KR20190096411A - 항-pcsk9 항체 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 프로단백질 전환 효소 서브틸리신/켁신 유형 9(PCSK9)에 특이적으로 결합하는 항체, 상기 항체의 항원-결합 단편, 및 상기 항체 또는 단편을 포함하는 조성물을 제공한다. 또한, 상기 항체 또는 단편을 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 함유하는 숙주 세포, 및 치료 및 진단에서 상기 항체 및 항체 단편의 적용을 제공한다.

Description

항-PCSK9 항체 및 이의 용도
본 발명은 프로단백질 전환 효소 서브틸리신/켁신 유형 9(이하 PCSK9로서 지칭함)에 특이적으로 결합하는 신규한 항체 및 항체 단편 및 상기 항체 또는 항체 단편을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 상기 항체 또는 항체 단편을 코딩(encoding)하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 숙주 세포, 및 관련 용도에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 상기 항체 및 항체 단편의 치료적 및 진단적 용도에 관한 것이다.
혈청 콜레스테롤 수준의 상승은 심혈관 사상을 유도하는 중요한 위험 인자이다. 현재, 콜레스테롤-저하 요법의 기초는 스타틴이고, 이는 아테롬성동맥경화성 심혈관 질환의 일차 및 이차 예방에서 중요한 역할을 담당한다. 그러나, 현재의 지질-저하 요법은 임상적 니즈를 만족시키지 못한다.
스타틴은 심혈관 질환으로부터 기인하는 사망을 감소시킬 수 있지만, 스타틴 요법에는 일정한 제한이 있다. 먼저, 스타틴은 저밀도 지단백질 콜레스테롤(LDL-C)의 수준을 최대 40 내지 55%까지 저하시킬 수 있고, 스타틴의 용량을 배로 하는 것은 추가로 LDL-C의 수준을 약 6%까지 저하시킬 수 있을 뿐이다.
다수의 샘플을 사용한 연구는 스타틴/조합물이 LDL-C의 치료 목적을 달성하지 못하는 것을 나타내고 있다. L-TAP 2(지질 치료 평가 프로젝트 2)의 연구에서, 미국, 유럽 및 아시아의 9개 국가로부터 고지혈증을 갖는 9955명의 환자는 안정한 지질-저하 요법을 제공받았다(이들중 75%는 스타틴 요법을 제공받았다). LDL-C에 의해 정상 상태로 저하되는 전체 비율은 47 내지 84%이다[참조: Waters DD et al, Lipid Treatment Assessment Project (L-TAP) 2: a multinational survey to evaluate the proportion of patients achieving Low Density Lipoprotein cholesterol goals. Circulation. 120(1): 28-34, 2009]. 복수 스타틴의 종합적 임상 분석에서, 스타틴은 일차 및 이차 예방으로서 심혈관 질환을 감소시키는 역할을 갖지만, 특히 고위험 그룹에서 전체적으로 사상의 1/3만이 감소되고, 이중 27%의 사상만이 감소된다[참조: Libby P., The forgotten majority: unfinished business in cardiovascular risk reduction. Journal of the American College of Cardiology. 46(7):1225-1228, 2005].
현재, 상이한 메카니즘을 통해 다양한 콜레스테롤-저하 약물이 시판되고 있거나 조사중에 있고, 그 중에서도, PCSK9에 대한 항체는 이들의 우수한 안전성 및 유효성으로 인해 광범위하게 관심을 받고 있다.
PCSK9는 프로단백질 전환효소의 패밀리에 속하는 세린 프로테아제이다. 설치류 및 인간에서, PCSK9는 주로 간에서, 두번째로는 소장 및 신장에서 발현된다. 먼저, 72kDa PCSK9 전구체 단백질은 조면 소포체에서 합성된다. 전구체 단백질은 30개 아미노산 N-말단 신호 펩티드, 리더 펩티드(31-152), 촉매 영역(153-425) 및 C-말단 시스테인/히스티딘-풍부 도메인(CHRD)(426-692)을 포함한다[참조: Duff CJ., et al., Antibody-mediated disruption of the interaction between PCSK-9 and the Low Density Lipoprotein receptor. The Biochemical Journal. 419(3):577-584, 2009; Lambert G., et al., Molecular basis of PCSK-9 function. Atherosclerosis. 203(1):1-7, 2009]. 위치 Gln152 상에서 자가촉매시킨 후, 전구체 단백질은 14kDa 리더 펩티드 단편 및 63kDa 성숙 기능성 단백질(촉매 구조 및 C-말단 도메인을 포함)으로 절단되고, 이는 비-공유적으로 강력하게 결합하여 복합체를 형성한다. 리더 펩티드는 성숙 단백질의 분자 샤페론으로 작용하고, 그 후 복합체는 소포체를 떠나 골지체에 도달하고, 골지체에서 티로신 설페이트화, 아세틸화 및 일련의 번역후 변형을 통해 세포로부터 혈액 순환으로 분비된다.
분비 PCSK9는 주로 간세포의 원형질 막의 표면 상에서 저밀도 지단백질 수용체(LDLR)의 분해를 매개한다. PCSK9의 촉매 영역은, LDLR 구조에서 상피 성장 인자-유사 반복 상동성 도메인-A(EGF-A)에 결합하고 LDLR/PCSK9 복합체를 형성할 수 있는 LDLR-결합 부위를 포함하고, 이는 이어서 클라트린으로 코팅 후에 간세포로 흡수된다. 간세포의 엔도좀에서, LDLR과 PCSK9 사이의 상호작용은 산성 환경, 즉 감소된 pH 값에 기인하여 보다 안정한 복합체를 형성하도록 증강되고, 이에 의해 LDLR의 형태 변화를 저해하고 LDLR의 해리 및 재순환을 방지하고 단백질분해틀 통해 분해되는 리소좀으로 LDLR/PCSK9 복합체의 수송을 촉진한다[참조: Lambert G., et al., Molecular basis of PCSK9 function. Atherosclerosis. 203(1):1-7, 2009; George M, et al., Looking into the crystal ball-upcoming drugs for dyslipidemia. Journal of Cardiovascular Pharmacology and Therapeutics. 20(1):11-20, 2016]. PCSK9는 저밀도 지단백질 콜레스테롤(LDL-C)의 클리어런스 경로를 방해함으로써 생체내에서 작용한다. LDL-C가 LDLR에 결합하여 흡수된 후, 결합된 PCSK9는 LDLR이 LDLR/LDL-C 복합체로부터 박리하는 것을 방지하고, 분해되는 리소좀으로 복합체를 수송하여 LDLR이 간세포의 표면으로 재순환될 수 없고, 이에 의해 간세포의 표면 상에서 LDLR의 양을 감소시킨다[참조: Lambert G., et al., Molecular basis of PCSK-9 function. Atherosclerosis. 203(1): 1-7, 2009]. 추가로, 골지체 중의 미성숙 PCSK9는 또한 세포내 LDLR에 직접 결합하여 분해되는 리소좀으로 들어갈 수 있고, 이는 LDLR이 간세포의 표면 상에서 발현되는 것을 방지한다[참조: Lambert G., et al., Molecular basis of PCSK-9 function. Atherosclerosis. 203 (1): 1-7, 2009; Zhang Y., et al., Dysregulation of the Low Density Lipoprotein receptor pathway is involved in lipid disorder-mediated organ injury. International Journal of Biological Sciences. 12(5): 569-579, 2016]. 따라서, PCSK9는 세포 표면 및 세포내 경로를 통해 LDLR에 대해 직접 작용하고 간세포의 표면 상에서 LDLR의 발현을 감소시키고 간세포에 의한 LDL-C 재흡수를 저하시키고 감소된 LDL-C 클리어런스 및 순환 중의 지속적으로 증가된 LDL-C 수준을 야기할 수 있다. PCSK9의 저해는 LDLR에 대한 혈장 PCSK9의 결합을 차단할 수 있고, 이에 의해 LDLR의 흡수 및 분해를 방지하고, 세포 표면 상에서 LDLR 발현의 수준 및 양을 증가시키고 LDLR에 의한 LDL-C 재흡수를 증가시키고, 궁극적으로 순환 중의 LDL-C 수준을 감소시켜, 혈액 지방을 저하시키는 직접 효과를 달성할 수 있다.
PCSK9는, 초저밀도 지단백질 수용체(VLDLR), 아포지단백질 E 수용체 2(apoER2) 및 LDLR-관련 단백질1(LDLR)을 포함하는, LDLR 패밀리의 다른 구성원의 분해를 촉진시킨다[참조: Lambert G., et al., Molecular basis of PCSK-9 function. Atherosclerosis. 203(1): 1-7, 2009]. PCSK9는 VLDLR 및 apoER2의 EGF-A 도메인에 결합하지만, 분해 경로는 상이하고, 이러한 분해의 생리학적 의의는 이제까지 밝혀지지 않았다[참조: Burke AC., et al. PCSK-9: regulation and target for drug Development for dyslipidemia. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 13(3), 2016]. 또한, 최근의 연구는, 순환 중의 콜레스테롤의 항상성을 유지하는 것에 추가하여, 스캐빈저 수용체 CD36이 또한 PCSK9와 상호작용할 수 있는 것으로 밝혀졌고, 이는 PCSK9가 트리글리세라이드의 대사에 역할을 담당할 수 있음을 시사한다[참조: Burke AC., et al. PCSK-9: regulation and Target for drug development for dyslipidemia. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 13(3), 2016]. 요약하면, PCSK9는 생체내에서 지질 사이클 및 대사와 밀접하게 관련되어 있다.
인간 유전학에 대한 연구는 LDL-C의 수준 및 관상 심장 질환의 발생율의 조절에서 PCSK9의 역할을 뒷받침하는 강력한 증거를 제공한다. 인간에 대한 연구는 PCSK9 유전자에서 기능 획득형 돌연변이가 LDL-C의 상승된 혈청 수준과 연관되고 조기 관상동맥 심장 질환과 연관되어 있는 반면[참조: Abifadel M., et al., Mutations in PCSK-9 cause autosomal dominant hypercholesterolemia. Nature Genetics. 34(2):154-156, 2003], 기능 상실형 돌연변이는 LDL-C의 보다 낮은 혈청 수준과 연관되어 있음을 확인했다[참조: Cohen JC., et al, Sequence variations in PCSK-9, low LDL, and protection against coronary heart disease. New England Journal of Medicine 54(12): 1264-1272, 2006]. 15년간의 전향적 코호트 연구(ARIC 연구)에서, PCSK9 넌센스 돌연변이를 갖는 사람은 유의적으로 감소된 수준의 LDK-C 및 관상동맥성 심장 질환의 위험성을 나타냈다[참조: Cohen JC., et al., Sequence variations in PCSK-9, low LDL, and protection against coronary heart disease. New England Journal of Medicine. 54(12): 1264-1272, 2006]. 이 연구는 3,363명 흑인 대상체를 포함했고, 이의 2.6%는 PCSK9142X 또는 PCSK9679X 넌센스 돌연변이를 포함했다. LDL-C의 수준은 28% 감소했고, 관상동맥성 심장 질환의 위험성은, 돌연변이를 갖지 않는 대상체와 비교하여, 88% 감소했다[참조: Cohen JC., et al., Sequence variations in PCSK-9, low LDL, and protection against coronary heart disease. New England Journal of Medicine. 54(12): 1264-1272, 2006]. 이 연구는 9,524명 백인 대상체를 포함했고, 이의 3.2%는 PCSK946L 넌센스 돌연변이를 포함했다. LDL-C의 수준은 15% 감소했고, 관상동맥성 심장 질환의 위험은 47% 감소했다[참조: Cohen JC., et al., Sequence variations in PCSK-9, low LDL, and protection against coronary heart disease. New England Journal of Medicine. 54(12): 1264-1272, 2006]. 또한, PCSK9를 포함하는 여성에서, 복합 헤테로접합체 불활성화 돌연변이, PCSK9는 혈장에서 검출할 수 없고, LDL-C의 혈청 수준은 극히 낮았지만(14mg/dl), 전체적 건강 상태는 양호했고, 그녀는 다산이었다[참조: Zhao Z., et al., Molecular characterization of loss of function mutations in PCSK-9 and identification of a compound heterozygote. American Journal of Human Genetics. 79(3): 514-523, 2006.].
생체내 동물 실험은 추가로 PCSK9의 작용을 뒷받침하는 메카니즘을 밝혀냈다. 마우스에서 PCSK9의 상승된 혈청 수준은 간세포에서 LDLR 단백질의 감소 및 전체 콜레스테롤의 혈청 수준의 증가를 야기했다[참조: Lagace TA., et al, Secreted PCSK-9 decreases the number of LDL receptors in hepatocytes and in livers of parabiotic mice. Journal of Clinical Investigation 116(11): 2995-3005, 2006]. 대조적으로, PCSK9 녹아웃 마우스는 간세포에서 LDLR 단백질 수준의 상승을 나타냈고(반면, LDLR 메신저 RNA의 수준은 변화하지 않았다), 전체 콜레스테롤의 상응하는 혈청 수준은 대략 50% 감소했다[참조: Rashid S., et al., Decreased plasma cholesterol and hypersensitivity to statin in mice lacking PCSK-9. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102(15): 5374-5379, 2005].
따라서, PCSK9가 저밀도 지단백질(LDL)의 조절에 역할을 담당하는 것을 나타내는 실질적 증거가 있고; PCSK9의 발현 또는 상향조절은 LDL 콜레스테롤의 증가된 혈장 수준과 연관되고; PCSK9 발현의 억제 또는 결핍은 LDL 콜레스테롤의 감소된 혈장 수준과 연관되고; LDL 콜레스테롤 수준의 저하는 PCSK9 서열의 변화와 연관되고; 이는 관상동맥성 심장 질환에 대한 방어를 부여하는 것으로 밝혀졌다[참조: Cohen, 2006 N. Engl. J. Med. 354: 1264-1272].
임상 실험에서, LDL 콜레스테롤 수준의 감소는 관상동맥 사상의 등급과 직접 관련되는 것으로 밝혀졌다[참조: Law et al., 2003 BMJ 326: 1423-1427]. 또한, LDL 콜레스테롤의 혈장 수준에서 중등도 수명 감소가 관상동맥 사상의 발생율의 실질적 감소와 연관되어 있는 것으로 밝혀졌다[참조: Cohen, 2006 N. Engl. J. Med. 354: 1264-1272]. 또한, 비-지질-관련 심혈관 위험 인자의 높은 유병률을 갖는 모집단에서도 동일하다. 따라서, LDL 콜레스테롤 수준의 관리 및 제어는 큰 이점을 갖는다.
이러한 이유로, 콜레스테롤 수준을 조절하고 PCSK9의 활성을 차단 또는 억제 또는 중화시키기 위해 사용될 수 있는 기타 분자의 동정은 거대한 이점을 가질 것이다. LDL-C의 혈장 수준의 저하에 대한 PCSK9 항체 및 이들의 효과는 당해 기술분야에 공지되어 있다. 이러한 PCSK9 항체 및 이의 용도는, 예를 들면, US2009/0246192, US2009/0142352, US2010/0166768 및 WO 2010/029513에 개시되어 있다.
지금까지, 공지된 PCSK9 모노클로날 항체(monoclonal antibody) 알리로쿠맵(Alirocumab)(Sanofi/Regeneron의 제품, 상품명 PRALUENT) 및 에볼로쿠맵(Evolocumab)(Amgen의 제품, 상품명 REPATHA)은 일차 고콜레스테롤혈증의 다양한 유형에서 현저한 유효성을 나타냈고, 스타틴에 의해 불충분하게 조절된 고콜레스테롤혈증에서 및 가족성 고콜레스테롤혈증(각각 HeFH 및 HoFH로 지칭되는, 헤테로접합성 및 호모접합성 가족성 고콜레스테롤혈증 포함)에서의 사용을 위해, 및 관상동맥 아테롬성동맥경화성 심장 질환을 갖는 환자에서의 사용을 위해 미국에서 2015년에 FDA에 의해 승인되었다.
대체 PCSK9 항체가 여전히 요구되고 있다. 특히, 양호한 안정성을 가진 신뢰할 만한 세포주로부터 유래하는 PCSK9와의 높은 친화성을 갖고 높은 유효성으로 LDL-C의 수준을 감소시킬 수 있는 PCSK9 항체가 여전히 요구되고 있다. 여전히 보다 특히, 높은 유효성으로 LDL-C의 수준을 감소시킬 수 있고 지속된 계속적 기간(예를 들면, LDL-C 수준의 지속적 저해)을 제공할 수 있는 대체 PCSK9 항체가 요구되고 있다. 이러한 항체는 또한 바람직하게는 개발, 제조 또는 제형화에 유리한 양호한 물리화학적 성질을 가질 것이다.
본 발명은 적어도 부분적으로 PCSK9에 대해 지시된 다양한 항체에 기반한다. PCSK9는 중요한 및 유리한 치료적 표적으로 제시되어 있다. 그리고, 본 발명은 PCSK9의 발현 및/또는 활성과 연관된 병리학적 상태의 치료 및 진단을 위한 항체를 제공한다. 따라서, 본 발명은 항-PCSK9 항체, 조성물, 키트, 방법, 및 항-PCSK9 항체와 관련된 용도를 제공한다.
일부 실시형태에서, PCSK9 또는 이의 단편(바람직하게는 인간 PCSK9 단백질)에 결합하는 항-PCSK9 항체 또는 항체 단편(바람직하게는 항원-결합 단편)을 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항-PCSK9 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역(HCVR)을 포함하고, 여기서 상기 HCVR는 상보성 결정 영역(CDR) HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, HCDR1은 서열번호 1, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 및 20으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성(identity) 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, HCDR2는 서열번호 2, 14, 15, 16, 17 및 21로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, HCDR3은 서열번호 3, 18, 19 및 22로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항-PCSK9 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 경쇄 가변 영역(LCVR)을 포함하고, 여기서 상기 LCVR은 상보성 결정 영역(CDR) LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고, LCDR1은 서열번호 4의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, LCDR2는 서열번호 5의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, LCDR3은 서열번호 6의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항-PCSK9 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역(HCVR) 및 경쇄 가변 영역(LCVR)을 포함하고, 여기서 상기 HCVR은 상보성 결정 영역(CDR) HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, 상기 LCVR은 CDR LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고, HCDR1은 서열번호 1, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 및 20으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, HCDR2는 서열번호 2, 14, 15, 16, 17 및 21로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, HCDR3은 서열번호 3, 18, 19 및 22로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고; LCDR1은 서열번호 4의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, LCDR2는 서열번호 5의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, LCDR3은 서열번호 6의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항-PCSK9 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역(HCVR)을 포함하고, 여기서 상기 HCVR은 상보성 결정 영역(CDR) HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, HCDR1은 서열번호 1, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 및 20으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, HCDR2는 서열번호 2, 14, 15, 16, 17 및 21로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, HCDR3은 서열번호 3, 18, 19 및 22로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항-PCSK9 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 경쇄 가변 영역(LCVR)을 포함하고, 여기서 상기 LCVR은 상보성 결정 영역(CDR) LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고, LCDR1은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, LCDR2는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, LCDR3은 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항-PCSK9 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역(HCVR) 및 경쇄 가변 영역(LCVR)을 포함하고, 여기서 상기 HCVR은 상보성 결정 영역(CDR) HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, 상기 LCVR은 CDR LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고, HCDR1은 서열번호 1, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 및 20으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, HCDR2는 서열번호 2, 14, 15, 16, 17 및 21로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, HCDR3은 서열번호 3, 18, 19 및 22로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고; LCDR1은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, LCDR2는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, LCDR3은 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다.
바람직한 실시형태에서, 본원에 제공된 항-PCSK9 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역(HCVR) 및 경쇄 가변 영역(LCVR)을 포함하고, 여기서 상기 HCVR은 상보성 결정 영역(CDR) HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, 상기 LCVR은 CDR LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고, HCDR1은 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, HCDR2는 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, HCDR3은 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고; LCDR1은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, LCDR2는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, LCDR3은 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다.
바람직한 실시형태에서, 본원에 제공된 항-PCSK9 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역(HCVR) 및 경쇄 가변 영역(LCVR)을 포함하고, 여기서 상기 HCVR은 상보성 결정 영역(CDR) HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, 상기 LCVR은 CDR LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고, HCDR1은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, HCDR2는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, HCDR3은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고; LCDR1은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, LCDR2는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, LCDR3은 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다.
바람직한 실시형태에서, 본원에 제공된 항-PCSK9 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역(HCVR) 및 경쇄 가변 영역(LCVR)을 포함하고, 여기서 상기 HCVR은 상보성 결정 영역(CDR) HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, 상기 LCVR은 CDR LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고, HCDR1은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, HCDR2는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, HCDR3은 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고; LCDR1은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, LCDR2는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, LCDR3은 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다.
바람직한 실시형태에서, 본원에 제공된 항-PCSK9 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역(HCVR) 및 경쇄 가변 영역(LCVR)을 포함하고, 여기서 상기 HCVR은 상보성 결정 영역(CDR) HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, 상기 LCVR은 CDR LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고, HCDR1은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, HCDR2는 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, HCDR3은 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고; LCDR1은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, LCDR2는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, LCDR3은 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다.
바람직한 실시형태에서, 본원에 제공된 항-PCSK9 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역(HCVR) 및 경쇄 가변 영역(LCVR)을 포함하고, 여기서 상기 HCVR은 상보성 결정 영역(CDR) HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, 상기 LCVR은 CDR LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고, HCDR1은 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, HCDR2는 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, HCDR3은 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고; LCDR1은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, LCDR2는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, LCDR3은 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다.
바람직한 실시형태에서, 본원에 제공된 항-PCSK9 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역(HCVR) 및 경쇄 가변 영역(LCVR)을 포함하고, 여기서 상기 HCVR은 상보성 결정 영역(CDR) HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, 상기 LCVR은 CDR LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고, HCDR1은 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, HCDR2는 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, HCDR3은 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고; LCDR1은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, LCDR2는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, LCDR3은 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다.
바람직한 실시형태에서, 본원에 제공된 항-PCSK9 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역(HCVR) 및 경쇄 가변 영역(LCVR)을 포함하고, 여기서 상기 HCVR은 상보성 결정 영역(CDR) HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, 상기 LCVR은 CDR LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고, HCDR1은 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, HCDR2는 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, HCDR3은 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고; LCDR1은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, LCDR2는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, LCDR3은 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다.
바람직한 실시형태에서, 본원에 제공된 항-PCSK9 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역(HCVR) 및 경쇄 가변 영역(LCVR)을 포함하고, 여기서 상기 HCVR은 상보성 결정 영역(CDR) HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, 상기 LCVR은 CDR LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고, HCDR1은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, HCDR2는 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, HCDR3은 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고; LCDR1은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, LCDR2는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, LCDR3은 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다.
바람직한 실시형태에서, 본원에 제공된 항-PCSK9 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역(HCVR) 및 경쇄 가변 영역(LCVR)을 포함하고, 여기서 상기 HCVR은 상보성 결정 영역(CDR) HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, 상기 LCVR은 CDR LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고, HCDR1은 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, HCDR2는 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, HCDR3은 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고; LCDR1은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, LCDR2는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, LCDR3은 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다.
바람직한 실시형태에서, 본원에 제공된 항-PCSK9 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역(HCVR) 및 경쇄 가변 영역(LCVR)을 포함하고, 여기서 상기 HCVR은 상보성 결정 영역(CDR) HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, 상기 LCVR은 CDR LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고, HCDR1은 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, HCDR2는 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, HCDR3은 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고; LCDR1은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, LCDR2는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, LCDR3은 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다.
바람직한 실시형태에서, 본원에 제공된 항-PCSK9 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역(HCVR) 및 경쇄 가변 영역(LCVR)을 포함하고, 여기서 상기 HCVR은 상보성 결정 영역(CDR) HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, 상기 LCVR은 CDR LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고, HCDR1은 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, HCDR2는 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, HCDR3은 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고; LCDR1은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, LCDR2는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, LCDR3은 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항-PCSK9 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역 HCVR을 포함하고, 이는 서열번호 23, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 및 33으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항-PCSK9 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 경쇄 가변 영역 LCVR을 포함하고, 이는 서열번호 24의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항-PCSK9 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역(HCVR) 및 경쇄 가변 영역(LCVR)을 포함하고, 여기서 상기 중쇄 가변 영역 HCVR은 서열번호 23, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 및 33으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고; 상기 경쇄 가변 영역 LCVR은 서열번호 24의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항-PCSK9 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역 HCVR을 포함하고, 이는 서열번호 23, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 및 33으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항-PCSK9 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 경쇄 가변 영역 LCVR을 포함하고, 이는 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항-PCSK9 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역(HCVR) 및 경쇄 가변 영역(LCVR)을 포함하고, 여기서 상기 중쇄 가변 영역 HCVR은 서열번호 23, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 및 33으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고; 상기 경쇄 가변 영역 LCVR은 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다.
바람직한 실시형태에서, 본원에 제공된 항-PCSK9 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역(HCVR) 및 경쇄 가변 영역(LCVR)을 포함하고, 여기서 상기 중쇄 가변 영역 HCVR은 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고; 상기 경쇄 가변 영역 LCVR은 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다.
바람직한 실시형태에서, 본원에 제공된 항-PCSK9 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역(HCVR) 및 경쇄 가변 영역(LCVR)을 포함하고, 여기서 상기 중쇄 가변 영역 HCVR은 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고; 상기 경쇄 가변 영역 LCVR은 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다.
바람직한 실시형태에서, 본원에 제공된 항-PCSK9 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역(HCVR) 및 경쇄 가변 영역(LCVR)을 포함하고, 여기서 상기 중쇄 가변 영역 HCVR은 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고; 상기 경쇄 가변 영역 LCVR은 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다.
바람직한 실시형태에서, 본원에 제공된 항-PCSK9 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역(HCVR) 및 경쇄 가변 영역(LCVR)을 포함하고, 여기서 상기 중쇄 가변 영역 HCVR은 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고; 상기 경쇄 가변 영역 LCVR은 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다.
바람직한 실시형태에서, 본원에 제공된 항-PCSK9 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역(HCVR) 및 경쇄 가변 영역(LCVR)을 포함하고, 여기서 상기 중쇄 가변 영역 HCVR은 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고; 상기 경쇄 가변 영역 LCVR은 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다.
바람직한 실시형태에서, 본원에 제공된 항-PCSK9 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역(HCVR) 및 경쇄 가변 영역(LCVR)을 포함하고, 여기서 상기 중쇄 가변 영역 HCVR은 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고; 상기 경쇄 가변 영역 LCVR은 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다.
바람직한 실시형태에서, 본원에 제공된 항-PCSK9 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역(HCVR) 및 경쇄 가변 영역(LCVR)을 포함하고, 여기서 상기 중쇄 가변 영역 HCVR은 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고; 상기 경쇄 가변 영역 LCVR은 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다.
바람직한 실시형태에서, 본원에 제공된 항-PCSK9 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역(HCVR) 및 경쇄 가변 영역(LCVR)을 포함하고, 여기서 상기 중쇄 가변 영역 HCVR은 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고; 상기 경쇄 가변 영역 LCVR은 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다.
바람직한 실시형태에서, 본원에 제공된 항-PCSK9 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역(HCVR) 및 경쇄 가변 영역(LCVR)을 포함하고, 여기서 상기 중쇄 가변 영역 HCVR은 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고; 상기 경쇄 가변 영역 LCVR은 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다.
바람직한 실시형태에서, 본원에 제공된 항-PCSK9 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역(HCVR) 및 경쇄 가변 영역(LCVR)을 포함하고, 여기서 상기 중쇄 가변 영역 HCVR은 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고; 상기 경쇄 가변 영역 LCVR은 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항-PCSK9 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄를 포함하고, 여기서 상기 중쇄는 서열번호 34, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 및 44로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항-PCSK9 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 경쇄를 포함하고, 여기서 상기 경쇄는 서열번호 35의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항-PCSK9 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 여기서 상기 중쇄는 서열번호 34, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 및 44로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고; 상기 경쇄는 서열번호 35의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항-PCSK9 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄를 포함하고, 여기서 상기 중쇄는 서열번호 34, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 및 44로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항-PCSK9 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 경쇄를 포함하고, 여기서 상기 경쇄는 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항-PCSK9 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 여기서 상기 중쇄는 서열번호 34, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 및 44로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고; 상기 경쇄는 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다.
바람직한 실시형태에서, 본원에 제공된 항-PCSK9 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 여기서 상기 중쇄는 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고; 상기 경쇄는 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다.
바람직한 실시형태에서, 본원에 제공된 항-PCSK9 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 여기서 상기 중쇄는 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고; 상기 경쇄는 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다.
바람직한 실시형태에서, 본원에 제공된 항-PCSK9 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 여기서 상기 중쇄는 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고; 상기 경쇄는 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다.
바람직한 실시형태에서, 본원에 제공된 항-PCSK9 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 여기서 상기 중쇄는 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고; 상기 경쇄는 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다.
바람직한 실시형태에서, 본원에 제공된 항-PCSK9 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 여기서 상기 중쇄는 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고; 상기 경쇄는 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다.
바람직한 실시형태에서, 본원에 제공된 항-PCSK9 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 여기서 상기 중쇄는 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고; 상기 경쇄는 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다.
바람직한 실시형태에서, 본원에 제공된 항-PCSK9 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 여기서 상기 중쇄는 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고; 상기 경쇄는 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다.
바람직한 실시형태에서, 본원에 제공된 항-PCSK9 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 여기서 상기 중쇄는 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고; 상기 경쇄는 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다.
바람직한 실시형태에서, 본원에 제공된 항-PCSK9 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 여기서 상기 중쇄는 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고; 상기 경쇄는 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다.
바람직한 실시형태에서, 본원에 제공된 항-PCSK9 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 여기서 상기 중쇄는 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고; 상기 경쇄는 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항체는 항-PCSK9 항체의 아미노산 서열의 변이체, 및 상기 기재된 임의의 항체와 동일한 에피토프(epitope)에 결합하는 항체를 포함한다.
특정 실시형태에서, PCSK9 또는 이의 단편에 결합하는 항체 또는 이의 항체 단편(바람직하게는 항원-결합 단편)이 제공되고, 여기서 상기 항체는 PCSK9의 단편 내의 에피토프에 결합한다. 특정 실시형태에서, PCSK9 또는 이의 단편에 결합하는 항체 또는 이의 항체 단편이 제공되고, 여기서 상기 항체는, 인간 PCSK9 아미노산 서열 서열번호 53의 아미노산 75 내지 93 및 100 내지 110을 포함하는, PCSK9의 단편 내의 에피토프에 결합한다. 특정 실시형태에서, 본 발명에 따르는 항체의 기능적 및/또는 구조적 에피토프는 인간 PCSK9의 잔기 Y78을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 발명에 따르는 항체의 기능적 및/또는 구조적 에피토프는 인간 PCSK9의 잔기 T86을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 발명에 따르는 항체의 기능적 및/또는 구조적 에피토프는 인간 PCSK9의 잔기 H87을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 발명에 따르는 항체의 기능적 및/또는 구조적 에피토프는 인간 PCSK9의 잔기 Y78, T86 및 H87을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 발명에 따르는 항체의 기능적 및/또는 구조적 에피토프는 인간 PCSK9의 잔기 R104를 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 발명에 따르는 기능적 및/또는 구조적 에피토프는 인간 PCSK9의 잔기 Y78, T86, T87 및 R104를 포함한다. 특정 실시형태에서, 기능적 및/또는 구조적 에피토프는 인간 PCSK9의 잔기 Y78, T86, H87 및 R104로부터 선택된 하나 이상을 포함한다. 특정 실시형태에서, 기능적 및/또는 구조적 에피토프는 인간 PCSK9의 Y78, T86, H87 및 R104에 인접하는 하나 이상의 잔기를 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 발명에 따르는 항체의 기능적 및/또는 구조적 에피토프는 (i) 인간 PCSK9의 Y78, T86 및 H87로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 잔기, (ii) 인간 PCSK9의 R104를 포함한다. 특정 실시형태에서, 기능적 및/또는 구조적 에피토프는 하기 잔기 중의 하나, 둘, 셋 또는 모두를 포함한다: 인간 PCSK9의 Y78, T86, H87 및 R104.
일부 실시형태에서, 항-PCSK9 항체는 모노클로날 항체이다. 일부 실시형태에서, 항-PCSK9 항체는 인간화된 것이다. 일부 실시형태에서, 항-PCSK9 항체는 인간 항체이다. 일부 실시형태에서, 항-PCSK9 항체의 프레임워크 서열(framework sequence)의 적어도 일부는 인간 컨센서스(consensus) 프레임워크 서열이다. 한 가지 실시형태에서, 본 발명의 항-PCSK9 항체는 이의 항체 단편, 바람직하게는 Fab, Fab'-SH, Fv, scFv 또는 (Fab')2 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 항체 단편을 추가로 포함한다.
한 가지 국면에서, 본 발명은 임의의 상기 항-PCSK9 항체 또는 이의 단편을 코딩하는 핵산을 제공한다. 한 가지 실시형태에서, 핵산을 포함하는 벡터가 제공된다. 한 가지 실시형태에서, 벡터는 발현 벡터이다. 한 가지 실시형태에서, 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 한 가지 실시형태에서, 숙주 세포는 진핵생물이다. 또 다른 실시형태에서, 숙주 세포는 효모 세포, 포유동물 세포, 또는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 제조에 적합한 기타 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 또 다른 실시형태에서, 숙주 세포는 원핵생물이다.
한 가지 실시형태에서, 본 발명은 항-PCSK9 항체 또는 이의 단편(바람직하게는 항원-결합 단편)의 제조 방법을 제공하고, 여기서 상기 방법은 숙주 세포를, 항체 또는 이의 단편(바람직하게는 항원-결합 단편)을 코딩하는 핵산의 발현에 적합한 조건하에 배양하는 단계, 및 임의로 상기 항-PCSK9 항체 또는 이의 단편(바람직하게는 이의 항원-결합 단편)을 단리하는 단계를 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 방법은 항-PCSK9 항체 또는 이의 단편(바람직하게는 이의 항원-결팝 단편)을 숙주 세포로부터 회수하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 본원에 기재된 임의의 항-PCSK9 항체 또는 이의 단편(바람직하게는 이의 항원-결합 단편)을 포함하는 조성물을 제공하고, 바람직하게는 조성물은 약제학적 조성물이다. 한 가지 실시형태에서, 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함한다.
한 가지 국면에서, 본 발명은 대상체에서 LDL-수용체(LDLR)에 대한 PCSK9의 결합을 저해하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 본원에 기재된 임의의 항-PCSK9 항체 또는 이의 단편의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 본 발명은 추가로 대상체에서 LDL-수용체(LDLR)에 대한 PCSK9의 결합을 저해하기 위한 조성물 또는 의약의 제조에서 본원에 기재된 임의의 항-PCSK9 항체 또는 이의 단편의 용도에 관한 것이다.
또 다른 국면에서, 본 발명은 대상체에서 콜레스테롤 수준을 저하시키는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 본원에 기재된 임의의 항-PCSK9 항체 또는 이의 단편의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 한 가지 실시형태에서, 콜레스테롤은 LDL-콜레스테롤, 바람직하게는 혈청 콜레스테롤이다. 또 다른 국면에서, 본 발명은 대상체에서 LDL-콜레스테롤 수준을 저하시키는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 본원에 기재된 임의의 항-PCSK9 항체 또는 이의 단편의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 대상체에서 LDL-콜레스테롤의 혈청 수준을 저하시키는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 본원에 기재된 임의의 항-PCSK9 항체 또는 이의 단편의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 국면에서, 본 발명은 추가로 대상체에서 콜레스테롤 수준(한 가지 실시형태에서, LDL-콜레스테롤 수준 또는 LDL-콜레스테롤의 혈청 수준)을 저하시키는 의약의 제조에서 본원에 기재된 임의의 항-PCSK9 항체 또는 이의 단편의 용도에 관한 것이다.
또 다른 국면에서, 본 발명은 대상체에서 LDL-콜레스테롤 수준의 상승과 연관된 병태를 치료하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 본원에 기재된 임의의 항-PCSK9 항체 또는 이의 단편의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 본 발명은 추가로 대상체에서 LDL-콜레스테롤 수준의 상승과 연관된 대상체의 병태를 치료하기 위한 의약의 제조에서 본원에 기재된 임의의 항-PCSK9 항체 또는 이의 단편의 용도에 관한 것이다.
한 가지 국면에서, 본 발명은 콜레스테롤-관련 질환의 치료 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 본원에 기재된 임의의 항-PCSK9 항체 또는 이의 단편의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 본 발명은 추가로 콜레스테롤-관련 질환을 치료하기 위한 의약의 제조에서 본원에 기재된 임의의 항-PCSK9 항체 또는 이의 단편의 용도에 관한 것이다. 콜레스테롤-관련 질환의 예시적 및 비-제한적 예는 하기 제공되어 있다. 일부 실시형태에서, 콜레스테롤-관련 질환은 고콜레스테롤혈증 또는 고지혈증이다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 고콜레스테롤혈증 및/또는 고지혈증의 치료 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 본원에 기재된 임의의 항-PCSK9 항체 또는 이의 단편의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 추가로 고콜레스테롤혈증 및/또는 고지혈증을 치료하기 위한 의약의 제조에서 본원에 기재된 임의의 항-PCSK9 항체 또는 이의 단편의 용도에 관한 것이다.
한 가지 국면에서, 본 발명은, PCSK9의 활성을 제거, 저해 또는 저하시킴으로써 경감, 지연, 저해 또는 예방할 수 있는 임의의 질환 또는 병태를 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 스타틴에 의해 치료 또는 예방될 수 있는 질환 또는 병태는 본원에 기재된 임의의 항-PCSK9 항체 또는 이의 단편으로 치료될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예방된 콜레스테롤 합성 또는 증가된 LDLR 발현으로부터 유익할 수 있는 질환 또는 병태는 본원에 기재된 임의의 항-PCSK9 항체 또는 이의 단편으로 치료될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 추가로 대상체에게 유효량의 제2 의약과 조합하여 투여하는 것을 포함하고, 여기서 본원에 기재된 항-PCSK9 항체 또는 이의 단편은 제1 약물이다. 한 가지 실시형태에서 제2 의약은 LDLR 단백질의 수준을 증가시킨다. 또 다른 실시형태에서, 제2 의약은 LDL-콜레스테롤 수준을 저하시킨다. 또 다른 실시형태에서, 제2 의약은 스타틴을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 제2 의약은 스타틴이다. 일부 실시형태에서, 스타틴은 아토르바스타틴, 플루바스타틴, 로바스타틴, 메바스타틴, 피타바스타틴, 프라바스타틴, 로수바스타틴, 심바스타틴 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 또 다른 실시형태에서, 제2 의약은 HDL-콜레스테롤 수준을 상승시킨다. 일부 실시형태에서, 대상체 또는 개체는 포유동물, 바람직하게는 인간이다.
한 가지 국면에서, 본 발명은 샘플 중의 PCSK9 단백질을 검출하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 (a) 샘플을 본원에 기재된 임의의 항-PCSK9 항체 또는 이의 단편과 접촉시키는 단계; 및 (b) 항-PCSK9 항체 또는 이의 단편과 PCSK9 단백질 사이의 복합체의 형성을 검출하는 단계를 포함한다. 한 가지 실시형태에서, 항-PCSK9 항체는 검출가능하게 표지된다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 임의의 실시형태의 임의의 조합을 포함한다. 본원에 기재된 임의의 실시형태 또는 이의 임의의 조합은 본원에 기재된 본 발명의 임의의 및 모든 항-PCSK9 항체 또는 단편, 방법 및 이의 용도에서 사용하기에 적합하다.
도 1은 LDLR에 대한 PCSK9의 결합을 차단하는 다양한 농도의 각 항-PCSK9 항체의 능력을 나타낸다.
도 2는 다양한 농도의 각 항-PCSK9 항체가 LDLR을 복원시키는 HepG2 세포의 능력을 증가시키는 것을 나타낸다.
도 3은 LDLR의 세포 내재화를 감소시키는 다양한 농도의 각 항-PCSK9 항체의 능력을 나타낸다.
도 4는 본 발명의 예시적 항체의 FR 및 CDR의 서열 정보를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 예시적 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 서열 정보를 나타낸다.
도 6은 복합체 항-PCSK9 항체/PCSK9-WT의 HM4 고질량 MALDI ToF 분석을 나타내고, 여기서 항-PCSK9 항체는 0.5μM이고; PCSK9-WT는 4μM이고, 총 용적은 10μl이고; 가교는 K200이고, 인큐베이션 시간은 180분이다.
도 7은 PCSK9-WT의 트립신, 키모트립신, Asp-N, 엘라스타제 및 서모리신 펩티드를 나타낸다. 서열의 88.77%는 동정된 펩티드에 의해 커버되었다.
도 8은 PCSK9-WT와 항-PCSK9 항체 사이의 상호작용을 나타낸다.
도 9는, 랫트에서 항-PCSK9 항체 또는 에볼로쿠맵의 피하 또는 정맥내 투여 후, 투여 전(D1 투여 전, 기준선)의 것에 대한 혈청 LDL-C 수준의 % 변화율(평균)을 시간에 대해 플롯팅한 그래프이다.
도 10은, 랫트에서 항-PCSK9 항체 또는 에볼로쿠맵의 피하 또는 정맥내 투여 후, 투여 전(D1 투여 전, 기준선)의 것에 대한 혈청 %HDL-C 수준의 % 변화율(평균)을 시간에 대해 플롯팅한 그래프이다.
도 11은, 사이노몰구스에게 항-PCSK9 항체 또는 에볼로쿠맵의 투여 후, 투여 전(D1 투여 전, 기준선)의 것에 대한 혈청 LDL-C 수준의 % 변화율(평균)을 시간에 대해 플롯팅한 그래프이다.
도 12는, 사이노몰구스에게 항-PCSK9 항체 또는 에볼로쿠맵의 투여 후, 투여 전(D1 투여 전, 기준선)의 것에 대한 혈청 HDL-C 수준의 % 변화율(평균)을 시간에 대해 플롯팅한 그래프이다.
도 13은, 사이노몰구스에게 항-PCSK9 항체 또는 에볼로쿠맵의 투여 후, 투여 전(D1 투여 전, 기준선)의 것에 대한 혈청 TC 수준의 % 변화율(평균)을 시간에 대해 플롯팅한 그래프이다.
정의
본 발명을 하기에 상세히 설명하기 전에, 본 발명은, 이들이 상이할 수 있기 때문에, 본원에 기재된 특정 방법론, 용액 및 시약으로 한정되지 않는 것을 이해해야 한다. 또한, 본원에 사용되는 용어는 특정 실시형태를 설명하는 것을 목적으로 하고, 첨부 특허청구의 범위에 의해서만 한정되는 본 발명의 범위를 한정하는 것을 의도하는 것은 아닌 것으로 이해된다. 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는, 달리 정의되지 않는 한, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본 명세서를 해석하는 목적으로, 하기 정의가 사용되고, 단수형으로 사용되는 용어는 또한 복수형을 포함할 수 있고, 적절한 경우, 그 반대도 가능하다. 본원에서 사용되는 용어는 특정 실시형태를 설명하는 것을 목적으로 하고, 한정적인 것을 의도하지 않는 것으로 이해된다.
수치와 관련하여 사용되는 경우, 용어 "약"은 특정된 수치의 5% 이하의 하한치 및 특정된 수치의 5% 초과의 상한치 사이의 범위 내의 수치를 포함하는 것을 의미한다.
"친화성"은 분자(예: 항체) 및 이의 결합 파트너(항원)의 단일 결합 부위 사이의 모든 비-공유 상호작용의 합계의 강도를 지칭한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "결합 친화성"은, 달리 제시하지 않는 한, 결합 쌍(예: 항체 및 항원)의 구성원 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유한 결합 친화성을 지칭한다. 이의 파트너 Y에 대한 분자 X의 친화성은 일반적으로 평형 해리 상수(KD)에 의해 표시된다. 친화성은, 당해 기술분야에 공지되고 본원에 기재된 것들을 포함하여, 당해 기술분야에 공지된 종래의 방법에 의해 측정할 수 있다.
용어 "항-PCSK9 항체", "항-PCSK9", "PCSK9 항체" 또는 "PCSK9에 결합하는 항체"는, 해당 항체가 PCSK9를 표적화하는 진단제 및/또는 치료제로서 사용될 수 있도록, 충분한 친화성으로 PCSK9 단백질 또는 이의 단편에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 한 가지 실시형태에서, 항-PCSK9 항체는, 예를 들면, 방사선면역검정(RIA)에 의해 측정할 때, PCSK9에 대한 항체 결합의 약 10% 미만의 정도로 비관련된 비-PCSK9 단백질에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항-PCSK9 항체는 ≤ 1μM, ≤100nM, ≤10nM, ≤1nM, ≤0.1nM, ≤0.01nM 또는 ≤0.001nM의 평형 해리 상수(KD)(예를 들면, 10-8M 이하, 예를 들면, 10-8M 내지 10-13M, 예를 들면, 10-9M 내지 10-13M)를 갖는다.
본원에 사용된 바와 같이, "모노클로날 항체" 또는 "mAb"는, 예를 들면, 진핵생물, 원핵생물 또는 파지 클론으로부터 유래하는 단일 카피 또는 클로닝된 항체를 지칭하며, 이를 생산하는 방법을 지칭하는 것은 아니다. 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편은, 예를 들면, 하이브리도마 기술, 재조합 기술, 파지 디스플레이 기술, CDR 이식 등의 합성 기술, 또는 이러한 기술 또는 당해 기술분야에 공지된 기타 기술의 조합에 의해 제조될 수 있다.
"항체 단편"은 무손상 항체 이외의 분자를 지칭하고, 이는 무손상 항체가 결합하는 항원에 결합하는 무손상 항체의 일부를 포함한다.
참조 항체와 "동일한 에피토프에 결합하는 항체"는 경쟁 검정에서 이의 항원에 대한 참조 항체 결합의 50% 이상을 차단하는 항체를 지칭한다. 대조적으로, 참조 항체는 경쟁 검정에서 이의 항원에 대한 항체 결합의 50% 이상을 차단한다.
당해 기술분야에 공지된 항체의 5개 주요 부류: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 있고, 이들 항체 중의 몇몇은 서브클라스(이소형), 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2으로 추가 분류할 수 있다. 면역글로불린의 상이한 부류에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로서 지칭된다.
본 발명에 사용되는 용어 "세포독성제"는 세포 기능을 저해하거나 예방하고/하거나 세포 사멸 또는 파괴를 유발하는 물질을 지칭한다.
용어 "디아바디"는 2개의 항원 결합 부위를 갖는 항체 단편을 지칭하고, 상기 항체 단편은 동일한 폴리펩티드 쇄(VH-VL)에서 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함한다. 도메인은, 동일한 쇄 상의 2개 도메인이 서로 쌍을 형성하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 다른 쇄 상의 상보성 도메인과 쌍을 형성시켜 2개의 항원 결합 부위를 생성한다. 디아바디는 이가 또는 이중특이적일 수 있다. 디아바디는, 예를 들면, 문헌[참조: EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson et al, Nat. Med. 9: 129-134 (2003); and Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)]에 보다 상세하게 기재되어 있다. 트리아바디 및 테트라바디는 또한 문헌[참조: Hudson et al, Nat. Med. 9: 129-134 (2003)]에 기재되어 있다.
"이펙터 기능"은 항체의 Fc 영역에 기인할 수 있는 생물학적 활성을 지칭하고, 이는 항체 이소형에 따라 상이하다. 항체 이펙터 기능의 예는 C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성(CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개된 세포독성(ADCC); 식작용; 세포 표면 수용체(예: B 세포 수용체)의 하향 조절; 및 B 세포 활성화를 포함한다.
용어 "유효량"은, 단일 또는 복수 용량으로 환자에게 투여되는 경우, 치료되는 환자에서 목적하는 효과를 생성하는 본 발명의 항체 또는 단편의 양 또는 용량을 지칭한다. 유효량은, 포유동물의 종류; 이의 크기, 연령 및 일반 건강; 관여하는 특정 질환; 질환의 정도 또는 중증도; 개개 환자의 반응; 투여되는 특정 항체; 투여 방식, 투여되는 제형의 생체이용 특성; 선택된 투여 섭생; 및 임의의 병용 요법의 사용 등의 다양한 인자를 고려하여 당업자로서 주치의에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명에서 사용하기에 적합한 "항체 및 이의 항원-결합 단편"은 폴리클로날, 모노클로날, 일가, 이중특이적, 헤테로접합성, 다중특이적, 재조합, 이종성, 헤테로접합성, 키메라, 인간화(특히 CDR로 이식된), 탈면역화 또는 인간 항체, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생성된 단편, Fd, Fv, 디설파이드-결합 Fv(dsFv), 단일-쇄 항체(예: scFv), 디아바디 또는 테트라바디[참조: Holliger P. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (14), 6444-6448], 나노바디(또한 단일 도메인 항체로서 지칭됨), 항-이디오타입 (항-Id) 항체(예를 들면, 본 발명의 항체에 대한 항-Id 항체를 포함), 및 상기 어느 것의 에피토프-결합 단편을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다.
"Fab" 단편은 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함하고, 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)을 포함한다. Fab' 단편은, 항체 힌지 영역으로부터 유래하는 하나 이상의 시스테인을 포함하는, 중쇄 CH1 도메인의 카복실 말단에 일부 잔기가 부가되어 있다는 점에서 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 불변 도메인 내의 시스테인 잔기가 유리 티올 그룹을 포함하는 Fab'에 대한 본원에서의 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 Fab' 단편 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로 본래 생산된다. 항체 단편의 다른 화학적 결합도 또한 공지되어 있다.
용어 "Fc 영역"은 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하기 위해 본원에서 사용되고, Fc 영역은 불변 영역의 적어도 일부를 포함한다. 이 용어는 천연 Fc 영역 서열 및 Fc 영역 변이체를 포함한다. 특정 실시형태에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 Cys226 또는 Pro230로부터 중쇄의 카보닐 말단까지 신장한다. 그러나, Fc 영역의 C-말단 리신(Lys447)은 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 달리 지시하지 않는 한, Fc 영역 또는 불변 영역 중의 아미노산 잔기는 EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링되고, 이는 또한 문헌[참조: Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National. Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991]에 기재된 바와 같이 EU 인덱스로서 지칭된다.
"프레임워크" 또는 "FR"은 초가변 영역(HVR)(예: 상보성 결정 영역) 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 지칭한다. 가변 도메인의 FR은 전형적으로 4개 FR 도메인: FR1, FR2, FR3 및 FR4로 이루어진다. 따라서, HVR 및 FR 서열은 일반적으로 중쇄 가변 도메인(VH)(또는 경쇄 가변 도메인(VL))에서 하기 서열로 나타난다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
용어 "전장 항체", "무손상 항체" 및 "전체 항체"는 천연 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖거나 본원에 정의된 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 지칭하기 위해 본원에서 호환적으로 사용된다.
"Fv"는 전체 항원 결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 한 가지 실시형태에서, 이중-가닥 Fv 종은 하나의 중쇄 가변 도메인 및 하나의 경쇄 가변 도메인이 단단하게 비-공유적으로 회합되어 있는 이량체로 이루어져 있다. 단일-쇄 Fv(scFv)에서, 하나의 중쇄 가변 도메인은, 경쇄 및 중쇄가 이중-가닥 Fv 종과 유사한 "이량체" 구조로 회합될 수 있도록, 유연한 펩티드 링커에 의해 하나의 경쇄 가변 도메인에 공유 결합할 수 있다. 이러한 구성에서, 각 가변 도메인 내의 3개 HVR은 서로 상호작용하여, VH-VL 이량체의 표면 상에 위치하는 항원 결합 부위를 정의한다. 요약하면, 6개 HVR은 항체에 항원 결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인(또는 항원에 특이적인 3개 HVR만을 포함하는 Fv의 절반)이 항원을 인식하고 이에 결합하는 능력을 갖더라도, 친화성은 무손상 결합 부위보다 낮다[참조: Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore eds. (Springer-Verlag, New York, 1994), pp. 269-315].
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물"은 호환적으로 사용되고, 이러한 세포의 자손을 포함하여, 외인성 핵산이 도입되어 있는 세포를 지칭한다. 숙주 세포는 "형질전환체" 및 "형질전환 세포"를 포함하고, 이는 계대 수와 무관하게 일차 형질전환 세포 및 이로부터 유래하는 자손을 포함한다. 자손은 부모 세포와 핵산 함량에서 완전히 동일하지는 않을 수 있지만, 돌연변이를 함유할 수 있다. 최초로 형질전환된 세포에서 스크리닝 또는 선택된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이 자손이 본원에 포함된다.
"인간 항체"는, 인간 또는 인간 세포에 의해 생산되거나, 인간 항체 레퍼토리 또는 기타 인간 항체-코딩 서열을 이용하는 비-인간 공급원으로부터 유래하는 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 것이다. 인간 항체의 정의는 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 특히 제외한다.
"인간 컨센서스 프레임워크"는, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선택에서 가장 일반적으로 존재하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 일반적으로, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 서열의 선택은 가변 도메인 서열의 아형으로부터의 것이다. 일반적으로, 서열의 아형은 문헌[참조: Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3]에 정의된 아형이다. 한 가지 실시형태에서, VL의 경우, 아형은 문헌[참조: Kabat et al., supra]에서와 같이 아형 카파 I이다. 일부 실시형태에서, VH의 경우, 아형은 문헌[참조: Kabat et al., supra]에서와 같이 아형 III이다.
"인간화" 항체는 비-인간 HVR로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 지칭한다. 특정 실시형태에서, 인간화 항체는 실질적으로 모든 적어도 1개 및 전형적으로 2개의 가변 도메인을 포함하고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 HVR(예: CDR)은 비-인간 항체의 것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 항체의 것에 상응한다. 인간화 항체는 인간 항체로부터 유래하는 항체 불변 영역의 적어도 일부를 임의로 포함할 수 있다. "인간화 형태"의 항체, 예를 들면, 비-인간 항체는 인간화를 받은 항체를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "고콜레스테롤혈증"은, 콜레스테롤 수준이 목적하는 수준을 초과하여 증가되어 있는 병태를 지칭한다. 일부 실시형태에서, LDL-콜레스테롤 수준은 목적하는 수준을 초과하여 증가된다. 일부 실시형태에서, LDL-콜레스테롤의 혈청 수준은 목적하는 수준을 초과하여 증가된다.
"면역접합체"는, 세포독성제를 포함하지만 이들로 한정되지 않는, 하나 이상의 이종 분자(들)에 접합된 항체이다.
"개체" 또는 "대상체"는 포유동물을 포함한다. 포유동물은 가축 동물(예: 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류(예: 인간 및 비-인간 영장류, 예를 들면, 원숭이), 래빗, 및 설치류(예: 마우스 및 랫트)를 포함하지만 이들로 한정되지 않는다. 특정 실시형태에서, 개체 또는 대상체는 인간이다.
"단리된 항체"는 이의 천연 환경의 성분으로부터 분리된 것이다. 일부 실시형태에서, 항체는, 예를 들면, 전기영동(예: SDS-PAGE, 등전점 전기영동(IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피(예: 이온 교환 또는 역상 HPLC)에 의해 측정할 때, 95% 또는 99%를 초과하는 순도까지 정제된다. 항체 순도를 평가하기 위한 방법의 개설에 대해서는, 예를 들면, 문헌[참조: Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)]을 참조한다.
"단리된 핵산"은 이의 천연 환경의 성분으로부터 분리된 핵산 분자를 지칭한다. 단리된 핵산은, 통상 핵산 분자를 함유하는 세포에 함유된 핵산 분자를 포함하지만, 핵산 분자는 염색체 외측 또는 이의 천연 염색체 위치와는 상이한 염색체 위치에 존재한다.
"항-PCSK9 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 코딩하는 단리된 핵산"은, 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 하나 이상의 핵산 분자를 지칭하고, 숙주 세포 내의 하나 이상의 위치에 존재하는 이러한 핵산 분자 뿐만 아니라 단일 벡터 또는 별개 벡터에 함유된 이러한 핵산 분자를 포함한다.
참조 폴리펩티드 서열과 관련하여 "퍼센트(%) 아미노산 서열 동일성"은, 서열을 정렬시키고, 필요한 경우, 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해 갭을 도입한 후에, 참조 폴리펩티드 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분률로서 정의되고, 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존적 치환을 고려하지 않는다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정하는 목적을 위한 정렬은, 예를 들면, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 MEGALIGN(DNASTAR) 소프트웨어 등의 공적으로 입수가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여, 당해 기술분야에서 다양한 방식으로 달성할 수 있다. 당업자는, 비교되는 서열의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 서열을 정렬하는 적절한 파라미터를 결정할 수 있다.
서열 동일성의 백분률이 본원에서 언급되는 경우, 이들 백분률은, 달리 특별히 지시되지 않는 한, 보다 긴 서열의 전장에 대하여 계산된다. 보다 긴 서열의 전장에 대한 계산은 핵산 서열 및 폴리펩티드 서열 둘 다에 적용한다.
용어 "약제학적 조성물"은, 그 안에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성을 유효하게 할 수 있도록 하는 형태이고 제형이 투여되는 대상체에게 허용되지 않는 독성이 있는 추가 성분을 함유하지 않는 제형을 지칭한다.
용어 "약제학적으로 허용되는 담체"는 희석제, 보조제(예: 프로인트 보조제(완전 및 불완전)), 부형제 또는 치료제와 동시-투여되는 비히클을 지칭한다.
달리 지시하지 않는 한, 본원에서 사용되는 용어 "프로단백질 전환효소 서브틸리신/켁신 유형 9(PCSK9)", "PCSK9" 또는 "NARC-1"은, 달리 지시하지 않는 한, 포유동물, 예를 들면, 영장류(예: 인간) 및 설치류(예: 마우스 및 랫트)를 포함하여 임의의 척추동물 기원으로부터 유래하는 임의의 천연 PCSK9를 지칭한다. 이 용어는 "전장" 비처리 PCSK9, 게다가 세포내 프로세스를 통해 생산된 임의 형태의 PCSK9 또는 이의 임의의 단편을 포함한다. 이 용어는 또한 천연에 존재하는 PCSK9 변이체, 예를 들면, 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포함한다.
용어 "PCSK9 활성" 또는 PCSK9의 "생물학적 활성"은, 본원에서 사용되는 경우, PCSK9의 임의의 생물학적 효과를 포함한다. 일부 실시형태에서, PCSK9 활성은 기질 또는 수용체와 상호작용하거나 이에 결합하는 PCSK9의 능력을 포함한다. 일부 실시형태에서, PCSK9의 생물학적 활성은 LDL-수용체(LDLR)에 결합하는 PCSK9의 능력이다. 일부 실시형태에서, PCSK9는 LDLR을 수반하는 반응에 결합하고 이를 촉매한다. 일부 실시형태에서, PCSK9 활성은 LDLR의 이용가능성을 감소 또는 저하시키는 PCSK9의 능력을 포함한다. 일부 실시형태에서, PCSK9의 생물학적 활성은 대상체에서 LDL의 양을 증가시키는 PCSK9의 능력을 포함한다. 일부 실시형태에서, PCSK9의 생물학적 활성은 LDL에 결합하기 위해 대상체에서 이용가능한 LDLR의 양을 감소시키는 PCSK9의 능력을 포함한다. 일부 실시형태에서, PCSK9의 생물학적 활성은 LDL에 대한 결합에 이용가능한 LDLR의 양을 감소시키는 PCSK9의 능력을 포함한다. 일부 실시형태에서, PCSK9의 생물학적 활성은 PCSK9 신호전달로부터 발생하는 임의의 생물학적 활성을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "치료하는"은 기존의 증상, 병태, 장애 또는 질환의 진행 또는 중증도를 지연, 중단, 정지, 관해, 저지, 감소 또는 역전시키는 것을 지칭한다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은, 항원에 대한 항체의 결합에 관여하는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 일반적으로 유사한 구조를 갖고, 각각의 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역(FR) 및 3개의 상보성 결정 영역을 포함한다[참조: Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)]. 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 추가로, 특정 항원에 결합하는 항체는, 각각 상보성 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 항원에 결합하는 항체의 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 단리할 수 있다[참조: Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)].
본원에서 사용되는 용어 "벡터"는 그것이 결합하고 있는 또 다른 핵산을 전파시킬 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 이 용어는 자가-복제 핵산 구조로서의 벡터, 게다가 그것이 도입되어 있는 숙주 세포의 게놈 내로 도입된 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 그들이 작동적으로 연결되어 있는 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로서 지칭된다.
용어 "콜레스테롤-관련 질환"은 고콜레스테롤혈증, 고지혈증, 심장 질환, 대사 증후군, 당뇨병, 관상동맥성 심장 질환, 뇌졸중, 심혈관 질환, 알츠하이머 질환 및 일반적 지질이상증(이는, 예를 들면, 전체 혈청 콜레스테롤 수준의 증가, LDL 수준의 증가, 트리글리세라이드 수준의 증가, VLDL 수준의 증가 및/또는 낮은 수준의 HDL로서 나타난다)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 임의의 하나 이상을 포함한다. 항-PCSK9 항체(단독 또는 하나 이상의 기타 약물과 조합하여)로 치료될 수 있는 원발성 및 속발성 지질이상증의 일부 비-제한적 예는 대사 증후군, 당뇨병, 가족성 조합 고지혈증, 가족성 고트리글리세라이드혈증, 헤테로접합성 고콜레스테롤혈증을 포함하는 가족성 고콜레스테롤혈증, 호모접합성 고콜레스테롤혈증, 가족성 결핍성 아포지단백질 B-100; 다유전자 고콜레스테롤혈증; 잔존 제거 질환, 간 리파제 결핍증; 식사 무관심, 갑상선기능저하증, 약물(에스트로겐 및 프로게스테론 요법, 베타 차단제 및 티아지드 이뇨제를 포함) 중의 어느 하나에 속발하는 지질이상증; 신 증후군, 만성 신부전, 쿠싱 증후군, 원발성 담즙성 간경변, 글리코겐 축적 질환, 간암, 담즙정체증, 말단 비대증, 인슐린종, 고립성 성장 호르몬 결핍 및 알콜-유도된 고트리글리세리드혈증을 포함한다.
본 발명의 항체
본 발명의 한 가지 국면에서, 본원에서는 항-PCSK9 항체 및 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 일부 실시형태에서, 항-PCSK9 항체는 PCSK9 활성을 저해 또는 차단한다. 특정 실시형태에서, 본원에 제공된 항체는 ≤ 약 1μM, ≤ 약 100nM, ≤ 약 10nM, ≤ 약 1nM, ≤ 약 0.1nM, ≤ 약 0.01nM 또는 ≤ 약 0.001nM(예를 들어, 10-8M 이하, 예를 들면, 10-8M 내지 10-13M, 예를 들면, 10-9M 내지 10-13M)의 평형 해리 상수(KD)를 갖는다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항-PCSK9 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역(HCVR)을 포함하고, 여기서 HCVR는 상보성 결정 영역(CDR) HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, HCDR1은 서열번호 1, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 및 20으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, HCDR2는 서열번호 2, 14, 15, 16, 17 및 21로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, HCDR3은 서열번호 3, 18, 19 및 22로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다. 특정 실시형태에서, 항-PCSK9 항체 HCVR의 CDR(예를 들면, 참조 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성 또는 100% 동일성을 갖는 CDR)의 아미노산 서열은 상응하는 참조 서열에 대해 하나 이상의 치환(예: 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하고, 상기 CDR을 포함하는 항-PCSK9 항체는 PCSK9에 결합하는 능력을 갖는다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항-PCSK9 항체 또는 이의 항원-결팝 단편은 경쇄 가변 영역(LCVR)을 포함하고, 여기서 LCVR은 상보성 결정 영역(CDR) LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고, LCDR1은 서열번호 4의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, LCDR2는 서열번호 5의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, LCDR3은 서열번호 6의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다. 특정 실시형태에서, 항-PCSK9 항체 LCVR의 CDR(예: 참조 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성 또는 100% 동일성을 갖는 CDR)의 아미노산 서열은 상응하는 참조 서열에 대해 하나 이상의 치환(예: 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하고, 상기 CDR을 포함하는 항-PCSK9 항체는 PCSK9에 결합하는 능력을 갖는다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항-PCSK9 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역(HCVR)을 포함하고, 여기서 중쇄 가변 영역 HCVR은 서열번호 23, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 및 33으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 항-PCSK 항체의 중쇄 가변 영역 HCVR은 서열번호 23, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 및 33으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 하나 이상의 치환(예: 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 HCVR을 포함하는 항-PCSK9 항체는 PCSK9에 결합하는 능력을 갖는다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항-PCSK9 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 경쇄 가변 영역(LCVR)을 포함하고, 여기서 경쇄 가변 영역 LCVR은 서열번호 24의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 항-PCSK 항체의 경쇄 가변 영역 LCVR은 서열번호 24의 아미노산 서열에 대해 하나 이상의 치환(예: 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 LCVR을 포함하는 항-PCSK9 항체는 PCSK9에 결합하는 능력을 갖는다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항-PCSK9 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄를 포함하고, 여기서 중쇄는 서열번호 34, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 및 44로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 항-PCSK 항체의 중쇄는 서열번호 34, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 및 44로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 하나 이상의 치환(예: 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄를 포함하는 항-PCSK9 항체는 PCSK9에 결합하는 능력을 갖는다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항-PCSK9 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 경쇄를 포함하고, 여기서 경쇄는 서열번호 35의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 항-PCSK 항체의 경쇄는 서열번호 35의 아미노산 서열에 대해 하나 이상의 치환(예: 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄를 포함하는 항-PCSK9 항체는 PCSK9에 결합하는 능력을 갖는다.
바람직한 실시형태에서, 상기 치환, 삽입 또는 결실은 CDR의 외측(예를 들면, FR 내부)에서 발생한다. 임의로, 본 발명의 항-PCSK9 항체는 경쇄 가변 영역, 중쇄 가변 영역, 경쇄 또는 중쇄에 대한 번역후 변형을 포함한다.
일부 실시형태에서, 치환은 보존적 치환이다. 보존적 치환은 하나의 아미노산이 동일한 부류의 또 다른 아미노산으로 치환되는 것, 예를 들면, 하나의 산성 아미노산이 또 다른 산성 아미노산으로 치환되거나, 하나의 염기성 아미노산이 또 다른 염기성 아미노산으로 치환되거나, 하나의 중성 아미노산이 또 다른 중성 아미노산으로 치환되는 것을 의미한다. 예시적 치환은 하기 표 A에 제시되어 있다:
[표 A]
Figure pct00001
특정 실시형태에서, 본원에 제공된 항체는 항체가 글리코실화되어 있는 정도를 증가 또는 감소시키도록 변형된다. 항체에 대한 글리코실화 부위의 부가 또는 결실은, 하나 이상의 글리코실화 부위가 생성 또는 제거되도록 아미노산 서열을 변형시켜 편리하게 달성할 수 있다. 일부 용도에서, 원하지 않는 글리코실화 부위를 제거하는 변형이 유용할 수 있거나, 예를 들면, 항체-의존성 세포 세포독성(ADCC) 기능을 증강시키기 위해 푸코즈 모듈을 제거하는 변형이 유용할 수 있다[참조: Shield et al. (2002) JBC 277: 26733]. 다른 용도에서, 갈락토실화 변형을 수행하여 보체-의존성 세포독성(CDC)을 변형시킬 수 있다.
특정 실시형태에서, 하나 이상의 아미노산 변형을 본원에 제공된 항체의 Fc 영역에 도입하고, 이에 의해, 예를 들면, 이상 혈관신생 및/또는 혈관 투과성 또는 누출을 수반하는 질환 또는 병태의 치료에서, 항체의 유효성을 증강시키도록 Fc 영역 변이체를 생성할 수 있다. Fc 영역 변이체는 하나 이상의 아미노산 위치에 아미노산 변형(예: 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열(예: 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 항체의 하나 이상의 잔기가 시스테인 잔기로 치환되어 있는 시스테인 조작된 항체, 예를 들면, "티오MAb"를 작제하는 것이 바람직할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본원에 제공된 항체는 당해 기술분야에 공지되어 있고 용이하게 입수가능한 추가 비-단백질성 부분을 함유하도록 추가로 변형시킬 수 있다. 항체의 유도체화에 적합한 부분은 수용성 폴리머를 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다. 수용성 폴리머의 비제한적 예는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카복시메틸셀룰로즈, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리-아미노산(호모중합체 또는 램덤 공중합체), 및 글루칸 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 호모중합체, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸레이트화 폴리올(예: 글리세롤), 폴리비닐 알콜 및 이들의 혼합물을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 항-PCSK9 항체의 단편을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, 디아바디, 선형 항체, 단일 쇄 항체 분자(예: scFv); 및 항체 단편에 의해 형성된 다중특이적 항체를 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다. 항체 상의 파파인 소화에 의해 생성된 2개의 동일한 항원-결합 단편은 "Fab" 단편으로 명명되고, 각각은 단일 항원-결합 부위 및 나머지 "Fc" 단편을 갖는다. 이의 명칭은 결정화하기 쉬운 능력을 반영한다. F(ab')2 단편은 펩신 처리에 의해 생성되고, 이는 2개의 항원 결합 부위를 갖고 여전히 항원을 가교결합시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항-PCSK9 항체는 인간화 항체이다. 항체를 인간화하기 위한 상이한 방법은, 이의 전체 내용이 참조에 의해 본원에 도입되는 문헌[참조: Almagro & Fransson, Almagro JC and Fransson J (2008) Frontiers in Bioscience 13: 1619-1633]에 개설되어 있는 바와 같이, 당업자에게 공지되어 있다. 알마그로 및 프란손(Almagro & Fransson)은 이론적 접근법을 경험적 접근법과 구별한다. 이론적 접근법은 몇몇 조작된 항체 변이체를 생성하고 이들의 결합 또는 임의의 기타 관심 특성을 평가하는 것을 특징으로 한다. 설계된 변이체가 예상된 결과를 달성하지 못하는 경우, 새로운 라운드의 설계 및 결착 검정을 개시한다. 이론적 접근법은 CDR 이식, 리서페이싱(Resurfacing), 초인간화 및 인간 스트링 컨텐트 최적화를 포함한다. 대조적으로, 경험적 접근법은 인간화 변이체의 대규모 라이브러리를 생성하고 농축 기술 또는 고처리량 스크리닝을 사용하여 최적 클론을 선택하는 것에 기반한다. 결과적으로, 경험적 접근법은, 다수의 항체 변이체를 검색할 수 있는 신뢰성의 선택 및/또는 스크리닝 시스템에 의존한다. 파지 디스플레이 및 리보솜 디스플레이 등의 시험관내 디스플레이 기술은 이러한 요건을 만족시키고, 당업자에게 공지되어 있다. 경헙적 접근법은 FR 라이브러리, 가이드 선택, 프레임워크-셔플링 및 휴매니어링(Humaneering)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항-PCSK9 항체는 인간 항체이다. 인간 항체는 당해 기술분야에 공지된 다양한 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 인간 항체는 일반적으로 문헌[참조: van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol 5: 368-74 (2001) and Lonberg, Curr. Opin. Immunol 20: 450-459 (2008)]에 기재되어 있다.
본 발명의 항체는 목적하는 활성 또는 활성들을 갖는 항체에 대해 조합 라이브러리를 스크리닝하여 단리할 수 있다. 예를 들면, 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하고 목적하는 결합 특성을 갖는 항체에 대해 이러한 라이브러리를 스크리닝하는 다양한 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 이러한 방법은 문헌[참조: Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001]에 개설되어 있고, 예를 들면, 문헌[참조: McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); and Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)]에 추가로 기재되어 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 또한 세포독성제 또는 면역억제제("면역접합체") 등의 치료용 부분에 접합된 항-PCSK9 모노클로날 항체를 포함한다. 세포독성제는 세포에 유해한 임의의 제제를 포함한다. 면역접합체를 형성하기 위해 적합한 세포독성제(예: 화학요법제)의 예는 당해 기술분야, 예를 들면, WO05/103081에 공지되어 있다. 예를 들면, 세포독성제는 방사성 동위원소(예: At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소); 화학요법제 또는 약물(예: 메토트렉세이트, 아드리아마이신, 빈카 알칼로이드(빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포사이드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 기타 인터칼레이트제); 성장 억제제; 효소 및 이의 단편, 예를 들면, 핵산 하이드롤라제; 항생물질; 이의 단편 및/또는 변이체를 포함하여, 독소, 예를 들면, 소분자 독소 또는 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소; 및 다양한 공지된 항종양제 또는 항암제를 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항체는 단일특이적, 이중특이적 또는 다중특이적일 수 있다. 다중특이적 모노클로날 항체는 표적 폴리펩티드의 다양한 에피토프에 특이적일 수 있거나, 하나 이상의 표적 폴리펩티드에 특이적인 항원 결합 도메인을 함유할 수 있다[참조: Tutt et al. (1991) J. Immunol. 147: 60-69]. 항-PCSK9 모노클로날 항체는 또 다른 기능적 분자, 예를 들면, 또 다른 펩티드 또는 단백질에 결합되거나 이와 공-발현될 수 있다. 예를 들면, 항체 또는 이의 단편은 하나 이상의 다른 분자, 예를 들면, 또 다른 항체 또는 항체 단편(예를 들면, 화학적 커플링, 유전자 융합, 비-공유 회합, 또는 기타 방법에 의해)에 기능적으로 결합하여, 제2 또는 그 이상의 결합 특이성을 갖는 이중특이적 또는 다중특이적 항체를 생성할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항체는 인간 PCSK9 단백질에 결합한다.
본 발명의 핵산 및 이를 함유하는 숙주 세포
한 가지 국면에서, 본 발명은 상기 항-PCSK9 항체 또는 이의 단편 중의 어느 하나를 코딩하는 핵산을 제공한다. 핵산은 항체의 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역을 포함하는 아미노산 서열, 또는 항체의 경쇄 및/또는 중쇄를 포함하는 아미노산 서열을 코딩할 수 있다.
한 가지 실시형태에서, 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터가 제공된다. 한 가지 실시형태에서, 벡터는 발현 벡터이다.
한 가지 실시형태에서, 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 항체-코딩 벡터의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 본원에 기재된 원핵생물 또는 진핵생물 세포를 포함한다. 예를 들면, 항체는, 특히 글리코실화 및 Fc 이펙터 기능이 요구되지 않는 경우, 세균에서 생성될 수 있다. 예를 들면, 세균에서 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현에 대해서는 문헌[참조: 미국 특허 제5,648,237호, 제5,789,199호 및 제5,840,523호]을 참조하고, 또한 이. 콜라이(E. coli)에서 항체 단편의 발현을 기재하는 문헌[참조: Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003, pp. 245-254]을 참조한다. 발현 후, 항체는 가용성 분획으로 세균 세포 페이스트로부터 단리할 수 있고, 추가로 정제할 수 있다.
한 가지 실시형태에서, 숙주 세포는 진핵생물이다. 또 다른 실시형태에서, 숙주 세포는, 효모 세포, 포유동물 세포, 또는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 제조에서의 사용에 적합한 기타 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 예를 들면, 사상균 또는 효모 등의 진핵생물 미생물은, 진균 및 효모균을 포함하여, 항체를 코딩하는 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이고, 이의 글리코실화 경로는 "인간화"되어, 부분 또는 완전 인간 글리코실화 패턴을 갖는 항체의 생성을 야기한다[참조: Gerngross, Nat. Biotech. 22: 1409-1414 (2004), and Li et al, Nat. Biotech. 24: 210-215 (2006)]. 글리코실화 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다세포 생물(무척추동물 및 척추동물)로부터 유래한다. 척추동물 세포는 또한 숙주로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 현탁 성장에 적합하도록 조작된 포유동물 세포주를 사용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40으로 형질전환시킨 원숭이 신장 CV1 세포주(COS-7); 인간 배아 신장 세포주(293 또는 293 세포, 예를 들면, 문헌[참조: Graham et al, J. Gen Virol. 36:59 (1977)]에 기재된 바와 같음) 등이다. 기타 유용한 포유동물 숙주 세포주는 DHFR-CHO 세포를 포함하는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포[참조: Urlaub et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 216 (1980)]; 및 골수종 세포주, 예를 들면, Y0, NS0 및 Sp2/0를 포함한다. 항체의 생산에 적합한 특정 포유동물 숙주 세포주의 개설에 대해서는, 예를 들면, 문헌[참조: Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)]을 참조한다.
한 가지 실시형태에서, 항-PCSK9 항체를 제조하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를, 상기 제공된 바와 같이, 항체의 발현에 적합한 조건하에 배양하는 단계 및, 임의로, 항체를 숙주 세포(또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 회수하는 단계를 포함한다. 항-PCSK9 항체의 재조합 생산을 위해, 항체(예를 들면, 상기 기재된 항체)를 코딩하는 핵산을 단리하고 숙주 세포에서 추가 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 이상의 벡터에 삽입한다. 이러한 핵산은 통상의 절차(예를 들면, 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써)를 사용하여 용이하게 단리하고 서열분석한다.
약제학적 조성물 및 약제학적 제형
본 발명은 또한 항-PCSK9 항체를 포함하는 조성물(약제학적 조성물 또는 약제학적 제형 포함) 및 항-PCSK9 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 조성물은 PCSK9에 결합하는 하나 이상의 항체, 또는 PCSK9에 결합하는 하나 이상의 항체를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 이들 조성물은 또한 적합한 약제학적으로 허용되는 담체, 예를 들면, 완충제를 포함하여, 당해 기술분야에 공지된 약제학적 부형제를 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용하기에 적합한 약제학적으로 허용되는 담체는 물 및 오일 등의 멸균 액체일 수 있고, 이는 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 것들, 예를 들면, 땅콩유, 대두유, 광유, 피마자유 등을 포함한다. 약제학적 조성물이 정맥내 투여되는 경우, 물이 바람직한 담체이다. 생리식염수 용액 및 수성 덱스트로즈 및 글리세롤 용액은 또한 액체 담체로서 사용될 수 있고, 특히 주사가능한 용액으로 사용될 수 있다. 적합한 약제학적 부형제는 전분, 글루코즈, 락토즈, 슈크로즈, 젤라틴, 맥아, 벼, 소맥분, 쵸크, 실리카겔, 나트륨 스테아레이트, 글리세릴 모노스테아레이트, 탈크, 염화나트륨, 건조 탈지 분유, 글리세린, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 부형제 및 이의 용도에 대해서는 또한 문헌[참조: "Handbook of Pharmaceutical Excipients", Fifth Edition, R. C. Rowe, P. J. Seskey and S. C. Owen, Pharmaceutical Press, London, Chicago]을 참조한다. 필요한 경우, 조성물은 또한 미량의 습윤제 또는 유화제 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 정제, 환제, 캘슐제, 분말, 지속 방출 제제 등의 형태일 수 있다. 경구 제형은 표준 담체, 예를 들면, 약제학적 등급의 만니톨, 락토즈, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 및 사카린을 함유할 수 있다.
본 발명의 항-PCSK9 항체를 포함하는 약제학적 제형은, 바람직하게는 동결건조된 제제 또는 수용액의 형태로, 목적하는 순도를 갖는 본 발명의 항-PCSK9 항체를 하나 이상의 임의의 약제학적 담체와 혼합함으로써 제조할 수 있다[참조: Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Ed., Osol, A., ed. (1980)].
예시적 동결건조된 항체 제형은 미국 특허 제6,267,958호에 기재되어 있다. 수성 항체 제형은 미국 특허 제6,171,586호 및 국제공보 제WO2006/044908호에 기재되어 있고, 후자는 히스티딘-아세테이트 완충제를 포함한다.
본 발명의 약제학적 조성물 또는 제형은, 치료되는 특정 징후에 요구되는 하나 이상의 활성 성분을 또한 함유할 수 있고, 바람직하게는 이들 활성 성분은 각각 다른 보완적 활성에 악영향을 미치지 않는다. 예를 들면, 스타틴을 추가로 제공하는 것이 바람직하다. 활성 성분은 적합하게는 의도된 용도에 적합한 양으로 조합하여 존재한다.
지속 방출 제형을 제조할 수 있다. 지속 방출 제형의 적합한 예는 항체를 함유하는 고체 소수성 폴리머의 반투과성 매트릭스를 포함하고, 상기 매트릭스는 필름 또는 마이크로캡슐 등의 성형품의 형태이다.
치료 방법 및 항체의 용도
한 가지 국면에서, 본 발명은 대상체에서 LDL-수용체(LDLR)에 대한 PCSK9의 결합을 저해하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 본원에 기재된 임의의 항-PCSK9 항체 또는 이의 단편의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 국면에서, 본 발명은 대상체에서 콜레스테롤 수준을 저하시키는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 본원에 기재된 임의의 항-PCSK9 항체 또는 이의 단편의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 한 가지 실시형태에서, 콜레스테롤은 LDL-콜레스테롤이다. 또 다른 국면에서, 본 발명은 대상체에서 LDL-콜레스테롤 수준을 저하시키는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 본원에 기재된 임의의 항-PCSK9 항체 또는 이의 단편의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 대상체에서 LDL-콜레스테롤의 혈청 수준을 저하시키는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 본원에 기재된 임의의 항-PCSK9 항체 또는 이의 단편의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 국면에서, 본 발명은 대상체에서 LDL-콜레스테롤 수준의 상승과 연관된 병태를 치료하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 본원에 기재된 임의의 항-PCSK9 항체 또는 이의 단편의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 한 가지 국면에서, 본 발명은 콜레스테롤-관련 질환을 치료하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 본원에 기재된 임의의 항-PCSK9 항체 또는 이의 단편의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 고콜레스테롤혈증 및/또는 고지혈증을 치료하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 본원에 기재된 임의의 항-PCSK9 항체 또는 이의 단편의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 한 가지 국면에서, 본 발명은 PCSK9의 활성을 배제, 저해 또는 저하시킴으로써 경감, 지연, 저해 또는 예방될 수 있는 임의의 질환 또는 병태를 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 스타틴에 의해 치료 또는 예방될 수 있는 질환 또는 병태는 본원에 기재된 임의의 항-PCSK9 항체 또는 이의 단편으로 또한 치료될 수 있다. 일부 실시형태에서, 콜레스테롤 합성의 예방 또는 증가된 LDLR 발현으로부터 유익할 수 있는 질환 또는 병태는 또한 본원에 기재된 임의의 항-PCSK9 항체 또는 이의 단편으로 치료될 수 있다. 바람직하게는, 대상체는 인간이다.
다른 국면에서, 본 발명은 상기 언급된 관련 질환 또는 병태의 치료를 위한 의약의 제조 또는 조제에서 항-PCSK9 항체의 용도를 제공한다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 PCSK9에 대한 항체 또는 항체 단편은 고콜레스테롤혈증, 고지혈증, 심혈관 질환의 개시 및/또는 임의의 콜레스테롤-관련 질환의 개시를 예방 또는 경감시키기 위해 예방적으로 투여할 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 PCSK9에 대한 항체 또는 항체 단편은 기존의 고콜레스테롤혈증 및/또는 고지혈증을 치료하기 위해 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 항체 단편은 병태 및/또는 해당 병태와 연관된 증상의 개시를 지연시킬 것이다.
특정 실시형태에서, 본원에 기재된 방법 및 용도는 개체에게 스타틴 등의 적어도 하나의 추가 치료제의 유효량을 투여하는 것을 추가로 포함하고, 이는 아토르바스타틴, 플루바스타틴, 로바스타틴, 메바스타틴, 피타바스타틴, 프라바스타틴, 로수바스타틴, 심바스타틴 또는 이의 임의의 조합, 예를 들면, VYTORIN®, ADVICOR® 또는 SIMCOR®을 포함하지만 이들로 한정되지 않는다. 특정 실시형태에서, 추가의 치료제는 아테롬성동맥경화증 및/또는 심혈관 질환의 예방 및/또는 치료에 사용된다. 특정 실시형태에서, 추가의 치료제는 심혈관 사상의 재발 위험을 감소시키기 위해 사용된다. 특정 실시형태에서, 추가의 치료제는 대상체에서 HDL-콜레스테롤 수준을 증가시키기 위해 사용된다.
상기 언급된 병용 요법은 동시-투여(여기서, 2개 이상의 치료제는 동일한 또는 별도의 제제에 포함된다) 및 별도의 투여를 포함하고, 여기서 본 발명의 항-PCSK9 항체의 투여는 추가 치료제/애쥬번트의 투여 전, 투여와 동시에 및/또는 투여 후에 발생할 수 있다.
본 발명의 항체(및 임의의 추가 치료제)는, 비경구, 폐내 및 비강내를 포함하는 임의의 적합한 수단에 의해, 및 국소 투여에 바람직한 경우, 병변내 투여에 의해 투여될 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 투여는, 투여가 어느 정도로 단기간 또는 장기간인지에 따라, 임의의 적합한 경로를 통해, 예를 들면, 정맥내 또는 피하 주사 등의 주사에 의해 이루어질 수 있다. 다양한 시점에 걸쳐 단일 또는 복수 투여, 볼루스 투여 및 펄스 주입을 포함하지만 이들로 한정되지 않는 투여를 위한 다양한 타이밍 코스가 본원에서 고려된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 본 발명의 항체의 적절한 투여량(단독으로 또는 하나 이상의 기타 치료제와 조합하여 사용하는 경우)은, 치료되는 질환의 종류, 항체의 종류, 질환의 중증도 및 절차, 항체를 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지의 여부, 이전 요법, 환자의 임상 병력 및 항체에 대한 반응, 및 주치의의 재량에 의존한다. 항체는 적합하게는 1회 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 투여된다. 항체를 위한 예시적 용량 범위는 3 내지 30mg/kg을 포함한다.
진단 및 검출을 위한 방법 및 조성물
특정 실시형태에서, 본원에 제공된 임의의 항-PCSK9 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 생물학적 샘플 중의 PCSK9의 존재를 검출하기 위해 사용할 수 있다. 본원에 사용되는 용어 "검출"은 정량적 또는 정성적 검출을 포함한다. 특정 실시형태에서, 생물학적 샘플은 혈액, 혈청 또는 생물 유래의 기타 액체 샘플이다. 특정 실시형태에서, 생물학적 샘플은 세포 또는 조직을 포함한다.
한 가지 실시형태에서, 진단 또는 검출 방법에 사용하기 위한 항-PCSK9 항체가 제공된다. 또 다른 국면에서, 생물학적 샘플 중의 PCSK9의 존재를 검출하는 방법이 제공된다. 특정 실시형태에서, 상기 방법은 생물학적 샘플 중의 PCSK9 단백질의 존재를 검출하는 것을 포함한다. 특정 실시형태에서, PCSK9는 인간 PCSK9이다. 특정 실시형태에서, 상기 방법은 생물학적 샘플을, PCSK9에 대한 항-PCSK9 항체의 결합을 가능하게 하는 조건하에, 본원에 기재된 항-PCSK9 항체와 접촉시키고, 복합체가 항-PCSK9 항체 및 PCSK9 사이에 형성되는지를 검출하는 것을 포함한다. 상기 방법은 시험관내 또는 생체내 방법일 수 있다. 한 가지 실시형태에서, 항-PCSK9 항체는 항-PCSK9 항체를 사용한 치료에 적합한 대상체를 선택하기 위해 사용되고, 예를 들면, PCSK9 또는 LDL-콜레스테롤은 환자를 선택하기 위한 생물마커이다.
한 가지 실시형태에서, 본 발명의 항체는 고콜레스테롤혈증 및/또는 고지혈증 등의 콜레스테롤-관련 질환의 진단을 위해 사용될 수 있다.
특정 실시형태에서, 표지된 항-PCSK9 항체가 제공된다. 표지는 직접 검출되는 표지 또는 부분(예를 들면, 형광 표지, 발색단 표지, 전자 밀도 표지, 화학발광 표지 및 방사성 표지), 뿐만 아니라 간접적으로 검출되는 부분, 예를 들면, 효소적 반응 또는 분자 상호작용에 의한 효소 또는 리간드를 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다. 예시적 표지는 방사성동위체 32P, 14C, 125I, 3H 및 131I, 형광물질, 예를 들면, 희토류 킬레이트 또는 플루오레세인 및 이들의 유도체, 로다민 및 이들의 유도체, 단실, 움벨리페론, 루시퍼라제, 예를 들면, 반딧불 루시퍼라제 및 세균 루시퍼라제(미국 특허 제4,737,456호), 플루오레세인, 2,3-디하이드로프탈아진디온, 호세라디쉬 퍼옥시다제(HR), 알칼린 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 용균 효소, 탄수화물 옥시다제, 예를 들면, 글루코즈 옥시다제, 갈락토즈 옥시다제 및 글루코즈-6-포스페이트 데하이드로게나제, 헤테로사이클릭 옥시다제, 예를 들면, 우리카제 및 크산틴 옥시다제, HR 등의 염료 전구체를 산화시키기 위해 과산화수소를 이용하는 플러스 효소, 락토퍼옥시다제, 또는 마이크로퍼옥시다제, 비오틴/친화성, 스핀 표지, 파지 표지, 안정한 유리 라디칼 등을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 설명되지만, 이들 실시예는 예시로서 이해되어야 하고 한정하는 것은 아니며, 당업자에 의해 다양한 변형이 이루어질 수 있다.
실시예
실시예 1 부모 항체를 측정하기 위한 항-PCSK9 항체의 스크리닝
항원의 비오틴 표지
PCSK9 항원(서열번호 53)은 제조업자의 지시에 따라 피어스(Pierce)로부터 입수가능한 석신이미딜 설포네이트 비오틴 표지 키트를 사용하여 비오틴으로 표지했다. FITC-표지된 염소 항-인간 면역글로불린 F(ab') 카파 쇄 항체(LC-FITC)는 서던 바이오테크(Southern Biotech)로부터 구입하고, 폴리에틸렌 아비딘(SA-PE)은 시그마(Sigma)로부터 구입하고, 스트렙트아비딘-633(SA-633)은 몰큘라 프로브(Molecular Probes)로부터 구입했다. 스트렙토마이신 비드 및 세포 면역 자기 비드 분리 컬럼은 밀테니 엘에스(Miltenyi LS)로부터 구입했다.
예비 스크리닝
8개 합성 효모-기반 항체 제시 라이브러리(Adimab으로부터 이용가능)을 기존 방법(Xu et al., 2013; WO2009036379; WO 2010105256; W02012009568)에 따라 증폭시키고, 각 라이브러리의 다양성은 최대 1×109이다. 요약하면, 최초 2라운드의 스크리닝은 MACS 시스템(Miltenyi)을 사용한 자기(magnetic) 활성화 세포 선별을 사용함으로써 실시했다. 우선, 각 라이브러리의 효모 세포(~1×1010 세포/라이브러리)를 15분 동안 실온에서 FACS 세척 완충액(0.1% 소 혈청 알부민을 함유하는 포스페이트 완충액)에서 인큐베이션하고, 여기서 상기 기재된 바와 같이 제조한 100nM 비오틴-표지된 PCSK9은 완충액에 함유되었다. 50ml의 예비-냉각된 FACS 세척 완충액으로 1회 세척하고, 세포를 40ml의 동일한 세척 완충액으로 재현탁시킨 다음, 500㎕의 스트렙토마이신 비드를 첨가하고, 4℃에서 5분 동안 인큐베이션했다. 1000rpm에서 5분 동안 원심분리한 후, 상청액을 버리고, 세포를 5ml의 FACS 세척 완충액에 재현탁시키고, 세포 용액을 밀테니(Miltenyi) LS 컬럼에 첨가했다. 로딩을 완료한 후, 컬럼을 FACS 세척 완충액(회당 3ml)으로 3회 세척했다. 밀테니 LS 컬럼을 자기 필드로부터 제거하고, 5ml의 성장 배지로 용출시키고, 용출된 효모 세포를 회수하고, 밤새 37℃에서 성장시켰다.
유동 세포계측기에 의해 후속 라운드의 선별을 수행하고; MACS 시스템을 사용한 스크리닝에 의해 수득된 대략 1 × 108 효모 세포를 FACS 완충액으로 3회 세척하고, PCSK9 항원 또는 저농도의 비오틴(100-1nM)으로 표지된 PCSK9-Fc 융합 항원에서 실온에서 인큐베이션했다. 배양 배지를 버리고, 세포를 FACS 세척 완충액으로 2회 세척했다. 이어서, 세포를 LC-FITC(1:100 희석)와 혼합하고, SA-633(1:500 희석) 또는 EA-PE(1:50 희석) 시약과 혼합하고, 4℃에서 15분 동안 인큐베이션했다. 예비-냉각된 FACS 세척 완충액으로 2회 용출시키고, 0.4ml 완충액에 재현탁시킨 다음, 세포를 필터가 구비된 분리 튜브로 옮겼다. 세포는 FACS ARIA(BD Biosciences)를 사용하여 선별했다.
이어서, 후속 라운드의 스크리닝을 실시하여 경쟁 리간드를 수득하고 비-특이적 결합(예를 들면, CHO 세포의 막 단백질)을 제거했다. 최종 라운드의 선별 후, 수집된 효모 세포를 플레이팅하고, 37℃에서 밤새 인큐베이션하고, 표적 단일 클론을 선택했다. 수득된 항체의 가변 영역을 생거(Sanger) 방법으로 서열분석했다. 독특한 가변 영역 서열을 갖는 합계 대략 310개 항체가 수득되었고, 이어서 하나씩 동정했다.
이들 항-PCSK9 항체 단백질은 효모 발현 및 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 사용한 정제를 통해 수득되었다.
항체의 생산 및 정제
스크리닝에 의해 수득된 항-PCSK9 항체를 발현하는 효모 세포를 진탕시키고, 30℃에서 48시간 동안 유도하여 항-PCSK9 항체를 발현시켰다. 유도 종류 후, 효모 세포를 10분 동안 1300rpm에서의 원심분리에 의해 제거하고, 상청액을 회수했다. 상청액에 존재하는 항-PCSK9 항체는 단백질 A를 사용하여 정제하고, 아세트산 용액(pH 2.0)으로 용출시키고, 항-PCSK9 항체를 회수했다. 항체를 파파인으로 소화시키고, KappaSelect(GE Life Medical Group)으로 정제하여 상응하는 Fab 단편을 수득했다.
항-PCSK9 항체를 코딩하는 유전자 DNA는, 당해 기술분야의 종래의 방법에 따라, 항-PCSK9 항체를 발현하는 상기 기재된 효모 세포로부터 수득하고, 유전자 DNA를 종래의 방법에 따라 신규한 발현 벡터(pCDNA3.1)에 클로닝시켰다.
목적 항체의 유전자를 함유하는 상기 발현 벡터 및 형질감염 시약 리포펙타민 TM2000(Invitrogen으로부터 구입)을 제조업자에 의해 제공된 프로토콜에 따라 배양된 인간 신장 아세포 293 세포에 일시적으로 형질감염시키고, 배지를 버리고, 세포를 신선한 배지를 사용하여 4×106/ml로 희석시켰다. 세포를 7일 동안 37℃에서 5% CO2와 함께 배양하고, 48시간 마다 신선한 배지를 첨가하고, 7일 후, 13,000rpm으로 20분 동안 원심분리했다. 상청액을 수집하고, 단백질 A로 정제하여 >95% 순도를 갖는 항체를 수득했다.
ForteBio KD 검정(바이오필름 층 층간섭법)
ForteBio 친화성 검정은 기존 방법에 따라 수행했다(Estep, P et al, High throughput solution Based measurement of antibody-antigen affinity and epitope binning. MAbs, 2013. 5(2): p. 270-8). 요약하면, 센서를 검정 완충액 중에서 30분 동안 오프-라인 평형화시킨 다음, 60초 동안 온-라인 시험하여 기준선을 확립했다. 상기 기재된 바와 같이 수득한 정제된 항체를 AHQ 센서에 온라인 로딩했다. 이어서, 센서를 5분 동안 100nM의 PCSK9 항원에 넣은 다음, 센서를 검정 완충액으로 옮겨 5분 동안 해리시켰다. 동력학적 분석은 1:1 결합 모델을 사용하여 수행했다.
MSD-SET 동적 검출
평형 친화성의 검출은 이전에 기재되어 있다(Estep et al. 2013). 상기 기재된 바와 같이 수득된 비오틴-표지된 PCSK9 항원(b-PCSK9)은 0.1% IgG-비함유 BSA를 함유하는 인산염 완충된 생리식염수(PBSF)에 10-100pM의 최종 농도까지 첨가했다. 상기 수득된 항-PCSK9 Fab 또는 mAb를 3 내지 5배 연속 희석시키고, 5-100nM의 농도를 갖는 Fab 또는 mAb 용액을 수득했다. 항체(20nM 인산염 완충된 생리식염수 중에서 희석)를 MSD-ECL 플레이트 상에 4℃에서 밤새 또는 실온에서 30분 동안 코팅했다. 3% BSA를 첨가하고, 실온에서 30분 동안 700rpm으로 차단시킨 다음, 세척 완충액(PBSF+0.05% Tween 20)으로 3회 세척했다. 샘플을 플레이트에 첨가하고, 진탕기에 넣고, 실온에서 700rpm으로 150초 동안 인큐베이션한 다음, 1회 세척했다. 250ng/ml의 설포태그-표지된 스트렙트아비딘(PBSF에서 희석)을 첨가하고, 실온에서 3분 동안 인큐베이션했다. 완충액으로 3회 세척한 후, 플레이트에 결합된 항원은 MSD 섹터 이미져 2400 판독 장치를 사용하여 측정했다. 미결합된 항원의 백분률은 항체 적정 방법에 의해 수득했다. 항원에 대한 항-PCSK9 Fab 또는 mAb의 결합은 약물동태 이차 방정식에 따르는 것으로 밝혀졌다.
결합 에피토프의 Octet Red384 동정
결합 에피토프의 동정은 표준 샌드위치-유형 상호작용식 차단 검정을 사용하여 수행했다. 표적-특이적 대조군 IgG를 AHQ 센서 상에 고정시키고, 센서 상에서 이용가능한 Fc 결합 부위를 무관계 인간 IgG1 항체로 차단시켰다. 센서를 120초 동안 100nM 표적 항원 PCSK9 용액에 넣은 다음, 상기한 바와 같이 제조한 제2 100nM 항-PCSK9 항체 또는 리간드 용액에 넣었다. 데이터를 판독하고, ForteBio 데이터 분석 소프트웨어 7.0(ForteBio)으로 처리했다. 항원이 항체와의 결합후 제2 항체 또는 리간드에 또한 결합할 수 있는 경우, 이는 비결합 에피토프(비-경쟁적)의 존재를 의미하고, 그렇지 않은 경우, 이는 에피토프가 차단(경쟁적 또는 리간드-차단됨)되었음을 의미한다.
상기 스크리닝 및 동정을 통해, 본 발명자들은 LDLR에 대한 PCSK9의 결합을 차단할 수 있고 인간 및 마우스 PCSK9 둘 다에 결합할 수 있는 일부 항체를 수득했다. 보다 높은 친화성을 갖는 항-PCSK9 항체를 수득하기 위해, 본 발명자들은 하기 방법에 의해 항체 ADI-02396을 최적화했다.
실시예 2 항-PCSK9 항체의 친화성 최적화
VHmut 스크리닝
돌연변이는 이 방법에서 종래의 부정합-PCR에 의해 항체 중쇄 영역에 도입했다. PCR 프로세스 동안, 염기 부정합의 확률은 1μM 고도 돌연변이된 염기 유사체 dPTP 및 8-옥소-dGTP를 사용하여 약 0.01bp로 증가시켰다.
수득된 부정합 PCR 생성물은 상동성 재조합에 의해 중쇄 불변 영역을 함유하는 벡터로 작제했다. 이러한 방식으로, 본 발명자들은, PCSK9 항원의 역가, 비표지 항원의 경쟁 및 부모 항체와의 경쟁을 포함하는 스크리닝 압력하에 1×107의 라이브러리 용량을 갖는 이차 라이브러리를 수득했다. 3라운드의 성공적 스크리닝을 FACS 방법에 의해 실시했다.
CDRH1/CDRH2 스크리닝
VHmut 방법에 의해 수득된 자손 항체의 CDRH3 유전자는 1×108의 다양성을 갖는 CDRH1/CDRH2 유전자 라이브러리로 작제하고, 3라운드의 스크리닝에 제공했다. 제1 라운드에서는 MACS 방법을 사용하고, 제2 및 제3 라운드에서는 FACS 방법을 사용했다. 항체-항원 접합체는 최고 친화성을 갖는 항체를 선택하기 위해 친화성 압력에 제공했다.
제1 라운드의 최적화: 제1 단계는 항-PCSK9 항체와 인간-뮤린 가교-활성 및 리간드-경쟁(ADI-02396("부모" 항체로서 명명됨))과의 친화성을 증가시키는 것이었다. 요약하면, 돌연변이를 부모 항체("부정합-PCR" 접근법을 사용)에 도입하여 효모-기반 항체 제시의 제2 라이브러리를 확립했다. 대략 1×107 크기를 갖는 제2 라이브러리는 최고 친화성을 갖는 항체의 후속 농후화를 위해 최종적으로 생성되었다. 스크리닝 압력은 PCSK9 항원의 역가, 비표지 항원의 경쟁, 및 부모 항체와의 경쟁을 포함했다. FACS 기술을 또한 사용하여 표적 모집단을 스크리닝했다[참조: Chao et al. Nature Protocols, 2006 for particular procedures]. 2 내지 3라운드의 농후화 후, 수득된 효모를 플레이팅하여 단일 클론을 수득했다. 이러한 작업 후, 개선된 친화성을 갖는 합계 3개 자손, 즉 ADI-09111, ADI-09112 및 ADI-09113을 수득했다. 이들 3개 항체의 KD 범위는 ForteBio Octet로 측정할 때 1-10nM이었다. 2개의 자손 항체, ADI-09112 및 ADI-09113는 제2 라운드의 최적화를 위해 사용했다.
제2 라운드의 친화성 최적화: 제2 단계는 인간-뮤린 가교-활성 및 리간드-경쟁을 갖는 2개 항-PCSK9 mAb, ADI-09112 및 ADI-9113("부모" 항체로서 명명됨)의 친화성을 증가시키는 것이었다. 요약하면, 효모-기반 항체 제시의 제2 라이브러리를 각 부모 항체에 대해 다시 생성했다. 부모 항체의 CDR-H3 및 경쇄(LC)를 기존 효모 라이브러리에 존재하는 유전자의 CDR-H1 및 CDR-H2와 조합했다("H1/H2" 최적화로서 명명). 궁국적으로, 대략 1×108 크기를 갖는 5개 라이브러리는, 보다 높은 친화성을 갖는 항체의 후속 농후화를 위해 생성했다. 스크리닝 방법은 제1 라운드의 스크리닝과 동일하다. 2-3 라운드의 농후화 후, 효모를 플레이팅하여 단일 클론을 수득했다. 이러한 작업 후, 개선된 친화성을 갖는 자손 항체를 수득했고, 이중 ADI-10085, ADI-10086 및 ADI-10087은 ADI-09912의 CDR-H1 및 CDR-H2 영역의 변이체이고, ADI-10088, ADI-10089 및 ADI-10090은 ADI-09113의 VH 영역의 변이체이다. 항체의 관련 서열 정보에 대해서는 표 B 내지 D를 참조한다. 인간 PCSK9를 위한 이들 항체의 친화성은 10배 증가했고, KD 범위는, ForteBio 방법 및 MSD-SET 검정에 의해 측정할 때, 4-17pM 내지 200pM이었다(표 1 및 표 2). 일부 항체는 대조군 항체의 친화성보다 약 10배 더 높은 친화성을 갖는다. 항체의 수는 임상전 개발을 위해 항체의 다른 기능을 동정함으로써 추가로 제한될 수 있다.
본 출원에서 언급되는 각 항-PCSK9 항체의 서열 정보 및 넘버링은 하기 표 B-D에 제시되어 있다:
[표 B]
본 출원의 각 예시적 항체를 위한 CDR 서열 넘버
Figure pct00002
[표 C]
본 출원의 각 예시적 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 프레임워크 영역 서열 번호
Figure pct00003
[표 D]
본 출원의 각 예시적 항체의 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역, 중쇄 및 경쇄의 서열 번호
Figure pct00004
[표 1]
ForteBio 방법에 의해 측정한 각 항체의 KD 값
Figure pct00005
[표 2]
MSD-SET 다이나믹스에 의해 측정한 각 항체의 KD 값
Figure pct00006
실시예 3 항-PCSK9 항체가 LDLR에 대한 PCSK9의 결합을 저해하는 검정
실시예 1에 기재된 PCSK9 단백질을 PBS 용액(인산염 완충 용액)으로 400nmol/L로 희석시키고, 작업 용액으로 사용했다. 실시예 2에서 수득한 항-PCSK9 항체(ADI-10085, ADI-10086, ADI-10087, ADI-10088, ADI-10089 및 ADI-10090)를 PBS 용액으로 각각 1000nmol/L, 100nmol/L, 10nmol/L, 1nmol/L 및 0.1nmol/L의 농도까지 희석했다. 다양한 농도의 대조군 항체(알리로쿠맵, 에볼로쿠맵, 보코시주맵 및 로델시주맵)의 용액을 동일한 방식으로 제조했다. PCSK9 작업 용액을 동일 용적의 각 구배-희석된 항-PCSK9 항체 샘플 또는 대조군 샘플과 혼합했다. LDLR을 과발현하는 CHO 세포(CHO-LDLR)를 PBS 용액에 재현탁시키고, 계수하고, 세포 농도를 PBS 용액으로 4×106 세포/ml로 조정하고, 웰당 2.0×105 세포로 96-웰 U-형상 세포 배양 플레이트에 파종하고, 50㎕의 세포 배양 배지를 각 웰에 첨가하고, 50㎕의 PCSK9 및 항-PCSK9 항체의 혼합물을 첨가하고, 200g에서 5분 동안 실온에서 원심분리하고, 상청액을 버렸다. 항-His-FITC(R&D Systems)을 2.5㎍/ml의 최종 농도까지 PBS 용액으로 1:200의 비율에서 희석한 다음, 96-웰 플레이트에 웰당 100㎕로 첨가하고, 빙욕에서 30분 동안 인큐베이션했다. 200g에서 5분 동안 실온으로 원심분리하고, 상청액을 온화하게 버리고, 150㎕의 PBS 용액을 각 웰에 첨가하고, 200g에서 5분 동안 실온에서 원심분리하고, 상청액을 온화하게 버리고, 이 절차를 3회 반복했다. 80㎕/웰 PBS 용액을 각 웰에 첨가하고, 세포를 수회 피펫팅하여 재현탁시켰다. 세포의 형광 신호 값을 유동 세포계측에 의해 측정했다.
이 실험에서 검출된 형광 신호는 하기 표 3에 제시되어 있다.
[표 3]
형광 신호 값
Figure pct00007
표 3의 생 데이터를 GraphPad Prism 6 소프트웨어로 분석하고, 표 1을 수득했다.
본 실험 결과는 항-PCSK9 항체가 대조군 항체와 비교하여 LDLR에 대한 PCSK9의 결합을 차단하는 필적하는 능력을 갖는 것을 나타낸다.
실시예 4 세포 LDL-c 흡수 검정
튜브 중의 동결보존된 HepG2 세포를 액체 질소 저장 탱크로부터 꺼내고, 37℃ 수욕에서 신속하게 해동시켰다. 세포 현탁액을 15ml 원심분리 튜브로 옮기고, 4ml의 성장 배지(90% DMEM + 10% FBS, 여기서 DMEM 및 FBS 둘 다는 Gibco로부터 구입했다)를 실온에서 서서히 첨가하고, 1000 r/분에서 5분 동안 실온에서 원심분리한 다음, 세포 펠렛을 신선한 성장 배지에 재현탁시키고, 배양 플라스크로 옮기고, 37℃에서 5% CO2하에 배양했다. 로그 성장 단계에서 HepG2 세포를 PBS 용액으로 2회 세척하고, 1ml의 0.25% 트립신(Gibco로부터 구입)을 첨가하고, 3분 동안 소화시키고, 6ml의 성장 배지를 첨가하여 세포를 재현탁시키고 반응을 종료시켰다. HepG2 세포는 성장 배지로 0.8×106 세포/ml로 조정하고, 흑색 투명 하부를 갖는 폴리-D-리신 코팅된 96-웰 세포 배양 플레이트에 웰당 100㎕로 접종하고, 인큐베이터에서 37℃로 5% CO2하에 6 내지 7시간 동안 인큐베이션했다. 성장 배지를 버리고, 100㎕/웰의 검정 배지(DMEM+5%FBS)로 교환하고, 인큐베이터에서 37℃로 5% CO2하에 밤새 인큐베이션했다. 항체 샘플(ADI-10085, ADI-10087, ADI-10088, ADI-10089)을 각각 검정 배지로 66.7nmol/L까지 희석했다. 이어서, 출발 농도로서 66.7nmol/L의 샘플을 사용하여 4배 구배 희석을 실시했다. 양성 대조군 항체(알리로쿠맵, 에볼로쿠맵 및 로델시주맵) 및 음성 대조군(LDL, PCSK9+LDL 및 IgG)을 동일한 조작에 제공했다. 각 농도 구배에서 60μl의 수득된 샘플을 동일 용적의 60μl의 66.7nmol/L의 PCSK9와 별도로 혼합하여 각각의 혼합물을 수득했다. 120㎕의 검정 배지를 블랭크 대조군으로 사용했다. 96-웰 플레이트 중의 액체를 흡인하여 버리고, 50㎕의 상기 혼합물 및 블랭크 대조군 샘플을 각 웰에 별도로 첨가하고, 인큐베이터에서 37℃로 5% CO2하에 1시간 동안 인큐베이션했다. 플레이트를 꺼내고, 검정 배지로 희석시킨 6㎍/ml BODIPY(life technologies로부터 구입)으로 표지한 50㎕의 LDL 용액을 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 37℃로 5% CO2하에 4시간 동안 인큐베이션했다. 배지를 버리고, 플레이트를 웰당 100㎕의 PBS 용액으로 세척했다. 2회 세척후 PBS 용액을 버린 다음, 100㎕ PBS 용액을 다시 각 웰에 첨가했다. 형광 값은 Spectra Max I3 플레이트 판독기를 사용하여 판독했다.
형광 값에 대해 수득한 생 데이터를 하기 표 4에 수록하고, 표 4에 개시된 데이터를 분석하여 GraphPad Prism 6 소프트웨어로 플롯팅하고, 도 2를 수득했다. 본 실험 결과로부터, 항-PCSK9 항체(ADI-10085, ADI-10087, ADI-10088, ADI-10089)는 항-PCSK9 항체의 부재하의 형광 값과 비교하여 HepG2 세포의 경우에 약 2배 형광 값을 증강시킨 것으로 밝혀졌다. 이들 데이터는 본 출원에 개시된 각각의 항-PCSK9 항체가 LDLR을 복원하고 PCSK9에 의해 유도된 LDK-c 흡수의 감소를 저해하는 HepG2의 능력을 증가시킬 수 있고, 이에 의해 HepG2 세포에 의한 LDL-c의 흡수를 증가시킬 수 있음을 입증한다. 또한, 16.8nM 및 66.7nM에서 항체의 효과는 둘 다 양성 대조군 항체의 것보다 우수하다.
[표 4]
형광 신호 값
Figure pct00008
실시예 5 LDLR의 세포 내재화의 분석
PCSK9는 LDLR에 직접 결합하여 LDLR 내재화를 촉진시킬 수 있다. 간세포로 도입된 후, LDLR은 분해되는 리소좀으로 전송되고, 이에 의해 세포 표면 상에 발현된 LDLR을 감소시키고, LDL-c의 혈청 수준을 증가시킨다. 항-PCSK9 항체는 LDLR에 대한 PCSK9의 결합을 차단하고, 이에 의해 LDLR을 소비하는 PCSK9의 능력을 감소시킨다. 본 실험에서, CHO-LDLR 세포를 항-PCSK9 항체 및 PCSK9 단백질 용액과 함께 인큐베이션하고, LDLR의 형광 값을 상기 유동 세포계측에 의해 검출했다. 항-PCSK9 항체의 형광 값을 양성 대조군 항체(에볼로쿠맵)의 것과 비교하여 LDLR의 세포 내재화에 대한 항-PCSK9 항체의 생물학적 활성을 측정했다.
상기 PCSK9 단백질을 RPMI 1640 세포 배양 배지(Gibco)를 사용하여 50㎍/ml의 농도로 제조했다. 60㎕의 1000nm 항-PCSK9 항체(ADI-10085 및 ADI-10087)를 PCSK9(50㎍/ml) 용액과 균질하게 혼합하고, 30분 동안 인큐베이션했다. 양성 항체 대조군을 동일한 처리에 제공했다. CHO 세포 및 CHO-LDLR 세포를 각각 500g에서 3분 동안 실온으로 원심분리하고, PBS 용액에 재현탁시키고, 2×106 세포/ml의 세포 밀도로 조정하고, 96-웰 U-형상 플레이트에 100㎕/웰로 첨가했다. 상기 혼합된 샘플을 배양 플레이트에 사중으로 100㎕/웰로 첨가하고, 균질하게 피펫팅하고, 4℃에서 4시간 동안 인큐베이션했다. 이어서, 샘플을 200㎕의 PBS 용액으로 3회 세척하고, 500g에서 3분 동안 실온으로 원심분리했다. 5㎕의 항-LDLR-PE(Beijing Yiqiao Company, Cat No. 20131-R301-P)을 100㎕의 PBS 용액으로 희석시킨 다음, 96-웰 U-형상 플레이트에 웰당 100㎕로 첨가하고, 30분 동안 암 장소에서 인큐베이션했다. 세포를 200㎕의 PBS 용액으로 3회 세척하고, 500g에서 3분 동안 원심분리하고, 세포 배양 배지에 재현탁시켰다. CHO-LDLR 세포의 표면 상에 PE 형광-표지된 LDLR 단백질의 형광 신호를 유동 세포계측에 의해 검출했다. 실험 결과는 표 5에 제시되어 있다. 표 5의 생 데이터를 GraphPad Prism 6 소프트웨어로 분석하고, 도 3을 수득했다.
표 5의 결과로부터 볼 수 있는 바와 같이, 본 출원에서 수득된 항체는 세포 내재화로부터 LDLR을 효과적으로 방지한다.
[표 5]
형광 신호 값
Figure pct00009
실시예 6: 본 발명의 항-PCSK9 항체에 의해 인식된 에피토프
특성화 전에, 본 발명의 항-PCSK9 항체(ADI-10087이 본 실시예에서 사용되었고, 동일한 것이 또한 하기에서 사용되었다) 및 항원으로서 인간 PCSK9의 완전성 및 응집 수준은, CovalX HM4 상호작용 모듈(CovalX AG, Zurich, Switzerland)이 장착된 Ultrafelx III MALDI ToF ToF 질량 분광계(Bruker)를 사용하여 별도로 검출했다(실험 방법 및 결과 분석은 하기 섹션 A에 제시되어 있다). 항-PCSK9 항체 및 인간 PCSK9 사이의 어떠한 비-공유 중합도 검출되지 않았다. 인간 PCSK9(이하 PCSK9-WT로 지칭됨)은 59.983kDa(이하 환원된 PCSK9-WT로서 지칭됨) 및 13.749kDa의 2개 아단위의 비-공유 결합에 의해 형성된다.
A. 항체/항원 복합체의 특성화
1. 재료 및 방법
1.1 장치
복합체를 특성화하기 위해, CovalX HM4 상호작용 모듈이 구비된 Ultraflex III MALDI ToF ToF 질량 분광계(Bruker)를 사용하여 분자량을 측정했다.
CovalX 상호작용 모듈은 지시된 검출 시스템을 포함하고, 이는 최대 2MDa의 분자량에 대한 검출을 최적화하도록 설계되고, 나노몰 등급의 감도를 갖는다.
1.2 샘플 제조:
대조군 실험
항체/항원 복합체는 하기 농도로 제조했다:
Figure pct00010
1㎕의 수득된 항체/항원 혼합물을 1㎕의 시나핀산 매트릭스-과포화 용액(10mg/ml, 아세토니트릴/물(1:1, v/v), TFA 0.1%, K200 MALDI Kit에 의해 제공됨)과 혼합하고, 이로부터 1㎕를 MALDI 플레이트(SCOUT 384, AchorChip) 상에 스포팅했다. 실온에서 결정화한 후, 플레이트를 MALDI ToF 질량 분광계에 도입하고, 즉시 분석했다. 분석은 삼중으로 반복했다.
가교-결합 실험
대조군 실험(9㎕ 좌측)에 대해 제조한 혼합물은 CovalX's K200 MALDI MS 분석 키트를 사용하여 가교-결합에 제공했다. 9㎕의 항체/항원 혼합물을 1㎕의 K200 안정화제 시약(2mg/ml, CovalX AG, Zurich, Switzerland)와 혼합하고, 실온에서 180분 동안 인큐베이션했다. 이어서, 샘플은 대조군 시험과 동일하게 MALDI 분석용으로 제조했다.
1.3 고질량 MALDI MS 분석
MALDI ToF MS 분석은 CovalX HM4 상호작용 모듈을 사용하여 실시하고, 이는 표준 질소 레이저 이온 공급원을 구비하고, 0 내지 2000kDa의 상이한 질량 범위에 초점을 맞출 수 있다.
사용된 파라미터는 다음과 같다:
질량 분광계:
선형 및 양이온 모드
이온 공급원 1: 20kV
이온 공급원 2: 17kV
렌즈: 12 kV
펄스 이온 추출: 400ns
HM4:
게인 전압: 3.14kV
가속 전압: 20 kV
질량 분광계는 사용 전에 인슐린, BSA 및 IgG를 함유하는 단백질의 클러스터로 외부 질량 보정에 제공했다. 각 샘플에 대해, 3개 포인트를 분석했다(스폿당 300 레이저 샷). 제시된 스펙트로그램은 300 레이저 샷의 합계에 상응한다. MS 데이터는 CovalX 복합체 트랙커 분석 소프트웨어 버젼 2.0을 사용하여 분석했다.
2. 결과
2.1 항-PCSK9 항체/PCSK9-WT
2.1.1 상호작용 분석
대조군 실험
대조군 실험에서, 환원된 항원 PCSK9-WT 및 항-PCSK9 항체 둘 다를 검출했고, 검출된 분자량은 각각 MH+ = 59.716kDa 및 MH+ = 146.769kDa이었다(도 6, 대조군)
Figure pct00011
가교결합 실험
가교-결합 실험에서, 항체/항원 복합체는 가교-결합제 K200과 함께 180분 동안 인큐베이션하고, 분자량은 MALDI ToF로 측정했다. 가교-결합 후, 대조군 실험에서 검출된 2개의 피크에 추가하여, 4개의 추가 피크가 검출되었다: MH+ = 214.902kDa, MH+ = 229.111kDa, MH+ = 276.105kDa 및 MH+ = 290.815kDa(도 6, 가교-결합).
복합체 트랙커 소프트웨어를 사용하여, 본 발명자들은 대조군 및 가교-결합 스펙트로그램을 적층시켰고, 하기 조성을 갖는 4개의 비-공유 복합체를 해결했다(도 6, 적층):
Figure pct00012
3. 항체/항원 복합체 특성화의 결론
항체/항원 복합체의 특성화는 환원된 항원 PCSK9-WT 및 PCSK9-WT 둘 다가 항-PCSK9 항체에 결합할 수 있음을 나타냈다.
B. 항체/항원 복합체의 분자계면의 특성화(분자 계면)
항-PCSK9 항체와 항원 PCSK9-WT 사이의 결합 에피토프의 고분해능 측정을 위해, 항체/항원 복합체를 가교-결합제 DSS d0/d12와 함께 인큐베이션하고, 이어서 각각 트립신, 키모트립신, 아스파르테이트 N-말단 엔도뉴클레아제(Asp-N), 엘라스타제 및 서모리신으로 효소적 가수분해시키고, 효소적 가수분해 후에 수득된 가교-결합된 펩티드 단편을 고분해능 질량 분광분석(nLC-LTQ-Orbitrap MS/MS)을 사용하여 일렬로 접속된 나노-액상 크로마토그래피의 온라인 시스템에 의해 동정하고, XQuest 및 Stavrox 소프트웨어로 분석했다.
항원 PCSK9-WT 단독(항-PCSK9 항체 부재)에 대해, 가교-결합 및 서열 특성화의 분석을 수행했다(실험 단계는 하기 수록된 항체/항원 복합체에 대한 가교-결합 및 분석과 동일했다). 엔도뉴클레아제 효소적 가수분해 및 질량 분광 분석의 결과에 기초하여, PCSK9-WT의 동정된 서열 커버율은 88.77%였다. 상이한 단백질 엔도뉴클레아제 효소적 가수분해에 의해 동정된 아미노산 서열 및 펩티드는 도 7에 제시되어 있다. 이들 펩티드 및 항체/항원 복합체의 실험 결과를 통합하고, 분석하여 에피토프 동정의 정확성을 개선시켰다.
1. 재료 및 방법
1.1 장치
Ultimate 3000(Dionex) 나노-액상 크로마토그래피 시스템은 LTQ-Orbitrap XL 질량 분광계(Thermo Scientific)에 일렬로 접속시켰다.
1.2 샘플 제조:
항체/항원 복합체
0.5μM/4μM의 최종 농도를 갖는 항체/항원 혼합물을 수득하기 위해, 5㎕의 항체(1μM의 농도)를 5㎕의 항원 샘플(8μM의 농도)과 혼합했다. 혼합물을 37℃에서 180분 동안 인큐베이션했다.
Figure pct00013
가교-결합 반응
1mg DSS(d0) 가교-결합제(Thermo Scientific)를 1mg의 중수소화 DSS(d12) 가교-결합제(CovalX AG)와 혼합하고, 1ml의 DMF를 첨가하여 2mg/ml DSS d0/d12 용액을 수득했다. 10㎕의 사전 제조된 항체/항원 혼합물을 1㎕의 제조된 가교-결합제 DSS d0/d12 용액(2mg/ml)과 혼합하고, 가교결합을 위해 실온에서 180분 동안 인큐베이션했다.
환원/알킬화
10㎕의 사전 제조된 가교-결합된 항체/항원 복합체를 40㎕의 중탄산암모늄(25mM, pH 8.3)과 혼합하고, 2㎕의 DTT(500mM)를 첨가하고, 55℃에서 1시간 동안 인큐베이션했다. 인큐베이션 후, 2㎕의 요오도아세트아미드(1M)를 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 암실에서 인큐베이션했다. 인큐베이션 후, 120㎕의 단백질분해 완충액(각각 엔도뉴클레아제 생성물로부터 입수가능)을 첨가했다.
트립신 단백질분해
145㎕의 환원/알킬화된 가교-결합된 항체/항원 복합체를 0.70㎕의 트립신(Roche Diagnostic)과 100:1의 비율(단백질:효소, w/w)로 혼합하고, 밤새 37℃에서 인큐베이션했다.
키모트립신 단백질분해
145㎕의 환원/알킬화된 가교-결합된 항체/항원 복합체를 0.35㎕의 키모크립신(Roche Diagnostic)과 200:1의 비율(단백질:효소, w/w)로 혼합하고, 밤새 25℃에서 인큐베이션했다.
Asp-N 단백질분해
145㎕의 환원/알킬화된 가교-결합된 항체/항원 복합체를 0.35㎕의 Asp-N(Roche Diagnostic)과 200:1의 비율(단백질:효소, w/w)로 혼합하고, 밤새 37℃에서 인큐베이션했다.
엘라스타제 단백질분해
145㎕의 환원/알킬화된 가교-결합된 항체/항원 복합체를 0.70㎕의 엘라스타제(Roche Diagnostic)와 100:1의 비율(단백질:효소, w/w)로 혼합하고, 밤새 37℃에서 인큐베이션했다.
서모리신 단백질분해
145㎕의 환원/알킬화된 가교-결합된 항체/항원 복합체를 1.40㎕의 서모리신(Roche Diagnostic)과 50:1의 비율(단백질:효소, w/w)로 혼합하고, 밤새 70℃에서 인큐베이션했다.
밤새 단백질분해 후, 반응은 1% 포름산의 첨가에 의해 정지시켰다.
nLC-LTQ-Orbitrap MS/MS 분석
10㎕의 단백질분해 펩티드 용액을 TQ-Orbitrap XL(Thermo Scientific)에 일렬로 온라인 접속된 나노-액상 크로마토그래피 시스템(Ultimate 3000, Dionex)에 주입하고, 펩티드 단편을 동정했다. 액체 크로마토그래피 및 질량 분광분석을 위한 작동 파라미터는 다음과 같다:
Figure pct00014
Figure pct00015
데이터 분석
가교-결합된 펩티드 단편은 Xquest 버젼 2.0 및 Stavrox 2.1 소프트웨어를 사용하여 분석했다.
2. 결과
2.1.1 트립신 단백질분해
항-PCSK9 항체와 항원 PCSK9 사이에 가교결합된 펩티드 단편은, DSS d0/d12에 의해 트립신과 가교결합된 항체/항원 복합체의 단백질분해 후, nLC-LTQ-Orbitrap MS/MS 분석에 의해 검출했다. 이러한 가교-결합된 펩티드 단편은 Xquest 또는 Stavrox 소프트웨어로 검출할 수 있다.
Figure pct00016
2.1.2 키모트립신 단백질분해
항-PCSK9 항체와 항원 PCSK9 사이에 가교-결합된 6개 단백질 단편은, DSS d0/d12에 의해 키모트립신과 가교-결합된 항체/항원 복합체의 단백질분해 후, nLC-LTQ-Orbitrap MS/MS 분석에 의해 검출했다. 이들 가교-결합된 펩티드 단편은 Xquest 또는 Stavrox 소프트웨어로 검출할 수 있다.
Figure pct00017
2.1.3 Asp-N 단백질분해
항-PCSK9 항체와 항원 PCSK9 사이에 가교-결합된 펩티드 단편은, DSS d0/d12에 의해 Asp-N과 가교-결합된 항체/항원 복합체의 단백질분해 후, nLC-LTQ-Orbitrap MS/MS 분석에 의해 검출되지 않았다.
2.1.4 엘라스타제 단백질분해
항-PCSK9 항체와 항원 PCSK9 사이에 가교-결합된 펩티드 단편은, DSS d0/d12에 의해 엘라스타제와 가교-결합된 항체/항원 복합체의 단백질분해 후, nLC-LTQ-Orbitrap MS/MS 분석에 의해 검출되지 않았다.
2.1.5 서모리신 단백질분해
항-PCSK9 항체와 항원 PCSK9 사이에 가교-결합된 펩티드 단편은, DSS d0/d12에 의해 서모리신과 가교-결합된 항체/항원 복합체의 단백질분해 후, nLC-LTQ-Orbitrap MS/MS분석에 의해 검출되지 않았다.
3. 결론
본 발명자들은, 화학적 가교-결합 및 nLC-LTQ-Orbitrap MS/MS 분석에 의해 항-PCSK9 항체와 항원 PCSK9 사이의 상호작용 계면을 특성화할 수 있다.
본 발명자들의 분석은 모노클로날 항체의 에피토프가 다음과 같이 몇몇 PCSK9 아미노산 부위에 의해 형성된 영역을 포함하는 것을 나타낸다: 위치 48(티로신)(서열번호 53에 제시된 인간 PCSK9의 Y78에 상응), 위치 56(트레오닌)(서열번호 53에 제시된 인간 PCSK9의 T86에 상응), 위치 57(히스티딘)(서열번호 53에 제시된 인간 PCSK9의 H87에 상응) 및 위치 74(아르기닌)(서열번호 53에 제시된 인간 PCSK9의 R104에 상응). 결과는 도 8에 제시되어 있다.
항원 PCSK9에 결합할 수 있는 항-PCSK9 항체 상의 부위는 항체 경쇄의 위치 24(상보성 결정 영역 1) 상의 아르기닌, 위치 26(상보성 결정 영역 1) 상의 세린, 위치 28(상보성 결정 영역 1) 상의 세린 및 위치 96(상보성 결정 영역 2) 상의 페닐알라닌, 및 중쇄의 위치 102(상보성 결정 영역 3) 상의 세린을 포함한다.
실시예 7 건강한 SD 랫트의 혈중 지방의 저하에 대한 항-PCSK9 항체의 효과
시험되는 항체(항-PCSK9 항체 ADI-10087)를 당해 기술분야의 종래의 방법에 따라 SPF 등급 SD 랫트에게 투여하고, 여기서 암컷 랫트는 중량이 약 254 내지 294g이고 약 9 내지 12주령이었고; 수컷 랫트는 중량이 약 369 내지 420g이고 약 9 내지 12주령이었다. 각 그룹은 단일 용량으로 투여했고, 용량 섭생은 표 6에 제시되어 있다.
[표 6]
용량 및 투여
Figure pct00018
각 그룹의 동물은 하기 시점에서 종래의 방법에 따라 경정맥 채혈을 실시했다: 투여전 0h(D1), 투여후 72h(D4), 168h(D8), 336h(D15), 504h(D22), 672h(D29) 및 840h(D36). 항응고제를 함유하지 않는 시험관에 혈액을 수집하고, 응고시키기 위해 아이스 상에 위치시킨 다음, 5000rpm/분에서 2 내지 8℃로 10분 동안 원심분리했다. 혈청을 수집하고, LDL-C 및 HDL-C를 Hitachi-7060 자동 생화학 분석기로 측정했다. 투여전의 것들(기준선)과 비교하여 각 시점에서 LDL-C 및 HDL-C의 변화율(% LDL-C 및 % HDL-C)를 혈중 지방의 분석 데이터에 따라 계산했다. 실험 결과로부터, LDL-C 및 HDL-C의 혈청 수준은 랫트에서 본 발명의 3 내지 30mg/kg 항-PCSK9 항체의 단일 피하 투여 후에 용량-의존적으로 감소하는 것으로 밝혀졌다(도 9 및 도 10). 예를 들면, 기준선 수준과 비교하여 투여후 3일, 7일, 14일 및 21일에서 유의적으로 감소했다. 또한, LDL-C 및 HDL-C의 혈청 수준은 랫트에서 10mg/kg 에볼로쿠맵의 단일 투여 후에 유의적으로 감소하지 않는 것으로 밝혀졌다.
상기 방법은 또한 본 발명의 다른 항체의 측정에도 적용할 수 있다.
실시예 8 건강한 사이노몰구스의 혈중 지방의 저하에 대한 항-PCSK9 항체의 효과
시험되는 항체(항-PCSK9 항체 ADI-10087)를 당해 기술분야의 종래의 방법에 따라 사이노몰구스에게 투여했고, 여기서 암컷 동물은 체중이 약 2 내지 4kg이고 약 3 내지 5년령이었고; 수컷 동물은 체중이 약 3 내지 5kg이고 약 3 내지 5년령이었다. 용량 섭생은 표 7에 제시되어 있고, 여기서 그룹 1 내지 5는 단일 용량으로 투여했고, 그룹 6은 1주 1회 투여했고, 합계 4회 투여했다.
[표 7]
용량 및 투여
Figure pct00019
그룹 1 내지 5에 있어서, 혈액을 하기 시점에서 통상의 방법에 따라 피하 정맥 또는 약물을 투여한 사지 반대측의 전지 또는 후지의 사타구니 대퇴 동맥/사타구니 정맥으로부터 수집했다: 투여전 0h 및 투여후 24h(D2), 72h(D4), 120h(D6), 168h(D8), 336h(D15), 504h(D22), 672h(D29), 840h(D36), 1008h(D43), 1176h(D50) 및 1344h(D57). 그룹 6에 있어서, 혈액은 하기 시점에서 상기 방법에 따라 수집했다: 제1 투여전 0h 및 제1 투여후 24h(D2), 72h(D4), 120h(D6), 168h(D8, 제2 투여전), 336h(D15, 제3 투여전). 그리고, 혈액은 최종 투여전 0h, 최종 투여후 24h(D2), 72h(D4), 120h(D6), 168h(D8), 336h(D15), 504h(D22), 672h(D29), 840h(D36), 1008h(D43), 1176h(D50) 및 1344h(D57)에서 수집했다.
전체 혈액은 응고제 및 분리 겔을 함유하는 시험관에 수집하고, 응고시키기 위해 아이스 상에 위치시킨 다음, 5000rpm/분에서 2 내지 8℃로 10분 동안 원심분리했다. 혈액 샘플링을 종료한 후, 전체 콜레스테롤(TC), LDL-C 및 HDL-C를 측정했다. 투여전의 것들(기준선)과 비교하여 각 시점에서 LDL-C 및 HDL-C의 변화율(% LDL-C 및 % HDL-C)를 혈중 지방의 분석 데이터에 따라 계산했다. 실험 결과로부터, LDL-C(도 11) 및 TC(도 13)의 혈청 수준은 사이노몰구스에게 본 발명의 3, 10, 30mg/kg 항-PCSK9 항체(ADI-10087)의 단일 피하 후에 유의적으로 감소했고, 유의한 용량-효과 관계가 관찰되었고, 기준선 수준과 비교하여 투여후 3 내지 28일에서 유의적 감소가 있는 것으로 밝혀졌다. 이는 본원에 개시된 항체가 LDL-C 및 TC와 연관된 증상 및/또는 병태를 효과적으로 감소시키기 위해 사용될 수 있고, 예를 들면, 혈중 지방을 저하시키기 위해 사용될 수 있음을 나타낸다.
전체로서, 항-PCSK9 항체의 투여는 사이노몰구스에서 HDL-C의 혈청 수준에 유의적으로 영향을 미치지 않았다(도 12).
그러나, 본 발명자들은, 놀랍게도, 각각 본 출원의 10mg/kg 항-PCSK9 항체 및 에볼로쿠맵의 사이노몰구스에 대한 단일 피하 투여 후, 에볼로쿠맵 투여의 경우, 기준선 수준과 비교하여 LDL-C에서의 유의적 감소가 단지 14일 동안 지속되었고, 이는 본 출원의 항체의 투여후 21일보다 더욱 짧은 것을 밝혀냈다. 즉, LDL-C에서 유의한 감소를 유도한 본 출원의 항-PCSK9 항체에 대한 기간이 에볼로쿠맵에 대한 것보다 더욱 길었다.
상기 방법은 또한 본 발명의 다른 항체의 측정에도 적용할 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> INNOVENT BIOLOGICS (SUZHOU) CO., LTD. <120> ANTI-PCSK9 ANTIBODY AND APPLICATION THEREOF <130> IPA190815-CN <150> CN 201611210645.3 <151> 2016-12-24 <160> 53 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> heavy chain variable region CDR1 <400> 1 Gly Ser Ile Ser Ser Ser Ser Tyr Tyr Trp Gly 1 5 10 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> heavy chain variable region CDR2 <400> 2 Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 3 <211> 18 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> heavy chain variable region CDR3 <400> 3 Ala Arg Glu Gly Ser Gly Val Val Pro Ala Ala Gly Pro Asn Trp Phe 1 5 10 15 Asp Pro <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> light chain variable region CDR1 <400> 4 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> light chain variable region CDR2 <400> 5 Asp 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Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly 20 25 <210> 46 <211> 14 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> heavy chain variable region FR2 <400> 46 Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 1 5 10 <210> 47 <211> 30 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> heavy chain variable region FR3 <400> 47 Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys 1 5 10 15 Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 48 <211> 11 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> heavy chain variable region FR4 <400> 48 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 49 <211> 23 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> light chain variable region FR1 <400> 49 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys 20 <210> 50 <211> 15 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> light chain variable region FR2 <400> 50 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 51 <211> 32 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> light chain variable region FR3 <400> 51 Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 52 <211> 10 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> light chain variable region FR4 <400> 52 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 53 <211> 692 <212> PRT <220> <223> amino acid sequence of PCSK9 antigen <400> 53 Met Gly Thr Val Ser Ser Arg Arg Ser Trp Trp Pro Leu Pro Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Pro Ala Gly Ala Arg Ala Gln Glu 20 25 30 Asp Glu Asp Gly Asp Tyr Glu Glu Leu Val Leu Ala Leu Arg Ser Glu 35 40 45 Glu Asp Gly Leu Ala Glu Ala Pro Glu His Gly Thr Thr Ala Thr Phe 50 55 60 His Arg Cys Ala Lys Asp Pro Trp Arg Leu Pro Gly Thr Tyr Val Val 65 70 75 80 Val Leu Lys Glu Glu Thr His Leu Ser Gln Ser Glu Arg Thr Ala Arg 85 90 95 Arg Leu Gln Ala Gln Ala Ala Arg Arg Gly Tyr Leu Thr Lys Ile Leu 100 105 110 His Val Phe His Gly Leu Leu Pro Gly Phe Leu Val Lys Met Ser Gly 115 120 125 Asp Leu Leu Glu Leu Ala Leu Lys Leu Pro His Val Asp Tyr Ile Glu 130 135 140 Glu Asp Ser Ser Val Phe Ala Gln Ser Ile Pro Trp Asn Leu Glu Arg 145 150 155 160 Ile Thr Pro Pro Arg Tyr Arg Ala Asp Glu Tyr Gln Pro Pro Asp Gly 165 170 175 Gly Ser Leu Val Glu Val Tyr Leu Leu Asp Thr Ser Ile Gln Ser Asp 180 185 190 His Arg Glu Ile Glu Gly Arg Val Met Val Thr Asp Phe Glu Asn Val 195 200 205 Pro Glu Glu Asp Gly Thr Arg Phe His Arg Gln Ala Ser Lys Cys Asp 210 215 220 Ser His Gly Thr His Leu Ala Gly Val Val Ser Gly Arg Asp Ala Gly 225 230 235 240 Val Ala Lys Gly Ala Ser Met Arg Ser Leu Arg Val Leu Asn Cys Gln 245 250 255 Gly Lys Gly Thr Val Ser Gly Thr Leu Ile Gly Leu Glu Phe Ile Arg 260 265 270 Lys Ser Gln Leu Val Gln Pro Val Gly Pro Leu Val Val Leu Leu Pro 275 280 285 Leu Ala Gly Gly Tyr Ser Arg Val Leu Asn Ala Ala Cys Gln Arg Leu 290 295 300 Ala Arg Ala Gly Val Val Leu Val Thr Ala Ala Gly Asn Phe Arg Asp 305 310 315 320 Asp Ala Cys Leu Tyr Ser Pro Ala Ser Ala Pro Glu Val Ile Thr Val 325 330 335 Gly Ala Thr Asn Ala Gln Asp Gln Pro Val Thr Leu Gly Thr Leu Gly 340 345 350 Thr Asn Phe Gly Arg Cys Val Asp Leu Phe Ala Pro Gly Glu Asp Ile 355 360 365 Ile Gly Ala Ser Ser Asp Cys Ser Thr Cys Phe Val Ser Gln Ser Gly 370 375 380 Thr Ser Gln Ala Ala Ala His Val Ala Gly Ile Ala Ala Met Met Leu 385 390 395 400 Ser Ala Glu Pro Glu Leu Thr Leu Ala Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ile 405 410 415 His Phe Ser Ala Lys Asp Val Ile Asn Glu Ala Trp Phe Pro Glu Asp 420 425 430 Gln Arg Val Leu Thr Pro Asn Leu Val Ala Ala Leu Pro Pro Ser Thr 435 440 445 His Gly Ala Gly Trp Gln Leu Phe Cys Arg Thr Val Trp Ser Ala His 450 455 460 Ser Gly Pro Thr Arg Met Ala Thr Ala Val Ala Arg Cys Ala Pro Asp 465 470 475 480 Glu Glu Leu Leu Ser Cys Ser Ser Phe Ser Arg Ser Gly Lys Arg Arg 485 490 495 Gly Glu Arg Met Glu Ala Gln Gly Gly Lys Leu Val Cys Arg Ala His 500 505 510 Asn Ala Phe Gly Gly Glu Gly Val Tyr Ala Ile Ala Arg Cys Cys Leu 515 520 525 Leu Pro Gln Ala Asn Cys Ser Val His Thr Ala Pro Pro Ala Glu Ala 530 535 540 Ser Met Gly Thr Arg Val His Cys His Gln Gln Gly His Val Leu Thr 545 550 555 560 Gly Cys Ser Ser His Trp Glu Val Glu Asp Leu Gly Thr His Lys Pro 565 570 575 Pro Val Leu Arg Pro Arg Gly Gln Pro Asn Gln Cys Val Gly His Arg 580 585 590 Glu Ala Ser Ile His Ala Ser Cys Cys His Ala Pro Gly Leu Glu Cys 595 600 605 Lys Val Lys Glu His Gly Ile Pro Ala Pro Gln Glu Gln Val Thr Val 610 615 620 Ala Cys Glu Glu Gly Trp Thr Leu Thr Gly Cys Ser Ala Leu Pro Gly 625 630 635 640 Thr Ser His Val Leu Gly Ala Tyr Ala Val Asp Asn Thr Cys Val Val 645 650 655 Arg Ser Arg Asp Val Ser Thr Thr Gly Ser Thr Ser Glu Gly Ala Val 660 665 670 Thr Ala Val Ala Ile Cys Cys Arg Ser Arg His Leu Ala Gln Ala Ser 675 680 685 Gln Glu Leu Gln 690

Claims (21)

  1. 중쇄 가변 영역(HCVR) 및 경쇄 가변 영역(LCVR)을 포함하는 항-PCSK9 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서,
    상기 HCVR은 상보성 결정기 영역(CDR) HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, 상기 LCVR은 CDR LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고, 여기서 HCDR1은 서열번호 1, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 및 20으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성(identity) 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고; HCDR2는 서열번호 2, 14, 15, 16, 17 및 21로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고; HCDR3은 서열번호 3, 18, 19 및 22로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고; LCDR1은 서열번호 4의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고; LCDR2는 서열번호 5의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고; LCDR3은 서열번호 6의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지는, 항-PCSK9 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, 상기 중쇄 가변 영역 HCVR이 서열번호 23, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 및 33으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 경쇄 가변 영역 LCVR이 서열번호 24의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  4. 제1항에 있어서, 중쇄를 포함하고, 상기 중쇄는 서열번호 34, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 및 44로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  5. 제1항 또는 제4항에 있어서, 경쇄를 포함하고, 상기 경쇄는 서열번호 35의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  6. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 모노클로날 항체(monoclonal antibody)인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  7. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 인간화 항체 또는 인간 항체인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  8. 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 단편이 Fab, Fab'-SH, Fv, scFv 또는 (Fab')2 단편으로부터 선택된 단편인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  9. 제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 있어서, 프레임워크 서열(framework sequence)을 포함하고, 상기 프레임워크 서열의 적어도 일부가 인간 컨센서스(consensus) 프레임워크 서열인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  10. 제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항의 항-PCSK9 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩(encoding)하는 단리된 핵산.
  11. 제10항의 핵산을 포함하는 벡터로서, 바람직하게는 상기 벡터가 발현 벡터인, 벡터.
  12. 제11항의 벡터를 포함하는 숙주 세포로서,
    바람직하게는, 상기 숙주 세포가 원핵생물 또는 진핵생물이고, 보다 바람직하게는 효모 세포, 포유동물 세포 또는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 제조에 적합한 또 다른 세포로부터 선택되는, 숙주 세포.
  13. 항-PCSK9 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제조하는 방법으로서,
    상기 방법은 제12항의 숙주 세포를, 제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항의 항-PCSK9 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 코딩하는 핵산의 발현에 적합한 조건하에 배양하는 단계, 임의로 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 단리하는 단계를 포함하고, 임의로 상기 방법은 숙주 세포로부터 항-PCSK9 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 회수하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  14. 제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항의 항-PCSK9 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 임의로 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
  15. 대상체에서 콜레스테롤 수준을 저하시키는 방법으로서,
    상기 방법은 제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항의 항-PCSK9 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하고, 바람직하게는 상기 콜레스테롤이 LDL-콜레스테롤이고, 보다 바람직하게는 혈청 LDL-콜레스테롤인, 방법.
  16. 대상체에서 콜레스테롤 관련 질환을 치료하는 방법으로서,
    상기 방법은 제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항의 항-PCSK9 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하고, 바람직하게는 상기 콜레스테롤 관련 질환이 고콜레스테롤혈증 및/또는 고지혈증인, 방법.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 제2 의약의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함하고, 항-PCSK9 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제1 의약이고, 바람직하게는 상기 제2 의약이 스타틴을 포함하고, 보다 바람직하게는 상기 스타틴이 아토르바스타틴, 플루바스타틴, 로바스타틴, 메바스타틴, 피타바스타틴, 프라바스타틴, 로수바스타틴, 심바스타틴 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  18. 대상체에서 LDLR에 대한 PCSK9의 결합을 저해하는 방법으로서,
    상기 방법은 제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항의 항-PCSK9 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  19. 샘플 중의 PCSK9 단백질을 검출하는 방법으로서, 상기 방법은
    (a) 샘플을 제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 접촉시키는 단계; 및
    (b) 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 PCSK9 단백질 사이의 복합체의 형성을 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
  20. PCSK9의 에피토프(epitope)에 결합하는, 항-PCSK9 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서,
    PCSK9의 상기 에피토프는 인간 PCSK9 아미노산 서열 서열번호 53의 잔기 Y78, T86, H87 및 R104 중의 하나 이상을 포함하는, 항-PCSK9 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  21. 제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 동일한 에피토프에 결합하는, 항-PCSK9 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
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