CN110699294A - 一株多环芳烃降解菌及其筛选方法与应用 - Google Patents

一株多环芳烃降解菌及其筛选方法与应用 Download PDF

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Abstract

一株多环芳烃降解菌及其筛选方法与应用，涉及海洋石油烃降解菌。为转化异源物食烷菌(Alcanivorax xenomutans)45II‑AX，转化异源物食烷菌为革兰氏染色阴性的食烷菌属的菌株，生物学特性为非发酵型，专性需氧，菌体形态为无芽孢杆菌，菌落呈圆形，黄色不透明，表面光滑湿润，边缘规则，无晕环，中央凸起，直径2～3mm，最适生长条件为：pH＝7.0～8.5，温度25～28℃；可在降解有机化合物中应用。经鉴定，一株转化异源物食烷菌的16S rDNA基因序列于模式菌株Alcanivorax xenomutans JC109(T)，相似度为99.93％。

Description

一株多环芳烃降解菌及其筛选方法与应用
技术领域
本发明涉及海洋石油烃降解菌，尤其是涉及一株多环芳烃石降解菌及其筛选方法与应用。
背景技术
由于原油中含有不稳定的碳氢化合物，包括多环芳烃、甲苯、乙苯和二甲苯，这些有害物质可以通过呼吸、皮肤吸收和眼球进入人体内的血管中，有可能引起恶心、头痛、头晕等不适的感觉，甚至致癌，所以这次溢油事件对于附近居民的健康存在很大的威胁。溢油污染事故还会引起大面积海域严重缺氧，破坏海洋生产力，致使大量鱼、虾、贝类和海鸟死亡，造成局部“海洋荒漠化”；浮油被海浪冲到海岸，粘污海滩，造成海滩荒芜，破坏海产养殖和盐田生产，污染或毁坏滨海旅游区，降低海洋生态系统的服务功能和价值。石油污染物的生物富集作用不仅对海洋生物有毒害作用，可以通过食物链最终富集在人体内，从而对人类健康造成严重的危害。随着社会的不断发展，人类对石化产品的不断开发利用，致使环境中多环芳烃污染物浓度在逐年增加，已经威胁到人类的身体健康。存在于环境中的多环芳烃有天然和人为的两种来源。天然来源包括：某些细菌、藻类和植物的生物合成产物；森林、草原燃起的野火及火山喷发物；从化石燃料、木质素、底泥等散发出多环芳烃是长期地质年代间由生物降解物再合成的产物。多环芳烃是最早发现且为数最多的一类化学致癌物，可以引起正常细胞发生转化并发展成肿瘤。目前已对2000多种化合物做了实验，发现有致癌作用的达500多种，其中200多种为多环芳烃及其衍生物(张志家,金祖亮,竺酒恺,徐晓强.1990)。
多环芳烃在环境中的归宿包括挥发、光氧化、化学氧化、生物积累、土壤吸附及微生物降解等。多环芳烃在自然界中发生的化学反应可分为取代反应和加成反应，即分子中的不饱和化学键被破坏，生成较稳定的化合物(Cerniglia,C.E.1992)。此外，多环芳烃在自然环境中的反应大多是光氧化反应，在自然光或人造紫外线的照射下，多环芳烃会与氧气、臭氧或其它氧化剂反应生成内环过氧化物。多环芳烃还非常容易与大气特别是气溶胶中的SO2、SO3、或硫酸反应，生成水溶性的磺酸、亚磺酸和双磺酸。但诸多研究表明，微生物降解在PAHs的迁移转化乃至最终从环境中消失的过程中占有重要的地位，是环境中多环芳烃去除最主要的途径(Gibson,D.T.,Mahadevan,V.,Jerina,R.M.,et al.1975)。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一株多环芳烃降解菌(Alcanivorax xenomutans)45II-AX。
本发明的第二目的在于提供一株多环芳烃降解菌(Alcanivorax xenomutans)45II-AX的筛选方法。
本发明的第三目的在于提供一株多环芳烃降解菌(Alcanivorax xenomutans)45II-AX 16SrRNA核苷酸序列。
本发明的第四目的在于提供一株多环芳烃降解菌(Alcanivorax xenomutans)45II-AX可降解石油烃和高环多环芳烃(芘和苯并芘等)，可用于在石油或多环芳烃污染的盐碱性土壤的治理以及发生漏油事故海域等中应用。
所述一株多环芳烃降解菌为转化异源物食烷菌(Alcanivorax xenomutans)45II-AX，所述转化异源物食烷菌(Alcanivorax xenomutans)45II-AX为革兰氏染色阴性的食烷菌属的菌株，生物学特性为非发酵型，专性需氧，菌体形态为无芽孢杆菌，菌落呈圆形，黄色不透明，表面光滑湿润，边缘规则，无晕环，中央凸起，直径2～3mm，最适生长条件为：pH＝7.0～8.5，温度25～28℃；所述转化异源物食烷菌(Alcanivorax xenomutans)45II-AX已于2019年10月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏中心登记入册编号：CGMCC No.18723。
所述一株转化异源物食烷菌(Alcanivorax xenomutans)45II-AX筛选自太平洋深海沉积物，样品编号45II-CC-S06-MC01，距沉积物表层4～6cm，大洋45航次第二航段CC海区，153°23.1205′W，12°58.1135′N，沉积物为黄褐色，无味，弱黏性，表层呈半流动状，手搓略有粉砂感，太平洋深海沉积物样品在无菌收集后低温保存。
所述一株转化异源物食烷菌(Alcanivorax xenomutans)45II-AX的筛选方法包括以下步骤：
1)取大洋表层海水用121℃高压蒸汽灭菌20min后加入1％体积的无菌NH4NO3溶液和KH2PO4溶液及0.1％体积0.22μm滤膜除菌的FeSO4，所得培养基pH值约为7.5；
在步骤1)中，所述NH4NO3溶液的加入量可为100g/L；所述KH2PO4溶液的加入量可为10g/L，pH可为6.7；所述FeSO4的加入量可为0.4g/L。
2)接种前加入1％(V/V)多环芳烃和烷烃(碳源浓度为40mg/L)，培养物在28℃条件下进行初步富集培养，待富集物中培养基均变浑浊，说明烷烃和多环芳烃部分被降解，此时转接第二次，第三次转接到30天时准备分离单菌；
在步骤2)中，所述多环芳烃和烷烃中碳源的浓度可为40mg/L。
3)取第三次转接即第四轮富集30天时的培养物涂布到HLB固体培养基平板上，28℃温箱培养一周后从平板上挑出不同形态的菌落，分离纯化，提取DNA，进行16s测序，即得转化异源物食烷菌(Alcanivorax xenomutans)45II-AX。
在步骤3)中，所述HLB固体培养基的组分可为：胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，氯化钠30g，琼脂粉15g/L，去离子水1L，pH6.9～7.1。
所述一株转化异源物食烷菌(Alcanivorax xenomutans)45II-AX 16S rRNA核苷酸序列可为：
tggtgcaatccactcccatggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcattctgatccgcgattactagcgattccgacttcatggagtcgagttgcagactccaatccggactacgattggctttgagagattagctccgcctcgcgacctcgcaaccctctgtaccaaccattgtagcacgtgtgtagcccaggccgtaagggccatgatgacttgacgtcgtccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtctccctagagttcccacccgaagtgctggcaactaaggacaagggttgcgctcgttacgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacagccatgcagcacctgtcactgcgctcccgaaggcaccaatctatctctagaaagttcgcaggatgtcaaggcctggtaaggttcttcgcgttgcatcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcatttgagttttaaccttgcggccgtactccccaggcggtctacttatcgcgttagctgcgccaccaaagtcactaaggaccccaacggctagtagacatcgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgtttgctccccacgctttcgcacctcagcgtcagtgtcagtccaggaggccgccttcgccactggtgttccttccgatctctacgcatttcaccgctacaccggaaattccacctccctctactgcactctagcgtgccagtatcggatgcaattccaaggttgagccctgggctttcacatccgacttaacacaccgcctacgcgcgctttacgcccagtaattccgattaacgctcgcacctttcgtattaccgcggctgctggcacgaaattagccggtgcttcttctgtaggtaacgtcaagtactccagggtattagcccaaagccttcctccctactgaaagtgctttacaacccgaaggccttcttcacacacgcggcatggctggatcaggcttgcgcccattgtccaagattccccactgctgcctcccgtaggagtccgggccgtgtctcagtcccggtgtgactggccatcctctcagaccagttacggatcgtcgccttggtgggccattaccccaccaacaagctaatccgacgcgggctcatccatcagcgcaaggtccgaagatcccctgctttcccccgtagggattatgcggtattagctcgagtttccccgagttatcccccactaatgggcagattcccacgtgttactcacccgtccgccgctcgacgcctggga。
所述一株转化异源物食烷菌(Alcanivorax xenomutans)45II-AX可在降解有机化合物中应用，所述有机化合物可为石油烃类化合物等；所述石油烃类化合物可为多环芳烃等芳烃类化合物。
经鉴定，一株转化异源物食烷菌(Alcanivorax xenomutans)45II-AX的16S rDNA基因序列于模式菌株Alcanivorax xenomutans JC109(T)，相似度为99.93％，且在系统发育树上形成共同一枝，因此命名为Alcanivorax xenomutans 45II-AX，可降解石油烃和高环多环芳烃(芘和苯并芘等)，可用于在石油或多环芳烃污染的盐碱性土壤的治理以及发生漏油事故海域等中应用。
附图说明
图1为本发明所述转化异源物食烷菌(Alcanivorax xenomutans)45II-AX的菌落宏观形态图。
图2为本发明所述转化异源物食烷菌(Alcanivorax xenomutans)45II-AX的系统发育分析树。
图3为本发明所述转化异源物食烷菌(Alcanivorax xenomutans)45II-AX的多环芳烃降解率。
图4为本发明所述转化异源物食烷菌(Alcanivorax xenomutans)45II-AX的烷烃降解率。
具体实施方式
以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。
实施例1：菌株形态特征
将单菌落划线接种至HLB固体培养基中，将平板倒置于恒温培养箱内，28℃培养48h，菌落呈圆形，黄色不透明，表面光滑湿润，边缘规则，无晕环，中央凸起，直径2～3mm，参见图1。
实施例2：菌株的筛选和鉴定
(1)太平洋深海沉积物(样品编号45II-CC-S06-MC01，距沉积物表层4～6cm，大洋45航次第二航段CC海区，153°23.1205′W，12°58.1135′N)，沉积物为黄褐色，无味，弱黏性，表层呈半流动状，手搓略有粉砂感。沉积物样品在无菌收集后，经低温保存后运送至实验室进行下一阶段研究工作。
取大洋表层海水用121℃高压蒸汽灭菌20min后加入1％体积的无菌NH4NO3溶液(100g/L)和KH2PO4溶液(10g/L，pH6.7)及0.1％体积0.22μm滤膜除菌的FeSO4(0.4g/L)，最后所得培养基pH值约为7.5。接种前加入1％(V/V)多环芳烃(碳源浓度为40mg/L)和烷烃，培养物在28℃条件下进行初步富集培养。待富集物中培养基均变浑浊，说明多环芳烃和烷烃部分被降解。此时转接第二次，第三次转接到30天时准备分离单菌。取第三次转接即第四轮富集30天时的培养物涂布到HLB平板上，28℃温箱培养一周后从平板上挑出不同形态的菌落，分离纯化，获得食烷菌的纯菌。
提取该菌的基因组DNA并以此为模板采用通用27F，1492R引物扩增16S rDNA片段，并在EZ Biocloud上选取高相似度序列，用MEGA-X计算出序列的系统进化距离，构建系统发育树(NJ)，参见图2。
实施例3：菌株多环芳烃和烷烃降解能力测定
取大洋表层海水用121℃高压蒸汽灭菌20min后加入1％体积的无菌NH4NO3溶液(100g/L)和KH2PO4溶液(10g/L，pH6.7)及0.1％体积0.22μm滤膜除菌的FeSO4(0.4g/L)，最后所得培养基pH值约为7.5。接种前加入1％(V/V)烷烃和多环芳烃(碳源浓度为50mg/L)
培养五天后打开瓶口，通过GC-MS(气相色谱-质谱联用仪)得到样品的质量谱图，测得菲残余量，得到降解率为50％～60％。测得芘残余量，得到降解率为60％～70％。16烷降解率10％～20％，12烷降解率15％～25％，柴油降解率10～15％。多环芳烃降解率参见图3，烷烃降解率参见图4。
序列表
<110> 自然资源部第三海洋研究所；中国大洋矿产资源研究开发协会（中国大洋事务管理局）
<120> 一株多环芳烃降解菌及其筛选方法与应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1404
<212> DNA
<213> 转化异源物食烷菌(Alcanivorax xenomutans)
<400> 1
cgtcctcccg aaggttagac taactacttc tggtgcaatc cactcccatg gtgtgacggg 60
cggtgtgtac aaggcccggg aacgtattca ccgcggcatt ctgatccgcg attactagcg 120
attccgactt catggagtcg agttgcagac tccaatccgg actacgattg gctttgagag 180
attagctccg cctcgcgacc tcgcaaccct ctgtaccaac cattgtagca cgtgtgtagc 240
ccaggccgta agggccatga tgacttgacg tcgtccccac cttcctccgg tttgtcaccg 300
gcagtctccc tagagttccc acccgaagtg ctggcaacta aggacaaggg ttgcgctcgt 360
tacgggactt aacccaacat ctcacgacac gagctgacga cagccatgca gcacctgtca 420
ctgcgctccc gaaggcacca atctatctct agaaagttcg caggatgtca aggcctggta 480
aggttcttcg cgttgcatcg aattaaacca catgctccac cgcttgtgcg ggcccccgtc 540
aattcatttg agttttaacc ttgcggccgt actccccagg cggtctactt atcgcgttag 600
ctgcgccacc aaagtcacta aggaccccaa cggctagtag acatcgttta cggcgtggac 660
taccagggta tctaatcctg tttgctcccc acgctttcgc acctcagcgt cagtgtcagt 720
ccaggaggcc gccttcgcca ctggtgttcc ttccgatctc tacgcatttc accgctacac 780
cggaaattcc acctccctct actgcactct agcgtgccag tatcggatgc aattccaagg 840
ttgagccctg ggctttcaca tccgacttaa cacaccgcct acgcgcgctt tacgcccagt 900
aattccgatt aacgctcgca cctttcgtat taccgcggct gctggcacga aattagccgg 960
tgcttcttct gtaggtaacg tcaagtactc cagggtatta gcccaaagcc ttcctcccta 1020
ctgaaagtgc tttacaaccc gaaggccttc ttcacacacg cggcatggct ggatcaggct 1080
tgcgcccatt gtccaagatt ccccactgct gcctcccgta ggagtccggg ccgtgtctca 1140
gtcccggtgt gactggccat cctctcagac cagttacgga tcgtcgcctt ggtgggccat 1200
taccccacca acaaggtaat ccgacgcggg ctcatccatc agcgcaaggt ccgaagatcc 1260
cctgctttcc cccgtaggga ttatgcggta ttagctcgag tttccccgag ttatccccca 1320
ctaatgggca gattcccacg tgttactcac ccgtccgccg ctcgacgcct gggagcaagc 1380
tcccatcgtt ccgctcgact tgca 1404

Claims (10)

1.一株多环芳烃降解菌为转化异源物食烷菌(Alcanivorax xenomutans)45II-AX，所述转化异源物食烷菌(Alcanivorax xenomutans)45II-AX为革兰氏染色阴性的食烷菌属的菌株，生物学特性为非发酵型，专性需氧，菌体形态为无芽孢杆菌，菌落呈圆形，黄色不透明，表面光滑湿润，边缘规则，无晕环，中央凸起，直径2～3mm，最适生长条件为：pH＝7.0～8.5，温度25～28℃；所述转化异源物食烷菌(Alcanivorax xenomutans)45II-AX已于2019年10月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号：CGMCC No.18723。
2.如权利要求1所述一株转化异源物食烷菌(Alcanivorax xenomutans)45II-AX，其特征在于其筛选自太平洋深海沉积物，样品编号45II-CC-S06-MC01，距沉积物表层4～6cm，大洋45航次第二航段CC海区，153°23.1205′W，12°58.1135′N，沉积物为黄褐色，无味，弱黏性，表层呈半流动状，手搓略有粉砂感，太平洋深海沉积物样品在无菌收集后低温保存。
3.如权利要求1所述一株转化异源物食烷菌(Alcanivorax xenomutans)45II-AX的筛选方法，其特征在于包括以下步骤：
1)取大洋表层海水用121℃高压蒸汽灭菌20min后加入1％体积的无菌NH4NO3溶液和KH2PO4溶液及0.1％体积0.22μm滤膜除菌的FeSO4，所得培养基pH值约为7.5；
2)接种前加入1％多环芳烃和烷烃，培养物在28℃条件下进行初步富集培养，待富集物中培养基均变浑浊，说明烷烃和多环芳烃部分被降解，此时转接第二次，第三次转接到30天时准备分离单菌；
3)取第三次转接即第四轮富集30天时的培养物涂布到HLB固体培养基平板上，28℃温箱培养一周后从平板上挑出不同形态的菌落，分离纯化，提取DNA，进行16s测序，即得转化异源物食烷菌(Alcanivorax xenomutans)45II-AX。
4.如权利要求3所述一株转化异源物食烷菌(Alcanivorax xenomutans)45II-AX的筛选方法，其特征在于在步骤1)中，所述NH4NO3溶液的加入量为100g/L；所述KH2PO4溶液的加入量为10g/L，pH为6.7；所述FeSO4的加入量为0.4g/L。
5.如权利要求3所述一株转化异源物食烷菌(Alcanivorax xenomutans)45II-AX的筛选方法，其特征在于在步骤2)中，所述多环芳烃和烷烃中碳源的浓度为40mg/L。
6.如权利要求3所述一株转化异源物食烷菌(Alcanivorax xenomutans)45II-AX的筛选方法，其特征在于在步骤3)中，所述HLB固体培养基的组分为：胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，氯化钠30g，琼脂粉15g/L，去离子水1L，pH6.9～7.1。
7.如权利要求1所述一株转化异源物食烷菌(Alcanivorax xenomutans)45II-AX 16SrRNA核苷酸序列为：
tggtgcaatccactcccatggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcattctgatccgcgattactagcgattccgacttcatggagtcgagttgcagactccaatccggactacgattggctttgagagattagctccgcctcgcgacctcgcaaccctctgtaccaaccattgtagcacgtgtgtagcccaggccgtaagggccatgatgacttgacgtcgtccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtctccctagagttcccacccgaagtgctggcaactaaggacaagggttgcgctcgttacgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacagccatgcagcacctgtcactgcgctcccgaaggcaccaatctatctctagaaagttcgcaggatgtcaaggcctggtaaggttcttcgcgttgcatcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcatttgagttttaaccttgcggccgtactccccaggcggtctacttatcgcgttagctgcgccaccaaagtcactaaggaccccaacggctagtagacatcgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgtttgctccccacgctttcgcacctcagcgtcagtgtcagtccaggaggccgccttcgccactggtgttccttccgatctctacgcatttcaccgctacaccggaaattccacctccctctactgcactctagcgtgccagtatcggatgcaattccaaggttgagccctgggctttcacatccgacttaacacaccgcctacgcgcgctttacgcccagtaattccgattaacgctcgcacctttcgtattaccgcggctgctggcacgaaattagccggtgcttcttctgtaggtaacgtcaagtactccagggtattagcccaaagccttcctccctactgaaagtgctttacaacccgaaggccttcttcacacacgcggcatggctggatcaggcttgcgcccattgtccaagattccccactgctgcctcccgtaggagtccgggccgtgtctcagtcccggtgtgactggccatcctctcagaccagttacggatcgtcgccttggtgggccattaccccaccaacaagctaatccgacgcgggctcatccatcagcgcaaggtccgaagatcccctgctttcccccgtagggattatgcggtattagctcgagtttccccgagttatcccccactaatgggcagattcccacgtgttactcacccgtccgccgctcgacgcctggga。
8.如权利要求1所述一株转化异源物食烷菌(Alcanivorax xenomutans)45II-AX在降解有机化合物中应用。
9.如权利要求8所述应用，其特征在于所述有机化合物为石油烃类化合物。
10.如权利要求9所述应用，其特征在于所述石油烃类化合物为多环芳烃芳烃类化合物。
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