KR20190032227A

KR20190032227A - 액상 플라즈마를 포함하는 피부 진정용 조성물

Info

Publication number: KR20190032227A
Application number: KR1020180111159A
Authority: KR
Inventors: 김철호
Original assignee: 아주대학교산학협력단
Priority date: 2017-09-18
Filing date: 2018-09-17
Publication date: 2019-03-27
Also published as: US11510853B2; WO2019054836A2; US20200261325A1; KR102120552B1; WO2019054836A3

Abstract

본 발명은 부작용의 위험으로부터 안전한 피부 진정용 조성물을 제공하고자 하는 것으로, 액상 플라즈마를 포함하는 피부 진정용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 액상 플라즈마는 액상 물질에 순수한 에너지로서 플라즈마를 조사한 것으로, 화학 물질에 민감한 피부에 부작용의 위험 없이 이용 가능하고, 자외선으로 인한 피부염증 또는 광노화의 예방 또는 치료 효과가 현저하므로, 미용 및 의학 분야에서 크게 이용될 것으로 기대된다.

Description

액상 플라즈마를 포함하는 피부 진정용 조성물{Composition for skin-soothing comprising liquid type plasma}

본 발명은 액상 플라즈마를 포함하는 피부 진정용 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 고밀도 고에너지 플라즈마를 액체 속에서 발생시켜 제조한 “액상 플라즈마”를 유효성분으로 포함하는 피부 진정용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

피부에 노화가 일어나는 현상에는 시간에 따라 발생되는 자연노화와 외부환경에 의한 노화가 포함된다. 피부의 경우 외부환경 중 가장 중요한 것은 태양광이므로 이에 의한 노화현상을 특히 광노화라고 한다. 태양광 중에서 피부에 손상을 일으키는 광선은 자외선인데, 파장이 짧은 자외선 B(280~320 ㎚)가 피부손상의 주원인으로 알려져 있다. 자와선에 오랫동안 반복 노출되면 피부는 탄력을 잃고 주름이 생기며 거칠어지고 노인성 반점이 생기는 등의 변화를 보인다(J. Invest Dermatol.m 1979, 73; 47~53). 광노화된 피부에서는 표피가 두꺼워지고, 진피 상층부에 많은 양의 비정상적인 엘라스틴(elastin)이 축적되고, 진피 콜라겐(collagen)의 양과 구조의 손상이 나타나며 무코다당류(mucipolysaccharide)가 증가한다. 또한 비만세포(mast cell)가 증가하고 조직내 백혈구의 수가 증가하는 등 염증성 반응도 나타난다(J. Am. Acad. dermatol., 1989; 610~613 및 Photochem. Photobiol., 1995; 62; 348~352).

최근, 미용에 대한 관심이 높아짐에 따라, 광노화를 예방하고자 하는 의학조성물 또는 화장료조성물이 활발하게 연구되고 있다. 그러나 대부분의 조성물이 신규 화학물질의 발견 또는 조합에 관한 것이므로, 민감한 피부에 자극 요인로 작용하는 문제점을 가지고 있다. 일례로서, 히드록시산(Hydroxy Acid) 및 레티노이드는 광손상된 또는 자연적으로 노화된 피부의 외모, 피부 광택, 노화 점 치료 등에서의 개선과 같은 이점을 제공하는 것으로 증명되었으나, 이들 성분을 고농도로 적용시 때로 피부 자극, 예를 들면, 도포시 피부 발적 및 찌르는 듯한 감각 등의 부작용이 있는 것으로 알려져 있다.

따라서 본 발명은 부작용의 위험으로부터 안전한 피부 진정용 조성물을 제공하고자 하는것으로, 액상 플라즈마를 포함하는 자외선에 의해서 유발된 피부염증의 진정용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 액상 플라즈마는 액상 물질에 순수한 에너지로서 플라즈마를 조사한 것으로, 화학 물질에 민감한 피부에 부작용의 위험 없이 이용 가능하고, 자외선으로 인한 피부염증 또는 광노화의 예방 또는 치료 효과가 현저하므로, 미용 및 의학 분야에서 크게 이용될 것으로 기대된다.

본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 액상 플라즈마를 포함하는 피부 진정용 조성물에 관한 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

이하, 본원에 기재된 다양한 구체예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물, 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구체예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구체예" 또는 "구체예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구체예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구체예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구체예에서" 또는 "구체예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구체예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구체예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.

본 명세서에 있어서 "광노화(Photo Aging)"란, 태양광선에 의해 피부가 장기간 노출될 시 발생하는 피부 노화 증세를 의미한다. 특히, 광노화는 안면부 노화의 80%를 차지하는 것으로 알려져 있다. 피부는 태양광 중 '자외선'에 의해 많은 영향을 받는데, 자외선은 콜라겐 합성은 줄이고 분해를 증가시켜 피부 노화를 촉진시킨다. 자외선 중에서도 280~320nm 파장대의 '자외선 B'는 320~400nm의 '자외선 A'에 비해 일상 화상(sunburn)을 발생시키는 능력이 약 1,000배나 더 강한 것으로 알려져 있다. 자외선 A도 자외선 B에 비해서는 상대적으로 약하지만 피부 홍반 반응을 일으키는데 관여한다. 특히 태양의 지표각이 커지는 시간대(정오에서 오후 두 시 사이)로 갈수록 자외선 B의 양은 줄어들고 자외선 A가 증가하면서 햇빛에 의해 발생하는 피부 붉어짐 현상에 점점 큰 영향을 미친다. 피부가 자외선에 장시간 노출되면 광노화로 인해 세포 또는 조직 내 산화가 항산화 체계의 균형을 무너뜨려 산화 스트레스(oxidative stress)가 발생하게 된다. 광노화의 임상적 증상으로는 주름살이 증가하거나, 기미, 주근깨, 검버섯 등의 피부색조 침작이 증가하거나, 피부건조증이 증가하거나, 피부 탄력이 감소하는 것 등이 있고, 드물게 종양(흑색종)으로 발전하기도 한다.

본 발명의 일 구체예에서 "비열 대기압 플라즈마(non-thermal atmospheric pressure plasma)"란, 저온(cold) 또는 비평형(non-equlibrium) 플라즈마라고도 명명되며 열 플라즈마(thermal plasma)에 반대되는 개념이다. 비교적 낮은 압력 하에서 낮은 에너지를 가지고 쉽게 만들어질 수 있으며, 반응 가스의 온도가 대기의 온도와 비슷하지만 전자의 온도만 그보다 약 10 내지 100 배 높은 상태에 있는 특징이 있다. 상압이나 고압에서의 비열 대기압 플라즈마는 화학적으로 반응성이 매우 큰 반응물을 생성하여, 일반적인 방법으로는 실현되기 어렵거나 불가능한 화학반응을 촉진시킬 수 있는 특성을 가지고 있다. 본 발명에 있어서 플라즈마 발생 장치는 비열 대기압 플라즈마를 발생시킬 수 있는 것이라면 특별히 제한되지 않고 사용 가능하다. 비열 대기압 플라즈마 발생에 이용되는 캐리어 가스는 바람직하게는 산소, 질소, 헬륨, 및 아르곤으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것이고, 더욱 바람직하게는 질소이나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체예에서 “액상 플라즈마(Liquid type plasma, LTP)”란, 고밀도 고에너지 플라즈마를 액체 속에서 발생시키는 것을 의미하며, 대기압의 상온 비열 플라즈마(nonthermal plasma, NTP)에 노출시켜 제조될 수 있다. 상기 용어 “액상 플라즈마”는 용어 “플라즈마 처리된 액상 물질(plasma-conditioned liquid material)"과 상호교환적으로 사용될 수 있고, 상기의 “액상 물질”은 액상 형태의 물질은 제한없이 사용 가능하나, 바람직하게는 물, 식염수, 완충액, 또는 배지이고, 가장 바람직하게는 배지이다.

본 발명의 액상 플라즈마는 액상 조성물의 형태로 공급 가능하므로 유통 및 휴대가 편리하고, 보습이 중요한 피부 질환에 있어서 보습과 치료를 동시에 제공하는 것이 가능하다. 또한, 피부 환부에 직접 플라즈마를 처리하는 것보다 세포 손상이 적고, 사용자의 잘못된 기기 조작에 의한 화상 등 피부 손상의 위험이 전혀 없으며, 넓고 굴곡된 면적에도 균일하게 도포 가능한 장점이 있다.

본 발명의 일 구체예에서 “배지(culture media)”란, 인 비트로(in vitro)에서 세포 성장 및 생존을 지지할 수 있게 하는 배지를 의미하고, 세포의 배양에 적절한 당 분야에서 사용되는 통상의 배지를 모두 포함한다. 세포의 종류에 따라 배지와 배양조건을 선택할 수 있다. 세포의 배양에 사용되는 기본배지는 바람직하게는 세포 배양 최소 배지(cell culture minimum medium: CCMM)로, 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다. 이런 세포 배양 기본 배지에는 예를 들면, DMEM(Dulbeco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI1640, F-10, F-12, GMEM(Glasgow's Minimal essential Medium), Iscove's Modified Dulbecco's Medium 등이 있으나, 이로 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구체예에서 "치료”란, 본 발명에 따른 액상 플라즈마를 이용하여 광노화 또는 이로 인한 질환의 증세를 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다. 본원이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 대한의학협회 등에서 제시된 자료를 참조하여 광노와의 정확한 기준을 파악하고, 개선, 향상 및 치료된 정도를 판단할 수 있을 것이다.

본 발명의 일 구체예에서 “예방”이란, 본 발명에 따른 액상 플라즈마를 이용하여 광노화 또는 이로 인한 다른 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 광노화에 치료효과가 있는 본원의 조성물은 광노화의 초기증상 또는 증상이 나타나기 전에 본 발명에 따른 액상 플라즈마를 이용하여 이러한 질환을 예방할 수 있다는 것은 당업자에게 자명할 것이다.

본 명세서에 있어서 "약학조성물"이란, 특정한 목적을 위해 투여되는 조성물을 의미한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 약학조성물은 플라즈마를 액상 물질에 조사하여 제조한 액상 플라즈마를 유효성분으로 포함하는 것이며, 이에 관여하는 단백질 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기의 "약학적 허용될 가능한" 담체 또는 부형제는 정부의 규제부에 의해 승인된 것이나, 또는 척추 동물, 그리고 보다 특별하게는 인간에게 사용을 위한 정부 또는 기타 일반적으로 승인된 약전에서 리스트된 것을 의미한다.

비경구적인 투여를 위해 본 발명의 약학조성물은 유성 또는 수성 담체에 있는 현탁액, 용액 또는 에멀젼의 형태로 될 수 있고, 고체 또는 반고체의 형태로 제조될 수 있다. 또한, 본 발명의 약학조성물은 현탁제, 안정화제, 용해제 및/또는 분산제와 같은 제형화제를 포함할 수 있고, 멸균될 수 있다. 상기 약학조성물은 제조 및 저장의 조건 하에서 안정할 수 있고, 세균이나 곰팡이와 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 약학조성물은 사용 전에 적절한 담체와 재구성을 위해 멸균 분말 형태일 수 있다. 약학조성물은 단위-복용량 형태로, 마이크로니들 패치에, 앰플에, 또는 기타 단위-복용량 용기에, 또는 다-복용량 용기에 존재할 수 있다. 대안적으로, 약학적 조성물은 단지 멸균 액체 담체, 예를 들어 사용 바로 전에 주사용 물의 부가함을 요하는 동결-건조된(냉동건조) 상태로 보관될 수 있다. 즉시 주사용액 및 현탁액은 멸균 분말, 그래뉼 또는 타블렛으로 제조될 수 있다.

몇몇 비 제한적인 실시형태에 있어서, 본 발명의 약학조성물은 제형화되어 질 수 있고, 또는 액체 속에 미립구의 형태로 포함될 수 있다. 어떤 비 제한적인 실시형태에 있어서, 본 발명의 약학조성물은 이들의 약학적으로 허용될 수 있는 화합물 및/또는 혼합물을 0.001 내지 100,000 U/kg 사이의 농도로 포함할 수 있다. 또한 어떤 비 제한적인 실시형태에 있어서, 본 발명의 약학조성물은 적절한 부형제는 보존제, 현탁제, 추가적인 안정화제, 염료, 완충제, 항균제, 항진균제, 및 등장화제, 예를 들어, 설탕 또는 염화나트륨을 포함할 수 있다. 여기서 사용된 것으로, 용어 "안정화제"는 보존 수명을 증가하기 위해 본 발명의 약학조성물에 선택적으로 사용된 화합물을 언급한다. 비-제한적인 실시에 있어서, 안정화제는 당, 아미노산, 또는 폴리머일 수 있다. 또한 본 발명의 약학조성물은 하나 또는 그 이상의 약학적으로 허용될 수 있는 담체를 포함할 수 있고, 상기 담체는 용매 또는 분산 배지일 수 있다. 약학적으로 허용될 수 있는 담체의 비-제한적인 예는 물, 식염수, 에탄올, 폴리올 (예, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜), 오일, 및 이들의 적절한 혼합물을 포함한다. 본 발명의 약학조성물에 적용되는 멸균 기술의 비-제한적인 예는 세균-억제 필터를 통한 여과, 터미날 멸균화, 멸균 제제의 합체, 방사선 조사, 멸균 가스 조사, 가열, 진공 건조 및 동결 건조를 포함한다.

본 명세서에 있어서 “투여”란, 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 경구 투여, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여, 강내 투여, 복강 내 투여, 경막 내 투여가 이루어질 수 있으나, 본 발명의 약학조성물은 피부 위에 도포하거나 피하 또는 피내에 주사하는 형태로 제공되는 것이 가장 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 치료 방법은 상기 약학조성물을 약제학적 유효량으로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명에서 유효량은 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, (a) 플라즈마 발생 장치에 캐리어 가스를 충진하는 단계; (b) 상기 플라즈마 발생 장치에 1kV 내지 30kV의 전압 및 10 내지 30kHz의 주파수를 공급하여 플라즈마를 발생시키는 단계; 및 (c) 상기 발생된 플라즈마를 액상 물질에 조사하는 단계를 포함하는 피부 진정용 액상 플라즈마의 제조 방법을 제공하고, 상기 (a) 단계에서의 캐리어 가스는 질소, 헬륨, 아르곤, 및 산소로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 피부 진정용 액상 플라즈마의 제조 방법을 제공하며, 상기 캐리어 가스는 질소인 피부 진정용 액상 플라즈마의 제조 방법을 제공하며, 상기 (c) 단계에서의 조사는 액상 물질의 표면으로부터 0.1cm 내지 15cm 떨어진 거리에서 1㎖당 10 내지 120 초간 수행하는 것을 특징으로 하는 것인 피부 진정용 액상 플라즈마의 제조 방법을 제공하며, 상기 (c) 단계에서의 액상 물질은 물, 식염수, 완충액, 또는 배지인 피부 진정용 액상 플라즈마의 제조 방법을 제공하며, 상기 피부 진정은 자외선 손상 피부에 대한 진정인 피부 진정용 액상 플라즈마의 제조 방법을 제공한다.

상기 단계 (b)에서 1kV 내지 30kV의 전압 및 10 내지 30kHz의 주파수를 공급하여 플라즈마를 발생시키는 것이 바람직하며, 상기 범위를 벗어나는 경우, 세포독성 혹은 효과의 저하와 같은 문제가 발생할 수 있다.

또한 상기 단계 (c)에서 조사는 액상 물질의 표면으로부터 0.1cm 내지 15cm 떨어진 거리에서 1㎖당 10 내지 120 초간 수행하는 것이 바람직하며, 상기 범위를 벗어나는 경우 효과가 미미해지는 문제가 발생할 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에서, 상기 중 어느 하나 이상의 방법으로 제조된 액상 플라즈마를 포함하는 피부 진정용 화장료조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 중 어느 하나 이상의 방법으로 제조된 액상 플라즈마를 포함하는 광노화 예방 또는 개선용 화장료조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 중 어느 하나 이상의 방법으로 제조된 액상 플라즈마를 포함하는 자외선에 의한 피부 손상의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공하고, 상기 피부 손상은 피부 염증, 피부 주름, 피부 건조증, 피부 탄력 감소, 피부 각질 증가, 홍반, 미립종, 기미, 주근깨, 검버섯, 및 흑색종으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나인 자외선에 의한 피부 손상의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

이하 상기 본 발명을 단계별로 상세히 설명한다.

본 발명은 액상 플라즈마를 포함하는 피부 진정용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 액상 플라즈마는 화학 물질에 민감한 피부에 부작용의 위험 없이 이용 가능하고, 자외선으로 인한 피부염증 또는 광노화의 예방 또는 치료 효과가 현저하므로, 미용 및 의학 분야에서 크게 이용될 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른, 자외선 자극 전후에 액상 플라즈마 처리한 표피세포에서 ERK 및 p38 의 활성을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른, 자외선 자극 전후에 액상 플라즈마 처리한 표피세포에서 NF-kB 의 활성을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른, 자외선 자극 전후에 액상 플라즈마 처리한 표피세포에서 EGFR 의 활성을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른, 자외선 자극 전후에 액상 플라즈마 처리한 표피세포에서 TNF-α 및 IL-6 의 발현량을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른, 자외선 자극 전후에 액상 플라즈마(아르곤 플라즈마) 처리한 표피세포에서 IL-1β, IL-6 및 IL-8 발현량을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른, 자외선 자극 전후에 액상 플라즈마(아르곤 플라즈마) 처리한 표피세포에서 p-NFkB, p-ERK 및 IL-1β의 활성을 확인한 결과를 나타낸 도이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 액상 플라즈마의 제조

액상 플라즈마는 유전체로 석영 또는 세라믹 관을 구비하고, 다중 노즐의 비열 플라즈마 소스를 구비하는 대기압 플라즈마 발생 장치를 이용하여 제조하였다. 상기 장치의 가스 공급 노즐 직경은 3mm 미만이고, 의학적 연구를 위해 1인치 크기의 균일한 플라즈마를 발생시키도록 설계되었다. 상기 장치에 캐리어 가스로서 질소(N₂)를 10L/min 유량으로 공급하고, DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium) 세포 배지가 분주된 배양 접시(12-웰 플레이트, TPP, Renner, Dannstadt, Germany)의 바닥 표면으로부터 4cm 이격된 거리에서 1㎖당 60초간 플라즈마를 처리하는 방법으로 액상 플라즈마를 제조하였다. 이 때, 플라즈마 장치의 전원 공급 장치 사양은 전압 1 내지 30 kV, 및 평균 주파수 10 내지 30 kHz인 것이 바람직하고, 가장 바람직하게는 전압 15 kV, 및 동작 주파수 15 kHz인 것이나, 이에 한정하는 것은 아니다.

실시예 2. 사람 유래 피부 표피세포에 대한 자외선 처리

사람 유래의 피부 표피세포(immortalized human keratinocyte cell line, HaCaT)는 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank)으로부터 분양 받아, 10 부피% FBS, 및 1 부피% 항생제/항균제가 포함된 DMEM 배지로 배양하였다.

자외선 처리를 위해서, HaCaT 세포를 100-mm 플레이트에 1 X 10⁶ 개 파종하고, 24 시간 후 세포를 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척하고, 1 % FBS를 함유하는 배지로 교체 하였다. 24 시간 후, 세포를 최소양의 PBS(~ 2 ml)에서 20 mJ/cm², 또는 100 mJ/cm² UVB(280-320nm) 조사하고, 조사 직후 DMEM 배양 배지로 15분간 배양하고, 웨스턴 블랏 분석을 위해 수득하였다. 액상 플라즈마 실험군은 UVB 조사 1시간 전에 세포를 LTP로 1시간 동안 선처리하였고, UVB 조사 직후에 DMEM 배양 배지 대신 LTP로 15분간 배양하였다.

실시예 3. 자외선에 손상된 표피세포에 대한 액상 플라즈마(질소 플라즈마) 효과 확인

20 mJ/cm² 자외선 처리 후 15분간 추가 배양된 세포를 RIPA 완충액(150 mM NaCl, 1.0% Nonidet-P 40, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% sodium dodecyl sulfate, 50 mM Tris, pH 8.0, and a protease inhibitor cocktail, 및 PhoSTOP(Roche Molecular Biochemicals, Basel, Switzerland))으로 용해하고, 단백질 용해액 10 μg을 10 % SDS/PAGE 겔에서 단백질 분리한 뒤, PVDF 막(Amersham, Arlington Heights, IL, USA)으로 전이하였다. 단백질 전이된 PVDF 막에 pERK, ERK, p-p38, p38, p-NFκB, NFκB, p-EGFR, EGFR, 또는 GAPDH (Cell signaling Technology) 항체를 반응시키고, 각 신호의 발현 정도를 ECL 반응액(ECL　 Western Blotting Detection Reagents, Amersham)으로 측정하였다. 각 신호의 발현량은 GAPDH 신호를 기준으로 재산정하였다. 상기 결과를 도 1 내지 도 3에 나타내었다.

실험 결과, 자외선 처리 전후에 액상 플라즈마를 처리한 그룹은 자외선 처리만 수행한 대조군에 비하여 pERK, p-p38, p-NFκB, 및 p-EGFR의 발현이 감소하는 것으로 나타났다. NF-kB는 염증을 일으키는 유전자 발현 기구를 작동시켜 면역반응이나 염증반응에 관여하는 TNF(tumor necrosis factor), IL-6(interleukin-6) 분자 등의 발현을 야기하는 전사인자로 알려져 있다. 따라서, 자외선 손상 전후에 액상 플라즈마를 처리한 세포에서 액상 플라즈마를 처리하지 않은 대조군에 비하여 NF-kB를 비롯한 ERK, p38, 및 EGFR의 인산화가 감소하는 것은 피부 손상에 의한 염증성 반응이 감소되는 효과인 것으로 이해할 수 있다.

또한 20 mJ/cm² 자외선 처리 후 4시간 추가 배양된 세포의 TNF-α 와 IL-6(인터루킨-6) 유전자 발현량을 qPCR로 확인하였다. TNF-α와 IL-6는 염증성 병인에 관여하는 것으로 알려져 있다. TNF-α, IL-6, 및 GAPDH 의 프라이머 세트는 시판되는 것을 구매하여 사용하였고(Qiagen, Hilden, Germany), TNF-α 와 IL-6 의 GAPDH 신호를 기준으로 재산정하였다. 상기 결과를 도 4에 나타내었다.

실험 결과, 자외선 처리 전후에 액상 플라즈마를 처리한 그룹은 자외선 처리만 수행한 대조군에 비하여 TNF-α와 IL-6 발현이 현저하게 감소되는 것을 확인하였다.

실시예 4. 자외선에 손상된 표피세포에 대한 액상 플라즈마(아르곤 플라즈마) 효과 확인

캐리어 가스로서 아르곤을 공급한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법을 적용하여 액상 플라즈마를 제조하고 자외선에 손상된 표피세포에 대한 효과를 분석하였다. 도 5는 자외선 자극 전후에 액상 플라즈마(아르곤 플라즈마) 처리한 표피세포(HaCaT 세포)에서 IL-1β, IL-6 및 IL-8 발현량을 qPCR 실험으로 확인한 결과를 나타낸 것이다. 전사체의 발현양을 조사하기 위해 표피세포를 20 mJ/cm² 자외선 처리 후 4시간 추가 배양된 세포의 IL-1β, IL-6 와 IL-8 유전자 발현량을 qPCR로 확인하였다. IL-1β, IL-6, IL-8 및 GAPDH 의 프라이머 세트는 시판되는 것을 구매하여 사용하였고(Qiagen, Hilden, Germany), IL-1β, IL-8 와 IL-6 의 발현양은 18s RNA 양을 기준으로 재산정하여 계산하였다. 실험결과, 자외선 자극 (UVB, 20mJ/cm²) 전후에 아르곤 플라즈마를 처리한 그룹은 자외선 처리만을 수행한 그룹에 비해 전염증성 사이토카인(proinflammatory cytokine)에 해당하는 IL-1β, IL-6 및 IL-8 발현이 현저하게 감소되는 것으로 확인되었다.

도 6은 자외선 자극 전후에 액상 플라즈마(아르곤 플라즈마) 처리한 표피세포(HaCaT 세포)에서 p-NFkB, p-ERK 및 IL-1β의 활성을 확인한 결과를 나타낸 것이다. 실험은 20 mJ/cm² 자외선 처리 후 15분간 혹은 4시간 (IL-1β) 추가 배양된 세포를 RIPA 완충액(150 mM NaCl, 1.0% Nonidet-P 40, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% sodium dodecyl sulfate, 50 mM Tris, pH 8.0, and a protease inhibitor cocktail, 및 PhoSTOP(Roche Molecular Biochemicals, Basel, Switzerland))으로 용해하고, 단백질 용해액 10 μg을 10 % SDS/PAGE 겔에서 단백질을 분리한 뒤, PVDF 막(Amersham, Arlington Heights, IL, USA)으로 전이하였다. 단백질 전이된 PVDF 막에 pERK, ERK, p-p38, p38, p-NFκB, NFκB, p-EGFR, EGFR, 또는 GAPDH (Cell signaling Technology) 항체를 반응시키고, 각 신호의 발현 정도를 ECL 반응액(ECL　 Western Blotting Detection Reagents, Amersham)으로 측정하였다. 각 신호의 발현량은 GAPDH 신호를 기준으로 재산정하였다. 실험결과, 자외선 자극 (UVB, 20mJ/cm²) 전후에 아르곤 플라즈마를 처리한 그룹은 자외선 처리만을 수행한 그룹에 비해 자외선 자극 (UVB, 20mJ/cm²) 전후에 액상 플라즈마(아르곤 플라즈마) 처리한 표피세포에서 피부 염증 분자(skin inflammatory molecules)에 해당하는 p-NF-kB 및 p-ERK의 활성이 감소하고, 염증성 사이토카인(proinflammatory cytokine)에 해당하는 IL-1β의 생성이 감소하는 것으로 확인되었다.

상기 도 1 내지 도 6의 결과로부터 자외선 손상 전후에 피부에 액상 플라즈마를 처리하는 것이 자외선에 의한 피부염증 또는 광노화를 예방 또는 치료하는데 현저한 효과가 있음을 알 수 있었다.

Claims

(a) 플라즈마 발생 장치에 캐리어 가스를 충진하는 단계;
(b) 상기 플라즈마 발생 장치에 1kV 내지 30kV의 전압 및 10 내지 30kHz의 주파수를 공급하여 플라즈마를 발생시키는 단계; 및
(c) 상기 발생된 플라즈마를 액상 물질에 조사하는 단계를 포함하는, 피부 진정용 액상 플라즈마의 제조 방법.
제 1항에 있어서,
상기 (a) 단계에서의 캐리어 가스는 질소, 헬륨, 아르곤, 및 산소로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 피부 진정용 액상 플라즈마의 제조 방법.
제 2항에 있어서,
상기 캐리어 가스는 질소인, 피부 진정용 액상 플라즈마의 제조 방법.
제 1항에 있어서,
상기 (c) 단계에서의 조사는 액상 물질의 표면으로부터 0.1cm 내지 15cm 떨어진 거리에서 1㎖당 10 내지 120 초간 수행하는 것을 특징으로 하는 것인, 피부 진정용 액상 플라즈마의 제조 방법.
제 1항에 있어서,
상기 (c) 단계에서의 액상 물질은 물, 식염수, 완충액, 또는 배지인, 피부 진정용 액상 플라즈마의 제조 방법.
제 1항에 있어서,
상기 피부 진정은 자외선 손상 피부에 대한 진정인, 피부 진정용 액상 플라즈마의 제조 방법.
제 1항 내지 제 6항 중 어느 하나의 방법으로 제조된 액상 플라즈마를 포함하는, 피부 진정용 화장료조성물.
제 1항 내지 제 6항 중 어느 하나의 방법으로 제조된 액상 플라즈마를 포함하는,광노화 예방 또는 개선용 화장료조성물.
제 1항 내지 제 6항 중 어느 하나의 방법으로 제조된 액상 플라즈마를 포함하는, 자외선에 의한 피부 손상의 예방 또는 치료용 약학조성물.
제 9항에 있어서,
상기 피부 손상은 피부 염증, 피부 주름, 피부 건조증, 피부 탄력 감소, 피부 각질 증가, 홍반, 미립종, 기미, 주근깨, 검버섯, 및 흑색종으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나인, 자외선에 의한 피부 손상의 예방 또는 치료용 약학조성물.