JP2020196752A - コラーゲンに基づく治療送達系 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、その開示が、その全体が本明細書に参照によってはっきりと組み込まれてい
る、「Drug Delivery System」と題され、2014年8月27日に
提出された米国特許仮出願第62/042,664号明細書に対する優先権を主張する。
む治療送達デバイス、送達デバイスを作製するのに作動可能なプレマトリックス溶液およ
び活性薬剤送達のための方法に関する。本開示は、コラーゲン原線維マトリックスのタン
パク分解性生分解性性質、コラーゲン原線維マトリックスの微細構造性質、コラーゲン原
線維マトリックスの機械的性質およびコラーゲン原線維マトリックスの輸送性質の1つま
たは複数を制御することによって送達系をカスタマイズする方法にも関する。
体適合性、低免疫原性および生分解性のために、移植可能または注入可能薬物送達ビヒク
ルとしての使用のための候補材料として多くの注目を集めてきた。細胞外マトリックスは
、細胞のための足場を提供することが公知である一方、細胞を三次元的に組織化し、細胞
挙動を調節するための必須の情報を提供する。このように、組織工学の分野は、これらの
足場の形と機能の両方を模倣して、最適な組織修復および置き換えのための組成物を作り
出そうと努力している。コラーゲン、および特にI型コラーゲンは、身体におけるその高
い利用能、組織および種にわたる保存、生分解性ならびに生体適合性により、組織工学の
分野において使用され得る。実際、コラーゲンは、ECMの最も豊富な分子であるだけで
なく、それは、いくつかの組織の構造的および機械的性質の大部分を司る。コラーゲンの
in vivo形態は、ランダムに組織化されたテロペプチドによって両方の末端でキャ
ップされているトリプル−ヘリックス中央領域である。これらのコラーゲン分子は、天然
の分子架橋を含有する分枝状コラーゲン原線維ネットワークとして集合したECM内に見
出される。
ず、局所的活性薬剤放出を制御するためのビヒクルとしてのその使用は、限定されてきた
。さらに、特定の薬剤の予測可能な局在型送達を同時に達成しながら適切な組織再生を誘
導する組織移植片としてのその適用は、現在までのところ達成されていない。実際、少数
のコラーゲンに基づく活性薬剤送達製剤のみが臨床治験まで進んだ。既存の製剤は、非解
離性原線維コラーゲンまたは可溶化コラーゲンとして分類され得る。これらの製剤は、は
っきりと定まっていない分子組成、低い機械的完全性、急速な生分解および薬物放出プロ
ファイルに対する限定された制御を含めたいくつかの欠点を有する。
燥されて、架橋されていてもされていなくてもよいスポンジを形成する脱細胞化コラーゲ
ン細胞外マトリックス(ECM)粒子状物質を含有する製剤である。可溶性コラーゲンは
、対照的に、ペプシンまたは粘性コラーゲン溶液を形成するための哺乳動物組織の酸可溶
化から得られ、次いで、これは、凍結乾燥され、架橋もしくは非架橋スポンジまたは注入
可能粘性ゲルとして製剤化される。上記のように、以前記載されたコラーゲンに基づく活
性薬剤送達プラットフォームは、はっきりと定まっていない分子組成、低い機械的完全性
および安定性、急速なタンパク分解ならびに限定された設計制御を含めた多くの限定を有
する。化学的および物理的手段を含めた外因的な架橋は、機械的および取扱い性質を改善
し、移植時の持続性を増加させるために常法に従って使用されるが、かかるプロセシング
は、有害な組織応答および生物活性の喪失を伴う。
らの重大な限定に原因があるとされ得る。さらに、これらの従来の製剤は、ポアサイズお
よびタンパク分解性を含めた材料性質の制御が不十分である無定形な微細構造を示す。こ
れらのパラメーターの大ざっぱな制御は、凍結乾燥条件ならびに/または外因的な化学的
および物理的架橋の調節を通してしばしば達成される。架橋なしで形成された材料は、粘
性ゲルに相当する。それらは、機械的に不安定で、取扱うには柔らかすぎ、細胞誘導収縮
に耐えられず、したがって、組織再生に必要な細胞内殖および移動を支持できないと特徴
付けられる。他方、外因的な架橋は、細胞毒性または組織石灰化およびコラーゲン自体の
部分的変性などの細胞および組織に有害な効果を有することが示された。アルデヒドに基
づく架橋は、最終生成物中にアルデヒドが残存することにつながり得、コラーゲンの生体
適合性に影響を及ぼし得る。さらに、脱熱水架橋(de-hydrothermal cross-linking)に
はそれ固有の限界があり、十分に改善された性質を有する材料につながらない。
らなる進歩が必要とされている。本明細書で詳細に説明されることになるように、本開示
は、この必要性に取り組み、また、既存の技術における欠陥に取り組む関連する組成物、
デバイスおよび方法を提供する。
原線維マトリックス全体にわたってまたはコラーゲン原線維マトリックスの部分内に分散
した活性薬剤を含む治療送達デバイスが提供される。コラーゲン原線維マトリックスは、
可溶性オリゴマーコラーゲンの重合生成物または本明細書で非オリゴマー可溶性コラーゲ
ン分子とも称される可溶性コラーゲン分子の1つもしくは複数の他の型との可溶性オリゴ
マーコラーゲンの混合物の重合生成物を含む。一実施形態では、非オリゴマー可溶性コラ
ーゲン分子は、可溶性テロコラーゲン分子および可溶性アテロコラーゲン分子の1つまた
は複数を含む。一実施形態では、合成コラーゲン原線維マトリックスは、少なくとも5P
aの堅さを示す。オリゴマーコラーゲン、または非オリゴマー可溶性コラーゲン分子の1
つもしくは複数の型との可溶性オリゴマーコラーゲンの混合物は、外因的な架橋剤の非存
在下で自己集合して合成巨大分子コラーゲン原線維マトリックスとなる能力がある。
を含む水溶液を形成すること;(ii)ビルディングブロックの自己集合による重合を引
き起こし、その結果、不溶性合成コラーゲン原線維マトリックスを形成する;および(i
ii)(a)水溶液中に活性薬剤のある量を含め、それによって前記引き起こすことが、
活性薬剤が内部に分散したコラーゲン原線維マトリックスを形成すること、または(b)
合成コラーゲン原線維マトリックスを活性薬剤の量と接触させて、活性薬剤が内部に分散
したコラーゲン原線維マトリックスを形成することを含む、治療送達デバイスを作製する
ための方法が提供される。ビルディングブロックの量は、可溶性オリゴマーコラーゲンを
含む。一実施形態では、コラーゲン原線維マトリックスは、少なくとも5Paの堅さを示
す。
を含むプレマトリックス組成物も提供する。可溶性コラーゲン原線維ビルディングブロッ
クは、外因的な架橋剤の非存在下で自己集合して合成巨大分子コラーゲン原線維マトリッ
クスとなるように作動可能である、可溶性オリゴマーコラーゲン、または非オリゴマー可
溶性コラーゲン分子の1つもしくは複数の型との可溶性オリゴマーコラーゲンの混合物を
含む。一実施形態では、非オリゴマー可溶性コラーゲン分子は、可溶性テロコラーゲン分
子および可溶性アテロコラーゲン分子の1つまたは複数を含む。一実施形態では、薬剤は
、1つまたは複数のコラーゲン原線維ビルディングブロックと会合している。一実施形態
では、コラーゲン原線維マトリックスは、少なくとも5Paの堅さを示す。
溶液および活性薬剤を含むプレマトリックス組成物;または(ii)不溶性合成コラーゲ
ン原線維マトリックスおよびコラーゲン原線維マトリックス全体にわたってもしくはコラ
ーゲン原線維マトリックスの部分内に分散した第1の活性薬剤を含む治療送達デバイスを
in situ位置で配置することを含む、活性薬剤を送達するための方法が提供される
。
ら明らかとなろう。
様々な態様は、より明らかとなり、本出願自体の教示は、より良く理解されるであろう。
開示された実施形態は、網羅的であることまたは本出願の範囲を開示された正確な形に限
定すると解釈されることが意図されていない。
下の詳細な説明において開示された正確な形に限定することが意図されていない。むしろ
、実施形態は、当業者が本開示の原理および実行を正しく認識しかつ理解し得るように選
択され、記載されている。
属する分野の当業者によって通例理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で記載され
たものと類似したまたは同等の方法および材料が本出願の実行または試験において使用さ
れ得るが、様々な特定の方法および材料がここで記載される。
スを含むコラーゲンに基づく治療送達デバイスを対象とする。別の態様では、本開示は、
プレマトリックス組成物を対象とする。さらに他の態様では、本開示は、治療送達デバイ
スおよびプレマトリックス組成物を作製しかつ使用する方法を提供する。本開示のある特
定の実施形態に従って、例示的治療送達デバイスは、水溶液から、組成が分かっているコ
ラーゲン原線維マトリックスビルディングブロックの混合物を重合させることによって調
製される。コラーゲンに基づく治療送達デバイスは、移植可能または注入可能であってよ
い。開示された系は、バースト、持続的および標的放出を含めた、本明細書で活性薬剤と
称される1つまたは複数の治療薬に関して広範囲のカスタマイズ可能な時空間的分子放出
プロファイルを可能にする。
いう用語は、コラーゲン原線維を含み、可溶化コラーゲンビルディングブロックから制御
された条件下で形成されたI型コラーゲン組成物を表す。一実施形態では、コラーゲン原
線維マトリックス中の少なくとも1%のコラーゲンは、オリゴマーから構成される。他の
実施形態では、コラーゲン原線維マトリックス中の少なくとも2%、少なくとも3%、少
なくとも4%または少なくとも5%のコラーゲンは、オリゴマーから構成される。一実施
形態では、コラーゲン原線維マトリックス材料は、少なくとも5Paの堅さを有する。他
の実施形態では、コラーゲン原線維マトリックス材料は、少なくとも10Pa、少なくと
も15Pa、少なくとも20Paまたは少なくとも25Paの堅さを有する。
として公知の3つのポリペプチド単位のユニークなトリプルヘリックス構造立体配置を有
する少なくとも20の遺伝的に異なる分泌タンパク質のファミリーを表す。3つのアルフ
ァ鎖(2つのα1(I)および1つのα2(I)鎖)は、(Gly−X−Y)n反復単位
によって特徴付けられ、ここで、XおよびY位置は、プロリンおよびヒドロキシプロリン
によってしばしば占められ、各末端で非ヘリックステロペプチド末端が隣接する約300
nm長のトリプルヘリックスコラーゲン分子を形成する。モノマーとしても公知であるこ
れらのコラーゲン分子は、階層的様式で自己集合して、次いで、組み合わさって、身体の
組織のECMを形成する微細線維、原線維、ファイバーおよびファイバー束の組織特異的
ネットワークを形成する基本的なビルディングブロックである。リジルオキシダーゼは、
ねじれ型コラーゲン分子(モノマーと呼ばれる)のプレ原線維凝集物(prefibrillar agg
regate)に結合し、これらの間の架橋形成を触媒して、共有結合的に架橋されたダイマー
またはトリマー(オリゴマーと呼ばれる)を作り出す。種々のオリゴマー前駆体は、最終
的に組織特異的原線維構造およびマトリックス機能をもたらす進行性分子パッキングおよ
び集合を調節する。モノマー製剤とオリゴマー製剤の両方は、インタクトなテロペプチド
領域を有し、酸不安定性、中間架橋から産出される反応性アルデヒドを含有する。コラー
ゲンのタンパク分解酵素処置は、末端テロペプチド領域を除去して、アテロコラーゲン製
剤をもたらす一方、アミノおよびカルボキシル−テロペプチドの除去は、再構成された生
成物におけるコラーゲン分子の無定形な配置およびバンド形成された原線維パターンの喪
失をもたらす。
発生の分子内架橋を介して互いに共有結合しており、水性流体に可溶性である分子を表す
。
ゲンモノマー」または「モノマーコラーゲン」とも称される)という用語は、カルボキシ
およびアミノ末端非ヘリックステロペプチド末端がインタクトであり;原線維マトリック
スへの自己集合を経ることができ、分子間共有結合架橋を欠く個々のコラーゲン分子を表
す。
ダーゼ媒介性分子間架橋形成に重要であることが公知であるトロポコラーゲン鎖のアミノ
およびカルボキシ末端非トリプルヘリックスドメインを表す。
ゲンから部分的または完全に除去されているトリプルヘリックス分子を表す。かかるアテ
ロコラーゲン調製物は、典型的に、組織からの酵素に基づく(例えば、ペプシンに基づく
)コラーゲン抽出手順の結果である。
ックスポーションを表す特定のアミノ酸配列、しばしば−(Pro−Hyp−Gly)−
を有する化学的に合成されたコラーゲンビルディングブロックを表し、天然のコラーゲン
において見出されるものに似たトリプルヘリックス高次構造を形成する。
込まれ得る緩い網目構造または接続されたものの配置を表す。コラーゲンの文脈では、マ
トリックスは、間隙液相によって囲まれた不溶性コラーゲン原線維ネットワークまたは無
定形なナノ構造から構成される複合材料を表す。
含み、これは、コラーゲンの組織特異的、共有結合分子間架橋を保持する一方、テロコラ
ーゲン(またはモノマー)は、これらの分子間共有結合架橋を欠く個々のコラーゲン分子
であることが本明細書で理解され、正しく認識されよう。テロコラーゲンおよびオリゴマ
ーは、インタクトなテロペプチド領域を有し、酸不安定性、中間架橋から産出された反応
性アルデヒドを含有する。コラーゲン原線維が集合して原線維ポリマーネットワークを形
成するプロセスである、天然のin vivo重合時に、これらの反応性アルデヒドは、
原線維形成プロセスの一部として共有結合、中間架橋を自発的に再編成する。コラーゲン
が末端テロペプチド領域を除去するタンパク分解酵素で処置された場合、ペプシン−可溶
化(テロペプチド−欠乏性)アテロマー(atelomer)(またはアテロコラーゲン)製剤が
作り出される。アミノ(N)−テロペプチドとカルボキシル(C)−テロペプチドの両方
は、架橋および原線維形成において重要な役割を果たすので、それらの完全な除去は、再
構成された生成物におけるコラーゲン分子の無定形な配置およびバンド形成された原線維
パターンの結果的な喪失をもたらす。
ビルディングブロックは、ウシ、ブタおよびウマの皮および腱、ならびにヒトの腱などの
哺乳動物組織を含むが、これらに限定されない当技術分野で公知の多種多様の未加工のコ
ラーゲン供給源から得られ得る。代わりに、ビルディングブロックは、組換えテクノロジ
ーを使用して作製されたコラーゲン模倣ペプチドまたは可溶性コラーゲン分子とすること
ができる。本開示において記載されたこれらのビルディングブロックから形成されたマト
リックスは、市販のコラーゲン製剤と比較して、優れたメカノバイオロジー的性質を示す
。本明細書で記載されたマトリックスは、未加工のまたは天然のコラーゲンとは異なる性
質も示す。オリゴマー形でのI型コラーゲンポリマーは、本明細書で記載された不溶性合
成コラーゲン原線維マトリックスの主要なビルディングブロックである。本明細書でさら
に記載されるように、オリゴマーの、例えば、アテロコラーゲンおよび/またはテロコラ
ーゲンなどの非オリゴマー可溶性コラーゲン分子との比は、形成されたコラーゲン原線維
マトリックスの様々な性質を調節するために変動され得、これにより、デバイスの意図さ
れた目的、位置および設置に依存した、本明細書で開示されたコラーゲンに基づく治療送
達デバイスのカスタマイゼーションが可能になる。
デバイスは、活性薬剤または、任意選択で、1つを超える活性薬剤も含む。デバイスに含
まれた1つまたは複数の活性薬剤はまた、デバイスの意図された目的、位置および設置に
依存して変動し得る。本明細書では、「活性薬剤」という用語は、生物系における活性を
有する任意の化合物、薬剤、分子、生体分子、薬物、治療剤、ナノ粒子、ペプチド、タン
パク質、ポリペプチド、抗体、リガンド、部分抗体、ステロイド、増殖因子、転写因子、
DNA、RNA、ウイルス、細菌、脂質、ビタミン、小分子、または大分子を表す。活性
薬剤は、「生体分子」、「薬物」、銀アミン錯体、界面活性剤、ポリヘキサメチレンビグ
アニジン、ベタイン、抗菌薬、殺菌活性を有する線状ポリマービグアニジン、生理活性添
加剤、ヘパリン、グリコサミノグリカン、細胞外マトリックスタンパク質、抗生物質、増
殖因子、上皮増殖因子(EGF)、血小板由来増殖因子(PDGF)、繊維芽細胞増殖因
子(FGF)、コラーゲン結合性ペプチドまたは因子、結合組織活性化ペプチド(CTA
P)、形質転換増殖因子(TGF)、抗がん剤、免疫調節物質、免疫調節剤、抗炎症剤、
骨形成剤、造血剤、造血調節物質、骨誘導剤、TGF−β1、TGF−β2、TGFα、
インスリン様増殖因子(IGF)、腫瘍壊死因子(TNF)、インターロイキン、IL−
1、IL−2、コロニー刺激因子(CSF)、G−CSF、GM−CSF、エリスロポエ
チン、神経増殖因子(NGF)、インターフェロン(IFN)、IFN−α、IFN−β
、IFN−γ、防腐剤、色素、非生理活性薬剤、ホルモンおよび上記の合成類似体を含む
が、これらに限定されない。「生体分子」は、ステロイド、増殖因子、転写因子、DNA
、RNA(siRNA、mRNAなどを含めた)、ペプチド(天然および合成)、タンパ
ク質、部分または全抗体、リガンド、ウイルス、細菌、脂質、またはビタミンを含むが、
これらに限定されない。「薬物」は、化学療法薬、阻害剤、刺激薬、プロテアーゼ、抗生
物質、抗ウイルス薬を含むが、これらに限定されない「小分子」;「生体分子」、「大分
子」またはその組合せを含むが、これらに限定されず、ここで、薬物は、標的タンパク質
、細胞または組織に対して有益または否定的な効果を有するように使用される。界面活性
剤は、グリシン誘導体、スルホサクシネート、および分枝していない脂肪酸に基づくアミ
ドを含み得るが、これらに限定されない。
示すのに十分な特定の薬剤または因子の量を表す。免疫調節は、開業医が望むように免疫
系を抑制または増強し得る。免疫系を抑制することは、対象が臓器移植レシピエントであ
る場合またはループス、自己免疫性関節炎、自己免疫性糖尿病を含むが、これらに限定さ
れない自己免疫疾患の処置にとって望ましい場合があり;免疫系の抑制が望ましい追加の
診断は、当業者に公知である。代わりに、免疫調節は、例えば、がん、重症感染症または
創傷治癒の処置において免疫系を増強し得;免疫系の増強が望ましい追加の診断は、当業
者に公知である。
は、選択された薬剤に感受性の腫瘍細胞を有する対象において腫瘍細胞増殖を阻害する能
力がある薬剤の量である。
強するまたは阻害する薬剤の量である。
加を引き起こすまたはこれに貢献する薬剤の量である。
マトリックスビルディングブロックは、例えば、ブタの皮膚を含めたいくつかの供給源か
ら得られ得る。本明細書で記載されたコラーゲン組成物を作製するためのコラーゲンまた
はコラーゲン成分を単離するためのコラーゲン含有供給源材料として有用な適した組織は
、温血脊椎動物の粘膜下組織または任意の他の細胞外マトリックス含有組織を含む。粘膜
下組織を調製する適した方法は、その開示が、その全体が参照によって本明細書にそれぞ
れ組み込まれている米国特許第4,902,508号明細書;第5,281,422号明
細書および第5,275,826号明細書に記載されている。粘膜下組織以外の細胞外マ
トリックス材料含有組織は、本明細書で開示されたさらに他の実施形態に従ってコラーゲ
ンを得るために使用され得る。精製コラーゲンまたは部分的に精製された細胞外マトリッ
クス成分を得ることにおける使用のための他の細胞外マトリックス材料由来組織を調製す
る方法は、当業者に告知である。例えば、参照によって本明細書にそれぞれ組み込まれて
いる、米国特許第5,163,955号明細書(心臓周囲組織);第5,554,389
号明細書(膀胱粘膜下組織);第6,099,567号明細書(胃粘膜下組織);第6,
576,265号明細書(一般に、細胞外マトリックス組織);第6,793,939号
明細書(肝基底膜組織);および第7,919,121号明細書(肝基底膜組織);およ
び国際公開第2001/45765号パンフレット(一般に、細胞外マトリックス組織)
を参照されたい。様々な他の実施形態では、コラーゲン含有供給源材料は、胎盤組織、卵
巣組織、子宮組織、動物尾組織、皮膚組織、骨、腱および軟骨組織からなる群から選択さ
れ得る。一部の実施形態では、コラーゲンは、ブタ皮膚コラーゲン、ウシコラーゲンおよ
びヒトコラーゲンから選択される;しかしながら、任意の適した細胞外マトリックス含有
組織が本教示に従って精製コラーゲンまたは部分的に精製された細胞外マトリックス成分
を単離するためのコラーゲン含有供給源材料として使用され得ることが本明細書で理解さ
れ、正しく認識されよう。
膜下組織を調製するための例示的調製方法は、その開示が参照によって本明細書に組み込
まれている米国特許第4,902,508号明細書に記載されている。一実施形態では、
例えば、他の種を排除することなく、ブタ、ヒツジまたはウシ種から好ましくは収集され
た脊椎動物の腸のセグメントは、細胞を除去するための縦のぬぐい運動を使用した剥離に
供される、または細胞除去は、低張もしくは高張溶解によって達成される。一実施形態で
は、粘膜下組織は、水でまたは低張条件下の生理食塩水でなどの低張条件下ですすがれ、
任意選択で殺菌される。別の例示的実施形態では、かかる組成物は、粘膜および表在筋層
の管腔ポーションを機械的に除去することおよび/または水もしくは生理食塩水でなどの
低張もしくは高張洗浄で常在細胞を溶解させることによって調製され得る。これらの実施
形態では、粘膜下組織は、精製コラーゲンまたは部分的に精製された細胞外マトリックス
成分の単離前に、水和または脱水状態で保管され得る。様々な態様では、粘膜下組織は、
温血脊椎動物の粘膜の筋層と少なくとも管腔ポーションの両方から離層された粘膜下組織
を含めた任意の層剥離実施形態を含み得る。
ディングブロックは、オリゴマーコラーゲンである。オリゴマーコラーゲンの存在は、コ
ラーゲン原線維マトリックスへのビルディングブロックの自己集合を可能にし、集合速度
を増加させ、明瞭な原線維微細構造および優れた機械的完全性(例えば、堅さ)を有する
コラーゲン組成物をもたらす。
、様々な割合の非オリゴマー可溶性コラーゲン分子も含む。一実施形態では、ビルディン
グブロックは、テロコラーゲンおよび/またはアテロコラーゲンの一方または両方を含む
。ある特定の実施形態では、ビルディングブロックは、オリゴマーコラーゲンおよびアテ
ロコラーゲンを含む。他の実施形態では、ビルディングブロックは、オリゴマーコラーゲ
ンおよびテロコラーゲンを含む。さらに他の実施形態では、ビルディングブロックは、オ
リゴマーコラーゲン、テロコラーゲン、およびアテロコラーゲンを含む。オリゴマーコラ
ーゲン、テロコラーゲン、アテロコラーゲンおよび/または他の非オリゴマー可溶性コラ
ーゲン分子の量は、例えば、堅さ、強度、流体および質量輸送、タンパク分解ならびに/
または適合性を含めた結果として生じる合成コラーゲン原線維マトリックスの1つまたは
複数の性質を調節するために重合の開始前に溶液中で製剤化され得る。特定の活性薬剤と
の使用に関するオリゴマーと非オリゴマー可溶性コラーゲン分子との所定の比は、異なる
活性薬剤との使用に適したものとは異なり得ることが認識される。
シリウスレッドおよびヒドロキシプロリンに関するアミノ酸分析などの較正比色アッセイ
を含むが、これらに限定されない、当技術分野で公知の任意の手段によって測定され得る
。コラーゲンポリマー製剤の粘度は、溶液または分散液/懸濁液、濃度、分子組成、分子
サイズ、温度および操作条件を含み得るが、これらに限定されないいくつかの因子に影響
される。粘度測定値は、粘度計またはレオメーターを含むが、これらに限定されない当技
術分野で公知の任意の手段によって得られ得る。
組成物に存在する可溶性コラーゲンの濃度は、変動し得る。一部の実施形態では、コラー
ゲンは、約0.5mg/mlから約500mg/mlの濃度で存在する。他の実施形態で
は、コラーゲンは、約0.5mg/mlから約400mg/mlの濃度で存在する。さら
に他の実施形態では、コラーゲンは、約0.5mg/mlから約300mg/mlの濃度
で存在する。一部の実施形態では、コラーゲンは、約0.5mg/mlから約200mg
/mlの濃度で存在する。他の実施形態では、コラーゲンは、約0.5mg/mlから約
100mg/mlの濃度で存在する。さらに他の実施形態では、コラーゲンは、約1mg
/mlから約5mg/mlの濃度で存在する。さらに他の実施形態では、コラーゲンは、
約2mg/mlから約5mg/mlの濃度で存在する。一部の実施形態では、コラーゲン
は、約3.5mg/mlの濃度で存在する。他の実施形態では、コラーゲンは、約4mg
/mlから約10mg/mlの濃度で存在する。さらに他の実施形態では、コラーゲンは
、約5mg/mlの濃度で存在する。一部の実施形態では、コラーゲンは、約10mg/
mlから約20mg/mlの濃度で存在する。他の実施形態では、コラーゲンは、約12
mg/mlの濃度で存在する。さらに他の実施形態では、コラーゲンは、約20mg/m
lから約30mg/mlの濃度で存在する。一部の実施形態では、コラーゲンは、約24
mg/mlの濃度で存在する。一部の実施形態では、コラーゲンは、約500mg/ml
の濃度で存在する。他の実施形態では、コラーゲンは、約400mg/mlの濃度で存在
する。さらに他の実施形態では、コラーゲンは、約300mg/mlの濃度で存在する。
他の実施形態では、コラーゲンは、約200mg/mlの濃度で存在する。さらに他の実
施形態では、コラーゲンは、約100mg/mlの濃度で存在する。他の実施形態では、
コラーゲンは、約75mg/mlの濃度で存在する。さらに他の実施形態では、コラーゲ
ンは、約50mg/mlの濃度で存在する。
マー分子量(AMW)によって定量化されるオリゴマー含有量を有し得る。本明細書で記
載されたように、AMWの調節は、マトリックスの重合動態、原線維微細構造、分子性質
、および原線維構造、例えば、原線維間分枝、ポアサイズ、および機械的完全性(例えば
、マトリックス堅さ)に影響し得る。別の実施形態では、平均ポリマー分子量によって定
量化されるプレマトリックス組成物のオリゴマー含有量は、マトリックス堅さと正に相関
する。
ンは、還元型コラーゲンである。本明細書では、「還元型コラーゲン」は、反応性アルデ
ヒドを除くまたは実質的に減少させるためにin vitroで還元されたコラーゲンを
意味する。例えば、コラーゲンは、還元剤(例えば、水素化ホウ素ナトリウム)でのコラ
ーゲンの処置によってin vitroで還元され得る。
の送達に適応された合成コラーゲン原線維マトリックスを含む。活性薬剤の組込みは、重
合前にプレマトリックス組成物中で薬剤を可溶性コラーゲン原線維マトリックスビルディ
ングブロックと混合すること、既に形成された合成コラーゲン原線維材料を重合後に活性
薬剤に暴露すること、および活性薬剤を可溶性コラーゲン原線維マトリックスビルディン
グブロックに共有結合させ、修飾コラーゲンビルディングブロックを単独または無修飾コ
ラーゲン原線維マトリックスビルディングブロックの存在下で重合させることを含むが、
必ずしもこれらに限定されないいくつかの方法によって達成され得る。活性薬剤を合成コ
ラーゲン原線維マトリックスに組み込む方法は、活性薬剤に基づいて変動し得ることが本
明細書で理解され、正しく認識されよう。第1の活性薬剤をコラーゲン原線維マトリック
スに組み込む方法は、第2の活性薬剤をコラーゲン原線維マトリックスに組み込む方法と
同じかまたは異なり得ることがさらに認識される。活性薬剤に適用される「第1の」、「
第2の」、および「第3の」という用語は、種々の活性薬剤間の区別を可能にすることが
意図されており、必須の経時的特徴または順序を必ずしも伝達しないことも本明細書で理
解され、正しく認識されよう。
リマー上でまたは特異的酵素(細菌性コラゲナーゼ)もしくは化学的(ブロモシアン)切
断後のSDS−PAGE、ペプチドマッピング、アミノ末端配列決定、および非コラーゲ
ン不純物アッセイを含むが、これらに限定されない当技術分野で公知の任意の手段によっ
て評価され得る。コラーゲン原線維マトリックスの特徴を特徴付ける方法は、陽イオン交
換HPLC、自然蛍光、LC/MS、MS、動的光散乱、分子ふるいクロマトグラフィー
、粘度測定、円偏光二色性、示差走査熱量測定、トリプシン感受性、不純物プロファイリ
ング、TEM、SEM、cryo−SEM、共焦点顕微鏡法、多光子顕微鏡法および原子
間力顕微鏡法を含むが、これらに限定されない。
定量的微細構造特徴が環境またはクライオステージ走査電子顕微鏡(environmental or c
ryostage scanning electron microscopy)、透過型電子顕微鏡法、共焦点顕微鏡法、第
二次高調波発生多光子顕微鏡法によって決定され得る。引張り、圧縮および粘弾性性質は
、レオメトリーまたは引張り試験によって決定され得る。これらの方法の全ては、当技術
分野で公知である、またはその開示が、その全体が参照によって本明細書にそれぞれ組み
込まれている、米国特許出願第11/435,635号明細書(米国特許出願公開第20
07/0269476号明細書として2007年11月22日に公開された)、米国特許
出願第11/914,606号明細書(米国特許出願公開第2009/0011021号
明細書として2009年1月8日に公開された)、米国特許出願第12/300,951
号明細書(米国特許出願公開第2009/0175922号明細書として2009年7月
9日に公開された)、米国特許出願第13/192,276号明細書(米国特許出願公開
第2012/0027732号明細書として2012年2月2日に公開された)、米国特
許出願第13/383,796号明細書(米国特許出願公開第2012/0115222
号明細書として2012年5月10日に公開された)にさらに記載されている、またはRo
eder et al., J. Biomech. Eng., vol. 124, pp. 214-222 (2002)、Pizzo et al., J. Ap
pl. Physiol., vol. 98, pp. 1-13 (2004)、Fulzele et al., Eur. J. Pharm. Sci., vol
. 20, pp. 53-61 (2003)、Griffey et al., J. Biomed. Mater. Res., vol. 58, pp. 10-
15 (2001)、Hunt et al., Am. J. Surg., vol. 114, pp. 302-307 (1967)、およびSchill
ing et al., Surgery, vol. 46, pp. 702-710 (1959)に記載されている。コラーゲン特徴
およびコラーゲン特徴を特徴付ける方法は、その開示が、その全体が参照によって本明細
書に組み込まれているASTM International F3089-14, 2014 West Conshohocken PAにおい
て考察されている。
aの堅さを示す。別の実施形態では、合成コラーゲン原線維マトリックスは、5Paから
100GPaの間の堅さを示す。堅さは、弾性または線形率(linear modulus)とも称さ
れ得る。
ラーゲン原線維マトリックスは、「ハイブリッドコラーゲン原線維」マトリックスと本明
細書で称される。一実施形態では、コポリマーは、異なるまたは同じであり得る個々の化
学部分からなる1つまたは複数の合成または天然の非コラーゲン分子との可溶性コラーゲ
ンビルディングブロックの1つまたは複数の型の混合物の重合生成物を含む。本明細書で
は、「コポリマー」という用語は、末端と末端で(end-to-end)連結されて、線状分子を
形成する個々の化学部分、および分枝(例えば、「多重腕」または「星形」)構造の形で
一緒に連結された個々の化学部分を表す。代替の実施形態では、コポリマーは、2つのモ
ノマー種の共重合によって得られる、3つのモノマー種から得られる(「ターポリマー」
)、4つのモノマー種から得られる(「クオーターポリマー(quaterpolymer)」)また
は4つを超えるモノマー種から得られるコポリマーを含む。本開示は、マトリックスの原
線維内で非コラーゲン分子と会合しているコラーゲンビルディングブロック(「ハイブリ
ッド原線維」と本明細書で称される)を含むハイブリッドコラーゲン原線維マトリックス
の実施形態およびハイブリッドコラーゲン原線維マトリックス内で非コラーゲン分子がコ
ラーゲン原線維とは別に重合して、別々のコラーゲン原線維および非コラーゲンポリマー
を生成するハイブリッドコラーゲン原線維マトリックスの実施形態も企図する。別の実施
形態では、ハイブリッドコラーゲン原線維マトリックスは、ポアおよび間隙空間を規定す
る重合非コラーゲンポリマーまたはコポリマーを提供し、可溶性コラーゲン原線維マトリ
ックスビルディングブロックを含む水性流体を間隙空間に導入し、ビルディングブロック
を重合させて、間隙空間内でコラーゲン原線維マトリックスを形成することによって形成
される。
維マトリックスおよび/またはコラーゲンに基づく治療送達デバイスを提供するプレマト
リックス組成物を対象とする。コラーゲン原線維マトリックスを形成するためのプレマト
リックス組成物の重合は、制御された条件下で達成され得、ここで、制御された条件は、
pH、リン酸濃度、温度、緩衝液組成、イオン強度、ならびにコラーゲン分子と非コラー
ゲン分子の両方を含み得る所与のプレマトリックス組成物中に存在するビルディングブロ
ックおよび他の任意選択の分子の組成および濃度を含むが、これらに限定されない。
トリックスビルディングブロックを含む水性流体を表し、ビルディングブロックは、オリ
ゴマーおよび任意選択で、非オリゴマー可溶性コラーゲン分子の1つまたは複数の型を含
み、そのビルディングブロックは、外因的な架橋剤の非存在下で自己集合または重合して
高次構造(巨大分子集合体)となる能力を実証する。一実施形態では、ビルディングブロ
ックは、それらの分子組成および原線維形成能力に基づいて選択される。一実施形態では
、非オリゴマー可溶性コラーゲン分子は、テロコラーゲン分子およびアテロコラーゲン分
子の一方または両方を含む。
/テロコラーゲン(テロマーとも称される)およびアテロコラーゲン(アテロマーとも称
される)を含むが、これらに限定されないコラーゲンポリマービルディングブロックの種
々の型を含むコラーゲンポリマー溶液を含む。これらのビルディングブロックは、図1に
示されたように、それらの分子間架橋含有量、組成および架橋化学的性質に基づいて異な
る。図1を参照すると、(A)は、オリゴマーを描写し、(B)は、テロコラーゲンを描
写し、(C)は、アテロコラーゲンを描写する。図1中の灰色の棒は、安定な、成熟共有
結合架橋を表す。
性コラーゲンを精製することによって得られる。例えば、ビルディングブロックは、酸−
可溶化コラーゲンならびに例えば、その全体が参照によって本明細書にそれぞれ組み込ま
れている米国特許出願第11/435,635号明細書(米国特許出願公開第2007/
0269476号明細書として2007年11月22日に公開された)および第11/9
03,326号明細書(米国特許第8,084,055号明細書として2011年12月
27日に授与された)に記載されている一連の制御された集合動態(例えば、重合半減時
間)、分子組成、および原線維微細構造−機械的性質を有する三次元コラーゲンマトリッ
クスをもたらすために制御された規定の重合条件を利用することによって調製され得る。
一実施形態では、コラーゲンは、I型コラーゲンである。本開示のある特定の態様では、
コラーゲン原線維マトリックスビルディングブロックは、供給源組織から除去されている
。任意選択で、ビルディングブロックは、組織供給源から可溶化され得る一方、さらに他
の実施形態では、ビルディングブロックは、合成コラーゲンを含む。さらに他の実施形態
では、ビルディングブロックは、組換えコラーゲンを含む。
重合前、中、または後に、ミネラル、アミノ酸、糖、ペプチド、タンパク質、ビタミン(
アスコルビン酸などの)、もしくはラミニンおよびフィブロネクチンなどの造血幹細胞培
養を促進する糖タンパク質を含めた栄養素、ヒアルロン酸、または血小板由来増殖因子、
もしくは形質転換増殖因子ベータなどの増殖因子、ならびにデキサメタゾンなどのグルコ
コルチコイドと組み合わせられ得る。他の例示的実施形態では、グリセロール、グルコー
ス、またはポリヒドロキシル化化合物などの原線維形成阻害剤が重合前または中に加えら
れ得る。一実施形態に従って、細胞がコラーゲン組成物の重合前または重合後の最後のス
テップとしてコラーゲンまたは細胞外マトリックス成分に加えられ得る。他の例示的実施
形態では、カルボジイミド、アルデヒド、リジルオキシダーゼ、N−ヒドロキシスクシン
イミドエステル、イミドエステル、ヒドラジド、およびマレイミドなどの架橋剤が重合前
、中、または後に加えられ得る。
ロファイル(分子放出プロファイルとも称される)を制御するために使用され得る。本開
示の一態様では、プレマトリックス組成物は、オリゴマーおよび非オリゴマービルディン
グブロックの様々な割合の選択によって広範囲の調整可能またはカスタマイズ可能な原線
維微細構造、機械的性質、およびタンパク分解性を有する合成コラーゲン原線維材料を達
成するために調節される。合成コラーゲン−ファイバーマトリックス組成および自己集合
反応条件の調節は、原線維微細構造および関連する間隙液粘度、機械的性質ならびにタン
パク分解が調節されるのを可能にする。合成コラーゲン原線維マトリックスの設計特異性
は、機械物理的制約およびバイオインストラクティブ(bioinstructive)能力の選択を可
能にする。
リゴマー:非オリゴマー可溶性コラーゲン分子比が活性薬剤のバースト放出、徐放または
可変性放出を支持するように、調整され得る。バースト放出は、薬剤の急速投与型量を標
的エリアに送達する短い時間枠内の活性薬剤の急速な放出である。徐放は、所定の期間、
一様の速度での活性薬剤の継続的放出を提供する。治療送達系は、活性薬剤の初期、中間
期または後期バースト放出を提供するために製剤化され得ることが想像される。種々の活
性薬剤または活性薬剤の種々の濃度が種々の時期に放出され得ることがさらに認識される
。第1の活性薬剤が徐放で放出され得る一方、第2の活性薬剤がバースト放出で放出され
得ることも認識される。
を超える層を含み、それぞれ、少なくとも1つの物性または活性薬剤によって区別される
。層は、例えば、球状様式、円柱状様式、平面状様式または他の三次元様式で産出され得
、ここで、合成コラーゲン原線維マトリックスの1つの層は、合成コラーゲン原線維マト
リックスの少なくとも第2の層によって完全にまたはほぼ完全に囲まれており、コラーゲ
ンマトリックスの第2の層は、第1のコラーゲン原線維マトリックス層とは異なる少なく
とも1つの物性または活性薬剤を含む。さらに、コラーゲン原線維マトリックス層は、所
定のオリゴマー:非オリゴマー可溶性コラーゲン分子比の選択によって、種々の活性薬剤
の選択によって、または活性薬剤の種々の濃度によって異なり得る。別の実施形態では、
治療送達デバイスは、物性、可溶性コラーゲン分子および活性薬剤の1つまたは複数の勾
配を含む。
織様一貫性、取扱いおよび機械的性質を有するより高密度材料を達成するために、例えば
、非拘束または拘束圧縮によってさらにプロセシングされ得る。圧縮プロセシング選択肢
の例は、その内容が参照によって本明細書により組み込まれている米国特許出願公開第2
015/0105323号明細書に記載されている。
1つの物性の勾配を形成するために圧縮され得る。本明細書では、「圧縮された」という
用語は、力がコラーゲン原線維マトリックスに適用された場合、サイズの減少または密度
の増加を表し得る。例えば、圧縮は、拘束圧縮、可変圧縮、物理的圧縮、遠心分離、超遠
心分離、蒸発または吸引などであるが、これらに限定されない力を適用する様々な方法を
通して達成され得る。さらに、本明細書でのある特定の例示的態様に従って、コラーゲン
原線維マトリックスを圧縮することは、組成物における少なくとも1つの物性の勾配を形
成し得ることが理解され、正しく認識されよう。本明細書では、「物性」という用語は、
構造的、機械的、化学的、および動態学的性質を含めたコラーゲン組成物の任意の性質を
表し得る。
導勾配」という表現は、コラーゲン原線維マトリックスが供される圧縮の結果として提供
されるコラーゲン原線維マトリックスにおける勾配を表す。
う表現は、物理的手段によって力を適用することによるコラーゲン原線維マトリックスの
圧縮を表す。
は、それが圧縮を経る、コラーゲン原線維マトリックスの拘束を表す。
う表現は、非線形様式で力を適用することによるコラーゲン原線維マトリックスの圧縮を
表す。
遠心分離である。さらに他の実施形態では、圧縮は、蒸発である。一部の実施形態では、
圧縮は、吸引である。ある特定の実施形態では、吸引は、真空吸引である。選択された実
施形態では、圧縮は、塑性圧縮ではない。なぜなら塑性圧縮は、コラーゲン組成物から除
去可能な流体のほとんど全てが排出される極端なプロセスである可能性があり、足場の細
胞生存能力を減少させ、天然のマトリックス構造を損傷し得るからである。
テンを含むチャンバーにおいて行われ得る。典型的に、コラーゲン原線維マトリックスは
、鋳型に挿入され、次いで、圧縮に供され得る。
ば、鋳型は、多孔性ポリエチレンがプラテンの一部としてかつ/または試料鋳型の壁もし
くは底に沿って配置されるように調節可能であり得る。多孔性ポリエチレンの位置は、コ
ラーゲン原線維マトリックスにおける結果としての材料勾配を規定し得る。一部の実施形
態では、圧縮は、少なくとも1つの方向からの物理的力である。他の実施形態では、圧縮
は、2つ以上の方向からの物理的力である。さらに他の実施形態では、圧縮は、3つ以上
の方向からの物理的力である。一部の実施形態では、圧縮は、4つ以上の方向からの物理
的力である。
スは、特定の物性を得るための制御された条件下で作製され得る。例えば、コラーゲン原
線維マトリックスは、望ましいコラーゲン原線維密度、ポアサイズ(原線維−原線維分枝
)、弾性率、引張り歪み、引張り応力、線形率、圧縮率、損失弾性率、原線維面積率、原
線維体積率、コラーゲン濃度、細胞播種密度、せん断貯蔵弾性率(G’または弾性(固体
様)挙動)、および位相角デルタ(δまたは流体(粘性)−から固体(弾性)−様挙動の
測定値;δは、フック固体に関して0°、ニュートン流体に関して90°に等しい)を有
し得る。
て得られた応力−歪み曲線の線状領域の傾斜によって規定される;すなわち、堅さ)、圧
縮率、損失弾性率、またはせん断貯蔵弾性率(例えば、貯蔵弾性率)とすることができる
。これらの用語は、当業者に周知である。本明細書では、「原線維体積率」(すなわち、
原線維密度)は、三次元で原線維によって占められた総面積のパーセント面積として定義
される。
してなど、患者への後の移植のために形成され得る、または後の重合のためにプレマトリ
ックス組成物をin situである位置に注入して、in situでコラーゲンに基
づく治療送達材料を形成することによってin situで形成され得る。
医学的移植片、特に、軟部組織移植片に関して重要な考慮すべきことは、移植片血管新生
を促進する移植片、特に、細胞共移植(co-implantation)および細胞浸潤を可能にし、
細胞増殖を構造的かつ機能的に支持し、組織と生理学的に完全に統合することができるも
のの設計である。追加の重要な考慮すべきことは、移植片が再生組織の増殖を妨害するべ
きではないこと、およびその分解が組織再生に関与する細胞に悪影響を与えるであろうい
かなる副産物も後に残すべきではないことを含む。本明細書で記載されたコラーゲンに基
づく治療送達系は、細胞浸潤および増殖に適した強い多孔性枠組みを提供することによっ
て細胞共移植および細胞浸潤を可能にし、細胞増殖を構造的かつ機能的に支持し、生理学
的に組織と完全に統合することができるだけでなく、それらは、移植後に血管新生を増強
するための移植片の部位への血管新生促進活性薬剤の送達を可能にもする。コラーゲン原
線維マトリックスは、望ましい形状およびサイズを有する鋳型において重合を行うことに
よってならびに/または後重合プロセシングによって、任意のニまたは三次元形状で形成
され得る。
る。例えば、本開示のコラーゲンに基づく治療送達系のin vitro使用は、細胞組
織培養、創薬、および化学的毒性試験などの研究目的に利用され得る。他の実施形態では
、コラーゲンに基づく治療送達系は、損傷されたもしくは機能障害性臓器または組織の修
復のための、血管新生を含めた複合組織および臓器構築物を産出するためにin vit
roで使用され得る。
維マトリックスおよび高密度原線維マトリックスを含み得るが、これらに限定されない。
低密度原線維マトリックスは、約10mg/ml、9mg/ml、8mg/ml、7mg
/ml、6mg/ml、5mg/ml、4mg/ml、3mg/ml、2mg/mlまた
は1mg/ml未満のコラーゲン濃度を有し得る。高密度原線維マトリックスは、10m
g/ml、20mg/ml、30mg/ml、および40mg/ml超またはそれ超のコ
ラーゲン濃度を有し得る。低密度原線維マトリックスに適した適用は、in vitro
3D細胞培養、注入可能治療送達、および移植可能治療送達を含み得るが、これらに限
定されない。高密度原線維マトリックスまたは組織構築物に適した適用は、外科的移植片
、シート、原線維材料、生体弁、組織勾配、関節軟骨および再生医療製品を含み得るが、
これらに限定されない。
両方でヒトおよび獣医学において使用され得ることが本明細書で理解され、正しく認識さ
れよう。本開示の教示に従った例示的治療送達系の想像される使用は、止血剤として、欠
損した組織代替物または置換物として、皮膚同等物として、および組織増大のためのマト
リックスとして含むが、これらに限定されない。種々の適用における使用のためのコラー
ゲン−ファイバーマトリックスの望ましい物理的特徴は、適用および活性薬剤に依存して
異なり得る。
の例において記載されている。これらの例は、例示的のみであり、限定するまたは本開示
の他の実施形態を排除することは意図されていない。さらに、コラゲナーゼの存在および
非存在下での様々なコラーゲン原線維材料からの分子放出動態を測定しかつ比較するため
に、in vitroモデル系が、混合されたFITC−デキストラン分子を有する重合
3Dコラーゲンマトリックス系をコラゲナーゼまたは1×PBSに供することによって、
コラーゲン原線維材料からの放出動態を測定するように設計されたことが本明細書で理解
され、正しく認識されよう。特に、in vitroモデル系は、重合可能なコラーゲン
内で10kDaから2MDaの範囲の様々なサイズのFITC−デキストランを混合する
こと、次いで、オリゴマーマトリックスに関する公知の拡散係数に基づいて様々なサイズ
の分子に関する放出動態を予測するための計算モデルを確立することを伴った。次いで、
設計された実験モデル系は、標準化コラーゲンオリゴマーおよび市販のモノマーコラーゲ
ンで調製された低密度マトリックス内でのFITC−デキストランに関してサイズ依存性
分子放出動態を定め比較するために使用された。
を含むが、これらに限定されない哺乳綱に属する任意の種を表す。
または線維性結合組織を含むが、これらに限定されない任意の組織を表す。
子、分子、原子の集団などのランダムな熱運動を表す。
熟原線維および関連する原線維−ネットワーク構造体を構築するプロセスを表す。
ットワーク構造体を表す。
;多孔性材料を通る液体の流れの速度を表す。
虫、植物または動物宿主におけるタンパク質またはペプチドをコードするヌクレオチド配
列の発現によってなどであるが、これに限定されない組換え方法によって生成されたコラ
ーゲンまたはコラーゲン様ポリペプチドを表す。かかる組成物は、Gly−X−Yトリプ
レットをしばしば含み、ここで、Glyは、アミノ酸グリシンであり、XおよびYは、同
じかまたは異なり得、しばしばプロリンまたはヒドロキシプロリンであるが、任意の公知
のアミノ酸とすることができる。
ーゲン)または超分子系(例えば、ウイルス)がその成分からそれ自体を自発的に集合さ
せるプロセスを表す。
す。かかる混合物では、「溶質」は、「溶媒」として公知の別の物質に溶解した物質であ
る。
度を説明する一般用語であり;堅さの特定の測定値は、材料負荷フォーマット(例えば、
張力、圧縮、せん断、屈曲)に依存する。
は外観(例えば、肉眼形態)の変化を表し;生理学的条件下でのコラーゲンの分解は、コ
ラゲナーゼとして公知のタンパク分解酵素による中央のトリプルヘリックス領域内の部位
特異的切断に関与する。コラゲナーゼは、マトリックスメタロプロテアーゼとして公知の
プロテアーゼのより大きいファミリーのメンバーである。
ラーゲンポリマーの文脈では、可溶性は、溶液中のコラーゲン分子(部分的、全体または
複数)またはペプチドを表し;可溶性のさらなる資格は、それぞれ、希酸および中性塩溶
液に可溶性である組成物を説明する「酸可溶性」および「中性塩可溶性」を含み得る。
細書は、多種多様の形および実施形態を開示しており、そのいくつかの例が以下のように
記載されている:
マー可溶性コラーゲン分子の1つもしくは複数の型との可溶性オリゴマーコラーゲンの混
合物の重合生成物を含む不溶性合成コラーゲン原線維マトリックス;およびコラーゲン原
線維マトリックス全体にわたってまたはコラーゲン原線維マトリックスの部分内に分散し
た第1の活性薬剤を含むコラーゲンに基づく治療送達デバイスを提供する。以下の実施形
態も提供される:
開示された実施形態のいずれか。
た実施形態のいずれか。
ラーゲン分子および可溶性アテロコラーゲン分子の一方または両方を含む、本明細書で開
示された実施形態のいずれか。
れた実施形態のいずれか。
された実施形態のいずれか。
たは複数の型との可溶性オリゴマーコラーゲンの混合物の重合生成物を含み、オリゴマー
コラーゲンおよび非オリゴマー可溶性コラーゲン分子が、0:100から5:95、5:
95から10:90、10:90から15:85、15:85から20:80、20:8
0から25:75、25:75から50:50、50:50から75:25および75:
25から100:0からなる群から選択される範囲内の比にある、本明細書で開示された
実施形態のいずれか。
クスの部分内に分散した第2の活性薬剤をさらに含む、本明細書で開示された実施形態の
いずれか。
で開示された実施形態のいずれか。
第2の密度を有する第2のポーションを含み;第1の密度が、第2の密度とは異なってい
る、本明細書で開示された実施形態のいずれか。
ーションおよび第2の活性薬剤が内部に分散した第2のポーションを含み、治療送達デバ
イスが、第1の活性薬剤に関して第1の放出プロファイルおよび第2の活性薬剤に関して
第2の放出プロファイルを示し、第1の放出プロファイルが、第2の放出プロファイルと
は異なっている、本明細書で開示された実施形態のいずれか。
量を含む水溶液を形成すること;(ii)ビルディングブロックの自己集合による重合を
引き起こし、その結果、不溶性合成コラーゲン原線維マトリックスを形成すること;およ
び(iii)(a)水溶液中に活性薬剤の第2の量を含め、それによって前記引き起こす
ことが、活性薬剤が内部に分散した不溶性合成コラーゲン原線維マトリックスを形成する
こと、または(b)不溶性合成コラーゲン原線維マトリックスを活性薬剤の第2の量と接
触させて、活性薬剤が内部に分散したコラーゲン原線維マトリックスを形成することを含
む、治療送達デバイスを作製するための方法であって;ビルディングブロックの第1の量
が可溶性オリゴマーコラーゲン分子を含む、方法を提供する。以下の実施形態も提供され
る:
開示された実施形態のいずれか。
に含む、本明細書で開示された実施形態のいずれか。
ラーゲン原線維マトリックスを形成することをさらに含む、本明細書で開示された実施形
態のいずれか。
することを含む、本明細書で開示された実施形態のいずれか。
乾燥することをさらに含む、本明細書で開示された実施形態のいずれか。
量を含む水溶液および水溶液中の活性薬剤の第2の量を含むプレマトリックス組成物であ
って、可溶性コラーゲン原線維ビルディングブロックの第1の量が、可溶性オリゴマーコ
ラーゲン、または非オリゴマー可溶性コラーゲン分子の1つもしくは複数の他の型との可
溶性オリゴマーコラーゲンの混合物を含み、ビルディングブロックが、外因的な架橋剤の
非存在下で自己集合して少なくとも5Paの堅さを有する巨大分子不溶性合成コラーゲン
原線維マトリックスとなるように作動可能である、プレマトリックス組成物を提供する。
以下の実施形態も提供される:
ラーゲン分子および可溶性アテロコラーゲン分子の一方または両方を含む、本明細書で開
示された実施形態のいずれか。
態のいずれか。
れか。
細書で開示された実施形態のいずれか。
、10:90から15:85、15:85から20:80、20:80から25:75、
25:75から50:50、50:50から75:25および75:25から100:0
からなる群から選択される範囲内の比でオリゴマーコラーゲンおよび非オリゴマー可溶性
コラーゲン分子を含む、本明細書で開示された実施形態のいずれか。
を示す非可溶性合成コラーゲン原線維マトリックスを達成するために調節される能力があ
る、本明細書で開示された実施形態のいずれか。
コラーゲン原線維ビルディングブロックの第1の量を含む水溶液および水溶液中の活性薬
剤の第2の量を含むプレマトリックス組成物であって、可溶性コラーゲン原線維ビルディ
ングブロックの第1の量が、可溶性オリゴマーコラーゲン、または可溶性非オリゴマーコ
ラーゲン分子の1つもしくは複数の型との可溶性オリゴマーコラーゲンの混合物を含み、
ビルディングブロックが外因的な架橋剤の非存在下で自己集合してin situで少な
くとも5Paの堅さを有する不溶性合成巨大分子コラーゲン原線維マトリックスとなるよ
うに作動可能である、プレマトリックス組成物;あるいは(ii)可溶性オリゴマーコラ
ーゲンの重合生成物または可溶性非オリゴマーコラーゲン分子の1つもしくは複数の型と
の可溶性オリゴマーコラーゲンの混合物の重合生成物を含む不溶性合成コラーゲン原線維
マトリックス;およびコラーゲン原線維マトリックス全体にわたってまたはコラーゲン原
線維マトリックスの部分内に分散した第1の活性薬剤を含むコラーゲンに基づく治療送達
デバイスであって;コラーゲン原線維マトリックスが、少なくとも5Paの堅さを示す、
治療送達デバイスをin situ位置で配置することを含む方法を提供する。
(実施例)
オリゴマー、テロコラーゲン、およびアテロコラーゲン(またはオリゴマー、テロマー
、およびアテロマー)を含む可溶性コラーゲン原線維ビルディングブロックを市場体重の
ブタ(market weight pig)の真皮から得た。オリゴマー製剤を天然の分子間架橋によっ
て共有結合により連結したコラーゲン分子の凝集物(例えば、トリマー)を表すオリゴマ
ーを優先的に抽出する酸可溶化法を使用して調製した。テロマー製剤を酸可溶化、それに
続く塩析技法を使用して調製した。塩溶液を使用して、コラーゲン分子を選択的に単離し
、特に、テロマーおよびオリゴマー製剤は、テロペプチド末端に反応性アルデヒド基を含
有するので、これらは、架橋されていないまたは未熟な酸に不安定な架橋を含有した。最
後に、アテロコラーゲン製剤を、ペプシンがコラーゲン分子のNおよびC末端からテロペ
プチド末端を酵素的に切断する消化技法を通して調製した。これらの可溶性コラーゲン原
線維ビルディングブロックをそれらの分子組成および重合(コラーゲン原線維形成)能力
に基づいて標準化し、品質管理する。商用銘柄コラーゲンとの比較のために、ラット尾か
ら収集された酸可溶化I型コラーゲンをBD Biosciences(Bedford
、MA、BD−ラット尾コラーゲン、BD−RTCとして参照される)から購入した。
コラーゲンを0.01N HClにさらに希釈し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS、10
×、pH7.4)および0.1N水酸化ナトリウム(NaOH)でさらに中和して、中性
pH(7.4)および3mg/mlの最終コラーゲン濃度を達成した。その中で自由に混
合された分子を有するマトリックスを製剤化するために、4つの異なるサイズ(すなわち
、10、40、500および2MDa)のFITC−デキストランをロードして、異なる
サイズの治療分子を模倣した。ここで、FITC−デキストラン(10kDa、40kD
a、500kDa、または2MDa、Invitrogen、Eugene、OR製)を
10×PBSに可溶化して、重合マトリックス内の望ましい最終濃度を得た。FITC−
デキストランは、コラーゲンマトリックス系の上の上清からの蛍光レベル検出に基づく放
出動態の直接の定量化を可能にする。全ての中和された溶液を、図2に示すように、48
ウェルプレート(Corning、USA)において0.25ml体積で重合させた。系
は、コラゲナーゼ(IV型、Worthington Biochemical Cor
poration、USA製)の非存在または存在下での1×PBS(pH7.4)であ
った0.75mlトップ緩衝液(top buffer)中への分子放出動態を可能にした。
マトリックス粘弾性性質にも効果はない
FITC−デキストランの追加がコラーゲン原線維重合動態およびコラーゲン原線維送
達デバイス物性に対して効果を有さなかったことを確認するために、オリゴマーマトリッ
クス(3mg/ml)を、上記の手順において記載されたように、FITC−デキストラ
ン(10KDaおよび2MDa、それぞれ1.0mg/mlの最終濃度で)の非存在また
は存在下で中和した。各中和された溶液をスチールプレートと接触した重合のためにステ
ンレススチール40mm直径平行プレート形状(TA Instruments、New
Castle、DE)で適応されたAR2000レオメーター上に置いた。重合中の粘
弾性性質(せん断貯蔵弾性率(G’)、せん断損失弾性率(G”)、および位相変位デル
タの正接(δ))の時間依存性変化を時間掃引手順を使用して、振動せん断を通してモニ
ターした。レオメータープレートの温度を4℃で5分間維持して、重合前にFITC−デ
キストランを有するまたは有さない中和されたコラーゲン溶液の貯蔵弾性率のベースライ
ンを得た。次いで、温度を37℃まで上げて、マトリックスの重合を誘導した。FITC
−デキストランありまたはなしで調製されたマトリックスの重合動態および粘弾性性質を
比較した。重合半減時間(Thalf)を各試料に関して重合曲線の傾斜として定義され
た重合の速度とともに計算した。各製剤を三連で試験した。
結果としてのコラーゲン原線維マトリックスに関してコラーゲン原線維重合動態にも粘弾
性性質にも有意に影響しなかった(p>0.05)ことを示した。特に、図3Aは、G’
の時間依存性変化によって測定された重合動態を示す一方、図3Bは、10KDaおよび
2000KDa FITC−デキストラン(1mg/ml)の非存在または存在下で調製
された3mg/mlオリゴマーマトリックスに関して関連する最終G’値を示している。
放出に必要な時間を予測する
コラーゲン原線維マトリックスからの様々なサイズのFITC−デキストランの拡散に
基づく放出動態を予測しかつリザーバーサンプリング時間を定めるために、モノリシック
マトリックスに関して確立された数学的モデルを適応した。数学的モデルは、コラーゲン
マトリックス系および関連する上清「シンク」内の均一な初期薬物分布を有するスラブマ
トリックス形状に関し、拡散のフィックの第二法則に基づくものとした。
量を表し;Dは、系内の薬物の拡散係数であり、Lは、マトリックスの総厚さを表す。コ
ラーゲン原線維マトリックスに関する長さ値は、発明者らの実験系によって定められた2
.61mmとした。10KDa、40KDa、500KDaおよび2MDa FITC−
デキストランに使用した拡散係数値(D)は、3mg/mlオリゴマーコラーゲンマトリ
ックスに関して以前の公開された値に基づいて1.09E−10、4.8E−11、2.
52E−11、および1.76E−11(m2/秒)とした。
(累積放出の50%に必要な時間)は、FITC−デキストランサイズが増加するにつれ
て増加したことを示した。かかるサイズ依存性放出動態は、増加する分子サイズに伴うF
ITC−デキストラン減少の拡散係数(D)として予期され得る。
モノマーコラーゲン原線維マトリックスに関するサイズ依存性分子放出動態の比較
コラーゲン原線維マトリックスの分子放出動態を定めるための設計された実験モデルの
有用性をさらに検証し実証するために、10KDa、40KDa、500KDaおよび2
MDa FITC−デキストランをオリゴマーおよび市販のモノマーマトリックスにおい
て混合し、それらの放出を、設計されたin vitro実験モデル系で比較した。マト
リックス(各250μl)を48ウェルプレートにおいて調製し、上部にPBS(1×、
pH7.4)の750μlリザーバーを載せて、拡散に基づく放出を誘導した。コラーゲ
ン−マトリックスの拡散とタンパク分解の両方に基づく放出動態をシミュレートするため
に、実験のサブセットをクロストリジウム・ヒストリチクム(Clostridium Histolyticum
)(Worthington Biochem Corporation、USA)から
の125U/mlコラゲナーゼの存在下で行った。本系に従って行われたリザーバー緩衝
液選択により、以下のもの1)1×PBSを使用した場合(コラゲナーゼ条件の非存在)
、分子放出に対するコラーゲン微細構造単独の効果;および2)125U/mlコラゲナ
ーゼを使用した場合(コラゲナーゼ条件の存在)、分子放出に対するそのタンパク分解性
とともにコラーゲン微細構造の効果が調査されることが可能になったことに留意されたい
。
いで、上清内のFITC−デキストランをそれぞれ、493および530nmの励起およ
び放射波長で分光蛍光分析的に決定した(Molecular Devices Spe
ctramax M5)。このプロセスを、FITC−デキストラン放出の完了を示す、
ウェルの上清からの相対蛍光単位がベースライン蛍光(FITC−デキストランを含有し
ないPBSプラス/マイナスコラゲナーゼ)と一致するまで繰り返した。全ての蛍光値を
最大総蛍光強度に基準化し、%累積放出を時間に対してプロットした。10KDaおよび
2MDa FITC−デキストランに関する放出動態曲線に対するコラゲナーゼレベルの
追加の効果は、図15のグラフ表示に見られ得る。特に、10KDaまたは2MDa F
ITC−デキストランを含有する低密度重合オリゴマーマトリックス(3mg/ml)を
様々なコラゲナーゼレベルに供し、放出動態を測定した。さらに、図16は、様々なコラ
ゲナーゼ濃度に関して放出動態曲線から計算された放出の初速度およびT50%曲線を示
す例示的グラフを描写している。
スで観察されたが、市販のBDラット尾マトリックスでは観察されなかった。より詳細に
は、10kDa(×)、40kDa(□)、500kDa(△)、および2MDa(○)
の分子サイズを有するFITC−デキストランをオリゴマーおよび市販のモノマー(BD
ラット尾)マトリックス(3mg/ml)内で0.5mg/mlで重合させた。オリゴマ
ー(A)および市販のモノマー(D)コラーゲンマトリックスに関して、時間依存性放出
プロファイルを分光蛍光分析的にモニターし、初期放出速度(平均値±SD;n=3;B
、E)およびT50%(平均値±SD;n=3;C、F)を定量化した。各パネルに関し
て、文字は、テューキー−クレーマー範囲検定によって決定された統計的に異なる実験群
を示す(p<0.05)。1×PBS緩衝液を使用して、分子放出に対するコラーゲン微
細構造の効果を調査した場合、オリゴマーマトリックスがFITC−デキストランのサイ
ズに依存した放出プロファイルを示したことを結果は示した(図5A)。対照的に、かか
るサイズ依存性分子放出は、同じ濃度で調製された市販のモノマーマトリックスで観察さ
れなかった(図5D)。オリゴマー(B)からの初期放出速度の定量化は、FITC−デ
キストランサイズが大きくなるにつれて(10KDaから2MDa)減少する放出速度の
傾向およびT50%(C)に関して増加する傾向を示した。これらの傾向は、計算モデル
によって予測されたものと一貫していた。かかるサイズ依存性傾向は、市販のモノマーマ
トリックスに関して放出速度でもT50%においても観察されなかった。結果は、提供さ
れたオリゴマーコラーゲン原線維マトリックスの微細構造が、市販のBDラット尾コラー
ゲンモノマーマトリックスのものと比較して、FITC−デキストラン放出動態の制御を
改善したことを示した。
性および徐放性傾向を維持することが見出されたが、市販のモノマー(BDラット尾)マ
トリックスは、そのような傾向を維持していなかった。特に、10kDa(×)、40k
Da(□)、500kDa(△)、および2MDa(○)の分子サイズを有するFITC
−デキストランをオリゴマーおよび市販のモノマーマトリックス(3mg/ml)内で0
.5mg/mlで重合させた。オリゴマー(A)および市販のモノマー(D)マトリック
スに関して、時間依存性放出プロファイルをコラゲナーゼ(125U/ml)の存在下で
分光蛍光分析的にモニターし、初期放出速度(平均値±SD;n=3;B、E)およびT
50%(平均値±SD;n=3;C、F)を定量化した。各パネルに関して、文字は、テ
ューキー−クレーマー範囲検定によって決定される統計的に異なる実験群を示す(p<0
.05)。125U/mlコラゲナーゼを使用して、FITC−デキストラン放出動態に
対してコラーゲン微細構造に加えてタンパク分解性の効果を調査した場合、オリゴマーマ
トリックスは、サイズ依存性および徐放プロファイルを維持した(図6A)一方、市販の
モノマーコラーゲンマトリックスは、所与の期間において、試験された全ての分子サイズ
に関してより急速な「バースト」放出を示した(図6D)。放出プロファイルの初期傾斜
の定量化は、オリゴマーマトリックスと比較して市販のモノマーマトリックスに関して放
出の有意に高い速度および有意に少ないT50%(p<0.05)をもたらし、これは、
市販のモノマーマトリックスでは急速なタンパク分解が起き、長期間、分子放出を支持す
ることができないことを示している。
子の放出に関して実験的に試験された多機能性生移植片材料の上首尾の形成を示した。設
計された実験モデルは、分子放出に及ぼすコラーゲン原線維微細構造およびコラーゲン原
線維微細構造とタンパク分解性の両方の効果が単独で調査されるのを可能にした。
トリックス系の機能性および頑健性を確立した後、次いで、コラーゲン生移植片系を調節
して、放出に関してそれを調整可能にすることができる。分子放出は、2つの主要なパラ
メーター、すなわち、1)コラーゲン原線維微細構造、および2)そのタンパク分解性に
よって影響され得ることが本明細書で理解され、正しく認識されよう。したがって、これ
らの2つのパラメーターを調節するための手法を組み込んで、コラーゲン原線維材料から
の放出動態をカスタマイズすることが目的であった。コラーゲンビルディングブロックの
異なる原線維間分枝能力を使用することによっておよびコラーゲン原線維密度を改変する
ことによって、集合の超原線維レベルでの分子放出動態が調整され得ると考えられた。
ラーゲン原線維マトリックスにおけるビルディングブロックの2つの型を組み合わせるこ
とによってこれらのコラーゲン原線維材料からの分子放出を調節することが提唱された。
その後、コラーゲン原線維−密度を増加させて、長期間の分子放出を提供することおよび
これらの高密度材料からの放出を特徴付けることが提唱された。これらの高密度コラーゲ
ン原線維材料からの分子放出をさらに調節するために、タンパク分解性を調節するための
手段としてオリゴマーとテロコラーゲン;およびオリゴマーとアテロコラーゲンブロック
を種々の比で組み合わせることが提唱された。
駆体、テロコラーゲン、オリゴマーおよびアテロコラーゲンは、それらの分子間架橋組成
の点で異なることが本明細書で理解され、正しく認識されよう。コラーゲン前駆体は、コ
ラーゲンマトリックスの機械的および輸送性質の独立的制御を提供することが以前示され
た。このことから、したがって、これらの前駆体から形成されたマトリックスは、対応す
る濃度でそれらの変動する原線維微細構造、および変動するタンパク分解性に基づいて異
なる放出動態を示すことが仮定される。これを試験するために、マトリックスのタンパク
分解性を最初に研究し、その後、コラゲナーゼの非存在下と存在下の両方でのそれらから
の分子放出を特徴付けた。ワイブル関数を分子放出データに当てはめることによって、マ
トリックスの放出機構に対する微細構造およびタンパク分解性の効果を確認することも提
唱された。
違を確認するために、実験を行い、ここで、3mg/mlオリゴマー、テロコラーゲンお
よびアテロコラーゲンマトリックスを4℃で5分間、レオメータープレート上で重合させ
て、ベースラインを得、次いで、温度を重合のために37℃まで上げた。30分間の重合
後、形成されたマトリックスを振動せん断に基づく、および歪み制御時間掃引実験におい
て5000U/mlコラゲナーゼに暴露し、位相変位角デルタの正接を図7に示したよう
に時間に関して追跡した。絶対正接(absolute tan)デルタを時間の関数としてプロット
し、マトリックスの各型の代表試料をこの図に示す。正接デルタ値≧1の上昇は、固体か
ら液体への相変化を示し、これは、材料の完全なタンパク分解を示している。次いで、正
接デルタの一次導関数を時間に対してプロットして、屈曲ピークを得、これを使用して、
重合時間の最初の30分間を減算した後、マトリックスに関して総分解時間を計算した。
データ分析は、マトリックスに必要な分解時間がオリゴマー、テロコラーゲンおよびアテ
ロコラーゲンマトリックスによって有意に異なっていたことを示した(p<0.05;N
=3)。マトリックスは、アテロコラーゲン(138.0分)、その後のテロコラーゲン
(186.7分)、その後のオリゴマー(219.5分)マトリックスの順で分解し、こ
れは、アテロコラーゲンおよびオリゴマーマトリックスが得られたタンパク分解スペクト
ルの両極端を表したことを示している。結果は、コラーゲンビルディングブロックとして
のアテロコラーゲン、テロコラーゲン、およびオリゴマーの使用が、種々のタンパク分解
性および種々の原線維微細構造性質のおかげで含有された薬物分子の放出動態を調整する
機会を提供し得ることを示唆した。
タンパク分解差違に基づいて、種々のコラーゲン前駆体から形成されたマトリックスは、
種々の放出動態で分子を送達することが仮定された。この仮説を試験するために、0.2
5mg/ml最終濃度で10kDaおよび2MDa FITC−デキストランを含有する
、オリゴマー、テロコラーゲンおよびアテロコラーゲンビルディングブロックからの3m
g/ml重合マトリックスを製剤化した。製剤化をコラーゲン原線維送達デバイスの製剤
化に関して上で記載された手順(実施例1)に従って行った。次いで、製剤化送達系から
の放出動態を2つの条件下で測定した:1)放出動態に対する微細構造(拡散のみ)の効
果を調査するためのコラゲナーゼの非存在下;および2)放出動態に対する微細構造とタ
ンパク分解性の両方(拡散+分解)の効果を調査するための125U/mlコラゲナーゼ
の存在下。
ブロックに依存していることを例証するグラフ表示が示されている。特に、10kDaお
よび2MDaの分子サイズを有するFITC−デキストランをオリゴマー、テロコラーゲ
ン、およびアテロコラーゲンマトリックス(3mg/ml)内で重合させた。時間依存性
放出プロファイルをコラゲナーゼ(125U/ml)の非存在(A、B)および存在(C
、D)下で分光蛍光分析的にモニターし、初期放出速度(平均値±SD;n=3;A、C
)およびT50%(平均値±SD;n=3;B、D)を定量化した。各パネルに関して、
文字は、テューキー−クレーマー範囲検定によって決定される統計的に異なる実験群を示
す。結果は、コラゲナーゼの非存在下で、オリゴマー、テロコラーゲン、およびアテロコ
ラーゲンにおける微細構造に基づく差違は、放出動態パラメーターに影響したことを示し
た(図8Aおよび8B)。アテロコラーゲンおよびオリゴマーは、得られた放出スペクト
ルの極端な末端を再び形成したビルディングブロックであったことが明らかであった。
細構造に基づく拡散に加えてタンパク分解性により増強された。興味深いことに、コラゲ
ナーゼの存在下で測定されたタンパク分解は、オリゴマーとアテロコラーゲンマトリック
ス間のものに加えてテロコラーゲンおよびオリゴマーマトリックスにおける差違を強調し
た。図8Cおよび8Dに見られるように、初期放出速度の進行性の増加およびT50%値
の進行性の減少(p<0.05)がコラゲナーゼの存在下でオリゴマー、テロコラーゲン
、およびアテロコラーゲンマトリックスに関して得られた。
スが、マトリックスの異なる原線維微細構造および異なるタンパク分解により、種々の分
子放出プロファイルを呈したことを示した。
効果
ポリマーマトリックスからの薬物放出をシミュレートするために利用可能ないくつかの
経験的モデルがある。べき法則モデルが広範に使用されてきたが、それは、放出曲線の最
初の60%の説明に制限される。当てはめの質は、累積放出が約60%を超えるより長い
時点で貧弱であることが観察された。ワイブル関数は、等式によって記載されたワイブル
関数の経験的使用に基づく放出プロファイルの説明に使用することができる別の選択肢で
ある:
質量(加えられた薬物の量に等しいと仮定される)であり、aは、時間依存性のスケール
パラメーターを意味する一方、bは、溶解曲線の進行の形状を説明している。Papadopoul
ou et al.は、以下の表1に示したように、形状パラメーターbと放出の拡散機構間の強
力な関連を提供した(Papadopoulou V, Kosmidis K, Vlachou M, Macheras P: On the us
e of the Weibull function for the discernment of drug release mechanisms. Intern
ational journal of pharmaceutics (2006) 309(1-2):44-50を参照されたい)。
的に得られた放出曲線に当てはめることによって、根底にある放出機構が解明されるであ
ろうと仮定された。さらに、コラゲナーゼの非存在条件における放出動態のワイブル関数
に基づくシミュレーションを使用することによって、どのようにコラーゲンビルディング
ブロックの異なる原線維間分枝能力によって引き起こされる微細構造に基づく差違が単独
で、それらの分子放出動態に影響するかが検証されるはずである。
販のモノマーコラーゲン(BDラット尾)、アテロコラーゲン、テロコラーゲン、および
オリゴマーマトリックスから得られた実験放出動態に組み込んだ。ワイブル関数は、実験
データによく当てはまり、適合度からパラメーターaおよびbに関して決定されたR2お
よび信頼区間とともにパラメーター値aおよびbを以下の表2に示す。
た一方、オリゴマーおよびテロコラーゲンコラーゲン原線維マトリックスは、それらと関
連している複合の放出機構(フィックの拡散およびケースII輸送)を示したことを示し
ている。アテロコラーゲンは、パラメーターbの完全に異なる値を示し、これは、高度に
無秩序な空間におけるような拡散放出機構をおそらく示している。したがって、ワイブル
関数は、コラゲナーゼの非存在下での放出動態に単独で当てはまったので、この結果は、
コラーゲン原線維微細構造が分子放出に影響することを裏付けた。
オリゴマー:アテロコラーゲン比がコラーゲン原線維マトリックス重合動態に対して効
果を有したかどうかを決定するために、マトリックスを実施例2に記載した手順を使用し
てAR2000レオメーター上でFITC−デキストランなしで重合させた。5つの異な
るマトリックス組合せを重合前に0:100、25:75、50:50、75:25、お
よび100:0の比で可溶性オリゴマーおよびアテロコラーゲンビルディングブロックを
組み合わせることによって調製した。結果としての重合曲線ならびに計算された重合速度
およびT50%を図9に示す。特に、コラーゲン製剤が、4℃から37℃への温度の上昇
後に溶液からマトリックスへの転移を示したので、せん断−貯蔵弾性率の時間依存性変化
をモニターした。重合プロファイル(A)を使用して、各マトリックス型のN=3に関し
て重合の初速度(平均値±SD、B)および半減重合時間(平均値±SD、C)を定量化
した。
)ことが図9から観察された。形成されたマトリックスの堅さ値は、オリゴマーの百分率
が増加するにつれて増加した(図9A)。重合の速度は、増加するオリゴマー含有量とと
もに増加し(図9B)、T50%は、減少した(図9C)。急速な重合時間(T50%<
5分間)が0:100を除く全てのオリゴマー:アテロコラーゲン比に関して観察された
。
ゲン比(純アテロコラーゲン)マトリックス以外は、急速な重合(T50%<5分間)を
示した(図9C)。急速なコラーゲン原線維重合は、重要な設計特色である。臨床適用で
は、注入されたコラーゲン溶液が急速に重合して、多くの従来のコラーゲン製剤によって
は示されない特色である、in situでの適切なマトリックス設置および分子送達を
可能にする固体マトリックスを作り出すことが必要である。これらの結果は、オリゴマー
およびアテロコラーゲンビルディングブロックの種々の組合せの使用で、5分(例外:1
00%アテロコラーゲンマトリックス)以内に重合するそれらの潜在性を保持しながら種
々の堅さを有するマトリックスが調製され得ることを示した。
によるマトリックス放出動態の調節
オリゴマー:アテロコラーゲン比の異なる組合せを有するマトリックスで、異なる微細
構造およびタンパク分解が得られたことから、マトリックス組成物の調節が異なる薬剤放
出プロファイルを生ずるであろうことが暗示された。オリゴマーおよびアテロコラーゲン
ビルディングブロックを使用してマトリックス組成物を調節することにより、低原線維密
度マトリックス(3mg/ml)の分子放出動態が調整され得ると仮定された。これを試
験するために、コラーゲン原線維マトリックスを0:100、5:95、10:90、1
5:85、20:80、25:75、50:50、75:25および100:0%の比で
のオリゴマー:アテロコラーゲンの組合せで製剤化した。これらのマトリックスを0.5
mg/mlの1)一方のサブセットにおける10KDa FITC−デキストラン分子お
よび2)他方のサブセットにおける2MDa FITC−デキストラン分子と混合し、そ
れらの放出を10U/mlコラゲナーゼの非存在または存在下で研究した。
プロファイル(10kDaに関して図10A、および2MDaに関して10C)だが、種
々のコラゲナーゼ−依存性放出プロファイル(10kDaに関して図10B、および2M
Daに関して10D)を与えたことを示した。放出プロファイルは、10KDa FIT
C−デキストラン分子と比較して、2MDa FITC−デキストランの完全な放出に関
して増強された時間(図10CおよびD)も示した。これは、マトリックスがより小さい
サイズの分子よりも、それら内でより長い時間、より大きいサイズの分子を保持する傾向
を暗示した。
可溶性コラーゲンビルディングブロック濃度が増加すると、コラーゲン原線維密度が増
加し、ポアサイズが減少することが以前確立された。コラーゲン原線維密度が増加すると
、分子拡散およびタンパク分解が減少することも公知である。したがって、合成コラーゲ
ン原線維マトリックスからの放出が予混された可溶性コラーゲンビルディングブロックの
濃度を増加させることによって延長されると仮定された。これを試験するために、オリゴ
マーコラーゲン原線維マトリックスを低(3mg/ml)および高密度(15.6mg/
ml)で調製した。低密度マトリックスを前に記載したように調製した。高密度マトリッ
クスを、3mg/mlコラーゲン原線維マトリックスを拘束圧縮に供して、5.2×体積
減少を達成することによって調製した。直径1.1(厚さ2.6mm)のシリンダーを各
マトリックス型から調製し、放出動態を比較した。
それらが細胞浸潤および組織再生を支持し、誘導する能力を損なうことなく、増加した
原線維密度を有するコラーゲンマトリックスを作り出すことが望ましかった。この目的の
ために、オリゴマーマトリックスが、多孔度を細胞がそれに浸潤することができない程度
まで減少させることなく、組織様材料を作り出す点において利点を有することを示した。
したがって、概念証明研究としてオリゴマーコラーゲンマトリックスの密度を高めた。特
に、原線維密度になる、重合マトリックスの効果的なオリゴマー濃度をHarbin研究
室によって開発された拘束圧縮の方法によって増加させた。本発明の教示に従って拘束圧
縮を介して高原線維密度マトリックスを作り出すためのプロセスの概略図を図14に示す
。簡潔に述べると、2MDaまたは10kDa FITC−デキストランと混合された1
0.82mlの可溶性オリゴマーコラーゲン(3mg/ml)を圧縮鋳型(2cm幅、4
cm長さ)中にピペットで移した。溶液を37℃で終夜重合させて、13.52mmの厚
さを有するコラーゲン原線維マトリックスを作り出した。次いで、混合されたFITC−
デキストランを有する重合マトリックスを6mm/分で多孔性ポリエチレンプラテン(5
0ミクロンポア)を使用して最終厚さ2.6mm(2cm幅、4cm長さ)まで拘束圧縮
に供した。圧縮されたコラーゲンマトリックスの最終濃度は、15.6mg/ml(5.
2×圧縮)であった。直径1.1(厚さ2.6mm)のシリンダーを低密度(3mg/m
l)および高密度(15.6mg/ml)マトリックスから調製した。分子放出プロファ
イルを各マトリックス製剤の三連試料に関して50U/mlコラゲナーゼの存在下で測定
した。
改変された密度(3mg/ml=低;および15.6mg/ml=高)の製剤化された
コラーゲンマトリックスを、図11に示したように、それぞれ、10kDaおよび2MD
a FITC−デキストランの分子放出に関して比較した。特に、10kDaおよび2M
Da FITC−デキストランを3mg/mlおよび15.6mg/mlオリゴマーマト
リックスで混合した。両方のマトリックスに関して放出動態を50U/mlコラゲナーゼ
への暴露時に測定した。予期したように、低密度および高密度マトリックス製剤によって
示された放出プロファイル間の差違は、10kDa FITC−デキストラン(A)と比
較して2MDa FITC−デキストラン(D)で増強される。放出の初速度は、10K
Da(B)と2MDa(E)FITC−デキストランの両方に関して、低密度マトリック
スと比較して、高密度マトリックスにおいて有意に低い。放出のT50%は、図10Eお
よび10Fに見られるように、より小さいサイズFITC−デキストラン(10kDa)
とより大きいサイズ(2MDa)の両方に関して、低密度マトリックスにおけるよりも高
密度マトリックスにおいて有意に高い。結果は、圧縮されたマトリックスからのFITC
−デキストラン放出が、10KDa(図11A)と2MDa(図11D)FITC−デキ
ストランの両方に関して、圧縮されていない試料と比較して有意により延長されたことを
示した。放出の初速度の減少およびT50%値の増加も10KDa(図11B、C)と2
MDa(図11E、F)FITC−デキストランの両方に関してより高いコラーゲン原線
維密度で観察された。したがって、コラーゲンマトリックスの密度を高くすることにより
、コラーゲン原線維マトリックスからの分子放出が調節されることがこの実験から結論づ
けられた。
原線維マトリックスの密度の効果
どのようにオリゴマーコラーゲン原線維マトリックスの密度が薬剤放出に影響するかを
さらに明確にするために、10kDaおよび2MDa FITC−デキストランを3mg
/mlから40mg/mlの密度範囲にわたって調製されたマトリックス内で0.25m
g/mlの濃度で混合した。3mg/mlで調製されたオリゴマーマトリックスを拘束圧
縮の非存在下で前に記載したように調製した一方、20mg/mlおよび40mg/ml
マトリックスを4.05mg/mlマトリックスへの拘束圧縮の適用によって調製した。
簡潔に述べると、10.39mlおよび20.78mlの中和されたオリゴマーコラーゲ
ン(4.05mg/ml)を10kDaまたは2MDa FITC−デキストラン(0.
25mg/ml)と混合し、圧縮鋳型(2cm幅、4cm長さ)中にピペットで移した。
溶液を37℃で終夜重合させて、それぞれ、1.3cmおよび2.6cm厚さのマトリッ
クスを形成した。次いで、これらのマトリックスを多孔性ポリエチレンプラテンを使用し
て0.26cmの最終厚さまで拘束圧縮に供して、4.84×(20mg/ml)および
9.88×(40mg/ml)高密度化を達成した。直径1.1(厚さ0.263cm)
のシリンダーを全てのマトリックスから調製し、これを使用して、コラゲナーゼ(10U
/ml)の存在または非存在下で放出動態を測定した。全ての測定を三連試料上で行った
。放出プロファイルをプロットし、ワイブルを当てはめることに基づいて計算した50%
累積放出(T50%)に必要な時間に関して分析した。結果としてのワイブルパラメータ
ーを使用して、放出機構を定めた。
U/mlコラゲナーゼの存在下で10kDaと2MDa FITC−デキストランの両方
の分子放出に対して密度−依存性効果を示した。両方のFITC−デキストランに関して
、T50%の増加が増加した密度とともに観察された。予期したように、密度−依存性放
出のダイナミックレンジは、2MDa FITC−デキストランに関して最も大きかった
。さらに、10kDa FITC−デキストランは、試験した全てのマトリックスに関し
て、2MDa FITC−デキストランと比較して減少したT50%値を示した。興味深
いことに、ワイブル分析は、3mg/mlと20mg/mlオリゴマーマトリックスの両
方に関して、10kDa放出機構が拡散と分解の両方に関与したことを示した。他方、4
0mg/mlオリゴマーマトリックスによって実証されたコラゲナーゼ分解に対する増加
した耐性は、拡散のみの10kDa放出機構をもたらした。対照的に、試験した全てのマ
トリックス製剤は、拡散と分解の両方によって支配された2MDa FITC−デキスト
ラン放出機構を示した。
評価も、図18に示したように、オリゴマー濃度またはマトリックス密度との関数として
のT50%値の進行性の増加を示した。予期したように、コラゲナーゼの非存在下で得ら
れたT50%値は、コラゲナーゼの存在下で測定されたもの未満であった(図17)。ワ
イブルパラメーターは、10kDa FITC−デキストラン放出が3mg/mlおよび
20mg/mlに関しては主に拡散が関与する一方、40mg/mlマトリックスからの
放出では、拡散およびいくつかの他の機構が関与したことを示した。この実験は、コラー
ゲンマトリックスの密度を高くすることにより、どのようにコラーゲン原線維マトリック
スからの分子放出が調節されるかをさらに検証し、定めた。
市場体重のブタの皮をPurdue University Animal Care
and Use Committee(PACUC)ガイドラインに従って市販の食肉
加工源から得た。オリゴマーコラーゲンを、以前記載されたように(参照によって本明細
書に組み込まれているKreger et al, (2010) Biopolymers 93:690-707)真皮から抽出し
た。モノマーに富む(テロコラーゲン)コラーゲンを0.5M酢酸でブタ皮膚を抽出し、
その後塩析することによって調製した。分子間架橋部位を含有するコラーゲン分子内のテ
ロペプチド領域を完全なペプシン消化によって酵素的に除去した。全てのコラーゲンを0
.1M酢酸に対して徹底的に透析し、次いで、凍結乾燥した。使用前に、凍結乾燥された
コラーゲンを0.01N HClに溶解した。全てのコラーゲンを4℃で終夜のクロロホ
ルムへの暴露によって無菌にした。コラーゲン濃度をシリウスレッド(Direct R
ed 80)アッセイを使用して決定した。コラーゲン製剤を純度および重合能力に基づ
いて標準化した。ここで、重合能力を重合マトリックスのせん断貯蔵弾性率(G’)と重
合反応のコラーゲン含有量との間の関係として定義する。市販のモノマーコラーゲン、ラ
ット尾から収集された酸可溶化I型コラーゲンをBD Biosciences(Bed
ford、MA、BD−ラット尾コラーゲン、BD−RTCとして参照される)から購入
した。
3Dコラーゲン原線維マトリックスの調製のために、コラーゲンを0.01N HCl
で希釈し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS、10×、pH7.4)および0.1N水酸化
ナトリウム(NaOH)でさらに中和して、中性pH(7.4)および3mg/mlの最
終コラーゲン濃度を達成した。FITC−デキストランを有するマトリックスを製剤化す
るために、類似した重合プロセスを適用し、FITC−デキストラン(10kDa、40
kDa、500kDa、または2MDa Invitrogen、Eugene、OR)
を10×PBSにプレ溶解して(predissolve)、重合マトリックス内で0.5mg/m
lの最終濃度を得た。多様なオリゴマー:モノマー比を有するマトリックスの調製は、0
.5mg/ml FITC−デキストランとの3mg/mlでの各成分の中和、次いで、
体積比を変動させて、重合前に0:100、25:75、50:50、75:25、およ
び100:0を達成することを伴った。
持した。他の実験では、レオメータープレートの温度を10℃未満で5分間維持して、非
重合マトリックスのベースライン貯蔵弾性率を得、次いで、37℃まで増加させた。コラ
ーゲン溶液の増加した粘度のために、容積式ピペット(Microman、Gilson
、Middleton、WI)を使用して、全てのコラーゲン溶液を正確にピペットで移
した。FITC−デキストランの追加がコラーゲン重合動態およびマトリックス物性に対
して効果を有さなかったことを確認するために、マトリックスをFITC−デキストラン
(10KDaおよび2MDa、0.5mg/m1)の非存在および存在下で調製した。重
合中の粘弾性性質(せん断貯蔵弾性率(G’)、せん断損失弾性率(G”)、および位相
変位デルタ(/5))の時間依存性変化をステンレススチール40mm直径平行プレート
を用いたAR2000レオメーター(TA Instruments、New Cast
le、DE)を使用して振動せん断において測定した。次いで、FITC−デキストラン
の存在および非存在下で調製されたマトリックスに関して重合動態および粘弾性性質を比
較した。
0.5mg/mlの濃度で様々なサイズのFITC−デキストランを含有するコラーゲ
ンマトリックス(3mg/ml)を48−ウェルプレート(250 J.lllwell
)において重合させた。次いで、試料を、コラゲナーゼを含有しないまたは125U/m
l細菌クロストリジウム・ヒストリチクム(Clostridium histolyticum)コラゲナーゼ(
CLS4、Worthington Biomchemical Corporatio
n、Lakewood、NJ)を含有する750μl PBS、pH7.4で覆った。プ
レートをFisher Scientific Clinical Rotator上で
60rpmでのゆっくりとした回転に供した。各試料からの上清を特定の時間間隔で回収
し、新鮮溶液と交換した。サンプリング間隔を、Siepmann et alによって与えられた拡散
等式を使用してモデル化した、各分子サイズに関してシミュレートされた放出曲線に基づ
いて予測した。蛍光光度計(Molecular Devices Spectrama
x M5)を使用して、それぞれ、493および530nmの励起および放射波長で蛍光
を測定した。このプロセスを、FITC−デキストラン放出の完了を示す、ウェルの上清
からの相対蛍光単位がベースライン蛍光(FITC−デキストランを含有しないPBSプ
ラス/マイナスコラゲナーゼ)と一致するまで繰り返した。
ーターを使用して、放出曲線−放出の速度および放出のT50%を定めた。放出の初速度
をMicrosoft Excelでの線形トレンドラインの当てはめを使用して得られ
た、累積放出の25%に達するのに必要な経時的に分析された放出曲線の傾斜として定義
した。累積放出の50%を得るために必要な時間として定義された放出のT50%を、M
atlab(Mathworks)における放出曲線のパワー最適当てはめ(power best
fit)から得た。
較を95%の信頼区間で2−試料スチューデントt検定で行った。薬物サイズとマトリッ
クス組成との間の比較を95%信頼区間のANOVAおよび事後Tukey検定で行った
。
において例示的であり、制限的ではないと考えられる。ある特定の実施形態のみが示され
、記載されていること、ならびに本発明の精神内にある全ての変更および変更形態が保護
されることが望ましいことが理解される。
Claims (25)
- 可溶性オリゴマーコラーゲンの重合生成物、または非オリゴマー可溶性コラーゲン分子
の1つもしくは複数の型との可溶性オリゴマーコラーゲンの混合物の重合生成物を含む不
溶性合成コラーゲン原線維マトリックス;および
前記コラーゲン原線維マトリックス全体にわたってまたは前記コラーゲン原線維マトリッ
クスの部分内に分散した第1の活性薬剤
を含むコラーゲンに基づく治療送達デバイスであって、
前記コラーゲン原線維マトリックスが、少なくとも5Paの堅さを示す、治療送達デバイ
ス。 - 前記コラーゲン原線維マトリックスが、I型コラーゲンを含む、請求項1に記載の治療
送達デバイス。 - 前記非オリゴマー可溶性コラーゲン分子の1つまたは複数の他の型が、可溶性テロコラ
ーゲン分子および可溶性アテロコラーゲン分子の一方または両方を含む、請求項1に記載
の治療送達デバイス。 - 前記コラーゲンに基づく治療送達デバイスが、組織移植片である、請求項1に記載の治
療送達デバイス。 - 前記コラーゲンに基づく治療送達デバイスが、凍結乾燥されている、請求項1に記載の
治療送達デバイス。 - 前記コラーゲン原線維マトリックスが、非オリゴマー可溶性コラーゲン分子の1つまた
は複数の型との可溶性オリゴマーコラーゲンの混合物の重合生成物を含み、前記オリゴマ
ーコラーゲンおよび非オリゴマー可溶性コラーゲン分子が、0:100から5:95、5
:95から10:90、10:90から15:85、15:85から20:80、20:
80から25:75、25:75から50:50、50:50から75:25および75
:25から100:0からなる群から選択される範囲内の比にある、請求項1に記載の治
療送達デバイス。 - 前記コラーゲン原線維マトリックス全体にわたってまたは前記コラーゲン原線維マトリ
ックスの部分内に分散した第2の活性薬剤をさらに含む、請求項1に記載の治療送達デバ
イス。 - 前記第1および第2の活性薬剤のそれぞれが、増殖因子または薬物である、請求項7に
記載の治療送達デバイス。 - 前記コラーゲン原線維マトリックスが、第1の密度を有する第1のポーションおよび第
2の密度を有する第2のポーションを含み;前記第1の密度が、前記第2の密度とは異な
っている、請求項1に記載の治療送達デバイス。 - 前記コラーゲン原線維マトリックスが、前記第1の活性薬剤が内部に分散した第1のポ
ーションおよび第2の活性薬剤が内部に分散した第2のポーションを含み、前記治療送達
デバイスが、前記第1の活性薬剤に関して第1の放出プロファイルおよび前記第2の活性
薬剤に関して第2の放出プロファイルを示し、前記第1の放出プロファイルが、前記第2
の放出プロファイルとは異なっている、請求項1に記載の治療送達デバイス。 - 可溶性コラーゲン原線維ビルディングブロックの第1の量を含む水溶液を形成すること
;
前記ビルディングブロックの自己集合による重合を引き起こし、その結果、不溶性合成コ
ラーゲン原線維マトリックスを形成すること;および
前記水溶液中に活性薬剤の第2の量を含め、それによって前記引き起こすことが、前記活
性薬剤が内部に分散した前記不溶性合成コラーゲン原線維マトリックスを形成すること、
または前記不溶性合成コラーゲン原線維マトリックスを前記活性薬剤の前記第2の量と接
触させて、前記活性薬剤が内部に分散したコラーゲン原線維マトリックスを形成すること
を含む、治療送達デバイスを作製するための方法であって、
前記ビルディングブロックの第1の量が、可溶性オリゴマーコラーゲン分子を含み;
前記コラーゲン原線維マトリックスが、少なくとも5Paの堅さを示す、方法。 - 前記ビルディングブロックの第1の量が、可溶性非オリゴマーコラーゲン分子をさらに
含む、請求項11に記載の方法。 - 前記不溶性合成コラーゲン原線維マトリックスを圧縮して、凝縮された不溶性合成コラ
ーゲン原線維マトリックスを形成することをさらに含む、請求項11に記載の方法。 - 前記圧縮することが、前記不溶性合成コラーゲン原線維マトリックスを拘束圧縮に供す
ることを含む、請求項13に記載の方法。 - 前記引き起こすことの後に、前記不溶性合成コラーゲン原線維マトリックスを凍結乾燥
することをさらに含む、請求項11に記載の方法。 - 可溶性コラーゲン原線維ビルディングブロックの第1の量を含む水溶液および前記水溶
液中の活性薬剤の第2の量を含むプレマトリックス組成物であって、前記可溶性コラーゲ
ン原線維ビルディングブロックの第1の量が、可溶性オリゴマーコラーゲン、または非オ
リゴマー可溶性コラーゲン分子の1つもしくは複数の他の型との可溶性オリゴマーコラー
ゲンの混合物を含み、前記ビルディングブロックが、外因的な架橋剤の非存在下で自己集
合して少なくとも5Paの堅さを有する巨大分子不溶性合成コラーゲン原線維マトリック
スとなるように作動可能である、プレマトリックス組成物。 - 前記非オリゴマー可溶性コラーゲン分子の1つまたは複数の他の型が、可溶性テロコラ
ーゲン分子および可溶性アテロコラーゲン分子の一方または両方を含む、請求項16に記
載のプレマトリックス組成物。 - 前記オリゴマーコラーゲンが、I型コラーゲンを含む、請求項16に記載のプレマトリ
ックス組成物。 - 前記活性薬剤が、増殖因子または薬物である、請求項16に記載のプレマトリックス組
成物。 - 前記活性薬剤が、前記ビルディングブロックの1つまたは複数に共有結合している、請
求項16に記載のプレマトリックス組成物。 - 0:100から5:95、5:95から10:90、10:90から15:85、15
:85から20:80、20:80から25:75、25:75から50:50、50:
50から75:25および75:25から100:0からなる群から選択される範囲内の
比で前記オリゴマーコラーゲンおよび非オリゴマー可溶性コラーゲン分子を含む、請求項
16に記載のプレマトリックス組成物。 - 前記活性薬剤に関して最適化活性薬剤放出プロファイルを示す非可溶性合成コラーゲン
原線維マトリックスを達成するために調節される能力がある、請求項16に記載のプレマ
トリックス組成物。 - 活性薬剤を送達するための方法であって、
可溶性コラーゲン原線維ビルディングブロックの第1の量を含む水溶液および前記水溶液
中の活性薬剤の第2の量を含むプレマトリックス組成物であって、前記可溶性コラーゲン
原線維ビルディングブロックの第1の量が、可溶性オリゴマーコラーゲン、または可溶性
非オリゴマーコラーゲン分子の1つもしくは複数の型との可溶性オリゴマーコラーゲンの
混合物を含み、前記ビルディングブロックが、外因的な架橋剤の非存在下で自己集合して
in situで少なくとも5Paの堅さを有する不溶性合成巨大分子コラーゲン原線維
マトリックスとなるように作動可能である、プレマトリックス組成物;あるいは
可溶性オリゴマーコラーゲンの重合生成物または可溶性非オリゴマーコラーゲン分子の1
つもしくは複数の型との可溶性オリゴマーコラーゲンの混合物の重合生成物を含む不溶性
合成コラーゲン原線維マトリックス;および前記コラーゲン原線維マトリックス全体にわ
たってまたは前記コラーゲン原線維マトリックスの部分内に分散した第1の活性薬剤を含
むコラーゲンに基づく治療送達デバイスであって、前記コラーゲン原線維マトリックスが
、少なくとも5Paの堅さを示す、治療送達デバイス
をin situ位置で配置することを含む方法。 - 前記プレマトリックス組成物が、注入によってin situで配置される、請求項2
3に記載の方法。 - 前記コラーゲンに基づく治療送達デバイスが、組織移植片である、請求項23に記載の
方法。
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