KR20160050174A - 식물의 환경 스트레스 내성을 증가시키는 벼 유래의 OsGIRL1 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 벼 유래의 OsGIRL1 (Oryza sativa gamma-ray induced LRR-RLK1) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 OsGIRL1 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 비형질전환체에 비해 식물의 환경 스트레스 내성을 증가시키는 방법, 벼 유래의 OsGIRL1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 OsGIRL1 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 비형질전환체에 비해 환경 스트레스 내성이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 비형질전환체에 비해 환경 스트레스 내성이 증가된 형질전환 식물체 및 상기 식물체의 종자 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래의 OsGIRL1 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는, 식물체의 환경 스트레스 내성 증가용 조성물을 제공한다.

Description

식물의 환경 스트레스 내성을 증가시키는 벼 유래의 OsGIRL1 유전자 및 이의 용도{OsGIRL1 gene from rice for increasing environmental stress tolerance in plant and uses thereof}

본 발명은 식물의 환경 스트레스 내성을 증가시키는 벼 유래의 OsGIRL1 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 벼 유래의 OsGIRL1 (Oryza sativa gamma-ray induced LRR-RLK1) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 OsGIRL1 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 비형질전환체에 비해 식물의 환경 스트레스 내성을 증가시키는 방법, 벼 유래의 OsGIRL1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 OsGIRL1 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 비형질전환체에 비해 환경 스트레스 내성이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 비형질전환체에 비해 환경 스트레스 내성이 증가된 형질전환 식물체 및 상기 식물체의 종자 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래의 OsGIRL1 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는, 식물체의 환경 스트레스 내성 증가용 조성물에 관한 것이다.

감마선은 생명체의 물리적, 생리적 특성을 변화시킬 수 있으며, 감마선의 생물학으로 활성산소를 생산하는 세포 분자들 사이의 상호작용에 영향을 준다(Kovacs and Keresztes, 2002, Micron. 33: 199-210). 중요한 세포 구성요소들을 손상 또는 변경시키는 감마선은 조사량에 따라 유기체의 형태적, 해부학적, 생화학적 및 생리학적 측면에 영향을 준다(Ashraf et al., 2003, Pak. J. Bot. 35: 791-795). 고선량의 감마선을 식물의 종자에 조사하였을 때 호르몬의 균형, 잎에서의 가스교환, 물의 교환 및 효소 활성을 위한 단백질의 합성과 같은 중요한 생물학적 과정이 중단될 수 있다(Hameed et. al., 2008, Pak. J. Bot. 40: 1033-1041).

LRR(Leucine-rich repeat)-RLK(receptor-like kinase) 단백질은 애기장대와 쌀의 게놈과 같은 식물 게놈에서 가장 큰 패밀리 중 하나이지만 인간과 효모에서는 발견되지 않는다. LRR-RLKs는 식물 게놈에서 극단적인 확장으로 기능의 중요성을 반영하며, LRR 도메인과 RLK 도메인의 조합으로 발생한다(Hwang et al., 2011, Genetica 139: 1023-1032). LRR 슈퍼패밀리는 고유의 길이와 반복되는 염기서열의 보존에 기초하여 최소 6개의 아과로 세분되며, 신호 전달 모티프를 포함한 LRRs은 단백질-단백질 상호작용의 역할을 하고 있다(Kajava, 1998, J. Mol. Biol. 277: 519-527; Kobe and Deisenhofer, 1994, Trends Biochem. Sci. 19: 415-421). RLKs는 세포질 Ser/Thr(serine/threonine) 단백질 키나아제 도메인을 포함하고 있으며(Shiu and Bleecker, 2001, Sci. STKE re22), 단백질 키나아제는 단백질 Ser/Thr 키나아제, 단백질 티로신 키나아제 그리고 단백질 히스티딘 키나아제의 세 가지 세포질 유형으로 분류될 수 있다(Becraft et al., 1996, Science 273: 1406-1409).

RLKs는 세포와 세포의 신호전달 과정뿐만 아니라 식물 형태 발생 동안 다양한 생물학적 기능(Torii et al., 1996, Plant Cell 8: 735-746), 분열 생장(Clark et al., 1997, Cell 89: 575-585), 배발생(Schmidt et al., 1997, Development 124: 2049-2062), 화분의 자가 불화합성(Muschietti et al., 1998, Plant Cell 10: 319-330), 환경 신호 처리(Deeken and Kaldenhoff, 1997, Planta 202: 479-486), 호르몬 조절(Hong et al., 1997 Plant Physiol. 113: 1203-1212; Li and Chory, 1997, Cell 90: 929-938; van der Knaap et al., 1999, Plant Physiol. 120: 559-570), 병원균 방어(Song et al., 1995, Science 270: 1804-1806), ABA 초기 신호(Osakabe et al., 2005, Plant Cell 17: 1105-1119), 브라시노스테로이드 신호, 세포사멸의 부정적 조절(Oh et al., 2010, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107: 17827-17832), 발아 속도, 산화 스트레스에 대한 내성(de Lorenzo et al., 2009, Plant Cell 21: 668-680)에 관여한다. 그러나 식물에서 많은 LRR-RLK 유전자의 기능은 명확하게 규명되지 않았다.

한국등록특허 제0440725호에는 '비생물성 스트레스에 대한 단자엽 식물의 내성을 증가시키는 방법'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1412555호에서는 '벼 유래 OsCYP19-4 유전자를 이용한 환경 스트레스에 대한 내성이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법'이 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이 '환경 스트레스 내성을 증가시키는 벼 유래의 OsGIRL1 유전자 및 이의 용도'에 대해서는 밝혀진 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자는 벼 OsGIRL1 유전자가 감마선 조사에서 발현이 유도되는 것을 확인하였고, OsGIRL1 유전자가 과발현된 형질전환 애기장대 식물체에서 감마선 조사 또는 한발 스트레스 조건에서 비형질전환체에 비해 저항성을 보여 OsGIRL1이 환경 스트레스에 중요한 유전자임을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 벼 유래의 OsGIRL1 (Oryza sativa gamma-ray induced LRR-RLK1) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 OsGIRL1 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 비형질전환체에 비해 식물의 환경 스트레스 내성을 증가시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 벼 유래의 OsGIRL1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 OsGIRL1 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 비형질전환체에 비해 환경 스트레스 내성이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 비형질전환체에 비해 환경 스트레스 내성이 증가된 형질전환 식물체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 식물체의 종자를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래의 OsGIRL1 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는, 식물체의 환경 스트레스 내성 증가용 조성물을 제공한다.

본 발명을 통해 OsGIRL1 유전자 과발현 형질전환 식물체에서는 감마선 조사 및 한발 스트레스 처리시 비형질전환체에 비해 강한 저항성을 보이는 것을 확인하였다. 따라서 환경 스트레스에 대해 저항성이 강한 형질전환 식물체의 개발을 위해 OsGIRL1 유전자는 유용할 것으로 기대된다.

도 1은 벼의 23종 LRR-RLK 유전자의 감사선 조사 후 선량별 발현량을 RT-PCR방법으로 분석한 결과이다.
도 2는 선발된 OsGIRL1 유전자의 감마선 조사 후 발현량을 qRT-PCR법으로 분석하고, 감마선 조사에 의해 발현되는 것으로 알려진 OsNAC10 유전자와 비교 분석한 결과이다.
도 3은 감마선 조사에 유도된 OsGIRL1 유전자의 비생물학적 스트레스별 발현 양상을 qRT-PCR법으로 분석한 결과이다. A: 염 스트레스, B: 한발 스트레스, C: 고온 스트레스, D: 살리실산 처리, E: 자스몬산 처리, F: ABA 처리. A~F에서 OsSalT, OsHSP90-1, OsPR1b, OsPBZ1, OsSalT 유전자는 양성 대조구로 함께 조사하였다.
도 4는 벼 유래 감마선 조사에 의해 유도된 유전자(OsGIRL1)가 형질전환된 애기장대의 유전자 발현 유무를 확인하기 위해 RT-PCR법으로 분석한 결과이다. 레인의 숫자는 개별 형질전환체를 의미, 35S:EGFP: 공백터(empty vector).
도 5는 OsGIRL1 유전자가 형질전환된 애기장대의 감마선에 대한 내성을 확인한 결과이다. 감마선을 100, 200Gy 선량으로 조사하고, 형질전환체의 표현형을 비교한 결과이다. A: 감마선 조사 후 형질전환체의 생육양상, B: 형질전환체 잎의 형태, C: 형질전환체의 신장, 잎의 길이와 폭을 비교한 결과
도 6은 OsGIRL1 유전자가 형질전환된 애기장대의 한발 스트레스에 대한 저항성을 확인한 결과이다. PEG를 -0.25, -0.5, -0.7Mpa 농도로 처리한 배지에서 뿌리의 신장을 비교한 결과이다. A: 뿌리 신장 양상, B: 뿌리 신장을 비교한 결과
도 7은 OsGIRL1 유전자가 형질전환된 애기장대의 한발 스트레스에 대한 저항성을 확인한 결과이다. PEG를 -0.25, -0.5, -0.7Mpa 농도로 처리한 배지에서 발아율을 비교한 결과이다. A: -0.25Mpa 농도, B: -0.5Mpa 농도, C: -0.7Mpa 농도

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 벼 유래의 OsGIRL1 (Oryza sativa gamma-ray induced LRR-RLK1) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 OsGIRL1 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 비형질전환체에 비해 식물의 환경 스트레스 내성을 증가시키는 방법을 제공한다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호화된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

본 발명에서, 상기 OsGIRL1 유전자 서열은 재조합 벡터 내로 삽입될 수 있다. 용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 재조합 벡터는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스 벡터, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소 (translation control element)를 가지는 것이다.

OsGIRL1 유전자 각각의 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보솜 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터 (EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리 (binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스 (예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

본 발명의 재조합 발현 벡터에서, 상기 프로모터는 형질전환에 적합한 프로모터들로서, 바람직하게는 CaMV 35S 프로모터, 액틴 프로모터, 유비퀴틴 프로모터, pEMU 프로모터, MAS 프로모터, 히스톤 프로모터 또는 Clp 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 상부의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 중합효소가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "항시성 (constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이며, 본 발명에서는 항시성 프로모터의 사용이 바람직할 수 있다. 따라서, 항시성 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제 (NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 아그로박테리움 튜머파시엔스 (Agrobacteriumtumefaciens)의 옥토파인 (Octopine) 유전자의 터미네이터, 파세올린 (phaseoline) 터미네이터, 대장균의 rrnB1/B2 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 터미네이터 영역이 식물 세포에서의 유전자 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

재조합 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트 (glyphosate) 또는 포스피노트리신 (phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신 (kanamycin), 하이그로마이신 (hygromycin), 클로람페니콜 (chloramphenicol), G418, 블레오마이신 (Bleomycin)과 같은 항생제 내성 유전자, aadA 유전자 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법, 하나한 방법 (Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 유전자총-매개 형질전환 방법 (bombardment), 아그로박테리움-매개 형질전환법, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법 및 DEAE-덱스트란 처리법 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 OsGIRL1 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으며, OsGIRL1 유전자는 서열번호 1의 염기 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열 (추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제 (즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 환경 스트레스는 감마선 스트레스 또는 한발 스트레스일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은

벼 유래의 OsGIRL1 (Oryza sativa gamma-ray induced LRR-RLK1) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및

상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 비형질전환체에 비해 환경 스트레스 내성이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

상기 식물세포를 형질전환시키는 방법은 전술한 바와 같다.

또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해서 당업계에 주지되어 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 OsGIRL1 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 비형질전환체에 비해 환경 스트레스 내성이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

상기 식물체는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리, 양파 등의 단자엽 식물 또는 애기장대, 감자, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 완두 등의 쌍자엽 식물일 수 있으며, 바람직하게는 단자엽 식물이며, 더욱 바람직하게는 벼 식물체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래의 OsGIRL1 (Oryza sativa gamma-ray induced LRR-RLK1) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는, 식물체의 환경 스트레스 내성 증가용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 유효성분으로 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 OsGIRL1 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하며, 상기 OsGIRL1 유전자 또는 상기 OsGIRL1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물에 형질전환함으로써 식물체의 환경 스트레스 내성을 증가시킬 수 있는 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 벼 LRR - RLK 유전자들의 감마선 조사에 의한 발현 특성 분석

벼 식물체 데이터베이스 분석을 통해 선발된 23종의 LRR-RLK 유전자들의 감마선 조사에 대한 발현 양상을 분석하기 위해, 생육상에서 2주 동안 생장한 유묘기 벼(품종: 동안벼)를 사용하였다. 감마선은 50Gy, 100Gy, 150Gy, 200Gy 및 400Gy의 선량으로 유묘기 벼에 조사하였으며, 조사 후 벼의 잎을 수확하여 RT-PCR법을 통해 유전자 발현 특성을 확인하였다. 벼 액틴(Os03g50885) 유전자는 발현 양상 비교를 위해서 동량의 RNA를 사용하였음을 증명하기 위하여 사용되었으며, 프라이머의 염기서열은 표 1의 No. 24와 같다. 그 결과 여섯 개의 유전자, Os01g05960, Os02g12440, Os05g16824, Os05g24010, Os05g39410 그리고 Os06g36320는 감마선 조사 후 조사선량이 증가할수록 발현이 증가하였다(도 1). 본 발명을 위해 Os02g12440 유전자를 선발하였고, OsGIRL1(Oryza sativa gamma-ray induced LRR-RLK1)로 명명하였다. 본 발명에 위해 평가된 LRR-RLK 유전자들의 특이적 프라이머들은 표 1과 같다. 또한, 선발된 OsGIRL1의 감마선 조사 후 발현량을 확인하기 위해 정량적 RT-PCR(qRT-PCR) 방법을 사용하여 분석하였다. 그 결과 200Gy와 400Gy를 조사하였을 때 세배 이상 증가하는 것을 확인하였으며, 감마선 조사에 의해 발현 되는 것으로 알려진 OsNAC10 유전자의 발현 양상과의 비교를 통해 OsGIRL1 유전자가 감마선 조사 후 유사하게 발현되는 것을 증명하였다 (도 2). OsNAC10과 OsGIRL1 유전자의 qRT-PCR 방법으로 발현량을 확인하기 위한 프라이머의 염기서열은 표 2와 같다.

실시예 2: 다양한 환경 스트레스 및 호르몬 처리에 의한 OsGIRL1 유전자의 발현특성 분석

감마선 조사에 의해 발현이 유도된 유전자인 OsGIRL1에 다양한 환경 스트레스 및 호르몬 처리 후 유전자 발현 양상을 qRT-PCR법으로 분석하였다. 생육상에서 2주 동안 생장한 유묘기 벼(품종: 동안벼)에 환경 스트레스 처리를 위해 염 스트레스는 200mM 염화나트륨을, 고온 스트레스는 45℃ 환경을, 한발 스트레스는 20% 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG)을 처리하고, 호르몬 처리는 0.1mM ABA, 0.1mM 자스몬산 그리고 1mM 살리실산을 처리하여 0, 6, 24 및 48시간에 잎 조직을 수확하여 OsGIRL1 유전자의 발현 특성을 분석하였다(도 3).

염 및 한발, 그리고 고온 스트레스 처리에 대한 양성 대조군으로 OsSalT(도 3A 및 도 3B)와 OsHSP90 -1(도 3C) 유전자를 함께 확인하였고, 살리실산, 자스몬산, 그리고 ABA 처리에 대한 양성 대조군으로 OsPR1b(도 3D), OsPBZ1(도 3E) 그리고 OsSalT(도 3F)를 각각 사용하여 확인하였다. 그 결과, 자스몬산 처리(도 3E)를 제외하고 모든 환경 스트레스와 호르몬 처리에서 OsGIRL1 유전자가 염(도 3A), 한발(도 3B), 고온(도 3C), 살리실산(도 3D), 그리고 ABA(도 3F) 처리 후 발현이 증가되는 것을 확인하였다. 본 발명에서 qRT-PCR법을 위해 사용한 각 유전자 특이적 프라이머들은 표 3과 같다.

실시예 3: OsGIRL1 유전자의 총 길이 cDNA 클로닝

OsGIRL1 유전자의 총 길이 염기 서열 정보는 벼 게놈 데이터베이스 (http://rice.plantbiology.msu.edu/analyses_search_locus.shtml)를 통해 염기서열 및 아미노산 서열을 검색하였다 (OsGIRL1 유전자의 염기서열은 서열번호 1, OsGIRL1 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 2로 기재함). OsGIRL1 유전자의 전체 길이 cDNAs를 클로닝 하기 위해 정방향 프라이머 5'-GAGATCTAGAATGCTGTCAGTAGTGAACTT-3'(서열번호 65) 및 역방향 프라이머 5'-GAGAGGTACCTAGCTGATGTGTATCAAACC-3'(서열번호 66)를 제작하고, 다카라사의 Pfu DNA 중합효소를 사용하여 PCR을 수행하였다.

PCR 부산물을 ELPIS-Biotech 사의 DOKDO PrepTM gel Extraction 키트를 사용하여 정제하고, 정제된 DNA 산물을 pBIN35S-GFP 벡터로 클로닝하였다. 이 재조합 벡터를 대장균(E. coli) 세포로 형질전환하고 카나마이신 항생제를 사용하여 형질전환된 대장균 세포를 선별하였다. 선별된 대장균 세포들을 배양하여 ELPIS-Biotech 사의 DOKDO PrepTM Plasmid Mini-prep 키트를 사용하여 플라스미드 DNA를 추출한 후 서열 분석을 진행하였다.

실시예 4: OsGIRL1 유전자 형질전환 애기장대의 감마선 및 한발 스트레스 저항성 실험

OsGIRL1 유전자를 과발현하는 형질전환 애기장대를 제조하기 위하여, 꽃대침지법(floral dip transformation)을 시행하였다. 이들 형질전환 애기장대에 삽입된 목적유전자를 확인하기 위해 RT-PCR 분석을 실시하였다. 이 유전자는 벼에서 분리한 것으로 원래 애기장대에 존재하지 않으므로 대조군 형질전환체(비형질전환체라고 칭함, 공벡터, 35S:EGFP)에서는 검출되지 않았으며, 개별 형질전환체(35S:GIRL1-EGFP-1/35S:GIRL1-EGFP-2)에서는 OsGIRL1 유전자가 확인되었다(도 4).

형질전환 애기장대의 감마선 조사에 대한 반응을 확인하기 위해 형질전환 종자를 발아시켜 한국원자력연구원의 첨단방사선연구소에서 감마선조사장치(60Co, ca. 150TBq capacity, Atomic Energy of Canada Limited, Ontario, Canada)를 이용하여 100Gy와 200Gy의 선량으로 조사한 후 4주 후에 형질전환체의 길이, 잎의 길이 및 잎의 폭을 측정하였다. 그 결과 조사 항목에 대하여 애기장대 형질전환체가 대조군(비형질전환체)에 비하여 200Gy에서 유의성 있게 생육이 좋은 것을 확인하였다(도 5). 따라서, OsGIRL1 유전자가 감마선에 내성을 가지고 있음을 증명하였다. 한발 스트레스에 대한 저항성을 확인하기 위해 -0.25Mpa(대조군), -0.5Mpa, 그리고 -0.7Mpa 농도의 PEG를 포함한 배지에 형질전환 및 공벡터 형질전환체 종자를 넣고, 1일 간격으로 총 14일 동안 발아율과 뿌리 길이를 측정하였다. 그 결과, PEG -0.5Mpa 농도에서 형질전환체가 대조군에 비하여 뿌리가 유의성 있게 증가하였으며(도 6), -0.7Mpa 농도에서는 형질전환체 및 대조군 모두 뿌리가 신장하지 않았다. 발아율은 형질전환체는 -0.5Mpa 농도에서 배지에 종자를 치상한 후 5일 후에 100% 발아하였으며, 대조군은 7일 후에 약 80%만 발아를 하였으며, -0.7Mpa 농도에서는 형질전환체에서만 9일 후에 약 15%가 발아를 하였다. 대조군으로 사용한 -0.25Mpa 농도의 배지에서는 3일에서 5일 사이에 형질전환체 및 대조군 모두 100% 발아하였다(도 7). 따라서, OsGIRL1 유전자가 한발 스트레스에 저항성이 있음을 확인하였다.

<110> KNU-Industry Cooperation Foundation <120> OsGIRL1 gene from rice for increasing environmental stress tolerance in plant and uses thereof <130> PN14284 <160> 66 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 2106 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 1 atgctgtcag tagtgaactt cgatggaaat cagcttgaag caaccaatga tgctgattgg 60 ggcttcatga ctagtctaac caattgcagc aatatgatac tgatagatgt tagtatcaac 120 aaactccaag gtgtgctacc aaaagcaatt ggtaatatgt caacacaatt ggagtatttc 180 ggcataacaa acaacaatat aacaggaaca atacctgaat caatagggaa cctcgtcaac 240 ttggatgaac ttgacatgga aaacaatctt ctcatgggga gccttcccgc atctctcggc 300 aatctcaaga agttgaatag attgtctttg tcaaataaca atttttcagg atccatccca 360 gtaactcttg gcaatcttac aaaacttaca atccttttgc ttagtaccaa tgcactgagt 420 ggagctatac cttctactct cagcaattgt cctttagaaa tggtggacct ttcttacaac 480 aacctttccg gcccgatacc gaaggaactt tttcttatct ccacaatatc aagtttcctg 540 tatcttgcgc acaataaatt aactgggaat ttgccttcag aagtgggaaa tctcaagaat 600 cttgatgaac tcgacctctc tgataatacg atttcaggaa agatccctac caccattgga 660 gaatgccaga gcttacagta tctcaattta tctaggaact tcatcgagga cacaattcct 720 ccgtcactgg aacaattaag ggggctccta gtacttgatc tttctcaaaa taatttgtct 780 ggaacaatcc ctagattcct aggtagcatg acaggtcttt ctactctgaa tctttcaagc 840 aatgatttcg aaggtgaagt tccaaaatat ggaatatttc ttaatgcaac tgcaacctct 900 gtcatgggaa acaatgactt gtgtggtggg gcgcctcaac tgaagttgcc aaaatgctca 960 aatcaaacta aacatgggct gtcttcaaag atcatcataa ttatcattgc aggaagcaca 1020 attttgtttc tcattctatt cacatgcttt gcgctacgtc taaggactaa gcttagaaga 1080 gcaaacccaa agataccgct ctccgataag caacatatga gagtttctta tgctcagttg 1140 tccaaagcaa caaatagttt tgcatctgag aacctcattg gagtgggcag ctttggtgca 1200 gtgtaccaag gaagaattgg gatctctgac caacaattgg tggttgcagt gaaggtgctc 1260 aacttgcaac aagctggtgc gtatcgaagt tttgatgcag aatgtgaggc tttgagatgt 1320 attcgccatc ggaatcttgt aaagattctt acagtttgct caggtattga tttccaaggt 1380 agtgacttca aggcgcttgt atttgagttc ctgccaaatg gaaatttaga ccagtggcta 1440 cacaagcatc ttgaggaaga aggtgaacct aaggtgctaa atctcgttga aagactccaa 1500 attgcgatag atgtggcttc tgcacttgaa tacttacatc agcacaagcc atgtccaatt 1560 gttcactgtg atctgaagcc aagcaatatt cttcttgaca atgacatggt tgctcatgtt 1620 ggtgattttg ggcttgcaag gttccttcat caagaacaca gcaatagttc agataaatca 1680 actggttgga atgcaataag aggaacaatt ggctatgttg ccccagagta tggattgggc 1740 aatgaagtct caatccatgg agacgtctac agctatggca tacttttgct ggagatgttc 1800 actggaaaaa ggccaacaaa cagtgaattc ggcgatgttc ttactcttca tgagtatgta 1860 gaaacagcgc tgccagacca aacaactagt gtcattgacc aaagcctact agatgcgaca 1920 tggaatagcg aaggaacagc tcaaaagtac cacgacatcg aagagataag aactgagtgc 1980 attgtttcaa ttctgaaggt cggaatattg tgctcaaaag agataccaac tgatcggatg 2040 caaattgggg atgcattgag agagttgcag gcaattagag ataggtttga tacacatcag 2100 ctatag 2106 <210> 2 <211> 701 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 2 Met Leu Ser Val Val Asn Phe Asp Gly Asn Gln Leu Glu Ala Thr Asn 1 5 10 15 Asp Ala Asp Trp Gly Phe Met Thr Ser Leu Thr Asn Cys Ser Asn Met 20 25 30 Ile Leu Ile Asp Val Ser Ile Asn Lys Leu Gln Gly Val Leu Pro Lys 35 40 45 Ala Ile Gly Asn Met Ser Thr Gln Leu Glu Tyr Phe Gly Ile Thr Asn 50 55 60 Asn Asn Ile Thr Gly Thr Ile Pro Glu Ser Ile Gly Asn Leu Val Asn 65 70 75 80 Leu Asp Glu Leu Asp Met Glu Asn Asn Leu Leu Met Gly Ser Leu Pro 85 90 95 Ala Ser Leu Gly Asn Leu Lys Lys Leu Asn Arg Leu Ser Leu Ser Asn 100 105 110 Asn Asn Phe Ser Gly Ser Ile Pro Val Thr Leu Gly Asn Leu Thr Lys 115 120 125 Leu Thr Ile Leu Leu Leu Ser Thr Asn Ala Leu Ser Gly Ala Ile Pro 130 135 140 Ser Thr Leu Ser Asn Cys Pro Leu Glu Met Val Asp Leu Ser Tyr Asn 145 150 155 160 Asn Leu Ser Gly Pro Ile Pro Lys Glu Leu Phe Leu Ile Ser Thr Ile 165 170 175 Ser Ser Phe Leu Tyr Leu Ala His Asn Lys Leu Thr Gly Asn Leu Pro 180 185 190 Ser Glu Val Gly Asn Leu Lys Asn Leu Asp Glu Leu Asp Leu Ser Asp 195 200 205 Asn Thr Ile Ser Gly Lys Ile Pro Thr Thr Ile Gly Glu Cys Gln Ser 210 215 220 Leu Gln Tyr Leu Asn Leu Ser Arg Asn Phe Ile Glu Asp Thr Ile Pro 225 230 235 240 Pro Ser Leu Glu Gln Leu Arg Gly Leu Leu Val Leu Asp Leu Ser Gln 245 250 255 Asn Asn Leu Ser Gly Thr Ile Pro Arg Phe Leu Gly Ser Met Thr Gly 260 265 270 Leu Ser Thr Leu Asn Leu Ser Ser Asn Asp Phe Glu Gly Glu Val Pro 275 280 285 Lys Tyr Gly Ile Phe Leu Asn Ala Thr Ala Thr Ser Val Met Gly Asn 290 295 300 Asn Asp Leu Cys Gly Gly Ala Pro Gln Leu Lys Leu Pro Lys Cys Ser 305 310 315 320 Asn Gln Thr Lys His Gly Leu Ser Ser Lys Ile Ile Ile Ile Ile Ile 325 330 335 Ala Gly Ser Thr Ile Leu Phe Leu Ile Leu Phe Thr Cys Phe Ala Leu 340 345 350 Arg Leu Arg Thr Lys Leu Arg Arg Ala Asn Pro Lys Ile Pro Leu Ser 355 360 365 Asp Lys Gln His Met Arg Val Ser Tyr Ala Gln Leu Ser Lys Ala Thr 370 375 380 Asn Ser Phe Ala Ser Glu Asn Leu Ile Gly Val Gly Ser Phe Gly Ala 385 390 395 400 Val Tyr Gln Gly Arg Ile Gly Ile Ser Asp Gln Gln Leu Val Val Ala 405 410 415 Val Lys Val Leu Asn Leu Gln Gln Ala Gly Ala Tyr Arg Ser Phe Asp 420 425 430 Ala Glu Cys Glu Ala Leu Arg Cys Ile Arg His Arg Asn Leu Val Lys 435 440 445 Ile Leu Thr Val Cys Ser Gly Ile Asp Phe Gln Gly Ser Asp Phe Lys 450 455 460 Ala Leu Val Phe Glu Phe Leu Pro Asn Gly Asn Leu Asp Gln Trp Leu 465 470 475 480 His Lys His Leu Glu Glu Glu Gly Glu Pro Lys Val Leu Asn Leu Val 485 490 495 Glu Arg Leu Gln Ile Ala Ile Asp Val Ala Ser Ala Leu Glu Tyr Leu 500 505 510 His Gln His Lys Pro Cys Pro Ile Val His Cys Asp Leu Lys Pro Ser 515 520 525 Asn Ile Leu Leu Asp Asn Asp Met Val Ala His Val Gly Asp Phe Gly 530 535 540 Leu Ala Arg Phe Leu His Gln Glu His Ser Asn Ser Ser Asp Lys Ser 545 550 555 560 Thr Gly Trp Asn Ala Ile Arg Gly Thr Ile Gly Tyr Val Ala Pro Glu 565 570 575 Tyr Gly Leu Gly Asn Glu Val Ser Ile His Gly Asp Val Tyr Ser Tyr 580 585 590 Gly Ile Leu Leu Leu Glu Met Phe Thr Gly Lys Arg Pro Thr Asn Ser 595 600 605 Glu Phe Gly Asp Val Leu Thr Leu His Glu Tyr Val Glu Thr Ala Leu 610 615 620 Pro Asp Gln Thr Thr Ser Val Ile Asp Gln Ser Leu Leu Asp Ala Thr 625 630 635 640 Trp Asn Ser Glu Gly Thr Ala Gln Lys Tyr His Asp Ile Glu Glu Ile 645 650 655 Arg Thr Glu Cys Ile Val Ser Ile Leu Lys Val Gly Ile Leu Cys Ser 660 665 670 Lys Glu Ile Pro Thr Asp Arg Met Gln Ile Gly Asp Ala Leu Arg Glu 675 680 685 Leu Gln Ala Ile Arg Asp Arg Phe Asp Thr His Gln Leu 690 695 700 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gggggagcag ctcaagtgcg 20 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 agcggatcag gccctccag 19 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 ccgacatgcg ctccgacaca 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gcctccagct cgttggcgtt 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 tgtccaggct cgaggggacg 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 agcacgggtt cttgagcggc 20 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 ggtgttgtgg tgcttgaggt gct 23 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 ggcctctctt gcggcgatgg 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA 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<223> primer <400> 20 tgcacgccat tgcgagctga 20 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 gcgacgagga ctgatccgac tgaa 24 <210> 22 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 ttgccttgaa accgcaggtc tg 22 <210> 23 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 gggtgaggag gcagatacac ctcc 24 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 gtcttccgtg gaggagccgt c 21 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 gatcggcggc ctcgtgatgg 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 cgagcaggat cgtcgcgacc 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 tcccacgagc cttggcactg 20 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 aacaagtgcc ttgccagccc a 21 <210> 29 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 29 tgtgcctgct agctggagga ag 22 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 30 tgcaggaacc ggacccgtga 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 31 gggaacgcca gcccctgttc 20 <210> 32 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 32 tggtccatcg aggcgagctc a 21 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 33 gcattcccga gcggcaaagc 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 34 gccggtgagc tggttgcagt 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 35 tgggtccatc cggcatgcca 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 36 ctttagccag cgcacgggct 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 37 tcgccgctgt tcatgcccag 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 38 tatggcagac ggtgccgctg 20 <210> 39 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 39 atgcaaacca gctcgagggc ac 22 <210> 40 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 40 tgctcaagct agcaggaatg tccc 24 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 41 atcgccgggc ttcctcgtct 20 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 42 ccggcgcact ccaccttgag 20 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 43 tggccgctcg tcttcctcgt 20 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 44 cgaaagcccc aagctcggca 20 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 45 gcagcagcag cagcaatgcc 20 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 46 gcccagacag gccgcaagag 20 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 47 gacagggtgg tcgagctgcg 20 <210> 48 <211> 20 <212> DNA 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<220> <223> primer <400> 57 cacattatca agtcagaggt t 21 <210> 58 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 58 ggatgagctt ctccttct 18 <210> 59 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 59 gaagagcgac tacgactac 19 <210> 60 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 60 ctctgtccga cgaagttg 18 <210> 61 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 61 gagaaggaag gcgacatc 18 <210> 62 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 62 ccattcatgg ctcacctc 18 <210> 63 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 63 gtcagctcag gacatcagtg 20 <210> 64 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 64 tctctgtaga ggtgccttcg 20 <210> 65 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 65 gagatctaga atgctgtcag tagtgaactt 30 <210> 66 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 66 gagaggtacc tagctgatgt gtatcaaacc 30

Claims (10)

1. 벼 유래의 OsGIRL1 (Oryza sativa gamma-ray induced LRR-RLK1) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 OsGIRL1 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 비형질전환체에 비해 식물의 환경 스트레스 내성을 증가시키는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 OsGIRL1 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 환경 스트레스는 감마선 스트레스 또는 한발 스트레스인 것을 특징으로 하는 방법.
4. 벼 유래의 OsGIRL1 (Oryza sativa gamma-ray induced LRR-RLK1) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및
   상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 비형질전환체에 비해 환경 스트레스 내성이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 OsGIRL1 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제4항에 있어서, 상기 환경 스트레스는 감마선 스트레스 또는 한발 스트레스인 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 비형질전환체에 비해 환경 스트레스 내성이 증가된 형질전환 식물체.
8. 제7항에 있어서, 상기 식물체는 단자엽 식물인 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체.
9. 제7항에 따른 식물체의 종자.
10. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래의 OsGIRL1 (Oryza sativa gamma-ray induced LRR-RLK1) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는, 식물체의 환경 스트레스 내성 증가용 조성물.

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