KR20190086655A - 저온-적응된 해양생물종의 천연 공급원으로부터 유래된 젤라틴 중합체 및 그것의 용도 - Google Patents

저온-적응된 해양생물종의 천연 공급원으로부터 유래된 젤라틴 중합체 및 그것의 용도 Download PDF

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파울로 디아즈-칼데론
알레산드로 자우파
콕스 후안 파블로 아세베도
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유니버시다드 데 로스 안데스
셀즈 포 셀즈, 에스.피.에이.
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Abstract

본 발명은 저온-적응된 해양생물종의 천연 공급원으로부터 유래된 아미노산 사슬 젤라틴 중합체를 1% 내지 20% (w/v)의 농도로 포함하는 용액을 포함하는 조성물에 관한 것이고, 이러한 조성물은 선택적으로 광개시제와 같은 중합 개시제를 추가로 포함하고, 이러한 아미노산 사슬 젤라틴 중합체는 화학적으로 작용화되어, 유리 라디칼의 존재 하에 중합 또는 가교에 대해 반응성으로 된다. 이러한 조성물은 3D 프린팅, 압출 시스템(적층 제작(additive fabrication)), 분무 시스템, 주조(casting), 마이크로- 및 나노 섬유 제작 시스템(전기방사, 용액 블로우 방사(solution blow spinning)) 또는 미세유체장치(microfluidics)에 특히 유용하다.

Description

저온-적응된 해양생물종의 천연 공급원으로부터 유래된 젤라틴 중합체 및 그것의 용도
본 발명은 생체의학 분야 및 영양 부문에 관한 것으로서, 특히 본 발명은 저온-적응된 해양생물종의 천연 공급원으로부터 유래된 아미노산 사슬 젤라틴 중합체를 1% 내지 20% (w/v)의 농도로 포함하는 용액을 포함하는 조성물에 관한 것이고, 상기 조성물은 선택적으로 광개시제 또는 임의의 다른 유형의 라디칼-유래 개시제를 추가로 포함하고, 유리 라디칼의 존재 하에 중합 또는 가교에 대해 반응성으로 되도록 화학적으로 작용화된다(chemically functionalized). 이러한 조성물은 생체의학 및 영양 분야에 사용하기 위한 새로운 바이오 가공 기술(bio fabrication technology)에 특히 적합하다.
생체의학 분야에서, 새로운 바이오 가공 기술은 생체물질, 예컨대 치료 또는 진단 목적의 스캐폴드, 비드, 조작된 조직(engineered tissue), 장치 및 마이크로-장치를 제조할 수 있게 한다. 이들 기술 중 일부(바이오 가공 기술 또는 바이오 제조(biomanufacturing))는 무엇보다도, 3D 바이오-프린팅, 압출 시스템(적층 제작(additive fabrication)), 분무 시스템, 주조(casting), 마이크로- 및 나노 섬유 제작 시스템(전기방사, 용액 블로우 방사(solution blow spinning)) 및 미세유체기술(microfluidics)과 같은 기술의 사용을 포함한다. 식품 과학에서도, 이들 기술 중 일부, 특히 압출 및 분무 시스템이 사용된다.
이들 기법 또는 기술의 사용은, 생체물질의 응집(aggregation) 및 중합 또는 가교 상태의 조절을 필요로 한다. 이러한 측면에서, 생체물질은 처음에는 그것의 액체 상태로 취급된 다음, 중합/가교의 조절을 통해 보다 고체 상태로 최종 생성물이 수득된다. 이러한 측면에서, 이들 기술의 고성능 기능은, 임의의 주어진 특정 적용에서 최종 생성물의 기능성이 고체 상태에서의 생체물질의 기계적, 물리화학적 및 생물학적 특성에 의존한다는 점을 고려하여, 액체 상태에서의 생체물질의 유동학적 특성, 및 보다 고체 상태로의 전이 과정에서 시스템이 갖는 조절 수준에 매우 의존적이다. 즉, 이들 기술이 고성능을 발휘하기 위해서는 중합/가교 전의 특이적인 유동학적 특성, 중합/가교의 조절, 및 중합 또는 가교된 생체물질의 기계적 특성이 필요하다.
사실상, 고정밀 바이오 제조 기술(예컨대 잉크젯 바이오프린팅, 분무-코팅 및 미세유체-유래 시스템)은, 초소형 액적(very small drop)(pL)의 형성을 허용하거나 또는 마이크로-크기 채널 내에서 높은 유동 저항을 피하기 위해, 특이적인 유동학적 특성을 이용하여 생체물질의 중합/가교 상태를 조절할 수 있게 하는 조성물을 필요로 한다. 따라서, 이상적인 조성물은 가교/중합 전에는 특이적인 유동학적 특성(예를 들어 3D 바이오프린팅을 수행할 때 양호한 분사 능력(jetting capability)을 초래함)을 가질 것이고, 일단 생체물질이 고체 상태로 되면 양호한 기계적 특성을 가질 것이다. 이상적인 조성물은 가교/중합 단계 전에, 상이한 전단 속도 및/또는 온도에서 뉴턴형(Newtonian) 유체 거동, 25-10 cP의 점도 및 안정성을 가질 것이다. 바람직하게는, 이상적인 조성물은 또한, 낮은 표면 장력(25-30 mN/m)을 가질 것이다.
생체의학 분야는 치료 또는 진단 적용의 결과에 영향을 미치는 많은 물리화학적 및 생물학적 특성을 요구한다. 이들 특성 중 일부는, 세포 구성성분의 미세환경의 조절, 및 특이적인 생물학적 반응에서 유래된 세포와 생체물질의 직접적인 상호작용, 및 세포의 생물학적 활성에 따른 생체물질의 능동적인 리모델링과 관련이 있다. 이들 특성들은 또한, 생물학적으로 의미 있는 요소(element)의 전달 조절, 세포융화성(cytocompatibility), 생물활성(bioactivity) 및 생물분해성(biodegradability)으로 열거되어 있다. 한편, 영양 분야에서, 캡슐화된 비타민 또는 다른 활성 화합물의 보충을 위한 분무 시스템 또는 비드 제작과 같이 식품 코팅의 증착을 위한 특수하고 비용-효율적인 기술이 요망되고 있다.
안타깝게도, 이들 두 분야는 모두, 지금까지 사용된 대부분의 생체물질의 최적에 미치지 못하는 유동학적 성질 및 중합/가교의 조절로 인해, 성능이 제한된다.
최근, 포유류 젤라틴(예를 들어 돼지 및 소)을 대체하는 젤라틴 공급원을 찾는 데에 관심이 증가하고 있다. 특히, 어류 젤라틴이 대체재로서 제안되어 왔지만, 극복해야 하는 중요한 과제는 이것의 열등한 유동학적 특성이다. 이러한 한계는 냉수성 어류의 콜라겐/젤라틴의 프롤린-풍부 영역의 결여에 기인한다(Karim A A et al: Food Hydrocolloids 2009, 23(3), 563-576; Gomez-Guillen M C et al: Food Hydrocolloids 2011, 25(8) 1813-1827).
어류 젤라틴 중합체에 개선된 기계적 특성을 제공하려는 목적으로, 분자내 및 분자간 가교의 유도가 이미 보고되었다. Chiou B S et al: Polymer 2006, 47(18), 6379-6386은 가교제(즉, 글루타르알데하이드 및/또는 게니핀(genipin))를 젤라틴-함유 조성물에 첨가하는 단계를 포함하는 전형적인 젤라틴 가교 방법을 기재하고 있다. 이러한 방법을 이용하여 최적의 가교를 수득하는 데 필요한 시간은 수시간 내지 수일이다.
이외에도, J. B. Yi et al: Journal of Food Science 2006, 71(9), E376-E383은 효소적 트랜스글루타미나제(즉, MTGase)를 사용한 어류 젤라틴 가교를 기술하고 있다. 이 문헌은, 효소적 트랜스글루타미나제를 이용한 가교를 통해 적합한 점도를 갖는 젤을 수득하는 데 필요한 시간이 수분의 범위임을 교시하고 있다.
이에, 고정밀 바이오 제조 기술에 적합한 유동학적 특성을 가지며, 이에 더하여 가교가 양호한 기계적(압축 및/또는 인장) 특성을 갖는 조성물을 초래하는 젤라틴 조성물을 수득하고자 하는 요망이 존재하며, 바람직하게는 여기서, 가교 시간은 수초 내지 수분의 범위까지, 예를 들어 최대 5분까지 단축된다.
따라서, 이들 기술에 사용하기 위한 새로운 생체물질이 절실히 요망된다. 결과적으로, 생체의학 및 식품에서 최적의 적용에 요망되는 기하학적 특성, 생물학적 특성 및 물리학적 특성을 갖는 구조적으로 복잡한 스캐폴드를 제조할 수 있는 신규의 고도 생물활성적 생체물질이 여전히 요망되고 있다.
본 발명에서 본 발명자들은, 아미노산 서열에 메타크릴로일기와 같은 화학적 치환기가 도입된, 저온-적응된 해양생물종의 천연 공급원으로부터 유래된 젤라틴 중합체, 예컨대 연어 젤라틴을, 생체의학 및 식품 산업에 독특한 특성, 즉 이의 저온-적응된 성질로부터 유래된 특성을 갖는 새로운 광-가교성 생체물질로서 사용하는 것을 제안하였다. 저온-적응된 유기체, 예컨대 연어의 독특한 특징은 이들 유기체의 단백질의 전형적으로 보다 구조적인 가요성이다. 이러한 의미에서, 10% w/v에서 용액 중 연어 젤라틴은 소 젤라틴보다 4배 더 낮은 점도를 나타내었다. 이러한 특성은, 저 점도 및 신속 중합을 갖는 생체물질을 필요로 하는 특수 제작 기술, 예컨대 고해상 3D 프린팅을 위한 멀티젯 또는 폴리젯 기술, 또는 미세유체-유래 기법의 사용을 허용한다. 본 발명자들의 초기 연구 가설은, 유동학적 이득 외에도 분자 수준에서 연어 젤라틴의 더 높은 가요성이 MMP(메탈로프로테이나제)의 촉매 효율을 증강시킬 수 있을 것이라고 언급하였다. 이는, 이러한 새로운 생체물질을 기초로 광-제작된(photo-fabricated) 하이드로겔의 바람직하지 못한 기계적 인성(toughness) 손상(impairment)에도 불구하고, 생체내에서 세포 이동/침범, 혈관신생 및 조직 통합을 개선시킬 것이다. 그러나, 대조적으로, 본 발명자들은, 연어 젤라틴의 더 높은 가요성으로 인해 MMP의 증가된 촉매 턴오버(catalytic turnover), 및 변형된 연어 젤라틴을 기초로 한 하이드로겔의 분자적 가요성이 소 젤라틴보다 높음에도 불구하고, 연어 하이드로겔의 기계적 특성이 소의 것보다 높은 영률을 나타내었다는 예상치 못한 사실을 관찰하였다. 또한, 광-가교성 연어 젤라틴의 하이드로겔은 중간엽 줄기세포, HUVEC과 조합되고 마우스 모델에서 피하 이식된 경우, 더 높은 수준의 혈관화 및 조직 통합을 보여주었다. 더욱이, 아미노산 서열에 메타크릴로일기와 같은 화학적 치환기가 도입된, 저온-적응된 해양생물종의 천연 공급원으로부터 유래된 젤라틴 중합체, 예컨대 연어 젤라틴은 새로운 광-가교성 생체물질로서 식품 가공 및 보존을 위한 우수한 조성물을 구성한다.
따라서, 제1 양태에서, 본 발명은 저온-적응된 해양생물종의 천연 공급원으로부터 유래된 아미노산 사슬 젤라틴 중합체를 1% 내지 20% (w/v)의 농도로 포함하는 용액을 포함하는 조성물에 관한 것이고, 상기 조성물은 선택적으로 광개시제와 같은 중합 개시제를 추가로 포함하고, 유리 라디칼의 존재 하에 중합 또는 가교에 대해 반응성으로 되도록 화학적으로 작용화된다. 바람직하게는, 조성물은 아미노산 사슬 젤라틴 중합체를 5% 내지 20% (w/v)의 농도로 포함한다. 보다 바람직하게는, 조성물은 계면활성제를 추가로 포함한다. 보다 더 바람직하게는, 조성물의 아미노산 사슬 젤라틴 중합체는 중합체의 형성 또는 표면 또는 다른 분자와의 반응을 매개할 수 있는 메타크릴로일기, 아크릴로일기 또는 임의의 작용기 또는 모이어티로 구성된 군으로부터 선택되는 화학제(chemical agent)에 의해 작용화된다. 작용기는 본원에 교시된 다양한 라디칼 및 화학적 엔터티를 포함하고, 알케닐 모이어티, 예컨대 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 디메타크릴레이트, 올리고아크릴레이트, 올리고메타크릴레이트, 에타크릴레이트, 이타코네이트 또는 아크릴아미드를 포함한다. 추가 작용기는 알데하이드를 포함한다. 다른 작용기는, 예를 들어 에틸렌적으로 불포화된 단량체, 예컨대 아크릴산 또는 메타크릴산의 알킬 에스테르, 예컨대 메틸 메타크릴레이트, 에틸 메타크릴레이트, 부틸 메타크릴레이트, 에틸 아크릴레이트, 부틸 아크릴레이트, 헥실 아크릴레이트, n-옥틸 아크릴레이트, 라우릴 메타크릴레이트, 2-에틸헥실 메타크릴레이트, 노닐 아크릴레이트, 벤질 메타크릴레이트, 동일한 산의 하이드록시알킬 에스테르, 예컨대 2-하이드록시에틸 아크릴레이트, 2-하이드록시에틸 메타크릴레이트 및 2-하이드록시프로필 메타크릴레이트, 동일한 산의 니트릴 및 아미드, 예컨대 아크릴로니트릴, 메타크릴로니트릴 및 메타크릴아미드, 비닐 아세테이트, 비닐 프로피오네이트, 비닐리덴 클로라이드, 비닐 클로라이드 및 비닐 방향족 화합물, 예컨대 스티렌, t-부틸 스티렌 및 비닐 톨루엔, 디알킬 말레에이트, 디알킬 이타코네이트, 디알킬 메틸렌-말로네이트, 이소프렌 및 부타디엔을 포함할 수 있다. 카르복실산 기를 함유하는 적합한 에틸렌적으로 불포화된 단량체는 아크릴 단량체, 예컨대 아크릴산, 메타크릴산, 에타크릴산, 이타콘산, 말레산, 푸마르산, 모노메틸 이타코네이트, 모노에틸 이타코네이트 및 모노부틸 이타코네이트를 포함하여 모노알킬 이타코네이트, 모노메틸 말레에이트, 모노에틸 말레에이트 및 모노부틸 말레에이트를 포함하여 모노알킬 말레에이트, 시트라콘산 및 스티렌 카르복실산을 포함한다. 적합한 폴리에틸렌적으로 불포화된 단량체는 부타디엔, 이소프렌, 알릴메타크릴레이트, 알킬 디올의 디아크릴레이트, 예컨대 부탄디올 디아크릴레이트 및 헥산디올 디아크릴레이트, 디비닐 벤젠 등을 포함한다. 아미노산 사슬이 메타크릴로일기에 의해 작용화되는 것이 바람직하다.
본 발명의 제1 양태의 바람직한 구현예에서, 유리 라디칼의 존재 하에 중합 또는 가교를 할 수 있는 화학제를 이용한 젤라틴 중합체의 산성 측쇄의 작용화도(degree of functionalization)는 라이신 잔기의 10% 내지 100%, 바람직하게는 20% 내지 100%, 보다 바람직하게는 30% 내지 100%, 보다 바람직하게는 40% 내지 100%, 보다 바람직하게는 50% 내지 100%, 보다 바람직하게는 60% 내지 100%, 보다 바람직하게는 70% 내지 100%, 보다 바람직하게는 80% 내지 100%, 보다 바람직하게는 90% 내지 100%이다. 보다 바람직한 구현예에서, 작용화도는 약 90%이다.
본 발명의 제1 양태의 또 다른 바람직한 구현예에서, 계면활성제는 SDS, tween 20, Kolliphor® P 188(Sigma-Aldrich) 등으로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 제1 양태의 또 다른 바람직한 구현예에서, 중합 개시제는 바람직하게는 약 0.01% 내지 5% (w/v) 농도의 광개시제, 예컨대 Irgacure® 2959[(Ciba specialty chemical, 현재 BASF Resins]이다. 본 발명의 맥락에서, "중합 개시제"는 단량체 또는 마크로머의 중합을 예를 들어, 유리 라디칼 발생에 의해 개시할 수 있는 임의의 성분을 지칭함을 주지한다. 중합 개시제는 종종 산화제이다. 예시적인 중합 개시제는 예를 들어, 전자기 방사선 또는 열에 노출됨으로써 활성화되는 것들을 포함한다. 중합 개시제가 또한 사용될 수 있고, 예를 들어 미국 특허 출원 공개 2010/0137241에 기재되어 있으며, 이 문헌은 그 전체가 원용에 의해 포함된다.
본 발명의 제1 양태의 또 다른 바람직한 구현예에서, 용액은 가교 전에 1 msec 내지 4시간, 바람직하게는 1초 내지 4시간, 보다 바람직하게는 1분 내지 4시간, 바람직하게는 10분 내지 4시간, 보다 바람직하게는 30분 내지 4시간, 보다 바람직하게는 45분 내지 4시간, 보다 더 바람직하게는 약 1시간 내지 약 4시간, 보다 더 바람직하게는 약 1시간 내지 약 3시간의 시간 간격 동안 -5℃로부터 15℃의 온도까지 전처리된다.
본 발명의 제1 양태의 또 다른 바람직한 구현예에서, 젤라틴 중합체는 살모(Salmo) 또는 온코린쿠스(Oncorhynchus) 속(genus)으로부터 유래되고, 바람직하게는 젤라틴 중합체는 연어로부터 유래된다.
본 발명의 제2 양태는 저온-적응된 해양생물종, 바람직하게는 살모 또는 온코린쿠스 속의 천연 공급원으로부터 유래된 아미노산 사슬 젤라틴 중합체를 1% 내지 20% (w/v), 바람직하게는 5 내지 20% (w/v)의 농도로 포함하는 용액을 포함하는 조성물의 제조 방법에 관한 것이며, 상기 조성물은 선택적으로 광개시제와 같은 중합 개시제를 추가로 포함하고, 화학적으로 작용화되어, 유리 라디칼의 존재 하에 중합 또는 가교에 대해 반응성으로 되고, 상기 제조 방법은
a. 저온-적응된 해양생물종, 바람직하게는 살모 또는 온코린쿠스 속의 천연 공급원으로부터 유래된 아미노산 사슬 젤라틴 중합체를 수득하고, 상기 중합체를 용매 내에서 1% 내지 20% (w/v), 바람직하게는 5 내지 20% (w/v)의 최종 농도로 용해시키는 단계;
b. 유리 라디칼의 존재 하에 중합 또는 가교에 대해 반응성이 되도록 할 수 있는 화학제를 상기 단계 a)의 용액에 첨가함으로써, 상기 단계 a)의 아미노산 사슬 젤라틴 중합체의 1차 구조를 화학적으로 변형시키는 단계;
c. 모든 미반응된 화학제를 상기 단계 b)의 용액으로부터 제거하는 단계; 및
d. 선택적으로, 중합 개시제, 예컨대 광개시제 및/또는 계면활성제를 상기 용액에 첨가하는 단계
를 포함한다.
본 발명의 제2 양태의 바람직한 구현예에서, 아미노산 사슬은 메타크릴로일기 또는 아크릴로일기로 구성된 군으로부터 선택되는 화학제에 의해 작용화된다.
본 발명의 제2 양태의 또 다른 바람직한 구현예에서, 본 방법은
a. 저온-적응된 해양생물종, 바람직하게는 살모 또는 온코린쿠스 속의 천연 공급원으로부터 유래된 아미노산 사슬 젤라틴 중합체를 수득하고, 상기 중합체를 용매 내에서 1% 내지 20% (w/v), 바람직하게는 5 내지 20% (w/v)의 최종 농도로 용해시키는 단계;
b. 메타크릴산 무수물을 상기 단계 a)의 용액에 첨가함으로써, 상기 단계 a)의 아미노산 사슬 젤라틴 중합체의 1차 구조를 화학적으로 변형시키는 단계;
c. 모든 미반응된 메타크릴산 무수물을 상기 단계 b)의 용액으로부터 제거하는 단계;
d. 선택적으로, 라디칼-유래 개시제, 예컨대 광개시제 및/또는 계면활성제를 첨가하는 단계;
e. 선택적으로, 적용 가능하다면, 상기 단계 c) 또는 d)로부터 생성된 조성물을 여과하고 동결 건조하는 단계
를 포함한다.
본 발명의 제2 양태의 또 다른 바람직한 구현예에서, 본 방법은 화학적으로 변형된 아미노산 사슬 및 광개시제를 포함하는 용액을, 상기 광개시제의 성질에 따라 광, 가시광선, 자외선 또는 적외선에 노출시켜, 가교된 조성물을 제공하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명의 제3 양태는 본 발명의 제2 양태의 방법들 중 임의의 방법에 의해 수득되거나 또는 수득 가능한 용액에 관한 것이다.
본 발명의 제4 양태는 본 발명의 제2 양태에 정의된 바와 같은 화학적으로 변형된 아미노산 사슬을 포함하는 용액을 중합 개시제, 보다 특히 광개시제, 상기 광개시제의 성질에 따라 광, 가시광선, 자외선 또는 적외선에 노출시킴으로써 가교된 조성물을 제공하여 수득되거나 또는 수득 가능한 가교된 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 제5 양태는 3D 프린팅, 압출 시스템(적층 제작), 분무 시스템, 주조, 마이크로- 및 나노 섬유 제작 시스템(전기방사, 용액 블로우 방사) 또는 미세유체장치를 위한, 저온-적응된 해양생물종, 바람직하게는 살모 또는 온코린쿠스 속의 천연 공급원으로부터 유래된 아미노산 사슬 젤라틴 중합체를 1% 내지 20% (w/v), 바람직하게는 5 내지 20% (w/v)의 농도로 포함하는 용액의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 제6 양태는 3D 프린팅, 압출 시스템(적층 제작), 분무 시스템, 주조, 마이크로- 및 나노 섬유 제작 시스템(전기방사, 용액 블로우 방사) 또는 미세유체장치를 위한, 본 발명의 제1 양태에 정의된 바와 같거나 또는 본 발명의 제3 양태에 정의된 바와 같은 조성물의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 제7 양태는 치료 또는 진단 목적에 적합한 스캐폴드, 비드, 조작된 조직 또는 장치 및 마이크로-장치의 제조를 위한, 본 발명의 제1 양태에 정의된 바와 같거나 또는 본 발명의 제3 양태 또는 제4 양태에 정의된 바와 같은 조성물의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 제8 양태는 식품 코팅을 위한, 본 발명의 제1 양태에 정의된 바와 같거나 또는 본 발명의 제3 양태 또는 제4 양태에 정의된 바와 같은 조성물의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 제9 양태는 식품 코팅을 위한, 또는 치료 또는 진단 목적에 적합한 스캐폴드, 비드, 조작된 조직 또는 장치 및 마이크로-장치의 제조를 위한, 저온-적응된 해양생물종, 바람직하게는 살모 또는 온코린쿠스 속의 천연 공급원으로부터 유래된 아미노산 사슬 젤라틴 중합체를 1% 내지 20% (w/v), 바람직하게는 5 내지 20% (w/v)의 농도로 포함하는 용액의 용도에 관한 것이다.
도 1. 100 s-1 전단 유동(shear flow)에서 측정된 점도이다. 25℃에서의 농도 증가는 메타크릴레이트화된 연어 젤라틴과 비교하여 메타크릴레이트화된 소 젤라틴의 경우 훨씬 더 높은 점도 증가를 제공하였다. 0.02 Pa.s는 20 센티푸아즈에 해당한다. 모든 생체물질들은 실시예에 예시된 바와 같이 동일한 수준의 화학적 작용화를 가졌다.
도 2. 젤화 온도이다. G'로 표시되는 전단 계수(shear modulus) 또는 전단 탄성 계수(modulus of rigidity)는 생체물질의 젤화 동안 증가한다. 15% 농도 (w/v)에서 메타크릴레이트화된 연어 젤라틴(SG8)은 비-메타크릴레이트화된 연어 젤라틴(SG)과 비교하여 이의 젤화 온도를 감소시킨다. 이 도면에 도시된 다른 곡선들은, 충전제 분자, 예컨대 셀룰로스 나노휘스커(CNW; cellulose nanowhisker)를 포함하며 유사한 젤화/온도 상관관계를 보여주지만 더 높은 전단 계수를 보여주는 복합물들에 상응한다.
도 3. 전단 유동의 변화에 반응한 유체 점도의 변화이다. 소 젤라틴은 비-뉴턴형 유체 거동에 전형적인 전단 담화 효과(shear thinning effect)를 보여주며, 한편 연어 젤라틴의 경우 뉴턴형 거동이 관찰된다(전단 유동의 증가 결과 점도 변화가 없음).
도 4. 전단 유동의 변화에 반응한 유체 점도의 변화이다. 소 또는 연어로부터의 메타크릴레이트 젤라틴을 비교하면, 연어는 상이한 전단 유동에서 훨씬 더 낮은 값의 점도를 보여주었다. 메타크릴레이트화된 연어 젤라틴은 5% (v/w) 농도에서를 제외하고 상이한 농도에서 뉴턴형 거동을 보여주었다. 한편, 모든 시험된 농도에서 메타크릴레이트화된 소 젤라틴은 비-뉴턴형 거동을 보여주었다.
도 5. 10% 농도 및 라이신 아미노산에서의 80% 작용화에서 메타크릴레이트화된 소 젤라틴의 광가교된(0.5% 광개시제) 하이드로겔의 압축 계수를, 동일한 농도이지만 20% 작용화(적색), 60%(그린), 78%(주황색) 및 85%(보라색) 작용화에서 연어 젤라틴을 기초로 한 하이드로겔과 비교한 것이다.
도 6. 10% 농도 및 라이신 아미노산에서의 80% 작용화에서 메타크릴레이트화된 소 젤라틴의 광가교된(0.5% 광개시제) 하이드로겔의 압축 계수를, 동일한 농도이지만 78% 작용화(보라색), 및 4℃에서 2시간 동안의 냉각 전처리를 수반한 78% 작용화(황색)에서 연어 젤라틴을 기초로 한 하이드로겔과 비교한 것이다.
도 7. 인장 영률(tensile young's modulus)이다. 라이신기에서 상이한 작용화도(60%, 78% 및 85%)를 갖는 가교된 메타크릴레이트화된 젤라틴(CMG) 하이드로겔의 인장 시험을 연어 및 소 기원을 비교하여 시험하였다. 유사한 결과가 관찰되었으며, 이때 연어 젤라틴에서 약간 더 높은 값이 관찰되었다.
도 8. 24시간에서 캡슐화된 인자의 전달 속도이다. 10% (v/w) 농도, 및 100 ng/ml의 농도에서 캡슐화된 인자(VEGF)에 의한 80% 작용화에서 메타크릴레이트화된 연어 젤라틴의 하이드로겔을 37℃에서 세포 배양 배지에서 인큐베이션하였다. 상이한 농도의 콜라게나제 유형 II(Whortington)를 사용하였고, 상층액 내로의 VEGF 전달 속도를 평가하였다. 그래프트(graft)는 전달된 VEGF 및 연어 젤라틴의 가용성 중합체의 농도를 보여준다.
도 9. WST-1 세포 증식 비색검정법 키트(K302, Biovision, USA)를 제조업체의 설명서에 따라 사용하여, 가교된 생체물질 내에서 캡슐화된 HUVEC의 세포 증식 평가를 수행하였다. 간략하게는, 이러한 검정법은 세포성 미토콘드리아 데하이드로게나제에 의해 포르마잔을 발생시키는, WST-1의 대사적 절단(metabolic cleavage)을 정량화한다. 여기서, 10% (v/w) 농도 및 78% 작용화(라이신 측쇄에서)에서 메타크릴레이트화된 소 젤라틴의 하이드로겔의 비교를, 10% (v/w) 농도 및 20% 작용화(Nat-Bio 1), 60% 작용화(Nat-Bio 2), 78%(Nat-Bio 3) 및 85%(Nat-Bio 4)에서 메타크릴레이트화된 연어 젤라틴과 비교하였다.
도 10. 가교 하이드로겔의 면역원성을 연어와 소 사이에서 비교한 것이다. 10% (v/w) 농도 및 20% 작용화(소 0.5, 연어 0.5) 또는 78% 작용화(소 5, 연어 5)에서 연어 및 소 젤라틴 하이드로겔을 제조하고, 마우스(C57 bl/6)에 피하 이식하였다. 14일 후, 마우스의 겨드랑이 부분 림프절로부터 백혈구를 단리하고, 휴지기 T 림프구 항-CD3(aCD3), 소 및 연어 젤라틴(Hidro)의 활성제의 부재 또는 존재 하에 배양하였다. 염증 인자인 IL-6 및 IFN을 측정하여, 연어 및 소 하이드로겔의 면역반응성을 정량화하였다. 이들 결과는 연어와 비교하여 소에서 더 높은 면역반응성을 보여주었다.
도 11. 3주 후, 연어 하이드로겔의 피하 이식은 상기 하이드로겔 내부에서 전반적인(full) 혈관화, 및 주변 마우스 세포로부터의 세포 침범을 보여주었다. 화살표는 이식된 하이드로겔 내부의 혈관을 가리킨다. 이들 결과는 상기 하이드로겔의 매우 양호한 조직 통합을 보여주었다.
도 12. 피부를 세척하고 전처리 및 추출용 용액의 제조 과정의 이미지, 및 10℃에서 전처리되는 동안의 인큐베이션 이미지를 보여준다.
도 13. 변형된 및 동결 건조된 연어 젤라틴의 외양이다. 바이오잉크를 제조하기 위해, 이는 제제의 베이직(basic) 구성성분이며, 인산염-완충 식염수 pH 7.4에서 상이한 농도에서 제조된다.
도 14. 연어 젤라틴의 작용화, 및 변형된 연어 젤라틴의 가교의 도식도이다.
도 15. 베이직 바이오잉크(85% 및 10% (w/v) 농도에서 작용화된 MSG) 내로 혼입되는, 실험실에서 제조된 셀룰로스 나노휘스커의 원자힘 현미경 검사(AFM; atomic force microscopy)에 의해 수득된 이미지이다. 이들 박테리아 셀룰로스 나노휘스커를 칠레 대학교의 프랑크 퀘로(Franck Quero) 교수의 감독 하에 제조하였다.
도 16. 80%의 라이신에서 메타크릴로일로 작용화된 변형된 연어 젤라틴의 가교된 하이드로겔 내에 캡슐화된 세포의 현미경 이미지이다.
도 17. 20% 및 80%(각각 0.5 및 5로 지칭됨)의 라이신 작용화 수준까지 변형된 소 및 연어 젤라틴-계 7-일 하이드로겔 이식물이 이식된 C57BL/6 마우스이다. 7일 후 외식된 하이드로겔은 유의한 혈관 관주(vascular irrigation) 존재를 갖는 것으로 보인다. 변형된 20% 연어 하이드로겔은 더 높은 수준의 조직 통합 및 이의 리모델링을 가졌기 때문에 외식될 수 없었고, 이러한 조직의 한정된 존재(defined presence)는 마우스의 등에서도 관찰되지 않았다.
도 18. 변형된 젤라틴에서 1차 아민의 정량화이다. 화학적 작용화 반응에 첨가된 메타크릴산 무수물의 양은 퍼센트로 표현되며, 여기서, 그램(g)으로 표시된 소정량의 메타크릴산 무수물은 10% (w/v)의 농도에서 100 ml의 젤라틴(소 또는 연어) 용액에 첨가된다. 각각의 젤라틴의 라이신 작용화의 퍼센트는, 작용화되지 않은 동일한 젤라틴과 비교하여 OPA 방법에 의해 비-정량화성(quantifiable) 라이신의 퍼센트로서 계산된다.
도 19. 메타크릴로일기에 의한 상이한 수준의 라이신 작용화에서 변형된 연어 및 소 젤라틴으로부터 형성된 하이드로겔에 대한 영률 및 압축 계수이다. 모든 하이드로겔을 10% (w/v) 젤라틴 용액으로부터 제조하고, 동일한 선량으로 조사하였다(365 nm, 800 mW/cm2, 2분 동안). 0.5% = 20% 작용화; 2% = 60% 작용화; 5% = 80% 작용화; 10% = 90% 작용화.
도 20. 기하학적 특성의 측정이다. (a) 이중 갭, (b) 콘-플레이트(cone-plate), (c) 플레이트-플레이트이다.
도 21. 이중 갭 기하학적 특성(a, b) 및 콘-플레이트 기하학적 특성(c, d)에서 25℃에서 측정된, 상이한 전단 속도에서의 물(a,c) 및 1X PBS(b, d)의 점도이다.
도 22. 이중 갭 기하학적 특성은 연어 젤라틴의 뉴턴형 거동을 보다 적합하게 설명할 수 있고, 상이한 측정들 사이에서 더 작은 변화를 가능하게 한다. 25℃에서, 이중 갭 기하학적 특성에서, 소 및 연어 젤라틴 시료들 사이에서의 필수적인 차이를 가장 잘 관찰할 수 있다. 소 젤라틴은, 삼중 나선의 형성이 약 25℃에서 관찰되기 때문에 겔 상태로 존재한다.
도 23. 이중 갭 기하학적 특성(a,b) 및 콘-플레이트 기하학적 특성(c,d)에서 계산된, 25℃에서 전단 속도에 따른 연어 젤라틴(a,c) 및 소 젤라틴(b,d)의 점도이다.
도 24. 이중 갭 기하학적 특성(a) 및 콘-플레이트 기하학적 특성(b)에서 계산된, 37℃에서 전단 속도에 따른 연어 젤라틴의 점도이다.
도 25. 100 s-1의 전단 속도에서 작용화되고 계산된 연어 젤라틴(Nat-Bio = 라이신에서 85% 작용화된 연어 젤라틴) 및 소 젤라틴의 점도이다. 둘러싸인(bound) 영역은 폴리젯 장비에 의해 허용되는 점도값에 상응한다. 각각의 실험을 3회 중복하여, 평균 및 각각의 표준 편차를 수득하였다.
도 26. CNW가 보충된 베이직 바이오잉크 제제에 대한 온도 주사(scan)에서 저장 탄성률(storage modulus)(저장 탄성률) 및 연어 젤라틴의 전단 속도에 따른 점도이다. SG = 연어 젤라틴; SG8 = 85%의 라이신에서 메타크릴로일기에 의해 작용화되어 변형된 연어 젤라틴; CNW = 셀룰로스 나노휘스커.
도 27. 37℃에서 전단 속도에 따른, 3%(a, c) 및 5% w/w의 CNW를 갖는 변형된 연어 젤라틴 화합물(a,b) 및 비-변형된 젤라틴(c, d)의 점도이다.
도 28. (a) 1%의 변형률 및 1 Hz의 주파수를 적용함으로써, 연어 젤라틴(-·-), 85%의 작용화 수준을 갖는 변형된 연어 젤라틴(-·-), 및 동일하되 3%(SG_CNW3 -·-, SG8_CNW3 -·-) 및 5%의 셀룰로스 나노휘스커(CNW)를 갖는 연어 젤라틴(SG_CNW5 -·-, SG8_CNW5 -·-)에 대한, 온도에 따른 저장 탄성률 G'이다. (b) a)의 곡선으로부터 외삽된, 상이한 젤라틴에 대한 최대 저장 탄성률 값의 막대 그래프이다.
도 29. 메타크릴로일기의 공유 가교를 유도하기 전에 젤화(물리적 가교)를 유도하는 온도에서 전처리에 의해 개선되는 기계적 특성이다. 결과를, 젤화를 유도하지 않는 온도에서의 전처리와 비교하였고, 소 젤라틴을 연어 젤라틴과 동시에 비교하였다. "소 0.5 LT"의 경우, 오로지 1개의 복제물(replica)만 존재하는 한편, 다른 시료들의 경우, n=3임을 주지한다. 0.5 = 라이신의 20% 작용화; 10% = 라이신의 90% 작용화.
도 30. "WST-1 세포 증식 비색검정법 키트"(K302, Biovision, USA)에 의해 평가된 캡슐화된 세포 증식이다. 3 WST-1 대사 정량화 복제물들을 이용하여 1개 조건 당 3회의 실험을 수행하였다. 1X PBS 중 10% (w/v)의 농도에서 변형된 젤라틴 용액으로부터 하이드로겔을 제조하였다. 추가로, 비교를 위해, 80% 라이신 작용화를 갖는 소 젤라틴 하이드로겔에서의 캡슐화를 포함시켰다. Nat-Bio 1 = 20% 작용화; Nat-Bio 2 = 60% 작용화; Nat-Bio 3 = 80% 작용화; Nat-Bio 4 = 90% 작용화.
도 31. 젤라틴 하이드로겔이 이식된 영역을 조사한 림프샘에 존재하는 림프성(lymphoid) 세포의 특징화이다. 연어 및 소 젤라틴 하이드로겔, 및 상이한 수준의 작용화(0.5 = 20% 작용화; 5 = 80% 작용화)를 비교한다. 20% 작용화에서의 연어 젤라틴 하이드로겔을 제외하고는, 이식 후 7일째에 상이한 조건들 사이에서 유의한 차이가 존재하지 않는다. 데이터가 예비용(n = 2)임을 고려하면, 하이드로겔이 존재한 결과가 아니라 수술적 시술 자체에 의해 발생되는 염증에 의한 림프성 세포의 증가를 배제하기 위해, 수술적 시술 대조군의 존재 하에 하기 실험을 수행해야 한다.
도 32. 변형된 연어 또는 소 젤라틴의 존재에 의한 전염증성 사이토카인의 생성이다. 하이드로겔을 이식한 마우스의 림프절로부터 단리한 세포를 시험관내에서 배양하고, 변형된 연어 또는 소 젤라틴의 존재에 의한 염증 유도 기억에 처리하였다. 연어 젤라틴과 비교하여 소 젤라틴으로 자극시킨 경우 더 큰 면역 반응이 관찰되고, 작용화도가 더 낮은 젤라틴의 경우 더 큰 면역 반응이 관찰된다. 네이브(naive) = 비-이식된 마우스; se = 자극 없음; aCD3 = 일반적인(자극된) T 세포 활성자; 0.5 = 20%에서 작용화된 젤라틴 하이드로겔을 이식한 마우스의 림프절로부터의 림프구; 5 = 80%에서 작용화된 젤라틴 하이드로겔을 이식한 마우스의 림프절로부터의 림프구; 하이드로 = 20% 또는 80% 자극되든지간에, 시험관내 배양물 내에서 변형된 젤라틴에 의한 기억 자극; IL-6 = 인터루킨 6; IFN감마 = 인터페론 감마. 염증 반응은 염증 인자(IL-6, IFN감마)의 생성과 연관이 있다.
도 33. 상이한 수준의 라이신 작용화(메타크릴로일기에 의한 작용화)에서 변형된 소 및 연어 젤라틴-계 하이드로겔 외식편의 조직학적 이미지이다. 20%(0.5%)에서 작용화된 젤라틴-계 하이드로겔의 경우, 심부 조직 통합, 세포 침범 및 혈관화가 관찰되며, 한편 더 높은 작용화(80%)의 경우, 세포는 주로 하이드로겔의 주변부에 머무른다. 20% 라이신에서 작용화된 연어 젤라틴-계 하이드로겔은 이들의 리모델링 수준으로 인해 회복될 수 없었다. 영역으로 이동한 세포의 활성에 의한 완전한 조직 통합 또는 생체물질의 신속한 분해가 추정된다.
도 34. 변형된 젤라틴-계 하이드로겔 침범 검정법이다. 이들 이미지는 이들 검정법의 음성 대조군(좌측) 및 양성 대조군(우측)에 상응한다. 특히, 이들 검정법은 트랜스웰 장치 내에서, 상부 챔버 및 하부 챔버를 나누는 다공성 막 상에서 1 mm의 하이드로겔 층을 형성함으로써 수행된다. 하이드로겔은 2.4% 농도에서 용액으로부터 변형된 젤라틴으로부터 형성된다. 검정법 후, 다공성 막의 하부 표면으로 이동한 세포는 청색으로 염색된다. 음성 대조군은 상부 챔버 및 하부 챔버 둘 다에서 이동 유도제의 존재 하에 수행된다(DMEM + 10% FBS). 양성 대조군은 하부 챔버에서만 이동 유도제의 존재 하에 수행된다.
도 35. 비-작용화된 연어 젤라틴(G.S.) 및 비-작용화된 소 젤라틴(G.B.)의 젤 강도이다.
도 36. 상이한 전단 속도에서의 점도 측정이다. a) 25℃에서 유지된 15% [p/v] 농도에서 연어 젤라틴의 용액이다. b) 25℃에서 유지된 15% [p/v] 농도에서 소 젤라틴의 용액이다. c) 3개의 상이한 농도(5%, 10%, 15% [w/v])에서 제조되고 25℃에서 유지된, 90%의 라이신이 메타크릴로일기에 의해 작용화된 연어 젤라틴의 용액이다. d) 3개의 상이한 농도(5%, 10%, 15% [w/v])에서 제조되고 25℃에서 유지된, 90%의 라이신이 메타크릴로일기에 의해 작용화된 소 젤라틴의 용액이다. 주지: 90% 메타크릴화된 연어 젤라틴의 경우, 점도는 매우 낮았으며, 장비에서 민감성 한계로 인해 부정확한, 특히 0.1 내지 10 s-1 측정을 생성한다. 오차 막대 = SD, n=3 실험.
도 37. 라이신 아민에서 90%의 메타크릴로일 작용화도를 갖는 연어 및 소 젤라틴에 대한 전단 유동에서 100 s-1에서 점도 측정에 대한 요약 그래프이다. 오차 막대 = SD, n = 3 실험.
도 38. a) 연어 및 소 젤라틴 유래 하이드로겔의 평균 압축 계수의 그래프적 비교 - DMA 상에서 수행된 시험이다. b) 연어 및 소 젤라틴 유래 하이드로겔의 인장 시험으로부터 수득된 평균 영률의 그래프적 비교 - 기계적 시험기를 사용하여 수행된 시험이다. * P < 0.05; ** P < 0.01 (Mann-Whitney), n = 5-6.
도 39. 콜라게나제 유형 2에 의한 하이드로겔 가수분해의 진행 곡선이다. 상이한 공급원 및 유사한 작용화도의 젤라틴으로부터 유래된 하이드로겔 사이에서 비교 가수분해 동역학이다(a)-(c). 동일한 젤라틴 공급원으로부터 유래되지만 상이한 작용화도를 갖는 하이드로겔 사이에서 비교 가수분해 동역학이다(d)-(e). 가수분해 반응을 37℃에서 3벌 중복 수행하였다. B2M, B5M, B10M은 0.5, 2 및 10 MAA [% v/v]에서 작용화 반응 처리된 젤라틴으로 제작된 하이드로겔을 나타낸다. B는 소를 나타내고 S는 연어를 나타낸다. 3개의 가수분해 반응을 이 실험에서 수행하였다. 오차 막대 = S.E.
도 40. a) OPA 검정법을 사용한 연어(SG) 및 소 젤라틴(BG) 내 유리 아민의 비교 정량화, 및 aa 조성물 분석을 기초로 하는 SG와 BG 사이에서 라이신 비교 정량화이다. b) SG 및 BG 폴리펩타이드의 분자량 SDS-PAGE 분석이다. 퍼센트는 소 정량화를 기준으로 계산되었다. AA 조성물 분석은 2벌 중복으로 수행되었고, OPA 분석은 3벌 중복으로 수행되었다.
도 41. OPA 방법을 사용한, 유리 아민 측정을 기초로 하는 작용화된 라이신의 정량화이다. 연어(SG) 및 소 젤라틴(BG)을, 0.5, 2, 5 및 10% (v/v)의 MAA가 보충된 10% 젤라틴 용액을 사용하여 메타크릴산 무수물(MAA)과 반응시켰다. 작용화된 젤라틴의 동일한 배치를 사용하여, OPA 검정법을 3회 수행하였다. 오차 막대: S.D.
도 42. 메타크릴로일의 상이한 치환도에서 소(a) 및 연어(b) 젤라틴의 1H-NMR 스펙트럼이다. 연어(SG) 및 소 젤라틴(BG)을, 0.5(즉, S0.5M), 2, 5 및 10% (v/v)의 MAA가 보충된 10% 젤라틴 용액을 사용하여 메타크릴산 무수물(MAA)과 반응시켰다. "a" 신호는 페닐알라닌에 상응하고, 피크 인테그럴(peaks integral)의 정규화에 사용하였다. "b" 신호(2.9 ppm.)는 라이신 메틸렌에 상응하고, 이의 환원은 라이신 작용화와 연관이 있다. "c" 신호(1.8 ppm.)는 메타크릴로일기의 존재와 관련이 있다. 비교 정량화를 위해, 스펙트럼 정규화를 페닐알라닌 신호(6.9-7.5 ppm, 스펙트럼에서 "a" 피크)를 사용하여 수행하였다.
도 43. 각각의 젤라틴 조제물의 1H-NMR 스펙트럼을 사용한 라이신 메틸렌 신호의 환원에서의 계산을 기초로 한, 작용화된 라이신의 정량화이다. 연어(SG) 및 소 젤라틴(BG)을, 0.5, 2, 5 및 10% (v/v)의 MAA가 보충된 10% 젤라틴 용액을 사용하여 메타크릴산 무수물(MAA)과 반응시켰다. 전체 연구에서 시험된 작용화된 젤라틴의 동일한 배치를 사용하여, 메타크릴화도를 독특한 NMR 실험 및 1H-NMR 스펙트럼으로부터 수득하였다.
도 44. 새로운 제제의 기계적 및 유동학적 시험이다. a) 압축 시험 및 b) 유동학적 시험을, 1% 및 5% [w/w]의 8arm-PEG10K-아크릴레이트 트리펜타에리트리톨이 보충된 가교된 SG8 제제(15% [w/v] 연어 젤라틴 작용화된 at 90%) 상에서 수행하였다.
도 45. 가교 반응성 및 흡습성의 수동 정성적 시험이다. a) 반응성 및 흡습성에 대해 수동으로 시험된 100 μm 두께의 하이드로겔의 사진이다. 프린터 헤드로부터 자외선 광을 2 및 4회 통과시킨 후, 비-가교된 하이드로겔의 존재에 의해 반응성을 평가하였다. 기계적 스크래칭 후 액체 용액만 존재함 = 비-가교됨; 기계적 스크래칭 후 액체 용액 및 덩어리진(lumpy) 하이드로겔이 존재함 = 부분적으로 가교됨; 기계적 스크래칭 실질적인 하이드로겔만 존재함 = 가교됨이다. 기계적 스크래칭 후 대체되는 용액 및 하이드로겔에 의해 흡습성을 평가하였다. 수화됨, 저 수화 및 건조라는 3개의 수준이 존재하였고, 이들 수준은 각각, 대체된 부피가 50 μl 하이드로겔, 25 μl 하이드로겔 및 0 μl인 것으로 대략 특징화된다. b) 스크래치 또는 하이드로겔 대체 프로토콜의 도식도이다.
도 46. 상이한 유형 및 양의 계면활성제가 보충된 마스터 제제(90%에서 작용화된 연어 젤라틴(SG8)의 15% [w/v] 용액)의 표면 장력이다. 변형된 연어 젤라틴 및 계면활성제의 농도는 각각 w/v% and v/v%로 표현된다. 오차 막대 = SD, n = 3 실험이다. 결과는 a) 300초의 평형화 후 정적 표면 장력으로 제시되고, b) 동적 표면 장력의 유도체로서 제시된다.
도 47. 새로운 제제를 기초로 한 하이드로겔 내에서 캡슐화된 세포에 대한 세포 생존력(viability)이다.
도 48. 상이한 pH 조건에서 추출된 연어 젤라틴에 대한 전기영동 SDS-PAGE이다.
도 49. 상이한 pH 조건에서 추출된 연어 젤라틴에 대한 젤 강도(블룸(bloom), g)이다.
도 50. 상이한 pH 조건에서 추출된 연어 젤라틴에 대한 온도(유동 온도 램프(flow temperature ramp)에 의해 시험됨)의 함수로서의 점도이다.
도 51. 상이한 pH 조건에서 추출된 연어 젤라틴에 대한 라만 스펙트럼이다.
도 52. a) 냉각 전처리 및 광가교 처리 시, 젤라틴 중합체 및 이의 구조적 변형을 도시한 그래프이다. 온도 저하 시 삼중 나선 형성 및 광-유도 공유 연결을 통한 후속적인 구조적 고정이 니타나 있다. b) 냉각 전처리된 경우, 다양한 메타크릴화도를 갖는 연어 젤라틴의 15% (w/v) 용액의 압축 계수 시험이다.
정의
본원에 사용된 바와 같이, "저온-적응된 해양생물종의 천연 공급원"은 생물학적 화합물, 특히 해양 저온 환경에 서식하거나 또는 적응된 살아 있는 생물종으로부터 추출된 젤라틴으로서 이해된다. 이와 같이, 이들 유형의 화합물, 특히 저온-적응된 중합체는 더 낮은 온도에서 양호하게 기능하기 위해 특수한 특성을 획득한다. 이들 특성 중 일부는, 포유류-유래 화합물과 비교하여 소정의 온도에서 더 낮은 점도, 더 낮은 젤화 온도, 더 낮은 온도에서 액체 상태 안정성, 용액 내에서 더 낮은 표면 장력, 및 더 높은 분자 이동성 또는 가요성이다.
본원에 사용된 바와 같이, "화학적으로 작용화된"은, 화학적 기가 화학적 또는 생화학적 반응에 의해 화학적 구조에 첨가된 화합물, 생물학적 화합물 또는 중합체로서 이해된다. 화학적 또는 생화학적 반응 동안 화학적 기가 첨가될 수 있는 위치는 원래의 화학적 구조에 존재하는 화학적 기의 반응성에 의해 결정될 수 있다. 추가로, 화합물 또는 중합체는, 작용화를 구성하는 새로운 화학적 기에 대한 접근을 제공하기 위해, 화학적 구조에 반응성 기를 첨가하고자 이전에 처리될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "아크릴로일기"는 구조 H2C=CH-C(=O)-를 갖는 에논 형태이며; 이는 아크릴산으로부터 유래된 아실기이다. 상기 기에 대한 바람직한 IUPAC 명칭은 프로프-2-에노일이고, 이는 또한 (덜 정확하게는) 아크릴릴 또는 간단히 아크릴로서 공지된다. 아크릴로일기를 함유하는 화합물은 "아크릴 화합물"로서 지칭될 수 있다. 아크릴 화합물은 전형적으로, α,β-불포화된 카르보닐 화합물이며: 이는 탄소-탄소 단일 결합에 의해 분리되는 탄소-탄소 이중 결합 및 탄소-산소 이중 결합(카르보닐)을 함유하며, 따라서 두 작용기 모두에 대해 특징적인 특성을 가진다:
- C=C 결합에서: 산 및 할로겐의 친전자성 첨가, 수소화, 하이드록실화 및 결합의 절단
- C=O 결합에서: 친핵성 치환(예컨대 에스테르에서) 또는 친핵성 첨가(예컨대 케톤에서).
아크릴산의 카르복실기는 암모니아와 반응하여 아크릴아미드를 형성할 수 있거나, 또는 알코올과 반응하여 아크릴레이트 에스테르를 형성할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "화학적 광개시제"는, 광 자극 또는 적용 후, 공유 결합이 절단되어 1개, 2개 이상의 라디칼을 형성하여 라디칼 중합을 돕는 화학적 화합물 또는 분자로서 이해된다.
본원에 사용된 바와 같이, "아미노산 사슬 젤라틴 중합체"는 펩타이드 결합에 의해 함께 연결된 일련의 아미노산 단량체로서 이해된다. 아미노산 동일성의 특정 서열로서 결합된 아미노산의 이러한 사슬은 콜라겐 유형 I의 서열에 상응하지만, 추출 과정 후, 이들 콜라겐 중합체는 일부 아미노산 변형을 받게 되고, 추출 조건에 따라 서열의 단축이 소정의 연장(extend)까지 수행된다. 이러한 방식으로, 젤라틴은 부분적으로 가수분해되고 변성된 콜라겐으로서 이해된다.
본원에 사용된 바와 같이, "아미노산 측쇄에서의 작용화도"는, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 다르게는 공유 결합된 아미노산의 서열을 포함하는 아미노산의 총 수로부터, 화학적 변형을 받아 그 결과 원래의 화학적 구조에 화학적 기가 첨가된 아미노산의 수로서 이해된다.
본원에 사용된 바와 같이, "냉각 전처리"는, 화합물 또는 중합체가 실온보다 낮은 온도, 대략 21℃보다 낮은 온도에서 인큐베이션되는 과정에서의 단계로서 이해된다.
본원에 사용된 바와 같이, "용액"은 2개 이상의 성분들로 구성된 균질한 혼합물이다. 이러한 혼합물에서, 용질은 용매로 공지된 또 다른 성분에 용해된 성분이다. 용액은 이의 상(phase)을 포함하여 용매의 특징을 다소 닮으며, 용매는 보편적으로 혼합물의 주요 부분을 차지한다. 용액 중 용질의 농도는, 얼마나 많은 상기 용질이 용매 중에 용해되어 있는지를, 얼마나 많은 용매가 염처럼 존재하는지에 관하여 측정한 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, "3D 프린팅"은 연속적인 층별(layer by layer) 발생 단계에서 통상적으로 제작되는 3차원 구조물의 제조 과정으로서 이해된다. 이러한 3D 프린팅은 조각술(carving)과 구별되는데, 상기 3D 프린팅은 구조물의 주변 경계부로부터 접근 가능하거나 또는 접근 가능하지 않은 특정 구조물을 제작하는 한편, 조각술은 원래의 고체로부터 재료를 제거함으로써 특징부를 재형성하고, 여기서 모든 제작된 구조물이 외부로부터 접근 가능하기 때문이다.
본원에 사용된 바와 같이, "압출 시스템(적층 제작)"은, 압력을 가하여 물질을 노즐에 통과시킴으로써 상기 물질을 표면 상에 증착시킬 수 있는 시스템으로서 이해된다.
본원에 사용된 바와 같이, "분무 시스템"은, 압력을 가하여 물질을 특수 설계된 노즐을 통해 밀어넣음으로써 작은 확산성 입자 또는 액적을 생성할 수 있는 시스템으로서 이해된다.
본원에 사용된 바와 같이, "주조"는 이전에 형성된 몰드를 충전하여, 경화, 중합 또는 가교 후, 충전제 물질 밖으로 특정 형상을 재형성하는 과정으로서 이해된다.
본원에 사용된 바와 같이, "마이크로- 및 나노 섬유 제작 시스템(전기방사)"은, 압출 노즐과 물질 증착 구역 사이의 강한 전기장 형태 내에서 중합체 용액을 압출시켜, 상기 중합체의 나노섬유 및 마이크로섬유를 보다 고체 상태에서 증착시키는 시스템으로서 이해된다. 용어 "전기방사"는 당업계에 공지되어 있고, 하전된 중합체 분사물(jet)이 컬렉터 접지(grounded collector) 상에서 수합되고; 신속하게 회전하는 컬렉터가 나노섬유를 정렬시키는 한편, 정지형 컬렉터가 섬유 매트를 무작위로 배향시키는 과정이다. 중합체 분사물은, 적용된 정전하가 용액의 표면 장력을 극복할 때 형성된다. 주어진 중합체에 대해 최소 농도가 존재하며, 이를 임계 얽힘 농도(critical entanglement concentration)라고 하며, 이 농도보다 낮은 농도에서 안정한 분사가 달성될 수 없고, 나노입자가 달성될 수 있더라도 나노섬유는 더 이상 형성되지 않을 것이다(전기분무(electrospray)). 안정한 분사물은 2개의 도메인인 스트리밍 분절(segment) 및 휘핑(whipping) 분절을 갖는다. 휘핑 분사물은 통상 육안으로는 보이지 않는 한편, 스트리밍 분절은 종종 적절한 광 조건 하에 볼 수 있다. 스트림의 길이, 두께, 일관성(consistency) 및 움직임을 관찰하는 것은, 형성중인 나노섬유의 정렬 및 형태를 예측하는 데 유용하다. 스트림은, 용액의 조성 및 전기방사 장치의 배치를 조정함으로써 최적화될 수 있으며, 따라서 생성중인 섬유의 정렬 및 형태를 최적화될 수 있다. 본원에 사용되는 중합체를 전기방사하기 위한 임의의 공지된 방법은, 본원에 개시된 다기능성 생체물질을 제공하기 위한 본 발명의 방법과 함께 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "미세유체장치"는 마이크로미터 크기의 채널 회로로 구성된 장치로서 이해되며, 여기서, 유체는 상기 채널 내에서 관류되어 일반적으로 층류(평행 벡터를 갖는 유동 및 비-난류(non-turbulent flow))를 형성한다.
상세한 설명
이미 언급된 바와 같이, 생체의학 분야는 치료 또는 진단 적용의 결과에 영향을 미치는 많은 물리화학적 및 생물학적 특성을 요구한다. 이들 특성 중 일부는 세포 구성성분의 미세환경의 조절, 및 특정 생물학적 반응 및 세포의 생물학적 활성에 반응한 생체물질의 능동적인 리모델링에서 유래되는 세포와 생체물질의 직접적인 상호작용과 관련이 있다. 이들 특성은 또한, 생물학적으로 의미 있는 요소의 조절 전달, 세포융화성, 생물활성 및 생물분해성으로 열거되어 있다. 한편, 영양 분야에서, 캡슐화된 비타민 또는 다른 활성 화합물의 보충을 위한 분무 시스템 또는 비드 제작과 같이 식품 코팅의 증착을 위한 특수하고 비용-효율적인 기술이 요망되고 있다. 안타깝게도, 이들 두 분야는 모두, 지금까지 사용된 대부분의 생체물질의 차선의 유동학적 성질 및 중합/가교의 조절로 인해, 성능이 제한된다. 따라서, 이들 기술에 사용하기 위한 새로운 생체물질이 절실히 요망된다. 결과적으로, 생체의학 및 식품에서 최적의 적용에 요망되는 기하학적 특성, 생물학적 특성 및 물리학적 특성을 갖는 구조적으로 복잡한 스캐폴드를 제조할 수 있는 신규의 고도 생물활성적 생체물질이 여전히 요망되고 있다.
본 발명은, 저온-적응된 해양생물종, 바람직하게는 살모 또는 온코린쿠스 속의 천연 공급원으로부터 유래되고, 유리 라디칼의 존재 하에 중합 또는 가교에 반응성으로 되도록 화학적으로 작용화된 아미노산 사슬 젤라틴 중합체를 포함하는 조성물(이하, "본 발명의 조성물")을 제공함으로써, 상기 문제점을 해결한다. 작용화의 성질은 메타크릴로일기 내지 아크릴로일기를 포함하여 다양할 수 있을 것이다(본 발명의 내용 참조). 생체물질의 이러한 화학적 작용화는, 이러한 화학적으로 작용화된 하이드로겔이 유리 라디칼 처리될 때, 보다 고형이고 열적으로 안정한 하이드로겔로의 중합 또는 가교의 신속한 조절을 제공한다. 더욱이 놀랍게도, 이러한 작용화는 하기 예시된 바와 같이, 생체물질의 유동학적 특성을 변형시킨다.
이러한 유동학적 특성을 예시하기 위해, 본 발명자들은 본 발명의 조성물의 베이직 제제를 제조하였으며, 이는 약 1% 내지 20% (w/v)의 농도의 메타크릴로일 연어 젤라틴 용액을 포함하고, 약 0.01% 내지 5% (w/v) 농도의 화학적 광개시제(소정의 파장에서 강한 광의 존재 하에 유리 라디칼을 발생시킴)를 첨가한 것이다. 상이한 아미노산 측쇄, 특히 라이신에서의 화학적 작용화도는 1% 내지 100%일 수 있다. 이러한 용액의 중합 또는 가교는 광에 노출됨으로써 유도된다. 본 발명자들은 또한, 약 1% 내지 20% (w/v)의 농도의 메타크릴로일 소 젤라틴 용액을 포함하고, 약 0.01% 내지 5% (w/v) 농도의 화학적 광개시제(소정의 파장에서 강한 광의 존재 하에 유리 라디칼을 발생시킴)를 첨가한 추가의 베이직 제제를 비교예로서 제조하였다. 마지막으로, 본 발명자들은 또한, 약 1% 내지 20% (w/v)의 농도의 비-메타크릴로일 연어 젤라틴 용액을 제조하였다. 이들 모든 용액을 본 명세서에 상술된 실시예 1 내지 3에 따라 제조하였다.
도 1에 도시된 바와 같이, 25℃에서, 젤라틴 용액, 메타크릴로일 소 젤라틴 용액 및 메타크릴로일 연어 젤라틴 용액 둘 다에서 농도 증가가 존재한다. 그러나, 100 s-1 전단 유동에서 측정된 바와 같이 이러한 점도 증가는 메타크릴레이트화된 연어 젤라틴과 비교하여 메타크릴레이트화된 소 젤라틴에서 훨씬 더 높은 증가를 제공하였다. 사실상, 약 1% 내지 20% (w/v) 농도의 메타크릴레이트화된 연어 젤라틴 용액은, 하기 유동학적 특성을 갖는 아미노산 중합체를 포함하는 용액을 제공하였다:
o 25℃에서의 점도: 3 - 20 센티푸아즈.
o 37℃에서의 점도: 1.5 - 8 센티푸아즈.
이들 점도 값은 바이오 가공 기술, 예컨대 비제한적으로 분무 또는 3D 프린팅에 특히 유용한데, 이들 기술의 고성능 기능화가 액체 상태의 생체물질의 유동학적 특성에 고도로 의존하기 때문이다.
도 2에 도시된 바와 같이 젤화 온도에 관하여, 15% 농도 (w/v)에서 메타크릴레이트화된 연어 젤라틴(SG8)은 비-메타크릴레이트화된 연어 젤라틴(SG)과 비교하여 이의 젤화 온도를 낮추며, 따라서 메타크릴레이트화된 연어 젤라틴을 더 넓은 온도 범위에서 보다 유동학적으로 안정하게 만든다. 또한, 도 2에 예시된 다른 곡선들은 셀룰로스 나노휘스커(CNW)와 같은 충전제 분자를 포함한 복합물들에 상응한다. 이러한 복합물은 유사한 젤화/온도 상관관계를 보여주지만 더 높은 전단 계수를 보여주었다. 이러한 더 높은 전단 계수로 인해, 이들 복합물은 잉크젯 바이오-프린팅 공정에서 훨씬 덜 선호하게 된다.
또한, 도 3에 도시된 바와 같이, 전단 유동의 변화에 반응한 유체 점도의 변화에서, 소 젤라틴은 비-뉴턴형 유체 거동에 전형적인 전단 담화 효과를 보여주며, 한편 메타크릴레이트화된 연어 젤라틴의 경우 뉴턴형 거동이 관찰된다(전단 유동의 증가 결과 점도 변화가 없음). 특히, 5% 내지 20%의 메타크릴로일 연어 중합체의 농도 범위에서, 상기 용액은 뉴턴형 용액으로서 거동하였다.
더욱이, 도 4에 도시된 바와 같이, 소 또는 연어로부터 수득된 메타크릴레이트 젤라틴을 비교하면, 연어는 상이한 전단 유동에서 훨씬 더 낮은 점도값을 보여주었다. 또한, 메타크릴레이트화된 연어 젤라틴은 상이한 농도에서 뉴턴형 거동을 보여주었다. 한편, 모든 시험된 농도에서 메타크릴레이트화된 소 젤라틴은 비-뉴턴형 거동을 보여주었다.
추가로, 현재까지 수행된 실험에서 표면 장력이 계산되지는 않았지만, 0.01% 내지 5% 이하 농도의 계면활성제를 첨가하는 것은 메타크릴레이트화된 연어 젤라틴의 점도 또는 뉴턴형 거동을 변화시키지 않음을 주지한다. 이는, 생체물질 용액의 표면 장력이 예컨대 Kolliphor® P 188(Sigma-Aldrich)와 같은 계면활성제를 첨가함으로써 조절될 수 있음을 의미한다.
3d 프린팅 기술, 예컨대 고정밀 잉크젯(폴리젯, stratasys)에서, 20 센티푸아즈 초과의 점도를 갖는 프린팅 생체물질은 3D 프린팅 성능을 유의하게 저하시킨다. 상기 언급된 바와 같이, 메타크릴레이트화된 연어 젤라틴 용액은 넓은 온도 범위에서 20 센티푸아즈보다 낮은 점도를 가지며, 이로써 이러한 용액 또는 조성물은 넓은 온도 범위에서 이러한 낮은 점도를 필요로 하는 3d 프린팅 기술 및 다른 적용(즉, 식품 코팅 적용을 위한 분무)에 특히 유용하게 된다. 유사하게는, 비-뉴턴형 거동 또는 높은 표면 장력을 갖는 생체물질은 또한, 바이오 가공 기술을 저하시킨다. 이러한 측면에서, 상기 언급된 바와 같이 메타크릴레이트화된 연어 젤라틴 용액은 넓은 농도 및 온도 범위에서 뉴턴형 용액으로서 거동하였다.
더욱이, 액체 상태의 안정성 및 신속한 중합은 바이오 가공 기술, 예컨대 3D 프린팅에서 중요한 또 다른 양태이다. 이러한 의미에서, 실온에 근접한 젤화 온도를 갖는 생체물질은 프린팅 공정 동안, 이들 시스템에서 심각한 저하 효과를 유발하였으며, 결국에는 생체물질의 젤화로 인해 프린터 헤드에서 유동 회로가 막혔다. 동일한 문제점은 미세유체장치 시스템에서도 발생하며, 이러한 시스템에서, 이들의 기능은 나노리터 및 마이크로리터 층류의 정밀한 조절을 기초로 하며, 여기서 점도 및 젤화의 임의의 변화 사건은 시스템 내에서 유동 조절을 방해한다. 마찬가지로, 분무 시스템은 고도로 점성이거나 또는 더 심하게는 젤화 생체물질을 사용하여 수행될 수 없다.
상기 이유들 모두에 대해, 저온-적응된 해양생물종, 바람직하게는 살모 또는 온코린쿠스 속의 천연 공급원으로부터 유래되고, 유리 라디칼의 존재 하에 중합 또는 가교에 대해 반응성으로 되도록 화학적으로 작용화된 아미노산 사슬 젤라틴 중합체를 1% 내지 20% (w/v)의 농도로 포함하는 용액은 생체의학 적용 또는 영양 분야에서의 적용에 사용하기 위한 바이오 가공 기술, 예컨대 3D 프린팅, 미세유체장치 시스템 및 분무 시스템에 특히 적합한 유동학적 특성을 갖는 조성물을 제공한다.
따라서, 제1 양태에서, 본 발명은 저온-적응된 해양생물종의 천연 공급원으로부터 유래된 아미노산 사슬 젤라틴 중합체를 1% 내지 20% (w/v)의 농도로 포함하는 용액을 포함하는 조성물에 관한 것이고, 상기 조성물은 선택적으로 광개시제와 같은 중합 개시제를 추가로 포함하고, 유리 라디칼의 존재 하에 중합 또는 가교에 대해 반응성으로 되도록 화학적으로 작용화된다.
상기 언급된 바와 같이, 젤라틴은 뼈, 피부 및 결합 조직의 주요 섬유성 단백질의 구성분인 콜라겐의 부분 가수분해에 의해 수득된다. 콜라겐의 공급원은 젤라틴의 특성에 영향을 미치는 것으로 당업계에 공지되어 있다.
저온-적응된 해양생물종의 천연 공급원으로부터 유래된 아미노산 사슬 젤라틴 중합체로는, 예를 들어 저온-적응된 해양 어류종(예를 들어 이의 껍질, 뼈, 지느러미 및/또는 비늘)으로부터 유래된 아미노산 사슬 젤라틴 중합체를 포함한다. 저온-적응된 해양 어류종의 목록은 가두스(Gadus) 속, 예컨대 대구(예를 들어 가두스 모후아(Gadus morhua) 또는 가두스 마크로세팔루스(Gadus macrocephalus)) 또는 알라스카 폴록(Allaska Pollok)(가두스 찰코그람무스(Gadus chalcogrammus)), 살모 속, 예컨대 대서양 연어(살모 살라(Salmo salar)), 온코린쿠스 속(태평양 연어), 예컨대 곱사 송어(pink salmon)(온코린쿠스 고르부스차(Oncorhynchus gorbuscha)), 왕 연어(Chinook salmon)(온코린쿠스 샤비트챠(Oncorhynchus tshawytscha)), 백 연어(Chum salmon)(온코린쿠스 케타(Oncorhynchus keta)), 은 연어(Coho salmon)(온코린쿠스 키수츠(Oncorhynchus kisutch)), 참 송어(Masu salmon)(온코린쿠스 마소우(Oncorhynchus masou)) 및 홍 연어(Sockeye salmon)(온코린쿠스 네르카(Oncorhynchus nerka)), 대구과(Gadidae family)에 대구로서 속하는 해덕대구(haddock)(멜라노그람무스 애글레피누스(Melanogrammus aeglefinus)); 및 메를루키우스(Merluccius) 속의 구성원을 포함한다. Gomez-Guillen M C 등(Food Hydrocolloids 2011, 25(8) 1813-1827)에 의해 언급된 바와 같이 이러한 목록은 특별히 제한되지 않으며, 젤라틴 추출에 적합한 어류 또는 해양생물종의 수는 계속적으로 증가하고 있다.
최근, 어류 젤라틴을 구조적으로 및 기능적으로 특징화하고자 하는 몇몇 연구들이 수행되어 왔으며, 예를 들어 Leuenberger BH: Food Hydrocolloids 1991, 5(4) 353-61. Lim et al: Food Science 1999, 64(4), 616-22; Choi and Regenstein Food Science 2000, 65(2), 194-9; Gilsenan PM et al: Food Hydrocolloids 2000, 14(3), 191-5; Gomez-Guillen MC et al: Journal of Science and Food Agriculture 2001, 81(7), 665-73; Haug IJ et al: Food Hydrocolloids 2004, 18(2), 203-13; Cho SM et al: Food Hydrocolloids 2005, 19(2), 221-9, Gomez-Guillen M C et al: Food Hydrocolloids 2011, 25(8) 1813-1827; Karim A A et al: Food Hydrocolloids 2009, 23(3), 563-576; 및 Boran G and Regenstein JM, Adv Food Nutr Res. 2010;60:119-43을 참조하며, 이들은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
젤라틴의 아미노산 조성은 이의 부모 콜라겐의 아미노산 조성과 매우 흡사하며, Gly-X-Y 트리플렛의 반복 서열을 특징으로 하고, 여기서, X는 대체로 프롤린이고, Y는 대체로 하이드록시프롤린이다. 어류 젤라틴, 특히 저온-적응된 생물종은 포유류 종으로부터 단리된 젤라틴보다 더 낮은 함량의 프롤린 및 하이드록시프롤린을 갖는 것을 특징으로 한다(Karim A A et al: Food Hydrocolloids 2009, 23(3), 563-576).
전반적으로, 어류 젤라틴은 포유류 젤라틴과 비교하여 더 낮은 농도의 이미노산(프롤린 및 하이드록시프롤린)을 가지며, 온수성 어류 젤라틴(예컨대 눈다랑어 및 틸라피아(tilapia))은 냉수성 어류(예컨대 대구, 와이팅(whiting) 및 큰 넙치(halibut)) 젤라틴보다 더 높은 아미노산 함량을 가진다(Eastoe & Leach, chemical constitution of gelatin. In A. G. Ward, & A. Courts (Eds.), The science and technology of gelatin (pp. 73-107). New York: Academic Press). 프롤린 및 하이드록시프롤린 함량은 포유류 젤라틴의 경우 대략 30%이며, 온수성 어류 젤라틴(틸라피아 및 나일 퍼치(Nile perch))의 경우 22-25%이고, 냉수성 어류 젤라틴(대구)의 경우 17%이다(Muyonga et al., Food Hydrocolloids. 2004, 18. 581-592). 이를 예시하기 위해, Karim A A 등(Food Hydrocolloids 2009, 23(3), 563-576)은 표 2에서 일부 어류 젤라틴의 아미노산 함량을 돼지 젤라틴과 비교하여 보여준다(잔기의 수/1000개 아미노산 잔기).
특정 구현예에서, 선택적으로 상기 또는 하기에 기재된 특징들 중 하나 이상과 조합하여, 본 발명의 저온-적응된 해양생물종의 천연 공급원으로부터 유래된 아미노산 사슬 젤라틴 중합체는 20% 이하, 바람직하게는 19%, 18%, 17%, 16% 또는 15% 이하의 프롤린 및 하이드록시프롤린 함량을 제시하는 것을 특징으로 한다. 이에 더하여 또는 대안적으로, 이러한 아미노산 사슬 젤라틴 중합체는 총 1000개 아미노산 잔기 당 50 내지 60개의 하이드록시프롤린 잔기, 및 총 1000개 아미노산 잔기 당 95 내지 115개의 프롤린 잔기를 제시하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 제1 양태의 바람직한 구현예에서, 선택적으로 상기 또는 하기에 기재된 특징들 중 하나 이상과 조합하여, 젤라틴 중합체는 살모 또는 온코린쿠스 속으로부터 유래되고, 바람직하게는 젤라틴 중합체는 연어로부터 유래된다.
바람직하게는, 본 조성물은 5% 내지 20% (w/v) 농도의 아미노산 사슬 젤라틴 중합체를 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 조성물은 계면활성제를 추가로 포함한다. 보다 더 바람직하게는, 조성물의 아미노산 사슬 젤라틴 중합체는 중합체의 형성 또는 표면 또는 다른 분자와의 반응을 매개할 수 있는 메타크릴로일기, 아크릴로일기 또는 임의의 작용기 또는 모이어티로 구성된 군으로부터 선택되는 화학제에 의해 작용화된다. 작용기는 본원에 교시된 다양한 라디칼 및 화학적 엔터티를 포함하고, 알케닐 모이어티, 예컨대 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 디메타크릴레이트, 올리고아크릴레이트, 올리고메타크릴레이트, 에타크릴레이트, 이타코네이트 또는 아크릴아미드를 포함한다. 추가 작용기는 알데하이드를 포함한다. 다른 작용기는 에틸렌적으로 불포화된 단량체, 예를 들어, 아크릴산 또는 메타크릴산의 알킬 에스테르, 예컨대 메틸 메타크릴레이트, 에틸 메타크릴레이트, 부틸 메타크릴레이트, 에틸 아크릴레이트, 부틸 아크릴레이트, 헥실 아크릴레이트, n-옥틸 아크릴레이트, 라우릴 메타크릴레이트, 2-에틸헥실 메타크릴레이트, 노닐 아크릴레이트, 벤질 메타크릴레이트, 동일한 산의 하이드록시알킬 에스테르, 예컨대 2-하이드록시에틸 아크릴레이트, 2-하이드록시에틸 메타크릴레이트 및 2-하이드록시프로필 메타크릴레이트, 동일한 산의 니트릴 및 아미드, 예컨대 아크릴로니트릴, 메타크릴로니트릴 및 메타크릴아미드, 비닐 아세테이트, 비닐 프로피오네이트, 비닐리덴 클로라이드, 비닐 클로라이드, 및 비닐 방향족 화합물, 예컨대 스티렌, t-부틸 스티렌 및 비닐 톨루엔, 디알킬 말레에이트, 디알킬 이타코네이트, 디알킬 메틸렌-말로네이트, 이소프렌 및 부타디엔을 포함할 수 있다. 카르복실산 기를 함유하는 적합한 에틸렌적으로 불포화된 단량체는 아크릴 단량체, 예컨대 아크릴산, 메타크릴산, 에타크릴산, 이타콘산, 말레산, 푸마르산, 모노메틸 이타코네이트, 모노에틸 이타코네이트 및 모노부틸 이타코네이트를 포함하여 모노알킬 이타코네이트, 모노메틸 말레에이트, 모노에틸 말레에이트 및 모노부틸 말레에이트를 포함하여 모노알킬 말레에이트, 시트라콘산, 및 스티렌 카르복실산을 포함한다. 적합한 폴리에틸렌적으로 불포화된 단량체는 부타디엔, 이소프렌, 알릴메타크릴레이트, 알킬 디올의 디아크릴레이트, 예컨대 부탄디올 디아크릴레이트 및 헥산디올 디아크릴레이트, 디비닐 벤젠 등을 포함한다. 아미노산 사슬이 메타크릴로일기에 의해 작용화되는 것이 바람직하다.
언급된 바와 같이, 이러한 용액 또는 조성물은 유리 라디칼에 반응성인 화학적 기에 의해 작용화되어, 광개시제와 조합되고 상기 광개시제의 성질에 따라 광, 가시광선, 자외선 또는 적외선에 노출되는 경우, 신속한 중합/가교를 가능하게 한다. 바람직한 화학적 기는 메타크릴로일기 또는 아크릴로일기이다. 본 발명에 유용한 적합한 광개시제는 당업계에 잘 공지되어 있다.
본 발명의 제1 양태의 바람직한 구현예에서, 선택적으로 상기 또는 하기에 기재된 특징들 중 하나 이상과 조합하여, 중합 개시제는 바람직하게는 약 0.01% 내지 5% (w/v) 농도의 광개시제, 예컨대 Irgacure® 2959[(Ciba specialty chemical, 현재 BASF Resins]이다. 본 발명의 맥락에서, "중합 개시제"는 단량체 또는 마크로머의 중합을 예를 들어, 유리 라디칼 발생에 의해 개시할 수 있는 임의의 성분을 지칭함을 주지한다. 중합 개시제는 종종 산화제이다. 예시적인 중합 개시제는 예를 들어, 전자기 방사선 또는 열에 노출됨으로써 활성화되는 것들을 포함한다. 중합 개시제가 또한 사용될 수 있고, 예를 들어 미국 특허 출원 공개 2010/0137241에 기재되어 있으며, 이 문헌은 그 전체가 원용에 의해 포함된다.
추가로, 1% 내지 20%, 바람직하게는 5% 내지 20% 농도 범위의 화학적으로 작용화된 중합체를 갖는 이러한 용액 또는 조성물은 아미노산 측쇄, 특히 라이신에서 5% 내지 100%의 가변적인 작용화도를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 이러한 용액 또는 조성물은 아미노산 측쇄, 특히 라이신에서, 20% 내지 100%, 30% 내지 100%, 50% 내지 100%, 60% 내지 100%, 70% 내지 100%, 80% 내지 100%, 또는 90% 내지 100%, 바람직하게는 약 90%의 가변적인 작용화도를 포함한다.
콜라겐이 가용성 젤라틴으로 전환되는 것은 화학적 또는 효소적 가수분해에 의해 달성될 수 있다. 이러한 과정은 콜라겐에 존재하는 많은 분자내 및 분자간 공유 가교를 절단시킨다. 또한, 콜라겐 분자의 사슬 내 일부 아미드 결합은 가수분해를 받는다. 추출 과정은 폴리펩타이드 사슬의 길이, 및 젤라틴의 기능적 특성에 영향을 미칠 수 있다.
전형적으로, 화학적 가수분해는 콜라겐을 산 또는 알칼리 내에서 온화하게(mildly) 가열하여, 가교 결합을 절단하는 것을 포함한다. 일반적으로, 온화한 산 전처리는 젤라틴 추출 전에 사용된다. 어류 젤라틴은 많은 상이한 방법을 사용하여 추출되어 왔다. 어류 껍질 콜라겐에서 확인되는 가교의 산 불안정성 때문에, 온화한 산 처리는 일반적으로, 적절한 팽윤(swelling)을 생성하고 비공유 분자내 및 분자간 결합을 방해하기에 충분하다. 저온-적응된 해양생물종의 젤라틴의 추출 pH는 전형적으로 3 내지 5.5, 바람직하게는 4 내지 5, 예컨대 약 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9 또는 5이고, 보다 바람직하게는 추출 pH는 약 5이다. 콜라겐 추출 수율을 높이기 위해, 적절한 프로테아제 저해제(예를 들어 펩스타틴 A)가 또한, 추출 과정 동안 사용될 수 있다. Karim A.A.et al. Food Hydrocolloids 2009, 23(3), 563-576의 표 4는 어류 젤라틴 추출에 대해 이전에 기재된 몇 가지 방법들을 요약한 것이며, 이러한 방법들은 본 발명의 저온-적응된 해양생물종의 천연 공급원으로부터 유래된 아미노산 사슬 젤라틴 중합체의 추출에 사용될 수 있다.
특정 구현예에서, 저온-적응된 해양생물종의 천연 공급원으로부터 유래된 아미노산 사슬 젤라틴 중합체의 추출 방법은 온화한 산성 전처리 및 온화한 염기성 전처리를 포함한다. 바람직하게는, 상기 젤라틴 추출 방법은
- 약 pH 13에서의 알칼리성(alkalyne) 가수분해(예를 들어 pH: 13.4에서 NaOH 0.1 M 이용);
- 약 pH 4에서의 산성 가수분해(예를 들어 pH: 3.8에서 아세트산 0.05 M); 및
- 50℃ 내지 70℃(바람직하게는 약 60℃)의 온도 및 pH 3 내지 5.5(바람직하게는 약 pH 5)의 pH 조정에서의 젤라틴 추출. 인큐베이션 시간은 특별히 제한되지 않고, 통상 수분 내지 수시간, 바람직하게는 2 내지 4시간, 보다 바람직하게는 3.5시간이 소요된다. 바람직한 구현예에서, 젤라틴 추출은 60℃및 약 pH 5에서 3.5시간 동안 발생한다.
상기 조성물은 계면활성제를 0.001% 내지 10%, 바람직하게는 0.01% 내지 1% 농도로 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 계면활성제는 SDS, tween 20 및 폴록사머(예컨대 Kolliphor® P 188(Sigma-Aldrich)) 등으로 구성된 군으로부터 선택된다.
또 다른 구현예에서, 상기 계면활성제는 생체적합성 계면활성제이다. 생체적합성 계면활성제는 당업계에 잘 공지되어 있으며, 예시적인 비제한적 예로서 퍼플루오로로펜탄(PFP), 폴리에틸렌 옥사이드-코-폴리락트산(PEO-PLA), 폴리에틸렌 옥사이드-코-폴리-ε-카프로락톤(PEO-PCL), 　세틸 트리메틸 암모늄 브로마이드(CTAB), 소 혈청 알부민(BSA), Pico-Surf™ 1, Novec™ 7500, FC-40, 아미노산-계 계면활성제(1개의 단일 사슬을 갖는 아미노산-계 계면활성제, 시스테인 또는 아르기닌 저미니(gemini) 계면활성제, 라이신 유도체, 및 글리세롤지질-유사 구조를 갖는 계면활성제)를 포함한다. 바람직하게는, 이러한 생체적합성 계면활성제는 플루오로계면활성제로 구성된 군으로부터 선택된다. 플루오로계면활성제는 퍼플루오르화된 알킬 꼬리를 제시하는 것을 특징으로 한다. 이들 계면활성제는 표면 장력을 감소시키는 데 있어서 비-퍼플루오르화된 계면활성제보다 효율적인 것으로 나타나 있다. 그러나, 이들 화합물은 생체축적되고 따라서 독성인 것으로 공지되어 있는 단점과 연관되어 있다. 생체적합성 플루오로계면활성제로는, 예를 들어 퍼플루오로로헥산산(PFHxA),　퍼플루오로로부탄술폰산 및 퍼플루오로로부탄 술포네이트(PFBS)가 있다. 6개 미만의 탄소로 구성된 알킬 꼬리가 있는 퍼플루오르화된 계면활성제는 감소된 생체축적을 갖는 것으로 나타나 있다. 이에, 바람직한 구현예에서, 상기 생체적합성 계면활성제는 6개 미만의 탄소로 구성된 알킬 꼬리가 있는 퍼플루오르화된 계면활성제이다. 이러한 계면활성제로는, Novec FC-4430(3M™,　Zonyl FSN-100(DuPont™) y 트리실록산 계면활성제(Silwet L-77) 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 6개 미만의 탄소로 구성된 알킬 꼬리가 있는 특히 바람직한 퍼플루오르화된 계면활성제는 분기화된(ramified) 짧은 알킬 꼬리, 예컨대 2, 3, 4 또는 5개 탄소, 바람직하게는 2개 탄소로 구성된 알킬 꼬리가 있는 플루오로계면활성제이다. 보다 바람직한 구현예에서, 이들 계면활성제는 몇 개의 C2F5 사슬을 포함하는 분지형 플루오로계면활성제이다. 이들 계면활성제로는, Merck사에 의해 개발된 TIVIDA™ 계면활성제, 예컨대 TIVIDA 2300 및 TIVIDA 2500이 있다.
실시예 9.2는 6개 미만의 탄소를 갖는 분지형 플루오로계면활성제(즉, TIVIDA 2300 및 TIVIDA 2500)가 감소된 세포 독성(주목할 만하게는, 세포독성인 것으로 확인된 BYK-345와 비교) 및 개선된 세포 생존력(변형된 연어 젤라틴만 기초로 한 하이드로겔 대조군보다 더 높았음)을 가짐을 보여준다. 이러한 더 양호한 세포 생존력은 플루오로계면활성제(TIVIDA 2300, TIVIDA 2500)의 존재로 인해 하이드로겔 내에서 영양소, 대사물질 및 기체의 더 높은 확산 계수와 상관관계가 있을 가능성이 있다.
특정 구현예에서, 선택적으로 상기 또는 하기에 기재된 특징들 중 하나 이상과 조합하여, 6개 미만의 탄소로 구성된 알킬 꼬리가 있는 상기 플루오로계면활성제는 0.005% 내지 0.1% (w/v), 바람직하게는 0.01% 내지 0.03% (w/v), 보다 더 바람직하게는 약 0.02% (w/v)의 농도로 존재한다.
또한, 상기 조성물은 분지형 폴리에틸렌글리콜 유도체, 예컨대 멀티-암 PEG 유도체를 포함할 수 있다. 분지형의 농도는 0.1% 내지 10% (w/w), 바람직하게는 1% 내지 5% (w/w), 보다 바람직하게는 약 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4.5% 또는 약 5%일 수 있다. 바람직한 분지형 PEG 유도체는 트리펜타에리트리톨(8ARM(TP) PEG)(본원에서 8arm-PEG10K-아크릴레이트로도 지칭됨), 트리펜타에리트리톨헥사글리세롤(8ARM PEG), 디펜타에리트리톨(6ARM PEG), 펜타에리트리톨(4ARM PEG), 글리세롤(3ARM PEG), 3arm 및 4arm 헤테로작용성 PEG 및 마지막으로 헤테로이작용성 PEG로 구성된 군으로부터 선택된다. 이들은 모두 가변적인 PEG 길이를 가질 수 있을 것이다.
실시예 9.1에서, 분지형 폴리에틸렌글리콜 유도체, 예컨대 멀티-암 PEG 유도체를 1% and 5% (w/w)의 농도로 추가로 포함하는 본 발명의 조성물의 자외선 광에 노출시켰을 때 그 저항성을 시험하였다. 1% (w/w)의 농도는 탈수 신호 없이 워밍(warming) 자외선 광을 2회 통과한 후 꽤 가교된 하이드로겔을 나타내었다. 더욱이, 상기 제제는 이의 점도 및 뉴턴형 거동을 유지하는 것으로 나타났다. 한편, 5% (w/w) 제제는 4회 통과한 후에도 탈수에 저항성인 것으로 나타났다. 더욱이, 가교 반응성은 더 개선된 것으로 나타났다.
바람직한 구현예에서, 상기 조성물은 본원에 기재된 바와 같이 6개 미만의 탄소를 갖는 분지형 플루오로계면활성제 및 분지형 PEG 유도체를 추가로 포함한다. 이에, 본원에 기재된 실험 결과에 따르면, 이러한 조성물은 하기 특징을 가질 것이다:
- 뉴턴형 거동
- 낮은 점도(5.5-20 cP)
- 낮은 표면 장력
- 높은 가교 반응성 및 구조적 온전성
- 양호한 기계적 특성(25-100 kPa의 압축 계수)
- 양호한 흡습성
- 세포융화성
- 양호한 영양소, 대사물질 및 기체 확산.
바람직한 구현예에서, 선택적으로 상기 또는 하기에 기재된 특징들 중 하나 이상과 조합하여, 상기 조성물은
- 라이신기 중 80% 초과(바람직하게는 85% 초과)에서 작용화된 저온-적응된 해양생물종(바람직하게는, 연어) 메타크릴로일 젤라틴 1% 내지 20% (w/v);
- 0.1 내지 10% (w/w) 농도, 바람직하게는 1% 내지 5% (w/w) 농도의 분지형 PEG 유도체(바람직하게는, 8arm-PEG10K-아크릴레이트 트리펜타에리트리톨);
- 0.005% 내지 0.1% (w/v) 농도의 플루오로계면활성제; 및
- 0.01% 내지 5% (w/v) 농도의 광개시제
를 포함한다.
보다 더 바람직한 구현예에서, 선택적으로 상기 또는 하기에 기재된 특징들 중 하나 이상과 조합하여, 상기 조성물은
- 라이신기 중 대략 90%에서 작용화된 저온-적응된 해양생물종(바람직하게는, 연어) 메타크릴로일 젤라틴 15% (w/v);
- 1% 내지 5% (w/w) 농도의 분지형 PEG 유도체(바람직하게는, 8arm-PEG10K-아크릴레이트 트리펜타에리트리톨);
- 0.005% 내지 0.1% (w/v) 농도의, 6개 미만의 탄소를 (바람직하게는 C2F5 사슬과 함께) 갖는 분지형 플루오로계면활성제; 및
- 0.05% 내지 0.5% (w/v), 바람직하게는 약 0.2% (w/v) 농도의 광개시제.
를 포함한다.
본 발명의 제1 양태의 또 다른 바람직한 구현예에서, 용액은 가교 전에 1 msec 내지 4시간, 바람직하게는 1초 내지 4시간, 보다 바람직하게는 1분 내지 4시간, 바람직하게는 10분 내지 4시간, 보다 바람직하게는 30분 내지 4시간, 보다 바람직하게는 45분 내지 4시간, 보다 더 바람직하게는 약 1시간 내지 약 4시간, 보다 더 바람직하게는 약 1시간 내지 약 3시간의 시간 간격 동안 5℃로부터 15℃의 온도까지 전처리된다.
도 6에 예시된 바와 같이, 가교 전 1℃ 내지 12℃ 범위 내에서 가변적인 시간, 바람직하게는 4시간 미만 동안의 온도 전처리는 중합된/가교된 생체물질의 기계적 특성(압축 계수)을 크게 증가시킨다.
이러한 기계적 특성은 5 킬로파스칼 내지 700 킬로파스칼의 범위 내에서 조정될 수 있다. 따라서, 5% 내지 100%의 산성 측쇄, 특히 라이신에서 가변적인 작용화도를 갖는 메타크릴로일 젤라틴 중합체의 농도 범위 및 4시간 미만의 가변적인 시간 동안 1℃ 내지 12℃ 범위 내에서 가교 전 온도 전처리에서, 중합된/가교된 생체물질의 상이한 물리화학적 및 생물학적 특성이 조정될 수 있다. 예를 들어, 도 8에 도시된 바와 같이 하이드로겔 주변의 미세환경을 조절하기 위한 캡슐화된 가용성 인자의 전달 속도, 또는 도 9에 도시된 바와 같이 캡슐화된 세포의 증식이 조정될 수 있다. 조정될 수 있는 중합된/가교된 생체물질의 다른 물리화학적 및 생물학적 특성은
o 생체물질 내에서 세포 침범성;
o 수동 분해(passive degradation) 시간;
o 세포 활성(효소 분비)에 의한 활성 분해 시간;
o 리모델링 능력;
o 세포 접착; 및
o 면역원성;
o 생체 내에 이식된 경우, 물질 내에서 혈관신생 형성 능력;
o 이식된 경우 조직 통합 능력(혈관신생 능력과 매우 밀접한 관계에 있음)
이다.
결과적으로 상기 언급된 바와 같이, 저온-적응된 해양생물종, 특히 살모 또는 온코린쿠스 속의 천연 공급원으로부터 유래되고, 유리 라디칼의 존재 하에 중합 또는 가교에 대해 반응성으로 되도록 화학적으로 작용화된 아미노산 사슬 젤라틴 중합체를 1% 내지 20% (w/v)의 농도로 포함하는 용액은, 중온성(mesophilic) 생물종, 예컨대 포유류로부터 유래된 다른 아미노산 중합체-계 생체물질과 비교하여, 뿐만 아니라 놀랍게는 비-메타크릴레이트화된 연어 젤라틴(SG)과 비교하여, 개선된 특성을 갖는 조성물을 제공한다.
이에, 추가의 양태에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 방법으로 처리된다:
i. 유리 라디칼의 존재 하에 중합 또는 가교에 대해 반응성으로 되도록 화학적으로 작용화된 아미노산 사슬 젤라틴 중합체를 1% 내지 20% (w/v)의 농도로 포함하는 용액을 포함하는 조성물을, 젤라틴 중합체의 젤화점(gelling point)보다 낮은 온도까지 처리하여, 물리적 가교를 유도하는 단계; 및
ii. 상기 단계 i)에서 수득된 물리적으로 가교된 화학적으로 작용화된 중합체의 공유 가교를 유도하는 단계;
여기서, 상기 젤라틴 중합체는 천연 공급원, 바람직하게는 본원에 기재된 바와 같이 저온-적응된 해양생물종으로부터 유래된다.
당업자는, 냉각 시, 예를 들어 시차 주사 열량계에 의해 결정될 수 있는 젤화점을 결정하는 방법을 알고 있을 것이다. 젤화점은 특정 어류종에 따라 다를 수 있지만, 전형적으로 냉수-적응된 생물종은 10℃ 미만의 젤화점을 가진다.
중합 개시제는 단계 i)의 용액에 존재할 수 있거나, 또는 단계 ii)를 수행하기 전에 첨가될 수 있으며: 바람직하게는, 단계 i)의 상기 용액은 중합 개시제를 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 선택적으로 상기 또는 하기에 기재된 특징들 중 하나 이상과 조합하여, 중합 개시제는 화학적 광개시제이고, 바람직하게는 0.5% 농도에서 확인되며, 여기서, 단계 ii)는 화학적으로 변형된 아미노산 사슬 및 화학적 광개시제를 포함하는 용액을, 상기 광개시제의 성질에 따라 광, 가시광선, 자외선 또는 적외선에 노출시켜, 가교된 조성물을 제공하는 단계를 포함한다.
단계 i)에서, 조성물은 젤라틴 중합체의 젤화점보다 낮은 온도, 전형적으로 1℃ 내지 12℃(바람직하게는 약 4℃)에서 4시간 미만 동안, 바람직하게는 2시간 동안 처리된다.
바람직한 구현예에서, 선택적으로 상기 또는 하기에 기재된 특징들 중 하나 이상과 조합하여, 단계 i)의 조성물은 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 수득된다:
a. 저온-적응된 해양생물종, 바람직하게는 살모 또는 온코린쿠스 속의 천연 공급원으로부터 유래된 아미노산 사슬 젤라틴 중합체를 수득하고, 상기 중합체를 용매 내에서 1% 내지 20% (w/v)의 최종 농도로 용해시키는 단계;
b. 유리 라디칼의 존재 하에 중합 또는 가교에 대해 반응성이 되도록 할 수 있는 화학제를 첨가함으로써, 상기 단계 a)의 아미노산 사슬 젤라틴 중합체의 1차 구조를 화학적으로 변형시키는 단계;
c. 모든 미반응된 화학제를 상기 단계 b)의 용액으로부터 제거하는 단계;
d. 선택적으로, 라디칼-유래 개시제, 예컨대 광개시제 및/또는 계면활성제를 첨가하는 단계;
e. 선택적으로, 적용 가능하다면, 상기 단계 c) 또는 d)로부터 생성된 조성물을 여과하고 동결 건조하는 단계.
저온-적응된 해양생물종의 껍질로부터 젤라틴의 추출 pH는 전형적으로 3 내지 5.5, 바람직하게는 4 내지 5, 예컨대 약 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9 또는 5이고, 보다 바람직하게는 추출 pH는 약 5이다.
추가의 양태에서, 본 발명은 상기 양태에 따른 방법에 의해 수득되거나 또는 수득 가능한 가교된/중합된 젤라틴 중합체를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 상기 젤라틴 중합체 및 조성물의 다른 특징은 본 발명의 제1 양태 하에 본원에 기재된 바와 같다.
본 발명은 하기 실시예를 참조로 하여 더욱 쉽게 이해될 것이다. 하기 실시예는 단지 본 발명을 예시할 뿐, 본 발명을 제한하는 것이 아님을 주지한다.
실시예
실시예 1. 메타크릴로일 연어 젤라틴 용액의 제조
- 연어 젤라틴 추출:
1. 모든 잔여 살(meat) 및 비늘을 연어 껍질로부터 제거한다.
2. 상기 껍질을 작은 큐브 정사각형(3-5 cm/면(side))으로 절단한다.
3. 껍질 1 그램 당 6 ml의 NaOH 0.1 M을 첨가하고, 10℃에서 일정한 교반(900 0rpm)을 1시간 동안 유지시킨다. → 6 mL/g*500 g = 3 L(측정된 pH = 13).
4. 용액을 제거하고, 껍질을 dH2O로 여과 및 침지에 의해 세척한다.
5. 껍질 1 그램 당 6 ml의 NaOH 0.1 M을 첨가하고, 10℃에서 일정한 교반을 1시간 동안 유지시킨다. → 3 L(측정된 pH = 13).
6. 용액을 제거하고, 껍질을 dH2O로 여과에 의해 세척하고, 여과된 껍질을 dH2O에서 헹구고 침지시킨다.
주의사항: 이 단계에서 너무 과도한 세척은 단계 7에서 산성 용액의 pH에 영향을 줄 수 있으며, 더 높은 산성을 초래하여, 이 단계에서는 피해져야 하는 젤라틴의 부분 추출을 유도할 수 있다.
7. 껍질 1 그램 당 6 ml의 0.05 M CH3COOH를 첨가하고, 10℃에서 일정한 교반을 1시간 동안 유지시킨다(측정된 pH = 3.3).
8. 상기 껍질을 우선 dH2O로 세척하고, 껍질 1 그램 당 6 ml의 dH2O 내에서 적신다.
9. CH3COOH를 적가함으로써 pH를 4.0까지 설정한다.
10. 일정한 교반 및 60℃를 유지하면서 4시간 동안 인큐베이션한다.
11. pH 및 온도를 60분마다 체크한다.
12. 껍질을 용액으로부터 제거한다.
13. 용액을 진공 펌프 및 필터 페이퍼 22 ㎛를 사용하여 여과한다.
14. 젤라틴 용액을 건조 팬에 넣음으로써 60℃에서 48시간 동안 건조한다.
15. 젤라틴 필름을 분말로 분쇄한다.
- 메타크릴로일기에 의한 연어 젤라틴 작용화
메타크릴산 무수물을 혼합하고, 이전에 기재된 바와 같이 젤라틴 용액으로부터의 아미노기, 주로 라이신과 반응시킨 후 메타크릴로일 연어 젤라틴을 합성하였다(Nichol et al. 2010; Van Den Bulcke et al. 2000). 간략하게는, 분쇄된 연어 젤라틴을 60℃에서 PBS 1X (pH 7.4)에서 10% (w/v)의 최종 농도로 용해시켰다. 완전히 용해된 후, 여전히 교반하면서, 메타크릴산 무수물(276685, Sigma, USA)을 8% (v/v)의 최종 농도로 서서히 첨가하였다. 상이한 수준의 메타크릴로일 작용화는 상이한 농도의 메타크릴산 무수물을 필요로 한다. 3시간의 반응 후, PBS 1X 내에서 5X 희석을 수행하고, 반응된 젤라틴을 40℃에서 1주일 동안 탈이온수에 대해 투석시켰다. 신선한 탈이온수로 매일 교체하여, 투석 동안 모든 미반응된 메타크릴산 무수물을 제거하였다. 마지막으로, 투석된 혼합물을 8 ㎛ 다공성 필터 페이퍼를 사용하여 여과하고, 동결 건조한 다음, 저장하였다.
실시예 2. 메타크릴로일 소 젤라틴 용액의 제조.
실시예 1과 유사하게, 메타크릴산 무수물을 혼합하고, 이전에 기재된 바와 같이 젤라틴 용액으로부터의 아미노기, 주로 라이신과 반응시킨 후 메타크릴로일 소 젤라틴을 합성하였다(Nichol et al. 2010; Van Den Bulcke et al. 2000). 간략하게는, 소 젤라틴(블룸(Bloom) 220, Rousselot, Netherlands)을 60℃에서 PBS 1X (pH 7.4)에서 10% (w/v)의 최종 농도로 용해시켰다. 완전히 용해된 후, 여전히 교반하면서, 메타크릴산 무수물(276685, Sigma, USA)을 8% (v/v)의 최종 농도로 서서히 첨가하였다. 상이한 수준의 메타크릴로일 작용화는 상이한 농도의 메타크릴산 무수물을 필요로 한다. 3시간의 반응 후, PBS 1X 내에서 5X 희석을 수행하고, 반응된 젤라틴을 40℃에서 1주일 동안 탈이온수에 대해 투석시켰다. 신선한 탈이온수로 매일 교체하여, 투석 동안 모든 미반응된 메타크릴산 무수물을 제거하였다. 마지막으로, 투석된 혼합물을 8 ㎛ 다공성 필터 페이퍼를 사용하여 여과하고, 동결 건조한 다음, 저장하였다.
실시예 3. 비-메타크릴로일 연어 젤라틴 용액의 제조.
연어 젤라틴을 실시예 1에 설명된 바와 같이 추출하고, 비-메타크릴로일 연어 젤라틴은 통상, 수득된 젤라틴을 60℃에서 PBS 1X (pH 7.4)에서 10% (w/v) 젤라틴의 최종 농도로 용해시킴으로써 제조한다. 상이한 농도의 젤라틴을 갖는 용액은, 상이한 양의 분쇄된 젤라틴을 PBS 1X에 용해시킬 것을 필요로 한다.
실시예 4. 본 발명의 조성물 및 생체의학에서 상기 조성물의 용도.
4.1. 재료 및 방법
- 연어 젤라틴의 추출.
80 kg의 연어 껍질을 Los Fiordos Ltda라고 하는 연어 농장으로부터 얻고, 2016년 1월 10일에 -20℃에서 동결시켜 유지시켰다. 조절된 해동 단계 후, 남은 살 잔여물 및 비늘을 수동으로 세정 제거하였다. 현재까지, 매번 5 kg의 껍질을 가공하면서 5회의 세정을 수행해 왔으며, 깨끗한 껍질의 수율은 대략 17%(850 그램)이다. 그 후에, 껍질을 4 cm2 표면적을 갖는 조각들로 절단한다. 자비에 엔리온(Javier Enrione) 교수의 실험실에 의해 이전에 구축된 추출 프로토콜을 수행하였으며, 상기 프로토콜은 10℃에서 1시간 동안 0.1 M NaOH를 이용한 2개의 전처리 단계로 구성되며, 각각의 단계에 후속해서 증류수를 사용한 껍질 세척 단계가 존재한다. 세번째 전처리를 10℃에서 1시간 동안 0.05 M 아세트산 용액 내에서 수행하고, 후속해서 껍질을 증류수로 세척한다. 껍질을 60℃에서 3.5시간 동안 증류수에서 인큐베이션함으로써 산 추출을 마지막으로 수행하는데, 상기 증류수에서 상이한 양의 아세트산을 첨가함으로써 pH를 상이한 수준까지 조정한다. 시험된 pH는 3, 4 및 5이었다. 추출된 젤라틴 수율, 가수분해 수준 및 젤 강도를 평가하였다.
- 연어 젤라틴의 화학적 변형.
광을 이용한 조사에 의해 중합을 할 수 있기 위해, 메타크릴산 무수물(Sigma)을 젤라틴 내 라이신 측쇄의 유리 아미노기와 반응시킴으로써 메타크릴로일기에 의한 연어 젤라틴의 작용화를 수행한다. 이러한 목적을 위해 1X PBS(인산염-완충 식염수)를 사용하여 연어 젤라틴을 포함하는 10% 용액 (w/v)을 제조하였다. 완전한 가용화를 위해 이 용액을 60℃에서 1시간 동안 유지시켰다. 상이한 부피의 메타크릴산 무수물을 화학적 추출 후드 하에 및 교반 하에 적가하고(10, 5, 2, 1 또는 0.5 ml을 100 ml의 용액에 첨가함), 이를 조절된 교반 하에, 온도가 60℃에서 유지되는 것을 확인하면서 3시간 동안 반응하도록 놔두었다. 용액의 pH를 7에서 유지시켰으며, 그렇지 않으면 상기 용액은 산성으로 될 수 있고, 변형된 젤라틴의 가수분해도(degree of hydrolysis)가 증가할 수 있다.
연어 젤라틴의 작용화 후, 3 부피의 1X PBS pH 7.4를 첨가하고, 그 후에 40℃에서 7일 동안 물을 1일 2회 교환하면서 20 부피의 증류수에 대해 투석함으로써, 반응 혼합물을 희석시켰다. 일단, 미반응된 메타크릴산 무수물을 제거하기 위한 투석 과정이 종료되면, 반응 혼합물을 8 ㎛ 기공 크기를 갖는 막을 통해 여과하고, 그 후에 동결 건조하고, 이를 -80℃에 저장하였다(도 13 참조).
일단, 연어 젤라틴이 화학적으로 변형되면, 작용화된 유리 아민 또는 라이신의 퍼센트를 이전에 문헌에 기재된 OPA 방법을 사용하여 정량화하였다(Journal of Food Science 2001, 66(5), 642). 반응 전 및 후에 유리 아민을 정량화함으로써, 총 메타크릴로일기에 의해 작용화된 라이신의 수를 결정할 수 있다(도 14 참조).
- 자외선 광-유도 가교 후, 연어 젤라틴 메타크릴레이트의 기계적 특징화
광중합을 유도하기 위해, 0.5% W/V 농도의 광개시제 Irgacure 2919(Sigma)를 변형된 연어 젤라틴 용액(1X PBS 또는 증류수 중 5%, 7%, 10%, 15% (w/v))에 포함시키고, 이를 직경이 10 mm이고 높이가 3 mm인 원통형 몰드 내에서 자외선 광(365 nm, 800 mW/cm2)으로 2분 동안 조사하였다. 변형된 연어 젤라틴(MSG) 하이드로겔 또는 형성된 스캐폴드는, 메타크릴화 반응에 첨가된 메타크릴산 무수물의 양, 및 따라서 작용화 수준에 따라 상이한 기계적 특성(영률)을 가졌으며, 또한, 하이드로겔을 발생시키는 데 사용된 MSG 농도에 따라 달랐다. DMA(동적 기계적 분석기) 및 텍스처 분석기를 둘 다 사용하여, 기계적 시험을 수행하였다. 시험을 압축 모드 및 인장 모드 둘 다에서 수행하였다.
- 베이직 제제(본원에서 "바이오잉크"로도 지칭됨)의 유동학적 특징화.
상기 실시예 4에 기재된 프로토콜에 따라, 젤라틴 라이신 잔기에서 85% 작용화도를 갖는 MSG를 발생시켰다. 증류수에서 상이한 변형된 젤라틴 농도를 갖는 용액을 제조하여(5%, 10% 및 15% (w/v)), 유동학적 연구를 수행하였다. 100 s-1의 전단 속도에서의 점도 데이터를, Anton Paar MCR 301 유량계 및 원뿔형 기하학적 특성을 사용하여 기록하였다. 이들 용액의 표면 장력 값을, 점적(drop) 부피 장력계 장비(Lauda TVT2, Dr. R.Wobser GmbH and Co., Lauda-Kigshofen, Germany)를 사용하여 추가로 정량화하였으며, 이는 조절된 속도에서 관류되는 모세관의 끝부분(tip)에서 액적의 부피 결정을 기초로 하였다. 액적이 이의 임계 부피에 도달하였을 때, 상기 액적은 중력으로 인해 모세관으로부터 낙하하였다. 표면 장력을, 이러한 임계 부피, 용액의 밀도 및 모세관의 반경을 기초로 계산하였다(Food Hydrocolloids 25(5):958-967). 이러한 방법은 밀도의 정밀한 결정을 필요로 한다. 이를 디지털 밀도 측정기(meter)(DMA 45, Anton Paar KG,Graz, Austria)에 의해 수행하였다. 이들 실험을 메트로폴리타나 기술대학교(Universidad Tecnolgica Metropolitana)에서 로미 지가(Rommy Ziga) 교수의 감독 하에 수행하였다.
- 계면활성제 및 기계적 보강 구성성분(셀룰로스 나노휘스커)의 혼입이 베이직 바이오잉크의 유동학적 매개변수에 미치는 효과의 예비 측정
85%의 라이신 잔기에서 작용화된 15% 연어 젤라틴을 포함하고, 0%, 3% 및 5% (w/v)의 박테리아 셀룰로스 나노휘스커가 추가로 보충된 용액의 점도 및 점탄성 구성성분에서 측정을 수행하였다. 원뿔형 기하학적 특성을 사용하는 Anton Paar MCR 301 유량계를 이용하여 실험을 수행하였다(도 15 참조).
- 가교 공정에서 변형된 젤라틴의 가교 방법의 개발
비변형된 젤라틴 중합체를 젤화점 온도보다 낮은 온도로 처리할 때, 이들 중합체의 자연적인 활성들 중 하나는, 중합체의 삼중 나선의 형성이며, 이는 열가역적(thermoreversible) 하이드로겔의 형성을 초래한다. 즉, 일단 하이드로겔이 저온에서 형성되면, 이들 하이드로겔은 더 높은 온도로 처리될 때 이들의 액체 상태로 되돌아갈 수 있다. 가교된 하이드로겔의 기계적 특성을 개선하기 위한 제안된 방법들 중 하나는, 광-매개 가교를 유도하기 전에, 저온에 의해 유도되는 삼중 나선의 형성을 허용하는 것이다. 이는, 광 유도에 의해 형성되는 공유 결합을 구축함으로써 형태(conformation)를 고정(setting)하기 전에, 보다 정돈되고 기계적으로 보강된 분자 구조의 형성을 허용한다. 이러한 방법은, 삼중 나선의 형성을 유도하지 않는 가교와 비교하여, 중합-후 기계적 특성을 20배 증가시킬 수 있었다. 이들 증가는 이전에 임의의 다른 기법에 의해서는 관찰되지 않았으며, 이들 하이드로겔의 양호한 생물활성에도 불구하고 물질로서의 이들의 약점들 중 하나가 낮은 기계적 특성임을 고려하면, 환자 및 시장으로 옮겨지기 위한 우수한 전망을 약속한다. 텍스처 분석기를 사용한 압축 시험에 의해 기계적 특성을 측정하였다. 라이신 잔기에서 상이한 작용화도를 갖는 변형된 젤라틴을 10% (w/v) 농도로 갖는 용액을 제조하고(22% 및 90%), 4℃에서 2시간 동안 인큐베이션한 후, 광-매개 가교를 유도하였다. 냉각 전처리된 하이드로겔의 기계적 특성을, 냉각 전처리되지 않은 하이드로겔과 비교하였다.
- 최적화된 생체물질 생체적합성 연구.
o 상이한 작용화도에서 변형된 연어 젤라틴으로 형성된 하이드로겔 내에 캡슐화된 인간 제대혈 내피 세포(HUVEC)의 증식
상기 기재된 바와 같이, 라이신의 상이한 수준의 작용화까지 변형된 연어 젤라틴-계 하이드로겔(20%, 50%, 60%, 80% 및 90%)을, 보고서(1.c.)에서 상기 기재된 바와 같이 광개시제와 함께 제조하였다. 하이드로겔의 광중합 또는 가교 전에, 이들 하이드로겔을 HUVEC 세포와 6 x 106 세포/ml의 최종 농도에서 혼합하였다. 하이드로겔을, 10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신 및 1X 글루타민이 보충된 DMEM 배양 배지에서 인큐베이션하였다. 배지를 2일마다 교환하고, 세포 인큐베이터 내에서 7℃ 및 5% CO2에서 유지시켰다. 캡슐화된 세포의 증식을, WST-1 세포 증식 비색검정법 키트(K302, Biovision, USA)를 공급업체의 설명서에 따라 사용하여 평가하였다. 간략하게는, 이러한 검정법은 WST-1에서 포르마잔으로의 대사적 전환을 정량화하며, 이러한 대사적 전환은 세포에서 미토콘드리아 데하이드로게나제에 의해 매개된다(도 16 참조).
o 뮤린 동물 모델에서 피하 이식된 변형된 연어 젤라틴의 면역 반응.
상이한 수준의 라이신 작용화(20% 및 80%)를 갖는 변형된 연어 하이드로겔을 제조하였다. 원통형 하이드로겔의 치수는 직경이 10 mm이고 높이가 3 mm이었다. 이들 하이드로겔을 C57BL/6 마우스의 등에 피하 이식하였다. 이들을 7일 후에 제거하여, 면역 반응을 분석하였다. 간략하게는, 림프샘에 존재하는 면역 세포, 및 이동한 세포 또는 하이드로겔에 통합된 세포를 분석하고, 이러한 하이드로겔의 존재에 반응한 염증 수준을 평가하였다. 모든 실험을, 이들 하이드로겔을 동일한 수준의 작용화를 갖는 소 젤라틴으로 제조된 하이드로겔과 비교하도록 수행하였다(도 17 참조).
o 상이한 수준까지 작용화된 연어 젤라틴으로부터 형성된 하이드로겔에서 세포 침범의 능력.
세포화된(cellularized) 3D 구조를 제조하기 위한 바이오잉크의 설계에서 관련 있는 점(point)들 중 하나는, 캡슐화된 세포가 이동에 의해 생물학적으로 반응하여, 실제 하이드로겔을 리모델링하고, 다른 세포를 3D 구축물 이식 영역까지 이동하도록 근접시키고, 예를 들어 혈관구조의 형성에 의해 이식물과 상호작용할 수 있게 해야 한다는 점이다. 이를 예비 수준에서 평가하기 위해, 상이한 수준까지의 작용화에 의해 변형된 연어 젤라틴 하이드로겔을 통한 세포 침범에 대한 검정법을 수행하였다. 이들 결과를 또한, 소 젤라틴 변형을 사용하여 수득된 결과와 비교하였다. 기본적으로, 이러한 검정법은 트랜스웰 장치의 사용을 수반하였다. 상기 장치는 2개의 챔버인 상부 챔버 및 하부 챔버를 가졌으며, 이들은 8 ㎛ 기공 크기를 갖는 막에 의해 경계지어져 있으며, 이러한 막을 통해 세포는 상기 하부 챔버에 존재하는 유인성 자극인자에 의해 매개되어 하나의 챔버로부터 또 다른 챔버까지 이동한다. 하이드로겔을 두께가 약 1 mm인 막 상에 증착시키고, 세포를 하이드로겔 상에 접종한다. 사용된 세포는 조직 공학에 사용되는 세포 모델로서 골수-유래 중간엽 줄기세포이다. 하부 챔버의 하부 챔버 파트의 상부로부터 막 상에서 관찰될 수 있는 세포는 하이드로겔 및 다공성 막을 통해 이동해야 했다. 이동된 세포의 수의 정량화는, 세포가 하이드로겔 내에서 이동하는 능력을 입증한다.
4.2. 결과
- 연어 젤라틴의 화학적 변형.
젤라틴 라이신에서 메타크릴로일기에 의한 작용화에 의한 연어 젤라틴의 화학적 변형을 이전에 문헌에 기재된 OPA 방법에 의해 체크하였다(Journal of Food Science 2001, 66(5), 642). 기본적으로, 이러한 방법은 젤라틴 폴리펩타이드 사슬에 존재하는 유리 아미노기 또는 1차 아민을 특정 시약에 의해 정량화한다. OPA 방법을 이용한 바응에 대한 반응성 유리 아미노기는 대부분 라이신 측쇄로부터 비롯되고, 작은 퍼센트(2-4%)는 가수분해도에 따라, 분자의 폴리펩타이드 사슬의 N-말단 아미노에 상응하였다. 메타크릴산 무수물에 의한 작용화 반응은 라이신 1차 아민에 메타크릴로일 작용기를 혼입하여, 유리 아미노의 수를 정량화할 때 OPA 시약과 반응하지 않도록 한다(도 18 참조).
- 자외선 광-유도 가교 후, 메타크릴레이트화된 연어 젤라틴의 기계적 특징화.
이전의 섹션에서 언급된 바와 같이, 젤라틴 라이신 내에서 메타크릴로일기에 의한 작용화 수준은, 하이드로겔의 가교를 유도함으로써 형성되는 하이드로겔의 기계적 특성을 소정의 수준에서 개념적으로 결정해야 한다. 메타크릴로일기의 수가 높을수록, 가교를 유도할 때 형성되는 분자내 및 분자간 공유 결합의 수가 높아진다. 하이드로겔에서 이러한 더 높은 수준의 가교는 구축물의 기계적 특성(영률 및 압축 계수)의 증가를 유도할 것이다. 메타크릴로일기의 상이한 수준의 작용화 및 동일한 광-유도 가교에서 10% (w/v) 변형된 젤라틴 용액으로부터 제조된 하이드로겔에 대한 기계적 특성의 결과를 도 19에 나타낸다. 이들 매개변수를 연어 젤라틴 및 소 젤라틴에 대해 비교하였다(도 19 참조).
충분히 흥미롭게는, 하이드로겔이 상이한 수준의 작용화를 가졌을 때, 압축 계수(압축 시험에 의해 측정됨)의 차이가 관찰되지 않았으며, 한편 작용화 수준이 커짐에 따라 영률(인장 시험에 의해 측정됨)은 증가를 나타내었다.
- 본 발명의 베이직 제제의 유동학적 특징화.
잉크젯(폴리젯) 프린팅 공정에서 액적 형성은 유동학적 특성에 따라 다르다. 유동학적 연구의 주요 목적은, 예정된 다인성(multifactorial) 실험 설계에 따른 새로운 제제의 제1 최적화 단계를 수행하기 위해 초기값을 획득하는 것이었다.
젤라틴은 콜라겐의 부분 분해로부터 유래되고, 열가역적 물리적 격자를 형성할 수 있는 단백질성 생체물질이다. 젤라틴의 사슬이 냉각됨에 따라, 이들 젤라틴은 비정질로부터 나선체(삼중 나선)로의 형태적 전이를 수행하여, 격자 결합점을 형성한다. 해당 연구는 메타크릴로일기에 의한 작용화를 통한 젤라틴의 분자적 특징의 효과 및 이들의 유동학적 거동에 집중하였다.
유동학은 물질이 어떻게 변형되고 유동하는지에 대한 연구이며; 탄성, 가소성 및 점도를 포함한다.
가장 중요한 유동학적 특성들 중 일부는 하기의 특성들이다:
· 겉보기 점도(전단 응력과 전단 속도 사이의 관계)
· 저장 탄성률 및 손실 탄성률(loss modulus)(선형 점탄성 거동)
· 전이 온도.
해당 연구에서, 모든 유동학적 측정을 Anton-Paar MCR301 응력-조절 유량계(Anton-For, Graz, Austria)에 의해 수행하였다.
연어 젤라틴의 경우 낮은 점도값이 예상되므로, 상이한 기하학적 특성을 사용하여, 측정 정밀도 및 민감성에 미치는 이들의 효과를 분석하였다.
o 기하학적 특성의 측정
이중 갭(도 20a에서 상기)). 시료와의 접촉 면적이 매우 넓기 때문에, 낮은 응력의 경우 더 양호한 측정 민감성을 제공하는 기하학적 특성이다. 한편, 각각의 측정에 더 많은 물질이 필요하고(10 mL vs. 콘-플레이트에서 300 μL), 기하학적 특성의 표면 폭(amplitude)으로 인해 신속한 온도 조절이 제한된다.
콘-플레이트(도 20b)). 콘의 각도 결과, 전단 응력의 균질한 분포를 제공하는 최적의 기하학적 특성이다. 이러한 콘-플레이트는 이중 갭만큼 민감하지는 않지만, 낮은 점도 물질로도 양호한 측정을 할 수 있게 한다. 상기 콘-플레이트는 입자 시스템에는 권고되지 않는다. 0.5°의 각도 및 50 mm의 직경을 갖는 콘-플레이트를 이들 점도 측정에 사용하였다.
플레이트-플레이트(도 20c)): 이는, 갭의 폭, 신속한 온도 변화 및 전단 속도를 조절할 수 있기 때문에, 가장 가요성인 기하학적 특성이다. 측정 민감성은 상부 플레이트의 직경(해당 연구에서 50 mm)에 따라 증가한다. 민감성이 이전의 기하학적 특성들의 민감성보다 낮긴 하지만, 이러한 기하학적 특성은 신속하고 균질한 온도 조절을 가능하게 하므로, 젤화 연구에 사용되었다.
25℃ 및 37℃에서 1 내지 1000 s-1 의 전단 속도를 이용한 유동 주사를 통해 5% 내지 15% (w/v)의 상이한 농도에서 연어 젤라틴 및 소 젤라틴에 대해 겉보기 점도를 측정하였으며, 처음에는 이중 갭 및 콘-플레이트 기하학적 특성의 측정 민감성을 비교하였다. 1%의 변형률 및 0.1-100 Hz의 주파수에서의 주파수 주사, 및 1 Hz의 주파수 및 0.01 내지 100%의 변형률 폭에서의 진폭 주사(amplitude scan)를 수행하여, 선형 구역을 결정하였다. 1%의 변형률 및 1 Hz의 주파수를 적용함으로써, 저장 탄성률 G' 및 손실 탄성률 G'', 뿐만 아니라 젤화 Tg 및 용융점 Tm을 37℃로부터 3℃까지 및 3℃로부터 20℃까지의 온도에 대한 온도 주사 측정으로부터 외삽하였다.
연어 젤라틴(SG)을 연어 껍질로부터 추출하였다. 소 젤라틴(BG)은 알칼리 처리에 의해 소 뼈로부터 유래되었다.
젤라틴을 메타크릴산 무수물(276685, Sigma)과의 반응을 통해 메타크릴로일기에 의해 작용화시켰다. 간략하게는, 연어 및 소의 젤라틴을 60℃에서 PBS(pH 7.4) 내에서 10% (w/v)의 농도까지 용해시켰다. 계속해서 교반하면서, 메타크릴산 무수물을 8% w/w의 농도까지 서서히 첨가하였다. 3시간 후, PBS로 희석시켜 반응을 중단시키고, 후속해서 증류수 내에서 40℃에서 1주일 동안 투석시켰다. 최종 생성물(각각 SG8 및 BG8, 연어 및 소)을 8 ㎛ 기공에서의 여과 및 동결 건조에 의해 수득한다.
박테리아 셀룰로스를 황산 내에서 산 가수분해시킴으로써 셀룰로스 나노휘스커(CNW)를 수득하였다. 가수분해 생성물을 투석시켜, 반응 부산물을 제거하고, 재현탁을 위해 초음파처리하고, 마지막으로 이온 교환 수지를 통해 정제하여, 0.1% 용액 (w/v)을 수득하였다. 젤라틴 용액 중 3% w/w 및 5% w/w 용액을 수득하기 위해, CNW를 로토베이퍼(rotovapor)를 통해 농축시켰다.
o 젤라틴 용액
각각의 연어 젤라틴(SG), 소 젤라틴(BG), 및 각각 라이신의 85% 작용화를 갖는 변형된 젤라틴(SG8 및 BG8)에 대해 15% 스탁(stock) 용액(w/v)을 60℃에서 1시간 동안 계속해서 교반함으로써 제조하였다. 상기 용액을 후속해서, 10% 및 5% 용액(w/v)을 수득할 때까지 희석시켰다. 상기 용액을 측정할 때까지, 37℃에서 일정한 교반 하에 유지시켰다.
o CNW를 포함한 젤라틴 용액.
CNW가 보충된 15% 용액 (w/v)의 연어 젤라틴(SG) 및 변형된 연어(SG8)을, 각각 9 및 15 mg의 CNW를 함유하는 2 ml의 CNW 용액에 0.3 g의 젤라틴을 첨가하여, 젤라틴에 대해 3% 또는 5% (w/w)의 CNW 농도를 갖는 용액을 수득함으로써 제조하였다.
처음에, 측정 민감성에 미치는 측정 기하학적 특성의 효과를 분석하였다. 3벌 중복하여 수득된 측정은 최상의 이중 갭 민감성을 보여주며, 여기서 2개 유체의 뉴턴형 거동이 낮은 전단 속도에서도 기재되어 있다.
강조되어야 하는 중요한 점들 중 하나는, 변형된 소 젤라틴과는 달리, 폴리젯 프린터에 사용되도록 허용 가능한 바이오잉크 중 젤라틴 농도의 범위가 연어의 경우 더 넓다는 점이다.
- 계면활성제 및 기계적 보강 구성성분(셀룰로스 나노휘스커)의 혼입이 베이직 제제의 유동학적 매개변수에 미치는 효과의 예비 측정.
가교 후, 기계적 특성을 개선시키기 위해 베이직 제제에 셀룰로스 나노휘스커(CNW)를 혼입하는 것은, 바이오잉크의 최종 유동학적 특성에 영향을 미칠 수 있다. 이러한 이유에서, 용액 중 젤라틴 그램에 관하여 3% 및 5% (w/w) 농도의 CNW를 제제에 포함시킨 실험을 수행하였다. 그 결과는, 보충된 바이오잉크에서 저장 탄성률의 증가를 보여주었으며, 이는 바이오잉크 제제 내 상이한 중합체와 입자 사이의 상호작용 힘의 증가로서 해석된다. 이는 기계적 특성의 증가로 번역될 것이지만, 용액 점도의 증가는 바이오잉크를 폴리젯 기술이 허용하는 범위 밖에 남겨두게 된다. 추가로, 나노휘스커의 첨가에 의해 뉴턴형 거동으로부터 비-뉴턴형 거동으로의 변화(점도는 유체에 적용된 전단 속도에 반비례함)가 관찰될 수 있으며, 이는 폴리젯 장비에서는 권고되지 않는다(도 26, 27 및 28 참조).
- 가교 과정에서 변형된 젤라틴의 가교 방법의 개발.
하이드로겔을 보강하기 위한 새로운 방법을 연구하려는 주요 이유들 중 하나는, 셀룰로스 나노휘스커의 혼입이 바이오잉크의 유동학적 특성을 변화시켰으며, 이는 상기 바이오잉크를 폴리젯 기술에 부적합하게 만든다는 사실이었다. 젤라틴 단량체의 삼중 나선 배열의 형성이 유도되는 젤라틴의 온도에 의한 열가역적 젤화의 자연적인 이해를 기초로, 먼저 삼중 나선의 형성(물리적 가교)을 유도하고, 그 후에 메타크릴로일기의 광-매개 가교(화학적 또는 공유 가교)를 유도하는 가능성을 연구하였다. 상기 언급된 바와 같이, 이미 삼중 나선으로서 배열된 젤라틴의 화학적 가교는 상기 삼중 나선 구조를 고정하고, 이를 보강하여, 상기 젤라틴을 온도 증가에 대해 비가역적으로 만든다. 놀랍게도, 이러한 방법은 기계적 특성을 20배 증가시켰으며, 이러한 보강 수준은 이전에 연구된 다른 방법들에 의해서는 관찰되지 않았다(도 29 참조). 이는, 달성된 기계적 특성을 생체내 이식을 허용하는 천연 연조직과 비교하기 때문에 조직 공학에 적용하기에 매우 적절하다. 새로운 도 52(a)는 젤화 온도에서 삼중 나선 형성, 및 자외선 광에 노출 시 (비가역적인) 공유 가교를 그래프로 나타낸다. 도 52(b)는 15%에서 메타크릴레이트화된 연어 젤라틴 하이드로겔에 대한 압축 계수 결과(kPa)를 보여주며, 여기서, 가교 전에, 이러한 젤라틴은 4℃에서 냉각 전처리되었다. 시험된 젤라틴은 다양한 메타크릴화도(0.5, 2, 5 및 10)를 가진다. 이러한 도면은, 냉각 전처리가 젤라틴 하이드로겔의 구조적 특성을 보강시켜, 높은 수준의 압축 계수에 도달한다.
- 최적화된 생체물질 생체적합성 연구
o 상이한 작용화도에서 변형된 연어 젤라틴으로 형성된 하이드로겔 내에 캡슐화된 인간 제대혈 내피 세포(HUVEC)의 증식
세포를 하이드로겔 또는 스캐폴드 내에 캡슐화하는 이들 과정에 대한 주요 염려들 중 하나는, 상기 과정 후에 세포가 도달하게 되는 상태이다. 이러한 이유에서, 증식 검정법을 상기 설명된 바와 같이 수행하였다. 이러한 경우, 가교 및 세포 캡슐화 후 1일, 4일 및 14일째에 WST-1의 미토콘드리아 대사를 정량화하였으며, 이는 하이드로겔 내에서 세포 증식과 상관관계가 있었다. 20%의 라이신에서 메타크릴로일기에 의한 작용화에 의해 변형된 연어 젤라틴을 기초로 한 하이드로겔의 경우에서와 같이, 하이드로겔 내에서 증식이 높을수록, 더 낮은 기계적 특성이 관찰되었다. 그러나, 60%, 80% 및 90%의 작용화 수준은 유의한 차이를 보여주지 않았다(도 30 참조).
o 뮤린 동물 모델에서 피하 이식된 변형된 연어 젤라틴의 면역 반응.
이러한 보고서의 상기 섹션에 언급된 바와 같이, 외래 스캐폴드가 이식된 경우, 이러한 스캐폴드의 존재에 대한 면역 반응은, 조직 병태의 치료를 위한 조작된 조직의 통합의 성공에 대한 결정 인자일 수 있다. 면역 거부는 매우 광범위한 염증 반응으로 인해 하이드로겔(캡슐화된 세포가 있거나 또는 없음)의 제거 또는 환자에의 손상을 초래할 수 있다. 이를 평가하기 위해, 예비 피하 이식 실험을 마우스에서 낮은 작용화(20%) 또는 높은 작용화(80%)에 의해 변형된 연어 젤라틴 또는 소 젤라틴으로부터 제조된 하이드로겔을 이용하여 수행하였다. 그 결과는 일반적으로, 연어 젤라틴과 비교하여 소 젤라틴의 존재와 연관된 더 높은 면역원성을 보여주었으며, 더욱이, 하이드로겔이 더 높은 정도까지 작용화된 경우 면역 반응이 더 낮은 것으로 보인다(도 31 및 도 32 참조). 이러한 개념에 관하여, 이러한 효과는, 더 많이 작용화된 하이드로겔보다 덜 작용화된 하이드로겔에서 더 높은 세포 침범 능력 및 혈관구조 형성과 관련이 있을 수 있으며, 이는 덜 작용화된 경우, 면역계의 세포를 하이드로겔과 더 많이 접촉시킬 수 있다(도 33 참조). 면역 반응은 일반적으로 꽤 낮으며, 이는 일반적으로 젤라틴에 대해 기재된 이전의 발견들을 입증한다는 것이 강조되어야 한다.
o 상이한 수준에서 작용화된 연어 젤라틴으로부터 형성된 하이드로겔 내에서 세포 침범의 능력.
검정법은 이러한 하위활성(subactivity)에 관하여 설정될 수 있을 것이며, 상이한 작용화도를 갖는 변형된 소 및 연어 젤라틴-계 하이드로겔의 침범 능력을 시험관내에서 정량화하기 위한 것이고, 실험은 현재 수행되고 있다. 도 12는 이러한 검정법의 음성 대조군 및 양성 대조군을 보여주며, 이러한 검정법은 2.4% 농도에서 젤라틴 용액으로부터 형성된 하이드로겔을 사용한다. 음성 대조군을 트랜스웰의 2개 챔버 모두에서 유도 인자의 존재 하에 수행하며, 한편 양성 대조군을 하부 챔버에서만 수행하여, 세포 화학주성만 정량화하고 무작위 이동은 정량화하지 않는다.
실시예 5. 연어 젤라틴 및 소 젤라틴 용액(작용화된 및 비-작용화된)의 용융 특징화.
연어 및 소 젤라틴 용액(7 w/v%)의 용융 온도(Tm) 및 엔탈피(△Hm)를, 시차 주사 열량계(DSC)를 사용하여 평가하였으며, 표 1에 나타낸다. 연어 젤라틴의 Tm(4.2±0.026℃)은 소 젤라틴의 Tm(12.2±0.008℃)보다 유의하게 더 낮다. 이들 젤라틴이 작용화되었을 때, 용융 온도는 유의하게 낮아진다(p<0.05, t-테스트). 그러나, 변형된 연어 젤라틴의 Tm은 변형된 소 젤라틴에 대해서보다 훨씬 더 낮다(p<0.05, t-테스트). 연어 젤라틴의 Tm과 소 젤라틴의 Tm 사이의 이러한 차이는 더 넓은 적용 창, 예를 들어 기술적 적용에서 적절하게 수행하도록 젤화가 연장될 때까지의 시간에 걸쳐 점도 변화 없이 예컨대 바이오 가공 기술이 더 넓은 온도 범위(더 넓은 가공 창(processing window)) 내에서 안정한 액체 응집 상태를 필요로 하는 조직 공학을 허용하는 기술적 이점으로서 사용될 수 있다.
표 1에서 용융 전이 온도 변화(△T)가 또한, 소 젤라틴과 비교하여 연어 젤라틴의 삼중 나선 형성, 및 따라서 점탄성 특성의 더 양호한 조절을 허용하는 보다 양호하게 정의된 온도에서 전이가 발생함을 입증하는 것이 또한 중요하다.
표 1: 젤라틴 용액(7%)의 용융 특징화.
연어 젤라틴 소 젤라틴
비-작용화됨 작용화됨 비-작용화됨 작용화됨
Tm (℃) 4.26 (±0.026) 4.09 (±0.080) 12.20 (±0.008) 9.69 (±0.198)
△H m (J/g) 0.88 (±0.028) 0.48 (±0.088) 1.20 (±0.016) 0.73 (±0.010)
△T (℃) 11.19 (±0.020) 10.97 (±0.143) 19.72 (±0.013) 17.46 (±0.163)
결과는 평균 (±표준 편차)로서 나타나 있다.
실시예 6. 비-작용화된 연어 및 소 젤라틴에서 젤 강도
젤 강도(블룸 강도)를 Wainewright(1977)에 의해 보고된 방법에 따라 측정하였다. 연어 및 소 젤라틴 젤(6.67% w/v)을 블룸 병(150 mL, Stable Micro System, UK) 내에서, 건조 젤라틴을 증류수 내에서 60℃에서 20분 동안 용해시키고 현탁액을 40℃에서 40분 동안 유지시켜서 제조하였다. 제조된 현탁액을 인큐베이터 내에서 3℃에서 16-18시간 동안 유지시켰다. 젤 강도를, 부하(load) 세포가 5 kg이며 크로스-헤드 속도가 1 mm/ s이고 R1.27-cm-직경 원통형 프로브가 구비된 텍스처 분석기 TA.XTplus(Stable Micro System, UK) 상에서 평가하였다. 프로브가 4 mm의 거리에서 젤라틴 젤 내로 침투하였을 때, 최대 힘(g)을 결정하였다. 이 검정법의 결과를 도 35에 나타낸다.
도 35는 연어 젤라틴(SG) 및 소 젤라틴(BG)에서 측정된 젤 강도를 보여준다. 상이한 공급원(각각 어류 및 포유류)으로부터 수득된 젤라틴들 사이에서 이들의 젤 강도의 측면에서 유의한 차이가 존재하고, 비-작용화된 소 젤라틴의 젤 강도가 비-작용화된 연어 젤라틴의 젤 강도보다 약 2.5배 더 높다는 것은 괘 명백하다. 이러한 거동은 젤라틴의 분자량 및 아미노산 프로파일에서의 기존의 차이와 관련이 있을 수 있다. 문헌에서, 연어 젤라틴의 분자량이 소 젤라틴보다 낮다고 보고되어 있다. 한편, 글리신 및 이미노산(프롤린 및 하이드록시프롤린) 함량은 소 젤라틴에서보다 높다. 따라서, 연어 젤라틴에서 더 낮은 분자량 및 소정의 아미노산(글리신, 프롤린 및 하이드록시프롤린)의 감소된 함량은 나선형 구조를 접는 능력의 감소를 설명할 수 있으며, 이는 젤라틴 젤 강도에 직접적인 영향을 미친다.
소 젤라틴과 비교하여 비-가교된 및 비-작용화된 연어 젤라틴의 훨씬 더 낮은 초기 강도의 측면에서, 메타크릴레이트화된 어류 젤라틴의 가교/중합은 거의 즉각적인 중합을 초래하여, 메타크릴레이트화된 가교된 소 젤라틴과 동일한 범위에서 압축 및 인장 특성을 갖는 젤을 제공한다는 발견(본원에 도시된 바와 같은 도 19 및 도 38 참조)은 완전히 예상치 못한 것이었다.
실시예 7. 타크릴레이트화된 연어 및 소 젤라틴 용액의 추가의 특징화
유동학적 특징화
메타크릴로일기로 치환된 및 비-치환된 소 및 연어 젤라틴의 비교 유동학적 연구를 수행하여, 고정밀 시스템에서 이들 젤라틴의 유용성을 추정하였다.
상이한 전단 속도에서 점도 측정을 상기 기재된 바와 같이 수행하였다. 그 결과는, 한편으로는 소와 비교하여 비-작용화된 및 작용화된 연어 젤의 용액에 대해 더 낮은 점도를 보여주었고, 다른 한편으로는 (작용화된 및 비-작용화된) 연어 젤라틴 용액에 대해 뉴턴형 거동을 보여주었으며, 한편 소 젤라틴 용액에 대해서는 비-뉴턴형 거동을 보여주었다(도 36 참조). 비-뉴턴형 거동은, 전단 속도가 증가함에 따라 소 젤라틴 용액에서 점도의 전단-희박 효과에 의해 드러나며, 반면 연어 젤라틴 용액에서 점도는 상이한 수준의 전단 응력을 따라 변경되지 않은 채로 있다. 뉴턴형 거동은, 드롭-온-디맨드(drop-on-demand) 프린팅 및 3D 프린팅 시스템에서 양호한 분사 또는 액적 형성에 있어서 엄격한 전제 조건이며, 바이오 가공 용도에서 연어 젤라틴에 대한 또 다른 이점일 것이다. 또 다른 흥미로운 양태는, 연어 젤라틴이 심지어 20% [w/v]의 농도에서도 적절한 점도 범위 내에서 수행될 수 있다는 것이며, 이는 농도, 따라서 가교 후 기계적 특성의 측면에서 더 넓은 작용 범위를 의미한다(도 37 참조).
기계적 특징화
동적 기계적 분석(DMA)을 통해 측정된 연어 젤라틴 및 소 젤라틴으로부터 유래된 하이드로겔의 기계적 특성은 o-프탈디알데하이드(OPA) 아민 정량화 결과 및 이전의 연구(Billiet T. et al., Biomaterials 2014, 35: 49-62)와 일치하는데, 양의 상관관계를 의미하는 작용화도에 따라 압축 계수가 증가했기 때문이다. 연어 젤라틴 및 소 젤라틴을 기초로 하는 하이드로겔은 둘 다, 11 kPa(각각 10.6±0.7 S.D. kPa 및 10.5±0.9 S.D. kPa)의 압축 계수를 나타낸 0.5 MAA [% v/v]의 농도를 사용한 반응에서 변형된다(도 38a 참조). 2 MAA [% v/v]에서 연어 젤라틴 하이드로겔은 30.5±2.2 kPa의 압축 계수를 나타내었으며, 이와 비교하여 동일한 작용화 조건 하에 소 젤라틴으로부터 유래된 하이드로겔은 26.6±3.6 kPa의 압축 계수를 나타내었다. 5 MAA [% v/v]의 반응을 통해 변형된 소 젤라틴 유래-하이드로겔은 각각 32±1.3 kPa 내지 30.7±4 kPa로, 연어 젤라틴으로부터 유래된 하이드로겔보다 유사한 압축 계수를 보여주었다. 더욱이, 10 MAA [% v/v]에서 변형된 젤라틴으로부터의 하이드로겔은 유의성(p = 0.06, Mann-Whitney)에 근접한 흥미로운 차이를 보여주었는데, 상기 연어 젤라틴 하이드로겔은 평균 33 kPa을 나타낸 한편, 10 MAA [% v/v]에서의 소 젤라틴을 기초로 하는 하이드로겔은 28.2±1.7 kPa의 압축 계수를 보여주었고, 이는 OPA 및 핵 자기 공명(NMR) 결과가 10 MAA [% v/v]에서 더 높은 작용화도를 가리켰음에도 불구하고 5 MAA [% v/v]에서 소 젤라틴으로부터 유래된 하이드로겔에서 32±1.3 kPa가 수득된 것을 고려하면 감소를 의미한다. 전반적으로, 연어 젤라틴으로부터 유래된 하이드로겔 또는 소 젤라틴으로부터 유래된 하이드로겔 중 어느 것도, 압축 기계적 특성의 측면에서 다른 것을 능가하지 못하였다.
0.5 MAA [% v/v]에서 반응을 통해 발생된 연어-유래 또는 소-유래 젤라틴의 하이드로겔 중 어느 것도, 기계적 시험기를 사용한 인장 시험을 할 수 있을 정도로 충분한 온전성을 갖지 못하였다. 그러나, 2 및 10 MAA [% v/v](도 38b) 참조)의 반응 조건에서 발생된 하이드로겔로부터 수득된 결과는, 작용화도와 영률 사이에 양의 상관관계를 보여주는 DMA에 의해 수득된 것을 지지한다.
더욱이, 10 MAA [% v/v]에서 반응한 연어 젤라틴으로부터 유래된 하이드로겔은 22.2±1.2 S.D. kPa(5 MAA [% v/v]에서의 연어 하이드로겔로부터 1 kPa 증가)의 영률을 나타내었으며, 이는 작용화도와 영률 사이에 명백한 양의 상관관계를 초래하였다. 이러한 결과는 또한, 10 MAA [% v/v]에서의 반응으로부터 수득된 소 젤라틴에서도 관찰되었으며, 여기서 하이드로겔은 3 kPa 증가를 보여준다. 일반적으로, 메타크릴로일 치환도에서 작은 변화는 양호한 상관관계를 갖는 기계적 시험에서 반영되며, 연어 및 소로부터의 광-가교된 변형된 젤라틴들 사이에서 기계적 거동의 차이는 관찰되지 않는다.
가수분해 평가
이전에 제시된 바와 같이, 메타크릴로일 작용화도는 광-가교된 하이드로겔의 기계적 특성을 증강시킬 수 있을 것이며(도 38 참조), 따라서 기계적 도전이 예상되는 조직 공학 적용이 선호될 수 있을 것이다. 그러나, 측쇄 서열의 수반되는 간섭과 더불어 젤라틴의 aa 서열을 따라 벌키(bulky) 기(메타크릴로일)를 포함시키는 것은, 물질 함유(harboring) 및 ECM(세포외 기질) 리모델링 효소의 촉매 면에서 가수분해에 영향을 미칠 수 있을 것이며, 따라서, 기질 특이성 및 촉매작용이 손상될 수 있을 것이다. 이러한 생체물질 작용화 양태를 평가하기 위해, 2개의 상이한 공급원들로부터 유래되고 상이한 메타크릴화도를 갖는 광-가교된 하이드로겔을 콜라게나제 유형 2를 이용하여 가수분해시켰다. 가수분해 동역학(도 39 참조)으로부터, 유사한 작용화도를 갖는 연어 젤라틴 및 소 젤라틴을 비교할 때, 10 MAA [% v/v]에서 작용화 반응 처리된 젤라틴으로부터 제조된 하이드로겔에서를 제외하고는, 뚜렷한 차이가 관찰되지 않는다. 해당 경우에, 가수분해의 초기 속도 및 가수분해의 정류적 피크(stationary peak)까지의 시간은 소 젤라틴과 비교하여 연어 젤라틴에서 더 빨랐다. 메타크릴화도에 관하여, 메타크릴로일 치환이 증가할 때, 가수분해의 초기 속도 및 정류적 피크까지의 시간이 감소한다. 흥미롭게는, 연어로부터의 기계적 하이드로겔 및 소 하이드로겔이 유사한 결과를 보여주긴 했지만, 특히 높은 작용화도에서 연어 젤라틴 하이드로겔은 더 빠른 효소적 가수분해를 보여주었으며, 그 후에, 생체내에 이식된 경우 더 빠른 효소-유래 조직 통합(더 빠른 혈관화, 세포 침범 및 증식)을 예상한다.
실시예 8. 메타크릴레이트화된 연어 및 소 젤라틴의 작용화의 특징화
반응성 메타크릴산 무수물은, 온화한 조건 하에 젤라틴과 혼합된 경우 메타크릴로일기를 라이신의 유리 아민기와 반응시키고 대체로 결합시킬 수 있다(Nichol JW, Biomaterials. 2010, 31(21): 5536-5544). 반응된 메타크릴로일 젤라틴 내의 잔여 유리 아민기의, o-프탈디알데하이드(OPA) 검정법(P.M. Nielsen, Journal of Food Science 2001, 66(5): 642-646)을 통한 정량화는 젤라틴의 메타크릴화 또는 작용화 정도를 평가하는 신뢰할 만한 방법일 것이다. 다른 한편, 연어 젤라틴 및 소 젤라틴의 OPA 검정법 및 SDS-PAGE 분석은 비교 가수분해 수준 및 분자량 근사치를 각각 정량화할 수 있다(도 40 참조). 연어 젤라틴 및 소 젤라틴의 아미노산 조성물 분석은 소 젤라틴의 경우 약간 더 높은 양의 라이신(9% 더 높은 수의 라이신)을 보여주었으며, 이는 OPA 검정법을 사용하여 9% 더 높은 유리 아민의 정량화와 동일하며; 따라서, 가수분해 수준은 추출된 (소 및 연어) 젤라틴 둘 다에서 동일하다. 이는, 젤라틴 조제물에서 상이한 가수분해도가, 펩타이드 결합 절단 후 새로 노출된 아민으로 인해 비교 라이신 조성물 분석과 상이한 OPA 비교 정량화를 초래할 것이기 때문에, 제외된다. 이들 정량화는, 상이한 젤라틴 조제물에서 메타크릴로일 아민 조정의 양이 연어 젤라틴과 소 젤라틴 사이에서 유사하며, 이는 각각 미반응된 연어 젤라틴 및 소 젤라틴 내의 유리 아민 함량에 대한 퍼센트로서 언급됨을 나타내어 본 발명자들을 도왔다(도 41 참조).
SDS-PAGE 분석에 따라, 정제된 연어 및 소 젤라틴의 분자량 분포를 고려하면, 아민기 정량화 및 라이신 조성물에 의해 나타난 동일한 가수분해도, 및 작용화된 라이신의 수, 젤라틴 단량체 당 메타크릴로일의 수는 다양한 정도의 메타크릴로일 작용화도에서 제조된 소 젤라틴과 연어 젤라틴 사이에서 유사할 것이다. 이러한 측면에서, 유사한 시료를 갖는 것의 중요성은, 시험관내 및 생체내 검정법에서의 차이가, 폴리펩타이드의 단량체 당 메타크릴로일의 분자량, 가수분해도 또는 수의 차이에 의해서가 아니라 연어 젤라틴 및 소 젤라틴의 상이한 성질(예를 들어 프롤린 및 하이드록시프롤린 함량)에 의해 설명된다는 사실에 기인한다.
그러나, 이러한 접근법은, 다른 덜 반응성인 아미노산, 예컨대 세린, 트레오닌, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민에서 메타크릴로일 치환이 반응 동안 발생했다는 정보를 제공하지 않았다. 따라서, NMR 분석을 기초로 하는 두번째의 보다 정보적인 정량적 방법을 수행하여, 라이신 이외의 아미노산에서의 메타크릴로일기의 존재를 배제하였다. 도 42는 상이한 메타크릴화도에서 소 젤라틴 및 연어 젤라틴에 대해 수득된 스펙트럼을 보여준다. 비-변형된 젤라틴 및 변형된 젤라틴을 비교하고, 이전에 보고된(J Mater Sci: Mater Med (2012) 23:2607-2617) 화학적 이동을 분석한 후, 작용화된 젤라틴의 스펙트럼에서 d = 5.4 ppm 및 d = 5.6 ppm에서 관찰된 새로운 피크는 상이한 메타크릴로일 치환도를 갖는 젤라틴 조제물들 중에서 차별적으로 관찰되었다. 이들 피크는 메타크릴로일기에서 아크릴 양성자의 존재에 의해 발생되며, 한편 d = 1.8 ppm에 위치한 피크(스펙트럼에서 "c" 피크)는 동일한 첨가된 기의 메틸 작용기에 의한 것이다. 다른 한편으로, d = 2.9 ppm(스펙트럼에서 "b" 피크)에 위치한 라이신 메틸렌의 존재와 연관된 이동 신호의 감소는 라이신의 작용화를 나타낸다. 이전에 보고된(J Mater Sci: Mater Med (2012) 23:2607-2617), 하이드록실기에서 메타크릴로일 이전에 의한 것일 다른 NMR 피크는 본 발명자들의 젤라틴 조제물에서는 관찰되지 않았다. 비-변형된 젤라틴 및 변형된 젤라틴으로부터 수득된 1H-NMR 스펙트럼은 OPA 검정법과 비교하여 유사한 결과를 확인시켜 주었다(도 41 및 도 43 참조). 이러한 전제 하에, 상이한 반응 조건에서 수득된 메타크릴화도는 소 젤라틴과 연어 젤라틴 사이에서 유사하다.
실시예 9. 메타크릴레이트화된 냉수성 어류 젤라틴을 포함하는 새로운 제제
실시예 9.1 분지형 폴리에틸렌글리콜 유도체(예를 들어 멀티-암 PEG 유도체)를 추가로 포함하는 제제
개선된 가교 반응성, 더 양호한 흡습성(탈수를 피하는 능력), 및 더 큰 압축 계수 및 영률을 갖는 새로운 복합물을 제조하기 위해, 마스터 제제 SG8(90%에서 작용화된 15% [w/v] 연어 젤라틴)에 상이한 농도의 분지형 폴리-링커 PEG(8arm-PEG10K-아크릴레이트 트리펜타에리트리톨)를 보충하고, 기계적 특성, 유동학적 거동, 반응성 및 탈수에 대한 저항성에 대해 시험하였다. PEG의 농도 증가는 메카닉스(mechanic's) 후 가교(post crosslinking)의 측면에서 더 강인한 제제를 발생시켰으나, 더 높은 PEG 농도는 뉴턴형 제제를 상대적으로 비-뉴턴형이며 보다 점성인 제제로 변화시켰다(도 44 참조).
반응성 시험을 위해, 정상적인 작동 조건 하에 프린터 헤드(Objet30 3D 프린터, STRATASYS)로부터 자외선 광을 2 및 4회 통과시킨 후, 가교된 하이드로겔의 정성적 관찰을 수행하였다. SG8 제제만 기초로 하는 100 μm 높이 하이드로겔은 2회 통과 후 부분적으로 가교되고 탈수되었으며, 4회 통과 후 완전히 건조되었고, 한편, 1% [w/w] PEG가 보충된 하이드로겔은 2회 통과 후 탈수의 신호 없이 꽤 가교된 하이드로겔을 보여주었으나, 4회 통과 후 낮은 수화가 관찰되었다. 5% [w/w] PEG가 보충된 SG8 제제는 4회 통과 후에도 탈수에 저항성이고, 가교 반응성은 더 개선되었다(도 45 참조).
실시예 9.2 계면활성제를 추가로 포함하는 제제
표면 장력 측정
이미 언급된 바와 같이, 용액 내에서 물질의 양호한 분사 능력은 바람직하게는, 뉴턴형 유체 거동, 25-10 cP의 점도 및 낮은 표면 장력(25-30 mN/m)을 가진다. SG8 마스터 제제는 표면 장력을 제외하고, 바람직한 유동학적 매개변수 모두에 부합한다. 본 발명자들은 90%에서 작용화된 연어 젤라틴의 15% [w/v] 용액(SG8)을 제조하였으며, 이러한 용액은 43 mN/m의 정적 표면 장력을 보여주었다(도 46 참조). 표면 장력을 적절한 범위까지 낮추기 위해, 물 시스템에 대해 상이한 계면활성제, BYK-345(BYK, US), Tivida FL 2300 및 Tivida FL 2500(MERCK, Germany)을 사용하였다. 단지 작은 부피를 첨가함으로써, 모든 계면활성제는 마스터 제제의 정적 표면 장력을 25 mN/m까지 낮출 수 있었다(도 46 참조).
대부분의 액체가 순환 조건 하에 통상적으로 취급되기 때문에, 표면 장력의 시간 변화(time variation) 구성성분을 보고하는 것이 중요하다(도 46 참조). 이러한 구성성분은 계면활성제의 농도 및 성질에 따라 달라진다. 이러한 측면에서, 평형화 시간이 더 짧은 계면활성제는 pL 액적 형성 동안 표면 장력을 낮추는 데 더 효율적이다. 정적 표면 장력, 및 평형에 도달하는 데 필요한 시간을 고려하면, 0.02% [v/v] 농도에서 Tivida FL2300 및 0.02%에서 BYK 345가 잉크젯 시스템에서 pL 액적 형성에 사용되는 가장 유망한 계면활성제 조건인 것으로 보인다.
세포 생존력 및 세포 융화성 결정
새로운 복잡한 제제의 세포 생존력 및 세포 융화성을 입증하기 위해, 이러한 제제를 기초로 한 하이드로겔을 캡슐화된 세포와 함께 제조하였다.
세포가 하이드로겔 표면으로부터 100 ㎛보다 먼 거리에서 이러한 세포가 캡슐화되는 트랜스글루타미나제-가교된 젤라틴 젤에서, 이들 세포의 증식 프로파일이 급격하게 감소됨을 나타내는 이미 공지된 현상이 존재한다(PLoS One. 2014 Aug 18;9(8):e105616). 심지어 더 긴 거리에서 세포에 대한 영양소, 산소 및 대사물질 확산 및 교환의 배제된(deducted) 제한도 마찬가지로, 이들 세포의 생존력에서 중요한 효과를 예측할 것이다.
유사한 조건을 본 발명자들의 새로운 제제에서 시험하였으며, 이러한 제제에서 세포(2×106 세포/mL)를 높이가 1.5 mm이고 직경이 8 mm인 하이드로겔 내에서 캡슐화하였다. 상이한 시간 간격(0, 1, 7, 14, 21일) 후, 캡슐화된 세포를 하이드로겔로부터 회수하고(도 47a), 계수하고(도 47b), 생존력을 시험하였다(도 47c). 예상된 바와 같이, 회수된 세포의 수는 7일까지 감소하였는데, 아마도 하이드로겔 내 심부에서 캡슐화된 세포의 세포 사멸로 인한 것일 것이다. 7일 후, 세포 수는 다시 증가하는데, 아마도 하이드로겔 표면에 근접한 캡슐화된 세포의 세포 증식으로 인한 것일 것이다.
흥미롭고 예상치 못하게는, 계면활성제 TIVIDA 2300 및 TIVIDA 2500의 존재 하에 하이드로겔 제제는 7일째에 관찰된 세포 사멸을 감소시키며, 한편 계면활성제 BYK-345는 세포를 모두 사멸시켰으며, 이는 대체로 세포막의 온전성에 영향을 미치는 상기 계면활성제의 특정 화학적 성질 때문이다. TIVIDA 2300 및 TIVIDA 2500의 경우, 세포 생존력은 훨씬 더 높았으며, 변형된 연어 젤라틴만 기초로 하는 하이드로겔의 대조군보다 훨씬 더 높았다. 이러한 더 양호한 세포 생존력은 플루오로계면활성제(TIVIDA 2300, TIVIDA 2500)의 존재로 인해 하이드로겔 내에서 영양소, 대사물질 및 기체의 더 높은 확산 계수와 상관관계가 있을 가능성이 있다.
실시예 10. 상이한 pH에서 연어 젤라틴의 추출
연어 젤라틴을 이미 설명된 프로토콜에 따라 대서양 연어 껍질로부터 추출하였다. 간략하게는, 근육 및 비늘 잔여물을 제거하기 위한 세정, 및 0.1 M 용액 NaOH 및 0.05 M 아세트산 용액을 이용한 일련의 처리를 포함한 전처리 후, 연어 젤라틴 추출을 상이한 pH(3, 4 및 5) 하에 60℃에서 3.5시간 동안 수행하였다. 상층액 액체를 진공 여과하고(22 mm), 오븐 내에서 55℃에서 24시간 동안 건조하였다. 수득된 건조된 젤라틴을 분쇄하고, 추가 사용때까지 5℃에 저장하였다.
상이한 pH 조건 하에 수득된 연어 젤라틴을, 이들의 생화학적 특성(근사(proximate) 조성물, 분자량 및 아미노산 프로파일) 및 물리적 특성, 특히 젤 강도, 열적 및 유동학적 특성 및 라만 분광법에 의한 분자 배치의 측면에서 특징화하였다.
생화학적 특성 특징화
생화학적 특성에 관하여, 근사 조성물을 AOAC (2015)에 의해 기재되고 입증되며 이전에 젤라틴 특징화(Journal of the Science of Foods and Agriculture 91(2011):2558-2565, Food Hydrocolloids 71(2017):118-128)에서 사용된 방법을 사용하여 시험하였다. 분자량을 SDS-PAGE 전기영동에 의해 결정하고, 아미노산 프로파일을 HPLC에 의해 결정하였다(Journal of the Science of Foods and Agriculture 91(2011):2558-2565, Food Hydrocolloids 71(2017):118-128). 그 결과는, 근사 조성물의 측면에서, 상이한 pH 조건에서 젤라틴의 추출은 다량영양소(macronutrient) 조성물에 유의하게 영향을 미치지 않음을 보여주었다(표 2). 단백질 함량(시험된 모든 젤라틴 내에서 약 99% 건조 기준) 및 회분(ash) 함량(약 0.6% 건조 기준)에서 유의한 차이는 검출되지 않았으며, 반면, 지방 함량은 사용된 방법의 검출 한계보다 낮았고, 비-질소성 분획 역시 검출되지 않았다. 한편, 아미노산 조성물은 pH 추출이 원인인 유의한 차이를 보여주지 않았다. 젤라틴 안정성에 가장 중요한 아미노산(글리신, 프롤린 및 하이드록시프롤린)의 함량은 pH 추출에 의해 영향을 받지 않았다(표 2). 그러나, 추출에 더 낮은 pH가 사용되면, 더 낮은 pH에서 더 높은 가수분해 조건이 발생하므로 전기영동 젤 상에서 분자량 분포가 더 높아지기 때문에 SDS-PAGE 전기영동에 의해 평가된 분자량은, pH 추출이 젤라틴 가닥의 분자량을 결정하기 위한 키-값(key-value)임을 보여주었다. 따라서, pH 5에서 추출된 젤라틴은 약 120 kDa 주변에 놓인 분자량 밴드를 명확하게 보여주었으며, 이러한 밴드는 대체로 α-나선에 상응하고, 대략 250 kDa에서 다른 밴드는 더 복잡한 젤라틴 가닥(예를 들어 β-나선)과 관련이 있었다(도 48). 그러나, pH 3에서 추출된 젤라틴은 37 내지 100 kDa에 분포된 분자량 밴드를 보여주며, 이는 더 낮은 pH 값에서 촉진된 더 높은 가수분해 조건을 가리킨다(도 48).
표 2. 상이한 pH에서 수득된 연어 젤라틴에 대한 근사 조성물 및 아미노산 함량
pH 3.0 4.0 5.0
수분 (% ww) 11.5 5.4 3.7
단백질 (% dw) 99.4 99.4 99.5
비-질소성 추출물 0.0 0.0 0.0
지질 (% dw) ND+ ND+ ND+
회분 (% dw) 0.6 0.6 0.5
글리신 (mg/100g 단백질) 24.56 (3.27)* 25.26 (1.03) 26.68 (1.57)
프롤린 (mg/100g 단백질) 10.95 (1.29) 11.60 (0.14) 12.24 (0.32)
하이드록시프롤린 (mg/100g 단백질) 8.24 (0.47) 8.60 (0.02) 8.81 (0.10)
*괄호안의 값은 표준 편차에 상응한다.
물리적 특성 특징화
물리적 특성 특징화의 측면에서, pH 추출은 젤 강도에 대해 강한 효과를 보여주었다(도 49). 따라서, 시험된 최고 pH 추출(pH 5)은 더 높은 젤 강도를 가졌으며, 시험된 최저 pH(pH 3)는 더 낮은 젤 강도를 보여주었고, 이는 SDS-PAGE에 의해 평가된 pH 5에서 추출된 젤라틴에 의해 제시된 더 높은 분자량과 일치한다. 이러한 거동은 높은 분자량을 갖는 젤라틴이 더 많은 양의 나선 구조를 형성하는 능력이 더 높다는 것과 관련이 있었다(Biomaterials 25(2004):5675-5680). 젤 강도 결과에 의해 기재된 거동은 상이한 pH에서 추출된 젤라틴의 열적 매개변수와 직접적으로 상관관계가 있다. 온도 주사를 10℃/분의 속도에서 70℃로부터 -5℃까지 적용하고, 무작위 젤라틴 가닥으로부터 나선 구조 형성과 관련된 발열 전이를 발생시키는 온도(젤화점)를 평가하는 시차 주사 열량계(DSC)에 의해 열적 특성을 연구하였다. DSC 데이터는, pH 5에서 추출된 젤라틴으로부터의 젤 형성에는 더 높은 에너지(엔탈피)가 관여하고, pH 3에서 수득된 젤라틴으로부터의 젤 형성에는 더 적은 에너지가 관여함을 보여준다. 따라서, pH 5에서 추출된 연어 젤라틴은 더 높은 분자량을 가지며, 이는 더 강한 젤라틴 젤을 생성하고, 이는 젤라틴 접힘을 촉진하기 위해서는 더 높은 에너지를 사용할 것을 내포한다. 그렇지 않다면, 전이 온도가 또한, 언급된 매개변수와 상관관계가 있으며, 여기서, 더 높은 분자량의 젤라틴에서, 전이는 소정의 온도에서 발생하고, 분자량이 감소함에 따라 전이 온도는 더 낮은 값으로 이동하고 있다(표 3).
상이한 pH에서 수득된 연어 젤라틴의 유동학적 특징화에 관하여, 수득된 결과는 또한, 이전에 제시된 결과와 직접적으로 상관관계가 있다. 도 50은 시험된 연어 젤라틴 시료의 점도 거동을 온도의 함수로서 보여준다(유동 온도 램프). 젤라틴 가닥의 분자량이 점도 거동에 미치는 효과가 상당히 명백한데, 여기서, pH 5에서 추출된 젤라틴은 시험된 모든 온도 범위에서 더 높은 점도를 보여주었으며, 한편 pH 3에서 추출된 젤라틴에서는 그 반대의 결과가 관찰되었다. 이들 결과는 또한, 더 높은 분자량을 갖는 젤라틴 가닥이 더 많은 양의 나선 구조를 형성할 수 있으며(더 높은 젤 강도), 더 높은 유동 저항성을 촉진하고, 더 높은 점도를 보여준다는 것을 강조하고 있다. 예를 들어, 4℃에서 수득된 점도 값은, pH 3, 4 및 5에서 추출된 젤라틴에 대해 각각 0.035, 1.477 및 12.50 Pa·s이었다. 유동학적 분석을 통해, G' 계수와 G'' 계수 사이의 교차점을 판독함으로써 젤라틴의 젤화점을 평가할 수도 있다(데이터는 제시되지 않음). 따라서, 흥미롭게는, 유동학에 의해 기록된 젤화점은 이전에 DSC에 의해 기록된 젤화점과 일치한다(표 3).
표 3. 상이한 pH에서 수득된 연어 젤라틴에 대한 열적 매개변수 및 유동학적 매개변수
pH T 젤화 (℃) - DSC △H (Jg -1 )(db) - DSC T 젤화 (℃) - 유동학적 특성
3.0 3.6 (0.3)*a -2.3 (0.5)a 3.0a
4.0 9.4 (0.5)b** -6.7 (1.1)b 7.0b
5.0 10.6 (0.3)c -8.6 (1.1)c 10.5c
*괄호안의 값은 표준 편차에 상응한다.
**동일한 세로행 내의 상이한 문자들은 유의한 차이를 나타낸다(p<0.05).
마지막으로, 라만 분광법에 의한 분자 배치의 분석 또한, 이후의 분석과 밀접한 관련이 있는 결과를 보여준다. 라만 스펙트럼은 도 51에 도시되어 있다. 상이한 pH에서 추출된 젤라틴에서 수득된 라만 스펙트럼은 이러한 종류의 단백질에 대해 예상된 스펙트럼이다. 예를 들어, 상이한 아미드기 I, II 및 III이 문헌에서 이들 기에 대해 보고된 라만 이동(Raman shift)(각각 1650 cm-1, 1550 cm-1 및 1240 cm-1)에서 검출되었다. 추출 pH가 감소하고 있을 때 피크 강도의 증가를 보여준 아미드 B 기에 의해 나타난 거동이 흥미롭다. 아미드 B 기는 단백질 백본의 말단 구역에 놓인 하이드록실기와 관련이 있으며, 이러한 경우, N-말단에 하이드록실기를 갖는 분자가 더 많은 수로 존재함을 제시한다. 이러한 거동은, 낮은 pH의 가수분해 효과로 인해 pH 3에서 수득된 더 가수분해된 젤라틴 사슬과 일치한다. 따라서, 라만 스펙트럼 결과는 SDS-PAGE 결과와 융화성이고, 젤 강도 및 열적 및 유동학적 특성과 일치한다.

Claims (22)

  1. 저온-적응된 해양생물종의 천연 공급원으로부터 유래된 아미노산 사슬 젤라틴 중합체를 1% 내지 20% (w/v)의 농도로 포함하는 용액을 포함하는 조성물로서,
    상기 조성물은 광개시제와 같은 중합 개시제를 추가로 포함하고,
    상기 아미노산 사슬은 메타크릴로일기 또는 아크릴로일기로 구성된 군으로부터 선택되는 화학제(chemical agent)에 의해 화학적으로 작용화되어(chemically functionalized), 유리 라디칼의 존재 하에 중합 또는 가교에 대해 반응성으로 되는, 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 용액이 화학적으로 작용화된 아미노산 사슬 젤라틴 중합체를 5% 내지 20% (w/v)의 농도로 포함하는, 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 아미노산 사슬이 메타크릴로일기에 의해 작용화되는, 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 화학제에 의한 상기 젤라틴 중합체의 아미노산 측쇄의 작용화도(degree of functionalization)가 라이신 잔기의 30% 내지 100%인, 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 화학제에 의한 상기 젤라틴 중합체의 아미노산 측쇄의 작용화도가 라이신 잔기의 80% 이상, 바람직하게는 라이신 잔기의 85% 이상인, 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 중합 개시제가 광개시제인, 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    유리 라디칼의 존재 하에 중합 또는 가교에 반응성인 기들의 공유 가교를 유도하기 전에, 젤화(물리적 가교)를 유도하는 온도에서 상기 용액을 전처리하는, 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 젤라틴 중합체가 살모(Salmo) 또는 온코린쿠스(Oncorhynchus) 속(genus)으로부터 유래되는 것인, 조성물.
  9. 저온-적응된 해양생물종, 바람직하게는 살모 또는 온코린쿠스 속의 천연 공급원으로부터 유래된 아미노산 사슬 젤라틴 중합체를 1% 내지 20% (w/v), 바람직하게는 5 내지 20% (w/v)의 농도로 포함하는 용액을 포함하는 조성물의 제조 방법으로서,
    상기 조성물은 선택적으로 광개시제를 추가로 포함하며,
    상기 아미노산 사슬은 메타크릴로일기 또는 아크릴로일기로 구성된 군으로부터 선택되는 화학제에 의해 화학적으로 작용화되어, 유리 라디칼의 존재 하에 중합 또는 가교에 대해 반응성으로 되고,
    상기 제조 방법은
    a. 저온-적응된 해양생물종, 바람직하게는 살모 또는 온코린쿠스 속의 천연 공급원으로부터 유래된 아미노산 사슬 젤라틴 중합체를 수득하고, 상기 중합체를 용매, 바람직하게는 PBS 또는 수(water) 중에 1% 내지 20% (w/v), 바람직하게는 5 내지 20% (w/v)의 최종 농도로 용해시키는 단계;
    b. 유리 라디칼의 존재 하에 중합 또는 가교에 반응성으로 되도록 할 수 있는 화학제를 첨가함으로써, 상기 단계 a)의 아미노산 사슬 젤라틴 중합체의 1차 구조를 화학적으로 변형시키는 단계;
    c. 모든 미반응된 화학제를 상기 단계 b)의 용액으로부터 제거하는 단계;
    d. 선택적으로, 라디칼-유래 개시제, 예컨대 광개시제 및/또는 계면활성제를 첨가하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  10. 저온-적응된 해양생물종, 바람직하게는 살모 또는 온코린쿠스 속의 천연 공급원으로부터 유래된 아미노산 사슬 젤라틴 중합체를 1% 내지 20% (w/v), 바람직하게는 5 내지 20% (w/v)의 농도로 포함하는 용액을 포함하는 조성물의 제조 방법으로서,
    상기 조성물은 선택적으로 광개시제를 추가로 포함하며,
    상기 아미노산 사슬은 메타크릴로일기 또는 아크릴로일기로 구성된 군으로부터 선택되는 화학제에 의해 화학적으로 작용화되어, 유리 라디칼의 존재 하에 중합 또는 가교에 대해 반응성으로 되고,
    상기 제조 방법은
    a. 저온-적응된 해양생물종, 바람직하게는 살모 또는 온코린쿠스 속의 천연 공급원으로부터 유래된 아미노산 사슬 젤라틴 중합체를 수득하고, 상기 중합체를 용매, 바람직하게는 PBS 또는 수 중에 1% 내지 20% (w/v), 바람직하게는 5 내지 20% (w/v)의 최종 농도로 용해시키는 단계;
    b. 메타크릴산 무수물을 상기 단계 a)의 용액에 첨가함으로써, 상기 단계 a)의 아미노산 사슬 젤라틴 중합체의 1차 구조를 화학적으로 변형시키는 단계;
    c. 모든 미반응된 메타크릴산 무수물을 상기 단계 b)의 용액으로부터 제거하는 단계;
    d. 선택적으로, 라디칼-유래 개시제, 예컨대 광개시제 및/또는 계면활성제를 첨가하는 단계;
    e. 선택적으로, 적용 가능하다면, 상기 단계 c) 또는 d)로부터 생성된 조성물을 여과하고 동결 건조하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 저온-적응된 해양생물종의 천연 공급원으로부터 유래된 아미노산 사슬 젤라틴 중합체가 저온-적응된 어류, 바람직하게는 살모 또는 온코린쿠스 속의 껍질 또는 뼈로부터 수득된 것인, 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 추출 과정이 pH 3 내지 5.5, 바람직하게는 약 pH 5에서의 조정을 포함하는, 방법.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법이, 화학적으로 변형된 아미노산 사슬 및 광개시제를 포함하는 용액을, 상기 광개시제의 성질에 따라 광, 가시광선, 자외선 또는 적외선에 노출시켜, 가교된 조성물을 제공하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  14. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득되거나 또는 수득 가능한 용액을 포함하는 조성물.
  15. 제13항에 따른 방법에 의해 수득되거나 또는 수득 가능한 가교된 조성물.
  16. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 조성물 또는 제14항 또는 제15항에 따른 조성물로서,
    용액이 계면활성제를 추가로 포함하고,
    바람직하게는 상기 계면활성제가 6개 미만의 탄소를 갖는 분지형 플루오로계면활성제인, 조성물.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 계면활성제가 0.005% 내지 0.1% (w/v)의 농도의, 6개 미만의 탄소를 갖는 분지형 플루오로계면활성제인, 조성물.
  18. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 조성물 또는 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 조성물로서,
    상기 조성물이 분지형 폴리에틸렌글리콜(PEG) 유도체를 추가로 포함하는, 조성물.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 PEG 유도체가 1% 내지 5% (w/w)의 농도의 멀티-암(multi-arm) PEG 유도체인, 조성물.
  20. 3D 프린팅, 압출 시스템(적층 제작(additive fabrication)), 분무 시스템, 주조(casting), 마이크로- 및 나노 섬유 제작 시스템(전기방사, 용액 블로우 방사(solution blow spinning)) 또는 미세유체장치(microfluidics)를 위한, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 조성물 또는 제14항에 따른 조성물의 용도.
  21. 치료 또는 진단 목적에 적합한 스캐폴드, 비드, 조작된 조직(engineered tissue) 또는 장치 및 마이크로-장치의 제조를 위한, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 조성물 또는 제14항에 따른 조성물의 용도.
  22. 식품 코팅을 위한, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 조성물 또는 제14항에 따른 조성물의 용도.
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