JP7167027B2 - 抗pcsk9抗体およびその使用 - Google Patents
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Description
本発明を以下に詳細に説明する前に、本発明は、本明細書に記載の特定の方法論、溶液および試薬に限定されず、これらは変更され得ることを理解されたい。本明細書において使用される用語は、特定の実施形態を説明することを目的とするものであり、添付の特許請求の範囲によって制限される本発明の範囲のみに限定することを意図していないことも理解される。本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、他に定義されない限り、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。
本発明の一つの態様において、抗PCSK9抗体およびその抗原結合フラグメントが本明細書において提供される。いくつかの実施形態において、抗PCSK9抗体は、PCSK9活性を阻害または遮断する。特定の実施形態において、本明細書において提供される抗体は、約1μM以下、約100nM以下、約10nM以下、約1nM以下、約0.1nM以下、約0.01nM以下または約0.001nM以下(例えば、10-8M以下、例えば、10-8M~10-13M、例えば、10-9M~10-13M)の平衡解離定数(KD)を有する。
一つの態様において、本発明によれば、上記の抗PCSK9抗体またはそのフラグメントのいずれかをコードする核酸が提供される。核酸は、抗体の軽鎖可変領域および/または重鎖可変領域を含むアミノ酸配列、または抗体の軽鎖および/または重鎖を含むアミノ酸配列をコードし得る。
本発明には、抗PCSK9抗体を含む組成物(医薬組成物または医薬製剤を含む)および抗PCSK9抗体をコードするポリヌクレオチドを含む組成物も包含される。特定の実施形態において、組成物は、PCSK9に結合する1つ以上の抗体、またはPCSK9に結合する1つ以上の抗体をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを含む。これらの組成物はまた、緩衝剤を含む、当技術分野において公知の薬学的賦形剤等の適切な薬学的に許容可能な担体を含み得る。
一つの態様において、本発明は、対象におけるPCSK9とLDL受容体(LDLR)との結合を阻害する方法に関し、該方法は、本明細書に記載の抗PCSK9抗体またはそのフラグメントのいずれかの有効量を対象に投与することを含む。別の態様において、本発明は、対象におけるコレステロールレベルを低下させる方法に関し、該方法は、本明細書に記載の抗PCSK9抗体またはそのフラグメントのいずれかの有効量を対象に投与することを含む。一つの実施形態において、コレステロールはLDL-コレステロールである。別の態様において、本発明は、対象におけるLDL-コレステロールレベルを低下させる方法に関し、該方法は、本明細書に記載の抗PCSK9抗体またはそのフラグメントのいずれかの有効量を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、本発明は、対象におけるLDL-コレステロールの血清レベルを低下させる方法に関し、該方法は、本明細書に記載の抗PCSK9抗体またはそのフラグメントのいずれかの有効量を対象に投与することを含む。別の態様において、本発明は、対象におけるLDL-コレステロールレベルの上昇に関連する状態を治療する方法に関し、該方法は、本明細書に記載の抗PCSK9抗体またはそのフラグメントのいずれかの有効量を対象に投与することを含む。一つの態様において、本発明は、コレステロール関連疾患を治療する方法に関し、該方法は、本明細書に記載の抗PCSK9抗体またはそのフラグメントのいずれかの有効量を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、本発明は、高コレステロール血症および/または高脂血症を治療する方法に関し、該方法は、本明細書に記載の抗PCSK9抗体またはそのフラグメントのいずれかの有効量を対象に投与することを含む。一つの態様において、本発明は、PCSK9の活性を排除、阻害または低下させることによって改善、遅延、阻害または予防され得る任意の疾患または状態を治療する方法に関する。いくつかの実施形態において、スタチンによって治療または予防することができる疾患または状態もまた、本明細書に記載の抗PCSK9抗体またはそのフラグメントのいずれかで治療することができる。いくつかの実施形態において、コレステロール合成の阻害またはLDLR発現の増大によりもたらされ得る疾患または状態もまた、本明細書に記載の抗PCSK9抗体またはそのフラグメントのいずれかで治療することができる。好ましくは、前記対象はヒトである。
特定の実施形態において、本明細書において提供される任意の抗PCSK9抗体またはその抗原結合フラグメントは、生物学的試料中のPCSK9の存在の検出に使用することができる。本明細書において使用される用語「検出」には、定量的または定性的な検出が包含される。特定の実施形態において、生物学的試料は、血液、血清または生物由来の他の液体試料である。特定の実施形態において、生物学的試料は細胞または組織を含む。
抗原のビオチン標識
Pierce社から入手可能なスクシンイミジルスルホネートビオチン標識キットを、製造業者の指示に従って使用することによって、PCSK9抗原(配列番号53)をビオチンで標識した。FITC標識ヤギ抗ヒト免疫グロブリンF(ab’)κ鎖抗体(LC-FITC)をSouthern Biotech社から購入し、ポリエチレンアビジン(SA-PE)をSigma社から購入し、ストレプトアビジン-633(SA-633)をMolecular Probes社から購入した。ストレプトマイシンビーズおよび細胞性免疫磁気ビーズ分離カラムは、Miltenyi LS社から購入した。
8つの合成酵母ベースの抗体提示ライブラリー(Adimab社から入手可能)を、既存の方法(Xu et al., 2013;WO2009036379;WO2010105256;W02012009568)に従って増幅し、各ライブラリーの多様性(diversity)を最大1×109とした。つまり、最初の2回のスクリーニングをMiltenyi社製のMACSシステムを用いた磁気活性化細胞選別を使用することによって実施した。まず、各ライブラリーからの酵母細胞(~1×1010細胞/ライブラリー)を、上記のように調製された100nMビオチン標識PCSK9抗原を含むFACS洗浄緩衝液(0.1%ウシ血清アルブミンを含有するリン酸緩衝液)中で、15分間室温でインキュベートした。予め冷却した50mlのFACS洗浄緩衝液で1回洗浄し、次いで、細胞を40mlの同じ洗浄緩衝液に再懸濁し、500μlのストレプトマイシンビーズを添加し、4℃で5分間インキュベートした。1000rpmで5分間遠心分離した後、上清を捨て、細胞を5mlのFACS洗浄緩衝液に再懸濁し、細胞溶液をMiltenyi LSカラムに充填した。充填が完了した後、FACS洗浄緩衝液でカラムを3回、1回につき3mlで洗浄した。Miltenyi LSカラムを磁場から外し、5mlの増殖培地で溶出し、溶出した酵母細胞を集めて37℃で一晩増殖させた。
スクリーニングにより得られた抗PCSK9抗体を発現する酵母細胞を振盪し、30℃で48時間誘導して抗PCSK9抗体を発現させた。誘導終了後、1300rpmで10分間遠心分離することにより酵母細胞を除去し、上清を回収した。上清中に存在する抗PCSK9抗体を、Protein Aを用いて精製し、酢酸溶液によりpH2.0で溶出し、抗PCSK9抗体を回収した。対応するFabフラグメントを得るために、抗体をパパインで消化し、KappaSelect(GE Life Medical Group社製)を用いて精製した。
既存の方法(Estep, P et al, High throughput solution Based measurement of antibody-antigen affinity and epitope binning. MAbs, 2013. 5(2): p. 270-8)に従って、ForteBio Affinity Assayを実施した。つまり、センサーをアッセイ緩衝液中で、30分間オフラインで平衡化し、次いで、60秒間オンラインで試験してベースラインを確立した。上記のようにして得られた精製抗体をAHQセンサーにオンラインで充填した。次いで、センサーを、100nMのPCSK9抗原に5分間入れた後、センサーをアッセイ緩衝液に移して5分間解離させた。動力学的分析を、1:1結合モデルを用いて行った。
平衡親和性の検出は、これまでに記載されている(Estep et al. 2013)。上記のようにして得られたビオチン標識PCSK9抗原(b-PCSK9)を、最終濃度10~100pMの0.1%IgG不含BSAを含有するリン酸緩衝食塩水(PBSF)に添加した。上記で得られた抗PCSK9 FabまたはmAbを3~5倍連続希釈し、5~100nMの濃度のFabまたはmAb溶液を得た。抗体(20nMリン酸緩衝食塩水で希釈)をMSD-ECLプレート上に4℃で一晩または室温で30分間コーティングした。3%BSAを添加し、700rpmで30分間室温でブロックし、次いで洗浄緩衝液(PBSF+0.05%Tween20)で3回洗浄した。試料をプレートに添加し、振盪機に入れ、700rpmで150秒間室温でインキュベートした後、1回洗浄した。250ng/mlのスルホタグ標識ストレプトアビジン(PBSF中に希釈)を添加し、室温で3分間インキュベートした。緩衝液で3回洗浄した後、プレートに結合した抗原をMsd Sector Imager 2400 Reader Deviceを用いて測定した。未結合抗原のパーセンテージを、抗体滴定法により得た。抗原への抗PCSK9 FabまたはmAbの結合が薬物動態学の二次方程式に従うことが見出された。
結合エピトープの同定は、標準的なサンドイッチ型の相互作用的遮断アッセイを用いて行われた。標的特異的対照IgGをAHQセンサー上に固定化し、センサー上の利用可能なFc結合部位を、無関係のヒトIgG1抗体でブロックした。センサーを100nMの標的抗原PCSK9溶液に120秒間入れ、次いで、上記のように調製した第2の100nMの抗PCSK9抗体またはリガンド溶液に入れた。データは、ForteBio Data Analysis Software 7.0(ForteBio社製)によって読み取り、処理を行った。抗原が抗体に結合した後に二次抗体またはリガンドにも結合することができるならば、未結合エピトープ(非競合)の存在を意味し、そうでなければ、エピトープが遮断された(競合またはリガンド遮断)ことを意味する。
VHmutスクリーニング
この方法では、従来のミスマッチPCRによって、抗体の重鎖領域に突然変異を導入した。PCRプロセスの間、1μMの高度に変異した塩基アナログdPTPおよび8-オキソ-dGTPを使用することにより、塩基ミスマッチの可能性を約0.01bpに増大させた。
VHmut法により得られた後代抗体のCDRH3遺伝子を、1×108の多様性を有するCDRH1/CDRH2遺伝子ライブラリーに組み込み、3回のスクリーニングに供した。1回目ではMACS法が使用され、2回目および3回目ではFACS法が使用された。抗体-抗原コンジュゲートを親和性圧力にかけて、最も高い親和性を有する抗体を選択した。
実施例1に記載のPCSK9タンパク質をPBS溶液(リン酸緩衝溶液)で400nmol/Lに希釈し、作業溶液として使用した。実施例2で得られた抗PCSK9抗体(ADI-10085、ADI-10086、ADI-10087、ADI-10088、ADI-10089およびADI-10090)を、PBS溶液でそれぞれ1000nmol/L、100nmol/L、10nmol/L、1nmol/Lおよび0.1nmol/Lの濃度に希釈した。様々な濃度の対照抗体(アリロクマブ、エボロクマブ、ボコシズマブおよびロデルシズマブ)の溶液を同じ方法により調製した。PCSK9作業溶液を、等容量の各勾配希釈抗PCSK9抗体試料または対照試料と混合した。LDLを過剰発現しているCHO細胞(CHO-LDLR)をPBS溶液に再懸濁、計数し、細胞濃度をPBS溶液で4×106細胞/mlに調整し、96ウェルU字型細胞培養プレートに1ウェル当たり2.0×105細胞となるように播種し、50μlの細胞培養培地を各ウェルに添加し、PCSK9および抗PCSK9抗体の混合物50μlを添加し、200gで、5分間室温で遠心分離し、上清を捨てた。抗His-FITC(R&D Systems社製)をPBS溶液で終濃度2.5μg/mlに1:200の比率で希釈し、次いで96ウェルプレートに100μl/ウェルとなるように添加し、氷浴中で30分間インキュベートした。室温で5分間、200gで遠心分離し、上清を静かに捨て、各ウェルに150μlのPBS溶液を添加し、室温で5分間、200gで遠心分離し、上清を穏やかに捨て、この手順を3回繰り返した。80μl/ウェルのPBS溶液を各ウェルに添加し、細胞を数回ピペッティングすることにより再懸濁した。細胞の蛍光シグナル値をフローサイトメトリーにより測定した。
凍結保存したチューブ内のHepG2細胞を液体窒素貯蔵タンクから取り出し、37℃の水浴で急速に解凍した。細胞懸濁液を15mlの遠心分離チューブに移し、4mlの増殖培地(90%DMEM+10%FBS、DMEMおよびFBSの両方ともGibco社から購入)を室温でゆっくりと添加し、室温で5分間、1000r/分で遠心分離し、次いで、細胞ペレットを新鮮な増殖培地に再懸濁し、培養フラスコに移し、5%CO2下、37℃で培養した。対数増殖期のHepG2細胞をPBS溶液で2回洗浄し、1mlの0.25%トリプシン(Gibco社から購入)を添加し、3分間消化し、6mlの増殖培地を添加して細胞を再懸濁し、反応を終結させた。HepG2細胞を増殖培地で0.8×106細胞/mlに調整し、黒色の透明底部を有するポリ-D-リジン被覆96ウェル細胞培養プレート(Nunc社から購入)に、1ウェルあたり100μLとなるように播種し、37℃、5%CO2で6~7時間インキュベートした。増殖培地を捨て、100μl/ウェルとなるようにアッセイ培地(DMEM+5%FBS)に交換し、インキュベーター中で、37℃、5%CO2で一晩インキュベートした。抗体試料(ADI-10085、ADI-10087、ADI-10088、ADI-10089)を、それぞれ66.7nmol/Lとなるようにアッセイ培地で希釈した。次いで、出発濃度が66.7nmol/Lの試料を使用して、4倍の勾配希釈を行った。陽性対照抗体(アリロクマブ、エボロクマブおよびロデルシズマブ)および陰性対照(LDL、PCSK9+LDLおよびIgG)を同じ操作に供した。得られた各濃度勾配の試料60μlを、等容量60μlの66.7nmol/LのPCSK9と別々に混合して、各混合物を得た。120μlのアッセイ培地をブランク対照として使用した。96ウェルプレート中の液体を吸引して捨て、50μlの上記混合物およびブランク対照試料を別々に各ウェルに添加し、インキュベーター中で、37℃、5%CO2で1時間インキュベートした。プレートを取り出し、アッセイ培地で希釈した6μg/mlのBODIPY(life technologies社から購入)で標識した50μlのLDL溶液を各ウェルに添加し、プレートを37℃、5%CO2で4時間インキュベートした。培地を捨て、プレートを1ウェル当たり100μlのPBS溶液で洗浄した。2回洗浄した後、PBS溶液を捨て、次いで、100μlのPBS溶液を各ウェルに再び添加した。Spectra Max I3プレートリーダーを用いて蛍光値を読み取った。
PCSK9は、LDLRに直接結合してLDLRの内在化を促進することができる。肝細胞に入った後、LDLRはリソソームに輸送されて分解され、それによって細胞表面に発現されるLDLRが減少し、LDL-cの血清レベルが増大する。抗PCSK9抗体は、PCSK9とLDLRとの結合を遮断し、それによってPCSK9がLDLRを消費する能力を低下させる。この実験において、CHO-LDLR細胞を抗PCSK9抗体およびPCSK9タンパク質溶液と共にインキュベートし、LDLRの蛍光値を上記のフローサイトメトリーによって検出した。抗PCSK9抗体の蛍光値を陽性対照抗体(エボロクマブ)の蛍光値と比較して、LDLRの細胞内在化に対する抗PCSK9抗体の生物学的活性を決定した。
特性解析を行う前に、本発明の抗PCSK抗体(この実施例ではADI-10087を使用した、以下、同じ抗体を使用した)の完全性、および抗原としてのヒトPCSK-9との凝集レベルを、CovalX HM4相互作用モジュール(CovalX AG製、スイス、チューリッヒ)を備えたUltrafelx III MALDI ToF ToF質量分析計(Bruker社製)を用いてそれぞれ検出した(実験方法および結果分析は、以下のセクションAに示される)。抗PCSK抗体とヒトPCSK9との間の非共有重合は検出されなかった。ヒトPCSK9(以下、PCSK9-WTと称する)は、59.983kDa(以下、PCSK9-WT還元(Reduced)と称する)および13.749kDaの2つのサブユニットの非共有結合によって形成される。
1.材料および方法
1.1 装置
複合体の特性解析を行うために、CovalX HM4相互作用モジュールを備えたUltraflex III MALDI ToF ToF質量分析計(Bruker社製)を用いて分子量を測定した。
対照実験用に調製した混合物(9μl左)を、CovalX社のK200 MALDI MS分析キットを用いて架橋に供した。9μlの抗体/抗原混合物と、1μlのK200 Sabilizer試薬(2mg/ml、CovalX AG製、チューリッヒ、スイス)と混合し、そして室温で180分間インキュベートした。その後、対照実験と同様に、試料をMALDI分析用に調製した。
標準的な窒素レーザーイオン源を備え、0~2000kDaの異なる質量範囲に焦点を合わせることができるCovalX HM4相互作用モジュールを使用して、MALDI ToF質量分析を行った。
質量分析計:
リニアおよび陽イオンモード
イオン源1:20kV
イオン源2:17kV
レンズ:12kV
パルスイオン抽出:400ns
HM4:
ゲイン電圧:3.14kV
加速電圧:20kV
2.1 抗PCSK9抗体/PCSK9-WT
2.1.1 相互作用分析
対照実験
対照実験では、抗原PCSK9-WT還元および抗PCSK9抗体の両方が検出され、検出された分子量は、それぞれMH+=59.716kDaおよびMH+=146.769kDaであった(図6、対照)。
架橋実験では、抗体/抗原複合体を架橋剤K200と180分間インキュベートし、分子量をMALDI ToFで測定した。架橋後、対照実験で検出された2つのピークに加えて、4つのさらなるピークが検出された:MH+=214.902kDa、MH+=229.111kDa、MH+=276.105kDaおよびMH+=290.815kDa(図6、架橋)。
抗体/抗原複合体の特性解析により、抗原PCSK9-WT還元およびPCSK9-WTの両方が抗PCSK9抗体に結合できることが明らかになった。
抗PCSK9抗体と抗原PCSK9-WTとの間の結合エピトープの高分解能決定のために、抗体/抗原複合体を架橋剤DSS d0/d12とインキュベートし、続いてトリプシン、キモトリプシン、アスパラギン酸N-末端エンドヌクレアーゼ(Asp-N)、エラスターゼおよびサーモリシンをそれぞれ用いて酵素加水分解し、酵素加水分解後に得られた架橋ペプチドフラグメントを、高分解能質量分析(nLC-LTQ-Orbitrap MS/MS)と直列的に接続されたナノ液相クロマトグラフィーのオンラインシステムによって同定し、XQuestおよびStavroxソフトウェアを用いて分析した。
1.1 装置
Ultimate 3000(Dionex社製)ナノ液相クロマトグラフィーシステムは、LTQ-Orbitrap XL質量分析計(Thermo Scientific社製)と直列的に接続された。
抗体/抗原複合体
最終濃度0.5μM/4μMの抗体/抗原混合物を得るために、5μLの抗体(濃度1μM)と5μLの抗原試料(濃度8μM)とを混合した。混合物を37℃で180分間インキュベートした。
1mgのDSS(d0)架橋剤(Thermo Scientific社製)と1mgの重水素化DSS(d12)架橋剤(CovalX AG製)とを混合し、1mlのDMFを添加して、2mg/mlのDSS d0/d12溶液を得た。予め調製した抗体/抗原混合物10μlと、調製した架橋剤DSS d0/d12溶液(2mg/ml)1μlとを混合して、架橋のために室温で180分間インキュベートした。
予め調製した架橋抗体/抗原複合体10μlと、40μlの重炭酸アンモニウム(25mM、pH8.3)とを混合し、2μlのDTT(500mM)を添加し、55℃で1時間インキュベートした。インキュベーション後、2μlのヨードアセトアミド(1M)を添加して、暗所にて室温で1時間インキュベートした。インキュベーション後、120μlのタンパク質分解緩衝液(各エンドヌクレアーゼ産物から入手可能)を添加した。
145μlの還元/アルキル化架橋抗体/抗原複合体と0.70μlのトリプシン(Roche Diagnostic社製)とを100:1(タンパク質:酵素、w/w)の比で混合し、37℃で一晩インキュベートした。
145μlの還元/アルキル化架橋抗体/抗原複合体と0.35μlのキモトリプシン(Roche Diagnostic社製)とを200:1(タンパク質:酵素、w/w)の比で混合し、25℃で一晩インキュベートした。
145μlの還元/アルキル化架橋抗体/抗原複合体と0.35μlのAsp-N(Roche Diagnostic社製)とを200:1(タンパク質:酵素、w/w)の比で混合し、37℃で一晩インキュベートした。
145μlの還元/アルキル化架橋抗体/抗原複合体と0.70μlのエラスターゼ(Roche Diagnostic社製)とを100:1(タンパク質:酵素、w/w)の比で混合し、37℃で一晩インキュベートした。
145μlの還元/アルキル化架橋抗体/抗原複合体と1.40μlのサーモリシン(Roche Diagnostic社製)とを50:1(タンパク質:酵素、w/w)の比で混合し、70℃で一晩インキュベートした。
10μlのタンパク質分解ペプチド溶液を、TQ-Orbitrap XL(Thermo Scientific社製)と直列的にオンラインで接続されたナノ液相クロマトグラフィーシステム(Ultimate 3000、Dionex社製)に注入し、ペプチドフラグメントを同定した。液体クロマトグラフィーおよび質量分析のためのランニングパラメータは以下の通りとした。
架橋ペプチドフラグメントを、Xquestバージョン2.0およびStavrox 2.1ソフトウェアを使用することによって分析した。
2.1.1トリプシンタンパク質分解
抗PCSK9抗体と抗原PCSK9との間で架橋されたペプチドフラグメントは、DSS d0/d12によって架橋された抗体/抗原複合体をトリプシンでタンパク質分解した後、nLC-LTQ-Orbitrap MS/MS分析によって検出された。この架橋ペプチドフラグメントは、XquestまたはStavroxソフトウェアのいずれかを用いて検出可能であった。
抗PCSK9抗体と抗原PCSK9との間で架橋された6つのペプチドフラグメントは、キモトリプシンを用いたDSS d0/d12によって架橋された抗体/抗原複合体のタンパク質分解の後、nLC-LTQ-Orbitrap MS/MS分析によって検出された。これらの架橋ペプチドフラグメントは、XquestまたはStavroxソフトウェアのいずれかを用いて検出可能であった。
抗PCSK9抗体と抗原PCSK9との間で架橋されたペプチドフラグメントは、DSS d0/d12によって架橋した抗体/抗原複合体をAsp-Nでタンパク質分解した後、nLC-LTQ-Orbitrap MS/MS分析によって検出されなかった。
抗PCSK9抗体と抗原PCSK9との間で架橋されたペプチドフラグメントは、DSS d0/d12によって架橋された抗体/抗原複合体をエラスターゼでタンパク質分解した後、nLC-LTQ-Orbitrap MS/MS分析によって検出されなかった。
抗PCSK9抗体と抗原PCSK9との間に架橋されたペプチドフラグメントは、DSS d0/d12によって架橋された抗体/抗原複合体をサーモリシンでタンパク質分解した後、nLC-LTQ-Orbitrap MS/MS分析によって検出されなかった。
本発明者らは、化学架橋およびnLC-LTQ-Orbitrap MS/MS分析によって、抗PCSK9抗体と抗原PSCK9との間の相互作用界面を特徴付けることができた。
試験対象の抗体(抗PCSK9抗体 ADI-10087)を、当技術分野の通常の方法に従ってSPFグレードのSDラットに投与した。雌ラットは、体重が約254~294gであり、約9~12週齢であり、雄ラットは、体重が約369~420gであり、約9~12週齢であった。各群に単回投与で投与した。投与レジメンを表6に示す。
試験対象の抗体(抗PCSK9抗体 ADI-10087)を、当技術分野の通常の方法に従ってカニクイザルに投与した。雌動物は、体重が約2~4kgであり、約3~5歳であり、雄動物の体重は約3~5kgで、約3~5歳であった。投与レジメンを表7に示す。群1~5には単回投与で投与され、群6には週1回投与され、全体で4回投与された。
Claims (18)
- 抗PCSK9抗体またはその抗原結合フラグメントであって、重鎖可変領域(HCVR)および軽鎖可変領域(LCVR)を含み、
(1)前記重鎖可変領域HCVRが配列番号23のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、かつ前記軽鎖可変領域LCVRが配列番号24のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、
(2)前記重鎖可変領域HCVRが配列番号25のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、かつ前記軽鎖可変領域LCVRが配列番号24のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、
(3)前記重鎖可変領域HCVRが配列番号26のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、かつ前記軽鎖可変領域LCVRが配列番号24のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、
(4)前記重鎖可変領域HCVRが配列番号27のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、かつ前記軽鎖可変領域LCVRが配列番号24のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、
(5)前記重鎖可変領域HCVRが配列番号28のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、かつ前記軽鎖可変領域LCVRが配列番号24のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、
(6)前記重鎖可変領域HCVRが配列番号29のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、かつ前記軽鎖可変領域LCVRが配列番号24のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、
(7)前記重鎖可変領域HCVRが配列番号30のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、かつ前記軽鎖可変領域LCVRが配列番号24のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、
(8)前記重鎖可変領域HCVRが配列番号31のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、かつ前記軽鎖可変領域LCVRが配列番号24のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、
(9)前記重鎖可変領域HCVRが配列番号32のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、かつ前記軽鎖可変領域LCVRが配列番号24のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、または、
(10)前記重鎖可変領域HCVRが配列番号33のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、かつ前記軽鎖可変領域LCVRが配列番号24のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、
前記抗体またはその抗原結合フラグメント。 - 重鎖および/または軽鎖を含み、前記重鎖が配列番号34、36、37、38、39、40、41、42、43および44から選択されるアミノ酸配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の同一性または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、かつ/または前記軽鎖が配列番号35のアミノ酸配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の同一性または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、請求項1に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 抗PCSK9抗体またはその抗原結合フラグメントであって、重鎖および軽鎖を含み、
(1)前記重鎖が配列番号34のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、前記軽鎖が配列番号35のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、
(2)前記重鎖が配列番号36のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、前記軽鎖が配列番号35のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、
(3)前記重鎖が配列番号37のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、前記軽鎖が配列番号35のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、
(4)前記重鎖が配列番号38のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、前記軽鎖が配列番号35のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、
(5)前記重鎖が配列番号39のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、前記軽鎖が配列番号35のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、
(6)前記重鎖が配列番号40のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、前記軽鎖が配列番号35のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、
(7)前記重鎖が配列番号41のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、前記軽鎖が配列番号35のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、
(8)前記重鎖が配列番号42のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、前記軽鎖が配列番号35のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、
(9)前記重鎖が配列番号43のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、前記軽鎖が配列番号35のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、または、
(10)前記重鎖が配列番号44のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、前記軽鎖が配列番号35のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、
前記抗体またはその抗原結合フラグメント。 - 請求項1~3のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントであって、配列番号53のヒトPCSK9のアミノ酸配列の残基Y78、T86、H87およびR104によって形成される領域を含むPCSK9のエピトープに結合する、前記抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項1~4のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 前記抗体がヒト化抗体またはヒト抗体である、請求項1~5のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 前記抗原結合フラグメントが、Fab、Fab’-SH、Fv、scFvまたは(Fab’)2フラグメントから選択されるフラグメントである、請求項1~6のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 請求項1~7のいずれか一項に記載の抗PCSK9抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする、単離された核酸。
- 請求項8に記載の核酸を含むベクターであって、好ましくは発現ベクターである、前記ベクター。
- 請求項8に記載の核酸または請求項9に記載のベクターを含む宿主細胞であって、好ましくは原核生物または真核生物であり、より好ましくは酵母細胞、哺乳動物細胞、または抗体もしくはその抗原結合フラグメントを調製するのに適した他の細胞から選択される、前記宿主細胞。
- 抗PCSK9抗体またはその抗原結合フラグメントを調製する方法であって、請求項1~7のいずれか一項に記載された抗PCSK9抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする核酸の発現に適した条件下で、請求項10に記載の宿主細胞を培養することを含み、任意に前記抗体またはその抗原結合フラグメントを単離することを含み、任意に宿主細胞から抗PCSK9抗体またはその抗原結合フラグメントを回収することをさらに含む、前記方法。
- 請求項1~7のいずれか一項に記載の抗PCSK9抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、医薬組成物。
- 対象におけるコレステロールレベルを低下させるため、または対象におけるコレステロール関連疾患を治療するため、または対象におけるPCSK9とLDLRとの結合を阻害するために使用される、請求項1~7のいずれか一項に記載の抗PCSK9抗体またはその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物であって、好ましくは前記コレステロールがLDL-コレステロール、より好ましくは血清LDL-コレステロールであり、または、好ましくは前記コレステロール関連疾患が高コレステロール血症または高脂血症である、前記医薬組成物。
- 前記医薬組成物が薬学的に許容可能な担体をさらに含む、請求項12または13に記載の医薬組成物。
- 前記医薬組成物がスタチンをさらに含み、好ましくは該スタチンがアトルバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、シンバスタチンおよびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項12または13に記載の医薬組成物。
- 対象におけるコレステロールレベルを低下させるため、または対象におけるコレステロール関連疾患を治療するため、または対象におけるPCSK9とLDLRとの結合を阻害するための医薬の製造における、請求項1~7のいずれか一項に記載の抗PCSK9抗体またはその抗原結合フラグメントの使用であって、好ましくは前記コレステロールがLDL-コレステロール、より好ましくは血清LDL-コレステロールであり、または、好ましくは前記コレステロール関連疾患が高コレステロール血症または高脂血症である、前記使用。
- 前記抗PCSK9抗体またはその抗原結合フラグメントが第2の医薬と組み合わせて投与され、好ましくは前記第2の医薬がLDLRタンパク質のレベルを増加させるか、または前記第2の医薬がLDL-コレステロールのレベルを低下させ、より好ましくは前記第2の医薬がスタチンを含み、最も好ましくは前記スタチンがアトルバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、シンバスタチンおよびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項16に記載の使用。
- 試料中のPCSK9タンパク質を検出する方法であって、
(a)試料と請求項1~7のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントとを接触させること、および
(b)前記抗体またはその抗原結合フラグメントとPCSK9タンパク質との複合体の形成を検出すること
を含む、前記方法。
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