KR20190054716A

KR20190054716A - 가뭄 저항성 유전자 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20190054716A
Application number: KR1020170151609A
Authority: KR
Inventors: 김범기; 윤인선; 권택윤; 김진애; 민명기; 이용상; 송인식
Original assignee: 대한민국(농촌진흥청장)
Priority date: 2017-11-14
Filing date: 2017-11-14
Publication date: 2019-05-22
Also published as: KR102026766B1

Abstract

본 발명은 가뭄 저항성 OsPYL/RCAR7 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 벼에서 분리한 OsPYL/RCAR7 유전자를 형질전환한 식물체가 내건성 증진에 효과가 있는 것을 확인하여 이를 이용하여 식물의 생장 및 수확량에는 영향이 없는, 내건성이 우수한 식물체를 생산하는데 이용할 수 있다.

Description

가뭄 저항성 유전자 및 이의 용도{A novel genes for enhancing drought resistance and their uses}

본 발명은 가뭄 저항성 벼 유전자인 OsPYL/RCAR7 및 이의 용도에 관한 것이다.

고등식물은 이동이 불가하기 때문에 그들의 일생동안 다양한 환경 요인들인 가뭄, 고염(high salt), 중금속, 냉해, 열충격 및 오존과 같은 스트레스에 직면하게 된다. 이러한 비생물학적 스트레스는 작물의 생장과 발달의 제한 요인이 되며 이들 스트레스 중에서 수분 부족은 작물생산 감소의 주요 원인으로 여겨지는 가장 심각한 환경 요인이다. 세계적으로 물의 소비는 계속적으로 증가되어 왔으며, 깨끗한 물의 이용가능성은 인간뿐만 아니라 고등식물에게 또한 중요한 문제가 될 수 있다. 식물은 단기적 또는 장기적인 물부족에 대해 내성을 증가시키기 위해 신호 네트워크 경로를 조절하거나 스트레스-반응성 유전자들을 유도하는 등의 다양한 방어 전략을 작동시킨다. 이러한 수분 스트레스에 대한 세포적 또는 유전적 방어 메카니즘은 널리 알려져 있다(Shinozaki and Yamaguchi-shinozaki, 2007). 그러나 아직까지 고등식물에 있어서 스트레스에 대한 내성이나 민감성에 관여하는 스트레스-관련 유전자들의 생물학적 기능들에 대한 지식은 여전히 부족한 상태다. 그러므로 작물의 생산성을 증가시키기 위해 스트레스 반응 유전자들에 대한 기능 연구가 중요하다.

한편, 식물은 가뭄, 염, 추위, 더위, 병충해 등의 다양한 환경적 스트레스에 자주 노출되기 때문에 스트레스의 해로운 효과에 대처하는 생리학적, 생화학적, 분자적 방어 기작을 발전시켜왔으며, 특히 앱시스산(abscisic acid: ABA) 신호 변환 조절은 식물이 상기 스트레스를 극복할 수 있도록 한다. 보고된 바에 의하면, 앱시스산을 미리 처리하고 스트레스를 준 식물은 그렇지 않은 식물에 비해 스트레스에 잘 저항하는 반면 앱시스산을 생성하지 못하거나, 앱시스산에 반응하지 못하는 돌연변이 식물들은 스트레스에 약한 것으로 알려졌다. 따라서 앱시스산의 반응에 관여하는 단백질들을 이용하면, 환경 스트레스에 대한 저항성이 향상된 식물을 개발할 수 있을 것으로 기대되고 있다. 반면에, 앱시스산에 의해 스트레스 저항성은 증가되지만 앱시스산의 작용은 식물의 생장을 저해할 수 있다.

이에, 식물체의 건조 저항성 증진방법이 주요한 과제의 대상이 되고 있으며, 앱시스산의 반응에 관여하는 단백질을 이용하는 방법에 대한 연구가 이루어지고 있으나(한국 특허 공개번호 10-2010-0040789), 아직 미비한 실정이다.

이에, 본 발명자들은 식물 유래의 가뭄 저항성을 가지는 유전자를 탐색하였으며, 가뭄 저항성 벼 유전자인 OsPYL/RCAR7[Oryza sativa PYR1(PYRABACTINE RESISTANCE 1)-LIKE/REGULATORY COMPONENTS OF ABA RECEPTOR7]을 발견하였다. 상기 유전자는 높은 스트레스하에서만 앱스시산에 대한 수용체로 작용하여 저항성을 나타내는 것을 특징으로 하여 기존에 알려진 유전자와 기능이 상이함을 밝힘으로써 본발명을 완성하였다.

한국공개특허 제10-2010-0040789호

본 발명의 목적은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 벼 유래의 OsPYL/RCAR7[Oryza sativa PYR1(PYRABACTINE RESISTANCE 1)-LIKE/REGULATORY COMPONENTS OF ABA RECEPTOR7] 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 가뭄 저항성 증진용 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환 식물체를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환 식물체 제조 방법을 제공하는 것이다.

아울러, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래 OsPYL/RCAR7 단백질을 코딩하는 유전자를 식물체에서 과다 발현시킴으로써 가뭄 저항성을 증가시키는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 벼 유래의 OsPYL/RCAR7 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 가뭄 저항성 증진용 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환 식물체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 형질전환 식물체 제조 방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래 OsPYL/RCAR7 단백질을 코딩하는 유전자를 식물체에서 과다 발현시킴으로써 가뭄 저항성을 증가시키는 방법을 제공하는 것이다.

벼 유래의 OOsPYL/RCAR7[Oryza sativa PYR1(PYRABACTINE RESISTANCE 1)-LIKE/REGULATORY COMPONENTS OF ABA RECEPTOR7] 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 가뭄 저항성 증진용 재조합 벡터로 형질전환 된 식물체는 생육상태는 변화시키지 않고 가뭄저항성을 증진시킬 수 있으므로 환경재해저항성 작물을 개발에 유용하게 이용할 수 있다.

도 1은 다양한 ABA 수용체들이 ABA 신호전달에 미치는 영향을 검증한 결과이다.
도 2는 OsPYL/RCAR7 단백질이 ABA 수용체로서의 기능을 가지는지 여부를 확인하기 위하여 ABA 농도에 따른 OsPP2C와의 상호작용을 검증한 결과이다: A: yeast two hybridization, B: OsPYL/RCAR7의 OsPP2C활성 억제능
도 3은 OsPYL/RCAR7이 과발현된 형질전환 벼의 표현형을 분석한 결과이다. A: 생육 사진, B: 주요농업형질 정량분석
도 4는 벼에서 OsPYL/RCAR7 유전자를 발현시키기 위한 벡터 구조를 나타낸 도이다.
도 5는 OsPYL/RCAR7 유전자를 과발현시킨 형질전환 벼에서 가뭄 스트레스 저항성을 확인한 도이다. A: 생육사진, B: 가뭄처리 후 생존률 검정, C: 수분손실율 검정

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 벼 유래의 OsPYL/RCAR7[Oryza sativa PYR1(PYRABACTINE RESISTANCE 1)-LIKE/REGULATORY COMPONENTS OF ABA RECEPTOR7] 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 내건성(drought tolerance) 증진용 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명에서 용어 "내건성(drought tolerance)"은 식물이 한해(drought damage)에 견뎌낼 수 있는 성질, 즉 가뭄을 견디는 성질로서 내건성 또는 한발저항성이라고도 한다.

상기 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어지는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 또한 상기 유전자는 앱시스산(Abscisic acid, ABA) 수용체인 OsPYL/RCAR7[Oryza sativa PYR1(PYRABACTINE RESISTANCE 1)-LIKE/REGULATORY COMPONENTS OF ABA RECEPTOR7] 단백질을 코딩하는 유전자로, 다른 앱시스산 수용체와 달리 고농도의 앱시스산에서만 수용체로서의 기능을 가짐을 특징으로 한다. 이에 따라, 일반적인 비-스트레스 환경에서는 정상적인 생육을 나타내며, 높은 스트레스 환경에서만 식물 저항성을 증진시키는데 기여하게 된다.

또한, 상기 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함될 수 있다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "발현 벡터"는 흔히 "재조합 벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "재조합 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 재조합 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, pLλ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 리보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다.

한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 (예: λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.

한편, 본 발명의 재조합 벡터가 발현 벡터이고, 진핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.

본 발명의 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신, 테트라사이클린 및 바스타 제초제에 대한 내성 유전자가 있다.

또한, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 벼 유래의 OsPYL/RCAR7 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 가뭄 저항성 증진용 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환 식물체를 제공한다.

상기 식물체는 OsPYL/RCAR7 유전자 발현에 의해 가뭄 저항성이 증가한 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 식물체는 단자엽 식물인 것이 바람직하고, 벼(Oryza sativa L.)인 것이 가장 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.

또한, 본 발명은

(1) 제 1항의 OsPYL/RCAR7 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계;

(2) 상기 벡터를 아그로박테리움을 이용하여 식물체에 형질전환하는 단계; 및

(3) 상기 형질전환체를 선별하는 단계를 포함하는 형질전환 식물체 제조 방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래 OsPYL/RCAR7 단백질을 코딩하는 유전자를 식물체에서 과다 발현시킴으로써 가뭄 저항성을 증가시키는 방법을 제공한다.

<실시예 1> 벼의 OsPYL/RCAR7 단백질 선별

<1-1> 벼 ABA 수용체의 ABA 신호전달 활성 검정

동진벼로부터 total RNA 분리 후 cDNA를 합성하였다. 이들 cDNA를 주형으로 하고 OsPYL/RCAR들에 대하여 제작된 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR산물은 Qiagen사의 Gel extraction kit를 사용하여 정제하였고, 정제된 PCR산물은 Invotrogen사의 pENTR-D TOPO 벡터에 cloning하였고 이들은 과발현용 벡터pGEM3XHA에 클로닝하였다. 상기 구축된 OsPYL/RCAR 유전자 벼 원형질체 일시발현용 벡터와 Rab16a 프로모터-루시퍼라아제가 결합된 ABA 신호반응 리포터 벡터를 동시에 원형질체에 형질전환하여 ABA에 대한 반응성을 조사하였다.

구체적으로, 벼 원형질체 분리 및 형질전환은 하기와 같이 수행하였으며, 형질전환 후 루시퍼라아제 어세이(luciferase assay)를 실시하여 OsPYL/RCAR 단백질 과발현시 ABA에 대한 반응성을 분석하였다.

우선, 벼 원형질체를 분리하고 Rab16a 프로모터-루시퍼라아제 결합 벡터를 형질전환하기 위해, 껍질을 제거한 볍씨를 70% 에탄올과 40% 차아염소산 나트륨을 이용하여 소독을 한 후 고형 배지(1/2MS, 0.8% agar, pH5.7)가 들어있는 식물배양용기에 심고, 28℃ 배양실에서 7일간 암배양 처리하였다. 벼의 잎집(leaf sheath) 부분을 1~2㎜ 크기로 잘게 자른 후 효소 용액(enzyme solution; 1.5% cellulose R-10, 0.75% macerozyme R-10, 0.6M mannitol, 10mM MES, 0.1% BSA, 3.4mM CaCl2, 5mM β-mecaptoethanol, pH5.7)에 4시간 처리하여 세포벽을 제거하였다.

0.45㎛ 크기의 체를 이용하여 벼의 잎집(leaf sheath)을 제거한 후 현탁액을 W5 용액(W5 solution; 0.1% glucose, 0.9% NaCl, 2mM MES, 0.08% KCl, 125mM CaCl2, pH5.7)을 이용하여 세척(washing) 한 후 원심분리를 이용하여 원형질체를 침전시켰다. 상기 침전된 원형질체를 MaMg 용액(MaMg solution; 600mM mannitol, 15mM MgCl2, 5mM MES, pH5.6)을 이용하여 풀어주고 최종적으로 300㎕의 원형질체를 상기 구축된 ABA 수용체 과발현용 벡터 DNA(4㎕)와 Rab16프로모터-루시퍼라아제 결합 벡터 DNA(4㎕), 내재적 대조군(internal control)으로서 UBQ10 프로모터 DNA(1㎕, 레닐라 루시퍼라아제(Renillia luciferase))와 잘 섞고 330㎕의 PEG를 이용하여 형질전환하였다.

루시퍼라아제 활성(luciferase activity)을 검정하기 위해 형질전환된 벼 원형질체를 100㎕ 패시브 용해 버퍼(passive lysis buffer; Promega, USA)를 이용하여 현탁 및 용해하였다. 용해된 원형질체 10㎕를 Promega사의 Dual luciferase assay kit를 이용하여 루시퍼라아제 활성(luciferase activity)을 조사하였다.

그 결과, 하기 도 1에 나타난 바와 같이, OsPYL/RCAR 유전자들은 ABA에 대해 현저하게 다른 반응성을 나타내었다.

그 결과, OsPYL/RCAR7는 다른 수용체와 비교하여 가장 낮은 ABA 반응성을 나타내었고, 이는 앱시스산을 처리하지 않은 대조구와 유사한 수준의 반응성을 나타내었다(도 1).

<1-2> OsPYL/RCAR7 유전자의 앱시스산에 대한 요구성 검정

원형질체 일시발현 시스템에서 OsPYL/RCAR7이 5uM의 앱시스산 처리시에도 대조구와 동일한 활성을 나타냈으므로, 실제로 앱시스산 수용체로서 기능을 할 수 있는지 확인하기 위하여 yeast two hybridization, BiFC 등을 통하여 앱시스산 수용체의 기능을 확인하였다.

yeast two hybridization을 위하여 OsPP2C08, 30, 51의 cDNA를 pGAD7 운반체에 클로닝하고 OsPYL/RCAR1, OsPYL/RCAR5, OsPYL/RCAR6, OsPYL/RCAR7은 pGBKT7에 클로닝하였다. OsPYL/RCAR과 OsPP2C의 각 조합을 효모균주 AH109에 형질전환시켰다. 형질전환된 효모 세포는 루신, 트립토판, 히스티딘이 제거된 합성배지에서 ABA 첨가여부에 따른 효모세포 생장의 차이로 상호작용 여부를 확인하였다.

yeast two hybridization 실험결과, 0.1혹은 1uM에서 상호작용하는 OsPYL/RCAR들과 달리 OsPYL/RCAR7은 검토한 모든 OsPP2C들과 10uM 앱시스산에서만 상호작용함을 알 수 있었다(도 2A). 또한, OsPYL/RCAR7이 OsPP2C들의 활성을 저해하는 고유의 특성을 나타내는지 확인하기 위하여 도 1과 동일한 실험방법으로 벼 원형질체내에 OsPYL/RCAR7, OsPP2C 및 Rab16a 프로모터-루시퍼라아제를 동시에 발현시킨 후 앱시스산에 대한 반응성을 관찰하였다. OsPYL/RCAR5에 비하여 현저히 낮기는 하지만 5uM 앱시스산 처리 시 OsPP2C8과 OsPP2C30에 대한 저해능력이 있음을 알 수 있었다 (도 2B). 위의 결과를 종합하였을 때 OsPYL/RCAR7은 높은 농도의 앱시스산 요구성과 낮은 활성을 갖는 앱시스산 수용체임을 알 수 있었다.

<실시예 2> OsPYL/RCAR7 유전자 발현벡터 및 형질전환체 제작

<2-1> OsPYL/RCAR7 유전자 발현 벡터 제작

OsPYL/RCAR7 유전자가 상시 발현될 수 있도록 유비키틴 프로모터(ubiquitin promoter) 조절를 받고, 바스타(Basta)로 형질전환체를 선발할 수 있는 식물형질전환용 벡터 pGA2897를 이용하였다. pGA2897벡터에 OsPYL/RCAR7 유전자를 도입하기 위해 OsPYL/RCAR7 유전자에 대해 specific한 프라이머(Forward: 5‘-CACCATGGCCACCAAGCGCGCGTAC-3’, 서열번호 3; Reverse: 5’-CTATCTGCTTGTCAG CTGAAAGATATCCTG-3’, 서열번호 4)를 제작하였다. 동진벼로부터 합성된 cDNA를 주형으로 하고 제작된 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR산물은 Qiagen사의 Gel extraction kit를 사용하여정제 하였고, 정제된 PCR산물은 Invotrogen사의 pENTR-D TOPO 벡터에 cloning하였다. pENTR-D TOPO 벡터에 cloning된 OsPYL/RCAR7 유전자를 식물형질전환용 벡터인 pGA2897에 도입하기 위해 Invitrogen사의 LR clonase이용하여 반응을 수행하였다. 최종적으로 OsPYL/RCAR7 유전자가 pGA2897에 도입됨을 확인하기 위해 pGA2897벡터가 가지고 있는 ubiquitin 프로모터에 특이적인 프라이머(5‘-GCATATGCAGCAGCTATATGTGG-3’, 서열번호 5)를 이용하여 시퀀싱을 통해 OsPYL/RCAR7 유전자의 도입여부를 확인하였다.

<2-2> OsPYL/RCAR7 유전자 발현 형질전환체 제작

상기 <실시예 2-1>에서 제작한 OsPYL/RCAR7 유전자 발현 벡터를 아그로박테리움에 형질전환한 다음 이를 벼에 형질전환하여 형질전환 벼를 제작하였다.

구체적으로, OsPYL/RCAR7 유전자가 상시 발현될 수 있도록 제작한 OsPYL/RCAR7/pGA2897 벡터를 아그로박테리아균(A. tumefaciens LBA4404)에 형질전환하기 위하여 얼림과 녹임을 2-3번 반복한 후, 37℃의 열 충격 방법에 의해 형질전환하여 YEP배지(Yeast 10g, NaCl 5g, peptone 10g, Agar 15g /1L)에서 이틀 동안 배양하여 콜로니를 확인하였다. 콜로니 PCR에 의해 형질전환이 확인된 콜로니는 벼에 형질전환하기 위하여 AB 배지 (AB buffer(K₂HPO₄ 60g, NaH₂PO₄ 20g/1L), AB Salts(NH₄Cl 60g, MgSO₄ㆍ7H₂O 6g, KCl 3g, CaCl₂ㆍ2H2O 0.265g, FeSO₄.7H₂O 50mg/1L, Glucose 5g/1L)에서 배양하였다.

벼 형질전환에 사용하는 동진 볍씨는 껍질을 벗긴 현미를 사용하였다. 볍씨를 70% ethanol에서 1분간 침지시킨 후 락스를 50% 소독한 용액에서 40분간 소독하였다. 이때 락스 30mL당 10uL Tween 20을 떨어뜨린 것을 사용하는 것이 더 바람직하다.

소독액을 모두 따라 버린 후 볍씨를 멸균수로 5회 세척하였다. 소독액이 잘 세척이 되면 여과지를 이용해 볍씨에서 물기를 제거한 후 2N6 배지에 볍씨를 치상하였다. 이때 볍씨는 배지 안에 박아 넣어 배지와 접촉이 잘되도록 하며 씨눈은 위로 향하도록 하였다. 2N6 배지는 N6 배지 의 다량원소, 미량원소, 비타민을 함유한 혼합물 4g/L와 30g/L sucrose, 0.5g/L proline, 0.5g/L glutamine, 0.3g/L casamino acids, 0.01g/L myo-inositol, 2mg/L 2,4-D, 4g/L phytagel이 첨가된 고체 배지(pH5.8)이다. 배양온도는 28℃이며 암처리하였다.

2N6에서 5일간 배양하여, 캘러스가 유도되면 배유를 제거하였다. 배유는 캘러스가 훼손되지 않도록 핀셋을 이용하여 조심스럽게 제거하며, 자엽과 뿌리 부분은 그대로 두어야 캘러스가 훼손되는 것을 방지할 수 있다.

아그로박테리움은 목적 유전자가 삽입된 것을 준비하여 AB 고체 배지에 3일간 배양한 후 AAM 액체 배지에 모아서 현탁액을 만들었다. 흡광도기계를 이용하여 현탁액의 농도를 측정하였고 먼저 OD₅₉₅=0.1이 되도록 만든 후 AAM으로 10배 희석하여 OD₅₉₅=0.01이 되도록 만들었다.

현탁액에 배유를 제거한 캘러스를 2분간 침지시켜 아그로박테리움을 접종하였고, 2분 동안 부드럽게 용액을 흔들어 주었다. 접종이 끝나면 캘러스에서 현탁액만을 따라 버리고 여과지를 이용하여 여액을 제거하였다. 이 작업은 신속히 진행하며 캘러스가 지나치게 여과지 위에 오래 방치되어 마르지 않도록 주의하였다. 캘러스는 2N6-AS 배지에 옮겨서 공동배양하였다. 2N6-AS배지는 2N6 배지에 10g/L glucose와 100uM acetosyringone을 추가하여 만든 배지로 pH5.2로 조정하였다. 배지 위에는 미리 여과지를 한 장씩 깔아놓아서 충분히 배지 성분이 스며들게 한 다음, 접종이 끝난 캘러스를 여과지 위에 올려놓았다. 여과지는 공동배양 기간 동안 아그로박테리움이 과도하게 성장하여 캘러스가 물러지는 현상을 방지하기 위한 것이다. 공동배양은 25℃에서 7일간 암배양하여 수행하였다.

공동배양이 끝나면 캘러스에 유용 유전자를 삽입하는 기능을 맡았던 아그로박테리움이 더 이상 필요 없으므로 세척 작업을 통해 제거하였다. 세척은 멸균증류수 1L에 항생제인 carbenicillin을 500mg을 넣은 용액으로 수행하였고, 캘러스를 3회 정도 세척한 뒤 여과지를 사용하여 여액까지 모두 제거하였다. 아그로박테리움 LBA4404 균주를 사용하는 경우에는 공동배양 기간동안 아그로박테리움의 과도한 성장이 이루어지지 않았기 때문에 위의 세척 작업을 하지 않는 것이 더 바람직할 수 있다. 캘러스는 2N6 배지에 항생제인 cefotaxime 200mg/L, Hygromycin 40mg/L가 첨가된 2N6-CH 배지로 옮겼다. 이때 핀셋을 이용하여 자엽과 뿌리 부분을 제거하며 캘러스는 2~3조각으로 나누어 배지와 닿는 면적이 최대가 되게 옮겨 배양하였다. 배양온도는 28℃에서 암배양기에서 14일간 배양하여 형질전환된 캘러스를 유도하였다.

14일 후, 항생제인 하이그로마이신이 첨가된 2N6-CH 배지에서 형질전환된 캘러스가 분열하면서 성장하면 슈트와 뿌리를 유도할 수 있는 재분화 배지인 MSR 배지로 계대배양하였다. 형질전환된 캘러스의 구분은 새롭게 분화된 캘러스 덩어리의 유무로 판단하며 갈변되어 죽은 캘러스는 버렸다. MSR 재분화 배지에서 성장한 유 식물체는 수도용 상토로 옮겨 온실에서 생육하였다.

<실시예 3> OsPYL/RCAR7 유전자가 형질전환된 벼의 가뭄저항성 분석

<3-1> OsPYL/RCAR7 과발현 형질전환벼의 주요 농업 형질 특성 검정

앱시스산 수용체 과발현 식물체들은 생육저해, 수량감소 등의 특성을 나타내므로, 활용성에 많은 단점을 갖고 있다. 따라서, OsPYL/RCAR7 과발현 형질전환체도 동일한 효과를 나타내는지 확인하기 위하여 과발현 형질전환체의 주요 농업형질 특성을 검정하였다. 실시예 2를 통해 제작된 OsPYL/RCAR7 과발현 형질전환체 4개 계통에서 이삭길이 및 간장 크기 등은 대조구와 거의 동일하였고, 이삭수 및 총 종자무게에서 C14-1과 3의 평균값이 대조구에 비하여 감소한 듯 하나, 통계적으로 의미있는 차이는 아니었으며, 두 개의 다른 계통은 동일한 수치를 나타냈다. 따라서, OsPYL/RCAR7은 일반적인 앱시스산 수용체 과발현 식물체와 달리 생육저해를 나타내지 않는 것으로 판단할 수 있었다 (도 3).

<3-2> OsPYL / RCAR7 과발현 형질전환벼의 가뭄 저항성 특성 검정

OsPYL/RCAR7이 매우 낮은 앱시스산 수용체 활성을 갖고 있고, 정상 생육조건에서 과발현 형질전환벼의 특성이 대조구와 동일함에도 다른 앱시스산 수용체와 마찬가지로 가뭄저항성 효과를 나타내는지 확인하기 위하여 과발현 형질전환벼의 가뭄저항성을 검정하였다.

그 결과, OsPYL/RCAR7 과발현 형질전환 벼들은 포트에서 가뭄처리시 대조구에 비하여 생존율이 높음을 확인하였으며, 수분 손실율 조사(water loss assay)에서도 대조구에 비하여 수분 손실이 지연됨을 확인하여, 가뭄저항성이 증진되었음을 확인하였다(도 4).

<110> Republic of Korea <120> A novel genes for enhancing drought resistance and their uses <130> P17R12C1171 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 621 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsPYL/RCAR7 <400> 1 atgaacggcg ctggtggtgc gggaggagca gcggcaggga agttgccaat ggtgagccac 60 cgacgggtgc agtgcagact agcggacaag cggtgtgagc tccgggagga agagatggag 120 tatatccggc agttccaccg ccacgagccc agcagcaacc agtgcacctc gttcgtcgcc 180 aagcatatca aggcgcccct ccaaaccgtt tggtcactag tgaggaggtt tgatcagcca 240 caacttttca aaccttttgt gagaaagtgc gtaatgcgag aaaacattat tgtgaccgga 300 tgtgttaggg aggtcaatgt tcaaagcggg cttccagcca caaggagcac tgagaggtta 360 gagttgcttg atgataacga acatatcctc aaagtcaagt ttattggggg cgatcatatg 420 ttgaagaatt actcatccat cctaaccatc cactctgagg tcatcgatgg ccaacttgga 480 acattggtgg tcgaatcatt tgtagtggat attccagatg ggaacaccaa agacgacata 540 tgctatttca tcgagaacgt tctcaggtgc aaccttatga cccttgctga tgtgtcagag 600 gagcgccttg ccaatccttg a 621 <210> 2 <211> 206 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OsPYL/RCAR7 <400> 2 Met Asn Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Ala Ala Gly Lys Leu Pro 1 5 10 15 Met Val Ser His Arg Arg Val Gln Cys Arg Leu Ala Asp Lys Arg Cys 20 25 30 Glu Leu Arg Glu Glu Glu Met Glu Tyr Ile Arg Gln Phe His Arg His 35 40 45 Glu Pro Ser Ser Asn Gln Cys Thr Ser Phe Val Ala Lys His Ile Lys 50 55 60 Ala Pro Leu Gln Thr Val Trp Ser Leu Val Arg Arg Phe Asp Gln Pro 65 70 75 80 Gln Leu Phe Lys Pro Phe Val Arg Lys Cys Val Met Arg Glu Asn Ile 85 90 95 Ile Val Thr Gly Cys Val Arg Glu Val Asn Val Gln Ser Gly Leu Pro 100 105 110 Ala Thr Arg Ser Thr Glu Arg Leu Glu Leu Leu Asp Asp Asn Glu His 115 120 125 Ile Leu Lys Val Lys Phe Ile Gly Gly Asp His Met Leu Lys Asn Tyr 130 135 140 Ser Ser Ile Leu Thr Ile His Ser Glu Val Ile Asp Gly Gln Leu Gly 145 150 155 160 Thr Leu Val Val Glu Ser Phe Val Val Asp Ile Pro Asp Gly Asn Thr 165 170 175 Lys Asp Asp Ile Cys Tyr Phe Ile Glu Asn Val Leu Arg Cys Asn Leu 180 185 190 Met Thr Leu Ala Asp Val Ser Glu Glu Arg Leu Ala Asn Pro 195 200 205 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsPYL/RCAR7 forward primer <400> 3 caccatggcc accaagcgcg cgtac 25 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsPYL/RCAR7 reverse primer <400> 4 ctatctgctt gtcagctgaa agatatcctg 30 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ubiquitin promoter primer <400> 5 gcatatgcag cagctatatg tgg 23

Claims

서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 벼 유래의 OsPYL/RCAR7 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 내건성 증진용 재조합 벡터.
제 1항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 내건성 증진용 재조합 벡터.
제 1항의 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환 식물체.
제 3항에 있어서, 상기 식물체는 OsPYL/RCAR7 유전자 발현에 의해 내건성이 증가한 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체.
제 3항에 있어서, 상기 식물체는 단자엽 식물인 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체.
제 5항에 있어서, 상기 단자엽 식물은 벼(Oryza sativa L.)인 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체.
(1) 제 1항의 OsPYL/RCAR7 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계;
(2) 상기 벡터를 아그로박테리움을 이용하여 식물체에 형질전환하는 단계; 및
(3) 상기 형질전환체를 선별하는 단계를 포함하는 형질전환 식물체 제조 방법.
서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래 OsPYL/RCAR7 단백질을 코딩하는 유전자를 식물체에서 과다 발현시킴으로써 내건성을 증가시키는 방법.