KR20190050540A - 쌍별귀뚜라미 추출물 함유 조성물의 제조방법, 이에 의해 제조된 곤충 추출물 함유 조성물 및 이를 포함하는 식품 - Google Patents
쌍별귀뚜라미 추출물 함유 조성물의 제조방법, 이에 의해 제조된 곤충 추출물 함유 조성물 및 이를 포함하는 식품 Download PDFInfo
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Abstract
본 출원은 쌍별귀뚜라미 추출물 함유 조성물의 제조방법, 이에 의해 제조된 곤충 추출물 함유 조성물 및 이를 포함하는 식품에 관한 것이다.
Description
본 출원은 쌍별귀뚜라미 추출물 함유 조성물의 제조방법, 이에 의해 제조된 곤충 추출물 함유 조성물 및 이를 포함하는 식품에 관한 것이다.
2013년 곤충을 식량으로 추천하는 유엔 보고서가 나온 이후 미래 식량 및 환경에 대한 관심이 더욱 높아지면서 식용 곤충에 관한 연구가 활발히 이루어지고 있다. 곤충은 다량의 불포화 지방산 및 아미노산이 고루 들어있으며, 이외에도 다양한 비타민, 무기질, 키토산 등의 영양성분을 함유하고 있다. 특히, 쌍별귀뚜라미는 탄수화물 2.5%, 단백질 20.2%, 지방 7.7%으로 양질의 영양분을 함유하고 있다.
그러나, 곤충을 원물 형태로 섭취하기에는 외관 및 곤충 특유의 이미, 이취 때문에 일반 소비자들이 쉽게 섭취하기에는 어려움이 있다. 따라서 곤충 식량의 혐오감을 없애고 유용한 영양성분들을 활용하고자 하는 시도가 있어 왔고, 특히 곤총의 불포화지방산의 조성과 같은 영양성분에 대한 연구 및 풍미개선에 대한 연구가 주로 이루어져 왔다. 다만, 쌍별귀뚜라미에 대해서는 영양성분에 대한 연구는 많이 진행되어 대한민국 공개특허공보 제10-2016-0134939호와 같이 양어용 사료 첨가제 또는 대한민국 등록특허공보 제10-1702851호와 같은 기능성소재로서 사용하려는 시도는 있었었으나, 풍미개선과 관련된 연구는 미흡한 실정 식품 소재용 추출물에 관한 개발은 많이 이루어지지 않았다.
상기와 같은 문제를 해결하기 위해 본 출원은 곤충, 특히 쌍별귀뚜라미 추출물 함유 조성물의 제조방법에 관한 것으로, 쌍별귀뚜라미를 절식시키는 단계, 상기 쌍별귀뚜라미를 분쇄하는 단계, 및 상기 분쇄물을 원심분리 하는 단계 및 원심분리된 상등액에 단백질 분해 효소를 처리하는 단계를 포함하는, 식품 소재용 쌍별귀뚜라미 추출물 함유 조성물의 제조방법으로서, 상기 쌍별귀뚜라미 추출물은 헥사날(hexanal) 함량이 0mg/L 초과 0.2mg/L 이하인 것을 특징으로 하는, 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 출원은 상기 제조방법으로 제조된 식품 소재용 쌍별귀뚜라미 추출물 함유 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
그리고 본 출원은 상기 조성물을 포함하는 식품을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기의 목적을 달성하기 위한 본 출원의 일 양태는 쌍별귀뚜라미를 절식시키는 단계, 상기 쌍별귀뚜라미를 분쇄하는 단계 및 상기 분쇄물을 원심분리 하는 단계 및 원심분리된 상등액에 단백질 분해 효소를 처리하는 단계를 포함하는, 식품 소재용 쌍별귀뚜라미 추출물 함유 조성물의 제조방법으로서, 상기 쌍별귀뚜라미 추출물은 헥사날(hexanal) 함량이 0mg/L 초과 0.2mg/L 이하인 것을 특징으로 하는, 제조방법을 제공할 수 있다.
쌍별귀뚜라미(쌍별이)는 (Gryllus bimaculatus)는 메뚜기목 귀뚜라미과 곤충으로 메뚜기, 식용번데기, 백강잠누에, 갈색거저리 애벌레 (고소애), 흰점박이꽃무지 애벌레 (꽃무지), 장수풍뎅이 유충과 함께 국내에 식품원료로 등록되어 있는 곤충이다. 쌍별귀뚜라미의 영양성분은 탄수화물 2.5%, 단백질 20.2%, 지방 7.7%으로 양질의 영양분을 가지는 곤충으로 쌍별귀뚜라미를 원물 형태 그대로 섭취하기에는 익숙하지 않은 형태로 종래에는 단순히, 건조 분말화하여 사용되었으나, 쌍별귀뚜라미에 포함된 지방으로 인하여 분말의 형태가 곱지 않고, 이미 (곤충 특유의 비린맛)과 이취가 있어 풍미의 기호도가 매우 낮은 문제점이 있었다.
상기 절식시키는 단계는 쌍별귀뚜라미를 분쇄하기 전에 절식시키는 단계로서 상기 절식은 1 내지 72시간 동안 이루어질 수 있다. 상기 쌍별귀뚜라미는 적당한 온도와 습도를 유지시켜 생육되는 것으로, 주로 톱밥이나 밀겨 등의 식이로 생육되는데, 쌍별귀뚜라미를 절식 없이 가공하였을 때는 귀뚜라미의 내장에 있던 잔여 사료 및 배설물로 인하여 가공에도 불구하고 강한 이미, 이취가 있어 기호도를 더욱 떨어뜨리는 문제가 있다. 그러나 쌍별귀뚜라미를 절식시킴으로써 귀뚜라미 내장의 사료 및 배설물의 함량을 낮출 수 있다. 더욱 구체적으로 상기 절식은 24 내지 72시간동안 이루어질 수 있다. 절식이 1시간 미만 이루어질 경우 귀뚜라미의 내장의 사료 및 배설물이 충분히 제거되지 않아 가공 후에도 이미, 이취가 남을 수 있고, 72시간 초과하여 절식이 이루어질 경우 쌍별귀뚜라미의 생육이 저해될 수 있는 문제가 있다. 또한 상기 절식단계 이전에 밀가루 식이로 생육하여 쌍별귀뚜라미의 이미, 이취를 더욱 감소시킬 수 있다.
상기 분쇄하는 단계는 후술하는 단백질 분해 효소의 작용이 용이할 수 있도록 절식시킨 쌍별귀뚜라미를 분쇄하는 단계로서 쌍별귀뚜라미를 부위별로 분해하거나 별도의 절단 공정 없이 쌍별귀뚜라미 모든 부위를 분쇄하여 사용할 수 있다. 분쇄를 용이하게 하며 단백질 분해 쇼소의 작용이 용이하도록 하기 위하여 일정량의 물을 첨가할 수 있다. 구체적으로 쌍별귀뚜라미 100중량부 대비 100 내지 900 중량부, 더욱 구체적으로 200 내지 800중량부의 물을 첨가할 수 있다, 물이 100 중량부 미만으로 첨가될 경우 쌍별귀뚜라미의 분쇄가 용이하지 않을 수 있고, 900 중량부 초과하여 첨가될 경우 고형분이 낮아 추후 농축 과정 등에서 공정 경제성이 떨어질 수 있다.
상기 원심분리하는 단계는 상기 쌍별귀뚜라미 분쇄물을 원심분리하여 지방과 침전물을 제외한 수용성 상등액만을 분리하는 단계이다. 구체적으로 상등액을 분리하는 단계는 쌍별귀뚜라미 분쇄물을 3000 내지 8000rpm에서 10 내지 30분간 원심분리하여 분리할 수 있다. 상기 범위 외에서는 쌍별귀뚜라미 분쇄물이 충분히 분리되지 않거나 공정경제성이 떨어지는 문제점이 있다.
상기 효소처리 단계는 상기 상등액에 단백질 분해효소를 처리하는 단계로서 체내에 흡수가 용이한 유리아미노산의 비율을 높이고 이미, 이취를 줄일 수 있다. 상기 단백질 분해효소는 특별히 제한되지는 않으나, 경제성을 고려하여 상업적으로 널리 사용되는 단백질 분해효소를 사용할 수 있고, 구체적으로는 펩신, 트립신, 플라보르자임(Flavourzyme), 프로타멕스(Protamex), 파파인, 알파키모트립신, 판크레아제 중에 선택된 어느 하나 이상일 수 있고, 더욱 구체적으로는 플라보르자임 및 프로타맥스 중 선택된 어느 하나 이상일 수 있고, 가장 구체적으로는 플라보르자임 및 프로타맥스을 함께 사용할 수 있다. 상기 플라보르자임은 아스퍼질러스 오리재 (Aspergillus oryzae) 유래의 단백질 분해 효소로 엔도 프로테이즈 (endoprotease) 및 엑소 프로테이즈 (exoprotease) 특성을 가지고 있고, 상기 프로타멕스는 바실러스 서브틸러스 (Bacillus sp.) 유래의 단백질 분해효소로 엔도 프로테이즈 (endoprotease)의 특성을 가지고 있다 (도 4 참조). 상기 단백질 분해 효소는 0.0001 내지 5% 첨가하여, 5분 내지 5시간동안 처리할 수 있다. 더욱 구체적으로는 0.001 내지 3% 첨가하여 30분 내지 2시간 동안 처리할 수 있다. 상기 범위외의 조건으로 단백질 분해효소가 첨가되거나 처리될 경우 조성물 내에 유리아미노산의 함량이 낮거나 이미, 이취를 줄일 수 없는 문제점 또는나, 생산 효율이 떨어져 공정 경제성이 낮아지며, 조성물의 품질이 저하될 수 있는 문제점이 있다.
상기 쌍별귀뚜라미 추출물 함유 조성물은 0mg/L 초과 0.2mg/L 이하의 헥사날 (hexanal)함량을 가질 수 있다. 전술한 바와 같이 쌍별귀뚜라미는 가공하더라도 이미, 이취가 있을 수 있는데 본 출원에 따른 제조방법은 절식시키는 단계를 통하여 제조된 쌍별귀뚜라미 추출물의 이취를 줄일 수 있어, 이취를 내는 산화 생성물 중 한 성분인 헥사날 (hexanal)이 0.2mg/L이하로 함유된다 (실험예 5 참조).
상기 제조방법은 쌍별 귀뚜라미 추출물 함유 조성물을 살균, 냉각, 농축 및 동결 건조로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단계를 추가로 더 포함할 수 있다.
상기 살균, 냉각하는 단계를 통하여 첨가된 효소를 불활성화 시키고 미생물을 조절하여 유통안전성을 확보할 수 있다. 구체적으로 상기 살균하는 단계는 90 내지 150℃에서 10 내지 120분, 구체적으로는 100 내지 130℃에서 30 내지 60분 이루어질 수 있다. 살균하는 단계가 90℃ 미만이거나 10분 미만에서 이루어질 경우 효소 실활 및 살균이 충분히 이루어지지 않을 수 있고, 150℃ 이상이거나 120분 이상에서 이루어질 경우 영양소가 파괴될 수 있다. 상기 냉각하는 단계는 0 내지 10℃에서 30분 내지 2시간, 구체적으로 1 내지 7℃에서 45분 내지 1.5시간 이루어질 수 있다. 냉각하는 단계가 0℃ 미만이거나 2시간 초과하여 이루어질 경우 공정경제성이 떨어질 수 있고, 10℃ 초과하거나 30분 미만으로 이루어질 경우 추출물함유 조성물이 충분히 냉각되지 않을 수 있다.
상기 농축하는 단계를 통하여 고형분 함량을 높게 하여 식품 소재로서 사용이 더 용이하도록 하는 단계를 포함한다. 농축 과정을 거치는 경우, 90℃이상 10분 이상 효소 실활 공정만 간단히 거친 후 농축하고, 살균 냉각의 공정은 농축 후에 하도록 한다. 구체적으로는 공지의 농축기를 이용하여 40 내지 60℃, 30 내지 50rpm, 20 내지 40mbar 조건에서 농축할 수 있다. 상기 농축하는 단계는 추출물 함유 조성물의 농도가 5 내지 30brix, 구체적으로는 10 내지 25brix가 되도록 농축할 수 있다. 상기 범위 외로 농축할 경우 후술되는 분말화 단계가 용이하지 않거나, 공정 경제성이 떨어질 수 있고, 식품 소재로서 이용하기 어려울 수 있다.
상기 동결건조하는 단계를 통하여 추출물 함유 조성물을 분말화 함으로써 식품 소재로서 저장이 용이하고 다양한 제품에 적용할 수 있다. 구체적으로 동결건조 후 분말화하는 방법을 사용할 수 있다. 추출하여 동결 건조한 분말은 일반적인 열풍건조 등의 방법으로 건조한 후 분말화 한 것에 비하여 지방 함량이 낮아 뭉치지 않고 고운 분말을 얻을 수 있다.
상기 쌍별귀뚜라미 추출물 함유 조성물은 L-티로신(L-tyrosine)을 0.1 내지 1.0mg/ml로 포함할 수 있다. L-티로신은 단백질 가수분해 효소가 단백질을 가수분해 함으로써 생성되는 아미노산 중 하나로써, 본 출원은 단순히 쌍별귀뚜라미에 포함된 아미노산 뿐만아니라 추가적으로 단백질 분해효소처리를 하였기 때문에 더욱 높은 L-티로신 함량을 나타낼 수 있다 (실험예 1 참조).
또한, 상기 제조방법은 쌍별귀뚜라미를 분쇄하는 단계 이후 수용성 영양성분만을 추출하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 제조방법은 분쇄물 전체적으로 원심 분리 후 단백질 분해 효소를 처리함으로써 가용성 펩타이드 (L-티로신 등)를 많이 함유하는 추출물을 포함하는 조성물을 제조할 수도 있으나 (도 3 참조), 수용성 영양성분만을 추출함으로써 항산화력 및 항염증 효과를 높일 수 있다 (실험예 2 내지 4 참조). 구체적으로, 상기 수용성 영양성분을 추출하는 단계는 열수 추출을 통해 이루어 질 수 있고, 더욱 구체적으로는 80 내지 120℃에서 10 내지 30분간 추출, 가장 구체적으로는 100℃에서 20분간 추출하여 이루어 질 수 있다.
또 다른 본 출원의 일 양태는, 상기의 제조방법으로 제조된, 식품 소재용 쌍별귀뚜라미 추출물 함유 조성물을 제공할 수 있다. 구체적으로 상기 조성물은 분말, 과립 또는 액상으로 제조될 수 있으며, 상기의 제조방법으로 제조되었기 때문에 이미, 이취가 낮으면서도 유리아미노산의 함량이 높다. 또한, 상기 조성물은 항산화, 항염증 효과를 가지면서도 항염증 작용에서세포 사멸에 큰 영향을 주지 않는다 (실험예 2, 3 및 4 참조)
다른 본 출원의 일 양태는, 상기의 조성물을 포함하는 식품을 제공할 수 있다. 본 출원의 식품은 상기 조성물을 포함함에 따라, 이취가 개선되어 풍미가 향상되고, 항산화, 항염증 효능이 있다.
본 출원에 따른 쌍별귀뚜라미 추출물 함유 조성물의 제조방법, 이에 의해 제조된 곤충 추출물 함유 조성물 및 이를 포함하는 식품은 이미, 이취가 적어 풍미가 향상되고 유리아미노산의 함량이 높을 뿐만 아니라 항산화, 항염증 효능을 가지는 효과가 있다.
도 1은 본 출원의 쌍별 귀뚜라미 추출물 함유 조성물의 제조방법을 나타낸 흐름도이다.
도 2는 실험예 1에 따른 본 출원의 쌍별 귀뚜라미 추출물에 플라보르자임 (Flavourzyme), 프로타맥스(Protamex) 효소를 처리했을 때 농도, 시간별 L-티로신 (L-tyrosine) 함량을 측정한 결과이다.
도 3은 실험예 1에 따른 본 출원의 쌍별 귀뚜라미 추출물에 플라보르자임 (Flavourzyme), 프로타맥스(Protamex) 각 1%를 혼합 처리했을 때, 추출 공정 유무에 따른 시간별 L-티로신 (L-tyrosine) 함량을 측정한 결과이다.
도 4는 본 출원의 쌍별 귀뚜라미 추출물에 처리한 단백질 분해 효소의 적정 처리 조건을 나타내었다.
도 5는 실험예 2에 따른 본 출원의 쌍별 귀뚜라미 추출물의 전자 공여능을 DPPH 라디칼 소거능 실험으로 확인한 결과이다.
도 6은 실험예 2에 따른 본 출원의 쌍별 귀뚜라미 추출물의 EC50(ppm) 값을 나타낸 표이다.
도 7은 실험예 3에 따른 본 출원의 쌍별 귀뚜라미 추출물의 RAW 264.7 대식세포에서 Nitrite 생성 저해 효과를 나타낸 그래프로서 도 7a는 제조방법 (열수 추출 여부, 효소처리 여부)에 따른 Nirite 생성 저해 효과를 나타낸 그리프이고, 도 7b는 효소처리, 농도 차이에 따른 Nirite 생성 저해 효과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 실험예 4에 따른 본 출원의 쌍별 귀뚜라미 추출물의 RAW 264.7 대식세포에서 세포 생존율 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 실험예 5에 따른 본 출원의 쌍별 귀뚜라미 추출물의 제조 공정 중 Hexanal 성분의 감소를 나타낸 흐름도이다.
도 2는 실험예 1에 따른 본 출원의 쌍별 귀뚜라미 추출물에 플라보르자임 (Flavourzyme), 프로타맥스(Protamex) 효소를 처리했을 때 농도, 시간별 L-티로신 (L-tyrosine) 함량을 측정한 결과이다.
도 3은 실험예 1에 따른 본 출원의 쌍별 귀뚜라미 추출물에 플라보르자임 (Flavourzyme), 프로타맥스(Protamex) 각 1%를 혼합 처리했을 때, 추출 공정 유무에 따른 시간별 L-티로신 (L-tyrosine) 함량을 측정한 결과이다.
도 4는 본 출원의 쌍별 귀뚜라미 추출물에 처리한 단백질 분해 효소의 적정 처리 조건을 나타내었다.
도 5는 실험예 2에 따른 본 출원의 쌍별 귀뚜라미 추출물의 전자 공여능을 DPPH 라디칼 소거능 실험으로 확인한 결과이다.
도 6은 실험예 2에 따른 본 출원의 쌍별 귀뚜라미 추출물의 EC50(ppm) 값을 나타낸 표이다.
도 7은 실험예 3에 따른 본 출원의 쌍별 귀뚜라미 추출물의 RAW 264.7 대식세포에서 Nitrite 생성 저해 효과를 나타낸 그래프로서 도 7a는 제조방법 (열수 추출 여부, 효소처리 여부)에 따른 Nirite 생성 저해 효과를 나타낸 그리프이고, 도 7b는 효소처리, 농도 차이에 따른 Nirite 생성 저해 효과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 실험예 4에 따른 본 출원의 쌍별 귀뚜라미 추출물의 RAW 264.7 대식세포에서 세포 생존율 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 실험예 5에 따른 본 출원의 쌍별 귀뚜라미 추출물의 제조 공정 중 Hexanal 성분의 감소를 나타낸 흐름도이다.
이하에서는 실시예를 통해 본 출원의 내용을 더욱 구체적으로 설명한다. 다만, 실시예는 본 출원의 일 예시일 뿐이고, 본 출원의 범위가 실시예의 범위로 한정되는 것을 의미하는 것은 아니다.
<실시예>
제조예
1: 쌍별 귀뚜라미 추출물의 제조
(1) 쌍별 귀뚜라미를 절식시키는 단계
밀겨 식이하여 40~45일 된 쌍별 귀뚜라미는 사용 전 절식하면서 배설물을 배출하는 과정을 거친다. 24시간 절식 과정을 거친 쌍별 귀뚜라미는 세척한 후 냉동보관한다.
(2) 쌍별 귀뚜라미에 가수, 분쇄하는 단계
상기 전처리한 원료 100 중량부에 400 중량부 물을 첨가한 후 분쇄하여 효소 처리가 용이한 액상으로 만든다.
(3) 쌍별 귀뚜라미 추출물을 원심 분리하는 단계
상기 분쇄물을 6000rpm, 20분 원심 분리한 후 상등액만 취한다.
(4) 쌍별 귀뚜라미 원심 분리 상등액에 효소를 처리하는 단계
상기 원심 분리한 상등액에 단백질 분해 효소인 플라보르자임 (Flavourzyme) 또는 프로타맥스(Protamex)를 0.1%, 0.25%, 0.5%, 0.75%, 1% 첨가하고 플라보르자임 (Flavourzyme) 50℃, 프로타맥스(Protamex) 60℃온도에서 1, 2, 3, 4, 5시간 처리하거나, 플라보르자임 (Flavourzyme) + 프로타맥스(Protamex) 55℃에서 1, 2, 3, 4, 5시간 처리한 후 100℃, 10분 간 효소를 불활성화 시켰다.
(5) 쌍별 귀뚜라미 효소 처리액을 살균, 냉각하는 단계
상기 효소 처리액을 100℃, 30분간 살균하고, 4℃, 60분간 냉각하여 냉장 조건에서 장기간 보관이 가능하도록 하였다.
제조예
2: 쌍별 귀뚜라미 추출물의 제조
(1) 쌍별 귀뚜라미의 전처리 단계
밀겨 식이하여 40~45일 된 쌍별 귀뚜라미는 사용 전 절식하면서 배설물을 배출하는 과정을 거친다. 24시간 절식 과정을 거친 쌍별 귀뚜라미는 세척한 후 냉동보관한다.
(2) 쌍별 귀뚜라미에 가수, 분쇄하는 단계
상기 전처리한 원료 100 중량부에 400 중량부 물을 첨가한 후 분쇄하여 추출 및 효소 처리가 용이한 액상으로 만든다.
(3) 분쇄물을 추출하는 단계
상기 분쇄물을 100℃에서 20분간 추출하여 원심분리 전 수용성 영양 성분을 추출한다.
(4) 쌍별 귀뚜라미 추출물을 원심 분리하는 단계
상기 추출액을 6000rpm, 20분 원심 분리한 후 상등액만 취한다.
(5) 쌍별 귀뚜라미 원심 분리 상등액에 효소를 처리하는 단계
상기 원심 분리한 상등액에 단백질 분해 효소인 플라보르자임 (Flavourzyme) 또는 프로타맥스(Protamex)를 0.1%, 0.25%, 0.5%, 0.75%, 1% 첨가하고 플라보르자임 (Flavourzyme) 50℃, 프로타맥스(Protamex) 60℃에서 1, 2, 3, 4, 5시간 처리하거나, 플라보르자임 (Flavourzyme) + 프로타맥스(Protamex) 55℃에서 1, 2, 3, 4, 5시간 처리한 후 100℃, 10분 간 효소를 불활성화 시켰다.
(6) 쌍별 귀뚜라미 효소 처리액을 살균, 냉각하는 단계
상기 효소 처리액을 100℃, 30분 간 살균하고, 4℃, 60분간 냉각하여 냉장 조건에서 장기간 보관이 가능하도록 하였다.
실험예 1: 효소 종류 및 처리 조건에 따른 L-티로신 (L-tyrosine) 함량 측정
쌍별귀뚜라미 조성물의 효소적 가수분해를 위한 적정 효소 농도 및 반응시간을 설정하기 위하여 가수분해 시간에 따른 가수분해물의 함량을 L-티로신 (L-tyrosine)을 측정하여 확인하였다. 플라보르자임 (Flavourzyme)과 프로타맥스(Protamex) 단일 효소 농도를 각각 0.1%, 0.25%, 0.5%, 0.75%, 1%로 하고, 반응 시간을 1, 2, 3, 4, 5시간으로 설정하여 실험한 결과는 도 2에 나타내었다. 또한, 수용성 영양성분만의 추출단계 유무 및 가수분해 시간에 따른 가수분해물의 함량을 L-티로신 (L-tyrosine)을 측정하여 확인하였다. 수용성 영양성분만의 추출단계 유무의 차이 외 플라보르자임 (Flavourzyme)과 프로타맥스(Protamex)를 각 1%씩 혼합하고, 반응 시간을 1, 2, 3, 4, 5시간으로 설정하여 실험한 결과는 도 3에 나타내었다.
그 결과 플라보르자임 (Flavourzyme)과 프로타맥스 (Protamex) 단일 효소 처리 및 플라보르자임 (Flavourzyme)과 프로타맥스 (Protamex) 혼합처리구 중 가수분해능은 플라보르자임 (Flavourzyme) + 프로타맥스 (Protamex) 혼합처리구의 가수분해능이 가장 우수하였으며, 플라보르자임 (Flavourzyme)과 프로타맥스 (Protamex) 단일 처리구는 유사한 수준의 가수분해능을 나타내었고, 농도가 증가할수록 우수한 가수분해능을 보였다. 특히, 반응시간 측면에서는 효소 처리 후 1시간부터 급격히 가수분해가 이루어지는 것으로 보이며, 이후에는 약간의 증가가 있었지만, 그 차이가 크지 않았다. 따라서, 플라보르자임 (Flavourzyme)과 프로타맥스 (Protamex) 효소의 단독 처리구는 1-5시간의 반응시간이 요구되는 것으로 보이며, 플라보르자임 (Flavourzyme)과 프로타맥스 (Protamex) 혼합 처리구는 1-3시간의 반응 시간이 필요한 것으로 판단되었다.
플라보르자임 (Flavourzyme) + 프로타맥스 (Protamex) 혼합 처리구에서 쌍별귀뚜라미의 분쇄물에서 수용액을 추출, 원심 분리하여 효소처리 하는 것보다, 수용액을 추출하지 않고 원심 분리하여 효소 처리하는 것이 가수분해 효율이 우수하였다.
이하의 실험예 2 - 5에서는 플라보르자임 (Flavourzyme)과 프로타맥스 (Protamex)를 각 1%씩 55℃, 2시간 혼합 처리한 것을 사용하였다.
실험예 2: 쌍별귀뚜라미 추출물의 전자공여능 측정
전자공여능은 DPPH(1,1 diphenyl-2-picrylhydrazyl)의 환원력을 이용하여 측정하였다. 제조방법 별(열수 추출 여부, 효소처리 여부) 98~50000ppm의 쌍별귀뚜라미 추출물 100㎕에 0.2mM DPPH 용액 100㎕를 가한 후 실온에서 30분간 반응시키고 525 nm에서 흡광도를 측정하여 산화 저해율을 계산하였고, 이를 도 5 및 6에 나타내었다. 그 결과 도 5에서 도시된 바와 같이 쌍별귀뚜라미 (쌍별이) 추출물은 제조방법과 무관하게 항산화력이 있음이 확인되었고, 특히, 도 6에서 도시된 바와 같이 쌍별귀뚜라미 (쌍별이)의 수용성 영양성분을 추출하고 플라보르자임 (Flavourzyme)과 프로타맥스 (Protamex) 효소 처리를 한 경우 EC50 값이 3967ppm 수준으로 우수한 항산화력이 있음을 확인하였다.
실험예 3: 쌍별귀뚜라미 추출물의 NO 생성 저해 효과
쌍별귀뚜라미의 항염증 효능을 분석하기 위해 LPS(Lipopolysaccharide)를 통해 염증반응을 유도한 RAW 264.7 세포에 쌍별귀뚜라미 추출물을 처리하여 생성된 NO의 양을 세포 배양액 중에 존재하는 NO2 -의 형태로서 측정하였다.
Raw 264.7 세포는 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin) 100 unit/ml과 10% 소태아혈청(fetal bovine serum/ Gibco, MD, USA)이 함유된 배지(Dublecco's Modified Eagle Medium/ Gibco, MD, USA)를 사용하여 37℃, 5% CO2 인큐베이터(incubator/Thermo Scientific, IL, USA)에서 배양하였으며, 2일 간격으로 계대 배양을 실시하였다.
NO 생성 측정을 위해 RAW 264.7 세포를 2x105 cells/well로 96 웰 플레이트(well plate)에 분주하고 5시간 후에 쌍별 귀뚜라미 추출물을 LPS와 함께 제조방법 별 (열수 추출 여부, 효소 처리 여부, 도 7a) 또는 효소처리별, 농도별(8, 40, 200, 1000ppm 도 7b)로 처리 후 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 배양하였다. 배양이 완료된 후 배양액 100㎕와 Griess reagent[1%(w/v) sulfanilamide in 5%(v/v) phosphoric acid와 0.1(w/v) naphtylethylenediamine-HCl] 100㎕를 혼합하여 96 웰 플레이트(well plate)에서 10분 동안 반응시킨 후 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준 물질로는 NaNO2를 사용하였다.
NO는 NOS(NO Synthase)의 효소 촉매작용을 통해 생성되는 자유 라디칼로 혈압 조절과 신경 전달 매개체로 면역 반응에 중추적인 역할을 담당하나, 과량의 NO 생성은 염증반응을 일으킨다고 알려져 있다.
실험 결과 도7a 및 7b에 도시한 바와 같이, LPS로 유도한 Raw cell 264.7에서의 NO2 생성은 통계적으로 유의성 있게 억제되었으며, 이를 통해 항염증 효과를 확인하였다. 후술되는 실험예 4에서의 세포 생존율 분석을 토대로 세포 독성에도 큰 영향이 없는 것으로 보아 쌍별귀뚜라미 추출물은 천연 기능성 소재로도 활용 가능할 것으로 보인다.
실험예 4: 세포생존율 분석
Raw 264.7 세포는 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin) 100 unit/ml과 10% 소태아혈청(fetal bovine serum/ Gibco, MD, USA)이 함유된 배지(Dublecco's Modified Eagle Medium/ Gibco, MD, USA)를 사용하여 37℃, 5% CO2 인큐베이터(incubator/Thermo Scientific, IL, USA)에서 배양하였으며, 2일 간격으로 계대 배양을 실시하였다.
세포 생존율 측정을 위해 RAW 264.7 세포를 2x105 cells/well로 96 웰 플레이트(well plate)에 분주하고, 쌍별 귀뚜라미 추출물을 효소 처리별, 농도별(8, 40, 200, 500, 1000ppm)로 처리 후 37℃, 5% CO2incubator에서 24시간 배양하였다.
CellTiter 96® aqueousnon-radio active cell proliferation assay reagent(Promega,WI,USA)를 첨가한 후, 37℃, 5% CO2 incubator에서 90분 반응시켜 마이크로 플레이트 리더기(microplate reader/ Beckman Coulter, CA, USA)를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하여 세포 생존율을 측정하였다.
그 결과, 도 8에 도시한 바와 같이, 쌍별귀뚜라미 추출물은 88.45±2.65~103.71±4.68% 세포 생존율을 나타내어 8~1000 ppm 농도에서 항염증 활성 측정 시 세포 사멸에 큰 영향을 주지 않는 것으로 분석되었다.
실험예
5: 효소 종류 및 처리 조건에 따른
헥사날
(
hexanal
) 함량 측정
곤충 유래의 이취, 비린취 성분을 저감화하여 식품의 소재로 활용하고자, 산화생성물 중 한 성분인 헥사날(Hexanal)을 가스 크로마토그램으로 분석하여 비린취가 감소하는 것을 확인하였다.
헥사날 (Hexanal)은 올레산, 리놀레산, 아라키돈산 (oleic acid, linoleic acid, arachidonic acid)와 같은 지방산의 산화와 알데하이드류의 분해에 의해 주로 생성되는 물질이며, 산화 생성물 중 하나로 이취, 비린취를 내는 성분으로 알려져 있다. 쌍별 귀뚜라미의 지방함량은 생물 기준 9.0% (oleic acid 26%, linoleic acid 32%) 이다.
도 9에 나타난 바와 같이 전처리(식이조절, 절식), 추출, 원심분리, 효소 처리 과정을 거치면서 헥사날(Hexanal)이 줄어들어 이취와 비린취가 감소하는 것을 확인하였다.
Claims (12)
- 쌍별귀뚜라미를 절식시키는 단계;
상기 쌍별귀뚜라미를 분쇄하는 단계;
상기 분쇄물을 원심분리 하는 단계; 및
원심분리된 상등액에 단백질 분해 효소를 처리하는 단계;
를 포함하는, 식품 소재용 쌍별귀뚜라미 추출물 함유 조성물의 제조방법으로서,
상기 쌍별귀뚜라미 추출물은 헥사날(hexanal) 함량이 0mg/L 초과 0.2mg/L 이하인 것을 특징으로 하는, 제조방법. - 제 1항에 있어서, 상기 절식은 1 내지 72시간 동안 이루어지는 것인, 제조방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 단백질 분해 효소는 펩신, 트립신, 플라보르자임(Flavourzyme), 프로타멕스(Protamex), 파파인, 알파키모트립신, 판크레아제 //로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 제조방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 단백질 분해 효소는 5분 내지 5시간 동안 처리하는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 단백질 분해 효소는 30분 내지 2시간 동안 처리하는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 단백질 분해 효소는 0.0001 내지 5%로 처리하는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 제조방법은 쌍별귀뚜라미 추출물 함유 조성물을 살균, 냉각, 농축 및 동결 건조로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단계를 추가로 포함하는, 제조방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 쌍별귀뚜라미 추출물은 L-티로신(L-tyrosine)을 0.1 내지 1.0mg/ml로 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
- 제 1항에 있어서,
상기 제조방법은 수용성 영양성분만을 추출하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조방법. - 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항의 제조방법으로 제조된, 식품 소재용 쌍별귀뚜라미 추출물 함유 조성물.
- 제 10항에 있어서, 상기 조성물은 분말, 과립 또는 액상인 것을 특징으로 하는, 조성물.
- 제 10항 또는 제 11항의 조성물을 포함하는, 식품.
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