CN109196004A - 用于血管化组织修复的工程化支架 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了包含聚合物和环状肽配体的支架。所述肽配体增加内皮细胞和/或祖细胞对支架的附着。本发明还提供了包含所提供的支架的工程化组织。本发明还提供了包含涂层聚合物和环状肽配体的涂层。本发明还提供了通过植入所提供的支架来改善内皮细胞和/或祖细胞的内皮化和血管形成用于对象中的组织再生和修复对象的骨缺损的方法。

Description

用于血管化组织修复的工程化支架
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年3月11日提交的第62/307,050号美国临时申请的权益，其公开内容出于所有目的通过引用整体并入本文。
发明背景
在过去的几十年中，组织工程在维持、恢复或改善宿主组织功能的组织替代物和可移植器官的发展方面取得了相当大的进展(Langer(2000)Mol Therapy1:12)。局部内皮细胞(EC)和循环内皮祖细胞(EPC)在使这些工程化组织构建体血管化中起重要作用，影响新组织形成的长期存活和功能(Carmeliet和Jain(2011)Nature 473:298；Yoder和Ingram(2009)Curr Opinion Hematology 16:269)。这种血管形成过程已被确定为工程组织产品成功转译的主要挑战和限制因素(Santos和Reis(2010)Macromol Biosci 10:12)。
基于生物材料的支架广泛用于组织工程应用，为已经移植或原位募集(recruited)的细胞提供结构支撑，使细胞附着、增殖并且形成新的血管网络(Gong和Niklason(2006)16:153；Zhang等人，(2007)J Cell Mol Med11:945)。存在于天然细胞外基质(ECM)上的生物活性基序对于为此类细胞和组织粘附、生长和功能提供细胞结合位点是至关重要的(Frantz等人，(2010)J Cell Sci 123:4195；Hynes(2009)Science 326:1216)。可以通过各种复杂的生物工程方法来精确设计合成材料以模拟ECM的物理结构，但由于缺乏存在于天然ECM上的生物活性基序，因此它们的应用受到限制。在合成材料表面上产生功能性生物活性涂层以模拟天然ECM可以显著改善人工支架的生物学功能(Jordan和Chaikof(2007)J Vascular Surgery 45:104；Rose等人，(2004)Biomaterials 25:5125；Williams(2008)Biomaterials29:2941)。已经使用各种功能性生物分子和策略来修饰基于生物材料的支架以改善支架中的内皮化和血管形成(Yoder(2009)；He等人，(2005)Biomaterials26:7606；Lee等人，(2012)Biomaterials 33:8343；Yu等人，(2012)Biomaterials 33:8062；Zeng等人，(2012)Biomaterials 33:473；Zeng等人，(2010)Biomaterials 31:1636；Zheng等人，(2012)Biomaterials 33:2880)。然而，由于其不稳定的结构、非特异性细胞结合亲和力以及不能与EC发生功能性相互作用，因此大多数这些生物分子在转译应用中受到限制。非特异性结合不需要的(“脱靶”)细胞类型，例如血小板(Klinger和Jelkmann(2002)JInterferon Cytokine Res 22:913；Stokes和Granger(2012)J Physiol 590:1023；Wagner和Burger(2003)Arteriosclerosis Thrombosis Vascular Biology 23:2131)和炎性细胞(Qin(2012)Atherosclerosis 221:2；Shi和Palmer(2011)Nat Rev:Immunol 11:762)可能会对植入的支架造成不利的身体反应。因此，组织工程应用迫切需要能够与各种来源的EPC和EC特异性相互作用的有效、稳定的生物活性分子。
在血管发育和再生的过程中，整联蛋白，存在于细胞表面上的异二聚受体家族与其在ECM中的配体之间的相互作用在血管粘附、迁移、增殖、存活和分化中起重要作用(Francis(2006)Methods Mol Biol 330:331；Malinin等人，(2012)Curr OpinionHematology 19:206)。先前的报道显示，十六种整联蛋白涉及血管生物学，其中八种(α1β1、α2β1、α3β1、α4β1、α5β1、α6β1、αvβ3和αvβ5)在不同时间在EPC和EC上表达(Rupp和Little(2001)89:566；Caiado和Dias(2012)Fibrogenesis Tissue Repair 5:4)。因此，与EPC和EC上表达的整联蛋白结合的配体表示用于产生类似于天然ECM的生物活性表面的良好候选物，以改善EPC和EC附着和血管形成。例如，精氨酸-甘氨酸天冬氨酸(RGD)基序是在许多ECM蛋白和解整联蛋白中发现的最常见的整联蛋白结合序列(Curly等人，(1999)Cell MolLife Sci 56:427；D’Souza等人，(1991)Trends Biochem Sci 16:246；Jin和Varner(2004)British J Cancer90:561；Ruoslahti和Pierschbacher(1986)Cell44:517；Brooks等人，(1994)Science264:569)。然而，已发现RGD基序缺乏特异性，因为不同的整联蛋白识别含有多种RGD的天然蛋白质和肽(Goodman等人，(2002)45:1045)。因此，迫切需要鉴定靶向特异性整联蛋白的新配体，其具有对EPC和EC的高结合特异性和亲和力。还需要开发应用这些新配体的支架和方法，改善工程化组织的血管生成和内皮化。本发明令人惊讶地解决了这些和其它需求。
发明简述
通常，本文提供了用于改善血管生成和内皮化的组合物和方法。用这些组合物或方法产生医疗装置或支架对于血管、血管内、血液接触或组织工程应用具有新的治疗潜力。
一种提供的支架包含聚合物和共价固定在聚合物表面上的肽配体。肽配体增加内皮细胞和/或内皮祖细胞与支架的附着，并且是式I的化合物：
X2、X6和X7可以各自独立地为氨基酸，其中X2、X6和X7中的至少一个是D-氨基酸；式I的R1可以是H、C1-6烷基、-C(O)R1a或L-A。R1a可以是C1-6烷基、C1-6杂烷基、C1-6烷基-NH2、C1-6烷基-C(O)N(H)-C1-6杂烷基、环烷基、C1-6-烷基环烷基、杂环烷基、C1-6烷基-杂环烷基、芳基、C1-6烷基-芳基、杂芳基或C1-6烷基-杂芳基，其中环烷基、杂环烷基、杂芳基和芳基可以任选地被可以是卤素、-NO2、-OH、-CN、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6卤代烷基或C1-6卤代烷氧基的成员取代。R2可以是H、C1-6烷基或L-A。L是连接基团，并且A是活性剂。
还提供了包含支架的工程组织，所述支架包含聚合物和共价固定在聚合物表面上的式I的肽配体。
还提供了包含涂层聚合物和共价连接至涂层聚合物的式I肽配体的涂层。
还提供了用于改善内皮细胞和/或内皮祖细胞的内皮化和血管形成以在对象中进行组织再生的方法，该方法包括植入包含聚合物和共价固定在聚合物表面上的式I的肽配体的支架。
还提供了用于修复对象的骨缺损的方法，该方法包括植入包含聚合物和共价固定在聚合物表面上的式I的肽配体的支架。在一些实施方案中，骨缺损是颅骨缺损。
还提供了涂覆表面的方法，该方法包括使涂层聚合物官能化，以及将涂层聚合物粘附至表面上。该方法还包括将式I的肽配体共价连接至涂层聚合物。
附图的简要说明
图1例示了其中通过用整联蛋白配体进行涂覆并且任选地在植入前接种细胞来产生医疗装置的实施方案。该医疗装置可用于修复临界尺寸的颅骨或其它骨缺损，并且整联蛋白配体涂层起到增加移植细胞附着至支架或内源性细胞向支架募集的作用。
图2示出了配体LXW7-N3的合成方案。
图3示出了来自用于测试配体的EPC/EC结合亲和力的珠上细胞结合测定的图像。HECFC(a-c)，HCAEC(d-f)和THP-1单核细胞(g-i)与显示LXY30(左图)、LLP2A(中图)和LXW7(右图)的树脂珠一起孵育。比例尺＝50μm。
图4是来自图3的珠上细胞结合测定的结果的图表。对结合在显示不同类型的配体的珠上的细胞数量进行定量和统计学分析。数据表示为平均值±标准偏差：**p<0.01(n＝3)。
图5示出了在不同浓度(0nM、25nM、50nM、100nM)下，在使用LXW7修饰的PLCL膜上接种30分钟后，粘附的EPC的细胞核图像。
图6是附着在图5的膜上的EPC数量的图。
图7示出了在1天和1周时在PLCL膜(对照和LXW7 50nM)上的粘附细胞图像，放大倍数为20倍。
图8示出了来自LXW7与EPC/EC的结合特异性测定的图像。将显示LXW7的珠与HECFC(a–c)、HCAEC(d-f)、HMVEC(g-i)、THP-1单核细胞(j-l)、或血小板(m-o)一起孵育10分钟(左图)、30分钟(中图)或2小时(右图)。LXW7有效支持EPC/EC附着(a-i)，但不支持THP-1单核细胞(j-1)或血小板(m-o)的有效附着。比例尺＝50μm。
图9是来自图8的结合特异性测定结果的图。对结合在显示LXW7的每个珠上的不同类型的细胞的数量进行定量和统计学分析。数据表示为平均值±标准偏差：*p<0.05，**p<0.01(n＝3)。
图10示出了来自LXW7和GRGD对不同细胞类型的结合亲和力测定的流式细胞术数据。测试包括来自不同来源的EPC/EC，包括HECFC(A)、HCAEC(B)、HMVEC(C)和THP-1单核细胞(D)、血小板(E)，以及工程化以高度表达αvβ3(αvβ3-K562，F)和αIIbβ3(αIIbβ3-K562，G)的K562细胞。将细胞与LXW7-bio、GRGD-bio或D-生物素肽一起孵育，随后与链霉亲和素-藻红蛋白一起孵育。进行流式细胞术分析以测定配体的结合亲和力。将用D-生物素处理的样品用作阴性对照。
图11示出了来自细胞和血小板附着于LXW7和GRGD处理的表面的测定的图像。图像是在由D-生物素(a-c)(对照)、LXW7(d-f)或GRGD(g-i)处理的表面上附着的HCAEC(左图)、THP-1单核细胞(中图)和血小板(右图)。a、b、d、e、g和h的比例尺为50μm。c、f和i的比例尺为20μm。
图12是来自图11的附着测定的结果的图。对附着在不同处理表面上的细胞或血小板的数量进行定量和统计学分析。数据表示为平均值±标准偏差：**p<0.01(n＝4)。
图13是显示通过MTS测定评估的LXW7处理的表面和D-生物素处理的表面(对照)上的EC增殖的图。数据表示为平均值±标准偏差：**p<0.01，***p<0.001(n＝4)。
图14示出了显示LXW7对EC生物功能影响的另外数据。显示了LXW7对VEGFR2磷酸化(Tyr1175)和ERK1/2磷酸化的影响的蛋白质印迹分析(左图)和光密度测定(右图)的结果。数据表示为平均值±标准偏差：*p<0.05，**p<0.01(n＝4)。
图15示出了用不同浓度的LXW7处理48小时后EPC上的VEGFR-2(A)和EGFR(B)的mRNA水平的图。*P<0.05vs.对照，#P<0.05vs.25nM(n＝10/组)。
图16是来自用LXW7通过点击化学修饰的电纺微纤维支架的结构的SEM分析的图像。
图17示出了LXW7和LXW7-N3的化学结构。
图18示出了LXW7与电纺微纤维支架表面连接所涉及的化学过程的示意图。
图19是具有未处理的支架、仅PEG修饰的支架和PEG-LXW7修饰的支架的膜的ATR-FTIR光谱图。
图20示出了孵育2小时后粘附在未处理的纳米纤维膜表面(a)和LXW7-修饰的纳米纤维膜表面(b)上的CD31染色的HCAEC的代表性免疫细胞化学图像。比例尺＝50μm。
图21是来自图20的CD31免疫染色图像的粘附细胞的定量和相关统计分析的图。数据表示为平均值±标准偏差：**p<0.01(n＝3)。
图22示出了在未处理的膜表面(a、c)和LXW7修饰的纳米纤维膜表面(b、d)上生长2天的EC的SEM图像(a、b中的比例尺：250μm，c、d中的比例尺：50μm)。
图23是来自图22的SEM图像的细胞覆盖区域的定量和相关统计分析的图表。数据表示为平均值±标准偏差：**p<0.01(n＝3)。
图24示出了外植的移植物的检查的结果。显示了在植入后6周，未处理的移植物和LXW7处理的移植物的外侧周围的新毛细血管形成的图像。还显示了用于内皮细胞(EC)标记物CD31的LXW7处理的移植物的横截面的免疫染色图像。显示的图表绘制了不同时间点的移植物的通畅率，每组在每个时间点包括6只动物。
图25示出了图24的外植的移植物的腔表面的正面DAPI染色的图像。DAPI染色显示对照移植物(左图)的腔表面上的细胞少于LXW7处理的移植物(右图)。并排比较了植入后的三个时间点(1周、2周、6周)。
图26示出了移植物的近端、中间和远端部分的CD31和CD34的正面免疫染色的图像。植入后1周，未处理的移植物(A-C)、LXW7处理的移植物(D-F)。(G-L)植入后2周，未处理的移植物(G-I)，LXW7处理的移植物(J-L)。(M-R)植入后6周，未处理的移植物(M-O)，LXW7处理的移植物(P-R)。
发明详述
I.概述
本发明提供了包含聚合物和环状肽配体的支架。肽配体增加内皮细胞和/或祖细胞与支架的附着。本发明还提供了包含所提供的支架的工程化组织。本发明还提供了通过植入所提供的支架来改善内皮细胞和/或祖细胞的内皮化和血管形成以在对象中进行组织再生和修复对象的骨缺损的方法。
II.定义
术语“支架”是指提供适于细胞培养、组织工程化或组织再生的三维结构的基质。支架的结构可以具有例如，支架(stent)、分流器、贴片、移植物或植入物的形式。可以修饰支架以促进细胞募集、粘附或增殖。示例性修饰包括但不限于，掺入一种或多种细胞粘附促进剂、表面涂层或官能团。
术语“氨基酸”是指天然存在的α-氨基酸及其立体异构体，以及非天然氨基酸及其立体异构体。氨基酸的“立体异构体”是指氨基酸的镜像异构体，例如L-氨基酸或D-氨基酸。例如，天然存在的氨基酸的立体异构体是指天然存在的氨基酸的镜像异构体，即D-氨基酸。
氨基酸在本文可以通过它们通常已知的三个字母符号或由IUPACIUB生物化学命名委员会推荐的一个字母符号来表示。例如，L-氨基酸在本文可以通过其通常已知的三个字母符号表示(例如，Arg用于L-精氨酸)或通过大写字母一个字母氨基酸符号表示(例如，R用于L-精氨酸)。D-氨基酸在本文可以通过其通常已知的三个字母符号表示，其中“D”作为前缀(例如DArg。D-Arg或DArg用于D-精氨酸)或通过小写字母一个字母氨基酸符号表示(例如，r用于D-精氨酸)。
氨基酸可以通过几种性质中的至少一种来表征。例如，氨基酸可以是碱性的、酸性的、极性的或疏水的。碱性氨基酸是在pH值低于pKa时具有碱性或带正电荷侧链的氨基酸，并且包括但不限于Lys、Arg、HoArg、Agp、Agb、Dab、Dap和Orn及其立体异构体。酸性氨基酸是在生理pH下具有酸性或带负电侧链的氨基酸，并且包括但不限于Asp、Glu、Aad、Bec及其立体异构体。碱性氨基酸通常可以用符号“X+”表示，并且酸性氨基酸用“X-”表示。极性氨基酸通常是指具有极性和不带电荷的侧链的氨基酸，并且包括但不限于Asn、Ser、Thr、Gln。类似地，疏水性氨基酸通常是指具有疏水侧链的氨基酸，并且包括但不限于Val、Leu、Ile、Met和Phe。本领域技术人员将理解，其它碱性和酸性氨基酸是本领域已知的。
关于氨基酸序列，本领域技术人员将认识到，肽、多肽或蛋白质序列的单个替换、添加或删除是“保守修饰的变体”，其改变、添加或删除单个氨基酸或编码序列中的较少百分比的氨基酸，其中改变导致用化学上相似的氨基酸替换氨基酸。化学上相似的氨基酸包括但不限于天然存在的氨基酸，例如L-氨基酸，诸如D-氨基酸的天然存在的氨基酸的立体异构体和非天然氨基酸例如氨基酸类似物、氨基酸模拟物、合成氨基酸、N-取代的甘氨酸和N-甲基氨基酸。
提供功能相似的氨基酸的保守替换表是本领域熟知的。例如，可以进行替换，其中脂肪族氨基酸(例如，G、A、I、L或V)被该基团的另一成员替换。类似地，脂肪族极性不带电荷基团例如C、S、T、M、N或Q可以被该基团的另一个成员替换；以及碱性残基，例如K、R或H，可以彼此替换。在一些实施方案中，具有酸性侧链的氨基酸(例如E或D)可以分别被其不带电荷的对应物(例如Q或N)替换；或者反之亦然。以下八组中的每一组包含彼此是保守替换的其它示例性氨基酸：
1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、缬氨酸(V)；
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；
7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；以及
8)半胱氨酸(C)、蛋氨酸(M)
(参见例如，Creighton,Proteins,1984)
术语“肽”是指由肽键连接的单链D-或L-氨基酸或者D-和L-氨基酸的混合物组成的化合物。通常，肽的长度为约2个至约50个氨基酸。优选地，本发明的肽的长度为约2个至约25个氨基酸，更优选地长度为3个至20个氨基酸，并且最优选地长度为3个至10个氨基酸。
术语“生物聚合物”是指天然存在的聚合物，或与生物系统相容或模拟天然存在的聚合物的合成聚合物。例如但不限于，本发明的生物聚合物包括寡糖、蛋白质、聚酮、类肽、水凝胶、诸如聚(乙二醇)的聚(二醇)和聚乳酸。
术语“配体”是指选择性地、共价地或非共价地与另一个特定分子或分子的特定部分结合的分子。
术语“结合”包括任何物理或化学连接或紧密缔合，其可以是永久的或暂时的。
术语“非共价相互作用”是指紧密接近的两个物质不形成共价键的相互作用。非共价相互作用的类型包括例如，氢键、范德华相互作用、配位、π-π相互作用、疏水相互作用和亲水相互作用。
术语“共价相互作用”是指紧密接近的两个物质形成共价键的相互作用。
术语“αvβ3整联蛋白”是指玻连蛋白的受体。αvβ3整联蛋白用作显示精氨酸甘氨酸天冬氨酸(RGD)三肽序列的多种细胞外基质蛋白的受体。这些蛋白质包括玻连蛋白、纤连蛋白、纤维蛋白原、层粘连蛋白、胶原蛋白、Von Willibrand因子。
术语“对象”是指动物，例如哺乳动物，包括但不限于灵长类动物(例如，人)、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、大鼠、小鼠等。在某些实施方案中，对象是人。
术语“烷基”是指具有所示碳原子数的直链或支链饱和脂肪族基团。例如，C1-C6烷基包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、己基等。其它烷基包括但不限于庚基、辛基、壬基、癸基等。烷基可包括任何数量的碳，例如1至2、1至3、1至4、1至5、1至6、1至7、1至8、1至9、1至10、2至3、2至4、2至5、2至6、3至4、3至5、3至6、4至5、4至6和5至6。烷基通常是单价的，但可以是二价的，例如当烷基将两个部分连接在一起时。
术语“烷氧基”是指具有连接烷基与连接点的氧原子的烷基。烷氧基包括，例如，甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、2-丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、己氧基等。烷氧基可以进一步被其中描述的各种取代基取代。例如，烷氧基可以被卤素取代以形成“卤代烷氧基”。
如本文所用，术语“杂烷基”是指具有1个至3个杂原子(例如N、O和S)的烷基。其它杂原子也可以是有用的，包括但不限于B、Al、Si和P。杂原子也可以被氧化，例如但不限于-S(O)-和-S(O)2-。例如，杂烷基可以包括醚、硫醚和烷基-胺。
如本文所用，术语“卤代烷基”是指其中一些或所有氢原子被卤素原子取代的如上定义的烷基。卤素(卤代)优选表示氯或氟，但也可以是溴或碘。例如，卤代烷基包括三氟甲基、氟甲基、1,2,3,4,5-五氟-苯基等。术语“全氟”定义具有至少两个被氟取代的可用氢的化合物或基团。例如，全氟苯基是指1,2,3,4,5-五氟苯基，全氟甲烷是指1,1,1-三氟甲基，并且全氟甲氧基是指1,1,1-三氟甲氧基。
如本文所用，术语“卤代-烷氧基”是指具有至少一个卤素的烷氧基。卤代烷氧基如针对烷氧基所定义，其中一些或所有氢原子被卤素原子取代。烷氧基可以被1、2、3或更多个卤素取代。当所有的氢被卤素取代时，例如被氟取代时，化合物是全取代的，例如全氟化的。卤代烷氧基包括但不限于：三氟甲氧基、2,2,2-三氟乙氧基、全氟乙氧基等。
如本文所用，术语“卤素”是指氟、氯、溴和碘。
如本文所用，术语“环烷基”是指饱和或部分不饱和的单环、稠合二环或桥接多环组合，其含有3个至12个环原子，或所示的原子数。单环包括例如环丙基、环丁基、环丙基、环戊基、环己基和环辛基。二环和多环包括，例如，降冰片烷、萘烷和金刚烷。例如，C3-8环烷基包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环辛基和降冰片烷。
如本文所用，术语“烷基-环烷基”是指具有烷基组分和环烷基组分的基团，其中烷基组分将环烷基组分连接至连接点。烷基组分如上所定义，但是烷基组分是至少二价的以连接环烷基组分和连接点。在某些情况下，烷基组分可以不存在。环烷基组分如在本文所定义。烷基-环烷基的实例包括亚甲基-环己烷等。
如本文所用，术语“杂环烷基”是指具有3个环成员至约20个环成员和1个至约5个杂原子(例如N、O和S)的环系统。另外的杂原子也可以是有用的，包括但不限于B、Al、Si和P。杂原子也可以被氧化，例如但不限于-S(O)-和-S(O)2-。例如，杂环包括但不限于，四氢呋喃基、四氢噻吩基、吗啉代、吡咯烷基、吡咯啉基、咪唑烷基、咪唑啉基、吡唑烷基、吡唑啉基、哌嗪基、哌啶基、吲哚啉基、奎宁环基和1,4-二氧杂-8-氮杂-螺[4.5]癸-8-基。
如本文所用，术语“烷基-杂环烷基”是指具有烷基组分和杂环烷基组分的基团，其中烷基组分将杂环烷基组分连接至连接点。烷基组分如上所定义，但是烷基组分是至少二价的以连接杂环烷基组分和连接点。在某些情况下，烷基组分可以不存在。杂环烷基组分如上所定义。烷基-杂环烷基的实例包括亚甲基-哌啶基等。
如本文所用，术语“芳基”是指含有6个至16个环碳原子的单环或稠合双环、三环或更大的芳环组合。例如，芳基可以是苯基、苄基或萘基，优选为苯基。“亚芳基”是指来自芳基的二价基团。芳基可以被一个、两个或三个选自烷基、烷氧基、芳基、羟基、卤素、氰基、氨基、氨基-烷基、三氟甲基、亚烷基二氧基和氧基-C2-C3-亚烷基的基团单取代、二取代或三取代；所有这些都任选地进一步被取代，例如如前文所定义的；或者1-萘基或2-萘基，或者1-菲基或2-菲基；亚烷基二氧基是连接在苯基的两个相邻碳原子上的二价取代基，例如亚甲基二氧基或亚乙二氧基。氧基-C2-C3-亚烷基也是连接在苯基的两个相邻碳原子上的二价取代基，例如，氧基亚乙基或氧基亚丙基。氧基-C2-C3-亚烷基-苯基的实例是2,3-二氢苯并呋喃-5-基。
优选的芳基是萘基、苯基或被烷氧基、苯基、卤素、烷基或三氟甲基单取代或二取代的苯基，尤其是苯基或被烷氧基、卤素或三氟甲基单取代或二取代的苯基，并且特别是苯基。
作为R的取代苯基的实例是，例如，4-氯苯-1-基、3,4-二氯苯-1-基、4-甲氧基苯-1-基、4-甲基苯-1-基、4-氨基甲基苯-1-基、4-甲氧基乙基氨基甲基苯-1-基、4-羟乙基氨基甲基苯-1-基、4-羟乙基-(甲基)-氨基甲基苯-1-基、3-氨基甲基苯-1-基、4-N-乙酰氨基甲基苯-1-基、4-氨基苯-1-基、3-氨基苯-1-基、2-氨基苯-1-基、4-苯基-苯-1-基、4-(咪唑-1-基)-苯基、4-(咪唑-1-基甲基)-苯-1-基、4-(吗啉-1-基)-苯-1-基、4-(吗啉-1-基甲基)-苯-1-基、4-(2-甲氧基乙基氨基甲基)-苯-1-基和4-(吡咯烷-1-基甲基)-苯-1-基、4-(苯硫基)-苯-1-基、4-(3-苯硫基)-苯-1-基、4-(4-甲基哌嗪-1-基)-苯-1-基和4-(哌啶基)-苯基和在杂环中任选取代的4-(吡啶基)-苯基。
如本文所用，术语“烷基-芳基”是指具有烷基组分和芳基组分的基团，其中烷基组分将芳基组分连接至连接点。烷基组分如上所定义，但是烷基组分是至少二价的以连接芳基组分和连接点。在某些情况下，烷基组分可以不存在。芳基组分如上所定义。烷基-芳基的实例包括但不限于苄基。
如本文所用，术语“杂芳基”是指含有5个至16个环原子的单环或稠合双环或三环芳环组合，其中1个至4个环原子是各自为N、O或S的杂原子。例如，杂芳基包括吡啶基、吲哚基、吲唑基、喹喔啉基、喹啉基、异喹啉基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、呋喃基、吡咯基、噻唑基、苯并噻唑基、噁唑基、异噁唑基、三唑基、四唑基、吡唑基、咪唑基、噻吩基或任何其它被取代的基团，特别是被例如烷基、硝基或卤素单取代或二取代的基团。吡啶基表示2-吡啶基、3-吡啶基或4-吡啶基，有利地是2-吡啶基或3-吡啶基。噻吩基表示2-噻吩基或3-噻吩基。喹啉基优选地表示2-喹啉基、3-喹啉基或4-喹啉基。异喹啉基优选地表示1-异喹啉基、3-异喹啉基或4-异喹啉基。苯并吡喃基、苯并硫代吡喃基分别优选地表示3-苯并吡喃基或3-苯并硫代吡喃基。噻唑基优选地表示2-噻唑基或4-噻唑基，并且最优选为4-噻唑基。三唑基优选为1-(1,2,4-三唑基)、2-(1,2,4-三唑基)或5-(1,2,4-三唑基)。四唑基优选为5-四唑基。
优选地，杂芳基是吡啶基、吲哚基、喹啉基、吡咯基、噻唑基、异噁唑基、三唑基、四唑基、吡唑基、咪唑基、噻吩基、呋喃基、苯并噻唑基、苯并呋喃基、异喹啉基、苯并噻吩基、噁唑基、吲唑基、或任何取代的基团，尤其是单取代的或二取代的。
类似地，芳基和杂芳基的取代基是变化的并且选自：-卤素、-OR’、-OC(O)R’、-NR’R”、-SR’、-R’、-CN、-NO2、-CO2R’、-CONR’R”、-C(O)R’、-OC(O)NR’R”、-NR”C(O)R’、-NR”C(O)2R’、,-NR’-C(O)NR”R”’、-NHC(NH2)＝NH、-NR’C(NH2)＝NH、-NH-C(NH2)＝NR’、-S(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)2NR’R”、-N3、-CH(Ph)2、全氟(C1-C4)烷氧基和全氟(C1-C4)烷基，其数量为0至芳环系统上的开放化合价的总数；并且其中R’、R”和R”’独立地选自氢、(C1-C8)烷基和杂烷基、未取代的芳基和杂芳基、(未取代的芳基)-(C1-C4)烷基和(未取代的芳基)氧基-(C1-C4)烷基。
如本文所用，术语“烷基-杂芳基”是指具有烷基组分和杂芳基组分的基团，其中烷基组分将杂芳基组分连接至连接点。烷基组分如上所定义，但是烷基组分是至少二价的以连接杂芳基组分和连接点。在某些情况下，烷基组分可以不存在。杂芳基组分如本文所定义。烷基-杂芳基的实例包括亚甲基-吡啶基等。
III.支架
本发明提供了几种促进内皮细胞和/或内皮祖细胞附着的支架。支架包含聚合物和共价固定在聚合物表面上的肽配体。选择肽配体以增加内皮细胞和/或内皮祖细胞附着至支架，并且是式I的化合物：
X2、X6和X7可以各自独立地为氨基酸，其中X2、X6和X7中的至少一个是D-氨基酸。式I的R1可以是H、C1-6烷基、-C(O)R1a或L-A。R1a可以是C1-6烷基、C1-6杂烷基、C1-6烷基-NH2、C1-6烷基-C(O)N(H)C1-6杂烷基、环烷基、C1-6烷基-环烷基、杂环烷基、C1-6烷基-杂环烷基、芳基、C1-6烷基-芳基、杂芳基或C1-6烷基-杂芳基，其中环烷基、杂环烷基、杂芳基和芳基任选地被卤素、-NO2、-OH、-CN、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6卤代烷基或C1-6卤代烷氧基取代。R2可以是H、C1-6烷基或L-A。基团L是连接基团，并且基团A是活性剂。
式I的化合物可包括碱性氨基酸，例如具有带正电荷侧链的氨基酸。碱性氨基酸的非限制性实例是Lys、Arg、HoArg、Agp、Agb、Dab、Dap和Orn，及其立体异构体。式I的化合物还可以包括酸性氨基酸，例如具有带负电荷的侧链的氨基酸。酸性氨基酸的非限制性实例是Asp、Glu、Aad和Bec，及其立体异构体。碱性氨基酸通常可以通过符号“X+”表示并且酸性氨基酸通过“X-”表示。本领域技术人员将理解，其它碱性和酸性氨基酸是本领域已知的。
可用于本发明化合物的氨基酸包括天然存在的氨基酸、以及后来被修饰的那些氨基酸，例如γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸，以及非天然氨基酸。天然存在的α氨基酸包括(显示相应的3个字母和单个字母代码)但不限于丙氨酸(Ala，A)、半胱氨酸(Cys，C)、天冬氨酸(Asp，D)、谷氨酸(Glu，E)、苯丙氨酸(Phe，F)、甘氨酸(Gly，G)、组氨酸(His，H)、异亮氨酸(Ile，I)、精氨酸(Arg，R)、赖氨酸(Lys，K)、亮氨酸(Leu，L)、蛋氨酸(Met，M)、天冬酰胺(Asn，N)、脯氨酸(Pro，P)、谷氨酰胺(Gln，Q)、丝氨酸(Ser，S)、苏氨酸(Thr，T)、缬氨酸(Val，V)、色氨酸(Trp，W)和酪氨酸(Tyr，Y)。天然存在的α-氨基酸的立体异构体包括但不限于D-丙氨酸(DAla，a)、D-半胱氨酸(DCys，c)、D-天冬氨酸(DAsp，d)、D-谷氨酸(DGlu，e)、D-苯丙氨酸(DPhe，f)、D-组氨酸(DHis，h)、D-异亮氨酸(DIle，i)、D-精氨酸(DArg，r)、D-赖氨酸(DLys，k)、D-亮氨酸(DLeu，l)、D-蛋氨酸(DMet，m)、D-天冬酰胺(DAsn，n)、D-脯氨酸(DPro，p)、D-谷氨酰胺(DGln，q)、D-丝氨酸(DSer，s)、D-苏氨酸(DThr，t)、D-缬氨酸(DVal，v)、D-色氨酸(DTrp，w)和D-酪氨酸(DTyr，y)。
非天然氨基酸包括但不限于L-构型或D-构型的氨基酸类似物、氨基酸模拟物、合成氨基酸、N-取代的甘氨酸和N-甲基氨基酸，其以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用。例如，“氨基酸类似物“是具有与天然存在的氨基酸相同基本化学结构的非天然氨基酸，即与氢、羧基、氨基键合但具有修饰的R(即，侧链)基团的α碳。合适的非天然氨基酸包括但不限于，α-氨基己二酸(Aad)、α-氨基丁酸(Abu)、3-氨基苯甲酸(3Abz)、氮杂环丁烷-2-甲酸(Aca)、1-氨基环丁烷-1-甲酸(Acb)，α-氨基-3-氯-4,5-二氢-5-异唑乙酸(Acdi)、4-氨基-4-羧基-1,1-二氧代-四氢硫代吡喃(Acdt)、1-氨基-1-环己烷甲酸(Ach)、1-氨基环戊烷-1-甲酸(Acp)、1-氨基环丙烷-1-甲酸(Acpc)、4-氨基-4-羧基四氢吡喃(Actp)、8-氨基-1,4-二氧杂螺[4.5]癸烷-8-甲酸(Aecc)、(S)-2-氨基-4-胍基-丁酸(Agb)、烯丙基甘氨酸(Agl)、(S)-2-氨基-3-胍基-丙酸(Agp)、2-氨基庚酸(Aha)、1-氨基-1-(4-羟基环己基)甲酸(Ahch)、α-氨基异丁酸(Aib)、2-氨基茚满-2-甲酸(Aic)、1-氨基-1-(4-酮环己基)甲酸(Akch)、2-氨基辛酸(Aoa)、2-氨基-2-萘基乙酸(Ana)、1-氨基-1-(3-哌啶基)甲酸(3Apc)、1-氨基-1-(4-哌啶基)甲酸(4Apc)、2-氨基-3-(4-哌啶基)丙酸(4App)、高精氨酸(HoArg)、Nα-甲基精氨酸((NMe)Arg)、Nα-甲基天冬氨酸((NMe)Asp)、α-氨基辛二酸(Asu)、(R)-2-氨基-3-(2-羧乙基硫烷基)丙酸(Bec)、4,4'-联苯基丙氨酸(Bipa)、(R)-2-氨基-3-(羧甲基硫烷基)丙酸(Bmc)、4-羧基甲氧基苯丙氨酸(Bmp)、4-苯甲酰基苯丙氨酸(Bpa)、3-苯并噻吩基丙氨酸(Bta)、5H-噻唑并[3,2a]吡啶-3-甲酸(Btd)、β-叔丁基丙氨酸(Bua)、α-叔丁基甘氨酸(Bug)、4-氰基-2-氨基丁酸(Cab)、环丁基丙氨酸(Cba)、环己基丙氨酸(Cha)、高环己基丙氨酸(HoCha)、α-环己基甘氨酸(Chg)、瓜氨酸(Cit)、高瓜氨酸(HoCit)、环丙基丙氨酸(Cpa)、环戊基甘氨酸(Cpeg)、3-羧甲基-1-苯基-1,3,8-三氮杂螺[4,5]癸-4-酮(Cptd)、高半胱氨酸(HoCys)、α,γ-二氨基丁酸(Dbu)、二乙基甘氨酸(Deg)、3,3-二苯基-丙氨酸(Dpa)、二正丙基甘氨酸(Dpg)、α,β-二氨基丙酸(Dap)、α,γ-二氨基丁酸(Dab)，2-呋喃基-丙氨酸(Fua)、高精氨酸(HoArg)、羟基脯氨酸(Hyp)、O-苄基羟基脯氨酸(Hyp(Bzl))、高亮氨酸(HoLeu)、2-茚满基甘氨酸(Ing)、蛋氨酸亚砜(Met(O))、蛋氨酸甲基锍(Met(SMe))、3-(1-萘基)丙氨酸(Nal1)、3-(2-萘基)丙氨酸(Nal2)、3-(羧甲基氨基)丙酸(Nglu)、哌啶甲酸(Nip)、异哌啶甲酸(IsoNip)、正亮氨酸(Nle)、正缬氨酸(Nva)、八氢吲哚-2-甲酸(Oic)、鸟氨酸(Orn)、2-吡啶基丙氨酸(2Pal)、3-(3-吡啶基)丙氨酸(3Pal)、3-(4-吡啶基)丙氨酸(4Pal)、青霉胺(Pen)、高苯丙氨酸(HoPhe)、Nα-甲基苯丙氨酸((NMe)Phe)、2-氯-苯丙氨酸(Phe(2Cl))、α-甲基苯丙氨酸((CαMe)Phe)、3,4-二甲氧基-苯丙氨酸(Phe(3,4-二OMe))、4-羧基苯丙氨酸(Phe(4COOH))、4-硝基苯丙氨酸(Phe(4NO2))、4-三氟甲基-苯丙氨酸(Phe(4CF3))、4-叔丁基-苯丙氨酸(Phe(4tBu))、3,4-二氯-苯丙氨酸(Phe(3,4-二Cl))、苯基甘氨酸(Phg)、(2S,5R)-5-苯基吡咯烷-2-甲酸(Ppca)、炔丙基甘氨酸(Pra)、高脯氨酸(HoPro)、β-高脯氨酸(βHoPro)、2-喹啉基丙氨酸(2Qal)、Nα-甲基甘氨酸(Sar)、高丝氨酸(HoSer)、3-苯乙烯基-丙氨酸(Sta)、牛磺酸(Tau)、4-噻唑基丙氨酸(Tha)、3-(2-噻吩基)丙氨酸(2Thi)、3-(3-噻吩基)丙氨酸(3Thi)、噻唑烷-4-甲酸(Thz)、噻唑烷-2-甲酸(Thz(2COOH))、四氢-异喹啉-3-甲酸(3Tic)、(R)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸(Tic)、3,5-二硝基酪氨酸(Tyr(3,5-二NO2))、3-硝基酪氨酸(Tyr(3NO2))、3,5-二碘酪氨酸(Tyr(diI))和Nα-甲基缬氨酸((NMe)Val)、苯丙氨酸类似物、赖氨酸衍生物，及其立体异构体(参见Liu和Lam，Anal.Biochem.,295:916(2001))。因此，非天然α氨基酸以非天然L-α-氨基酸、非天然D-α-氨基酸或其组合的形式存在。
氨基酸也可以分为碱性、酸性、疏水性和/或极性。本发明的一些合适的碱性氨基酸是Lys、Arg、HoArg、Agp、Agb、Dab、Dap、Orn和及其立体异构体。一些合适的酸性氨基酸是Asp、Glu、Aad、Bec及其立体异构体。疏水性氨基酸包括但不限于Val、Leu、Ile、Met和Phe及其立体异构体。极性氨基酸包括但不限于Asn、Ser、Gln、Thr及其立体异构体。
合适的苯丙氨酸类似物包括但不限于高苯丙氨酸(HoPhe)、苯基甘氨酸(Phg)、3,3-二苯基丙氨酸(Dpa)、4-氨基苯丙氨酸(Phe(4-NH2))、2-甲基苯丙氨酸(Phe(2-Me))、3-甲基苯丙氨酸(Phe(3-Me))、4-甲基苯丙氨酸(Phe(4-Me))、4-叠氮基苯丙氨酸(Phe(4-N3))、2-氟苯丙氨酸(Phe(2-F))、3-氟苯丙氨酸(Phe(3-F))、4-氟苯丙氨酸(Phe(4-F))、2-氯苯丙氨酸(Phe(2-Cl))、3-氯苯丙氨酸(Phe(3-Cl))、4-氯苯丙氨酸(Phe(4-Cl))、2-溴苯丙氨酸(Phe(2-Br))、3-溴苯丙氨酸(Phe(3-Br))、4-溴苯丙氨酸(Phe(4-Br))、2-碘苯丙氨酸(Phe(2-I))、3-碘苯丙氨酸(Phe(3-I))、4-碘苯丙氨酸(Phe(4-I))、2-三氟甲基苯丙氨酸(Phe(2-CF3))、3-三氟甲基苯丙氨酸(Phe(3-CF3))、4-三氟甲基苯丙氨酸(Phe(4-CF3))、2-甲氧基苯丙氨酸(Phe(2-OMe))、3-甲氧基苯丙氨酸(Phe(3-OMe))、2-硝基苯丙氨酸(Phe(2-NO2))、3-硝基苯丙氨酸(Phe(3-NO2))、4-硝基苯丙氨酸(Phe(4-NO2))、2-氰基苯丙氨酸(Phe(2-CN))、3-氰基苯丙氨酸(Phe(3CN))、4-氰基苯丙氨酸(Phe(4-CN))、3,4-二甲氧基苯丙氨酸(Phe(3,4-二Ome))、3,4-二氟苯丙氨酸(Phe(3,4-二F))、3,5-二氟苯丙氨酸(Phe(3,5-二F))、2,4-二氯苯丙氨酸(Phe(2,4-二Cl))、3,4-二氯苯丙氨酸(Phe(3,4-二Cl))、4-苯甲酰基苯丙氨酸(Bpa)、4-羧基苯丙氨酸(Phe(4-COOH))、4,4’-联苯丙氨酸(Bip)、2,3,4,5,6-五氟苯丙氨酸(Phe(F5))、3,4,5-三氟苯丙氨酸(Phe(F3))、4-氯苯基甘氨酸(Phg(4-Cl))、2-氯苯基甘氨酸(Phg(2-Cl))、3-氯苯基甘氨酸(Phg(3-Cl))、4-溴苯基甘氨酸(Phg(4-Br))、2-溴苯基甘氨酸(Phg(2-Br))、3-溴苯基甘氨酸(Phg(3-Br))、4-乙基苯丙氨酸(Phe(4-Et))、4-乙氧基苯丙氨酸(Phe(4-OEt))、4-丁氧基苯丙氨酸(Phe(4-OBu))、O-甲基酪氨酸(Tyr(Me))、O-苄基酪氨酸(Tyr(Bzl))、3,5-二溴酪氨酸(Tyr(diBr))、3,5-二碘酪氨酸(Tyr(diI))、高酪氨酸(HoTyr)、3-氯酪氨酸(Tyr(3Cl))，其立体异构体，及其组合。
赖氨酸(Lys)、鸟氨酸(Orn)和Dbu的合适的衍生物包括但不限于Lys38、Lys27、Lys73、Lys55、Lys28、Lys72、Lys12、Lys123、Lys63、Lys124、Lys82、Lys31、Lys15、Lys125、Lys43、Lys24、Lys5、Lys4、Lys50、Lys81、Orn38、Orn27、Orn73、Orn55、Orn28、Orn72、Orn12、Orn123、Orn63、Orn124、Orn82、Orn31、Orn15、Orn125、Orn43、Orn24、Orn5、Orn4、Orn50、Orn81、Dbu38、Dbu27、Dbu73、Dbu55、Dbu28、Dbu72、Dbu12、Dbu123、Dbu63、Dbu124、Dbu82、Dbu31、Dbu15、Dbu125、Dbu43、Dbu24、Dbu5、Dbu4、Dbu50、Dbu81，其立体异构体，及其组合。参见表1，其中描述了每种赖氨酸衍生物的结构。Orn和Dbu的衍生物类似于赖氨酸衍生物，并且相应的羧酸分别连接至Orn和Dbu的侧链。
合适的N-甲基-氨基酸包括N-甲基-Ala、N-甲基-Cys、N-甲基-Asp、N-甲基-Glu、N-甲基-Phe、N-甲基-Gly、N-甲基-His、N-甲基-Ile、N-甲基-Arg、N-甲基-Lys、N-甲基-Leu、N-甲基-Met、N-甲基-Asn、N-甲基-Gln、N-甲基-Ser、N-甲基-Thr、N-甲基-Val、N-甲基-Trp、N-甲基-Tyr、N-甲基-Acp、N-甲基-Acb、N-甲基-Acpc、N-甲基-Cit、N-甲基-HoCit、N-甲基-Aad、N-甲基-4-Pal、N-甲基-3-Pal、N-甲基-Pra、N-甲基-Aib、N-甲基-Abu、N-甲基-Nva、N-甲基-Dpr、N-甲基-Dbu、N-甲基-Nle、N-甲基-Nal-2、N-甲基-Nal1、N-甲基-Cha、N-甲基-Cpa、N-甲基-Hle、N-甲基-HoSer、N-甲基-Har、N-甲基-Hcy、N-甲基-Chg、N-甲基-Bta、N-甲基-2-Thi、N-甲基-3-Thi、N-甲基-Asu、N-甲基-Acdt、N-甲基-Ahch、N-甲基-Akch、N-甲基-Actp、N-甲基-Tyr(3-NO2)、N-甲基-Ach、N-甲基-3-Apc、N-甲基-4-Apc、N-甲基-4-App、N-甲基-Tha、N-甲基-Aoa、N-甲基-Aha、N-甲基-Orn、N-甲基-Aca、N-甲基-Agl、N-甲基-Cab、N-甲基-2Pal、N-甲基-Cba、N-甲基-HoPhe、N-甲基-Phg、N-甲基-Phe(4-NH2)、N-甲基-4-Phe(4-Me)、N-甲基-Phe(4-F)、N-甲基-Phe(4-Cl)、N-甲基-Phe(2-Br)、N-甲基-Phe(3-Br)、N-甲基-Phe(4-Br)、N-甲基-Phe(3-CF3)、N-甲基-Phe(4-CF3)、N-甲基-Phe(4-NO2)、N-甲基-Phe(4-CN)、N-甲基-Bpa、N-甲基-Phg(4-Cl)、N-甲基-Phg(4-Br)、N-甲基-Tyr(Me)、N-甲基-Lys38、N-甲基-Lys27、N-甲基-Lys73、N-甲基-Lys55、N-甲基-Lys28、N-甲基-Lys72、N-甲基-Lys12、N-甲基-Lys123、N-甲基-Lys63、N-甲基-Lys124、N-甲基-Lys82、N-甲基-Lys31、N-甲基-Lys15、N-甲基-Lys125、N-甲基-Lys43、N-甲基-Lys24、N-甲基-Lys5、N-甲基-Lys4、N-甲基-Lys50、N-甲基-Lys81、N-甲基-Orn38、N-甲基-Orn27、N-甲基-Orn73、N-甲基-Orn55、N-甲基-Orn28、N-甲基-Orn72、N-甲基-Orn12、N-甲基-Orn123、N-甲基-Orn63、N-甲基-Orn124、N-甲基-Orn82、N-甲基-Orn31、N-甲基-Orn15、N-甲基-Orn125、N-甲基-Orn43、N-甲基-Orn24、N-甲基-Orn5、N-甲基-Orn4、N-甲基-Orn50、N-甲基-Orn81、N-甲基-Dbu38、N-甲基-Dbu27、N-甲基-Dbu73、N-甲基-Dbu55、N-甲基-Dbu28、N-甲基-Dbu72、N-甲基-Dbu12、N-甲基-Dbu123、N-甲基-Dbu63、N-甲基-Dbu124、N-甲基-Dbu82、N-甲基-Dbu31、N-甲基-Dbu15、N-甲基-Dbu125、N-甲基-Dbu43、N-甲基-Dbu24、N-甲基-Dbu5、N-甲基-Dbu4、N-甲基-Dbu50、N-甲基-Dbu81，其立体异构体，及其组合。
氨基酸模拟物是具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构但以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的化学化合物。合适的氨基酸模拟物包括但不限于β-氨基酸和γ-氨基酸。在β-氨基酸中，氨基与羧基基团的β-碳原子键合，使得在氨基与羧基之间存在两个碳原子。在γ-氨基酸中，氨基与羧基的γ-碳原子键合使得在氨基与羧基之间存在三个碳原子。对于β-氨基酸或γ-氨基酸，合适的R基团包括但不限于存在于天然存在的氨基酸和非天然氨基酸中的侧链。
N-取代的甘氨酸是基于甘氨酸的非天然氨基酸，其中氨基酸侧链与甘氨酸氮原子连接。合适的氨基酸侧链(例如，R基团)包括但不限于存在于天然存在的氨基酸中的侧链和存在于非天然氨基酸(例如氨基酸类似物)中的侧链。适用于本发明的N-取代的甘氨酸的实例包括但不限于N-(2-氨基乙基)甘氨酸、N-(3-氨基丙基)甘氨酸、N-(2-甲氧基乙基)甘氨酸、N-苄基甘氨酸、(S)-N-(1-苯基乙基)甘氨酸、N-环己基甲基甘氨酸、N-(苯基乙基)甘氨酸、N-(3-苯基丙基)甘氨酸、N-(6-氨基半乳糖基)甘氨酸、N-(2-(3'-吲哚基乙基)甘氨酸、N-(2-(对甲氧基苯基乙基))甘氨酸、N-(2-(对氯苯基乙基)甘氨酸和N-[2-(对羟基苯基乙基))甘氨酸。在本文中称为“类肽”的N-取代的甘氨酸低聚物已显示具有蛋白酶抗性(Miller等人，Drug Dev.Res.,35:2032(1995))。因此，含有至少一种非天然α-氨基酸、D-氨基酸或其组合的类肽在本发明的范围内。
在其它实施方案中，式I的基团R1和R2可各自独立地为H、C1-6烷基或L-A。并且基团L可以为连接基团，以及基团A可以为活性剂。
在其它实施方案中，R1可以是乙酰基、3-氨基丙酰基、Ebes、异丁酰基、戊酰基、环己基乙酰基、5-溴-2-糠酰基、3-苯基丙酰基、对氯苯基乙酰基、4-硝基苯甲酰基、3,5-二羟基苯甲酰基、4-(三氟甲基)苯甲酰基、2-甲基噻唑-4-羰基、烟酰基、2-萘甲酰基或联苯基-4-羰基。
可用于本发明的连接基团包括具有一个或多个不同的反应性官能团的连接基团，其允许诸如肽的部分与螯合剂的共价连接。连接部分具有两个或更多个不同的反应性官能团。在一些情况下，可以使用多价连接基团，并且可经由连接基团连接本发明的多种RGD肽和/或多种活性剂。合适的连接基团包括但不限于可从Pierce Biotechnology,Inc.(Rockford,Il)获得的那些。在本发明的优选实施方案中，连接基团提供羧基用于连接螯合剂和氨基以连接肽。然而，本领域技术人员理解，任何反应性官能团可存在于连接基团上，只要它与待共价连接的部分上的官能团相容。如本文所用，术语“螯合剂-连接基团缀合物”是指与连接基团共价连接的螯合剂。这种螯合剂-连接基团缀合物可以经由连接基团上存在的官能团与肽连接。一些合适的连接基团包括但不限于β-丙氨酸、2,2’-亚乙基二氧基双(乙胺)单琥珀酰胺(Ebes)和双(Ebes)-Lys。其它合适的连接基团包括具有生物素的那些。另外的连接基团可以见于Bioconjugate Techniques,Greg T.Hermanson,AcademicPress，第2版，2008中(通过引用整体并入本文)。
连接基团可以是可裂解的连接基团，其设计用于在特定条件下或在特定环境中进行裂解。这种连接基团的裂解可以例如，被特定的病理信号或特定的酶增强或影响。选择设计用于特定条件的可裂解的连接基团可以允许靶向其中存在这种条件的特定位置。可裂解的连接基团可以对例如碱性pH条件、酸性pH条件、蛋白酶活性、金属蛋白酶活性或还原条件敏感。在一些实施方案中，连接基团可以通过例如二硫化物还原、光裂解或蛋白质消化来裂解。
可以广泛地选择活性剂A。在一些实施方案中，活性剂可以选自药物、诸如抗生素的抗微生物剂、疫苗、适配体、基于人A结构域支架的avimer支架、双体、骆驼科、鲨鱼IgNAR抗体、具有修饰特异性的纤连蛋白III型支架、抗体、抗体片段、维生素和辅因子、多糖、碳水化合物、类固醇、脂质、脂肪、蛋白质、肽、多肽、核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸和核酸(例如，mRNA、tRNA、snRNA、RNAi、微RNA、DNA、cDNA、反义构建体、核酶等及其组合。在一个实施方案中，活性剂可选自蛋白质、肽、多肽、可溶性或细胞结合的物质、细胞外或细胞内的物质、驱动蛋白、分子马达、酶、细胞外基质材料及其组合。在另一个实施方案中，活性剂可选自核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸和核酸(例如，mRNA、tRNA、snRNA、RNAi、DNA、cDNA、反义构建体、核酶等及其组合)。在另一个实施方案中，活性剂可选自类固醇、脂质、脂肪及其组合。例如，活性剂可以与细胞外基质结合，例如当活性剂是透明质酸时。其它活性剂包括诊断剂或治疗剂，例如药物、放射性标记物、显像剂、化学治疗剂和纳米颗粒。在一些实施方案中，活性剂剂可以是生物素。
显像剂是指附着于本发明化合物用于对对象中的肿瘤、器官或组织成像的标记物。成像部分可以共价或非共价附着于化合物。适用于本发明的显像部分的实例包括但不限于放射性核素、生物素、诸如荧光素的荧光团、罗丹明、德克萨斯红、Cy2、Cy3、Cy5或Cy5.5、Alexa 350、Alexa 405、Alexa 488、Alexa 546、Alexa 555、Alexa 568、Alexa 594、Alexa 633、Alexa 647、Alexa 680、R-藻红蛋白、抗体、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、其衍生物，以及其混合物。用于合成本发明化合物作为生物素缀合物或作为DOTA缀合物的示例性方法分别提供在实施例12和13中。本领域技术人员将知道使特定显像部分与本发明化合物缀合的其它合适方法。
放射性标记物是指显示放射性的核素。“核素”是指由其原子序数、原子质量和能量状态确定的一类原子，例如碳14(14C)。“放射性”是指辐射，包括由放射性物质发射的α粒子、β粒子、核子、电子、正电子、中微子和γ射线。适用于本发明的放射性核素包括但不限于氟18(18F)、磷32(32P)、钪47(47Sc)、钴55(55Co)、铜60(60Cu)、铜61(61Cu)、铜62(62Cu)、铜64(64Cu)、铜67(67Cu)、镓66(66Ga)、镓67(67Ga)、镓68(68Ga)、铷82(82Rb)、钇86(86Y)、钇87(87Y)、钇90(90Y)、锶89(89Sr)、铑105(105Rh)、银111(111Ag)、铟111(111In)、碘123(123I)、碘124(124I)、碘125(125I)、碘131(131I)、锡117m(117mSn)、锝99m(99mTc)、钷149(149Pm)、钐153(153Sm)、钬166(166Ho)、镥177(177Lu)、铼186(186Re)、铼188(188Re)、铊201(201Tl)、砹211(211At)和铋212(212Bi)。如本文所用，117mSn和99mTc中的“m”代表亚态。此外、天然存在的放射性元素例如铀、镭和钍，通常代表放射性同位素的混合物，是放射性核素的合适实例。67Cu、131I、177Lu和186Re是β和γ发射放射性核素。212Bi是α和β发射放射性核素。211At是α发射放射性核素。32P、47Sc、89Sr、90Y、105Rh、111Ag、117mSn、149Pm、153Sm、166Ho和188Re是β发射放射性核素的实例。67Ga、111In、99mTc和201Tl是γ发射放射性核素的实例。55Co、60Cu、61Cu、62Cu、66Ga、68Ga、82Rb和86Y是正电子发射放射性核素的实例。64Cu是β和正电子发射放射性核素。
可用于本发明的纳米颗粒包括尺寸为1nm至1000nm的颗粒。纳米颗粒包括但不限于珠、金属颗粒或在某些情况下可以是胶束、脂质体或其它他囊泡，或树枝状分子。其它纳米颗粒包括碳纳米管和量子点。纳米颗粒可以用诊断剂和/或治疗剂填充。
在一些实施方案中，式I的基团X2可以是Gly、Ala、Sar或β-丙氨酸、及其立体异构体。类似地、基团X6可以是Val、Leu、Ile、Met、Phe、Asn、Glu、Gln、His、Lys、Arg、Asp、Gly、Ala、Ser、Thr、Tyr、Trp、Pro、Aad、Bec、Bmc、Bmp、Phe(4COOH)、Hyp、HoSer、Tha、Ahch、Actp、Akch、Tyr(二I)、Trp、Thz、2Thi、3Thi、Cit、HoCit、Aib、Nglu或Fua及其立体异构体。此外、基团X7可以是Val、Leu、Ile、Met、Phe、Asn、Glu、Gln、His、Lys、Arg、Asp、Gly、Ala、Ser、Thr、Tyr、Trp、Pro、Bmp、HoSer、Nglu、HoCit、Bec、Aad、Hyp、Ahch、Phe(4COOH)、Akch、Aecc、Abu、Phe(3,4-二OMe)、Cpa、2Thi、3Thi、Thz、Phg、Phe(4-NO2)、Nle、(NMe)Phe、Aic、Chg、Bta、Bpa、Nal2、Nal1、Tic、Ppca、Cha、Bipa、Deg、Dpg、Acpc、Bmc、Cit、Sar、Tha、Pra、Actp、Aib、Agl、Acbc、Fua、Nva、Trp、Bug、Ach、(NMe)Val、Cpeg、(CαMe)Phe、Tyr(diI)、Phe(2-Cl)、Bua、HoPhe、HoLeu、Sta、Ing、Phe(4-CF3)、Oic、Dpa、Phe(4-t-Bu)、HoCha或Phe(3,4-二Cl)及其立体异构体。在其它实施方案中、基团X2、X6和X7中的每一个可以是D-氨基酸。
在其它实施方案中，本发明支架的肽配体可具有式Ia：
式Ia的基团R1和R2如上所述。在一些实施方案中，基团X6可以是DSer、DAsp、Ahch、Bmp、DGlu、Nglu或DCit，并且基团X7可以是DPhe、DGlu、DSer、DBug、DBta、DVal、DAglDPra、D(NMe)Val、D(CαMe)Val、DAbu、DIng、DIle、Actp、DTha、DAsp、DNal1或Ppca。在一些其它实施方案中，基团X6可以是DAsp或DSer，并且基团X7可以是DGlu、DPhe、DSer、DVal、DBug或DBta。
式Ia的R1和R2可各自独立地为H或C1-6烷基。在一些实施方案中，R1是H。在一些实施方案中，R2是H。在一些实施方案中，R1和R2都是H。
式Ia的X6可以是DSer、DAsp、DGlu或DCit。式Ia的X7可以是DPhe、DGlu、DSer、DBug、DBta、DVal、DAgl、DPra、D(NMe)Val、D(CαMe)Val、DAbu、DIng、DIle、DTha、DAsp或DNal1。在一些实施方案中，X6是DAsp和DSer。在一些实施方案中，X7是DGlu、DPhe、DSer、DVal、DBug或DBta。
在另一实施方案中，本发明的肽配体可以是cGRGDsfc、cGRGDdfc、cGRGDsec、cGRGDdsc、cGRGDd-DBug-c、cGRGDd-DBta-c、cGRGDd-DBta-c、cGRGDdvc、CGRGDdvc、cGRGDdvC、CGRGDdvC、DPen-GRGDdv-DPen、DPen-GRGDdvc、cGRGDdv-DPen、Ac-cGRGDdvc、(β-丙氨酸)-cGRGDdvc、(Ebes)-cGRGDdvc、caRGDdvc、c-Sar-RGDdvc、c-β-丙氨酸-RGDdvc、cG-HoArg-GDdvc、cG-Agp-GDdvc、cG-Agp-GEdvc、cGRGDd-DAgl-c、cGRGDd-DPra-c、cGRGDd-DBug-c、cGRGDd-D(NMe)Val-c、cGRGDd-D(CαMe)Val-c、cGRGDd-DAbu-c、CGRGDd-Ding-c、c-Sar-RGD-Ahch-ic、c-Sar-RGD-Ahch-DBug-c、cGRGDd-DAgl-C、C-Sar-RGDd-DPra-C、C-Sar-RGDd-Actp-C、c-Sar-RGDd-DPra-C、c-Sar-RGDd-Actp-C、CGRGDd-DTha-C、cGRGDd-DPra-C、cGRGDd-Actp-C、c-Sar-RGD-Ahch-iC、c-Sar-RGD-Ahch-DBug-C、C-Sar-RGD-Bmp-dC、CGRGDe-Ppca-c、cGRGD-Nglu-Ppca-c、cGRGDd-DNal1-c或cGRGDd-DBta-c。在其它实施方案中，本发明的化合物可以是cGRGDsfc、cGRGDdfc、cGRGDsec、cGRGDdsc、cGRGDdvc、cGRGDd-DBug-c或cGRGDd-DBta-c。
在另一实施方案中，本发明的肽配体可以是cGRGDsfc、cGRGDdfc、cGRGDsec、cGRGDdsc、cGRGDdvc、CGRGDdvc、cGRGDdvC、CGRGDdvC、、caRGDdvc、c-Sar-RGDdvc、c-β-丙氨酸-RGDdvc、cGRGDd-DAgl-c、cGRGDd-DPra-c、cGRGDd-DBug-c、DPen-GRGDdv-DPen、DPen-GRGDdvc、cGRGDdv-DPen、cGRGDd-D(NMe)Val-c、cGRGDd-D(CαMe)Val-c、cGRGDd-DAbu-C、cGRGDdic、CGRGDd-Ding-c、c-Sar-RGD-Ahch-ic、c-Sar-RGD-Ahch-DBug-c、cGRGDd-DAgl-C、C-Sar-RGDd-DPra-C、C-Sar-RGDd-Actp-C、c-Sar-RGDd-DPra-C、c-Sar-RGDd-Actp-C、CGRGDd-DTha-C、cGRGDd-DPra-C、cGRGDd-Actp-C、c-Sar-RGD-Ahch-iC、c-Sar-RGD-Ahch-DBug-C、C-Sar-RGD-Bmp-dC、CGRGDe-Ppca-c、CGRGD-Nglu-Ppca-c、CGRGDd-DNal1-C、CGRGD-D3Thi-Ppca-c、cGRGDd-DBta-c、cG-HoArg-GDdvc、cG-(NMe)Arg-GDdvc、cGR-Sar-Ddvc、cGRG-(NMe)Asp-dvc、cG-Agp-GDdvc、cG-Agp-GEdvc、cGRGDsdC、cGRGDd-Ding-c、cGRGDd-DNal1-c、cGRGDd-DNal2-c、cGRGDd-D3Thi-c、cGRGDd-D2Thi-c、cGRGDdwc、cGRGDd-DTha-c、cGRGD-DCit-Ppca-c、cGRGDe-Ppca-c、cGRGD-NGlu-Ppca-c、cGRGD-DCit-DBta-c、cGRGD-DBec-Ahch-c或cGRGD-DBec-DPra-c。在一些实施方案中，肽配体是cGRGDdvc(LXW7)。
支架的肽配体用于增加内皮细胞和/或内皮祖细胞的附着。肽配体可以对细胞表面整联蛋白具有亲和力。整联蛋白可以调节细胞的滞留、调动、血管形成或内皮化。在一些实施方案中，肽配体结合整联蛋白α4β1、α5β1、α6β1、αvβ3和αvβ5中的一种或多种。在一些实施方案中，肽配体结合细胞上的整联蛋白αvβ3。
所提供的支架优选具有良好的生物相容性、易成型、良好的降解、骨传导性、适当的孔径和孔隙率以及合适的机械强度的期望特性。有利的是，支架材料易于雕刻或模制以加工成各种尺寸和形状。如果支架的降解产物对植入对象产生尽可能小的负面影响也是有利的。具有合适的孔径和孔隙率可以允许植入细胞所需的营养物和其它因子的良好质量传输。合适的机械强度可以防止周围组织或纤维组织向内生长对支架的损害。支架可以是例如，磷酸钙陶瓷或聚合物。支架可包括多个层，每个层具有不同的组成和功能。
支架可包括生物相容性聚合物或生物聚合物。支架可以是医疗装置，并且支架的聚合物可以是医疗装置或装置本身的组件。支架或装置可适用于腔内或腔外定位或操作。在一些实施方案中，聚合物是羟磷灰石。在一些实施方案中，支架的聚合物是聚(L-乳酸)(PLLA)、聚己内酯(PCL)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、羟磷灰石(HA)、聚(丙交酯-共-ε-己内酯)(PLCL)、聚四氟乙烯(PTFE)、膨胀型聚四氟乙烯(ePTFE)或其组合。在一些实施方案中，聚合物是ePTFE。在一些实施方案中，聚合物是杂化聚合物或共聚物。
可用于本发明的生物聚合物可具有在多个相似官能团存在下可与互补官能团进行化学选择性连接的官能团。例如但不限于，伯醇可以在仲醇存在下选择性地反应。以类似的方式，多胺生物聚合物可具有伯胺和仲胺，其中仅伯胺与适当的互补官能团进行化学选择性连接。其中一种的反应性优于另一种的其它类似的官能团可以是醛和酮。在一些情况下，生物聚合物本身不包含用于化学选择性连接的官能团，但随后可以经用于化学选择性连接的官能团衍生化。
支架的聚合物可进一步包括涂层。肽配体可以共价连接至涂层。在一些实施方案中，涂层是聚对二甲苯聚合物。聚对二甲苯聚合物可通过气相沉积方法共形地涂覆在聚合物上。在一些实施方案中，在用聚对二甲苯涂覆之前使用微波等离子体或紫外辐射活化聚合物。在一些实施方案中，聚对二甲苯聚合物是聚对二甲苯A、聚对二甲苯C、聚对二甲苯D、聚对二甲苯HT或聚对二甲苯N。聚对二甲苯聚合物也可以是官能化聚对二甲苯，例如三环[8.2.2.24,7]十六-4,6,10,12,13,15-己烯-5-甲醛(CAS：729-30-6)、三环[8.2.2.24,7]十六-4,6,10,12,13,15-己烯-5-胺(CAS：10122-95-9)、三环[8.2.2.24,7]十六-4,6,10,12,13,15-己烯-5-甲酸(CAS：18931-39-0)，或用醛基、酯基、醇基、酸酐基、炔基、苯基乙酰基或其它官能团中的一种或多种官能化的其它聚对二甲苯。医疗装置和植入物中聚对二甲苯涂层的进一步描述可以见于例如Kuppusami和Oskouei(2015)UniversalJ.Biomed.Eng.2015:9，以及Tan和Craighead(2010)Materials3:1803中，两者都是为了所有目的整体并入。
可以将细胞在植入对象之前或之后接种到支架上。在一些实施方案中，内皮细胞、内皮祖细胞和/或骨原细胞接种在支架上。在一些实施方案中，用来自脂肪干细胞(ASC)的细胞接种支架。在一些实施方案中，ASC衍生的内皮细胞和成骨细胞用于依次接种支架。ASC衍生的内皮细胞可以在支架的骨构建体内形成血管网络，而ASC衍生的成骨细胞可以增加骨再生。
IV.工程化组织
组织工程化方法可以包括将具有体外生物相容性的支架吸附在正常组织细胞上，所述支架已经接种了所需的细胞类型。然后，这种多孔支架可以降解并且被身体吸收。该过程的结果可包括植入被递送到身体损伤部位的细胞以及复合生物可降解材料。优选的是，诸如支架的材料也促进植入细胞的生长、繁殖和/或分化。这可以使工程组织所需的形态和功能逐渐形成，以用作受损组织和器官的替代物，实现康复和重建的目的。在一些实施方案中，本发明提供了包含本发明支架的工程化组织。
V.改善内皮化和血管形成的方法
本发明提供了几种改善工程化组织的内皮化和血管形成的方法。该方法包括将本发明的支架植入对象。细胞可包括内皮细胞和/或内皮祖细胞。在一些实施方案中，该方法包括植入具有肽配体的支架，所述肽配体增加内皮细胞和/或内皮祖细胞向支架的募集。在一些实施方案中，该方法包括植入具有肽配体的支架，所述肽配体增加在支架上的移植的内皮细胞和/或内皮祖细胞的增殖和整合。
VI.修复骨缺损的方法
骨缺损的治疗是一个非常常见的临床问题，因为骨缺损会给患者带来很大的不便，严重影响他或她的日常生活。临床治疗方法通常包括自体骨移植或同种异体移植，尽管后者存在传播疾病和由于供体的免疫排斥的有限风险。使用组织工程化方法制备骨替代物可以避免这些问题中的一些并且促进骨再生以治疗骨缺损。
大而复杂的骨缺损可能超过身体的再生能力，并且这种缺损的手术修复仍然是一个特殊的挑战。目前对大的骨缺损的手术治疗涉及使用自体骨移植物或同种异体材料。虽然这些方法在很大程度上是成功的，但它们具有固有的缺点。例如，同种异体材料在排斥、感染方面存在问题，并且自体骨移植物通常在可用性和供体部位发病率方面受到限制。因此，迫切需要一种适合于目前可用的骨修复技术的替代方案。组织工程化的骨构建体具有克服当前方法的缺点的潜力。然而，大而复杂的构建体的存活依赖于用于有效和即时的营养物递送的复杂的血管网络。在没有血管网络的情况下，远离血液供应的接种细胞死亡，最终危及整个构建体的存活。
本发明提供了几种修复对象的骨缺损的方法。该方法包括将本发明的支架植入对象。在一些实施方案中，骨缺损是颅骨缺损。在一些实施方案中，在将支架植入对象之前，将内皮细胞和/或成骨细胞接种在支架上。在一些实施方案中，在将支架植入对象之后，将内皮细胞和/或成骨细胞接种在支架上。
VII.涂层
本发明还提供了几种用于修饰支架和医疗装置的涂层。涂层可以促进其所应用的表面的内皮化，从而增加支架上细胞的再生或生长潜力。涂覆的表面可以是任何材料，包括聚合物、塑料、金属或玻璃。例如，支架可以是血管移植物的形式，并且血管移植物的涂层可以使得能够在移植物腔表面上产生自我再生内皮。涂层还可以应用于各种血管内装置，包括心脏瓣膜和导管。
涂层产品可用于血液透析，这是一种功能性血管通路必需的程序。最常见的血液透析血管通路的当前形式涉及使用动静脉PTFE透析移植物。然而，由于诸如血栓形成、狭窄和感染的并发症，这些移植物可能具有高失败率。通过促进对移植物支架形成功能性内皮，所提供的涂层可以增加或改善移植物的几种有益性质。这些包括抗粘附性质、抗炎和免疫应答、细胞增殖促进、平滑肌张力调节和止血调节分子产生。
所提供的涂层包括上述任何肽配体。在一些实施方案中，涂层包括配体LXW7。涂层还包括聚合物，例如聚对二甲苯聚合物。聚对二甲苯是与可植入的医疗装置和移植物相关的最新涂层聚合物，因为它在柔韧性和对植入物表面的持久体内粘附方面具有优异的机械性质。聚对二甲苯可以通过化学气相沉积(CVD)方法共形地涂覆至不规则的基底上，并且是化学惰性的、不可生物降解的，并且基本上与基底无关。由于其生物相容性，FDA已批准聚对二甲苯作为用于涂覆医疗装置的第VI类聚合物。在一些实施方案中，聚对二甲苯聚合物是聚对二甲苯C、聚对二甲苯D、聚对二甲苯HT或聚对二甲苯N。在一些实施方案中，首先用聚对二甲苯聚合物涂覆该装置或支架。聚对二甲苯可以在涂覆之前或之后被官能化。在使聚对二甲苯官能化之后，它可以与诸如LXW7的配体缀合。在一些实施方案中，在将该聚合物用于涂覆支架或装置之前，将配体与涂层聚合物缀合。在一些实施方案中，在涂覆之前使用微波等离子体活化支架或装置表面。在一些实施方案中，支架或装置表面暴露于紫外线辐射，诱导表面和涂层的光化学共价偶联。在一些实施方案中，涂覆的表面通过在涂覆涂层之后暴露于例如高温或紫外线辐射进行固化。在一些实施方案中，在涂覆之前进行的活化过程中将官能团添加到支架或装置表面。然后将移植物聚合物加入到官能化表面中并且用于支持进一步的聚合物生长，从而产生涂层聚合物。
可以使用任何合适的化学方法使涂层或支架聚合物官能化，以促进聚合物彼此共价连接，或者配体或连接的连接基团与任一聚合物的共价连接。例如，聚合物可以用醛基官能化，醛基可以与配体或连接基团上的伯胺反应。聚合物可以用环氧丙氧基官能化，环氧丙氧基可以与配体或连接基上的胺反应。聚合物可以用琥珀酰亚胺基官能化，琥珀酰亚胺基可以与配体或连接基上的胺交联。聚合物可以用异氰酸酯基官能化，异氰酸酯基可以共价连接至配体或连接基上的胺上。聚合物可以用马来酰亚胺基官能化，马来酰亚胺基可以与配体或连接基上的硫醇反应。聚合物可以用氯基官能化，氯基可以共价连接到配体或连接基上的醇基。聚合物可以用乙醛酰基官能化，乙醛酰基可以通过肟键或噻唑烷环形成而共价连接至配体或连接基团。聚合物可以用硫酯基官能化，硫酯基可以与配体或连接基的N-末端半胱氨酸形成酰胺键。聚合物可以用醌基官能化，醌基可以与引入配体或连接基团中的环二烯反应。可以类似地应用其它合适的化学物质以使配体或连接基团与聚合物共价缀合。
涂层聚合物的官能化可包括引入炔烃官能团。在一些实施方案中，修饰涂层的聚对二甲苯聚合物以产生炔烃官能化的聚对二甲苯，然后通过点击化学将其共价连接至LXW7-连接基团-叠氮化物。在一些实施方案中，在用炔烃官能化的涂层聚合物(例如，聚对二甲苯)进行涂覆之前，活化(例如，通过微波等离子体)支架或装置的聚合物基质(例如，ePTFE)。该涂层可以通过例如CVD方法。然后，可以将配体-连接基团-叠氮化物(例如，LXW7-连接基团-N3)固定在表面上以完成涂覆。在替代实施方案中，在将涂层涂覆至支架或装置之前，使配体-连接基团-叠氮化物和官能化涂层聚合物缀合。
VIII.实施例
将通过具体实施例更详细地描述本发明。提供以下实施例仅用于说明目的，并不旨在以任何方式限制本发明。本领域技术人员将容易地认识到，可以改变或修改各种非关键参数以产生基本上相同的结果。
实施例1.细胞培养和血小板分离
如先前所述，从人脐带血中分离出内皮细胞集落形成细胞(ECFC)，一种EPC亚型，通常也称为向外生长内皮细胞(OEC)(Williams等人，(2015)PloS One10:e0123437；Ingram等人，(2004)Blood104:2752)。从UC Davis脐带血收集项目(UCBCP)获得人脐带血(10U肝素/mL血液)并且用不含钙和镁、pH 7.2(Hyclone)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)1:1进行稀释。将15mL的Ficoll-Paque PLUS(Amersham Biosciences)置于20mL的稀释血液的底部，并且在室温下以2000rpm离心30分钟。收集位于Ficoll与血清之间界面处的浑浊的单核细胞(MNC)层并且分配到含有10mL EBM-2(Lonza)的50-mL锥形管中，并且在室温下以1500rpm离心10分钟。小心吸出上清液，用红细胞裂解缓冲液(eBioscience,Inc.)处理沉淀，然后按照制造商的说明用CD34微珠磁性分选(Miltenyi Biotec GmbH)进行分选。将CD34+细胞接种在大鼠尾胶原蛋白I(BD Biosciences Discovery)涂覆的组织培养板上，并且在EGM-2培养基(Lonza)中培养。24小时后，除去非粘附细胞，每天更换培养基至第7天，之后每隔一天更换培养基。ECFC衍生的菌落出现在培养的第4天至第7天，具有s典型的内皮鹅卵石模式。分离并且扩增单个菌落，并在第一代之前使其生长至80％至90％融合。对于所有实验，在P3与P5之间使用ECFC。
人冠状动脉内皮细胞(HCAEC)购自ATCC。人心脏微血管内皮细胞(HMVEC)购自Lonza。THP-1单核细胞获自Pamela Lein博士(University of California,Davis)。用人整联蛋白αvβ3基因(αvβ3-K562细胞)转染的髓样白血病K562细胞由Yoshikazu Takada博士提供，并且用人整联蛋白αIIbβ3基因转染的K562细胞(αIIbβ3-K562细胞)由JenniferCochran博士提供(Stanford University)。
在EC扩增培养基EGM-2中培养HECFC、HCAEC和HMVEC，并且在补充有10％胎牛血清(FBS，Hyclone)和0.05mM的2-巯基乙醇(Sigma)的RPMI培养基1640(Gibco)中培养THP-1单核细胞。将αvβ3-K562细胞和αIIbβ3-K562细胞在RPMI培养基1640加10％FBS中培养。富含血小板的血浆(PRP)从UC Davis Medical Center(Sacramento，CA)获得。将新鲜PRP(260×103血小板/μL)离心，将沉淀重悬浮于含有2mM CaCl2和MgCl2的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(DPBS；Hyclone)中至终浓度为1×108血小板/mL。
实施例2.EPC/EC-珠和血小板-珠结合测定
如实施例1所述，将HECFC、HCAEC、HMVEC和THP-1单核细胞在它们各自的生长培养基中培养。对于细胞珠结合测定，将在2mL的它们各自的培养基中的6×105的HECFC、HCAEC、HMVEC或THP-1单核细胞添加至超低附着的35-mm培养皿(Corning Incorporated)中，然后加入树脂珠(Lam等人，(1991)Nature 354:82)。将培养皿在37℃、5％CO2的振荡培养箱中以40rpm培养不同时间点。对于血小板珠结合测定，将如实施例1所述分离的血小板添加至超低附着的35-mm培养皿中，并且在如细胞珠结合测定中所述的振荡培养箱中与树脂珠一起孵育。使用Olympus IX81显微镜在不同时间点拍摄相衬图像。
实施例3.EC和血小板附着测定
配体LXW7、LXY30和LLP2A按照第9,073,974号美国专利合成。生物素化的LXW7(LXW7-bio)和生物素化的GRGD(GRGD-bio)使用已建立的固相肽合成方案来合成(Xiao等人，(2010)Mol Cancer Therapeutics 9:2714)。肽-bio被设计为具有附着于Lys的侧链的生物素，其中在肽与Lys(生物素)之间具有两个亲水性连接基团。为了用配体修饰培养表面，用500μL的20μg/mL抗生物素蛋白(Thermo Fisher Scientific)涂覆24孔板中的靶培养孔，并在37℃下孵育1小时。用DPBS冲洗抗生物素蛋白涂覆的孔三次，并且用500μL摩尔当量(2μM)的D-生物素(Thermo Fisher Scientific)、LXW7-bio或GRGD-bio处理。1小时后，将孔用DPBS洗涤三次，并且用1％牛血清白蛋白(BSA；Thermo Fisher Scientific)封闭1小时。在将孔用DPBS冲洗三次后，进行细胞附着测定，将悬浮在相应维持培养基中的5×104个HCAEC和THP-1单核细胞加入孔中，并且在37℃、5％CO2下分别孵育10分钟或16小时。在每个时间点后，将孔用DPBS洗涤三次，并且将粘附细胞在10％福尔马林(Azer Scientific)中固定20分钟。对于血小板附着测定，将PRP离心，并将血小板沉淀重悬浮于含有2mM CaCl2和1mMMgCl2的1％BSA中，以达到1×108个血小板/mL的最终浓度，以5×107个血小板/cm2的密度加入孔中，并且在37℃、5％CO2下孵育16小时。将孔用DPBS洗涤三次，并且将粘附细胞在10％福尔马林中固定20分钟。将HCAEC孔再次用DPBS洗涤，并且用1％BSA封闭1小时。进行另外的洗涤，并且将板与小鼠抗PECAM-1抗体(1:100；Abcam)在1％BSA中于4℃下孵育过夜。将孔洗涤并且与山羊抗小鼠AlexaFluor 594缀合物(1:500；Life Technologies)在1％BSA中于室温下孵育1小时，然后用4’,6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)染色细胞核。用DPBS洗涤三次后，使用Olympus IX81显微镜将细胞成像。从每个样品中随机取出五幅图像，并且使用Image J软件(NIH)进行图像的定量。
实施例4.配体-细胞结合亲和力的流式细胞术分析
将LXW7-bio(1μM)与3×105个HECFC、HCAEC、HMVEC、αvβ3-K562和αIIbβ3-K562细胞以及THP-1单核细胞和1×108个血小板在冰上于结合缓冲液(含10％FBS的HEPES)中孵育30分钟。将样品用含有1％FBS的DPBS洗涤三次，并且在冰上与2μg/ml的链霉亲和素-藻红蛋白一起孵育30分钟，然后用DPBS洗涤。在BD Fortessa LSR细胞分析仪上分析样品，并且使用FlowJo software(Treestar,Inc.)进行进一步的数据分析和门控。
实施例5.在LXW7上的EC增殖的MTS测定
将来自实施例3的96孔板在室温下用1μM抗生物素蛋白溶液处理1小时。将抗生物素蛋白涂覆的孔用DPBS冲洗三次，并且用LXW7-bio(1μM)处理，用D-生物素(1μM)作为对照。1小时后，将孔用DPBS洗涤三次并且用1％BSA封闭1小时。每个孔接种3×103个活的HCAEC，并且在EGM-2培养基中培养5天。根据制造商的说明书(Interchim)每天进行MTS测定，并且在SpectraMax-3读板仪(Molecular Devices)上进行分析。
实施例6.蛋白质印迹分析
将来自实施例2的100-mm培养皿用抗生物素蛋白处理，然后用LXW7-bio或D-生物素处理，如实施例5所述。每个培养皿接种8×105个HCAEC，并在EGM-2培养基中培养4天。使用提取试剂盒(Thermo Fisher Scientific)裂解细胞，并使用BCA蛋白质分析(ThermoFisher Scientific)测定蛋白质浓度。加载15μg的每种样品并且使用4％至12％Bis-TrisNuPAGE凝胶(Thermo Fisher Scientific)分离并转移至硝基纤维素膜。将膜在5％BSA的TBST(含有0.5％吐温-20的Tris缓冲盐水)溶液中封闭，随后用一级抗体抗VEGF受体2、抗磷酸化VEGF受体2、抗p44/42MAPK(Erk1/2)和抗磷酸化-p44/42MAPK(Erk1/2)(Thr202/Tyr204)孵育，均购自Cell Signaling Technologies，在1％BSA中于4℃下过夜。用TBST洗涤三次后，将膜与相应的辣根过氧化物酶缀合的二级抗体在1％脱脂奶粉的TBST(BioRad)中在室温下孵育1小时。洗涤后，使用West Dura底物(Thermo Fisher Scientific)使蛋白质带可视化，并且使用Image J软件定量。
实施例7.LXW7修饰的生物材料支架的制备
聚(L-乳酸)(PLLA)(MW 67,400，Sigma Aldrich)和聚己内酯(PCL,MW 2,000，Polysciences)用于制造电纺微纤维生物材料支架。聚合物共混物(例如，19％的PLLA和5％的PCL；w/v)完全溶解在1,1,1,3,3,3-六氟-1-丙醇(HFIP,Aladdin)中。通过将聚合物纤维静电纺丝至旋转筒收集器上来制备厚度为约200μm的微纤维膜。向心轴施加4.5kV的负电压，并且通过使用高压发生器(γ高压)向喷丝头施加4kV的正电压。
通过三个步骤将LXW7移植到PLLA/PCL膜表面上。将膜在0.01N氢氧化钠中孵育10分钟以暴露表面上的羧基。然后，将膜在1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基磺基琥珀酰亚胺(磺基-NHS)(Thermo Fisher Scientific)的0.5M吗啉代乙烷磺酸(MES)缓冲液(pH 5.5，Thermo Fisher Scientific)中进一步孵育30分钟。在用DPBS短暂洗涤后，将膜在H2N-PEG-炔烃(MP 5000,Polysciences,Inc.)的DPBS溶液中在摇床上孵育2小时。最后，在水系统中存在5μM CuSO4·5H2O、50μM抗坏血酸钠、Cu粉和N,N-二异丙基乙胺(DIEA)(均来自Sigma)下，通过点击化学将通过与LXW7-bio类似的方法，但使用赖氨酸(图2)的侧链连接的5-叠氮基戊酸合成的叠氮基衍生的LXW7(LXW7-N3)与炔烃修饰的膜缀合持续6天(Nandivada等人，(2006)Angewandte Chemie 45:3360)。
用扫描电子显微镜(SEM,Hitachi TM-1000)表征膜的结构。使用衰减全反射-傅里叶变换红外(ATR-FTIR)光谱仪(PerkinElmer)获得未处理的、仅PEG修饰的和PEG-LXW7修饰的膜的衰减全反射光谱。
实施例8.用LXW7支持的EC附着和扩散修饰的生物材料支架
将LXW7-修饰的电纺微纤维膜和未处理的对照膜置于35-mm组织培养皿中。将膜用DPBS冲洗并且在EGM-2培养基中与HCAEC以5×104个细胞/cm2的密度孵育。孵育2小时后，吸出培养基，用DPBS洗去未附着的细胞三次。将粘附细胞固定在10％福尔马林中，并且用抗PECAM-1抗体(1:100；Abcam)免疫染色，并且使用Olympus IX81显微镜成像。将一些细胞样品在EGM-2培养基中进一步培养2天，并且用SEM表征细胞形态和在微纤维支架表面上的扩散。使用Image J软件定量细胞覆盖区域。
实施例9.统计分析
对于双样品比较，使用学生t检验。对于多样品比较，进行方差分析(ANOVA)以检测具有不同处理的组之间是否存在显著差异，并且使用Tukey多重比较测试进行后分析。p值为0.05或更小将表明比较的样品之间的显著差异。
实施例10.使用珠上全细胞结合测定法测定整联蛋白靶向肽配体与EPC/EC的结合 亲和力
测试了三种整联蛋白靶向配体-LXY30(α3β1)、LLP2A(α4β1)和LXW7(αvβ3)对EPC和EC的结合活性。孵育2小时后，结果显示LXY30仅结合HCAEC(图3,d)，但不结合HECFC或THP-1单核细胞(图3,a和g)。LLP2A与HECFC和THP-1单核细胞(图3,b和h)结合，但不与HCAEC结合(图3,e)。LXW7结合HECFC和HCAEC(图3,c和f)，但不结合THP-1单核细胞(图3,i)。对每个珠上结合的细胞数量的定量显示，在用不同类型的配体修饰的每个珠上结合的不同类型的细胞之间存在显著差异(图4)。LXY30仅结合EC，而不结合EPC。LLP2A仅结合EPC，而不结合EC。LXW7良好地结合EPC和EC。基于这些结果，我们选择LXW7作为最佳候选配体，并且LXW7在以下实验中进一步表征。
实施例11.LXW7浓度对细胞粘附的影响
为了优化不同LXW7浓度修饰对EPC粘附的影响，将1×105个细胞接种在PLCL上，并且用不同浓度的LXW7修饰表面。荧光图像显示PLCL表面几乎没有细胞附着(图5,A)，而细胞粘附在LXW7-PLCL表面上，并且50nM是最佳附着表面(图5,B-D；图6、图7)。
实施例12.测试LXW7与EPC/EC的结合特异性
对EPC/EC具有高结合特异性的配体不仅支持快速的细胞附着，还可能抵抗其它“脱靶”细胞、血小板和蛋白质的附着。为了确定LXW7与EPC/EC的结合特异性，将显示LXW7的树脂珠与来自不同来源(HECFC、HCAEC和HMVEC)的EPC/EC、THP-1单核细胞和血小板一起孵育。在孵育后的不同时间点(10分钟、30分钟或2小时)，拍摄相差图像以确定细胞-珠结合亲和力。我们发现LXW7有效地支持来自不同来源的EPC/EC的附着，并且附着于LXW7珠的细胞数量随时间增加(图8,a-i)。值得注意的是，LXW7不支持THP-1单核细胞(图8,j-l)或血小板(图8,m-o)的有效附着。对每个珠上结合的细胞和血小板数量的定量显示，与显示LXW7的珠上的THP-1单核细胞和血小板相比，来自不同来源(HECFC、HCAEC和HMVEC)的EPC/EC明显更多(图9)。这些结果表明LXW7对EPC/EC具有强结合特异性。
实施例13.LXW7和RGD结合特异性和亲和力的比较
常规的三氨基酸序列，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸或“RGD”已广泛用作生物材料领域中的粘附肽以改善细胞附着。然而，常规RGD与许多类型的细胞结合并且对EPC/EC没有特异性结合亲和力(Barber等人，(2007)J Biomed Mat Res 80:306；Hynes(2002)Cell 110:673；Rammelt等人，(2006)Biomaterials 27:5561)。为了研究LXW7是否对EPC/EC具有较高的特异性，我们通过流式细胞术比较了EC结合特异性和LXW7与常规GRGD肽的亲和力。结果显示，与常规GRGD肽(图10,A-C)相比，LXW7与不同类型的EPC/EC具有更高的结合亲和力。两种配体均不与THP-1单核细胞结合(图10,D)。与我们先前的结果一致，LXW7与血小板的结合亲和力非常低，但GRGD显示出与血小板的强结合(图10,E)。为了确认配体是否确实靶向整联蛋白αvβ3，我们使用高度表达整联蛋白αvβ3的αvβ3-K562细胞来测试它们对GRGD和LXW7的结合亲和力。尽管GRGD和LXW7都与αvβ3-K562细胞结合良好，但是我们发现LXW7具有比GRGD更高的结合亲和力(图10,F)。
整联蛋白αIIbβ3的表达局限于巨核细胞谱系的细胞，例如血小板，并且已经表明αIIbβ3介导的血小板聚集体的形成导致循环中的血栓形成(Bennett(2005)J ClinicalInvestigation 115:3363；Lefkovits等人，(1995)New England J Med 332:1553)。为了研究配体是否与可在体内引起血栓形成的血小板结合，我们使用αIIbβ3-K562细胞，其被设计为在其表面上高度表达αIIbβ3。我们发现LXW7显示出与αIIbβ3-K562细胞的非常低的结合，而GRGD显示出非常强的结合(图10,G)。
这些结果表明LXW7对整联蛋白αvβ3具有较高的结合亲和力，但对整联蛋白αIIbβ3的结合亲和力低于常规RGD肽。这表明LXW7在其支持更强和更特异性EPC/EC结合的能力方面具有比常规RGD肽更优的潜力。
为了确认流式细胞术分析的结果，我们采用活细胞培养测定来确定细胞-配体结合亲和力。我们使用LXW7-bio或GRGD-bio(D-生物素作为阴性对照)来处理培养表面并且研究HCAEC、THP-1单核细胞和血小板在培养表面上的选择性附着。HCAEC在10分钟(图11,d和g)内与LXW7和GRGD处理的表面结合，但不与对照表面(图11,a)结合。定量附着细胞的数量并且显示LXW7处理的表面比GRGD修饰的表面吸引更多的HCAEC(图12)，进一步证实LXW7在与EC结合方面优于GRGD。此外，LXW7和GRGD处理的表面都不支持THP-1单核细胞附着(图11,b、e和h以及图12)。此外，LXW7处理的表面显示出有限的血小板粘附，而GRGD处理的表面允许显著更高数量的血小板附着(图11,c、f和i以及图12)。这进一步证实了我们之前的结果，即与常规GRGD肽相比，LXW7支持更强的EC附着，但显著更弱的血小板附着。
实施例14.LXW7改善EC生物学功能的能力
通过MTS测定在不同时间点测试LXW7对EC增殖的影响。结果显示，当与D-生物素处理的表面(对照)相比时，LXW7处理的表面在培养48小时后显著促进EC增殖，并且在整个实验期间保持该趋势(图13)。收集在LXW7处理的表面上培养96小时的EC用于蛋白质印迹分析。当与D-生物素处理的表面(对照)相比时，LXW7处理的表面显著增加VEGFR2(Tyr1175)的磷酸化及其在EC中的下游信号分子ERK1/2的磷酸化(图14)。此外，发现VEGFR2和EGFR mRNA水平的增加取决于使用LXW7的处理时间(图15)。不受任何特定理论束缚，LXW7诱导的EC增殖可归因于LXW7活化整联蛋白αvβ3，因此增强VEGFR2和ERK1/2的磷酸化并且诱导EC增殖的事实。
实施例15.用LXW7修饰生物材料支架表面
ECM提供三维结构和天然配体，用于细胞附着以及组织生长和功能(Wang等人，(2009)Nat Rev 10:75)。为了模拟ECM结构，我们采用静电纺丝技术，使用PLLA和PCL聚合物共混物生产微纤维支架。SEM图像显示，电纺支架具有微纤维的多孔结构(图16)，其形态与天然ECM相似。与ECM相比，这些支架具有缺点，因为它们缺乏生物活性基序，例如通常存在于ECM上的整联蛋白配体，因此用功能配体修饰人工ECM可以改善其生物学功能。为了改善微纤维支架的生物学功能，我们开发了一种通过LXW7经由点击化学使聚合物表面功能化的方案(图18)。首先用叠氮基使LXW7官能化(图17)。通过使用H2N-PEG-炔烃，用PEG使微纤维膜官能化。使用EDC和磺基-NHS将H2N-PEG-炔烃共价连接至微纤维上的羧基(图18)。然后，将LXW-N3通过点击化学连接至H2N-PEG-炔烃官能化微纤维(图18)。将已被证明是检测固体表面上的酰胺键的有力工具的ATR-FTIR光谱分析(Lin等人，(2001)Artificial Organs25:617)用于该研究，以证实LXW7在支架表面上的固定。未处理的表面和改性表面的ATR-FTIR光谱示于图19中。用PEG-LXW7修饰的膜的典型光谱表现为归属于酰胺I基团(1647cm-1)的峰强度明显上升，所述酰胺I基团在LXW7-N3的结构中大量分布(图17)。与未处理的膜的光谱相比时，仅由PEG修饰的膜的光谱在约1630cm-1和1670cm-1仅显示出小的演变，因为在用仅PEG连接基团修饰膜后仅形成少量酰胺I基团(图18)。PEG-LXW7和仅PEG修饰的膜的光谱之间在1647cm-1处存在显著差异，表明在LXW7被修饰后，大量酰胺I基团被引入膜上(图19)。所有这些数据证实LXW7已成功固定在膜表面上。
实施例16.用LXW7修饰的生物材料支架表面支持的EC附着和扩散
将HCAEC接种在经或未经LXW7修饰的PLLA/PCL微纤维膜上，并且在EGM-2培养基中培养2小时。洗涤后，将附着在LXW7修饰的膜(图20,b)和未处理的膜(图20,a)上的HCAEC固定，并且用CD31抗体染色。Cd31阳性细胞的定量显示，当与未处理的膜相比时，附着于LXW7修饰的膜的HCAEC明显更多(图21)。将在2小时附着在膜表面上的HCAEC在培养基中保持两天。SEM分析显示，与未处理的膜(图22,a和c)相比，EC在LXW7修饰的膜(图22,b和d)上生长和扩散得更好。细胞覆盖区域的定量显示，与未处理的膜相比时，LXW7修饰的膜上存在显著更多的细胞覆盖区域(图23)。这些结果表明，LXW7的功能在化学修饰后得到很好的保持，并且LXW7修饰的生物材料支持EC的优良附着和扩散。
实施例17.体内评估血管移植物
为了测试LXW7促进内皮化的能力，将基于聚合物的小直径血管移植物(ID 1mm)通过电击化学用LXW7进行功能化并且在大鼠颈动脉旁路模型中进行评估。雄性Sprague-Dawley大鼠(体重350g至400g)购自Charles River动物设施。用2.0％异氟烷麻醉大鼠，并且使用加热垫将其核心体温保持在37.5℃。将大鼠的左颈总动脉自由解剖并在近端和远端夹紧。在切开颈总动脉后，将移植物通过使用10-0针进行端端吻合术，并且在仔细排气后恢复循环。在长达6周的不同时间点，对大鼠实施安乐死以检查移植物的通畅性。然后处死动物并且移出血管移植物。使用移植物横截面的组织学分析来确认通畅性。
用于组织学检查的样品在最佳切割温度(OCT)化合物中快速冷冻，并且使用低温恒温器切成10-μm厚度。将免疫组织化学染色用于分析具有CD31(550300，小鼠，BDBiosciences)和CD34(AF4117，大鼠，R&D)一级抗体的组织切片。用佳能共聚焦显微镜捕获免疫组织化学图像。
将移植物移出并且用4％多聚甲醛固定30分钟。将每个移植物用微型剪刀纵向切成4片。将样品用PBS洗涤，用1％牛血清白蛋白封闭，并且与抗EPC标记物CD34、EC标记物CD31的一级抗体一起孵育，然后与Alexa-Fluor 488或Alexa-Fluor 546标记的二级抗体一起孵育，然后进行共聚焦显微镜检查。
上述移出的移植物的检查结果示于图24、图25和图26中。发现LXW7修饰的移植物具有比对照移植物显著更高的通畅率。在植入后6周之后，6个LXW7修饰的移植物中有5个是有效的，而6个对照移植物中只有1个是有效的(图24)。在6周时，在LXW7修饰的移植物的整个长度上存在成熟EC，而在对照移植物的中间段中仅鉴定了有限数量的EC(图26)。这证实合成血管移植物的腔表面上的LXW7涂层可以产生“活的”内皮。
尽管为了清楚理解的目的，已经通过说明和实施例的方式详细地描述了前述发明，但是本领域技术人员将理解，可以在所附权利要求的范围内实施某些改变和修改。此外，本文提供的每个参考文献通过引用整体并入，其程度如同每个参考文献通过引用单独并入。在本申请与本文提供的参考文献之间存在冲突的情况下，本申请应占主导地位。
IX.示例性实施方案
根据当前公开的主题提供的示例性实施方案包括但不限于权利要求和以下实施方案：
1.支架，包含：聚合物；和肽配体，所述肽配体共价固定在所述聚合物的表面上，其中所述肽配体增加内皮细胞和/或内皮祖细胞对所述支架的附着，并且其中所述肽配体是式I的化合物：
其中X2、X6和X7各自独立地为氨基酸，其中X2、X6和X7中的至少一个是D-氨基酸；R1选自H、C1-6烷基、-C(O)R1a和L-A；R1a选自C1-6烷基、C1-6杂烷基、C1-6烷基-NH2、C1-6烷基-C(O)N(H)-C1-6杂烷基、环烷基、C1-6烷基-环烷基、杂环烷基、C1-6烷基-杂环烷基、芳基、C1-6烷基-芳基、杂芳基和C1-6烷基-杂芳基，其中所述环烷基、杂环烷基、杂芳基和芳基任选地被选自卤素、-NO2、-OH、-CN、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6卤代烷基和C1-6卤代烷氧基的成员取代；R2选自H、C1-6烷基和L-A；L是连接基团；并且A是活性剂。
2.如实施方案1所述的支架，其中R1和R2各自独立地选自H、C1-6烷基和L-A；L是连接基团；A是活性剂；X2选自Gly、Ala、Sar和β-丙氨酸及其立体异构体；X6选自Val、Leu、Ile、Met、Phe、Asn、Glu、Gln、His、Lys、Arg、Asp、Gly、Ala、Ser、Thr、Tyr、Trp、Pro、Aad、Bec、Bmc、Bmp、Phe(4COOH)、Hyp、HoSer、Tha、Ahch、Actp、Akch、Tyr(diI)、Trp、Thz、2Thi、3Thi、Cit、HoCit、Aib、Nglu和Fua及其立体异构体；并且X7选自Val、Leu、Ile、Met、Phe、Asn、Glu、Gln、His、Lys、Arg、Asp、Gly、Ala、Ser、Thr、Tyr、Trp、Pro、Bmp、HoSer、Nglu、HoCit、Bec、Aad、Hyp、Ahch、Phe(4COOH)、Akch、Aecc、Abu、Phe(3,4-二OMe)、Cpa、2-Thi、Thz、Phg、Phe(4-NO2)、Nle、(NMe)Phe、Aic、Chg、Bta、Bpa、Nal2、Nal1、Tic、Ppca、Cha、Bipa、Deg、Dpg、Acpc、Bmc、Cit、Sar、Tha、Pra、Actp、Aib、Agl、Acbc、Fua、Nva、Thi、Trp、Bug、Ach、(NMe)Val、Cpeg、(CαMe)Phe、Tyr(二I)、Phe(2-Cl)、Bua、HoPhe、HoLeu、Sta、Ing、Phe(4-CF3)、Oic、Dpa、Phe(4-t-Bu)、HoCha和Phe(3,4-二Cl)及其立体异构体。
3.如实施方案1所述的支架，其中所述肽配体是式Ia的化合物：
其中X6和X7各自独立地为D-氨基酸；R1选自H、C1-6烷基和-C(O)R1a；R1a选自C1-6烷基、C1-6杂烷基、C1-6烷基-NH2、C1-6烷基-C(O)N(H)-C1-6杂烷基、环烷基、C1-6烷基-环烷基、杂环烷基、C1-6烷基-杂环烷基、芳基、C1-6烷基-芳基、杂芳基和C1-6烷基-杂芳基，其中所述环烷基、杂环烷基、杂芳基和芳基任选地被选自卤素、-NO2、-OH、-CN、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6卤代烷基和C1-6卤代烷氧基的成员取代；并且R2选自H和C1-6烷基。
4.如实施方案3所述的支架，其中R1和R2各自独立地选自H和C1-6烷基。
5.如实施方案3所述的支架，其中X6选自DSer、DAsp、DGlu和DCit；并且X7选自DPhe、DGlu、DSer、DBug、DBta、DVal、DAgl、DPra、D(NMe)Val、D(CαMe)Val、DAbu、DIng、DIle、DTha、DAsp和DNal1。
6.如实施方案3所述的支架，其中X6选自DAsp和DSer；并且X7选自DGlu、DPhe、DSer、DVal、DBug和DBta。
7.如实施方案3所述的支架，其中所述肽配体选自cGRGDsfc、cGRGDdfc、cGRGDsec、cGRGDdsc、cGRGDd-DBug-c、cGRGDd-DBta-c、cGRGDdvc、Ac-cGRGDdvc、(β-丙氨酸)-cGRGDdvc、(Ebes)-cGRGDdvc、cGRGDd-DAgl-c、cGRGDd-DPra-c、cGRGDd-DBug-c、cGRGDd-D(NMe)Val-c、cGRGDd-D(CαMe)Val-c、cGRGDd-DAbu-c、cGRGDd-DNal1-c、cGRGDd-DNal2-c和cGRGDd-DBta-c。
8.如实施方案3所述的支架，其中所述肽配体选自cGRGDsfc、cGRGDdfc、cGRGDsec、cGRGDdsc、cGRGDdvc、cGRGDd-DBug-c和cGRGDd-DBta-c。
9.如实施方案3所述的支架，其中所述肽配体是cGRGDdvc(LXW7)。
10.如实施方案1至9中任一项所述的支架，其中所述肽配体与所述细胞上的整联蛋白αvβ3结合。
11.如实施方案1至10中任一项所述的支架，其中所述聚合物选自聚(L-乳酸)(PLLA)、聚己内酯(PCL)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、羟磷灰石(HA)、聚(丙交酯-共-ε-己内酯)(PLCL)、聚四氟乙烯(PTFE)、膨胀型聚四氟乙烯(ePTFE)及其组合。
12.如实施方案1至11中任一项所述的支架，其中所述聚合物还包含涂层，并且其中所述肽配体与所述涂层共价连接。
13.如实施方案12所述的支架，其中所述涂层是聚对二甲苯聚合物。
14.如实施方案1至13中任一项所述的支架，其中内皮细胞、内皮祖细胞和/或骨原细胞接种在所述支架上。
15.包含实施方案1至14中任一项所述的支架的工程化组织。
16.涂层，包含：涂层聚合物；和实施方案1至9中任一项所述的肽配体，其中所述肽配体与所述涂层聚合物共价连接。
17.如实施方案16所述的涂层，其中所述肽配体是cGRGDdvc(LXW7)。
18.如实施方案16或17所述的涂层，其中所述涂层聚合物是聚对二甲苯聚合物。
19.改善内皮细胞和/或内皮祖细胞的内皮化和血管形成用于对象中的组织再生的方法，所述方法包括将实施方案1至14中任一项所述的支架植入所述对象。
20.如实施方案19所述的方法，其中所述肽配体增加内皮细胞和/或内皮祖细胞向所述支架的募集。
21.如实施方案19或20所述的方法，其中所述肽配体增加在所述支架上的内皮细胞和/或内皮祖细胞的增殖。
22.用于修复对象的骨缺损的方法，所述方法包括将实施方案1至13中任一项所述的支架植入所述对象。
23.如实施方案22所述的方法，其中在植入前，将内皮细胞和骨原细胞接种在所述支架上。
24.涂覆表面的方法，所述方法包括：使涂层聚合物官能化；将所述涂层聚合物粘附至所述表面；并且将肽配体共价连接至所述涂层聚合物，其中所述肽配体是实施方案1至9中任一项所述的肽配体或其官能化衍生物。
25.如实施方案24所述的方法，其中所述肽配体是cGRGDdvc(LXW7)或其官能化衍生物。
26.如实施方案24或25所述的方法，其中所述涂层聚合物是聚对二甲苯聚合物。
27.如实施方案24至26中任一项所述的方法，其中所述涂层聚合物的官能化包括将炔烃官能团引入所述涂层聚合物中。
28.如实施方案27所述的方法，其中用叠氮化物官能团使所述肽配体官能化。
29.如实施方案24至28中任一项所述的方法，其中所述表面包含支架聚合物。
30.如实施方案29所述的方法，其中所述支架聚合物选自聚(L-乳酸)(PLLA)、聚己内酯(PCL)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、羟磷灰石(HA)、聚(丙交酯-共-ε-己内酯)(PLCL)、聚四氟乙烯(PTFE)、膨胀型聚四氟乙烯(ePTFE)及其组合。
31.如实施方案24至30中任一项所述的方法，其中将所述涂层聚合物粘附至所述表面包括化学气相沉积(CVD)。
32.如实施方案24至31中任一项所述的方法，还包括：在将所述涂层聚合物粘附至所述表面之前使所述表面活化。
33.如实施方案32所述的方法，其中所述表面的活化包括施加微波等离子体。

Claims (33)

1.支架，包含：
聚合物；和
肽配体，所述肽配体共价固定在所述聚合物的表面上，其中所述肽配体增加内皮细胞和/或内皮祖细胞对所述支架的附着，并且其中所述肽配体是式I的化合物：
其中
X2、X6和X7各自独立地为氨基酸，其中X2、X6和X7中的至少一个是D-氨基酸；
R1选自H、C1-6烷基、-C(O)R1a和L-A；
R1a选自C1-6烷基、C1-6杂烷基、C1-6烷基-NH2、C1-6烷基-C(O)N(H)-C1-6杂烷基、环烷基、C1-6烷基-环烷基、杂环烷基、C1-6烷基-杂环烷基、芳基、C1-6烷基-芳基、杂芳基和C1-6烷基-杂芳基，其中所述环烷基、杂环烷基、杂芳基和芳基任选地被选自卤素、-NO2、-OH、-CN、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6卤代烷基和C1-6卤代烷氧基的成员取代；
R2选自H、C1-6烷基和L-A；
L是连接基团；并且
A是活性剂。
2.如权利要求1所述的支架，其中
R1和R2各自独立地选自H、C1-6烷基和L-A；
L是连接基团；
A是活性剂；
X2选自Gly、Ala、Sar和β-丙氨酸及其立体异构体；
X6选自Val、Leu、Ile、Met、Phe、Asn、Glu、Gln、His、Lys、Arg、Asp、Gly、Ala、Ser、Thr、Tyr、Trp、Pro、Aad、Bec、Bmc、Bmp、Phe(4COOH)、Hyp、HoSer、Tha、Ahch、Actp、Akch、Tyr(diI)、Trp、Thz、2Thi、3Thi、Cit、HoCit、Aib、Nglu和Fua及其立体异构体；并且
X7选自Val、Leu、Ile、Met、Phe、Asn、Glu、Gln、His、Lys、Arg、Asp、Gly、Ala、Ser、Thr、Tyr、Trp、Pro、Bmp、HoSer、Nglu、HoCit、Bec、Aad、Hyp、Ahch、Phe(4COOH)、Akch、Aecc、Abu、Phe(3,4-二OMe)、Cpa、2-Thi、Thz、Phg、Phe(4-NO2)、Nle、(NMe)Phe、Aic、Chg、Bta、Bpa、Nal2、Nal1、Tic、Ppca、Cha、Bipa、Deg、Dpg、Acpc、Bmc、Cit、Sar、Tha、Pra、Actp、Aib、Agl、Acbc、Fua、Nva、Thi、Trp、Bug、Ach、(NMe)Val、Cpeg、(CαMe)Phe、Tyr(二I)、Phe(2-Cl)、Bua、HoPhe、HoLeu、Sta、Ing、Phe(4-CF3)、Oic、Dpa、Phe(4-t-Bu)、HoCha和Phe(3,4-二Cl)及其立体异构体。
3.如权利要求1所述的支架，其中所述肽配体是式Ia的化合物：
其中
X6和X7各自独立地为D-氨基酸；
R1选自H、C1-6烷基和-C(O)R1a；
R1a选自C1-6烷基、C1-6杂烷基、C1-6烷基-NH2、C1-6烷基-C(O)N(H)-C1-6杂烷基、环烷基、C1-6烷基-环烷基、杂环烷基、C1-6烷基-杂环烷基、芳基、C1-6烷基-芳基、杂芳基和C1-6烷基-杂芳基，其中所述环烷基、杂环烷基、杂芳基和芳基任选地被选自卤素、-NO2、-OH、-CN、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6卤代烷基和C1-6卤代烷氧基的成员取代；并且
R2选自H和C1-6烷基。
4.如权利要求3所述的支架，其中
R1和R2各自独立地选自H和C1-6烷基。
5.如权利要求3所述的支架，其中
X6选自DSer、DAsp、DGlu和DCit；并且
X7选自DPhe、DGlu、DSer、DBug、DBta、DVal、DAgl、DPra、D(NMe)Val、D(CαMe)Val、DAbu、DIng、DIle、DTha、DAsp和DNal1。
6.如权利要求3所述的支架，其中
X6选自DAsp和DSer；并且
X7选自DGlu、DPhe、DSer、DVal、DBug和DBta。
7.如权利要求3所述的支架，其中所述肽配体选自cGRGDsfc、cGRGDdfc、cGRGDsec、cGRGDdsc、cGRGDd-DBug-c、cGRGDd-DBta-c、cGRGDdvc、Ac-cGRGDdvc、(β-丙氨酸)-cGRGDdvc、(Ebes)-cGRGDdvc、cGRGDd-DAgl-c、cGRGDd-DPra-c、cGRGDd-DBug-c、cGRGDd-D(NMe)Val-c、cGRGDd-D(CαMe)Val-c、cGRGDd-DAbu-c、cGRGDd-DNal1-c、cGRGDd-DNal2-c和cGRGDd-DBta-c。
8.如权利要求3所述的支架，其中所述肽配体选自cGRGDsfc、cGRGDdfc、cGRGDsec、cGRGDdsc、cGRGDdvc、cGRGDd-DBug-c和cGRGDd-DBta-c。
9.如权利要求3所述的支架，其中所述肽配体是cGRGDdvc(LXW7)。
10.如权利要求1所述的支架，其中所述肽配体与所述细胞上的整联蛋白αvβ3结合。
11.如权利要求1所述的支架，其中所述聚合物选自聚(L-乳酸)(PLLA)、聚己内酯(PCL)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、羟磷灰石(HA)、聚(丙交酯-共-ε-己内酯)(PLCL)、聚四氟乙烯(PTFE)、膨胀型聚四氟乙烯(ePTFE)及其组合。
12.如权利要求1所述的支架，其中所述聚合物还包含涂层，并且其中所述肽配体与所述涂层共价连接。
13.如权利要求12所述的支架，其中所述涂层是聚对二甲苯聚合物。
14.如权利要求1所述的支架，其中内皮细胞、内皮祖细胞和/或骨原细胞接种在所述支架上。
15.包含权利要求1所述的支架的工程化组织。
16.涂层，包含：
涂层聚合物；和
权利要求1所述的肽配体，其中所述肽配体与所述涂层聚合物共价连接。
17.如权利要求16所述的涂层，其中所述肽配体是cGRGDdvc(LXW7)。
18.如权利要求16所述的涂层，其中所述涂层聚合物是聚对二甲苯聚合物。
19.改善内皮细胞和/或内皮祖细胞的内皮化和血管形成用于对象中的组织再生的方法，所述方法包括将权利要求1所述的支架植入所述对象。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述肽配体增加内皮细胞和/或内皮祖细胞向所述支架的募集。
21.如权利要求19所述的方法，其中所述肽配体增加在所述支架上的内皮细胞和/或内皮祖细胞的增殖。
22.用于修复对象的骨缺损的方法，所述方法包括将权利要求1所述的支架植入所述对象。
23.如权利要求22所述的方法，其中在植入前，将内皮细胞和骨原细胞接种在所述支架上。
24.涂覆表面的方法，所述方法包括：
使涂层聚合物官能化；
将所述涂层聚合物粘附至所述表面；并且
将肽配体共价连接至所述涂层聚合物，其中所述肽配体是权利要求1所述的肽配体或其官能化衍生物。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述肽配体是cGRGDdvc(LXW7)或其官能化衍生物。
26.如权利要求24所述的方法，其中所述涂层聚合物是聚对二甲苯聚合物。
27.如权利要求24所述的方法，其中所述涂层聚合物的官能化包括将炔烃官能团引入所述涂层聚合物中。
28.如权利要求27所述的方法，其中用叠氮化物官能团使所述肽配体官能化。
29.如权利要求24所述的方法，其中所述表面包含支架聚合物。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述支架聚合物选自聚(L-乳酸)(PLLA)、聚己内酯(PCL)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、羟磷灰石(HA)、聚(丙交酯-共-ε-己内酯)(PLCL)、聚四氟乙烯(PTFE)、膨胀型聚四氟乙烯(ePTFE)及其组合。
31.如权利要求24所述的方法，其中将所述涂层聚合物粘附至所述表面包括化学气相沉积(CVD)。
32.如权利要求24所述的方法，还包括：
在将所述涂层聚合物粘附至所述表面之前使所述表面活化。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述表面的活化包括施加微波等离子体。
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