KR20190041219A - 계면활성, 유화성 및 지방족 탄화수소 혼합물질 분해능을 보유한 미생물 혼합체 - Google Patents
계면활성, 유화성 및 지방족 탄화수소 혼합물질 분해능을 보유한 미생물 혼합체 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 로도코커스 청신기 AB7 (Rhodococcus qingshengii AB7), 넵튜노모나스 피코필라 GRM1 (Neptunomonas phycophila GRM1) 및 알카리보락스 보크멘시스 BD 3 (Alcanivorax borkumensis BD3) 균주를 이용하여 오염된 의류의 세척활성을 높여주는 미생물 혼합체의 발명에 관한 것이다.
본 발명은 계면활성, 유화성 및 지방족 탄화수소 혼합물질을 생물학적으로 분해하는 효능을 보유한 미생물 혼합체에 관한 것이다.
본 발명은 계면활성, 유화성 및 지방족 탄화수소 혼합물질을 생물학적으로 분해하는 효능을 보유한 미생물 혼합체에 관한 것이다.
Description
본 발명은 로도코커스 청신기 AB7 (Rhodococcus qingshengii AB7), 넵튜노모나스 피코필라 GRM1 (Neptunomonas phycophila GRM1) 및 알카리보락스 보크멘시스 BD 3 (Alcanivorax borkumensis BD3) 균주를 이용하여 오염된 의류의 세척활성을 높여주는 미생물 혼합체 발명에 관한 것이다.
본 발명은 계면활성, 유화성 및 지방족 탄화수소 혼합물질을 생물학적으로 분해하는 효능을 보유한 미생물 혼합체에 관한 것이다.
본 발명은 로도코커스 청신기 AB7 (Rhodococcus qingshengii AB7), 넵튜노모나스 피코필라 GRM1 (Neptunomonas phycophila GRM1) 및 알카리보락스 보크멘시스 BD 3 (Alcanivorax borkumensis BD3) 균주를 이용하여 오염된 의류의 세척활성을 높여주는 미생물 혼합체에 관한 것이다.
본 출원인은 상기 3종의 미생물을 계면활성, 유화성 및 지방족 탄화수소 혼합물질을 생물학적으로 분해하는 미생물 혼합체 형태로 특허기탁이 완료된 상태(KCTC13343BP)이다.
선행기술문헌을 살펴보면, 대한민국 등록특허공보 제10-1109120호에는 '해양 원유 분해활성을 갖는 기능성 미생물 커뮤니티'가 기재되어 있다. 청구항 1에는 "알칸니보락스 속(Alcanivorax sp.), 이디오마리나 속(Idiomarina sp.), 올레이필러스 속(Oleiphilus sp.) 및 스핑고모나스 속(Sphingomonas sp.)을 포함하여 해양 원유 분해활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 기능성 미생물 커뮤니티 FMC-CR9[KCTC 11511BP]." 에 대해 기재되어 있으며, 원유로 오염된 해수 정화 방법에 관한 것이다.
선행기술문헌을 살펴보면, 대한민국 등록특허공보 제10-0563207호에는 '환경오염을 유발하는 알킬페놀류의 생물학적 분해방법'이 기재되어 있다. 청구항 1에는 "계면활성제로 사용되며, 환경을 오염시키는 알킬페놀류의 분해방법에 있어서, 큰이빨버섯 또는 좀구멍버섯의 단독 또는 이들의 혼합균주를 알킬페놀에 접촉시켜 분해시키는 것을 특징으로 하는 알킬페놀류의 생물학적 분해방법"이 기재되어 있다.
선행문헌을 살펴보면 미생물을 활용한 원유 정화 및 알킬페놀류 분해 방법에 대해 기재되어 있으나, 이를 이용한 의류세척 효율을 증진시킬 수 있는 혼합 미생물 배양체에 관해서는 기재되어 있지 않다.
따라서 본 발명자는 계면활성, 유화성 및 지방족 탄화수소 화합물을 분해하여 의류세척 효율을 증진시키는 미생물 혼합체를 제조함으로서 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 로도코커스 청신기 AB7 (Rhodococcus qingshengii AB7), 넵튜노모나스 피코필라 GRM1 (Neptunomonas phycophila GRM1) 및 알카리보락스 보크멘시스 BD 3 (Alcanivorax borkumensis BD3) 균주를 이용하여 오염된 의류의 세척활성을 높여주는 미생물 혼합체를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 계면활성, 유화성 및 지방족 탄화수소 혼합물질을 생물학적으로 분해하는 효능을 보유한 미생물 혼합체를 제공하는 것이다.
본 발명은, 로도코커스 청신기 AB7 (Rhodococcus qingshengii AB7), 넵튜노모나스 피코필라 GRM1 (Neptunomonas phycophila GRM1) 및 알카리보락스 보크멘시스 BD3 (Alcanivorax borkumensis BD3) 균주의 단일 배양체를 혼합하여 제조함으로서, 계면활성, 유화성 및 지방족탄화수소 분해능을 보유한 미생물 혼합체를 제공함으로서 기술적 과제를 해결하고자 한다.
본 발명은, 상기 균주 3종의 단일 배양체를 1:1:1의 부피비율로 혼합하여 제조한 것을 특징으로 하는 미생물 혼합체를 제공함으로서 기술적 과제를 해결하고자 한다.
본 발명은, 상기 균주 3종의 단일 배양체를 1:1:1의 부피비율로 혼합하여 제조함으로서, 유류오염(Hexane)에 대해 계면활성 및 유화성을 나타내며, 지방족 탄화수소 혼합물질(paraffin) 성분을 분해하는 것을 특징으로 하는 미생물 혼합체를 제공함으로서 기술적 과제를 해결하고자 한다.
본 발명은, 로도코커스 청신기 AB7 (Rhodococcus qingshengii AB7), 넵튜노모나스 피코필라 GRM1 (Neptunomonas phycophila GRM1) 및 알카리보락스 보크멘시스 BD3 (Alcanivorax borkumensis BD3) 균주의 단일 배양체를 혼합하여 제조함으로서, 계면활성, 유화성 및 지방족탄화수소 분해능을 보유한 미생물 혼합체를 포함하는 친환경 의류 세척제를 제공함으로서 기술적 과제를 해결하고자 한다.
본 발명은, 청구항 1의 방법으로 제조된 미생물 혼합체를 포함하는 친환경 미생물 세제를 제공함으로서 기술적 과제를 해결하고자 한다.
본 발명은 로도코커스 청신기 AB7 (Rhodococcus qingshengii AB7), 넵튜노모나스 피코필라 GRM1 (Neptunomonas phycophila GRM1) 및 알카리보락스 보크멘시스 BD 3 (Alcanivorax borkumensis BD3) 균주를 이용하여 오염된 의류의 세척활성을 높여주는 미생물 혼합체를 제공하고자 한다.
본 발명은 계면활성, 유화성 및 지방족 탄화수소 혼합물질을 생물학적으로 분해하는 효능을 보유한 미생물 혼합체를 제공하고자 한다.
도 1은 균주 1(Rhodococcus qingshengii AB7)에 대한 계통학적 tree. 16S rRNA 유전자 염기서열 분석 및 비교 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 균주 2(Neptunomonas phycophila GRM1)에 대한 계통학적 tree. 16S rRNA 유전자 염기서열 분석 및 비교 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 균주 3(Alcanivorax borkumensis BD3)에 대한 계통학적 tree. 16S rRNA 유전자 염기서열 분석 및 비교 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 미생물 배양상등액의 계면활성 효과측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 혼합배양체의 유화성 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 혼합배양체의 지방족 탄화수소 혼합물질 분해 기능 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 균주 2(Neptunomonas phycophila GRM1)에 대한 계통학적 tree. 16S rRNA 유전자 염기서열 분석 및 비교 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 균주 3(Alcanivorax borkumensis BD3)에 대한 계통학적 tree. 16S rRNA 유전자 염기서열 분석 및 비교 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 미생물 배양상등액의 계면활성 효과측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 혼합배양체의 유화성 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 혼합배양체의 지방족 탄화수소 혼합물질 분해 기능 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 안 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.
따라서 본 명세서에 기재된 실험예와 참고예는 본 발명의 가장 바람직한 일실시예에 불과한 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형 예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.
실시예1. 미생물 혼합체 제조
오염된 의류로부터 오염물질 탈착기능이 있는 균주 (3종) 혼합체로서, 균주1 Rhodococcus qingshengii AB7, 균주2 Neptunomonas phycophila GRM1, 균주3 Alcanivorax borkumensis BD3 을 혼합하여 제조한 미생물 혼합체(기탁번호 KCTC 13343BP)를 특허 기탁완료한 바 있다.
도 1은 균주 1(Rhodococcus qingshengii AB7)에 대한 계통학적 tree. 16S rRNA 유전자 염기서열 분석 및 비교 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 균주 2(Neptunomonas phycophila GRM1)에 대한 계통학적 tree. 16S rRNA 유전자 염기서열 분석 및 비교 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 균주 3(Alcanivorax borkumensis BD3)에 대한 계통학적 tree. 16S rRNA 유전자 염기서열 분석 및 비교 결과를 나타낸 도면이다.
1) 증균을 위한 미생물 배양
글라이세롤 15 %와 함께 80℃에서 보관중이던 미생물 균주1 Rhodococcus qingshengii AB7, 균주2 Neptunomonas phycophila GRM1, 균주3 Alcanivorax borkumensis BD3 을 배양하기 위해 상기 3종의 미생물을 각각 25ml의 Marine Agar 배지에 100ul씩 도말 한다. 각각의 도말된 미생물을 30-35℃ 인큐베이터에서 3일간 배양한 후, 단일 군집을 선별하여 5mL의 marine broth에 접종한다. 접종된 5ml의 marine broth는 2일간 30-35℃ 혼탁 배양기에서 배양하며, 배양된 배양액을 250ml의 marine broth에 재 접종하여 증균한다. 1L 플라스크에서 220rpm의 속도로 36시간 혼탁 배양 후 원심분리(10,000 rpm, 10분)를 통해 균체를 각각 회수 한다. 회수된 각 균체는 배양액과 균체로 나누고, 균체의 경우 PBS 10ml에 재현탁하여 4℃에 보관하며 배양액 또한 4℃에 보관한다.
2) 미생물 배양체 및 혼합체 조성
상기 3종의 각 미생물 배양체는 1: 1:１로 배합하며, 혼합비율을 정확히 결정하기 위해, 회수된 각 개체에 200ml의 PBS 1X buffer를 현탁한 뒤, UV-vis spectrophotometer를 이용해 O.D 값을 측정한다. 측정된 O.D값을 고려하여 각 현탁되어 있는 세가지 균체의 O.D값을 PBS 1X buffer를 첨가하면서 일정(~OD 1.0)하게 맞춰준다. 희석에 의해 동일한 O.D값으로 고정된 각 균체를 혼합하여 계면활성 및 세척기능을 측정하는데 사용할 수 있다.
의류 세척능 검증(계면활성, 탈착능)을 위한 미생물배양 기법 1
증균 실험에 의해 200ml Marine Broth에 배양된 배양체를 대상으로 원심분리하여 상등액을 확보하고 각 상등액을 1:1:1로 혼합하여 준비한다.
의류 세척능 검증(유화성, 탈착능)을 위한 미생물배양 기법 2
증균 실험에 의해 200ml Marine Broth에 배양된 배양체를 원심분리에 의해 확보하고 PBS 1X에 희석하여 확보한 O.D값이 1.0 으로 맞추어진 혼탁액을 1:1:1로 혼합하여 미생물 배양체를 10ml 준비한다.
실험예 1. 혼합 배양체의 계면활성능 및 유화성 검증을 통한 세척효과
계면활성 기능과 유화도 측정을 통한 세척 효과 검증 목적은 3가지 미생물 혼합체가 갖는 계면활성 또는 유화성은 미생물이 배출하는 물질과 미생물세포 자체 성분 때문에 나타날 수 있다. 따라서 본 발명에서는 의류세척기능을 함유한 미생물혼합체를 개발할 뿐 아니라, 세척효과를 증진시키는 물질이 함유된 배양액 또는 배양체를 분리하여 세척기능을 실험해 봄으로서, 향후 세척기능을 높일 수 있는 방향을 제시하고자 한다.
1-1. 의류 세척능 계면활성 및 탈착능 검증
밀폐 가능한 2.0cm 내경의 30ml 유리시험관에 각 미생물 혼합체 상등액을 5ml씩 분주한 뒤, Diesel, Benzene, Hexane with Crude oil을 각각 5 ml 씩 첨가한다. 접종 및 첨가를 마친 각각의 시험관은 유기용매에 녹지 않는 고무마개와 알류미늄 캡으로 고정한 뒤, Vortex 3,000 rpm에서 30초 동안 흔든 실험관을 상온에서 10분간 정치한 후 에멀전 층의 두께를 측정한다.
도 4는 미생물 배양상등액의 계면활성 효과측정 결과를 나타낸 그래프이다.
미생물 배양상등액의 계면활성 효과측정 결과, 대조군에 비해 Hexane과 같은 유류계열 오염물질 세척기능에 중요한 계면활성을 나타내는 것을 확인 할 수 있었다. 또한 계면활성을 대변하는 에멀전층이 혼합 배양체의 배양액에 의해 두껍게 나타나는 것을 확인할 수 있다.
1-2. 의류 세척능 유화성 및 탈착능 검증
밀폐 가능한 2.0cm 내경의 30ml 유리시험관에 각 PBS 1X에 현탁한 미생물 혼합체를 5ml씩 분주한 뒤, Diesel, Benzene, Hexane with Crude oil을 각각 5 ml 씩 첨가한다. 접종 및 첨가를 마친 각각의 시험관은 유기용매에 녹지 않는 고무마개와 알류미늄 캡으로 고정한 뒤, Vortex 3,000 rpm에서 30초 동안 흔든 실험관을 상온에서 10분간 정치한 후 에멀전 층의 두께를 측정한다.
도 5는 혼합배양체의 유화성 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
미생물 배양체의 유화성 측정 결과, 대조군에 비해 Hexane과 같은 유류계열 오염물질 세척기능에 중요한 유화도가 높게 나타내는 것을 확일 할 수 있다. 하지만 미생물 배양체와 유류오염물질간의 유화도로인해 나타나는 에멀전 층의 두께가 배양액에 의해 나타나는 에멀전 층보다 얇게 나타나는 것을 확인할 수 있다.
실험예2. 혼합 배양체의 오염물질 성분 분석 및 분해기능 검증
의류 오염물질 성분 분석 및 오염물질 분해 기능 검증 목적은 3가지 미생물 혼합체는 산업체에서 사용된 작업복으로부터 오염물질을 탈착할 수 있는 계면활성 특성 뿐 아니라 오염물질을 친환경적으로 제거할 수 있는 오염물질에 대한 분해능력을 보유할 수 있다. 따라서 본 발명에서는 의류세척기능을 함유한 미생물혼합체를 개발할 뿐 아니라, 의류에 오염된 오염물질을 분해시키는 효과를 검증하여 미생물 혼합체의 친환경적 세제 기능을 제시하고자 한다.
2-1. 의류 오염물질 성분 분석
오염물질 성분 분석 방법은 산업체에서 사용된 작업복에 주로 오염되는 오염물질 성분을 분석하기 위해 ㈜포스코의 각 사업장에서 사용된 의류를 회수하여 분석한다.
각 사업장에서 회수된 의류는 외피의 오염이 가장 심한 부위를 2X2 cm 크기로 절단하여, 5ml의 Benzene 과 Chloroform이 각각 함유된 60ml 유리시험관에 용해시켰다. 용해시킨 용매는 10,000 rpm의 속도에서 1분간 원심분리하여 Sodium sulfate 0.03g을 첨가하여 수분을 제거한 뒤, 1.5ml 유리 Vial에 ?긴다. 옮겨진 용매는 Gas Chromatography Mass Spectrometry (GC/MS)를 이용해 분석하는데, 250℃(inlet), 100℃ 에서 15℃/min 씩 300℃ 까지 온도 상승 후 10분간 300℃(oven) 조건에서 DB-5ms 컬럼을 사용하여 분석한다.
오염물질 성분 분석 결과, 분석된 크로마토그램의 각 피크들에 대한 질량분석을 통해 작업복에 흡착되어 있는 직물오염물질에는 naphthalene, phthalate을 포함한 단환형 방향족 탄화수소, 다환성 방향족 탄화수소, 불포화지방족 탄화수소, 비정형 방향족 탄화수소 등이 다양하게 존재하였으나, 주로 hexadecane, tetracosane 등의 지방족 탄화수소가 35 % 이상 함유되어 있었다.
2-2. 혼합배양체의 오염물질 분해 기능 검증
혼합 배양체의 오염물질 분해기능은 표준물질에 대한 분해기능을 측정하여 평가하였다. 작업복에 흡착된 오염물질의 분석결과에 따라 주된 오염물질로 분석된 지방족 탄화수로를 포함하는 paraffin(지방족 탄화수소 혼합물질)을 표준물질로 선정한 후 500 ppm의 paraffin mixture를 5ml의 최소영양배지가 함유된 유리시험관에 첨가한 후 미생물 혼합체를 100ul (OD 1.0기준) 접종하였다. 30℃, 220rpm의 조건에서 24시간 반응시킨 후 시험관 내 잔존하는 오염물질(paraffin) 양을 측정하고자 GC chromatograph system를 사용하였다.
혼합배양체가 배양된 시험관으로부터 잔존하는 오염물질을 회수하기 위해 5ml의 다이부틸 클로라이드(Dimethyl chloride)를 첨가하여 배양액을 추출한다. 추출된 유기용매 층의 일부를 1.5ml GC chromatography 전용 vial에 옮기고, 물성분을 제거하여 시료를 준비한다. 준비된 시료는 GC chromatograph system에서 HP-5 컬럼을 사용하여 측정하고, 오염물질이 함유된 표준농도 시료와 균체를 접종하지 않은 대조군(control)의 페놀 크로마토그램을 활용해 각 시험군에 잔존하는 오염물질양을 측정한다.
혼합배양체의 오염물질 분해 기능 검증결과, 24시간 혼합배양체와 오염물질을 반응시킨 뒤 GC chromatography 측정결과를 살펴본 결과 대부분의 paraffin 성분들이 제거되어 전체적으로 50% 이상의 오염물질이 감소된 것을 확인 할 수 있었다. 특히, paraffin 성분 중 분자량이 작은 탄화수소 뿐 아니라 상대적으로 분해가 힘든 분자량이 큰 지방족 탄화수소도 현저하게 감소한 것을 확인 할 수 있었다.
결과적으로 본 발명자가 보유한 3종(Rhodococcus qingshengii AB7, Neptunomonas phycophila GRM1, Alcanivorax borkumensis BD3)의 미생물 혼합체는 유류계열 오염의류로부터 오염물질을 탈착시키는 기능을 가지며, 해당 미생물 혼합체는 단순한 오염물질 탈착기능 뿐만 아니라, 계면활성, 유화성 및 지방족 탄화수소 혼합물질을 효과적으로 분해하는 것으로 나타났다.
특히, 미생물 혼합체는 실제 작업환경에서 유래한 작업복에 흡착되어 있는 오염물질의 대부분을 차지하는 지방족 탄화수소를 분해하는 기능을 함유하고 있으며, 분해가 어려운 분자량이 큰 지방족 탄화수소까지 분해 하는 효과를 보인다.
이를 통해 친환경적으로 오염물질을 분해할 수 있는 미생물 혼합체 발명을 완성하였다.
Claims (5)
- 로도코커스 청신기 AB7 (Rhodococcus qingshengii AB7), 넵튜노모나스 피코필라 GRM1 (Neptunomonas phycophila GRM1) 및 알카리보락스 보크멘시스 BD3 (Alcanivorax borkumensis BD3) 균주의 각 단일 배양체를 혼합하여 제조된, 계면활성, 유화성 및 지방족탄화수소 분해능을 보유한 미생물 혼합체.
- 청구항 1에 있어서,
상기 균주 3종의 단일 배양체를 1:1:1의 부피비율로 혼합하여 제조한 것을 특징으로 하는 미생물 혼합체.
- 청구항 1 및 청구항 2에 있어서,
상기 균주 3종의 단일 배양체를 1:1:1의 부피비율로 혼합하여 제조함으로서, 유류오염(Hexane)에 대해 계면활성 및 유화성을 나타내며, 지방족 탄화수소 혼합물질(paraffin) 성분을 분해하는 것을 특징으로 하는 미생물 혼합체.
- 로도코커스 청신기 AB7 (Rhodococcus qingshengii AB7), 넵튜노모나스 피코필라 GRM1 (Neptunomonas phycophila GRM1) 및 알카리보락스 보크멘시스 BD3 (Alcanivorax borkumensis BD3) 균주의 단일 배양체를 혼합하여 제조함으로서, 계면활성, 유화성 및 지방족탄화수소 분해능을 보유한 미생물 혼합체를 포함하는 친환경 의류 세척제.
- 청구항 1의 방법으로 제조된 미생물 혼합체를 포함하는 친환경 미생물 세제.
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