KR20190093104A - 염증성 피부 질환 개선을 위한 소듐서팩틴의 신규 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 소듐서팩틴의 신규 용도에 대한 것으로, 보다 상세하게는 소듐서팩틴의 염증성 피부 질환의 치료/개선 또는 피부 보습용 용도에 대한 것이다.
본 발명에 따른 소듐서팩틴은 자극물질에 의해 유도되는 NO나 염증성 사이토카인인 IL-6의 발현을 농도의존적으로 감소시킬 뿐만 아니라, 마우스모델이나 실제 인체 적용 시험에서 피부건조증, 습진, 가려움증, 홍반 완화 등의 효과를 나타내며, 아울러 피부장벽 강화 효과와 피부 보습효과를 제공하고 세포독성을 나타내지 않는바, 부작용을 유발하지 않는 염증성 피부질환의 좋은 치료전략으로써도 유용하다.

Description

염증성 피부 질환 개선을 위한 소듐서팩틴의 신규 용도{Novel Use of Sodium Surfactin for Improvement of Inflammatory Skin Diseases}

본 발명은 소듐서팩틴의 신규 용도에 대한 것으로, 보다 상세하게는 소듐서팩틴의 염증성 피부 질환의 치료/개선 또는 피부 보습용 용도에 대한 것이다.

소듐서팩틴(Sodium Surfactin)은 아미노산과 지방산으로 구성되는 펩타이드리피드로 바실러스 서브틸러스의 발효물로부터 생산된다. 이는 생물계 계면활성제로 알려져 있으며 쉽게 생분해되므로 환경친화적이다. 생물 계면활성제는 식품, 세제, 펄프 및 제지, 원유, 의약품, 화장품, 환경정화 등 응용될 수 있다. 아울러, 한국공개특허 10-2004-0055035는 소듐 서팩틴의 제조방법 및 제조된 서듐 서팩틴을 이용한 콜라겐 분해효소 저해 효과를 개시하고 있으나, 항염증 효과, 특히 염증성 피부 질환과 관련된 용도는 보고된 바 없다.

한편, 최근 생활환경 중 사람에 대한 위해요인이 점점 증가하고, 노령인구가 급격히 늘어나고 있다. 이에 각질층의 생성-탈락속도가 늦어지고, 각질형성세포의 지질합성능력이 저하되거나, 표피에서 정상적인 세포의 분열, 성숙 및 분화가 원활하지 않음으로 인해, 각질층의 보습인자와 지질의 양이 감소되어 정상적인 각질층의 기능을 유지하지 못하는, 즉 피부장벽기능이 와해된 피부를 갖고 있는 사람들도 증가추세에 있다.

이러한 비정상적인 표피세포의 분열, 분화로 인해 피부는 피부건조증, 아토피, 건선 등의 다양한 염증성 피부 질환을 유발하게 된다. 이러한 제 질환들은 자체로 수분보유기능만을 갖는 통상적인 보습제만으로는 단지 그 증상을 약간 완화시킬 수 있을 뿐이다. 즉, 그 근본적인 치유를 기대하기는 어려운 실정이다. 따라서 피부아토피, 피부건조증 및 습진 등과 같은 염증성 피부 질환을 치료 및 개선시키기 위한 조성물의 개발이 필요한 시점이다. 이에 알레르기성 피부염이나 아토피 피부염 등과 같은 염증성 피부 질환을 개선하기 위한 치료제나 기능성 화장품이 개발되고 있으나, 염증성 피부 질환 개선 효과가 미미하거나 화합물을 유효성분으로 이용하여 독성이나 부작용이 우려되는 경우가 발생하여 천연물 유래 신소재 개발이 요청되었다.

이에 본 발명자들은 염증성 피부 질환에 효과적으로 작용하면서도 기존 약물이나 기능성 화장품의 부작용 문제를 해결할 수 있는 새로운 염증성 피부 질환 치료제 또는 화장료 조성물을 개발하고자 예의 노력한 결과, 천연물 소재인 소듐서팩틴이 항염증 효과를 가지면서도 피부 가려움, 피부건조증을 개선하는 보습 효과를 가짐을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.

특허문헌 1: KR10-2004-0055035 A

본 발명의 목적은 소듐서팩틴의 신규한 신규한 용도를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 염증성 피부 질환의 예방 또는 치료/개선용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 부작용 없이 피부 염증 및 가려움, 피부건조증, 습진 등을 개선시키고 우수한 보습 효과를 제공하는 천연물 소재를 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 소듐서팩틴의 신규 용도를 제공한다.

구체적으로, 본 발명은 소듐서팩틴(Sodium surfactin)을 유효성분으로 함유하는 염증성 피부 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 소듐서팩틴을 유효성분으로 함유하는 염증성 피부 질환의 개선 또는 피부 보습용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 소듐서팩틴을 유효성분으로 함유하는 염증성 피부 질환의 개선용 기능성 화장품을 제공한다.

본 발명은 기존 약물이나 기능성 화장품의 독성 문제나 부작용 문제 없이 염증성 피부질환을 특이적이고 효과적으로 치료/개선할 수 있는 새로운 염증성 피부질환의 예방 또는 치료용 조성물 및 염증성 피부질환 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 소듐서팩틴은 자극물질에 의해 유도되는 NO나 염증성 사이토카인인 IL-6의 발현을 농도의존적으로 감소시킬 뿐만 아니라, 마우스모델이나 실제 인체 적용 시험에서 피부건조증, 습진, 가려움증, 홍반 완화 등의 효과를 나타내며, 아울러 피부장벽 강화 효과와 피부 보습효과를 제공하고 세포독성을 나타내지 않는바, 부작용을 유발하지 않는 염증성 피부질환의 좋은 치료전략으로써도 유용하다.

도 1은 Raw 264.7세포에서 소듐서팩틴 처리 농도에 따른 NO 생성 억제 효과를 보여주는 그래프이다.
도 2는 Raw 264.7세포에서 소듐서팩틴 처리 농도에 따른 IL-6, TNF-알파, 및 GAPDH의 발현량을 보여주는 사진이다.
도 3은 4주간 phthalic anhydride (PA)를 마우스 모델의 귀 뒷면과 등에 도포하여 PA 미처리군, PA 단독 처리군, PA 및 소듐서팩틴 처리군간 체중 및 귀의 두께 변화를 측정한 그래프이다.
도 4는 4주간 phthalic anhydride (PA)를 마우스 모델의 귀 뒷면과 등에 도포한 후 부검 시 세럼 내 PA 미처리군, PA 단독 처리군, PA 및 소듐서팩틴 처리군간 IL-6 발현양을 측정한 그래프이다.
도 5는 4주간 phthalic anhydride (PA)를 마우스 모델의 귀 뒷면과 등에 도포하여 PA 미처리군, PA 단독 처리군, PA 및 소듐서팩틴 처리군간 등의 피부 질환 정도를 육안으로 관찰한 사진이다.
도 6은 인체적용시험에서 SLS를 이용하여 피부 장벽에 손상을 가한 후 소듐서팩틴 적용 시 1주 후 및 2주 후 피부 장벽 회복 정도를 보이는 사진이다.
도 7은 소듐서팩틴 함유 크림의 적용 전후 수분 증가량을 보이는 그래프이다.
도 8은 소듐서팩틴 함유 크림의 사용 시간 경과에 따른 보습 측정 결과 그래프이다.
도 9는 소듐서팩틴 함유 크림의 사용 시간 경과에 따른 경피 수분 손실량 변화 그래프이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명의 상세한 설명 등에서 사용되는 주요 용어의 정의는 다음과 같다.

본 발명에서의 용어 "치료"는 이롭거나 바람직한 임상적 결과를 수득하기 위한 접근을 의미한다. 본 발명의 목적을 위해서, 이롭거나 바람직한 임상적 결과는 비제한적으로, 증상의 완화, 질병 범위의 감소, 질병 상태의 안정화(즉, 악화되지 않음), 질병 진행의 지연 또는 속도의 감소, 질병 상태의 개선 또는 일시적 완화 및 경감(부분적이거나 전체적일 수 있음), 검출가능하거나 또는 검출되지 않거나의 여부를 포함한다. "치료"는 치료학적 치료 및 예방적 또는 예방 조치 방법 모두를 가리킨다. 상기 치료들은 예방되는 장애뿐만 아니라 이미 발생한 장에에 있어서 요구되는 치료를 포함한다. 질병을 "개선(improving)"하는 것은 치료를 하지 않는 경우와 비교하여, 질병상태의 범위 및/또는 바람직하지 않은 임상적 징후가 감소되거나 진행의 시간적 추이가 늦춰지거나 길어지는 것을 의미한다.

본 발명에서의 용어 "예방"은 질환의 임상 증상이 발달하지 않도록 질환 또는 장애의 개시에 대해 보호하는 요법을 지칭한다. 따라서, "예방"은 질환의 징후가 대상체에서 검출가능하기 전에 대상체에게 요법을 투여하는 것 (예를 들어, 치료 물질을 투여하는 것)에 관한 것이다. 대상체는 질환 또는 장애가 발달할 위험이 있는 개체, 예컨대 질환 또는 장애의 발달 또는 개시와 연관된 것으로 공지된 1종 이상의 위험 인자를 갖는 개체일 수 있다. 따라서, 특정 실시양태에서, 용어 "염증성 피부 질환을 예방하는 것"은 검출가능한 염증성 피부 질환을 갖지 않은 대상체에게 염증성 피부 질환 치료 물질을 투여하는 것을 지칭한다. 항염증 예방 요법을 위한 대상체는 염증성 피부 질환에 걸릴 위험이 있는 개체일 수 있는 것으로 이해된다.

본원에 사용된 용어 "치료 유효량" 또는 "유효량"은 목적하는 생물학적 또는 의학적 반응을 도출하는데 유효한 양, 예컨대 질환을 치료하기 위한 대상체에게 투여했을 때 질환에 대한 이러한 치료를 발생시키는데 충분한 소듐서팩틴의 양을 지칭한다. 유효량은 질환 및 그의 중증도 및 치료될 대상체의 연령, 체중 등에 따라 달라질 것이다. 유효량은 양의 범위를 포함할 수 있다. 관련 기술분야에서 이해되는 바와 같이, 유효량은 1회 이상의 용량일 수 있고, 즉 목적하는 치료 종점을 달성하기 위해 단일 용량 또는 다중 용량이 요구될 수 있다. 유효량은 1종 이상의 치료제를 투여하는 것과 관련하여 고려될 수 있고, 단일 작용제는 1종 이상의 다른 작용제와 함께 바람직하거나 유익한 결과가 달성될 수 있거나 달성되는 경우에 유효량으로 제공되는 것으로 고려될 수 있다. 임의의 공-투여되는 화합물의 적합한 용량은 화합물의 조합 작용 (예를 들어, 추가적 또는 상승작용적 효과)으로 인해 임의로 저감될 수 있다.

본 명세서를 통하여, 문맥에서 달리 표현하지 않으면, "함유하다" 및 "포함하다"란 문구는 제시된 단계 또는 단계들의 군을 포함하나, 임의의 다른 단계 또는 단계들의 군이 배제되지 않음을 내포하는 것으로 이해하여야 한다.

이하, 구체적으로 본 발명을 설명한다.

본 발명은 일 관점에서, 소듐서팩틴(Sodium surfactin)을 유효성분으로 함유하는 염증성 피부 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 소듐서팩틴은 화학식 1로 표시되는 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 조성물이다:

[화학식 1]

여기서, n=9임.

본 발명의 일 실시예에서는 소듐서팩틴이 LPS를 이용하여 염증을 유도하였을 때 NO 생성을 억제하는 활성을 가질 뿐만 아니라, 염증성 사이토카인인 IL-6의 발현을 농도 의존적으로 감소시킴을 확인하였다.

본 발명의 다른 실시예에서는 PA로 자극한 마우스모델에 있어서 소듐서팩틴이 PA 유도에 따른 가피 생성, 진피층이 두꺼워지는 변화를 완화시키는 것이 확인되었으며 마우스모델 세럼 내 IL-6 발현 역시 감소하였다. 또한, 육안 검사에서도 피부건조증, 습진 등이 크게 완화됨이 확인되었다.

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 아토피 피부염 환자의 홍반 및 가려움증이 개선됨을 확인하였다.

아울러, 본 발명의 또 다른 실시예에서는 20명의 피험자를 모집하여 테스트한 결과 소듐서팩틴 함유 크림의 피부 장벽 강화 효과와 피부 보습 효과를 확인할 수 있었다.

이에 본 발명은 또 다른 관점에서, 소듐서팩틴을 유효성분으로 함유하는 염증성 피부질환의 개선 또는 피부 보습용 화장료 조성물에 대한 것이다.

본 발명에서 "피부질환"이란 피부에서 발생되는 비정상적인 상태 또는 증상을 의미한다. 본 발명의 일 구현예에서 상기 피부질환은 염증성 피부질환이다. 상기 염증성 피부 질환은 면역세포가 매개하는 염증반응으로 인한 가려움증, 홍반 등과 같은 증상이 나타내는 피부질환을 의미한다. 이때, 상기 염증성 피부 질환은 알레르기성 피부염, 아토피 피부염, 습진, 무좀, 알레르기성 두드러기, 소양, 백선, 건선 또는 피부건조증 등일 수 있다. 여기서, 아토피 피부염이란, 만성적으로 재발하는 심한 가려움증이 동반되는 피부 습진 질환으로, 피부염의 일환이다.

본 발명의 조성물은 약학적 조성물로 제조될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 (a) 상술한 본 발명의 소듐서팩틴의 약학적 유효량; 및 (b) 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물이다.

본 발명의 조성물이 약학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다 본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed, 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 비경구 또는 경구 투여할 수 있으며, 예컨대 피부 투여, 정맥내 투여, 피하 투여, 근육내 투여, 복강내 투여, 국소 투여, 비강 내 투여, 폐내 투여, 직장 내 투여, 경막 내 투여, 안구 투여 및 경피 투여 등의 방법으로 투여될 수 있다. 임상 실무에서, 본 발명의 소듐서팩틴은 임의의 통상적인 경로, 특히 외용제로 투여될 수 있다.

상기 소듐서팩틴은 대상체 또는 환자에게로 투여되며, 이때 "대상체(들)"은 동물, 예를 들어 비-영장류 (예를 들면, 소, 돼지, 말, 고양이, 개, 래트 및 마우스) 및 영장류 (예를 들면, 원숭이, 예를 들어 사이노몰구스 (cynomolgous) 원숭이, 침팬지 및 인간)를 비롯한 포유동물, 및 예를 들어, 인간을 나타낸다. 또 다른 실시양태에서, 대상체는 축산용 동물 (예를 들면, 말, 소, 돼지 등) 또는 애완용 동물 (예를 들면, 개 또는고양이)이다. 바람직한 실시양태에서, 대상체는 인간이다.

본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다 본 발명의 약학적 조성물의 일반적인 투여량은 성인 기준으로 00001-1000 ㎎/kg 범위 내이나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다 이때 제형은 오일 또는 수성매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 화장료 조성물로 제조될 수 있다 본 발명의 소듐서팩틴을 유효성분으로 포함하는 염증성 피부질환의 예방 또는 개선용 조성물이 화장료 조성물로 제조되는 경우, 유효 성분으로서의 소듐서팩틴 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로 서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

실시예

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

소듐서팩틴의 세포독성의 확인

소듐서팩틴(Kaneka corporation)의 세포독성을 확인하기 위하여 다음의 실험을 수행하였다.

마우스 섬유아세포 L929 세포 (mouse fibroblast L929, ATCC CCL-1, USA)를 10% FBS가 함유된 DMEM으로 현탁시킨 후, 96 웰 조직 배양 플레이트의 각각의 웰에 세포의 농도가 5×10⁴ 세포/웰이 되도록 분주한 다음 5% CO₂, 37℃ 조건 하에서 24시간 배양하였다. 배양 후 배지에 소듐서팩틴을 표 1에 기재된 농도로 처리한 후 24시간 배양하였다. 배양이 끝난 다음 각각의 웰에 MTT (2 mg/ml in PBS, Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide, Sigma-aldrich, USA) 10㎕ 를 첨가하고 3시간 동안 반응시켰다. MTT는 완전히 살아있는 세포 또는 손상 받지 않는 세포의 미토콘드리아에 반응하여 formazan을 형성한다. 반응 후 배양액을 제거하고 DMSO (Dimethyl Sulfoxide, Sigma-aldrich, USA)를 100 ㎕를 가하여 10분간 반응시키고 ELISA reader (ELX 808, BioTek Instruments Inc., USA)를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 농도별 세포독성 값을 측정하여 하기 표 1에 나타내었다.

농도(w/%)	0.001	0.01	0.1	1	MTT50
생존율(%)	100	100	95	72	>1

그 결과, 표 1에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 소듐서팩틴은 300㎍/㎖이상에서 MTT50을 나타내어서 미독성이거나, 무독성인 것으로 나타났다.

추가로, 각 생물계면활성제를 이용하여 상기와 같은 방법으로 세포독성을 측정하여 비교하였다.

계면활성제	NR50(g/L, w/w)
LAS(Linear Alkyl Sulfonate)	<0.01
SDS(Sodium Dodecyl Sulfate)	0.05
Na-Surfactin	>10
Glycerol	50

그 결과, 표 2에 나타난 바와 같이, 기존의 계면활성제들과 비교하였을 때에도 역시 미독성이거나 무독성인 것으로 나타났다.

즉, 본 발명에 따른 소듐서팩틴은 매우 안전한 원료임을 알 수 있다.

소듐서팩틴의 염증성 피부질환 개선 효과의 확인(1)

2-1: Na-surfactin의 Nitric oxide (NO)생성 억제 활성 측정

일반적인 마우스 대식세포인 Raw 264.7 세포주를 이용하여 염증 억제 정도를 실험하였다.

Raw 264.7 세포(ATCC, TIB-71)로부터 생성된 NO의 양은 Green 등의 방법에 따라 griess 시약을 이용하여 세포배양액 중에 존재하는 NO²의 형태로 측정하였다. 6 well plate에 Raw 264.7 세포를 1 × 10⁵ cell/well로 분주하였다. 37℃ CO₂ incubator 에서 24시간 배양한 이후 1X phosphate buffered saline (PBS)로 2번 세척하였다. LPS 1μg/ml을 대조군(normal)을 제외하고 처리한 후 2시간 이후 농도 별로 조제한 시료용액(소듐서팩틴)을 처리하여 24시간 배양한 후 상등액을 얻은 후, 동량의 griess 시약을 첨가하여 96 well plate에서 10분 반응시킨 후 540 nm에서의 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, Raw 264.7 세포에 Na-surfactin을 6.25, 12.5, 25, 50 ㎍/㎖의 농도로 처리하였을 시, LPS 단독 처리구에서 22.9μM이 발생하였으나 이들 실험군에서는 22.7, 20.8, 18.0, 16.1μM로 측정되어 농도의존적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 즉, 본 발명에 따른 소듐서팩틴이 효과적으로 NO를 억제함을 확인할 수 있으며 이는 소듐서팩틴이 항염 효과를 가짐을 나타낸다.

2-2: Na-surfactin의 IL-6 발현 억제 활성 측정

추가적으로, Raw 264.7 세포주를 이용하여 Na-surfactin 처리에 따른 IL-6, TNF-α, COX-2 발현량을 확인하였다.

100mm cell culture plate에 5×10⁵ cells/well의 농도로 RAW 264.7cell을 분주하여 24시간동안 배양하였고, LPS(1μg/ml) 와 시료를 각각 24시간동안 처리하였다. 시료처리가 끝난 샘플들은 PBS로 세척 후 RIPA buffer[Radio Immuno Precipataion Assay, 50mM Tris/HCl (pH 7.2), 150mM NaCl, 1% Triton X-100 (or NP-40), 1% Sodium deoxy cholate, 0.1% SDS, 1% Trasylol(protease inhibitor)] 100ul로 부유시켜 1.5ml eppendroff tube에 옮긴 다음 4℃에서 1시간동안 반응시켰다. 고속원심분리기를 이용하여 4℃, 13,000 rpm으로 5분 동안 원심 분리하여 상층액을 회수하였고, 단백질 정량은 Bradford 시약(Sigma)을 시료 희석액과 시약의 비율을 1:9로 희석하여 측정하였다.

준비된 시료를 1×Sample buffer[1M Tris/HCl (pH 6.8), 50% glycerol, 10% SDS, 2-mercaptoet hanol, 1% bromphenol blue in 3rd D.W]와 동량으로 혼합하여 5분 동안 가열한 뒤 western용 electrophresis(20ug/lane of protein, BIO-RAD)로 10% SDS-PAGE(80V 30분, 120V 2시간)를 시행하였다. 전개된 단백질을 PVDF membrane으로 100 V, 1시간동안 이동시켰다. 이 membrane을 5% skim milk으로 상온에서 1시간동안 블로킹하고, 1^st antibody (IL-6, TNF-α, GAPDH, 1:1000, Santacruze)를 4℃ shaker에서 밤새도록 처리하였다. 그 후, 2차 항체를 상온에서 1시간동안 반응시켰다.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, Raw 264.7 세포에 소듐서팩틴(Na-surfactin)을 6.25, 12.5, 25, 50 ㎍/㎖의 농도로 처리하였을 시, IL-6와 TNF-알파의 발현이 LPS 단독 처리구에서 증가하였으나 Na-surfactin을 처리에 의해 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

소듐서팩틴의 염증성 피부질환 개선 효과의 확인(2)

소듐서팩틴의 염증성 피부질환 개선효과를 확인하기 위하여, 다음과 같이 PA(phthalic anhydride)처리한 마우스모델에 소듐서팩틴을 처리하고 체중 변화, 귀의 두께 변화, 부검 후 세럼 내 사이토카인 측정, 육안 검사를 수행하였다.

Specifiedpathogen-free (SPF) 상태의 Hairless 마우스(8주령, 25±5g)를 (주)중앙실험동물(Seoul, Korea)에서 구입하였으며 방사선 조사된 사료(Purina, Seoungnam, Korea)를 자유급식 하도록 하였고, 12시간의 조명주기(08:00~20:00), 온도 23±1℃, 상대습도 50±5%에서 사육하였다. 실험동물을 5마리씩 3군(Vehicle 처리군, phthalic anhydride (PA) 처리군, PA+ Na-surfactin 처리군)으로 무작위로 배정하였다. Vehicle 처리군은 정제수를 4주 동안 12회에 걸쳐 Hairless마우스의 귀와 머리부위에 100 μL/1회씩 도포하였고, PA 처리군은 12.5% PA 용액(100 μL)를 동일한 조건에서 처리하였다. PA+Na-surfactin 처리군은 12.5%의 PA를 처리하면서 동시에 크림을 격일로 4주 동안 피부에 도포하였다. 4주 후, 마우스는 Zoletil 1 mL/kg을 투여하여 마취하고, 혈액을 채취하였다. (귀 두께 측정: 귀의 두께는 주 1회, 귀의 정중앙부위를 버니어캘리퍼스(Vernier calipers, Germany)를 이용하여 측정하였다.)

먼저, 마우스 모델의 귀 뒷면과 등에 4주간 PA를 도포한 결과, 체중의 경우 도 3A에 나타난 바와 같이 미처리 대조군(Con), PA 단독 처리군(PA), PA 및 소듐서팬틴 처리군(Na-Surfactin)에 있어 거의 변화가 관찰되지 않았다. 그러나, 도3B에 나타난 바와 같이, 귀 두께의 경우 PA 단독 처리군(PA)에서는 PA 유도를 진행하면서 점차 가피가 생기고 진피층에 지방세포가 끼는 등 두꺼워지는 변화를 보였으나 실험군인 PA 및 소듐서팩틴 처리군(Na-Surfactin)에서는 완화되는 경향을 보였다.

상기 마우스 모델은 4주 후 부검 후 세럼을 분리하여 mouse IL-6 Quantikine ELISA kit (R&D systems, Inc. USA)를 이용하여 ELISA를 수행하여 IL-6 수치를 측정하였다. 마우스를 Zoletil로 마취한 상태에서 복대정맥으로부터 혈액을 채취하여 헤파린 튜브(heparin tube)에서 30분방치한 후 원심분리를 실시하여 혈청을 분리하였다. 먼저, 포획항체(capture antibodies)를 immunoplate에 분주하여 실온에서 1시간 동안 부착시키고, 미부착된 항체는 세척용액(washing solution, 50 mM Tris, 0.14 M NaCl, 0.05%Tween 20, pH 8.0)으로 3번 세척하여 제거하였다. 포획항체가 결합된 immunoplate의 각 well에 마우스로부터 분리된 혈청과 희석된 표준 IL-6 (standard IL-6)를 첨가하여 1시간 동안 결합시킨 뒤 미부착된 용액을 제거하고, horseradish peroxidase가 결합된 항체를 첨가하였다. 최종적으로 기질용액(substrate solution)을 첨가하여 어두운 실온에서 30분간 반응을 시켰다. 반응 결과는 MicroplateReader (Molecular Device Co., USA)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하여 확인하였다.

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, PA 단독 처리군(PA)에 비하여 PA 및 소듐서팩틴 처리군(Na-Surfactin)에서 크게 IL-6 발현이 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

아울러, PA를 마우스 모델의 등에 4주 도포하여 관찰한 결과, 도 5에 나타난 바와 같이 PA 단독처리군(PA)에서는 피부 건조증, 습진 등이 심하게 일어나나 PA 및 소듐서팩틴 처리군(Na-Surfactin)에서 이러한 현상이 크게 완화됨을 확인할 수 있었다.

소듐서팩틴의 피부 장벽 강화 효과의 확인

소듐서팩틴의 피부건조증이나 습진 등과 같은 피부질환의 치료/개선 효능을 확인하기 위하여 통상의 크림제형의 화장료 조성물에 3% 농도의 소듐서팩틴을 첨가하여 소듐서팩틴 함유 크림을 제조한 다음, 피부 장벽 강화 효과를 테스트하였다. 충청북도화장품임상연구지원센터에 의뢰하여 총 20명의 피험자를 모집하여 피부 장벽에 손상을 가한 후 Tewameter를 이용하여 전박 부위의 경피수분손실량(TEWL)을 측정하여 평가하였다.

모든 평가는 항온·항습(22±2℃, RH40~60%)조건에서 실시하였다. 먼저, 전박부위의 피부 상태를 육안평가 및 기초 설문조사하여 시험에 영향을 줄 수 있는 요인(점, 상처, 피부과 치료 유무 등)을 평가해 시험에 참여할 피험자 20명을 선정하였다. 시험하고자 하는 전박부위를 세정하고 항온, 항습 조건에서 30분 이상 적응하였다. 이후, 테스트 전 전박부위의 TWEL을 측정하고, 1% SLS(Sodiumㅡ Lauryl Sulfate)용액을 전박 부위에 패치하였다.

이후 패치를 제거한 후 항온, 항습 조건에서 1시간 이상 대기한 후 시험부위의 TWEL을 다시 측정하였다. 그리고, 3% 소듐서팩틴 함유 크림을 도포한 후, 부작용 유무를 평가하였다.

피부장벽강화 개선율은 아래 식에 따라 계산하였다.

피부장벽강화 개선율(%) = (SLS 처리 직 후 TEWL 측정값-소듐서팩틴 사용후 TEWL 측정값) / (SLS 처리 직 후 TWEL 측정값 - SLS 처리 전 TEWL 측정값) * 100

사용 전·후변화에 대해 쌍체검정(paired t-test)법을 이용하였으며 통계결과는 생물학적 통계분석에서 가장 많이 사용하는 유의차 5%(p<0.05)일 때 통계적 유의성이 있다고 간주하였다.

측정시점	사용 전		SLS 처리 직후		제품사용 1주 후		제품사용 2주 후
제품사용유무	소듐서팩틴	무도포	소듐서팩틴	무도포	소듐서팩틴	무도포	소듐서팩틴	무도포
TEWL측정값(평균±표준편차, g/m3/h)	6.26±1.56	6.08±1.27	48.24±13.64	47.96±14.55	13.76±3.53	14.05±3.47	8.70±1.79	10.32±2.39
피부장벽강화개선율(%)	-	-	-	-	82.14	80.96	94.20	89.87
p value	-	-	-	-	p<0.01	p<0.01	p<0.01	p<0.01

그 결과, 표 3에 나타난 바와 같이, 사용 1주 후 82.14%, 사용 2주 후 94.20%의 피부 장벽 강화 효과를 나타내었다. 무처치 대조부위와 비교 시 사용 2주 후 통계적으로 유의차 있게 시험부위의 피부 장벽 강화 개선 효과가 우수한 것으로 나타났다. 아울러 시험기간 동안 시험제품에 의한 피부 유해사례는 발생하지 않았다. 도 6은 인체적용 시험 결과의 일예로, 본 발명의 소듐서팩틴 사용 시 미사용부위에 비하여 피부 손상에 대한 개선효과가 명확함을 제시한다.

따라서, 소듐서팩틴은 사용 2주 후부터 피부 장벽 강화 개선에 도움을 주는 물질로 판단된다.

소듐서팩틴의 보습 효과의 확인

5-1: 소듐서팩틴 함유 크림 제형의 보습력 측정

통상의 크림제형의 화장료 조성물에 3%농도의 소듐서팩틴을 첨가하여 소듐서팩틴 함유 크림을 제조하였다. 이후 Skin-O-Mat (pH, 수분, 유분 측정 장비, Cosmomed, Germany)를 이용하여 피부 보습력 테트스를 진행하였다.

Skin-O-Mat 장비는 피부의 정전부하용량(capacitance)를 이용하여 피부의 수분을 측정하는 방법으로 아토피, 보습 등을 위한 측정에 사용되고 있으며 피부 개선의 정도를 객관적으로 확실하고 신뢰도 있게 검증 가능하다. 팔에 일정한 간격의 표시를 한 후, 상기 제조된 소듐서팩틴 함유 크림을 일정량 골고루 도포하고 시간이 흐른 뒤 장비를 통해 피부의 수분 함유량을 측정하였다.

그 결과 도 7에 도시된 바와 같이, 소듐서팩틴 함유 크림을 바른 경우, 도포 전과 비교하여 평균 69.1%의 수분 증가율을 확인할 수 있었다.

5-2: 소듐서팩틴 함유 크림 제형의 보습 및 경피수분손실량 개선 인체적용시험

소듐서팩틴의 피부건조증이나 습진 등과 같은 피부질환의 치료/개선 효능을 확인하기 위하여 보습 및 경피수분손실량 개선 효과를 테스트하였다. 충청북도화장품임상연구지원센터에 의뢰하여 총 20명의 피험자를 모집하여 안건성 피험자 보습 및 TWEL 유효성 인체적용 시험을 수행하였다.

아침/저녁 본 발명에 따른 소듐서팩틴 함유 크림을 사용하였고, 일반적인 화장품 보관방법에 준하여 보관하였다. 주관적인 설문을 통해 피험자 스스로 건성으로 인식하고 있는 피험자를 대상으로 피부 수분함량을 객관적으로 측정하는 Corneometer를 이용하여 전박 부위 수분 함량을 측정하고, 그 측정값이 30미만인 피험자를 악건성피험자로 선정하여 시험을 실시하였다. 시간대별 피부 수분 함량은 Corneometer를 이용하여 측정하였으며 경피 수분 손실량은 Tewameter를 이용하여 시험부위의 경피 수분 손실량(TEWL: Transepidermal Water Loss)을 측정하여 평가였다. 모든 시험은 항온·항습(22±2℃, RH 40~60%)조건에서 실시하였다.

사용 전·후 시험 부위의 수분 함량 및 TEWL을 측정 분석하여 소듐서팩틴 함유 크림의 유효성을 평가하였다. 보습 및 TEWL 개선율은 아래의 식에 따라 계산하였다.

보습 개선율(%) = (제품 사용 후 수분함량 - 제품 사용 전 수분 함량) / (제품 사용 전 수분함량) * 100

피부 장벽(경피수분손실량 TEWL) 개선율(%) = (-) (제품 사용 후 TEWL - 제품 사용 전 TEWL) / (제품 사용 전 TEWL) * 100

사용 전·후변화에 대해 쌍체검정(paired t-test)법을 이용하였으며 통계결과는 생물학적 통계분석에서 가장 많이 사용하는 유의차 5%(p<0.05)일 때 통계적 유의성이 있다고 간주하였다.

측정시점	사용전	사용 1주 후	사용 2주 후
수분함량 측정값(평균±표준편자. 단위: A.U.)	27.32±2.65	40.22±5.92	43.44±5.35
피부 보습 개선율(%)	-	47.37	59.14
p value	-	p<0.01	p<0.01

그 결과, 표 4 및 도 8에 나타난 바와 같이, 사용 후 1주 후 47.37%, 사용 2주 후 59.14%의 피부 수분함량 개선 효과를 나타내었다. 통계 분석 시 사용 1주 후부터 통계적으로 유의차 있게 사용 전 대비 수분함량을 증가시켰다. 평가기간 동안 본 제품에 대한 피부 유해사례는 발생하지 않았다.

측정시점	사용전	사용 1주 후	사용 2주 후
수분함량 측정값(평균±표준편자. 단위: A.U.)	8.97±1.25	8.16±1.39	6.72±1.87
피부 보습 개선율(%)	-	9.08	25.13
p value	-	p<0.01	p<0.01

아울러, 소듐서팩틴에 의한 경피수분손실량 측정을 통한 피부 장벽 개선 효과를 평가한 결과, 표 5 및 도 9에 나타난 바와 같이, 소듐서팩틴 사용 1주 후 및 사용 2주 후 모두 경피 수분 손실량에 있어서 개선 효과를 나타내었다. 또한 사용 1주 후부터 통계적으로 유의차 있게 사용 전 대비 수분함량을 증가시켰다. 또한 평가 기간 동안 피부 유해 사례는 발생하지 않았다.

소듐서팩틴의 아토피 피부염 환자의 홍반 및 가려움증 개선 효과 확인

실시예 5의 소듐서팩틴 함유 크림을 현재 아토피 피부염을 앓고 있는 50대 남성에서 홍반 및 가려움증 개선 효과를 확인하고자 하였다. 해당 환자는 병력 12년으로 가려움증, 홍반, 염증부위 긁음, 긁은 부위 상처 등으로 증상을 호소하였으며 강한 향이나 화학물질에 심각한 감작반응 보였다.

상기 환자에 소듐서팩틴 함유 크림은 아토피 피부염이 발생한 왼쪽 종아리 뒷부분에 하루 3번, 4일간 도포한 후 홍반 개선 여부는 육안으로, 가려움증 개선은 SCORE로 확인하였다.

그 결과, 4일간 소듐서팩틴 함유 크림 도포 후 바른 부위의 홍반이 개선됨이 육안으로 확인되었으며, 가려움 역시 시간 경과에 따라 해소되는 것으로 확인되었다.

이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

부호 없음

Claims (5)

1. 소듐서팩틴(Sodium surfactin)을 유효성분으로 함유하는 염증성 피부 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 염증성 피부 질환은 알레르기성 피부염, 아토피 피부염, 습진, 무좀, 알레르기성 두드러기, 소양, 백선, 건선 및 피부건조증으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 소듐서팩틴은 화학식 1로 표시되는 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 조성물:
   [화학식 1]
   

   

   
   여기서, n=9임.
4. 소듐서팩틴을 유효성분으로 함유하는 염증성 피부 질환의 개선 또는 피부 보습용 화장료 조성물.
5. 제4항에 있어서, 상기 염증성 피부 질환은 알레르기성 피부염, 아토피 피부염, 습진, 무좀, 알레르기성 두드러기, 소양, 백선, 건선 및 피부건조증으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 조성물.

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