CN104004687B - 一株石油烃降解菌dlfj1‑1及其降解基因与应用 - Google Patents

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Abstract

一株石油烃降解菌DLFJ1‑1及其降解基因与应用，涉及环境石油污染生物处理。所述一株石油烃降解菌(Thioclava sp.)DLFJ1‑1，登记入册编号为CGMCC No.9013。所述有机化合物为石油烃类化合物，所述石油烃类化合物包括但不限于柴油、液态烷烃等烃类化合物。通过对Thioclava sp.DLFJ1‑1进行基因组测序发现许多和烷烃或者芳香烃降解相关基因，这些基因可在石油烃污染环境监测和生物修复中应用。实验证明，石油烃降解菌DLFJ1‑1能够利用石油∶柴油＝1∶1作为能源和碳源生长繁殖，该菌7天能将无机盐培养基中的5g/L的石油∶柴油＝1∶1降解59.195％。

Description

一株石油烃降解菌DLFJ1-1及其降解基因与应用
技术领域
本发明涉及环境石油污染生物处理，尤其是涉及一株石油烃降解菌DLFJ1-1及其降解基因与应用。
背景技术
石油及其产品是人类最重要的能源和工业原料，素有“工业血液”和“人类文明社会的血液”之称。然而，石油在给人类社会发展带来巨大的推动作用的同时，也给人类的环境，尤其是海洋环境造成了不可忽视的溢油污染及其生态损害。溢油污染事故还会引起大面积海域严重缺氧，破坏海洋生产力，致使大量鱼、虾、贝类和海鸟死亡，造成局部“海洋荒漠化”；浮油被海浪冲到海岸，粘污海滩，造成海滩荒芜，破坏海产养殖和盐田生产，污染或毁坏滨海旅游区，降低海洋生态系统的服务功能和价值。石油污染物的生物富集作用不仅对海洋生物有毒害作用，可以通过食物链最终富集在人体内，从而对人类健康造成严重的危害(徐卫东.海洋石油开发中含油污水处理与溢油防治技术[J].油气田环境保护.1999,26:6；卓诚裕.海洋油污染防治技术[M]:国防工业出版社,1996.)。
生物修复(bioremediation)指生物催化降解环境污染物，减少或最终消除环境污染的受控或自发过程。生物修复的基础是自然界中微生物对污染物的生物代谢作用，由于自然界的生物修复过程一般较慢，难以实际推广应用，因此一般指人为促进条件下的生物修复。20世纪80年代末美国在Exxon Vadez油轮石油泄露的生物修复项目中，短时间内清除了污染，治理了环境，是生物修复成功应用的开端，同时也开创了生物修复在治理海洋污染中的应用(Bragg JR,Prince RC,Harner EJ et al.Effectiveness of Bioremediationfor the Exxon-Valdez Oil-Spill.Nature.1994,368(6470):413-418.；Head IM,Swannell RP.Bioremediation of petroleum hydrocarbon contaminants in marinehabitats.Curr Opin Biotechnol.1999,10(3):234-239.)。在海洋环境中生活着各种各样的石油烃降解菌。在过去的十年里，分离到了许多的烷烃和芳香烃类降解菌，其主要属于变形菌纲的菌株。包括：Alcanivorax spp.、Cycloclasticus spp.、Oleiphilus spp.、Oleispira spp.、Thalassolituus spp.，Marinobacter spp.、Neptunomonas spp.和Planomicrobium spp.等属的一些菌株。其中Alcanivorax spp.、Oleiphilus spp.、Oleispira spp.、Thalassolituus spp.和Planomicrobium alkanoclasticum MAE2是专业的烃类降解菌，能利用不同链长的支链和直链饱和烷烃。对石油污染后的生态环境中菌株动态变化的大量研究表明，土著的Alcanivorax和Marinobacter往往在短时间内成为此生璄中的优势菌株，它们主要负责饱和烷烃的降解(Yakimov MM,Timmis KN,GolyshinPN.Obligate oil-degrading marine bacteria.Current opinion inbiotechnology.2007,18(3):257-266.)。
发明内容
本发明的目的是提供一株石油烃降解菌(Thioclava sp.)DLFJ1-1。
本发明的另一个目的是提供一株石油烃降解菌(Thioclava sp.)DLFJ1-1在降解各种有机化合物中的应用。
所述一株石油烃降解菌(Thioclava sp.)DLFJ1-1，已于2014年04月03日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101，登记入册编号为CGMCC No.9013。该菌来源于大连新港溢油事件发生地的表层海水，经人工富集培养、分离纯化得到。该菌是革兰氏染色阴性的硫膨大杆菌属(Thioclava sp.)的菌株DLFJ1-1，生物学特性为触酶阳性，氧化酶阳性，非发酵型，专性需氧，菌体形态为无芽孢杆菌，菌落呈圆形，米黄色不透明，表面光滑湿润，边缘规则，无晕环，中央凸起，直径1mm。通过对该菌基因组的测序，发现该菌含有很多与石油烃或者芳香烃降解相关的基因。该菌的最适生长条件为：pH＝6.5～8.5，温度25～30℃。
所述一株石油烃降解菌(Thioclava sp.)DLFJ1-1可在降解各种有机化合物中应用。
所述有机化合物为石油烃类化合物，所述石油烃类化合物包括但不限于柴油、液态烷烃等烃类化合物。
通过对石油烃降解菌(Thioclava sp.)DLFJ1-1进行基因组测序发现，石油烃降解菌(Thioclava sp.)DLFJ1-1具有许多与烷烃或者芳香烃降解相关基因(参见表1)，这些基因可在石油烃污染环境监测和生物修复中应用。
表1DLFJ1-1基因组中与烷烃降解相关的基因
实验证明，石油烃降解菌(Thioclava sp.)DLFJ1-1能够利用石油∶柴油＝1∶1(体积比)作为能源和碳源生长繁殖，该菌7天能将无机盐培养基中的5g/L的石油∶柴油＝1∶1降解59.195％。
该菌对chloromycetin，Carbenicillin，Cefobid，Rocephin，Penicillin G等抗生素敏感，且该菌由环境样品中得来，可以认为当菌体释放到自然环境中时，不会同时携带耐药因子在土著菌间传播。
附图说明
图1为DLFJ1-1在石油∶柴油＝1∶1中的降解图。
具体实施方式
以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。
实施例一：Thioclava sp.DLFJ1-1的分离鉴定
现场采集大连新港溢油地区表层海水，采用海水培养基加入1％石油∶柴油＝1∶1在28℃180r/min条件下进行富集培养。一周后，在固体培养基(M2)中稀释涂布平板，得到多株纯菌，纯菌经过接种至液体培养基中验证其降解石油烃的能力，最后得到一株石油烃的高效降解菌DLFJ1-1，该菌经16S rDNA鉴定为硫膨大杆菌属(Thioclava sp.)；选取其中相似序列，用MEGA5.0计算出序列的系统进化距离，构建系统进化树。进化树显示，与其相似度最高的菌株都为Thioclava sp.菌株。结合菌株的16S rDNA的测定结果，将其归属于硫膨大杆菌属(Thioclava sp.)。固体培养基(M2)的成分：乙酸钠5g/L,柠檬酸钠0.05g/L，普通肉汤培养基0.5g/L，蛋白胨0.1g/L，酵母粉0.1g/L，苹果酸0.05g/L，葡萄糖1g/L，蔗糖0.5g/L，硝酸铵1g/L，氯化铵0.2g/L，酒石酸钠0.05g/L，可溶性淀粉0.5g/L，琼脂粉15g/L，加海水至1L,调pH7.5，115℃高压蒸汽灭菌30min后补加1％体积已灭菌的KH2PO4溶液(10g/L,pH6.7)及0.1％体积0.22μm滤膜除菌的FeSO4(0.4g/L)。
实施例二：Thioclava sp.DLFJ1-1降解石油烃的性能
将Thioclava sp.DLFJ1-1接种至含1％石油∶柴油＝1∶1的海水培养基中，在180r/min、28℃摇床中避光培养，每隔一天分别取样利用重量法测定培养液中石油烃的降解率，实验结果见图1。
由图1可以看出Thioclava sp.DLFJ1-1在第3～5天之间对于石油∶柴油＝1∶1的降解较快，该菌在7天内可以将1％石油∶柴油＝1∶1降解59.195％。
实施例三：Thioclava sp.DLFJ1-1的抗生素敏感性试验
抗生素敏感试验采用纸片法，以各个抗生素纸片在培养降解菌MA平板上的抑菌直径大小，作为敏感或者耐药的判定标准(参见表2)。
表2 DLFJ1-1抗生素实验
实施例四：Thioclava sp.DLFJ1-1相关石油烃降解相关基因的应用
将Thioclava sp.DLFJ1-1进行基因组测序，从基因组中寻找与石油烃降解相关的基因，发现许多石油烃降解相关基因。
表1 DLFJ1-1基因组中与烷烃降解相关的基因
表1给出DLFJ1-1基因组中与烷烃降解相关的基因。

Claims (1)

1.一株石油烃降解菌(Thioclava sp.)DLFJ1-1在降解石油烃类化合物中的应用；所述一株石油烃降解菌(Thioclava sp.)DLFJ1-1，已于2014年04月03日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，登记入册编号为CGMCC No.9013；
所述石油烃类化合物为柴油。
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Thioclava dalianensis sp. nov., isolated from surface seawater;Zhang R 等;《Int J Syst Evol Microbiol》;20130201;第63卷;摘要 *
北极表层海水中氯代十六烷降解菌的多样性;王建宁 等;《微生物学报》;20120804;第52卷(第8期);1011-1020 *

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