 유전자삽입 포유동물로부터의 적합한 생물학적 샘플(예를 들면, 혈액 샘플, 또는 B-세포의 임의의 샘플)을 수득한 후, 임의의 적합한 공지된 기술을 사용하여, 샘플로부터 출발하여 SIRP1α에 대해 지시된 VHH 서열을 생성시킴을 포함한다. 예를 들면, 이러한 목적으로, 제WO02085945호 및 제WO04049794호(이들의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다)에 기재된 추가의 방법 및 기술과 중쇄 항체-발현 마우스를 사용할 수 있다.
일 구현예에서, 키메라 단백질은 즉, 천연적으로 발생하는 VHH 서열(및 특히 골격 서열내)의 아미노산 서열내 하나 이상의 아미노산 잔기를 사람으로부터의 통상의 4-쇄 항체로부터의 VH 도메인내 상응하는 위치(들)에서 발생하는 아미노산 잔기중 하나 이상으로 대체함으로써 "사람화된" VHH를 포함하다. 이는 당해 분야에 공지된 사람화 기술을 사용하여 수행할 수 있다. 일부 구현예에서, 가능한 사람화 치환 또는 사람화 치환의 조합은 당해 분야에 공지된 방법, 예를 들면, VHH의 서열과 천연적으로 발생하는 사람 VH 도메인의 서열을 비교함으로써 측정할 수 있다. 일부 구현예에서, 사람화 치환은 수득되는 사람화된 VHH가 여전히 유리한 기능적 특성을 보유하도록 선택된다. 일반적으로, 사람화의 결과로서, 본 발명의 VHH는 상응하는 천연적으로 발생하는 VHH 도메인과 비교하여, 우호적인 특성, 예를 들면, 감소된 면역원성과 같은 유리한 특성을 여전히 보유하지만, 보다 "사람-유사성"이 될 수 있다. 다양한 구현예에서, 본 발명의 사람화된 VHH는 당해 분야에 공지된 임의의 적합한 방식으로 수득될 수 있으므로 출발 물질로서 천연적으로 발생하는 VHH 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 사용하여 수득된 폴리펩타이드에 엄격하게 제한되지 않는다.
일 구현예에서, 키메라 단백질은 즉, 통상의 4-쇄 항체로부터의 천연적으로 발생하는 VH 도메인의 아미노산 서열내 하나 이상의 아미노산 잔기를 카멜리드의 중쇄 항체의 VHH 도메인내 상응하는 위치(들)에서 발생하는 하나 이상의 아미노산 잔기로 대체함으로써, "카멜화"된 VHH를 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 "카멜화" 치환은 VH-VL 계면을 형성하고/하거나 이에 존재하는 아미노산 위치, 및/또는 소위 카멜리다에 특징적 잔기(Camelidae hallmark residue)에 삽입된다(참고: 예를 들면, 제WO9404678호, 이의 전체 내용이 본원에 참고로 포함된다). 일부 구현예에서, 카멜화된 VHH를 생성하거나 설계하기 위한 출발 물질 또는 출발 점으로서 사용된 VH 서열은 포유동물로부터의 VH 서열, 예를 들면, 사람의 VH 서열, 예를 들면, VH3 서열이다. 다양한 구현예에서, 카멜화된 VHH는 당해 분야에 공지된 임의의 적합한 방식(즉, 상기 (1) 내지 (8)에서 나타낸 바와 같음)으로 수득될 수 있으므로 출발 물질로서 천연적으로 발생하는 VH 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 사용하여 수득된 폴리펩타이드에 엄격하게 제한되지 않는다.
다양한 구현예에서, "사람화" 또는 "카멜화" 둘 모두는 천연적으로 발생하는 VHH 도메인 또는 VH 도메인 각각을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 제공한 후, 당해 분야에 공지된 방식으로 뉴클레오타이드 서열내 하나 이상의 코돈을 새로운 뉴클레오타이드 서열이 각각 사람화된" 또는 "카멜화된" VHH를 암호화하도록 하는 방식으로 변화시킴으로써 수행할 수 있다. 이러한 핵산은 이후에 당해 분야에 공지된 방식으로 발현됨으로서, 본 발명의 목적한 VHH를 제공할 수 있다. 대안적으로, 천연적으로 발생하는 VHH 도메인 또는 VH 도메인 각각의 아미노산 서열을 기반으로 하여, 본 발명의 목적한 사람화되거나 카멜화된 VHH의 아미노산 서열을 설계한 후 당해 분야의 펩타이드 합성을 위한 기술을 사용하여 새로이(de novo) 합성할 수 있다. 또한, 천연적으로 발생하는 VHH 도메인 또는 VH 도메인 각각의 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열을 기반으로 하여, 목적한 사람화되거나 카멜화된 VHH를 각각 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 설계한 후 당해 분야에 공지된 핵산 합성을 위한 기술을 사용하여 새로이 합성할 수 있으며, 이후 이렇게 수득된 핵산을 당해 분야에 공지된 방식으로 발현시켜, 본 발명의 목적한 VHH를 제공할 수 있다. 천연적으로 발생하는 VH 서열 또는 VHH 서열로부터 출발하여, 본 발명의 VHH 및/또는 이를 암호화하는 핵산을 수득하기 위한 다른 적합한 방법 및 기술은 당해 분야에 공지되어 있으며, 예를 들면, 하나 이상의 천연적으로 발생하는 VH 서열(예를 들면, 하나 이상의 FR 서열 및/또는 CDR 서열), 하나 이상의 천연적으로 발생하는 VHH 서열의 하나 이상의 부분(예를 들면, 하나 이상의 FR 서열 또는 CDR 서열), 및/또는 하나 이상의 합성 또는 반-합성 서열을 적합한 방식으로 조합함으로써 본 발명의 VHH 또는 이를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 또는 핵산을 제공할 수 있다.
본 발명의 키메라 단백질을 생산하는 방법은 본원에 기술되어 있다. 예를 들면, 본 발명의 키메라 단백질을 암호화하는 DNA 서열(예컨대, 변형된 신호전달제 및 표적화 모이어티 및 링커를 암호화하는 DNA 서열)은 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 합성 DNA 서열은 예컨대, 발현 조절 서열을 포함하는 다른 적절한 뉴클레오타이드 서열에 연결시킴으로써, 목적한 키메라 단백질을 암호화하는 유전자 발현 작제물을 생산할 수 있다. 따라서, 다양한 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 키메라 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 핵산을 제공한다.
본 발명의 키메라 단백질을 암호화하는 핵산은 발현 벡터내로 혼입(연결)시킬 수 있으며, 이는 숙주 세포내로, 형질감염, 형질전환, 또는 형질도입 기술을 통해 도입될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 키메라 단백질을 암호화하는 핵산은 레트로바이러스 형질도입에 의해 숙주 세포내로 도입될 수 있다. 예시적인 숙주 세포는 이. 콜라이(E.coli) 세포, 차이니즈 햄스터 난소(Chinese hamster ovary: CHO) 세포, 사람 배아 신장 293(HEK 293) 세포, HeLa 세포, 새끼 햄스터 신장(BHK) 세포, 원숭이 신장 세포(COS), 사람 간세포 암종 세포(예컨대, Hep G2), 및 골수종 세포이다. 형질절환된 숙주 세포는 숙주 세포가 본 발명의 키메라 단백질을 암호화하는 유전자를 발현하도록 하는 조건 하에서 성장시킬 수 있다. 따라서, 다양한 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 키메라 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 다양한 구현예에서, 본 발명은 이러한 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 추가로 제공한다.
구체적인 발현 및 정제 조건은 사용된 발현 시스템에 따라 변할 것이다. 예를 들면, 유전자가 이. 콜라이내에서 발현되는 경우, 이는 우선 적합한 세균 프로모터로부터 하부에 가공된 유전자, 예컨대, Trp 또는 Tac, 및 원핵세포 신호 서열을 위치시킴으로써 발현 벡터내로 클로닝된다. 다른 예에서, 가공된 유전자가 진핵 숙주 세포, 예컨대, CHO 세포내에서 발현되는 경우, 이는 우선 예를 들면, 적합한 진핵세포 프로모터, 분비 신호, 인핸서(enhancer), 및 다양한 인트론을 함유하는 발현 벡터내로 삽입된다. 유전자 작제물은 형질감염, 형질전환, 또는 형질도입 기술을 사용하여 숙주 세포내로 도입될 수 있다.
본 발명의 키메라 단백질은 단백질의 발현을 허용하는 조건 하에서 키메라 단백질을 암호화하는 발현 벡터로 형질감염시킨 숙주 세포를 성장시킴으로써 생산할 수 있다. 발현 후, 단백질은 당해 분야에 잘 공지된 기술, 예컨대, 친화성 태그, 예를 들면, 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST) 및 히스티딘 태그를 사용하거나 크로마토그래피에 의해 수거하고 정제할 수 있다.
따라서, 다양한 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 키메라 단백질을 암호화하는 핵산을 제공한다. 다양한 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 키메라 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
다양한 구현예에서, 본 SIRP1α 표적화 모이어티 또는 이를 포함하는 키메라 단백질은 생체내, 예를 들면, 환자내에서 발현시킬 수 있다. 예를 들면, 다양한 구현예에서, 본 SIRP1α 표적화 모이어티 또는 이를 포함하는 키메라 단백질은 본 SIRP1α 표적화 모이어티 또는 이를 포함하는 키메라 단백질을 암호화하는 핵산의 형태로 투여될 수 있다. 다양한 구현예에서, 핵산은 DNA 또는 RNA이다. 일부 구현예에서, 본 SIRP1α 표적화 모이어티 또는 이를 포함하는 키메라 단백질은 변형된 mRNA, 즉, 하나 이상의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 mRNA에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, 변형된 mRNA는 이의 전체 내용이 본원에 참고로 포함된, 미국 특허 제8,278,036호에서 발견된 하나 변형들을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 mRNA는 하나 이상의 m5C, m5U, m6A, s2U, ψ 및 2'-O-메틸-U를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 본 키메라 단백질을 암호화하는 변형된 mRNA를 투여하는 것에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 본 발명은 이를 포함하는 유전자 치료요법 벡터에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 본 발명은 이를 포함하는 유전자 치료요법 방법에 관한 것이다. 다양한 구현예에서, 핵산은 종양분해성 바이러스, 예컨대, 아데노바이러스, 레오바이러스, 홍역, 헤르페스 단성, 뉴캐슬 질환 바이러스(Newcastle disease virus) 또는 박시니아(Vaccinia)의 형태이다.
약제학적으로 허용되는 염 및 부형제
본원에 기술된 키메라 단백질은 충분히 염기성인 작용 그룹을 지닐 수 있으며, 이는 무기 또는 유기산, 또는 카복실 그룹과 반응할 수 있으며, 이는 무기 또는 유기 염기와 반응하여, 약제학적으로 허용되는 염을 형성할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 산 부가 염은 당해 분야에 잘 공지된 바와 같은, 약제학적으로 허용되는 산으로부터 형성된다. 이러한 염은 예를 들면, 이의 전문이 본원에 참고로 포함된, 문헌: Journal of Pharmaceutical Science, 66, 2-19(1977) and The Handbook of Pharmaceutical Salts; Properties, Selection, and Use. P. H. Stahl 및 C. G. Wermuth(eds.), Verlag, Zurich(Switzerland) 2002에 나열된 약제학적으로 허용되는 염을 포함한다.
약제학적으로 허용되는 염은 비-제한적 예로서, 설페이트, 시트레이트, 아세테이트, 옥살레이트, 클로라이드, 브로마이드, 요오다이드, 니트레이트, 비설페이트, 포스페이트, 산 포스페이트, 이소니코티네이트, 락테이트, 살리실레이트, 산 시트레이트, 타르트레이트, 올레이트, 탄네이트, 판토테네이트, 비타르트레이트, 아스코르베이트, 석시네이트, 말레이트, 겐티시네이트, 푸마레이트, 글루코네이트, 글루카로네이트, 사카레이트, 포르메이트, 벤조에이트, 글루타메이트, 메탄설포네이트, 에탄설포네이트, 벤젠설포네이트, p-톨루엔설포네이트, 캄포르설포네이트, 파모에이트, 페닐아세테이트, 트리플루오로아세테이트, 아크릴레이트, 클로로벤조에이트, 디니트로벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메녹시벤조에이트, 메틸벤조에이트, o-아세톡시벤조에이트, 나프탈렌-2-벤조에이트, 이소부티레이트, 페닐부티레이트, α-하이드록시부티레이트, 부틴-1,4-디카복실레이트, 헥신-1,4-디카복실레이트, 카프레이트, 카프릴레이트, 신나메이트, 글리콜레이트, 헵타노에이트, 히푸레이트, 말레이트, 하이드록시말레이트, 말로네이트, 만델레이트, 메실레이트, 니코티네이트, 프탈레이트, 테라프탈레이트, 프로피올레이트, 프로피오네이트, 페닐프로피오네이트, 세바케이트, 수베레이트, p-브로모벤젠설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 에틸설포네이트, 2-하이드록시에틸설포네이트, 메틸설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트, 나프탈렌-1,5-설포네이트, 크실렌설포네이트, 및 타르타레이트 염을 포함한다.
용어 "약제학적으로 허용되는 염"은 또한 산성 작용 그룹, 예를 들면, 카복실산 작용 그룹, 및 염기를 가진 본 발명의 화합물의 염을 지칭한다. 적합한 염기는 알칼리 금속, 예를 들면, 나트륨, 칼륨, 및 리튬의 수산화물; 알칼리 토금속, 예를 들면, 칼슘 및 마그네슘의 수산화물; 다른 금속, 예를 들면, 알루미늄 및 아연의 수산화물; 암모니아, 및 유기 아민, 예를 들면, 치환되지 않거나 하이드록시-치환된 모노-, 디-, 또는 트리-알킬아민, 디사이클로헥실아민; 트리부틸 아민; 피리딘; N-메틸, N-에틸아민; 디에틸아민; 트리에틸아민; 모노-, 비스-, 또는 트리스-(2-OH-저급 알킬아민), 예를 들면, 모노-; 비스-, 또는 트리스-(2-하이드록시에틸)아민, 2-하이드록시-3급-부틸아민, 또는 트리스-(하이드록시메틸)메틸아민, N,N-디-저급 알킬-N-(하이드록실-저급 알킬)-아민, 예를 들면, N,N-디메틸-N-(2-하이드록시에틸)아민 또는 트리-(2-하이드록시에틸)아민; N-메틸-D-글루카민; 및 아미노산, 예를 들면, 아르기닌, 라이신 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 조성물은 약제학적으로 허용되는 염의 형태이다.
약제학적 조성물 및 제형
다양한 구현예에서, 본 발명은 본원에 기술된 키메라 단백질 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본원에 기술된 임의의 약제학적 조성물은 대상체에게 약제학적으로 허용되는 담체 또는 비히클을 포함하는 조성물의 성분으로서 투여될 수 있다. 이러한 조성물은 적합한 양의 약제학적으로 허용되는 부형제를 임의로 포함함으로써 적절한 투여용 형태를 제공할 수 있다.
다양한 구현예에서, 약제학적 부형제는 액체, 예를 들면, 물 및 석유, 동물, 식물성, 또는 합성 기원의 것을 포함하는 오일, 예를 들면, 땅콩 오일, 대두 오일, 광 오일, 참깨 오일 등일 수 있다. 약제학적 부형제는 예를 들면, 염수, 검 아카시아, 젤라틴, 전분 페이스트, 활석, 케라틴, 콜로이드성 실리카, 우레아 등일 수 있다. 또한, 보조제, 안정화제, 증점제, 윤활제, 및 착색제를 사용할 수 있다. 일 구현예에서, 약제학적으로 허용되는 부형제는 대상체에게 투여되는 경우 멸균성이다. 물은 본원에 기술된 임의의 제제가 정맥내 투여되는 경우 유용한 부형제이다. 염수 용액 및 수성 덱스트로즈 및 글리세롤 용액은 또한 구체적으로 주사가능한 용액을 위한 액체 부형제로서 사용될 수 있다. 적합한 약제학적 부형제는 또한 전분, 글루코즈, 락토즈, 슈크로즈, 젤라틴, 맥아, 쌀, 곡물, 백악, 실리카 겔, 스테아르산나트륨, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 염화나트륨, 건조된 탈지 우유, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 본원에 기술된 임의의 제제는 경우에 따라, 또한 소량의 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 포함할 수 있다. 적합한 약제학적 부형제의 다른 예는 본원에 참고로 포함된 문헌: Remington's Pharmaceutical Sciences 1447-1676(Alfonso R. Gennaro eds., 19th ed. 1995)에 기술되어 있다.
본 발명은 다양한 제형으로 기술된 약제학적 조성물(및/또는 추가의 치료제)를 포함한다. 본원에 기술된 임의의 본 발명의 약제학적 조성물(및/또는 추가의 치료제)는 액제, 현탁제, 유제, 점적제, 정제, 환제, 펠렛제(pellet), 캅셀제, 액체를 함유하는 캅셀제, 젤라틴 캅셀제, 분말, 지속-방출성 제형, 좌제, 유제, 에어로졸제, 스프레이제, 현탁제, 동결건조된 산제, 동결된 현탁제, 건조된 산제의 형태, 또는 사용에 적합한 임의의 다른 형태를 취할 수 있다. 일 구현예에서, 조성물은 캅셀제의 형태로 존재한다. 다른 구현예에서, 조성물은 정제의 형태로 존재한다. 여전히 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 연질-겔 캅셀제 형태로 제형화된다. 추가의 구현예에서, 약제학적 조성물은 젤라틴 캅셀제의 형태로 제형화된다. 여전히 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 액체로 제형화된다.
필요할 경우, 본 발명의 약제학적 조성물(및/또는 추가의 제제)은 또한 가용화제를 포함할 수 있다. 또한, 제제는 당해 분야에 공지된 적합한 비히클 또는 전달 장치로 전달할 수 있다. 본원에 요약한 조합 치료요법은 단일 전달 비히클 또는 전달 장치로 동시-전달될 수 있다.
본 발명의 본 약제학적 조성물(및/또는 추가의 제제)를 포함하는 제형은 편리하게는 단위 투여형으로 나타낼 수 있으며 약학 분야에 잘 공지된 임의의 방법으로 제조할 수 있다. 이러한 방법은 일반적으로 치료제를 하나 이상의 보조 성분을 구성하는, 담체와 회합시키는 단계를 포함한다. 전형적으로, 제형은 치료제를 액체 담체, 미분된 고체 담체 또는 둘 다와 함께 균일하게 및 친밀하게 회합시킨 다음, 필요할 경우 생성물을 목적한 제형의 투여형으로 성형(예컨대, 습윤 또는 건조 과립화, 분말 배합 등에 이은, 당해 분야에 공지된 통상의 방법을 사용한 타정)함으로써 제조한다.
다양한 구현예에서, 본원에 기술된 임의의 약제학적 조성물(및/또는 추가의 제제)는 본원에 기술된 투여 방식을 위해 조정된 조성물로서 통상의 과정에 따라 제형화된다.
투여 경로는 예를 들면: 경구, 피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 비강내, 경막외, 설하, 비강내, 뇌내, 질내, 경피, 직장, 흡입에 의해, 또는 국소 경로를 포함한다. 투여는 국부 또는 전신계일 수 있다. 일부 구현예에서, 투여는 경구적으로 수행한다. 다른 구현예에서, 투여는 비경구 주사에 의한다. 투여 방식은 의사의 판단에 남겨질 수 있으며, 부분적으로 의학적 상태의 부위에 의존한다. 대부분의 경우에서, 투여는 본원에 기술된 임의의 제제의 혈류내로의 방출을 야기한다.
일 구현예에서, 본원에 기술된 키메라 단백질은 경구 투여용으로 조정된 조성물로서 통상의 과정에 따라 제형화된다. 경구 전달용 조성물은 정제, 로젠지제, 수성 또는 오일성 현탁제, 과립제, 산제, 유제, 캅셀제, 시럽제 또는 엘릭서르제(elixir)의 형태일 수 있다. 경구 투여된 조성물은 하나 이상의 제제, 예를 들면, 감미제, 예를 들면, 프럭토즈, 아스파르탐 또는 사카린; 풍미제, 예를 들면, 페퍼민트, 윈터그린의 오일, 또는 체리; 착색제; 및 방부제를 포함함으로써, 약제학적으로 기호성이 있는 제제를 제공할 수 있다. 더욱이, 정제형 또는 환제형에서, 조성물은 위장관내에서 붕해 및 흡수를 지연시키기 위해 코팅됨으로써 연장된 기간에 걸쳐 지속된 작용을 제공할 수 있다. 본원에 기술된 삼투압적으로 활성 구동되는 임의의 키메라 단백질 주변의 선택적으로 투과성인 막은 또한 경구 투여된 조성물에 적합하다. 이러한 후자의 플랫폼에서, 캅셀제 주변 환경으로부터의 유체는 구동 화합물에 의해 흡수되며, 이는 팽윤하여 제제 또는 제제 조성물을 구멍을 통해 대체시킨다. 이러한 전달 플랫폼은 즉시 방출형 제형의 스파이크화된 프로파일(spiked profile)과는 대치되는 것으로서 필수적으로 0차수의 전달 프로파일을 제공할 수 있다. 시간-지연된 물질, 예를 들어, 글리세롤 모노스테아레이트 또는 글리세롤 스테아레이트가 또한 유용할 수 있다. 경구 조성물은 표준 부형제, 예를 들면, 만니톨, 락토즈, 전분, 스테아르산마그네슘, 나트륨 사카린, 셀룰로즈, 및 탄산마그네슘을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 부형제는 약제학적 등급이다. 활성 화합물 외에, 현탁제는 현탁화제, 예를 들면, 에톡실화된 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 및 소르비탄 에스테르, 미세결정성 셀루로즈, 알루미늄 메타하이드록사이드, 벤토나이트, 아가-아가, 트라가칸트 등, 및 이의 혼합물을 함유할 수 있다.
비경구 투여(예컨대, 정맥내, 근육내, 복강내, 피하 및 동맥내 주사 및 주입)용으로 적합한 투여형은 예를 들면, 액제, 현탁제, 분산제, 유제 등을 포함한다. 이들은 또한 멸균 고체 조성물(예컨대, 동결건조된 조성물)의 형태로 제조될 수 있으며, 이는 사용 직전에 멸균 주사가능한 매질 속에 용해되거나 현탁될 수 있다. 이들은 예를 들면, 당해 분야에 공지된 현탁화제 또는 분산제를포함할 수 있다. 비경구 투여용으로 적합한 제형 성분은 멸균 희석제, 예를 들면, 주사용수, 멸균 용액, 고정 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매; 항세균제, 예를 들면, 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예를 들면, 아스코르브산 또는 아황산나트륨; 킬레이트제, 예를 들면, EDTA; 완충제, 예를 들면, 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트; 및 강직성 조절용 제제, 예를 들면, 염화나트륨 또는 덱스트로즈를 포함한다.
정맥내 투여를 위해, 적합한 담체는 생리학적 염수, 정균수(bacteriostatic water), 크레모포어(Cremophor) ELTM(BASF, 뉴저지주 파르시파나 소재) 또는 포스페이트 완충된 염수(PBS)를 포함한다. 담체는 제조 및 저장 조건 하에서 안정할 수 있으며, 미생물에 대해 보존되어야 한다. 담체는 용매 또는 예를 들면, 물, 에탄올, 글리콜(예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜), 및 이의 적합한 혼합물을 함유하는 분산 매질일 수 있다.
본원에 제공된 조성물은 단독으로 또는 다른 적합한 성분과 함께, 흡입을 통해 투여될 에어로졸 제형(즉, "분무된")으로 제조될 수 있다. 에어로졸 제형은 가압된 허용되는 추진제, 예를 들면, 디클로로디플루오로메탄, 프로판, 질소 등 속에 위치할 수 있다.
본원에 기술된 임의의 본 발명의 약제학적 조성물(및/또는 추가의 제제)는 조절-방출 또는 지연-방출 수단에 의해 또는 당해 분야의 통상의 기술자에게 잘 알려진 전달 장치에 의해 투여될 수 있다. 예는 미국 특허 제3,845,770호; 제3,916,899호; 제3,536,809호; 제3,598,123호; 제4,008,719호; 제5,674,533호; 제5,059,595호; 제5,591,767호; 제5,120,548호; 제5,073,543호; 제5,639,476호; 제5,354,556호; 및 제5,733,556호에 기술된 것을 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 이들 각각은 이의 전문이 본원에 참고로 포함된다. 이러한 투여형은 예를 들면, 하이드록시프로필 셀룰로즈, 하이드로프로필메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 다른 중합체 매트릭스, 겔, 투과성 막, 삼투압 시스템, 다층 코팅, 미세입자, 리포좀, 미세구, 또는 이의 조합을 사용하여 하나 이상의 활성 성분의 조절된- 또는 지속된-방출을 제공함으로써 다양한 비율로 목적한 방출 프로파일을 제공하는데 유용할 수 있다. 당해 분야의 기술자에게 공지된 적합한 조절된- 또는 지속된-방출 제형, 예를 들어, 본원에 기술된 것들은 본원에 기술된 제제의 활성 성분과 함께 사용하기 위해 용이하게 선택될 수 있다. 따라서, 본 발명은 경구 투여용으로 적합한 단일 단위 투여형, 예를 들면, 그러나 이에 한정되지 않는, 정제, 캅셀제, 겔캡제(gelcap), 및 조절된- 또는 지속된-방출을 위해 채택된 카플렛제(caplet)를 제공한다.
활성 성분의 조절된- 또는 지속된 방출은 다양한 조건, 예를 들면, 그러나 이에 한정되지 않는 pH에서의 변화, 온도에 있어서의 변화, 적절한 파장의 광에 의한 자극, 효소의 농도 또는 이용성, 물의 농도 또는 이용가능성, 또는 다른 생리학적 조건 또는 화합물에 의해 자극될 수 있다.
다른 구현예에서, 조절된-방출 시스템은 치료될 표적 부위에 근접하게 위치시킴으로써, 전신계 용량의 분획(fraction) 만을 필요로 할 수 있다(참고: 예컨대, Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138(1984)). 문헌: Langer, 1990, Science 249:1527-1533의 검토에서 논의된 다른 조절된-방출 시스템을 사용할 수 있다.
약제학적 제형은 바람직하게는 멸균성이다. 멸균은 예를 들면, 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 달성할 수 있다. 조성물이 동결건조되는 경우, 필터 멸균화를 동결건조 및 재구성 전 또는 후에 수행할 수 있다.
투여 및 투여량
본 발명에 따라 투여될 키메라 단백질의 급성 용량은 특수한 투여형, 및 투여 방식에 따라 변할 것임을 인지할 것이다. 키메라 단백질의 작용을 개질시킬 수 있는 많은 인자(예컨대, 체중, 성별, 식이, 투여 시간, 투여 경로, 배출 속도, 대상체의 상태, 약물 조합, 유전적 성형 및 반응 민감성)이 당해 분야의 기술자에 의해 고려될 수 있다. 투여는 연속적으로 또는 하나 이상의 별개의 용량으로 최대 허용된 용량내에서 수행될 수 있다. 제공된 세트의 상태에 대한 최적의 투여 속도는 통상의 투여량 투여 시험을 사용하여 당해 분야의 숙련가에 의해 확인될 수 있다.
일부 구현예에서, 키메라 단백질의 적합한 투여량은 약 0.01 mg/kg 내지 약 10 g/kg의 대상체의 체중, 약 0.01 mg/kg 내지 약 1 g/kg의 대상체의 체중, 약 0.01 mg/kg 내지 약 100 mg/kg의 대상체의 체중, 약 0.01 mg/kg 내지 약 10 mg/kg의 대상체의 체중, 예를 들면, 약 0.01 mg/kg, 약 0.02 mg/kg, 약 0.03 mg/kg, 약 0.04 mg/kg, 약 0.05 mg/kg, 약 0.06 mg/kg, 약 0.07 mg/kg, 약 0.08 mg/kg, 약 0.09 mg/kg, 약 0.1 mg/kg, 약 0.2 mg/kg, 약 0.3 mg/kg, 약 0.4 mg/kg, 약 0.5 mg/kg, 약 0.6 mg/kg, 약 0.7 mg/kg, 약 0.8 mg/kg, 약 0.9 mg/kg, 약 1 mg/kg, 약 1.1 mg/kg, 약 1.2 mg/kg, 약 1.3 mg/kg, 약 1.4 mg/kg, 약 1.5 mg/kg, 약 1.6 mg/kg, 약 1.7 mg/kg, 약 1.8 mg/kg, 1.9 mg/kg, 약 2 mg/kg, 약 3 mg/kg, 약 4 mg/kg, 약 5 mg/kg, 약 6 mg/kg, 약 7 mg/kg, 약 8 mg/kg, 약 9 mg/kg, 약 10 mg/kg의 체중, 약 100 mg/kg의 체중, 약 1 g/kg의 체중, 약 10 g/kg의 체중, 이들 사이의 모든 값 및 범위를 포함하는 범위이내이다.
키메라 단백질의 개개 용량은 예를 들면, 약 0.01 mg 내지 약 100 g, 약 0.01 mg 내지 약 75 g, 약 0.01 mg 내지 약 50 g, 약 0.01 mg 내지 약 25 g, 약 0.01 mg 내지 약 10 g, 약 0.01 mg 내지 약 7.5 g, 약 0.01 mg 내지 약 5 g, 약 0.01 mg 내지 약 2.5 g, 약 0.01 mg 내지 약 1 g, 약 0.01 mg 내지 약 100 mg, 약 0.1 mg 내지 약 100 mg, 약 0.1 mg 내지 약 90 mg, 약 0.1 mg 내지 약 80 mg, 약 0.1 mg 내지 약 70 mg, 약 0.1 mg 내지 약 60 mg, 약 0.1 mg 내지 약 50 mg, 약 0.1 mg 내지 약 40 mg의 활성 성분을 함유하는 단위 투여형(예컨대, 정제 또는 캅셀제), 단위 투여형당 약 0.1 mg 내지 약 30 mg, 약 0.1 mg 내지 약 20 mg, 약 0.1 mg 내지 약 10 mg, 약 0.1 mg 내지 약 5 mg, 약 0.1 mg 내지 약 3 mg, 약 0.1 mg 내지 약 1 mg, 또는 단위 투여형당 약 5 mg 내지 약 80 mg으로 투여될 수 있다. 예를 들면, 단위 투여형은 약 0.01 mg, 약 0.02 mg, 약 0.03 mg, 약 0.04 mg, 약 0.05 mg, 약 0.06 mg, 약 0.07 mg, 약 0.08 mg, 약 0.09 mg, 약 0.1 mg, 약 0.2 mg, 약 0.3 mg, 약 0.4 mg, 약 0.5 mg, 약 0.6 mg, 약 0.7 mg, 약 0.8 mg, 약 0.9 mg, 약 1 mg, 약 2 mg, 약 3 mg, 약 4 mg, 약 5 mg, 약 6 mg, 약 7 mg, 약 8 mg, 약 9 mg 약 10 mg, 약 15 mg, 약 20 mg, 약 25 mg, 약 30 mg, 약 35 mg, 약 40 mg, 약 45 mg, 약 50 mg, 약 55 mg, 약 60 mg, 약 65 mg, 약 70 mg, 약 75 mg, 약 80 mg, 약 85 mg, 약 90 mg, 약 95 mg, 약 100 mg, 약 200 mg, 약 500 mg, 약 1 g, 약 2.5 g, 약 5 g, 약 10 g, 약 25 g, 약 50 g, 약 75 g, 약 100 g, 이들 사이의 모든 값 및 범위로 투여될 수 있다.
일 구현예에서, 키메라 단백질은 약 0.01 mg 내지 약 100 g으로 매일, 약 0.01 mg 내지 약 75 g으로 매일, 약 0.01 mg 내지 약 50 g으로 매일, 약 0.01 mg 내지 약 25 g으로 매일, 약 0.01 mg 내지 약 10 g으로 매일, 약 0.01 mg 내지 약 7.5 g으로 매일, 약 0.01 mg 내지 약 5 g으로 매일, 약 0.01 mg 내지 약 2.5 g으로 매일, 약 0.01 mg 내지 약 1 g으로 매일, 약 0.01 mg 내지 약 100 mg으로 매일, 약 0.1 mg 내지 약 100 mg으로 매일, 약 0.1 mg 내지 약 95 mg으로 매일, 약 0.1 mg 내지 약 90 mg으로 매일, 약 0.1 mg 내지 약 85 mg으로 매일, 약 0.1 mg 내지 약 80 mg으로 매일, 약 0.1 mg 내지 약 75 mg으로 매일, 약 0.1 mg 내지 약 70 mg으로 매일, 약 0.1 mg 내지 약 65 mg으로 매일, 약 0.1 mg 내지 약 60 mg으로 매일, 약 0.1 mg 내지 약 55 mg으로 매일, 약 0.1 mg 내지 약 50 mg으로 매일, 약 0.1 mg 내지 약 45 mg으로 매일, 약 0.1 mg 내지 약 40 mg으로 매일, 약 0.1 mg 내지 약 35 mg으로 매일, 약 0.1 mg 내지 약 30 mg으로 매일, 약 0.1 mg 내지 약 25 mg으로 매일, 약 0.1 mg 내지 약 20 mg으로 매일, 약 0.1 mg 내지 약 15 mg으로 매일, 약 0.1 mg 내지 약 10 mg으로 매일, 약 0.1 mg 내지 약 5 mg으로 매일, 약 0.1 mg 내지 약 3 mg으로 매일, 약 0.1 mg 내지 약 1 mg으로 매일, 또는 약 5 mg 내지 약 80 mg으로 매일 투여된다. 다양한 구현예에서, 키메라 단백질은 약 0.01 mg, 약 0.02 mg, 약 0.03 mg, 약 0.04 mg, 약 0.05 mg, 약 0.06 mg, 약 0.07 mg, 약 0.08 mg, 약 0.09 mg, 약 0.1 mg, 약 0.2 mg, 약 0.3 mg, 약 0.4 mg, 약 0.5 mg, 약 0.6 mg, 약 0.7 mg, 약 0.8 mg, 약 0.9 mg, 약 1 mg, 약 2 mg, 약 3 mg, 약 4 mg, 약 5 mg, 약 6 mg, 약 7 mg, 약 8 mg, 약 9 mg 약 10 mg, 약 15 mg, 약 20 mg, 약 25 mg, 약 30 mg, 약 35 mg, 약 40 mg, 약 45 mg, 약 50 mg, 약 55 mg, 약 60 mg, 약 65 mg, 약 70 mg, 약 75 mg, 약 80 mg, 약 85 mg, 약 90 mg, 약 95 mg, 약 100 mg, 약 200 mg, 약 500 mg, 약 1 g, 약 2.5 g, 약 5 g, 약 7.5 g, 약 10 g, 약 25 g, 약 50 g, 약 75 g, 약 100 g, 이들 사이의 모든 값 및 범위를 포함하는 매일 용량으로 투여된다.
본 발명의 특정의 구현예에 따라서, 키메라 단백질을 포함하는 약제학적 조성물은 예를 들면, 1일 1회 이상(예컨대, 매일 약 2회, 약 3회, 약 4회, 약 5회, 약 6회, 약 7회, 약 8회, 약 9회, 또는 약 10회), 1일당 약 1회, 약 격일당, 약 3일마다, 주당 약 1회, 2주당 약 1회, 매달마다 약 1회, 2개월마다 약 1회, 3개월마다 약 1회, 6개월마다 약 1회, 또는 매년 약 1회 투여될 수 있다.
조합 치료요법 및 추가의 치료제
다양한 구현예에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 추가의 치료제(들)과 함께 공-투여된다. 공-투여는 동시 또는 순차적일 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 추가의 치료제 및 키메라 단백질은 대상체에게 동시 투여된다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "동시에"는 추가의 치료제 및 키메라 단백질이 약 60분 이하, 예를 들면, 약 30분 이하, 약 20분 이하, 약 10분 이하, 약 5분 이하, 또는 약 1분 이하의 시간 분리로 투여됨을 의미한다. 추가의 치료제 및 키메라 단백질의 투여는 단일 제형((예컨대, 추가의 치료제 및 키메라 단백질을 포함하는 제형) 또는 별개의 제형(예컨대, 추가의 치료제를 포함하는 제1 제형 및 키메라 단백질을 포함하는 제2 제형)의 동시 투여에 의해 이루어질 수 있다.
동시-투여는 치료제의 투여 시간이 추가의 치료제 및 키메라 단백질의 약리학적 활성이 시간내에 오버랩됨으로써 조합된 치료학적 효과를 발휘하는 경우, 치료제가 동시에 투여됨을 필요로 하지 않는다. 예를 들면, 추가의 치료제 및 키메라 단백질은 순차적으로 투여될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "순차적으로"는 추가의 치료제 및 키메라 단백질이 약 60분 이상의 시간 분리로 투여됨을 의미한다. 예를 들면, 추가의 치료제와 키메라 단백질의 순차적 투여 사이의 시간은 약 60분 이상, 약 2시간 이상, 약 5시간 이상, 약 10시간 이상, 약 1일 이상, 약 2일 이상, 약 3일 이상, 약 1주 이상의 이격, 약 2주 이상의 이격, 또는 약 1개월 이상 이격될 수 있다. 최적의 투여 시간은 물질대사율, 배출, 및/또는 투여되는 추가의 치료제 및 키메라 단백질의 약동학적 활성에 의존할 것이다. 추가의 치료제 또는 키메라 단백 세포를 먼저 투여할 수 있다.
동시-투여는 또한 동일한 투여 경로에 의해 대상체에게 투여될 치료제를 필요로 하지 않는다. 오히려, 이러한 치료학적 제제는 임의의 적절한 경로, 예를 들면, 경구적으로 또는 비경구적으로 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 키메라 단백질은 다른 치료제와 동시-투여되는 경우 상승적으로 작용한다. 이러한 구현예에서, 키메라 단백질 및 추가의 치료제는 제제가 단독치료요법의 맥락에서 사용되는 경우 사용된 용량보다 더 낮은 용량에서 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명은 추가의 치료제로서 화학치료제에 관한 것이다. 예를 들면, 제한없이, 본 키메라 단백질 및 화학치료제의 이러한 조합은 본원의 어딘가에 기술된 바와 같이, 암의 치료에 있어서의 용도가 발견된다. 화학치료제의 예는 알킬화제, 예를 들면, 티오테파 및 시톡산(CYTOXAN) 사이클로포스파미드; 알킬 설포네이트, 예를 들면, 부설판, 임프로설판 및 피포설판; 아지리딘, 예를 들면, 벤조도파, 카르보퀴온, 메투레도파, 및 우레도파; 에틸렌이민 및 메틸라멜라민, 예를 들면, 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에티닐렌티오포스포르아미드 및 트리메틸올로멜라민; 아세토게닌(예컨대, 불라타신 및 불라타시논); 캄프토테신(합성 유사체 토포테칸 포함); 브리오스타틴; 칼리 스타틴; CC-1065(이의 아조젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체 포함); 크립토피신(예컨대, 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; 두오카르마이신(합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1 포함); 엘레우테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕티인; 스폰기스타틴; 질소 머스타드, 예를 들면, 클로람부실, 클로마파진, 클로로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로르에타민, 메클로르에타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 무스타드; 니트로스우레아, 예를 들면, 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 및 라니무스틴; 항생제, 예를 들면, 에네디인 항생제(예컨대, 칼리체아미신, 특히 칼리체아미신 감말 및 칼리체아미신 오메갈(참고: 예컨대, Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33: 183-186(1994)); 다이네미신, 예를 들면, 다이네미신 A; 비포스포네이트, 예를 들면, 클로드로네이트; 에스퍼라미신; 뿐만 아니라 에오카르지노스타틴 발색단 및 관련 크로모단백질 에네디인 항생제 발색단), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카미노마이신, 카르지노필린, 클로로마이시니스, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르루이신, 아드리아마이신(ADRIAMYCIN) 독소루비신(모르폴리노- 독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시 독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 예를 들면, 미토마이신 C, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항-대사산물, 예를 들면, 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실(5-FU); 엽산 유사체, 예를 들면, 데놉테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 푸린 유사체, 예를 들면, 플루다라빈, 6-머캅토푸린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예를 들면, 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 사이타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘; 안드로겐, 예를 들면, 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스톨락톤; 항-아드레날, 예를 들면, 미노글루테쓰이미드, 미토탄, 트릴로스탄; 엽산 보충제, 예를 들면, 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐루라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르미틴; 엘리프티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 질산갈륨; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 마이탄시노이드, 예를 들면, 마이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 포도필린산; 2-에틸하이드라지드; 프로카르바진; PSK 다당류 복합체(JHS Natural Products, Eugene, Oreg.); 라족산; 리족신; 시조푸란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리초테센(예컨대, T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미톨락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드("Ara-C"); 사이클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드, 예를 들면, 탁솔(TAXOL) 파클리탁셀(Bristol-Myers Squibb Oncology, 뉴저지주 프린스톤 소재), 파클리탁셀의 아브락산(ABRAXANE) 크레모포르가 들어있지 않은, 알부민-가공된 나노입자 제형(American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, 111.), 및 탁소테레(TAXOTERE) 독세탁셀(Rhone-Poulenc Rorer, 프랑스 안토니 소재); 클로란부실(chloranbucil); 겜자르(GEMZAR) 겜시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토푸린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예를 들면, 시스플라틴, 옥살리플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드(VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴; 나벨빈(NAVELBINE). 비노렐빈; 노반트론; 테니포시드; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 크셀로다; 이반드로네이트; 이리노테칸(캄프토사르(Camptosar), CPT-11)(이리노테칸과 5-FU 및 류코보린의 치료 요법 포함); 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴(DMFO); 레티노이드, 예를 들면, 레티노산; 카페시타빈; 콤브레타스타틴; 류코보린(LV); 옥살리플라틴 치료 요법(FOLFOX)을 포함하는 옥살리플라틴; 라파티닙(Tykerb); PKC-α의 억제제, Raf, H-Ras, EGFR(예컨대, 세포 증식을 감소시키는 에를로티닙(Tarceva)) 및 VEGF-A) 및 상기 중 어느 것의 약제학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 치료 방법은 방사선의 사용을 추가로 포함한다. 또한, 치료 방법은 추가로 광역동 치료요법의 사용을 추가로 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명은 암의 치료시 추가의 치료제로서, 스플라이세솜(spliceosome)의 임의의 성분을 포함하는, 스플라이세솜을 표적화하는 임의의 제제에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 암의 치료시 추가의 치료제로서 Myc(즉, 항-Myc 치료제)를 표적화하는 임의의 제제에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 감염성 질환 적용을 포함하나, 이에 제한하지 않고, 본 발명은 추가의 치료제로서 항-감염제에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 항-감염제는 항-바이러스제, 예를 들면, 그러나 이에 한정되지 않는, 아바카비르, 아사이클로비르, 아데포비르, 암프레나비르, 아타자나비르, 시도포비르, 다루나비르, 델라비르딘, 디다노신, 도코사놀, 에파비렌즈, 엘비테그라비르, 엠트리시타빈, 엔푸비르티드, 에트라비린, 팜시클로비르, 및 포스카르네트이다. 일부 구현예에서, 항-감염제는 항-세균제, 예를 들면, 그러나 이에 한정되지 않는, 세팔로스포린 항생제(세팔렉신, 세푸록심, 세파드록실, 세파졸린, 세팔로틴, 세파클로르, 세파만돌, 세폭시틴, 세프프로질, 및 세프토비프롤); 플루오로퀴놀론 항생제(시프로, 레바퀸, 플록신, 테퀸, 아벨록스, 및 노르플록스); 테트라사이클린 항생제(테트라사이클린, 미노사이클린, 옥시테트라사이클린, 및 독시사이클린); 페니실린 항생제(아목시실린, 암피실린, 페니실린 V, 디클록사실린, 카르베니실린, 반코마이신, 및 메티실린); 모노박탐 항생제(아즈트레오남); 및 카르바페넴 항생제(에르타페넴, 도리페넴, 이미페넴/실라스타틴, 및 메로페넴)이다. 일부 구현예에서, 항-감염제는 항-말라리아제(예컨대, 클로로퀸, 퀴닌, 메플로퀸, 프리마퀸, 독시사이클린, 아르테메테르/루메판트린, 아토바쿠온/프로구아닐 및 설파독신/피리메타미드), 메트로니다졸, 티니다졸, 이베르멕틴, 피란텔 파모에이트, 및 알벤다졸이다.
일부 구현예에서, 자가면역 적용을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 추가의 치료제는 면역억제제이다. 일부 구현예에서, 면역억제제는 소염제, 예를 들면, 스테로이드성 소염제 또는 비-스테로이드성 소염제(NSAID)이다. 스테로이드, 특히 아드레날 코르티코스테로이드 및 이들의 합성 유사체는 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 본 발명에 유용한 코르티코스테로이드의 예는 하이드록실트리암시놀론, 알파-메틸 덱사메타손, 베타-메틸 베타메타손, 베클로메타손 디프로피오네이트, 베타메타손 벤조에이트, 베타메타손 디프로피오네이트, 베타메타손 발레레이트, 클로베타솔 발레레이트, 데소니드, 데속시메타손, 덱사메타손, 디플로라손 디아세티트, 디플루코르톨론 발레레이트, 플루아드레놀론, 플루아드레놀론 발레레이트, 플루아드레놀론, 플루클로롤론 아세토니드, 플루메타손 피발레이트, 플루오시놀론 아세토니드, 플루오시노나이드, 플루코르틴 부틸 에스테르, 플루오코르톨론, 플루프레드니덴(플루프레드닐리덴) 아세테이트, 플루란드레놀론, 할시노니드, 하이드로코르티손 아세테이트, 하이드로코르티손 부티레이트, 메틸프레드니솔론, 트리암시놀론 아세토니드, 코르티손, 플루세토니드, 플루드로코르티손, 디플루오로손 디아세테이트, 플루라드레놀론 아세토니드, 메드리손, 암시나펠, 암시나피드, 베타메타손 및 이의 에스테르의 균형물, 클로로프레드니손, 클로코르텔론, 클레스시놀론, 디클로리손, 디플루프레드네이트, 플루클로로니드, 플루니솔리드, 플루오로메탈론, 플루페롤론, 플루프레드니솔론, 하이드로코르티손, 메프레드니손, 파라메타손, 프레드니솔론, 프레드니손, 베클로메타손 디프로피오네이트이다. 본 발명에서 사용될 수 있는 (NSAIDS)는 살리실산, 아세틸 살리실산, 메틸 살리실레이트, 글리콜 살리실레이트, 살리실미드, 벤질-2,5-디아세톡시벤조산, 이부프로펜, 풀린닥, 나프록센, 케토프로펜, 에토페나메이트, 페닐부타존, 및 인도메타신을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 면역억제제는 세포정지제, 예를 들면, 알킬화제, 항대사산물(예컨대, 아자티오프린, 메토트렉세이트), 세포독성 항생제, 항체(예컨대, 바실릭시맙, 닥클리주맙, 및 무로모납), 항-임뮤노필린(예컨대, 사이클로스포린, 타크롤리무스, 시롤리무스), 인터페론, 오피오이드, TNF 결합 단백질, 마이코페놀레이트, 및 작은 생물학적 제제(예컨대, 핀골리모드, 마리오신)일 수 있다. 추가의 소염제는 예를 들면, 미국 특허 제4,537,776호에 기술되어 있으며, 이의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다.
일부 구현예에서, 본 발명은 추가의 치료제로서 비만을 치료하기 위한 다양한 제제에 관한 것이다. 비만을 치료하기 위해 사용된 예시적인 제제는 오를리스타트(예컨대, ALL1, XENICAL), 로라카세린(예컨대, BELVIQ), 펜테르민-토피라메이트(예컨대, QSYMIA), 시부트람메(예컨대, REDUCTIL 또는 MERJDIA), 리모나반트(ACOMPLLA), 엑세나티드(예컨대, BYETTA), 프람린티드(예컨대, SYMLIN) 펜테르민, 벤즈페타민, 디에틸프로피온, 펜디메트라즈메(phendimetrazme), 부프로피온, 및 메트로르민을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 식품에서 특수 영양제를 흡수하는 신체의 능력을 방해하는 제제는 추가의 제제 중에서, 예컨대, 오를리스타트(예컨대, ALU, XENICAL), 글루코만난, 및 구아 검이 있다. 아페타이트를 억제하는 제제는 또한 추가의 제제 중에서, 예컨대, 카테콜라민 및 이들의 유도체(예를 들면, 펜테이민 및 다른 암페타민계 약물), 다양한 항억제제 및 기분 안정제(예컨대, 부프로피온 및 토피라메이트), 식욕억제제(예컨대, 덱세드린, 디곡신)이 있다. 신체의 물질대사를 증가시키는 제제가 또한 추가의 제제 중에 있다.
일부 구현예에서, 추가의 치료제는 식욕 억제제, 신경전달물질 재흡수 억제제, 도파민생성 효능제, 세로토닌 작동성 효능제, GABAergic 신호전달의 조절인자, 항경련제, 항우울제, 모노아민 옥시다제 억제제, 물질 P(NK1) 수용체 길항제, 멜라노코르틴 수용체 효능제 및 길항제, 리파제 억제제, 지방 흡수의 억제제, 에너지 흡수 또는 대사산물의 조절제, 칸나비노이드 수용체 조절인자, 중독 치료제, 대사 증후군 치료제, 퍼옥시존 증식인자-활성화된 수용체(PPAR) 조절인자; 디펩티딜 펩티다제(dipcptidyl peptidase) 4(DPP-4) 길항제, 심혈관 질환 치료용 제제, 상승된 트리글리세라이드 수준 치료용 제제, 저 HDL 치료용 제제, 과콜레스테롤혈증 치료용 제제, 및 고혈압 치료용 제제를 포함한다. 심혈관 질환용 일부 제제는 스타틴(예컨대, 로바스타틴, 아토르바스타틴, 플루바스타틴, 로수바스타틴, 심바스타틴 및 프라바스타틴) 및 오메가-3 제제(예컨대, LOVAZA, EPANQVA, VASCEPA, 일반적인 에스테르화된 오메가-3, 어류 오일, 크릴 오일, 조류 오일)을 포함한다. 일부 구현예에서, 추가의 제제는 암페타민, 벤조디아제핀, 설포닐 우레아, 메글리티니드, 티아졸리딘디온, 비구아니드, 베타-차단제, XCE 억제제, 이뇨제, 니트레이트, 칼슘 채널 차단제, 페늘레르민(phenlermine), 시부트라미드, 이오르카세린(iorcaserin), 세틸리스타트, 리모나반트, 타라나반트, 토피라메이트, 가바펜틴, 발프로에이트, 비가바트린, 부프로피온, 티아가빈, 세르트랄린, 플루옥세틴, 트라조돈, 조니사미드, 메틸페니데이트, 바레니클린, 날트렉손, 디에틸프로피온, 펜디메트라진, 레파글리니드(rcpaglini.de), 나테글리니드, 글리메피리드, 메트포르민, 피오글리타존, 로시글릴라존(rosiglilazone), 및 시타글립틴 중에서 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명은 추가의 치료제로서 당뇨병 치료용으로 사용된 제제에 관한 것이다. 예시적인 항-당뇨병 제제는 설포닐우레아(예컨대, DYMELOR(아세토헥사미드), DIABINESE(클로르프로파미드), ORINASE(톨부타미드), 및 TOLINASE(톨라자미드), GLUCOTROL(글리피지드), GLUCOTROL XL(연장된 방출), DIABETA(글리부리드), MICRONASE(글리부리드), GLYNASE PRESTAB(글리부리드), 및 AMARYL(글리메피리드)); 비구아니드(예컨대, 메트포르민(GLUCOPHAGE, GLUCOPHAGE XR, RIOMET, FORTAMET, 및 GLUMETZA)); 티아졸리딘디온(예컨대, ACTOS(피오글리타존) 및 AVANDIA(로시글리타존); 알파-글루코시다제 억제제(예컨대, PRECOSE(아카르보즈) 및 GLYSET(미글리톨); 메글리티니드(예컨대, PRANDIN(레파글리니드) 및 STARLIX(나테글리니드)); 디펩티딜 펩티다제 IV(DPP-IV) 억제제(예컨대, JANUVIA(시타글립틴), NESINA(알로글립틴), ONGLYZA(삭사글립틴), 및 TRADJENTA(리나글립틴)); 나트륨-글루코즈 공-수송인자(Sodium-glucose co-transporter) 2(SGLT2) 억제제(예컨대, INVOKANA(카나글리포진)); 및 조합 환제(예컨대, 글리부리드(설포닐우레아)와 메트포르민을 조합한 GLUCOVANCE, 글리피지드(설포닐우레아) 및 메트포르민을 조합한 METAGLIP, 및 메트로프린 및 로시글리타존(AVANDIA) 둘 다를 하나의 환제에 사용한 AVANDAMET, KAZANO(알로글립틴 및 메트포르민), OSENI(알로글립틴 및 피오글리타존), 경구용 METFORMIN, 경구용 ACTOS, 피하용 BYETTA, 경구용 JANUVIA, 경구용 WELCHOL, 경구용 JANUMET, 경구용 글리피지드, 경구용 글리메피리드, 경구용 GLUCOPHAGE, 피하용 LANTUS, 경구용 글리부리드, 경구용 ONGLYZA, 경구용 AMARYl, 피하용 LANTUS SOLOSTAR, 피하용 BYDUREON, 피하용LEVEMIR FLEXPEN, 경구용 ACTOPLUSMET, 경구용 GLUMETZA, 경구용 TRADJENTA, 경구용 브로모크립틴, 경구용 KOMBIGLYZE XR, 경구용 INVOKANA, 경구용 PRANDIN, 피하용 LEVEMIR, 경구용 PARLODEL, 경구용 피오글리타존, 피하용 NOVOLOG, 피하용 NOVOLOG FLEXPEN, 피하용 VICTOZA 2-PAK, 피하용 HUMALOG, 경구용 STARLIX, 경구용 FORTAMET, 경구용 GLUCOVANCE, 경구용 GLUCOPHAGE XR, 피하용 NOVOLOG Mix 70-30 FLEXPEN, 경구용 GLYBURIDE-METFORMIN, 경구용 아카르보즈, 피하용 SYMLINPEN 60, 경구용 GLUCOTROl, 주사용 NOVOLIN R, 경구용 GLUCOTROL, 경구용 DUETACT, 경구용 시타글립틴, 피하용 SYMLINPEN 120, 피하용 HUMALOG KWIKPEN, 경구용 JANUMET XR, 경구용 GLIPIZIDE-METFORMIN, 경구용 CYCLOSET, 피하용 HUMALOG MIX 75-25, 경구용 나테글리니드, 피하용 HUMALOG Mix 75-25 KWIKPEN, 피하용 HUMULIN 70/30, 경구용 PRECOSE, 피하용 APIDRA, 주사용 후물린(Humulin) R, 경구용 젠타두에토(Jentadueto), 피하용 Victoza 3-Pak, 피하용 Novolin 70/30, 피하용 NOVOLIN N, 피하용 인슐린 데테미르, 경구용 미분된 글리부리드, 경구용 GLYNASE, 피하용 HUMULIN N, 피하용 인슐린 글라르긴, 경구용 RIOMET, 경구용 피오글리타존-메트포르민, 피하용 APIDRA SOLOSTAR, 피하용 인슐린 리스프로, 경구용 GLYSET, 피하용 HUMULIN 70/30 Pen, 경구용 콜레세벨람, 경구용 시토글립틴-메트포르민, 경구용 DIABETA, 인슐린 레귤러 사람 주사액(regular human inj), 피하용 HUMULIN N Pen, 피하용 엑세나티드, 피하용 HUMALOG Mix 50-50 KWIKPEN, 피하용 리라글루티드, 경구용 KAZANO, 경구용 레파글리니드, 경구용 클로르프로파미드, 피하용 인슐린 아스파르트, 피하용 NOVOLOG Mix 70-30, 피하용 HUMALOG Mix 50-50, 경구용 삭사글립틴, 경구용 ACTOPLUS Met XR, 경구용 미글리톨, 피하용 NPH 인슐린 사람 재조합물(recomb), 인슐린 NPH 및 레귤러 사람 피하용, 경구용 톨라자미드, 경구용 미페프리스톤, 피하용 인슐린 아스파르트 프로탐-인슐린 아스파르트, 경구용 레파글리니드-메트포르민, 경구용 삭사글립틴-메트포르민, 경구용 리나글립틴-메트포르민, 경구용 NESINA, 경구용 OSENI, 경구용 톨부타미드, 인슐린 리브프로 프로타민 및 리스프로 피하용, 피하용 프라믈린티드, 피하용 인슐린 글룰리신, 경구용 피오글리타존-글리메피리드, 경구용 PRANDIMET, 피하용 NOVOLOG PenFill, 경구용 리나글립틴, 피하용 엑세나티드 미세구, 경구용 KORLYM, 경구용 알로글립틴, 경구용 알로글립틴-피오글리타존, 경구용 알로글립틴-메트포르민, 경구용 카나글리플로진, 리스프로(HUMALOG); 아스파르트(NOVOLOG); 글룰리신(APIDRA); 레귤러(Regular)(NOVOLIN R 또는 HUMULIN R); NPH(NOVOLIN N 또는 HUMULIN N); 글라르긴(LANTUS); 데테미르(LEVEMIR); HUMULIN 또는 NOVOLIN 70/30; 및 NOVOLOG Mix 70/30 HUMALOG Mix 75/25 또는 50/50을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, 본 발명은 수혈을 사용한 조합 치료요법에 관한 것이다. 예를 들면, 본 조성물은 수혈을 보조할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명은 철 보충물을 사용한 조합 치료요법에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 EPO-기반 제제를 사용한 조합 치료요법에 관한 것이다. 예를 들면, 본 조성물은 다른 EPO-계 제제에 대한 보조제로서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 조성물은 다른 EPO-계 제제에 대한 유지 치료요법으로서 사용된다. 다른 EPO-계 제제는 다음을 포함한다: 에포에틴 알파, 예를 들면, 이에 제한되지 않는, DARBEPOETIN(ARANESP), EPOCEPT(LUPIN PHARMA), NANOKINE(NANOGEN PHARMACEUTICAL), EPOFIT(INTAS PHARMA), EPOGEN(AMGEN), EPOGIN, EPREX,(JANSSEN-CILAG), BINOCRIT(SANDOZ), PROCRIT; 에포에틴 베타, 예를 들면, 이에 제한되지 않는, NEORECORMON(HOFFMANN-LA ROCHE), RECORMON, 메톡시 폴리에틸렌 글리콜-에포에틴 베타(MIRCERA, ROCHE); 에포에틴 델타, 예를 들면, 이에 한정되지 않는, DYNEPO(적혈구 생성 자극 단백질, SHIRE PLC); 에포에틴 오메가, 예를 들면, 이에 한정되지 않는, EPOMAX; 에포에틴 제타, 예를 들면, 이에 제한되지 않는, SILAPO(STADA) 및 RETACRIT(HOSPIRA) 및 기타 EPO, 예를 들면, 그러나 이에 제한되지 않는, EPOCEPT(LUPIN PHARMACEUTICS), EPOTRUST(PANACEA BIOTEC LTD), ERYPRO SAFE(BIOCON LTD.), REPOITIN(SERUM INSTITUTE OF INDIA LIMITED), VINTOR(EMCURE PHARMACEUTICALS), EPOFIT(INTAS PHARMA), ERYKINE(INTAS BIOPHARMACEUTICA), WEPOX(WOCKHARDT BIOTECH), ESPOGEN(LG LIFE SCIENCES), RELIPOIETIN(RELIANCE LIFE SCIENCES), SHANPOIETIN(SHANTHA BIOTECHNICS LTD), ZYROP(CADILA HEALTHCARE LTD.), EPIAO(RHUEPO)(SHENYANG SUNSHINE PHARMACEUTICAL CO. LTD), CINNAPOIETIN(CINNAGEN).
일부 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 면역-조절제, 예를 들면, 이에 제한되지 않는 면역 체크포인트를 조절하는 제제를 사용한 조합 치료요법에 관한 것이다. 다양한 구현예에서, 면역-조절제는 PD-1, PD-L1, 및 PD-L2 중 하나 이상을 표적화한다. 다양한 구현예에서, 면역-조절제는 PD-1 억제제이다. 다양한 구현예에서, 면역-조절제는 PD-1, PD-L1, 및 PD-L2 중 하나 이상에 대해 특이적인 항체이다. 예를 들면, 일부 구현예에서, 면역-조절제는 항체, 예를 들면, 이에 제한되지 않는, 니볼루맙, (ONO-4538/BMS-936558, MDX1106, OPDIVO, BRISTOL MYERS SQUIBB), 펨브롤리주맙(KEYTRUDA, MERCK), 피리딜주맙(CT-011, CURE TECH), MK-3475(MERCK), BMS 936559(BRISTOL MYERS SQUIBB), MPDL328OA(ROCHE)이다. 일부 구현예에서, 면역-조절제는 CD137 또는 CD137L 중 하나 이상을 표적화한다. 다양한 구현예에서, 면역-조절제는 CD137 또는 CD137L 중 하나 이상에 대해 특이적인 항체이다. 예를 들면, 일부 구현예에서, 면역-조절제는 항체, 예를 들면, 그러나 이에 제한되지 않는, 우렐루맙(BMS-663513 및 항-4-1BB 항체로 공지됨)이다. 일부 구현예에서, 본 키메라 단백질은 고형 종양 및/또는 B-세포 비-호지킨 림프종 및/또는 두경부암 및/또는 다발 골수종의 치료용 우렐루맙(임의로 하나 이상의 니볼루맙, 리릴루맙, 및 우렐루맙과 함께)과 조합된다. 일부 구현예에서, 면역-조절제는 CTLA-4, AP2M1, CD80, CD86, SHP-2, 및 PPP2R5A 중 하나 이상을 표적화하는 제제이다. 다양한 구현예에서, 면역-조절제는 CTLA-4, AP2M1, CD80, CD86, SHP-2, 및 PPP2R5A 중의 하나 이상에 대해 특이적인 항체이다. 예를 들면, 일부 구현예에서, 면역-조절제는 항체, 예를 들면, 비-제한적 방식으로, 이필리무맙(MDX-010, MDX-101, Yervoy, BMS) 및/또는 트레멜리무맙(Pfizer)이다. 일부 구현예에서, 본 키메라 단백질은 하나 이상의 흑색종, 전립샘 암, 및 폐암의 치료용 이필리무맙(임의로 바비툭시맙)과 조합된다. 다양한 구현예에서, 면역-조절제는 CD20을 표적화한다. 다양한 구현예에서, 면역-조절제는 항체 특이적인 CD20이다. 예를 들면, 일부 구현예에서, 면역-조절제는 항체, 예를 들면, 비-제한적 방식으로, 오파투무맙(GENMAB), 오비누투주맙(GAZYVA), AME-133v(APPLIED MOLECULAR EVOLUTION), 오크렐리주맙(GENENTECH), TRU-015(TRUBION/EMERGENT), 벨투주맙(IMMU-106)이다.
일부 구현예에서, 본 키메라 단백질은 키메라 항원 수용체(CAR) T-세포 치료요법과 함께 사용되는 경우 상승적으로 작용한다. 예시적인 구현예에서, 키메라 단백질은 종양 또는 암의 치료시 CAR T-세포 치료요법과 함께 사용된 경우 상승적으로 작용한다. 일 구현예에서, 키메라 단백질은 혈액-기반 종양을 치료하는데 있어서 CAR T-세포 치료요법과 함께 사용되는 경우 상승적으로 작용한다. 일 구현예에서, 키메라 단백질은 고형 종양을 치료하는데 있어서 CAR T-세포 치료요법과 함께 사용된 경우 상승적으로 작용한다. 예를 들면, 키메라 단백질 및 CAR T-세포의 사용은 종양 또는 암을 감소시키거나 제거하기 위해, 또는 종양 또는 암의 성장 및/또는 진행 및/또는 전이를 느리게 하기 위해 상승적으로 작용할 수 있다. 다양한 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 CAR T-세포 분열을 유도한다. 다양한 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 CAR T-세포 분열을 유도한다. 다양한 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 CAR T 세포의 에너지를 방지한다.
다양한 구현예에서, CAR T-세포 치료요법은 항원(예컨대, 종양 항원)을 표적화하는 CAR T 세포, 예를 들면, 그러나 이에 한정되지 않는, 카보닉 안하이드라제 IX(CAIX), 5T4, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD38, CD47, CS1, CD138, Lewis-Y, L1-CAM, MUC16, ROR-1, IL13Rα2, gp100, 전립샘 줄기 세포 항원(PSCA), 전립샘-특이적인 막 항원(PSMA), B-세포 성숙 항원(BCMA), 사람 파필로마바이러스형 16 E6(HPV-16 E6), CD171, 폴레이트 수용체 알파(FR-α), GD2, 사람 상피 성장 인자 수용체 2(HER2), 메소텔린, EGFRvIII, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP), 암배아 항원(CEA), 및 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEGF-R2) 뿐만 아니라 당해 분야에 잘 공지된 다른 종양 항원도 포함한다. 추가의 예시적인 종양 항원은 MART-1/멜란-A, gp100, 디펩티딜 펩티다제 IV(DPPIV), 아데노신 데아미나제-결합 단백질(ADAbp), 사이클로필린 b, 결장직장 관련된 항원(CRC)-0017-1A/GA733, 암배아 항원(CEA) 및 이의 면역원성 에피토프 CAP-1 및 CAP-2, etv6, aml1, 전립샘 특이적인 항원(PSA) 및 이의 면역원성 에피토프 PSA-1, PSA-2, 및 PSA-3, T-세포 수용체/CD3-제타 쇄, MAGE-계열의 종양 항원(예컨대, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, MAGE-A12, MAGE-Xp2(MAGE-B2), MAGE-Xp3(MAGE-B3), MAGE-Xp4(MAGE-B4), MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-C4, MAGE-C5), GAGE-계열의 종양 항원(예컨대, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7, GAGE-8, GAGE-9), BAGE, RAGE, LAGE-1, NAG, GnT-V, MUM-1, CDK4, 타이로시나제, p53, MUC 계열, HER2/neu, p21ras, RCAS1, α-페토단백질, E-카드헤린, α-카테닌, β-카테닌 및 γ-카테닌, p120ctn, gp100 Pmel117, PRAME, NY-ESO-1, cdc27, 선종성 결장 폴립증(adenomatous polyposis coli) 단백질(APC), 포드린, 콘넥신 37, Ig-유전자형, p15, gp75, GM2 및 GD2 강글리오사이드, 바이러스 생성물, 예를 들면, 사람 파필로마 바이러스 단백질, Smad 계열의 종양 항원, lmp-1, NA, EBV-암호화된 핵 항원(EBNA)-1, 뇌 글리코겐 포스포릴라제, SSX-1, SSX-2(HOM-MEL-40), SSX-1, SSX-4, SSX-5, SCP-1 CT-7, c-erbB-2, CD19, CD37, CD56, CD70, CD74, CD138, AGS16, MUC1 , GPNMB, Ep-CAM, PD-L1, 및 PD-L2를 포함한다.
예시적인 CAR T-세포 치료요법은 JCAR014(Juno Therapeutics), JCAR015(Juno Therapeutics), JCAR017(Juno Therapeutics), JCAR018(Juno Therapeutics), JCAR020(Juno Therapeutics), JCAR023(Juno Therapeutics), JCAR024(Juno Therapeutics), CTL019(Novartis), KTE-C19(Kite Pharma), BPX-401(Bellicum Pharmaceuticals), BPX-501(Bellicum Pharmaceuticals), BPX-601(Bellicum Pharmaceuticals), bb2121(Bluebird Bio), CD-19 슬리핑 뷰티 세포(Sleeping Beauty cell)(Ziopharm Oncology), UCART19(Cellectis), UCART123(Cellectis), UCART38(Cellectis), UCARTCS1(Cellectis), OXB-302(Oxford BioMedica, MB-101(Mustang Bio) 및 Innovative Cellular Therapeutics에 의해 개발된 CAR T-세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, 키메라 단백질은 다발 경화증(MS)를 치료하는 방법에서 하나 이상의 MS 치료제, 예를 들면, 그러나, 이에 한정되지 않는 3-인터페론, 글라티라머 아세테이트, T-인터페론, IFN-β-2(미국 특허 공개 공보 제2002/0025304호), 스피로게르마늄(예컨대, N-(3-디메틸아미노프로필)-2-아자-8,8-디메틸-8-게르만스피로[4:5]데칸, N-(3-디메틸아미노프로필)-2-아자-8,8-디에틸-8-게르마스피로[4:5] 데칸, N-(3-디메틸아미노프로필)-2-아자-8,8-디프로필-8-게르마스피로[4:5]데칸, 및 N-(3-디메틸아미노프로필)-2-아자-8, 8-디부틸-8-게르마스피로[4:5]데칸), 비타민 D 유사체(예컨대, 1,25(OH) 2D3,(참고: 예컨대, 미국 특허 제5,716,946호)), 프로스타글란딘(예컨대, 라타노프로스트, 브리모니딘, PGE1, PGE2 및 PGE3, 참고: 예컨대, 미국 특허 공개 공보 제2002/0004525호), 테트라사이클린 및 유도체(예컨대, 미노사이클린 및 독시사이클린, 참고: 예컨대, 미국 특허 공보 제20020022608호), VLA-4 결합 항체(참고: 예컨대, 미국 특허 공개 공보 제2009/0202527), 아드레노코르티코트로프성 호르몬(adrenocorticotrophic hormone), 코르티코스테로이드, 프레드니손, 메틸프레드니손, 2-클로로데옥시아데노신, 미톡산트론, 설파살라진, 메토트렉세이트, 아자티오프린, 사이클로포스파미드, 사이클로스포린, 푸마레이트, 항-CD20 항체(예컨대, 리툭시맙), 및 티자니딘 하이드로클로라이드와 함께 사용된다.
일부 구현예에서, 키메라 단백질은 MS의 하나 이상의 증상 또는 부작용을 치료하는 하나 이상의 치료제와 함께 사용된다. 이러한 제제는 아만타딘, 바클로펜, 파파베린, 메클리진, 하이드록시진, 설파메톡사졸, 시프로플록사신, 도쿠세이트, 페몰린, 단트롤렌, 데스모프레씬, 덱사메타손, 톨테로딘, 페닐로인, 옥시부티닌, 비사코딜, 베늘라팍신, 아미트립틸린, 메텐아민, 클로나제팜, 이소니아지드, 바르데나필, 니트로푸란토인, 프실리움 친수성 무실로이드, 알프로스타딜, 가바펜틴, 노르트립틸린, 파록세틴, 프로판텔린 브로마이드, 모다피닐, 플루옥세틴, 페나조피리딘, 메틸프레드니솔론, 카르밤아제핀, 이미프라민, 디아제팜, 실데나필, 부프로피온, 및 세르트랄린을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, 키메라 단백질은 다발 경화증을 치료하는 방법에서 본원에 기술된 질환 개질 치료요법(disease modifying therapies: DMTs)(예컨대, 표 A의 제제) 중 하나 이상과 함께 사용된다. 일부 구현예에서, 본 발명은 본원에 기술된 DMT(예컨대, 하기 표에 나열된 제제) 중 하나 이상의 사용과 비교하여 하나 이상의 개시된 결합제의 부재하에서 증진된 치료 효과를 제공한다. 일 구현예에서, 키메라 단백질 및 하나 이상의 DMT의 조합은 상승적 치료 효과를 생산한다.
예시적인 질환 개질 치료요법
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MS 질환 진행은 질환 진행의 조기 단계에서 가장 강력하고, 가장 피해가 있을 수 있다. 따라서, 예를 들면, 비용 및 부작용 완화의 측면에서 많은 환불 정책 및 진료 패턴과 대치하여, 환자의 장기간 질환 상태가 가장 강력한 DMT, 예를 들명, 소위 초-라인 치료요법(second-line therapy)을 사용한 치료를 개시하는 것이 가장 유리할 수 있다. 일부 구현예에서, 환자는 초-라인 치료요법과 함께 키메라 단백질의 요법을 사용하여 치료된다. 이러한 조합을 하나 이상의 초-라인 치료요법의 부작용 프로파일을 감소시키는데 사용한다. 일부 구현예에서, 조합은 하나 이상의 초-라인 치료요법의 투여 빈도의 용량을 감소시킨데 사용된다. 예를 들면, 상기 제공된 표에 나열된 제제의 용량은 조합의 맥락에서 약 50%, 또는 약 40%, 또는 약 30%, 또는 약 25% 까지 감소시킬 수 있고/있거나 투여 빈도는 1/2, 또는 종종 1/3로 감소될 수 있거나 예를 들면, 매일로부터 격일 또는 매주, 격일로부터 매주 또는 격주로, 매주로부터 격주 또는 매달 등으로 감소될 수 있다. 따라서 일부 구현예에서, 키메라 단백질은 보다 편리한 치료 요법을 허용함으로써 환자 집착을 증가시킨다. 또한, 일부 DMT는 제안된 생애 용량 제한을 가지는데, 예컨대, 미톡산트론의 경우, 생애 누적 용량은 140 mg/m2, 또는 2 내지 3년의 치료요법으로 엄격히 제한되어야 한다. 일부 구현예에서, 키메라 단백질을 사용한 모집은 이러한 DMT를 사용한 보다 낮거나 거의 흔하지 않는 투여에 의해 미톡산트론에 대한 환자의 접근을 보존한다.
일부 구현예에서, 환자는 나이브(naive) 환자이며, 이는 하나 이상의 DMT를 사용한 치료를 제공받지 않았으며, 키메라 단백질은 제2-라인 치료요법의 부작용을 완충시키기 위해 사용된다. 따라서, 나이브 환자는 처음 질환에서 제2-라인 치료요법의 장기간 이점으로부터 유리할 수 있다. 일부 구현예에서, 키메라 단백질은 제2-라인 치료요법의 사용을 앞서는 도입 치료요법으로서 사용된다. 예를 들면, 키메라 단백질은 약 3개월의 초기 치료 기간 동안 투여되어 질환을 안정화시킨 후 환자를 제2 라인 제제의 유지 치료요법으로 이전시킬 수 있다.
일반적으로 나이브 환자는 제공받아서 아마도 하나 이상의 DMT에 실패한 환자와 비교하여 치료요법에 보다 반응하는 경향이 있는 것으로 여겨진다. 일부 구현예에서, 키메라 단백질은 하나 이상의 DMT를 제공받아서 아마도 이에 실패한 환자에서의 용도가 발견된다. 예를 들면, 일부 구현예에서, 키메라 단백질은 하나 이상의 DMT를 제공받아서 아마도 이에 실패한 환자에서 치료학적 효과를 증가시키며 이들 환자가 나이브 완자와 같이 반응하도록 할 수 있다.
일부 구현예에서, 환자는 하나 이상의 DMT를 사용한 치료를 제공받았거나 제공받고 있으며 잘 반응하지 않고 있다. 예를 들면, 환자는 하나 이상의 DMT에 대해 난치성이거나 불량하게 반응성일 수 있다. 일부 구현예에서, 환자는 하나 이상의 테리플루노미드(AUBAGIO(GENZYME)); 인터페론 베타-1a(AVONEX(BIOGEN IDEC); 인터페론 베타-1b(BETASERON(BAYER HEALTHCARE PHARMACEUTICALS, INC.); 글라티라머 아세테이트(COPAXONE(TEVA NEUROSCIENCE); 인터페론 베타-1b(EXTAVIA(NOVARTIS PHARMACEUTICS CORP.); 핀골리모드(GILENYA(NOVARTIS PHARMACEUTICALS CORP.); 알렘투주맙(LEMTRADA(GENZYME); 미톡산트론(NOVANTRONE(EMD SERONO); 페길화된 인터페론 베타-1a(PLEGRIDY(BIOGEN IDEC); 인터페론 베타-1a(REBIF(EMD SERONO, INC.); 디메틸 푸마레이트(BG-12)(TECFIDERA(BIOGEN IDEC); 및 나탈리주맙(TYSABRI(BIOGEN IDEC)에 대해 난치성이거나 불량하게 반응성이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 개시된 결합제는 환자에서 하나 이상의 DMT의 치료학적 이점을 생성하므로 DMT에 대한 비-반응성을 감소시키거나 제거한다. 예를 들면, 이는 보다 높은 용량 또는 빈도에서 하나 이상의 DMT를 사용한 환자 치료요법을 피할 수 있다.
보다 공격적인 질환을 지닌 환자에서, 하나의 접근법은 유도 치료 모델이며, 여기서 강력한 효능을 지니나 강력한 안전성이 우려되는 치료요법이 먼저 제공된 후 유지 치료요법이 제공될 수 있다. 이러한 모델의 예는 알렘투주맙을 사용한 초기 치료에 이어서, IFN-β GA, 또는 BG-12에 의한 치료를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 개시된 결합제는 유지용의 치료요법을 변환시킬 필요성을 방지하는데 사용된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 개시된 결합제를 사용하여 제2 라인 치료요법을 포함하는, 하나 이상의 DMT에 대한 유지 치료요법으로서 사용된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 개시된 결합제를 유도시 제1 치료요법으로서 사용한 후 유지 치료요법, 예를 들면, 제1 라인 치료요법으로서 다른 DMT를 사용한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 개시된 결합제는 약 3 개월의 초기 치료 기간 동안 투여하여 질환을 안정화시킨 후 환자를 제1 라인 제제의 유지 치료요법으로 이전시킬 수 있다.
다양한 구현예에서, 하나 이상의 개시된 결합체를 사용하여 본원에 개시된 임의의 제제를 제한없이 포함하는, DMT의 하나 이상의 부작용을 감소시킨다. 예를 들면, 하나 이상의 개시된 결합제를 하나 이상의 DMT를 절약하는 용량을 허용하는 요법에서 사용할 수 있으므로 보다 적은 부작용을 야기한다. 예를 들면, 일부 구현예에서, 하나 이상의 개시된 결합제는 AUBAGIO 또는 관련된 제제의 하나 이상의 부작용을 감소시킬 수 있으며, 이는 모발 빠짐(hair thinning), 설사, 플루(flu), 오심, 비정상적인 간 시험 및 손 또는 발에서 비정상적인 마비 또는 저림(감각이상), 감염 위험을 증가시킬 수 있는 백혈구의 수준; 혈압의 증가; 및 심각한 간 손상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 개시된 결합제는 주사 후 플루-유사 증상, 우울증, 약한 빈혈, 간 비정상, 알레르기 반응, 및 심장 문제를 포함하는 AVONEX 또는 관련 제제의 하나 이상의 부작용을 감소시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 개시된 결합제는 주사 후 플루-유사 증상, 주사 부위 반응, 알레르기 반응, 우울증, 간 비정상, 및 낮은 백혈구 수를 포함하는 BETASERON 또는 관련된 제제의 하나 이상의 부작용을 감소시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 개시된 결합제는 주사 부위 반응, 혈관확장(혈압의 확장); 심장 통증; 흥분증, 심장 동통, 심계 항진, 호흡의 단축, 및 플러싱(flushing)을 포함하는, 주사 직후 반응을 포함하는 COPAXONE 또는 관련된 제제의 하나 이상의 부작용을 감소시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 개시된 결합제는 주사 후 플루-유사 증상, 주사 부위 반응, 알레르기 반응, 우울증, 간 비정상, 및 낮은 백혈구 수를 포함하는 EXTAVIA 또는 관련된 제제의 하나 이상의 부작용을 감소시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 개시된 결합제는 제1 용량 후 두통, 플루, 설사, 등 동통, 간 효소 증가, 기침, 느림 심장 박동, 감염, 및 눈의 팽윤을 포함하는 GILENYA 또는 관련 제제의 하나 이상의 부작용을 감소시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 개시된 결합제는 발진, 두통, 열, 비강 울혈, 오심, 뇨관 감염, 피로, 불면증, 상부 호흡관 감염, 두드러기, 가려움증, 갑상선 장애, 진균 감염, 관절, 사지 및 등 내 통증, 설사, 오심, 플러싱 및 주입 반응(오심, 두드러기, 가려움, 불면증, 오한, 플러싱, 피로, 호흡의 단축, 맛 감각의 변화, 소화불량, 현기증, 동통 포함)을 포함하는 LEMTRADA 또는 관련된 제제의 하나 이상의 부작용을 감소시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 개시된 결합제는 투여 후 24시간째에 청록색 뇨; 감염, 골수 억제(피로, 피멍, 낮은 혈액 세포수), 오심, 모발 빠짐, 방광 감염, 구강점막 질환, 및 심각한 간 및 심장 손상을 포함하는 NOVANTRONE 또는 관련된 제제의 하나 이상의 부작용을 감소시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 개시된 결합제는 주입 후 플루-유사 증상, 주사 부위 반응, 우울증, 약한 빈혈, 간 비정상, 알레르기 반응, 및 심장 문제를 포함하는 PLEGRIDY 또는 관련 제제의 하나 이상의 부작용을 감소시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 개시된 결합제는 주사 후 플루-유사 증상, 주사 부위 반응, 간 비정상, 우울증, 알레르기 반응, 및 낮은 적혈구 및 백혈구 수를 포함하는 REBIF 또는 관련된 제제의 하나 이상의 부작용을 감소시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 개시된 결합제는 플러싱(열 또는 피부에서 가려움 및 홍조의 감각), 위장 문제(오심, 설사, 복부 통증), 발진, 뇨속 단백질, 상승된 간 효소; 및 혈액 림프구(백혈구) 수에 있어서의 감소를 포함하는 TECFIDERA 또는 관련된 제제의 하나 이상의 부작용을 감소시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 개시된 결합제는 두통, 피로, 뇨관 감염, 우울증, 호흡관 감염, 관절 통증, 배탈, 복부 불편함, 설사, 질염, 팔 또는 다리내 통증, 발진, 주입 2시간 내에 알레르기 또는 과감작성 반응(현기증, 열, 발진, 가려움, 오심, 플러싱, 저혈압, 호흡 곤란함, 심장 통증)을 포함하는 TYSABRI 또는 관련된 제제의 하나 이상의 부작용을 감소시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명은 이의 전체 내용이 본원에 참고로 포함된, 제WO 2013/10779호, 제WO 2015/007536호, 제WO 2015/007520호, 제WO 2015/007542호, 및 제WO 2015/007903호에 기술된 하나 이상의 키메라제를 사용한 조합 치료요법에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 키메라 단백질은 즉, 조성물에 대한 임의의 유형의 분자의 공유결합성 부착에 의해 변형됨으로써 공유결합성 부착이 조성물의 활성을 방지하지 않는 유도체를 포함한다. 예를 들어, 제한되지 않지만, 유도체는 특히, 글리코실화, 지질화(lipidation), 아세틸화, 페길화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호/차단 그룹에 의한 유도체화, 단백질분해성 절단, 세포 리간드 또는 다른 단백질에 대한 연결 등에 의해 변형된 조성물을 포함한다. 임의의 다수의 화학적 변형은 공지된 기술, 예를 들면, 이에 제한되지 않는 특정 화학적 분열, 아세틸화, 포르밀화, 투니카마이신의 대사적 합성 등에 의해 수행될 수 있다.
여전히 다른 구현예에서, 본원에 기술된 키메라 단백질은 예시적인 구현예에서, 독소, 화학치료제, 방사선동위원소, 및 세포자멸사 또는 세포 사멸을 유발하는 제제를 추가로 포함한다. 이러한 제제는 본원에 기술된 조성물에 접합될 수 있다.
본원에 기술된 키메라 단백질은 따라서 효과기 모이어티, 예를 들면, 화학적 링커, 검출가능한 모이어티, 예를 들면, 형광성 염료, 효소, 기질, 생물발광성 물질, 방사활성 물질, 및 화학발광성 모이어티, 또는 기능성 모이어티, 예를 들면, 스트렙타비딘, 아비딘, 바이오틴, 세포독소, 세포독성제, 및 방사활성 물질을 가하기 위해 해독후적으로 변형될 수 있다.
예시적인 세포독성제는 메토트렉세이트, 아미노프테린, 6-머캅토푸린, 6-티오구아닌, 사이타라빈, 5-플루오로우라실 데카르바진; 알킬화제, 예를 들면, 메클로르에타민, 티오에파 클로람부실, 멜팔란, 카르무스틴(BSNU), 미토마이신 C, 로무스틴(CCNU), 1-메틸니트로소우레아, 사이클로토스파미드(cyclothosphamide), 메클로르에타민, 부설판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C, 시스-디클로로디아민 백금(II)(DDP) 시스플라틴 및 카르보플라틴(파라플라틴)을 포함하나, 이에 한정되지 않으며; 안트라사이클린은 다우노루비신(이전에는 다우노마이신), 독소루비신(아드리아마이신), 데토루비신, 카르미노마이신, 이다루비신, 에피루비신, 미톡산트론 및 비산트렌을 포함하고; 항생제는 닥티노마이신(악티노마이신 D), 블레오마이신, 칼리케아미신, 미트라마이신, 및 안트라마이신(AMC); 및 세포분열정지제, 예를 들면, 빈카 알칼로이드, 빈크리스틴 및 빈블라스틴을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 다른 세포독성제는 파클리탁셀(탁솔), 리신, 슈도모나스 외독소, 겜시타빈, 사이토찰라신 B, 그라미시딘 D, 에티디움 브로마이드, 에메틴, 에토포시드, 테노포시드, 콜키신, 디하이드록시 안트라신 디온, 1-데하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀올, 푸로마이신, 프로카르바진, 하이드록시우레아, 아스파라기나제, 코르티코스테로이드, 마이토탄(O,P'-(DDD)), 인터페론, 및 이러한 세포독성제의 혼합물을 포함한다.
추가의 세포독성제는 화학치료제, 예를 들면, 카르보플라틴, 시스플라틴, 파클리탁셀, 겜시타빈, 칼리체아미신, 독소루비신, 5-플루오로우라실, 미토마이신 C, 악티노마이신 D, 사이클로포스파미드, 빈크리스틴, 블레오마이신, VEGF 길항제, EGFR 길항제, 플라틴, 탁솔, 이리노테칸, 5-플루오로우라실, 겜시타빈, 류코보린, 스테로이드, 사이클로포스파미드, 멜팔란, 빈카 알칼로이드(예컨대, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신 및 비노렐빈), 무스틴, 타이로신 키나제 억제제, 방사선치료요법, 성 호르몬 길항제, 선택적인 안드로겐 수용체 조절인자, 선택적인 에스트로겐 수용체 조절인자, PDGF 길항제, TNF 길항제, IL-1 길항제, 인터루킨(예컨대, IL-12 또는 IL-2), IL-12R 길항제, 독소 접합된 모노클로날 항체, 종양 항원 특이적인 모노클로날 항체, 에르비툭스, 아바스틴, 페르투주맙, 항-CD20 항체, 리툭산, 옥크렐리주맙, 오파투무맙, DXL625, HERCEPTIN® 또는 이의 임의의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 식물 및 세균으로부터의 독성 효소, 예를 들면, 리신, 디프테리아 독소 및 슈도모나스 독소를 치료제(예컨대, 항체)에 접합시켜 세포-형-특이적인 사멸 시약을 생성할 수 있다(Youle, et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 77:5483(1980); Gilliland, et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 77:4539(1980); Krolick, et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 77:5419(1980)).
다른 세포독성제는 미국 특허 제6,653,104호에서 골든버그(Goldenberg)에 의해 기술된 바와 같은 세포독성 리보뉴클레아제를 포함한다. 본 발명의 구현예는 또한 방사면역접합체에 관한 것이며, 여기서 알파 또는 베타 입자를 방출하는 방사성핵종은 복합체-형성제의 존재 또는 부재하에서 키메라 단백질에 안정하게 커플링된다. 이러한 방사성핵종은 베타-방사체, 예를 들면, 인-32, 스칸듐-47, 구리-67, 갈륨-67, 이트륨-88, 이트륨-90, 요오드-125, 요오드-131, 사마륨-153, 루테튬-177, 레늄-186 또는 레늄-188, 및 알파-방사체, 예를 들면 아스타틴-211, 납-212, 비스무쓰-212, 비스무쓰-213 또는 악티늄-225를 포함한다.
예시적인 검출가능한 모이어티는 또한 서양고추냉이 퍼옥시다제, 아세틸콜린에스테라제, 알칼린 포스파타제, 베타-갈락토시다제 및 루시페라제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 추가의 예시적인 형광성 물질은 로다민, 플루로레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 움벨리페론, 디클로로트리아지닐아민, 피코에리트린 및 단실 클로라이드를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 추가의 예시적인 화학발광성 모이어티는 루미놀을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 추가의 예시적인 생물발광성 물질은 루시페린 및 아에쿠오린을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 추가의 예시적인 방사활성 물질은 요오드-125, 탄소-14, 황-35, 트리움 및 인-32을 포함한다.
치료 방법
본원에 기술된 방법 및 조성물은 다양한 질환 및 장애, 예를 들면, 그러나 이에 한정되지 않는 암, 감염, 면역 장애, 빈혈증, 자가면역 질환, 심혈관 질환, 상처 치유, 허혈 관련 질환, 신경변성 질환, 대사 질환 및 많은 다른 질환 및 장애를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 임의의 본 제제는 다양한 질환 및 장애, 예를 들면, 그러나 이에 한정되지 않는 암, 감염, 면역 장애, 염증 질환 또는 상태, 및 자가면역 질환 치료용 의약의 치료, 또는 제조시 사용할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명은 만성 육아종병, 골석화증, 특발성 폐 섬유증, 프라이드라이히 운동실조증(Friedreich's ataxia), 아토피성 피부염, 샤가스병(Chagas disease), 암, 심부전, 자가면역 질환, 겸상 적혈구 질환(sickle cell disease), 탈라쎄미아(thalassemia), 혈액 손실, 수혈 반응, 당뇨병, 비타민 B12 결핍증, 콜라겐 혈관 질환, 슈와크만 증후군(Shwachman syndrome), 혈소판감소자색반, 복강병(Celiac disease), 엔도크린 결핍증 상태, 예를 들면, 갑상샘 기능저하증 또는 애디슨병(Addison's disease), 자가면역 질환, 예를 들면, 크론병(Crohn's Disease), 전신 홍반성 낭창, 류마티스 관절염 또는 청소년 류마티스 관절염, 궤양성 결장염 면역 장애, 예를 들면, 호산성 근막염, 저면역글로불린혈증(hypoimmunoglobulinemia), 또는 흉선종/흉선 암종, 이식체 대 숙주병, 전백혈병, 비혈액학적 증후군(Nonhematologic syndrome)(예컨대, 다운스(Down's), 두보비츠(Dubowwitz), 섹케르(Seckel)), 펠티 증후군(Felty syndrome), 용혈성 요독성 증후군, 골수이형성 증후군(myelodysplasic syndrome), 발작성 야간혈색뇨(nocturnal paroxysmal hemoglobinuria), 골골수섬유증(osteomyelofibrosis), 범혈구감소증, 순수한 적혈구 무형성, 쇤라인-헤노흐자반병(Schoenlein-Henoch purpura), 말라리아, 단백질 고갈, 월경과다증, 전신 경화증, 간 경화증, 대사저하 상태(hypometabolic state), 및 울혈성 심부전 중 하나 이상을 갖는 환자의 치료에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 만성 육아종병, 골석화증, 특발성 폐 섬유증, 프리드라이히 운동실조증, 아토피성 피부염, 샤가스병, 마이코박테리아 감염, 암, 경화증, 간염, C형 간염, 패혈성 쇼크, 및 류마티스 관절염 중 하나 이상을 갖는 환자의 치료에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 암을 가진 환자의 치료에 관한 것이다. 본원에 사용된 바와 같은, 암은 체 기관 및 시스템의 정상 기능화를 방해할 수 있는 세포의 임의의 조절되지 않는 성장을 지칭하며, 원발성 및 전이성 종양 둘 다를 포함한다. 원발성 종양 또는 이들의 원래의 위치로부터 이동한 암 및 씨드 필수 기관(seed vital organ)은 궁극적으로 영향받은 기관의 기능성 저하를 통해 대상체의 사멸을 초래한다. 전이는 원발성 종양으로부터 신체의 다른 부분으로 암 세포의 전파로부터 생성되는, 원발성 종양 위치로부터 떨어진, 암 세포 또는 암세포의 그룹이다. 전이는 궁극적으로 대상체의 사멸을 야기한다. 예를 들면, 암은 양성 및 악성 암, 폴립, 과형성뿐만 아니라, 휴면기 종양 또는 미세전이를 포함할 수 있다.
치료될 수 있는 예시적인 암은 암종(예컨대, 다양한 아형, 예를 들면, 선암종, 기저 세포 암종, 편평 세포 암종, 및 전이 세포 암종 포함), 육종(예를 들면, 골 조직 및 연조직 포함), 백혈병(예를 들면, 급성 골수모양, 급성 림프아구성, 만성 골수모양, 만성 림프구성, 및 모발 세포 포함), 림프종 및 골수종(예를 들면, 호지킨(Hodgkin) 및 비-호지킨 림프종(non-Hodgkin lymphoma), 경쇄, 비-분비성, MGUS, 및 형질세포종 포함), 및 중추신경계 암(예를 들면, 뇌(예컨대, 신경교종(예컨대, 별아교세포종, 희소돌기아교세포종, 및 뇌실막종 포함), 수막종, 뇌하수체 샘종, 및 신경종, 및 척수 종양(예컨대, 수막종 및 신경섬유종)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
치료될 수 있는 예시적인 암은 기저 세포 암종, 담즙관 암; 방광암, 골암; 뇌 및 중추신경계 암; 유방암; 복막의 암; 자국경부 암; 융모막암; 결장 및 직장 암; 연결 조직 암; 소화계의 암; 내피 암; 식도암; 눈암; 두경부의 암; 위암(위장암 포함); 교모세포종; 간 암종; 간암; 상피내 신생물(intra-epithelial neoplasm); 신장 또는 신암; 후두암; 백혈병; 간암; 폐암(예컨대, 소-세포 폐암, 비-소 세포 폐암, 폐의 선암종, 및 폐의 편평세포 암종); 흑색종; 골수종; 신경모세포종; 구강암(입술, 혀, 입, 및 인두); 난소암; 췌장암; 전립샘 암; 망막모세포종; 횡문근육종; 직장암; 호흡계의 암; 타액선 암종; 육종; 피부암; 편평 세포 암; 위암; 고환암; 갑상선암; 자궁 또는 내막 암; 뇨 시스템의 암; 음문암; 림프종, 예를 들면, 호지킨 및 비-호지킨 림프종뿐만 아니라 B-세포 림프종(저 등급/난포 비-호지킨 림프종(NHL); 소 림프구성(SL) NHL; 중간 등급/난포 NHL; 중간 등급 확산 NHL; 고 등급 면역모세포 NHL; 고 등급 림프모구성 NHL; 고 등급 소 비-분열된 세포 NHL; 벌키 질환(bulky disease) NHL; 외투세포 림프종; AIDS-관련 림프종; 및 발덴스트롬 거대글로불린혈증(Waldenstrom's Macroglobulinemia); 만성 림프세포성 백혈병(CLL); 급성 림프모구성 백혈병(ALL); 모발 세포 백혈병; 만성 골수모구 백혈병; 뿐만 아니라 다른 암종 및 육종; 및 이식후 림프구증식성 장애(PTLD) 뿐만 아니라, 모반증과 관련된 비정상 혈관 증식, 부종(예컨대, 뇌 종양과 관련됨), 및 메이그 증후군(Meigs' syndrome)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
다양한 구현예에서, 본 발명은 Myc-구동된 암, 즉, Myc를 과발현하는 암 세포의 치료에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 암 세포는 c-Myc, N-Myc, 및/또는 L-Myc 중 어느 하나를 과발현한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 암 세포가 본원에 기술된 항암 치료제 중 임의의 하나를 사용한 치료에 민감하도록 한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 암 세포의 전사 활성을 감소시킨다.
일부 구현예에서, 본 발명은 미생물 감염 및/또는 만성 감염을 가진 환자의 치료에 관한 것이다. 예시적인 감염은 샤가스 병, HIV/AIDS, 결핵, 골수염, B형 간염, C형 간염, 엡슈타인-바르 바이러스(Epstein-Barr virus) 또는 파르보바이러스(parvovirus), T 세포 백혈병 바이어스, 세균 과성장 증후군, 진균 또는 기생충 감염을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
다양한 구현예에서, 본 조성물은 하나 이상의 염증 질환 또는 상태, 예를 들면, 염증, 급성 염증, 만성 염증, 호흡 질환, 죽상경화증, 재발협착증, 천식, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염, 패혈성 쇼크, 류마티스 관절염, 염증성 창자병, 염증설 골반 질환, 통증, 안구 염증 질환, 소아 지방변증, 레이 증후군(Leigh Syndrome), 글리세롤 키나제 결핍증, 가족성 호산백혈구 증가증(FE), 상염색체 열성 뇌성 운동실조증(autosomal recessive spastic ataxia), 후두 염증성 질환; 결핵; 만성 담낭염, 기관지 확장증, 규폐증 및 다른 진폐증을 치료하거나 예방하는데 사용된다.
다양한 구현예에서, 본 조성물은 하나 이상의 자가면역 질환 또는 상태, 예를 들면, 다발성 경화증, 진성 당뇨병, 루푸스, 소아 지방변증, 크론병, 궤양성 결장염, 길랑-바레 증후군(Guillain-Barre syndrome), 경화증, 굿패스쳐 증후군(Goodpasture's syndrome), 베게너 육아종증(Wegener's granulomatosis), 자가면역 간질, 라스무센의 뇌염(Rasmussen's encephalitis), 원발성 담즙 경화증, 경화 쓸개관염, 자가면역 간염, 애디슨 질환(Addison's disease), 하시모토 갑상선염(Hashimoto's thyroiditis), 섬유근육통, 메니에르 증후군(Menier's syndrome); 이식 거부(예컨대, 동종이식체 거부의 예방), 악성 빈혈, 류마티스 관절염, 전신 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus), 피부근염, 소그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 홍반성 루푸스, 다발 경화증, 중증 근무력증, 라이터 증후군(Reiter's syndrome), 그레이브스 질환(Grave's disease), 및 다른 자가면역 질환을 치료하거나 예방하기 위해 사용된다.
다양한 구현예에서, 본 조성물은 심혈관 질환, 예를 들면, 심장 및 혈관화에 영향을 미치는 질환 또는 상태, 예를 들면, 그러나 이에 한정되지 않는 관상 동맥성 심장 질환(CHD), 뇌혈관 질환(CVD), 대동맥 협착증, 말초 혈관 질환, 죽상경화증, 동맥경화증, 심근 경색(심장 마비), 뇌혈관 질환(뇌졸중), 일시적인 허혈성 마비(transient ischaemic attack: TIA), 협심증(안정한 및 불안정한), 심방 세동, 부정맥, 판막증(vavular disease), 및/또는 울혈성 심부전을 치료하거나, 제어하거나, 예방하는데 사용된다.
다양한 구현예에서, 본 조성물은 하나 이상의 대사-관련 장애를 치료 또는 예방하는데 사용된다. 다양한 구현예에서, 본 발명은 당뇨병, 예를 들면, 제1형 및 제2형 당뇨병 및 비만 관련 당뇨병의 치료, 제어 및 예방에 유용하다. 본 발명의 조성물 및 방법은 당뇨병-관련 장애, 예를 들면, 그러나 이에 한정되지 않는, 당뇨병성 판막증, 고혈당증, 손상된 글루코즈 내성, 인슐린 내성, 비만, 지질 장애, 이상지질혈증, 과지질혈증, 고중성지질혈증, 과콜레스테롤혈증, 저 HDL 수준, 고 LDL 수준, 죽상경화증 및 이의 후유증, 혈관 재발협착증, 자극성 창자 증후군, 염증성 창자병, 예를 들면, 크론병 및 궤양성 결장염, 다른 염증성 상태, 췌장염, 복부 비만, 비만, 신경변성 질환, 망막병증, 신생물 상태, 지방 세포 종양, 지방 세포 암종, 예를 들면, 지방육종, 전립샘암 및 다른 암, 예를 들면, 위, 유방, 방광 및 결장암, 혈관형성, 알츠하이머 질환(Alzheimer's disease), 건선, 고혈압, 대사 증후군(예컨대, 사람은 다음 장애 중 하나 이상을 갖는다: 복부 비만, 고중성지질혈증, 저 HDL 콜레스테롤, 고혈압, 및 고 절식 혈장 글루코즈), 난소 안드로겐과잉증(ovarian hyperandrogenism)(다낭성 난소 증후군), 및 인슐린 내성이 구성 성분인 다른 장애, 예를 들면, 수면 무호흡의 치료 또는 예방에 유용하다. 본 발명의 조성물 및 방법은 비만, 예를 들면, 유전적 또는 환경적, 및 비만-관련 장애의 치료, 제어 또는 예방에 유용하다. 본원의 비만-관련 장애는 비만과 관련되거나, 이에 의해 유발되거나, 이로부터 생성된다. 비만-관련 장애의 예는 비만, 당뇨병, 과식, 밤참 증후군(binge eating), 및 과식증, 고혈압, 상승된 혈장 인슐린 농도 및 인슐린 내성, 이상지질혈증, 고지질혈증, 자궁내막의, 유방, 전립샘, 신장 및 결장 암, 골관절염, 폐쇄 수면 무호흡, 담석증, 심장 질환, 비정상적인 심부전 및 부정맥증, 심근 경색, 울혈성 심부전, 관상동맥성 심장 질환, 돌연사, 뇌졸중, 다낭성 난소병, 두개인두종, 프라더-윌리 증후군(Prader-Willi Syndrome), 프뢰리히 증후군(Frohlich's syndrome), GH-결핍성 대상체, 정상 변이체 단신증(normal variant short stature), 터너 증후군(Turner's syndrome), 및 감소된 대사 활성 또는 총 지방을 뺀 질량(예컨대, 급성 림프모구 백별형을 지닌 어린이)의 퍼센트로서 휴식기 에너지 소비량의 감소 또는 감소된 대사 활성을 나타내는 다른 병리학적 상태를 포함한다. 비만-관련된 장애의 추가의 예는 대사 증후군, 인슐린 내성 증후군, 재생성 호르몬 이상, 성 및 재생 기능장애, 예를 들면, 손상된 생식능, 불임, 남성에서 생식샘저하증 및 여성에서 다모증, 모체 비만과 관련된 태아 결함, 위장 운동 장애, 예를 들면, 비만-관련 위-식도 역류, 호흡 장애, 예를 들면, 비만-저환기증후군(피크위크 증후군(Pickwickian syndrome)), 숨이 참(breathlessness), 심혈관 장애, 염증, 예를 들면, 혈관조직의 전신성 염증, 동맥경화증, 고콜레스테롤혈증, 하부 요통, 방광 질환, 고요산혈증, 통풍, 및 신장암, 및 증가된 무감각 위험이다. 본 발명의 조성물 및 방법은 또한 알츠하이머 질환을 치료하는데 유용하다.
다양한 구현예에서, 본 조성물은 하나 이상의 호흡성 질환, 예를 들면, 특발성 폐 섬유증(IPF), 천식, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 기관지확장, 알레르기성 비염, 축농증, 폐 혈관수축, 염증, 알레르기, 방해된 호흡, 호흡 곤란 증후군, 낭성 섬유증, 폐 고혈압, 폐 혈관수축, 폐기종, 한타바이러스 폐 증후군(Hantavirus pulmonary syndrome: HPS), 뢰플러 증후군(Loeffler's syndrome), 굿파스처 증후군(Goodpasture's syndrome), 흉막염, 폐렴, 폐 부종, 폐 섬유증, 유육종증, 호흡 합포체 바이러스(respiratory syncitial virus) 감염과 관련된 합병증, 및 다른 호흡성 질환을 치료 또는 예방하는데 사용된다.
일부 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 신경변성 질환을 치료 또는 예방하는데 사용된다. 예시적인 신경변성 질환은 프라드리히 운동실조증(Friedreich's ataxia), 다발 경화증(예를 들면, 이에 한정되지 않는 양성 다발경화증; 재발 경감 다발 경화증(relapsing-remitting multiple sclerosis: RRMS); 2차 진행성 다발 경화증(SPMS); 진행 재발 다발 경화증(PRMS); 및 폐 진행성 다발 경화증(PPMS)), 알츠하이머 질환(예를 들면, 이에 제한되지 않는, 조기 발생 알츠하이머 질환, 말기 발병 알츠하이머 질환, 및 가족성 알츠하이머 질환(FAD), 파킨슨 질환 및 파킨슨병(예를 들면, 이에 제한되지 않는, 특발성 파킨슨 질환, 혈관 파킨슨증후군, 약물-유도된 파킨슨증후군, 루이소체 치매(Dementia with Lewy bodies), 유전된 파킨슨 질환, 청소년 파킨슨 질환), 헌팅톤 질환(Huntington's disease), 근위축성 측색경화증(ALS, 예를 들면, 이에 제한되지 않는, 산발성 ALS, 가족성 ALS, 서 태평양 ALS, 청소년 ALS, 히라마야 질환(Hiramaya Disease))을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
다양한 구현예에서, 본 키메라 단백질은 상처, 예컨대, 비-치유성 상처, 궤양, 화상, 또는 동상, 만성 또는 급성 상처, 개방 또는 폐쇄된 상처, 내부 또는 외부 상처(예시적인 외부 상처는 침투성 및 비-침투성 상처이다)를 치료하는데 있어서의 용도가 발견된다. 다양한 구현예에서, 본 키메라 단백질은 허혈, 비-제한적인 예로서, 급성 관상 증후군과 관련된 허혈, 급성 폐 손상(ALI), 급성 심근 경색(AMI), 급성 호흡 곤란 증후군(ARDS), 동맥 폐색 질환, 죽상경화증, 관절 연골 결함, 무균성 전신 염증, 죽상경화성 심혈관 질환, 자가면역 질환, 골절, 골절, 뇌 부종, 뇌 관류저하, 버거 질환(Buerger's disease), 화상, 암, 심혈관 질환, 연골 손상, 대뇌 경색, 대뇌 허혈, 대뇌 허혈, 뇌졸중, 뇌혈관 질환, 화학치료요법-유발된 신경병증, 만성 감염, 만성 장간막 허혈(chronic mesenteric ischemia), 절뚝거림, 울혈성 심부전, 연결 조직 손상, 타박상, 관상 동맥 질환(CAD), 중증 하지 허혈(CLI), 크론병, 심부 정맥 혈전증, 심한 상처, 지연된 궤양 치유, 지연된 상처-치유, 당뇨병(제I형 및 제II형), 당뇨병성 신경병증, 당뇨병 유발된 허혈, 파종성 혈관내 응고(DIC), 색전성 뇌 허혈, 동상, 이식체-대-숙주 질환, 유전성 출혈 모세혈관확장성 혈관 질환, 산소과잉성 손상, 저산소증, 염증, 염증성 창자 질환, 염증 질환, 손상된 힘줄, 간혈성 파행(intermittent claudication), 장 허혈, 허혈, 허혈성 뇌 질환, 허혈성 심장 질환, 허혈성 말초 혈관 질환, 허혈성 태반, 허혈성 신장 질환, 허혈성 혈관 질환, 허혈성 재관류 손상, 열상, 좌측 주요 관상 동맥 질환, 사지 허혈, 하지 허혈(lower extremity ischemia), 심근 경색, 심근 허혈, 기관 허혈, 골관절염, 골다공증, 골육종, 파킨슨 질환, 말초 동맥 질환(PAD), 말초 동맥 질환, 말초 허혈, 말초 신경병증, 말초 혈관 질환, 전-암 폐 부종, 폐 색전증, 리모델링 장애(remodeling disorder), 신장 허혈, 망막 허혈, 망막증, 패혈증, 피부 궤양, 고형 기관 이식, 척추 손상, 뇌졸중, 연골하-골 낭종(subchondral-bone cyst), 혈전증, 혈전성 뇌 허혈, 조직 허혈, 일시적인 허혈성 발작(TIA), 외상성 뇌 손상, 궤양성 결장염, 신장의 혈관 질환, 혈관 염증 상태, 폰 히펠린도 증후군(von Hippel-Lindau syndrome), 또는 조직 또는 기관에 대한 손상을 치료하는데 있어서의 용도가 발견된다.
다양한 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 빈혈, 예를 들면, 만성 신장 질환(예컨대, 투석으로부터) 및/또는 항암제(예컨대, 화학치료요법 및/또는 HIV 치료(예컨대, 지도부딘(INN) 또는 아지도티미딘(AZT)), 염증성 창자병(예컨대, 크론 병 및 궤양성 결장염)으로부터 생성되는 빈혈, 염증 상태(예컨대, 관절염, 루푸스, IBD)에 연결된 빈혈, 재생불량성 빈혈로서, 당뇨병, 조현병, 대뇌 말라리아에 연결된 빈혈, 및 암의 치료(예컨대, 화학치료요법 및/또는 방사선)로부터의 척수형성이상증, 및 다양한 골수이형성 증후군 질환(예컨대, 겸상 적혈구성 빈혈, 헤모글로빈 SC 질환, 헤모글로빈 C 질환, 알파- 및 베타-지중해빈혈, 조기 출산 후 신생아 빈혈, 및 비교가능한 상태)의 치료에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 빈혈, 즉, 적혈구의 수 및/또는 적혈구에서 발견된 헤모글로빈의 양이 정상보다 낮은 상태를 가진 환자의 치료에 관한 것이다. 다양한 구현예에서, 빈혈은 급성 또는 만성일 수 있다. 예를 들면, 본 빈혈은 철 결핍증 빈혈, 신장 빈혈, 만성 질환/염증의 빈혈, 악성 빈혈, 예를 들면, 대적혈구성 빈혈(macrocytic achylic anemia), 청소년 악성 빈혈 및 선천성 악성 빈혈, 암-관련 빈혈, 항암 관련 빈혈(예컨대, 화학치료요법-관련된 빈혈, 방사선요법-관련된 빈혈), 순수한 적혈구 형성부전증, 과도한 폭발을 지닌 난치성 빈혈(refractory anemia with excess of blasts), 무형성 빈혈, X-라인 시데로블라스트성 빈혈(siderobalstic anemia), 용혈성 빈혈, 겸상 적혈구성 빈혈, ESA의 손상된 생산에 의해 유발된 빈혈, 골수이형성 증후군, 저색소 빈혈, 소적혈구성 빈혈, 시데로블라스트성 빈혈, 자가면역 용혈성 빈혈, 쿨리 빈혈증, 지중해 빈혈(Mediterranean anemia), 다이아몬드-블랙핀 빈혈(Diamond Blackfan anemia), 판코니 빈혈(Fanconi's anemia) 및 약물-유도된 면역 용혈성 빈혈을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 빈혈은 심각한 증후군, 예를 들면, 저산소증, 만성 피로, 집중력 결여, 창백한 피부, 저혈압, 현기증 및 심장 부전을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, 본 발명은 만성 신장 부전으로부터 야기되는 빈혈의 치료에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 신장 대체 요법, 예를 들면, 투석, 혈액투석, 복강 투석, 혈액 여과법, 혈액투석여과, 및 신장 이식으로부터 야기되는 빈혈의 치료에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 투석 중이 아닌 만성 신장 질환을 지닌 환자에서 빈혈의 치료에 관한 것이다. 예를 들면, 본 발명은 1 단계 CKD, 또는 2 단계 CKD, 또는 3 단계 CKD, 또는 4 단계 CKD, 또는 5 단계 CKD의 환자에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 본 환자는 4 단계 CKD 또는 5 단계 CKD이다. 일부 구현예에서, 본 환자는 신장 이식을 겪었다. 일부 구현예에서, 본 발명은 급성 신장 손상(AKI)을 가진 환자의 빈혈의 치료에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 빈혈은 화학치료요법에 의해 유도된다. 예를 들면, 화학치료요법은 임의의 골수억제성 화학치료요법일 수 있다. 일부 구현예에서, 화학치료요법은 하나 이상의 레블리미드, 탈로미드, 덱사메타손, 아드리아마이신 및 독실이다. 일부 구현예에서, 화학치료요법은 하나 이상의 백금-기반 약물, 예를 들면, 시스플라틴(예컨대, PLATINOL) 및 카르보플라틴(예컨대, PARAPLATIN)이다. 일부 구현예에서, 화학치료요법은 본원에 기술된 화학치료제 중 임의의 하나이다. 일부 구현예에서, 화학치료요법은 이의 내용이 본원에 참고로 포함된, 문헌: Groopman et al. J Natl Cancer Inst(1999) 91(19): 1616-1634에 기술된 임의의 제제이다. 일부 구현예에서, 본 조성물 및 방법은 말기 단계 암 환자(예컨대, IV 단계, 또는 III 단계, 또는 II 단계 암)에서 화학치료요법-관련된 빈혈의 치료에 사용된다. 일부 구현예에서, 본 조성물 및 방법은 용량-진한(dose-dense) 화학치료요법 또는 다른 공격성 화학치료요법 섭생을 제공받는 암 환자에서 화학치료요법-관련된 빈혈의 치료에 사용된다.
일부 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 혈액-기반 암, 예를 들면, 백혈병, 림프종, 및 다발 골수종을 가진 환자에서 빈혈의 치료에 관한 것이다. 이러한 암은 골수에 직접적으로 영향을 미칠 수 있다. 또한, 본 발명은 골 또는 골수로 확산된 전이성 암에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 본 발명은 방사선 치료요법을 겪는 환자에서 빈혈의 치료에 관한 것이다. 이러한 방사선 치료요법은 골수에 손상을 입혀서, 적혈구를 제조하는 이의 능력을 저하시킬 수 있다. 추가의 구현예에서, 본 발명은 철, 비타민 B12, 및 엽산 중 하나 이상의 감소증 또는 결핍증을 가진 환자의 치료에 관한 것이다. 추가의 구현예에서, 본 발명은 과도한 출혈, 예를 들면, 이에 제한되지 않는, 수술 후 또는 내부 출혈을 유발하는 종양으로부터 환자내 빈혈의 치료에 관한 것이다. 추가의 구현예에서, 본 발명은 만성 질환의 빈혈을 가진 환자에서 빈혈의 치료에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 본 방법 및 조성물은 적혈구 생산을 자극시킨다. 일부 구현예에서, 본 방법 및 조성물은 골수내 헌신적인 적혈구 조상의 분열 및 분화를 자극시킨다.
본 발명의 특정 구현예는 암 환자에서 화학치료요법-유도된 빈혈을 치료하는데 특히 유용하다. 일부 구현예에서, 본 방법 및 조성물은 암 환자의 화학치료요법을 끝낸 후 키메라 단백질의 연속 투여를 허용한다. 일부 구현예에서, 본 방법 및 조성물은 비-암 환자에 대해 용량 감소없이 암 환자의 치료를 허용한다. 일부 구현예에서, 본 방법 및 조성물은 화학치료요법을 제공받고 치유가능하는 것으로 고려되는 암 환자의 치료를 허용한다. 다양한 구현예에서, 암 환자는 혈액 응고의 병력, 최근 수술, 연장된 기간의 장기 요양 또는 제한된 활성, 및 화학치료제를 사용한 치료 중 하나 이상을 갖는다.
키트(kit)
본 발명은 또한 본원에 기술된 임의의 제제(예컨대, 다양한 추가의 치료제의 존재 또는 부재하에서의 키메라 단백질)의 투여용 키트를 제공한다. 키트는 물질 또는 성분, 예를 들면, 본원에 기술된 본 발명의 약제학적 조성물 중 적어도 하나의 집합이다. 따라서, 일부 구현예에서, 키트는 본원에 기술된 약제학적 조성물 중 적어도 하나를 함유한다.
키트 속에 배치된 성분의 정확한 특성은 이의 의도된 목적에 좌우된다. 일 구현예에서, 키트는 사람 대상체를 치료할 목적으로 구성된다.
사용을 위한 설명서가 키트에 포함될 수 있다. 사용을 위한 설명서는 목적한 결과를 달성하기 위해, 예를 들면, 암을 치료하기 위해 키트의 성분의 사용하는데 있어서 사용될 기술을 설명하는 가시적인 표현을 포함한다. 임의로, 키트는 당해 분야의 기술자에 의해 용이하게 인식될 바와 같이, 다른 유용한 성분, 예를 들면, 희석제, 완충제, 약제학적으로 허용되는 담체, 주사기, 카테터(catheter), 도포기(applicator), 피펫팅(pipetting) 또는 측정 도구, 붕대용 재료 또는 다른 유용한 용품을 함유한다.
키트내 조립된 물질 및 성분은 전문가에게 제공되어 이들의 작동능 및 유용성을 보존하는 임의의 편의성 및 적합한 방식으로 저장될 수 있다. 예를 들면, 성분은 실온, 냉장 또는 동결된 온도에서 제공될 수 있다. 성분은 전형적으로 적합한 포장재 속에 함유된다. 다양한 구현예에서, 포장재는 잘-공지된 방법에 의해 구성되어, 바람직하게는 멸균성, 오염물질이 없는 환경을 제공한다. 포장재는 키트 및/또는 이의 성분의 함량 및/또는 목적을 나타내는 외부 표지를 가질 수 있다.
정의
본원에 사용된 바와 같은, 단수("a", "an", 또는 "the")는 하나 또는 하나 이상을 의미할 수 있다.
달리 구체적으로 기술하거나 내용으로부터 명확하지 않는 한, 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "또는"은 포괄적이고 "또는" 및 "및" 둘 다를 포함하는 것으로 이해된다.
또한, 언급된 수치 표시와 관련하여 사용된 경우 용어 "약"은 그러나 언급된 수치의 10%까지의 플러스 또는 마이너스의 언급된 수치, 예컨대, 상술한 값의 (플러스 또는 마이너스) 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 또는 0.01%를 의미한다. 예를 들면, "약 50"은 45 내지 55의 범위를 포함한다.
"유효량"은 의학적 용도와 관련하여 사용된 경우 관심있는 질환의 측정가능한 치료, 예방, 또는 발병율에 있어서의 감소를 제공하는데 효과적인 양이다.
본원에 사용된 바와 같이, 이러한 조절의 부재와 관련한 제제 또는 자극의 존재하에서, 활성 및/또는 효과의 판독이 유의한 양까지, 예를 들면, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 이상 및 예를 들면, 적어도 약 100% 이하를 포함하여 감소된다. 당해 분야의 숙련가에 의해 이해될 바와 같이, 일부 구현예에서, 활성은 감소되며 일부 하부 판독물은 감소될 것이지만 다른 것은 증가될 것이다.
역으로, 이러한 제제 또는 자극의 부재에 대해, 활성 및/또는 효과의 판독이 유의적인 양까지, 예를 들면, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 이상, 및 예를 들면, 적어도 약 100% 이하, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 50배, 적어도 약 100배까지 증가된다.
본원에 지칭되는 바와 같이, 모든 조성물 퍼센트는 달리 명시하지 않는 한, 총 조성물의 중량 기준이다. 본원에 사용된 바와 같은, 단어 "포함하다" 및 이의 변형체는 비제한적인 것이어서 목록내 항목의 인용은 이러한 기술의 조성물 및 방법에서 또한 유용할 수 있는 항목과 같은 다른 것의 배제가 아닌 것으로 의도된다. 유사하게, 용어 "할 수도 있다(can 및 may)" 및 이의 변형체는 비제한적인 것으로 의도되므로, 구현예가 특정 요소를 포함할 수 있거나 포함할 수도 있거나 또는 특징이 이러한 요소 또는 특징을 함유하지 않는 본 기술의 다른 구현예를 배제하지 않음을 열거한다.
포함하는, 함유하는, 또는 갖는과 같은 용어의 동의어로서 개방형 용어(open-ended term) "포함하는"은 본원에 본 발명을 설명하고 청구하기 위해 사용되며, 본 발명, 또는 이의 구현예는 "로 이루어지는" 또는 "로 필수적으로 이루어지는"과 같은 대안적인 용어를 사용하여 대안적으로 기술될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 단어 "바람직한" 및 "바람직하게는"은 특정의 환경 하에서 특정의 이익을 제공하는 기술의 구현예를 지칭한다. 그러나, 다른 구현예도 동일하거나 다른 환경 하에서 또한 바람직할 수 있다. 또한, 하나 이상의 바람직한 구현예의 인용은 다른 구현예가 유용하지 않으며, 기술 범위로부터 다른 구현예를 배제하기 위해 의도되지는 않음을 내포하지 않는다.
치료학적 효과를 달성하기 위해 필요한 본원에 기술된 조성물의 양은 특수한 목적을 위한 통상의 과정에 따라 실험적으로 결정될 수 있다. 일반적으로, 치료학적 목적을 위해 치료제를 투여하기 위해, 치료제는 약리학적 유효 용량으로 제공된다. "약제학적 유효량", "약제학적 유효 용량", "치료학적 유효량" 또는 "유효량"은 특히 장애 또는 질환을 치료하기 위해, 목적한 생리학적 효과 또는 목적한 결과를 달성할 수 있는 양을 생산하기에 충분한 양을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 유효량은 예를 들면, 장애 또는 질환의 증상의 발달을 지연시키고, 장애 또는 질환의 증상의 과정을 변경시키고(예컨대, 질환의 증상의 진행을 지연시키고), 장애 또는 질환의 하나 이상의 증상 또는 징후를 감소시키거나 제거하고, 장애 또는 질환의 증상을 회복시키기에 충분한 양을 지칭한다. 치료학적 이점은 또한 개선이 실현되는지 여부에 상관없이, 직면하는 질환 또는 장애의 진행을 중단시키거나 지연시킴을 포함한다.
유효량, 독성, 및 치료학적 효능은 예컨대, LD50(집단의 약 50%까지 치사인 용량) 및 ED50(집단의 약 50%로 치료학적으로 효과적인 용량)을 측정하기 위한, 세포 배양물 또는 실험 동물에서 표준 약제학적 과정에 의해 측정될 수 있다. 투여량은 사용된 투여형 및 활용된 투여 경로에 따라 변할 수 있다. 독성과 치료 효과 사이의 용량 비는 치료학적 지수이며 LD50/ED50 비로서 나타낼 수 있다. 일부 구현예에서, 큰 치료학적 지수를 나타내는 조성물 및 방법이 바람직하다. 치료학적 유효 용량은 예를 들면, 세포 배양 검정을 포함하는 시험관내 검정으로부터 초기에 평가될 수 있다. 또한, 용량을 동물 모델에서 제형화하여 세포 배양물, 또는 적절한 동물 모델에서 측정한 바와 같은 IC50을 포함하는 순환하는 혈장 농도를 달성할 수 있다. 혈장 속에서 기술된 조성물의 수준은 예를 들면, 고 성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정할 수 있다. 임의의 특수한 투여량의 효과는 적합한 생물검정으로 모니터링할 수 있다. 투여량은 주치의에 의해 결정될 수 있으며, 필요에 따라, 관찰된 치료 효과를 맞추기 위해 조절할 수 있다.
특정의 구현예에서, 효과는 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 50%, 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 90%의 정량화할 수 있는 변화를 야기할 것이다. 일부 구현예에서, 효과는 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 50%, 약 70%, 또는 심지어 약 90% 이상의 정량화가능한 변화를 생성할 것이다. 치료학적 이점은 또한 개선이 실현되는지 여부에 상관없이, 근본적인 질환 또는 장애의 진행을 중단하거나 지연시킴을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은, "치료 방법"은 본원에 기술된 질환 또는 장애를 치료하기 위한 조성물의 용도 및/또는 본원에 기술된 질환 또는 장애를 치료하기 위한 의약의 제조시의 용도 및/또는 용도들을 위한 조성물에 동일하게 적용가능하다.
실시예
용어 "AcTaferon"은 인터페론-기반 키메라를 참고하기 위해 본원에 가끔 사용된다.
다음의 실시예에서, 달리 나타내지 않는 한, IFN에 대한 돌연변이는 사람 IFN-α2에 대한 것이다.
Q124R 돌연변이체는 쥐 모델에서 생체내에서 검정될 수 있는 약화된 사람 IFN 알파 2 돌연변이체를 나타낸다. 구체적으로, Q124R은 마우스에서 사용하기에 적합한 사람 IFN 돌연변이(즉, 이는 마우스에서 작용하는 사람 돌연변이체 IFN이다)이다. 참고: 이의 전체 내용이 본원에 참고로 포함된 Nat. Comm. 2014;5:3016. doi: 10.1038/ncomms4016.
실시예 1. 쥐 SIRP1α에 대해 지시된 VHH는 SIRP1α에 결합하고 SIRP1α/CD47 상호작용을 중화시킨다.
HEK293T 세포를 쥐 SIRP1α 발현 플라스미드로 일시적으로 형질감염시키고 10% FBS가 보충된 DMEM 속에서 37℃에서 48시간 동안 유지시켰다. 세포를 탈착시키고, PBS로 세척하고 1% FBS가 보충된 PBS 속에서 정제된 His-태그된 VHH의 나타낸 농도로 1시간 동안 처리하였다. 샘플을 PBS로 세척하고 1% FBS가 보충된 PBS 속에서 Alexa488-커플링된 항-His 항체(RnD Systems)와 함께 1시간 동안 항온처리하였다. 샘플을 FACSCalibur 분석기(BD Biosciences)에서 측정하였다.
도 1a에 나타낸 바와 같이, 항-쥐 SIRP1α VHH의 일련의 희석은 쥐 SIRP1α를 발현하는 세포에서의 FACS-기반 mSIRPA 결합 검정에서 시험하였다. 형광성 강도의 기하 평균을 플롯팅하였다. 항-쥐 SIRP1α VHH는 쥐 SIRP1α에 특이적으로 결합한다(도 1b).
항-쥐 SIRP1α VHH가 중화하는지에 상관없이 CD47과의 상호작용을 또한 시험하였다(도 1b).
HEK293T 세포를 쥐 SIRP1α 발현 플라스미드로 일시적으로 형질감염시키고 37℃에서 1시간 동안 나타낸 농도에서 1개의 항-쥐 SIRP1α VHH가 보충된 DMEM 배지 속에서 96-웰 플레이트 속에서 씨딩(seeding)하였다. 다음에, 세포를 SEAP(분비된 알칼린 포스파타제)에 커플링된 쥐 CD47(N-말단 158 아미노산)으로 이루어진 융합 단백질을 함유하는 조건화된 배지로 2시간 동안 37℃에서 처리하였다. 항온처리 후, 세포를 PBS + 0.05% 트윈-20으로 4회 세척하고, 포스파타제 활성을 제조업자의 설명서(ThermoFisher Scientific)에 따라 PhosphaLight 검정을 사용하여 측정하였다.
도 1b에 나타낸 바와 같이, 항-마우스 SIRP1α VHH의 일련의 희석물을 쥐 CD47-쥐 SIRPα 결합 검정에서 시험하였다. 3회 측정의 평균 -/+ 표준 편차를 도 1b에 플롯팅하였다. 항-쥐 SIRP1α VHH는 용량-의존성 방식으로 CD47 결합을 억제한다. 데이타는 항-쥐 SIRP1α VHH가 SIRP1α-CD47 상호작용을 중화함을 입증하였다.
실시예 2. 생체내 항-종양 효과에 있어서 SIRP1α 이-특이적인 키메라
생체내 쥐 연구를 B16 모델에서 항-마우스 Sirp1α VHH/사람 IFN Q124R 키메라로 착수하였다.
SIRP1α-표적화된 키메라(20xGGS-링커를 통해 마우스 SIRP1α에 대해 특이적인 N-말단 중화 VHH에 대해 커플링된 hIFNα2Q124R)를 pHen6 벡터에서 작제하고, His-태그된 SIRP1a-키메라의 대규모 생산을 이. 콜라이(E. coli)내에서 수행하였다. 세균을 정지 상(0.7 내지 0.8의 OD600)까지 배양하고 이때 IPTG(BioScientific) 를 가하여 LacZ 프로모터를 활성화시켰다. 세포 상층액을 밤새 배양한 후 수집하였다. 주변세포질 분획 속의 단백질을 슈크로즈 용액을 사용하여 삼투압 쇼크로 방출시키고 코발트 이온이 로딩된 HiTrap 세파로즈 수지(Clontech, Takara Biotechnology) 상에서 고정화된 금속 이온 크로마토그래피(IMAC)로 정제하였다. 단백질의 결합 후, 컬럼을 0.5% EMPIGEN(Calbiochem, Millipore), 0.5% CHAPS(Sigma-Aldrich) 및 PBS로 세척하였다. 이미다졸(Merck)을 용출을 위해 사용하고 PD-10 겔 여과 컬럼(GE Healthcare)을 사용하여 제거하였다. 단백질 농도를 280 nm에서의 흡광도를 사용하여 측정하고 순도를 SDS-PAGE를 통해 평가하였다. LPS 수준을 리물루스 아메보사이트 라이세이트(Limulus Amebocyte Lysate: LAL) QCL-1000(Lonza)를 사용하여 정량화하였다. 여전히 존재하는 경우, LPS를 내독소 제거 수지(Endotoxin Removal Resin)(Thermo Scientific)를 사용하여 정량화하였다. 모든 생성물의 생물학적 활성을 앞서 기술된 바와 같이(Nat. Comm. 2014;5:3016. doi: 10.1038/ncomms4016) WHO 국제 마우스 IFNa 표준 Ga02-901-511에 대한 마우스 루시퍼라제 리포터 세포주 LL171을 사용한 기능성 검정으로 평가하였다.
마우스를 12/12 시간의 명/암 주기로 온도-조절된 환경에서 병원체가 없는 조건 하에서 유지시키고 사료 및 물을 자유로이 제공하였다. 암컷 C57BL/6J 마우스(Charles River Laboratories, Saint-Germain sur l'Arbresle, 프랑스)를 B16-mCD20 클론의 5.106개의 세포(mCD20에 대한 발현 카세트를 함유하는 플라스미드로 안정하게 형질감염된 B16Bl6 세포)를 8주령에서, 30G 인슐린 주사기를 사용하여, 50μl의 현탁액으로, 약하게 진정시킨 마우스(4% 이소플루란 사용)의 털을 제거한 옆구리에 접종하였다.
종양 치료를 종양 접종 후 7일째에 시작하여, 종양 가장자리에서 피하인, 병소 주위(p.l.)로 수행하였다. 마우스(n=5)에게 7, 8, 9, 10, 11, 14, 15 및 16일째에 SIRP1a-키메라 치료를 제공하였다. 대조군으로서, 마우스를 100 μl의 PBS(n=4)로 치료하였다. 키메라에게 35 μg의 단백질(1.6 mg/kg)에 상응하는, 치료당 5,500 IU에서 제공하였다. 마지막 종양 치료 후 1일째에, 혈액을 EDTA-코팅된 마이크로비테 튜브(microvette tube)(Sarstedt)로부터 수집하고, Hemavet 950FS(Drew Scientific, 미국 워터스버리 소재) 전혈 계수기 내에서 분석하였다. WBC, 림프구, 호중구 및 단핵구는 K/㎕로, rbc는 M/㎕로, 헤모글로빈은 g/dl로 및 헤마토크릿(hematocrit)은 %로; 혈소판은 K/㎕로 및 평균 혈소판 용적은 fL로 나타낸다.
도 2a 내지 2b에 나타낸 바와 같이, 실질적인 종양 성장 억제는 PBS 대조군(상부 곡선)과 비교하여 항-마우스 Sirp1α VHH/사람 IFN Q124R 키메라(하부 곡선)로 달성하였다. 또한, Sirp1α VHH/사람 IFN Q124R 키메라는 다양한 혈액 세포-기반 매개변수(전혈 세포수("wbc"), 림프구 수("ly"), 호중구 수("ne"), 단핵구 수("mo"), 적혈구 수("rbc"), 헤모글로빈("hb"); 헤마토크릿("hct"), 혈소판("plt"), 및 평균 혈소판 용적("mpv")으로 평가한 바와 같이, 안전한 것으로 밝혀졌다. 중요하게도, 항-마우스 Sirp1α VHH/사람 IFN Q124R 키메라 및 PBS는 이러한 매개변수에서 거의 차이가 없음을 나타낸다. 야생형 인터페론은 생체내에서 잘 견디지 못하는 것으로 알려져 있다.
실시예 3. SIRP1α 이-특이적인 키메라
항-마우스 Sirp1α VHH/항-마우스 PD-L1 VHH/사람 IFN Q124R 이-특이적인 키메라를 연구하였다. 구체적으로, FACS 분석을 수행하여 마우스 PD-L1 양성 B16 세포주에서 STAT1 포스포릴화를 정량화하였다.
B16 세포를 Sirp1α 이특이적인 키메라로 15분 동안 37℃에서 10% FBS로 보충된 DMEM 배지 속에서 자극시켰다. 자극 후, 세포를 1 용적의 고정 완충액(Fix Buffer) I(BD Biosciences)으로 10분 동안 37℃에서 가함으로써 고정시키고, 2 용적의 Perm III 완충액 I(BD Biosciences) 속에 30분 동안 빙상에서 재현탁함으로써 투과시켰다. 샘플을 항-STAT1 pY701 항체(BD Biosciences)로 20분 동안 4℃에서 염색하고 FACSCalibur(BD Biosciences) 및 CellQuest Pro Version 4.0.2 소프트웨어(BD Biosciences)로 분석하였다.
도 3에 나타낸 바와 같이, B16 세포를 100 ng/ml의 항-마우스 Sirp1α VHH/ 항-마우스 PD-L1 VHH/사람 IFN Q124R 이-특이적인 키메라, 및 BcII10 VHH-사람 Q124R IFN의 키메라로 자극시키거나 자극시키지 않고 15분 동안 37℃에 두었다. 고정 및 투과시킨 후, 세포를 포스포 STAT1에 대해 염색하고 FACS 속에서 분석하였다. 데이타는 PD-L1 표적화가 표적화되지 않은 (BcII10 VHH) 키메라와 비교하는 경우 이특이적인 키메라에 의해 STAT1 포스포릴화를 유의적으로 증가시켰음을 나타낸다.
실시예 4: SIRP1α 이-특이적인 키메라
본 실시예에서, 돌연변이된 사람 IFN알파2(IFNα2) 및, 사람 SIRP1α을 표적화하는 재조합 중쇄 만의 항체(VHH)를 포함하는 키메라 단백질을 작제하고 특성화한다.
상기 키메라 단백질을 FACS 속에서 CD20-양성 및 CD20-음성 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 속에서 STAT1 포스포릴화로 실험한다.
키메라 단백질의 생성, 생산, 및 정제
돌연변이된 IFNα2를 기반으로 한 키메라 단백질을 생성하기 위해, 야생형 사람 IFNα2를 암호화하는 핵산 서열을 굴곡성 20*Gly-Gly-Ser 굴곡성 링커를 통해사람 SIRP1α를 표적화하는 VHH 서열에 융합시킨다. 수득되는 핵산 작제물 속의 야생형 사람 IFNα2를 다음의 돌연변이들 중 하나로 돌연변이시킨다: R33A, R144A, R144S, R144T, R144Y, R144L, R144I, A145G, A145H, A145Y, A145K, A145D, M148A, R149A, 및 L153A. 사람 SIRP1α를 표적화하는 VHH에 융합된 야생형 IFNα2 또는 야생형 IFNα2 만을 가진 핵산 작제물을 대조군으로서 사용한다.
상기 개시된 핵산 작제물을 세균 발현을 위해 pHEN6C 벡터내로 삽입한다. 단백질 발현을 1 mM IPTG를 사용하여 밤새 유도하고, 세포를 펠렛화하고, 주변세포질 추출물을 TES(0.2 M 트리스 pH 8.0, 0.5 mM EDTA, 0.5 M 슈크로즈) 및 TES/4 완충제를 사용하여 제조한다. 단백질을 TALON 금속 친화성 수지를 사용하여 제조업자의 안내서에 따라 추출물로부터 정제하고 이미다졸을 PD10 컬럼(GE Healthcare)을 사용하여 샘플로부터 제거한다.
PBMC 속에서 STAT1 포스포릴화
건강한 공여자의 연막(buffy coat)으로부터의 PBMC를 Lymphoprep(StemCell technologies)를 사용한 밀도 구배 원심분리를 사용하여 단리한다. 세포를 FACS 완충액(2% FBS, PBS 중 1 mM EDTA)으로 2회 세척하고 항-사람 CD20 FITC(SinoBiologicals)로 20분 동안 4℃에서 염색하였다. 2회 세척 후, 세포를 야생형 IFN1α2, 야생형 IFNα2/SIRP1α 키메라 단백질, 또는 상기 개시된 돌연변이된 IFNα2/SIRP1α 키메라 단백질 중 하나의 일련 희석물로 15분 동안 37℃에서 자극시켰다. 고정(10분, 37℃, 고정 완충제 I; BD Biosciences), 투과화(빙상에서 30분, Perm III 완충제 I; BD Biosciences) 및 세척 후, 세포를 항-STAT1 pY701 Ab(BD Biosciences)로 염색하였다. 샘플을 FACSCalibur(BD Biosciences)로 획득하고 FlowJo Version 10.2 소프트웨어(LLC)로 분석하였다.
결과
CD20 양성 및 CD20 음성 세포는 야생형 사람 IFNα2 단독에 대해 비교가능하게 민감한 것으로 예측된다. 또한 VHH를 표적화하는 SIRP1α에 대한 야생형 사람 IFNα2의 융합이 CD20 음성 세포와 비교하여 CD20 양성 세포에서 STAT1 포스포릴화에 있어서 유의적인 증가, 즉, 임뮤노킨 효과(ImmunoKine effect)를 생성할 것으로 예측된다.
돌연변이된 IFNα2를 가진 키메라 단백질은 CD20 음성 세포에서 경우에 따라, 활성을 거의 가지지 않을 것으로 예측된다. 또한, 돌연변이된 IFNα2를 갖는 키메라 단백질의 활성에 있어서의 손실은 CD20 항원이 PBMC에서 발현되는 경우 크게 회복될 것임이 또한 예측된다.
실시예 5. SIRP1 α 이-특이적인 키메라 생체내 항-종양 효과
생체내 쥐 연구를 B16 모델에서 이러한 실시예의 항-마우스 SIRP1α VHH/돌연변이된 사람 IFNα 키메라 단백질로 수행한다.
20xGGS-링커를 통해 마우스 SIRP1α에 대해 특이적인 VHH를 중화시키는 N-말단에 커플링된 돌연변이된 사람 IFNα2를 포함하는, SIRP1α VHH/돌연변이된 사람 IFNα2 키메라 단백질을 암호화하는 핵산 작제물을 pHen6 벡터내에서 작제한다. 사람 IFNα2내에서의 돌연변이를 R33A, R144A, R144S, R144T, R144Y, R144L, R144I, A145G, A145H, A145Y, A145K, A145D, M148A, R149A, 및 L153A로부터 선택한다. His-태그된 SIRP1α VHH/돌연변이된 사람 IFNα2 키메라 단백질의 대규모 생산을 이. 콜라이에서 수행한다. 세균을 정지 상(0.7 내지 0.8의 OD600)까지 배양시키고 이때 IPTG(BioScientific)를 가하여 LacZ 프로모터를 활성화시킨다. 세포 상층액을 밤새 배양 후 수집한다. 주변세포질 분획 속의 단백질을 슈크로즈 용액을 사용하여 삼투압 쇼크로 방출시키고 코발트 이온으로 로딩된 HiTrap 세파로즈 수지(Clontech, Takara Biotechnology) 상에서 고정된 금속 이온 크로마토그래피(IMAG)로 정제한다. 단백질의 결합 후, 컬럼을 0.5% EMPIGEN(Calbiochem, Millipore), 0.5% CHAPS(Sigma-Aldrich) 및 PBS로 세척한다. 이미다졸(Merck)을 용출을 위해 사용하고 PD-10 겔 여과 컬럼(GE Healthcare)을 사용하여 제거한다. 단백질 농도를 280 nm에서 흡광도를 사용하여 측정하고 순도를 SDS-PAGE를 통해 평가한다. LPS 수준을 리물루스 아메보사이트 라이세이트(Limulus Amebocyte Lysate: LAL) QCL-1000(Lonza)를 사용하여 정량화하였다. 여전히 존재하는 경우, LPS를 내독소 제거 수지(Thermo Scientific)를 사용하여 제거하였다. 모든 생성물의 생물학적 활성을 앞서 기술된 바와 같이(Nat. Comm. 2014;5:3016. doi: 10.1038/ncomms4016) WHO 국제 마우스 IFNa 표준 Ga02-901-511에 대한 마우스 루시퍼라제 리포터 세포주 LL171을 사용한 기능성 검정으로 평가하였다.
마우스를 12/12 시간의 명/암 주기로 온도-조절된 환경에서 병원체가 없는 조건 하에서 유지시키고 사료 및 물을 자유로이 제공하였다. 암컷 C57BL/6J 마우스(Charles River Laboratories, Saint-Germain sur l'Arbresle, 프랑스)를 B16-mCD20 클론의 5.106개의 세포(mCD20에 대한 발현 카세트를 함유하는 플라스미드로 안정하게 형질감염된 B16Bl6 세포)를 8주령에서, 30G 인슐린 주사기를 사용하여, 50μl의 현탁액으로, 약하게 진정시킨 마우스(4% 이소플루란 사용)의 털을 제거한 옆구리에 접종하였다.
종양 치료를 종양 접종 후 7일째에 시작하여, 종양 가장자리에서 피하인, 병소 주위(p.l.)로 제공한다. 마우스(n=5)에게 7, 8, 9, 10, 11, 14, 15 및 16일째에 SIRP1a-키메라 치료를 제공한다. 대조군으로서, 마우스를 100 μl의 PBS(n=4)로 치료한다. 키메라 단백질 치료된 마우스에게 35 μg의 단백질(1.6 mg/kg)에 상응하는, 치료당 5,500 IU에서 제공한다. 마지막 종양 치료 후 1일째에, 혈액을 EDTA-코팅된 마이크로비테 튜브(Sarstedt)로부터 수집하고, Hemavet 950FS(Drew Scientific, 미국 워터스버리 소재) 전혈 계수기 내에서 분석한다. WBC, 림프구, 호중구 및 단핵구는 K/㎕로, rbc는 M/㎕로, 헤모글로빈은 g/dl로 및 헤마토크릿은 %로; 혈소판은 K/㎕로 및 평균 혈소판 용적은 fL로 나타낸다.
실질적인 종양 성장 억제는 PBS 대조군과 비교하여 항-마우스 SIRP1α VHH/돌연변이된 사람 IFNα2 키메라 단백질로 치료한 마우스에서 관찰될 것이다. 또한 SIRP1α VHH/돌연변이된 사람 IFNα 키메라 단백질은 다양한 혈액 세포-기반 매개변수(전혈 세포수("wbc"), 림프구 수("ly"), 호중구 수("ne"), 단핵구 수("mo"), 적혈구 수("rbc"), 헤모글로빈("hb"); 헤마토크릿("hct"), 혈소판("plt"), 및 평균 혈소판 용적("mpv")으로 평가한 바와 같이, 안전한 것으로 밝혀질 것임이 예측된다. 또한, 항-마우스 Sirp1α VHH/돌연변이된 사람 IFN Q124R 키메라 및 PBS는 이러한 매개변수에서 거의 차이가 없음을 나타낼 것임이 추가로 예측된다. 야생형 인터페론은 생체내에서 잘 견디지 못하는 것으로 알려져 있다.
등가물
본 발명은 이의 특수한 구현예와 관련하여 기술하였지만, 추가의 변형 및 이러한 응용은 일반적으로, 본 발명의 원리에 따라서 및 본 발명이 속한 분야내에서 공지되거나 통상적인 실시로서 및 지금까지 제시된 필수적인 특징에 적용될 수 있는 바와 같이 및 첨부된 청구범위의 영역내에 수반되는 바와 같이, 본 개시내용으로부터의 이러한 이탈을 포함하는, 본 발명의 임의의 변화, 용도, 또는 적응을 포함하는 것으로 의도됨이 이해될 것이다.
당해 분야의 숙련가는 본원에 구체적으로 기술된 특정 구현예에 대한 다수의 등가물을, 단지 통상의 실험을 사용하여 인식하게 될 것이거나, 확인할 수 있다. 이러한 등가물은 다음의 청구범위의 영역내에 포함되는 것으로 의도된다.
참고 문헌의 혼입
본원에 참고된 모든 특허 및 공보는 이의 전문이 본원에 참고로 포함된다.
본원에 논의된 공보는 본원의 출원일 이전에 이들의 개시내용에 대해서만 제공된다. 본 발명이 선행 발명에 의해 이러한 공보를 선행하는 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다.
본원에 사용된 바와 같은, 모든 제목은 단순히 조직화를 위한 것이며 어떠한 방식으로도 본 개시내용을 제한함을 의도하지는 않는다. 임의의 개별 단락의 내용은 모든 단락에 동등하게 적용될 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> ORIONIS BIOSCIENCES NV VIB VZW UNIVERSITEIT GENT <120> TARGETED CHIMERIC PROTEINS AND USES THEREOF <130> IPA190918-US <150> US 62/454,993 <151> 2017-02-06 <160> 276 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 504 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 1 Met Glu Pro Ala Gly Pro Ala Pro Gly Arg Leu Gly Pro Leu Leu Cys 1 5 10 15 Leu Leu Leu Ala Ala Ser Cys Ala Trp Ser Gly Val Ala Gly Glu Glu 20 25 30 Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala Ala Gly 35 40 45 Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro Val Gly 50 55 60 Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu Ile Tyr 65 70 75 80 Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser Asp Leu 85 90 95 Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn Ile Thr 100 105 110 Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys Gly Ser 115 120 125 Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser Val 130 135 140 Arg Ala Lys Pro Ser 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Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Arg Ser Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Thr Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 100 105 110 Ser Ser <210> 243 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 243 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Thr Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 244 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 244 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 245 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 245 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 246 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 246 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 247 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 247 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 248 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 248 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 249 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 249 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 250 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 250 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20 <210> 251 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 251 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 <210> 252 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 252 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 30 <210> 253 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 253 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Ser 35 <210> 254 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 254 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 35 40 <210> 255 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 255 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 256 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 256 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 257 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 257 Gly Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 258 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 258 Glu Ala Ala Ala Lys 1 5 <210> 259 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 259 Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys 1 5 10 <210> 260 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 260 Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys 1 5 10 15 <210> 261 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 261 Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala 1 5 10 <210> 262 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 262 Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys 1 5 10 15 Ala <210> 263 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 263 Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys 1 5 10 15 Glu Ala Ala Ala Lys Ala 20 <210> 264 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 264 Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys 1 5 10 15 Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala 20 25 <210> 265 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 265 Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys 1 5 10 15 Glu Ala Ala Ala Lys Ala Leu Glu Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala 20 25 30 Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala 35 40 45 <210> 266 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 266 Pro Ala Pro Ala Pro 1 5 <210> 267 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 267 Lys Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser Glu Gln Leu Ala Gln Phe Arg Ser 1 5 10 15 Leu Asp <210> 268 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 268 Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr 1 5 10 <210> 269 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 269 Gly Ser Ala Gly Ser Ala Ala Gly Ser Gly Glu Phe 1 5 10 <210> 270 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 270 Gly Gly Gly Ser Glu 1 5 <210> 271 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 271 Gly Ser Glu Ser Gly 1 5 <210> 272 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 272 Gly Ser Glu Gly Ser 1 5 <210> 273 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 273 Gly Glu Gly Gly Ser Gly Glu Gly Ser Ser Gly Glu Gly Ser Ser Ser 1 5 10 15 Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu 20 25 30 Gly Gly Ser 35 <210> 274 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 274 Cys Pro Pro Cys 1 <210> 275 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 275 Glu Glu Phe Gly Asn Gln 1 5 <210> 276 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 276 Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln 1 5

Claims (31)

  1. (a) SIRP1α를 인식하여 이에 결합하는 인식 도메인(recognition domain)을 포함하는 표적화 모이어티(targeting moiety); 및
    (b) 야생형 신호전달제(signaling agent)와 비교하여 야생형 신호전달제에 비해 증진된 안전성을 부여하는 하나 이상의 돌연변이를 가진 변형된 신호전달제를 포함하는 키메라 단백질(chimeric protein)로서,
    상기 표적화 모이어티 및 변형된 신호전달제가 하나 이상의 링커(linker)와 임의로 연결되는 키메라 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 하나 이상의 추가의 표적화 모이어티를 추가로 포함하는 키메라 단백질.
  3. 제2항에 있어서, 하나 이상의 추가의 표적화 모이어티가 종양 세포 상에서 항원 또는 수용체를 인식하여 이에 결합하는 키메라 단백질.
  4. 제2항에 있어서, 하나 이상의 추가의 표적화 모이어티가 면역 세포 상의 항원 또는 수용체를 인식하여 이에 결합하는 인식 도메인을 포함하는 키메라 단백질.
  5. 제4항에 있어서, 면역 세포가 대식구, 단핵구, 및 수지 세포로부터 선택되는 키메라 단백질.
  6. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 추가의 표적화 모이어티가 PD-L1, PD-L2, PD-1, 및 Clec9A 중 하나 이상을 인식하는 키메라 단백질.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 인식 도메인이 완전한 길이의 항체, 단일-도메인 항체, 재조합 중쇄 만의 항체(VHH), 단일-쇄 항체(scFv), 상어 중쇄 만의 항체(shark heavy-chain-only antibody: VNAR), 미세단백질(예컨대, 시스테인 노트 단백질(cysteine knot protein), 노틴(knottin)), 다르핀(darpin), 안티칼린, 아드넥틴(adnectin), 앱타머(aptamer); Fv, Fab, Fab', F(ab')2, 펩타이드 모사체 분자(peptide mimetic molecule), 수용체에 대한 천연 리간드, 또는 합성 분자를 포함하는 키메라 단백질.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 인식 도메인이 목적한 항원 또는 수용체를 기능적으로 조절하는 키메라 단백질.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 인식 도메인이 목적한 항원 또는 수용체를 인식하여 이에 결합하지만 이를 기능적으로 조절하지 않는 키메라 단백질.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 신호전달제가 야생형 신호전달제에 비해 신호전달제의 수용체에서 감소된 친화성 또는 활성을 부여하는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 키메라 단백질.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 신호전달제가 야생형 신호전달제에 비해 수용체에 대해 실질적으로 감소되거나 제거된 친화성 또는 활성을 부여하는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 키메라 단백질.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 신호전달제가 (a) 야생형 신호전달제에 비해 수용체에 대해 실질적으로 감소되거나 제거된 친화성을 부여하는 하나 이상의 돌연변이 및 (b) 야생형 신호전달제에 비해 수용체에 대해 감소된 친화성 또는 활성을 부여하는 하나 이상의 돌연변이 둘 모두를 포함하는 키메라 단백질.
  13. 제10항에 있어서, 하나 이상의 돌연변이가 활성의 약화를 허용하는 키메라 단백질.
  14. 제13항에 있어서, 효능 또는 길항 활성이 약화된 키메라 단백질.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 변형된 신호전달제가 이의 활성을 효능성으로부터 길항성으로 전환시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 키메라 단백질.
  16. 제10항에 있어서, 돌연변이가 하나 이상의 표적화 모이어티에 대한 부착에 의해 회복될 수 있는 감소된 친화성 또는 활성을 부여하는 키메라 단백질.
  17. 제11항에 있어서, 돌연변이가 하나 이상의 표적화 모이어티에 대한 부착에 의해 실질적으로 회복될 수 없는 실질적으로 감소되거나 제거된 친화성 또는 활성을 부여하는 키메라 단백질.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 신호전달제가 인터페론, 인터루킨, 및 종양 괴사 인자 중 하나 이상으로부터 선택되는 키메라 단백질.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 신호전달제가 인터페론인 키메라 단백질.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 단백질이 암, 감염, 면역 장애, 자가면역 질환, 심혈관 질환, 상처, 허혈-관련 질환, 신경변성 질환, 및/또는 물질대사 질환 중 하나 이상을 가진 환자에서 사용하기에 적합한 키메라 단백질.
  21. (a) SIRP1α를 인식하여 이에 결합하는 인식 도메인을 포함하는 제1의 표적화 모이어티;
    (b) PD-1을 인식하여 이에 결합하는 인식 도메인을 포함하는 제2의 표적화 모이어티; 및
    (b) L153A, R149A, M148A, R144X1, A145X2, R33A로부터 임의로 선택된, 야생형 신호전달제와 비교하여 신호전달제의 수용체에서 감소된 친화성 또는 활성을 부여하는 하나 이상의 돌연변이를 갖는 사람 인터페론 알파 2를 포함하고, 여기서
    X1은 A, S, T, Y, L, 및 I로부터 선택되며,
    X2는 G, H, Y, K, 및 D로부터 선택되고,
    여기서 표적화 모이어티 및 변형된 신호전달제는 하나 이상의 링커와 임의로 연결되는 키메라 단백질.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 키메라 단백질을 암호화하는 재조합 핵산 조성물.
  23. 제22항에 따른 핵산을 포함하는 숙주 세포.
  24. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 키메라 단백질의 유효량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여함을 포함하는, 암의 치료 방법.
  25. 제24항에 있어서, 암이, 기저 세포 암종, 담즙관 암; 방광암; 골암; 뇌 및 중추 신경계 암; 유방암; 복막의 암; 경부암; 융모막암; 결장 및 직장암; 연결 조직암; 소화계의 암; 자궁내막 암; 식도암; 눈암(eye cancer); 두경부의 암; 위암(위장 암 포함); 교아세포종; 간 암종; 간세포암; 상피내 신생물; 신장 또는 신 암; 후두암; 백혈병; 간암; 폐암(예컨대, 소-세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암종, 및 폐의 편평 암종); 흑색종; 골수종; 신경아세포종; 구강암(입술, 혀, 입, 및 인두); 난소암; 췌장암; 전립샘암; 망막모세포종; 횡문근육종; 직장암; 호흡계의 암; 타액선 암종; 육종; 피부암; 편평 세포암; 위암; 고환 암; 갑상선 암; 자궁 또는 자궁내막 암; 비뇨계의 암; 음문암; 호지킨 림프종(Hodgkin lymphoma) 및 비-호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma)을 포함하는 림프종 뿐만 아니라, B-세포 림프종(저 등급/여포성 비-호지킨 림프종(NHL); 소 림프구성(SL) NHL; 중간 등급/여포성 NHL; 중간 등급의 확산성 NHL; 고 등급의 면역아세포성 NHL; 고 등급의 림프아구성 NHL; 고 등급의 작은 비-절단된 세포(high grade small non-cleaved cell) NHL; 벌키 질환(bulky disease) NHL; 외투 세포 림프종(mantle cell lymphoma); AIDS-관련 림프종; 및 발덴스트롬 거대글로불린혈증(Waldenstrom's Macroglobulinemia); 만성 림프성 백혈병(CLL); 급성 림프모구성 백혈병(ALL); 모발 세포 백혈병; 만성 골수아구성 백혈병; 뿐만 아니라 다른 암종 및 육종; 및 이식 후 림프구증식성 장애(PTLD) 뿐만 아니라, 모반증과 관련된 비정상적인 혈관 증식, 부종(예컨대, 뇌 종양과 관련된 것), 및 메이그 증후군(Meigs' syndrome) 중 하나 이상으로부터 선택되는 방법.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 암이 Myc 단백질을 과발현하는 방법.
  27. 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 대식구에 의한 암 세포의 식세포작용을 유도하고/하거나 향상시키는 방법.
  28. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 의약으로서 사용하기 위한 키메라 단백질.
  29. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 암의 치료에 사용하기 위한 키메라 단백질.
  30. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 간염 치료시 사용하기 위한 키메라 단백질.
  31. 의약의 제조시의, 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 키메라 단백질의 용도.
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