KR20190039577A - 항-ｖｅｇｆ-ａ 및 항-ａｎｇ2 항체 및 이의 용도 - Google Patents

항-ｖｅｇｆ-ａ 및 항-ａｎｇ2 항체 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 및 앤지오포이에틴(ANG)에 대한 활성을 갖는 이중특이적 항체, 및 이러한 이중특이적 항체를 제조하고 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

항-ＶＥＧＦ-Ａ 및 항-ＡＮＧ2 항체 및 이의 용도
본 발명은 혈관 내피 성장 인자(VEGF; vascular endothelial growth factor) 및 앤지오포이에틴(ANG; angiopoietin)에 대한 활성을 갖는 이중특이적 항체, 및 이러한 항체의 용도에 관한 것이다.
기존의 맥관 구조로부터 새로운 혈관의 형성인 혈관신생은 사실상 모든 기관들의 형성 및 생리학적 기능에 필요한 복잡한 생물학적 과정이다. 혈관신생은 배발생, 정상적인 생리학적 성장, 수선 및 병리학적 과정, 예컨대 종양 증식의 필수적인 요소이다. 통상적으로, 혈관신생은 내피 세포에 의한 혈관 발아, 분지화 및 세관 형성을 수반하는(내피 세포(EC)의 활성화, 혈관 탈안정화, 분해 효소의 합성 및 방출, EC 이동, EC 증식, EC 구조화와 분화 및 혈관 성숙과 같은 과정들을 수반하는) 다단계 과정에서 혈관형성 인자와 혈관억제 인자의 국소적인 균형에 의해 긴밀하게 제어된다.
성인에서, 생리학적 혈관신생은 대체로 상처 치유, 및 암컷의 생식 기능 및 배아 발생의 몇몇 구성성분으로 국한된다. 임의의 비정상적인, 바람직하지 못한 또는 병리학적 혈관신생을 포함하는 질병-관련 혈관신생에서, 혈관형성 인자와 혈관억제 인자 사이의 국소적인 균형은 탈제어되어, 부적절한 및/또는 구조적으로 비정상적인 혈관 형성을 초래한다. 병리학적 혈관신생은 당뇨병성 망막병증, 건선, 암, 류마티스 관절염, 아테롬, 카포시 육종 및 혈관종을 포함한 질병 상태와 연관이 있어 왔다(문헌[Fan et al, 1995, Trends Pharmacology. Science. 16: 57-66; Folkman, 1995, Nature Medicine 1: 27-31]). 암에서, 1 내지 2 mm3보다 큰 원발성 및 속발성 종양의 성장은 혈관신생을 필요로 한다(문헌[Folkman, J. New England Journal of Medicine 1995; 33, 1757-1763]).
VEGF는 강력하고 편재하는 혈관 성장 인자이다. VEGF를 내피 세포에 대한 분비된 미토겐으로서 식별하기 전에, 상기 VEGF는 혈관 투과성 인자로서 식별되었으며, 증식, 이동, 특수화 및 생존을 포함하여 내피 세포 거동의 많은 별개의 양태들을 조절하는 VEGF의 능력을 강조하고 있다(문헌[Ruhrberg, 2003 BioEssays 25:1052-1060]). VEGF 계통(family) 구성원은 VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, 태반 성장 인자(PIGF) 및 내분비선-유래 VEGF(EG-VEGF)를 포함한다. 활성 형태의 VEGF는 동종이량체로서 합성되거나, 다른 VEGF 계통 구성원과의 이종이량체로서 합성된다. VEGF-A는 선택적 스플라이싱에 의해 발생된 6개의 동종형: VEGF121, VEGF145, VEGF165, VEGF183, VEGF189 및 VEGF206으로서 존재한다. 이들 동종형은 주로 이들의 생체이용률의 측면에서 상이하며, VEGF165가 지배적인 동종형이다(문헌[Podar, et al. 2005 Blood 105(4):1383-1395]). 배발생 동안, 단계- 및 조직-특이적 비율의 다양한 동종형들을 생성하기 위한 스플라이싱의 제어는 VEGF에 반응한 내피 세포의 별개이고 문맥 의존적인 거동에 대한 풍부한 잠재성을 형성한다.
VEGF는 정상적인 혈관신생 및 질병-관련 혈관신생(문헌[Jakeman, et al. 1993 Endocrinology: 133,848-859; Kolch, et al. 1995 Breast Cancer Research and Treatment: 36,139-155])과 혈관 투과성(문헌[Connolly, et al. 1989 J. Biol. Chem: 264,20017-20024]) 둘 다의 중요한 자극자인 것으로 여겨진다. 항체를 이용한 VEGF의 봉쇄(sequestration)에 의한 VEGF 작용의 길항작용은 종양 성장의 감소를 초래할 수 있다(문헌[Kim, et al. 1993 Nature: 362,841-844]). VEGF 유전자의 이형접합적 분열(heterozygous disruption)은 혈관화에 있어서 치명적인 결함을 초래하였다(문헌[Carmeliet, et al. 1996 Nature 380:435-439; Ferrara, et al. 1996 Nature 380:439-442]).
VEGF 계통 외에도, 앤지오포이에틴은 혈관 발달 및 출생후 혈관신생에 관여하는 것으로 생각된다. 앤지오포이에틴은 천연 발생 효능제, 앤지오포이에틴-1(ANG-1), 뿐만 아니라 천연 발생 길항제, 앤지오포이에틴-2(ANG-2)를 포함한다. ANG-1의 역할은 성인에서 보존되는 것으로 생각되며, 성인에서 상기 ANG-1은 광범위하고 구성적으로 발현된다(문헌[Hanahan, Science, 277:48-50 (1997); Zagzag, et al., Exp Neurology, 159:391-400 (1999)]). 대조적으로, ANG-2 발현은 주로 혈관 재건 부위로 한정되며, 이 부위에서, ANG-2는 ANG-1의 구성적인 안정화 또는 성숙화 기능을 차단하여, 혈관을 발아 신호에 더 반응성일 수 있는 가소성(plastic) 상태로 되돌리고 그 상태로 유지되게 할 수 있는 것으로 생각된다(문헌[Hanahan, 1997; Holash et al., Oncogene 18:5356-62 (1999); Maisonpierre, 1997]). 질병-관련 혈관신생에서 ANG-2 발현의 연구는 혈관 ANG-2 발현을 보여주는 많은 종양 유형들을 확인하였다(문헌[Maisonpierre et al., Science 277:55-60 (1997)]). 기능성 연구는, ANG-2가 종양 혈관신생에 관여하고, 마우스 이종이식 모델에서 ANG-2 과발현을 증가된 종양 성장과 연관시킨다고 제안한다(문헌[Ahmad, et al., Cancer Res., 61:1255-1259 (2001)]). 다른 연구는 ANG-2 과발현을 종양 과다혈관성(hypervascularity)과 연관시켰다(문헌[Etoh, et al., Cancer Res. 61:2145-53 (2001); Tanaka et al., Cancer Res. 62:7124-29 (2002)]).
상동성-기초 클로닝 접근법을 사용하여, Valenzuela 등(문헌[Proc Natl Acad Sci U S A. 1999 Mar 2;96(5):1904-9])은 2개의 신규 앤지오포이에틴: 마우스에서 앤지오포이에틴-3(ANG-3) 및 인간에서 앤지오포이에틴-4(ANG-4)를 식별하였다. ANG-3 및 ANG-4가 ANG-1 및 ANG-2의 마우스 및 인간 버전보다 서로로부터 더 구조적으로 분기되기는 하지만, 이들은 동일한 유전자 자리(locus)의 마우스 및 인간 대응물을 나타내는 것으로 보인다. 앤지오포이에틴 계통의 이들 구성원의 생물학에 대해서는 거의 알려진 바가 없다. 예를 들어, ANG-4는 폐에서만 높은 수준으로 발현된다(문헌[Tsigkos, et al., Expert Opin. Investig. Drugs 12(6): 933-941 (2003); Valenzuela, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 96:1904-1909 (1999)]). ANG-4 발현 수준은 저산소증에 반응하여 증가하는 것으로 공지되어 있고, 내피 세포 성장 인자는 교모세포종 세포주 및 내피 세포에서 ANG-4 발현 수준의 증가를 초래한다. 그러나, 발현 제어 기전, 및 결과적으로 생리학적 및 질병-관련 혈관신생에 미치는 효과는 공지되어 있지 않다(문헌[Lee, et al., FASEB J. 18: 1200-1208 (2004)]).
앤지오포이에틴은 혈관 내피 내에서 선택적으로 발현되는 Tie 수용체 티로신 키나제 계통에 대한 리간드로서 처음 발견되었다(문헌[Yancopoulos et al.,Nature 407:242-48 (2000)]). ANG-1, ANG-2, ANG-3 및 ANG-4는 Tie-2 수용체에 주로 결합하며, 따라서 Tie-2 리간드로서 공지되어 있다. ANG-1이 Tie-2에 결합하면, 자가인산화를 통해 수용체의 티로신 인산화, 및 후속적으로 신호 전달을 통해 수용체의 신호 전달 경로의 활성화를 유도한다(문헌[Maisonpierre, P. et al. 1997 Science: 277, 55-60]). ANG-2는 Tie-2 수용체의 ANG-1-유도 키나제 활성화의 경쟁적 억제를 통해 작용하는, ANG-1에 대한 천연 발생 길항제이다(문헌[Hanahan, 1997; Davis et al., Cell 87:1161-69 (1996); Maisonpierre et al., Science 277:55-60 (1997)]).
Tie-2 및 ANG-1의 녹-아웃 마우스 연구는 유사한 표현형을 보여주고, ANG-1에 의해 자극된 Tie-2 인산화가 발생중인 혈관의 재건 및 안정화를 매개하고, 혈관신생 동안 혈관 성숙, 및 내피 세포-지지 세포 접착의 유지를 촉진한다고 제안한다(문헌[Dumont et al., Genes & Development, 8:1897-1909 (1994); Sato, Nature, 376:70-74 (1995); (Thurston, G. et al., 2000 Nature Medicine: 6, 460-463)]).
최근, ANG-1, ANG-2 및/또는 Tie-2는 가능한 항암 치료의 표적으로서 제안되었다(예를 들어, 미국 특허 6,166,185, 5,650,490 및 5,814,464를 참조하며, 각각은 항-Tie-2 리간드 및 수용체 항체를 개시하고 있음). 가용성 Tie-2를 사용한 연구는 설치류에서 종양의 수 및 크기를 저하시키는 것으로 보고되었다. 또한, 일부 그룹은, ANG-2에 결합하는 항체(예를 들어 미국 특허　6,166,185 및 미국 특허 출원 공개 2003/0124129 참조) 및 VEGF-A에 결합하는 항체(예를 들어 미국 특허 8,216,571 참조)의 사용을 보고하였다. 추가로, VEGF-A 및 ANG-2를 표적화하는 예들이 존재한다(예를 들어, WO200197850, WO2007089445 및 미국 특허 8,268,314 참조). 그러나, 보다 관용성이거나 효과적인, VEGF-A 및 ANG-2를 표적화하는 이중특이적 항체에 대한 충족되지 않은 요망이 의학 분야에 존재한다. 보다 구체적으로, 안전성은 적어도 VEGF-A의 표적화와 연관된 독성(예를 들어 혈전색전성 사례(thromboembolic event), 신장 독성 등)에 관한 것이므로, 이러한 안전성을 개선하는 것과 관련된 충족되지 않은 요망이 존재한다. 이를 위해, 본원에 개시된 VEGF-A 및 ANG-2를 표적화하는 이중특이적 항체는 예를 들어, 혈전색전성 사례 및/또는 신장 독성과 관련된 독성의 저하와 더불어, 혈관 탈제어 및 종양 성장을 감소시키는 데 효과적이다.
본 발명은 VEGF 및 ANG에 결합하는 이중특이적 항체에 관한 것이다. 나아가, 본 발명은 VEGF 및 ANG에 결합하고, VEGF 및 ANG의 적어도 하나의 생물학적 활성의 활성을 감소시키는 이중특이적 항체에 관한 것이다. 더 나아가, 본 발명은 VEGF 및 ANG에 결합하고 종양 성장을 감소시키고/감소시키거나 종양 부피를 감소시키는 이중특이적 항체를 이를 필요로 하는 대상체에게 제공하는 것에 관한 것이다.
도 1. 5개의 상이한 이중특이적 항체(BiS) 백본인 BiS1, BiS2, BiS3, BiS4 및 BiS5의 일반적인 구조적 포맷의 개략도를 제시한다. scFv는 진회색으로 도시되어 있고, IgG Fv는 연회색으로 도시되어 있다.
도 2. 이중특이적 항체 BiS3Ab-VEGF H1RK-ANG-2의 개략적인 도면을 제시한다.
도 3. 이중특이적 항체 BiS3Ab-VEGF H1RK-ANG-2의 경쇄에 대한 DNA 및 단백질 서열을 제시한다.
도 4. 이중특이적 항체 BiS3Ab-VEGF H1RK-ANG-2의 중쇄의 DNA 서열을 제시한다.
도 5. 이중특이적 항체 BiS3Ab-VEGF H1RK-ANG-2의 중쇄의 단백질 서열을 제시한다.
도 6. 이중특이적 항체 BiSAb-VEGF H1RK-ANG-2의 용출 프로파일에 대한 대표적인 데이터이다.
도 7. 이중특이적 항체 BiSAb-VEGF H1RK-ANG-2에 대한 정제 프로파일에 대한 대표적인 데이터이다.
도 8. 이중특이적 항체 BiS3Ab-VEGF H1RK-ANG-2에 대한 대표적인 SDS-PAGE 젤이다. BsAb는 온전한 BiS3Ab-VEGF H1RK-ANG-2이며; Ab는 항-VEGF mAb이며; H-BsAb는 BiS3Ab-VEGF H1RK-ANG-2의 중쇄이며; H-Ab는 항-VEGF mAb의 중쇄이고; L은 BiS3Ab-VEGF H1RK-ANG-2 및 항-VEGF의 경쇄이다.
도 9. 이중특이적 항체 BiS3Ab-VEGF H1RK-ANG-2를 포커싱한 후의 대표적인 데이터이다.
도 10. 이중특이적 항체 BiS3Ab-VEGF H1RK-ANG-2에 대한 전이 온도에 대한 대표적인 데이터이다.
도 11. 이중특이적 항체 BiSAb-VEGF H1RK-ANG-2가 VEGF-165 및 ANG-2에 동시적으로 결합하는 데 대한 대표적인 데이터이다.
도 12a. ELISA 기초 검정을 사용하여, 이중특이적 항체 BiSAb-VEGF H1RK-ANG-2가 VEGF-165 및 ANG-2에 동시적으로 결합하는 데에 대한 대표적인 데이터이다.
도 12b. ELISA 기초 검정을 사용하여, 이중특이적 항체 BiSAb-VEGF H1RK-ANG-2가 VEGF-165 및 ANG-2에 동시적으로 결합하는 데에 대한 대표적인 데이터이다.
도 13. 이중특이적 항체 BiSAb-VEGF H1RK-ANG-2에 의한 VEGF121에의 결합의 결여를 보여주는 대표적인 데이터이다.
도 14. 이중특이적 항체 BiSAb-VEGF H1RK-ANG-2에 의한 VEGF189에의 결합의 결여를 보여주는 대표적인 데이터이다.
도 15. 786-0 신세포암종 모델에서 이중특이적 항체 BiSAb-VEGF H1RK-ANG-2의 존재 하에 종양 부피의 감소를 보여주는 대표적인 데이터이다.
도 16. BxPC3 췌장암종 모델에서 이중특이적 항체 BiSAb-VEGF H1RK-ANG-2의 존재 하에 종양 부피의 감소를 보여주는 대표적인 데이터이다.
도 17a. 이중특이적 항체 BiSAb-VEGF H1RK-ANG-2의 부재 하에 혈관형성을 보여주는 대표적인 데이터이다.
도 17b. 이중특이적 항체 BiSAb-VEGF H1RK-ANG-2의 존재 하에 혈관형성을 보여주는 대표적인 데이터이다.
도 18. 이중특이적 항체 BiSAb-VEGF H1RK-ANG-2의 존재 하에 망막의 주변부(파선)로 향하는 혈관 이동(화살표)의 감소를 보여주는 대표적인 데이터이다. 4X 배율.
도 19. BiSAb-VEGF H1RK-ANG-2의 존재 하에 혈관 분지화의 감소를 보여주는 대표적인 데이터이다. 20X 배율.
도 20a. 항-VEGF 항체 및 이중특이적 항체 BiSAb-VEGF H1RK-ANG-2의 부재 하에 신장 병상(renal pathology)을 보여주는 대표적인 데이터이다.
도 20b. 항-VEGF 항체의 존재 하에 신장 병상 데이터를 보여주는 대표적인 데이터이다.
도 20c. 존재하는 이중특이적 BiSAb-VEGF H1RK-ANG-2의 존재 하에 신장 병상의 감소를 보여주는 대표적인 데이터이다.
정의
본 발명을 상세히 기재하기 전에, 본 발명은 특정 조성물 또는 공정 단계로 제한되지 않으며, 변화될 수 있음을 이해한다. 본 명세서 및 첨부된 청구항에 사용된 바와 같이, 단수형("a", "an" 및 "the")은 문맥상 명확하게 다르게 지시하지 않는 한, 복수형을 포함한다. 용어 "일(a)"(또는 "하나(an)"), 뿐만 아니라 용어 "하나 이상" 및 "적어도 하나의"는 본원에서 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 나아가, 양태가 "포함하는"이라는 단어와 함께 본원에 기재된 곳에서는 어디에서나, "~로 구성된" 및/또는 "~로 필수적으로 구성된"에 관하여 기재된 유사한 양태들 또한 제공되는 것으로 이해한다.
상보성 결정 영역(CDR)은 항체가 이의 항원에 결합하는 것을 책임진다. CDR은 당업계에서 많은 방법들에 의해 결정된다(Kabat(문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]); Chothia(문헌[Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)]); IMGT(ImMunoGeneTics)(문헌[Lefranc, M.P. et al., Dev. Comp. Immunol. 27: 55-77 (2003)]); 및 다른 방법들 포함). 특이적인 CDR 서열이 본원에서 언급되고 청구되더라도, 본 발명은 또한, 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 정의된 CDR 서열을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "대상체"는 제한 없이, 인간, 및 비-인간 영장류, 예컨대 침팬지 및 다른 유인원 및 원숭이 종을 포함한 다른 영장류를 포함하여 척삭동물(cordata) 아문의 임의의 구성원을 지칭하고; 가축, 예컨대 소, 양, 돼지, 염소 및 말; 애완 동물, 예컨대 개 및 고양이; 마우스, 래트 및 기니피그와 같은 설치류를 포함하는 실험 동물; 애완용, 야생 및 사냥용 새, 예컨대 닭, 칠면조 및 다른 가금류, 오리, 거위 등이 또한, 비제한적인 예이다.
이중특이적 항체
본 발명의 적합한 이중특이적 항체는 임의의 아이소타입(예를 들어 IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 서브-아이소타입(예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 알로타입(예를 들어 Gm, 예를 들어 G1m(f, z, a 또는 x), G2m(n), G3m(g, b, 또는 c), Am, Em, 및 Km(1, 2 또는 3))일 수 있거나 이로부터 유래된다. 이러한 항체는 경쇄 불변 영역의 아미노산 서열을 기초로 하여 람다 사슬 또는 카파 사슬로서 분류된 경쇄를 포함할 수 있다. 도 1은 5개의 상이한 이중특이적 백본(BiS)의 배향의 개략도를 보여준다(예를 들어 PCT 특허 출원 PCT/US2016/035026 및 PCT/US2015/025232 참조). scFv 내의 특이적인 링커, 및 scFv를 본 발명의 이중특이적 항체의 특정 부위(예를 들어 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS)에 연결하는 링커가 기재되어 있다. 그러나, scFv 내, 또는 scFv를 본 발명의 이중특이적 항체의 임의의 특정 부위에 연결하는 임의의 적합한 링커가 사용될 수 있다(예를 들어 PCT 특허 출원 PCT/US2016/035026 및 PCT/US2015/025232 참조).
결합 분자의 생성
본원에 기재된 이중특이적 항체의 생성 및 스크리닝을 위한 재조합 DNA 방법은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어 미국 특허 4,816,567). 이중특이적 항체를 인코딩하는 DNA, 예를 들어 VH 도메인, VL 도메인, 단일 사슬 가변 단편(scFv) 또는 이들의 조합을 인코딩하는 DNA가 적합한 발현 벡터 내로 삽입될 수 있으며, 그 후에 이러한 벡터는 항체를 생성하지 않는 적합한 숙주 세포, 예컨대 이. 콜라이 세포, 시미안(simian) COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 골수종 세포 내로 형질감염되어, 본 발명의 이중특이적 항체가 수득될 수 있다.
적합한 발현 벡터가 당업계에 공지되어 있다. 발현 벡터는 프로모터에 연결된 이중특이적 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 함유할 수 있다. 이러한 벡터는 항체 분자의 불변 영역을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있고(예를 들어 미국 특허 5,981,216; 5,591,639; 5,658,759 및 5,122,464 참조), 항체의 가변 도메인은 전체 중쇄(scFv 부분 포함), 전체 경쇄, 또는 전체 중쇄와 전체 경쇄 둘 다의 발현을 위해 이러한 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 발현 벡터는 종래의 기술에 의해 숙주 세포에 전이될 수 있고, 전이된 세포는 종래의 기술에 의해 배양되어, 이중특이적 항체를 생성할 수 있다.
재조합 항체의 발현을 위한 숙주로서 적합한 포유류 세포주는 당업계에 공지되어 있고, 비제한적으로 CHO 세포, HeLa 세포, 베이비 햄스터 신장(BHK) 세포, 원숭이 신장 세포(COS), 인간 간세포암종 세포(예를 들어 Hep G2), 인간 상피 신장 293 세포 및 많은 다른 세포주들을 포함하여 아메리칸 타입 컬처 컬렉션(American Type Culture Collection)으로부터 입수 가능한 많은 불멸화된 세포주를 포함한다. 상이한 숙주 세포는 단백질 및 유전자 생성물의 번역-후 프로세싱 및 변형을 위한 특징적이고 특이적인 기전을 가진다. 이중특이적 항체의 올바른 변형 및 프로세싱을 보장하기 위해 적절한 세포주 또는 숙주 시스템이 선택될 수 있다. 이를 위해, 유전자 생성물의 1차 전사체의 적절한 프로세싱, 글리코실화 및 인산화를 위한 세포 머시너리를 갖는 진핵 숙주 세포가 사용될 수 있다. 이러한 포유류 숙주 세포로는 CHO, VERY, BHK, Hela, COS, MDCK, 293, 3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT2O 및 T47D, NS0(임의의 기능적 면역글로불린 사슬을 내인성으로 생성하지 않는 뮤린 골수종 세포주), SP20, CRL7O3O 및 HsS78Bst 세포가 있다. 인간 림프구를 불멸화시킴으로써 개발된 인간 세포주는 모노클로날 항체를 재조합적으로 생성하는 데 사용될 수 있다. 인간 세포주 PER.C6®(Crucell, 네덜란드 소재)이 모노클로날 항체를 재조합적으로 생성하는 데 사용될 수 있다. 재조합 항체의 발현을 위해 숙주로서 사용될 수 있는 추가의 세포주로는, 곤충 세포(예를 들어 Sf21/Sf9, 트리코플루시아니(Trichoplusiani) Bti-Tn5b1-4), 또는 효모 세포(예를 들어 에스. 세레비지애(S. cerevisiae), 피치아(Pichia), US7326681 등), 식물 세포(US20080066200) 또는 닭 세포(WO2008142124)가 있다.
이중특이적 항체는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 세포주에서 안정하게 발현될 수 있다. 안정한 발현은 재조합 단백질의 장기적인 고수율 생성에 사용될 수 있다. 안정한 발현을 위해, 숙주 세포는 발현 조절 요소(예를 들어 프로모터, 인핸서, 전사 종결자, 폴리아데닐화 부위 등) 및 선별 마커 유전자를 포함하는 적절하게 조작된 벡터에 의해 형질변환될 수 있다. 외래 DNA의 도입 후, 세포를 농화된 배지 내에서 1 내지 2일 동안 성장시키고, 그 후에 선별 배지로 교환하는 것이 허용된다. 재조합 플라스미드 내의 선별 마커는 선별에 내한 내성을 부여하고, 이러한 플라스미드를 세포의 염색체 내로 안정하게 통합시킨 세포가 성장하여 증식소(foci)를 형성할 수 있게 하며, 이러한 증식소가 결과적으로 클로닝되고 세포주 내로 확장될 수 있다. 안정한 세포주를 고수율로 생성하는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 일반적으로 상업적으로 입수 가능하다. 일시적인 발현은 또한, 당업계에 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 일시적인 형질감염은, 세포 내에 도입된 핵산이 해당 세포의 게놈 또는 염색체 DNA 내로 통합되지 않고, 상기 세포에서 염색체외 요소로서(예를 들어 에피솜(episome)으로서) 유지되는 과정이다.
안정하게 또는 일시적으로 형질감염된 이중특이적 항체를 발현하는 세포주는 당업계에 공지된 세포 배양 배지 및 조건에서 유지되어, 이중특이적 항체의 발현 및 생성을 초래할 수 있다. 세포 배양 배지는 예를 들어, DMEM 또는 Ham's F12를 포함한 상업적으로 입수 가능한 배지 제제를 기초로 할 수 있다. 또한, 세포 배양 배지는 세포 성장 및 생물학적 단백질 발현 둘 다에서의 증가를 지지하도록 변형될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "세포 배양 배지", "배양 배지" 및 "배지 제제"는 다세포 유기체 또는 조직 외부의 인공적인 시험관내 환경에서 세포의 유지, 성장, 전파 또는 확장을 위한 영양액을 지칭한다. 세포 성장을 촉진하도록 제제화된 세포 배양 성장 배지 또는 재조합 단백질 생성을 촉진하도록 제제화된 세포 배양 성장 배지를 포함한 세포 배양 배지는 특이적인 세포 배양 용도용으로 최적화될 수 있다. 영양소, 성분 및 구성성분이라는 용어는 세포 배양 배지를 구성하는 구성분을 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 세포주는 유가식(fed batch) 방법을 사용하여 유지될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "유가식 방법"은, 처음에 기본 배지와 함께 인큐베이션된 후, 세포 배양물에 추가 영양소가 공급되는 방법을 지칭한다. 예를 들어, 유가식 방법은 주어진 기간 내에 결정된 공급 스케쥴에 따라 보충 배지를 추가하는 단계를 포함할 수 있다. 따라서, "유가식 세포 배양"은, 처음에 세포, 전형적으로 포유류, 및 배양 배지를 배양 용기에 공급하고, 배양 동안 추가의 배양 영양소를 연속적으로 또는 별개의 증분으로 배양물에 공급하되, 배양 종결 전에 세포 및/또는 생성물을 주기적으로 수합하거나 수합하지 않는 세포 배양을 지칭한다.
세포 배양 배지 및 이러한 배지에 함유된 영양소는 당업계에 공지되어 있다. 세포 배양 배지는 기본 배지, 및 변형된 기본 배지를 초래하는 적어도 하나의 가수분해물, 예를 들어 대두-기초 가수분해물, 효모-기초 가수분해물, 또는 2가지 유형의 가수분해물들의 조합을 포함할 수 있다. 추가 영양소는 기본 배지, 예컨대 농축된 기본 배지만 포함할 수 있거나, 가수분해물 또는 농축된 가수분해물만 포함할 수 있다. 적합한 기본 배지로는 둘베코스 모디파이드 이글스 배지(DMEM), DME/F12, 미니멀 이센셜 배지(MEM), 베이잘 배지 이글(BME), RPMI 1640, F-10, F-12, α-미니멀 이센셜 배지(α-MEM), 글래스고스 미니멀 이센셜 배지(G-MEM), PF CHO(예를 들어 CHO 단백질 무함유 배지(Sigma) 또는 CHO 세포 단백질-무함유용 EX-CELL™ 325 PF CHO 혈청-무함유 배지(SAFC Bioscience) 참조) 및 이스코브스 모디파이드 둘베코스(Iscove's Modified Dulbecco's) 배지가 있다. 사용될 수 있는 기본 배지의 다른 예로는 BME 기본 배지(Gibco-Invitrogen; 또한, 문헌[Eagle, H (1965) Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 89, 36] 참조); 둘베코스 모디파이드 이글 배지(DMEM, 분말)(Gibco-Invitrogen(# 31600); 또한, 문헌[Dulbecco and Freeman(1959) Virology. 8:396; Smith et al. (1960) Virology. 12:185. Tissue Culture Standards Committee, In Vitro 6:2, 93] 참조); CMRL 1066 배지(Gibco-Invitrogen (#11530); 또한, 문헌[Parker et al. (1957) Special Publications, N.Y. Academy of Sciences, 5:303] 참조)가 있다.
기본 배지는 혈청-무함유일 수 있으며, 이는, 상기 배지가 혈청(예를 들어 태아 소 혈청(FBS), 말 혈청, 염소 혈청, 또는 당업자에게 공지된 임의의 다른 동물-유래 혈청)을 함유하지 않거나 동물 단백질 무함유 배지 또는 화학적으로 한정된 배지임을 의미한다.
기본 배지는 표준 기본 배지에서 확인되는 소정의 비-영양 구성성분, 예컨대 다양한 무기 및 유기 완충제, 계면활성제(들) 및 소듐 클로라이드를 제거하기 위해 변형될 수 있다. 기본 세포 배지로부터의 이러한 구성성분의 제거는 잔여 영양 구성성분의 증가된 농축을 허용하고, 전반적인 세포 성장 및 단백질 발현을 개선할 수 있다. 또한, 생략된 구성성분은 세포 배양 조건의 요건에 따라, 변형된 기본 세포 배지를 함유하는 세포 배양 배지 내에 다시 첨가될 수 있다. 세포 배양 배지는 변형된 기본 세포 배지, 및 하기 영양소, 철 공급원, 재조합 성장 인자; 완충제; 계면활성제; 삼투몰농도 제어제; 에너지 공급원; 및 비-동물 가수분해물 중 적어도 하나를 함유할 수 있다. 또한, 변형된 기본 세포 배지는 아미노산, 비타민, 또는 아미노산과 비타민 둘 다의 조합을 선택적으로 함유할 수 있다. 변형된 기본 배지는 L-글루타민과 같은 글루타민 및/또는 메톡트렉세이트를 추가로 함유할 수 있다.
정제 및 단리
일단 이중특이적 항체가 생성되면, 이러한 항체는 당업계에 공지된 면역글로불린 분자 정제 방법에 의해, 예를 들어 크로마토그래피(예를 들어 이온 교환, 친화성, 특히 특이적인 항원 단백질 A 또는 단백질 G에 대한 친화성, 및 사이징 컬럼 크로마토그래피), 원심분리, 차별적인 용해성에 의해, 또는 단백질 정제를 위한 임의의 다른 표준 기술에 의해 정제될 수 있다. 나아가, 본 발명의 이중특이적 항체는 이종성 폴리펩타이드 서열(본원에서 "태그"로 지칭됨)에 융합되어, 정제를 용이하게 할 수 있다.
용도
본 발명의 이중특이적 항체는 많은 방식들로 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 이중특이적 항체는 VEGF, ANG, 또는 이들 단백질의 임의의 조합에 결합하여, 이로써 VEGF, ANG, 또는 이들 활성의 임의의 조합의 적어도 하나의 생물학적 활성을 감소시키는 데 사용될 수 있다. 보다 특히, 본 발명의 이중특이적 항체는 VEGF-165, ANG-2, 또는 이들 단백질의 임의의 조합에 결합하여, 이로써 VEGF-165, ANG-2, 또는 이들 활성의 임의의 조합의 적어도 하나의 생물학적 활성을 감소시키는 데 사용될 수 있으며, 이들 감소는 이들의 각각의 수용체의 활성화 또는 인산화의 감소 및/또는 세포 탈제어와 관련하여 혈관신생의 감소를 포함할 수 있다.
예시적인 구현예
본 발명의 일 구현예는 본원에 기재된 이중특이적 항체의 중쇄 상보성 결정 영역 1 내지 3(즉, HCDR1, HCDR2 및 HCDR3) 및 경쇄 상보성 결정 영역 1 내지 3(즉, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)을 포함하는 제1 결합 도메인, 및 본원에 기재된 이중특이적 항체의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 및 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 제2 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항체에 관한 것으로서, 여기서, 제1 결합 도메인은 VEGF-A에 결합하고, 제2 결합 도메인은 ANG-2에 결합한다. 추가 구현예에서, 이중특이적 항체는 BiS3Ab-VEGF H1RK-ANG-2이다.
또 다른 구현예는 본원에 기재된 이중특이적 항체의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 및 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 제1 결합 도메인, 및 본원에 기재된 이중특이적 항체의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 및 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 제2 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항체에 관한 것으로서, 여기서, 제1 결합 도메인은 VEGF-A에 결합하며, 제2 결합 도메인은 ANG-2에 결합하고, 이중특이적 항체는 VEGF165에 결합한다. 추가 구현예에서, 이중특이적 항체는 BiS3Ab-VEGF H1RK-ANG-2이다.
또 다른 구현예는 본원에 기재된 이중특이적 항체의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 및 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 제1 결합 도메인, 및 본원에 기재된 이중특이적 항체의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 및 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 제2 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항체에 관한 것으로서, 여기서, 제1 결합 도메인은 VEGF-A에 결합하며, 제2 결합 도메인은 ANG-2에 결합하고, 이중특이적 항체는 VEGF121과 비교하여 더 큰 친화성으로 VEGF165에 결합한다. 추가 구현예에서, 이중특이적 항체는 BiS3Ab-VEGF H1RK-ANG-2이다.
또 다른 구현예는 본원에 기재된 이중특이적 항체의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 및 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 제1 결합 도메인, 및 본원에 기재된 이중특이적 항체의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 및 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 제2 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항체에 관한 것으로서, 여기서, 제1 결합 도메인은 VEGF-A에 결합하며, 제2 결합 도메인은 ANG-2에 결합하고, 이중특이적 항체는 VEGF189와 비교하여 더 큰 친화성으로 VEGF165에 결합한다. 추가 구현예에서, 이중특이적 항체는 BiS3Ab-VEGF H1RK-ANG-2이다.
또 다른 구현예는 본원에 기재된 이중특이적 항체의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 및 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 제1 결합 도메인, 및 본원에 기재된 이중특이적 항체의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 및 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 제2 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항체에 관한 것으로서, 여기서, 제1 결합 도메인은 VEGF-A에 결합하며, 제2 결합 도메인은 ANG-2에 결합하고, 이중특이적 항체는 VEGF121 및 VEGF189와 비교하여 더 큰 친화성으로 VEGF165에 결합한다. 추가 구현예에서, 이중특이적 항체는 BiS3Ab-VEGF H1RK-ANG-2이다.
또 다른 구현예는 본원에 기재된 이중특이적 항체의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 및 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 제1 결합 도메인, 및 본원에 기재된 이중특이적 항체의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 및 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 제2 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항체에 관한 것으로서, 여기서, 제1 결합 도메인은 VEGF-A에 결합하며, 제2 결합 도메인은 ANG-2에 결합하고, 이중특이적 항체는 인간 VEGFR2 인산화, 뮤린 VEGFR2 인산화, 또는 인간 및 뮤린 VEGFR2 인산화 둘 다를 감소시킨다. 추가 구현예에서, 이중특이적 항체는 BiS3Ab-VEGF H1RK-ANG-2이다.
또 다른 구현예는 본원에 기재된 이중특이적 항체의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 및 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 제1 결합 도메인, 및 본원에 기재된 이중특이적 항체의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 및 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 제2 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항체에 관한 것으로서, 여기서, 제1 결합 도메인은 VEGF-A에 결합하며, 제2 결합 도메인은 ANG-2에 결합하고, 이중특이적 항체는 인간 Tie2 수용체 인산화를 감소시킨다. 추가 구현예에서, 이중특이적 항체는 BiS3Ab-VEGF H1RK-ANG-2이다.
또 다른 구현예는 본원에 기재된 이중특이적 항체의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 및 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 제1 결합 도메인, 및 본원에 기재된 이중특이적 항체의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 및 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 제2 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항체에 관한 것으로서, 여기서, 제1 결합 도메인은 VEGF-A에 결합하며, 제2 결합 도메인은 ANG-2에 결합하고, 이중특이적 항체는 혈관신생을 감소시킨다.
또 다른 구현예는 본원에 기재된 이중특이적 항체의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 및 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 제1 결합 도메인, 및 본원에 기재된 이중특이적 항체의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 및 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 제2 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항체에 관한 것으로서, 여기서, 제1 결합 도메인은 VEGF-A에 결합하며, 제2 결합 도메인은 ANG-2에 결합하고, 이중특이적 항체는 종양을 갖는 대상체에게 제공된 결과 종양 성장을 감소시키거나, 종양 부피를 감소시키거나, 종양 성장을 감소시키고 종양 부피를 감소시킨다. 추가 구현예에서, 이중특이적 항체는 BiS3Ab-VEGF H1RK-ANG-2이다.
또 다른 구현예는 본원에 기재된 이중특이적 항체의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 및 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 제1 결합 도메인, 및 본원에 기재된 이중특이적 항체의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 및 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 제2 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항체에 관한 것으로서, 여기서, 제1 결합 도메인은 VEGF-A에 결합하며, 제2 결합 도메인은 ANG-2에 결합하고, 이중특이적 항체는 제2 결합 도메인의 제조에 사용된 부모 ANG-2 항체보다 더 큰 친화성으로 ANG-2에 결합한다. 보다 특정한 구현예에서, ANG-2에 대한 제2 결합 도메인의 결합 친화성은 약 1배 내지 약 20배만큼 증가된다. 보다 더 특정한 구현예에서, ANG-2에 대한 제2 결합 도메인의 결합 친화성은 약 1배, 약 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 6배, 약 7배, 약 8배, 약 9배, 약 10배, 약 11배, 약 12배, 약 13배, 약 14배, 약 15배, 약 16배, 약 17배, 약 18배, 약 19배 또는 약 20배만큼 증가된다. 추가 구현예에서, 이중특이적 항체는 BiS3Ab-VEGF H1RK-ANG-2이다.
또 다른 구현예는 본원에 기재된 이중특이적 항체의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 및 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 제1 결합 도메인, 및 본원에 기재된 이중특이적 항체의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 및 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 제2 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항체에 관한 것으로서, 여기서, 제1 결합 도메인은 VEGF-A에 결합하며, 제2 결합 도메인은 ANG-2에 결합하고, 이중특이적 항체는, VEGF165에 결합하는 것, VEGF121과 비교하여 더 큰 친화성으로 VEGF165에 결합하는 것, VEGF189와 비교하여 더 큰 친화성으로 VEGF165에 결합하는 것, VEGF121 및 VEGF189와 비교하여 더 큰 친화성으로 VEGF165에 결합하는 것, 인간 VEGFR2 인산화를 감소시키는 것, 뮤린 VEGFR2 인산화를 감소시키는 것, 인간 및 뮤린 VEGFR2 인산화를 감소시키는 것, 인간 Tie2 수용체 인산화를 감소시키는 것, 혈관신생을 감소시키는 것, 종양 성장을 감소시키는 것, 종양 부피를 감소시키는 것, 종양 성장을 감소시키고 종양 부피를 감소시키는 것, 및 제2 결합 도메인의 제조에 사용된 부모 ANG-2 항체와 비교하여 제2 결합 도메인을 통해 ANG-2에 대한 친화성을 증가시키는 것을 포함한 본원에 기재된 특징들 중 하나 이상 또는 임의의 조합을 가진다. 추가 구현예에서, 이중특이적 항체는 BiS3Ab-VEGF H1RK-ANG-2이다.
또 다른 구현예는 식 VH-CH1-H-CH2-CH3을 갖는 항체 중쇄를 포함하는 이중특이적 항체에 관한 것이며, 여기서, VH는 중쇄 가변 도메인이며, CH1은 중쇄 불변 영역 도메인 1이며, H는 힌지 영역이며, CH2는 중쇄 불변 영역 도메인 2이고, CH3은 중쇄 불변 영역 도메인 3이다. 또 다른 추가 구현예에서, 이중특이적 항체는 식 VL-CL을 갖는 항체 경쇄를 포함하며, 여기서, VL은 가변 경쇄 도메인이고, CL은 경쇄 불변 도메인이다. 또 다른 보다 추가의 구현예에서, 이중특이적 항체는 식 VH-CH1-H-CH2-CH3 및 VL-CL을 가진다. 추가 구현예에서, 이중특이적 항체는 BiS3Ab-VEGF H1RK-ANG-2이다.
또 다른 구현예는 식 VH-CH1-H-CH2-CH3 및 VL-CL을 포함하는 이중특이적 항체에 관한 것이며, 여기서, 하나 이상의 scFv 분자는 항체 중쇄 또는 항체 경쇄의 하나 이상의 N-종결 부분에 공유 부착된다. 또 다른 추가 구현예에서, 하나 이상의 scFv 분자는 이중특이적 항체의 하나 이상의 VL의 N-종결 도메인에 공유 부착된다. 보다 특정한 구현예에서, 이중특이적 항체는 식 VH-CH1-H-CH2-CH3 및 scFv-L1-VL-CL을 포함하며, 여기서, L1은 링커이고, 다른 다양한 파트들은 이전에 기재되어 있다. 또 다른 보다 특정한 구현예에서, 이중특이적 항체는 식 scFv-L1-VH-CH1-CH2-CH3 및 VL-CL을 포함한다.
또 다른 구현예는 식 VH-CH1-H-CH2-CH3 및 VL-CL을 포함하는 이중특이적 항체에 관한 것이며, 여기서, 하나 이상의 scFv 분자는 항체 중쇄의 하나 이상의 C-종결 부분에 공유 부착된다. 보다 특정한 구현예에서, 이중특이적 항체는 식 VH-CH1-CH2-CH3-L1-scFv 및 VL-CL을 포함한다. 또 다른 보다 특정한 구현예에서, 이중특이적 항체는 식 VH-CH1-CH2-CH3-L1-scFv-L2 및 VL-CL을 포함하며, 여기서, L2는 링커이고 L1과 독립적이며, L1 및 L2는 CH3에 공유 결합되고, 다른 다양한 파트들은 이전에 기재되어 있다. 또 다른 추가의 보다 특정한 구현예에서, 이중특이적 항체는 식 VH-CH1-L1-scFv-L2-CH2-CH3 및 VL-CL을 포함하며, 여기서, L1 및 L2는 독립적인 링커이고, 중쇄는 힌지 영역을 함유할 수 있거나 힌지리스일 수 있다. 추가 구현예에서, 이중특이적 항체는 BiS3Ab-VEGF H1RK-ANG-2이다.
구체적인 구현예에서, HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 및 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 제1 결합 도메인; 및 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 및 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 제2 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항체가 존재하며, 여기서, 제1 결합 도메인 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 및 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 SEQ ID NO: 17 내지 22를 각각 포함하고, 제2 결합 도메인 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 및 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 SEQ ID NO: 23 내지 28을 각각 포함한다.
또 다른 구체적인 구현예에서, SEQ ID NO: 3 및 9를 각각 포함하는 중쇄 및 경쇄를 포함하는 제1 결합 도메인, 및 SEQ ID NO: 5 및 11을 각각 포함하는 중쇄 및 경쇄를 포함하는 제2 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항체가 존재한다.
또 다른 구체적인 구현예에서, SEQ ID NO: 1을 포함하는 중쇄 아미노산 서열 및 SEQ ID NO: 7을 포함하는 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 이중특이적 항체가 존재한다.
또 다른 구체적인 구현예에서, 파트 VH-CH1-H-CH2-CH3, VL-CL, 및 하나 이상의 scFv, L1, 또는 선택적으로 L2를 갖는 식을 포함하는 이중특이적 항체가 존재하며, 여기서, 상기 식은 하기의 식일 수 있다:
a. VH-CH1-CH2-CH3 및 scFv-L1-VL-CL;
b. scFv-L1-VH-CH1-CH2-CH3 및 VL-CL;
c. VH-CH1-CH2-CH3-L1-scFv 및 VL-CL;
d. VH-CH1-CH2-CH3-L1-scFv-L2 및 VL-CL, 여기서, L1 및 L2는 CH3에 공유 결합됨;
e. VH-CH1-L1-scFv-L2-CH2-CH3 및 VL-CL, 중쇄는 힌지 영역을 함유하거나 힌지리스일 수 있음.
또 다른 구체적인 구현예에서, 식 VH-CH1-CH2-CH3-L1-scFv 및 VL-CL을 포함하는 이중특이적 항체가 존재한다.
또 다른 구체적인 구현예에서, SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 포함하는 scFv를 포함하는 이중특이적 항체가 존재한다.
또 다른 구체적인 구현예에서, HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 및 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 제1 결합 도메인; 및 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 및 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 제2 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 핵산 서열이 존재하며, 여기서, 제1 결합 도메인 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 및 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 SEQ ID NO: 17 내지 22를 각각 포함하고, 제2 결합 도메인 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 및 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 SEQ ID NO: 23 내지 28을 각각 포함한다.
또 다른 구체적인 구현예에서, HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 및 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 제1 결합 도메인; 및 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 및 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 제2 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터가 존재하며, 여기서, 제1 결합 도메인 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 및 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 SEQ ID NO: 17 내지 22를 각각 포함하고, 제2 결합 도메인 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 및 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 SEQ ID NO: 23 내지 28을 각각 포함한다.
또 다른 구체적인 구현예에서, HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 및 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 제1 결합 도메인; 및 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 및 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 제2 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 포함하는 세포가 존재하며, 여기서, 제1 결합 도메인 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 및 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 SEQ ID NO: 17 내지 22를 각각 포함하고, 제2 결합 도메인 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 및 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 SEQ ID NO: 23 내지 28을 각각 포함한다.
또 다른 구체적인 구현예에서, HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 및 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 제1 결합 도메인; 및 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 및 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 제2 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 포함하는 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 이중특이적 항체를 제조하는 방법이 존재하며, 여기서, 제1 결합 도메인 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 및 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 SEQ ID NO: 17 내지 22를 각각 포함하고, 제2 결합 도메인 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 및 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 SEQ ID NO: 23 내지 28을 각각 포함한다.
또 다른 구체적인 구현예에서, 이중특이적 항체를 대상체에게 제공하는 단계를 포함하는, 혈관신생을 감소시키는 방법이 존재하며, 여기서, 이중특이적 항체는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 및 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 제1 결합 도메인; 및 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 및 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 제2 결합 도메인을 포함하며, 제1 결합 도메인 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 및 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 SEQ ID NO: 17 내지 22를 각각 포함하고, 제2 결합 도메인 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 및 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 SEQ ID NO: 23 내지 28을 각각 포함한다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
실시예
본원에 기재된 실험을 위해, MEDI3617(문헌[Int J Oncol. 2012 May;40(5):1321-30]), Avastin®(문헌[Ferrara, N et al. BiochemBiophys Res Comm, 333:328-335, 2005]), G6-31(문헌[Liang, WC et al. J Biol Chem, 281: 951-961, 2006]), B20-4.1(문헌[Liang, WC et al. J Biol Chem, 281: 951-961, 2006]), 및 R347로 지정된 아이소타입 대조군을 포함한 다양한 항체들을 필요에 따라 단일특이적 또는 이중특이적 항체로서 사용하였다. 마우스와 교차-반응성이지 않은 모든 VEGF 동종형들에 결합할 수 있는 항-VEGF IgG1 항체를 일부 결합 및 기능성 연구를 위한 양성 대조군으로서 사용할 수 있다. 마우스 VEGF에 대한 교차-반응성이 필요하다면, 항체 G6-31 및 B20-4.1을 양성 대조군으로서 사용할 수 있다.
실시예 1 - BS3AB-VEGF H1RK-ANG2의 포맷 및 서열.
VEGF-A 및 ANG-2의 수용체인 VEGFR 및 Tie2에 대한 결합을 각각 감소시킴으로써, 이들 VEGF-A 및 ANG-2의 하나 이상의 생물학적 활성을 동시에 감소시키도록 BiS3Ab-VEGF H1RK-ANG-2를 디자인하였다. 도 2는 BiS3Ab-VEGF H1RK-ANG-2의 개략적인 다이어그램이다. 이중특이적 2가 항체는 Dimasi 등(문헌[J Mol Biol. 2009])에 의해 이미 기재된 바와 같이 각각의 중쇄의 C-종결부에 연결된 scFv와 함께 전장 IgG 분자로 구성된다. Fab 영역의 결합 특이성은 항-VEGF-A(제1 결합 도메인)이고, scFv는 항-ANG-2(제2 결합 도메인)이다. 제1 결합 도메인의 경쇄를 인코딩하는 전체 뉴클레오타이드 서열이 도 3에 도시되어 있다. 번역된 아미노산 서열 및 경쇄 가변 영역 아미노산 서열 또한, 도 3에 도시되어 있다. 항-VEGF 경쇄는 위치 107에서 트레오닌을 라이신으로 돌연변이화시킴으로써 교정된 생식선(germline)이었다. 생식선 교정된 항-VEGF 서열은 H1RK로 지칭된다. 중쇄의 완전한 뉴클레오타이드 서열은 도 4에 도시되어 있고, 상응하는 아미노산 서열은 도 5에 도시되어 있다. 중쇄 서열의 아미노산 서열은 제1 결합 도메인의 중쇄 가변 영역, CH1, CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 중쇄 불변 영역, 연결성 글리신 세린 링커, 제2 결합 도메인의 가변 경쇄, scFv 글리신 세린 링커, 및 제2 결합 도메인의 가변 중쇄 영역으로 더 나뉠 수 있다.
실시예 2 - 일시적인 형질감염
BiS3Ab-VEGF H1RK-ANG-2 및 부모 항체의 일시적인 형질감염을, 120 rpm, 37℃ 및 8% CO2에서 FreeStyle™ 혈청-무함유 배지(Invitrogen)에서 배양된 HEK 293F 현탁 세포에서 수행하였다. 형질감염 하루 전에 세포를 0.7 x 106로 나누었다. 300 μL의 293fectin™ 형질감염 시약(Invitrogen) 및 200 μg의 DNA를 5 mL의 Opti-MEM® I 리듀스드(Reduced) 혈청 배지(Invitrogen) 내로 개별적으로 희석시키고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. DNA 및 293fectin™ 혼합물을 조합하고, 추가의 30분 동안 인큐베이션한 다음, 300 mL의 1X106 HEK 293F 세포/mL에 첨가하였다. 형질감염된 배양물의 부피를, FreeStyle™ 혈청-무함유 배지를 이용하여 3일마다 2배로 만들었다. 11일째에 배양물을 1500 X g에서 10분 동안 원심분리에 의해 수합하고, 0.2 mM 여과하였다(Eppendorf).
단백질 A 결합 방법을 사용하여 BiSAb-VEGF H1RK-ANG-2 및 부모 항체의 발현을 모니터링하였다. 배양된 배지의 분취물을 0.2 μm 필터(Eppendorf) 처리하고, HPLC 시스템(Agilent 1100 Capillary LC)을 사용하여 단백질 A 컬럼(POROS®A 20 ㎛ 컬럼, 4.6 x 50 mm, 0.8 mL) 상으로 로딩하였다. 컬럼을 1X PBS pH 7.2로 세척하고, 항체를 0.1% 인산(pH 1.8)을 이용하여 용출시켰다. A280 nm에서 UV 신호를 적분함으로써 결정된, 용출된 피크 아래 면적을 측정하고, 이를 사용하여 공지된 IgG 표준과 비교하여 발현 수준을 계산하였다. 표 1은 부모 항체 및 BiSAb-VEGF H1RK-ANG-2의 발현 수준을 보여준다.
Figure pct00005
실시예 3 - 단백질 정제 및 농도 결정
항체를 표준 단백질 A 친화성 크로마토그래피 방법에 의해 정제하였다. 1 리터의 조건화된 배지를 1500 x g에서 10분 동안 원심분리하고, 0.2 μM 진공 여과하였다(Nalgene). 여과된 상층액을 Akta Explorer(GE)를 사용하여 mAbselect™ 단백질 A 컬럼(GE) 상으로 로딩하였다. 20 컬럼 부피의 1X PBS, pH 7.2를 이용하여 단백질 A 컬럼을 평형화시키고, 여과된 배양 배지를 5 mL/분의 유속을 사용하여 로딩하였다. 20 컬럼 부피의 1X PBS, pH 7.2를 사용함으로써, 비결합된 물질을 제거하였다. 10 컬럼 부피의 0.1 M 글리신, 150 mM 소듐 클로라이드 pH 3.2를 사용하여 항체 용출을 수행하였다. 280 nm의 흡광도를 사용하여, 용출을 모니터링하였다. 1 분획의 1 M Tris-HCl pH 7.0 당 1/10의 부피를 사용함으로써, 단백질 A 용출된 항체를 즉시 중화시켰다. 그 후에, 0.22 μM 주사기 필터(Nalgene)를 사용하여 항체를 여과하였다. NanoDrop(NanoDrop) 및 1.4 M-1cm-1의 소광 계수를 사용하여 280 nm에서 흡광도를 판독함으로써, 정제된 항체의 농도를 결정하였다.
BiSAb-VEGF H1RK-ANG-2의 발현 동안 발생된 응집물을 세라믹 하이드록시아파타이트 유형 II(GE) 정제에 의해 효율적으로 제거할 수 있다. CHT 컬럼을 5 컬럼 부피의 1 M 소듐 하이드록사이드를 이용하여 예비-조건화하고, 1X PBS pH 7.2를 5 mL/분에서 이용하여 pH 7.2까지 중화시켰다. 20 컬럼 부피의 완충제 A(멸균수 중 20% 1X PBS, pH 7.2)를 사용하여, 상기 컬럼을 사용 전에 평형화시켰다. BiSAb-VEGF H1RK-ANG-2 단백질 A 용출제를 CHT 컬럼 상에 직접적으로 로딩하고, 20 컬럼 부피의 완충제 A를 이용하여 세척하였다. 단량체 분획을 15 컬럼 부피에 대해 15% 완충제 A 및 85% 완충제 B(5X PBS, pH 7.2)를 이용하여 용출하였다. 100% 완충제 B를 사용하여 응집물을 용출하였다. 대표적인 용출 프로파일을 도 6에 제시한다. 단량체 분획을 1X PBS, pH 7.2에서 밤새 투석시켰다.
단백질 A 정제 후 응집물 수준을 결정하고 폴리싱(polishing) 단계가 필요하다면, BiS3Ab-VEGF H1RK-ANG-2의 단량체 함량을 측정하였다. TSK GEL G3000SWXL 컬럼(Tosoh Bioscience)과 함께 Agilent 1100 HPLC(Agilent)를 사용하여 분석 크기-배제 크로마토그래피(SEC-HPLC)를 수행하였다. 250 μg의 이중특이적 항체를 분석에 사용하였다. 이동상은 0.1 M 소듐 술페이트, 0.1 M 소듐 포스페이트 pH 6.8이었고, 280 nm의 흡광도를 사용하여 항체를 모니터링하였다. Chemstation 소프트웨어(Agilent)를 분석에 사용하였고, Prism5 소프트웨어(GraphPad)를 사용하여 도면을 제작하였다. 단백질 정제 후 및 세라믹 하이드록시아파타이트 정제 후, 대표적인 단량체 함량을 도 7에 제시한다. 세라믹 하이드록시아파타이트 크로마토그래피를 사용함으로써 BiS3Ab-VEGF H1RK-ANG-2 중 적어도 12%의 응집물을 효율적으로 제거할 수 있다.
실시예 4 - BISAB-VEGF H1RK-ANG-2의 분석 특징화
BiS3Ab-VEGF H1RK-ANG-2를 환원성(reducing) 및 비-환원성 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 15 μL의 1 X PBS pH 7.2 중 2 μg의 단백질, 항-VEGF 또는 BiS3Ab-VEGF H1RK-ANG-2를 1X NuPAGE 환원제(Invitrogen)와 함께 및 없이 5 μL의 LDS-PAGE 로딩 완충제와 혼합하였다. 10 μL의 노벡스 샤프 프리-스테인드 단백질 표준(Novex Sharp Pre-Stained Protein Standard)(Invitrogen)을 단백질 래더(ladder)로서 사용하였다. 시료를 70℃에서 10분 동안 가열하고, 벤치탑 원심분리를 사용하여 13,500 rpm에서 회전 침전(spun down)시키고, 4 내지 12% Nupage 젤(Invitrogen) 상에 로딩하였다. 전기영동을 MOPS 완충제에서 200 볼트에서 1시간 동안 수행하였다. SDS-PAGE 젤을 SimplyBlue™ SafeStain(Invitrogen)을 이용하여 염색시키고, 수(water) 중에서 밤새 탈색시켰다. 대표적인 SDS-PAGE 젤을 도 8에 제시한다.
iCE2 분석기(ProteinSimple)를 사용하여 BiS3Ab-VEGF H1RK-ANG-2의 영상 모세관 등전점 전기영동(imaged capillary isoelectric focusing)을 수행하였다. 파말라이트(pharmalyte) pH 3 내지 10 및 8 내지 10.5를 Sigma사로부터 입수하였다. 애노드액(0.1% 메틸 셀룰로스 중 80 mM 인산), 캐소드액(0.1%% 메틸 셀룰로스 중 100 mM 소듐 하이드록사이드), 0.5% 메틸셀룰로스, 헤모글로빈 및 양쪽성 물질을 포함한 iCE3 분석기의 성능 평가용 FC 카트리지 화학 시험 키트, 및 0.35% 메틸 셀룰로스 중 pI 마커를 ProteinSimple사로부터 구매하였다. 5.85 및 9.46 pI 마커를 ProteinSimple사로부터 구매하였다. 사용된 FC 카트리지 분리를 ProteinSimple사로부터 구매하였다. BiS3Ab-VEGF H1RK-ANG-2를 탈이온수 중 1 mg/mL에서 제조하였다. 50 μl의 1 mg/ml Bs3Ab-VEGF-Ang2 용액, 2 μl의 5.85 pI 마커, 2 μl의 9.46 pI 마커, 140 μl의 0.5% 메틸셀룰로스, 2 μl의 파말라이트 3 내지 10 및 6 μl의 8 내지 10.5 파말라이트를 조합하였으며; 45초 동안 와동(vortex)시키고, 10,000 rpm에서 3분 동안 원심분리하였다. 오토샘플러(ProteinSimple)를 사용하여 시료를 모세관에 도입하였다. 1000 kV에서 1분/s 동안, 후속해서 3000 kV에서 7분/s 동안 프리-포커스(pre-focus)에 의해 시료 분리를 수행하였다. 중수소 램프 검출기를 이용하여 280 nm에서 검출을 수행하였다. 데이터를 분석하고, iCE280 분석기 소프트웨어를 사용하여 도면을 제작하였다. BiS3Ab-VEGF H1RK-ANG-2의 대표적인 포커싱을 도 9에 도시하고; 단백질의 pI를 표시한다.
VP-DSC(Microcal)를 사용한 시차 주사 열량계 분석 전에, BiS3Ab-VEGF H1RK-ANG-2를 25 mM 히스티딘 pH 6.0 내에서 밤새 3회 투석시켰다. 최종 투석 완충제를 참조 스캔에 사용하여, 참조 공제(substraction)용의 안정한 기준선을 수득하였다. 시약을 최소 2분 동안 탈기시키고, 단백질을 참조 완충제 내에서 1 mg/mL까지 희석시키고, 20℃로부터 110℃까지 1℃/분에서 16초의 필터 기간을 사용하여 스캔하였다. BiS3Ab-VEGF H1RK-ANG-2에 대한 대표적인 전이 온도를 도 10에 제시한다.
실시예 5 - ANG-2에 대한 BIS3AB-VEGF H1RK-ANG-2의 결합 친화성
ANG-2에 대한 BiS3Ab-VEGF H1RK-ANG-2 결합 친화성을 결정하였다. 평형 결합 상수(KD)를 KinExA 3000 및 3200 장비(Sapidyne Instruments, 미국 아이다호주 보이시 소재) 상에서 수행된 측정으로부터 수득하였다. 인간 ANG-2(huAng2) 단백질을 코팅 완충제(50 mM 소듐 카르보네이트 완충제, pH9) 중 5 mg/mL 및 30 mg/mL의 농도에서 UltraLink® 바이오서포트(Biosupport) 비드(PIERCE, 미국 일리노이주 록퍼드 소재) 상으로 코팅시켰다. 그 후에, 코팅된 비드를 미반응된 huAng2 단백질 용액으로부터 분리하고(부드러운 펄스 회전(pulse spin)), 10 mg/mL에서 BSA를 함유하는 1 M Tris, pH 8을 이용하여 실온에서 대략 15분 동안 블로킹시켰다. 이후, 비드 슬러리를 회전시켜, 블로킹 용액을 제거하고, 그 후에, 신선한 블록 완충제를 사용하여 블록 단계를 대략 2시간 동안 반복하고, 사용할 때까지 4℃에 보관하였다. 사용 전에, huAng2-코팅된 비드를 비드 바이얼에 전이시키고, 대략 27 mL의 장비 완충제(HBS-P 완충제, pH7.4; 10 mM HEPES, 0.15 M NaCl, 0.005% P20+0.02% NaN3를 함유함)에 재현탁시키고, KinExA 장비에 부착시켰다. 간략하게는, BiS3Ab-VEGF H1RK-ANG-2의 용액을 장비 완충제(HBS-P 완충제) 내에서 4 pM, 40 pM 및 400 pM에서 제조하고, 그 후에, 13개 튜브의 3개의 개별 시리즈로 배분하였다. 수용체- 및 KD-조건화된 조건들 둘 다 하에 측정을 수행할 수 있도록 이중특이적 항체의 이들 농도를 선택하였으며, 이는 시약 활성 및 친화성의 보다 엄격한 추정을 각각 허용할 것이다. 그 후에, huAng2 단백질의 2배 단계 희석물을, 이중특이적 용액을 함유하는 9개의 튜브에 걸쳐 적정하였으며, 후속해서 10배 희석물을 2개 이상의 튜브에 걸쳐 적정하였고, 하나의 튜브를 이중특이적-단독, "제로" 대조군으로서 남겨 두었다. 그렇게 하여, 이는 huAng2 단백질의 농도 시리즈를 39 fM 내지 2 nM(4 pM 이중특이적 실험), 156 pM 내지 8 nM(40 pM 및 400 pM 이중특이적 실험) 범위로 제공하였다. 판매 회사 소프트웨어(Sapidyne Instruments, 미국 아이다호주 보이시 소재)를 통해 입수 가능한 이론 곡선 시뮬레이션을 기초로, 혼합물을 실온에서 1 내지 3일 동안 인큐베이션하여, 결합이 평형에 도달하도록 하였다. 이 시간의 종결 시, 신호-시험 실험을 수행하여, 각각의 측정 세트에 적절한 진행 조건을 결정하였다. 1 mg/mL에서 BSA를 함유하는 장비 완충제 중 0.75 mg/mL 또는 1.0 mg/mL에서 이용된 종-특이적인, 2차 항체 시약(염소 항-인간 IgG (H+L)-DyLight649, 파트 #109-495-088, Jackson ImmunoResearch Laboratories)을 사용하여 유리 항체의 검출을 가능하게 하였다. 그 후에, 모든 측정 세트로부터 수득된 데이터를 소프트웨어의 n-곡선 분석 특징을 사용하여 1-부위 결합 모델에 동시에 적합화시켜, 표 2에 보고된 바와 같이 평형 결합 상수(KD)를 수득하였다.
Figure pct00006
VEGF에 대한 BiSAb-VEGF H1RK-ANG-2 결합 친화성을 결정하였다. 항-hu-Ang2 측정과 함께, 평형 결합 상수(KD) 측정을 KinExA 3000 및 3200 장비(Sapidyne Instruments, 미국 아이다호주 보이시 소재) 상에서 수행하였다. 인간 VEGF(huVEGF) 단백질을 코팅 완충제(50 mM 소듐 카르보네이트 완충제, pH9) 중 3 mg/mL, 30 mg/mL 및 50 mg/mL의 농도에서 UltraLink® 바이오서포트 비드(PIERCE, 미국 일리노이주 록퍼드 소재) 상으로 코팅시켰다. 그 후에, 코팅된 비드를 미반응된 huVEGF 단백질 용액으로부터 분리하고(부드러운 펄스 회전), 10 mg/mL에서 BSA를 함유하는 1 M Tris, pH 8을 이용하여 실온에서 대략 15분 동안 블로킹시켰다. 이후, 비드 슬러리를 회전시켜, 블로킹 용액을 제거하고, 그 후에, 신선한 블록 완충제를 사용하여 블록 단계를 대략 2시간 동안 반복하고, 사용할 때까지 4℃에 보관하였다. 사용 전에, huAng2-코팅된 비드를 비드 바이얼에 전이시키고, 대략 27 mL의 장비 완충제(10 mM HEPES + 300 mM NaCl + 5 mM CaCl2 + 0.05% P20 + 0.02% NaN3, pH 8)에 재현탁시키고, KinExA 장비에 부착시켰다. 간략하게는, BiSAb-VEGF H1RK-ANG-2의 용액을 장비 완충제 내에서 10 pM, 100 pM 및 2.5 nM에서 제조하고, 13개 튜브의 3개의 개별 시리즈로 배분하였다. 수용체- 및 KD-조건화된 조건들 둘 다 하에 측정을 수행할 수 있도록 이중특이적의 이들 농도를 선택하였으며, 이는 시약 활성 및 친화성의 보다 엄격한 추정을 각각 허용할 것이다. 그 후에, huVEGF 단백질의 2배 단계 희석물을 이중특이적 용액을 함유하는 9개의 튜브에 걸쳐 적정하였으며, 후속해서 10배 희석물을 2개 이상의 튜브에 걸쳐 적정하였고, 하나의 튜브를 이중특이적-단독, "제로" 대조군으로서 남겨 두었다. 그렇게 하여, 이는 huVEGF 단백질의 농도 시리즈를 78 fM 내지 4 nM(10 pM 이중특이적 실험), 488 fM 내지 25 nM(100 pM 이중특이적 실험) 및 3.91 pM 내지 200 nM(2.5 nM 이중특이적 실험) 범위로 제공하였다. 판매 회사 소프트웨어(Sapidyne Instruments, 미국 아이다호주 보이시 소재)를 통해 입수 가능한 이론 곡선 시뮬레이션을 기초로, 혼합물을 실온에서 1 내지 4일 동안 인큐베이션하여, 결합이 평형에 도달하도록 하였다. 이 시간의 종결 시, 신호-시험 실험을 수행하여, 각각의 측정 세트에 적절한 진행 조건을 결정하였다. 1 mg/mL에서 BSA를 함유하는 장비 완충제 중 0.75 mg/mL, 1.0 mg/mL 또는 2 mg/mL에 이용된 종-특이적인, 2차 항체 시약(염소 항-인간 IgG (H+L)-DyLight649, 파트 #109-495-088, Jackson ImmunoResearch Laboratories)을 사용하여 유리 항체의 검출을 가능하게 하였다. 그 후에, 모든 측정 세트로부터 수득된 데이터를 소프트웨어의 n-곡선 분석 특징을 사용하여 1-부위 결합 모델에 동시에 적합화시켜, 상기 표 2에 보고된 바와 같이 평형 결합 상수(KD)를 수득하였다.
실시예 6 - ANG-2 및 VEGF165에 대한 BIS3AB-VEGF H1RK-ANG-2에 의한 동시 결합
10 mM 아세테이트, pH 5 중 10 nM의 VEGF165, 100 nM의 Ang2 및 10 nM의 Bs3Ab-VEGF-Ang2를 사용하여 동시 결합 실험을 Biacore 3000(GE Healthcare) 상에서 25℃에서 수행하고, 제조업체(GE Healthcare)에 의해 제공된 표준 아민 커플링 프로토콜을 사용하여 CM5 센서칩 표면 상에 고정하였다. 용액 BiSAb-VEGF H1RK-ANG-2 고정된 칩을 사용하여, 100 nM의 VEGF, 및 100 nM의 VEGF와 500 nM의 ANG-2의 혼합물을 HBS 완충제(GE Healthcare)에서 제조하였다. VEGF 용액을 30 mL/분의 유속에서 500초 동안 주사하였다. 제1 주사 후, VEGF 또는 VEGF/ANG-2 혼합물의 추가 주사를 250초 동안 주사하였다. 우선 500 nM의 ANG-2를 주사하고, 후속해서 VEGF/ANG-2 혼합물의 또 다른 ANG-2 주사에 의해, 유사한 실험을 수행하였다. 동시 결합을 더 확인하기 위해, VEGF 및 ANG-2 코팅된 칩을 사용하였다. VEGF165 표면의 경우, 50 nM의 BiSAb-VEGF H1RK-ANG-2를 30 mL/분에서 600초 동안 유동시키고, 후속해서 50 nM BiSAb-VEGF H1RK-ANG-2 및 500 nM ANG-2의 제2 주사를 수행하였다. ANG-2 표면을 유사한 실험에 사용하였다. 50 nM의 BiSAb-VEGF H1RK-ANG-2를 30 mL/분에서 500초 동안의 초기 주사에 사용하였다. 50 nM의 BiSAb-VEGF H1RK-ANG-2, 또는 BiSAb-VEGF H1RK-ANG-2와 100 nM의 VEGF165의 혼합물을 사용하여, 제2 주사를 수행하였다. BIA평가(GE healthcare)를 사용하여 데이터를 분석하고, Prism 5(Graph Pad)를 사용하여 도면을 제작하였으며, 대표적인 결과를 도 11에 제시한다.
BiSAb-VEGF H1RK-ANG-2 항체를 또한, 이중 결합 ELISA에서 VEGF 및 ANG-2에 대한 동시 결합에 대해 스크리닝하였다. Ca++ 또는 Mg++ 없이 PBS에 희석된 100 ㎕의 1.0 ㎍/mL 인간 또는 마우스 VEGF(Peprotech)를 이용하여 맥시소프(Maxisorp) 플레이트(Nunc, Cat #439454)를 코팅시키고, 밤새 냉장시켰다. 플레이트를 디캔팅(decant)시키고, 그 후에, 1X PBS 중 3% BSA(Sigma, Cat #A-3059) 및 0.1% Tween-20을 함유하는 200 ㎕의 블로킹 완충제를 이용하여 플레이트 쉐이커 상에서 1.5시간 동안 블로킹시켰다. 0.1% Tween-20을 함유하는 1 X PBS로 플레이트를 3회 세척하였다. 블로킹 완충제 중 50 ㎕의 60 nM 및 단계 희석의 BiSAb-VEGF H1RK-ANG-2 이중특이적 항체, Ang-2 항체, 또는 이중특이적 r347 아이소타입 대조군 암(arm)(BS3Ab-r347-Ang2)을 2벌 중복하여 첨가하고, 플레이트 쉐이커 상에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척 완충제로 3회 세척하고, 그 후에, 블로킹 완충제 중 50 ㎕의 1 ㎍/ml 인간 또는 마우스 Ang2-비오틴(R&D Systems)을 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트 쉐이커 상에서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고, 그 후에, 50 ㎕의 1:15,000 스트렙타비딘 HRP(Pierce)를 플레이트 쉐이커 상에서 실온에서 1시간 동안 첨가하였다. 플레이트를 세척하고, 그 후에 50 ㎕의 TMB 용액(KPL)을 각각의 웰에 첨가함으로써 발색시키고, 그 후에 50 ㎕의 1 M 인산을 이용하여 반응을 중단시켰다. 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 플레이트를 450 nm에서 판독하였다. GraphPad Prism, 버전 5.01(미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)에서 비-선형 회귀 분석(로그 용량 반응, 4-매개변수 적합도 곡선)을 사용하여 EC50 값을 결정하였다. 대표적인 결과를 도 12a(인간) 및 도 12b(마우스)에 제시한다. 인간 및 마우스 VEGF 및 ANG-2에 대한 강한 동시 결합은, 이러한 검정에서 VEGF 및 ANG-2에 대한 동시 결합의 실패를 가리키는 약한 결합을 보여준 Ang2 항체(MEDI3617) 단독 및 BS3Ab-r347-Ang2와 비교하여 BiSAb-VEGF H1RK-ANG-2(각각 EC50 10.8 pM 및 103.8 pM)에 의해 나타났다.
실시예 7 - 감소된 VEGF121 결합에 대한 BISAB-VEGF H1RK-ANG-2의 스크리닝
항체를 ELISA 포맷에서 VEGF121 결합에 대해 스크리닝하였다. Ca++ 또는 Mg++ 없이 PBS에 희석된 25 ㎕의 2 ㎍/mL 인간 VEGF(Peprotech)를 이용하여 96-웰 하프 웰 맥시소프 플레이트를 코팅시키고, 밤새 냉장시켰다. 플레이트를 디캔팅시키고, 그 후에, 1X PBS 중 3% BSA(Sigma, Cat #A-3059) 및 0.1% Tween-20을 함유하는 180 ㎕의 블로킹 완충제를 이용하여 37℃에서 1.5시간 동안 블로킹시켰다. 0.1% Tween-20을 함유하는 1 X PBS로 플레이트를 3회 세척하였다. 블로킹 완충제 중 50 ㎕의 단계 희석의 항-VEGF 항체, Avastin®(양성 대조군; 항-VEGF 항체) 및 r347(음성 대조군)을 2벌 중복하여 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척 완충제로 3회 세척하고, 그 후에, 50 ㎕의 1:5000 염소 항-인간 HRP IgG H+L(Jackson Immunoresearch)을 각각의 웰에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 50 ㎕의 TMB 용액(KPL)을 각각의 웰에 첨가하여 플레이트를 발색시키고, 그 후에 50 ㎕의 1 M 인산을 이용하여 반응을 중단시켰다. 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 플레이트를 450 nm에서 판독하였다. 대표적인 결과를 도 13에 제시한다. BiSAb-VEGF H1RK-ANG-2는 양성 대조군 B20-4.1과 대조적으로, VEGF121 결합이 결여되었다.
실시예 8 - 감소된 VEGF189 결합에 대한 BiSAb-VEGF H1RK-ANG-2의 스크리닝
ELISA 포맷에서 VEGF189에 대한 결합에 대해 BiSAb-VEGF H1RK-ANG-2를 스크리닝하였다. Ca++ 또는 Mg++ 없이 PBS에 희석된 25 ㎕의 2 ㎍/mL 인간 VEGF189(R&D Systems)를 이용하여 96-웰 하프 웰 맥시소프 플레이트를 코팅시키고, 밤새 냉장시켰다. 플레이트를 디캔팅시키고, 그 후에, 1X PBS 중 3% BSA(Sigma, Cat #A-3059) 및 0.1% Tween-20을 함유하는 180 ㎕의 블로킹 완충제를 이용하여 37℃에서 1.5시간 동안 블로킹시켰다. 0.1% Tween-20을 함유하는 1 X PBS로 플레이트를 3회 세척하였다. 블로킹 완충제 중 50 ㎕의 6.7 nM 및 단계 희석의 BiSAb-VEGF H1RK-ANG-2, G6-31(양성 대조군) 및 BS3Ab-r347-Ang2(음성 대조군)를 2벌 중복하여 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척 완충제로 3회 세척하고, 그 후에, 50 ㎕의 1:5000 염소 항-인간 HRP IgG H+L(Jackson Immunoresearch)을 각각의 웰에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 50 ㎕의 TMB 용액(KPL)을 각각의 웰에 첨가하여 플레이트를 발색시키고, 그 후에 50 ㎕의 1 M 인산을 이용하여 반응을 중단시켰다. 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 플레이트를 450 nm에서 판독하였다. 도 14는 BiSAb-VEGF H1RK-ANG-2에 대한 대표적인 결과를 보여준다. BiSAb-VEGF H1RK-ANG-2는 양성 대조군 G6-31과 비교하여 VEGF189에 대해 5배 더 낮은 결합(EC50 0.057 nM vs 0.0096 nM)을 보여주었다.
실시예 9 - VEGF-ANG2 이중특이적 항체의 약효를 결정하기 위한 기능적 검정
BiSAb-VEGF H1RK-ANG-2를 기능적 바이오검정에서 스크리닝하여, 인간, 마우스 및 시노(cyno) 수용체를 갖는 세포주에서 pVEGFR2 및 pTie2를 감소시키는 능력을 결정하였다. Ad293-HuVEGFR2(Cl. E2), Hek293-Tie2, Ad293-muVEGFR2-muAng2 세포(Cl. D10), Ad293-cynoVEGFR2-cynoAng2 세포(Cl. SB5) 및 Ad293-cynoTie2 세포(Cl. D12)를 안정한 형질감염으로부터 발생시켰다. 세포를 100 ㎕ DMEM + 10% FBS(Life Technologies, 미국 캘리포니아주 칼즈배드 소재)와 함께 96-웰 폴리-D-라이신 조직 배양 플레이트(Costar, 미국 메사추세츠주 튜크스베리 소재)에 서브컨플루언시(subconfluency)에서 접종하고, 37℃ 및 5% CO2에서 밤새 인큐베이션하였다. 이튿날, 배지를 흡인하고, 50 ㎕ 기아(starvation) 배지(DMEM + 0.2% FBS + 0.1% BSA)로 대체하고, 세포를 인큐베이터에 밤새 되돌렸다. 24시간째에, 배지를 흡인하고, 2660 nM(2X 농도) 항체, BiSAb-VEGF H1RK-ANG-2 및 BS3Ab-HPV-r347 음성 대조군을 혈청 무함유 DMEM + 0.1% BSA에서 단계 희석시키고, 37℃에서 30분 동안 플레이트에 2벌 중복 첨가하였다. 그 후에, 1:1로 혼합된 50 ㎕의 12 ㎍/ml 인간, 마우스(R&D Systems) 또는 시노 Ang2(인-하우스 조제물) + 20 nM의 인간, 마우스(Peprotech, 미국 뉴저지주 록키힐 소재), 또는 시노(인-하우스 조제물) VEGF(4X)를 웰에 첨가하고, 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 그 후에, 플레이트를 37℃에서 추가의 7분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 디캔팅시키고, 프로테아제 및 포스파타제 억제제(Life Technologies, 미국 캘리포니아주 칼즈배드 소재)를 함유하는 55 ㎕ 빙냉 RIPA 용해(lysis) 완충제(Boston BioProducts, 미국 메사추세츠주 보스턴 소재)를 이용하여 웰을 용해시켰다. pVEGFR2 전체 세포 용해물 키트(Meso Scale Diagnostics, 미국 메릴랜드주 록빌 소재)를 사용하여 인간, 시노 및 뮤린 pVEGFR2를 검출하였다.
메조 스케일 다이아그노스틱스(MSD; Meso Scale Diagnostics) 플랫폼을 사용하여 개발된 프로토콜을 사용하여 인간 및 시노 pTie2를 결정하였다. 2 ㎍/mL의 Tie2 항체 클론 16(Abcam, 미국 메사추세츠주 캠브리지 소재)을 이용하여 MSD 고 결합(high bind) 플레이트를 밤새 코팅시켰다. 이튿날, 플레이트를 트리스(tris) 완충 식염수(TBS)로만 세척하고, TBS 중 3% MSD 블라커 A + 0.05% Tween 20(Sigma, 미국 미주리주 세인트루이스 소재)을 이용하여 실온에서 1시간 동안 회전 쉐이킹하면서 블로킹시켰다. TBS + 0.05% Tween 20으로 플레이트를 세척하고, 용해물을 플레이트에 첨가하고, 그 후에 실온에서 1시간 동안 회전 쉐이킹하면서 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고, 1 ㎍/ml의 항-인간 Tie2 항체(AF2720, R&D Systems, 미국 미네소타주 미네아폴리스 소재)를 실온에서 1시간 동안 회전 쉐이킹하면서 첨가하였다. 플레이트를 세척하고, 그 후에, 1 ㎍/ml 술포-태그 염소 항-토끼 2차 항체(MSD, 미국 메릴랜드주 록빌 소재)를 플레이트에 실온에서 1시간 동안 회전 쉐이킹하면서 첨가하였다. 플레이트를 세척하고, 판독 완충제 T(MSD, 미국 메릴랜드주 록빌 소재)를 첨가하고, 그 후에, Sector Imager 6000(MSD, 미국 메릴랜드주 록빌 소재)을 사용하여 플레이트를 즉시 판독하였다.
메조 스케일 다이아그노스틱스(MSD) 플랫폼을 사용하여 개발된 프로토콜을 사용하여 뮤린 pTie2를 결정하였다. MSD 스트렙타비딘 플레이트를 TBS 중 3% MSD 블라커 A + 0.05% Tween 20(Sigma, 미국 미주리주 세인트루이스 소재)을 이용하여 실온에서 1시간 동안 회전 쉐이킹하면서 블로킹시켰다. TBS + 0.05% Tween 20으로 플레이트를 세척하고, 그 후에, 블로킹 완충제 중 25 ㎕/웰의 2 ㎍/ml 비오틴 항-마우스 Tie2 항체(Biolegend# 124006)를 실온에서 1시간 동안 회전 쉐이킹하면서 인큐베이션하였다. 플레이트를 디캔팅시키고, 3회 세척하였다. 그 후에, 25 ㎕/웰의 용해물을 2벌 중복하여 1개 웰 당 첨가하고, 실온에서 2시간 동안 플레이트 쉐이커 상에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고, 그 후에, 25 ㎕의 술포-태그 PY20(MSD)을 1개 웰 당 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 플레이트 쉐이커 상에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고, 150 ㎕의 2X MSD 판독 완충제 T를 첨가하고, Sector Imager 6000(MSD, 미국 메릴랜드주 록빌 소재)을 사용하여 플레이트를 즉시 판독하였다.
pTie2 및 pVEGFR2에 대한 퍼센트 인산화를 식: [평균 RLU(시험 시료)/평균 RLU (항체 없음)] * 100에 의해 계산하였다. 대표적인 결과를 표 3에 제시한다. BiSAb-VEGF H1RK-ANG-2는 인간, 마우스 및 시노 pVEGFR2 및 pTie2를 강력하게 감소시켰으며, 이는, 2개 암 모두가 이중특이적 포맷에서 기능적임을 보여준다. BiSAb-VEGF H1RK-ANG-2의 항-ANG-2 활성은, BiSAb-VEGF H1RK-ANG-2의 scFV 항-ANG-2의 제조에 사용된 ANG-2 항체(MEDI3617)와 비교하였을 때 두드러지게 더 큰 활성을 보여주었다.
Figure pct00007
실시예 10 - BiSAb-VEGF H1RK-ANG-2의 생체내 활성
BiSAb-VEGF H1RK-ANG-2를, 종양 구획 내에서의 항-혈관신생을 예시하기 위해 BxPC3 종양의 캐스팅을 포함한 786-0 신세포암종 및 BxPC3 췌장암종 모델에서 효능에 대해 생체내에서 시험하였다. 또한, 망막 혈관형성 모델을 수행하여, BiSAb-VEGF H1RK-ANG-2의 활성을 더 나타내었다. 보다 더, 혈소판감소증의 모델을 마우스에서 수행하여, VEGF의 모든 동종형에 결합하는 항-VEGF 양성 대조군 항체(G6-31)와 비교하여 BiSAb-VEGF H1RK-ANG-2에서 더 적은 독성이 발생하는지 결정하였다. 마지막으로, 신장 병상을 평가하였다.
786-0 신세포암종 모델의 경우, 인간 신장암 세포주 786-0으로부터의 종양 단편을 누드 마우스의 우측 옆구리에 피하 이식하였다. 종양 부피가 대략 200 mm3에 도달한 후, 투약을 개시하였다. 마우스를 1주일에 2회 총 6회 투약 동안 치료하였다(축 상에서 삼각형). 분자량을 기초로, 용량을 정규화하였다. BiSAb-VEGF H1RK-ANG-2는 종양 성장을 감소시키는 데 있어서 ANG-2 항체(MEDI3617) 또는 VEGF 항체(Avastin®) 단독과 비교하여 더 효과적이었다. 원-웨이 ANOVA 분석 Graphpad Prism 버전 5.01(미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)에 의해 결정된 바와 같이 P-값은 0.03이다. 대표적인 데이터를 도 15에 제시한다.
BxPC3 췌장암종 모델의 경우, BxPC3 종양 단편을 암컷 SCID 마우스의 우측 옆구리에 피하 이식하였다. 종양 부피가 대략 200 mm3에 도달한 후, 투약을 개시하였다. 마우스를 1주일에 2회 총 6회 투약 동안 치료하였다(축 상에서 삼각형). 분자량을 기초로, 용량을 정규화하였다. BiSAb-VEGF H1RK-ANG-2는 종양 성장을 감소시키는 데 있어서 ANG-2 항체(MEDI3617) 또는 VEGF 항체(Avastin®) 단독과 비교하여 더 효과적이었다. 원-웨이 ANOVA 분석 Graphpad Prism 버전 5.01(미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)에 의해 결정된 바와 같이 P-값은 0.02이다. 대표적인 데이터를 도 16에 제시한다.
종양 부피 외에도, BxPC3 췌장암종 모델 연구로부터 종양을 사용하여 종양 맥관 구조를 평가하였다. 안락사 전 15분째에 마우스에게 헤파린을 투약하여, 혈액 응고를 예방하였다. 0.1 mM 소듐 니트로푸루시드 용액을 대략 6 mL/분의 속도로 관류시켰다. 8 mL의 라텍스, 10 mL의 희석제 및 900 uL의 큐어(cure)를 혼합함으로써 Microfil MV-122를 제조하였다. 혼합물이 침강된 후(대략 1분), 17 mL의 총 부피가 투여될 때까지 상기 혼합물을 2 mL/분의 속도로 관류시켰다. 60 내지 90분 후, 종양을 절개하고, 10% NBF에 24시간 동안 침지시켰다. 그 후에, 시료를 에탄올 구배(25% ETOH/PBS, 50% ETOH/PBS, 75% ETOH/PBS, 95% ETOH, 및 그 후에 100% ETOH)를 통해 각각의 구배 수준에서 24시간 동안 전이시켰다. 최종 인큐베이션 후, 시료를 메틸 살리실레이트에 침지시켜, 탈수된 종양 시료를 투명화(clear)시킨 후, 광학 현미경에 의해 이미징하였다. 마우스에서 BiSAb-VEGF H1RK-ANG-2를 이용하여 종양 맥관 구조를 감소시켰다. 대표적인 데이터를 도 17에 제시한다.
상기 기재된 모델 외에도, BiSAb-VEGF H1RK-ANG-2를 망막 혈관신생 모델에서 평가하였다. 이 모델을 사용하여, CD1 마우스에게 출생 시, 1일째, 3일째 및 5일째에 복강내 투약하였다. 8일째 후, 마우스를 마취시키고, 플루오레세인-표지 덱스트란을 주입하였다. 눈을 제거하고, 10% 포르말린으로 고정한 후, 플랫 마운트(flat mount)를 제조하였다. 플랫 마운트를 형광 현미경에 의해 검사하였다.
신생(neonatal) 망막 혈관신생은 2개의 과정, 즉, 시신경(도 18 도트-화살표)으로부터 망막 가장자리까지의 혈관 이동, 및 분지화로 구성된다. BiSAb-VEGF H1RK-ANG-2는, 존재하는 BiSAb-VEGF H1RK-ANG-2가 없을 때의 이동 정도와 비교하여, 감소된 혈관 이동을 나타내었다. 대표적인 결과를 도 18에 제시한다. BiSAb-VEGF H1RK-ANG-2는, 존재하는 BiSAb-VEGF H1RK-ANG-2가 없을 때의 분지화 정도와 비교하여, 감소된 혈관 분지화를 나타내었다. 대표적인 결과를 도 19에 제시한다.
혈소판감소증 모델의 경우, Meyer 등(문헌[J ThrombHaemost 7:171-81, 2009])으로부터 방법을 채택하였다. 간략하게는, 8 내지 16주령의 FC 감마 수용체 2A 유전자 이식 마우스에게, 예비혼합된 VEGF165, 0.6 단위 헤파린, 및 항체를 측면 꼬리 정맥 내로 주사하였다. 그 후에, 고통의 행동 징후에 대해 마우스를 관찰하고, 점수를 매겼다: (-) 멈추고, 모서리로부터 모서리까지 일정하게 이동하며, 정상적으로 숨을 쉼, (+) 무기력의 징후가 존재하고, 멈추고, 더 오랫동안 이동하며, 얕은 숨을 쉼, (++) 매우 무기력하고, 이동하는 것을 멈추고, 상자의 거의 한쪽 면에 머물러 있으며, 깊은 숨을 쉼, (+++) 심각한 혈전증성 사례-경련(twitching) 및 빙빙 돌기(twirling), (++++) 사망. BiSAb-VEGF H1RK-ANG-2는 항-VEGF 대조군(G6-31)과 비교하여 혈소판감소증을 감소시켰다. 대표적인 데이터를 표 4에 제시한다.
Figure pct00008
1개 그룹 당 4마리의 동물로부터의 신장을 과요오드산-쉬프(PAS; Periodic acid-Schiff)를 통한 염색에 의해 검사하였다. 14번의 치료 투약 후, PAS 염색을 사용하여 신장 병상을 검사하였다. BiSAb-VEGF H1RK-ANG-2와 비교하여 항-VEGF(G6-31) 치료된 동물에서, 증가된 혈관사이 바탕질 및 굵어진 모세관 고리(화살표)가 존재하였다. 대표적인 것을 표 5 및 도 20a 내지 20c에 제시한다.
Figure pct00009
원용에 의한 포함
특허, 특허 출원, 논문, 교재 등을 포함하여 본원에 인용된 모든 참조문헌들, 및 상기 참조문헌에서 인용된 참조문헌들은 이들이 이미 존재하지 않는 정도까지, 모든 목적을 위해 그 전체가 원용에 의해 본원에 포함된다.
등가사항
상기 기재된 명세서는 당업자가 구현예를 실시할 수 있기에 충분한 것으로 여겨진다. 그러나, 상기 내용이 문맥에서 아무리 상세히 나타날 수 있더라도, 구현예는 많은 방식으로 실시될 수 있고, 청구항은 이의 임의의 등가사항을 포함하는 것으로 이해될 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> MEDIMMUNE LIMITED <120> ANTI-VEGF-A AND ANTI-ANG2 ANTIBODIES AND USES THEREOF <130> ANGVE-105-WO-PCT <140> PCT/EP2017/071104 <141> 2017-08-22 <150> 62/378,388 <151> 2016-08-23 <160> 32 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 713 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 1 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Trp Tyr 20 25 30 Glu Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gly Trp Thr Met Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Pro Leu Tyr Ser Ser Asp Gly Leu Ser Ala Gly Asp Ile Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125 Ser Val Phe Pro 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aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttcac agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240 cctgaagatt ttgcagttta ctactgtcaa cagagttacc gcaccccttc cttcggccaa 300 gggacacgac tggagattaa acgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642 <210> 30 <211> 2139 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 30 gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60 tcttgcgctg cttccggatt cactttctct tggtacgaga tgtattgggt tcgccaagct 120 cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttct atctctcctt ctggtggctg gactatgtat 180 gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240 ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc gacccccttg 300 tatagcagtg acgggctttc ggcgggggat atctggggcc aagggacaat ggtcaccgtc 360 tcaagcgcgt cgaccaaggg cccatccgtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc 420 tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 480 gtgtcctgga actcaggcgc tctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 540 tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc 600 cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagagagtt 660 gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 720 gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 780 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 840 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 900 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 960 ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 1020 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtct acaccctgcc cccatcccgg 1080 gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 1140 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1200 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctatagca agctcaccgt ggacaagagc 1260 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1320 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaaggcg gagggggatc cggcggaggg 1380 ggctctgaga tcgtgctgac ccagagcccc ggcaccctga gcctgagccc tggcgagaga 1440 gccaccctga gctgccgggc cagccagtcc atcaccggca gctacctggc ttggtatcag 1500 cagaagcccg gacaggcccc cagactgctg atcaccggcg cttccagctg ggccaccggc 1560 atccccgaca gattcagcgg cagcggctcc ggcaccgact tcaccctgac catcagcaga 1620 ctggagcccg aggacttcgc cgtgtactac tgccagcagt acagcagcag ccccatcacc 1680 ttcggatgcg gcaccaggct ggagatcaag ggcggagggg gctctggggg agggggcagc 1740 ggcggcggag gatctggggg agggggcagc caggtgcagc tggtcgagtc tggcggcgga 1800 gtggtgcagc ccggcagaag cctgagactg agctgcgccg ccagcggctt caccttcacc 1860 aactacggca tgcactgggt ccgccaggcc cctggcaagt gcctggagtg ggtggccgtg 1920 atcagccacg acggcaacaa caagtactac gtggacagcg tgaagggcag attcaccatc 1980 agcagggaca acagcaagaa caccctgtac ctccagatga acagcctgag agccgaggac 2040 accgccgtgt actactgcgc cagagagggc atcgactttt ggagcggcct gaattggttc 2100 gacccctggg gccagggcac cctggtgacc gtgtccagc 2139 <210> 31 <211> 713 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 31 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Trp Tyr 20 25 30 Glu Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gly Trp Thr Met Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Pro Leu Tyr Ser Ser Asp Gly Leu Ser Ala Gly Asp Ile Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 130 135 140 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 180 185 190 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 195 200 205 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser 210 215 220 Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 225 230 235 240 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 245 250 255 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 260 265 270 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 275 280 285 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 290 295 300 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 305 310 315 320 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 325 330 335 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 340 345 350 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 355 360 365 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 370 375 380 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 385 390 395 400 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 405 410 415 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 420 425 430 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 435 440 445 Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile 450 455 460 Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg 465 470 475 480 Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Thr Gly Ser Tyr Leu 485 490 495 Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Thr 500 505 510 Gly Ala Ser Ser Trp Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 515 520 525 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu 530 535 540 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Ser Pro Ile Thr 545 550 555 560 Phe Gly Cys Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly 565 570 575 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val 580 585 590 Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu 595 600 605 Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met 610 615 620 His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val Ala Val 625 630 635 640 Ile Ser His Asp Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys Gly 645 650 655 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln 660 665 670 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 675 680 685 Glu Gly Ile Asp Phe Trp Ser Gly Leu Asn Trp Phe Asp Pro Trp Gly 690 695 700 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 705 710 <210> 32 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial 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180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330

Claims (11)

  1. 중쇄 상보성 결정 영역 1 내지 3(HCDR1, HCDR2 및 HCDR3) 및 경쇄 상보성 결정 영역 1 내지 3(LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)을 포함하는 제1 결합 도메인, 및 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 및 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 제2 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항체로서, 여기서, 제1 결합 도메인의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 및 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 SEQ ID NO: 17 내지 22를 각각 포함하고, 제2 결합 도메인의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 및 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 SEQ ID NO: 23 내지 28을 각각 포함하는, 이중특이적 항체.
  2. 제1항에 있어서, 제1 결합 도메인이 SEQ ID NO: 3 및 9를 각각 포함하는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 제2 결합 도메인이 SEQ ID NO: 5 및 11을 각각 포함하는 중쇄 및 경쇄를 포함하는, 이중특이적 항체.
  3. 제1항에 있어서, 중쇄 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 1을 포함하고, 경쇄 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 7을 포함하는, 이중특이적 항체.
  4. 제1항에 있어서, 이중특이적 항체가 파트 VH-CH1-H-CH2-CH3, VL-CL, 및 하나 이상의 scFv, L1, 또는 선택적으로 L2를 갖는 식을 포함하며, 개별 파트는, VH는 중쇄 가변 도메인이며; CH1은 중쇄 불변 영역 도메인 1이며; H는 힌지 영역이며; CH2는 중쇄 불변 영역 도메인 2이며; CH3은 중쇄 불변 영역 도메인 3이며; VL은 가변 경쇄 도메인이며; CL은 경쇄 불변 도메인이며; L1은 링커이고; L2는 L1과 독립적인 링커이며, 상기 식은 하기의 식일 수 있는, 이중특이적 항체:
    a. VH-CH1-CH2-CH3 및 scFv-L1-VL-CL;
    b. scFv-L1-VH-CH1-CH2-CH3 및 VL-CL;
    c. VH-CH1-CH2-CH3-L1-scFv 및 VL-CL;
    d. VH-CH1-CH2-CH3-L1-scFv-L2 및 VL-CL, 여기서, L1 및 L2는 CH3에 공유 결합됨;
    e. VH-CH1-L1-scFv-L2-CH2-CH3 및 VL-CL, 중쇄는 힌지 영역을 함유하거나 힌지리스일 수 있음.
  5. 제4항에 있어서, 식 VH-CH1-CH2-CH3-L1-scFv 및 VL-CL을 포함하는, 이중특이적 항체.
  6. 제5항에 있어서, scFv가 SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 포함하는, 이중특이적 항체.
  7. 제1항의 이중특이적 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 핵산 서열.
  8. 제7항의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 벡터.
  9. 제8항의 벡터를 포함하는, 세포.
  10. 제9항의 벡터를 포함하는 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 제1항의 이중특이적 항체를 제조하는 방법.
  11. 제1항의 이중특이적 항체를 대상체에게 제공하는 단계를 포함하는, 혈관신생을 감소시키는 방법.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024085606A1 (ko) * 2022-10-20 2024-04-25 (주)니오테스바이오 인간 안지오포이에틴-2에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체 및 그 응용

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20220185875A1 (en) * 2019-03-18 2022-06-16 Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. Bispecific antibody specifically bound to vegf and ang2
EP4183802A1 (en) * 2020-06-22 2023-05-24 Innovent Biologics (Suzhou) Co., Ltd. Anti-ang-2 antibody and use thereof
KR20230061458A (ko) 2020-09-04 2023-05-08 에프. 호프만-라 로슈 아게 Vegf-a 및 ang2에 결합하는 항체 및 사용 방법
KR20230162791A (ko) * 2021-03-30 2023-11-28 에이비프로 코퍼레이션 항-ANG2 x VEGF 다중특이적 항체를 사용하여 맥락막 혈관신생을 치료하는 방법
CN116265487A (zh) * 2021-12-16 2023-06-20 三优生物医药(上海)有限公司 抗ang2-vegf双特异性抗体及其用途
CN116925234B (zh) * 2022-04-02 2024-05-31 合肥星眸生物科技有限公司 一种编码抗vegf-a和ang-2双特异性抗体的aav载体
US11883030B2 (en) 2022-04-29 2024-01-30 inQB8 Medical Technologies, LLC Systems, devices, and methods for controllably and selectively occluding, restricting, and diverting flow within a patient's vasculature
WO2023212361A1 (en) 2022-04-29 2023-11-02 inQB8 Medical Technologies, LLC Systems, devices, and methods for controllably and selectively occluding, restricting, and diverting flow within a patient's vasculature
CN116462768B (zh) * 2023-06-13 2023-09-22 浙江时迈药业有限公司 针对folr1的双特异性抗体及其用途

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20150063847A (ko) * 2013-12-02 2015-06-10 삼성전자주식회사 항 VEGF-A/항 Ang2 이중 특이 항체
WO2015171747A1 (en) * 2014-05-07 2015-11-12 Medimmune, Llc Methods of using anti-ang2 antibodies

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5981216A (en) 1985-04-01 1999-11-09 Alusuisse Holdings A.G. Transformed myeloma cell-line and a process for the expression of a gene coding for a eukaryotic polypeptide employing same
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
US5814464A (en) 1994-10-07 1998-09-29 Regeneron Pharma Nucleic acids encoding TIE-2 ligand-2
US5650490A (en) 1994-10-07 1997-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Tie-2 ligand 2
KR20030036238A (ko) 2000-06-23 2003-05-09 쉐링 악티엔게젤샤프트 ＶＥＧＦ/ＶＥＧＦ 수용체 및 안지오포이에틴/Ｔｉｅ수용체의 기능을 방해하는 조합 제제 및 조성물과 이들의용도 (Ⅱ)
US7029872B2 (en) 2000-06-28 2006-04-18 Glycofi, Inc Methods for producing modified glycoproteins
US7521053B2 (en) 2001-10-11 2009-04-21 Amgen Inc. Angiopoietin-2 specific binding agents
CN105085678B (zh) * 2004-12-21 2019-05-07 阿斯利康公司 血管生成素-2的抗体及其应用
CA2633211A1 (en) * 2005-12-15 2007-06-21 Astrazeneca Ab Combination of angiopoietin-2 antagonist and of vegf-a, kdr and/or flt1 antagonist for treating cancer
MX2008009220A (es) 2006-01-17 2008-10-10 Biolex Therapeutics Inc Composiciones y metodos para la humanizacion y optimizacion de n-glicanos en plantas.
AR059066A1 (es) 2006-01-27 2008-03-12 Amgen Inc Combinaciones del inhibidor de la angiopoyetina -2 (ang2) y el inhibidor del factor de crecimiento endotelial vascular (vegf)
EP1995309A1 (en) 2007-05-21 2008-11-26 Vivalis Recombinant protein production in avian EBx® cells
US8216571B2 (en) 2007-10-22 2012-07-10 Schering Corporation Fully human anti-VEGF antibodies and methods of using
JP5596559B2 (ja) 2008-01-28 2014-09-24 メディミューン リミテッド 安定化アンジオポエチン２抗体とその用途
US8268314B2 (en) * 2008-10-08 2012-09-18 Hoffmann-La Roche Inc. Bispecific anti-VEGF/anti-ANG-2 antibodies
TWI426920B (zh) * 2010-03-26 2014-02-21 Hoffmann La Roche 雙專一性、雙價抗－ｖｅｇｆ／抗－ａｎｇ－２抗體
US9527925B2 (en) 2011-04-01 2016-12-27 Boehringer Ingelheim International Gmbh Bispecific binding molecules binding to VEGF and ANG2
CN102250248A (zh) * 2011-06-15 2011-11-23 常州亚当生物技术有限公司 抗vegf/ang2双特异性抗体及其应用
WO2013070565A1 (en) 2011-11-07 2013-05-16 Medimmune, Llc Multispecific and multivalent binding proteins and uses thereof
HRP20211641T1 (hr) * 2012-07-13 2022-02-04 Roche Glycart Ag Bispecifična protutijela anti-vegf/anti-ang-2 i njihova primjena u liječenju vaskularnih očnih bolesti
EP3218399A1 (en) * 2014-11-10 2017-09-20 F. Hoffmann-La Roche AG Bispecific antibodies and methods of use in ophthalmology
AR103477A1 (es) * 2015-01-28 2017-05-10 Lilly Co Eli Compuestos de vegfa / ang2

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20150063847A (ko) * 2013-12-02 2015-06-10 삼성전자주식회사 항 VEGF-A/항 Ang2 이중 특이 항체
WO2015171747A1 (en) * 2014-05-07 2015-11-12 Medimmune, Llc Methods of using anti-ang2 antibodies

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024085606A1 (ko) * 2022-10-20 2024-04-25 (주)니오테스바이오 인간 안지오포이에틴-2에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체 및 그 응용

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