CN109952341A - 衍生自天然来源的冷适应海洋物种的明胶聚合物及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种包括转而含有浓度为1％(w/v)至20％(w/v)的氨基酸链明胶聚合物的溶液的组合物，所述氨基酸链明胶聚合物衍生自天然来源的冷适应海洋物种且经化学官能化以变成具有反应性从而在自由基存在下进行聚合或交联，所述溶液还包含聚合引发剂，例如光引发剂。所述组合物尤其可用于3D打印、挤出系统(添加剂制造)、喷雾系统、浇铸、微纳米纤维制造系统(静电纺丝、溶液吹制纺丝)或微流控。

Description

衍生自天然来源的冷适应海洋物种的明胶聚合物及其用途

技术领域

本发明涉及生物医学领域和消化行业，特别是涉及包括转而含有浓度为1％(w/v)至少20％(w/v)的氨基酸链明胶聚合物的溶液的组合物，所述溶液非必要地还包含光引发剂或任何其它类型的自由基衍生的引发剂，所述氨基酸链明胶聚合物衍生自天然来源的冷适应海洋物种并且经化学官能化以变成具有反应性从而在自由基存在下进行聚合或交联。这种组合物特别适用于生物医学和消化领域中使用的新型生物制造技术。

背景技术

在生物医学领域中，新型生物制造技术允许制备用于治疗或诊断目的的生物材料，例如支架、珠粒、工程组织、器件和微器件。其中一些(生物制造或生物加工)技术包括使用诸如3D生物打印、挤出系统(添加剂制造)、喷雾系统、浇铸、微纳米纤维制造系统(静电纺丝、溶液吹制纺丝)和微流体等技术。在食品科学中，也使用这些技术中的一些，特别是挤出和喷雾系统。

使用这些工艺或技术需要控制生物材料的聚集和聚合或交联状态。在这个意义上，生物材料最初以其液态进行处理，然后通过控制聚合/交联，获得更坚固的状态下的的最终产物。在这方面，这些技术的高性能功能高度依赖于生物材料在液态时的流变性质以及系统在转变为更坚固状态时的控制水平，同时考虑到在任何给定的特定应用中的最终产品的功能性取决于生物材料在固态时的机械、物理化学和生物学性质。换句话说，这些技术的高性能要求在聚合/交联之前有特定流变性质、对聚合/交联和聚合的或交联的生物材料的机械性质的控制。

实际上，高精度生物加工技术(例如生物喷墨打印、喷涂和微流控衍生系统)需要能够控制生物材料的聚合/交联状态的组合物，该组合物具有特定的流变性质以允许形成非常小的液滴(pL)或避免微尺寸通道内的高流动阻力。因此，理想的组合物在交联/聚合之前将具有特定的流变性质(例如导致在进行生物3D打印时具有良好的喷射能力)并且一旦生物材料处于固态就将具有良好的机械性能。理想的组合物将在交联/聚合步骤之前具有：牛顿流体行为，粘度在25-10cP之间，并且在不同的剪切速率和/或温度下具有稳定性。优选地，理想的组合物还具有低表面张力(25-30mN/m)。

生物医学领域需要许多影响治疗或诊断应用结果的物理化学和生物学特性。这些特性中的一些与细胞成分的微环境的控制和生物材料与特定生物响应中衍生的细胞的直接相互作用以及响应细胞生物学活性的生物材料的活性重塑有关。这些特性也被列为生物学上有意义的元素的控制传递、细胞相容性、生物活性和生物降解性。另一方面，在消化领域中，需要专门用于沉积食品涂料的有成本效益的技术，例如用于补充包封的维生素或其他活性化合物的喷雾系统或珠粒制造。

不幸的是，由于迄今为止使用的大多数生物材料的流变性质和聚合/交联的控制未达到最优化，这两个领域在性能上都受到限制。

近年来，人们对寻找明胶来源替代物来替代哺乳动物明胶(例如猪和牛)越来越感兴趣。特别地，已提出将鱼明胶作为替代物，但要克服的重要挑战是其流变性质差。这种限制归因于冷水鱼的胶原蛋白/明胶缺乏富含脯氨酸的区域(Karim A A et al:FoodHydrocolloids 2009,23(3),563-576；Gomez-Guillén M C et al:Food Hydrocolloids2011,25(8)1813-1827)。

为了提供机械性能提高的鱼明胶聚合物，先前已经报道分子内和分子间的交联诱导。Chiou B S et al:Polymer 2006,47(18),6379-6386描述了向含明胶组合物中加入交联剂(即戊二醛和/或京尼平)的传统明胶交联方法。使用该策略获得最佳交联所需的时间在数小时至数天的范围内。

此外，J.B.Yi et al:Journal of Food Science 2006,71(9),E376-E383描述了使用酶促转谷氨酰胺酶(即MTGase)进行鱼明胶交联。该文献教导了通过用酶促转谷氨酰胺酶交联获得具有合适粘度的凝胶所需的时间在数分钟的范围内。

相应地，需要获得具有适用于高精度生物加工技术的流变性质的明胶组合物，该组合物进一步交联并产生具有良好机械(压缩和/或拉伸)性能的组合物，优选地，其中交联时间减少到数秒到数分钟的范围，例如最多5分钟。

因此，迫切需要用于这些技术的新型生物材料。因此，仍然需要新型高生物活性生物材料，其可以产生具有所需几何结构、生物和物理性质的结构复杂的支架，以在生物医学和食品中有最佳应用。

发明内容

在本发明中，我们提出使用衍生自天然来源的冷适应海洋物种的、并且在氨基酸序列中引入化学取代基(例如甲基丙烯酰基)的明胶聚合物(例如鲑鱼明胶)，，作为新型可光交联生物材料，该新型可光交联生物材料具有衍生自冷适应性质的独特的生物医学和食品工业特性。冷适应生物(如鲑鱼)的独特的特征是它们通常具有较高的蛋白结构柔韧性。在这个意义上，10％w/v鲑鱼明胶溶液显示出比牛明胶低4倍的粘度。该特性允许使用专门用于高分辨率3D打印或微流控衍生技术的制造技术，例如多点喷射或Polyjet技术，这些技术需要低粘度和快速聚合的生物材料。我们最初的工作假设指出，除了流变学的好处之外，鲑鱼明胶在分子水平上的更高的柔韧性可以提高MMP(金属蛋白酶)的催化效率。尽管基于这种新型生物材料的光学制备的水凝胶的机械韧性受到不希望有的损害，但这将改善体内细胞迁移/侵袭、血管生成和组织整合。然而，相比之下，我们观察到意想不到的事实：尽管由于鲑鱼明胶的较高柔韧性导致MMP的催化转换增加，并且与牛相比，基于改性鲑鱼明胶的水凝胶的分子柔韧性更高，但是鲑鱼水凝胶的机械性能显示出比牛更高的杨氏模量。另外，当与间充质干细胞、HUVEC结合并在皮下植入到小鼠模型中时，可光交联的鲑鱼明胶的水凝胶显示出更高水平的血管形成和组织整合。此外，衍生自天然来源的冷适应海洋物种的明胶聚合物(如鲑鱼明胶)在氨基酸序列中引入了化学取代基(如甲基丙烯酰基)，作为新型可光交联生物材料，构成了食品加工和保鲜的杰出组合物。

因此，在第一方面，本发明涉及包括转而含有浓度为1％(w/v)至20％(w/v)的氨基酸链明胶聚合物的溶液的组合物，所述溶液还非必要地包含聚合引发剂(如光引发剂)，所述氨基酸链明胶聚合物衍生自天然来源的冷适应海洋物种且经化学官能化以变成具有反应性从而在自由基存在下进行聚合或交联。优选地，所述组合物包含浓度为5％(w/v)至20％(w/v)的氨基酸链明胶聚合物。更优选地，所述组合物还包含表面活性剂。又更优选地，所述组合物的氨基酸链明胶聚合物用选自以下的化学试剂官能化：甲基丙烯酰基、丙烯酰基或任何能够介导聚合物形成或与表面或其他分子反应的官能团或部分。官能团包括本文教导的各种基团和化学实体，并且包括烯基部分，例如丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、二甲基丙烯酸酯、低聚丙烯酸酯、低聚甲基丙烯酸酯、乙基丙烯酸酯，衣康酸酯或丙烯酰胺。另外的官能团包括醛类。其它官能团可包括烯键式不饱和单体，包括：例如丙烯酸或甲基丙烯酸的烷基酯，如甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸丁酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸丁酯、丙烯酸己酯、丙烯酸正辛酯、甲基丙烯酸月桂酯、甲基丙烯酸2-乙基己酯、丙烯酸壬酯、甲基丙烯酸苄酯；相同酸的羟烷基酯，如丙烯酸2-羟乙酯、甲基丙烯酸2-羟乙酯和甲基丙烯酸2-羟丙酯；相同酸的腈和酰胺，如丙烯腈、甲基丙烯腈和甲基丙烯酰胺、乙酸乙烯酯、丙酸乙烯酯、偏二氯乙烯、氯乙烯；以及乙烯基芳族化合物，如苯乙烯、叔丁基苯乙烯和乙烯基甲苯、马来酸二烷基酯、衣康酸二烷基酯、亚甲基丙二酸二烷基酯、异戊二烯和丁二烯。合适的含羧酸基团的烯键式不饱和单体包括丙烯酸单体(如丙烯酸、甲基丙烯酸、乙基丙烯酸)、衣康酸、马来酸、富马酸、衣康酸单烷基酯(包括衣康酸单甲酯、衣康酸单乙酯和衣康酸单丁酯)、马来酸单烷基酯(包括马来酸单甲酯、马来酸单乙酯和马来酸单丁酯)、柠康酸和苯乙烯羧酸。合适的多烯键式不饱和单体包括丁二烯，异戊二烯，甲基丙烯酸烯丙酯，烷基二醇的二丙烯酸酯(如二丙烯酸丁二醇酯和二丙烯酸己二醇酯)、二乙烯基苯等。氨基酸链优选用甲基丙烯酰基官能化。

在本发明第一方面的优选实施例中，明胶聚合物的酸性侧链与在自由基存在下能够聚合或交联的化学试剂官能化的程度为10％至100％，优选20％至100％，更优选30％至100％，更优选40％至100％，更优选50％至100％，更优选60％至100％，更优选70％至100％，更优选80％至100％，更优选90％至100％的赖氨酸残基。在更优选的实施例中，官能化程度约为90％。

在本发明第一方面的另一个优选实施例中，表面活性剂选自SDS、吐温20、P188(Sigma-Aldrich)等。

在本发明第一方面的另一个优选实施例中，聚合引发剂是光引发剂，例如2959[Ciba特殊化学品，现在属于BASF Resins]，优选浓度约为0.01％(w/v)至5％(w/v)。应注意，在本发明的上下文中，“聚合引发剂”是指可通过例如自由基生成来引发单体或大分子单体聚合的任何物质。聚合引发剂通常是氧化剂。示例性的聚合引发剂包括通过暴露于例如电磁辐射或热而活化的聚合引发剂。也可以使用例如公开号为2010/0137241的美国专利申请中描述的聚合引发剂，该申请通过引用整体并入。

在本发明第一方面的另一个优选实施例中，在交联之前，在-5℃至15℃的温度下对溶液进行预处理，时间间隔为1毫秒至4小时，优选1秒至4小时，更优选1分钟至4小时，优选10分钟至4小时，更优选30分钟至4小时，更优选45分钟至4小时，还更优选约1小时至约4小时，还更优选约1小时至约3小时。

在本发明第一方面的另一个优选实施例中，所述明胶聚合物衍生自斑鳟属(Salmo)或太平洋鲑属(Oncorhynchus)，优选地，所述明胶聚合物来自鲑鱼。

本发明的第二方面涉及制备包括转而含有浓度为1％(w/v)至20％(w/v)(优选5％(w/v)至20％(w/v))的氨基酸链明胶聚合物的溶液的组合物的方法，含，所述溶液还非必要地包含聚合引发剂如光引发剂，所述氨基酸链明胶聚合物衍生自天然来源的冷适应海洋物种(优选衍生自斑鳟属或太平洋鲑属)且经化学官能化以变成具有反应性从而在自由基存在下进行聚合或交联，所述方法包括以下步骤：

a、获得衍生自天然来源的冷适应海洋物种(优选自斑鳟属或太平洋鲑属)的氨基酸链明胶聚合物，并将其溶解在溶剂中至终浓度为1％(w/v)至20％(w/v)之间，优选5％(w/v)至20％(w/v)；

b、通过向步骤a)的溶液中加入能够变成具有反应性以在自由基存在下进行聚合或交联的化学试剂，来对步骤a)的氨基酸链明胶聚合物的一级结构进行化学改性；

c、除去步骤b)的溶液中所有未反应的化学试剂；以及

d、非必要地向溶液中加入聚合引发剂(如光引发剂)和/或表面活性剂。

在本发明第二方面的优选实施例中，用选自甲基丙烯酰基和丙烯酰基的化学试剂使氨基酸链官能化。

在本发明的第二方面的又一个优选实施例中，所述方法包括以下步骤：

a、获得衍生自天然来源的冷适应海洋物种(优选衍生自斑鳟属或太平洋鲑属)的氨基酸链明胶聚合物，并将其溶解在溶剂中至终浓度为1％(w/v)至20％(w/v)之间，优选5％(w/v)至20％(w/v)；

b、通过向步骤a)的溶液中加入甲基丙烯酸酐来使步骤a)的氨基酸链明胶聚合物的一级结构进行化学改性；

c、除去步骤b)的溶液中所有未反应的甲基丙烯酸酐；

d、非必要地加入自由基衍生的引发剂(如光引发剂)和/或表面活性剂；

e、如果适用，则非必要地过滤并冷冻干燥步骤c)或d)中的所得组合物。

在本发明第二方面的另一个优选实施例中，所述方法还包括将包含经化学改性的氨基酸链和光引发剂的溶液暴露于光，根据光引发剂的性质暴露于可见光、UV光或红外光，以提供交联组合物。

本发明的第三方面涉及通过本发明第二方面的任何方法获得的或可获得的溶液。

本发明的第四方面涉及通过将包含如本发明第二方面所定义的经化学改性的氨基酸链的溶液暴露于聚合引发剂，更具体地，取决于光引发剂的性质暴露于可见光、UV光或红外光而获得的或可获得的交联组合物，以提供交联组合物。

本发明的第五方面涉及组合物在3D打印、挤出系统(添加剂制造)、喷雾系统、浇铸、微纳米纤维制造系统(静电纺丝、溶液吹制纺丝)或微流控上的用途，所述组合物包含这样的溶液：所述溶液又包含浓度为1％(w/v)至20％(w/v)(优选5％(w/v)至20％(w/v))的衍生自天然来源的冷适应海洋物种(优选自斑鳟属或太平洋鲑属)的氨基酸链明胶聚合物。

本发明的第六方面涉及如本发明第一方面所定义或本发明第三方面所定义的组合物在3D打印、挤出系统(添加制造)、喷雾系统、浇铸、微纳米纤维制造系统(静电纺丝、溶液吹制纺丝)或微流控上的用途。

本发明的第七方面涉及如本发明第一方面所定义或如本发明第三或第四方面所定义的组合物在制备适用于治疗或诊断目的的支架、珠粒、工程组织或器件和微器件上的用途。

本发明的第八方面涉及如本发明第一方面所定义或如本发明第三或第四方面所定义的组合物用于食品涂料的用途。

本发明的第九方面涉及转而包含浓度为1％(w/v)至20％(w/v)(优选5％(w/v)至20％(w/v))的衍生自天然来源的冷适应海洋物种(优选自斑鳟属或太平洋鲑属)的氨基酸链明胶聚合物的溶液在食品涂料或制备适用于治疗或诊断目的的支架、珠粒、工程组织或器件和微器件上的用途；其。

附图说明

图1.在100s^-1剪切流下测量的粘度。在25℃下，与鲑鱼甲基丙烯酸酯化明胶相比，在牛甲基丙烯酸酯化明胶的情况下，浓度的增加使粘度增加高得多。0.02Pa.s相当于20厘泊。所有生物材料具有与实施例中所示的相同水平的化学官能化。

图2.凝胶化温度。在生物材料凝胶化期间，剪切模量或刚度模量(表示为G')增加。与非甲基丙烯酸酯化鲑鱼明胶(SG)相比，浓度为15％(w/v)的甲基丙烯酸酯化鲑鱼明胶(SG8)凝胶化温度降低。该图中所示的其他曲线与包含填料分子(如纤维素纳米晶须(CNW))的复合材料对应，显示出相似的凝胶化/温度相关性，但剪切模量更高。

图3.流体粘度响应剪切流变化的变化。牛明胶显示出剪切稀化效应(典型的非牛顿流体行为)，而对于鲑鱼明胶，观察到牛顿行为(粘度不随剪切流增加而变化)。

图4.流体粘度响应剪切流变化的变化。比较来自牛或鲑鱼的甲基丙烯酸酯化明胶，鲑鱼在不同的剪切流下显示出低得多的粘度值。甲基丙烯酸酯化鲑鱼明胶在不同浓度下(除了浓度为5％(v/w)时)显示出牛顿行为。另一方面，甲基丙烯酸酯化牛明胶在所有测试浓度下显示出非牛顿行为。

图5.浓度为10％且80％赖氨酸氨基酸官能化的甲基丙烯酸酯化牛明胶的光交联(0.5％光引发剂)水凝胶的压缩模量以及，相同浓度但20％(红色)、60％(绿色)、78％(橙色)和85％(紫色)官能化的基于鲑鱼明胶的水凝胶的比较。

图6.浓度为10％且80％赖氨酸氨基酸官能化的甲基丙烯酸酯化牛明胶的光交联(0.5％光引发剂)水凝胶的压缩模量以及，相同浓度但78％官能化(紫色)和在4℃下冷却预处理2小时的78％官能化(黄色)的基于鲑鱼明胶的水凝胶的比较。

图7.拉伸下的杨氏模量。比较鲑鱼和牛来源，对赖氨酸基团(60％、78％和85％)进行了不同程度的官能化的交联的甲基丙烯酸酯化明胶(CMG)水凝胶进行拉伸试验。观察到类似的结果，并且对于鲑鱼明胶，值略高。

图8.包封因子在24小时内的递送率。将浓度为10％(v/w)且80％官能化的甲基丙烯酸酯化鲑鱼明胶水凝胶和浓度为100ng/ml的包封因子(VEGF)在细胞培养基中于37℃孵育。使用不同浓度的II型胶原酶(Whortington)并估算VEGF递送到上清液中的速率。图表[AD1]显示递送的VEGF和鲑鱼明胶的可溶性聚合物的浓度。

图9.使用WST-1细胞增殖比色测定试剂盒(K302，Biovision，美国)按照制造商的说明书在交联的生物材料中进行包封的HUVEC的细胞增殖评估。简而言之，该测定法通过细胞线粒体脱氢酶产生的甲瓒对WST-1的代谢裂解进行定量。这里比较浓度为10％(v/w)且78％(赖氨酸侧链)官能化的甲基丙烯酸酯化牛明胶水凝胶与浓度为10％(v/w)且20％官能化(Nat-Bio 1)、60％官能化(Nat-Bio 2)、78％(Nat-Bio 3)和85％(Nat-Bio 4)的甲基丙烯酸酯化鲑鱼明胶。

图10.交联水凝胶的免疫原性和鲑鱼与牛之间的比较。制备浓度为10％(v/w)且20％官能化(牛0.5，鲑鱼0.5)或78％官能化(牛5，鲑鱼5)的鲑鱼和牛明胶水凝胶并皮下植入小鼠(C57b/6)中。14天后，分离来自小鼠腋下淋巴结的白细胞并在不存在或存在使T淋巴细胞抗CD3(aCD3)休眠的活化剂的情况下、培养牛和鲑鱼明胶(Hidro)。测量作为炎性因子的IL-6和IFN以对鲑鱼和牛水凝胶的免疫反应性进行定量。这些结果表明，与鲑鱼相比，牛的免疫反应性更高。

图11.皮下植入鲑鱼水凝胶3周后显示水凝胶内部完全血管化，细胞从周围的小鼠细胞侵入。箭头表示植入的水凝胶内的血管。这些结果显示水凝胶的组织整合作用非常好。

图12.清洁皮肤和制备用于预处理和提取的溶液的过程的图像，以及在10℃下预处理期间的孵育图像。

图13.经改性且冻干的鲑鱼明胶的外观。为了制备生物墨水，在pH 7.4的磷酸盐缓冲液中制备制剂的不同浓度的基本成分。

图14.鲑鱼明胶官能化和改性鲑鱼明胶的交联的示意图。

图15.原子力显微镜(AFM)拍摄的在实验室中制备的待掺入到基本生物墨水(85％官能化且浓度为10％(w/v)的MSG)中的纤维素纳米晶须的图像。这些细菌纤维素纳米晶须是在智利大学(Universidad de Chile)的Franck Quero教授的监督下制备的。

图16.包封在改性鲑鱼明胶的交联水凝胶中的细胞的显微图像，所述改性鲑鱼明胶中80％赖氨酸用甲基丙烯酰基官能化。

图17.植入基于牛和鲑鱼明胶的改性为20％和80％赖氨酸官能化水平(分别称为0.5和5)的水凝胶7天后的C57BL/6小鼠。7天后移出的水凝胶，看见明显存在血管灌溉。不能移出改性20％的鲑鱼水凝胶，因为它们具有较高水平的组织整合及组织重塑，并且未在小鼠背部观察到该组织的明确存在。

图18.改性明胶中伯胺的定量。在化学官能化反应中加入的甲基丙烯酸酐的量表示为百分比，其中将一定量的甲基丙烯酸酐(以克计)加入到100ml浓度为10％(w/v)的明胶(牛或鲑鱼)溶液中。根据通过OPA方法测量的非可定量赖氨酸相对于未官能化的相同明胶的百分比来计算每种明胶的赖氨酸官能化百分比。

图19.由用甲基丙烯酰基使赖氨酸官能化至不同水平的改性鲑鱼和牛明胶形成的水凝胶的杨氏模量和压缩模量。所有水凝胶均由10％(w/v)明胶溶液制备，并用相同剂量(365nm，800mW/cm²，2分钟)照射。0.5％＝20％官能化；2％＝60％官能化；5％＝80％官能化；10％＝90％官能化。

图20.测量用几何结构。(a)双间隙，(b)锥-板(c)板-板。

图21.在25℃下用双间隙几何结构(a，b)和锥-板几何结构(c，d)计算的不同剪切速率下的水(a，c)和1X PBS(b，d)的粘度。

图22.双间隙几何结构允许获得对鲑鱼明胶的牛顿行为的更合适的描述并且使不同测量方法之间的变化较小。在25℃时，双间隙几何结构允许最好地观察牛和鲑鱼明胶样品之间的本质区别。牛明胶处于凝胶状态，因为在约25℃时观察到三螺旋的形成。

图23. 25℃下随用双间隙几何结构(a，b)和锥-板几何结构(c，d)计算的剪切速率而变化的鲑鱼明胶(a，c)和牛明胶(b，d)的粘度。

图24. 37℃下随用双间隙几何结构(a)和锥-板几何结构(b)计算的剪切速率而变化的鲑鱼明胶的粘度。

图25.在100s^-1的剪切速率下计算的官能化的鲑鱼明胶(Nat-Bio＝赖氨酸中有85％官能化的鲑鱼明胶)和牛明胶的粘度。结合区域与Polyjet设备允许的粘度值对应。每个实验重复3次以获得平均值和各自的标准偏差。

图26.补充有CNW的基础生物墨水制剂在温度扫描中的储能模量(储能模量)和随鲑鱼明胶的剪切速率而变化的粘度。SG＝鲑鱼明胶；SG8＝用甲基丙烯酰基使85％赖氨酸官能化的改性鲑鱼明胶；CNW＝纤维素纳米晶须。

图27. 37℃下随剪切速率而变化的具有3％(a，c)和5％w/w CNW的改性鲑鱼明胶化合物(a，b)和未改性明胶(c，d)的粘度。

图28.(A)通过施加1％变形和1Hz的频率，随温度而变化的鲑鱼明胶(-·-)、官能化水平为85％的改性鲑鱼明胶(-·-)以及具有相同官能化水平且具有3％(SG_CNW3-·-、SG8_CNW3-·-)和5％(SG_CNW5-·-、SG8_CNW5-·-)纤维素纳米晶须(CNW)的鲑鱼明胶的储能模量G'。(b)从a)曲线推断的不同明胶的最大储能模量值的条形图。

图29.在诱导甲基丙烯酰基共价交联前在温度下进行预处理来诱导凝胶化(物理交联)而提高的机械性能。将结果与不诱导凝胶化的温度预处理进行比较，同时将牛明胶与鲑鱼明胶进行比较。注意，对于“牛0.5LT”的情况，只有一次重复，而对于其他样品，n＝3。0.5＝20％赖氨酸官能化；10％＝90％赖氨酸官能化。

图30.通过“WST-1细胞增殖比色测定试剂盒”(K302，Biovision，美国)评估包封细胞的增殖。每个条件进行三个实验，每个实验进行3次WST-1代谢定量重复。水凝胶由浓度为10％(w/v)的改性明胶的1X PBS溶液制备。另外，为了比较，包括在具有80％赖氨酸官能化的牛明胶水凝胶中的包封。Nat-Bio 1＝20％官能化；Nat-Bio 2＝60％官能化；Nat-Bio 3＝80％官能化；Nat-Bio 4＝90％官能化。

图31.存在于灌注植入有明胶水凝胶的区域的淋巴腺中的淋巴样细胞的表征。比较了不同官能化水平(0.5＝20％官能化；5＝80％官能化)的鲑鱼和牛明胶水凝胶。除了20％官能化的鲑鱼明胶水凝胶之外，植入后7天不同条件之间没有显著差异。鉴于初步数据(n＝2)，必须在存在对照外科手术流程的情况下进行以下实验，以排除淋巴样细胞的增加为外科手术流程本身产生的炎症所导致的，而不是作为水凝胶存在的结果。

图32.在改性鲑鱼或牛明胶存在下促炎细胞因子的产生。体外培养从植入水凝胶的小鼠的淋巴结中分离的细胞，并通过在改性鲑鱼或牛明胶存在下对该细胞进行炎症记忆诱导。与鲑鱼明胶相比，用牛明胶刺激时观察到更强的免疫反应，而对于官能化程度较低的明胶的情况，则观察到更强的免疫反应。初始型＝未植入的小鼠；se＝无刺激；aCD3＝一般(刺激的)T细胞激活剂；0.5＝来自植入20％官能化的明胶水凝胶的小鼠淋巴结的淋巴细胞；5＝来自植入80％官能化的明胶水凝胶的小鼠淋巴结的淋巴细胞；Hydro＝在体外培养物中改性明胶的记忆刺激，无论是20％还是80％刺激；IL-6＝白细胞介素6；IFNgamma＝干扰素γ。炎症响应与炎性因子(IL-6，IFNγ)的产生有关。

图33.不同赖氨酸官能化水平(用甲基丙烯酰基官能化)的基于改性牛明胶和鲑鱼明胶的水凝胶的外植体的组织学图像。对于20％(0.5％)官能化的基于明胶的水凝胶的情况，观察到深度组织整合、细胞侵入和血管形成，而对于更高的官能化(80％)，细胞主要停留在水凝胶的外围。20％赖氨酸官能化的基于鲑鱼明胶的水凝胶由于其重塑水平而无法回收。假设通过迁移到该区域的细胞的活性组织完全整合且生物材料快速降解。

图34.基于改性明胶水凝胶侵袭测定。这些图像与这些测定的阴性对照(左)和阳性对照(右)对应。特别地，这些测定在Transwell装置中通过在多孔膜上形成分隔顶室和底室的1mm水凝胶层来进行。水凝胶由浓度为2.4％的改性明胶溶液形成。测定后，迁移到多孔膜底面的细胞被染成蓝色。在顶室和底室(DMEM+10％FBS)中均存在迁移诱导剂的情况下进行阴性对照。在迁移诱导剂仅在底室中存在的情况下进行阳性对照。

图35.非官能化鲑鱼明胶(G.S.)和非官能化牛明胶(G.B.)的凝胶强度。

图36.不同剪切速率下的粘度测量。a)保持在25℃的浓度为15％[p/v]的鲑鱼明胶溶液。b)保持在25℃的浓度为15％[p/v]的牛凝胶溶液。c)90％赖氨酸用甲基丙烯酰基官能化的鲑鱼明胶溶液，其制备成3种不同浓度(5％、10％、15％[w/v])并保持在25℃。d)90％赖氨酸用甲基丙烯酰基官能化的牛明胶溶液，其制备成3种不同浓度(5％、10％、15％[w/v])并保持在25℃。注意：在鲑鱼明胶90％甲基丙烯酸酯化的情况下，粘度非常低，由于设备的敏感性限制而测量产生不精确的测量结果，特别是在0.1和10s^-1之间。误差条＝SD，n＝3次实验。

图37.赖氨酸胺的甲基丙烯酰基官能化程度为90％的鲑鱼和牛明胶在剪切流为100s^-1时的粘度测量结果的总结图。误差条＝标准差，n＝3次实验。

图38.a)鲑鱼和牛明胶衍生的水凝胶的平均压缩模量的图形比较-在DMA上进行的测试。b)从鲑鱼和牛明胶衍生的水凝胶的拉伸试验获得的平均杨氏模量的图形比较-使用机械测试仪进行的测试。*P<0.05；**P<0.01(Mann-Whitney),n＝5-6。

图39.用2型胶原酶水解水凝胶的进展曲线。衍生自不同来源的明胶且官能化程度类似的水凝胶之间的水解动力学比较(a)-(c)。衍生自相同明胶来源但官能化程度不同的水凝胶之间的比较水解动力学比较(d)-(e)。水解反应在37℃下以一式三份进行。B2M、B5M、B10M表示用明胶制备的、在0.5、2和10MAA[％v/v]下承受官能化反应的水凝胶。B代表牛，S代表鲑鱼。这个实验进行了三次水解反应。误差条＝S.E。

图40.a)使用OPA测定和基于aa组合物分析的SG和BG之间的赖氨酸比较定量，对鲑鱼(SG)和牛明胶(BG)中的游离胺进行比较定量。b)SG和BG多肽的分子量SDS-PAGE分析。计算相对于牛定量的百分比。AA组合物分析一式两份进行，OPA分析一式三份进行。

图41.使用OPA方法基于游离胺测量的官能化赖氨酸的定量。使用补充有0.5、2、5和10％(v/v)MAA的10％明胶溶液使鲑鱼(SG)和牛明胶(BG)与甲基丙烯酸酐(MAA)反应。使用相同批次的官能化明胶，OPA测定进行3次。误差条：S.D。

图42.不同甲基丙烯酰取代度的牛(a)和鲑鱼(b)明胶的¹H-NMR谱图。使用补充有0.5％(v/v)(即S0.5M)、2％(v/v)、5％(v/v)和10％(v/v)MAA的10％明胶溶液使鲑鱼(SG)和牛明胶(BG)与甲基丙烯酸酐(MAA)反应。“a”信号与苯丙氨酸对应并用于峰积分的归一化。“b”信号(2.9ppm)与赖氨酸亚甲基对应并且其还原与赖氨酸官能化有关。“c”信号(1.8ppm)与甲基丙烯酰基的存在有关。对于比较定量，使用苯丙氨酸信号(6.9-7.5ppm，光谱中的“a”峰)进行光谱归一化。

图43.使用每种明胶制剂的¹H-NMR光谱，基于赖氨酸亚甲基信号的还原计算的官能化赖氨酸的定量。使用补充有0.5％(v/v)、2％(v/v)、5％(v/v)和10％(v/v)MAA的10％明胶溶液使鲑鱼(SG)和牛明胶(BG)与甲基丙烯酸酐(MAA)反应。使用在整个研究中测试的相同批次的官能化明胶，甲基丙烯酸酯化程度从独特的NMR实验和¹H-NMR谱图获得。

图44.新制剂的机械和流变测试。在补充有1％[w/w]和5％[w/w]的8臂-PEG10K-丙烯酸酯三季戊四醇的交联的SG8制剂(15％[w/v]的90％官能化的鲑鱼明胶)上进行a)压缩测试和b)流变测试。

图45.交联反应性和吸湿性的手动定性测试。a)手动测试100μm厚的水凝胶的反应性和吸湿性的图片。在来自打印机头的UV光穿过2次和4次后，通过非交联水凝胶的存在评估反应性。机械刮擦后只有液体溶液＝非交联的；机械刮擦后有液体溶液和块状水凝胶＝部分交联的；机械刮擦后仅有大量水凝胶＝交联的。通过溶液和体积在机械刮擦后移位的水凝胶来评估吸湿性。有3个水平：水合、低水合和干燥，其近似表征为50μl水凝胶体积、25μl水凝胶体积和无体积移位。b)刮痕或水凝胶移位方案的示意图。

图46.补充有不同类型和数量的表面活性剂的主制剂(15％[w/v]的90％(SG8)官能化的鲑鱼明胶溶液)的表面张力。改性鲑鱼明胶和表面活性剂的浓度分别以w/v％和v/v％表示。误差条＝SD，n＝3次实验。结果表示为a)平衡300s后的静态表面张力和b)动态表面张力的导数。

图47.基于新制剂的水凝胶中的包封细胞的细胞活力。

图48.在不同pH条件下提取的鲑鱼明胶的SDS-PAGE电泳。

图49.在不同pH条件下提取的鲑鱼明胶的凝胶强度(Bloom，g)。

图50.在不同pH条件下提取的鲑鱼明胶的粘度随温度的变化(通过流温度斜坡测试)。

图51.在不同pH条件下提取的鲑鱼明胶的拉曼光谱。

图52.A)明胶聚合物及其在承受冷却预处理和光交联后的结构改性的图形描述。显示出温度降低时的三螺旋形成以及随后通过光诱导的共价连接的结构固定。B)在进行预冷却时甲基丙烯酸酯化程度不同的15％(w/v)鲑鱼明胶溶液的压缩模量测试。

具体实施方式

术语定义

如本文所用，“天然来源的冷适应海洋物种”应理解为生物化合物，特别是从栖息于海洋寒冷环境中或适应海洋寒冷环境的现存物种中提取的明胶。因此，这些类型的化合物，尤其是冷适应的聚合物，获得在较低温度下良好地起作用的特殊性质。这些性质中的一些是：与哺乳动物衍生的化合物相比，某些浓度下的粘度较低；凝胶化温度较低；较低温度下具有液态稳定性；溶液中的表面张力较低且分子运动性或柔韧性较高。

如本文所用，“经化学官能化”应理解为化学基团通过化学或生物化学反应加入其化学结构中的化合物、生物化合物或聚合物。在化学或生物化学反应过程中可以加入化学基团的位置可以通过原始化学结构中存在的化学基团的反应性来确定。另外，可以预先处理化合物或聚合物以在其化学结构中添加活性基团，以获得构成官能化的新化学基团。

如本文所用，“丙烯酰基”是具有H₂C＝CH–C(＝O)–结构的烯酮形式；它是衍生自丙烯酸的酰基。该基团的优选的IUPAC名称是丙-2-烯酰基，该基团也(不太正确)称为丙烯酰或简称为丙烯醛基。含有丙烯酰基的化合物可称为“丙烯酸化合物”。丙烯酸化合物通常是α,β-不饱和羰基化合物：它含有由碳-碳单键分开碳-碳双键和碳-氧双键(羰基)，因此具有两种官能团的性质：

在C＝C键处：酸和卤素的亲电加成、氢化、羟基化和键断裂

在C＝O键处：亲核取代(例如在酯中)或亲核加成(例如在酮中)。

丙烯酸的羧基可与氨反应形成丙烯酰胺，或与醇反应形成丙烯酸酯。

如本文所用，“化学光引发剂”应理解为，其在光刺激或施用后，共价键断裂形成一个、两个或更多个自由基以辅助自由基聚合的化学化合物或分子。

如本文所用，“氨基酸链明胶聚合物”应理解为通过肽键连接在一起的一系列氨基酸单体。这种键合的氨基酸链作为氨基酸身份的特定序列与I型胶原蛋白的序列对应，然而，在提取过程之后，这些胶原蛋白聚合物经过一些氨基酸改性并且取决于提取条件在一定程度上缩短序列。以这种方式，明胶应理解为部分水解和去饱和的胶原蛋白。

如本文所用，“氨基酸侧链上的官能化程度”应理解为氨基酸总数中包含经过化学改性且因此在其原始化学结构中添加了化学基团的肽、多肽或共价键合的氨基酸序列的氨基酸数。

如本文所用，“冷却预处理”应理解为化合物或聚合物在温度低于室温(约低于21℃)时进行孵育的过程中的步骤。

如本文所用，“溶液”是由两种或更多种物质组成的均匀混合物。在这种混合物中，溶质是溶解在另一种称为溶剂的物质中的物质。溶液或多或少地具有溶剂的特性，包括溶剂的相，并且溶剂通常是混合物的主要部分。溶液中溶质的浓度是有多少溶质溶解在溶剂的量度，与有多少溶剂存在相关，如盐。

如本文所用，“3D打印”应理解为通常在逐层生成的连续步骤中创建的三维结构的制造过程。它与雕刻有区别，因为3D打印创建了可从结构的外围边界到达或不可到达的特定结构，而雕刻通过从原始实体移除材料来重新创建特征，其中所有创建的结构都可从外部到达。

如本文所用，“挤出系统(添加剂制造)”应理解为能够通过施加压力使材料通过喷嘴以使材料沉积在表面上的系统。

如本文所用，“喷雾系统”应理解为能够通过施加压力将材料推过特殊设计的喷嘴以产生小的分散颗粒或液滴的系统。

如本文所用，“浇铸”应理解为填充先前生成的模具的过程，以便在固化、聚合或交联之后从填充材料中重建特定形状。

如本文所用，“微纳米纤维制造系统(静电纺丝)”应理解为在挤出喷嘴和材料沉积区域之间形成的强电场内挤出聚合物溶液，产生更坚固的状态的聚合物微纳米纤维的沉积的系统。术语“静电纺丝”在本领域中是已知的，并且是一种将带电荷的聚合物射流收集在接地的收集器上的方法；快速旋转的收集器得到对齐的纳米纤维，而静态的收集器得到随机取向的纤维垫。当施加的静电荷克服溶液的表面张力时，形成聚合物射流。给定的聚合物的最小浓度称为临界缠结浓度，低于该浓度，不能实现稳定的射流并且不会形成纳米纤维-尽管可以实现纳米颗粒(电喷雾)。稳定的射流具有两个域，即射流段和鞭动段。虽然通常肉眼看不见鞭动射流，但是在适当的光照条件下通常可见射流段。观察射流的长度、厚度、稠度和移动对于预测正在形成的纳米纤维的排列和形态是有用的。可以通过调节溶液的组成和静电纺丝设备的构造来优化射流，从而优化所生产的纤维的排列和形态。本文所用的任何已知的进行聚合物静电纺丝的方法可与本发明的方法一起使用，以提供本文所公开的多功能生物材料。

如本文所用，“微流控”应理解为包含微米尺寸的通道回路的装置，其中流体被灌注形成通道内的大致层状的料流(具有平行向量和非湍流的料流)。

说明

如上所述，生物医学领域需要许多影响治疗或诊断应用结果的物理化学和生物学特性。这些特性中的一些与细胞成分的微环境的控制和生物材料与特定生物响应中衍生的细胞的直接相互作用以及响应细胞生物学活性的生物材料的活性重塑有关。这些特性也被列为生物学上有意义的元素的控制传递、细胞相容性、生物活性和生物降解性。另一方面，在消化领域中，需要用于沉积食品涂料的专门且有成本效益的技术，例如用于补充包封的维生素或其他活性化合物的喷雾系统或珠粒制造。不幸的是，由于迄今为止使用的大多数生物材料的流变性质和聚合/交联的控制未达到最优化，这两个领域在性能上都受到限制。因此，迫切需要用于这些技术的新型生物材料。因此，仍然需要新型高生物活性生物材料，其可以产生具有所需几何结构、生物和物理特性的结构复杂的支架，以在生物医学和食品中有最佳应用。

本发明通过提供一种包含氨基酸链明胶聚合物的组合物(下文中称为“本发明的组合物”)解决上述问题，氨基酸链明胶聚合物衍生自天然来源的冷适应海洋物种，特别是衍生自斑鳟属和太平洋鲑属，并且经化学官能化以变成具有反应性从而在自由基存在下进行聚合或交联。官能化的性质可以是多种多样的，包括甲基丙烯酰基至丙烯酰基(参见本发明的发明内容)。在当这种经化学官能化的水凝胶遇到自由基时，生物材料的这种化学官能化赋予对聚合或交联成更坚固和更热稳定的水凝胶的快速控制。此外，令人惊讶的是，这种官能化改变了生物材料的流变性质，如下所示。

为了说明这种流变性质，我们制备了本发明的组合物的基本制剂，其包含浓度约为1％(w/v)至20％(w/v)的甲基丙烯酰基鲑鱼明胶溶液，添加了浓度为约0.01％(w/v)至5％(w/v)的化学光引发剂(其在特定波长的强光存在下产生自由基)。不同氨基酸侧链(尤其是赖氨酸)的化学官能化程度可以为1％至100％。通过暴露于光下诱导该溶液的聚合或交联。我们还制备了进一步的基本制剂作为比较实施例，其包含浓度为约1％(w/v)至20％(w/v)的甲基丙烯酰基牛明胶溶液，添加了浓度约为0.01％(w/v)至5％(w/v)的化学光引发剂(其在特定波长的强光存在下产生自由基)。最后，我们还制备了浓度为约1％(w/v)至20％(w/v)的非甲基丙烯酰基鲑鱼明胶溶液。所有这些解决方案都是根据本说明书中详述的实施例1至3制备的。

如图1所示，在25℃下，明胶溶液、甲基丙烯酰基牛明胶溶液和甲基丙烯酰基鲑鱼明胶溶液的浓度均增大。然而，与甲基丙烯酸酯化鲑鱼明胶相比，在100s^-1剪切流下测得的这种粘度的增加使得甲基丙烯酸酯化牛明胶的增加高得多。事实上，浓度为约1％(w/v)至20％(w/v)的甲基丙烯酸酯化鲑鱼明胶溶液使包含氨基酸聚合物的溶液具有以下流变性质：

ο在25℃下的粘度：3-20厘泊。

ο在37℃下的粘度：1.5-8厘泊。

这些粘度值在生物制造技术(例如但不限于喷涂或3D打印)中特别有用，因为这些技术的高性能功能高度依赖于液态生物材料的流变性质。

关于凝胶化温度并如图2所示，与非甲基丙烯酸酯化鲑鱼明胶(SG)相比，浓度为15％(w/v)的甲基丙烯酸酯化鲑鱼明胶(SG8)的凝胶化温度降低，从而使甲基丙烯酸酯化鲑鱼明胶在更宽的温度范围内在流变学上更稳定。此外，图2中所示的其他曲线与包括填料分子(如纤维素纳米晶须(CNW))的复合材料对应。这些复合材料显示出类似的凝胶化/温度相关性，但剪切模量较高。这种较高的剪切模量使得这些复合材料对喷墨生物打印方法不太有利。

此外，如图3所示，流体粘度响应剪切流的变化而变化，牛明胶显示剪切稀化效应(典型的非牛顿流体行为)，而对于甲基丙烯酸酯化鲑鱼明胶，观察到牛顿行为(粘度不随剪切流增加而变化)。特别地，在甲基丙烯酰基鲑鱼聚合物的浓度范围为5％至20％时，溶液表现为牛顿溶液。

此外，如图4所示，比较来自牛或鲑鱼的甲基丙烯酸酯化明胶，鲑鱼在不同的剪切流下显示出低得多的粘度值。此外，甲基丙烯酸酯化鲑鱼明胶在不同浓度下显示出牛顿行为。另一方面，甲基丙烯酸酯化牛明胶在所有测试浓度下显示出非牛顿行为。

此外，注意到尽管在迄今为止进行的实验中尚未计算表面张力，但添加浓度在0.01％至5％之间的表面活性剂不会改变甲基丙烯酸酯化鲑鱼明胶的粘度或牛顿行为。这意味着可以通过添加表面活性剂如P 188(Sigma-Aldrich)来控制生物材料溶液的表面张力。

在诸如高精度喷墨(polyjet、stratasys)的3D打印技术中，打印粘度高于20厘泊的生物材料的3D打印性能显著劣化。如上所示，甲基丙烯酸酯化鲑鱼明胶溶液在很宽的温度范围内粘度低于20厘泊，使得该溶液或组合物特别适用于在3D打印技术和其他要求在宽温度范围内有如此低粘度的应用(即用于食品涂料应用的喷雾)。类似地，具有非牛顿行为或高表面张力的生物材料也使生物制造技术劣化。在这方面，如上所示，甲基丙烯酸酯化鲑鱼明胶溶液在宽范围的浓度和温度下表现为牛顿溶液。

此外，液态稳定性和快速聚合是生物制造技术(如3D打印)中的另一个重要方面。在此意义上，在打印过程中，具有接近室温的胶凝温度的生物材料在这些系统中引起严重的有害影响，并且最终由于生物材料的凝胶化而堵塞打印机头中的流动回路。同样的问题适用于微流控系统，其中它们的功能基于微升纳米层流的精确控制，其中粘度和凝胶化事件的任何变化都会破坏对系统中的料流的控制。喷雾系统同样不能使用高粘度或更差的凝胶化生物材料。

由于上述所有原因，包含浓度为约1％至20％(w/v)的氨基酸链明胶聚合物的溶液使组合物具有特别适用于生物制造技术(例如3D打印、微流控系统和喷雾系统)的流变性质以用于生物医学应用或在消化领域应用，所述氨基酸链明胶聚合物衍生自天然来源的冷适应海洋物种(优选自斑鳟属和太平洋鲑属)，经化学官能化以变成具有反应性从而在自由基存在下进行聚合或交联。

因此，在第一方面，本发明涉及包括转而含有浓度为1％(w/v)至20％(w/v)的氨基酸链明胶聚合物的溶液的组合物，所述溶液非必要地还包含聚合引发剂如光引发剂，所述氨基酸链明胶聚合物衍生自天然来源的冷适应海洋物种并且经化学官能化以变成具有反应性从而在自由基存在下进行聚合或交联。

如上所述，明胶通过胶原蛋白的部分水解获得，该胶原蛋白是骨骼、皮肤和结缔组织的主要纤维蛋白成分。本领域已知胶原蛋白的来源影响明胶的特性。

衍生自天然来源的冷适应海洋物种的氨基酸链明胶聚合物包括例如衍生自冷适应海洋鱼类(例如自其皮肤、骨骼、鳍和/或鳞片)的氨基酸链明胶聚合物。冷适应海洋鱼类的名单包括鳕属的成员，例如鳕鱼(如大西洋鳕或太平洋鳕)或Allaska Pollok(黄线狭鳕(Gadus chalcogrammus))；斑鳟属的成员，例如大西洋鲑鱼(Salmo salar)；太平洋鲑属的成员(太平洋鲑鱼)，其包括粉鲑(Oncorhynchus gorbuscha)、奇努克鲑(Oncorhynchustshawytscha)、马苏大马哈鱼(Oncorhynchus keta)、银鲑(Oncorhynchus kisutch)、山女鳟(Oncorhynchus masou)和红大马哈鱼(Oncorhynchus nerka)，和鳕鱼一样属于鳕科的黑线鳕(Melanogrammus aeglefinus)；以及无须鳕属的成员。该列表没有特别限制，如Gomez-GuillénMC等人(Food Hydrocolloids 2011,25(8)1813-1827))所述，适合于明胶提取的鱼或海洋物种的数量不断增加。

近年来，已经进行了旨在从结构上和功能上表征鱼明胶的若干研究，例如，参见Leuenberger BH:Food Hydrocolloids 1991,5(4)353-61.Lim et al:Food Science1999,64(4),616-22；Choi and Regenstein Food Science 2000,65(2),194-9；GilsenanPM et al:Food Hydrocolloids 2000,14(3),191-5；Gomez-Guillén MC et al:Journalof Science and Food Agriculture 2001,81(7),665-73；Haug IJ et al:FoodHydrocolloids 2004,18(2),203-13；Cho SM et al:Food Hydrocolloids 2005,19(2),221-9,Gomez-Guillén M C et al:Food Hydrocolloids 2011,25(8)1813-1827；Karim AA et al:Food Hydrocolloids 2009,23(3),563-576；以及Boran G and Regenstein JM,Adv Food Nutr Res 2010；60:119-43，以上文献通过引用并入本文。

明胶的氨基酸组成非常接近其母体胶原蛋白的组成，其特征在于Gly-X-Y三联体的重复序列，其中X主要是脯氨酸且Y主要是羟脯氨酸。鱼明胶，特别是冷适应物种的特征在于脯氨酸和羟脯氨酸含量低于从哺乳动物物种中分离的明胶的脯氨酸和羟脯氨酸含量(Karim A A et al:Food Hydrocolloids 2009,23(3),563-576)。

总体而言，与哺乳动物明胶相比，鱼明胶具有较低浓度的亚氨基酸(脯氨酸和羟脯氨酸)，而相比冷水鱼(如鳕鱼、牙鳕和大比目鱼)明胶，温水鱼明胶(如大眼金枪鱼和罗非鱼)的亚氨基酸含量更高(Eastoe&Leach,chemical constitution of gelatin.InA.G.Ward,&A.Courts(Eds.),The science and technology of gelatin(pp.73-107).NewYork:Academic Press)。哺乳动物明胶的脯氨酸和羟脯氨酸含量为约30％，温水鱼明胶(罗非鱼和尼罗河鲈鱼)为22-25％，冷水鱼明胶(鳕鱼)为17％(Muyonga et al.,FoodHydrocolloids.2004,18.581-592)。为了说明这一点，Karim A A等人(FoodHydrocolloids 2009,23(3),563-576)在表2中显示了与猪肉明胶相比的一些鱼明胶的氨基酸含量(残基数/1000个氨基酸残基)。

在一个具体实施例中，非必要地与上文或下文描述的一种或多种特征组合，衍生自本发明的天然来源的冷适应海洋物种的氨基酸链明胶聚合物的特征在于所存在的脯氨酸和羟脯氨酸的含量等于或小于20％，优选等于或小于19％、18％、17％、16％或15％。除此之外或替代地，氨基酸链明胶聚合物的特征在于每1000个总氨基酸残基存在50至60个羟脯氨酸残基且每1000个总氨基酸残基存在95至115个脯氨酸残基。

在本发明第一方面的一个优选实施例中，非必要地与上文或下文描述的一种或多种特征组合，明胶聚合物衍生自斑鳟属或太平洋鲑属，优选地明胶聚合物衍生自鲑鱼。

优选地，所述组合物包含浓度为5％(w/v)至20％(w/v)的氨基酸链明胶聚合物。更优选地，所述组合物还包含表面活性剂。又更优选地，所述组合物的氨基酸链明胶聚合物用选自以下的化学试剂官能化：甲基丙烯酰基、丙烯酰基或任何能够介导聚合物形成或与表面或其他分子反应的官能团或部分。官能团包括本文教导的各种基团和化学实体，并且包括烯基部分，例如丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、二甲基丙烯酸酯、低聚丙烯酸酯、低聚甲基丙烯酸酯、乙基丙烯酸酯，衣康酸酯或丙烯酰胺。另外的官能团包括醛类。其它官能团可包括烯键式不饱和单体，包括：例如丙烯酸或甲基丙烯酸的烷基酯，如甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸丁酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸丁酯、丙烯酸己酯、丙烯酸正辛酯、甲基丙烯酸月桂酯、甲基丙烯酸2-乙基己酯、丙烯酸壬酯、甲基丙烯酸苄酯；相同酸的羟烷基酯，如丙烯酸2-羟乙酯、甲基丙烯酸2-羟乙酯和甲基丙烯酸2-羟丙酯；相同酸的腈和酰胺，如丙烯腈、甲基丙烯腈和甲基丙烯酰胺、乙酸乙烯酯、丙酸乙烯酯、偏二氯乙烯、氯乙烯；以及乙烯基芳族化合物，如苯乙烯、叔丁基苯乙烯和乙烯基甲苯、马来酸二烷基酯、衣康酸二烷基酯、亚甲基丙二酸二烷基酯、异戊二烯和丁二烯。合适的含羧酸基团的烯键式不饱和单体包括丙烯酸单体(如丙烯酸、甲基丙烯酸、乙基丙烯酸)、衣康酸、马来酸、富马酸、衣康酸单烷基酯(包括衣康酸单甲酯、衣康酸单乙酯和衣康酸单丁酯)、马来酸单烷基酯(包括马来酸单甲酯、马来酸单乙酯和马来酸单丁酯)、柠康酸和苯乙烯羧酸。合适的多烯键式不饱和单体包括丁二烯，异戊二烯，甲基丙烯酸烯丙酯，烷基二醇的二丙烯酸酯(如二丙烯酸丁二醇酯和二丙烯酸己二醇酯)、二乙烯基苯等。氨基酸链优选用甲基丙烯酰基官能化。

如上所述，这种溶液或组合物用对自由基具有反应性的化学基团官能化，因此当与光引发剂结合并暴露于光(根据光引发剂的性质暴露于可见光、UV光或红外光)时，允许快速聚合/交联。优选的化学基团是甲基丙烯酰基或丙烯酰基。适用于本发明的光引发剂是本领域熟知的。

在本发明第一方面的一个优选实施例中，非必要地与上文或下文描述的一种或多种特征组合，聚合引发剂是光引发剂，例如2959[Ciba特殊化学品，现在属于BASFResins]，优选浓度为约0.01％(w/v)至5％(w/v)。应注意，在本发明的上下文中，“聚合引发剂”是指可通过例如自由基生成来引发单体或大分子单体聚合的任何物质。聚合引发剂通常是氧化剂。示例性的聚合引发剂包括通过暴露于例如电磁辐射或热而活化的聚合引发剂。也可以使用例如公开号为2010/0137241的美国专利申请中描述的聚合引发剂，该申请通过引用整体并入。

此外，具有浓度范围为1％至20％，优选5％至20％的经化学官能化的聚合物的这种溶液或组合物可在氨基酸侧链(尤其是赖氨酸)上包含5％至100％的可变程度的官能化，优选地，这种溶液或组合物包含在氨基酸侧链(尤其是赖氨酸)上20％至100％、30％至100％、50％至100％、60％至100％、70％至100％、80％至100％或90％至100％，优选约90％的可变程度的官能化。

可以通过化学或酶促水解将胶原蛋白转化为可溶性明胶。该过程导致许多存在于胶原蛋白中的分子内和分子间的共价交联的裂解。此外，胶原蛋白分子链中的一些酰胺键发生水解。提取过程可以影响多肽链的长度和明胶的功能性质。

通常，化学水解包括在酸或碱中温和地加热胶原蛋白以破坏交联键。通常，在提取明胶之前使用温和的酸进行预处理。已经使用许多不同的方法来提取鱼明胶。由于在鱼皮胶原蛋白中发现交联的酸不稳定性，温和的酸处理通常足以产生足够的溶胀并破坏分子内和分子间非共价键。提取冷适应海洋物种的明胶的pH通常在3至5.5之间，优选在4至5之间，例如约4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或5，更优选地，提取的pH约为5。为了增加胶原蛋白提取产率，也可以在提取过程中使用适当的蛋白酶抑制剂(例如胃蛋白酶抑制剂A)。表4总结了Karim A.A.et al.Food Hydrocolloids 2009,23(3),563-576先前描述的用于提取鱼明胶的几种方法，该方法可用于提取本发明的衍生自天然来源的冷适应海洋物种的氨基酸链明胶聚合物。

在一个具体实施例中，提取衍生自天然来源的冷适应海洋物种的氨基酸链明胶聚合物的方法包括温和的酸性和温和的碱性预处理。优选地，所述明胶提取方法包括：

在pH约为13时进行碱水解(例如用0.1M NaOH，pH：13.4)；

在pH约为4时进行酸水解(例如用0.05M乙酸，pH：3.8)；以及

在50℃至70℃(优选约60℃)之间的温度下并pH调节为3至5.5之间(优选pH约为5)，进行明胶提取，。孵育时间没有特别限制，通常需要数分钟至数小时，优选2至4小时，更优选3.5小时。在一个优选的实施例中，在60℃下，pH约为5时，明胶提取进行3.5小时。

所述组合物还可包含浓度为0.001％至10％，优选0.01％至1％的表面活性剂。在一个特定实施例中，所述表面活性剂选自SDS、吐温20和泊洛沙姆(例如P 188(Sigma-Aldrich))等。

在另一个实施例中，所述表面活性剂是生物相容表面活性剂。生物相容性表面活性剂在本领域是公知的，包括作为说明性的非限制性例子的：全氟戊烷(PFP)、聚环氧乙烷-共-聚乳酸(PEO-PLA)、聚环氧乙烷-共-聚-ε-己内酯(PEO-PCL)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、牛血清白蛋白(BSA)、Pico-Surf^TM 1、Novec^TM 7500、FC-40，基于氨基酸的表面活性剂(具有单链的基于氨基酸的表面活性剂、胱氨酸或精氨酸双子表面活性剂、赖氨酸衍生物和具有甘油脂样结构的表面活性剂)。优选地，该生物相容性表面活性剂选自含氟表面活性剂。含氟表面活性剂的特征在于具有全氟烷基尾。已显示这些表面活性剂比非全氟化表面活性剂在降低表面张力上更有效。然而，相关的缺点是已知这些化合物具有生物累积性并因此具有毒性。生物相容的含氟表面活性剂包括例如全氟己酸(PFHxA)、全氟丁烷磺酸和全氟丁烷磺酸盐(PFBS)。已经表明，具有烷基尾少于6个碳的全氟化的表面活性剂的生物累积性降低。因此，在一个优选的实施例中，所述生物相容性表面活性剂是具有烷基尾少于6个碳的全氟化的表面活性剂。这包括但不限于Novec FC-4430(3M^TM)、Zonyl FSN-100(DuPont^TM)和三硅氧烷表面活性剂(Silwet L-77)。特别优选的具有烷基尾少于6个碳的的全氟化的表面活性剂是具有支链短烷基尾(例如2、3、4或5个碳，优选2个碳)的含氟表面活性剂。在一个更优选的实施例中，这些表面活性剂是包含几个C₂F₅链的支化的含氟表面活性剂。这包括Merck开发的TIVIDA^TM表面活性剂，如TIVIDA 2300和TIVIDA 2500。

实施例9.2显示具有少于6个碳的支化的含氟表面活性剂(即TIVIDA 2300和TIVIDA 2500)的细胞毒性降低(特别是与发现具有细胞毒性的BYK-345相比)且细胞活力提高(其高于基于仅有改性鲑鱼明胶的水凝胶对照)。由于含氟表面活性剂(TIVIDA 2300、TIVIDA 2500)的存在，这种更好的细胞活力可能与水凝胶中营养物、代谢物和气体的更高扩散系数相关。

在一个具体的实施例中，非必要地与上文或下文所述的一种或多种特征组合，所述烷基尾少于6个碳的的含氟表面活性剂的浓度为0.005％(w/v)至0.1％(w/v)，优选0.01％(w/v)至0.03％(w/v)，甚至更优选约0.02％(w/v)。

此外，所述组合物可包含支化的聚乙二醇衍生物，例如多臂PEG衍生物。支化的浓度可以为0.1％(w/w)至10％(w/w)，优选1％(w/w)至5％(w/w)，更优选约1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％或约5％。优选的支化PEG衍生物选自三季戊四醇(8ARM(TP)PEG)(本文也称为8臂-PEG10K-丙烯酸酯)、三季戊四醇六甘油(8ARM PEG)、二季戊四醇(6ARM PEG)、季戊四醇(4ARM PEG)、甘油(3ARM PEG)、3臂和4臂异功能PEG，最后是异双功能PEG。它们都可以具有可变的PEG长度。

实施例9.1测试了本发明的组合物对暴露于紫外光的抗性，该组合物进一步包含支化的聚乙二醇衍生物，例如浓度为1％和5％(w/w)的多臂PEG衍生物。1％浓度(w/w)显示交联良好的水凝胶在经过暖UV光2次后没有脱水信号。此外，所述制剂显示出保持其粘度和牛顿行为。另一方面，5％(w/w)制剂显示即使在经过4次后仍能抵抗脱水。此外，显示了交联反应性进一步提高。

在一个优选的实施例中，所述组合物还包含如本文所述的具有少于6个碳的支化的含氟表面活性剂和支化的PEG衍生物。根据本文所述的实验结果，这种组合物具有以下特征：

-牛顿行为

-低粘度(5.5-20cP)

-低表面张力

-高交联反应性和结构完整性

-良好的机械性能(压缩模量在25-100kPa之间)

-良好的吸湿性

-细胞相容性

-良好的营养物、代谢物和气体扩散

在一个优选的实施例中，非必要地与上文或下文所述的一种或多种特征组合，所述组合物包含：

-1％(w/v)至20％(w/v)的80％以上(优选地，超过85％)赖氨酸基团官能化的冷适应海洋物种(优选地，鲑鱼)甲基丙烯酰基明胶；

-浓度为0.1％(w/w)至10％(w/w)(优选浓度为1％(w/w)至5％(w/w))的支化的PEG衍生物(优选8臂-PEG10K-丙烯酸酯三季戊四醇)；

-浓度为0.005％(w/v)至0.1％(w/v)的含氟表面活性剂；以及

-浓度为0.01％(w/v)至5％(w/v)的光引发剂。

在一个甚至更优选的实施例中，非必要地与上文或下文所述的一种或多种特征组合，所述组合物包含：

-15％(w/v)的约90％以上赖氨酸基团官能化的冷适应海洋物种(优选地，鲑鱼)甲基丙烯酰基明胶；

-浓度为1％(w/w)至5％(w/w)的支化的PEG衍生物(优选8臂-PEG10K-丙烯酸酯三季戊四醇)；

-浓度为0.005％(w/v)至0.1％(w/v)的具有少于6个碳(优选具有C₂F₅链)的支化的含氟表面活性剂；以及

-浓度为0.05％(w/v)至0.5％(w/v)(优选约为0.2％(w/v))的光引发剂。

在本发明第一方面的另一个优选实施例中，在交联之前，在-5℃至15℃的温度下对溶液进行预处理，该时间间隔为1毫秒至4小时，优选1秒至4小时，更优选1分钟至4小时，优选10分钟至4小时，更优选30分钟至4小时，更优选45分钟至4小时，还更优选约1小时至约4小时，还更优选约1小时至约3小时。

如图6所示，在可变时间(优选小于4小时)内在1℃至12℃范围内交联之前的温度预处理大大提高了聚合/交联的生物材料的机械性能(压缩模量)。

这种机械性能可在5千帕至700千帕的范围内调节。因此，在甲基丙烯酰基明胶聚合物的浓度范围内，通过在酸性侧链(尤其是赖氨酸)上的5％至100％的不同程度的官能化，以及在低于4小时的可变时间中、1℃至12℃的范围内的交联之前的温度预处理，可以调节聚合/交联的生物材料的不同的物理化学和生物学特性。例如，如图8所示，控制水凝胶周围的微环境的包封的可溶性因子的递送速率，或如图9所示的包封细胞的增殖。可调节的聚合/交联的生物材料的其他物理化学和生物学特性是：

ο生物材料内的细胞侵袭；

ο被动降解的时间；

ο通过细胞活性(酶分泌)主动降解的时间；

ο重塑能力

ο细胞黏附；以及

ο免疫原性。

ο植入体内时在材料内形成血管生成的能力

ο植入时组织整合的能力(与血管生成能力密切相关)

因此，如上所述，与衍生自嗜温物种(如哺乳动物)的其它基于氨基酸聚合物的生物材料相比，并且令人惊讶地与非甲基丙烯酸酯化的鲑鱼明胶(SG)相比，浓度为约1％(w/v)至20％(w/v)的包含衍生自天然来源的冷适应海洋物种(特别是来自斑鳟属和太平洋鲑属)且经化学官能化以变成具有反应性从而在自由基存在下进行聚合或交联的氨基酸链明胶聚合物的溶液为组合物提供了改进的性质。

因此，在另一方面，本发明涉及一种包括以下步骤的方法：

i.使包含这样的溶液的组合物处于低于明胶聚合物胶凝点的温度，从而引发物理交联：所述溶液转而包含浓度为1％(w/v)至20％(w/v)的氨基酸链明胶聚合物，所述氨基酸链明胶聚合物经化学官能化以变成具有反应性从而在自由基存在下进行聚合或交联；和

ii.诱导步骤i)中获得的经物理交联的化学官能化聚合物进行共价交联；

其中所述明胶聚合物衍生自天然来源，优选衍生自本文所述的冷适应海洋物种。

本领域技术人员将知道如何确定胶凝点，例如，其可以在冷却时通过差示扫描量热法测定。凝胶化点可能取决于具体的鱼种类，但通常冷水适应物种的胶凝点低于10℃。

聚合引发剂可以存在于步骤i)中的溶液或在进行步骤ii)之前加入：优选地，步骤i)中的所述溶液还包含聚合引发剂。

在一个具体实施例中，非必要地与上文或下文所述的一种或多种特征组合，所述聚合引发剂是化学光引发剂，优选以0.5％的浓度存在，并且其中步骤ii)包括将包含经化学改性的氨基酸链和化学光引发剂的溶液暴露于光(根据光引发剂的性质暴露于可见光、UV光或红外光)，以提供交联组合物。

在步骤i)中，使组合物处于低于明胶聚合物胶凝点的温度(通常为1℃至12℃(优选约4℃))小于4小时，优选2小时。

在一个优选的实施例中，非必要地与上文或下文所述的一种或多种特征组合，步骤i)的组合物通过包括以下步骤的方法获得：

a、获得衍生自天然来源的冷适应海洋物种(优选衍生自斑鳟属或太平洋鲑属)的氨基酸链明胶聚合物，并将其溶解在溶剂中至终浓度在1％(w/v)至20％(w/v)之间；

b、通过加入能够变成具有反应性从而在自由基存在下进行聚合或交联的化学试剂，来使步骤a)的氨基酸链明胶聚合物的一级结构进行化学改性；

c、除去步骤b)的溶液中所有未反应的化学试剂；

d、非必要地加入自由基衍生的引发剂(如光引发剂)和/或表面活性剂；

e、如果适用，则非必要地过滤并冷冻干燥步骤c)或d)中所得的组合物。

从冷适应海洋物种皮肤的提取明胶的pH通常在3至5.5之间，优选在4至5之间，例如约4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或5，更优选地，该pH约为5。

在另一方面，本发明涉及包含通过根据上述方面的方法获得的或可获得的交联/聚合的明胶聚合物的组合物。所述明胶聚合物和组合物的其他特征如本文中本发明第一方面所述。

通过引用以下实施例将更容易理解本发明。应注意，以下实施例仅用于说明本发明，并且不限制本发明。

实施例

实施例1.甲基丙烯酰基鲑鱼明胶溶液的制备。

-鲑鱼明胶的提取：

1.去除鲑鱼皮肤上所有剩余的肉和鳞片。

2.将皮肤切成小正方形(3-5cm/边)

3.每克皮肤加入6mL的0.1M NaOH，在10℃下保持恒定搅拌(900 0rpm)1小时。→6mL/g*500g＝3L(测得的pH＝13)

4.除去溶液并用dH₂O通过过滤和浸泡洗涤皮肤。

5.每克皮肤加入6mL 0.1M NaOH，在10℃下保持恒定搅拌1小时。→3L(测得的pH＝13)

6.除去溶液并通过过滤用dH₂O洗涤皮肤，用dH₂O冲洗并浸泡过滤后的皮肤。

注意：在该步骤中过于大量的洗涤可能影响步骤7中的酸性溶液的pH，这可能导致更高的酸度，从而诱导在该阶段需要避免的明胶的部分提取。

7.然后，每克皮肤加入6mL的0.05M CH₃COOH，在10℃下保持恒定搅拌1小时。(测量的pH＝3.3)

8.首先用dH₂O清洗皮肤，然后将它们浸入dH₂O中，每克皮肤6ml。

9.通过逐滴加入CH₃COOH将pH设定为4.0。

10.孵育4小时，保持恒定搅拌和60℃。

11.每60分钟检查一次pH和温度。

12.除去溶液中的皮肤。

13.使用真空泵和22μm滤纸过滤溶液。

14.将明胶溶液置于干燥盘中，在60℃下干燥48小时。

15.将明胶膜研磨成粉末。

-用甲基丙烯酰基对鲑鱼明胶进行官能化

如前所述，在混合甲基丙烯酸酐并与明胶溶液中的氨基(主要是赖氨酸)反应后，合成甲基丙烯酰基鲑鱼明胶(Nichol et al.2010；Van Den Bulcke et al.2000)。简而言之，在60℃下，将经研磨的鲑鱼明胶溶解在PBS1X(pH7.4)中至终浓度为10％(w/v)。完全溶解后，在仍搅拌的同时，缓慢加入甲基丙烯酸酐(276685，Sigma，美国)至终浓度为8％(v/v)。不同水平的甲基丙烯酰基官能化需要不同浓度的甲基丙烯酸酐。反应3小时后，在PBS1X中进行5X稀释，并将反应的明胶在40℃下用去离子水透析1周。每天更换新鲜的去离子水以在透析过程中除去所有未反应的甲基丙烯酸酐。最后，使用8μm多孔滤纸过滤透析的混合物，并在储存前冷冻干燥。

实施例2.甲基丙烯酰基牛明胶溶液的制备。

与实施例1类似，如前所述(Nichol et al.2010；Van Den Bulcke et al.2000).，在与甲基丙烯酸酐混合并与明胶溶液中的氨基(主要是赖氨酸)反应后，合成甲基丙烯酰基牛明胶。简而言之，在60℃下，将牛明胶(Bloom 220，Rousselot，荷兰)溶解在PBS1X(pH7.4)中至终浓度为10％(w/v)。完全溶解后，在仍搅拌的同时，缓慢加入甲基丙烯酸酐(276685，Sigma，美国)至终浓度为8％(v/v)。不同水平的甲基丙烯酰基官能化需要不同浓度的甲基丙烯酸酐。反应3小时后，在PBS1X中进行5X稀释，并将反应的明胶在40℃下用去离子水透析1周。每天更换新鲜的去离子水以在透析过程中除去所有未反应的甲基丙烯酸酐。最后，使用8μm多孔滤纸过滤透析的混合物，并在储存前冷冻干燥。

实施例3.非甲基丙烯酰基鲑鱼明胶溶液的制备。

根据实施例1中的说明来提取鲑鱼明胶，并且通常通过将获得的明胶在60℃下溶解在PBS1X(pH 7.4)中至终浓度为10％(w/v)来制备非甲基丙烯酰基鲑鱼明胶。浓度不同的明胶的溶液需要在PBS1X中溶解不同量的经研磨的明胶。

实施例4.本发明的组合物及其在生物医学中的用途。

4.1.材料和方法

-鲑鱼明胶的提取

在2016年1月10日从称为Los Fiordos Ltda的鲑鱼养殖场收到80kg鲑鱼皮，并在-20℃保持冷冻。在受控的解冻步骤之后，手动清除剩余的肉残留物和鳞片。迄今为止，已经进行了5轮清洁，每次处理5千克皮肤，产率约为所清洁的皮肤的17％(850克)。然后将皮肤切成表面积为4cm²的块。执行先前由Javier Enrione教授的实验室确定的提取方案，该提取方案包括两个预处理步骤：在10℃下使用0.1M NaOH预处理1小时，然后使用蒸馏水对每个样品进行皮肤洗涤步骤。第三次预处理在10℃下、0.05M乙酸溶液中进行1小时，随后用蒸馏水洗涤皮肤。最后进行酸提取，使皮肤在60℃下在蒸馏水中孵育3.5小时，其中通过添加不同量的乙酸将pH调节至不同水平。测试的pH为3、4和5。评价提取的明胶的产率、水解水平和凝胶强度。

-鲑鱼明胶的化学改性

通过使甲基丙烯酸酐(Sigma)与明胶中赖氨酸侧链的游离氨基反应，用甲基丙烯酰基使鲑鱼明胶进行官能化从而能够提高用光照射来进行聚合。为此目的，使用1X PBS(磷酸盐缓冲液)制备包含鲑鱼明胶的10％溶液(w/v)。将该溶液保持在60℃下1小时以完全溶解。在化学提取罩下和搅拌下逐滴添加不同体积的甲基丙烯酸酐(将10ml、5ml、2ml、1ml或0.5ml加入到100ml溶液中)并在受控搅拌下使其反应3小时，且确保温度保持在60℃。溶液的pH保持在7，否则它可能变为酸性并可能增加改性明胶的水解程度。

在鲑鱼明胶官能化后，通过加入3体积的pH 7.4的1X PBS来稀释反应混合物，然后在40℃下用20体积的蒸馏水透析7天，每天更换水两次。一旦用于除去未反应的甲基丙烯酸酐的透析过程结束，通过孔径为8μm的膜过滤反应混合物，然后冷干并将其储存在-80℃(参见图13)。

一旦鲑鱼明胶进行了化学改性，使用先前文献中描述的OPA方法量化官能化游离胺或赖氨酸的百分比(Journal of Food Science 2001,66(5),642)。通过在反应之前和之后定量游离胺，可以确定用总甲基丙烯酰基官能化的赖氨酸的数量(参见图14)。

-紫外光诱导交联后鲑鱼明胶甲基丙烯酸酯的机械表征。

为了诱导光聚合，将浓度为0.5％W/V的Irgacure 2919(Sigma)光引发剂包含在改性鲑鱼明胶(5％(w/v)、7％(w/v)、10％(w/v)、15％(w/v)溶于1X PBS或蒸馏水的溶液中，然后在直径10mm，高3mm的圆柱形模具中用UV光(365nm，800mW/cm2)照射2分钟。形成的改性鲑鱼明胶(MSG)水凝胶或支架具有不同的机械性能(杨氏模量)，该机械性能取决于加入到甲基丙烯酸酯化反应中的甲基丙烯酸酐的量，因而取决于官能化水平，并且还取决于用于生成水凝胶的MSG浓度。使用DMA(动态机械分析仪)和纹理分析仪进行机械测试。测试在压缩模式和拉伸模式下进行。

-基本制剂(在本文中也称为“生物墨水”)的流变学表征。

根据上文实施例4中描述的方案，生成了在明胶赖氨酸残基中官能度为85％的MSG。在蒸馏水中制备不同浓度的改性明胶溶液(5％、10％和15％(w/v))以进行流变学研究。使用Anton Paar MCR 301流变仪和锥形几何结构记录剪切速率为100s^-1时的粘度数据。在测定液滴在毛细管尖端处以受控速度灌注的体积的基础上，使用液滴体积张力计设备(Lauda TVT2，Dr.R.Wobser GmbH and Co.，Lauda-德国)额外量化这些溶液的表面张力值。液滴在达到其临界体积时因重力而从毛细管下落。基于该临界体积、溶液密度和毛细管半径计算表面张力(Food Hydrocolloids 25(5):958-967)。该方法需要精确测定密度。这通过数字密度计(DMA 45，Anton Paar KG，Graz，奥地利)来完成。这些实验在Universidad Tecnológica Metropolitana进行，由Rommy 教授监督。

-掺入表面活性剂和机械增强组分(纤维素纳米晶须)对基本生物墨水的流变参数的影响的初步测量。

测量溶液的粘度和粘弹性组分，所述溶液包含15％的赖氨酸残基中有85％官能化的鲑鱼明胶，另外补充有0％(w/v)、3％(w/v)和5％(w/v)的细菌纤维素纳米晶须。通过Anton Paar MCR 301流变仪，使用锥形几何结构进行实验(参见图15)。

-改性明胶在交联过程中的交联策略进展。

当未改性明胶聚合物处于比胶凝点温度更低的温度时，其中未改性明胶聚合物的一种天然活性是形成聚合物的三螺旋，从而形成热可逆水凝胶。换句话说，一旦在低温下形成水凝胶，当该水凝胶处于更高的温度时，它们可以恢复到其液体状态。所提出的用于提高交联的水凝胶的机械性能的策略之一是允许在诱导光介导交联之前形成由低温诱导的三螺旋。这允许在通过建立由光诱导形成的共价键来设定构象之前形成更有序和机械增强的分子结构。与交联相比，该策略允许获得聚合后的机械性能增加20倍，而不会诱导形成三螺旋。之前没有通过任何其他技术看到这种增加，这对于转移到患者和市场具有很好的前景，考虑到尽管它们具有良好的生物活性，但这些水凝胶作为材料的弱点之一是它们的机械性能低。使用纹理分析仪，通过压缩测试来测量机械性能。制备浓度为10％(w/v)的赖氨酸残基具有不同程度的官能化的改性明胶溶液(22％和90％)，并在诱导光介导的交联之前在4℃下孵育2小时。比较经过预冷却步骤的水凝胶的机械性能与未经预冷却步骤的水凝胶的机械性能。

-优化的生物材料的生物相容性研究。

ο包封在由具有不同程度官能化的改性鲑鱼明胶形成的水凝胶中的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的增殖。

如上所述，与如上文报道(1.c)所述的光引发剂一起制备改性为在其赖氨酸中具有不同官能化水平(20％、50％、60％、80％和90％)的基于鲑鱼明胶的水凝胶。在水凝胶光聚合或交联之前，将它们与HUVEC细胞混合，终浓度为6×10⁶个细胞/ml。将水凝胶在补充有10％FBS、1％Pen/Strep和1X谷氨酰胺的DMEM培养基中孵育。每2天更换培养基并将其保持在37℃和5％CO₂的细胞培养箱中。根据供应商的说明使用WST-1细胞增殖比色测定试剂盒(K302，Biovision，美国)评估包封细胞的增殖。简而言之，该测定对WST-1至甲瓒的代谢转化进行定量，该转化由细胞的线粒体脱氢酶介导(参见图16)。

ο皮下植入改性鲑鱼明胶的小鼠动物模型的免疫应答。

制备具有不同赖氨酸官能化水平(20％和80％)的改性鲑鱼水凝胶。圆柱形水凝胶的尺寸为直径10mm、高3mm。将它们皮下植入C57BL/6小鼠的背部。7天后将其取出以分析免疫应答。简而言之，分析存在于淋巴腺中的免疫细胞和迁移的细胞或整合在水凝胶中的细胞，并评估响应于该水凝胶的存在的炎症水平。进行所有实验，使其与用具有相同官能化水平的牛明胶制备的水凝胶进行比较(参见图17)。

ο由不同官能化水平的鲑鱼明胶形成的水凝胶中的细胞侵袭能力。

用于制造细胞化3D结构的生物墨水的设计中的相关点之一是包封的细胞必须能够通过迁移、重塑实际的水凝胶来在生物学上进行响应，并允许靠近3D构建体植入区域的其他细胞迁移和与植入物(例如通过形成脉管系统)相互作用。为了在初步水平上评估这一点，进行了通过不同官能化水平进行改性的鲑鱼明胶水凝胶中细胞侵袭的测定。还将这些结果与使用改性牛明胶获得的结果进行比较。基本上，该测定涉及使用跨室(transwell)装置。所述装置具有两个腔室，由孔径为8μm的膜界定的顶部腔室和底部腔室，细胞在底部腔室中存在的引诱剂刺激介导下从一个腔室通过所述膜迁移到另一个腔室。将水凝胶沉积在厚度约为1mm的膜上，水凝胶上接种有细胞。使用的细胞是骨髓来源的间充质干细胞，其作为组织工程中使用的细胞模型。从底部腔室的底部腔室部分的顶部可以在膜上看到的细胞必须迁移通过水凝胶和多孔膜。迁移细胞的数量的定量证明了细胞在水凝胶中迁移的能力。

4.2.结果

-鲑鱼明胶的化学改性

通过先前在文献中描述的OPA方法(Journal of Food Science 2001,66(5),642)检查明胶赖氨酸中用甲基丙烯酰基官能化对鲑鱼明胶进行的化学改性。基本上，该方法通过特定试剂对明胶多肽链中存在的游离氨基或伯胺进行定量。在OPA方法中，用于反应的反应性游离氨基大部分来自赖氨酸侧链，并且取决于水解程度，小部分(2-4％)与分子多肽链的N-末端氨基对应。用甲基丙烯酸酐官能化的反应在赖氨酸伯胺中并入甲基丙烯酰基官能团，在定量游离氨基的数量时不允许它们与OPA试剂反应(参见图18)。

-紫外光诱导交联后的甲基丙烯酸酯化鲑鱼明胶的机械表征。

如前面部分所述，在明胶赖氨酸中用甲基丙烯酰基官能化的水平应在概念上确定通过诱导其交联形成的水凝胶的机械性质的特定水平。甲基丙烯酰基的数量越多，在诱导交联时形成的分子间和分子内共价键的数量越多。水凝胶中这种较高水平的交联将导致构建体的机械性能(杨氏模量和压缩模量)的提高。由10％(w/v)的具有不同官能化水平的改性明胶溶液制备的水凝胶和具有甲基丙烯酰基的相同光诱导交联的水凝胶的机械性能结果显示在图19中。比较鲑鱼和牛明胶的这些参数(参见图19)。

足够有趣的是，当水凝胶的官能化水平不同时，没有观察到压缩模量(通过压缩测试来测量)的差异，而随着官能化水平越大，杨氏模量(通过拉伸测试来测量)显示增加。

-本发明的基本制剂的流变学表征。

喷墨(聚合物打印)打印过程中的液滴形成取决于流变性质。流变学研究的主要目的是获得初始值，以根据预定义的多因素实验设计执行新制剂的第一优化步骤。

明胶是一种蛋白质生物材料，衍生自部分降解的胶原蛋白，能够形成热可逆的物理晶格。当明胶链冷却时，它们经历从无定形到螺旋形(三螺旋)的构象过渡，以形成晶格键合点。该研究集中于通过甲基丙烯酰基官能化对明胶的分子特征及其流变行为的影响。

流变学研究材料如何变形和流动；它包括弹性、塑性和粘度。

一些重要的流变学性质是：

·表观粘度(剪切应力和剪切速率的关系)

·储能模量和损耗模量(线性粘度行为)

·转变温度。

在该研究中，所有流变学测量均使用Anton-Paar MCR301应力控制型流变仪(Anton-For，Graz，奥地利)来进行。

由于鲑鱼明胶的粘度值较低，因此使用不同的几何结构来分析它们对测量精度和灵敏度的影响。

ο测量用的几何结构

双间隙(在图20a上)。几何结构在低应力的情况下提供更好的测量灵敏度，因为与样品的接触面积非常大。在，每次测量需要更多材料(10mL相比于锥-板的300μL)，由于几何结构表面的振幅，快速温度控制受限。

锥-板(图20b))。由锥角提供均匀的剪切应力分布的最佳几何结构。它不像双间隙那么灵敏，但它也可以用低粘度材料进行良好的测量。不建议将其用于粒子系统。这些粘度测量使用角度为0.5°和直径为50mm的锥-板进行。

板-板(图20c))。这是最灵活的几何结构，因为它允许调节间隙的幅度、快速温度变化和剪切速率。测量灵敏度随顶板直径(在该研究中为50mm)而增加。虽然灵敏度低于前述几何结构，但这种几何结构允许快速和均匀的温度控制，因此它被用于凝胶化研究。

在25℃和37℃且剪切速率为1至1000s^-1下，通过流动扫描测量浓度为5％(w/v)至15％(w/v)不等的鲑鱼和牛明胶的表观粘度，初步比较双间隙和锥-板几何结构的测量灵敏度。以1％形变和0.1-100Hz频率进行频率扫描，且以1Hz的频率和0.01-100％之间的形变振幅进行振幅扫描，以确定线性区域。从温度为37℃到3℃和3℃到20℃的温度扫描测量，通过施加1％的形变和1Hz频率来推测储能模量G'和损耗模量G”以及凝胶化T_g和熔化温度T_m。

鲑鱼明胶(SG)从鲑鱼皮中提取。牛明胶(BG)来源于碱处理后的从牛骨。

明胶通过与甲基丙烯酸酐(276685，Sigma)反应用甲基丙烯酰基官能化。简而言之，将鲑鱼和牛的明胶在60℃下溶解在PBS(pH 7.4)中至浓度为10％(w/v)。在连续搅拌下，缓慢加入甲基丙烯酸酐至浓度为8％w/w。3小时后，通过用PBS稀释来终止反应并随后在40℃下在蒸馏水中透析一周。通过在8um孔中过滤并冷冻干燥获得最终产物(分别为SG8和BG8，鲑鱼和牛)。

通过使细菌纤维素在硫酸中进行酸水解而获得纤维素纳米晶须(CNW)。透析水解产物以除去反应副产物，超声处理以重新悬浮，最后通过离子交换树脂纯化，得到0.1％溶液(w/v)。为了获得明胶溶液的3％w/w和5％w/w溶液，通过旋转蒸发仪浓缩CNW。

o明胶溶液

通过在60℃下连续搅拌1小时，制备每种鲑鱼明胶(SG)、牛明胶(BG)和相应的85％赖氨酸(SG8和BG8)官能化的改性明胶的15％储备溶液(w/v)。随后稀释溶液直至获得10和5％溶液(w/v)。在37℃下将溶液保持恒定搅拌下直至测量。

o具有CNW的明胶溶液

通过将0.3g明胶分别加入到2mL含有9mg和15mg的CNW的CNW溶液中，制备补充有CNW的鲑鱼明胶(SG)和改性鲑鱼(SG8)的15％溶液(w/v)，以获得相对于明胶，浓度为3％或5％(w/w)CNW的溶液。

首先，分析了测量几何结构对测量灵敏度的影响。一式三份获得的测量显示出双间隙灵敏度最佳，其中也描述了在低剪切速率下两种流体的牛顿行为。

需要强调的重点之一是，与改性牛明胶不同，在鲑鱼的情况下，生物墨水中Polyjet打印机所用的可接受的明胶浓度范围更为宽广。

-掺入表面活性剂和机械增强组分(纤维素纳米晶须)对基本制剂的流变参数的影响的初步测量。

为了提高交联后的机械性能，将纤维素纳米晶须(CNW)掺入基本制剂中可以影响生物链最终的流变性。由于这个原因，对包括相对于溶液中明胶克数浓度为3％和5％(w/w)的CNW的制剂进行实验。结果显示补充的生物墨水中的储能模量增加，这被解释为生物墨水制剂中不同聚合物和颗粒之间相互作用力的增加。这将转化为机械性能的增加，但是溶液粘度的增加使得生物墨水超出了Polyjet技术允许的范围。此外，可以看出，通过添加纳米晶须，从牛顿行为到非牛顿行为的变化(粘度与施加到流体的剪切速率成反比)，这并非是Polyjet设备所推荐的(参见图26、27和28)。

-改性明胶在交联过程中的交联策略的进展。

研究增强水凝胶新策略的主要原因之一是纤维素纳米晶须的掺入改变了生物材料的流变性质，使其不适用于Polyjet技术。基于对明胶温度的热可逆凝胶化(其中诱导形成三螺旋排布的明胶单体)的自然理解，研究了首先诱导形成三螺旋(物理交联)，然后诱导光介导甲基丙烯酰基团的交联(化学或共价交联)的可能性。如上所述，已经排列成三螺旋的明胶的化学交联使三螺旋结构固定并加强该结构，使其不能随温度升高而逆转。令人惊讶的是，这种策略使机械性能提高了20倍，并且之前没有通过其他研究策略看到这种增强水平(见图29)。这与组织工程中的应用极其相关，因为所获得的机械性能与天然软组织相当，这允许体内植入。新图52(a)图示了在凝胶化温度下的三螺旋形成和暴露于紫外光时的(不可逆的)共价交联。图52(b)显示15％甲基丙烯酸酯化鲑鱼明胶水凝胶的压缩模量结果(kPa)，其中在交联之前，该水凝胶已经在4℃下进行预冷处理。测试的明胶具有不同程度的甲基丙烯酸酯化(0.5、2、5和10)。该图显示预冷处理导致明胶水凝胶的结构性质的增强，达到高水平的压缩模量。

-优化的生物材料生物相容性研究

ο包封在由官能化程度不同的改性鲑鱼明胶形成的水凝胶中的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的增殖

这些将细胞包封在水凝胶或支架中的过程的主要问题之一是细胞在该过程后的最终状态。因此，如上所述进行增殖测定。在这种情况下，在交联和细胞包封后第1天、第4天和第14天对WST-1在线粒体中的代谢进行定量，并且WST-1在线粒体中的代谢与水凝胶中的细胞增殖相关。观察到具有较低机械性能的水凝胶中的较高增殖，如基于通过其20％赖氨酸与甲基丙烯酰基的官能化来改性的鲑鱼明胶的水凝胶情况。然而，60％、80％和90％的官能化水平没有显示出显著差异(参见图30)。

ο皮下植入改性鲑鱼明胶的小鼠动物模型的免疫应答。

如本报告前一部分所述，植入时对外来支架的存在的免疫应答可能是用于治疗组织病变的工程组织整合成功的决定性因素。由于非常广泛的炎症反应，免疫原性排斥可以导致水凝胶(有或没有包封的细胞)的消除或对患者的损害。为了评估这一点，在小鼠中用水凝胶进行初步皮下植入实验，所述水凝胶由通过低官能化(20％)或高官能化(80％)而改性的鲑鱼或牛明胶来制备。结果显示，与鲑鱼明胶相比，较高的免疫原性与牛明胶的存在相关，此外，当水凝胶官能化程度更高时，免疫反应似乎更低(参见图31和32)。关于这个观念，这种效应可能与官能化低的的水凝胶比官能化高的水凝胶具有较高的细胞侵袭能力和脉管系统形成有关，这样可以使官能化低的水凝胶中的免疫系统中的细胞与水凝胶接触更多(参见图33)。应该强调的是，免疫反应通常相当低，这证实了通常所描述关于明胶的早期发现。

ο由官能化水平不同的鲑鱼明胶形成的水凝胶中的细胞侵袭能力。

可以针对该亚活性设立测定，其用于体外定量具有不同官能化程度的基于改性牛和鲑鱼明胶的水凝胶的侵袭能力，并且目前实验正在进行。图12显示该测定的阴性和阳性对照，其使用由浓度为2.4％的明胶溶液形成的水凝胶。阴性对照在跨室的两个室中存在诱导因子的情况下进行，而阳性对照仅在底室中进行，仅对细胞趋化作用而不是随机迁移进行定量。

实施例5.鲑鱼和牛明胶溶液(官能化和非官能化)的熔化表征。

使用差示扫描量热法(DSC)评估鲑鱼和牛明胶溶液)(7w/v％)的熔化温度(T_m)和焓(ΔHm，并示于表1中。鲑鱼明胶的T_m(4.2±0.026℃)显著低于牛明胶的T_m(12.2±0.008℃)。当这些明胶官能化时，熔化温度显著降低(p<0.05，t检验)。然而，改性鲑鱼明胶的T_m远低于改性牛明胶的T_m(p<0.05，t检验)。鲑鱼和牛明胶T_m之间的这种差异可以用作允许更广泛的应用窗口的技术优势，该更广泛应用窗口例如组织工程，其中生物制造技术需要在更宽的温度范围内(更宽的处理窗口)具有稳定的液体聚集状态，例如不随着时间而改变粘度直到凝胶化延伸到在技术应用中适当地进行。

同样重要的是要强调表1(ΔT)中的熔化转变温度范围也证明，与牛明胶相比，转变发生在更明确的温度下，可以更好地控制三螺旋形成，从而更好控制鲑鱼明胶的粘弹性。

表1：明胶溶液(7％)的熔化表征

结果显示为平均值(±标准偏差)。

实施例6.非官能化鲑鱼和牛明胶的凝胶强度

按照Wainewright(1977)报道的方法测量凝胶强度(波隆姆(bloom)强度)。通过将干明胶在60℃在蒸馏水中溶解20分钟并在将悬浮液在40℃下保持40分钟后，在Bloom罐(150mL，Stable Micro Systems，英国)中制备鲑鱼和牛明胶凝胶(6.67％w/v)。将制备的悬浮液在3℃下在培养箱中保持16-18小时。在配备有直径为R1.27cm的圆柱形探针的纹理分析仪TA.XTplus(Stable Micro Systems，英国)上，以载荷单元为5kg，十字头速度为1mm/s评估凝胶强度。当探针穿透明胶凝胶4mm的距离时，确定最大力(g)。该测定结果如图35所示。

图35显示了在鲑鱼明胶(SG)和牛明胶(BG)中测得的凝胶强度。很明显，从不同来源(分别是鱼和哺乳动物)获得的明胶之间在凝胶强度方面的差异明显，非官能化牛明胶的凝胶强度比非官能化鲑鱼明胶的凝胶强度高约2.5倍。这种行为可能与明胶的分子量和氨基酸谱的现有差异有关。据文献报道，鲑鱼明胶的分子量低于牛明胶。另一方面，牛明胶中的甘氨酸和亚氨基酸(脯氨酸和羟脯氨酸)含量较高。因此，鲑鱼明胶分子量较低且某些氨基酸(甘氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸)的含量降低可以解释折叠螺旋结构的能力降低，这对明胶凝胶强度有直接影响。

鉴于未交联和未官能化的鲑鱼明胶相对于牛明胶的初始强度低得多，以下发现完全出乎意料：甲基丙烯酸酯化鱼明胶的交联/聚合引起几乎瞬时聚合，提供具有与甲基丙烯酸酯化交联的牛明胶相同范围的压缩和拉伸性能的凝胶(参见本文所示的图19和38)。

实施例7.甲基丙烯酸酯化鲑鱼和牛明胶溶液的其他表征

流变学表征

进行用甲基丙烯酰基取代和未用甲基丙烯酰基取代的牛和鲑鱼明胶的流变学比较研究，以便在高精度系统中实现其可用性。

如上所述在不同剪切速率下进行粘度测量。结果表明，一方面，非官能化和官能化鲑鱼凝胶溶液的粘度比牛低，另一方面，鲑鱼明胶溶液(官能化和非官能化)表现出牛顿行为，而牛明胶溶液表现出非牛顿行为(见图36)。随着剪切速率的增加，牛溶液的粘度的剪切稀化效应揭示了非牛顿行为，而对于鲑鱼溶液，粘度在不同的剪切应力水平下保持不变。牛顿行为是按需滴定打印和3D打印系统中良好喷射或液滴形成的严格的先决条件，这将是鲑鱼明胶在生物制造用途中的另一个优点。另一个有趣的方面是鲑鱼明胶即使在浓度为20％[w/v]时也可以在适当的粘度范围内进行，这意味着浓度方面的工作范围更宽，因此交联后的机械性能的工作范围更宽(参见图37)。

机械表征

通过动态力学分析(DMA)测量衍生自鲑鱼和牛明胶的水凝胶的机械性能与邻苯二甲醛(OPA)伯胺定量结果以及先前的研究一致(Billiet T.et al.,Biomaterials 2014,35:49–62)，随着压缩模量的增加，官能化程度表示正相关。基于鲑鱼和牛明胶的水凝胶均在反应中使用0.5MAA[％v/v]浓度进行改性，表现出的压缩模量为11kPa(分别为10.6±0.7SD kPa和10.5±0.9SD kPa)(见图38a)。2MaA[％v/v]的鲑鱼明胶水凝胶表现出压缩模量为30.5±2.2kPa，相比之下，在相同的官能化条件下，衍生自牛明胶的水凝胶的压缩模量为26.6±3.6kPa。通过5MAA[％v/v]反应改性的衍生自牛明胶的水凝胶显示出与衍生自鲑鱼明胶的水凝胶相似的压缩模量，分别为32±1.3kPa至30.7±4kPa。此外，来自以10MAA[％v/v]改性的明胶的水凝胶显示出有趣的差异，该差异接近显著(p＝0.06，Mann-Whitney)，因为鲑鱼表现出平均值为33kPa，而基于10MAA[％v/v]的牛明胶的水凝胶显示压缩模量为28.2±1.7kPa，考虑到衍生自5MAA[％v/v]的牛明胶的水凝胶获得的32±1.3kPa，这意味着减小，即使OPA和核磁共振(NMR)结果表明在10MAA[％v/v]下官能化程度更高。总的来说，衍生自鲑鱼或衍生自牛明胶的水凝胶在压缩机械性能方面彼此之间没有胜负。

通过在0.5MAA[％v/v]下反应产生的衍生自鲑鱼或牛的明胶的水凝胶都不具有足够的完整性以使用机械测试仪进行拉伸测试。然而，在2至10MAA[％v/v]之间的反应条件下产生的水凝胶获得的结果(参见图38b))支持：通过DMA获得的结果显示官能化程度和杨氏模量之间的正相关。

此外，衍生自在10MAA[％v/v]下反应的鲑鱼明胶的水凝胶显示出杨氏模量为22.2±1.2S.D.kPa(在5MAA[％v/v]下鲑鱼水凝胶增加1kPa)，这导致官能化程度和杨氏模量之间的明显正相关。对于在10MAA[％v/v]下反应获得的牛明胶也观察到该结果，其中水凝胶显示增加3kPa。通常，甲基丙烯酰基取代程度的微小变化以良好的相关性反映在机械测试中，并且没有观察到来自鲑鱼和牛的光交联的改性明胶之间机械行为的差异。

水解评估

如前所述，甲基丙烯酰基官能化程度可以增强光交联水凝胶的机械性能(参见图38)，因此可能对预期存在机械挑战的组织工程应用有利。然而，沿着明胶aa序列包含本体基团(甲基丙烯酰基)并伴随着侧链序列的中断，可能影响ECM(细胞外基质)重塑酶在催化侧的物质纳入和水解，因此可能不利于底物特异性和催化作用。为了评估此生物材料官能化方面，用2型胶原酶水解衍生自两种不同来源和甲基丙烯酸酯化程度不同的光交联水凝胶。根据水解动力学(参见图39)，当比较具有相似官能度的鲑鱼和牛明胶时，没有观察到显著差异，除了由在10MAA[％v/v]下进行官能化反应的明胶制备的水凝胶。在那种情况下，与牛相比，鲑鱼明胶的初始水解速率和水解静止峰的时间更快。关于甲基丙烯酸酯化程度，当甲基丙烯酰基取代增加时，水解的初始速率和达到静止峰的时间减少。有趣的是，虽然来自鲑鱼和牛水凝胶的机械水凝胶显示出类似的结果，但鲑鱼明胶水凝胶，特别是在高度官能化时，表现出更快的酶水解，期望随后在植入体内时酶促组织整合更快(更快的血管形成、细胞侵袭和增殖)。

实施例8.甲基丙烯酸酯化鲑鱼和牛明胶的官能化的表征

当在温和条件下与明胶混合时，反应性甲基丙烯酸酐能够反应并将甲基丙烯酰基主要结合到赖氨酸的游离胺基上(Nichol JW,Biomaterials.2010,31(21):5536-5544)。通过邻苯二甲醛(OPA)测定对已反应的甲基丙烯酰基明胶中剩余的游离胺基团进行定量(P.M.Nielsen,Journal of Food Science 2001,66(5):642-646)将是评估明胶甲基丙烯酸酯化或官能化程度的可靠方法。另一方面，鲑鱼和牛明胶的OPA测定和SDS-PAGE分析能够分别对水解比较水平和近似分子量进行定量(参见图40)。鲑鱼和牛明胶的氨基酸组成分析显示在牛明胶的情况下，赖氨酸含量稍高(赖氨酸数量高出9％)，这相当于使用OPA测定法定量的游离胺高出9％；因此，提取的两种明胶(牛和鲑鱼)的水解水平相同。推断是因为在OPA比较定量中会因肽键断裂后新暴露的胺导致明胶制剂中不同程度的水解，与比较赖氨酸组成分析不同。这些定量有助于我们证明不同明胶制剂中甲基丙烯酰胺的调节量在鲑鱼和牛明胶之间是相当的，该调节量分别以相对于未反应的鲑鱼和牛明胶中的游离胺含量百分比表示(见图41)。

根据SDS-PAGE分析，考虑到纯化的鲑鱼和牛明胶的分子量分布，通过胺基定量和赖氨酸组成证明了水解的等效程度，而官能化赖氨酸的数量、每个明胶单体的甲基丙烯酰基的数量在不同的甲基丙烯酰基官能化程度下制备的牛和鲑鱼明胶之间是相当的。在这方面，具有可比较样品的重要性在于：体外和体内测定的差异可通过鲑鱼和牛明胶的不同性质(例如脯氨酸和羟脯氨酸含量)来解释，而不是由于分子量、水解程度或每个多肽单体中的甲基丙烯酰基团数的差异。

然而，如果在反应期间其他反应性较低的氨基酸(例如丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺)发生甲基丙烯酰基取代，则该方法不能提供信息。因此，实施基于NMR分析的第二个更具信息量的定量方法，以丢弃赖氨酸以外的氨基酸中的甲基丙烯酰基的存在。图42)显示了在不同甲基丙烯酸酯化程度下获得的牛和鲑鱼明胶的光谱。比较未改性明胶和改性明胶，并且遵循先前报道的化学位移的分析(J Mater Sci:Mater Med(2012)23:2607–2617)，在d＝5.4ppm和d＝5.6ppm下，从官能化明胶光谱中观察到的新的峰中观察到在具有不同甲基丙烯酰取代程度的明胶制剂中的差异。这些峰是由甲基丙烯酰基团中的丙烯酸质子的存在而产生，而峰位于d＝1.8ppm。(光谱中的“c”峰)是由于添加的相同基团的甲基功能。另一方面，与位于d＝2.9ppm(光谱中的“b”峰)的赖氨酸亚甲基的存在相关的位移信号的减少证明了赖氨酸的官能化。先前报道的在羟基上可能发生甲基丙烯酰基转移的其他NMR峰(J Mater Sci:Mater Med(2012)23:2607–2617)在我们的明胶制剂中未观察到。与OPA测定相比，从未改性和改性明胶获得的¹H-NMR谱证实了相似的结果。(见图41和43)。在此前提下，在牛和鲑鱼明胶之间，不同的反应条件下获得的甲基丙烯酸酯化程度是相似的。

实施例9.包含甲基丙烯酸酯化冷鱼明胶的新制剂

实施例9.1还包含支化聚乙二醇衍生物(例如多臂PEG衍生物)的制剂

为了创造交联反应性提高、吸湿性(避免脱水的能力)更好以及压缩和杨氏模量更大的新型组合物，主要制剂SG8(15％[w/v]的90％官能化的鲑鱼明胶)补充有不同浓度的支化多接头PEG(8臂-PEG10K-丙烯酸酯三季戊四醇)并测试其机械性能、流变行为、反应性和抗脱水性。就交联后的力学而言，PEG浓度的增加产生了韧性更大的制剂，然而更高浓度的PEG将牛顿制剂调节成为相对非牛顿且更粘稠的制剂(参见图44)。

对于反应性测试，定性观察在正常工作条件(Objet30 3D打印机，STRATASYS)下经过来自打印机头的UV光2次和4次后的交联水凝胶。基于单独的SG8制剂的高度为100μm的水凝胶在经过2次后部分交联并脱水，并且在经过4次后完全干燥，而补充有1％[w/w]PEG在经过2次后显示交联较好的水凝胶，然而，在经过4次后，观察到低水合作用。补充有5％[w/w]PEG的SG8制剂甚至在经过4次后抗脱水，并且交联反应性进一步提高(参见图45)。

实施例9.2还包含表面活性剂的制剂

表面张力测量

如前所述，溶液中材料的良好喷射能力优选要具有牛顿流体行为，粘度在25-10cP之间且表面张力低(25-30mN/m)。除了表面张力之外，SG8主制剂符合所有优选的流变学参数。我们制备了15％[w/v]的90％官能化的鲑鱼明胶溶液(SG8)，其静态表面张力为43mN/m(参见图46)。为了将表面张力降低到适当的范围，针对水系统使用不同的表面活性剂：BYK-345(BYK，US)、Tivida FL 2300和Tivida FL 2500(MERCK，德国)。通过仅添加小体积，所有表面活性剂都能够将主制剂的静态表面张力降低至25mN/m(参见图46)。

由于大多数液体通常在循环条件下处理，所以报告表面张力的时间变化分量非常重要(见图46)。该分量根据表面活性剂的浓度和性质而变化。在这方面，具有较短平衡时间的表面活性剂对降低pL液滴形成期间的表面张力更有效。考虑到静态表面张力和达到平衡所需的时间，浓度为0.02％[v/v]的Tivida FL2300和浓度为0.02％的BYK 345似乎是最有希望用于喷墨系统中pL液滴形成的表面活性剂条件。

细胞活力和细胞相容性测定

为了验证新复合制剂的细胞活力和细胞相容性，制备具有包封的细胞的基于该制剂的水凝胶。

一种已知的现象描述谷氨酰胺转移酶交联的明胶凝胶，其中细胞被包封，细胞与水凝胶表面的距离超过100um，细胞的增殖情况急剧减少(PLoS One.2014Aug 18；9(8):e105616)。扣除营养物质、氧气和代谢物扩散的限制，推测细胞交换距离更远也会对其生存能力产生重要影响。

用我们的新制剂测试了类似的条件，其中将细胞(2×10⁶个细胞/mL)包封在高为1.5mm且直径为8mm的水凝胶中。在不同的时间间隔(0、1、7、14、21天)后，从水凝胶中回收包封的细胞(图47a)，计数(图47b)和测试活力(图47c)。如所预期的，回收细胞的数量减少直至第7天，可能是由于水凝胶深处的包封细胞的细胞死亡。在第7天后，细胞数量再次增加，可能是由于靠近水凝胶表面的包封细胞的细胞增殖。

有趣的是，在表面活性剂TIVIDA 2300和TIVIDA 2500存在下，非预期的水凝胶制剂中，了第7天观察到的细胞死亡减少，而表面活性剂BYK-345杀死了所有细胞，很可能是因为其特殊化学作用影响细胞膜完整性。在TIVIDA 2300和TIVIDA 2500的情况下，细胞活力高得多，甚至高于仅基于改性鲑鱼明胶的水凝胶对照。这种更好的细胞活力可能与因含氟表面活性剂(TIVIDA 2300、TIVIDA 2500)的存在而导致的水凝胶中营养物、代谢物和气体的扩散系数更高相关。

实施例10.在不同pH下提取鲑鱼明胶

按照前述方案从大西洋鲑鱼(Salmo salar)皮中提取鲑鱼明胶。简而言之，经过预处理(包括清洁以消除肌肉和鳞屑的残留物，以及使用0.1M NaOH溶液和0.05M乙酸溶液进行一系列处理)后，在60℃在不同pH(3、4和5)下提取鲑鱼明胶3.5小时。真空过滤上清液(22mm)并在55℃下在烘箱中干燥24小时。研磨得到的干燥明胶并在5℃下储存直至进一步使用。

不同pH条件下获得的鲑鱼明胶在其生物化学性质(近似组成、分子量和氨基酸谱)和物理性质，特别是凝胶强度、热学和流变性质以及通过拉曼光谱的分子构型方面进行表征。

生物化学性质表征

关于生物化学性质，使用AOAC(2015)描述和验证且之前用于明胶表征的方法来测试近似组成(Journal of the Science of Foods and Agriculture 91(2011):2558-2565,Food Hydrocolloids 71(2017):118-128)。通过SDS-PAGE电泳测定分子量，通过HPLC测定氨基酸谱(Journal of the Science of Foods and Agriculture 91(2011):2558-2565,Food Hydrocolloids71(2017):118-128)。结果表明，就近似组成而言，在不同pH条件下提取明胶不会显著影响常量营养素组成(表2)。未检测到蛋白质含量(在所有测试的明胶中约99％干基)和灰分含量(约0.6％干基)的显著差异，而脂肪含量低于所用方法的检测极限且非含氮部分也未检测到。另一方面，氨基酸组成没有显示出由pH提取引起的显著差异。对明胶稳定性的最重要氨基酸(甘氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸)的含量不受pH提取的影响(表2)。然而，通过SDS-PAGE电泳估算的分子量表明，pH提取是确定明胶链分子量的关键值，因为在较低pH下产生较高的水解环境，所以提取所用的pH值越低，电泳凝胶上的分子量分布越高。因此，在pH 5下提取的明胶显示出明显的分子量带，其位于约120kDa处，最可能与α螺旋对应，而其他约250kDa的条带与更复杂的明胶链(例如β螺旋)相关(图48)。但是，在pH 3下提取的明胶显示分子量带分布在37和100kDa之间，揭示了较低的pH值促成较高的水解环境(图48)。

表2.在不同pH下获得的鲑鱼明胶的近似组成和氨基酸含量。

*括号中的值与标准偏差对应

物理性质表征

就物理性质表征而言，pH提取显示出对凝胶强度的强烈影响(图49)。因此，测试的最高pH提取(pH 5)具有较高的凝胶强度并且测试的最低pH(pH 3)显示出较低的凝胶强度，这与通过SDS-PAGE估算的在pH 5下提取的明胶显示的较高分子量一致。这种行为与较高分子量明胶形成较高量的螺旋结构的较高能力有关(Biomaterials 25(2004):5675-5680)。凝胶强度结果描述的行为与在不同pH下提取的明胶的热参数直接相关。通过差示扫描量热法(DCS)，在10℃/min下施加70℃至-5℃的温度扫描来研究热性能，并估算发生与从随机明胶链形成的螺旋结构(胶凝点)相关的放热转变时的温度。DSC数据显示，在由pH 5下提取的明胶形成凝胶中涉及的能量(焓)较高，并且在用pH 3下获得的明胶形成凝胶中涉及的能量较少(表3)。因此，在pH 5下提取的鲑鱼明胶具有更高的分子量，产生更强的明胶凝胶，这意味着使用更高的能量来促进明胶折叠。另外，转变温度也与引用的参数相关，其中在较高分子量的明胶中，转变发生在某一温度下，并且随分子量降低，转变温度变为为较低的值(表3)。

关于在不同pH下获得的鲑鱼明胶的流变学表征，获得的结果也与先前显示的结果直接相关。图50显示了所测试的鲑鱼明胶样品的粘度行为随时间的变化(料流温度斜坡)。明胶链的分子量对粘度行为的影响非常显著，其中在pH 5时提取的明胶在所有测试的温度范围内显示出较高的粘度，而在pH 3时提取的明胶中观察到相反的情况。这些结果还突出了分子量更高的的明胶链能够形成更高含量的螺旋结构(更高的凝胶强度)，促进更高的通量阻力并显示更高的粘度。例如，在4℃下，对于在pH 3、4和5时提取的明胶，获得的粘度值分别为0.035Pa·s、1.477Pa·s和12.50Pa·s。也可以通过流变学分析，通过读取模量G'和G”之间的交点来估算明胶的胶凝点(数据未显示)。因此，有趣的是，通过流变学记录的胶凝点与之前通过DSC记录的胶凝点一致(表3)。

表3.不同pH下获得的鲑鱼明胶的热学和流变学参数。

*括号中的值与标准偏差对应

**同一列中的不同字母代表显著差异(p<0.05)

最后，通过拉曼光谱分析分子构象也显示与后来的分析密切相关的结果。拉曼光谱如图51所示。所获得在不同pH下提取的明胶的拉曼光谱是这类蛋白质的预期光谱。例如，在文献中报道的酰胺I、II和III组的拉曼位移处检测到这些不同组(分别为1650cm^-1、1550cm^-1和1240cm^-1)。有趣的是酰胺B组显示的行为，当提取的pH值降低时，峰显示强度增加。酰胺B基团与位于蛋白质骨架末端区域的羟基相关，并且在这种情况下，表明存在数量更多的在N-末端具有羟基的分子。由于低pH下的水解作用，这种行为与在pH 3时获得的水解程度更高的明胶链一致。因此，拉曼光谱结果与SDS-PAGE结果相容并且与凝胶强度和热学以及流变学性质一致。

Claims (22)

1.一种包括转而含有浓度为1％(w/v)至20％(w/v)的氨基酸链明胶聚合物的溶液的组合物，所述氨基酸链明胶聚合物衍生自天然来源的冷适应海洋物种，所述溶液还包含聚合引发剂，例如光引发剂并且其中所述氨基酸链明胶聚合物用选自甲基丙烯酰基或丙烯酰基的化学试剂进行化学官能化以变成具有反应性从而在自由基存在下进行聚合或交联。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述溶液包含浓度为5％(w/v)至20％(w/v)的化学官能化氨基酸链明胶聚合物。

3.根据权利要求1或2中任一项所述的组合物，其特征在于，所述氨基酸链用甲基丙烯酰基官能化。

4.根据前述权利要求中任一项的组合物，其特征在于，所述明胶聚合物的氨基酸侧链用所述化学试剂官能化的程度为赖氨酸残基的30％至100％。

5.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述明胶聚合物的氨基酸侧链用所述化学试剂官能化的程度为赖氨酸残基的至少80％，优选赖氨酸残基的至少85％。

6.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其特征在于，所述聚合引发剂是光引发剂。

7.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其特征在于，所述溶液在诱导凝胶化(物理交联)的温度下进行预处理，然后在自由基存在下诱导对聚合或交联具有反应性的基团进行共价交联。

8.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其特征在于，所述明胶聚合物衍生自斑鳟属或太平洋鲑属。

9.一种制备包括转而含有氨基酸链明胶聚合物的溶液的组合物的方法，所述氨基酸链明胶聚合物衍生自天然来源的冷适应海洋物种，优选衍生自斑鳟属或太平洋鲑属，浓度为1％(w/v)至20％(w/v)，优选5％(w/v)至20％(w/v)，所述溶液还非必要地包含聚合引发剂，并且其中所述氨基酸链明胶聚合物用选自甲基丙烯酰基或丙烯酰基的化学试剂进行化学官能化以变成具有反应性从而在自由基存在下进行聚合或交联，所述方法包括以下步骤：

a、获得衍生自天然来源的冷适应海洋物种，优选衍生自斑鳟属或太平洋鲑属的氨基酸链明胶聚合物，并将其溶解在溶剂中，优选溶解在PBS或水中至终浓度在1％(w/v)至20％(w/v)之间，优选5％(w/v)至20％(w/v)；

b、通过加入能够变成具有反应性以在自由基存在下进行聚合或交联的化学试剂，来对步骤a)的氨基酸链明胶聚合物的一级结构进行化学改性；

c、除去步骤b)的溶液中所有未反应的化学试剂；

d、非必要地加入自由基衍生的引发剂如光引发剂和/或表面活性剂。

10.一种制备包括转而含有氨基酸链明胶聚合物的溶液的组合物的方法，所述氨基酸链明胶聚合物衍生自天然来源的冷适应海洋物种，优选衍生自斑鳟属或太平洋鲑属，浓度为1％(w/v)至20％(w/v)，优选5％(w/v)至20％(w/v)，所述溶液还非必要地包含聚合引发剂，并且其中所述氨基酸链明胶聚合物用选自甲基丙烯酰基或丙烯酰基的化学试剂进行化学官能化以变成具有反应性从而在自由基存在下进行聚合或交联，所述方法包括以下步骤：

a、获得衍生自天然来源的冷适应海洋物种，优选衍生自斑鳟属或太平洋鲑属的氨基酸链明胶聚合物，并将其溶解在溶剂中，优选溶解在PBS或水中至终浓度在1％(w/v)至20％(w/v)之间，优选5％(w/v)至20％(w/v)；

b、通过向步骤a)的溶液中加入甲基丙烯酸酐来使步骤a)的氨基酸链明胶聚合物的一级结构进行化学改性；

c、除去步骤b)的溶液中所有未反应的甲基丙烯酸酐；以及

d、非必要地加入自由基衍生的引发剂如光引发剂和/或表面活性剂；

e、如果适用的话，非必要地过滤并冷冻干燥步骤c)或d)中的所得组合物。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，衍生自天然来源的冷适应海洋物种的所述氨基酸链明胶聚合物是从冷适应鱼，优选从斑鳟属或太平洋鲑属的皮肤或骨中获得。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，提取方法包括将pH为3和5.5之间，优选pH约为5。

13.根据权利要求10至12中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将包含化学改性的氨基酸链和光引发剂的溶液暴露于光以提供交联组合物，其中根据光引发剂的性质，将包含化学改性的氨基酸链暴露于可见光、UV光或红外光。

14.一种组合物，其包含通过权利要求10至12中任一项所述的方法获得的或可获得的溶液。

15.通过权利要求13所述的方法获得的或可获得的交联组合物。

16.根据权利要求1至9中任一项所述的组合物或根据权利要求14或15中任一项所述的组合物，其特征在于，所述溶液还包含表面活性剂，优选其中所述表面活性剂为少于6个碳的支化的含氟表面活性剂。

17.根据权利要求16所述的组合物，其特征在于，所述表面活性剂为浓度为0.005％(w/v)至0.1％(w/v)的少于6个碳的支化的含氟表面活性剂。

18.根据权利要求1至9中任一项所述的组合物或权利要求14至17中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包含支化的聚乙二醇(PEG)衍生物。

19.根据权利要求18所述的组合物，其特征在于，所述PEG衍生物是浓度为1％(w/w)至5％(w/w)的多臂PEG衍生物。

20.如权利要求1至9中任一项所定义的或如权利要求14所定义的组合物在3D打印、挤出系统(添加剂制造)、喷雾系统、浇铸、微纳米纤维制造系统(静电纺丝、溶液吹制纺丝)或微流控中的用途。

21.如权利要求1至9中任一项所定义的或如权利要求14所定义的组合物在制备适于治疗或诊断目的的支架、珠粒、工程组织或器件和微器件中的用途。

22.如权利要求1至9中任一项所定义的或如权利要求14所定义的组合物在食品涂料中的用途。