KR20190084286A

KR20190084286A - 생체 조직 구멍 폐쇄용, 궤양 보호용 및 혈관 색전 치료술용 졸

Info

Publication number: KR20190084286A
Application number: KR1020197016712A
Authority: KR
Inventors: 도시오 우라오카; 나오히사 야하기; ?지 유노키; 요시미 오야부; 다케후미 나리타
Original assignee: 지호우도쿠리츠교우세이호우징 도쿄토리츠 산교기주츠켄큐센타; 도시오 우라오카
Priority date: 2016-11-17
Filing date: 2017-11-16
Publication date: 2019-07-16
Also published as: EP3542830B1; WO2018092836A1; JP2018079145A; KR102408275B1; EP3542830A4; EP3542830A1; US11559602B2; JP7012950B2; US20190343992A1

Abstract

본 발명은 생체 조직 구멍 폐쇄, 궤양 보호, 또는 혈관 색전 치료술에 이용할 수 있는, 카테터에 의한 송달에 적합한 생체 주입용 졸을 제공하는 것을 목적으로 한다. 0.6질량％ 내지 3질량％의 콜라겐, 물, 200mM 내지 330mM의 염화나트륨 및 완충제를 함유하고, pH가 6.0 내지 9.0인 생체 조직 구멍 폐쇄용 졸, 궤양 보호용 졸 및 혈관 색전 치료술용 졸을 제공한다.

Description

생체 조직 구멍 폐쇄용, 궤양 보호용 및 혈관 색전 치료술용 졸

본원 발명은, 내시경 치료 등에 사용하는 생체 주입용 졸에 관한 것이며, 보다 상세하게는, 내시경 치료 시 등에 생긴 구멍을 폐쇄하기 위해, 내시경 치료 시 등에 발생할 수 있는 궤양을 보호하기 위해, 또는 암 치료나 소화관 출혈의 지혈을 행하는 혈관 색전 치료술에 사용하기 위한, 생체 조직 구멍 폐쇄용, 궤양 보호용 및 혈관 색전 치료술용 졸에 관한 것이다.

내시경 치료, IVR(인터벤셔널ㆍ라디올로지) 치료(X선, CT 등, 화상 진단 장치를 사용하면서 체내에 카테터를 삽입하여 행해지는 치료) 등의 저침습 치료가 급속하게 보급되고 있다. 이들 저침습 치료에는, 생체 조직에 생긴 관통 구멍의 폐쇄, 궤양의 보호, 혈관의 색전을 생체 주입 겔로 행할 것이 요구되는 경우가 있다. 카테터 경유로 약액이나 재료를 송달하는 것이 저침습 치료에 있어서 중요하지만, 고체상의 재료를 카테터 경유로 송달하는 것은 용이하지 않다.

임상에서 사용되는 겔화능을 갖는 제제로서는, 생체 접착제라고 불리는(생체 실란트나 조직 접착제라고도 불리는), 가교제와 고분자의 반응을 이용한 제제나, 모노머의 중합 반응을 이용한 제제가 있다(특허문헌 1 등). 단시간에 겔화하여 생체 조직과 결합하는 기능을 갖지만, 제제를 조합한 후 바로 겔화가 개시되기 때문에, 카테터와 같은 긴 세관을 통하여 송달하는 용도에 있어서 부적합하다. 따라서, 내시경적으로 행해지는 경우가 많은 생체 조직 구멍 폐쇄, 궤양의 보호 및 혈관 색전 치료술에 이용하기가 어렵다.

또한, 가교제를 사용하지 않고, 고분자의 자기 조직화(소수성 상호 작용이나 정전적 상호 작용 등)에 의해 졸-겔 전이를 발생시키는 생체 주입 겔도 보고되어 있다(특허문헌 2 내지 4 등). 체온에 응답하여 겔화하기 때문에, 예를 들어 카테터 경유로의 송달이 용이해지는 등의 이점이 있지만, 약하고 불안정하며, 생체 조직에 대한 정착성이 낮아, 생체 조직 구멍 폐쇄, 궤양 보호 및 혈관 색전 치료술에 이용하기가 어렵다.

또한, 생체 실란트제 혹은 지혈제로서 범용되고 있는 제제로서, 생체 반응 중 하나인 피브리노겐과 트롬빈의 가교 반응을 이용한 피브린 글루가 있다. 약액 혼합 후의 겔화 시간이 길기 때문에 카테터 경유로의 송달이 가능하고 지혈 효과를 갖지만, 겔화에 체온 응답성이 없기 때문에, 국소적으로 재현성 좋게 겔을 형성시키기가 어렵다. 가령 국소적으로 겔을 형성할 수 있다고 해도, 겔의 강도가 약하기 때문에, 폴리글리콜산 시트 등의 보호 시트와 병용하지 않으면 안정된 궤양 피복을 형성할 수 없다(비특허문헌 1). 생체 조직에 대한 접착력도 매우 낮아(특허문헌 5), 겔에 의한 폐쇄, 색전ㆍ폐색, 보호재로서의 안정성이 부족하다. 또한, 혈액 제재의 일종이라는 점에서 안전성의 면에서도 리스크가 높아, C형 간염 등의 감염이 보고되고 있다.

한편, 본 발명자는, 특정한 콜라겐/게니핀 혼합 수용액에 대하여, 콜라겐이 체온 부근의 온도에서 섬유화되고, 그 후 게니핀 가교가 도입되는 겔화 특성을 갖는다는 것을 이미 알아냈다(특허문헌 6). 또한, 특정한 콜라겐 수용액의 겔화 속도를, 무기염 농도의 조정에 의해 빠르게 할 수 있다는 것도 알아냈다(특허문헌 7 및 비특허문헌 2). 그러나, 이들 수용액의 특정한 의료 용도에 대한 유효성은 알려져 있지 않았다.

일본 특허 제4585743호 공보 일본 특허 제5019851호 공보 일본 특허 공표 제2008-505919호 일본 특허 공개 제2014-221830호 일본 특허 공개 제2007-325824호 일본 특허 공개 제2014-103985호 일본 특허 공개 제2016-077410호

Tsuji et al. Gastrointestinal Endoscopy Volume 79, Issue 1, Pages 151-155, 2014 Yunoki et al. Journal of Biomedical Materials Research Part A Volume 103, Issue 9, pages 3054-3065, 2015

이상과 같이, 생체 조직 구멍 폐쇄, 궤양 보호 또는 혈관 색전 치료술에 이용할 수 있는, 카테터에 의한 송달에 적합한 생체 주입용 겔은 이제까지 존재하지 않았다. 또한, 카테터를 경유하여 졸상 물질을 송달하고, 졸-겔 전이된 겔에 의한 생체 조직 구멍의 폐쇄, 궤양의 보호, 또는 혈관 색전에 성공하였다는 사례는 없었다.

이러한 배경 하, 본 발명은 생체 조직 구멍 폐쇄, 궤양의 보호, 또는 혈관 색전 치료술에 이용할 수 있는, 카테터에 의한 송달에 적합한 생체 주입용 졸을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 과제에 대하여, 본 발명자들은, 특정한 농도의 콜라겐, 물, 특정한 농도의 염화나트륨 및 완충제를 함유하고, 특정한 pH를 갖는 졸이, 관통 구멍의 폐쇄, 궤양의 물리적 보호, 및 혈관 색전에 적합한 3가지 특성인 (1) 카테터를 통하여 생체 외로부터 생체 내로 송달하는 것이 가능한 긴 유동성 유지 시간, (2) 송달 후 신속하게 겔화하는 예민한 체온 응답성, 및 (3) 겔화된 후에 경화를 일으켜, 생체 조직에 정착하는 성질을 구비하여, 생체 조직 구멍의 폐쇄, 궤양의 보호 또는 혈관의 색전을 행할 수 있다는 것을 알아내어, 본 발명을 완성시켰다.

즉, 본 발명은 이하의 것에 관한 것이다.

[1] 0.6질량％ 내지 3질량％의 콜라겐, 물, 200mM 내지 330mM의 염화나트륨 및 완충제를 함유하고, pH가 6.0 내지 9.0인 생체 조직 구멍 폐쇄용 졸.

[2] 0.6질량％ 내지 3질량％의 콜라겐, 물, 200mM 내지 330mM의 염화나트륨 및 완충제를 함유하고, pH가 6.0 내지 9.0인 궤양 보호용 졸.

[3] 0.6질량％ 내지 3질량％의 콜라겐, 물, 200mM 내지 330mM의 염화나트륨 및 완충제를 함유하고, pH가 6.0 내지 9.0인 혈관 색전 치료술용 졸.

[4] 상기 완충제가 인산염을 포함하는, [1] 내지 [3] 중 어느 것에 기재된 졸.

[5] 게니핀 또는 게니핀 유도체를 40mg/L 내지 1400mg/L의 범위로 함유하는, [1] 내지 [4] 중 어느 것에 기재된 졸.

[6] 콜라겐이 텔로펩티드 제거형 콜라겐을 포함하는, [1] 내지 [5] 중 어느 것에 기재된 졸.

[7] 1.4질량％ 내지 1.7질량％의 콜라겐을 함유하고, 카테터를 통하여 생체 조직에 국소 투여되는, [1] 내지 [6] 중 어느 것에 기재된 졸.

[8] 생체 조직에 접촉하면 겔화하여 생체 조직에 부착되는, [1] 내지 [7] 중 어느 것에 기재된 졸.

본 발명은, 또한 이하의 것에 관한 것이다.

[9] 생체 조직에 접촉하면 겔화하여 생체 조직에 부착되는 졸에 의해, 생체 조직 구멍 폐쇄, 궤양 보호 또는 혈관 색전을 행하기 위한 키트이며,

상기 졸을 형성하기 위한 콜라겐, 염화나트륨, 완충제 및 게니핀을 포함하는 키트.

[10] 생체 조직에 접촉하면 겔화하여 생체 조직에 부착되는 졸에 의해, 생체 조직 구멍 폐쇄, 궤양 보호 또는 혈관 색전을 행하기 위한 키트이며,

0.6질량％ 내지 3질량％의 콜라겐, 물, 200mM 내지 330mM의 염화나트륨 및 완충제를 함유하고, pH가 6.0 내지 9.0인 졸, 그리고

게니핀을 포함하는 키트.

[11] [1] 내지 [8] 중 어느 것에 기재된 졸을 사용하는, 생체 조직 구멍 폐쇄 방법.

[12] [1] 내지 [8] 중 어느 것에 기재된 졸을 사용하는, 궤양 보호 방법.

[13] [1] 내지 [8] 중 어느 것에 기재된 졸을 사용하는, 혈관 색전 방법.

본 발명에 따르면, 카테터를 통하여 송달 가능한 졸에 의해, 생체 조직의 관통 구멍의 폐쇄, 궤양의 보호 또는 혈관의 색전을 행할 수 있다.

도 1은, 시험예 1의 돼지 위의 천공 폐쇄 실험에 있어서의, 돼지 위의 천공 형성(도 1의 a), 콜라겐 졸 송달(도 1의 b), 겔화(도 1의 c) 및 천공 폐쇄(도 1의 d)의 모습을 도시한다.
도 2는, 시험예 1의 돼지 위의 천공 폐쇄 실험에 있어서의, 적출한 위의 누설 시험의 모습을 도시한다.
도 3은, 시험예 1의 돼지 위의 천공 폐쇄 실험에 있어서의, 천공부를 포함하는 돼지 위 조직의 HE 염색상을 도시한다.
도 4는, 시험예 2의 돼지 결장의 천공 폐쇄 실험에 있어서의, 돼지 결장의 천공 형성(도 4의 a), 콜라겐 졸 송달(도 4의 b), 겔화(도 4의 c) 및 천공 폐쇄(도 4의 d)의 모습을 도시한다.
도 5는, 시험예 2의 돼지 결장의 천공 폐쇄 실험에 있어서의, 적출한 결장의 누설 시험의 모습을 도시한다.
도 6은, 시험예 3의 돼지 위의 천공 폐쇄 실험에 있어서의, 돼지 위의 천공 형성(도 6의 a), 콜라겐 졸 송달(도 6의 b), 겔화(도 6의 c), 천공 폐쇄(도 6의 d), 큰 천공의 폐쇄(도 6의 e) 및 생리 식염수를 겔에 분사해도 겔이 파괴되지 않은 모습(도 6의 f)을 도시한다.
도 7은, 시험예 4의 돼지 위의 ex vivo 궤양 보호 시험의 결과를 도시한다.
도 8은, 시험예 5의 콜라겐 졸의 동적 점탄성 시험의 결과를 도시한다. 겔화의 체온 응답성을 평가한 결과를 도 8의 a에 도시하고, 졸 조합 후 30분까지 G'를 추적한 결과를 도 8의 b에 도시한다.
도 9는, 시험예 6의 콜라겐 졸의 동적 점탄성 시험의 결과를 도시한다. 상이한 NPB 농도의 졸의 겔화 거동을 도 9의 a에 도시하고, 37℃ 도달 후의 겔화 시간을 NPB 농도에 대하여 플롯한 결과를 도 9의 b에 도시한다.
도 10은, 시험예 7의, 겔의 관입 시험 결과를 도시한다. 게니핀 농도가 상이한 겔의, 응력-왜곡선을 도 10의 a에 도시하고, 탄성률을 도 10의 b에 도시한다.
도 11은, 시험예 8의, 점도 측정의 결과를 도시한다.
도 12는, 시험예 9의, 비교예 1의 콜라겐 졸을 사용한 돼지 위의 천공 폐쇄 실험의 결과를 도시한다.

이하, 본 발명을 실시하기 위한 형태(이하, 간단히 「본 실시 형태」라고도 함)에 대하여 상세하게 설명한다. 이하의 본 실시 형태는, 본 발명을 설명하기 위한 예시이며, 본 발명을 이 본 실시 형태로만 한정한다는 취지는 아니다.

본 실시 형태의 졸(졸 조성물, 의약 조성물)은, 0.6질량％ 내지 3질량％의 콜라겐, 물, 200mM 내지 330mM의 염화나트륨 및 완충제를 함유하고, pH가 6.0 내지 9.0이다.

본 실시 형태의 졸이 함유하는 콜라겐은, 특별히 한정되지 않지만, 실온 부근에서의 섬유화가 진행되기 어려운 텔로펩티드 제거형 콜라겐인 것이 바람직하며, 실질적으로 텔로펩티드 제거형 콜라겐을 포함하는 것이 보다 바람직하다. 텔로펩티드 제거형 콜라겐은, 콜라겐 분자가 양쪽 말단에 갖는 텔로펩티드를, 단백질 분해 효소에 의해 효소적으로 분해 제거한 것이며, 예를 들어 콜라겐 분자가 양쪽 말단에 갖는 텔로펩티드를 펩신 소화에 의해 분해 제거한 것이다. 또한, 텔로펩티드 제거형 콜라겐 중에서도, 의료 기기의 원료로서 승인되어 있는 포유류 유래의 텔로펩티드 제거형 콜라겐이 바람직하며, 이미 임상 응용되고 있고, 열안정성이 우수한 돼지 껍질 유래의 텔로펩티드 제거형 콜라겐이 보다 바람직하게 사용된다. 텔로펩티드 제거형 콜라겐은 아텔로콜라겐의 별칭으로 시판되어 있으며, 용이하게 입수할 수 있다.

콜라겐은, 섬유 형성능을 갖는 콜라겐(섬유 형성 콜라겐)이라면 특별히 한정되지 않는다. 섬유 형성 콜라겐 중에서도, 뼈, 피부, 힘줄 및 인대를 구성하는 콜라겐인 타입 I, 연골을 구성하는 콜라겐인 타입 II, 타입 I 콜라겐으로 구성되는 생체 조직에 포함되는 타입 III 등이, 입수 용이성, 연구 실적의 풍부함, 혹은 제조한 겔을 적용하는 생체 조직과의 유사성의 관점에서 바람직하게 사용된다. 콜라겐은 통상의 방법에 의해 생체 조직으로부터 추출ㆍ정제하여 얻을 수도 있고, 시판품을 입수해도 된다. 콜라겐은 각 타입이 정제된 것이어도 되고, 복수 타입의 혼합물이어도 된다.

콜라겐의 변성 온도는, 32℃ 이상이면 바람직하고, 35℃ 이상이면 보다 바람직하고, 37℃ 이상이면 더욱 바람직하다. 변성 온도가 32℃ 이상이면, 졸의 실온에서의 유동성을 보다 길게 유지하는 것이 가능해짐과 함께, 생체 내에서의 콜라겐의 변성이 일어나기 어려워진다. 콜라겐의 변성 온도의 상한은 특별히 한정되지 않지만, 50℃ 이하이면 바람직하고, 45℃ 이하이면 보다 바람직하고, 41℃이면 더욱 바람직하다.

변성 온도가 상기 상한값 이하이면, 생체 조직에 접촉하였을 때의 겔화를 보다 빠르게 진행시킬 수 있다. 콜라겐의 변성 온도는, 통상의 방법, 즉 콜라겐 수용액의 온도 상승에 수반하는 원편광 2색성, 선광도, 또는 점도의 변화에 의해 측정된다. 콜라겐의 변성 온도는, 상기 수치 범위 내의 변성 온도를 갖는 콜라겐을 선택함으로써 조정해도 된다.

본 실시 형태의 졸은, 콜라겐과 물을 함유하는 콜라겐 수용액을 포함하는 졸이며, 투여한 부위에 있어서 국소적으로 겔화시키기 위한 졸 체류성의 관점에서, 콜라겐 농도가 높은 졸이 바람직하다. 콜라겐 농도가 지나치게 낮으면 졸의 점도가 저하되어, 겔화 전에 졸이 도입 부위로부터 산일하는 경우가 있다. 게다가, 졸의 콜라겐 농도가 높은 편이, 겔화 후의 겔의 경도가 향상되기 때문에, 조직 관통 구멍, 혈관 색전 등을 확실하게 행한다고 하는 관점에서도, 콜라겐 농도가 높은 졸이 바람직하다.

한편, 카테터를 경유하여 본 실시 형태의 졸을 투여한다고 하는 관점에서는, 콜라겐 농도가 낮은 졸이 바람직하다. 카테터의 직경이나 길이에도 의존하지만, 콜라겐 농도가 높아짐에 따라 졸의 점도가 높아져, 압출 저항이 증가하여, 투여가 곤란해지는 경우가 있다.

이상의 관점에서, 본 실시 형태의 졸에 있어서, 콜라겐의 농도는 졸의 전량을 기준으로 하여, 0.6질량％ 내지 3.0질량％이며, 0.8질량％ 내지 2.2질량％이면 바람직하고, 1.4질량％ 내지 1.7질량％이면 보다 바람직하고, 1.4질량％ 내지 1.6질량％이면 특히 바람직하다.

본 실시 형태의 졸은, 무기염인 염화나트륨을 소정 농도 포함함으로써, 생체 조직에 접촉하였을 때 콜라겐의 섬유화가 가속되고, 체온에 응답하여 빠르게 겔화된다.

졸에 포함되는 염화나트륨의 농도는, 생리적 염 농도(140mM)보다 높은 200mM 내지 330mM의 범위에서 적절하게 조정할 수 있으며, 220mM 내지 310mM이면 바람직하고, 예를 들어 280mM 전후로 할 수 있다. 염화나트륨 농도가 생리적 염 농도 미만인 경우, 체온에 응답한 콜라겐의 섬유화에 긴 시간을 요하는 경우가 있다. 한편, 염화나트륨 농도가 330mM을 초과하면, 카테터 내에서 졸이 유동성을 상실하기 쉬워지는 경우가 있다. 염화나트륨의 농도를 이러한 범위로 함으로써, 카테터 내에서의 졸의 유동성을 유지하면서, 체온에 응답하여 빠르게 겔화하는 것이 가능하게 된다.

본 실시 형태의 졸의 pH(23℃에 있어서의 pH. 특필하지 않는 한 본 명세서 전체에 있어서 마찬가지임)는 6.0 내지 9.0이며, 6.5 내지 8.0이 보다 바람직하다. 콜라겐의 섬유화는 중성 부근에서 활발하게 발생한다는 것이 알려져 있다. pH를 소정의 범위 내로 함으로써, 콜라겐의 섬유화를 보다 촉진시킬 수 있다. pH의 조정은, 통상의 방법에 의해 가능하며, 예를 들어 졸에 포함되는 무기염의 농도, 바람직하게는 염화나트륨 및 인산수소나트륨의 농도의 제어나, 염산이나 수산화나트륨 등의 강산 및/또는 강알칼리의 첨가에 의해, pH를 조정하는 것이 가능하다. pH는 공지의 pH 미터(예를 들어, HORIBA사제, 상품명 「NAVIh F-71」)에 의해 측정할 수 있다.

또한, 본 실시 형태의 졸은, pH를 유지하는 등의 목적을 위해, 완충제를 함유한다. 완충제로서는, 졸이 원하는 특성을 갖는 한 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 인산염, 아세트산염, 붕산염, HEPES, 트리스 등을 사용할 수 있다. 인산염으로서는, 인산나트륨, 인산수소나트륨(인산2수소나트륨 및 인산수소2나트륨의 총칭) 및 인산수소칼륨(인산2수소칼륨 및 인산수소2칼륨의 총칭) 등을 사용할 수 있다. 아세트산염으로서는 아세트산나트륨 등을 사용할 수 있고, 붕산염으로서는 붕산나트륨 등을 사용할 수 있으며, 각각 수산화나트륨 등에 의한 pH 조절과 맞추어 사용할 수 있다. 또한, 상기 염화나트륨과 완충제를 합한, 염화나트륨 함유 인산 완충액(NPB) 등의 완충액을 사용해도 된다.

이들 완충제 중, 인산염 및 이것을 포함하는 NPB가 특히 바람직하게 사용된다. 인산염은, 콜라겐의 섬유화가 활발하게 생기는 pH6 내지 9에서의 완충능이 우수하며, 인산 완충 생리 식염수 등 세포 세정액에도 포함되는 바와 같이 생체에 대한 안전성이 확인되었다고 하는 이점이 있다.

완충제의 농도는 pH가 원하는 범위로 유지되고, 졸이 원하는 특성을 갖는 한 특별히 한정되지 않는다.

pH 완충 효과를 충분히 발휘한다는 관점에서, 완충제 농도를 5mM 이상으로 할 수 있다. 한편, 완충제 농도가 높아지면, 조제 전에 완충액 내의 염이 석출되는 경우, 혹은 이온 강도가 지나치게 높아져 졸 사용 시에 조직 장해성을 야기하는 경우가 있기 때문에, 완충제 농도를 140mM 이하로 할 수 있다. 완충제 농도는, 10mM 초과 120mM 미만이면 바람직하고, 예를 들어 20mM 내지 110mM으로 할 수 있으며, 30mM 내지 100mM이면 보다 바람직하다. 완충제 농도를 이러한 범위로 함으로써, 졸의 pH를 6.0 내지 9.0의 범위 내로 유지하는 것이 용이해지고, 카테터 내에서의 졸의 유동성을 유지하면서 카테터를 통한 송달 후에는 체온에 응답하여 빠르게 송달 장소에서 겔화된다고 하는 본 실시 형태의 졸의 효과를 발휘하면서, 염의 석출이나 조직 장해성을 억제하는 것이 가능하게 된다.

상기 졸은, 생체 조직에 접촉하면, 체온에 응답하여 겔화한다. 이 겔의 강도를 높인다는 관점 및 생체 조직에 대한 부착성을 높인다는 관점에서, 상기 졸은 가교제를 포함하는 것이어도 된다. 가교제는 특별히 한정되지 않고, 1종을 단독으로 또는 2종 이상을 조합하여 사용할 수도 있지만, 가교제 그 자체의 세포 독성이 낮다고 여겨지고 있는 식물 유래의 게니핀, 혹은 가교제가 콜라겐 분자간에 삽입되지 않기 때문에 수세로 제거되는 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드(이하, 「EDC」라고 표기함)와 그의 가교 보조제인 N-히드록시숙신이미드(NHS) 등이 바람직하게 사용된다. 게니핀은 게니포시드의 아글리콘이며, 예를 들어 게니포시드의 산화, 환원 및 가수분해에 의해 얻어지거나, 혹은 게니포시드의 효소 가수분해에 의해 얻어진다. 게니포시드는, 꼭두선이과의 치자나무에 포함되는 이리도이드 배당체이며, 치자나무로부터 추출하여 얻어진다. 게니핀은, C₁₁H₁₄O₅의 분자식으로 표시되며, 통상의 방법에 의해 합성해도 되고, 시판품을 입수해도 된다. 또한, 게니핀은, 본 실시 형태의 졸의 원하는 특성을 저해하지 않을 정도로, 그 가교 효과를 확보하는 범위에서, 유도체화되어 있어도 된다. 게니핀의 유도체로서는, 예를 들어 일본 특허 공표 제2006-500975호 공보에 기재된 것을 사용할 수 있다. 또한, 본 명세서 중에 있어서, 게니핀은 게니핀의 중합체도 포함한다. 게니핀은 다양한 조건에서 중합된다는 것이 알려져 있으며, 그 중합 조건ㆍ방법에 대해서는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 강알칼리 조건 하에서 알돌 축합에 의해 중합시키는 방법(Mi et al. Characterization of ring-opening polymerization of genipin and pH-dependent cross-linking reactions between chitosan and genipin. Journal of Polymer Science: Part A: Polymer Chemistry, Vol.43, 1985-2000(2005))을 사용할 수 있다.

EDC는 수용성 카르보디이미드의 1종이며, 수용성 카르보디이미드라면 그 종류를 불문하고 가교제로서 사용할 수 있지만, 그 중에서도, 저렴하면서 또한 안전성이 높은 EDC가 특히 바람직하게 사용된다. 수용성 카르보디이미드는 1종을 단독으로 또는 2종 이상을 조합하여 사용된다. 또한, EDC는 단독으로 사용해도 되고, NHS와 혼합하여 사용해도 된다. EDC에 의한 가교 반응은 NHS의 혼합에 의해 촉진된다는 것이 알려져 있다.

본 실시 형태의 졸이 게니핀을 함유하는 경우, 게니핀 농도는 환부 송달까지 졸의 유동성을 유지한다는 관점에서, 1800mg/L 이하로 할 수 있으며, 40mg/L 내지 1400mg/L가 바람직하고, 예를 들어 100mg/L 내지 1000mg/L로 할 수 있다. 게니핀 농도를 이러한 범위로 함으로써, 카테터 내에서의 졸의 유동성을 유지하면서, 겔 강도를 가교에 의해 증강시킬 수 있다.

또한, 본 실시 형태의 졸에는, 종래의 콜라겐 수용액에 사용되는 각종 용매 및 첨가제가 더 포함되어도 된다. 그러한 용매 및 첨가제로서는, 예를 들어 희염산, 시트르산, 아세트산 등의 산을 들 수 있다.

상기 첨가제 및 용매는 1종을 단독으로 또는 2종 이상을 조합하여 사용된다. 또한, 졸에 있어서의 상기 첨가제 및 용매의 함유 비율은, 본 실시 형태의 졸의 원하는 특성을 저해하지 않는 범위라면 특별히 한정되지 않는다.

본 실시 형태의 졸은, 내시경 치료, IVR 치료 등의 카테터를 사용한 저침습 치료에 있어서 유용하며, 특히 생체 조직에 생긴 관통 구멍의 폐쇄, 궤양의 보호 및 혈관의 색전에 유용하다.

예를 들어, EMR(내시경적 점막 절제술)이나 ESD(내시경적 점막하층 박리술) 등의 내시경 치료에 있어서, 우발증으로서의 천공의 발증이 문제가 되고 있다. 천공의 폐쇄는 클리핑으로 행해지지만, 수개의 클립을 하나씩 스코프 경유로 송달하는데 손이 많이 가고, 또한 천공을 확실하게 폐쇄하기 위해서는 내시경 디바이스의 고도의 조작 기술을 요한다. 내시경 치료 후의 궤양 치유의 불량 등에 의한 후출혈이나 지발성 천공 등도 보고되어 있다.

또한, IVR 치료에서는, 혈관 색전 치료술이 보급되어 있다. 혈관 색전 치료술이란 간장 등의 암의 치료와 소화관이나 폐로부터의 출혈의 지혈을 목적으로 하여, 동맥에 삽입된 카테터를 통하여 색전재를 혈관 내로 보내는 수기이다. 구체적으로는, 색전재가 장기 내의 병변부 근방으로 송달되어, 암 병소에 영양을 공급하는 혈관과, 출혈의 원인으로 되는 혈관에, 각각 송달되어 혈류를 차단하는 방법이다. 색전재에 종래 사용되고 있는 젤라틴 스펀지는 환부 사이즈에 맞추어 커트할 필요가 있으며, 그 사이즈가 부적합한 경우에는 색전이 달성되지 않는다고 하는 문제도 있다. 또한, 코일도 색전재로 사용되지만, 고가이며, 한번 송달된 것은 영구히 체내에 남는다.

본 실시 형태의 졸은, 카테터를 통하여 생체 조직에 투여 가능한 긴 유동성 유지 시간, 송달 후에 생체 온도로 빠르게 겔화하는 체온 응답성, 및 겔화한 후에 생체 조직에 접착되는 특성을 구비하기 때문에, 상기와 같은 용도에 있어서 특히 유용하며, 보다 구체적으로는, ESD나 EMR 등의 내시경 치료 시에 형성되는 궤양부의 보호(이에 수반하는 궤양부의 수복을 포함함), 클리핑 조작을 용이하게 행하기 위한 일시적 폐쇄도 포함한 천공부의 폐쇄, IVR 치료 시의 혈관 색전 등에 있어서 유용하다.

종래의 생체 접착제는, 조합 후 빠르게 점도가 상승하여 1분 전후로 겔화에 이르는 것이었지만, 본 실시 형태의 졸은, 카테터를 통하여 생체 조직에 투여 가능한 긴 유동성 유지 시간(예를 들어, 실온에서 10분간)을 갖고, 예를 들어 내경 2.2mm, 전체 길이 2.8m의 카테터를 경유하여, 예를 들어 내시경이나 투시 화상하에서 송달할 수 있다. 또한, 본 실시 형태에 있어서, 카테터를 통한 투여에는, 분무용 카테터를 사용한 투여도 포함된다. 투여에 사용하는 카테터의 내경 및 길이는, 투여 부위나 졸의 점도 등에 따라 적절하게 변경할 수 있지만, 예를 들어 내경 0.5mm 내지 2.8mm, 길이 1m 내지 3m의 카테터를 사용할 수 있다. 본 실시 형태의 졸은, 내경이 작은 카테터(예를 들어 내경 0.5mm 내지 2.5mm)나, 긴 카테터(예를 들어, 길이 1.5m 내지 3m)를 사용해도 생체 조직에 투여 가능하다고 하는 특성을 갖는다.

본 실시 형태의 졸의 점도는, 카테터의 구멍 직경에 따라 적절하게 조정 가능하지만, 예를 들어 전단 속도 1s^-1에 있어서 23℃에서 계측되는 점도가 0.2Paㆍs 내지 52Paㆍs, 바람직하게는 2Paㆍs 내지 20Paㆍs, 보다 바람직하게는 5Paㆍs 내지 12Paㆍs이다. 상기 범위의 점도이면, 투여 중에는 유동성을 가지며, 또한 투여 후에는 환부에 체류하여 원하는 위치에 겔 형성을 행할 수 있다. 점도의 측정은, 후술하는 실시예에 예시하는 바와 같이, 일본 공업 규격 (JIS)K7117-2에 기술되는 원뿔-평판 시스템을 사용하여, 전단 속도를 제어할 수 있는 공지의 레오미터를 사용하여 행할 수 있다. 본 실시 형태의 콜라겐 졸과 같은 고분자 용액은 비뉴턴 유체이며, 계측 시의 전단 속도가 증가하면 점도가 저하되어, 어떤 점도값으로 수렴된다. 따라서, 본 실시 형태의 졸의 점도는, 점도의 차이가 명료하게 관찰되는 저전단 속도에 있어서, 구체적으로는 전단 속도 1s^-1에서 계측되는 점도로서 기술된다.

상기한 바와 같이 카테터를 통하여 생체 조직에 투여한 후, 본 실시 형태의 졸은, 생체 온도(체온)에서 빠르게 겔화를 개시하여 국소적으로 겔을 형성하여, 생체 조직 구멍 폐쇄, 궤양 보호 및 혈관 색전을 행할 수 있다. 겔화는, 통상, 투여 후 37℃에 도달하고 나서 5분 이내에 일어난다. 형성되는 겔의 강도는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 후술하는 실시예에 기재된 압축 시험 또는 관입 시험 등에 의해 결정되는 탄성률로서 10kPa 내지 200kPa의 범위가 바람직하며, 보다 바람직하게는 20kPa 내지 100kPa의 범위이다. 탄성률이 지나치게 작으면, 겔이 용이하게 변형되어, 생체 조직 구멍의 폐쇄나 혈관 색전이 파탄되는 경우가 있다. 겔 주위의 생체 조직을 대폭 초과하는 탄성률을 나타내는 경우, 생체 조직이 변형된 경우에 탄성률의 차이에 의해 겔-생체 조직의 접착이 파탄되는 경우가 있다.

상기한 바와 같이, 국소적으로 겔을 형성할 때, 우선은 생체 조직 상에서 콜라겐이 섬유화(자기 조직화의 일종)되어 겔을 형성한다(1차 겔화). 게니핀 등의 가교제를 졸이 함유하고 있는 경우, 콜라겐 섬유 겔에 가교가 도입되어(2차 겔화), 겔의 강도가 높아짐과 함께, 콜라겐과 생체 조직의 사이를 화학적으로 보다 견고하게 접착한다.

본 실시 형태의 졸은, 생체 조직의 점막하층에 침투되어, 정착될 수 있다.

이상의 특성에 의해, 본 실시 형태의 졸은, 유동이 발생하는 생체 내에서 국소적으로 재현성 좋게, 천공을 폐쇄하고, 혈관을 색전할 정도의 조직 정착성과 강도를 구비한 겔을 형성할 수 있다. 형성된 겔은, 안전성 및 생체 적합성이 우수한 성분 조성의 겔이며, 통상의 콜라겐의 경우와 마찬가지로, 서서히 가수분해, 효소 분해 등의 작용을 받는다.

본 실시 형태의 졸은, 투여 대상 환부의 상태에 따라, 약제를 더 포함해도 된다. 그러한 약제로서는, 종래의 인젝터블 겔에 함유되는 것이라면 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어 생리 활성을 갖는 펩티드류, 단백류, 그 밖의 항생 물질, 항종양제, 호르몬제 등을 들 수 있다. 약제는 1종을 단독으로 또는 2종 이상을 조합하여 사용된다. 또한, 약제의 함유 비율은, 그 약제의 효능을 발휘하면서, 본 실시 형태의 겔의 원하는 특성을 저해하지 않는 범위이면 특별히 한정되지 않는다.

본 실시 형태는, 또한 생체 조직에 접촉하면 겔화하여 생체 조직에 부착되는 졸에 의해, 생체 조직 구멍 폐쇄, 궤양 보호 또는 혈관 색전을 행하기 위한 키트에 관한 것이기도 하다.

일 양태에 있어서, 상기 키트는, 상기 졸을 형성하기 위한 콜라겐, 염화나트륨 및 완충제를 포함하고, 목적에 따라 게니핀, 졸 투여용 카테터 등을 더 포함한다. 키트에 포함되는 각 성분은 용액 상태여도 되고, 건조 상태에서 키트에 포함되는 성분을 사용 전에 적절하게 용해하여 졸을 형성해도 된다.

일 양태에 있어서, 상기 키트는 0.6질량％ 내지 3질량％의 콜라겐, 물, 200mM 내지 330mM의 염화나트륨 및 완충제를 함유하고, pH가 6.0 내지 9.0인 생체 조직 구멍 폐쇄용 졸과, 게니핀을 포함하는 키트여도 된다.

본 실시 형태는 또한, 상기 졸을 사용한 생체 조직 구멍 폐쇄 방법, 궤양 보호 방법 또는 혈관 색전 방법에 관한 것이기도 하다. 또한, 본 실시 형태는, 이들 방법을 포함하는, 내시경 치료 및 IVR 치료 등의 저침습 치료 방법에 관한 것이기도 하다. 이들 방법은, 본 실시 형태의 졸에 관한 상술한 기재를 참조하여 실시할 수 있다.

<실시예>

이하, 실시예 및 비교예에 기초하여 본 실시 형태를 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이하의 실시예 및 비교예에 한정되는 것은 아니다.

[콜라겐 용액의 준비]

농도 1.0질량％의 돼지 피부로 만들어진 콜라겐 용액(텔로펩티드 제거형 콜라겐, 닛폰 햄 가부시키가이샤제, 콜라겐의 변성 온도: 40℃)을 콜라겐 원액으로서 준비하였다. 증발기(수용 온도: 29℃)를 사용하여 콜라겐 용액을 농축하여, 농도 2.4질량％의 콜라겐 용액을 얻었다. 이것을 15mL 원심 튜브 혹은 50mL 원심 튜브에 소분하여, 냉장고에 보관하였다.

[게니핀 수용액의 준비]

게니핀(와코 쥰야쿠 고교 가부시키가이샤제)을 순수에 용해하여, 농도 24mM(5430mg/L)의 게니핀 수용액을 조제하였다. 이것을 순수로 희석하여, 상이한 농도의 게니핀 수용액을 조제하였다.

[NPB의 준비]

농도 50mM의 인산수소2나트륨 수용액(140mM의 염화나트륨 함유) 및 농도 50mM의 인산2수소나트륨 수용액(140mM의 염화나트륨 함유)을, 순수를 용매로 하여 조제하였다. 이것들을 pH 미터(HORIBA사제, 상품명 「NAVIh F-71」)에 의해 측정하면서 교반ㆍ혼합하여, pH7.0의 140mM 염화나트륨 함유 50mM 인산 완충액으로 조정하고, 이것을 1×NPB로 정의하였다. 또한, 실시예 전체에 있어서, 특필하지 않는 한, pH는 상기 pH 미터를 사용하여 23℃에서 측정하였다. 마찬가지의 조작에 의해 12×NPB(pH7.0의 1.68M 염화나트륨 함유 0.6M 인산 완충액)를 조제하고, 순수로 희석하여 상이한 배수의 NPB(n×NPB)를 조제하였다.

[실시예 1]

[a. 콜라겐 졸의 조제: 동물 실험 이외에 사용하는 경우]

상기와 같이 하여 준비한, 15mL 원심 튜브에 들어간 콜라겐 용액 6g을, 크래쉬 아이스를 채운 발포 스티롤 용기 내에 정치하였다. 튜브 내에는 교반을 촉진시키기 위한 마그네틱 스터러(10.8g, 내경 10mm×39mm)를 수용하였다. 이어서, 4℃ 냉장고 내에 정치한 게니핀 수용액 2mL 및 실온에 정치한 10×NPB 2mL를 마이크로 피펫으로 빨아올려, 콜라겐 용액이 든 원심 튜브에 첨가하고, 그 원심 튜브를 격렬하게 흔들어 섞어 교반하였다. 약 30초간 교반한 후의 원심 튜브를 원심 분리기의 소정 위치에 세트하여, 3200rpm, 1.5분간의 조건에서 원심 분리를 행하여, 기포를 액 상면에 모으고, 1.44％ 콜라겐 졸(용매, 2×NPB; 게니핀 농도, 4mM(905mg/L))을 얻었다.

[b. 콜라겐 졸의 조제: 동물 실험에 사용하는 경우]

상기와 같이 하여 준비한, 50mL 원심 튜브에 들어간 콜라겐 용액 12g을, 크래쉬 아이스를 채운 발포 스티롤 용기 내에 정치하였다. 튜브 내에는 교반을 촉진시키기 위한 마그네틱 스터러(10.8g, 내경 10mm×39mm)를 수용하였다. 이어서, 동일하게 크래쉬 아이스를 채운 용기 내에 정치한 20mM 게니핀 수용액 4mL 및 실온에 정치한 10×NPB 4mL를 마이크로 피펫으로 빨아올려, 콜라겐 용액이 든 원심 튜브에 첨가하고, 그 원심 튜브를 격렬하게 흔들어 섞어 교반하여, 1.44％ 콜라겐 졸(용매, 2×NPB; 게니핀 농도, 4mM(905mg/L))을 얻었다. 이것을 실시예 1의 돼지 위 천공 폐쇄 실험용으로서 사용하였다.

[실시예 2]

콜라겐 농도를 1.44％로부터 1.6％로 높인 것을 제외하고 실시예 1과 동일한 조성의 콜라겐 졸을 조합하였다.

[실시예 3]

NPB 농도를 2×NPB로부터 1.8×NPB로 저하시킨 것을 제외하고 실시예 1과 동일한 조성의 콜라겐 졸을 조제하였다.

[실시예 4]

NPB 농도를 2×NPB로부터 1.6×NPB로 저하시킨 것을 제외하고 실시예 1과 동일한 조성의 콜라겐 졸을 조제하였다.

[실시예 5]

게니핀 농도를 4mM으로부터 2mM(452mg/L)으로 저하시킨 것을 제외하고 실시예 1과 동일한 조성의 콜라겐 졸을 조제하였다.

[실시예 6]

게니핀을 포함하지 않는 것을 제외하고 실시예 1과 동일한 조성의 콜라겐 졸을 조합하였다.

[비교예 1]

실시예 1의 콜라겐 졸의 NPB 농도를 2×NPB로부터 2.4×NPB로 높이고, 게니핀 농도를 4mM으로부터 8mM(1810mg/L)으로 높인 콜라겐 졸을 조제하였다.

[비교예 2]

NPB 농도를 2×NPB로부터 1×NPB로 저하시킨 것을 제외하고 실시예 1과 동일한 조성의 콜라겐 졸을 조제하였다.

[비교예 3]

NPB 농도를 2×NPB로부터 1×NPB로 낮추고, 콜라겐 농도를 1.44％로부터 0.5％로 낮춘 것을 제외하고 실시예 1과 동일한 조성의 콜라겐 졸을 조제하였다.

[시험 방법]

[돼지 위의 천공 폐쇄 실험]

SPF 돼지(체중 30kg)를 사용하여 급성 천공 폐쇄 실험을 행하였다. 전신 마취 하, 돼지 위에 대하여 생리 식염수를 점막하에 국소 주입하고, 팽융 형성된 가상 병변에 대하여, ESD 전용 나이프를 사용하여 ESD를 실시하였다. 형성된 궤양 바닥에 대하여, 내경 5mm의 천공을 제작하였다. 탈기에 의한 위의 허탈을 확인 후, 신속하게 콜라겐 졸을 카테터(전체 길이 2400mm; 제품명: 파인 제트 S2825(가부시키가이샤 톱); 내경: 2.2mm; 선단 100mm를 가위로 절단) 경유로 천공부에 송달하였다. 송기에 의해 위가 확장되는 것을 확인한 후, 1시간 안정시키고, 돼지를 안락사시킨 후에 위를 적출하였다. 위의 유문을 겸자로 폐쇄하고, 분문으로부터 물을 주입하여 위를 물로 채우는 누설 시험을 실시하였다. 누설 시험 후, 천공부를 포함하는 개소를 절제ㆍ고정화하여 헤마톡실린-에오진(HE) 염색에 의한 조직 관찰에 제공하였다.

[돼지 결장의 천공 폐쇄 실험]

SPF 돼지(체중 30kg)를 사용하여 급성 천공 폐쇄 실험을 행하였다. 전신 마취 하, 돼지 결장에 대하여, ESD 전용 나이프를 사용하여 내경 5mm의 천공을 제작하였다. 탈기에 의한 결장의 허탈을 확인 후, 신속하게 콜라겐 졸을 카테터([돼지 위의 천공 폐쇄 실험]과 마찬가지임) 경유로 천공부에 송달하였다. 송기에 의해 결장이 확장되는 것을 확인한 후, 1시간 안정시키고, 돼지를 안락사시킨 후에 결장을 절단, 적출하였다. 절단된 결장의 편측을 겸자로 폐쇄하고, 한쪽 개구부로부터 물을 주입하여 결장을 물로 채우는 누설 시험을 실시하였다.

[돼지 위의 ex vivo 궤양 보호 시험]

내시경 치료로 생기는 궤양의 콜라겐 겔에 의한 피복 처치를 모방한, 돼지 절제 위를 사용한 ex vivo 궤양 보호 시험을 행하였다. 약 60×60mm의 돼지 절제 위에 대하여, 23G의 바늘을 사용하여 생리 식염수를 점막하 국소 주입하여 팽융을 형성시키고, 절제 위의 중앙에 수술용 메스를 사용하여 30×30mm의 인공 궤양을 제작하였다. 이와 같이 얻어진 시험편을, 60°로 경사지게 한 알루미늄판 상에 고정하고, 37℃, 습도 70％로 설정한 인큐베이터(Rcom Max 20; Autoelex사제)에 설치하였다. 적외 온도계(IT-545; 호리바 세이사쿠쇼제)를 사용하여 시험편의 표면 온도가 37℃에 도달하였음을 확인한 후, 18G의 시린지 니들을 사용하여 시험편의 인공 궤양부에 콜라겐 졸(3mL)을 송달하였다. 그대로 2시간 정치하여, 콜라겐의 겔화를 완료시켰다.

인공 궤양부에 형성된 콜라겐 겔의 접착과 두께를 평가하기 위해, 시험편을 조직 관찰에 제공하였다. 시험편을 4％ 파라포름알데히드 수용액으로 고정하고, 20％ 수크로오스 수용액으로 치환한 후, 4％ 카르복시메틸셀룰로오스 수용액으로 포매하였다. 이것을 -100℃에서 5분간 동결하고, 동결 마이크로톰(CM3050S; 레이카 마이크로 시스템즈사제)을 사용하여 두께 20㎛의 절편을 제작하였다. 얻어진 절편을 풍건하고, 헤마톡실린-에오진 염색을 실시하였다. 70％에서 99.5％로 단계적으로 농도를 증가시킨 에탄올 수용액으로 절편을 세정하고, 봉입제(Eukitt; Kindler사제)로 봉입한 후, 정립 현미경(BX53; 올림푸스사제)에 의해 관찰하였다.

[동적 점탄성 시험]

[점도 측정]

동적 점탄성 측정 장치(HAAKE MARSIII; ThermoFisher Scientific제)를 사용한 회전 모드에 의해, 콜라겐 졸의 점도를 측정하였다. 23℃로 설정한 내경 60mm의 더블 콘 센서(DC60/1Ti, 콘 각도 1°)에 콜라겐 졸을 충전하고, 전단 속도 1s^-1의 회전을 개시하였다. 각 스텝의 유지 시간 20s에서 전단 속도를 단계적으로 100s^-1까지 증가시켜, 응력을 계측하고, 전단 속도와 응력으로부터 점도를 산출하였다. 얻어진 점도 곡선(점도 vs 전단 속도)으로부터 콜라겐 졸의 유동 특성이 비뉴토니안임을 확인한 후, 전단 속도 1s^-1일 때의 점도값을 채용하였다.

[동적 점탄성 측정]

동적 점탄성 측정 장치(점도 측정에서 사용한 것과 마찬가지임)를 사용한 동적 측정(진동 모드)에 의해, 콜라겐 졸의 체온 응답성의 겔화 속도를 계측하였다. 23℃로 설정한 더블 콘 센서에 콜라겐 졸을 충전하고, 전단 변형을 제어한 동적 측정(주파수, 1Hz; 전단 변형, 0.005)을 개시하였다. 5min 경과 후, 온도를 23℃에서 37℃까지 30s에 걸쳐 증가시키고, 그대로 37℃에서 유지하였다. 전체 행정에 있어서 저장 탄성률(G') 및 손실 탄성률(G")의 변화를 추적하였다. 실온에서는 G'<G"였던 점탄성 특성이, 장치 온도가 37℃에 도달하고 나서 G'=G"로 될 때까지의 시간을 겔화 시간이라고 정의하였다.

[디쉬 상에 제작한 겔의 관입 시험]

겔 중앙부에 프로브를 관입시키는 역학 시험에 의해, 콜라겐 겔의 역학 특성을 평가하였다. 6well 바이올로지컬 플레이트에 약 3g/well(내경 35mm)의 콜라겐 졸을 첨가하고, 37℃의 수욕에 띄워 가온하였다. 30min 경과 후, 건조를 방지하기 위해 플레이트 전체를 파라필름으로 덮고, 37℃ 인큐베이터에 24h 정치하여 겔화를 완료시켰다. 텍스처 애널라이저(TA.XTplus; Stable Microsystems사제)를 사용하여, 얻어진 겔의 중앙부에 대하여 직경 5mm의 스테인리스제 원기둥 프로브를 속도 0.2mm/s로 관입시켜, 응력-왜곡선을 얻었다. 응력-왜곡선에 있어서의 왜곡 0.005 내지 0.04의 직선 영역의 기울기로부터 탄성률을 산출하였다.

[시험예 1]

실시예 1의 콜라겐 졸을 사용하여, 시험 방법에 기재된 돼지 위의 천공 폐쇄 실험을 행하였다. 돼지 위의 천공 형성, 콜라겐 졸 송달, 겔화 및 천공 폐쇄의 모습을 도 1에 도시한다. 천공부의 졸이 겔화된 직후에 송기를 행하면 위가 확장됨으로써, 천공부가 폐쇄되었음이 증명되었다.

적출한 위의 누설 시험의 모습을 도 2에 도시한다. 폐쇄된 2개소의 천공으로부터의 누수는 보이지 않아, 천공부의 폐쇄가 유지되고 있음이 증명되었다.

천공부를 포함하는 돼지 위 조직의 HE 염색 상을 도 3에 도시한다. 천공부는 겔이 마개가 되도록 하여 폐쇄되며, 겔과 조직이 밀착되어 있는 모습이 관찰되었다.

[시험예 2]

실시예 1 및 2의 콜라겐 졸을 사용하여, 시험 방법에 기재된 돼지 결장의 천공 폐쇄 실험을 행하였다. 돼지 결장의 천공 형성, 콜라겐 졸 송달 및 천공 폐쇄의 모습을 도 4에 도시한다. 천공부의 졸이 겔화된 직후에 송기를 행하면 결장이 확장됨으로써, 천공부가 폐쇄되었음이 증명되었다.

적출한 결장의 누설 시험의 모습을 도 5에 도시한다. 어느 졸을 사용한 경우에도, 폐쇄된 2개소의 천공으로부터의 누수는 보이지 않아, 천공부의 폐쇄가 유지되고 있음이 증명되었다. 또한, 실시예 1의 콜라겐 졸을 결장 천공 폐쇄에 사용한 경우, 천공부에 생기는 압력차로 졸이 장 밖으로 유출되어, 천공부에 겔을 잘 형성할 수 없는 경우도 있었지만, 실시예 1(1.44％)보다 농도가 보다 높은 실시예 2의 콜라겐 졸(1.6％)을 사용한 경우에는, 천공부에 있어서의 겔 형성이 보다 용이하였다.

[시험예 3]

실시예 3의 콜라겐 졸을 사용하여, 시험 방법에 기재된 돼지 위의 천공 폐쇄 실험을 행하였다. 시험예 1과 마찬가지의 방법으로 제작한 돼지 위궤양 바닥에 대한 천공 형성, 콜라겐 졸 송달 및 천공 폐쇄의 모습을 도 6에 도시한다. 천공부의 졸이 겔화된 직후에 송기를 행하면 위가 확장됨으로써, 천공부가 폐쇄되었음이 증명되었다. 생리 식염수를 겔에 분사해도 겔은 파괴되지 않았다(도 6).

또한 내경이 큰 천공(내경 10mm)을 다른 위치에 작성하고, 마찬가지로 겔로 천공을 폐쇄하였다(도 6의 e). 생리 식염수를 겔에 분사해도 겔은 파괴되지 않았다(도 6의 f). 천공 주위의 궤양 바닥에 확산ㆍ부착된 겔도, 생리 식염수의 분사에 의해 박리되지 않아, 궤양을 보호하고 있음을 확인하였다. 실시예 3의 콜라겐 졸은, 실시예 1 및 2와 동일 농도의 게니핀을 포함하며, 겔화되었을 때의 강도가 궤양 보호에 충분한 강도라고 생각되었다.

[시험예 4]

실시예 1, 실시예 4, 비교예 2 및 비교예 3의 콜라겐 졸을 사용하여, 시험 방법에 기재된 돼지 위의 ex vivo 궤양 보호 시험을 행하였다. 결과를 도 7에 도시한다. 경사지게 한 돼지 절제 위궤양부에 실시예 1 및 실시예 4의 콜라겐 졸을 분사한 경우, 점막하층 표면에는 대조 시험과 유사한 콜라겐 겔층의 형성이 보였다. 겔층의 두께는, 실시예 1의 졸을 사용한 경우에는 24±4mm(10점의 평균값±표준 편차), 실시예 4의 졸을 사용한 경우에는 20±2mm(10점의 평균값±표준 편차)로 계측되었다.

실제 수술에 있어서 궤양부가 하방에 위치된다고만은 할 수 없다. 만약 하방에 위치된 경우, 겔화될 때까지 시간이 있어도 졸은 궤양 바닥으로부터 산일되지 않고 겔화된다(도 7의 대조). 그러나, 임상에서는 궤양부가 위의 측방에 위치하는 경우가 자주 있다. 본 시험예의 결과는, 실시예의 졸이 중력에 의해 산일되기 쉬운 측방 궤양에 대해서도, 신속한 겔화에 의해 궤양을 겔층으로 보호 가능함을 나타내고 있다.

한편, 비교예 2의 콜라겐 졸을 사용한 경우, 콜라겐 겔층이 형성된 부위로 되지 않는 부위가 생기고, 형성된 부위에 있어서도 겔층의 두께는 11±2mm(10점의 평균값±표준 편차)까지 감소하였다. NPB 농도를 낮춤으로써 졸에 포함되는 염화나트륨 농도가 PBS와 동일한 140mM까지 저하되고, 콜라겐 섬유화의 체온 응답성이 저하되었기 때문에(시험예 5 및 도 8 참조), 분사한 대부분의 콜라겐 졸이 겔화 전에 궤양부로부터 산일되어 버렸다고 생각되었다.

비교예 3의 콜라겐 졸을 사용한 경우, 경사지게 한 돼지 절제 위궤양부에 콜라겐 졸을 분사하면, 콜라겐 졸은 겔화 전에 궤양부로부터 산일되어, 조직 절편으로부터는 겔층의 형성을 확인할 수 없었다. 콜라겐 농도의 저하에 의해, 겔에 의한 궤양 보호가 곤란해진다고 생각되었다.

[시험예 5]

실시예 1, 실시예 2 및 비교예 2의 콜라겐 졸의 동적 점탄성 시험을 실시하였다. 겔화의 체온 응답성을 평가한 결과를 도 8의 a에 도시한다.

실시예 1 및 실시예 2의 콜라겐 졸을 사용한 경우, 장치 온도를 23℃로 유지한 최초 5분간 G'는 변화하지 않고, 37℃에 도달한 직후에 G'는 지수 함수적으로 증가하였다.

한편, 비교예 2의 콜라겐 졸을 사용한 경우, 콜라겐 섬유화의 체온 응답성은 저하되었다. 이것은, NPB 농도를 낮춤으로써 졸에 포함되는 염화나트륨 농도가 PBS와 동일한 140mM까지 저하되었기 때문이라고 생각되었다.

이어서, 실시예 1, 실시예 5 및 실시예 6의 콜라겐 졸(각각, 게니핀 4mM, 2mM 및 0mM)의 동적 점탄성 시험을 실시하였다. 계측 개시로부터 30분(장치 온도가 37℃에 도달하고 나서 24.5분)까지 G'를 추적한 결과를 도 8의 b에 도시한다. 게니핀의 농도의 차이는, 37℃ 도달 직후의 지수 함수적인 G' 증가에는 거의 영향을 미치지 않았지만, 37℃ 도달 후 5분이 경과하였을 때부터, 게니핀 농도에 의존하여 G'가 서서히 증가하였다. 한편, 게니핀을 첨가하지 않은 경우, 37℃에 도달 후 7분만에 G'의 증가는 거의 종료되었다.

도 8에 도시한 이들 결과로부터, 콜라겐 졸이 생체 조직에 접촉하고 나서 빠르게 발생하는 겔화를 콜라겐의 섬유화가 담당하고, 이 콜라겐 섬유 겔을 게니핀 이 서서히 가교한다고 하는 2단계의 공정으로 견고한 겔이 얻어지는 것이라고 생각되었다.

[시험예 6]

콜라겐의 섬유화에 의한 겔화와 게니핀 가교에 의한 겔화를 나누어 기술하기 위해, 게니핀을 첨가하지 않는 1.44％ 콜라겐 졸인 실시예 6의 콜라겐 졸의 NPB 농도(2×NPB)를, 1, 1.4, 1.6 및 1.8(×NPB)로 변화시켜 동적 점탄성 시험을 실시하고, 체온 응답성의 섬유화에 의한 겔화 거동을 조사하였다. 결과를 도 9의 a에 도시한다. 등장액으로서 범용되는 PBS에 상당하는 1×NPB를 사용한 경우, 장치 온도가 37℃에 도달하고 나서 약 5분간 G'의 증가는 관찰되지 않고, 콜라겐의 섬유화는 지연되었다. 한편, NPB 농도를 높이면, NPB 농도에 의존하여 체온 응답성의 겔화가 가속되었다. 37℃ 도달 후의 겔화 시간을 NPB 농도에 대하여 플롯한 결과(도 9의 b)로부터도, NPB 농도의 증가에 의해 콜라겐 섬유화에 의한 겔화가 가속됨을 알 수 있다.

[시험예 7]

실시예 1 및 실시예 6의 콜라겐 졸(각각, 게니핀 농도 4mM 및 0mM), 그리고 이들 졸의 게니핀 농도를 0.2mM 및 1mM으로 한 콜라겐 졸을 사용하여 디쉬 상에 제작한 겔의 관입 시험 결과를 도 10에 도시한다. 얻어진 응력-왜곡선의 전체적인 경사는 게니핀 농도와 함께 증가하며, 콜라겐 겔의 강도가 게니핀의 첨가에 의해 향상되었음이 나타났다. 게니핀 농도가 1mM으로부터 4mM(실시예 1의 농도)에 걸쳐 경사의 증가는 거의 한계치로 되었다(도 10의 a). 게니핀을 포함하지 않는 경우, 겔은 약하게 취화되었다.

한편, 콜라겐 겔의 탄성률도 게니핀 농도와 함께 증가하였지만, 4mM까지 단조로운 증가를 보였다(도 10의 b). 실시예 1의 졸 유래의 겔(게니핀 농도 4mM)에서 얻어진 탄성률은 게니핀을 포함하지 않는 실시예 6의 졸 유래의 겔에 비하여 약 8배 높았다.

도 10의 결과로부터, 게니핀 농도가 1mM에서는 실시예 1의 4mM과 마찬가지의 겔 강도가 얻어져, 게니핀을 첨가하지 않은 겔보다 4.0배 높은 탄성률이 얻어짐을 알 수 있었다. 따라서, 게니핀을 첨가함으로써, 게니핀을 첨가하지 않은 콜라겐 졸보다 단단한 겔을 천공부에 형성할 수 있었다.

[시험예 8]

실시예 6의 콜라겐 졸(콜라겐 농도 1.44％)의 콜라겐 농도를, 0.5, 0.9, 1.2, 1.8 및 2.06％로 변경한 졸을 조제하고, 동적 점탄성 측정 장치의 회전 모드에 의해 전단 속도 1s^-1일 때의 점도를 측정한 결과를 도 11에 도시한다.

콜라겐 농도가 0.5％일 때의 점도는 불과 0.12(Paㆍs)였지만, 농도를 1.44％까지 높이면 점도는 6.56(Paㆍs)까지 증가하고, 농도가 2.06％로 되면 점도는 19.4(Paㆍs)에 달하였다. 이와 같이, 콜라겐 졸의 점도는 콜라겐 농도에 대하여 지수 함수적으로 변화하는 성질이 있기 때문에, 콜라겐 졸의 소화관 내에서의 국소 체류성 및 카테터와 같은 세관에 대한 도입성이라고 하는, 상반된 성질을 충족하기 위한 농도 조절이 중요하다.

[시험예 9]

비교예 1의 콜라겐 졸을 사용하여, 돼지 위의 천공 폐쇄 실험을 시도하였다. 그러나, 도 12에 도시하는 바와 같이, 카테터로부터 토출된 졸은 이미 겔화되고(도 12의 a), 끈 모양으로 겔화된 콜라겐은 궤양 바닥에 부착되지 않고 미끄러져 떨어졌다(도 12의 b). 추가 토출을 행하였지만, 카테터 선단으로부터 끈 모양 콜라겐 겔이 토출되었다(도 12의 c 및 12의 d).

구강 및 식도를 경유하도록 설치된 내시경은 체온에 의해 가온되며, 거기에 삽입된 카테터도 실온보다 높은 온도까지 가온된다. 고농도의 NPB 및 게니핀의 사용에 의해 체온 응답성의 겔화가 지나치게 가속된 콜라겐 졸의 경우, 환부에 대한 송달 전에 겔화하는 경우가 있어, 생체 조직 구멍의 폐쇄, 궤양의 보호 및 혈관 색전 용도로는 적합하지 않다고 생각되었다.

※ 평가

A. In vivo 돼지 위 천공 폐쇄

B. In vivo 돼지 결장 천공 폐쇄

C. Ex vivo 돼지 위궤양 보호

D. 겔화의 체온 응답성 평가

E. 겔의 관입 시험

F. 회전 점도 측정

<산업상 이용가능성>

본 발명에 따르면, 관통 구멍의 폐쇄, 궤양의 물리적 보호 및 혈관 색전에 적합한 3가지 특성인 (1) 카테터를 통하여 생체 외로부터 생체 내로 송달하는 것이 가능한 긴 유동성 유지 시간, (2) 송달 후 신속하게 겔화하는 예민한 체온 응답성, 및 (3) 겔화된 후에 경화를 일으켜, 생체 조직에 정착하는 성질을 구비한 졸에 의해, 관통 구멍의 폐쇄, 궤양의 물리적 보호 및 혈관 색전을 행할 수 있다. 본 발명은 의료 분야에 있어서의 산업상 이용 가능성을 갖는다.

본 출원은, 2016년 11월 17일에 출원된 일본 특허 출원 제2016-224255호에 기초하는 우선권을 주장하는 것이며, 그 내용은 여기에 참조로서 원용된다.

Claims

0.6질량％ 내지 3질량％의 콜라겐, 물, 200mM 내지 330mM의 염화나트륨 및 완충제를 함유하고, pH가 6.0 내지 9.0인, 생체 조직 구멍 폐쇄용 졸.
0.6질량％ 내지 3질량％의 콜라겐, 물, 200mM 내지 330mM의 염화나트륨 및 완충제를 함유하고, pH가 6.0 내지 9.0인, 궤양 보호용 졸.
0.6질량％ 내지 3질량％의 콜라겐, 물, 200mM 내지 330mM의 염화나트륨 및 완충제를 함유하고, pH가 6.0 내지 9.0인, 혈관 색전 치료술용 졸.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 완충제가 인산염을 포함하는, 졸.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
게니핀 또는 게니핀 유도체를 40mg/L 내지 1400mg/L의 범위로 함유하는, 졸.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
콜라겐이 텔로펩티드 제거형 콜라겐을 포함하는, 졸.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
1.4질량％ 내지 1.7질량％의 콜라겐을 함유하고, 카테터를 통하여 생체 조직에 국소 투여되는, 졸.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
생체 조직에 접촉하면 겔화하여 생체 조직에 부착되는, 졸.