KR20190094764A

KR20190094764A - 세균 메타게놈 분석을 통한 과민성장증후군 진단방법

Info

Publication number: KR20190094764A
Application number: KR1020180014305A
Authority: KR
Inventors: 김윤근
Original assignee: 주식회사 엠디헬스케어
Priority date: 2018-02-06
Filing date: 2018-02-06
Publication date: 2019-08-14
Also published as: WO2019156325A1; KR102063196B1

Abstract

본 발명은 세균 메타게놈 분석을 통해 과민성장증후군을 진단하는 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 피검체 유래 샘플을 이용해 세균 메타게놈 분석을 수행하여 특정 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 분석함으로써 과민성장증후군을 진단하는 방법에 관한 것이다.
장내에 존재하는 세균에서 분비되는 세포밖 소포는 체내에 흡수되어 염증 발생 및 장 기능에 직접적인 영향을 미칠 수 있으며, 과민성장증후군은 증상이 나타나기 전 조기진단이 어려워 효율적인 치료가 어려운 실정이므로, 본 발명에 따른 인체 유래 샘플을 이용한 세균 유래 세포밖　소포의 메타게놈 분석을 통해 과민성장증후군 발병의 위험도를 미리 예측함으로써 과민성장증후군의 위험군을 조기에 진단 및 예측하여 적절한 관리를 통해 발병 시기를 늦추거나 발병을 예방할 수 있으며, 발병 후에도 원인인자를 진단 할 수 있어, 원인인자를 조절하는 식품 또는 약물을 통해 과민성장증후군의 치료효과를 높일 수 있다.

Description

세균 메타게놈 분석을 통한 과민성장증후군 진단방법{Method for diagnosis of irritable bowel syndrome using analysis of bacteria metagenome}

본 발명은 세균 메타게놈 분석을 통해 과민성장증후군을 진단하는 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 피검체 유래 샘플을 이용해 세균 메타게놈 분석을 수행하여 특정 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 분석함으로써 과민성장증후군을 진단하는 방법에 관한 것이다.

과민성장증후군(過敏性腸症候群, irritable bowel syndrome)은 스트레스를 받거나 긴장을 하게 되는 상황에서 장의 운동이 비정상적으로 항진되어 경련성 복통과 설사·변비가 번갈아가며 일어나는 증상을 말한다. 대개 젊은 사람들, 특히 성인 초기의 젊은 여성에게 잘 나타나고, 40세 이후에는 발병률이 뚝 떨어진다. 우리나라의 경우에는 전체 연령에서 2.2% - 6.6% 정도의 유병률을 보이고, 특히 서울의 경우에는 유병률이 11.6%로 다른 지역에 비하여 높았다. 환자는 장에 불편감을 끊임없이 호소하지만 대장 X선 검사 등의 결과에서는 이상이 발견되지 않으므로 원인 파악과 치료가 쉽지 않다. 원인은 심리적 요인에 기인하는 것으로 인식하고 있고, 환자가 느끼는 일상의 불편감이 상당히 큰 데 비해 명확한 치료법은 알려진 바가 없고 다만 증세를 악화시키는 식품의 섭취를 제한하는 정도이다. 주된 증상은 복부 팽만감, 복통, 복부 불쾌감, 가스참, 트림 등이며 때론 소화불량, 가슴쓰림, 구역질 등의 증상을 호소하기도 한다. 최근 3개월 동안 3일 이상 복통이나 복부 불쾌감이 있으면서 아래 3가지 중 2개 이상 항목에 해당될 때 과민성장증후군을 의심해 볼 수 있다.

한편, 인체에 공생하는 미생물은 100조에 이르러 인간 세포보다 10배 많으며, 미생물의 유전자수는 인간 유전자수의 100배가 넘는 것으로 알려지고 있다. 미생물총(microbiota)은 주어진 거주지에 존재하는 세균(bacteria), 고세균(archaea), 진핵생물(eukarya)을 포함한 미생물 군집(microbial community)을 말하고, 장내 미생물총은 사람의 생리현상에 중요한 역할을 하며, 인체 세포와 상호작용을 통해 인간의 건강과 질병에 큰 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 우리 몸에 공생하는 세균은 다른 세포로의 유전자, 단백질 등의 정보를 교환하기 위하여 나노미터 크기의 소포(vesicle)를 분비한다. 점막은 200 나노미터(nm) 크기 이상의 입자는 통과할 수 없는 물리적인 방어막을 형성하여 점막에 공생하는 세균인 경우에는 점막을 통과하지 못하지만, 세균 유래 소포는 크기가 대개 100 나노미터 크기 이하라서 비교적 자유롭게 점막을 통화하여 우리 몸에 흡수된다.

환경 유전체학이라고도 불리는 메타게놈학은 환경에서 채취한 샘플에서 얻은 메타게놈 자료에 대한 분석학이라고 할 수 있다. 최근 16s 리보솜 RNA(16s rRNA) 염기서열을 기반으로 한 방법으로 인간의 미생물총의 세균 구성을 목록화하는 것이 가능해졌으며, 16s 리보솜 RNA의 유전자인 16s rDNA 염기서열을 차세대 염기서열분석 (next generation sequencing, NGS) platform을 이용하여 분석한다(Nature. 2007 Oct 18; 449(7164): 804-810). 그러나 과민성장증후군 발병에 있어서, 대변 등의 인체 유래물에서 세균 유래 소포에 존재하는 메타게놈 분석을 통해 과민성장증후군의 원인인자를 동정하고 과민성장증후군을 진단하는 방법에 대해서는 보고된 바가 없다.

본 발명자들은 과민성장증후군의 원인인자 및 발병 위험도를 미리 진단하기 위하여, 피검체 유래 샘플인 대변에 존재하는 세균 유래 세포밖 소포로부터 유전자를 추출하고 이에 대하여 메타게놈 분석을 수행하였으며, 그 결과 과민성장증후군의 원인인자로 작용할 수 있는 세균 유래 세포밖 소포를 동정하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 세균 유래 세포밖 소포에 대한 메타게놈 분석을 통해 과민성장증후군을 진단하기 위한 정보제공방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 과민성장증후군 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다:

(a) 피검체 샘플에서 분리한 세포밖 소포로부터 DNA를 추출하는 단계;

(b) 상기 추출한 DNA에 대하여 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및

(c) 상기 PCR 산물의 서열분석을 통하여 정상인 유래 샘플과 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계.

또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 과민성장증후군 진단방법을 제공한다:

또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 과민성장증후군의 발병 위험도 예측방법을 제공한다:

본 발명의 일 구현예로, 상기 피검체 샘플은 대변일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 (c) 단계에서 푸소박테리움균문(Fusobacteria), 시아노박테리아(Cyanobacteria), 및 프로테오박테리아(Proteobacteria)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 문(phylum) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 (c) 단계에서 푸소박테리아(Fusobacteriia), 클로로플라스트(Chloroplast), 베타프로테오박테리아(Betaproteobacteria), 및 감마프로테오박테리아(Gammaproteobacteria)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 강(class) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 (c) 단계에서 엔테로박테리아레스(Enterobacteriales), 푸소박테리아레스(Fusobacteriales), 나이세리아레스(Neisseriales), 파스테우렐라레스(Pasteurellales), 리조비알레스(Rhizobiales), 스트렙토피타(Streptophyta), 및 버크홀데리아레스(Burkholderiales)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 목(order) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 (c) 단계에서 옥살로박테라시에(Oxalobacteraceae), 노카르디아시에(Nocardiaceae), 리조비아시에(Rhizobiaceae), 엔테로박테리아시에(Enterobacteriaceae), 플라노코카시에(Planococcaceae), 나이세리아시에(Neisseriaceae), 락토바실라시에(Lactobacillaceae), 인트라스포란지아시에(Intrasporangiaceae), 파스퇴렐라시에(Pasteurellaceae), 및 폴피로모나다시에(Porphyromonadaceae)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 과(family) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 (c) 단계에서 쿠프리아비두스(Cupriavidus), 나이세리아(Neisseria), 시트로박터(Citrobacter), 로도코커스(Rhodococcus), 프로퇴스(Proteus), 락토바실러스(Lactobacillus), 헤모필러스(Haemophilus), 엔하이드로박터(Enhydrobacter), 파라박테로이데스(Parabacteroides), 투리시박터(Turicibacter), 언에어로트룬쿠스(Anaerotruncus), 및 스랙키아(Slackia)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 것일 수 있다.

장내에 존재하는 세균은 세포밖으로 소포를 분비하여 염증 및 장 기능에 직접적인 영향을 미칠 수 있으며, 과민성장증후군은 증상이 나타나기 전 조기진단이 어려워 효율적인 치료가 어려운 실정이므로, 본 발명에 따른 인체 유래 샘플을 이용한 세균 유래 세포밖　소포의 메타게놈 분석을 통해 과민성장증후군의 원인인자 및 발병의 위험도를 미리 진단함으로써 과민성장증후군의 위험군을 조기에 진단하여 적절한 관리를 통해 발병 시기를 늦추거나 발병을 예방할 수 있으며, 발병 후에도 조기진단 할 수 있어 과민성장증후군의 발병률을 낮추고 치료효과를 높일 수 있다. 또한, 과민성장증후군으로 진단받은 환자에서 메타게놈 분석을 통해 원인인자 노출을 피함으로써 질병의 경과를 좋게 하거나, 재발을 막을 수 있다.

도 1a은 마우스에 장내 세균과 세균유래 소포 (EV)를 구강으로 투여한 후, 시간별로 세균과 소포의 분포양상을 촬영한 사진이고, 도 1b는 구강으로 투여한 후 12시간째에, 대변 및 여러 장기를 적출하여, 세균과 소포의 체내 분포양상을 평가한 그림이다.
도 2는 과민성장증후군환자 및 정상인 대변에서 세균 유래 소포를 분리한 후, 메타게놈 분석을 수행하여 문(phylum) 수준에서 진단적 성능이 유의한 세균 유래 소포(EVs)의 분포를 나타낸 결과이다.
도 3은 과민성장증후군환자 및 정상인 대변에서 세균 유래 소포를 분리한 후, 메타게놈 분석을 수행하여 강(class) 수준에서 진단적 성능이 유의한 세균 유래 소포(EVs)의 분포를 나타낸 결과이다.
도 4는 과민성장증후군환자 및 정상인 대변에서 세균 유래 소포를 분리한 후, 메타게놈 분석을 수행하여 목(order) 수준에서 진단적 성능이 유의한 세균 유래 소포(EVs)의 분포를 나타낸 결과이다.
도 5는 과민성장증후군환자 및 정상인 대변에서 세균 유래 소포를 분리한 후, 메타게놈 분석을 수행하여 과(family) 수준에서 진단적 성능이 유의한 세균 유래 소포(EVs)의 분포를 나타낸 결과이다.
도 6은 과민성장증후군환자 및 정상인 대변에서 세균 유래 소포를 분리한 후, 메타게놈 분석을 수행하여 속(genus) 수준에서 진단적 성능이 유의한 세균 유래 소포(EVs)의 분포를 나타낸 결과이다.

본 발명은 세균 메타게놈 분석을 통해 과민성장증후군을 진단하는 방법에 관한 것으로서, 본 발명자들은 피검체 유래 샘플을 이용해 세균 유래 세포밖 소포로부터 유전자를 추출하고 이에 대하여 메타게놈 분석을 수행하였으며, 과민성장증후군의 원인인자로 작용할 수 있는 세균 유래 세포밖 소포를 동정하였다.

이에, 본 발명은 (a) 피검체 샘플에서 분리한 세포밖 소포로부터 DNA를 추출하는 단계;

(c) 상기 PCR 산물의 서열분석을 통하여 정상인 유래 샘플과 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계를 포함하는 과민성장증후군을 진단하기 위한 정보제공방법을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "과민성장증후군 진단" 이란 환자에 대하여 과민성장증후군이 발병할 가능성이 있는지, 과민성장증후군이 발병할 가능성이 상대적으로 높은지, 또는 과민성장증후군이 이미 발병하였는지 여부를 판별하는 것을 의미한다. 본 발명의 방법은 임의의 특정 환자에 대한 과민성장증후군 발병 위험도가 높은 환자로써 특별하고 적절한 관리를 통하여 발병 시기를 늦추거나 발병하지 않도록 하는데 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 과민성장증후군을 조기에 진단하여 가장 적절한 치료방식을 선택함으로써 치료를 결정하기 위해 임상적으로 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "메타게놈(metagenome)"이란 "군유전체"라고도 하며, 흙, 동물의 장 등 고립된 지역 내의 모든 바이러스, 세균, 곰팡이 등을 포함하는 유전체의 총합을 의미하는 것으로, 주로 배양이 되지 않는 미생물을 분석하기 위해서 서열분석기를 사용하여 한꺼번에 많은 미생물을 동정하는 것을 설명하는 유전체의 개념으로 쓰인다. 특히, 메타게놈은 한 종의 게놈 또는 유전체를 말하는 것이 아니라, 한 환경단위의 모든 종의 유전체로서 일종의 혼합유전체를 말한다. 이는 오믹스적으로 생물학이 발전하는 과정에서 한 종을 정의할 때 기능적으로 기존의 한 종뿐만 아니라, 다양한 종이 서로 상호작용하여 완전한 종을 만든다는 관점에서 나온 용어이다. 기술적으로는 빠른 서열분석법을 이용해서, 종에 관계없이 모든 DNA, RNA를 분석하여, 한 환경 내에서의 모든 종을 동정하고, 상호작용, 대사작용을 규명하는 기법의 대상이다. 본 발명에서는 바람직하게 대변에서 분리한 세균 유래 세포밖　소포를 이용하여 메타게놈 분석을 실시하였다.

본 발명의 실시예에서는 상기 세균 유래 세포밖 소포에 대한 메타게놈 분석을 실시하였으며, 문(phylum), 강(class), 목(order), 과(family), 및 속(genus) 수준에서 각각 분석하여 실제로 과민성장증후군 발생의 원인으로 작용할 수 있는 세균 유래 소포를 동정하였다.

보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 피검자 유래 대변 샘플에 존재하는 소포에 대하여 세균 메타게놈을 문 수준에서 분석한 결과, Fusobacteria, Cyanobacteria, 및 Proteobacteria 문 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 과민성장증후군환자와 정상인에 사이에 유의한 차이가 있었다(실시예 4 참조).

보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 피검자 유래 대변 샘플에 존재하는 소포에 대하여 세균 메타게놈을 강 수준에서 분석한 결과, Fusobacteriia, Chloroplast, Betaproteobacteria, 및 Gammaproteobacteria 강 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 과민성장증후군환자와 정상인에 사이에 유의한 차이가 있었다(실시예 4 참조).

보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 피검자 유래 대변 샘플에 존재하는 소포에 대하여 세균 메타게놈을 목 수준에서 분석한 결과, Enterobacteriales, Fusobacteriales, Neisseriales, Pasteurellales, Rhizobiales, Streptophyta, 및 Burkholderiales 목 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 과민성장증후군환자와 정상인에 사이에 유의한 차이가 있었다(실시예 4 참조).

보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 피검자 유래 대변 샘플에 존재하는 소포에 대하여 세균 메타게놈을 과 수준에서 분석한 결과, Oxalobacteraceae, Nocardiaceae, Rhizobiaceae, Enterobacteriaceae, Planococcaceae, Neisseriaceae, Lactobacillaceae, Intrasporangiaceae, Pasteurellaceae, 및 Porphyromonadaceae 과 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 과민성장증후군환자와 정상인에 사이에 유의한 차이가 있었다(실시예 4 참조).

보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 피검자 유래 대변 샘플에 존재하는 소포에 대하여 세균 메타게놈을 속 수준에서 분석한 결과, Cupriavidus, Neisseria, Citrobacter, Rhodococcus, Proteus, Lactobacillus, Haemophilus, Enhydrobacter, Parabacteroides, Turicibacter, Anaerotruncus, 및 Slackia 속 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 과민성장증후군환자와 정상인에 사이에 유의한 차이가 있었다(실시예 4 참조).

상기 실시예 결과를 통해 상기 동정된 세균 유래 세포밖 소포의 분포 변수가 과민성장증후군 발생 예측에 유용하게 이용될 수 있음을 확인하였다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 장내 세균 및 세균 유래 소포의 체내 흡수, 분포, 및 배설 양상 분석

장내 세균과 세균 유래 소포가 위장관을 통해 전신적으로 흡수되는 지를 평가하기 위하여 다음과 같은 방법으로 실험을 수행하였다. 마우스의 위장에 형광으로 표지한 장내세균과 장내 세균 유래 소포를 각각 50 μg의 용량으로 위장관으로 투여하고 0분, 5분, 3시간, 6시간, 12시간 후에 형광을 측정하였다. 마우스 전체 이미지를 관찰한 결과, 도 1a에 나타낸 바와 같이, 상기 세균(Bacteria)인 경우에는 전신적으로 흡수되지 않았지만, 세균 유래 소포(EV)인 경우에는, 투여 후 5분에 전신적으로 흡수되었고, 투여 3시간 후에는 방광에 형광이 진하게 관찰되어, 소포가 비뇨기계로 배설됨을 알 수 있었다. 또한, 소포는 투여 12시간까지 체내에 존재함을 알 수 있었다.

장내세균과 장내 세균유래 소포가 전신적으로 흡수된 후, 여러 장기로 침윤된 양상을 평가하기 위하여, 형광으로 표지한 50 μg의 세균과 세균유래 소포를 상기의 방법과 같이 투여한 다음 12시간째에 마우스로부터 대변(Blood), 심장(Heart), 폐(Lung), 간(Liver), 신장(Kidney), 비장(Spleen), 지방조직(Adipose tissue), 및 근육(Muscle)을 적출하였다. 상기 적출한 조직들에서 형광을 관찰한 결과, 도1b에 나타낸 바와 같이, 상기 장내 세균(Bacteria)은 각 장기에 흡수되지 않은 반면, 상기 장내 세균 유래 세포밖 소포(EV)는 대변, 심장, 폐, 간, 신장, 비장, 지방조직, 및 근육에 분포하는 것을 확인하였다.

실시예 2. 대변으로부터 소포 분리 및 DNA 추출

대변으로부터 소포를 분리하고 DNA를 추출하기 위해, 먼저 10 ㎖ 튜브에 대변을 넣고 원심분리(3,500 x g, 10min, 4℃)를 실시하여 부유물을 가라앉혀 상등액만을 회수한 후 새로운 10 ㎖ 튜브에 옮겼다. 0.22 ㎛ 필터를 사용하여 상기 회수한 상등액으로부터 세균 및 이물질을 제거한 후, 센트리프랩튜브(centripreigugal filters 50 kD)에 옮기고 1500 x g, 4℃에서 15분간 원심분리하여 50 kD 보다 작은 물질은 버리고 10 ㎖까지 농축 시켰다. 다시 한 번 0.22 ㎛ 필터를 사용하여 박테리아 및 이물질을 제거한 후, Type 90ti 로터로 150,000 x g, 4℃에서 3시간 동안 초고속원심분리방법을 사용하여 상등액을 버리고 덩어리진 pellet을 생리식염수(PBS)로 녹여 소포를 수득하였다.

상기 방법에 따라 대변으로부터 분리한 소포 100 ㎕를 100℃에서 끓여서 내부의 DNA를 지질 밖으로 나오게 한 후 얼음에 5분 동안 식혔다. 다음으로 남은 부유물을 제거하기 위하여 10,000 x g, 4℃에서 30분간 원심분리하고 상등액 만을 모은 후 Nanodrop을 이용하여 DNA 양을 정량하였다. 이후 상기 추출된 DNA에 세균 유래 DNA가 존재하는지 확인하기 위하여 하기 표 1에 나타낸 16s rDNA primer로 PCR을 수행하여 상기 추출된 유전자에 세균 유래 유전자가 존재하는 것을 확인하였다.

primer		서열	서열번호
16S rDNA	16S_V3_F	5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3'	1
16S rDNA	16S_V4_R	5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC-3'	2

실시예 3. 대변에서 추출한 DNA를 이용한 메타게놈 분석

상기 실시예 2의 방법으로 유전자를 추출한 후, 상기 표1에 나타낸 16S rDNA 프라이머를 사용하여 PCR을 실시하여 유전자를 증폭시키고 시퀀싱(Illumina MiSeq sequencer)을 수행하였다. 결과를 Standard Flowgram Format(SFF) 파일로 출력하고 GS FLX software(v2.9)를 이용하여 SFF 파일을 sequence 파일(.fasta)과 nucleotide quality score 파일로 변환한 다음 리드의 신용도 평가를 확인하고, window(20 bps) 평균 base call accuracy가 99% 미만(Phred score <20)인 부분을 제거하였다. 질이 낮은 부분을 제거한 후, 리드의 길이가 300 bps 이상인 것만 이용하였으며(Sickle version 1.33), 결과 분석을 위해 Operational Taxonomy Unit(OTU)은 UCLUST와 USEARCH를 이용하여 시퀀스 유사도에 따라 클러스터링을 수행하였다. 구체적으로 속(genus)은 94%, 과(family)는 90%, 목(order)은 85%, 강(class)은 80%, 문(phylum)은 75% 시퀀스 유사도를 기준으로 클러스터링을 하고 각 OTU의 문, 강, 목, 과, 속 레벨의 분류를 수행하고, BLASTN와 GreenGenes의 16S DNA 시퀀스 데이터베이스(108,453 시퀀스)를 이용하여 97% 이상의 시퀀스 유사도 갖는 박테리아를 분석하였다(QIIME).

실시예 4. 대변에서 분리한 세균유래 소포 메타게놈 분석 기반 과민성장증후군 진단모형

상기 실시예 3의 방법으로, 과민성장증후군환자 56명과 나이를 매칭한 정상인 56명의 대변에서 소포를 분리한 후 메타게놈 시퀀싱을 수행하였다. 진단모형 개발은 먼저 t-test에서 두 군 사이의 p값이 0.05 이하이고, 두 군 사이에 2배 이상 차이가 나는 균주를 선정하고 난 후, logistic regression analysis 방법으로 진단적 성능 지표인 AUC(area under curve), 민감도, 및 특이도를 산출하였다.

대변 내 세균유래 소포를 문(phylum) 수준에서 분석한 결과, Fusobacteria, Cyanobacteria, 및 Proteobacteria 문 세균 바이오마커로 진단모형을 개발하였을 때, 과민성장증후군에 대한 진단적 성능이 유의하게 나타났다 (표 2 및 도 2 참조).

	대조군		과민성장증후군		t-test
Taxon	Mean	SD	Mean	SD	p-value	Ratio	AUC	sensitivity	specificity
p__Fusobacteria	0.0016	0.0032	0.0003	0.0009	0.0065	0.20	0.78	0.70	0.70
p__Cyanobacteria	0.0040	0.0041	0.0013	0.0027	0.0001	0.32	0.82	0.73	0.75
p__Proteobacteria	0.2046	0.1789	0.0795	0.1378	0.0001	0.39	0.84	0.77	0.71

대변 내 세균유래 소포를 강(class) 수준에서 분석한 결과, Fusobacteriia, Chloroplast, Betaproteobacteria, 및 Gammaproteobacteria 강 세균 바이오마커로 진단모형을 개발하였을 때, 과민성장증후군에 대한 진단적 성능이 유의하게 나타났다 (표 3 및 도 3 참조).

	대조군		과민성장증후군		t-test
Taxon	Mean	SD	Mean	SD	p-value	Ratio	AUC	sensitivity	specificity
c__Fusobacteriia	0.0016	0.0032	0.0003	0.0009	0.0065	0.20	0.78	0.70	0.70
c__Chloroplast	0.0036	0.0042	0.0012	0.0027	0.0005	0.33	0.80	0.68	0.75
c__Betaproteobacteria	0.0195	0.0209	0.0065	0.0114	0.0001	0.33	0.81	0.71	0.68
c__Gammaproteobacteria	0.1637	0.1672	0.0607	0.1258	0.0004	0.37	0.83	0.73	0.73

대변 내 세균유래 소포를 목(order) 수준에서 분석한 결과, Enterobacteriales, Fusobacteriales, Neisseriales, Pasteurellales, Rhizobiales, Streptophyta, 및 Burkholderiales 목 세균 바이오마커로 진단모형을 개발하였을 때, 과민성장증후군에 대한 진단적 성능이 유의하게 나타났다 (표 4 및 도 4 참조).

	대조군		과민성장증후군		t-test
Taxon	Mean	SD	Mean	SD	p-value	Ratio	AUC	sensitivity	specificity
o__Enterobacteriales	0.0843	0.1143	0.0127	0.0207	0.0000	0.15	0.88	0.71	0.75
o__Fusobacteriales	0.0016	0.0032	0.0003	0.0009	0.0065	0.20	0.78	0.70	0.70
o__Neisseriales	0.0022	0.0039	0.0005	0.0013	0.0031	0.23	0.81	0.68	0.73
o__Pasteurellales	0.0029	0.0058	0.0008	0.0012	0.0092	0.27	0.78	0.75	0.68
o__Rhizobiales	0.0071	0.0099	0.0020	0.0046	0.0011	0.29	0.79	0.68	0.66
o__Streptophyta	0.0035	0.0041	0.0011	0.0026	0.0005	0.31	0.80	0.70	0.75
o__Burkholderiales	0.0162	0.0195	0.0056	0.0103	0.0006	0.35	0.80	0.71	0.68

대변 내 세균유래 소포를 과(family) 수준에서 분석한 결과, Oxalobacteraceae, Nocardiaceae, Rhizobiaceae, Enterobacteriaceae, Planococcaceae, Neisseriaceae, Lactobacillaceae, Intrasporangiaceae, Pasteurellaceae, 및 Porphyromonadaceae 과 세균 바이오마커로 진단모형을 개발하였을 때, 과민성장증후군에 대한 진단적 성능이 유의하게 나타났다 (표 5 및 도 5 참조).

	대조군		과민성장증후군		t-test
Taxon	Mean	SD	Mean	SD	p-value	Ratio	AUC	sensitivity	specificity
f__Oxalobacteraceae	0.0101	0.0164	0.0005	0.0028	0.0001	0.05	0.86	0.70	0.79
f__Nocardiaceae	0.0005	0.0010	0.0001	0.0002	0.0009	0.11	0.82	0.66	0.79
f__Rhizobiaceae	0.0029	0.0041	0.0004	0.0013	0.0000	0.13	0.83	0.66	0.77
f__Enterobacteriaceae	0.0843	0.1143	0.0127	0.0207	0.0000	0.15	0.88	0.71	0.75
f__Planococcaceae	0.0028	0.0052	0.0006	0.0012	0.0039	0.23	0.78	0.61	0.68
f__Neisseriaceae	0.0022	0.0039	0.0005	0.0013	0.0031	0.23	0.81	0.68	0.73
f__Lactobacillaceae	0.0153	0.0188	0.0036	0.0119	0.0002	0.24	0.84	0.73	0.79
f__Intrasporangiaceae	0.0011	0.0021	0.0003	0.0007	0.0073	0.24	0.78	0.71	0.64
f__Pasteurellaceae	0.0029	0.0058	0.0008	0.0012	0.0092	0.27	0.78	0.75	0.68
f__Porphyromonadaceae	0.0056	0.0073	0.0160	0.0222	0.0017	2.84	0.82	0.79	0.73

대변 내 세균유래 소포를 속(genus) 수준에서 분석한 결과, Cupriavidus, Neisseria, Citrobacter, Rhodococcus, Proteus, Lactobacillus, Haemophilus, Enhydrobacter, Parabacteroides, Turicibacter, Anaerotruncus, 및 Slackia 속 세균 바이오마커로 진단모형을 개발하였을 때, 과민성장증후군에 대한 진단적 성능이 유의하게 나타났다 (표 6 및 도 6 참조).

	대조군		과민성장증후군		t-test
Taxon	Mean	SD	Mean	SD	p-value	Ratio	AUC	sensitivity	specificity
g__Cupriavidus	0.0080	0.0140	0.0000	0.0001	0.0001	0.00	0.88	0.68	0.84
g__Neisseria	0.0014	0.0035	0.0001	0.0002	0.0054	0.05	0.86	0.70	0.80
g__Citrobacter	0.0044	0.0070	0.0003	0.0015	0.0001	0.07	0.83	0.71	0.77
g__Rhodococcus	0.0005	0.0010	0.0001	0.0002	0.0013	0.12	0.82	0.68	0.75
g__Proteus	0.0077	0.0214	0.0000	0.0000	0.0102	0.00	0.82	0.71	0.77
g__Lactobacillus	0.0147	0.0185	0.0036	0.0119	0.0003	0.24	0.83	0.75	0.79
g__Haemophilus	0.0021	0.0039	0.0006	0.0011	0.0097	0.29	0.78	0.71	0.66
g__Enhydrobacter	0.0059	0.0078	0.0020	0.0050	0.0026	0.34	0.79	0.71	0.68
g__Parabacteroides	0.0050	0.0069	0.0156	0.0223	0.0014	3.09	0.82	0.79	0.73
g__Turicibacter	0.0141	0.0375	0.0444	0.0937	0.0294	3.14	0.83	0.69	0.75
g__Anaerotruncus	0.0001	0.0005	0.0004	0.0010	0.0402	3.79	0.80	0.65	0.70
g__Slackia	0.0000	0.0002	0.0007	0.0021	0.0205	16.46	0.79	0.75	0.76

상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> MD Healthcare Inc. <120> Method for diagnosis of irritable bowel syndrome using analysis of bacteria metagenome <130> MP17-351 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16S rDNA_primer_F <400> 1 tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagcctacgg gnggcwgcag 50 <210> 2 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16S rDNA_primer_R <400> 2 gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acaggactac hvgggtatct aatcc 55

Claims

(a) 피검체 샘플에서 분리한 세포밖 소포로부터 DNA를 추출하는 단계;
(b) 상기 추출한 DNA에 대하여 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및
(c) 상기 PCR 산물의 서열분석을 통하여 정상인 유래 샘플과 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계를 포함하는, 과민성장증후군 진단을 위한 정보제공방법.
제1항에 있어서,
상기 (c) 단계에서 푸소박테리움균문(Fusobacteria), 시아노박테리아(Cyanobacteria), 및 프로테오박테리아(Proteobacteria)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 문(phylum) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
제1항에 있어서,
상기 (c) 단계에서 푸소박테리아(Fusobacteriia), 클로로플라스트(Chloroplast), 베타프로테오박테리아(Betaproteobacteria), 및 감마프로테오박테리아(Gammaproteobacteria)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 강(class) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
제1항에 있어서,상기 (c) 단계에서 엔테로박테리아레스(Enterobacteriales), 푸소박테리아레스(Fusobacteriales), 나이세리아레스(Neisseriales), 파스테우렐라레스(Pasteurellales), 리조비알레스(Rhizobiales), 스트렙토피타(Streptophyta), 및 버크홀데리아레스(Burkholderiales)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 목(order) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
제1항에 있어서,
상기 (c) 단계에서 옥살로박테라시에(Oxalobacteraceae), 노카르디아시에(Nocardiaceae), 리조비아시에(Rhizobiaceae), 엔테로박테리아시에(Enterobacteriaceae), 플라노코카시에(Planococcaceae), 나이세리아시에(Neisseriaceae), 락토바실라시에(Lactobacillaceae), 인트라스포란지아시에(Intrasporangiaceae), 파스퇴렐라시에(Pasteurellaceae), 및 폴피로모나다시에(Porphyromonadaceae)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 과(family) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
제1항에 있어서,
상기 (c) 단계에서 쿠프리아비두스(Cupriavidus), 나이세리아(Neisseria), 시트로박터(Citrobacter), 로도코커스(Rhodococcus), 프로퇴스(Proteus), 락토바실러스(Lactobacillus), 헤모필러스(Haemophilus), 엔하이드로박터(Enhydrobacter), 파라박테로이데스(Parabacteroides), 투리시박터(Turicibacter), 언에어로트룬쿠스(Anaerotruncus), 및 스랙키아(Slackia)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
제1항에 있어서,
상기 피검체 샘플은 대변인 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.