KR20190022563A - 세포 봉입용 디바이스 및 그 사용 - Google Patents

세포 봉입용 디바이스 및 그 사용 Download PDF

Info

Publication number
KR20190022563A
KR20190022563A KR1020187037731A KR20187037731A KR20190022563A KR 20190022563 A KR20190022563 A KR 20190022563A KR 1020187037731 A KR1020187037731 A KR 1020187037731A KR 20187037731 A KR20187037731 A KR 20187037731A KR 20190022563 A KR20190022563 A KR 20190022563A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cell
cells
culture
type chip
tissue
Prior art date
Application number
KR1020187037731A
Other languages
English (en)
Inventor
도시아키 다케자와
Original Assignee
고쿠리츠겐큐가이하츠호징 노우교 · 쇼쿠힝 산교기쥬츠 소고겐큐기코
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 고쿠리츠겐큐가이하츠호징 노우교 · 쇼쿠힝 산교기쥬츠 소고겐큐기코 filed Critical 고쿠리츠겐큐가이하츠호징 노우교 · 쇼쿠힝 산교기쥬츠 소고겐큐기코
Publication of KR20190022563A publication Critical patent/KR20190022563A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M21/00—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses
    • C12M21/08—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses for producing artificial tissue or for ex-vivo cultivation of tissue
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/22—Polypeptides or derivatives thereof, e.g. degradation products
    • A61L27/24—Collagen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3604—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the human or animal origin of the biological material, e.g. hair, fascia, fish scales, silk, shellac, pericardium, pleura, renal tissue, amniotic membrane, parenchymal tissue, fetal tissue, muscle tissue, fat tissue, enamel
    • A61L27/3633—Extracellular matrix [ECM]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/24—Gas permeable parts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/34—Internal compartments or partitions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/44—Multiple separable units; Modules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/58—Reaction vessels connected in series or in parallel
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/02—Membranes; Filters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
    • C12M29/04—Filters; Permeable or porous membranes or plates, e.g. dialysis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
    • C12M29/16—Hollow fibers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

세포 봉입용(封入用) 디바이스는, 세포를 배양하여 이루어지는 다세포 구조체를 구축하기 위한 세포 봉입용 디바이스로서, 다공질막을 적어도 일부에 구비한다. 조직형(組織型) 칩은, 1종류의 세포가 봉입된 상기 세포 봉입용 디바이스를 구비한다. 기관형(器官型) 칩은, 적어도 2종류의 세포가 봉입된 상기 세포 봉입용 디바이스를 구비한다. 다세포 구조체를 제공하기 위한 키트는, 상기 조직형 칩 또는 상기 기관형 칩과 배양액을 포함하는 개폐 가능한 밀봉 용기를 구비한다. 기관형 칩 시스템은, 상기 조직형 칩 또는 상기 기관형 칩을 적어도 2개 구비하고, 상기 조직형 칩, 또는 상기 기관형 칩이 세포 봉입성을 유지하면서 연결되어 있다. 세포의 배양 방법은, 상기 세포 봉입용 디바이스를 사용하는 방법이다. 세포의 운반 방법은, 상기 세포 봉입용 디바이스에 세포를 사용하는 방법이다.

Description

세포 봉입용 디바이스 및 그 사용
본 발명은, 세포 봉입용(封入用) 디바이스, 조직형(組織型) 칩, 기관형(器官型) 칩, 기관형 칩 시스템, 상기 세포 봉입용 디바이스를 사용한 세포의 배양 방법, 및 상기 세포 봉입용 디바이스를 사용한 세포의 운반 방법에 관한 것이다.
본원은, 2016년 6월 28일에, 일본에 출원된 특허출원 2016-127823호에 기초한 우선권을 주장하고, 그 내용을 여기에 원용한다.
창약(創藥)이나 동물 실험 대체법과 관련된 기업에서는, 세포 뱅크 등으로부터 동결 세포를 구입한 후, 계대 배양하여 증식한 세포를 동결 보존하고, 또한 일부 세포로 배양 모델을 제작하여 개발에 필요한 시험을 실시하고 있다. 즉, 개발에 필요한 시험을 실시할 때까지, 막대한 비용과 시간을 소비하고 있다. 또한, 단층(單層) 배양의 세포가 아닌, 보다 생체에 가까운 「조직형 배양 모델」이 요구되고 있다.
또한, 재생 의료의 분야에서는, 세포 이식(移植)에 의한 치료 기술이 빠른 속도로 발전하고 있지만, 줄기세포 등, 귀중한 한정된 수의 세포를 이식 부위에 생착시키기 위한 기술 개발이 시급한 과제로 되어 있다.
「조직형 배양 모델」과 관련된 기술로서는, 예를 들면, 각종 겔 포매(包埋) 배양 기술, 스페로이드 배양 기술(예를 들면, 특허문헌 1 참조), 및 각종 챔버 배양 기술(예를 들면, 특허문헌 2 참조) 등이 있다.
또한, 「의료용 세포 이식 디바이스」와 관련된 기술로서는, 예를 들면, 하이드로겔막 부착형 세포 시트 이식 기술(예를 들면, 특허문헌 3 참조), 마이크로캡슐 봉입 기술(예를 들면, 특허문헌 4 참조), 및 아테로콜라겐겔 포매 기술(예를 들면, 특허문헌 5 참조) 등이 있다.
일본공개특허 제2012-65555호 공보 일본재공표 WO2008/130025호 공보 일본공개특허 제2015-35978호 공보 일본특표 2002-538194호 공보 일본재공표 WO2006/011296호 공보
특허문헌 1 및 2에 기재된 「조직형 배양 모델」과 관련된 종래 기술은, 모두 배양 조작이 번잡하여, 조직형 배양 모델의 구축에 비용과 시간을 필요로 한다. 그뿐 아니라, 생산 재현성이 반드시 양호하지는 않으므로, 로트간의 차이도 있었다. 또한, 스페로이도 배양 기술 등, 세포가 노출된 상태에 있는 배양 기술은, 3차원 조직을 구성하고 있는 각각의 세포의 보호 성능이 반드시 양호하지는 않았다.
또한, 특허문헌 3, 4 및 5에 기재된 「의료용 세포 이식 디바이스」와 관련된 종래 기술에 있어서, 하이드로겔막 부착형 세포 시트 이식 기술은 세포 시트가 노출된 상태이므로, 세포 보호 성능이 반드시 양호하지는 않았다. 한편, 세포 보호 성능이 우수한 마이크로캡슐 봉입 기술, 및 아테로콜라겐겔 포매 기술에는 이하의 과제가 있었다. 즉, 마이크로캡슐 봉입 기술은, 조작이 번잡하여 랑게르한스섬 등, 한정된 세포에 밖에 사용할 수 없었다. 또한, 아테로콜라겐겔 포매 기술은, 이식 부위에서의 세포 생착이 반드시 양호하지는 않았다.
또한, 전술한 「조직형 배양 모델」 및 「의료용 세포 이식 디바이스」와 관련된 종래 기술에서는, 세포를 장기적으로 배양 하에서 유지하는 것이 곤란하며, 배양 모델 또는 이식용의 재생 조직을 구축한 후, 즉석에서 사용하지 않으면 안되어, 시간적 제약이 있었다.
본 발명은, 전술한 사정을 감안하여 이루어진 것이며, 세포 보호 성능이 우수할 뿐만 아니라, 취급도 용이하며, 세포의 장기간 배양이 가능한 세포 봉입용 디바이스를 제공한다.
본 발명자는, 상기 문제점을 해결하기 위해 예의(銳意) 연구한 결과, 콜라겐 등의 다공질막을 구비한 세포 봉입용 디바이스를 제작하고, 상기 세포 봉입용 디바이스에 세포를 봉입하고 배양함으로써, 취급이 용이하며, 고기능의 조직형 칩이 얻어지는 것을 발견하였다.
즉, 본 발명은 이하의 태양(態樣)을 포함한다.
본 발명의 제1 태양에 따른 세포 봉입용 디바이스는, 세포를 배양하여 이루어지는 다세포 구조체를 구축하기 위한 세포 봉입용 디바이스로서, 다공질막을 적어도 일부에 구비한다.
상기 다공질막이 기상중(氣相中)에서 액밀성(液密性)을 가지고, 액상중(液相中)에서 반투성(半透性)을 가지는 반투막이라도 된다.
상기 태양의 세포 봉입용 디바이스에 있어서, 배양액에 현탁한 다세포를 주입할 수 있고, 내부 용적이 10mL 이하라도 된다.
상기 태양의 세포 봉입용 디바이스에 있어서, 전체가 상기 반투막으로 이루어져도 된다.
상기 반투막이 생체 적합성을 가지는 재료로 이루어져도 된다.
상기 생체 적합성을 가지는 재료가 겔화하는 세포외 매트릭스 유래 성분이라도 된다.
상기 겔화하는 세포외 매트릭스 유래 성분이 네이티브 콜라겐, 또는 아테로콜라겐이라도 된다.
본 발명의 제2 태양에 따른 조직형 칩은, 1종류의 세포가 봉입된 상기 제1 태양에 따른 세포 봉입용 디바이스를 구비한다.
상기 세포의 밀도가, 2.0×103세포/mL 이상 1.0×109세포/mL 이하라도 된다.
본 발명의 제3 태양에 따른 기관형 칩은, 적어도 2종류의 세포가 봉입된 상기 제1 태양에 따른 세포 봉입용 디바이스를 구비한다.
상기 세포의 밀도가, 2.0×103세포/mL 이상 1.0×109세포/mL 이하라도 된다.
본 발명의 제4 태양에 따른 키트는, 다세포 구조체를 제공하기 위한 키트이며, 상기 제2 태양에 따른 조직형 칩 또는 상기 제3 태양에 따른 기관형 칩과 배양액을 포함하는 개폐 가능한 밀봉 용기를 구비한다.
본 발명의 제5 태양에 따른 기관형 칩 시스템은, 상기 제2 태양에 따른 조직형 칩 또는 상기 제3 태양에 따른 기관형 칩을 적어도 2개 구비하고, 상기 조직형 칩 또는 상기 기관형 칩이 세포 봉입성을 유지하면서 연결되어 있다.
본 발명의 제6 태양에 따른 세포의 배양 방법은, 상기 제1 태양에 따른 세포 봉입용 디바이스를 사용하는 방법이다.
본 발명의 제7태 양에 따른 세포의 운반 방법은, 상기 제1 태양에 따른 세포 봉입용 디바이스를 사용하는 방법이다.
상기 태양에 의하면, 세포 보호 성능이 우수할 뿐만 아니라, 취급도 용이하며, 세포의 장기간 배양이 가능한 세포 봉입용 디바이스를 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명의 제1 실시형태에 따른 세포 봉입용 디바이스를 모식적으로 나타낸 사시도이다.
도 2는 본 발명의 제2 실시형태에 따른 세포 봉입용 디바이스를 모식적으로 나타낸 사시도이다.
도 3은 본 발명의 제3실시형태에 따른 세포 봉입용 디바이스를 모식적으로 나타낸 사시도이다.
도 4의 (A)는, 본 발명의 제1 실시형태에 따른 기관형 칩 시스템을 모식적으로 나타낸 사시도이다. (B)는, 본 발명의 제2 실시형태에 따른 기관형 칩 시스템 모식적으로 나타낸 사시도이다. (C)는, 본 발명의 제3실시형태에 따른 기관형 칩 시스템을 모식적으로 나타낸 사시도이다. (D)는, 본 발명의 제4실시형태에 따른 기관형짓 칩 시스템을 모식적으로 나타낸 사시도이다.
도 5는 제조예 1에 있어서 제작된 세포 봉입용 디바이스를 나타낸 화상이다.
도 6의 (A)는, 실시예 1에서의 HepG2 세포를 제조예 1에서 제작된 세포 봉입용 디바이스에 주입하는 상태를 나타낸 화상이다. (B)는, 실시예 1에서의 HepG2 세포를 봉입한 제조예 1에서 제작된 세포 봉입용 디바이스의 배양 상태를 나타낸 화상이다.
도 7의 (A)는, 실시예 1에서의 배양 개시로부터 6시간 후의 HepG2 세포의 상태를 나타낸 화상이다. (B)는, 실시예 1에서의 배양 1일째의 HepG2 세포의 상태를 나타낸 화상이다. (C)는, 실시예 1에서의 배양 2일째의 HepG2 세포의 상태를 나타낸 화상이다. (D)는, 실시예 1에서의 배양 7일째의 HepG2 세포의 상태를 나타낸 화상이다. (E)는, 실시예 1에서의 배양 12일째의 HepG2 세포의 상태를 나타낸 화상이다. (F)는, 실시예 1에서의 배양 14일째의 HepG2 세포의 상태를 나타낸 화상이다.
도 8의 (A)는, 실시예 2에서의 배양 7일째의 HepG2 세포의 간조직형 칩에 플루오레세인 디아세테이트(Fluorescein diacetate, FD)를 1시간 받아들이게 한 후에 세정하고, 1시간 더 배양한 후에 위상차현미경을 사용하여 관찰한 결과를 나타낸 화상이다. 하단(下段)은, 상단의 사각형으로 둘러싸여진 부분의 확대 화상이다. (B)는, 실시예 2에서의 배양 7일째의 HepG2 세포의 간조직형 칩에 FD를 1시간 받아들이게 한 후에 세정하고, 1시간 더 배양한 후에 대사물인 플루오레세인의 동태를, 형광현미경을 사용하여 관찰한 결과를 나타낸 화상이다. 하단은, 상단의 사각형으로 둘러싸여진 부분의 확대 화상이다. (C)는, (A) 및 (B)의 화상의 융합 화상이다. 하단은, 상단의 사각형으로 둘러싸여진 부분의 확대 화상이다.
도 9의 (A)는, 제조예 2에서의 환형(環形)(내경(內徑): 11mm, 외경(外徑): 20mm)으로 잘라낸 두께 3mm의 실리콘막을 나타내는 화상이다. (B)는, 제조예 2에서의 측면에 스테인레스관을 관통시켜 2군데에 구멍을 뚫은 환형 실리콘막을 나타내는 화상이다. (C)는, 제조예 2에서의 환형 실리콘막의 천정면 및 바닥면에 콜라겐비트리겔(등록상표) 막 건조체를 부착한 세포 봉입용 디바이스를 나타내는 화상이다. (D)는, 제조예 2에서의 겔 로딩 칩을 측면에 관통시킨 세포 봉입용 디바이스를 나타낸 화상이다. (E)는, 제조예 2에서의 세포 봉입용 디바이스의 내부에 배양액을 주입하는 상태를 나타낸 화상이다. (F)는, 제조예 2에서의 세포 봉입용 디바이스의 내부에 배양액을 주입하는 상태를 나타낸 화상이다. (G)는, 제조예 2에서의 튜브로 연결한 2개의 세포 봉입용 디바이스에 배양액을 통액(通液)하는 상태를 나타낸 화상이다. (H)는, 제조예 2에서의 배양액의 주입 후에 이쑤시개로 마개를 한 세포 봉입용 디바이스를 나타내는 화상이다.
도 10a는 제조예 3에서의 HepG2 세포의 현탁액을 세포 봉입용 디바이스에 주입하는 상태를 나타낸 화상이다.
도 10b는 제조예 3에서의 HepG2 세포의 현탁액을 봉입한 세포 봉입용 디바이스의 상태를 나타낸 화상이다.
도 11a는 실시예 3에서의 배양 4일째의 콘트롤 및 간조직형 칩의 위상차현미경상 및 형광현미경상(calcein-AM과 ethidium homodimer-1에 의한 염색상)이다.
도 11b는 실시예 3에서의 배양 32일째의 콘트롤 및 간조직형 칩의 위상차현미경상 및 형광현미경상(calcein-AM과 ethidium homodimer-1에 의한 염색상)이다.
도 12a는 실시예 4에서의 배양 32일째의 HepG2 세포의 간조직형 칩에 FD를 1시간 받아들이게 한 후에 세정하고, 1시간 더 배양한 후에 위상차현미경을 사용하여 관찰한 결과를 나타낸 화상이다.
도 12b는 실시예 4에서의 배양 32일째의 HepG2 세포의 간조직형 칩에 FD를 1시간 받아들이게 한 후에 세정하고, 더욱 1시간 더 배양한 후에 대사물인 플루오레세인의 동태를, 형광현미경을 사용하여 관찰한 결과를 나타낸 화상이다.
도 13a는 실시예 5에서의 배양 4, 16 및 32 일째의 콘트롤 및 간조직형 칩의 알부민 합성의 활성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 13b는 실시예 5에서의 배양 4, 16 및 32 일째의 콘트롤 및 간조직형 칩의 요소 합성의 활성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 13c는 실시예 5에서의 배양 3, 14 및 28 일째의 콘트롤 및 간조직형 칩의 CYP3A4 활성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 14a는 제조예 4에서의 인간 진피 유래 섬유아세포의 현탁액을 세포 봉입용 디바이스에 주입하는 상태를 나타낸 화상이다.
도 14b는 제조예 4에서의 인간 진피 유래 섬유아세포의 현탁액을 봉입한 세포 봉입용 디바이스의 상태를 나타낸 화상이다.
도 15는 실시예 6에서의 배양 1, 2, 3 및 8 일째의 진피 조직형 칩의 위상차현미경상이다.
도 16은 실시예 6에서의 배양 100일째의 진피 조직형 칩의 위상차현미경상 및 형광현미경상(calcein-AM과 ethidium homodimer-1에 의한 염색상)이다.
도 17a는 실시예 7에서의 배양 15일째의 진피 조직형 칩으로부터 회수하여 배양한, 배양 2일째의 인간 진피 유래 섬유아세포의 위상차현미경상이다.
도 17b는 실시예 7에서의 배양 15일째의 진피 조직형 칩으로부터 회수하여 배양한, 배양 7일째의 인간 진피 유래 섬유아세포의 위상차현미경상이다.
도 18a는 실시예 8에서의 배양 21일째의 진피 조직형 칩으로부터 회수하여 배양한, 배양 개시로부터 30분 후의 인간 진피 유래 섬유아세포의 위상차현미경상이다.
도 18b는 실시예 8에서의 배양 21일째의 진피 조직형 칩으로부터 회수하여 배양한, 배양 1일째의 인간 진피 유래 섬유아세포의 위상차현미경상이다.
도 19는 실시예 9에서의 배양 28일째의 콘트롤 및 간조직형 칩의 위상차현미경상 및 형광현미경상(calcein-AM과 ethidium homodimer-1에 의한 염색상)이다.
도 20a는 실시예 10에서의 배양 35일째의 HepG2 세포의 간조직형 칩에 FD를 1시간 받아들이게 한 후에 세정하고, 1시간 더 배양한 후에 위상차현미경을 사용하여 관찰한 결과를 나타낸 화상이다.
도 20b는 실시예 10에서의 배양 35일째의 HepG2 세포의 간조직형 칩에 FD를 1시간 받아들이게 한 후에 세정하고, 1시간 더 배양한 후에 대사물인 플루오레세인의 동태를, 형광현미경을 사용하여 관찰한 결과를 나타낸 화상이다.
도 21a는 실시예 11에서의 배양 3, 7, 14, 21 및 28 일째의 콘트롤 및 간조직형 칩의 알부민 합성의 활성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 21b는 실시예 11에서의 배양 3, 7, 14, 21 및 28 일째의 콘트롤 및 간조직형 칩의 요소 합성의 활성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 21c는 실시예 11에서의 배양 3, 7, 14, 21 및 28 일째의 콘트롤 및 간조직형 칩의 CYP3A4 활성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 22는 실시예 12에서의 세포 봉입용 디바이스 4 및 5의 내측으로부터 외측으로 투과한 단백질량을 경시적(經時的)으로 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 23은 실시예 13에서의 세포 봉입용 디바이스 4, 6-1 및 6-2의 내측으로부터 외측으로 투과한 단백질량을 경시적으로 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 24a는 실시예 14에서의 37℃에서의 배양 1일째, 및 25℃에서의 보존 1, 2, 3 및 6 일째의 간조직형 칩 4의 형광현미경상이다. 그리고, 상은, 칼세인-AM(calcein-AM)에 의한 염색상이다. 또한, 아래는, 에티듐 호모다이머-1(ethidium homodimer-1)에 의한 염색상이다.
도 24b는 실시예 14에서의 37℃에서의 배양 1일째, 및 25℃에서의 보존 1, 2, 3 및 6 일째의 간조직형 칩 6-1의 형광현미경상이다. 그리고, 상은, calcein-AM에 의한 염색 상이다. 또한, 아래는, ethidium homodimer-1에 의한 염색상이다.
도 25a는 실시예 15에서의 25℃에서의 보존 1, 2, 3 및 6 일째 후, 1일간(24시간) 37℃에 있어서 후배양을 행한 간조직형 칩 4의 형광현미경상이다. 그리고, 상은, calcein-AM에 의한 염색상이다. 또한, 아래는, ethidium homodimer-1에 의한 염색상이다.
도 25b는 실시예 15에서의 25℃에서의 보존 1, 2, 3 및 6 일째 후, 1일간(24시간) 37℃에 있어서 후배양을 행한 간조직형 칩 6-1의 형광현미경상이다. 그리고, 상은, calcein-AM에 의한 염색상이다. 또한, 아래는, ethidium homodimer-1에 의한 염색상이다.
도 26은 실시예 15에서의 25℃에서의 보존 1, 2, 3 및 6 일째 후, 1일간(24시간) 37℃에 있어서 후배양을 행한 간조직형 칩 4 및 간조직형 칩 6-1의 세포 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 27a는 제조예 7에서의 유치(留置) 침 카테터(catheter) 부착 세포 봉입용 디바이스를 나타내는 화상이다.
도 27b는 제조예 7에서의 인간 진피 유래 섬유아세포의 현탁액을 세포 봉입용 디바이스에 주입하는 상태를 나타낸 화상이다.
도 28은 실시예 16에서의 배양 1일째의 진피 조직형 칩을 촬영한 화상이다. 좌측 도면은, 배양액 중의 배양 1일째의 진피 조직형 칩을 나타내는 화상이며, 우측 도면은, 배양액으로부터 배양 1일째의 진피 조직형 칩을 꺼낸 화상이다.
도 29는 실시예 16에서의 배양 0, 1, 2 및 3 일째의 진피 조직형 칩의 위상차현미경상이다.
도 30a는 제조예 8에서의 아테로콜라겐비트리겔(등록상표)막 건조체만으로 구성된 세포 봉입용 디바이스를 나타낸 화상이다.
도 30b는 제조예 8에서의 인간 진피 유래 섬유아세포의 현탁액을 세포 봉입용 디바이스에 주입하는 상태를 나타낸 화상이다.
도 31은 실시예 17에서의 배양 1일째의 진피 조직형 칩을 촬영한 화상이다. 좌측 도면은, 배양액 중의 배양 1일째의 진피 조직형 칩을 나타내는 화상이며, 우측 도면은, 배양액으로부터 배양 1일째의 진피 조직형 칩을 꺼낸 화상이다.
도 32는 실시예 17에서의 배양 0, 1, 2 및 3 일째의 진피 조직형 칩의 위상차현미경상이다.
이하, 실시형태를 나타내고 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이하의 실시형태로 전혀 한정되지 않는다.
<<세포 봉입용 디바이스>>
본 실시형태의 세포 봉입용 디바이스는, 세포를 배양하여 이루어지는 다세포 구조체를 구축하기 위한 세포 봉입용 디바이스로서, 다공질막을 적어도 일부에 구비한다.
본 실시형태의 세포 봉입용 디바이스는, 핀셋 등으로 용이하게 취급할 수 있다. 또한, 종래에는, 배양 모델 또는 이식용의 재생 조직으로서 다세포 구조체를 제작 후, 1∼3 일 이내에 사용하지 않으면 안되어, 시간적 제약이 있었다. 이에 비해, 본 실시형태의 세포 봉입용 디바이스는, 세포를 3∼30 일 정도, 장기간 배양하는 것이 가능하며, 시간적 제약을 받지 않는다.
본 명세서에 있어서, 「다공질막」이란, 세공(細孔)을 다수 가지는 막을 의미하고, 공극(空隙)을 가지는 막, 세공과 공극을 가지는 막도 포함한다.
본 실시형태의 세포 봉입용 디바이스에 있어서, 예를 들면, 세포가 봉입된 본 실시형태의 세포 봉입용 디바이스를, 배양액을 포함하는 용기 내로 넣은 경우에, 세포를 세포 봉입용 디바이스의 외부로 투과시키지 않는다. 한편, 배양액에 용해하고 있는 영양분을 세포 봉입용 디바이스의 내부로 투과시키고 또한, 배양액에 용해한 노폐물을 포함하는 세포 생산물을 세포 봉입용 디바이스의 외부로 투과시킬 수 있다. 이 때문에, 본 실시형태의 세포 봉입용 디바이스는, 세포의 장기간 배양에 사용할 수 있다.
본 명세서에 있어서, 「다세포 구조체」란, 복수의 세포가 세포-기질간의 결합, 및 세포-세포간의 결합을 형성한 단층 세포 또는 다층 세포로 이루어지는 3차원 구조체를 의미한다. 본 실시형태에서의 다세포 구조체는, 1종류 이상의 기능 세포와, 그 발판의 역할을 하는 기질에 의해 구성되어 있다. 즉, 본 실시형태에서의 다세포 구조체는, 복수의 기능 세포와 기질이 상호 작용하는 것에 의해, 보다 생체 내의 조직 또는 기관과 유사한 형태를 구축하고 있다. 따라서, 다세포 구조체에는, 혈관 및/또는 담관 등의 모세관망상 구조가 3차원적으로 구축되어 있어도 된다. 이와 같은 모세관망상 구조는, 다세포 구조체의 내부에만 형성되어 있어도 되고, 적어도 그 일부가 다세포 구조체의 표면 또는 바닥면에 노출되도록 형성되어 있어도 된다.
<구조>
도 1은, 본 발명의 제1 실시형태에 따른 세포 봉입용 디바이스를 모식적으로 나타낸 사시도이다.
여기에 나타낸 세포 봉입용 디바이스(10)는, 다공질막(1)을 천정면 및 바닥면에 구비하고, 부재(2)에 의해 측면이 봉지(封止)된 원주 형상을 하고 있다. 도 1에 있어서, 다공질막을 천정면 및 바닥면에 구비하는 것을 예시하였으나, 천정면, 바닥면 또는 측면 등의 일부에 구비하는 것이라도 된다. 또는, 천정면, 바닥면 및 측면 등의 전체가 다공질막 중에서, 후술하는 반투막으로 이루어지는 것이라도 된다. 그 중에서도, 본 실시형태의 세포 봉입용 디바이스는, 배양 모델로서 사용하는 경우에는, 다공질막을 천정면 및 바닥면에 구비하는 것이 바람직하다. 또한, 의료용 세포 이식 디바이스로서 사용하는 경우에는, 전체가 반투막으로 이루어지는 것이 바람직하다.
도 1에 있어서, 세포 봉입용 디바이스의 형상이 원주인 것을 나타내었으나, 그 외의 형상이라도 된다. 본 실시형태의 세포 봉입용 디바이스의 형상은, 세포를 봉입할 수 있고, 세포에 균일하게 산소 및 배양액에 용해되어 있는 영양분이 널리 퍼지는 형상이라면 된다. 또한, 본 실시형태의 세포 봉입용 디바이스는, 배양액을 디바이스 내부에 채우고 있어도 되고, 배양액을 채우지 않고 기체(氣體) 부분을 남기고 있어도 된다. 본 실시형태의 세포 봉입용 디바이스의 형상으로서는, 예를 들면, 원주, 원뿔, 원뿔대, 각뿔, 각뿔대, 구, 다면체(예를 들면, 4면체, 5면체, 6면체(입방체 포함함), 8면체, 12면체, 20면체, 24면체, 케플러·푸앵소 입체 등) 등이 있고, 이들로 한정되지 않는다.
도 1에 나타낸 바와 같이 세포 봉입용 디바이스의 형상이 원주인 경우, 세포 봉입용 디바이스의 내경은, 1mm 이상 60mm 이하인 것이 바람직하고, 3mm 이상 35mm 이하인 것이 보다 바람직하고, 5mm 이상 26mm 이하인 것이 더욱 바람직하다.
또한, 세포 봉입용 디바이스의 외경은, 3mm 이상 68mm 이하인 것이 바람직하고, 5mm 이상 43mm 이하인 것이 보다 바람직하고, 7mm 이상 32mm 이하인 것이 더욱 바람직하다.
또한, 세포 봉입용 디바이스의 두께(원주의 높이)는, 5㎛ 이상이며, 50㎛ 이상 15mm 이하인 것이 바람직하고, 100㎛ 이상 10mm 이하인 것이 보다 바람직하고, 200㎛ 이상 2.5mm 이하인 것이 더욱 바람직하다.
그리고, 본명세서에 있어서, 「세포 봉입용 디바이스의 두께(원주의 높이)」는, 세포 봉입용 디바이스의 천정면 외측의 에지부로부터, 바닥면의 외측의 에지부까지의 거리를 의미한다.
도 1에 있어서, 천정면 및 바닥면이 평면인 것을 나타내었으나, 천정면 및 바닥면이 오목부 구조, 또는 볼록부 구조라도 된다. 특히, 천정면 및 바닥면이 오목부 구조일 때, 천정면의 내측의 오목부의 중심부(천정면의 내측의 가장 오목부)와 바닥면의 내측의 오목부의 중심부(바닥면의 내측의 가장 오목부)가 접촉하지 않고, 일정한 거리(예를 들면, 5㎛ 이상)를 유지하고 있는 것이 바람직하다. 이로써, 세포 봉입용 디바이스의 두께(원주의 높이), 즉 세포 봉입용 디바이스의 천정면의 외측의 에지부로부터, 바닥면의 외측의 에지부까지의 거리가, 천정면의 외측의 오목부의 중심부(천정면의 외측의 가장 오목부)로부터 바닥면의 외측의 오목부(바닥면의 외측의 가장 오목부)의 중심부까지의 거리보다 길어진다. 이로써, 예를 들면, 천정면으로부터 약제를 첨가한 경우에, 첨가한 약제의 방향성을 유지할 수 있다. 또한, 천정면 및 바닥면이 오목부 구조이므로, 천정면 및 바닥면의 외측에 새롭게 세포를 파종하여 배양하는 것이 가능하게 된다.
본 실시형태의 세포 봉입용 디바이스의 내부 용적은, 배양액에 현탁한 다세포를 주입할 수 있고, 세포의 활성을 어세이하는 시험 등의 인 비트로(In vitro) 시험계에서 사용되는 다세포 구조체를 구축할 수 있을 정도의 스몰 스케일이면 된다. 구체적으로는, 예를 들면, 10mL 이하인 것이 바람직하고, 10μL 이상 5mL 이하인 것이 보다 바람직하고, 15μL 이상 2mL 이하인 것이 더욱 바람직하고, 20μL 이상 1mL 이하인 것이 특히 바람직하다. 내부 용적이 상기 상한값 이하인 것에 의해, 충분히 산소 및 배양액의 영양분이 공급되고, 세포를 효율적으로 장기간에 걸쳐 배양할 수 있다. 또한, 내부 용적이 상기 하한값 이상인 것에 의해, 인 비트로 시험계에서 사용하기에 충분한 세포수 및 세포 밀도의 세포를 얻을 수 있다.
도 2는, 본 발명의 제2 실시형태에 따른 세포 봉입용 디바이스를 모식적으로 나타낸 사시도이다.
그리고, 도 2 이후의 도면에 있어서, 이미 설명된 도면에 나타낸 것과 동일한 구성 요소에는, 그 설명된 도면의 경우와 동일한 부호를 부여하고, 그 상세한 설명은 생략한다.
여기에 나타낸 세포 봉입용 디바이스(20)는, 지지체(3)를 구비하고 있는 점 외에는, 도 1에 나타낸 세포 봉입용 디바이스(10)와 동일하다. 즉, 세포 봉입용 디바이스(20)는, 다공질막(1)을 천정면 및 바닥면에 구비하고, 부재(2)에 의해 측면이 봉지된 원주 형상을 하고 있고, 외측면에 지지체(3)를 구비한다.
세포 봉입용 디바이스(20)는, 지지체(3)를 가지는 것에 의해, 예를 들면, 세포가 봉입된 세포 봉입용 디바이스(20)을 한층 큰 용기에 고정시킴으로써, 세포를 기상(氣相)에서 배양할 수 있다. 또한, 세포 봉입용 디바이스(20)는, 지지체(3)를 가지는 것에 의해, 예를 들면, 세포가 봉입된 세포 봉입용 디바이스(20)는, 배양액 중에 있어서, 부력에 의해 뜨는 것이 가능하다. 또한, 세포 봉입용 디바이스(20)와 같이 천정면 및 바닥면에 다공질막(1)을 구비하는 경우, 천정면은 공기에 접하고, 바닥면은 배양액에 접하므로, 세포를 기상 및 액상에서 배양할 수 있다.
또한, 지지체(3)는, 세포 봉입용 디바이스(20)에 고정되어 있어도 되고, 분리 가능해도 된다.
도 3은, 본 발명의 제3 실시형태에 따른 세포 봉입용 디바이스를 모식적으로 나타낸 사시도이다.
여기에 나타낸 세포 봉입용 디바이스(30)는, 튜브(4)를 구비하고 있는 점 외에는, 도 1에 나타낸 세포 봉입용 디바이스(10)와 동일하다. 즉, 세포 봉입용 디바이스(30)는, 다공질막(1)을 천정면 및 바닥면에 구비하고, 부재(2)에 의해 측면이 봉지된 원주 형상을 하고 있다. 또한, 세포 봉입용 디바이스(30)의 외측면에 있어서 마주보도록 튜브(4)를 구비하고, 튜브(4)는 세포 봉입용 디바이스(30)의 내부에 삽입되어 있고, 2개의 튜브(4) 및 세포 봉입용 디바이스(30)는 연통되어 있다.
세포 봉입용 디바이스(30)는, 튜브(4)를 구비함으로써, 배양액을 측면으로부터도 공급할 수 있다. 또한, 튜브(4)를 구비하는 세포 봉입용 디바이스(30)끼리를 연결시킴으로써, 후술하는 기관형 칩 시스템을 구축할 수 있다.
또한, 튜브(4)의 세포 봉입용 디바이스(30)가 삽입되어 있는 측과는 반대측의 선단에는, 마개나 밸브 등의 개폐 가능한 장치(도시하지 않음)를 구비하는 것이 바람직하다.
본 실시형태의 세포 봉입용 디바이스는, 도 1∼3에 나타낸 것으로 한정되지 않고, 본 실시형태의 세포 봉입용 디바이스의 효과를 손상시키지 않는 범위 내에 있어서, 도 1∼3에 나타낸 것의 일부 구성이 변경 또는 삭제된 것이나, 지금까지 설명한 것에 또 다른 구성이 추가된 것이라도 된다.
예를 들면, 도 1, 2에 나타낸 세포 배양용 디바이스에 있어서, 부재는 주입공을 구비하고 있어도 된다. 주입공을 구비하는 경우, 상기 주입공을 닫기 위한 마개를 구비하는 것이 바람직하다.
주입공의 형상은, 특별한 한정되지 않고, 예를 들면, 원형, 다각형(정다각형 등도 포함함), 타원형 등이 있다.
주입공의 반경은, 세포 배양용 디바이스의 두께(즉, 부재의 높이)에 따라 적절하게 조정하면 되고, 예를 들면, 10㎛ 이상 1000㎛ 이하이면 된다.
또한, 본 실시형태의 세포 봉입용 디바이스에 있어서는, 각 구성(다공질막, 부재 등)의 크기나 형상은, 목적에 따라 임의로 조절할 수 있다.
<각 구성>
[다공질막]
본 실시형태의 세포 봉입용 디바이스에 사용되는 다공질막으로서는, 내부에 봉입된 세포가 외부로 투과하지 않을 정도의 구멍을 가지는 막이면 되고, 특별한 한정은 없다. 다공질막으로서는, 예를 들면, 여과지, 반투막(예를 들면, 한외여과막 등), 부직포, 거즈상 메쉬, 각종 멤브레인 필터 등이 있으며, 이들로 한정되지 않는다.
또한, 본 실시형태에서의 다공질막의 세공의 크기로서는, 예를 들면, 0.01㎛ 이상 1,500㎛ 이하이면 되고, 예를 들면, 0.01㎛ 이상 1.0㎛ 이하이면 되고, 예를 들면, 0.01㎛ 이상 0.45㎛ 이하이면 된다. 전술한 구멍의 크기는, 내부에 봉입하는 세포 또는 후술하는 작은 생명 개체의 크기에 따라 적절하게 선택하면 된다.
그 중에서도, 본 실시형태에서의 다공질막은, 기상중에서 액밀성을 가지고, 액상중에서 반투성을 가지는 반투막인 것이 바람직하다. 반투막은, 기상중에서 액밀성을 가지므로, 예를 들면, 본 실시형태의 세포 봉입용 디바이스의 내부에 배양액 등의 액체를 포함하고 있는 경우에, 기상중에 있어서, 액체가 누출되지 않고, 내부에 유지할 수 있다. 이 액밀성은, 반투막 상에서의 표면 장력에 의한 것이다. 한편, 기체를 통과시킬 수 있으므로, 내부에 액체를 포함하는 경우, 내부의 액체는 경시적으로 증발한다.
또한, 본 실시형태의 세포 봉입용 디바이스에 사용되는 반투막은, 액상중에서 반투성을 가지므로, 예를 들면, 세포가 봉입된 본 실시형태의 세포 봉입용 디바이스를, 배양액을 포함하는 용기 내에 넣은 경우에, 세포 봉입용 디바이스 내의 세포는 디바이스의 외부로 투과시키지 않으며, 한편, 배양액에 용해하고 있는 영양분을 세포 봉입용 디바이스의 내부에 투과시키고 또한, 배양액에 용해한 노폐물을 포함하는 세포 생산물을 세포 봉입용 디바이스의 외부로 투과시킬 수 있다. 이에 따라, 본 실시형태의 세포 봉입용 디바이스는, 세포의 장기간 배양에 사용할 수 있다.
보다 구체적으로는, 본 실시형태의 세포 봉입용 디바이스에 사용되는 반투막은, 예를 들면, 분자량 약 1,000,000 이하의 고분자 화합물을 투과할 수 있는 것이면 되고, 예를 들면, 분자량 약 200,000 이하의 천연 비소를 투과할 수 있는 것이면 된다.
본 명세서에 있어서, 「액밀성」이란, 액체가 누출하지 않는 상태를 의미한다. 또한, 본 명세서에 있어서, 「반투성」이란, 일정한 분자량 이하의 분자 또는 이온만을 투과 가능한 성질을 의미하고, 「반투막」이란, 상기 성질을 가지는 막이다.
상기 다공질막의 재료로서는, 세포 독성이 없는 것이면 되고, 천연 고분자 화합물이라도 되고, 합성 고분자 화합물이라도 된다. 또한, 상기 다공질막이 반투막인 경우, 그 재료로서는, 생체 적합성을 가지는 재료인 것이 바람직하고, 생체 흡수성을 가지는 재료인 것이 보다 바람직하다. 본 실시형태의 세포 봉입용 디바이스의 전체가 생체 적합성 또는 생체 흡수성을 가지는 반투막으로 이루어지는 것인 경우, 의료용 세포 이식 디바이스로서 활용할 수 있다.
그리고, 본 명세서에 있어서, 「생체 적합성」이란, 생체 조직과 재료와의 적합성을 나타내는 평가 기준을 의미한다. 또한, 「생체 적합성을 가지는」이란, 재료 그 자체가 독성을 가지지 않고, 내독소 등의 미생물 유래의 성분을 가지지 않고, 생체 조직을 물리적으로 자극하지 않고, 생체 조직을 구성하는 단백질이나 세포 등과 상호 작용해도 거절되지 않는 상태를 의미한다. 또한, 본 명세서에 있어서, 「생체 흡수성」이란, 생체 내에 일정 기간, 재료가 그 형상 또는 물성을 유지하고, 그 후 분해 및 흡수됨으로써 생체 내로의 도입 부분으로부터 소실할 수 있는 성질을 의미한다.
상기 천연 고분자 화합물로서는, 예를 들면, 겔화하는 세포외 매트릭스 유래 성분, 다당류(예를 들면, 알지네이트, 셀룰로오스, 덱스트란, 풀루란(pullulane), 폴리히알루론산, 및 이들의 유도체 등), 키틴, 폴리(3-하이드록시알카노에이트)(특히, 폴리(β-하이드록시부틸레이트), 폴리(3-하이드록시옥타노에이트), 폴리(3-하이드록시지방산), 피브린, 한천, 아가로스 등이 있으며, 이들로 한정되지 않는다.
상기 셀룰로오스에는, 합성에 의해 개질(改質)된 것도 포함하고, 예를 들면, 셀룰로오스 유도체(예를 들면, 알킬셀룰로오스, 하이드록시알킬셀룰로오스, 셀룰로오스에테르, 셀룰로오스에스테르, 니트로셀룰로오스, 키토산 등) 등이 있다. 보다 구체적인 셀룰로오스 유도체로서는, 예를 들면, 메틸셀룰로우스, 에틸셀룰로오스, 하이드록시프로필셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스, 하이드록시부틸메틸셀룰로오스, 셀룰로오스아세테이트, 셀룰로오스프로피오네이트, 셀룰로오스아세테이트부틸레이트, 셀룰로오스아세테이트프탈레이트, 카르복시메틸셀룰로오스, 셀룰로오스트리아세테이트, 셀룰로오스술페이트나트륨염 등이 있다.
그 중에서도, 상기 천연 고분자 화합물로서는, 우수한 보수성(保水性)을 가지므로, 겔화하는 세포외 매트릭스 유래 성분, 피브린, 한천, 또는 아가로스인 것이 바람직하다.
겔화하는 세포외 매트릭스 유래 성분으로서는, 예를 들면, 콜라겐(I형, II형, III형, V형, XI형 등), 마우스 EHS 종양 추출물(IV형 콜라겐, 라미닌, 헤파란황산프로테오글리칸 등을 포함함)로부터 재구성된 기저막 성분(상품명: 마트리겔), 글리코사미노글리칸, 히알루론산, 르로테오글리칸, 젤라틴 등이 있고, 이들로 한정되지 않는다. 각각의 겔화에 적정한 염 등의 성분, 그 농도, pH 등을 선택하고 다공질막(특히, 반투막)을 제작할 수 있다. 또한, 원료를 조합함으로써, 다양한 생체내 조직을 모방한 다공질막(특히, 반투막)을 얻을 수 있다.
상기 합성 고분자 화합물로서는, 예를 들면, 폴리포스파젠, 폴리(비닐알코올), 폴리아미드(예를 들면, 나일론 등), 폴리에스테르아미드, 폴리(아미노산), 폴리 무수 화합물, 폴리술폰, 폴리카보네이트, 폴리아크릴레이트(아크릴 수지), 폴리 알킬렌(예를 들면, 폴리에틸렌 등), 폴리아크릴아미드, 폴리알킬렌글리콜(예를 들면, 폴리에틸렌글리콜 등), 폴리알킬렌옥시드(예를 들면, 폴리에틸렌옥시드 등), 폴리알킬렌테레프탈레이트(예를 들면, 폴리에틸렌테레프탈레이트 등), 폴리오르소에스테르, 폴리비닐에테르, 폴리비닐에스테르, 폴리비닐할라이드, 폴리비닐프롤리돈, 폴리에스테르, 폴리실록산, 폴리우레탄, 폴리하이드록시산(예를 들면, 폴리락티드, 폴리글리코리드 등), 폴리(하이드록시부티르산), 폴리(하이드록시발레르산), 폴리[락티드-co-(ε-카프로락톤)], 폴리[글리코리드-co-(ε-카프로락톤)]), 폴리(하이드록시알카노에이트), 및 이들의 코폴리머 등이 있고, 이들로 한정되지 않는다.
상기 폴리아크릴레이트(아크릴 수지)로서 보다 구체적으로는, 예를 들면, 폴리(메타크릴산메틸), 폴리(메타크릴산 에틸), 폴리(메타크릴산 부틸), 폴리(메타크릴산 이소부틸), 폴리(메타크릴산 헥실), 폴리(메타크릴산 이소데실), 폴리(메타크릴산 라우릴), 폴리(메타크릴산 페닐), 폴리(아크릴산 메틸), 폴리(아크릴산 이소프로필), 폴리(아크릴산 이소부틸), 폴리(아크릴산 옥타데실) 등이 있다.
그 중에서도, 상기 합성 고분자 화합물로서는, 생체 흡수성을 가지므로, 폴리하이드록시산(예를 들면, 폴리락티드, 폴리글리코리드 등), 폴리에틸렌테레프탈레이트, 폴리(하이드록시부티르산), 폴리(하이드록시발레르산), 폴리[락티드-co-(ε-카프로락톤)], 폴리[글리코리드-co-(ε-카프로락톤)]), 폴리(하이드록시알카노에이트), 폴리오르소에스테르, 또는 코폴리머인 것이 바람직하다.
본 실시형태에서의 다공질막의 재료는, 상기에 예시된 재료 중 1종류로 구성되어 있어도 되고, 2종류 이상으로 구성되어 있어도 된다. 또한, 본 실시형태에서의 다공질막의 재료는, 천연 고분자 화합물 또는 합성 고분자 화합물 중 어느 하나에 의해 구성되어 있어도 되고, 천연 고분자 화합물 및 합성 고분자 화합물의 양쪽으로 구성되어 있어도 된다.
그 중에서도, 본 실시형태에서의 다공질막이 반투막인 경우, 그 재료로서는, 천연 고분자 화합물이 바람직하고, 겔화하는 세포외 매트릭스 유래 성분이 보다 바람직하고, 콜라겐이 더욱 바람직하다. 또한, 콜라겐 중에서도 보다 바람직한 원료로서는, 네이티브 콜라겐 또는 아테로콜라겐을 예시할 수 있다.
본 실시형태에서의 다공질막의 재료가, 세포외 매트릭스 유래 성분인 경우에, 세포외 매트릭스 유래 성분을 다공질막(특히, 반투막)의 단위면적 1cm2당 0.1mg 이상 10.0mg 이하 함유하는 것이 바람직하고, 0.5mg 이상 5.0mg 이하 함유하는 것이 보다 바람직하다. 특히, 세포외 매트릭스 유래 성분이 아테로콜라겐인 경우, 아테로콜라겐을 다공질막(특히, 반투막)의 단위면적 1cm2당 0.5mg 이상 10.0mg 이하 함유하는 것이 바람직하고, 1cm2당 2.5mg 이상 5.0mg 이하 함유하는 것이 보다 바람직하다.
다공질막(특히, 반투막)에서의 세포외 매트릭스 유래 성분(특히, 아테로콜라겐)의 함유량이 전술한 범위인 것에 의해, 세포를 세포 봉입용 디바이스 내에 주입하고, 배양하는 것이 가능한 강도로 할 수 있다.
그리고, 「상기 막의 단위면적 1cm2당 중량」이란, 막의 두께를 임의로 하여, 상기 재료편 1cm2당에 함유되는 성분의 중량을 나타낸다.
본 실시형태에서의 다공질막의 두께는 특별히 제한되지 않지만, 1㎛ 이상 1000㎛ 이하인 것이 바람직하고, 1㎛ 이상 500㎛ 이하인 것이 보다 바람직하고, 5㎛ 이상 300㎛ 이하인 것이 더욱 바람직하고, 10㎛ 이상 200㎛ 이하인 것이 특히 바람직하다. 다공질막의 두께가 전술한 범위인 것에 의해, 세포를 세포 봉입용 디바이스 내에 주입하고, 배양하는 것이 가능한 강도로 할 수 있다. 또한, 다공질막이 반투막인 경우, 그 두께가 전술한 범위인 것에 의해, 본 실시형태의 세포 봉입용 디바이스를 의료용 세포 이식 디바이스로서 바람직하게 사용할 수 있다.
또한, 본 실시형태에서의 다공질막은, 사용 시에 파손될 우려가 없고, 실용적으로 대단히 우수하다. 특히 의료용 세포 이식 디바이스에 사용하는 경우, 다공질막(특히, 반투막)의 강도는, 이식 조작에 견딜 수 있는 강도를 가진다.
(다공질막의 제조 방법)
1. 합성 고분자 화합물을 사용한 다공질막의 제조 방법
예를 들면, 다공질막의 구성 재료가 상기 합성 고분자 화합물인 경우에는, 공지의 방법(예를 들면, 일본공개특허 제2001-149763호 공보 등 참조)을 사용하여 제조할 수 있다.
상기 합성 고분자 화합물을 사용한 다공질막의 제조 방법으로서 보다 구체적으로는, 먼저, 합성 고분자 화합물을 유기 용제 중에 용해한 제막(製膜) 원액을 조제한다. 유기 용제로서는, 합성 고분자 화합물에 대한 양용제이면 되고, 예를 들면, 테트라하이드로퓨란, 디옥산, 디메틸포름아미드, 디메틸아세트아미드, N-메틸-2-피롤리돈 등이 있고, 이들로 한정되지 않는다.
합성 고분자 화합물과 유기 용제의 혼합 비율은, 사용하는 합성 고분자 화합물 및 유기 용제의 종류에 따라 적절하게 조정하면 되고, 예를 들면, 합성 고분자 화합물 15중량%, 유기 용제 85중량%이면 된다. 또한, 용해 시의 유기 용제의 온도는, 통상 30℃ 이상 100℃ 이하이면 되고, 바람직하게는 50℃ 이상 80℃ 이하이다.
이어서, 조제한 제막 원액을 예를 들면, 노즐로부터 토출시키는 방법 등을 사용하여, 응고액 중에서 응고시켜, 소정 형상의 다공질막을 제작한다.
응고액으로서는, 유기 용제와 물의 혼합액을 사용하는 것이 바람직하다. 응고액에 사용하는 유기 용제로서는, 합성 고분자 화합물의 용해에 사용한 유기 용제로서 예시된 것과 동일한 것을 사용할 수 있다. 그리고, 응고액에 사용하는 유기 용제는, 합성 고분자 화합물의 용해에 사용한 유기 용제와는 동일한 종류라도 되고, 다른 종류라도 된다.
또한, 응고액 중에서의 물의 비율은, 예를 들면, 30중량% 이상 80중량% 이하이면 된다.
또한, 응고 속도를 조정할 목적으로, 응고액 중에, 예를 들면, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 글리세린 등의 알코올류나 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 등의 글리콜류를 첨가해도 된다.
얻어진 다공질막은, 증류수 등에 의해 세정하고, 또한 자외선 조사(照射) 등에 의한 멸균을 행하여, 사용하면 된다.
2. 하이드로겔을 사용한 다공질막의 제조 방법
또한, 예를 들면, 다공질막의 구성 재료가 하이드로겔인 경우에는, 공지의 방법(예를 들면, 국제공개 제2012/026531호, 일본공개특허 제2012-115262호 공보, 및 일본공개특허 제2015-35978호 공보 등 참조)을 사용하여 제조할 수 있다.
그리고, 본 명세서에 있어서, 「하이드로겔」이란, 고분자 화합물이 화학적 결합에 의해 그물눈 구조를 가지고, 그 그물눈에 다량인 물을 보유한 물질을 나타낸다. 하이드로겔로서 보다 구체적으로는, 천연물 고분자 화합물이나 합성 고분자 화합물의 인공 소재에 가교를 도입하여 겔화시킨 것을 의미한다.
하이드로겔에는, 예를 들면, 전술한 겔화하는 세포외 매트릭스 유래 성분, 피브린, 한천, 아가로스, 셀룰로오스 등의 천연 고분자 화합물, 및 폴리아크릴아미드, 폴리비닐알코올, 폴리에틸렌옥시드, 폴리(II-하이드록시에틸메타크릴레이트)/폴리카프로락톤[poly(II-hydroxyethylmethacrylate)/polycaprolactone] 등의 합성 고분자 화합물이 포함된다.
하이드로겔을 사용한 다공질막의 제조 방법으로서 보다 구체적으로는, 먼저, 주형에 완전하게는 겔화하고 있지 않은 상태의 하이드로겔(이하, 「졸」로 칭하는 경우가 있음)을 배치하고, 겔화를 유도한다.
졸이 콜라겐 졸인 경우, 콜라겐 졸은 적정한 염 농도를 가지는 것으로서, 생리식염수, PBS(Phosphate Buffered Saline), 행크스 평형염류용액(Hank's Balanced Salt Solution: HBSS), 기초배양액, 무혈청배양액, 혈청함유 배양액 등을 사용하여, 조제한 것을 사용하면 된다. 또한, 콜라겐 겔화 시의 용액 pH는, 예를 들면, 6 이상 8 이하이면 된다.
특히 무혈청배양액을 사용하는 경우, 다른 동물 혈청 성분 중에 포함되는 이식에 적합하지 않은 물질(예를 들면, 항원, 병원 인자 등)이 다공질막에 포함되는 것을 회피할 수 있으므로, 의료용 세포 이식 디바이스에 사용하는 경우에 바람직한 다공질막(특히, 반투막)을 얻을 수 있다.
또한, 콜라겐 졸의 조제는, 예를 들면, 4℃ 정도에서 행하면 된다. 그 후, 겔화할 때의 보온은, 사용하는 콜라겐의 동물종에 의존한 콜라겐의 변성 온도보다 낮은 온도로 하면 되고, 일반적으로는 20℃ 이상 37℃ 이하의 온도에서 보온함으로써 몇분으로부터 몇시간 겔화를 행할 수 있다.
또한, 다공질막을 제작하기 위한 콜라겐 졸의 농도는, 0.1% 이상 1.0% 이하인 것이 바람직하고, 0.2% 이상 0.6% 이하인 것이 보다 바람직하다. 콜라겐 졸의 농도가 전술한 하한값 이상인 것에 의해, 겔화가 지나치게 약하지 않고, 또한, 콜라겐 졸의 농도가 전술한 상한값 이하인 것에 의해, 균일한 콜라겐 겔로 이루어지는 다공질막(특히, 반투막)을 얻을 수 있다.
또한, 얻어진 하이드로겔을 건조하여, 하이드로겔 건조체로 해도 된다. 하이드로겔을 건조시킴으로써, 하이드로겔 내의 자유수를 완전히 제거하고, 또한 결합수의 부분 제거를 진행시킬 수 있다.
또한, 얻어진 하이드로겔 건조체를 PBS나 사용하는 배양액 등으로 재수화(再水和)함으로써, 비트리겔(등록상표)로 해도 된다.
이 유리화 공정(하이드로겔 내의 자유수를 완전히 제거한 후에, 결합수의 부분 제거를 진행시키는 공정)의 기간을 오래 할수록, 재수화했을 때에는 투명도, 강도가 우수한 비트리겔(등록상표)를 얻을 수 있다. 그리고, 필요에 따라 단기간의 유리화 후에 재수화하여 얻은 비트리겔(등록상표)을 PBS 등으로 세정하고, 다시 유리화할 수도 있다.
건조 방법으로서는, 예를 들면, 풍건(風乾), 밀폐 용기 내에서 건조(용기 내의 공기를 순환시키고, 항상 건조 공기를 공급), 실리카겔을 둔 환경 하에서 건조시키는 등, 다양한 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 풍건의 방법으로서는, 10℃40% 습도에서 무균으로 유지된 인큐베이터에서 2일간 건조시키는, 혹은 무균 상태의 클린 벤치 내에서 하룻밤, 실온에서 건조시키는 등의 방법을 예시할 수 있다.
그리고, 본 명세서에 있어서, 「비트리겔(등록상표)」이란, 종래의 하이드로겔을 유리화(vitrification)한 후에 재수화하여 얻어지는 안정한 상태에 있는 겔을 나타내고, 본 발명자에 의해, 「비트리겔(vitrigel)(등록상표)」로 명명되어 있다.
또한, 본 명세서에 있어서는, 하이드로겔로 이루어지는 다공질막의 제조 공정을 상세하게 설명하는 데 있어서, 상기 유리화 공정의 직후이며 재수화 공정을 거치고 있지 않은 하이드로겔의 건조체에 대해서는, 간단히 「하이드로겔 건조체」로 했다. 그리고, 상기 유리화 공정 후에 재수화의 공정을 거쳐 얻어진 겔을 「비트리겔(등록상표)」로 구별해서 나타낸다. 또한, 그 비트리겔(등록상표)을 유리화시켜 얻어진 건조체를 「비트리겔(등록상표) 건조체」로 했다. 또한, 비트리겔(등록상표) 건조체에 자외선 조사하는 공정을 실시하여 얻어지는 것을 「자외선 조사 처리를 실시한 비트리겔(등록상표) 건조체」로 했다. 또한, 「자외선 조사 처리를 실시한 비트리겔(등록상표) 건조체」에 재수화하는 공정을 실시하여 얻어지는 겔을 「비트리겔(등록상표) 재료」로 했다. 또한, 비트리겔(등록상표) 재료를 유리화시켜 얻어진 건조체를 「비트리겔(등록상표) 재료의 건조체」로 했다. 따라서, 「비트리겔(등록상표)」 및 「비트리겔(등록상표) 재료」는 수화체(水和體)이다.
즉, 얻어진 비트리겔(등록상표)를 재건조함으로써, 재유리화시켜, 비트리겔(등록상표) 건조체로 해도 된다.
건조 방법으로서는, 앞서 예시한 방법과 동일한 방법을 예로 들 수 있다.
또한, 얻어진 비트리겔(등록상표) 건조체에 자외선을 조사하여, 「자외선 조사 처리를 실시한 비트리겔(등록상표) 건조체」로 해도 된다.
자외선의 조사에는, 공지의 자외선 조사 장치를 사용할 수 있다.
비트리겔(등록상표) 건조체로의 자외선의 조사 에너지는, 단위면적당 총조사량이, 0.1mJ/cm2 이상 6000mJ/cm2 이하인 것이 바람직하고, 10mJ/cm2 이상 4000mJ/cm2 이하인 것이 보다 바람직하고, 100mJ/cm2 이상 3000mJ/cm2 이하인 것이 더욱 바람직하다. 총조사량이 전술한 범위인 것에 의해, 이어지는 재수화 공정에 있어서 얻어지는 비트리겔(등록상표) 재료의 투명도 및 강도를 특히 바람직하게 할 수 있다.
또한, 비트리겔(등록상표) 건조체로의 자외선의 조사는, 복수 회 반복하여 행해도 된다. 비트리겔(등록상표) 건조체로의 자외선의 조사를 반복할 경우, 1번째 자외선의 조사를 행한 후에, 자외선 조사 처리를 실시한 비트리겔(등록상표) 건조체의 재수화 및 재유리화의 공정을 행하고, 그 후 2번째 이후의 재유리화 후의 비트리겔(등록상표) 재료의 건조체로의 자외선의 조사를 행하는 것이 바람직하다.
단위면적당 자외선 총조사량이 동일할 때, 비트리겔(등록상표) 건조체로의 자외선의 조사를, 복수 회로 분할하여 반복하여 행함으로써, 이어지는 재수화 공정에 있어서 얻어지는 비트리겔(등록상표) 재료의 투명도 및 강도를 보다 높일 수 있다. 또한 분할의 횟수는 많을수록 바람직하다. 예를 들면, 비트리겔(등록상표) 건조체로의 자외선의 조사 단위면적당 총조사량이, 1000mJ/cm2 이상 4000mJ/cm2 이하의 범위일 때, 전술한 범위 내에서의 조사 횟수가 2회 이상 10회 이하인 것이 바람직하고, 2회 이상 6회 이하인 것이 보다 바람직하다.
또한, 비트리겔(등록상표) 건조체로의 자외선의 조사를 반복하는 경우, 자외선의 조사 부위를, 비트리겔(등록상표) 건조체의 한쪽 면과 다른쪽 면(상면과 하면)으로 나누어서 조사하고, 그 총조사량을, 비트리겔(등록상표) 건조체로의 단위면적당 자외선 총조사량으로 해도 된다.
자외선의 조사를, 비트리겔(등록상표) 건조체에 행함으로써, 이어지는 재수화 공정에 있어서 얻어지는 비트리겔(등록상표) 재료의 강도와 투명도가 높아지는 것은, 비트리겔(등록상표) 재료 내의 고분자 화합물끼리, 자외선에 의해 가교되기 때문인 것으로 여겨진다. 즉, 전술한 조작에 의해, 높은 투명도 및 강도를 비트리겔(등록상표) 재료에 유지시킬 수 있는 것으로 여겨진다.
또한, 얻어진 자외선 조사 처리를 실시한 비트리겔(등록상표) 건조체를 PBS나 사용하는 배양액 등으로 재수화함으로써, 비트리겔(등록상표) 재료로 해도 된다.
또한, 얻어진 비트리겔(등록상표) 재료를 건조함으로써, 재유리화시켜, 비트리겔(등록상표) 재료의 건조체로 해도 된다.
건조 방법으로서는, 앞서 예시한 방법과 동일한 방법을 예로 들 수 있다.
[부재]
본 실시형태의 세포 봉입용 디바이스에 있어서, 다공질막 이외의 부분을 구성하는 부재는, 액밀성을 가지는 것이면 된다. 또한, 본 실시형태의 세포 봉입용 디바이스에 있어서, 다공질막 이외의 부분을 구성하는 부재는, 통기성을 가지는 것이라도 되고, 통기성을 가지지 않는 것이라도 된다.
상기 부재가, 통기성을 가지는 것인 경우, 산소투과계수가, 예를 들면 100cm3/m2·24hr·atm 이상 5000cm3/m2·24hr·atm 이하이면 되고, 예를 들면 1000cm3/m2·24hr·atm 이상 3000cm3/m2·24hr·atm 이하이면 되고, 예를 들면 1200cm3/m2·24hr·atm 이상 2500cm3/m2·24hr·atm 이하이면 된다. 또한, 이산화탄소투과계수가, 예를 들면 1000cm3/m2·24hr·atm 이상 20000cm3/m2·24hr·atm 이하이면 되고, 예를 들면 3000cm3/m2·24hr·atm 이상 15000cm3/m2·24hr·atm 이하이면 되고, 예를 들면 5000cm3/m2·24hr·atm 이상 10000cm3/m2·24hr·atm 이하이면 된다.
또한, 상기 부재가 통기성을 가지지 않는 것인 경우, 산소투과계수가 예를 들면 100cm3/m2·24hr·atm 이하이면 되고, 예를 들면 50cm3/m2·24hr·atm 이하이면 된다. 또한, 이산화탄소투과계수가, 예를 들면 1000cm3/m2·24hr·atm 이하이면 되고, 예를 들면 500cm3/m2·24hr·atm 이하이면 된다.
본 실시형태의 세포 봉입용 디바이스에 있어서, 다공질막 이외의 부분을 구성하는 부재의 재료로서는, 세포의 배양에 적합한 것이면 된다. 다공질막 이외의 부분을 구성하는 재료로서는, 예를 들면, 소다석 유리, 파이렉스(등록상표) 유리, 바이콜(등록상표) 유리, 석영 유리 등의 유리 재료; 우레탄 고무, 니트릴 고무, 실리콘 고무, 실리콘 수지(예를 들면, 폴리디메틸실록산), 불소 고무, 아크릴 고무, 이소프렌 고무, 에틸렌프로필렌 고무, 클로로술폰화 폴리에틸렌 고무, 에피클로로 하이드린 고무, 클로로프렌계 고무, 스티렌·부타디엔 고무, 부타디엔 고무, 폴리이소부티렌 고무 등의 엘라스토머 재료; 폴리(염화비닐), 폴리(비닐알코올), 폴리(메타크릴산 메틸), 폴리(아세트산 비닐-공-무수 말레산), 폴리(디메틸실록산)모노 메타크릴레이트, 환형 올레핀 폴리머, 플루오로카본 폴리머, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌이민 등의 수상(樹狀) 폴리머를 포함하는 플라스틱; 폴리(아세트산 비닐-공-무수 말레산), 폴리(스티렌-공-무수 말레산), 폴리(에틸렌-공-아크릴산), 또는 이들의 유도체 등의 코폴리머 등을 예로 들 수 있고, 이들로 한정되지 않는다.
또한, 부재의 형상은, 본 실시형태의 세포 봉입용 디바이스의 전체 형상, 및 본 실시형태의 세포 봉입용 디바이스를 구성하는 부분에 따라, 적절하게 선택할 수 있다.
또한, 부재에는, 각각의 세포 봉입용 디바이스를 식별하기 위하여 궁리(예를 들면, 착색, 인자 등)되어 있어도 된다.
(부재의 제조 방법)
본 실시형태에서의 부재는, 사용하는 재료에 따라, 공지의 방법을 사용하여 제조할 수 있다.
예를 들면, 부재의 재료로서 엘라스토머 재료 또는 플라스틱을 사용하는 경우의 제조 방법으로서는, 압축 성형법, 사출 성형법, 압출 성형법 등이 있으며, 이들로 한정되지 않는다.
또한, 예를 들면, 부재의 재료로서 유리 재료를 사용하는 경우의 제조 방법으로서는, 예를 들면, 액적(液適) 성형법, 단너법, 오버플로우법, 플로우트법, 블로우 성형법, 프레스 성형법 등이 있고, 이들로 한정되지 않는다.
[지지체]
본 실시형태의 세포 봉입용 디바이스에 사용되는 지지체의 재료로서는, 예를 들면, 폴리아미드(예를 들면, 나일론 등), 폴리올레핀계 수지, 폴리에스테르계 수지, 폴리스티렌계 수지, 폴리카보네이트, 폴리아미드계 수지, 실리콘 수지 등의 유기 재료; 세라믹스, 유리 등의 무기 재료로 된 것 등이 있으며, 특별한 한정은 없다.
또한, 지지체의 형상은, 예를 들면, 시트형, 봉형 등이 있고, 이들로 한정되지 않는다.
또한, 지지체에는, 각각의 세포 봉입용 디바이스를 식별하기 위하여 궁리(예를 들면, 착색, 인자 등)되어 있어도 된다.
(지지체의 제조 방법)
본 실시형태에서의 지지체는, 사용하는 재료에 따라, 공지의 방법을 사용하여 제조할 수 있다.
예를 들면, 지지체의 재료로서 유기 재료를 사용하는 경우의 제조 방법으로서는, 예를 들면, 압축 성형법, 캘린더 성형법, 사출 성형법, 압출 성형법, 인플레이션 성형 등이 있으며, 이들로 한정되지 않는다.
또한, 예를 들면, 지지체의 재료로서 유리를 사용하는 경우의 제조 방법으로서는, 예를 들면, 앞서(부재의 제조 방법) 예시된 방법과 같은 것이 있다.
또한, 예를 들면, 지지체의 재료로서 세라믹스를 사용하는 경우의 제조 방법으로서는, 예를 들면, 건식 성형법(예를 들면, 금형 성형법, 냉간 정수압 성형법, 핫프레스법, 열간 정수 성형법 등), 소성 성형법(예를 들면, 물레 성형법, 압출 성형법, 사출 성형법), 슬립 캐스팅법(예를 들면, 슬러리 캐스팅법, 가압 캐스팅법, 회전 캐스팅법 등), 테이프 성형법 등이 있으며, 이들로 한정되지 않는다.
[튜브]
본 실시형태의 세포 봉입용 디바이스에 사용되는 튜브의 재료로서는, 특별한 한정은 없으며, 예를 들면, 세포 봉입용 디바이스를 의료용 세포 이식 디바이스로서 활용하는 경우에는, 상기 튜브의 재료로서는, 생체 적합성을 가지는 재료인 것이 바람직하다. 상기 생체 적합성을 가지는 재료로서는, 전술한 「다공질막」에 있어서 예시된 천연 고분자 화합물 및 합성 고분자 화합물을 예로 들 수 있다.
또한, 세포 봉입용 디바이스를 세포의 활성을 어세이하는 시험 등의 인 비트로 시험계에서 사용되는 다세포 구조체를 구축하기 위하여 사용하는 경우에는, 상기 생체 적합성을 가지는 재료라도 되고, 또는 세포의 배양에 적합한 재료라도 된다. 상기 생체 적합성을 가지는 재료로서는, 전술한 「다공질막」에 있어서 예시된 천연 고분자 화합물 및 합성 고분자 화합물을 예로 들 수 있다. 상기 세포의 배양에 적합한 재료로서는, 전술한 [부재]에 있어서 예시된 것과 동일한 것을 예로 들 수 있다.
또한, 튜브로서 바람직하게 사용되는 것으로서 보다 구체적으로는, 예를 들면, 의료용 카테터(catheter), 유치침 등이 있다.
(튜브의 제조 방법)
본 실시형태에서의 튜브는, 사용하는 재료에 따라, 공지의 방법을 사용하여 제조할 수 있다.
구체적인 제조 방법으로서는, 전술한 「다공질막의 제조 방법」 및 「부재의 제조 방법」에 있어서 예시된 방법과 동일한 방법을 사용하고, 튜브형이 되도록 형성하면 된다.
<<세포 봉입용 디바이스의 제조 방법>>
본 실시형태의 세포 봉입용 디바이스는, 원하는 형상이 되도록, 다공질막만, 또는 다공질막과 부재를 조립함으로써 제조할 수 있다. 또한, 필요에 따라, 지지체 및 튜브를 구비하면 된다.
다공질막, 부재, 지지체 및 튜브 각각의 제조 방법은, 앞서 설명한 바와 같이다.
보다 구체적으로는, 도 1에 나타낸 본 실시형태의 세포 봉입용 디바이스의 제조 방법을 이하에서 상세하게 설명한다.
먼저, 부재(2)의 천정면 및 바닥면과 동일한 크기, 또는 부재(2)의 천정면 및 바닥면보다 한층 큰 다공질막(1)을 2장 준비한다. 다음으로, 준비한 다공질막(1)을 각각 부재(2)의 천정면 및 바닥면이 되도록, 접합시킨다.
다공질막(1)과 부재(2)의 접합 방법으로서는, 예를 들면, 접착제에 의한 접합 방법, 양면 테이프에 의한 접합 방법, 히트 실러나 열판, 초음파, 레이저 등을 사용하여 열용착에 의해 접합하는 방법, 장부와 장붓 구멍을 제작함으로써 접합하는 장부 맞춤에 의한 방법(예를 들면, 편방향 맞춤, 2방향 맞춤, 3방향 맞춤, 4방향 맞춤, 턱솔 맞춤, 겹침 맞춤, 2장 장부, 2단 장부 등) 등이 있으며, 이들로 한정되지 않는다. 또한, 이들 접합 방법 중 1종류를 사용할 수도 있고, 2종류 이상을 조합하여 사용할 수도 있다.
또한, 상기 접착제로서는, 세포 독성이 없는 것이면 되고, 예를 들면, 우레탄계 접착제, 시아노아크릴레이트계 접착제, 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 인산 칼슘계 접착제, 레진계 시멘트 등의 합성 화합물의 접착제; 피브린 풀, 젤라틴 풀 등의 천연 화합물의 접착제 등이 있다.
또한, 상기 양면 테이프로서는, 세포 독성이 없는 것이면 되고, 의료용도로 사용되고 있는 것 등이 바람직하게 사용된다. 구체적으로는, 예를 들면, 지지체의 양면에 점착제층이 적층된 구조를 가지고, 상기 점착제층이 고무계, 아크릴계, 우레탄계, 실리콘계, 비닐에테르계의 공지의 점착제로 이루어지는 것 등이 있다. 보다 구체적으로는, 예를 들면, 3M재팬사에서 제조한 피부첩부용 양면 테이프(제품번호: 1510, 1504XL, 1524 등), 니토전공(日東電工)사에서 제조한 피부용 양면 점착 테이프(제품번호: ST502, ST534 등), 니치반 메디컬사에서 제조한 의료용 양면 테이프(제품번호: #1088, #1022, #1010, #809SP, #414125, #1010R, #1088R, #8810R, #2110R 등), DIC사에서 제조한 박형(薄形) 발포체 기재(基材) 양면 접착 테이프(제품번호: #84010, #84015, #84020 등) 등이 있다.
그리고, 백색이나 흑색 등의 착색된 색이 상이한 양면 접착 테이프(예를 들면, DIC사에서 제조한 #84010WHITE 및 #84010BLACK 등)를, 각각 부재(2)의 천정면 및 바닥면에 사용함으로써, 다공질막(1)이 투명 또는 반투명한 경우에는, 천정면측 및 바닥면측을 육안 관찰에 의해 용이하게 구별할 수 있다.
이어서, UV 조사 등에 의해 살균하고, 필요에 따라, 다공질막(1) 또는 부재(2)의 크기를 맞추는 것에 의해, 세포 봉입용 디바이스(10)를 얻을 수 있다.
또한, 도 2에 나타낸 본 실시형태의 세포 봉입용 디바이스(20)와 같이 지지체(3)를 배열하는 경우, 사전에 지지체(3)를 다공질막(1) 또는 부재(2)에 접합시켜 두어도 된다. 또는, 조립된 세포 봉입용 디바이스(20)에 지지체(3)를 접합시켜도 된다. 접합 방법으로서는, 전술한 다공질막과 부재의 접합 방법과 동일한 방법에 의해 고정되어 있어도 되고, 잠금쇠 등을 사용하여 제거 가능하도록 장착되어 있어도 된다.
또한, 도 3에 나타낸 본 실시형태의 세포 봉입용 디바이스(30)와 같이 튜브를 구비하는 경우, 사전에 다공질막(1) 또는 부재(2)에 튜브(4)를 삽입해 두어도 된다. 또는, 조립된 세포 봉입용 디바이스(30)에 튜브(4)를 삽입해도 된다. 튜브의 삽입 방법으로서는, 예를 들면, 튜브로서 유치침을 사용하는 경우, 세포 봉입용 디바이스에 유치침을 끼워넣고, 그 후, 내통침(內筒針)을 뽑는 것에 의해, 튜브를 삽입할 수 있다.
<<세포 봉입용 디바이스의 사용 방법>>
본 실시형태의 세포 봉입용 디바이스는 후술하여 나타낸 바와 같이, 예를 들면, 세포의 배양, 세포의 운반, 조직형 칩, 기관형 칩, 기관형 칩 시스템 등에 사용할 수 있다.
본 명세서에 있어서, 「조직」이란, 1종류의 줄기세포가 분화되어 가는 일정한 계보에 기초한 패턴으로 집합된 구조의 단위를 나타내고, 전체로서 하나의 역할을 가진다. 예를 들면, 표피 각화 세포는, 표피의 기저층(基底層)에 존재하는 줄기세포가 유극층(有棘層)을 경과하여 과립층을 구성하는 세포로 분화되고, 종말 분화하여 각질층을 형성함으로써, 표피로서의 배리어(barrier) 기능을 발휘하고 있다. 따라서, 본 실시형태의 조직형 칩은, 1개의 세포 계보로부터 유래하는 1종류의 세포를 포함하여 다세포 구조체를 구축함으로써, 예를 들면, 상피 조직, 결합 조직, 근 조직, 신경 조직 등을 재현할 수 있다.
또한, 본 명세서에 있어서, 「기관」이란, 2종류 이상의 조직으로 구성되며, 전체로서 하나의 기능을 담당한다. 따라서, 본 실시형태의 기관형 칩은, 세포 계보가 상이한 적어도 2종류의 세포를 포함하여 다세포 구조체를 구축함으로써, 예를 들면, 위, 장, 간장, 신장 등을 재현할 수 있다.
또한, 본 명세서에 있어서, 「기관계」란, 동일한 기능을 가진 2개 이상의 기관이나, 전체로서 일련의 기능을 담당하는 2개 이상의 기관의 통합을 나타낸다. 따라서, 본 실시형태의 기관형 칩 시스템은, 조직형 칩, 또는 기관형 칩을 복수 조합함으로써, 예를 들면, 소화기계, 순환기계, 호흡기계, 비뇨기계, 생식기계, 내분비계, 감각기계, 운동기계, 신경계 등의 기관계를 재현할 수 있다. 그리고, 생체는 이 기관계의 상호 작용에 의해 호메오스타시스(homeostasis)를 유지하고 있다. 본 실시형태의 기관형 칩 시스템에서는, 기관계가 상이한 기관형 칩을 복수 조합할 수 있으므로, 기관계가 상이한 기관의 상호 작용을 해석하는 것도 가능하게 된다. 예를 들면, 소장형 칩, 간장형 칩, 신경형 칩의 순으로 연결한 기관형 칩 시스템에 있어서, 소장형 칩에 약제를 첨가한 경우, 소장형 칩에서 흡수된 약제가 간장형 칩으로 대사되고, 간장형 칩에서 배출된 약제의 간대사물이 신경형 칩에 미치는 독성 등을 해석하는 것이 가능하게 된다.
<세포의 배양 방법>
본 실시형태의 세포 배양 방법은, 전술한 세포 봉입용 디바이스를 사용하는 방법이다.
본 실시형태의 배양 방법에 의하면, 세포를 용이하게 배양하여, 다세포 구조체를 구축할 수 있다. 또한, 세포를 3∼30 일 정도 유지할 수 있어, 종래보다 장기간 세포를 유지할 수 있다. 또한, 본 실시형태의 배양 방법에 의하면, 후술하는 조직형 칩을 얻을 수 있다.
본 실시형태의 배양 방법에 있어서, 이하에서 상세하게 설명한다.
먼저, 세포를 현탁한 배양액을 준비한다. 다음으로, 주사침(익상침, 유치침 등 포함함) 등을 사용하여, 전술한 세포 봉입용 디바이스 내에 현탁액을 주입한다.
주사침은, 다공질막에 찔러서 주입해도 되고, 부재에 찔러서 주입해도 된다. 주사침을 다공질막에 찌르는 경우에 있어서는, 전술한 「다공질막」에 예시된 재료, 함유량, 및 두께가 되는 다공질막을 가지는 세포 봉입용 디바이스를 사용함으로써, 파손되지 않고 사용할 수 있다.
또한, 세포를 현탁한 배양액의 주입 후, 주입한 부위(다공질막 또는 부재)의 재질이, 경도(硬度)가 높고 탄성이 낮은 것인 경우에는, 경도가 낮고 탄성이 높은 재질로 주입공을 막는 것이 바람직하다. 한편, 주입한 부위(다공질막 또는 부재)의 재질이, 경도가 낮고 탄성이 높은 것인 경우는, 경도가 높고 탄성이 낮은 재질로 주입공을 막는 것이 바람직하다.
보다 구체적으로는, 예를 들면, 주입한 부위가 실리콘으로 이루어지는 부재인 경우에는, 스테인레스의 철사 등을 사용하여 주입공을 막으면 되고, 또한, 예를 들면, 주입한 부위가 폴리아크릴레이트로 이루어지는 부재인 경우에는, 실리콘으로 이루어지는 실, 또는, 스테인레스로 이루어지는 철사 등으로 주입공을 막으면 된다.
이어서, 세포를 현탁한 배양액이 주입된 세포 봉입용 디바이스는, 기상 및/또는 액상에서 배양하고, 다세포 구조체를 구축시키면 된다. 기상에서의 배양은, 예를 들면, 비어 있는 샬레(schale) 등의 용기를 사용하여 행하면 되고, 세포가 건조하고 사멸하지 않을 정도의 시간에 있어서 배양하면 된다. 또한, 액상에서의 배양은, 예를 들면, 배양액을 포함하는 샬레 등의 용기를 사용하여 행하면 된다. 또한, 기상 및 액상에서의 배양은, 예를 들면, 도 2에 나타낸 지지체를 가지는 세포 봉입용 디바이스를 사용하여, 배양액을 포함하는 샬레 등의 용기에 상기한 세포 봉입용 디바이스를 띄우고 행하면 된다.
본 실시형태의 배양 방법에 있어서 사용되는 세포로서는, 예를 들면, 포유 동물 세포, 조류세포, 파충류세포, 양서류세포, 어류세포 등의 척추동물 세포; 곤충세포, 갑각류세포, 연체동물 세포, 원생동물 세포 등의 무척추동물 세포; 그램양성세균(예를 들면, 바실러스종 등), 그램음성세균(예를 들면, 대장균 등) 등의 세균: 효모, 식물 세포, 및 이들의 단일세포 또는 복수의 세포로 구성되는 작은 생명 개체 등이 있다.
상기 작은 생명 개체로서는, 예를 들면, 아메바, 짚신벌레, 클로스테리움, 규조, 클로렐라, 유글레나, 파쿠스 등의 단세포 생물; 물벼룩, 아르테미아의 유생, 요각류, 패충류, 초갑류의 유생, 엽하아강의 유생, 낭하상목류의 유생, 진하상목류의 유생 등의 미소(微小) 갑각류 동물; 플라나리아(가늘게 절단한 후의 재생 플라나리아도 포함함), 육생 절족동물의 유생, 선형동물, 식물의 종자(특히, 발아 종자), 캘러스, 프로토플라스트, 해양미생물(예를 들면, 비브리오속, 슈도모나스속, 에로모나스속, 알테로모나스속, 플라보박테륨속, 사이토파가속, 플렉시박터속 등의 해양세균, 남조, 갈색편모조류, 와편모충, 규조, 침폄모조류, 황금색조, 하프토조, 유글레나조, 프라시노조, 녹조 등의 조류 등), 치어류, 치패류 등을 들 수 있으며, 이들로 한정되지 않는다.
예를 들면, 본 실시형태의 세포 봉입용 디바이스를 사용하여 발아 종자를 배양하는 경우에 있어서, 세포 봉입용 디바이스의 천정면은 발아한 싹이 관통할 수 있을 정도의 경도를 가지고, 또한 생분해성 재료로 이루어지는 것에 의해, 발아 종자를 디바이스 내에 넣은 것을 그대로 토양에 심고, 식물체를 생육시킬 수 있다.
그리고, 본 명세서에 있어서 「생분해성 재료」란, 토양중 또는 수중의 미생물 등에 의해 무기물에 분해되는 성질을 가지는 재료를 의미한다.
상기 척추동물 세포(특히, 포유동물 세포)로서는, 예를 들면, 생식 세포(정자, 난자 등), 생체를 구성하는 체세포, 줄기세포, 전구 세포, 생체로부터 분리된 암 세포, 생체로부터 분리되고 불사화능을 획득하여 체외에서 안정하여 유지되는 세포(세포주), 생체로부터 분리되고 인위적으로 유전자 개변된 세포, 생체로부터 분리되고 인위적으로 핵이 교환된 세포 등이 있으며, 이들로 한정되지 않는다. 또한, 이들 세포의 세포괴(細胞塊)(스페로이도)를 사용해도 된다. 또한, 생체의 정상 조직 또는 암 조직으로부터 분리된 작은 조직편을, 그대로 세포괴와 마찬가지로 사용해도 된다.
생체를 구성하는 체세포로서는, 예를 들면, 피부, 신장, 비장, 부신, 간장, 폐, 난소, 췌장, 자궁, 위, 결장, 소장, 대장, 방광, 전립선, 고환, 흉선, 근육, 결합 조직, 뼈, 연골, 혈관 조직, 혈액, 심장, 눈, 뇌, 신경 조직 등의 임의의 조직으로부터 채취되는 세포 등이 있으며, 이들로 한정되지 않는다. 체세포로서, 보다 구체적으로는, 예를 들면, 섬유아 세포, 골수 세포, 면역 세포(예를 들면, B 림프구, T 림프구, 호중구, 마크로파지, 단구 등), 적혈구, 혈소판, 뼈세포, 주피 세포, 수상 세포, 표피 각화 세포(케라티노사이토), 지방 세포, 단엽 세포, 상피 세포, 표피 세포, 내피 세포, 혈관 내피 세포, 림프관 내피 세포, 간세포, 랑게르한스섬 세포 (예를 들면, α세포, β세포, δ세포, ε세포, PP세포 등), 연골 세포, 난구 세포, 글리아 세포, 신경 세포(뉴런), 올리고덴드로사이트, 마이크로글리아, 성상교세포, 심근 세포, 식도 세포, 근육 세포(예를 들면, 평활근 세포, 골격근 세포 등), 멜라닌 세포, 단핵 세포 등이 있으며, 이들로 한정되지 않는다.
줄기세포란, 자기를 복제하는 능력과 다른 복수 계통의 세포로 분화되는 능력을 겸비한 세포이다. 줄기세포로서는, 예를 들면, 배성 줄기세포(ES 세포), 배성 종양세포, 배성 생식 줄기세포, 인공다능성 줄기세포(iPS 세포), 신경 줄기세포, 조혈 줄기세포, 간엽계 줄기세포, 간 줄기세포, 췌장 줄기세포, 근 줄기세포, 생식 줄기세포, 장 줄기세포, 암 줄기세포, 모포 줄기세포 등이 있고, 이들로 한정되지 않는다.
전구 세포란, 상기 줄기세포로부터 특정 체세포 또는 생식 세포로 분화되는 도중의 단계에 있는 세포이다.
암 세포란, 체세포로부터 파생하여 무한한 증식 능력을 획득한 세포이며, 주위의 조직에 침윤하고, 또는 전이를 일으키는 악성 신생물이다. 암 세포의 유래가 되는 암으로서는, 예를 들면, 유방암(예를 들면, 침윤성 유관암, 비침윤성 유관암, 염증성 유방암 등), 전립선암(예를 들면, 호르몬 의존성 전립선암, 호르몬 비의존성 전립선암 등), 췌장암(예를 들면, 췌장관암 등), 위암(예를 들면, 유두선암, 점액성 선암, 선편평 상피암 등), 폐암(예를 들면, 비소세포 폐암, 소세포 폐암, 악성 중피종 등), 결장암(예를 들면, 소화관간질 종양 등), 직장암(예를 들면, 소화관간질 종양 등), 대장암(예를 들면, 가족성 대장암, 유전성 비폴리포시스 대장암, 소화관간질 종양 등), 소장암(예를 들면, 비호지킨림프종, 소화관간질 종양 등), 식도암, 십이지장암, 설암, 인두암(예를 들면, 상인두암, 중인두암, 하인두암 등), 두경부암, 타액선암, 뇌종양(예를 들면, 송과체별세포종양, 모양세포성별세포종, 미만성 별세포종, 퇴형성성 별세포종 등), 신경초종, 간장암(예를 들면, 원전성 간암, 간외 담관암 등), 신장암(예를 들면, 신장세포암, 신우와 요관의 이행 상피암 등), 담낭암, 췌장암, 자궁내막암, 자궁경암, 난소암(예를 들면, 상피성 난소암, 성선외 배세포종양, 난소성 배세포종양, 난소 저악성도 종양 등), 방광암, 요도암, 피부암(예를 들면, 안구 내 (안)흑색종, 메르켈세포암 등), 혈관종, 악성 림프종(예를 들면, 세망 육종, 림프 육종, 호지킨병 등), 멜라노마(악성 흑색종), 갑상선암(예를 들면, 갑상선수양암 등), 부갑상선암, 비강암, 부비강암, 뼈종양(예를 들면, 골육종, 유잉종양, 자궁육종, 연부조직육종 등), 전이성 수아종, 혈관섬유종, 융기성 피부섬유육종, 망막육종, 음경암, 정소종양, 소아고형암(예를 들면, 윌무스종양, 소아신장종양 등), 카포지 육종, AIDS에 기인하는 카포지 육종, 상악동 종양, 섬유성 조직구종, 평활근 육종, 횡문근 육종, 만성골수증식성 질환, 백혈병(예를 들면, 급성골수성 백혈병, 급성 림프아구성 백혈병 등) 등이 있으며, 이들로 한정되지 않는다.
또한, 본 명세서에 있어서, 「암(癌)」이란, 진단명을 나타낼 때 사용되고, 「암」이란, 악성 신생물의 총칭을 나타낼 때 사용된다.
세포주란, 생체외에서의 인위적인 조작에 의해 무한한 증식 능력을 획득한 세포아다. 세포주로서는, 예를 들면, HCT116, Huh7, HEK293(인간태아신장세포), HeLa(인간자궁경부암 세포주), HepG2(인간간암 세포주), UT7/TPO(인간백혈병 세포주), CHO(차이니즈 햄스터 난소 세포주), MDCK, MDBK, BHK, C-33A, HT-29, AE-1, 3D9, Ns0/1, Jurkat, NIH3T3, PC12, S2, Sf9, Sf21, High Five, Vero 등이 있으며, 이들로 한정되지 않는다.
본 실시형태의 배양 방법에 사용되는 동물 세포의 배양액은, 세포의 생존 증식에 필요한 성분(무기염, 탄수화물, 호르몬, 필수 아미노산, 비필수 아미노산, 비타민) 등을 포함하는 기초 배양액이면 되고, 세포의 종류에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 상기 배양액으로서는, 예를 들면, 둘베코수정이글배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium; DMEM), Minimum Essential Medium(MEM), RPMI-1640, Basal Medium Eagle(BME), Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-12(DMEM/F -12), Glasgow Minimum Essential Medium(Glasgow MEM) 등이 있으며, 이들로 한정되지 않는다.
또한, 세균, 효모, 식물 세포, 및 이들의 단일 세포 또는 복수의 세포로 구성되는 작은 생명 개체의 배양액은, 각각의 생육에 적합한 조성의 배양액을 조제하면 된다.
또한, 본 실시형태의 배양 방법에 있어서, 세포를 현탁하는 배양액에, 세포외 매트릭스 유래 성분, 생리 활성 물질 등을 혼합하고, 주입할 수도 있다.
상기 세포외 매트릭스 유래 성분으로서는, 전술한 「다공질막」에 있어서 예시된 것과 동일한 것을 예로 들 수 있다.
또한, 상기 생리 활성 물질로서는, 예를 들면, 세포 증식 인자, 분화 유도 인자, 세포 접착 인자 등이 있으며, 이들로 한정되지 않는다. 예를 들면, 분화 유도 인자를 포함함으로써, 주입하는 세포가 줄기세포, 또는 전구 세포 등인 경우, 상기 줄기세포, 또는 전구 세포를 분화 유도하여, 원하는 조직을 재현한 다세포 구조체를 구축시킬 수 있다.
또한, 본 실시형태의 배양 방법에 있어서, 세포를 현탁한 배양액을 세포 봉입용 디바이스의 용량 가득하게 주입해도 되고, 또는, 세포 봉입용 디바이스의 용량에 미치지 않는 양을 주입해도 된다. 예를 들면, 세포 봉입용 디바이스가 도 1에 나타낸 바와 같이 다공질막을 천정면 및 바닥면에 구비하는 구조이며, 다공질막의 재료가 콜라겐인 경우, 주사침 등에 의해 세포를 현탁한 배양액을 세포 봉입용 디바이스의 용량에 미치지 않는 양을 주입하고, 뽑아낸다. 이로써, 감압으로 세포 봉입용 디바이스의 천정면과 바닥면이 패이고, 천정면의 다공질막과 바닥면의 다공질막에 의해 세포가 협지되어, 콜라겐을 사용한 샌드위치 배양을 행할 수 있다.
본 실시형태의 배양 방법에 있어서, 동물 세포의 배양 조건으로서는, 배양하는 세포의 종류에 따라 적절하게 선택할 수 있다.
배양 온도로서는, 예를 들면, 25℃ 이상 40℃ 이하라도 되고, 예를 들면, 30℃ 이상 39℃ 이하라도 되고, 예를 들면, 35℃ 이상 39℃ 이하라도 된다.
또한, 배양 환경은, 예를 들면, 약 5%의 CO2 조건 하라도 된다.
배양 시간으로서는, 세포의 종류, 세포수 등에 의해 적절하게 선택할 수 있고, 예를 들면, 3일 이상 30일 이하라도 되고, 예를 들면, 5일 이상 20일 이하라도 되고, 예를 들면, 7일 이상 15일 이하라도 된다.
또한, 세균, 효모, 식물 세포, 및 이들의 단일 세포 또는 복수의 세포로 구성되는 작은 생명 개체의 배양 조건은, 각각의 생육에 적합한 환경이나 시간을 설정하면 된다.
<세포의 운반 방법>
본 실시형태의 세포 운반 방법은, 전술한 세포 봉입용 디바이스를 사용하는 방법이다.
본 실시형태의 운반 방법에 의하면, 세포를 안전하면서도 확실하게 운반할 수 있고, 장기간의 운반에도 대응할 수 있다. 본 실시형태의 운반 방법에 대하여, 이하에서 상세하게 설명한다.
먼저, 세포를 현탁한 배양액을 준비한다.
다음으로, 주사침(익상침, 유치침 등 포함함) 등을 사용하여, 전술한 세포 봉입용 디바이스 내에 세포를 현탁한 배양액을 주입한다.
본 실시형태의 운반 방법에 있어서 사용되는 세포 또는 작은 생명 개체로서는, 전술한 「세포의 배양 방법」에 있어서 예시된 것과 동일한 것을 예로 들 수 있다. 또한, 본 실시형태의 운반 방법에 있어서 사용되는 배양액으로서는, 전술한 「세포의 배양 방법」에 있어서 예시된 것과 동일한 것을 예로 들 수 있다.
또한, 본 실시형태의 세포 운반 방법에 있어서, 세포가 동물 세포인 경우, 세포를 현탁하는 배양액에, 세포외 매트릭스 유래 성분, 생리 활성 물질 등을 혼합하고, 주입해도 된다.
상기 세포외 매트릭스 유래 성분으로서는, 전술한 「다공질막」에 있어서 예시된 것과 동일한 것을 예로 들 수 있다.
또한, 상기 생리 활성 물질로서는, 전술한 「세포의 배양 방법」에 있어서 예시된 것과 동일한 것을 예로 들 수 있다.
세포 봉입용 디바이스 내에 봉입된 세포는, 다세포 구조체가 구축되는 도중의 단계라도 되고, 다세포 구조체가 구축된 후라도 된다. 그 중에서도, 즉 인 비트로 시험계 또는 생체 이식에 이용할 수 있으므로, 본 실시형태의 운반 방법에서의 세포 봉입용 디바이스 내에 봉입된 세포는 다세포 구조체가 구축된 후인 것이 바람직하다.
이어서, 세포가 봉입된 세포 봉입용 디바이스(후술하는 조직형 칩, 또는 후술하는 기관형 칩)를, 배양액을 포함하는 개폐 가능한 밀봉 용기에 봉입하고, 운반한다.
본 실시형태의 운반 방법에서의 밀봉 용기는, 개폐 가능한 것이면 되고, 특별한 한정은 없다. 밀봉 용기로서는, 예를 들면, 스크루 캡이 부착된 코니컬튜브, 스크루 캡이 부착된 세포 배양용 플라스크 등이 있으며, 이들로 한정되지 않는다.
운반하는 조건으로서는, 운반하는 세포 또는 작은 생명 개체의 종류에 따라 적절하게 선택할 수 있다.
운반 시의 온도로서는, 예를 들면, 4℃ 이상 40℃ 이하라도 되고, 예를 들면, 10℃ 이상 39℃ 이하라도 되고, 예를 들면, 18℃ 이상 37℃ 이하라도 된다.
또한, 운반 시의 환경은, 세포가 동물 세포인 경우, 상기 세포가 봉입된 세포 봉입용 디바이스가, 배양액이 용량 가득하게 채워진 밀봉 용기에 봉입된 상태라도 된다. 또는, 상기 세포가 봉입된 세포 봉입용 디바이스가, 배양액이 용량의 일부에 채워진 밀봉 용기에 봉입된 상태로서, 상기 밀봉 용기 내의 기체 부분에 있어서, 예를 들면, 약 5% CO2를 함유하는 공기의 조건 하라도 된다.
운반 시간으로서는, 세포의 종류, 세포수 등에 의해 적절하게 선택할 수 있고, 예를 들면, 1시간 이상 30일 이하라도 되고, 예를 들면, 1일 이상 20일 이하라도 되고, 예를 들면, 2일 이상 7일 이하라도 된다.
상기 세포가 봉입된 세포 봉입용 디바이스(후술하는 조직형 칩, 또는 후술하는 기관형 칩)는, 그 상태로 인 비트로 시험계 또는 생체 이식에 이용해도 되고, 세포 봉입용 디바이스를 파괴하고, 봉입된 세포를 꺼내고, 증식 배양할 목적이나 이식할 목적 등으로 사용해도 된다.
<조직형 칩>
본 실시형태의 조직형 칩은, 1종류의 세포(특히, 동물 세포)가 봉입된 전술한 세포 봉입용 디바이스를 구비한다.
본 실시형태의 조직형 칩은, 일일이 배양 모델을 구축할 필요가 없고, 종래의 배양 모델, 또는 동물 실험을 대체하여, 각종 질환에 대한 후보 약제의 스크리닝, 혹은 후보 약제를 비롯한 화학 물질의 정상인 조직에 대한 동태 및 독성의 평가 시험계에 활용할 수 있다.
또한, 종래의 배양 모델 또는 이식용의 재생 조직은 구축 후, 즉석에서 사용하지 않으면 안되며, 시간적 제약이 있었던 것에 비해, 본 실시형태의 조직형 칩은, 장기간 배양이 가능하다.
또한, 본 실시형태의 조직형 칩에 있어서, 세포 봉입용 디바이스가 생체 적합성을 가지는 재료로 이루어지는 경우, 의료용 세포 이식 디바이스로서 재생 의료로의 활용을 기대할 수 있다.
본 실시형태의 조직형 칩에 봉입된 세포로서는, 전술한 「세포의 배양 방법」에 있어서 예시된 것과 동일한 것을 예로 들 수 있다. 또한, 봉입된 세포의 종류는, 구축하고자 하는 조직의 종류에 따라, 적절하게 선택된 것이면 된다
또한, 본 실시형태의 조직형 칩에 봉입된 세포는, 다세포 구조체가 구축되는 도중의 단계라도 되고, 다세포 구조체가 구축된 후라도 된다. 본 실시형태의 조직형 칩은, 봉입된 세포가 다세포 구조체를 구축한 후라도, 3∼21 일 정도의 장기간 배양이 가능하다.
본 실시형태의 조직형 칩에 봉입된 세포의 밀도는, 구축하고자 하는 조직의 종류에 따라 상이하지만, 2.0×103세포/mL 이상 1.0×109세포/mL 이하인 것이 바람직하고, 2.0×105세포/mL 이상 1.0×107세포/mL 이하인 것이 보다 바람직하다.
세포 밀도가 전술한 범위 내인 것에 의해, 생체 조직에 보다 근접한 세포 밀도의 조직형 칩을 얻을 수 있다.
본 실시형태의 조직형 칩은, 전술한 「세포의 배양 방법」에 기재된 방법을 사용하여, 제조할 수 있다. 또한, 제조 후의 조직형 칩의 유지 조건에 대해서도, 전술한 「세포의 배양 방법」에 기재된 배양 조건과 동일한 조건으로 하면 된다. 또한, 조직형 칩의 내부에는, 배양액이나 공기 등의 기체를 포함해도 되고, 배양액이나 공기 등의 기체를 포함하지 않아도 된다. 조직형 칩 내에 배양액이나 공기 등의 기체를 포함하지 않는 경우, 세포, 또는 세포 및 세포외 매트릭스 유래 성분이 밀(密)하게 접착하고 있고, 생체 내의 조직에 보다 근접한 구성의 다세포 구조체를 구축하고 있다.
<기관형 칩>
본 실시형태의 기관형 칩은, 적어도 2종류의 세포(특히, 동물 세포)가 봉입된 전술한 세포 봉입용 디바이스를 구비한다.
본 실시형태의 기관형 칩은, 일일이 배양 모델을 구축할 필요가 없고, 종래의 배양 모델, 또는 동물 실험을 대체하여, 각종 질환에 대한 후보 약제의 스크리닝, 혹은 후보 약제를 비롯한 화학 물질의 정상인 기관에 대한 동태 및 독성의 평가 시험계에 활용할 수 있다.
또한, 종래의 배양 모델 또는 이식용의 재생 조직은 구축 후, 즉석에서 사용하지 않으면 안되며, 시간적 제약이 있었던 것에 비해, 본 실시형태의 기관형 칩은, 장기간 배양이 가능하다.
또한, 본 실시형태의 기관형 칩에 있어서, 세포 봉입용 디바이스가 생체 적합성을 가지는 재료로 이루어지는 경우, 의료용 세포 이식 디바이스로서 재생 의료로의 활용을 기대할 수 있다.
본 실시형태의 기관형 칩에 봉입된 세포로서는, 전술한 「세포의 배양 방법」에 있어서 예시된 것과 동일한 것을 예로 들 수 있다. 또한, 봉입된 세포의 종류는, 적어도 2종류의 세포가 봉입되어 있으면 되고, 구축하고자 하는 기관의 종류에 따라, 적절하게 선택되면 된다.
또한, 본 실시형태의 기관형 칩에 봉입된 세포는, 다세포 구조체가 구축되는 도중의 단계라도 되고, 다세포 구조체가 구축된 후라도 된다. 본 실시형태의 기관형 칩은, 봉입된 세포가 다세포 구조체를 구축한 후라도, 3∼21 일 정도의 장기간 배양이 가능하다.
또한, 예를 들면, 본 실시형태의 기관형 칩에 있어서, 상기 세포 봉입용 디바이스의 내측 천정면에 상피계 세포(예를 들면, 표피 각화 세포 등)로 이루어지는 다세포 구조체(즉, 상피 조직)를 구축하고, 내측의 바닥면에 간충직 세포(예를 들면, 진피 섬유아세포 등)로 이루어지는 다세포 구조체(즉, 간축직 조직)를 구축함으로써, 세포 봉입용 디바이스 내에서 조직간에서의 물질의 수수(授受)를 용이하게 재현할 수 있다.
본 실시형태의 기관형 칩에 봉입된 세포의 밀도는, 구축하고자 하는 기관의 종류에 따라 상이하지만, 2.0×103세포/mL 이상 1.0×109세포/mL 이하인 것이 바람직하고, 2.0×105세포/mL 이상 1.0×107세포/mL 이하인 것이 보다 바람직하다.
세포 밀도가 전술한 범위 내인 것에 의해, 생체내의 기관에 보다 근접한 세포 밀도의 기관형 칩을 얻을 수 있다.
본 실시형태의 기관형 칩은, 전술한 「세포의 배양 방법」에 기재된 방법을 사용하여, 제조할 수 있다. 또한, 제조 후의 기관형 칩의 유지 조건에 대해서도, 전술한 「세포의 배양 방법」에 기재된 배양 조건과 동일 조건으로 하면 된다. 또한, 기관형 칩의 내부에는, 배양액이나 공기 등의 기체를 포함해도 되고, 배양액이나 공기 등의 기체를 포함하지 않아도 된다. 기관형 칩 내에 배양액이나 공기 등의 기체를 포함하지 않을 경우, 세포, 또는 세포 및 세포외 매트릭스 유래 성분이 밀하게 접착하고 있고, 생체 내의 기관에 보다 근접한 구성의 다세포 구조체를 구축하고 있다.
<다세포 구조체를 제공하기 위한 키트>
본 실시형태의 키트는, 다세포 구조체를 제공하기 위한 키트이며, 전술한 조직형 칩 또는 전술한 기관형 칩과 배양액을 포함하는 개폐 가능한 밀봉 용기를 구비한다.
본 실시형태의 키트는, 일일이 배양 모델을 구축할 필요가 없고, 종래의 배양 모델 또는 동물 실험을 대체하여, 각종 질환에 대한 후보 약제의 스크리닝 또는 후보 약제를 비롯한 화학 물질의 정상인 조직이나 기관에 대한 동태 및 독성의 평가 시험계에 활용할 수 있다.
또한, 종래의 배양 모델 또는 이식용의 재생 조직은 구축 후, 즉석에서 사용하지 않으면 안되며, 시간적 제약이 있었던 것에 비해, 본 실시형태의 키트는, 장기간 배양이 가능하다.
본 실시형태의 키트에서의 조직형 칩 또는 기관형 칩에 봉입된 세포는, 다세포 구조체가 구축되는 도중의 단계라도 되고, 다세포 구조체가 구축된 후라도 된다. 그 중에서도, 즉시 인 비트로 시험계 또는 생체 이식에 사용할 수 있으므로, 본 실시형태의 키트에서의 조직형 칩 또는 기관형 칩에 봉입된 세포는 다세포 구조체가 구축된 후인 것이 바람직하다.
본 실시형태의 키트에서의 밀봉 용기는, 전술한 「세포의 운반 방법」에 있어서 예시된 것과 동일한 것을 예로 들 수 있다.
밀봉 용기의 재료로서는, 액밀성을 가지는 것이면 된다. 또한, 밀봉 용기는, 통기성을 가지는 것이라도 되고, 통기성을 가지지 않는 것이라도 된다. 밀봉 용기의 재료로서 보다 구체적으로는, 전술한 「부재」에 있어서 예시된 것과 동일한 것을 예로 들 수 있다. 그 중에서도, 밀봉 용기의 재료로서는, 파손되기 어렵고, 경량인 것을 고려하여, 플라스틱인 것이 바람직하다.
본 실시형태의 키트에서의 배양액은, 조직형 칩 또는 기관형 칩에 봉입된 세포의 종류에 따라 적절하게 선택할 수 있고, 구체적으로는, 전술한 「세포의 배양 방법」에 있어서 예시된 것과 동일한 것을 예로 들 수 있다.
또한, 본 실시형태의 키트에 있어서, 배양액은, 밀봉 용기의 용량 가득하게 포함되는 것이 바람직하다. 이는, 밀봉 용기에 배양액을 용량 가득하게 주입하고, 밀봉함으로써, 조직형 칩 또는 기관형 칩의 건조를 막고, 조직형 칩 또는 기관형 칩을 안전하게 운반할 수 있다.
본 실시형태의 키트에 있어서, 밀봉 용기 중에 포함되는 조직형 칩 또는 기관형 칩은 1개라도 되고, 2개 이상이라도 된다. 2개 이상인 경우, 동일한 종류의 다세포 구조체가 구축된 조직형 칩 또는 기관형 칩인 것이 바람직하다.
본 실시형태의 키트는, 또한, 밀봉 용기에 포함되는 배양액과는 별도로, 배양액을 구비하고 있어도 된다. 배양액이 밀봉 용기에 포함되는 것과 동일한 종류라도 되고, 다른 종류라도 된다. 배양액을 다르게 구비함으로써, 본 실시형태의 키트를 인 비트로 시험계 또는 생체 이식 등에 있어서 사용할 때까지의 동안에, 조직형 칩, 또는 기관형 칩을 배양하기 위한 교환용 배양액으로서 사용할 수 있다.
<기관형 칩 시스템>
본 실시형태의 기관형 칩 시스템은, 전술한 조직형 칩 또는 전술한 기관형 칩을 적어도 2개 구비하고, 상기 조직형 칩 또는 상기 기관형 칩이 세포 봉입성을 유지하면서 연결되어 있다.
본 실시형태의 기관형 칩 시스템은, 일일이 배양 모델을 구축할 필요가 없고, 종래의 배양 모델, 또는 동물 실험을 대체하여, 각종 질환에 대한 후보 약제의 스크리닝, 혹은 후보 약제를 비롯한 화학 물질의 정상인 복수의 조직이나 기관에 대한 동태 및 독성의 평가 시험 등으로의 활용을 기대할 수 있다.
도 4의 (A)는, 본 발명의 제1 실시형태에 따른 기관형 칩 시스템을 모식적으로 나타낸 사시도이다.
여기에 나타낸 기관형 칩 시스템(1A)은, 3개의 조직형 칩(100)이 각각 튜브(101)을 통하여 연결된 구조이다.
예를 들면, 배양액을 좌측의 화살표 방향으로부터 우측의 화살표 방향으로 흐르게 함으로써, 3개의 조직형 칩(100)을 연결된 채의 상태에서 배양할 수 있다. 또한, 예를 들면, 각종 질환에 대한 후보 약제를 좌측의 화살표 방향으로부터 우측의 화살표 방향으로 흐르게 함으로써, 질환에 대한 약효, 약제 및 그 대사물의 대사 경로나 세포 독성 등을 검증할 수 있다.
도 4의 (A)에 나타낸 조직형 칩(100)은, 전술한 「조직형 칩」에 기재된 것과 동일한 것이다. 조직형 칩(100)에 구축된 다세포 구조체를 구성하는 세포(도시하지 않음)의 종류는, 원하는 기관, 또는 기관계의 종류에 따라 적절하게 선택할 수 있다.
또한, 도 4의 (A)에 나타낸 튜브(101)는, 도 3의 튜브(4)와 동일하며, 그 구성은 전술한 「튜브」에 기재된 것과 동일하다.
도 4의 (B)는, 본 발명의 제2 실시형태에 따른 기관형 칩 시스템을 모식적으로 나타낸 사시도이다.
여기에 나타낸 기관형 칩 시스템(1B)는, 동일한 크기에 3개의 조직형 칩(200)이 중첩된 구조이다. 이 때, 각각의 조직형 칩(200) 중 적어도 천정면 및 바닥면은 다공질막이다.
예를 들면, 배양액을 상측의 화살표 방향으로부터 하측의 화살표 방향으로 흐르게 함으로써, 3개의 조직형 칩(200)을 중첩한 채의 상태에서 배양할 수 있다. 또한, 예를 들면, 각종 질환에 대한 후보 약제를 상측의 화살표 방향으로부터 하측의 화살표 방향으로 흐르게 함으로써, 질환에 대한 약효, 약제 및 그 대사물의 대사 경로나 세포 독성 등을 검증할 수 있다.
도 4의 (C)는, 본 발명의 제3 실시형태에 따른 기관형 칩 시스템을 모식적으로 나타낸 사시도이다.
여기에 나타낸 기관형 칩 시스템(1C)은, 크기가 상이한 4개의 조직형 칩(300)을 가지고, 가장 큰 조직형 칩(300) 중에, 작은 조직형 칩(300)이 봉입된 구조이다. 이 때, 가장 큰 조직형 칩(300)의 적어도 천정면 및 바닥면은 다공질막이며, 가장 큰 조직형 칩(300)에 봉입된 조직형 칩(300)은 전면 다공질막이다.
예를 들면, 배양액을 포함하는 샬레 등의 용기에 기관형 칩 시스템(1C)을 넣는 것에 의해 배양할 수 있다. 또한, 예를 들면, 각종 질환에 대한 후보 약제를 포함하는 샬레 등의 용기에 기관형 칩 시스템(1C)을 넣는 것에 의해, 질환에 대한 약효, 약제 및 그 대사물의 대사 경로나 세포 독성 등을 검증할 수 있다.
도 4의 (D)는, 본 발명의 제4 실시형태에 따른 기관형 칩 시스템을 모식적으로 나타낸 사시도이다.
여기에 나타낸 기관형 칩 시스템(1D)은, 크기가 상이한 4개의 조직형 칩(400)이 큰 순서에 아래로부터 중첩된 구조이다. 이 때, 각각의 조직형 칩(400)의 적어도 천정면 및 바닥면은 다공질막이다.
예를 들면, 배양액을 상측의 화살표 방향으로부터 하측의 화살표 방향으로 흐르게 함으로써, 4개의 조직형 칩(400)을 중첩한 채의 상태에서 배양할 수 있다. 또한, 예를 들면, 각종 질환에 대한 후보 약제를 상측의 화살표 방향으로부터 하측의 화살표 방향으로 흐르게 함으로써, 질환에 대한 약효, 약제 및 그 대사물의 대사 경로나 세포 독성 등을 검증할 수 있다.
본 실시형태의 기관형 칩 시스템은, 도 4의 (A)∼(D)로 한정되지 않고, 본 실시형태의 기관형 칩 시스템의 효과를 손상시키지 않는 범위 내에 있어서, 도 4의 (A)∼(D)에 나타낸 것의 일부 구성이 변경 또는 삭제된 것이나, 지금까지 설명한 것에 또 다른 구성이 추가된 것이라도 된다.
예를 들면, 도 4의 (A)∼(D)에 있어서 조직형 칩을 구비하는 경우를 예시하였으나, 기관형을 적어도 일부에 구비하는 것이라도 된다.
예를 들면, 도 4의 (A)에 나타낸 기관형 칩 시스템은, 각 튜브가 마개나 밸브 등의 개폐 가능한 장치를 구비하고 있어도 된다.
또한, 도 4의 (B) 및 도 4의 (D)에 나타낸 기관형 칩 시스템은, 각각의 조직형 칩이 지지체를 가지고 있어도 되고, 또한 각각의 조직형 칩을 고정시키기 위하여, 천정면 및 바닥면의 외주(外周)를 접착제 등으로 고정하고 있어도 된다.
또한, 본 실시형태의 기관형 칩 시스템에 있어서는, 각 구성(조직형 칩, 튜브 등)의 크기나 형상은, 목적에 따라 임의로 조절할 수 있다.
본 실시형태의 기관형 칩 시스템은, 그 자체로, 예를 들면, 간장, 위, 장 등의 장기를 재현할 수 있다. 또한, 본 실시형태의 기관형 칩 시스템을 복수 조합함으로써, 예를 들면, 소화기계, 순환기계, 호흡기계, 비뇨기계, 생식기계, 내분비계, 감각기계, 운동기계, 신경계 등의 기관계를 재현할 수 있다.
[실시예]
이하, 실시예에 의해 본 발명을 설명하지만, 본 발명은 이하의 실시예로 한정되는 것은 아니다.
[제조예 1] 세포 봉입용 디바이스(지지체가 부착된)의 제작 1
(1) 먼저, 환형 나일론 막 지지체가 부착된 네이티브 콜라겐비트리겔(등록상표)막(네이티브 콜라겐의 단위면적당 함유량: 0.5mg/cm2)(이하, 간단히 「콜라겐비트리겔(등록상표)막」으로 칭하는 경우가 있음)을 공지의 방법(참고 문헌: 일본공개특허 제2015-35978호 공보)에 준하여 조제했다.
(2) 이어서, 조제한 콜라겐비트리겔(등록상표)막을, 비닐 시트 상에 신전(伸展)하고, 그 위에 실리콘 링(내경 9.8mm×두께 1.9mm)을 탑재하였다.
(3) 이어서, 콜라겐비트리겔(등록상표)막 상의 실리콘 링의 주위에, 0.25% 콜라겐 졸 용액 0.4mL를 첨가하고, 또 1장의 콜라겐비트리겔(등록상표)막을 중첩시킴으로써, 실리콘 링을 2장의 콜라겐비트리겔(등록상표)막의 대략 중앙에 협지하였다.
공지의 방법(참고 문헌: 일본공개특허 제2015-203018호 공보)에 준하여, 접착제로서 사용한 0.25% 콜라겐 졸 용액은, 세포 배양용 콜라겐 산성 용액 I-AC(고켄(高硏)사 제조)과, 배양액으로서 10% 우태아혈청(Fetal bovine serum; FBS), 20mM HEPES, 100units/mL 페니실린, 100μg/mL 스트렙토마이신 함유 DMEM(이하, 간단히 「배양액」으로 칭하는 경우가 있음)을 등량 혼합하여 조제했다.
(4) 이어서, 10℃, 습도 40%의 인큐베이터 내에서, 클린 풍건기를 사용하여, 건조(유리화)했다.
(5) 이어서, 한층 작은 실리콘 링(내경 7.8mm×두께 1.9mm)을 알루미늄 호일로 감싸고, 건조시킨 콜라겐비트리겔(등록상표)막에 협지되어 있던 실리콘 링 위에 중첩하고, 실리콘 링 내측의 콜라겐비트리겔(등록상표)막 건조체를 마스크하고, 자외선(이하, 「UV」로 칭하는 경우가 있음) 조사(단위면적당 UV 총조사량: 400mJ/cm2)하였다.
(6) UV 조사 후의 콜라겐비트리겔(등록상표)막 건조체를 뒤집고, 동일하게 실리콘 링 내측의 콜라겐비트리겔(등록상표)막 건조체를 마스크하고, UV 조사(단위면적당 UV 총조사량: 400mJ/cm2)했다.
(7) 샬레 내 등에서 유리화를 진행시켜, 세포 봉입용 디바이스를 제작하였다(도 5 참조).
제작한 세포 봉입용 디바이스에, 1mL 투베르쿨린 침 부착 시린지를 사용하여, 배양액을 주입하였으나, 침을 제거한 후에도 디바이스 내부로부터 배양액이 누출되지 않고 유지할 수 있는 것이 확인되었다.
[실시예 1] 인간 간암 세포주의 HepG2 세포를 사용한 간조직형 칩의 제작 1
(1) 사전에 배양한 HepG2 세포(이화학연구소(理化學硏究所)바이오리소스센터로부터 구입, RCB1648)를 회수하고, 2.0×105세포/mL로 되도록 배양액과 혼합하고, HepG2 세포의 현탁액을 조제했다.
(2) 이어서, HepG2 세포의 현탁액을 1mL 투베르쿨린 침 부착 시린지 내에 충전했다. 다음으로, 제조예 1에서 제작한 세포 봉입용 디바이스에 실리콘 링의 외주부로부터 투베르쿨린 침의 선단을 실리콘 링 내부로 약간 찔러 넣었다. 다음으로, HepG2 세포의 현탁액 160μL를 세포 봉입용 디바이스 내에 주입하였다(도 6의 (A) 참조).
(3) 이어서, 샬레(직경 60mm) 내에 5mL의 배양액을 주입하고, 배양액 상에 (2)에서 HepG2 세포를 봉입한 디바이스를 띄우고, 기상 및 액상에서의 배양을 개시했다(도 6의 (B) 참조).
(4) 이어서, 하루걸러 배양액을 교환하고, 세포 봉입용 디바이스에 봉입된HepG2 세포를, 위상차현미경을 사용하여, 배양 개시로부터 6시간 후, 배양 1일째, 2일째, 7일째, 12일째, 및 14일째로 경시적으로 관찰하고, 촬영하였다(도 7의 (A)∼(F) 참조).
도 7의 (A)∼(F)로부터, 경시적으로 HepG2 세포가 증식하고, 배양 2일째에는 모세담관상 구조가 형성되어 있는 것을 확인할 수 있었다.
[실시예 2] HepG2 세포의 간조직형 칩에 의한 모델 약제의 대사와 대사물의 모세담관상 구조로의 배설과 축적 1
(1) 모델 약제로서의 플루오레세인 디아세테이트(FD)를 250μg/mL의 농도로 함유하는 배양액을 조제하여, 샬레(직경 60mm) 내에 5mL 주입했다.
(2) 이어서, 실시예 1에 있어서HepG2 세포를 사용하여 제작한 배양 7일째의 간조직형 칩을, (1)에서 조제한 FD 함유 배양액 중에 가라앉혀 1시간 배양함으로써 세포 내에 FD를 받아들이게 했다.
(3) 이어서, 5mL의 행크스평형염류용액(Hank's Balanced Salt Solution: HBSS)을 주입한 새로운 샬레(직경 60mm) 내에 옮겨 넣고 세정했다. 이 작업을 2회 행한 후, HepG2 세포에 의해 대사된 플루오레세인의 녹색 형광(여기(勵起) 파장: 490㎚, 형광 파장: 514㎚)이 세포질에 균일하게 분포되어 있는 것을 형광현미경의 관찰에 의해 확인했다.
FD는, 그대로는 형광을 발하지 않지만, 세포 내의 에스테라제 활성에 의해 에스테르 결합이 끊어짐으로써, 플루오레세인의 녹색 형광(여기 파장: 490㎚, 형광 파장: 514㎚)이 관찰된다.
(4) 이어서, 5mL의 신선한 배양액을 주입한 새로운 샬레(직경 60mm) 내로 간조직형 칩을 옮겨 넣고, 배양액 중에 가라앉히고 1시간 배양했다. 1시간 후의 세포에서의 플루오레세인의 배출을 위상차현미경과 형광현미경의 관찰에 의해 확인하였다(도 8의 (A)∼(C) 참조).
도 8의 (A)∼(C)로부터, 세포질에 분포되어 있던 플루오레세인이 모세담관상 구조에 배설되어 축적하는 것을 확인할 수 있었다.
[제조예 2] 세포 봉입용 디바이스(임의의 형상)의 제작 2
(1) 두께 3mm의 실리콘 막을 환형(내경: 11mm, 외경: 20mm)으로 잘라낸 후(도 9의 (A) 참조), 실리콘 막의 두께의 대략 중앙 부분에서 환형의 내부와 외부를 관통하도록 스테인레스 관(내경: 0.9mm, 외경: 1.26mm)을 통과시킴으로써, 측면의 2군데에 구멍을 뚫었다(도 9의 (B) 참조).
(2) 이어서, (1)에서 제작한 환형 실리콘 막을 측면의 부재가 되도록 천정면 및 바닥면에, 콜라겐비트리겔(등록상표)막 건조체를 공지의 방법(참고 문헌: 일본공개특허 제2012-115262호 공보)에 준하여 우레탄계 접착제로 접착하였다(도 9의 (C) 참조). 다음으로, 겔 로딩 칩을 측면의 2군데의 구멍에 관통시킴으로써, 세포 봉입용 디바이스를 제작하였다(도 9의 (D) 참조).
그리고, 실리콘 막은 다양한 두께로 된 것이 시판되어 있고, 이들을 원하는 형상으로 잘라냄으로써 측면의 부재를 제작한 후, 그 측면의 부재의 천정면 및 바닥면에 콜라겐비트리겔(등록상표)막 건조체를 부착함으로써, 임의의 형상의 세포 봉입용 디바이스를 제작할 수 있다.
(3) 이어서, (2)에서 제작한 세포 봉입용 디바이스의 겔 로딩 칩에 시린지를 접속함으로써, 디바이스 내부에 적당량의 배양액을 주입할 수 있는 것을 확인하였다(도 9의 (E) 및 (F) 참조).
또한, 2개의 세포 봉입용 디바이스를 겔 로딩 칩의 선단 부분의 튜브로 연결함으로써, 한쪽의 세포 봉입용 디바이스로부터 다른 쪽의 세포 봉입용 디바이스에 배양액을 통액할 수 있는 것을 확인하였다(도 9의 (G) 참조).
(4) 이어서, 적당량의 배양액을 주입한 세포 봉입용 디바이스로부터 겔 로딩 칩를 분리한 후, 그 구멍에 이쑤시개로 마개를 실시함으로써, 세포 봉입용 디바이스의 내부로부터 배양액이 누출되지 않는 것을 확인하였다(도 9의 (H) 참조).
그리고, 본 실시예에서는 마개로서 목제 이쑤시개를 사용하였지만, 배양용에는 아크릴 등의 플라스틱제 또는 스테인레스제의 마개가 바람직하다.
이상의 결과로부터, 본 실시형태의 세포 봉입용 디바이스에 의하면, 세포를 장기간 배양할 수 있고, 다세포 구조체를 구축할 수 있는 것을 확인할 수 있었다.
[제조예 3] 세포 봉입용 디바이스(지지체 없음)의 제작 3
(1) 제조예 1에서 사용한 실리콘 링보다 한층 작은 실리콘 링(내경 7.8mm, 두께 1.9mm)을 사용하고, 제조예 1과 동일한 방법을 사용하여, 세포 봉입용 디바이스를 제작했다. 다음으로, 환형 나일론 막을 제거하고, 외주부로 밀려나온 콜라겐비트리겔(등록상표)막 건조체를 실리콘 링 주위에 콜라겐 졸과 함께 접어넣고 건조했다.
(2) 이어서, 실리콘 링 내측의 콜라겐비트리겔(등록상표)막 건조체를 마스크하고, 양면에 UV 조사(한쪽 면 조사량: 400mJ/cm2, 총조사량: 800mJ/cm2)로 접착 고정하여, 지지체가 없는 세포 봉입용 디바이스를 제작했다. 얻어진 지지체가 없는 세포 봉입용 디바이스에 대하여, 유치침을 사용하여 HepG2 세포의 현탁액을 안전하게 봉입할 수 있는 것을 확인하였다(도 10a 및 도 10b 참조).
[실시예 3] 인간 간암 세포주의 HepG2 세포를 사용한 간조직형 칩의 제작 2
(1) 사전에 배양한 HepG2 세포(이화학연구소(理化學硏究所)바이오리소스센터로부터 구입, RCB1648)를 회수하고, 2.4×105세포/mL로 되도록 배양액과 혼합하여, HepG2 세포의 현탁액을 조제했다.
(2) 제조예 3에서 얻어진 세포 봉입용 디바이스의 실리콘 링 벽면으로부터 유치침을 찔러서 내통침을 제거하여, 유치침 카테터를 장착했다. 다음으로, 이 유치침 카테터를 사용하여 100μL의 HepG2 세포의 현탁액(2.4×105세포/mL)을 주입하여, 간조직형 칩을 제작했다. 실리콘 링의 내측 바닥 면적은 0.48cm2이므로, 초기 파종 밀도는 5.0×104세포/cm2였다.
(3) 24웰 플레이트의 웰 내에 1.0mL의 배양액을 주입하고, (2)에서 제작한 간조직형 칩을 배양액 중에 가라앉히고 배양을 개시했다. 콘트롤로서, 24웰 플레이트의 웰 내에 초기 파종 밀도가 5.0×104세포/cm2로 되도록 조제한 1.0mL의 HepG2 세포의 현탁액을 주입하여, 배양을 개시했다. 그 후, 하루마다 각 웰 내의 배양액을 교환하고, 약 1개월간 배양하여 이하의 해석을 행하였다.
(4) 위상차현미경 및 형광현미경에 의해 경시적으로 관찰하여, 다세포 집단의 형태 변화의 해석 및 calcein-AM과 ethidium homodimer-1을 사용한 생사 판정을 행하였다. 배양 4일째의 콘트롤 및 간조직형 칩의 위상차현미경상 및 형광현미경상을 도 11a에 나타낸다. 또한, 배양 32일째의 콘트롤 및 간조직형 칩의 위상차현미경상 및 형광현미경상을 도 11b에 나타낸다.
도 11a로부터, 배양 4일째에서는, 콘트롤의 세포는 증식하여 많은 불균일한 응집괴를 형성하고, 응집괴 중심부에 죽은 세포가 집적했다. 한편, 간조직형 칩의 세포는 균일하게 증식하여 모세담관상 구조를 형성하고, 대부분 생존하고 있었다.
또한, 도 11b로부터, 배양 32일째에서는, 콘트롤의 세포는 거대한 응집괴를 형성하고, 응집괴 내부에 많은 죽은 세포가 분산되어 있었다. 한편, 간조직형 칩의 세포는 규칙적인 치밀 구조를 형성하고, 대부분 생존하고 있는 것이 밝혀졌다.
[실시예 4] HepG2 세포의 간조직형 칩에 의한 모델 약제의 대사와 대사물의 모세담관상 구조로의 배설과 축적 2
(1) 모델 약제로서의 플루오레세인 디아세테이트(FD)를 25μg/mL의 농도로 함유하는 HBSS를 조제하고, 샬레(직경 60mm) 내에 5mL 주입했다.
(2) 이어서, 실시예 3에 있어서 HepG2 세포를 사용하여 제작한 배양 32일째의 간조직형 칩을, (1)에서 조제한 FD 함유 HBSS 중에 가라앉히고 1시간 배양함으로써 세포 내에 FD를 받아들이게 했다.
(3) 이어서, 5mL의 HBSS를 주입한 새로운 샬레(직경 60mm) 내에 옮겨 넣고 세정했다. 이 작업을 2회 행한 후, HepG2 세포에 의해 대사된 플루오레세인의 녹색 형광(여기 파장: 490㎚, 형광 파장: 514㎚)이 세포질에 균일하게 분포되어 있는 것을 형광현미경의 관찰에 의해 확인했다.
(4) 이어서, 5mL의 신선한 HBSS를 주입한 새로운 샬레(직경 60mm) 내로 간조직형 칩을 옮겨 넣고, HBSS 중에 가라앉히고 1시간 배양했다. 1시간 후의 세포에서의 플루오레세인의 배출을 위상차현미경 및 형광현미경의 관찰에 의해 확인하였다(도 12a(위상차현미경상) 및 도 12b(형광현미경상) 참조).
도 12a 및 도 12b로부터, 세포질에 분포되어 있던 플루오레세인이 모세담관상 구조에 배설되어 축적하는 것을 확인할 수 있었다.
[실시예 5] HepG2 세포의 간조직형 칩에서의 간조직 특이적 기능의 평가 1
(1) 간조직 특이적 기능을 평가하기 위하여, 실시예 3에 있어서 HepG2 세포를 사용하여 제작한 간조직형 칩에 대하여, 알부민 합성(배양 4, 16 및 32 일째를 평가), 요소 합성(배양 4, 16 및 32 일째를 평가) 및 CYP3A4 활성(배양 3, 14 및 28 일째를 사용)을 경시적으로 해석했다. 구체적으로는, 알부민 합성은, Human Albumin ELISA Quantitation Set(Bethyl Laboratories, Inc. 제조)를 측정 키트로서 사용하여 측정했다. 요소 합성은 QuantiChrom Urea Assay Kit(BioAssay Systems제)를 측정 키트로서 사용하여 측정했다. CYP3A4 활성은, P450-Glo(등록상표) CYP3A4 assay with Luciferin-IPA(Promega 제조)를 측정 키트로서 사용하여 측정했다. 그리고, 비활성은 파종 세포수로부터 산출했다. 또한, 실시예 3의 콘트롤에 대해서도 마찬가지로, 알부민 합성(배양 4, 16 및 32 일째를 평가), 요소 합성(배양 4, 16 및 32 일째를 평가) 및 CYP3A4 활성(배양 3, 14 및 28 일째를 사용)을 경시적으로 해석했다. 결과를 도 13a(알부민 합성), 도 13b(요소 합성) 및 도 13c(CYP3A4 활성)에 나타낸다.
도 13a, 도 13b 및 도 13c로부터, 간조직형 칩은 콘트롤에 비해, 알부민 합성, 요소 합성 및 CYP3A4 활성 모두에, 배양 초기보다 약 1개월간에 걸쳐 향상되어 유지하는 것이 밝혀졌다.
그리고, CYP3A4 활성에 대해서는, 인간 초대 동결 간세포의 평균적인 활성에 필적하는 것으로 여겨지고 있는 분화형 HepaRG 세포도 동시에 비교 해석한 바, 분화형 HepaRG 세포의 CYP3A4 활성은, 207,655±31,111(RLU/106cells)이었다. 따라서, 간조직형 칩의 CYP3A4 활성은, 분화형 HepaRG 세포의 약 1/3 이상의 레벨에 달하고 있는 것을 알았다.
[제조예 4] 세포 봉입용 디바이스(절삭 가공 및 성형 가공한 플라스틱제 링을 이용)의 제작 4
(1) 벽면 공로(孔路)가 부가된 플라스틱제의 대(大)링 및 소(小)링을 준비했다. 대링은, 두께 2.0mm의 벽면 공로(직경 0.70mm)가 부가되고, 내측 공간 체적 1.0mL, 내경 25.24mm, 내측 바닥 면적 5.00cm2였다. 한편, 소링은, 두께 2.0mm의 벽면 공로(직경 0.70mm)가 부가되고, 내측 공간 체적 0.1mL, 내경 7.98mm, 내측 바닥 면적 0.50cm2였다. 대링 및 소링 모두, 벽면 공로는 직경 800㎛인 스테인레스 구(球)로 마개가 되었다.
이들 플라스틱제의 대링 및 소링의 양면에, 폴리우레탄계 접착제를 사용하고, 제조예 1의 (1)과 동일한 방법을 사용하여 조제한 콜라겐비트리겔(등록상표)막의 건조체를 직접 접착하여, 세포 봉입용 디바이스를 제작했다.
(2) 이어서, 얻어진 세포 봉입용 디바이스에 대하여, 벽면 공로로부터 유치침 카테터를 사용하여 인간 진피 유래 섬유아세포의 현탁액을 안전하게 주입하고, 벽면 공로를 스테인레스 구로 마개를 함으로써 세포를 봉입할 수 있는 것을 확인하였다(도 14a 및 도 14b 참조).
[실시예 6] 인간 진피 유래 섬유아세포를 사용한 진피 조직형 칩의 제작 1
(1) 사전에 배양한 인간 진피 유래 섬유아세포를 회수하고, 1.0×105세포/mL로 되도록 배양액과 혼합하여, 인간 진피 유래 섬유아세포의 현탁액을 조제했다.
(2) 제조예 4에 있어서 플라스틱제 소링을 사용하여 제작한 세포 봉입용 디바이스에, 벽면 공로로부터 유치침 카테터를 사용하여 100μL의 인간 진피 유래 섬유아세포의 현탁액(1.0×105세포/mL)을 주입했다. 다음으로, 벽면 공로를 스테인레스 구로 마개를 함으로써 진피 조직형 칩을 제작했다. 그리고, 초기 파종 밀도는 2.0×104/cm2였다.
(3) 24웰 플레이트의 웰 내에 1.0mL의 배양액을 주입하고, (2)에서 제작한 진피 조직형 칩을 배양액 중에 가라앉히고 배양을 개시했다. 그 후, 하루마다 각 웰 내의 배양액을 교환하고, 21일간 배양했다.
(4) 위상차현미경에 의해 경시적으로 관찰하여, 다세포집단의 형태 변화의 해석을 행하였다. 배양 1, 2, 3 및 8 일째의 진피 조직형 칩의 위상차현미경상을 도 15에 나타낸다.
도 15로부터, 인간 진피 유래 섬유아세포는 콜라겐비트리겔(등록상표)막에 접착한 후, 양호하게 증식하여 다층화하는 것을 확인할 수 있었다.
(5) 또한, 상기 진피 조직형 칩에 대하여, 배양을 계속하고, 하루마다 각 웰 내의 배양액을 교환하고, 배양 개시로부터 100일째까지 배양했다.
(6) 100일간 배양한 진피 조직형 칩에 대하여, 위상차현미경 관찰, 및 calcein-AM과 ethidium homodimer-1을 사용한 생사 판정을 행하였다. 100일간 배양한 진피 조직형 칩의 위상차현미경상 및 형광현미경상을 도 16에 나타낸다.
도 16으로부터, 100일간 배양한 진피 조직형 칩의 세포는, 다층화 증식하여 규칙적인 치밀 구조를 형성하고, 대부분 생존하고 있는 것이 밝혀졌다.
[실시예 7] 진피 조직형 칩으로부터의 인간 진피 유래 섬유아세포의 회수 1
(1) 실시예 6에 있어서 제작한 배양 15일째의 진피 조직형 칩을 0.5mg/mL 콜라게나제로 처리하여, 진피 조직형 칩으로부터 인간 진피 유래 섬유아세포를 회수할 수 있는지 검토했다. 그 결과, 37℃에서 20분간 처리함으로써, 콜라겐비트리겔(등록상표)막이 소화되어, 인간 진피 유래 섬유아세포를 디바이스로부터 분리할 수 있는 것이 밝혀졌다.
(2) 이어서, 회수된 인간 진피 유래 섬유아세포를 플라스틱제 배양 접시 내에서 배양하고, 위상차현미경에 의해 경시적으로 관찰했다. 배양 2일째 및 7일째의 인간 진피 유래 섬유아세포의 위상차현미경상을 도 17a(배양 2일째) 및 도 17b(배양 7일째)에 나타낸다.
도 17a 및 도 17b로부터, 진피 조직형 칩으로부터 회수된 인간 진피 유래 섬유아세포가 양호하게 증식하는 것이 밝혀졌다.
[실시예 8] 진피 조직형 칩으로부터의 인간 진피 유래 섬유아세포의 회수 2
(1) 실시예 6에 있어서 제작한 배양 21일째의 진피 조직형 칩을 안과용 가위로 플라스틱제 링의 내연(內緣)을 따라 콜라겐비트리겔(등록상표)막을 잘라내었다. 다음으로, 배양액을 주입한 플라스틱제 배양 접시에 옮겨 넣고, 잘게 절단함으로써 다수의 작은 절단편으로 했다. 다음으로, 이 절단편을 배양함으로써, 인간 진피 유래 섬유아세포를 분리할 수 있는지 검토하기 위하여, 위상차현미경에 의해 경시적으로 관찰했다. 배양 개시로부터 30분 후 및 배양 1일째의 인간 진피 유래 섬유아세포의 위상차현미경상을 도 18a(배양 개시로부터 30분 후) 및 도 18b(배양 1일째)에 나타낸다.
도 18a 및 도 18b로부터, 진피 조직형 칩으로부터 회수된 인간 진피 유래 섬유아세포가 양호하게 증식하는 것이 밝혀졌다.
[실시예 9] 인간 간암 세포주의 HepG2 세포를 사용한 간조직형 칩의 제작 3
(1) 사전에 배양한 HepG2 세포(이화학연구소(理化學硏究所)바이오리소스센터로부터 구입, RCB1648)를 회수하고, 2.5×105세포/mL로 되도록 배양액과 혼합하여, HepG2 세포의 현탁액을 조제했다.
(2) 제조예 4에 있어서 플라스틱제 소링을 사용하여 제작한 세포 봉입용 디바이스에, 벽면 공로로부터 유치침 카테터를 사용하여 100μL의 HepG2 세포의 현탁액(2.5×105세포/mL)을 주입했다. 다음으로, 벽면 공로를 스테인레스 구로 마개를 하여, 간조직형 칩을 제작했다. 초기 파종 밀도는, 5.0×104/cm2였다.
(3) 24웰 플레이트의 웰 내에 1.0mL의 배양액을 주입하고, (2)에서 제작한 간조직형 칩을 배양액 중에 가라앉히고 배양을 개시했다. 콘트롤로서, 24웰 플레이트의 웰 내에 초기 파종 밀도가 5.0×104세포/cm2로 되도록 조제한 1.0mL의 HepG2 세포의 현탁액을 주입하고, 배양을 개시했다. 그 후, 하루마다 각 웰 내의 배양액을 교환하고, 약 1개월간 배양하고 이하의 해석을 행하였다.
(4) 위상차현미경 및 형광현미경에 의해 경시적으로 관찰하여, 다세포 집단의 형태 변화의 해석 및 calcein-AM과 ethidium homodimer-1을 사용한 생사 판정을 행하였다. 배양 28일째의 콘트롤 및 간조직형 칩의 위상차현미경상 및 형광현미경상을 도 19에 나타낸다.
도 19로부터, 배양 28일째에서는, 콘트롤의 세포는 거대한 응집괴를 형성하고, 응집괴 내부에 많은 죽은 세포가 분산되어 있었다. 한편, 간조직형 칩의 세포는 규칙적인 치밀 구조를 형성하고, 대부분 생존하고 있는 것이 밝혀졌다.
[실시예 10] HepG2 세포의 간조직형 칩에 의한 모델 약제의 대사와 대사물의 모세담관상 구조로의 배설과 축적 3
(1) 모델 약제로서의 플루오레세인 디아세테이트(FD)를 25μg/mL의 농도로 함유하는 HBSS를 조제하고, 샬레(직경 60mm) 내에 5mL 주입했다.
(2) 이어서, 실시예 9에 있어서 HepG2 세포를 사용하여 제작한 배양 35일째의 간조직형 칩을, (1)에서 조제한 FD 함유 HBSS 중에 가라앉히고 1시간 배양함으로써 세포 내에 FD를 받아들이게 했다.
(3) 이어서, 5mL의 HBSS를 주입한 새로운 샬레(직경 60mm) 내에 옮겨 넣고 세정했다. 이 작업을 2회 행한 후, HepG2 세포에 의해 대사된 플루오레세인의 녹색 형광(여기 파장: 490㎚, 형광 파장: 514㎚)이 세포질에 균일하게 분포되어 있는 것을 형광현미경의 관찰에 의해 확인했다.
(4) 이어서, 5mL의 신선한 HBSS를 주입한 새로운 샬레(직경 60mm) 내로 간조직형 칩을 옮겨 넣고, HBSS 중에 가라앉히고 1시간 배양했다. 1시간 후의 세포에서의 플루오레세인의 배출을 위상차현미경과 형광현미경의 관찰에 의해 확인하였다(도 20a(위상차현미경상) 및 도 20b(형광현미경상) 참조).
도 20a 및 도 20b로부터, 세포질에 분포되어 있던 플루오레세인이 모세담관상 구조에 배설되어 축적하는 것을 확인할 수 있었다.
[실시예 11] HepG2 세포의 간조직형 칩에서의 간조직 특이적 기능의 평가 2
(1) 간조직 특이적 기능을 평가하기 위하여, 실시예 9에 있어서 HepG2 세포를 사용하여 제작한 간조직형 칩에 대하여, 알부민 합성, 요소 합성 및 CYP3A4 활성을 경시적으로 해석했다(배양 3, 7, 14, 21 및 28 일째를 평가). 구체적으로는, 알부민 합성은, Human Albumin ELISA Quantitation Set(Bethyl Laboratories, Inc. 제조)을 측정 키트로서 사용하여 측정했다. 요소 합성은 QuantiChrom Urea Assay Kit(BioAssay Systems 제조)를 측정 키트로서 사용하여 측정했다. CYP3A4 활성은, P450-Glo(등록상표) CYP3A4 assay with Luciferin-IPA(Promega 제조)을 측정 키트로서 사용하여 측정했다. 그리고, 비활성은 파종 세포수로부터 산출했다. 또한, 실시예 9의 콘트롤에 대해서도 마찬가지로, 알부민 합성, 요소 합성 및 CYP3A4 활성을 경시적으로 해석했다(배양 3, 7, 14, 21 및 28 일째를 평가). 결과를 도 21a(알부민 합성), 도 21b(요소 합성) 및 도 21c(CYP3A4 활성)에 나타낸다.
도 21a, 도 21b 및 도 21c로부터, 간조직형 칩은 콘트롤에 비해, 알부민 합성, 요소 합성 및 CYP3A4 활성 모두, 배양 초기보다 약 1개월간에 걸쳐 향상되어 유지하는 것이 밝혀졌다.
그리고, CYP3A4 활성에 대해서는, 인간 초대 동결 간세포가 평균적인 활성에 필적하는 것으로 여겨지고 있는 분화형 HepaRG 세포도 동시에 비교 해석한 바, 분화형 HepaRG 세포의 CYP3A4 활성은, 179,447±15,287(RLU/106cells)이었다. 따라서, 7일간 이상 배양한 간조직형 칩의 CYP3A4 활성은, 분화형 HepaRG 세포의 약 1/2 이상의 레벨에 달하고 있는 것을 알았다.
[제조예 5] 세포 봉입용 디바이스(절삭 가공 및 성형 가공한 플라스틱제 링을 이용, 한쪽 면에 콜라겐비트리겔(등록상표)막 건조체, 다른 한쪽 면에 투석 막을 첨부)의 제작 5
(1) 벽면 공로가 부가된 플라스틱제 소링을 준비했다. 소링의 크기는, 내경 7.98mm, 외경 13.0mm, 두께 2.0mm(내측 공간 체적 0.1mL, 내측 바닥 면적 0.50cm2)였다. 이 플라스틱제 소링의 한쪽 면에, 폴리우레탄계 접착제를 사용하고, 제조예 1의 (1)과 동일한 방법을 사용하여 조제한 콜라겐비트리겔(등록상표)막의 건조체를 직접 접착했다.
(2) 이어서, 투석막(산코순약(三光純藥)사 제조, 투석막용 셀룰로오스 튜브, 분자량 컷: 14,000)을 준비하고, 수화시키고 튜브를 절개했다. 다음으로, 절개한 투석막을 지지 필름과 함께 환형 자석에 협지하고 건조시킨 상태에서, 소링의 다른 한쪽 면에 폴리우레탄계 접착제를 사용하여, 직접 접착했다. 다음으로, 지지 필름을 제거하여 링 외주의 여분의 부분을 절단함으로써 세포 봉입용 디바이스를 제작했다.
[제조예 6] 세포 봉입용 디바이스(절삭 가공 및 성형 가공한 플라스틱제 링을 이용, 한쪽 면에 콜라겐비트리겔(등록상표)막 건조체, 다른 한쪽 면에 멤브레인 필터를 첨부)의 제작 6
(1) 벽면 공로가 부가된 플라스틱제 소링을 준비했다. 소링의 크기는, 내경 7.98mm, 외경 13.0mm, 두께 2.0mm(내측 공간 체적 0.1mL, 내측 바닥 면적 0.50cm2)였다. 이 플라스틱제 소링의 한쪽 면에, 폴리우레탄계 접착제를 사용하고, 제조예 1의 (1)과 동일한 방법을 사용하여 조제한 콜라겐비트리겔(등록상표)막의 건조체를 직접 접착했다.
(2) 이어서, PTFE 멤브레인 필터(MILLIPORE사 제조, 옴니포어(등록상표) 멤브레인, 직경: 13.0mm, 공경(孔徑): 0.2㎛ 및 0.45㎛)를 준비하고, 70% 에탄올에 침윤시켜, 멸균하고, 건조시켰다. 다음으로, 건조시킨 각 멤브레인 필터를, 소링의 다른 한쪽 면에 폴리우레탄계 접착제를 사용하여, 직접 접착하고, 멤브레인의 공경이 다른 2종류의 세포 봉입용 디바이스를 제작했다.
[실시예 12] 세포 봉입용 디바이스의 단백질 투과성 시험 1
(1) 제조예 4에서 벽면 공로가 부가된 플라스틱제 소링을 사용하여 제작한 양면에 콜라겐비트리겔(등록상표)막 건조체가 첨부된 세포 봉입용 디바이스(이하, 「세포 봉입용 디바이스 4」로 칭하는 경우가 있음), 및 제조예 5에서 벽면 공로가 부가된 플라스틱제 소링을 사용하여 제작한 한쪽 면에 콜라겐비트리겔(등록상표)막 건조체가 첨부되고, 따른 한쪽 면에 투석막이 첨부된 세포 봉입용 디바이스(이하, 「세포 봉입용 디바이스 5」로 칭하는 경우가 있음)를 준비했다.
(2) 이어서, 세포 봉입용 디바이스 4 및 세포 봉입용 디바이스 5에, 100μL의 30% FBS 용액을 주입했다. 그리고, 30% FBS 용액은, 3.0mL의 FBS와 7.0mL의 PBS를 혼화하여 조제했다.
(3) 이어서, 12웰 플레이트의 각 웰에 3.0mL의 PBS를 분주했다.
(4) 이어서, 100μL의 30% FBS 용액이 봉입된 세포 봉입용 디바이스 4 및 세포 봉입용 디바이스 5를 하면이 콜라겐비트리겔(등록상표)막이 되도록 1개씩 12웰 플레이트의 각 웰에 가라앉혔다. 다음으로, 37℃ 인큐베이터 내에서 진탕(70rpm)을 개시했다.
(5) 이어서, 경시적으로 디바이스 내에서 디바이스외에 투과한 단백질량을 측정하였다(배양 개시로부터 30분 후, 1시간 후, 2시간 후, 6시간 후 및 24시간 후). 결과를 도 22에 나타낸다.
도 22로부터, 세포 봉입용 디바이스 4 및 세포 봉입용 디바이스 5의 단백질 투과성을 비교한 결과, 세포 봉입용 디바이스 5의 단백질 투과성은 세포 봉입용 디바이스 4보다 뒤떨어지는 것을 알았다.
[실시예 13] 세포 봉입용 디바이스의 단백질 투과성 시험 2
(1) 제조예 4에서 벽면 공로가 부가된 플라스틱제 소링을 사용하여 제작한 양면에 콜라겐비트리겔(등록상표)막 건조체가 첨부된 세포 봉입용 디바이스(이하, 「세포 봉입용 디바이스 4」로 칭하는 경우가 있음), 및 제조예 6에서 벽면 공로가 부가된 플라스틱제 소링을 사용하여 제작한 한쪽 면에 콜라겐비트리겔(등록상표)막 건조체가 첨부되고, 다른 한쪽 면에 PTFE 멤브레인 필터(공경: 0.2㎛)가 첨부된 세포 봉입용 디바이스(이하, 「세포 봉입용 디바이스 6-1」로 칭하는 경우가 있음), 및 제조예 6에서 벽면 공로가 부가된 플라스틱제 소링을 사용하여 제작한 한쪽 면에 콜라겐비트리겔(등록상표)막 건조체가 첨부되고, 다른 한쪽 면에 PTFE 멤브레인 필터(공경: 0.45㎛)가 첨부된 세포 봉입용 디바이스(이하, 「세포 봉입용 디바이스 6-2」로 칭하는 경우가 있음)를 준비했다.
(2) 이어서, 세포 봉입용 디바이스 4, 세포 봉입용 디바이스 6-1 및 세포 봉입용 디바이스 6-2에, 100μL의 30% FBS 용액을 주입했다. 그리고, 30% FBS 용액은, 3.0mL의 FBS와 7.0mL의 PBS를 혼화하여 조제했다.
(3) 이어서, 12웰 플레이트의 각 웰에 3.0mL의 PBS를 분주했다.
(4) 이어서, 100μL의 30% FBS용액이 봉입된 세포 봉입용 디바이스 4, 세포 봉입용 디바이스 6-1 및 세포 봉입용 디바이스 6-2를 하면이 콜라겐비트리겔(등록상표)막이 되도록 1개씩 12웰 플레이트의 각 웰에 가라앉혔다. 다음으로, 37℃ 인큐베이터 내에서 진탕(70rpm)을 개시했다.
(5) 이어서, 경시적으로 디바이스 내에서 디바이스외에 투과한 단백질량을 측정하였다(배양 개시로부터 5분 후, 30분 후, 2시간 후, 6시간 후 및 24시간 후). 결과를 도 23에 나타낸다.
도 23으로부터, 세포 봉입용 디바이스 4, 세포 봉입용 디바이스 6-1 및 세포 봉입용 디바이스 6-2의 단백질 투과성을 비교한 결과, 세포 봉입용 디바이스간에 큰 차이가 없는 것을 알았다.
[실시예 14] 인간 간암 세포주의 HepG2 세포를 사용한 간조직형 칩의 제작 4 및 보존 시험 1
(1) 사전에 배양한 HepG2 세포(이화학연구소(理化學硏究所)바이오리소스센터로부터 구입, RCB1648)를 회수하고, 2.5×105세포/mL로 되도록 배양액과 혼합하여, HepG2 세포의 현탁액을 조제했다.
(2) 제조예 4에 있어서 제작한 세포 봉입용 디바이스 4에, 벽면 공로로부터 유치침 카테터를 사용하여 100μL의 HepG2 세포의 현탁액(2.5×105세포/mL)을 주입했다. 다음으로, 벽면 공로를 스테인레스 구로 마개를 하여, 간조직형 칩(이하, 「간조직형 칩 4」로 칭하는 경우가 있음)을 제작했다. 초기 파종 밀도는, 5.0×104/cm2였다. 이 간조직형 칩을 5개 제작했다.
(3) 또한, 제조예 6에 있어서 제작한 세포 봉입용 디바이스 6-1에, 벽면 공로로부터 유치침 카테터를 사용하여 100μL의 HepG2 세포의 현탁액(2.5×105세포/mL)을 주입했다. 다음으로, 벽면 공로를 스테인레스 구로 마개를 하여, 간조직형 칩(이하, 「간조직형 칩 6-1」로 칭하는 경우가 있음)을 제작했다. 초기 파종 밀도는, 5.0×104/cm2였다. 이 간조직형 칩을 5개 제작했다.
(4) 이어서, 24웰 플레이트의 웰 내에 1.0mL의 배양액을 주입하고, (2) 및 (3)에서 제작한 간조직형 칩 4 및 간조직형 칩 6-1을 배양액 중에 가라앉히고, 5% CO2 존재 하, 37℃ 침윤 인큐베이터 내에서 배양을 개시했다.
(5) 24시간(만 하루 동안) 배양한 후, 각 간조직형 칩 1개씩 calcein-AM과 ethidium homodimer-1을 사용한 생사 판정을 행하였다. 그 결과, 어느 디바이스에 있어서도, 세포는 콜라겐비트리겔(등록상표)막에 양호하게 접착하여 생존하고 있는 것이 확인되었다(도 24a(「간조직형 칩 4」) 및 도 24b(「간조직형 칩 6-1」)의 「37℃ 배양 1일째」 참조).
(6) 이어서, 나머지 각 간조직형 칩 4개에 대해서는, 배양액을 주입한 15mL코니컬튜브를 준비하고, 코니컬튜브 내에 각 간조직형 칩 1개씩 옮겨 넣었다. 다음으로, 코니컬튜브에, 기체가 들어가지 않도록 배양액을 채우고 밀봉했다.
(7) 이어서, 간 조직형 칩 4 또는 간조직형 칩 6-1을 1개씩 밀봉한 코니컬튜브를 25℃ 기상 인큐베이터 내에 옮겨 넣고, 25℃에서의 보존을 개시했다.
(8) 25℃로 보존한 각 간조직형 칩을, 보존 후 1, 2, 3 및 6 일째에 1개씩 꺼냈다. 그 직후에, calcein-AM과 ethidium homodimer-1을 사용한 생사 판정을 행하였다. 결과를 도 24a(「간조직형 칩 4」) 및 도 24b(「간조직형 칩 6-1」)에 나타낸다.
도 24a 및 도 24b로부터, calcein 양성 세포는, 25℃ 3일간 이상의 보존에서는, 간조직형 칩 4 및 간조직형 칩 6-1 중 어느 것에 있어서도 보존 전과 비교하여 감소했다. 한편, ethidium homodimer-1 양성 세포는, 25℃의 모든 보존 기간에 있어서, 간조직형 칩 4 및 간조직형 칩 6-1의 양쪽 모두 보존 전과 비교하여 동등하며 약간인 것을 알았다. 이러한 사실로부터, 25℃의 보존 직후라면, 간조직형 칩 4 및 간조직형 칩 6-1 중 어느 것에 있어서도, 6일간에 걸쳐 양호하게 생존 세포를 유지할 수 있는 것이 시사되었다.
[실시예 15] 인간 간암 세포주의 HepG2 세포를 사용한 간조직형 칩의 제작 5 및 보존 시험 2
(1) 사전에 배양한 HepG2 세포(이화학연구소(理化學硏究所)바이오리소스센터로부터 구입, RCB1648)를 회수하고, 2.5×105세포/mL로 되도록 배양액과 혼합하여, HepG2 세포의 현탁액을 조제했다.
(2) 제조예 4에 있어서 제작한 세포 봉입용 디바이스 4에, 벽면 공로로부터 유치침 카테터를 사용하여 100μL의 HepG2 세포의 현탁액(2.5×105세포/mL)을 주입했다. 다음으로, 벽면 공로를 스테인레스 구로 마개를 하여, 간조직형 칩(이하, 「간조직형 칩 4」로 칭하는 경우가 있음)을 제작했다. 초기 파종 밀도는, 5.0×104/cm2였다. 이 간조직형 칩을 4개 제작했다.
(3) 또한, 제조예 6에 있어서 제작한 세포 봉입용 디바이스 6-1에, 벽면 공로로부터 유치침 카테터를 사용하여 100μL의 HepG2 세포의 현탁액(2.5×105세포/mL)을 주입했다. 다음으로, 벽면 공로를 스테인레스 구로 마개를 하여, 간조직형 칩(이하, 「간조직형 칩 6-1」로 칭하는 경우가 있음)을 제작했다. 초기 파종 밀도는, 5.0×104/cm2였다. 이 간조직형 칩을 4개 제작했다.
(4) 이어서, 24웰 플레이트의 웰 내에 1.0mL의 배양액을 주입하고, (2) 및 (3)으로 제작한 간조직형 칩 4 및 간조직형 칩 6-1을 배양액 중에 가라앉히고, 5% CO2 존재 하, 37℃ 침윤 인큐베이터 내에서 배양을 개시했다.
(5) 24시간(만 하루 동안) 배양한 후, 배양액을 주입한 15mL 코니컬튜브를 준비하고, 코니컬튜브 내에 각 간조직형 칩 1개씩 옮겨 넣었다. 다음으로, 코니컬튜브에, 기체가 들어가지 않도록 배양액을 채우고 밀봉했다.
(6) 이어서, 간조직형 칩 4 또는 간조직형 칩 6-1을 1개씩 밀봉한 코니컬튜브를 25℃ 기상 인큐베이터 내에 옮겨 넣고, 25℃에서의 보존을 개시했다.
(7) 25℃로 보존한 각 간조직형 칩을, 보존 후 1, 2, 3 및 6 일째에 1개씩 꺼냈다. 다음으로, 24웰 플레이트의 웰 내에 1.0mL의 배양액을 주입하고, 꺼낸 각 간조직형 칩을 배양액 중에 가라앉히고, 5% CO2 존재 하의 37℃ 습윤 인큐베이터 내에서 24시간(만 하루 동안)에 걸쳐, 후배양했다. 37℃에서의 24시간(만 하루 동안)의 후배양 후, calcein-AM과 ethidium homodimer-1을 사용한 생사 판정을 행하였다. 결과를 도 25a(「간조직형 칩 4」) 및 도 25b(「간조직형 칩 6-1」)에 나타낸다.
도 25a 및 도 25b로부터, calcein 양성 세포는, 간조직형 칩 4에서는 25℃ 3일간 이상의 보존, 또한, 간조직형 칩 6-1에서는 25℃ 6일간의 보존으로 감소하는 것을 알았다. 한편, ethidium homodimer-1 양성 세포는, 간조직형 칩 4에서는 25℃ 3일간 이상의 보존, 또한, 간조직형 칩 6-1에서는 25℃ 6일간의 보존으로 증가하는 것을 예측할 수 있었다.
이에, 도 25a 및 도 25b의 형광현미경상을 사용하여, 1변이 100㎛인 정사각형이 중첩되지 않도록 임의의 3군데를 선택하고, 그 정사각형 내의 calcein 및 ethidium homodimer-1의 양성 세포를 계측하여, 세포 생존율을 해석했다. 결과를 도 26에 나타낸다.
도 26로부터, 간조직형 칩 6-1에서는, 25℃ 보존 후의 후배양에서도 간조직형 칩 4보다 양호하게 세포 생존율을 유지하고 있었다. 특히, 간조직형 칩 6-1에서는, 25℃에서의 3일간 보존 후의 37℃에서의 후배양 1일째에 있어서, 77.3±9.2%의 세포 생존율을 유지할 수 있는 것을 알 수 있었다.
[제조예 7] 세포 봉입용 디바이스(유치침 카테터 부착, 아테로콜라겐비트리겔(등록상표)만으로 구성)의 제작 7
(1) 아테로콜라겐비트리겔(등록상표)막 건조체는, 내경 34mm의 벽면 주형 내에 10.0mL의 0.5% 아테로콜라겐를 주입하고, 아테로콜라겐비트리겔(등록상표)막 건조체(콜라겐량: 5.5mg/cm2)를 공지의 방법(참고 문헌: 국제공개 제2012/026531호)에 준하여 제작했다.
그리고, 0.5% 아테로콜라겐졸은, 얼음 위에서 무혈청 배양액 6mL를 50mL 코니컬튜브에 분주한 후, 돼지 유래 아테로콜라겐 용액(간토화학(關東化學)사 제조, 콜라겐 농도 1.0질량%) 6mL를 첨가하고, 3회 피펫팅을 행함으로써 조제했다.
또한, 사용한 무혈청 배양액은, 이하에 나타내는 조성이었다.
무혈청 배양액: 둘베코수정이글배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium; DMEM) (GIBCO사 제조, Cat. No.11885-084)
+20mM HEPES(GIBCO사 제조, Cat. No.15630-080)
+100units/mL 페니실린 + 100μg/mL 스트렙토마이신(GIBCO사 제조, Cat. No.15140-148)
(2) 이어서, (1)에서 제작한 아테로콜라겐비트리겔(등록상표)막 건조체 2장을 PBS로 재수화하여, 아테로콜라겐비트리겔(등록상표)막 2장을 조제했다. 다음으로, 비닐 시트 상에 1장의 아테로콜라겐비트리겔(등록상표)막을 신전하고, 그 위에 0.5mL의 0.5% 아테로콜라겐졸을 첨가하여 밀려나오지 않도록 펼쳤다. 이 아테로콜라겐비트리겔(등록상표)막 상의 대략 중심에, 유치침 카테터(니프로사 제조, 「니프로세이프렛캐스 NIC★26×3/4(상품명)」, 카테터, 케이지수 26G, 외경: 0.6mm, 길이: 19mm)의 선단이 오도록 유치침 카테터를 중첩시켜 두었다. 다음으로, 또 1장의 아테로콜라겐비트리겔(등록상표)막을 덮어 씌웠다.
그리고, 0.5% 아테로콜라겐졸은, 공지의 방법(참고 문헌: 일본공개특허 제2015-203018호 공보)에 준하여, 접착제로서 사용했다.
(3) 이어서, 10℃, 습도 40%의 인큐베이터 내에서, 클린 풍건기를 사용하여, 건조(유리화)했다.
(4) 이어서, 실리콘 링(내경 11.8mm×두께 2.4mm)을 알루미늄 호일로 싸고, 유치침 카테터를 협지한 원형의 아테로콜라겐비트리겔(등록상표)막 건조체의 중심과 동심(同心)이 되도록 중첩함으로써, 아테로콜라겐비트리겔(등록상표)막 건조체의 내측을 마스크했다. 다음으로, UV 조사(단위면적당 UV 총조사량: 400mJ/cm2)했다.
(5) UV 조사 후의 아테로콜라겐비트리겔(등록상표)막 건조체를 뒤집고, 동일하게 아테로콜라겐비트리겔(등록상표)막 건조체의 내측을 마스크하고, UV 조사(단위면적당 UV 총조사량: 400mJ/cm2)했다.
(6) 이어서, 샬레 내 등에서 유리화를 진행시켜, 유치침 카테터 부착 세포 봉입용 디바이스를 제작하였다(도 27a 참조).
(7) 이어서, 얻어진 세포 봉입용 디바이스에 대하여, 유치침 카테터로부터 인간 진피 유래 섬유아세포의 현탁액을 안전하게 주입하고, 세포를 봉입할 수 있는 것을 확인하였다(도 27b 참조).
[실시예 16] 인간 진피 유래 섬유아세포를 사용한 진피 조직형 칩의 제작 2
(1) 사전에 배양한 인간 진피 유래 섬유아세포를 회수하고, 5.2×105세포/mL로 되도록 배양액과 혼합하여, 인간 진피 유래 섬유아세포의 현탁액을 조제했다.
(2) 이어서, 제조예 7에 있어서 제작한 유치침 카테터 부착 세포 봉입용 디바이스를 배양액에서 재수화한 후, 유치침 카테터에 시린지를 접속하여 600μL의 인간 진피 유래 섬유아세포의 현탁액(5.2×105세포/mL)을 주입하여, 진피 조직형 칩을 제작했다. 다음으로, 유치침 카테터를 가볍게 당겨서, 진피 조직형 칩으로부터 제거했다. 이 때, 세포 봉입용 디바이스에 주입한 현탁액은 절반 가까이 외측으로 누출되었지만, 절반 정도는 주입한 상황을 유지할 수 있었다. 이 때문에, 초기 파종 밀도는 계산 불가능했다.
(3) 이어서, 직경 6cm의 샬레 내에 5.0mL의 배양액을 주입하고, (2)에서 제작한 진피 조직형 칩을 배양액 중에 가라앉히고 배양을 개시했다. 그 후, 하루마다 각 웰 내의 배양액을 교환하고, 3일간 배양했다. 배양 1일째의 진피 조직형 칩을 촬영한 화상를 도 28에 나타낸다.
(4) 위상차현미경에 의해 경시적으로 관찰하여, 다세포 집단의 형태 변화의 해석을 행하였다. 배양 0(2시간), 1, 2 및 3 일째의 진피 조직형 칩의 위상차현미경상을 도 29에 나타낸다.
도 29로부터, 인간 진피 유래 섬유아세포는 아테로콜라겐비트리겔(등록상표)막에 접착한 후, 양호하게 증식하는 것을 확인할 수 있었다.
[제조예 8] 세포 봉입용 디바이스(아테로콜라겐비트리겔(등록상표)만으로 구성)의 제작 8
(1) 제조예 7의 (1)과 동일한 방법을 사용하여, 아테로콜라겐비트리겔(등록상표)막 건조체 4장을 제작했다. 4장의 아테로콜라겐비트리겔(등록상표)막 건조체에 대하여, 각 막 두께를 디지메틱 마이크로미터(미쓰도요사 제조)로 계측한 결과, 74±11㎛이었다.
(2) 이어서, (1)에서 제작한아테로콜라겐비트리겔(등록상표)막 건조체 2장을 PBS로 재수화하여, 2장의 아테로콜라겐비트리겔(등록상표)막을 조제했다. 비닐 시트 상에 1장의 아테로콜라겐비트리겔(등록상표)막을 신전했다. 다음으로, 그 위에 0.5mL의 0.5% 아테로콜라겐졸을 첨가하여 밀려나오지 않도록 펼친 후, 또 1장의 아테로콜라겐비트리겔(등록상표)막을 덮어 씌웠다.
그리고, 0.5% 아테로콜라겐졸은, 공지의 방법(참고 문헌: 일본공개특허 제2015-203018호 공보)에 준하여, 접착제로서 사용했다. 나머지 2장의 아테로콜라겐비트리겔(등록상표)막에 대해서도, 동일하게 전술한 조작을 반복하여 행함으로써, 아테로콜라겐비트리겔(등록상표)막 건조체 2장의 2중층체를 2조(組) 제작했다.
(3) 이어서, 10℃, 습도 40%의 인큐베이터 내에서, 클린 풍건기를 사용하여, 건조(유리화)했다.
(4) 이어서, UV 조사(단위면적당 UV 총조사량: 400mJ/cm2)했다. 또한, UV 조사 후의 아테로콜라겐비트리겔(등록상표)막 2중층 접착 건조체를 뒤집고, UV 조사(단위면적당 UV 총조사량: 400mJ/cm2)했다.
(5) 이어서, 아테로콜라겐비트리겔(등록상표)막 건조체 2장의 2중층 접착 건조체를 PBS로 재수화했다. 다음으로, 직경 13mm의 펀치를 사용하여, 1조의 2중층 접착체로부터 직경 13mm의 아테로콜라겐비트리겔(등록상표)막 2중층 접착체를 2개 도려 내어, 합계 4개의 직경 13mm의 아테로콜라겐비트리겔(등록상표)막 2중층 접착체를 조제했다.
(6) 이어서, 비닐 시트 상에 1개의 직경 13mm의 아테로콜라겐비트리겔(등록상표)막 2중층 접착체를 신전했다. 다음으로, 그 위에 90μL의 0.5% 아테로콜라겐졸을 첨가하여 밀려나오지 않도록 펼친 후, 또 하나의 직경 13mm의 아테로콜라겐비트리겔(등록상표)막 2중층 접착체를 덮어 씌우는 것에 의해, 4중층체를 제작했다. 또한, 이 4중층체 위에 90μL의 0.5% 아테로콜라겐졸을 첨가하여 밀려나오지 않도록 펼친 후, 또 하나의 직경 13mm의 아테로콜라겐비트리겔(등록상표)막 2중층 접착체를 덮어 씌우는 것에 의해, 6중층체를 제작했다. 또한, 이 6중층체 위에 90μL의 0.5% 아테로콜라겐졸을 첨가하여 밀려나오지 않도록 펼친 후, 또 하나의 직경 13mm의 아테로콜라겐비트리겔(등록상표)막 2중층 접착체를 덮어 씌우는 것에 의해, 8중층체를 제작했다.
(7) 이어서, 10℃, 습도 40%의 인큐베이터 내에서, 클린 풍건기를 사용하여, 건조(유리화)했다.
(8) 이어서, UV 조사(단위면적당 UV 총조사량: 400mJ/cm2)했다. 또한, UV 조사 후의 아테로콜라겐비트리겔(등록상표)막 8중층 접착 건조체를 뒤집고, UV 조사(단위면적당 UV 총조사량: 400mJ/cm2)했다.
(9) 직경 13mm의 아테로콜라겐비트리겔(등록상표)막 8중층 접착 건조체를 PBS로 재수화했다. 다음으로, 직경 8mm의 펀치를 사용하고, 상기 펀치를 직경 13mm의 아테로콜라겐비트리겔(등록상표)막 8중층 접착체의 동심형으로 두고, 직경 8mm의 아테로콜라겐비트리겔(등록상표)막 8중층 접착체를 도려내는 것에 의해, 링형의 아테로콜라겐비트리겔(등록상표)막 8중층 접착체(내경 8mm, 외경 13mm)를 제작했다.
(10) 이어서, 10℃, 습도 40%의 인큐베이터 내에서, 클린 풍건기를 사용하여, 건조(유리화)함으로써, 링형의 아테로콜라겐비트리겔(등록상표)막 8중층 접착 건조체(내경 8mm, 외경 13mm)를 제작했다.
(11) 이어서, 제조예 7의 (1)과 동일한 방법을 사용하여, 아테로콜라겐비트리겔(등록상표)막 건조체 1장을 제작했다. 다음으로, 제작한 1장의 아테로콜라겐비트리겔(등록상표)막 건조체를 PBS로 재수화하여, 아테로콜라겐비트리겔(등록상표)막을 조제했다. 다음으로, 아테로콜라겐비트리겔(등록상표)막을 직경 13mm의 펀치를 사용하여 도려내는 것에 의해, 직경 13mm의 아테로콜라겐비트리겔(등록상표)막을 제작했다. 한편, (10)에서 제작한 링형의 아테로콜라겐비트리겔(등록상표)막 8중층 접착 건조체(내경 8mm, 외경 13mm)에 대해서도 PBS로 재수화하여, 링형의 아테로콜라겐비트리겔(등록상표)막 8중층 접착체(내경 8mm, 외경 13mm)를 조제했다.
(12) 비닐 시트 상에 직경 13mm의 아테로콜라겐비트리겔(등록상표)막을 신전하고, 그 위에 90μL의 0.5% 아테로콜라겐졸을 첨가하여 밀려나오지 않도록 펼쳤다. 다음으로, 이 위에, (11)에서 조제한 링형의 아테로콜라겐비트리겔(등록상표)막 8중층 접착체(내경 8mm, 외경 13mm)를 중층(重層)했다.
(13) 이어서, 10℃, 습도 40%의 인큐베이터 내에서, 클린 풍건기를 사용하여, 건조(유리화)했다.
(14) 이어서, 직경 13mm의 아테로콜라겐비트리겔(등록상표)막 건조체를 부착한 면을 위로 하여, UV 조사(단위면적당 UV 총조사량: 400mJ/cm2)했다.
(15) 한쪽 면에 아테로콜라겐비트리겔(등록상표)막 건조체를 접착한 링형의 아테로콜라겐비트리겔(등록상표)막 8중층 접착 건조체(내경 8mm, 외경 13mm)를 PBS로 재수화했다. 다음으로, 아테로콜라겐비트리겔(등록상표)막을 접착하지 않은 측의 링 면 상에, 적당량의 0.5% 아테로콜라겐졸을 첨가하여 밀려나오지 않도록 펼쳤다.
(16) 이어서, 제조예 7의 (1)과 동일한 방법을 사용하여, 아테로콜라겐비트리겔(등록상표)막 건조체 1장을 제작했다. 다음으로, 제작한 1장의 아테로콜라겐비트리겔(등록상표)막 건조체를 PBS로 재수화하여, 아테로콜라겐비트리겔(등록상표)막을 조제했다. 다음으로, 아테로콜라겐비트리겔(등록상표)막을 직경 13mm의 펀치를 사용해서 도려내는 것에 의해, 직경 13mm의 아테로콜라겐비트리겔(등록상표)막을 제작했다. 다음으로, 비닐 시트 상에 직경 13mm의 아테로콜라겐비트리겔(등록상표)막을 신전했다. 이 아테로콜라겐비트리겔(등록상표)막 위에, 상기 아테로콜라겐비트리겔(등록상표)막과, (15)에서 조제한 한쪽 면에 아테로콜라겐비트리겔(등록상표)막 건조체를 접착한 링형의 아테로콜라겐비트리겔(등록상표)막 8중층 접착체(내경 8mm, 외경 13mm)의 아테로콜라겐졸을 도포한 면이 접착하도록 덮어 씌웠다.
(17) 이어서, 10℃, 습도 40%의 인큐베이터 내에서, 클린 풍건기를 사용하여, 건조(유리화)했다.
(18) 이어서, 새롭게 직경 13mm의 아테로콜라겐비트리겔(등록상표)막 건조체를 부착한 면을 위로 하여, UV 조사(단위면적당 UV 총조사량: 400mJ/cm2)했다.
(19) 이어서, 샬레 내 등에서 유리화를 진행시켜, 링형의 아테로콜라겐비트리겔(등록상표)막 8중층 접착 건조체(내경 8mm, 외경 13mm)의 양면에 직경 13mm의 아테로콜라겐비트리겔(등록상표)막 건조체를 접착한 세포 봉입용 디바이스를 제작하였다(도 30a 참조).
(20) 이어서, 얻어진 세포 봉입용 디바이스에 대하여, 세포 봉입용 디바이스의 천장면에 유치침을 찔러서 내통침을 제거하여 유치침 카테터를 장착했다. 다음으로, 이 유치침 카테터를 사용하여, 인간 진피 유래 섬유아세포의 현탁액을 안전하게 주입하고, 세포를 봉입할 수 있는 것을 확인하였다(도 30b 참조).
[실시예 17] 인간 진피 유래 섬유아세포를 사용한 진피 조직형 칩의 제작 3
(1) 사전에 배양한 인간 진피 유래 섬유아세포를 회수하고, 5.2×105세포/mL로 되도록 배양액과 혼합하여, 인간 진피 유래 섬유아세포의 현탁액을 조제했다.
(2) 이어서, 제조예 8에 있어서 제작한 링형의 아테로콜라겐비트리겔(등록상표)막 8중층 접착 건조체(내경 8mm, 외경 13mm)의 양면에 직경 13mm의 아테로콜라겐비트리겔(등록상표)막 건조체를 접착한 세포 봉입용 디바이스의 천정측 아테로콜라겐비트리겔(등록상표)막 건조체로부터 유치침을 찔러서 내통침을 제거하고 유치침 카테터를 장착했다. 다음으로, 이 유치침 카테터에 시린지를 접속하여 140μL의 인간 진피 유래 섬유아세포의 현탁액(5.2×105세포/mL)을 주입하여, 진피 조직형 칩을 제작했다. 다음으로, 유치침 카테터를 가볍게 당겨서, 세포 봉입용 디바이스로부터 제거했다. 이 때, 세포 봉입용 디바이스에 주입한 현탁액은 거의 누출되지 않으므로, 초기 파종 밀도는 1.45×105/cm2였다.
(3) 이어서, 직경 6cm의 샬레 내에 5.0mL의 배양액을 주입하고, (2)에서 제작한 진피 조직형 칩을 배양액 중에 가라앉히고 배양을 개시했다. 그 후, 하루마다 각 웰 내의 배양액을 교환하고, 3일간 배양했다. 배양 1일째의 진피 조직형 칩을 촬영한 화상을 도 31에 나타낸다.
(4) 위상차현미경에 의해 경시적으로 관찰하여, 다세포집단의 형태 변화의 해석을 행하였다. 배양 0(2시간), 1, 2 및 3 일째의 진피 조직형 칩의 위상차현미경상을 도 32에 나타낸다.
도 32로부터, 인간 진피 유래 섬유아세포는 아테로콜라겐비트리겔(등록상표)막에 접착한 후, 양호하게 증식하는 것을 확인할 수 있었다.
[산업상 이용가능성]
본 실시형태의 세포 봉입용 디바이스는, 세포 보호 성능이 우수할뿐만 아니라 취급도 용이하며, 세포의 장기간 배양이 가능하다.
또한, 본 실시형태의 세포 봉입용 디바이스를 사용하여, 조직형 칩, 기관형 칩, 또는 기관형 칩 시스템을 구축함으로써, 종래의 배양 모델, 또는 동물 실험을 대체하여, 질환에 대한 약효, 약제 및 그 대사물의 대사 경로나 세포 독성의 확인 시험 등으로의 활용을 기대할 수 있다.
또한, 본 실시형태의 세포 봉입용 디바이스가 생체 적합성을 가지는 재료로 이루어지는 경우, 의료용 세포 이식 디바이스로서 재생 의료 로의 활용을 기대할 수 있다.
또한, 본 실시형태의 세포 봉입용 디바이스를 사용하여, 세포를 안전하게 또한 확실하게 운반할 수 있고, 장기간의 운반에도 대응할 수 있다.
또한, 본 실시형태의 세포 봉입용 디바이스는, 동물 세포 이외의 세포 또는 작은 생명 개체를 봉입하고, 생육 또는 성육할 수 있다.
1…다공질막, 2…부재, 3…지지체, 4, 101…튜브, 10, 20, 30…세포 봉입용 디바이스, 100, 200, 300, 400…조직형 칩, 1A, 1B, 1C, 1D…기관형 칩 시스템

Claims (15)

  1. 세포를 배양하여 이루어지는 다세포 구조체를 구축하기 위한 세포 봉입용(封入用) 디바이스로서,
    다공질막을 적어도 일부에 포함하는, 세포 봉입용 디바이스.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 다공질막이 기상중(氣相中)에서 액밀성(液密性)을 가지고, 액상중(液相中)에서 반투성(半透性)을 가지는 반투막인, 세포 봉입용 디바이스.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    배양액에 현탁한 다세포를 주입할 수 있고, 내부 용적이 10mL 이하인, 세포 봉입용 디바이스.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서,
    전체가 상기 반투막으로 이루어지는, 세포 봉입용 디바이스.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 반투막이 생체 적합성을 가지는 재료로 이루어지는, 세포 봉입용 디바이스.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 생체 적합성을 가지는 재료가 겔화하는 세포외 매트릭스 유래 성분인, 세포 봉입용 디바이스.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 겔화하는 세포외 매트릭스 유래 성분이 네이티브 콜라겐, 또는 아테로콜라겐인, 세포 봉입용 디바이스.
  8. 1종류의 세포가 봉입된 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기재된 세포 봉입용 디바이스를 포함하는, 조직형(組織型) 칩.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 세포의 밀도가 2.0×103세포/mL 이상 1.0×109세포/mL 이하인, 조직형 칩.
  10. 적어도 2종류의 세포가 봉입된 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기재된 세포 봉입용 디바이스를 포함하는, 기관형(器官型) 칩.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 세포의 밀도가 2.0×103세포/mL 이상 1.0×109세포/mL 이하인, 기관형 칩.
  12. 다세포 구조체를 제공하기 위한 키트로서,
    제8항 혹은 제9항에 기재된 조직형 칩, 또는 제10항 혹은 제11항에 기재된 기관형 칩과 배양액을 포함하는, 개폐 가능한 밀봉 용기를 포함하는, 키트.
  13. 제8항 혹은 제9항에 기재된 조직형 칩, 또는 제10항 혹은 제11항에 기재된 기관형 칩을 적어도 2개 포함하고, 상기 조직형 칩 또는 상기 기관형 칩이 세포 봉입성을 유지하면서 연결되어 있는, 기관형 칩 시스템.
  14. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기재된 세포 봉입용 디바이스를 사용하는, 세포의 배양 방법.
  15. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기재된 세포 봉입용 디바이스에 세포를 사용하는, 세포의 운반 방법.
KR1020187037731A 2016-06-28 2017-06-28 세포 봉입용 디바이스 및 그 사용 KR20190022563A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JPJP-P-2016-127823 2016-06-28
JP2016127823 2016-06-28
PCT/JP2017/023754 WO2018003858A1 (ja) 2016-06-28 2017-06-28 細胞封入用デバイス及びその使用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20190022563A true KR20190022563A (ko) 2019-03-06

Family

ID=60786079

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020187037731A KR20190022563A (ko) 2016-06-28 2017-06-28 세포 봉입용 디바이스 및 그 사용

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20210230526A1 (ko)
EP (1) EP3476929A4 (ko)
JP (1) JP7054523B2 (ko)
KR (1) KR20190022563A (ko)
CN (1) CN109790508A (ko)
WO (1) WO2018003858A1 (ko)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11814488B2 (en) 2017-05-17 2023-11-14 National Agriculture And Food Research Organization Production method and production apparatus for dried vitrigel membrane
JP6835384B1 (ja) * 2019-04-18 2021-02-24 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 細胞培養装置及びその使用
CN111500445A (zh) * 2020-04-22 2020-08-07 苏州济研生物医药科技有限公司 一种高通量的多器官芯片及其使用方法
CN113355238A (zh) * 2021-06-10 2021-09-07 上海睿钰生物科技有限公司 一种培养装置及基于培养装置的培养方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002538194A (ja) 1999-03-09 2002-11-12 ブイーボウアールエックス、インコーポレイテッド 生体活性物質用細胞保護生体適合封入系及びその製造方法
JP2006011296A (ja) 2004-06-29 2006-01-12 Toshiba Corp 偏光素子、偏光素子の製造方法、及び露光装置の評価方法
JP2008130025A (ja) 2006-11-24 2008-06-05 Oki Electric Ind Co Ltd 無人受付装置
JP2012065555A (ja) 2010-09-21 2012-04-05 Tokyo Univ Of Agriculture & Technology スフェロイド作製装置およびスフェロイド作製方法
JP2015035978A (ja) 2013-08-13 2015-02-23 独立行政法人農業生物資源研究所 ガラス化後のハイドロゲル膜の製造方法、ハイドロゲル材料の製造方法、ガラス化後のハイドロゲル膜、ガラス化後のハイドロゲル膜の乾燥体、細胞シート、およびガラス化後のハイドロゲル膜の製造装置

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4892538A (en) * 1987-11-17 1990-01-09 Brown University Research Foundation In vivo delivery of neurotransmitters by implanted, encapsulated cells
US5182111A (en) * 1987-11-17 1993-01-26 Boston University Research Foundation In vivo delivery of active factors by co-cultured cell implants
ATE183078T1 (de) * 1993-08-10 1999-08-15 Gore & Ass Zelleinkapselungsvorrichtung
JP3878709B2 (ja) * 1997-03-31 2007-02-07 ミクロクローニング シーシーシーデー エイビー 生物試料を培養するための配列、その製法及びそれによる測定方法
JP2001149763A (ja) 1999-11-26 2001-06-05 Nikkiso Co Ltd 半透膜および半透膜の製造方法
US20050175659A1 (en) * 2004-02-09 2005-08-11 Macomber Laurel R. Collagen device and method of preparing the same
US7931894B2 (en) 2004-07-30 2011-04-26 Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. Method of three-dimensionally culturing chondrocytes
JP2006320304A (ja) 2005-05-18 2006-11-30 Cellseed Inc 密閉系細胞培養容器及びそれを利用した細胞培養方法
US20090060972A1 (en) * 2005-11-21 2009-03-05 Nicast Ltd. Device and method for cell grafting
JPWO2008130025A1 (ja) 2007-04-18 2010-07-22 公立大学法人横浜市立大学 肝細胞培養容器及び肝細胞培養方法
US9309491B2 (en) * 2007-05-29 2016-04-12 Corning Incorporated Cell culture apparatus for co-culture of cells
JP2008301758A (ja) * 2007-06-07 2008-12-18 Univ Nihon 細胞培養装置
GB0806746D0 (en) * 2008-04-14 2008-05-14 Ucl Business Plc Membrane
DK2432797T3 (en) 2009-05-21 2017-01-16 Basf Enzymes Llc PHYTASES, NUCLEIC ACIDS, CODING THESE, AND METHODS OF PRODUCING AND USING THEREOF
DE102010020663A1 (de) * 2010-05-05 2011-11-10 Aesculap Ag Medizinisches Hohlkörperimplantat
CN103168099B (zh) * 2010-08-25 2016-08-03 独立行政法人农业生物资源研究所 水凝胶干燥体、玻璃质凝胶膜干燥体及它们的制造方法
EP2639293B1 (en) 2010-11-12 2021-10-20 Kanto Kagaku Kabushiki Kaisha Cell culture chamber, method for producing same, tissue model using cell culture chamber, and method for producing same
FR3014316B1 (fr) * 2013-12-10 2017-01-20 Defymed Organe bioartificiel
JP6384749B2 (ja) 2014-04-14 2018-09-05 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 多層構造のガラス化後のハイドロゲル乾燥体の製造方法、多層構造のガラス化後のハイドロゲル乾燥体、多層構造のガラス化後のハイドロゲル、徐放剤乾燥体の製造方法、接着方法、徐放剤乾燥体、及び徐放剤水和体
WO2018135252A1 (ja) * 2017-01-18 2018-07-26 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 半透膜及びその使用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002538194A (ja) 1999-03-09 2002-11-12 ブイーボウアールエックス、インコーポレイテッド 生体活性物質用細胞保護生体適合封入系及びその製造方法
JP2006011296A (ja) 2004-06-29 2006-01-12 Toshiba Corp 偏光素子、偏光素子の製造方法、及び露光装置の評価方法
JP2008130025A (ja) 2006-11-24 2008-06-05 Oki Electric Ind Co Ltd 無人受付装置
JP2012065555A (ja) 2010-09-21 2012-04-05 Tokyo Univ Of Agriculture & Technology スフェロイド作製装置およびスフェロイド作製方法
JP2015035978A (ja) 2013-08-13 2015-02-23 独立行政法人農業生物資源研究所 ガラス化後のハイドロゲル膜の製造方法、ハイドロゲル材料の製造方法、ガラス化後のハイドロゲル膜、ガラス化後のハイドロゲル膜の乾燥体、細胞シート、およびガラス化後のハイドロゲル膜の製造装置

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2018003858A1 (ja) 2019-04-18
EP3476929A1 (en) 2019-05-01
EP3476929A4 (en) 2020-02-26
JP7054523B2 (ja) 2022-04-14
CN109790508A (zh) 2019-05-21
WO2018003858A1 (ja) 2018-01-04
US20210230526A1 (en) 2021-07-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2639293B1 (en) Cell culture chamber, method for producing same, tissue model using cell culture chamber, and method for producing same
JP6835384B1 (ja) 細胞培養装置及びその使用
EP0671469B1 (en) A medium-penetrating cell culture carrier and a culturing method and a device using this carrier
KR20190022563A (ko) 세포 봉입용 디바이스 및 그 사용
JP5892611B2 (ja) ハイドロゲル乾燥体、ビトリゲル膜乾燥体およびこれらの製造方法
JP7112736B2 (ja) 半透膜及びその使用
Kong et al. Fast and safe fabrication of a free-standing chitosan/alginate nanomembrane to promote stem cell delivery and wound healing
WO2005014774A1 (ja) 動物細胞の培養担体と、該培養担体を用いた動物細胞の培養方法および移植方法
JP2017501745A (ja) 体外での複雑な生体組織の再構成のための流体デバイスおよび灌流システム
US10793816B2 (en) Tissue culture chip
US20200190456A1 (en) Native Extracellular Matrix-Derived Membrane Inserts for Organs-On-Chips, Multilayer Microfluidics Microdevices, Bioreactors, Tissue Culture Inserts, and Two-dimensional and Three-dimensional Cell Culture Systems
JP6425420B2 (ja) 細胞培養チャンバーとその製造方法、細胞培養チャンバーを利用した細胞培養方法および細胞培養キット
JP7083144B2 (ja) 吸引管付き細胞封入用デバイス及びその使用
US20120094372A1 (en) Ex Vivo Cell Culture: Enabling Process and Devices
JP2020103459A (ja) 管状ビトリゲル及びその使用

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application