KR20190008896A - 변이체 플라비바이러스 엔벨로프 서열 및 그의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 자연 플라비바이러스 E-단백질 융합 루프 서열에 존재하지 않는 N-연결 글리칸에 대한 적어도 하나의 글리코실화 부위를 포함하며, 여기서 적어도 하나의 글리코실화 부위 5는 N-연결 글리코실화 세쿠온(Asn-X-Ser/Thr)이고, 세쿠온의 Asn(N) 잔기는 자연 플라비바이러스 E-단백질 융합 루프 아미노산 서열의 위치 98 내지 110(DRGWGNGCGLFGK) 중 어느 하나를 점유하고, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산 잔기이고, Ser/Thr은 세린 또는 트레오닌 잔기를 나타내는 것인, 플라비바이러스 E-단백질 융합 루프의 단리된 재조합 유사체에 관한 것이다.

Description

변이체 플라비바이러스 엔벨로프 서열 및 그의 용도

본 발명은 플라비바이러스(Flavivirus)(예를 들어, 뎅기(dengue) 또는 지카(Zika) 바이러스)의 야생형 E 단백질의 핵산 및 단백질 변이체 및 그에 특이적인 결합 분자, 예컨대 상보성 핵산 또는 항원-결합 분자, 예를 들어 항체뿐만 아니라, 특히 플라비바이러스 감염의 진단 및 플라비바이러스 감염에 대해 면역시키기 위한 백신을 위한 조성물, 예컨대 치료, 예방 또는 진단 조성물, 키트, 키트 부품(kit-of-parts), 방법 및 그와 관련된 용도에 관한 것이다.

플라비비리다에(Flaviviridae)는 양성, 단일 가닥, 엔벨로프드(enveloped) RNA 바이러스 계열이다. 플라비비리다에는 절지동물(주로 진드기 및 모기)에서 발견되며, 인간을 감염시킬 수 있다. 이러한 계열의 구성원은 단일 속 플라비바이러스에 속하며, 전세계적으로 이환율 및 사망률을 높인다. 몇 가지 모기-전염 바이러스에는 뎅기열, 지카 바이러스, 황열, 일본 뇌염 및 웨스트 나일 바이러스가 포함된다. 기타 다른 플라비바이러스는 진드기에 의해 전염되며, 뇌염 및 출혈성 질환인 진드기 매개 뇌염(TBE), 카야사나삼림병(KFD) 및 알크후르마병, 및 옴스크 출혈열의 원인이다.

플라비바이러스는 10개의 바이러스 단백질, 즉 3개의 구조적 단백질(캡시드, 전구체 막/막, 및 엔벨로프(E)) 및 7개의 비구조적 단백질을 인코딩하는 작은 구형 비리온이다. E 단백질은 세포에 대한 바이러스의 부착, 엔도소말(endosomal) 구획과의 융합 및 숙주 면역 반응 조절에 중요한 역할을 한다. 바이러스 E 단백질의 엑토도메인(ectodomain)은 3개의 구조적으로 구별되는 도메인(DI, DII 및 DIII)으로 접혀서 비리온의 표면 상에 수미식(head-to-tail) 호모다이머를 형성한다. DI는 전체 E 단백질 구조를 구조화하는 중심 도메인이다. DII는 DI로부터 돌출된 2개의 연장된 루프로부터 형성되며, 이량체의 인접한 E 단백질의 DI 및 DIII 경계면에서 포켓(pocket)에 놓인다. DII의 말단에는 잔기 98개 내지 110개를 포함하고 플라비바이러스 중에서 고도로 보존되어 있는 융합 루프라고 불리는 글리신-풍부 소수성 서열이 있다. 이 영역은 pH-의존성 타입 II 융합 현상에 관여되어 왔는데, 이 과정 동안 상기 영역은 외부로 노출되고 방향이 바뀌어 막 접촉이 가능해진다. DIII는 7가닥 Ig-형 폴드(fold)를 형성하고, 성숙한 비리온에서 가장 먼 막 도메인이며, 수용체 결합에 관여하는 것으로 제안되었다. 줄기 영역은 엑토도메인을 비리온 조립 및 융합에 중요한 2-나선 C-말단 막 관통성 앵커(anchor)에 연결시킨다.

뎅기병은 전세계적으로 가장 중요한 인간 병원체 중 하나인 뎅기 바이러스(DENV)에 의해 유발되는 모기-매개 바이러스 감염이다. 감염은 비-증상/경증 열병(뎅기열, DF)에서 추가로 잠재적으로 치명적인 증상(뎅기 쇼크 증후군, DSS)으로 발전될 수 있는 심한 혈장 누출 및 출혈성 발현(뎅기 출혈열, DHF)에 이르기까지 광범위한 결과를 가진 전신 질환을 일으킨다. DENV는 애데스 종(Aedes spp.) 모기에 의해 전파되며, 세계의 열대 및 아열대 지역에 널리 분포되어 있다. 100개국 이상에서 약 30억명의 사람들이 감염의 위험에 처해 있는 것으로 추정되며, 매년 3억건 이상의 감염, 500,000건의 DHF 발현 및 20,000건의 사망이 보고되었다. 뎅기병의 확산 및 영향으로 세계 보건 기구는 이를 "세계에서 가장 중요한 모기-매개 바이러스 질환"으로 분류했다.

뎅기 바이러스의 4가지 상이한 혈청형(DENV1, DENV2, DENV3 및 DENV4)이 현재까지 확인되었으며, 각각의 혈청형은 인간에서 병원성이다. 어느 하나의 혈청형을 가진 감염은 3가지 기타 다른 혈청형에 대한 단지 일시적인 교차 방어와 함께 그 특정 혈청형에 대한 평생 면역력을 유도한다. 뎅기 감염의 심각한 발현은 상이한 바이러스 혈청형과 관련된 2차 감염과 연관되어 있으며; 이것은 감염의 항체-의존성 증강(ADE)으로 공지된 메카니즘을 통해 일어난다. ADE에서, 교차 반응, 그러나 약하거나 비중화된 항체에 의한 바이러스 입자의 인식은 단핵구, 대식세포 및 수지상 세포(인간에서 뎅기 바이러스 감염의 주요 표적)에 의한 미숙한 또는 불완전하게 중화된 바이러스의 Fc 수용체-매개 흡수를 증가시켜 환자의 임상 상태의 전염성 및 악화를 증가시킨다. ADE는, 4가지 혈청형 모두에 대해 완전-중화 항체를 이끌어 내지 않는 면역원이 감염을 예방하기 보다는 질병에 기여할 수 있기 때문에, 뎅기 백신 개발에 중요한 고려사항이다. 감염에 대한 효과적인 치료가 부족하고 인간 건강에 대한 위험을 고려할 때, 항체-의존성 증강을 일으킬 가능성이 없는 방어 반응을 제공하는 효율적인 백신을 개발할 필요가 있다.

사노피 파스퇴르(Sanofi Pasteur)에 의해 개발된 뎅박시아(Dengvaxia)^ㄾ(CYD-TDV)인 한 뎅기 백신이 허가되었다. 약 5종의 추가의 뎅기 백신 후보가 임상 개발 중에 있으며, (부탄탄(Butantan) 및 타케다(Takeda)에 의해 개발된) 2종의 후보가 2016년 초에 3상 시험을 시작할 것으로 예상되었다.

임상 시험에서, 뎅박시아^ㄾ 백신은 어린 아이들(5세 미만)에서 뎅기 출혈열(예방해야 할 바로 그 질환)로 인해 입원 위험을 증가시키는 것으로 나타났다. 결과적으로, 뎅박시아^ㄾ 백신은 제한적으로, 즉 9세 이상의 사람들에 대해서만 제한적으로 허가되었다. 지카 및 뎅기의 항원 교차 반응성을 고려할 때, 뎅박시아^ㄾ 백신 및 개발 중인 기타 다른 뎅기 백신을 사용한 백신 접종은 지카 바이러스의 ADE를 촉진시켜 성인에서 길랭-바레(Guillain-Barre) 증후군 및 유아에서 소두증의 발병을 증가시킬 수 있고, 지카에 대해 개발 중인 백신은 일부 대상체에서 뎅박시아와 마찬가지로 뎅기 출혈열의 위험을 증가시킬 수 있다는 우려가 있다.

지카 바이러스는 1947년 우간다에서 원숭이에서 처음 확인된 모기-매개 플라비바이러스이고, 이후 1952년에 우간다와 탄자니아 연합공화국에서 인간에서 확인되었다. 지카 바이러스 질병의 발생은 아프리카, 아메리카, 아시아 및 태평양에서 기록되었다. 1960년대부터 1980년대까지, 아프리카 및 아시아 전역에서, 통상적으로 경증 질환이 동반되는 인간 감염이 발견되었다. 증상은 뎅기와 같은 감염과 유사하며, 발열, 피부 발진, 결막염, 근육 및 관절 통증, 불쾌감 및 두통을 포함한다. 이러한 증상은 보통 경증이며, 2일 내지 7일 동안 지속된다. 그러나, 지카 바이러스 감염은 일부 대상체에서 합병증을 야기할 수 있다. 임신 중 지카 바이러스 감염은 소두증을 포함하는 선천성 두뇌 이상의 원인으로서 인식되어 왔다. 지카 바이러스는 길랭-바레 증후군의 기폭제이다. 지카 바이러스와 다양한 신경 장애 사이의 연관성이 조사되고 있다.

사노피는 2016년에 미국의 월터 리드 미육군 연구소(Walter Reed Army Institute of Research)(WRAIR) 및 브라질의 피오크루즈 공중 보건 센터(Fiocruz public health center)와 협력하여 지카 백신을 개발한 것으로 보고하였으며, 2016년에 플라스미드 DNA 백신 또는 정제된 비활성화된 바이러스 백신으로 예방 접종을 실시한 결과, 브라질 북동부에서 발생한 것과 관련된 지카 바이러스의 균주를 이용한 시도에 대해 민감한 마우스에서 완전한 예방을 제공한 것으로 보고하였다(Larocca et al., 2016 Nature 536, 474-478 (25 August 2016)).

그러나, 인간에서 플라스미드 DNA 백신 접종은 전달을 위해 '유전자 총' 또는 유사한 기술(예를 들어, 일렉트로포레이션)을 필요로 하며, 이러한 접근법은 뎅기 및 지카의 문제에 대한 전반적인 해결책을 제공하는 것으로 생각되지 않는다. 또한, 개발 중인 DNA 백신 및 비활성화된 바이러스 백신 접근법은 둘 다 ADE의 원인에 연루된 뎅기-지카 교차 반응성 에피토프를 함유한다.

감염 또는 백신 접종 후, 신체 면역 시스템은 바이러스의 표면 단백질에 결합하여 감염을 막는 중화 항체를 생성한다. 항체-의존성 증강(ADE)은 한 바이러스에 의해 유발된 항체가 유사한 바이러스의 감염에 결합할 수 있지만 이를 차단(중화)하지 않을 때 발생한다.

ADE는 뎅기 바이러스에 대해 가장 일반적으로 관찰된다. 뎅기 바이러스의 4가지 공지된 혈청형은 별개의, 그러나 관련된 표면 단백질을 갖는다. 제1 뎅기 바이러스 혈청형을 갖는 감염은 통상적으로 감염된 대상체에서 경증을 초래하거나, 증상을 초래하지 않는다. 대상체가 이후에 제2 뎅기 혈청형으로 감염될 경우, 면역 시스템은 바이러스의 제2 혈청형에 결합하는 제1 혈청형에 대한 항체를 생성하지만, 감염을 항상 차단하지는 못하고, ADE를 일으킬 가능성이 있다. 결과적으로, 뎅기 바이러스가 정상적으로 감염되지 않는 세포(즉, 항체의 '꼬리' 또는 Fc 영역에 대한 수용체를 갖는 세포)로의 바이러스의 항체-매개 흡수가 존재한다. 이것은 뎅기 출혈열 또는 뎅기 쇼크 증후군과 같은 더 심한 형태의 질환을 초래할 수 있다. 어린 유아만이 태반경유 전염된 모성 항-뎅기(anti-dengue) 항체의 결과로서 뎅기에 처음 노출시 뎅기 출혈열이 발생된다. 따라서, 항체는 성인과 유아에서 똑같이 (심각한) 질환 원인에 있어서 바이러스와 동등한 파트너이다.

뎅기 바이러스 항체는 기타 다른 뎅기 바이러스 혈청형의 ADE를 촉진할 뿐만 아니라, 지카 바이러스 감염을 증가시킨다. 문헌[Dejnirattisai et al., (2016) Nature Immunology 17, 1102-1108. "Dengue virus sero-cross-reactivity drives antibody-dependent enhancement of infection with Zika virus"]. Dejnirattisai외 다수는 세포 배양에서 지카 바이러스에 대한 뎅기 바이러스 환자로부터의 뎅기 중화 항체 또는 혈청의 효과를 시험하였다. 항체의 부재하에, 지카 바이러스는 세포를 불량하게 감염시켰지만, 지카 바이러스를 뎅기 혈청 또는 중화 항체와 함께 인큐베이션했을 때, 지카 바이러스는 이들 세포를 강하게 감염시켰으며, 이는 ADE의 작동을 나타낸다. 이러한 발견의 생리학적 타당성은 역학 연구에서 확인을 필요로 하지만, 이러한 발견은 현행 백신 접근법에 대한 명백한 위험성을 제기한다. 지금까지, 이 문제에 대한 만족할만한 해결책이 구상되거나 옹호되지 않았다.

이 분야의 백신은 개체군 기준으로 순 이득을 얻을 수 있지만, 개체 기준으로는 상황이 다르다. 일부 대상체에서, 비극적으로, 한 질환의 예방은 또 다른 질환으로 인한 사망의 위험 또는 심각성을 증가시킬 수 있다. 문헌[Paul LM et al. Clinical & Translational Immunology (2016) 5, e117 "Dengue virus antibodies enhance Zika virus infection"]은 다음과 같이 보고하였다:

"수십년 동안, 모기-전염 플라비바이러스인 지카 바이러스(ZIKV)에 의한 인간 감염은 산발적이고, 경증 질환과 연관되고, 증상이 기타 다른 급성 유열성 질환과 유사하였기 때문에, 보고가 부족했다. 최근 ZIKV와 연관된 심각한 질환에 대한 보고는 관심을 크게 높였다. ZIKV는 적격 애데스(Aedes) 모기 벡터가 발견되는 아메리카 및 전세계적으로 계속 확산될 것으로 예상된다. 가장 일반적인 모기-전염 인간 플라비바이러스인 뎅기 바이러스(DENV)는 최근 ZIKV 도입 분야에서 잘 확립되어 있으며 발생의 근원이다. DENV 및 ZIKV는 밀접한 관련이 있으며, 결과적으로 상당한 항원 중복을 초래한다. 항체-의존성 증강(ADE)을 통해, 항-DENV 항체는 특정 종류의 면역 세포에 대한 DENV의 감염성을 향상시켜 심각한 질환 결과와 관련이 있는 바이러스 생성을 증가시킬 수 있다. 유사하게, ZIKV는 기타 다른 플라비바이러스에 의해 생성된 항체에 반응하여 ADE를 겪는 것으로 나타났다. 발명자들은 중화 및 ADE 분석을 사용하여 ZIKV에 대한 인간 항-DENV 모노클로날 항체(HMAb) 및 인간 DENV 면역 혈청을 잘 특성화하여 광범위하게 중화시키는 중화 및 증대 가능성을 시험하였다. 우리는 항-DENV HMAb가 교차 반응하고, 중화시키지 않고, 시험관내에서 ZIKV 감염을 크게 증가시킨다는 것을 나타낸다. DENV 면역 혈청은 ZIKV에 대해 다양한 정도의 중화를 갖고, 유사하게 ZIKV 감염을 증가시켰다. 발명자들의 결과는 기존의 DENV 면역력이 생체내에서 ZIKV 감염을 증가시킬 수 있고, 질환의 심각성을 증가시킬 수 있다는 것을 시사한다. ZIKV와 DENV 사이의 상호 작용을 이해하는 것은 공중 보건 반응에 정보를 제공하는 데 중요할 것이며, ZIKV 및 DENV 백신 설계 및 구현 전략에 특히 유용할 것이다."

뎅기 바이러스 항체는 지카 바이러스의 ADE를 촉진시킬 수 있다. 지카 바이러스 항체는 뎅기 바이러스의 ADE를 촉진시킬 수 있다. 따라서, 지카 바이러스에 대한 예방 접종은 뎅기 출혈열 또는 뎅기 쇼크 증후군의 발병률을 증가시키거나, 달리 그것이 발병되지 않았지만 예방 접종을 받은 개체에서는 이러한 상태의 발생을 조장할 수 있다. 수년이 될 수 있는 감염들 사이의 간격을 고려해볼 때, 시판후 부작용 감시 연구가 새로운 백신이 어느 정도까지 심각한 뎅기병(출혈열, 쇼크 증후군) 또는 심각한 지카 후유증, 예컨대 길랭-바레 증후군 또는 소두증에 취약하게 만드는 지 여부를 알려줄 수 있기까지 몇 년이 걸릴 것이다.

따라서, 항체-의존성 증강의 문제를 피하기 위해 의도적으로 설계된 백신 접근법에 대한 분명한 요구가 존재한다.

현재의 혈청 시험을 사용한 플라비바이러스 감염의 구체적인 진단은 기타 다른 임상적으로 관련된 플라비바이러스에 대한 항체들간의 교차 반응성에 의해 복잡하게 된다. 교차 반응성은 상이한 플라비바이러스가 공존(co-circulate)하는 장소 또는 플라비바이러스에 대한 백신으로 예방 접종을 받은 집단에서 특히 문제가 된다. 교차 반응성 항체의 대부분은 면역 우세 플라비바이러스 엔벨로프(E) 단백질 표적에 대해 도메인 II의 말단에서 융합 루프에서 보존된 에피토프를 발생한다.

개체가 혈청 반응 음성이므로 뎅기 또는 지카에 노출되지 않았는지, 또는 개체가 혈청 반응 양성이므로 지카 및/또는 뎅기에 노출되었는지를 평가하고, 혈청 반응 양성인 개체가 지카 및/또는 4가지 뎅기 혈청형 중 어느 것에 노출된 것인지를 구별하기 위하여 밀접하게 관련된 플라비바이러스들을 구별할 수 있는 진단 접근법에 대한 요구가 존재한다. 예방 접종을 위한 대상체를 선택하거나, 예방 접종이 뎅기 또는 지카에 대해 방어적 면역 반응을 일으켰는지 확인하기 위하여 혈청전환을 평가하기 위해 사용될 수 있는 진단 접근법에 대한 요구가 존재한다. 따라서, 뎅기 바이러스 혈청형에 대한 항체 및 지카 바이러스에 대한 항체를 구별하기 위해 면역 반응의 심문을 가능하게 하는 진단 접근법에 대한 요구가 존재한다.

WO2016012800에는 뎅기 바이러스에 감염된 환자로부터 수득된 교차 반응성 중화 항체의 식별 및 특성화가 개시되어 있다. 급성 인간 항체 반응은 2개의 주요 에피토프, 즉 융합 루프(FL FLE) 상 공지된 에피토프, 및 엔벨로프 단백질의 손상되지 않은 비리온 또는 이량체에서 발견되고 도메인 I, II 및 III의 영역을 포함하는 신규한 것으로 언급된 제2 에피토프에 초점이 맞춰진 것으로 밝혀졌다. 제2 에피토프, 즉 엔벨로프 이량체 에피토프 또는 EDE와 반응성인 항체는 낮은 피코몰 범위로 곤충 및 일차 인간 세포 둘 다에서 생성된 바이러스를 완전히 중화시키는 것으로 보고되었다. 따라서, 안정화된 가용성 단백질 E 이량체를 포함하는 서브유닛 백신이 뎅기 백신으로서 제안되었다. WO2016012800에는 뎅기 바이러스 엔벨로프 당단백질 E 엑토도메인(sE; 가용성 엔벨로프 폴리펩티드/당단백질)이 뎅기 바이러스 혈청형 1, 2 및 4의 엔벨로프 당단백질 E의 1 내지 395 아미노산 단편 및 뎅기 바이러스 혈청형 3의 엔벨로프 당단백질 E의 1 내지 393 아미노산 단편을 나타낸다고 개시되어 있다. WO2016012800에는 H27F, H27W, L107C, F108C, H244F, H244W, S255C, A259C, T/S262C, T/A265C, L278F, L292F, L294N, A313C(DEN3에서 S313C) 및 T315C 중에서 선택되는 적어도 하나의 돌연변이(치환)를 갖는 DENV-1 sE, DENV-2 sE, DENV-3 sE, DENV-4 sE 및 이들의 돌연변이 sE로부터 선택되는 sE의 안정화된 이량체로서 EDE가 기재되어 있으며, 돌연변이는 이량체 구성에서 증가된 안정성에 기여하는 것으로 생각된다. 이들의 돌연변이 sE는 Q227N, E174N 및 D329N으로부터 선택되는 적어도 하나의 돌연변이(치환); 바람직하게는 3가지 모든 돌연변이 Q227N, E174N 및 D329N을 더 포함할 수 있으며, 돌연변이는 비-적절한 면역원성 영역을 마스킹하고, 발명의 안정화된 재조합 sE 이량체가 4가지 모든 뎅기 바이러스 혈청형에 대한 중화 항체를 우선적으로 유도하게 한다고 개시되어 있다.

기재된 sE 이량체 돌연변이는 면역원성을 방해하는 것이 아니라, 이량체 접촉부에 시스테인 돌연변이를 포함하여 가교에 의해 안정화를 제공하고/제공하거나 새로운 글리코실화 부위를 도입하여 클릭(click) 화학에 의해 이량체 상 인접한 당 사이에 화학적 가교를 허용하고/허용하거나, 적어도 하나의 sE 단량체의 아미노산 서열에서 적어도 하나의 아미노산 잔기를 적어도 하나의 벌키한 측쇄 아미노산으로 치환하여 이량체 경계면 또는 각각의 단량체의 도메인 1(D1)/도메인 3(D3) 링커에 공동을 형성하게 함으로써, 더 높은 이량체 친화성을 제공한다고 되어 있다.

WO2016012800에는 엔벨로프 단백질이 개선된 EDE가 생성되도록 조작될 수 있고, 항-융합 루프(항-FL) 항체를 인식할 수 없거나 발생할 수 없는 EDE가 개선된 EDE인 것으로 생각된다고 개시되어 있다. 이러한 개선은 특정 에피토프(항-FL 항체를 발생시키는 임의의 항원이 없음)가 스캐폴드 단백질에 융합된 혼성 단백질을 생성함으로써, 또는 (바이러스의 내부로 돌출된) 이량체의 내부 표면을 N 또는 O 연결된 글리칸 서열을 첨가하여 그것이 덜 면역원성이 되도록 당으로 변형시킴으로써 엔벨로프 단백질을 조작함으로써, 엔벨로프 단백질에서 하나 이상의 돌연변이, 결실 또는 삽입에 의해 수행될 수 있다고 개시되어 있다.

Roby외 다수(2013, 2014)는 플라비바이러스 게놈의 캡시드(C) 유전자내에 큰 내부 결실을 도입하여 비리온으로 패키징될 수 없는 복제-적격 RNA를 생성하지만, 전염성 바이러스를 생성하지 않으면서 높은 면역원성 서브바이러스 입자(SVP)의 분비를 유지함으로써 웨스트 나일 바이러스에 대한 백신 후보를 개발하는 접근법을 기재한다. 이러한 가전염성(pseudoinfectious) C-결실 백신은 형질감염된 세포로부터 다량의 비-전염성 면역원성 서브바이러스 입자(SVP)를 복제 및 분비할 수 있고, 따라서 비전염성 비활성화된 또는 서브유닛 백신의 안전성과 생백신의 복제에 의해 생성된 강한 면역 반응의 조합된 이점을 제공한다고 한다.

Roby외 다수(2013)는 웨스트 나일 바이러스 쿤진(KUNV)의 C-결실 CMV-프로모터 구동 cDNA를 갖는 구조물, pKUNdC/C(KUNdC18-100/CMV-C)를 생성하였으며, 여기서 알파 나선 1, 2, 및 4는 2개의 별개의 세그먼트에서 제거되고, 친수성 알파 나선 3은 유지되었다. pKUNdC/C에서 C-결실 WNV cDNA는 시토메갈로바이러스(CMV) 프로모터의 한 카피의 제어하에 놓이고, C 유전자는 동일한 플라스미드 DNA에서 CMV 프로모터의 제2 카피의 제어하에 놓였다. 더 큰 사이토솔 모이어티(알파 나선 3)의 보존은 C 및 dC44-59의 모든 알파 나선의 결실을 갖는 구조물에 비해 SVP 분비에서 유의한 개선을 초래하였다. 또한, SVP 분비에 대한 추가의 개선은 E 단백질의 아미노산 154 내지 156에서 NYS 모티프에 상응하는, WNV의 다수의 순환하는 균주 및 KUNV의 최근 단리물의 특징인, E 단백질의 N154에서 Asn-연결 글리코실화 모티프의 혼입시 관찰되었다. pKUNdC/C는 자가 복제 C-결실 RNA 생성 SVP를 주변 세포에 전달할 수 있는 단일-원형 전염성 입자(SRIP)를 생성하는 것으로 나타났다. 그러나, pKUNdC/C DNA로부터 생성된 SRIP와 SVP 둘 다의 양은 비교적 낮았다.

Roby외 다수(2014)는 CMV 프로모터가 더 강력한 연장 인자 EF1a 프로모터로 대체되고, 트랜스-C 발현을 최적화함으로써 SRIP 생성을 증가시키고자 한 시도에서 C의 상이한 형태가 사용된, 웨스트 나일 바이러스 쿤진(KUNV)의 C-결실 cDNA를 갖는 2세대 구조물의 생성을 보고하였다. C의 연장된 형태를 인코딩하는 연장 인자 EF1a 프로모터를 함유하는 구조물은 SRIP의 최고 역가를 생성하는 것으로 입증되었고, 마우스에서 면역원성이었다. SRIP 및 SVP 역가는 SVP의 분비를 증가시키는 (E 단백질의 아미노산 154 내지 156에서 NYS 모티프에 상응하는) 엔벨로프 단백질에서 N154 글리코실화 모티프의 혼입을 통해 추가로 개선되었다.

Davis외 다수(2014)는 CD209-발현 세포를 감염시키는 웨스트 나일 바이러스(WNV)의 능력을 조사하였다. 포유동물 세포-유래 웨스트 나일 바이러스는 C-타입 렉틴 CD209L을 발현하는 세포를 우선적으로 감염시키지만 CD209를 발현하는 세포는 감염시키지 않으며; 대조적으로, 뎅기 바이러스(DENV) 감염은 어느 하나의 부착 인자를 발현하는 세포에서 증가된다. DENV 및 WNV 비리온은 매우 유사한 구조를 갖는다. 그들의 표면은 20면체 격자(36)에 배열된 180개 엔벨로프(E) 단백질 서브유닛의 규칙적인 배열로 이루어진다. 또한, 프리-멤브레인 단백질(prM)의 퓨린-매개 가공 후 생성된 작은 막(M) 단백질이 비리온 표면 상에 존재하지만, 대부분은 바이러스 막에 매몰되어 있다-277에 부위를 첨가하고; (viii) T301N 및 G303S(TYG301NYS)는 Asn-301에 부위를 첨가하고; (ix) T330N은 Asn-330에 부위를 첨가하고; (x) K370T는 Asn-368에 부위를 첨가하고; (xi) G389N 및 Q391T(GEQ389NET)는 Asn-389에 부위를 첨가한다. 모든 부위는 CD209L매개 감염을 허용하였지만, 단지 일부만이 CD209 사용을 촉진하였다. 기타 다른 바이러스에서 볼 수 있듯이, 웨스트 나일 바이러스 상 만노스-풍부 글리칸은 CD209와의 상호 작용에 필요하지만, 만노스-풍부 글리칸은 CD209L매개 감염에 필요하지 않았다. 복합 글리칸, 특히 N-아세틸글루코사민-종결 구조는 CD209L과의 리포터 바이러스 입자 상호 작용을 매개할 수 있었다. Davis외 다수는 CD209L이 광범위한 특이성을 갖는 글리코실화된 플라비바이러스를 인식하는 반면, CD209는 만노스-풍부 글리칸을 갖는 플라비바이러스에 대해 선택적이므로, 비리온 상 N-연결 글리코실화 부위의 위치는 혼입되는 글리칸의 타입을 결정하여 CD209-발현 세포에 대한 바이러스 친화성을 제어한다고 제안하였다.

본 발명은 자연 플라비바이러스 E-단백질 융합 루프 서열에 존재하지 않는 N-연결 글리칸에 대한 적어도 하나의 글리코실화 부위를 포함하고, 여기서 적어도 하나의 글리코실화 부위는 N-연결 글리코실화 세쿠온(Asn-X-Ser/Thr)이고, 세쿠온의 Asn(N) 잔기는 자연 플라비바이러스 E-단백질 융합 루프 아미노산 서열의 위치 98 내지 110(서열번호 1 DRGWGNGCGLFGK) 중 어느 하나를 점유할 수 있고, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산 잔기이고, Ser/Thr은 세린 또는 트레오닌 잔기를 나타내는 것인, 플라비바이러스 E-단백질 융합 루프의 단리된 재조합 유사체를 제공한다.

본 발명에 따른 플라비바이러스 E-단백질 융합 루프의 단리된 재조합 유사체는 자연 플라비바이러스 E-단백질 융합 루프 서열에 존재하지 않는 2개의 글리코실화 부위를 포함할 수 있다.

본 발명은 본 발명의 플라비바이러스 E-단백질 융합 루프의 유사체를 포함하는 플라비바이러스 E-단백질의 단리된 재조합 유사체를 제공한다. 일부 구현예에서, 플라비바이러스 E-단백질의 단리된 재조합 유사체의 서열에 대한 유일한 변형은 N-연결 글리코실화 세쿠온(들)(Asn-X-Ser/Thr)을 도입하기 위한 융합 루프에서의 본 발명의 변형이고, 다른 구현예에서, 하나 이상의 추가의 변형은 융합 루프 외부의 잔기에서 플라비바이러스 E-단백질에 도입될 수 있다.

적어도 하나의 추가의 글리칸이 부착된 본 발명의 유사체가 제공된다. 바람직하게는, 적어도 하나의 추가의 글리칸은 N-연결 글리칸이다. 바람직하게는, 본 발명의 유사체는 재조합 DNA 또는 RNA 서열의 발현의 생성물이다. 적어도 하나의 추가의 글리칸은 플라비바이러스 E-단백질 융합 루프 외부의 플라비바이러스 E-단백질에서 하나 이상의 천연 글리코실화 부위에 존재할 수 있다.

본 발명의 유사체는 N-연결 글리코실화 세쿠온(Asn-X-Ser/Thr)을 포함하여 세쿠온의 Asn(N) 잔기가 위치 98 내지 101 및/또는 106 내지 110 중 어느 하나를 점유하도록 할 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 유사체에서, X는 다음의 13개의 아미노산 잔기 Gly, His, Asn, Gln, Tyr, Val, Ala, Met, Ile, Lys, Arg, Thr 또는 Ser 중 어느 하나이다.

본 발명의 바람직한 유사체에서, 플라비바이러스 E-단백질은 뎅기 바이러스 E-단백질이고, 세쿠온의 Asn(N) 잔기는 유사체 플라비바이러스 E-단백질 융합 루프의 아미노산 서열의 위치 101, 108 또는 101과 108 둘 다를 점유하거나, 플라비바이러스 E-단백질은 지카 E-단백질이고, 세쿠온의 Asn(N) 잔기는 유사체 플라비바이러스 E-단백질 융합 루프의 아미노산 서열의 위치 100을 점유한다.

본 발명의 바람직한 유사체에서, 플라비바이러스는 뎅기 바이러스이고, 유사체 플라비바이러스 E-단백질 융합 루프 98 내지 110의 아미노산 서열은 서열번호 2 DRGNGSGCGLNGS, 서열번호 3 DRGNGSGCGLFGK 및 서열번호 4 DRGWGNGCGLNGS로부터 선택된다.

본 발명의 또 다른 바람직한 유사체에서, 플라비바이러스는 지카 바이러스이고, 유사체 플라비바이러스 E-단백질 융합 루프 98 내지 110의 아미노산 서열은 서열번호 5 DRNHTNGCGLFGK이다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 플라비바이러스 E-단백질 융합 루프의 유사체를 인코딩하는 서열을 포함하는 단리된 재조합 DNA 또는 RNA 서열을 제공한다.

단리된 재조합 DNA 서열은 플라스미드 또는 선형 DNA-기반 백신일 수 있다. 본 발명의 단리된 재조합 DNA 서열은 포유동물 프로모터의 제어하에 본 발명에 따른 플라비바이러스 E-단백질의 유사체를 인코딩할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 DNA 또는 RNA 서열을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 숙주 세포는 본 발명에 따른 DNA 서열 또는 본 발명에 따른 플라스미드 또는 선형 DNA-기반 백신 면역원을 포함하는 진핵 숙주 세포일 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 숙주 세포는 본 발명의 유사체를 발현할 수 있다. 또한, 바람직하게는, 본 발명의 숙주 세포는 본 발명의 유사체를 발현하고 글리코실화할 수 있다.

본 발명은 유사체의 발현에 적합한 조건에서 본 발명에 따른 숙주 세포를 배양하고, 유사체를 단리시키는 것을 포함하는, 본 발명의 유사체의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명의 유사체 및 희석제를 포함하는 조성물이 제공된다.

본 발명의 조성물은 본 발명에 따른 유사체를 제약학적으로 허용가능한 희석제, 아쥬반트(adjuvant) 및/또는 담체와 함께 포함하는, 조성물로 접종된 대상체에서 면역 반응을 유도할 수 있는 면역원성 (백신) 조성물일 수 있다.

본 발명의 조성물은 DEN-1의 유사체, DEN-2의 유사체, DEN-3의 유사체, DEN-4의 유사체 및 지카의 유사체로부터 선택되는 본 발명의 하나 이상의 플라비바이러스 유사체를 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 각각의 4개의 뎅기 바이러스 혈청형 DEN-1, DEN-2, DEN-3 및 DEN-4를 나타내는 본 발명의 4개의 뎅기 유사체를 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 본 발명의 지카 바이러스 유사체를 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 각각의 4개의 뎅기 혈청형 DEN-1, DEN-2, DEN-3 및 DEN-4를 나타내는 본 발명의 4개의 뎅기 유사체 및 본 발명의 지카 바이러스 유사체를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 유사체에 특이적으로 결합할 수 있는 결합 분자를 제공한다. 결합 분자는 항체 또는 그의 단편, 도메인 항체, 단백질 스캐폴드 또는 앱타머일 수 있되, 단 그것은 본 발명의 유사체에 특이적으로 결합할 수 있다.

본 발명은 약제로서 사용하기 위한 본 발명의 유사체, 조성물 또는 결합 분자를 제공한다.

또한, 본 발명은 백신으로서 사용하기 위한 본 발명의 유사체, 조성물 또는 결합 분자를 제공한다.

또한, 플라비바이러스 감염의 예방적 또는 치료적 처리를 위한 약제로서의 용도 또는 플라비바이러스 감염의 예방적 또는 치료적 처리를 위한 약제의 제조에서의 용도를 위한 본 발명의 유사체, 조성물 또는 결합 분자가 제공된다.

본 발명은 본 발명의 유사체, 조성물 또는 결합 분자를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 플라비바이러스에 의한 감염에 대한 대상체의 보호 방법을 제공한다.

바람직한 구현예에서, 플라비바이러스 감염은 뎅기 바이러스 감염 또는 지카 바이러스 감염이다.

본 발명은 진단제로서 사용하기 위한 본 발명의 유사체, 조성물 또는 결합 분자를 제공한다.

본 발명은 본 발명의 유사체, 조성물 또는 결합 분자 및 상기 단리된 유사체 또는 결합 분자를 함유하는 면역학적 (항원-항체) 복합체를 검출할 수 있는 시약을 포함하는 진단 키트를 제공한다.

본 발명에 따른 진단 테스트 키트는 하나 이상의 대조군 표준물 및/또는 시험편 희석제 및/또는 세척 완충제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 진단 테스트 키트에서, 본 발명의 유사체 및/또는 그에 특이적인 결합 분자는 고체 지지체 상에 고정될 수 있다. 고체 지지체는 마이크로플레이트 웰일 수 있다. 본 발명에 따른 진단 테스트 키트에서, 상기 단리된 유사체 또는 결합 분자를 함유하는 면역학적 복합체는 ELISA 또는 측면 유동(lateral flow)에 의해 검출될 수 있다.

본 발명은 항체-의존성 증강의 문제를 방지하도록 의도적으로 설계된 백신 접근법을 제공한다.

본 발명은 개체가 혈청 반응 음성이고 따라서 뎅기 또는 지카에 노출되지 않았는지, 또는 개체가 혈청 반응 양성이고 지카 및/또는 뎅기에 노출되었는지 평가하기 위해, 그리고 혈청 반응 양성인 개체에 대해 개체가 지카 및/또는 4개의 뎅기 혈청형 중 어느 것에 노출되었는지를 구별하기 위해, 밀접하게 관련된 플라비바이러스들을 구별할 수 있는 진단 접근법을 제공한다. 본 발명은 예방 접종을 위한 대상체를 선택하거나, 예방 접종이 뎅기 또는 지카에 대해 방어적 면역 반응을 일으켰는지 여부를 결정하기 위해 혈청전환을 평가하는 데 사용될 수 있는 진단 접근법을 제공한다. 본 발명은 뎅기 바이러스 혈청형에 대한 항체 및 지카 바이러스에 대한 항체를 구별하기 위해 면역 반응의 조사를 가능하게 하는 진단 접근법을 제공한다.

본 발명은 본 발명의 여러가지 양태들의 다양한 구현예를 참조로 기재된다. 명료함을 위해, 별개의 구현예의 문맥에서 설명되는 본 발명의 특정 특징들은 또한 하나 이상의 구현예 또는 단일 구현예에서 조합하여 제공될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 반대로, 간략화를 위해, 단일 구현예의 문맥에서 설명되는 본 발명의 다양한 특징들은 또한 개별적으로 또는 임의의 적합한 하위조합으로 제공될 수 있다. 구현예들의 모든 조합은 본 발명에 구체적으로 포함되며, 각각의 모든 조합이 개별적으로 및 명시적으로 개시된 것처럼 본원에 개시된다. 추가로, 모든 하위조합 또한 본 발명에 구체적으로 포함되며, 각각의 모든 이러한 하위조합이 본원에 개별적으로 및 명시적으로 개시된 것처럼 본원에 개시된다.

본 발명은 플라비바이러스 교차 반응성 감염-증강 항체의 생성과 연관된 것으로 공지된 자연(천연, 야생형) E-단백질 융합 루프 에피토프가 변형되어 천연 융합 루프 에피토프 상에 일반적으로 존재하지 않는 N-연결 글리칸을 갖는 단백질의 글리코실화를 위한 하나 이상의(예를 들어, 2) 글리코실화 부위를 포함하는 변형된 플라비바이러스 핵산 및 단백질 서열을 제공한다. 이러한 변형은 융합 루프 아미노산 서열을 변경시키고, 글리칸의 존재는 에피토프를 추가로 위장시킨다. 따라서, 본 발명의 변형된 플라비바이러스 핵산 및 단백질 서열은 플라비바이러스 교차 반응성 감염-증강 항체의 수반되는 생성없이 방어적인 반응을 생성하여, 기존 백신 접근법으로 관찰된 항체-의존성 증강의 문제를 방지하도록 설계된다. 또한, 본 발명의 변형된 플라비바이러스 핵산 및 단백질 서열은 특정 플라비바이러스의 검출을 위한 항원으로서 또는 특정 플라비바이러스의 검출을 위한 항체와 같은 결합 분자를 생성하기 위한 진단 용도로 설계된다.

항체란, 실질적으로 손상되지 않은 항체 분자뿐만 아니라, 키메라 항체, 인간화된(humanised) 항체(여기서, 적어도 하나의 아미노산이 비-인간 항체, 예를 들어 자연 발생적 비-인간 항체 또는 비-인간 항체 서열로부터 조립된 항체에 대해 돌연변이됨), 단일 쇄 항체, 이중특이적 항체, 항체 중쇄, 항체 경쇄, 항체 중쇄 및/또는 경쇄의 호모다이머 또는 헤테로다이머, 및 이들의 항원 결합 부분 및 유도체의 의미를 포함한다. 화합물이 단백질일 경우, 예를 들어 항체 또는 그의 단편이 인간 대상체에 투여되고, 항체가 인간 항체 또는 그의 단편이 아닐 경우, 그것은 인간화되어 인간에서 면역원성을 감소시킬 수 있다. 인간화된 항체 또는 그의 단편의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다.

본 발명의 결합 분자는 바람직하게는 항체 또는 그의 항원 결합 부분이다. 항원 결합 부분은 Fv 단편; Fab-유사 단편(예를 들어, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab)2단편, Fv 또는 scFv 단편); 또는 도메인 항체일 수 있다. 항체 결합 부분은 손상되지 않은 항체에 존재하는 선형 아미노산 서열로부터 유도되거나, 선택적으로 기타 다른 아미노산이 산재된 일련의 비-연속적인 아미노산의 세트를 포함할 수 있고, 예를 들어 에피토프와 접촉하는 데 필요한 특정 아미노산을 포함할 수 있지만, 예를 들어 일부 경우에, 예를 들어 이종 스캐폴드 단백질에 의해 대체될 수 있는 천연 항체의 프레임워크에 필요한 아미노산을 포함하지 않을 수 있다. 본 발명에 따른 항체는 포유동물, 예컨대 인간, 원숭이, 래빗 또는 마우스를 면역화시키는 단계를 포함하는 방법; 및/또는 예를 들어 당업자에게 널리 공지된 바와 같은 파지 표시 선택 단계를 포함하는 시험관내 방법에 의해 수득될 수 있다.

또한, 용어 항체는 IgG, IgA, IgM, IdD 및 IgE를 포함하는 모든 부류의 항체를 포함한다. 또한, 용어 항체는 임의의 정의된 항체 및 이들의 항원 결합 부분의 변이체, 융합 및 유도체를 포함한다.

"중화시키다"는 이전에 감염되지 않은 세포를 감염시키는 바이러스의 능력을 감소시키는 것을 의미한다. 당업자는 바이러스 중화 능력을 모니터하는 적합한 기법을 잘 알고 있을 것이다.

본원에 기재된 바와 같은 서열 변화를 도입하기 위한 핵산 서열의 조작 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다.

야생형 서열(열 1 내지 9)에서 융합 루프 DRGWGNGCGLFGK(잔기 98 내지 110으로서 정의됨, 서열번호 1)가 볼드체로 나타나 있다. 변형된 유사체 HX 서열에서 N-연결 글리코실화 세쿠온을 만들기 위하여 변경된 잔기가 열 10 내지 20에 볼드체로 나타나 있다. 구조물 pCRO21 내지 24, 26 및 28은 잘 발현되고, 추가의 조사를 위하여 선택되었다. 뎅기 E-단백질의 경우, 4개의 잔기가 변경되어 2개의 글리코실화 부위(pCRO21 내지 24)가 만들어졌다. 지카 E-단백질의 경우, 3개의 잔기가 변경되어 1개의 글리코실화 부위(pCRO28)가 만들어졌다.

구조물 pCRO25, 29, 30 및 31은 선택된 발현 시스템에서 잘 발현되지 않았으므로, 몇 가지 경우에, 본 발명의 재조합 유사체 서열은 다음의 서열을 포함하지 않는다:

pCRO25 CKRTLVDRGNGSGCGLNGSGSLVTCAKFA (서열번호 7)

pCRO29 CKRTLVDRGWGNGCGNHTKGSLVTCAKFA (서열번호 8)

pCRO30 CKRTLVDRGNGSGCGLFGKGSLVTCAKFA (서열번호 9)

pCRO31 CKRTLVDRGWGNGCGLNGSGSLVTCAKFA (서열번호 10).

본 발명의 유사체에서, N-연결 글리코실화 세쿠온(Asn-X-Ser/Thr)은 세쿠온의 Asn(N) 잔기가 위치 98 내지 101 및/또는 106 내지 110 중 어느 하나를 점유하도록 존재할 수 있다. 즉, N 잔기는 98, 99, 100 및 101로부터 선택되는 위치 및/또는 106, 107, 108, 109 및 110으로부터 선택되는 위치를 점유할 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 유사체에서, X는 다음의 13개의 아미노산 잔기 Gly, His, Asn, Gln, Tyr, Val, Ala, Met, Ile, Lys, Arg, Thr 또는 Ser 중 어느 하나이며, Gly 또는 His가 특히 바람직하다. 본원에 기재된 본 발명의 특정 구현예에서, 뎅기 바이러스에 대해 X가 Gly인 것이 바람직하고, 지카에 대해 X가 His인 것이 바람직하다.

본 발명의 바람직한 유사체에서, 플라비바이러스 E-단백질은 뎅기 바이러스 E-단백질이고, 세쿠온의 Asn(N) 잔기는 유사체 플라비바이러스 E-단백질 융합 루프의 아미노산 서열의 위치 101, 108 또는 101과 108 둘 다를 점유하거나, 플라비바이러스 E-단백질은 지카 E-단백질이고, 세쿠온의 Asn(N) 잔기는 유사체 플라비바이러스 E-단백질 융합 루프의 아미노산 서열의 위치 100을 점유한다.

본 발명의 바람직한 유사체에서, 플라비바이러스는 뎅기 바이러스이고, 유사체 플라비바이러스 E-단백질 융합 루프 98 내지 110의 아미노산 서열은 DRGNGSGCGLNGS(서열번호 2), DRGNGSGCGLFGK(서열번호 3) 및 DRGWGNGCGLNGS(서열번호 4)로부터 선택된다.

본 발명의 또 다른 바람직한 유사체에서, 플라비바이러스는 지카 바이러스이고, 유사체 플라비바이러스 E-단백질 융합 루프 98 내지 110의 아미노산 서열은 DRNHTNGCGLFGK(서열번호 5)이다.

재조합 유사체 E-단백질 융합 루프 단백질을 인코딩하거나, 이러한 융합 루프 단백질을 포함하는 재조합 유사체 E-단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 일반적으로 DNA 서열의 제어 서열 및 분비 신호 서열을 함유하는 발현 벡터로의 기능적 및 작동가능한 삽입 후에 발현될 수 있다.

본 발명의 핵산 서열의 발현에 적합한 프로모터는 CMV이다.

본 발명에 따라 사용될 수 있는 숙주 세포는 HEK 및 CHO 세포주를 포함한다. 숙주는 유전학적으로 조작되어 인간-유사 N-연결 글리칸을 갖는 치료 당단백질을 생성할 수 있다.

본 발명의 면역원성 조성물은 아쥬반트와 함께 또는 아쥬반트 없이 투여될 수 있다. 아쥬반트는 면역원성 조성물에 직접 첨가되거나, 백신의 투여와 동시에 또는 그 직후에 별도로 투여될 수 있다. 이러한 아쥬반트는 알루미늄 염(알루미늄 히드록시드), 수중유 에멀전 제제(특정 자극제, 예컨대 무라밀 펩티드를 갖거나 이를 갖지 않음), 사포닌 아쥬반트, 시토카인, 박테리아 독소, 예컨대 콜레라 독소, 백일해 독소, 또는 이. 콜라이(E. coli) 이열성 독소의 해독된 돌연변이를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 면역원성 조성물은 기타 다른 면역원 또는 면역조절제, 예를 들어 면역 글로불린, 시토카인, 림포카인 및 케모카인과 함께 투여될 수 있다.

본원에 기재된 특정 구현예에서, 사용된 아쥬반트는 인간 및 수의학적 용도에 허용가능한 아쥬반트인 알하이드로겔(Alhydrogel)^ㄾ이었다. 그러나, 기타 다른 적합한 아쥬반트 및 보조약(adjuvantation) 및 제제 전략이 항원의 핵산 및 단백질 형태 중 어느 하나(또는 둘 다)에 대해 이용가능하다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 알하이드로겔은 최대 효과를 나타내도록 단백질이 중성 또는 거의-중성 pH 값(예를 들어, pH 7.4)에서 음으로 하전되는 것을 필요로 한다. 이것은, 알하이드로겔이 이러한 pH의 조건하에서 순 양전하를 갖기 때문이다. 반면, 알루미늄 포스페이트는 순 음전하를 갖고, 일반적으로 백신 제제에 대해 사용되는 pH의 생리학적 조건하에 양으로 하전된 단백질에 대해 더 우수하다. 단백질이 거의 중성 등전점을 가질 경우, 그것은 알하이드로겔 또는 알루미늄 포스페이트 아쥬반트에 잘 결합하지 않을 수 있어서, 아쥬반트 효과를 제한할 것이고, 기타 다른 보조약 전략으로부터 이점을 얻을 것이다.

예를 들어, 수중유 에멀전 또는 리포솜 현탁액을 기재로 하는 백신 아쥬반트는 최근 허가된 백신 제품 및 임상 시험에서 상당한 발전을 이루었다(Alving, Beck, Matyas, & Rao, 2016). 이러한 아쥬반트 물질은 기타 다른 아쥬반트 물질, 예컨대 QS21 사포닌 및 CpG 아쥬반트가 있거나 없는 모노포스포릴 지질-A의 자연 또는 합성 버전을 이용한다. 이러한 전략은 대상포진에 대해 매우 효과적인 백신 및 (30년간의 연구 후) 곧 허가될 것으로 예상되는 유망한 말라리아 백신 후보의 개발을 가능하게 하였다.

기타 다른 유망한 전달 및 보조약 전략, 예를 들어 바이로솜(Virosome)이 개발되었으며, 이것은 본 개시내용의 글리코실화된 엑소도메인 단백질과 사용하기에 적합할 수 있다. 또한, 개발 초기 단계에 있는 유망한 아쥬반트 물질 및 전략, 예컨대 독립형, 콘쥬게이트 또는 리포솜 백신 성분으로서 CD40 작용제 항체가 있다(Hatzifoti C, Bacon A, Marriott H, Laing P, Heath AW (2008) Liposomal Co-Entrapment of CD40mAb Induces Enhanced IgG Responses against Bacterial Polysaccharide and Protein. PLOS ONE 3(6): e2368). 본 발명의 조성물은 예를 들어 리포솜 제제에 의한 단백질 및 DNA 백신의 투여를 위한 공동-전달 전략에 사용될 수 있다(Laing et al., 2006).

본 발명의 실시는, 달리 지시되지 않는 한, 당업계의 기술 범위내에 있는 분자 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학의 통상적인 기법을 사용할 것이다. 이러한 기법은 문헌에 충분히 설명되어 있다. 예를 들어, 문헌[Sambrook, Fritsch, and Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989), Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait Ed., 1984), Animal Cell Culture (R. I. Freshhey, Ed., 1987), the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller and M. P. Calos eds. 1987), Handbook of Experimental Immunology, (D. M. Weir and C. C. Blackwell, Eds.), Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J. G. Siedman, J. A. Smith, and K. Struhl, eds., 1987), 및 Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach and W. Strober, eds., 1991)]을 참조한다. 상기 및 하기 둘 다에서 본원에 언급된 모든 특허, 특허 출원 및 간행물은 본원에 참고로 포함된다.

표준 3 및 1-글자 용어가 아미노산 잔기에 사용된다.

본원에 사용된 용어 "재조합"은 본 발명의 유사체, 또는 결합 분자, 예컨대 항체 또는 항체 단편을 생성하기 위한 유전 공학 방법(클로닝, 증폭)의 사용을 의미한다.

뎅기 백신 개발의 주요 문제점은, 백신의 사용이 뎅기 감염의 '항체 의존성 증강'을 일으킬 위험을 (유한한 수의 경우에) 수행하여, 질병을 예방하기보다 악화시킨다는 것이다. 본 출원은 꽤 일반적으로 플라비바이러스 백신에 관한 것이며, 이는 그것을 이러한 바이러스 족의 엔벨로프 단백질 'E'의 고도로 보존된 서열에 적용하기 때문이다. 증강은 자연 감염의 특징(여기서, 바이러스를 중화시키기 위해 보내진 항체는 전복되어 인간 골수 세포에 접근함)이며, 보통 바이러스의 제2 '혈청형'을 만났을 때 더 심한 증상이 나타난다(Halstead, Rojanasuphot, & Sangkawibha, 1983). 대부분의 경우 보호를 제공하는 백신 접종은 또한 어떤 경우에는 야생 뎅기 바이러스에 처음 노출되었을 때, 수용자를 뎅기 출혈열 (DHF)을 포함하는 심각한 뎅기, 즉, 백신이 아니면 일어나지 않았을 심각한 뎅기 또는 DHF의 '의원성' 사례에 잘 걸리게 한다. 또한, 기존의 백신 접근법은 또한 백신(또는 백신 코스)을 투여한 후 약간의 간격으로(예를 들어, 10년) 심각한 의원성 뎅기가 발병된 예방 접종을 한 개체의 개체군을 생성할 가능성을 갖고 있다. 이것은, 뎅기에 대한 면역력이 감소함에 따라, 방어 항체가 감염을 예방하는 것이 아니라 그것이 '증강'하는 농도에 도달하기 때문이다. 또한, '면역 기억'(면역 시스템이 야생 바이러스 또는 백신 투여와의 만남을 상기함)의 붕괴 속도는 백신의 4가지 혈청형에 대해 동시적이지 않아서, (항체 및 기억 수준에서) 뎅기의 각각의 혈청형에 대한 면역력은 상이한 시간에 상실되어, 심각한 질환의 위험성이 계속 증가하게 된다. 또한, 면역 기억의 이러한 점진적인 실패는 이전의 백신 접종의 결과로서 보호받는 대신, 현재 (감염된 모기에 의해 물릴 때) 심각한 뎅기에 취약하게 된 개체의 새로운 개체군을 생성한다. 해결책은 현재 존재하는 다양한 백신 포맷 중 몇 가지(생벡터, DNA 백신, 경구 백신, 서브유닛 백신, 바이러스-유사 입자 등)로 편입될 수 있는 방식으로, 효능을 유지하면서, '항체 의존성 증강'을 일으키는 경향이 0 또는 최소인 백신을 제조하는 것이다. 본 출원의 발명은 감염을 촉진시키는 항체를 생성하지 않는 신규 면역원을 생성함으로써 뎅기 및/또는 지카 백신에 의한 백신-유도된 질환의 증강의 경우를 방지한다. 이것은 감염-증강 항체의 생성과 특히 연관된 뎅기 및 지카 바이러스의 재조합으로 발현된 E-단백질의 특정 부위(들)로 하나 이상의 추가의 글리코실화 부위(예를 들어, N-연결 글리코실화 부위)를 도입하여 그러한 부위를 클로킹(cloaking)하고, 그것이 백신 접종 후 항체를 생성하는 것을 방지함으로써 달성된다.

뎅기에 대한 현재의 백신(허가된 것 및 개발 중인 것)은 공중 보건에 실질적으로 '순' 이익이 되는 것으로 입증될 수 있지만, 백신-유도된 뎅기(즉, 의원성으로-유발된 심각한 뎅기)의 경우를 피하기 위하여 개선된 안전성이 여전히 바람직하다. 유행성 지카 감염에 대한 길을 열어주는데 있어 자연 뎅기 감염의 그럴듯한 역할은 최근 세이빈 백신 연구소(Sabin Vaccine Institute)의 Philip K Russell에 의해 설명되었다(Russell, 2016). 지카 바이러스 감염에 취약하게 하는 뎅기 백신 접종 또는 증강된 중증도의 지카 감염을 일으키는 뎅기 백신 접종의 위험을 결정하는 체계적인 조사가 실시되지는 않았지만, 이러한 경우를 예상하는 것은 러셀의 관찰의 논리적인 확장이다. 또한, 심각한 뎅기에 대한 뎅기-백신-유도된 소인은 아직 보고되지 않았거나, '그런 것으로' 조사되지 않았지만, 사노피-파스퇴르 백신의 최근 3년간의 추적 조사에서, 심각한 뎅기에 대한 감수성의 백신-유도된 증강에 의해 설명될 수 있는, 9세 미만의 어린이의 입원율의 증가가 있다(Hadinegoro et al., 2015). 이러한 새로운 역학적 발달 및 실험실 데이터(하기)는 백신(증강을 피하기 위해 설계되지 않은 한)이 일부 경우에 질환의 증강을 초래할 수 있는 상당한 위험이 있음을 지시하며, 즉, 뎅기 백신 접종은 일어나지 않았을 수 있는 심각한 뎅기의 경우를 초래할 것이다. 또한, 뎅기 백신이 인구-전체 기준으로 사용될 경우, 지카 바이러스 감염의 확산을 촉진시킬 수 있다. 이러한 문제의 정당성은 뎅기 바이러스 항체가 지카 바이러스에 의한 인간 골수 세포의 감염을 증강시킨다는 것을 입증하는 시험관내 실험 데이터에 의해 추가로 뒷받침된다(Paul et al., 2016). 또한, 독립형 지카 백신은 (반대로) 뎅기 바이러스와 교차 반응하고, 뎅기 감염을 촉진시키는 항-지카 항체를 생성함으로써, 심각한 의원성 뎅기의 경우를 일으키는 뎅기 감염을 증강시키는 유사한 항체를 생성할 수 있다. 본 출원의 목적 상, 임의의 특정 가설에 얽매이는 것을 바라지는 않지만, 지카 바이러스에는 '5번째 뎅기 혈청형'의 상태가 부여된다. 이것은 뎅기 감염(및 뎅기 백신)이 지카 바이러스와 또한 반응하여 그의 신체 세포의 감염을 촉진하는 감염-증강 항체를 생성함으로써 지카의 확산을 촉진할 가능성이 있기 때문이다. 신규한 면역원 이외에, 본 개시내용은 이러한 백신들을 뎅기의 4가지 혈청형과 지카 바이러스를 나타내는 5가 백신 형태로 단일 투여 또는 코스의 백신 접종으로 조합함으로써, 백신이 (감염된 모기에 물렸을 때) 뎅기 또는 지카 감염을 증강시키는 임의의 경향을 최소화하는 추가의 안전성 특성을 갖는다.

본 발명은 플라비바이러스 감염을 예방하기 위한 백신, 특히 뎅기 및 지카 감염을 예방하기 위한 백신에 관한 것이다. 지카가 유행 현상으로 등장한 이래, 그의 전세계적으로 급속한 확산은 명백하게 뎅기-감염에 의해 촉진되었기 때문에(Russell, 2016), 백신 접종의 문제(즉, 일부 경우에 질환을 악화시키지 않는 백신을 만드는 방법)는 더욱 복잡해졌다. 새로운 백신 설계는 동종 증강(뎅기 백신이 일부 경우에 뎅기 감염을 촉진시킴) 및 교차-증강(뎅기 백신이 일부 경우에 지카 감염을 촉진시킴)(또한, 지카 백신이 일부 경우에 뎅기 감염을 촉진시킴)을 피하도록 요구된다. 뎅기의 4가지 모든 혈청형을 단일 백신(사노피-파스퇴르)으로 조합함으로써 이러한 전략을 포함하는 항체 증강 문제에 대한 통상적인 접근법, 또는 예를 들어 뎅기의 E-단백질의 N-말단 영역을 사용하는 서브유닛 접근법(Merck)은 항체 증강 문제가 인지되었지만, 지카-유행 상황에 적절한 포괄적인 해결책을 제공하지 않았다. 가장 진보된 뎅기 백신(허가된 사노피-파스퇴르 감독된(attenuated) 4가 뎅기 생백신)은 지카를 다루지 못하고, 상기 역학 및 시험관내 관찰로부터 교차-증강에 의해 지카 바이러스 감염의 사례를 촉진할 수 있다(심지어 대중의 면역력에 의해 지역 사회 전체에 순 이점을 갖는 동안에도).

플라비바이러스의 증강 에피토프와 방어적 에피토프를 구별하는 것이 특성 상 '이원적'이 아님을 인지하는 것이 중요하다. 일반적으로, 거의 모든 항-뎅기-E 항체는 (예를 들어) 중화와 감염-증강 둘 다의 가능성을 가지며, 후자의 특성은 보다 낮은 항체 농도에서, 예를 들어 백신에 대한 면역력 또는 노출이 줄어듦에 따라 나타난다(Dejnirattisai et al., 2014). 또한, Dejnirattisai외 다수는 (회복기에 생성된 모든 항체의 약 절반을 차지하는) 뎅기 E-단백질의 융합 루프에 대한 항체가 감염의 항체-의존성 증강에 대한 경향의 관점에서 E-단백질 상 기타 다른 부위에 대한 항체보다 현저하게 악화된다는 것을 발견하였다.

본 개시내용은 감염-증강 항체를 유도하거나 자극하는 능력이 감소된 면역원을 제공함으로써, 항체-의존성 증강 및 교차-증강의 문제를 다루는 백신을 제공한다. 감염-증강 항체가 생성되지 않도록 보장하기 위하여, 본 개시내용은 재조합으로 발현된 E-단백질의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열로 추가의 신규한 글리코실화 부위를 조작함으로써 융합 루프에 이식된 추가의 글리칸을 갖는 E-단백질을 사용한다. 글리칸의 '클로킹' 효과는 융합 루프 부위에 대해 항체가 생성되는 것을 막는 한편, 중화 항체를 생성하기에 더 좋은 기타 다른 부위를 보존한다. 이러한 방식으로, 일반적으로 (예를 들어, 숙주 당단백질의 것과 실질적으로 동일한 글리칸 구조를 갖는 단백질 표면의 많은 부분을 마스킹하는 HIV의 경우) 중화 항체의 생성을 저해하는 것으로 생각되는 글리칸이 사용되어, 즉 본 개시내용에서 문제가 되는 항체 반응(이 경우, 감염-증강 항체)을 일으킬 백신 면역원 상 부위를 마스킹하는 데 유리하게 작용한다.

뎅기의 경우, 4개의 백신 항원, 즉 항체 의존성 증강에 관련된 에피토프를 마스킹하기 위해 당조작(glycoengineering)에 의해 적합하게 변형된 4개의 혈청형의 E-단백질이 필요하다. 그러나, 감염 또는 백신 접종의 결과로서 뎅기 및 지카 바이러스 감염의 상호 교차-증강의 위험 때문에, 지카 성분, 즉 뎅기의 4가지 혈청형 '및' 지카를 포괄하는 '5가' 백신이 또한 바람직하다는 것이 명백하다.

다행히도, 본 발명의 백신 설계의 관점에서, 지카 바이러스의 E-단백질은 그의 아미노산 서열 및 3차원 구조의 관점에서 뎅기 바이러스 E-단백질의 것과 매우 상동성이다. 지카 비리온 E-단백질의 최근 cryo-EM 3.8 옹스트롬 구조는 (유추에 의해) 명확하게 지카 E-단백질 융합 루프 위치를 밝혀낸다(Kostyuchenko et al., 2016; Sirohi et al., 2016). 실제로, Sirohi외 다수는 지카의 다양한 바이러스 단리물, 4가지 뎅기 혈청형, 웨스트-나일, 일본 뇌염 및 황열 바이러스 중에서 완벽하게 보존된 융합 루프 서열 "DRGWGNGCGLFGK"(잔기 98 내지 110)에 대한 다양한 플라비바이러스 사이의 현저한 상동성 정도를 목록으로 만들었다(Sirohi의 보충 도 S2 참조).

지카 E-단백질의 5개의 아미노산 인서트(insert) 및 지카가 단량체 당 2개가 아닌 단일 N-연결 글리칸을 갖는다는 사실과 같이, 뎅기와 지카 E-단백질 사이에 주목할만한 차이가 존재하지만, 이러한 차이는 본 발명의 백신 설계에 매우 관대하다. 본 개시내용에서, 지카 바이러스의 E-단백질 융합 루프는 특히 감염의 동종 및 이종 증강이 가능한 감염-증강 항체에 의해 인식되는 부위, 즉 감염 또는 백신 접종 동안 항체 생성이 바람직하지 않은 부위일 것으로 예상된다.

부위 지정 돌연변이유발에 의해 추가의 글리코실화 부위를 단백질로 도입하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 특히 자연 호르몬 에리스로포이에틴의 변형된 형태인 Aranesp(다르베포에틴 알파(darbepoetin alfa))의 생성이 좋은 예이다(Elliott ("EP0640619A1," 2010), (Elliott et al., 2003)). 단백질의 리더 서열이 재조합 플라스미드 또는 기타 다른 벡터 DNA 서열에 혼입되어 신생 폴리펩티드 쇄를 숙주 세포의 세포질그물로 유도하여 글리코실화를 가능하게 하고, 단백질 폴딩을 용이하게 하도록 보장하기 위하여 적합한 유전자 구조물을 만드는 것이 중요하다. 다양한 진핵 세포 시스템, 예컨대 중국 햄스터 난소 세포(CHO)뿐만 아니라, 효모(예를 들어, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)) 및 기타 다른 벡터 시스템, 예컨대 바쿨로바이러스(플라비바이러스의 접종물 형태에 따라 바이러스 단백질 면역원에 곤충 글리칸을 갖게 하는 부가적인 장점을 가짐)이 재조합 생성에 적합하다. 그러나, 이. 콜라이에 기초한 것과 같은 원핵성 시스템은 적합하지 않은데, 이는 시스템이 단백질의 글리코실화를 수행하는 데 필요한 세포 장치를 갖지 않기 때문이다.

Aranesp의 경우, 분자는 당조작된 분자와 에리스로포이에틴 수용체의 상호 작용의 방해를 피하도록 전략적으로 배치된 2개의 추가의 N-연결 글리코실화 부위를 갖는다. 이러한 방식의 초기의 에리스로포이에틴-기반 제품의 당조작 목적은 그의 크기를 증가시켜 주 당 3회 대신 1회 투여될 수 있는 제품을 생성함으로써, 유통되는 분자의 수명을 개선시키는 것이었다(Elliott et al., 2003). 당조작은 본 개시내용에서 '변경되어' 그렇지 않는다면 감염의 항체 의존성 증강의 부작용을 초래할 수 있는 백신 면역원 상 부위를 클로킹한다.

바이러스는 중화 항체의 생성을 방해하는 글리칸의 면역-회피 특성을 이용하는 것으로 입증되었다. (예를 들어, HIV 당단백질 gp160/120에 대한) 백신 개발 분야에서, 글리칸은 일반적으로 숙주의 면역 시스템이 면역학적으로 내성이 있도록 프로그램된 숙주 글리칸으로 구성된 조밀한 글리코칼릭스를 형성함으로써, 항체의 당단백질 항원의 단백질 표면으로의 접근을 제한하면서 (백신 개발에 도움이 되는 것이 아닌) 문제로서 간주되어 왔다. 이러한 규칙의 일반성을 입증하는 주목할만한 예외가 있다: 예를 들어, 희소한 항-HIV 중화 항체의 경우인, 글리칸 그 자체 또는 마이너 변이체가 표적 또는 그의 일부인 경우; 및 일부 백신 설계에서 그 자체가 표적인 아르보바이러스 상 곤충-특이적 글리칸 에피토프의 경우(Dalziel, Crispin, Scanlan, Zitzmann, & Dwek, 2014). 본 개시내용은 글리칸의 스텔스(stealth) 품질을 이용하여 백신 면역원에서 유리하게 작용한다는 점에서 선행 기술과 상이하다. 이러한 신규 응용에서, 글리칸을 사용하여 백신 면역원 상 골칫거리인 부위를 클로킹하여 자연 비리온 상 동등한 비클로킹 부위를 인식하는 항체가 생성되는 것을 방지한다. 당조작은 (아미노산 서열 요소의 결실 또는 말단절단과 달리) 항원의 단백질 부분의 기본 구조와의 간섭을 최소화하면서 이러한 클로킹이 달성될 수 있게 한다. 결실 또는 말단절단 대신 당조작을 사용하여 단백질 구조를 보존하는 것은 그렇지 않았다면 해로운 효과로 변경될 수 있는 원격 중화 에피토프를 보호한다.

본 개시내용의 당조작된 플라비바이러스 E-단백질은 백신 접종의 목적을 위하여 다양한 형태로 혼입될 수 있다. 이러한 형태는 특징 상 단백질(즉, 당단백질) 또는 핵산일 수 있다. 그것은 정제된 단백질의 혼합물로서(아쥬반트로서 예를 들어 알루미늄 히드록시드 또는 알루미늄 포스페이트를 갖는 서브유닛 백신으로서), 바이러스-유사 입자로서(Frietze, Peabody, & Chackerian, 2016), 또는 서브유닛을 사용하여 DNA 백신으로서의 투여(Tregoning & Kinnear, 2014) 또는 황열 바이러스의 YFD 균주에 대해 예시된 바와 같은 전염성-감독된 클론 접근법(Tretyakova et al., 2014)을 위한 포유동물-발현가능한 DNA 구조물(예를 들어, 시토메갈로바이러스 프로모터를 갖는 플라스미드 DNA)로서 백신 제제에 나타낼 수 있다. 또한, 그것은 테미스 바이오사이언스 게엠베하(Themis Bioscience GmbH)에 의한 치쿤구니야(Chikungunya) 백신 후보에 따라 홍역 벡터 백신과 같은 감독된 바이러스 생벡터로 혼입될 수 있다(Ramsauer et al., 2015). 또한, 본 개시내용의 당조작된 플라비바이러스 E-단백질은 동일한 면역원의 포유동물-발현가능한 DNA 및 단백질 표현이 그와 동일한 입자(예를 들어, 리포솜)에서 공동-제형화되어 단리에 사용된 단백질 또는 DNA 면역원과 비교하여 항체 반응에서 극적인 개선을 제공하는 '공동-전달'과 같은 진보된 아쥬반트 전략에 적합한 후보일 것이다(Laing et al., 2006).

본 발명의 당조작 접근법은 E-단백질의 핵산 서열에서 다수의 염기 위치에서 한정된 변화를 수반하기 때문에, 본 개시내용의 감독된 생백신은 생 감독 접근법에서 알려진 문제(예를 들어, 이러한 이유로 미국에서 생존불가능한(non-viable) 소크(Salk) 버전으로 대체된 사빈 폴리오 백신)인, 돌연변이에 의한 야생형으로의 회귀에 대한 높은 수준의 내성을 가질 것이다: 즉, 그것이 더 안전하며, 병독성 증가에 대한 야생형 또는 데노보(de novo) 돌연변이로의 회귀에 의한 질병의 사례를 일으킬 가능성이 적을 것이다(Hanley, 2011). Hanley의 추론 및 본 개시내용을 고려할 때, 추가의 글리코실화 부위를 (즉, 감염-증강 에피토프의 클로킹을 달성하는 데 필요한 것 이상으로) 바이러스 단백질에 도입하는 것은 감독된 바이러스 생백신에서 불리한 돌연변이에 대해 보호하고, '모기 능력'에 대해 보호하여, 감독된 플라비바이러스 생백신이 확산되어 발병력 증가로의 발전이 모기에서 벡터 전달을 통해 가능하도록 하는 실행가능한 전략임이 분명하다. 이러한 추가의 글리코실화 부위는 플라비바이러스 E-단백질의 비-중화 부위에 가장 잘 위치한다.

(생벡터 접근법과 구별되는) 본 개시내용의 플라비바이러스 서브유닛 백신의 경우, 제2 추가의 글리칸에 대한 선호 부위는 E와 비리온의 하부 M-단백질의 접촉 표면을 포함하는 서열 요소를 포함할 것이다. 이러한 고도로 가용성인 하이퍼글리코실화된 E-단백질은 항원-특이적 B-세포의 1가 인게이지먼트(engagement)를 허용하여 항원-특이적 B-세포의 클로날 선택 및 체성 돌연변이 동안 항원에 대한 더 큰 경쟁을 생성함으로써 높은 친화도의 중화 항체를 선호한다.

본 발명은 또한 하기 항목에 의해 기재된다:

1. 자연 서열에 존재하지 않는 글리코실화를 위한 부위를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 플라비바이러스 E-단백질의 유사체.

2. 항목 1에 있어서, 글리코실화 부위가 N-연결 글리칸을 위한 것인 유사체.

3. 항목 1에 있어서, 글리코실화 부위가 O-연결 글리칸을 위한 것인 유사체.

4. 항목 1에 있어서, 적어도 하나의 추가의 글리칸이 부착된 유사체.

5. 항목 4에 있어서, 글리칸이 N-연결 글리칸인 유사체.

6. 항목 4에 있어서, 글리칸이 O-연결 글리칸인 유사체.

7. 항목 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 재조합 DNA 서열의 발현의 생성물인 유사체.

8. 항목 2에 있어서, N-연결 글리코실화 세쿠온(Asn-X-Ser/Thr)이 세쿠온의 Asn(N) 잔기가 플라비바이러스 E-단백질의 아미노산 서열의 다음의 잔기 DRGWGNGCGLFGK 중 어느 하나인 위치 98 내지 110 중 어느 하나를 점유하도록 치환되고, 여기서 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산 잔기이고, Ser/Thr은 세린 또는 트레오닌 잔기를 나타내는 것인 유사체.

9. 항목 2에 있어서, N-연결 글리코실화 세쿠온(Asn-X-Ser/Thr)이 세쿠온의 Asn(N) 잔기가 위치 98 내지 101 또는 106 내지 110 중 어느 하나를 점유하도록 치환된 유사체.

10. 항목 8에 있어서, X가 다음의 13개의 아미노산 잔기 Asn, Gln, Tyr, Val, Ala, Met, Ile, Lys, Gly, Arg, Thr, His 또는 Ser 중 어느 하나인 유사체.

11. 항목 8에 있어서, 치환된 세쿠온이 NTT이고, 여기서 T(Thr)은 세쿠온의 'X' 위치에서 명백하게 치환되고, 세쿠온의 선택적인 Ser/Thr 요소는 T인 유사체.

12. 항목 8에 있어서, 치환된 서열이 N-연결 글리코실화 세쿠온의 부분(X)으로서 자연 시스테인 잔기(C)를 이용하여 DRGWGNNCTLFGK(서열번호 11)를 판독하는 유사체.

13. 항목 8에 있어서, 치환된 서열이 N-연결 글리코실화 세쿠온의 부분으로서 자연 시스테인 잔기(C)를 이용하고 항목 11의 트레오닌 세쿠온 잔기 대신 세린 잔기를 갖는 DRGWGNNCSLFGK(서열번호 12)를 판독하는 유사체.

14. 항목 1 내지 13 중 어느 하나에 따른 플라비바이러스 E 단백질의 유사체를 인코딩하는 DNA 서열.

15. 포유동물 발현가능한 프로모터를 갖는 항목 1 내지 13 중 어느 하나에 따른 플라비바이러스 E-단백질의 유사체를 인코딩하는 플라스미드 또는 선형 DNA-기반 백신 면역원.

16. 숙주 세포가 상기 플라비바이러스 E-단백질의 유사체를 발현하게 하는 방식으로 항목 1에 따른 DNA 서열로 형질감염된 진핵 숙주 세포.

17. 항목 1 내지 16 중 어느 하나에 따른 플라비바이러스-E 단백질 유사체의 치료적 유효량을 제약학적으로 허용가능한 희석제, 아쥬반트 또는 담체와 함께 포함하는 백신 조성물.

18. 항목 17에 있어서, 4개의 뎅기 혈청형 DEN-1, DEN-2, DEN-3 및 DEN-4를 나타내는 4개의 뎅기 E-단백질의 치료적 유효량을 함유하는 백신 조성물.

19. 항목 17에 있어서, 치료적 유효량의 지카 바이러스 E-단백질을 포함하는 백신 조성물.

20. 항목 18에 있어서, 추가로 치료적 유효량의 지카 바이러스 E-단백질을 함유하는 백신 조성물.

<도면의 간단한 설명>

본 발명은 이제 첨부된 도면을 참조로 기재될 것이다:

도 1. 교차 반응성 융합 루프 항체의 생성 및 감염-증강 항체의 유도 또는 자극을 방지하기 위한 본 발명의 백신 면역원의 설계.

도 1 'A'는 4개의 뎅기 혈청형 DEN-1, DEN-2, DEN-3 및 DEN-4를 포함하는 당업계에 공지된 감독된 생백신과 같은 플라비바이러스 백신을 이용한 백신 접종의 효과를 나타낸다. 감독된 백신 비리온은 E-단백질 모이어티 줄기가 돌출된 둥근 구조로 나타나며, 융합 루프는 비리온 E-단백질 모이어티의 줄기 상 작은 스퍼(spur)로서 도시되고; 항체는 Y-형태의 분자로서 도시되고, 감염-증강 항체는 완전 흑색으로 나타낸 반면, 중화 항체는 흑색 윤곽의 백색으로 나타나 있고, 'B'는 본 발명의 백신 면역원 설계를 예시한다. 신규 면역원은 E-단백질을 함유하며, 여기서 융합 루프 서열은 (융합 루프 스퍼에 부착된 크레센트로서 도시된) 글리칸의 부착을 위한 글리코실화 부위를 포함하여 감염-증강 항체를 생성하지 않는 백신의 E-단백질에 대한 중화 항체를 생성하도록 치환되었다. 'C'는 야생형 플라비바이러스 비리온의 E-단백질에 결합될 때 E-단백질의 융합 루프에 대한 감염-증강 항체가 높은 친화도의 Fc-감마-수용체-IIa(흑색 윤곽의 백색 직사각형으로 도시됨)와 결합하여 Fc-감마 수용체 IIa를 운반하는 골수 세포의 감염을 촉진시키는 방법을 나타낸다. 'D'는 백신이 일부 대상체에서 방어적 수준의 항체 반응을 유도하는 데 실패하는 경우가 있다는 것을 나타낸다(예를 들어, 면역 억제됨). 뎅기에 대해 보호되지는 않지만, 이러한 면역 손상된 대상체(본 개시내용의 백신으로 면역화됨)는 적어도 신규 백신에 의해 뎅기에 걸리기 쉽지 않은데, 이는 그것이 융합 루프에 대한 항체 반응을 시작하지 않았기 때문이다. 이것은, 대상체가 융합-루프 항체의 중화 이하 농도를 유발한 통상적인 백신에 의해 심각한 뎅기 감염에 걸리기 쉽게 할 수 있는 비클로킹된 융합 루프를 함유하는 통상적인 설계의 백신과 대조될 수 있다.

도 2. 뎅기 및 지카 엑소도메인 단백질의 당조작된 형태의 재조합 발현.

도 2a: HEK293 세포에서 뎅기 및 지카 구조물의 발현의 평가를 나타내는 쿠마시(Coomassie) 스테인드 겔, 레인은 다음과 같이 나타냄:

1: pSF236 형질감염된 세포 WT, 2: pCRO21 형질감염된 세포, 3: pSF237 형질감염된 세포 WT, 4: pCRO22 형질감염된 세포, 5: pSF238 형질감염된 세포 WT, 6: pCRO23 형질감염된 세포, 7: pSF239 형질감염된 세포 WT, 8: pCRO24 형질감염된 세포, 9: pSF233 형질감염된 세포 WT, 10: pCRO25 형질감염된 세포. 11: pSF236 형질감염된 세포 WT, 12: pCRO21 형질감염된 세포, 13: pSF237 형질감염된 세포 WT, 14: pCRO22 형질감염된 세포, 15: pSF238 형질감염된 세포 WT, 16: pCRO23 형질감염된 세포, 17: pSF239 형질감염된 세포 WT, 18: pCRO24 형질감염된 세포, 19: pSF233 형질감염된 세포 WT, 20: pCRO25 형질감염된 세포. 레인 1 내지 10에 대해 상청액 농축물은 1 ul/1.1 ml이고, 레인 11 내지 20에 대해 상청액 농축물 탈론(Talon) 용출액 농도는 26 ul/400 ul였다.

도 2b: 뎅기-1 및 지카 구조물의 추가의 발현 평가를 나타내는 항-his-태그 웨스턴 블럿. 다음과 같이 레인 1 내지 8은 세포 펠렛을 나타내고, 레인 9 내지 16은 원(raw) (여과된) 상청액을 나타내고, 레인 17 내지 24는 Ni-NTA 용출액을 나타냄: 1: pSF236 세포 펠렛, 2: pCRO26 세포 펠렛, 3: pCRO27 세포 펠렛, 4: pSF233 세포 펠렛, 5: pCRO28 세포 펠렛, 6: pCRO29 세포 펠렛, 7: pCRO30 세포 펠렛, 8: pCRO31 세포 펠렛, 9: pSF236 여과된 상청액, 10: pCRO26 여과된 상청액, 11: pCRO27 여과된 상청액, 12: pSF233 여과된 상청액, 13: pCRO28 여과된 상청액, 14: pCRO29 여과된 상청액, 15: pCRO30 여과된 상청액, 16: pCRO31 여과된 상청액, 17: pSF236 Ni-NTA 용출액, 18: pCRO26 Ni-NTA 용출액, 19: pCRO27 Ni-NTA 용출액, 20: pSF233 NI-NTA 용출액, 21: pCRO28 Ni-NTA 용출액, 22: pCRO29 Ni-NTA 용출액, 23: pCRO30 Ni-NTA 용출액, 24: pCRO31 Ni-NTA 용출액. 3개의 화살표는 검출된 하이퍼글리코실화된 엑소도메인 형태를 나타낸다.

도 2c는 각각 뎅기 혈청형 1 내지 4(D1, D2, D3 및 D4)에 대한 하이퍼글리코실화된 형태 pCRO21, pCRO22, pCRO23, pCRO24 및 지카에 대한 pCRO28의 웨스턴 블럿을 나타낸다. 각각의 쌍의 좌측 레인은 야생형(wt)을 나타내는 한편, 각각의 쌍의 우측 레인은 뎅기 또는 지카 E-단백질 엑소도메인의 하이퍼글리코실화된 형태를 나타낸다. +2는 2개의 추가의 글리코실화 부위/글리칸을 나타내고, +1은 1개의 추가의 글리코실화 부위/글리칸을 나타낸다.

도 2d는 서열 목록에서 각각 플라스미드 pCRO21, pCRO22, pCRO23, pCRO24 및 pCRO28에 상응하는 정제된 하이퍼글리코실화된 E 엑소도메인 단백질 D1, D2, D3, D4 및 지카의 쿠마시 블루 스테인드 겔을 나타낸다. 좌측에 대한 척도는 '000s의 분자량 마커의 이동 위치이다.

도 3. 당조작된 뎅기 2 및 지카 엑소도메인 단백질에 존재하는 글리칸의 특징 및 서열-프로그램된 N-연결-글리코실화-부위의 점유 정도.

도 3a는 PNGase 소화 전후에 뎅기 및 지카 샘플의 SDS-PAGE 분석을 나타낸다.

도 3b는 HPAEC-PAD에 의한 참조 표준물과 비교한 뎅기-2 및 지카로부터 방출된 글리칸의 분석을 나타낸다.

도 3c는 뎅기-2 트립신 절단 부위 및 펩티드 단편을 나타낸다.

도 3d는 지카 트립신 절단 부위 및 펩티드 단편을 나타낸다.

도 3e는 지카 엔도-Lys-C 절단 부위 및 펩티드 단편을 나타낸다.

도 3f는 PNGase F 소화가 있거나 없는 뎅기-2의 트립신 소화를 나타낸다.

도 3g는 PNGase 소화가 있거나 없는 지카의 트립신 소화를 나타낸다.

도 3h는 PNGase 소화가 있거나 없는 지카의 엔도-Lys-C 소화를 나타낸다.

도 4. 직접 ELISA에 의해 측정된 마우스에서 선택 당조작된 뎅기 단백질 1, 2, 3 및 4 및 지카의 면역원성.

x-축은 예방 접종 후 일 수를 나타내고, y-축은 IgG 항체 역가를 나타낸다. 0일, 14일 및 21일에 3회 투여되었다. 투여량은 표 9에 나타나 있다. 항체 반응은 지시된 바와 같이 ELISA 고체상에서 야생형 VLP로서 5개의 모든 항원에 대해 개별 마우스에서 측정되었다: 상부 줄 좌측 Den 1 VLP 항원, 상부 줄 우측 Den 2 VLP 항원, 중간 줄 좌측 Den 3 VLP 항원, 중간 줄 우측 Den 4 VLP 항원, 하부 줄 좌측 지카 VLP 항원. 면역원(상기 분석에 사용된 항원과 구별됨)은 개방 원으로 나타낸 펜타-DNA(본 발명의 Den1 내지 4 및 지카 DNA 각각의 조합)이고, 펜타-Prot(본 발명의 Den1 내지 4 및 지카 단백질 각각의 조합)는 채워진 사각형으로 도시되고, 1가 지카는 채워진 삼각형으로 도시되고, 펜타 VLP(본 발명의 Den1 내지 4 및 지카 VLP 각각의 조합)는 채워진 역삼각형으로 도시되어 있다. PBS 대조군은 개방된 역삼각형으로 도시되어 있다.

도 5. 융합 루프 항체에 의한 당조작된 단백질의 인식의 회피 및 중화 에피토프의 보유.

본 개시내용의 하이퍼글리코실화된 항원을 추가로 특성화하기 위하여, 야생형 등가 항원과 비교하여, ELISA 분석을 실시하여 다양한 야생형 및 재조합 엑소도메인(도 4의 VLP 항원과 구별됨)에 대한 항체 결합을 측정하였다. 항원으로서 단지 야생형 VLP만을 사용한 도 4에서 사용된 ELISA와 달리, 이 분석은 단지 엑소도메인-타입 항원(본 발명의 재조합 야생형 및 재조합 하이퍼글리코실화된 형태 'HX')만을 사용하였다. 이러한 물질적으로 다양한 (비-글리코실화된 박테리아, 곤충-글리코실화된 및 인간-글리코실화된) 종 각각의 동일한 배향을 보장하기 위하여, 이들을 래빗 항-His-태그 모노클로날 항체에 의해 고체상에 고정시켜 그들의 C-말단 His 태그를 인식하였다. 코팅된 플레이트를 차단하고, '코팅 후' 단계에서 다양한 His-태그 부착 단백질의 일정한 농도에 노출시킨 후, 다양한 농도(4G2의 경우 도 5a) 또는 일정한 농도(도 5b, c)에서 모노클로날 항체로 프로빙하였다. 인간 폴리클로날 항-지카 회복기 혈청 샘플을 포함하는 다양한 뎅기 및 지카 항원 및 프로브 항체를 도 5b,c에서 시험하였다. 프로브 항체 후, 래빗 항-마우스 IgG Fc - 홀스래디시 퍼옥시다제(또는 래빗-항-인간 IgG Fc - 홀스래디시 퍼옥시다제) 콘쥬게이트(적절할 경우) 및 테트라메틸벤지딘 기질로 인큐베이션하였다. 마우스 모노클로날 항-인간-CD4 항체가 마우스 모노클로날 항체에 대한 대조군으로서 제공되었다.

도 5a는 융합-루프 항체 4G2(x-축, ng/ml)를 나타내며, 이는 뎅기-2 혈청형에 대해 형성되었지만, 플라비바이러스들 사이에서 고도로 교차 반응성이어서, 고체상 야생형 뎅기 혈청형-2 또는 뎅기 혈청형-4 야생형 엑소도메인 항원, 또는 융합 루프에 2개의 추가의 프로그램된 세쿠온을 함유하는 이들의 하이퍼글리코실화된 대응물(하이퍼글리코실화된 엑소도메인에 대해 'HX')에 결합한다. (별표는 ELISA 판독기의 판독 능력보다 높은 흡광도 값을 나타내고), Y 축은 450 nm에서의 흡광도를 나타낸다. 점은 중복 측정의 평균이다.

도 5b는 다양한 엑소도메인이 뮤린(murine) 모노클로날 항체의 세트를 포함하는 항체에 대한 결합을 스크리닝한, 본 발명의 분석 설계의 ELISA 플레이트 결과의 사진이다(좌측에서 우측 컬럼 1 및 2: 4G2(교차-반응성 융합-루프 항체), 컬럼 3 및 4: 알토 바이오리에이전츠(Aalto Bioreagents) 항-지카 항체 AZ1176-0302156-Lot3889; 컬럼 5 및 6: Z48 항-지카 항체, 웰 7 및 8: Z67 항-지카 항체(이들을 문헌[Zhao et al, Cell 2016]에 의해 ZV48 및 ZV67 지카-중화 항체로 기재되며, 더 네이티브 안티젠 컴파니(The Native Antigen Company) ZV67=MAB12125 및 ZV48=MAB12124로부터 수득하였음), 웰 9 및 10: 항-인간-CD4 대조군 밀리포어(Millipore) 024-10D6.B3 2322501; 웰 11 및 12: 지카 인간 회복기 혈청). 엑소도메인(모두 His-6 C-말단 태그를 가짐)은 다음과 같았다(상부에서 하부): '알토 곤충' = 아일랜드 더블린 소재 알토 바이오리에이전츠로부터의 Sf9 곤충-세포 생성된 야생형 재조합 지카 엑소도메인; 프로스펙 지카 = 이스라엘 소재 프로스펙(Prospec)으로부터의 박테리아로 생성된 재조합 야생형 엑소도메인; NAC WT den-2 = HEK293-생성된 인간 야생형 뎅기-2 엑소도메인(NCBI ACA48859.1의 잔기 280 내지 675 다음에 7개 또는 8개의 아미노산 길이의 글리신-세린 링커 다음에 His6 태그를 기재로 함); '엑시비온(Excivion) HX den-1 (인간) 클로킹됨'은 융합 루프로 프로그램된 2개의 N-글리코실화 세쿠온을 갖는 HEK 293 세포로부터 플라스미드 pCRO21의 발현 생성물을 나타내고; 마찬가지로, 엑시비온 HX den-2 내지 den-4의 경우, 각각 플라스미드 pCRO22, pCRO23 및 pCRO24를 나타낸다. '엑시비온 HX 지카 인간(클로킹됨)'은 융합 루프로 프로그램된 단일 글리코실화를 갖는 HEK293 세포에 발현된 플라스미드 pCRO28의 단백질 생성물을 나타낸다.

도 5c는 최대 흡광도(3.0 흡광도 단위임)의 %값으로서 엑셀 데이터 막대로 나타낸 흡광도 값을 나타내며, 이것은 복제물의 품질을 입증한다(2벌). 도 5c는 도 5b에서의 데이터의 그래프 표현이며, 도 5b와 동일한 레이아웃을 갖는다.

도 5d는 도 5b에 도시된 ELISA 플레이트를 보다 상세하게 나타낸다.

도 6. 당조작된 단백질에 의한 융합-루프 항체의 생성 방지.

면역화된 마우스로부터의 폴리클로날 혈청에서 융합 루프에 대한 항체를 검출하기 위하여, 도 4 및 도 5에서 사용된 것과 상이한 또 다른 ELISA 분석을 개발하였다. 이것은 비오틴-표지된 4G2를 표지로 사용하고, 비표지된 4G2를 표준물로 사용한 경쟁적 결합 분석이었다. 윗줄 좌측, 비콘쥬레이트된 4G2, x-축 4G2의 농도 ng/mL; 윗줄 중간, 펜타 DNA, 그룹 1, 42일, x-축 혈청의 희석; 윗줄 우측 펜타 Prot 그룹 2, 42일, x-축 혈청의 희석; 아랫줄 좌측 모노 지카, 그룹 3, 42일, X-축 혈청의 희석; 아랫줄 중간 펜타 VLP, 그룹 4, 42일, x-축 혈청의 희석; 아랫줄 우측 PBS, 그룹 5, 42일, x-축 혈청의 희석. 각각의 경우에, y-축은 %바이오티닐화(Bt)-4G2 결합이었다.

도 7. 당조작된 단백질(PRNT)에 의한 중화 항체의 생성.

도 7a는 풀링된 혈청에서 측정된 샘플 그룹 1 내지 5에 대한 뎅기 PRNT 반응: DENV에 대한 투여량 반응 곡선을 나타낸다, 윗줄 좌측 펜타 DNA(그룹 1 풀에 의한 DENV의 중화); 윗줄 중간 펜타 Prot(그룹 2 풀에 의한 DENV의 중화); 윗줄 우측 모노 지카(그룹 3 풀에 의한 DENV의 중화); 아랫줄 좌측 펜타 VLP(그룹 4 풀에 의한 DENV의 중화); 아랫줄 중간 PBS(그룹 5 풀에 의한 DENV의 중화). 각각의 경우에, x-축은 희석 인자이고, y-축은 중화%를 나타낸다.

도 7b는 풀링된 혈청에서 측정된 샘플 그룹 1 내지 5에 대한 PRNT 반응: ZIKV에 대한 투여량 반응 곡선을 나타낸다, 윗줄 좌측 펜타 DNA(그룹 1 풀에 의한 ZIKV의 중화); 윗줄 중간 펜타 Prot(그룹 2 풀에 의한 ZIKV의 중화); 윗줄 우측 모노 지카(그룹 3 풀에 의한 ZIKV의 중화); 아랫줄 좌측 펜타 VLP(그룹 4 풀에 의한 ZIKV의 중화); 아랫줄 중간 PBS(그룹 5 풀에 의한 ZIKV의 중화). 각각의 경우에, x-축은 희석 인자이고, y-축은 중화%를 나타낸다.

도 8. 회복기 뎅기 및 지카 혈청과 고정된 지카 및 뎅기 야생형(WT) 및 하이퍼글리코실화된(HX) 엑소도메인 단백질의 반응.

상부 패널은 혈청 인큐베이션 동안 10 ug/ml의 농도에서 경쟁하는 마우스 모노클로날 플라비바이러스 융합 루프 항체 4G2(항-뎅기-혈청형-2 교차 반응성 모노클로날 항체)의 존재(회색 막대, 각각의 쌍의 우측) 및 부재(흑색 막대, 각각의 쌍의 좌측)하에 래빗 항-His-태그 모노클로날 항체로 포획하여 고체상에 배향된 고정된 지카 및 뎅기 야생형(WT) 및 하이퍼글리코실화된(HX) 엑소도메인 단백질과 뎅기 회복기 혈청 중 항체의 ELISA 반응성을 나타낸다. 인간 혈청을 1/1000의 일정한 농도에서 시험하였다.

하부 패널은 경쟁하는 마우스 모노클로날 플라비바이러스 융합 루프 항체 4G2의 존재(회색 막대) 및 부재(흑색 막대)하에 고정된 지카 및 뎅기 야생형(WT) 및 하이퍼글리코실화된(HX) 엑소도메인 단백질과 지카 회복기 혈청 중 항체의 ELISA 반응성을 나타낸다. 조건 및 표지는 상부 패널에서와 동일하다. 오차 바는 중복 측정의 표준 오차이다.

실시예

실시예 1 감염-증강 항체의 유도 또는 자극을 방지하도록 설계된 신규 백신 면역원의 설계.

도 1, 'A'는 4개의 뎅기 혈청형 DEN-1, DEN-2, DEN-3 및 DEN-4를 포함하는 당업계에 공지된 감독된 생백신과 같은 플라비바이러스 백신을 사용한 백신 접종의 효과를 나타낸다. 백신은 바이러스 중화할 수 있는 항체 및 감염을 항체-의존성 증강할 수 있는 기타 다른 항체의 혼합물을 생성한다. 바이러스 중화할 수 있는 항체는 비리온 E-단백질의 수용체-상호 작용 표면, 즉 DCSIGN 렉틴/수용체에 결합하는 표면 상 부위를 인식하는 것을 포함한다. (예시의 간단함을 위하여, 단지 DCSIGN 수용체만이 나타나 있으며, 일반적으로 뎅기 및 플라비바이러스에 대해 기타 다른 수용체가 존재한다는 것을 유의한다). 'C'는 비리온의 E-단백질에 결합될 때, E-단백질의 융합 루프에 대한 감염-증강 항체가 높은 친화도의 Fc-감마-수용체-IIa와 결합하여 골수 세포의 감염을 촉진시키는 방법을 나타낸다. 심지어 (역설적으로) 골수 세포 및 B-세포에 대해 정상적으로 억제되는 낮은-친화도의 수용체 Fc-감마-수용체-IIb를 포함하는, Fc-감마 수용체의 몇 가지 유형이 이러한 현상에 연루되어 있다(Bournazos S, Signaling by Antibodie... Ann. Rev. Immunol 2017, 35:285-311). 감독된 생백신(당업계에 공지된 백신의 예)을 사용한 백신 접종의 결과는 항체의 2개의 대립 개체군, 즉 뎅기 비리온을 중화시키는 한 세트 및 감염 증강시킬 수 있는 또 다른 세트의 순 효과이다. 대부분의 백신 접종 대상체에서, 중화 항체는 감염-증강 항체의 효과를 극복하여, 백신 접종의 순 효과가 4개의 뎅기 혈청형에 대한 방어이도록 한다. 그러나, 4개의 혈청형에 대해 균형잡힌 반응을 시작하지 않거나, 예를 들어 홍역 또는 HIV 감염으로 인하여 면역 억제된 대상체에서, 플라비바이러스-감염-증강 항체는 이러한 대상체를 뎅기로 인한 심각한 감염에 대해 보호받게 하기 보다는 이에 취약하게 하고, 기타 다른 플라비바이러스로 감염되기 더 쉽게 한다. 또한, 일부 건강한(비-면역 억제됨) 뎅기-예방 접종을 한 대상체에서 감염-증강 항체는 지카 바이러스와 교차 반응한다. 이러한 뎅기-면역된 대상체는 이제 지카-감염된 모기 'C'에 의해 처음 물릴 때 지카 감염에 걸리기 쉽다. 반면, 'B'는 본 발명에 따라 설계된 백신 면역원을 예시한다. 신규 면역원은 융합 루프 서열이 변형되고, 감염-증강 항체의 생성 없이 백신의 E-단백질에 대한 중화 항체를 생성하기 위한 목적으로 글리칸으로 치환되도록 설계된 E-단백질을 함유한다. 'D'는 본 발명의 백신이 일부 대상체(예를 들어, 면역 억제됨)에서 방어적 수준의 항체 반응을 유도하는 데 때때로 실패한다는 것을 나타내지만, 당업계에 공지된 기타 다른 백신 설계와 달리, 본 발명의 백신은 면역 억제된 대상체에게 뎅기 또는 지카 바이러스에 의한 증강된 감염을 일으키지 않도록 설계된다. 본 발명의 면역원 및 백신은 개별 대상체를 기준으로 더 안전하게, 그리고 또한 중화 항체의 부재하에 지카-감염-증강 항체를 갖는 대상체의 개체군을 생성함으로써, 지카의 유행성 확산을 용이하게 할 가능성이 없도록 설계된다. (WT = 야생형).

실시예 2 (도 2) 뎅기 및 지카 엑소도메인 단백질의 당조작된(하이퍼글리코실화된) 형태의 재조합 발현.

4개의 뎅기 혈청형 및 지카를 나타내는 자연 야생형(WT) 엑소도메인 서열의 다양한 신규 재조합 형태를 인코딩하고, 이. 콜라이 복제 기점 및 시토메갈로바이러스(CMV) 프로모터뿐만 아니라, 헥사히스티딘 C-말단 태그를 함유하는 플라스미드 인서트를 데노보 유전자 합성에 의해 제조하였다(써모피셔(Thermofisher), GeneArt). 2개의 글리코실화 세쿠온을 DNA 서열에 삽입한 경우, 그렇지 않았다면 바람직하지 않은 동종 재조합 사건을 허용할 수 있는 직접 DNA 서열 반복부의 생성을 방지하기 위해 서열을 '수동으로' 변경하였다.

DENV1, DENV2, DENV3, DENV4 및 ZIKV 각각의 엔벨로프 단백질의 돌연변이된 엑소도메인을 코딩하는 플라스미드 발현 벡터 pCRO21(서열번호 13), pCRO22(서열번호 14), pCRO23(서열번호 15), pCRO24(서열번호 16) 및 pCRO28(서열번호 17)을 영국 옥스포드 소재 더 네이티브 안티젠 컴파니에 의해 다음과 같이 궁극적으로 선택 및 생성하였다: 발현 카세트를 5' NotI 부위 그 다음 컨센서스(consensus) Kozak 서열 그 다음 분비 신호로서 작용하는 인플루엔자-A 바이러스 혈구응집소 단백질의 처음 17개의 아미노산에 대한 코딩 서열을 함유하도록 데노보 합성하였다. 사용된 엔벨로프 단백질 코딩 서열(다단백질에 대한 넘버링)은 각각 280 내지 675(NCBI ACA48859.1), 281 내지 676(NCBI ADK37484.1), 281 내지 673(NCBI AIH13925.1), 280 내지 675(NCBI ANK35835.1) 및 291 내지 696(NCBI ARB07957.1)이었다. [다른 곳에서, 참조의 편의를 위하여, 넘버링은 융합 루프의 101에서 W를 기준점으로 하여 E-단백질에서 잔기 번호에 따라 표현됨]. 각각의 구조물은 길이 7개 내지 8개의 아미노산의 글리신-세린 링커에 대한 코딩 서열 그 다음 6x His-태그 및 정지 코돈을 함유하였다. 정지 코돈은 각각의 발현 카세트에서 NheI 부위가 뒤따른다. 포유동물 발현 벡터 pSF-CMV(옥스포드 제네틱스(Oxford Genetics), 옥스포드 소재)를 NotI 및 NheI로 소화시키고, 4.2 kb 단편을 유지 벡터(pUC57)를 보유하는 발현 카세트의 1,3 kb NotI 및 NheI 단편에 라이게이션하였다. 각각의 경우에, 일반식(NXS/T)의 1개 또는 2개의 추가의 세쿠온을 (이론적으로) 기능적 N-연결 글리코실화 부위를 인코딩할 수 있는 E-단백질 엑소도메인의 융합 루프로 도입하였다. 야생형 뎅기 단백질은 이미 자연적으로 2개의 글리코실화 부위를 갖고, 지카는 1개를 갖는다. 융합 루프에서 자연 글리칸은 발견되지 않았다.

소규모의 제조를 위하여, 3e6/ml에서 15 ml 분취액의 HEK293FT 세포를 pCRO21, pCRO22, pCRO23, pCRO24 또는 pCRO25(서열번호 18)로 개별적으로 형질감염시키고, 4개의 대조군 형질감염을 pSF233, pSF236, pSF237, pSF238 또는 pSF239를 사용하여 수행하였다. 1일 후, 15 ml의 구조 배지를 각각의 형질감염에 첨가하였다. 형질감염 후 3일째에 10개의 형질감염 각각을 동일한 방식으로 다음과 같이 처리하였다: 30 ml의 현탁액을 4,000 g에서 7분 동안 회전시켰다. 생성된 상청액을 0.22 um 디스크 필터를 사용하여 여과하였다. 펠렛을 1 ml의 PBS에 재현탁시켰다. 이어서, 여과된 상청액을 제조사의 지시에 따라, Vivaspin20(30,000 Da 컷오프)을 사용하여 농축시켰다. 농축물 부피는 0.6 ml 내지 1.2 ml 범위였다. 모든 농축물을 PBS로 1.2 ml까지 만들었다. 농축된 상청액을 탈론 하이트랩 스핀(Talon HiTrap Spin)(GE)을 사용하여 제조사의 지시에 따라 탈론 정제시켰다. 탈론 포획을 위한 완충제는 다음과 같았다: 평형 완충제: 50 mM 포스페이트 pH7.8, 300 mM NaCl; 세척 완충제: 50 mM 포스페이트 pH78, 300 mM NaCl, 5 mM 이미다졸; 용리 완충제: 50 mM 포스페이트 pH7.8, 300 mM NaCl, 150 mM 이미다졸.

SDS 전기영동 겔의 쿠마시-블루 스테이닝(staining)(도 2a, 도 2d) 및 웨스턴 블럿(도 2b, 도 2c)에 의한 생성된 단백질의 특성화가 도 2에 나타나 있다.

도 2c는 분비된 하이퍼글리코실화된 단백질을 생기게 하는, 선택된 구조물 pCRO21(D1), pCRO22(D2), pCRO23(D3), pCRO24(D4)(뎅기 혈청형 1 내지 4 각각의 경우) 및 지카의 경우 pCRO28의 항-His-태그 모노클로날 항체를 갖는 웨스턴 블럿을 나타낸다. 글리코실화로 인한 분자량 증가가 지카 +1 글리칸 구조물에 대한 것보다 +2 글리칸 뎅기 구조물에서 더 높다는 것이 분명하며, 이는 발현가능한 단백질로서 이론적으로 설계된 구조물 선택의 실제적인 달성을 입증한다. 야생형 형태가 각각의 쌍의 좌측에 나타나 있다.

도 2d는 코발트 킬레이트를 사용하는 코발트 킬레이트(탈론) 크로마토그래피 후 4개의 뎅기 바이러스 균주 D1, D2, D3, D4 및 지카로부터의 정제된 단백질, 하이퍼글리코실화된 E 단백질 엑소도메인의 쿠마시 블루 스테인드 겔을 나타낸다. 하이퍼글리코실화된 엑소도메인 D1, D2, D3, D4 및 지카는 각각 플라스미드 pCRO21, pCRO22, pCRO23, pCRO24 및 pCRO28에 상응한다.

스케일 업(scale-up) 제조를 위하여, 신규 하이퍼글리코실화된 단백질을 선형 폴리에틸렌이민(PEI)을 사용한 일시적인 형질감염에 의해 인간 배아 신장 세포(HEK 293)에서 재조합으로 발현하고, pCRO21을 기재로 하는 뎅기-1 하이퍼글리코실화된 구조물에 대해 다음과 같이 기재된 바와 같이, 코발트 킬레이트(탈론^ㄾ, 클론테크(Clontech)/GE)를 이용한 금속 킬레이트 친화도 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 20ㅧ 1 L의 HEK293 세포를 DENV1_Eexo_2xglyco 발현 벡터 pCRO21로 형질감염시켰다. 형질감염 3일 후, 상청액을 원심분리에 의해 수확하고, 맑은 상청액을 0.2 um 여과하고, 접선 유동 여과(TFF)에 의해 약 200 ml로 농축시켰다. 고정된 금속 친화도 크로마토그래피(IMAC)를 20 mM 나트륨 포스페이트 pH7.8 기재 완충제 시스템을 사용하여 제조사의 지시에 따라 5 ml HiTRAP 탈론 사전-패킹된 컬럼(GE)을 사용하여 TFF 보전물에 대해 수행하였다. DENV1_Eexo_2xglyco 단백질 함유 분획을 풀링하고, 20 mM TRIS-HCl pH7.8 10 mM NaCl에 대해 투석하였다. 제조사의 지시에 따라 사전-패킹된 5 ml HiTrap Q HP 컬럼을 사용하여 이온 교환 크로마토그래피를 수행하였다. DENV1_Eexo_2xglyco를 풀링하고, DPBS pH7.4에 대해 투석하였다. 투석된 용액을 0.22 um 여과하고, 무균 조건하에 바이알에 넣었다. BCA 분석 및 SDS-PAGE를 제조사의 지시에 따라 수행하였다(Bio-Rad).

3개의 하이퍼글리코실화된 구조물이 야생형보다 훨씬 더 높은 수준에서 발현한다는 것에 유의한다(플라스미드 pCRO22, pCRO23 및 pCRO24에 상응하는 하이퍼글리코실화된 뎅기 혈청형 2, 3 및 4가 존재함). 상당한 양의 세포-연관 단백질이 발견되었지만(나타내지 않음), 지카 플라스미드, pCRO25는 검출가능한 분비된 단백질을 생성하지 않았다(도 2a, 레인 20).

따라서, 구조물에서 뎅기-1 및 지카 하이퍼글리코실화된 형태의 발현 수준을 개선시키려는 시도가 추가로 이루어졌다(도 2b 참조). 이 경우, 정제를 위하여 니켈 킬레이트 크로마토그래피를 사용하였다. 뎅기(pCRO26(서열번호 19), 및 pCRO27(서열번호 20)) 및 지카(pCRO28(서열번호 17), pCRO29(서열번호 21), pCRO30(서열번호 22) 및 pCRO31(서열번호 23))의 추가의 구조물을 발현하고 정제하였다. 플라스미드 구조물 pCRO28의 유리한 발현을 항-His-태그 웨스턴 블럿(도 2c) 및 쿠마시 스테이닝(도 2d)에 의해 입증하였다.

선택된 하이퍼글리코실화된 형태는 pCRO21, pCRO22, pCRO23, pCRO24(뎅기 혈청형 1 내지 4 각각의 경우) 및 지카의 경우 pCRO28이었다. 하이퍼글리코실화된 엑소도메인 D1, D2, D3, D4 및 지카는 각각 플라스미드 pCRO21, pCRO22, pCRO23, pCRO24 및 pCRO28(서열번호 각각 24, 25, 26, 27 및 28)에 상응한다. 글리코실화로 인한 분자량 증가는 분명하게 지카 +1 구조물의 경우보다 +2 뎅기 구조물의 경우에 더 높다.

모두에서, 11개의 플라스미드 구조물을 제조하였고, 단백질 발현에 대해 시험하였고, 야생형과 비교하여 동등한 또는 (대부분의 경우에) 우수한 발현 수준을 기초로 추가의 조사를 위하여 5개를 선택하였다(pCRO21, pCRO22, pCRO23, pCRO24는 뎅기의 4개의 혈청형을 나타내고, pCRO28은 지카를 나타냄).

놀랍게도, 뎅기의 경우 융합 루프(3차원 공간에서 말단에 거의 근접한 위치에 있는 E 단백질의 끝에서 노출된 잔기 W, F 및 L을 특징으로 함)의 극단적인 소수성 특성을 고려할 때, 4개의 대표적인 혈청형 모두는 발현 수준에 불이익을 주지 않으면서 2개의 글리칸(친수성이고, 단순한 아미노산 치환이 불가능한 정도로 단백질의 이 부분의 토포그래피를 근본적으로 형질전환시킴)의 치환을 용인하였다(즉, 발현된 모든 것뿐만 아니라, 야생형 서열, 일부 경우에 현저히 우수함). 목적은 프로테아좀 분해를 위한 ERAD 채널을 통해 세포질그물로부터 박멸되는 단백질이 미스폴딩되지 않도록 보장하기 위하여 발현 수준에 대해 '야생형 이상'으로 설정되었다. 또한, 융합 루프에서 단일 글리칸을 갖는 뎅기 혈청형-1 서열의 예를 제조하였지만, 그것은 야생형 또는 2개의 글리칸을 갖는 종보다 더 우수하게 발현하지 않았다. 지카의 경우, (뎅기에 대해 확립된 방법에 따라) 융합 루프로 2개의 글리코실화 부위를 갖는 변이체를 생성하기 위한 시도가 성공적이지 않아, 야생형의 경우보다 재조합 단백질의 배양 배지로의 분비가 적었다.

따라서, 지카 E-단백질 엑소도메인의 경우, 본 발명자들은 융합 루프의 다양한 부위에서 단일 글리칸을 갖는 변이체의 생성을 탐구하였다. 뎅기 세쿠온 중 하나에 대한 트립토판(W101)을 아스파라긴으로 치환(W 대신 101에서 세쿠온의 N)하면 구조물의 발현 수준이 야생형의 경우보다 적었다. 마찬가지로, F108에서 글리칸을 삽입(즉, F 대신 108에서 세쿠온의 N)하면 구조물의 발현 수준이 야생형의 경우보다 적었다. 본 발명자들은 지카 융합 루프가 글리칸 삽입에 대해 덜 관대한 것으로 결론지었으며, 그것을 허용하는 더 보수적인 방법을 찾았다.

지카의 경우, 융합 루프의 W101 또는 다음의 F 둘 다가 N-연결 글리코실화 세쿠온의 N으로 대체될 수 없다는 것을 확립한 다음, 뎅기에 대해 취해진 접근법을 모델로 하지 않은 대안적인 전략을 개발하였다. 본 발명자들은 (3D 구조 PDB 5IRE를 기초로) 융합 루프의 말단에 가능한 한 가깝게 단일 글리칸을 배치하려고 하였다. (유전자 합성 또는 라이브러리 기술에 의해 어려웠을) 글리칸 삽입을 허용할 수 있는 수백 가지의 가능한 변이체를 체계적으로 제조 및 시험하는 과정을 거치지 않고, 본 발명자들은 가상의 해결책을 설계하고 그것을 시험하였다. 본 발명자들은 N-연결 글리코실화 세쿠온을 갖는 융합 루프의 상부에 W를 걸치도록 설계하였다. 그러나, 본 발명자들은 W가 세쿠온의 X 위치에서 용인되지 않기 때문에, 고전적인 NXS/T 세쿠온의 삽입에 의해 실행불가능할 수도 있다고 판단하였다. 그러나, W가 세쿠온의 중심의 'X' 위치에서 용인되지 않더라도, H(히스티딘, 소수성-방향족/양이온성 이중 특징을 갖는 W에 대한 비교적 보존된 대체물)가 X-위치에서 용인될 수 있다. 따라서, 본 발명자들은 100 위치를 N으로 치환하고, X-위치에 대해 W 대신 H를 사용하고, (본 발명자들이 S보다 H로 더 잘 작동한다는 것을 발견한) T를 사용하여 'NHT'(즉, 다단백질 넘버링 관습보다는 E-단백질 넘버링 관습을 사용한 잔기 100, 101, 102)로 판독되는 단일 세쿠온을 제조하였다. 플라스미드 pCRO28로부터 제조된 생성된 단백질은 야생형도 발현하는 것으로 밝혀졌고, 야생형보다 높은 정제율을 제공하였으며, 이는 발현에 장애가 없다는 것을 시사하였다. 본 발명자들이 탐구한 지카의 기타 다른 변이체는 사용된 발현 시스템에서 낮은 수준의 단백질을 생성하거나 전혀 분비하지 않았다.

실시예 3 (도 3) 당조작된 뎅기 혈청형-2 및 지카 단백질 상에 존재하는 글리칸의 특성화

실시예 2로부터의 선택된 단백질 중 2개, pCRO22의 뎅기-2 혈청형 생성물(모두 융합 루프에서 2개의 글리칸을 운반하도록 설계된 선택된 뎅기 구조물을 나타냄) 및 HEK 293의 형질감염으로부터 수득된 지카의 것(융합 루프에서 1개의 글리칸을 운반하도록 설계된 pCRO28의 생성물)에 대해 글리칸 조성 분석(글리코테라(GlycoThera), 독일)을 수행하였다.

폴리펩티드 N-글리코시다제 F(PNGase, 프로자임 인크.(Prozyme Inc.))로 소화하기 전후의 뎅기 및 지카 샘플의 SDS-PAGE 분석의 결과가 도 3a에 나타나 있다. 샘플을 95℃에서 5분 동안 50 mM DTT에서 환원시킨 후, SDS-PAGE 분석하였다(쿠마시 블루 스테이닝 후 15% 폴리아크릴아미드 겔) 레인 1: PNGase 소화 전 CV94(pCRO22 단백질, 뎅기-2); 레인 2: PNGase 소화 후 CV94; 레인 3: PNGase 소화 전 CV95(pCRO28 단백질, 지카); 레인 4: PNGase 소화 후 CV95; 레인 5: 분자량 표준물. 이 경우, (WT에 대한 도 2c의 증가와 구별되는) 겉보기 분자량의 감소 정도는 서열에 도입된 추가의 글리칸의 수에 기초한 이론적 예상과 일치한다: 즉, 뎅기-2는 이 소화에서 4개의 글리칸(2개의 자연 및 추가의 세쿠온의 서열 프로그래밍에 의해 도입된 2개)을 손실한 한편, 지카는 2개의 글리칸(1개의 자연 및 1개의 추가의 세쿠온의 서열 프로그래밍에 의해 도입된 1개)을 손실하였다. 문헌[Tarentino and Plummer, Methods in Enzymology, 1994; 230; 44-57]에 따라 PNGase를 이용한 효소 소화를 수행하였다.

글리칸을 하이퍼글리코실화된 단백질 생성물로부터 방출되고, 특정 엑소글리코시다제 처리와 함께, 펄스형 암페로메트릭 검출을 이용한 고성능 음이온-교환 크로마토그래피(HPAEC-PAD) 및 2-AB-표지된 N-글리칸의 형광 검출을 이용한 정상 HPLC에 의해 정량화하였다(도 3b). 표 2는 이러한 분석의 결과를 요약한다.

천연 올리고사카라이드의 정량적인 HPAEC-PAD 분석을 고해상도 CarboPac PA200 컬럼을 사용하는 써모 피셔 사이언티픽 인크.(Thermo Fisher Scientific Inc.)(미국 매사추세츠주 월섬 소재; 글리코테라 장치-ID: HPAEC-7)의 ICS 5000+ 이온 크로마토그래피 시스템 상에서 수행하였다. 적절한 올리고사카라이드 참조 표준물의 주입을 분석 순서에 포함하였다.

N-글리칸을 전기 화학적 검출을 통해 검출하였다. 데이터를 수집하고, 크로멜레온 크로마토그래피 매니지먼트 시스템(Chromeleon Chromatography Management System) 버전 6.8을 사용하여 크로마토그램을 수득하였다. 글리코테라의 참조 올리고사카라이드 표준에 따라 두 제제에서 주로 중성, 모노시알릴레이트화된, 디시알릴레이트화된 및 트리시알릴레이트화된 올리고사카라이드를 나타내는 HPAEC-PAD를 통해 천연 N-글리칸을 분석하였다(도 3b, 표 3).

탈시알릴레이트화된 N-글리칸을 글리코테라의 참조 올리고사카라이드 표준에 따라 두 샘플(CV94=뎅기-2 및 CV95=지카)에서 근위 α1,6-연결 푸코스를 갖는 유의한 순열 다양성을 갖는 복합체-타입 N-글리칸을 우세하게 나타내는 2-AB 표지 후 NP-HPLC를 통해 분석하였다. 뎅기 및 지카 제제 CV94(뎅기 2 pCRO22 단백질) 및 CV95(pCRO28 단백질) 지카로부터 방출된 천연 N-글리칸의 HPAEC-PAD 매핑(표 2에 나타낸 바와 같음)은 두 샘플에서 우세하게 중성(각각 16.9% 및 17.0%), 모노시알릴레이트화된(각각 30.7% 및 36.9%), 디시알릴레이트화된(각각 26.6% 및 32.0%) 및 트리시알릴레이트화된(각각 15.0% 및 8.4%) 올리고사카라이드의 존재를 나타내었다. 유의한 양의 테트라시알릴레이트화된 N-글리칸(각각 9.5% 및 5.1%)뿐만 아니라, 낮은 비율의 펜타시알릴레이트화된/설페이트화된 올리고사카라이드(각각 1.3% 및 0.6%)를 뎅기 및 지카 샘플 CV94 및 CV95에서 발견하였고; 포스포릴레이트화된 N-글리칸 구조, 예컨대 1개의 포스페이트 잔기를 갖는 올리고만노시딕 Man5-6GlcNAc2 글리칸 쇄는 분석된 샘플 중 어느 것에서도 검출되지 않았다.

글리칸의 부위 점유율 분석:

부위 점유율을 트립신 펩티드의 LC-MS 측정에 의해 결정하였다. 분석은 PNGase F에 의해 효소적으로 탈-N-글리코실화된 단백질로부터 유리된 트립신 또는 엔도 Lys-C 생성된 펩티드의 LC-MS 측정을 기초로 하였다. PNGaseF가 글리코아미다제이기 때문에, 아스파라긴(N)은 아스파르트산 잔기(D)로 전환되었다. 추출된 이온 크로마토그램(EIC)의 생성에 의해 정량화를 수행하였다. EIC는 0.01의 +/- m/z의 질량 윈도우 내에서 상이하게 하전된 표적 펩티드의 이론적인 m/z 값을 사용하여 생성하였다. 탈-N-글리코실화에 의해 생성된 특이적으로 변형된 대응물과 펩티드 강도를 비교하기 위하여, EIC의 피크 면적을 사용하였다. 이어서, 변형 비/정도를 다음과 같이 계산하였다: 변형 정도 = [변형된 펩티드의 EIC 아래의 면적]/([변형된 펩티드의 EIC 아래의 면적] + [비변형된 펩티드의 EIC 아래의 면적]).

서열 넘버링은 유용한 기준점으로서 W101(융합 루프의 맨 끝에 있음)과 함께, 다단백질보다는 단백질 서열 넘버링 관습에 의한 것이다. 부위는 N-말단에서 시작하는 선형 서열에서 그의 모양에 따라 넘버링되므로, 뎅기(pCRO22, 글리코테라 샘플 번호 CV94)에, 부위 2 및 3을 포함하는 2개의 추가의 세쿠온이 존재하였다. 자연 WT N-글리코실화 부위의 점유율은 각각 부위 1 및 부위 4에 대해 100% 및 99%인 것으로 확인하였다. 첨가된 N-글리코실화 부위 2 및 3(융합 루프에서)은 1개의 트립신 펩티드(T15) 상에 위치하고, 점유율은 38%(두 부위 모두) 및 추가의 51%이며, 여기서 2개의 부위 중 단지 1개만이 N-글리코실화되었다. 모두에서, 융합 루프의 89%는 적어도 하나의 글리칸을 가졌다.

지카의 경우, N-글리코실화 부위의 점유율은 각각 첨가된 '부위 1'(잔기 100, 융합 루프) 및 부위 2(잔기 154, 자연적으로 존재하는 글리칸)에 대해 99.5% 및 100%인 것으로 확인하였다. 프로그램된 글리코실화 세쿠온의 부위 점유는 PNGase 소화 및 트립신 펩티드 단편의 질량에 대한 그의 작용(이로써 아스파라긴 측쇄의 아미드 NH₂ 기가 손실되어 히드록실 기로 전환됨)으로부터 추론되었다. (다음의 서열에서 프로그램된 세쿠온은 볼드체임). 하이퍼글리코실화된 뎅기 2 엑소도메인에서, 관련 트립신 펩티드는 T15, 즉 101 및 108에서 치환된 N 잔기를 함유하는 15번째 트립신 펩티드(GN ₁₀₁ GSGCGLN ₁₀₈ GSGGIVTCAMFTCK₁₂₂(서열번호 35))였다. 하이퍼글리코실화된 지카 엑소도메인(단일 도입된 글리코실화 세쿠온 'NHT'를 가짐)에서, 관련 펩티드는 T10(N ₁₀₀ HTNGCGLFGK₁₁₀(서열번호 36))이었다.

뎅기 및 지카 엑소도메인 단백질의 융합 루프로 크고 복잡한 글리칸을 효율적으로 도입한 이러한 발견은, 이러한 단백질이 융합 루프에 결합되지 않거나, 융합-루프 항체를 유도하지 않을 것이라는 우리의 기대를 강화시켜 융합 루프의 야생형 버전을 인식할 수 있는 B-세포 또는 항체가 본 발명의 글리코실화된 형태와 결합하지 않을 것이라는 확신을 주었다. 이러한 시나리오는, 하나 이상의 큰 추가의 글리칸 구조를 융합 루프에 도입함으로써, 생성된 변이체 융합 루프가 항체 또는 B-세포 수용체를 결합시킬 수 없거나, 융합 루프의 야생형 버전과 반응성인 융합 루프 항체를 생성할 수 없기 때문에, 돌연변이가 융합 루프로 단순히 도입되는 것과는 현저히 다르다. 이것은 이후의 실시예에서 완전히 확인하였다. 또한, 이러한 전략은 단백질의 구조로부터 도메인 I 및 II를 삭제하는 것과 대비될 수 있는데, 이들 도메인은 또한 야생에서 플라비바이러스와 만났을 때 기억 면역 반응에 유용한 중화 에피토프 및 T-세포 에피토프를 제공하는 한편, 자연 바이러스 감염 또는 기타 다른 백신에 대한 면역 반응에서 융합 루프의 위험한 우위를 방지하도록 하는 방식으로 면역 시스템을 사전 컨디셔닝하기 때문이다.

실시예 4 (도 4) 직접 ELISA에서 선택 당조작된 뎅기 단백질 1, 2, 3 및 4 및 지카의 면역원성.

암컷 Balb-c 마우스를 PBS(음성 대조군) 및 알하이드로겔 상 하이퍼글리코실화된 엑소도메인 단백질의 다양한 뎅기 및 지카 제제 단독(지카 모노) 및 조합(펜타-) 및 네이키드 DNA(DNA)로서 면역화시켰다. 단백질의 알하이드로겔 제제를 200 ul의 총 부피로 피하(s.c.) 주사하고, 네이키드 DNA(뎅기의 플라스미드 pCRO21, pCRO22, pCRO23 및 pCRO24와 지카를 나타내는 pCRO28을 포함함)를 5가 DNA(5마이크로그램의 각각의 플라스미드 면역원을 나타냄)에 대해 50 ul의 총 부피로 근육내(i.m.) 주사하였다. 5가 단백질 조합물은 각각의 하이퍼글리코실화된 엑소도메인을 투여량 당 5 ug의 양으로 함유하고, 1가(지카)는 투여량 당 10 ug을 함유하였다. 마우스에게 0일, 14일 및 21일 각각에 한 번씩 3회 투여하였다. 도 4의 우측 아래에 있는 범례는 각각의 면역원의 조성물을 나타낸다. 각각의 패널의 제목은 고체상 ELISA 플레이트에 사용된 항원을 나타낸다. (야생형 재조합 VLP는 도 4에서 면역원, 그룹 4 및 항원으로서 둘 다 사용되었다). 마우스를 지시된 간격으로 안와후방으로 채혈하고, ELISA 및 PRNT 분석을 위하여 혈청을 수집하였다.

Balb-c 마우스를 당조작된 엑소도메인의 DNA 및 단백질 표현, 및 양성 대조군으로서 영국 옥스포드 소재 더 네이티브 안티젠 컴파니 엘티디로부터의 상응하는 VLP(즉, 야생형 서열을 나타내는 VLP)(여분의 글리칸 및 노출된 융합 루프 없음)로 면역화시켰다. 이러한 VLP(도 4의 ELISA 시험에서 두 면역원 및 또한 시험 항원으로서 사용됨)는 또한 엑소도메인에 존재하지 않는 다수의 추가의 에피토프, 특히 프리-멤브레인 단백질 prM의 에피토프를 함유한다.

리포솜 제제, 유전자 총 또는 일렉트로포레이션 기술로부터의 전달 보조의 부재하에 예상되는 바와 같이, 5개의 엑소도메인을 나타내는 네이키드 DNA에 대한 항체 반응은 거의 없었다. 네이키드 DNA에 대한 항체 반응은 뎅기 1, 2 및 3 천연 VLP에 대해 명백하였으며, 지카 및 뎅기 4 VLP에 대해서는 명백하지 않았다. 그러나, 이러한 결과는 적절한 전달 시스템을 갖는 이러한 DNA 인코딩된 항원(모두)의 잠재적인 유용성을 입증하기 위하여 제공되었다. 분석은 추가의 에피토프(상기 언급됨)의 존재로 인해, VLP에 대한 면역 반응을 검출하는데 자연적으로 더 민감하므로, 예상되는 바와 같이, VLP 항원에 대한 항체 반응은 VLP-면역화된 '그룹 4'에서 균일하고, 매우 강하였다. 그러나, 5가 면역원 제제를 갖는 5가지 모든 성분(뎅기 혈청형 1, 2, 3 및 4와 지카)에 대해 강하고 균형잡힌 면역 반응을 제공하는 본 발명의 신규 당조작된 엑소도메인 단백질에 대한 반응도 그러하였다. 반응은 엑소도메인 면역원(5가 단백질 및 1가 지카)에 대해 균일하게 높았으며, 비-반응자는 없었다. 또한, 1가-지카-하이퍼글리코실화된-엑소도메인-면역화된 그룹(투여량 10 ㎍)에서 지카에 대한 반응은, 동일한 엑소도메인이 절반의 투여량으로 사용된 5가 단백질 그룹에서의 반응보다 약간 더 높았다. 이러한 발견은 타입 특이적 면역 반응의 생성에서 혈청형간의 경쟁의 바람직한 결핍을 나타낸다(이것은 뎅기 혈청형 2에 대한 면역 반응이 문제가 될정도로 낮은 감독된 플라비바이러스 생백신 접근법, 예컨대 뎅박시아(Dengvaxia)의 공지된 문제점임).

뎅기 및 지카 바이러스에 대한 뮤린 항체를 측정하기 위한 직접 ELISA(도 4)를 위하여, Nunc™ 플랫 96-웰 마이크로플레이트, 써모사이언티픽(Thermoscientific), Cat. No. 269620을 (더 네이티브 안티젠 컴파니(옥스포드)로부터의) VLP를 사용하여 4.43 g/l의 나트륨 비카르보네이트 및 1.59 g/l의 나트륨 카르보네이트를 함유하는 비카르보네이트-카르보네이트 완충제(pH 9.4 내지 9.6) 중 0.5 ㎍/ml의 농도로 실온에서 2시간 동안 100 ㎕/웰로 코팅하였다. 플레이트를 둘베코(Dulbecco) 포스페이트 완충 식염수(PBS, 써모피셔-기브코(ThermoFisher-Gibco) 14190136)(PBS-BSA) 중 2% 중성 BSA(시그마알드리치(SigmaAldrich) A7906)로 흡인 및 차단하였다. 차단 완충제를 1/100 및 1/10,000의 농도(각 농도에서 중복)로 희석된 마우스 혈청의 시험을 위한 희석제로서 사용하였다. PBS-트윈(PBS-Tween)을 사용하여 웰을 5회 채우고 비우는 것에 의해, 각각의 인큐베이션(차단, 희석된 혈청 인큐베이션, 콘쥬게이트 인큐베이션) 후, 0.05% 트윈(Tween)-20 세정제(시그마-알드리치)(PBS-트윈)를 함유하는 PBS로 플레이트를 세척하였다. 혈청 인큐베이션 및 세척 후, 제2 항체 콘쥬게이트를 1:4000의 희석으로 PBS-BSA(염소 항-마우스 IgG HRP 콘쥬게이트 BioRad 103005)에 적용하였다. 플레이트를 마지막으로 세척한 후, 홀스래디시 퍼옥시다제(HRP)에 대한 기질을 첨가하고(3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘, TMB, 시그마-알드리치 T00440), 실온에서 20분의 인큐베이션 후, 0.16 M 황산으로 정지시켰다. 인큐베이션을 믹서(그랜트 바이오(Grant Bio), 약 500 rpm에서 PMS-1000) 상에서 수행하였다. 정지된 반응의 흡광도는 450 nm에서 판독되었다.

항체 반응을 0.5 마이크로그램/ml의 코팅 농도에서 고체상에 혈청형 2를 나타내는 뎅기 VLP로 융합 루프 항체 4G2(더 네이티브 안티젠 컴파니 엘티디, 옥스포드)에 대해 보정하였다. 항체 측정 "IgG 항체 역가"의 단위는 4-성분 다항식 회귀 적합선(어세이핏(AssayFit), IVD 툴즈(Tools))을 사용하여 표준 곡선의 내삽에 의해 결정된, 비희석된 혈청에서 4G2-등가물 ml 당 마이크로그램이다. 42일째에, 항체 반응은 하이퍼글리코실화된 엑소도메인 면역원(개념상 순수한 혈청 중 10 mg/ml 내지 100 mg/ml)에 대해 10⁴ 내지 10⁵에 도달하였다. (문자 그대로 취해진) 이러한 농도는 마우스 혈청의 IgG 농도가 단지 2 mg/ml 내지 5 mg/ml이기 때문에 도달 불가능하게 높으며, 아마도 표준화에 사용된 항체, 4G2와 비교하여 생성된 항체의 더 높은 친화도 또는 결합능을 반영하거나, 더 우수한 에피토프 노출(4G2의 융합 루프 에피토프는 VLP 및 비리온의 구조에서 반-미확인임)을 반영할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 4G2 보정은 분석이 때때로 수행되어 콘쥬게이트(배치에 따라 변하는 폴리클로날 항체로부터 제조된 항-IgG-Fc 홀스래디시 퍼옥시다제 콘쥬게이트)에서 배치 대 배치 변화와 같은 변수를 제어할 수 있게 하는 유용한 목적을 제공한다. 이것은 매우 콘쥬게이트-배치 및 항원-배치 의존성인 역치 흡광도 값에 기초한 항체 '역가'를 인용하는 것보다 더 신뢰할 수 있으며, 상이한 제조사에 의해 제공되는 콘쥬게이트들 사이에서 더 다양할 수 있다.

이러한 관찰의 또 다른 양태는 생성된 항체가 모든 단백질 면역원에 대해 IgM으로부터 (심지어 14일째에도) 부류-전환을 보여주는 IgG 부류라는 것이다. 이것은 백신 개발에 중요한 B-세포 기억 반응의 필수 요소이다. 이러한 발견의 또 다른 양태는 엑소도메인 단백질 면역원(및 어느 정도는 DNA 면역원)에 의해 생성된 항체가 항-His-태그 반응으로 인한 위양성의 가능성을 배제하면서 His 태그가 또한 결핍된 VLP 항원의 천연 형태를 강하게 인식한다는 것이다. 이것은 뎅기 및 지카 엑소도메인 물질 둘 다가 항-바이러스(VLP) 항체의 생성에서 면역원성인 엑소도메인 단백질의 천연 에피토프를 나타낸다는 것을 입증한다. 이러한 결과는 하이퍼글리코실화된 엑소도메인 종, 예를 들어 리포솜 RNA 또는 리포플렉스 RNA의 기타 다른 헥산 인코딩된 형태가 또한 비리온(VLP) 및 바이러스에 대한 바람직한 항체 반응을 생성할 것이라는 것을 시사한다.

이러한 다양한 바이러스와 항체의 공지된 교차 반응성에도 불구하고, 기타 다른 VLP보다 동종 지카 VLP에 대해 더 높은 항체 역가를 생성하는, 지카 1가 하이퍼글리코실화된 엑소도메인에 대한 면역 반응에는 특이성이 존재하였다. 이것은, 타입-특이적 항-지카 항체가 뎅기-교차 반응성 항체보다 일반적으로 더 우수한 중화 활성을 갖는 것으로 공지되어 있기 때문에 유리한 결과이다. 또한, 후속 시점에 (2회 또는 3회 투여 후), 지카-1가 하이퍼글리코실화된 엑소도메인에 대한 항체-반응에서 볼 수 있듯이, 융합 루프 에피토프(후속 실시예에서 후술하는 데이터에서 입증된 바와 같이, 하이퍼글리코실화된 엑소도메인 종에 의해 생성된 항체에 의해 인식되지 않음)를 배제한, 유익한 교차 반응성 중화 반응의 생성 가능성을 높이면서 시간이 지남에 따라 발달된 뎅기 균주에 대한 어느 정도의 교차 반응성이 존재하였다.

실시예 5 (도 5) 융합 루프 항체에 의한 당조작된 단백질의 인식 방지 및 중화 에피토프의 보유

(도 5의) ELISA 시험을 고체상에서의 His-6-태그 부착 엑소도메인 단백질의 지향성 포획을 사용하여 설계하였다(도 4의 VLP는 His-태그를 갖지 않음). 달리 명시되지 않는 한, 조건은 실시예 4 및 도 4의 ELISA 시험과 동일하였다. 8-웰 스트립 ELISA 플레이트(Dynex)를 실온에서 1시간 동안 및 이어서 밤새 비카르보네이트-카르보네이트 코팅 완충제에서 1 ㎍/ml의 농도로 래빗 모노클로날 항-His-6 태그(항-6X His 태그^ㄾ 항체 [HIS.H8](ab18184) Abcam)로 코팅하였다. 플레이트를 세척한 후, 실온에서 30분 동안 스타팅 블록(Starting Block)(써모피셔 37538)에 노출시킨 후, 37℃에서 2시간 동안 이어서 4℃에서 밤새도록 0.5 ㎍/ml의 농도에서 모두 C-말단 헥사-히스티딘 태그를 갖는 다양한 엑소도메인 단백질에 노출시켰다. 항체를 PBS-트윈 중 0.4% BSA의 적절한 웰에 첨가하고, 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 그 다음, 마우스 항체에 대한 제2 항체 콘쥬게이트(래빗-항-마우스-HRP IgG H&L, Abcam ab97046)를 1/10,000의 희석으로 PBS-트윈 중 0.4% BSA에 적용하였다. 인간 혈청에 대하여, 희석 배수는 PBS-트윈 0.4% BSA 중 1/1000이었고, 이어서 염소 항-인간 IgG Fc(HRP)를 1/20,000에서 전흡착하였다(Abcam ab98624). 제2 항체 HRP 콘쥬게이트를 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 플레이트를 연속적인 시약에의 노출 사이에 세척하였다. 마지막으로, TMB 기질을 첨가하고, 실온에서 10분 후에 정지시켰다.

항원은 다음과 같았다: 뎅기 혈청형 2 및 4를 나타내는 야생형 뎅기 엑소도메인은 더 네이티브 안티젠 컴파니로부터의 것이고(DENV2-ENV, DENV4-ENV); 'HX' 설계된 엑소도메인(하이퍼글리코실화된 엑소도메인)은 본 개시내용의 엑시비온 엑소도메인의 선택된 세트였다(뎅기의 경우 pCRO21 내지 24, 지카의 경우 pCRO28). 프로스펙 지카는 이스라엘의 프로스펙으로부터의 비-글리코실화된 박테리아 엑소도메인(zkv-007-a)이고, 알토 지카는 곤충(Sf9 세포) 유도된 지카 엑소도메인(AZ6312- Lot3909)이었다. 지카 바이러스 엑소도메인에 대한 마우스 모노클로날 항체는 다음과 같았다: 알토 바이오리에이전츠 AZ1176-0302156-Lot3889; Z48 및 Z67은 문헌[Zhao et al, Cell 2016]에 의해 기재된 중화 항체(더 네이티브 안티젠 컴파니 ZV67 MAB12125 및 ZV48 MAB12124)이었다. 항체 4G2는 융합 루프를 인식하는 항-뎅기-혈청형-2 항체이다(더 네이티브 안티젠 컴파니 AbFLAVENV-4G2).

도 5a는 항체 4G2에 의한 뎅기 2 및 4의 야생형 엑소도메인의 민감한 검출이 매우 낮은 농도(250 pg/ml)에서도 배경보다 유의하게 높은 신호를 제공한다는 것을 나타낸다. 반면, 하이퍼글리코실화된 엑소도메인은 시험된 임의의 농도에서 검출가능한 신호를 제공하지 않았다(5a). 야생형 및 융합-루프-글리코실화된(HX) 엑소도메인의 이러한 병행 비교는, 심지어 사용된 뎅기-2 HX 엑소도메인 중 11%의 비-글리코실화된(비록 돌연변이되었지만) 융합 루프의 존재에도 불구하고(글리코실화 부위 사용 데이터에 대해 실시예 3 참조), 융합-루프-글리코실화된(HX) 엑소도메인이 이러한 고전적인 융합 루프 항체(류신 107에 매우 의존성임, 문헌[Stiasny K et al., J Virol 2006 80:19 9557-68], 그 위치에서 D,T 또는 F를 용납하지 않음)와 반응하지 않음을 입증한다. 이것은 글리칸이 없더라도 사용된 돌연변이가 이러한 특정 융합 루프 항체(4G2)의 결합을 막기에 충분하다는 것을 입증한다. 그러나, 인간 항체의 클로날 다양성을 고려할 때, 플라비바이러스의 야생형 융합 루프를 인식할 수 있는 융합 루프 항체가 백신으로 사용될 때 이러한 신규 면역원을 갖는 인간에서 생성되지 않을 것이라는 확실한 추가의 층으로서 글리코실화된 형태를 사용하는 것이 궁극적으로 바람직할 것이다.

또한, 도 5b 및 c의 데이터는 지카의 경우, 엑소도메인의 HX 버전이 2개의 중화 에피토프 ZV48(Z48) 및 ZV67(Z67)을 포함하는 3개의 지카 모노클로날 항체 모두와 반응한다는 것을 입증한다. 이것은 지카 HX 엑소도메인이 글리칸 삽입에 의한 융합 루프의 구조에 급격한 변화가 있었음에도 불구하고, 이러한 중화 에피토프와 알토(Aaalto) 항체 에피토프를 보유하고 있음을 입증한다. 또한, 이러한 지카 HX 엑소도메인은 4개의 뎅기 HX 엑소도메인과 마찬가지로 4G2와 반응하지 않아서, 이러한 에피토프가 5개의 HX 단백질 모두에서 효과적으로 클로킹된 것으로 확인되었다.

또한, 시험된 지카 인간 회복기 혈청에 대한 도 5b 및 c의 데이터는 진단학적으로 유익하다. 이러한 혈청은 지카에 대한 그의 높은 PRNT 활성 및 그의 높은 수준의 지카 NS1 항체를 위해 선택된 NIBSC의 마크 페이지(Mark Page)로부터의 선물이었다. 도 5b 및 c의 데이터는 이러한 지카 회복기 혈청이 시험에서 기타 다른 항원보다 뎅기-2 wt 엑소도메인을 강하게 인식하고, 실제로 선호한다는 것을 입증한다. 이러한 관찰은 단백질의 HX 시리즈의 진단적 유용성을 입증하며, 이러한 환자가 또한 이전에 지카 이외의 또 다른 플라비바이러스에도 노출된 적이 있음을 나타낸다. 사실, 그것은, 지카 회복기 혈청이 (뎅기 회복기 혈청과 달리) 뎅기의 하이퍼글리코실화된 엑소도메인 형태와 반응하지 않기 때문에, 기타 다른 플라비바이러스가 뎅기가 아님을 시사한다. 따라서, 지카 회복기 혈청 중 융합 루프 항체는, 둘 다 이러한 혈청이 수집된 트리니다드에서 널리 퍼져 있는 황열(백신 접종 또는 감염에 의해) 또는 웨스트 나일 바이러스와 같은 제3 플라비바이러스에 대한 노출로부터 유래했음이 틀림없다.

도 5b 및 c의 데이터의 추가의 양태는, 지카 HX 항원이 중화 항체의 존재를 선택적으로 알려주는 능력을 갖는다는 것인데, 이는 상기 언급된 중화 에피토프가 유지되는 동안 4G2 융합 루프 에피토프가 효과적으로 클로킹되기 때문이다. HX 지카 엑소도메인 단백질 및 또한 따라서 뎅기 HX 엑소도메인 단백질은 따라서 지카 및 뎅기 백신의 개발 및 전개에 영향을 미치는 능력을 가질 것이다. 뎅기 백신의 경우, 시험의 HX 항원은 뎅기에 대해 경험이 없고, 현재 허가된 뎅박시아^ㄾ 항-뎅기 백신으로 백신 접종의 해를 입지 않았을 사람을 식별하여 차후의 뎅기 출혈열(백신이 무증상 일차 뎅기 감염으로 작용함)에 걸리기 쉬운 소인의 위험성을 감소시키는 데 유용할 것이다. 이러한 시험은 뎅박시아의 유용성을 어린 사람들(현재 9세 초과의 어린이들에게만 허가됨) 또는 (예를 들어, 뎅박시아 백신 접종이 현재 권장되지 않는 여행자 개체군에서의 사용을 위해) 유럽 및 미국과 같은 비-풍토병 지역의 경험이 없는 사람들에게까지 확장될 수 있다.

실시예 6 (도 6) 당조작된 단백질에 의한 융합-루프 항체의 생성 방지.

(이 실시예에서 고체상 ELISA 플레이트 상 뎅기 혈청형-3 VLP에 의해 나타낸) 융합 루프에 대한 폴리클로날 항체의 결합을 측정하기 위하여 ELISA 시험을 확립하였다.

경쟁 ELISA를 스트렙타비딘-홀스래디시 퍼옥시다제 콘쥬게이트를 사용하여 검출된 바이오티닐화 4G2(인테그레이티드 바이오세라퓨틱스(Integrated Biotherapeutics))를 사용하여 설정하였다. 면역화 혈청형 뎅기-2 VLP보다 약간 더 우수한 4G2와 반응하는 뎅기 혈청형 3 VLP(더 네이티브 안티젠 컴파니)를 고체상에 0.5 ug/ml로 코팅된 항원으로 사용하였다. (도 4의 그룹들로부터의) 풀링된 혈청 또는 (표준물로서) 비표지된 4G2를 (혈청 풀의 최고 농도로서 1/10으로부터) 다양한 희석액으로 적정하여 융합 루프에 결합하기 위하여 바이오티닐화 4G2와 경쟁할 수 있는 그들의 능력을 측정하였다. 지카 VLP 및 뎅기-2 VLP 야생형 재조합 물질을 항원으로서 사용하여 관심 플라비바이러스 전체에 걸친 이러한 현상(융합 루프 항체의 교차 반응성)의 보편성을 강조하는, 유사한 표준 곡선을 생성하였다(나타내지 않음).

이러한 분석에서(도 6), 고체상 항원에 결합하기 위하여 경쟁하는 비표지된 4G2의 능력을 바이오티닐화 4G2 및 스트렙타비딘-HRP 콘쥬게이트(1/3000에서 커크가드 앤드 페리(Kirkegaard and Perry) KPL KPL 14-30-00)를 사용하여 입증하였다. 달리 명시되지 않는다면, 조건은 실시예 4에서와 동일하였다. 먼저, 4G2의 샘플을 30:1의 반응물의 몰비를 사용하여 BioRad EZ-링크 NHS-PEG4 바이오티닐화 키트(21455)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 바이오티닐화시켰다. 비표지된 항체 및 바이오티닐화 항체를 고체상 항원에 결합시키기 위하여 밤새 실온 인큐베이션에서 경쟁하게 하였다. 항원-코팅된 플레이트를 표준 항체의 희석액(4G2의 4배 또는 5배 연속 희석액, 비표지됨)에 동시에 노출시켰다. 바이오티닐화 항체를 100 ng/ml의 농도로 사용하였다.

도 6은 4개의 모든 뎅기 혈청형과 지카의 VLP를 함유하는, 알하이드로겔 상 5가 VLP에 대해 생성된 항체가 풍부한 융합 루프 항체를 생성한다는 것을 입증하였다. VLP-면역화된 혈청이 폴리클로날 항혈청에서 바이러스 항체에 대해 일반적으로 최대량인 약 100마이크로그램/ml의 융합 루프 항체를 함유한다는 것을 이러한 데이터(4G2 및 생성된 항체의 유사한 친화도를 가정함)로부터 계산할 수 있다. 반면, 기타 다른 그룹 중 어느 것도 결합이 4G2와 상호 배타적인 유의한 양의 융합 루프 항체를 생성하지 않는다. 특히, 본 개시내용의 5가 (HX) 엑소도메인 단백질은 이러한 시험에서 평가된 바와 같이 융합 루프 항체를 생성하지 않으며, 경쟁 ELISA 시험에서 사용된 VLP 항원에 대한 아주 상당한 항체 반응을 생성함에도 불구하고, 1가 지카 (HX) 단백질을 생성하지 않는다. 지카의 경우, 억제는 단지 시험된 최고 농도에서만 검출가능하며, 이는 1/10 혈청 희석에서 이러한 단일 지점이 (논의를 위하여) 유의한 것으로 여겨질 경우, VLP 면역원과 비교하여 융합 루프 항체의 방지에 있어서, 1000배 초과의 이점을 나타낸다.

도 6의 데이터는 본 발명의 뎅기 백신(또는 지카 백신)이 보존된 융합 루프에게 항체 반응을 위해 대비시키지 않는다는 것을 입증한다. 이것은 뎅기의 제2 혈청형과 만났을 때 후속 출혈열에 대해 대비시키는 자연 일차 뎅기 감염과 대조적이다. 자연 일차 뎅기 감염에 대한 이러한 항체 반응은 항체의 생리학적 농도에서 불량한 중화 또는 비-중화이고, 기타 다른 숙주 세포를 감염시키지 못하게 하면서 특히 항체-복합 비리온이 Fc-수용체를 통해 골수 세포에 유입되어 감염시키도록 함으로써 뎅기 감염 및 질환의 항체-의존성 증강의 원인에 연루된다.

실시예 7 (도 7) 당조작된 뎅기 및 지카 단백질에 의한 중화 항체의 생성

실시예 4로부터의 혈청 풀을 플라크 감소 중화 시험(PRNT)에서 베로(Vero) 세포를 사용하여 뎅기 혈청형 2 및 지카 바이러스를 중화시키는 능력에 대해 시험하였다.

뎅기의 경우, 베로 세포를 감염시키기 위하여 사용된 뎅기 혈청형 2 균주(D2Y98P)는 VLP 및 엑소도메인의 면역화 뎅기 2 균주의 서열과 상이한 혈청형-2 균주(비-동종)였다. 뎅기 중화 항체를 생성할 것으로 (실시예 4로부터) 예상되는 그룹(즉, 5가 단백질 및 5가 VLP, 그룹 2 및 4)에서, '오프 표적' 뎅기 시험 바이러스의 강력한 중화가 있었다. 지카의 경우, 천연 지카 VLP를 인식하는 항체를 함유하는 것으로 나타난 그룹(즉, 5가 단백질 및 5가 VLP, 그룹 2, 3 및 4)에서 실시예 4의 결과로부터 예상되는 바와 같이 (비록 부분적임에도 불구하고) 유의한 중화가 있었다. 샘플 부피에 대한 한계로 인해, 시험된 혈청의 최대 농도는 1/50이므로, 이러한 결과를 해석할 때, 이러한 인자가 고려될 필요가 있다(즉, 면역화된 동물의 혈액에 보다 높은 중화 능력이 있음).

PRNT 분석을 다음과 같이 수행하였다. 각각의 그룹에서 동일한 부피의 개별 샘플을 취함으로써 5개의 마우스 혈청 샘플을 풀링하고(다음 슬라이드에서 샘플 설명), 이어서 ZIKV 및 DENV 각각에 대해 시험하였다. 1:50에서 시작하는 각각의 혈청 샘플 2벌의 12개의 2배 연속 희석액을 바이러스로 2시간 접종하기 위하여 제조하였다. 이어서, 혈청-바이러스 믹스를 24-웰 배양 플레이트에 시딩(seeding)된 베로 세포에 첨가하고, 가습된 5% CO₂ 분위기에서 37℃에서 인큐베이션하였다. 베로 세포는 ZIKV PRNT의 경우 3일 인큐베이션후(dpi) 및 DENV PRNT의 경우 4 dpi에 고정시켰다. 바이러스 플라크를 크리스탈 바이올렛 스테이닝에 의해 결정하였다.

뎅기에 의한 감염의 강력한 억제를 본 개시내용의 하이퍼글리코실화된 엑소도메인 단백질로 면역화된 그룹에서 관찰하였다(펜타-prot). 지카 면역화된 동물은 베로 세포의 뎅기 감염을 예방하지 않는 항체를 생성하였으며, 이는 이러한 신규 면역원에 의해 생성된 항체의 타입-특이적 특성을 예시한다. (지카 1가 그룹 및 5가 단백질 그룹으로부터의) 이러한 지카 항체는 지카 바이러스에 의한 베로 세포의 감염을 유의미하게 방어하였다. 예상되는 바와 같이, PBS-가짜-면역화된 동물은 방어 항체를 유발하지 않거나, 5가 DNA가 근육내 투여되지 않았다. 이러한 후자의 결과는 (유전자 총 또는 일렉트로포레이션 전략, 또는 분자 아쥬반트로서 인코딩된 단백질을 혼입시키는 전략과는 뚜렷이 구별되는) 근육내 주사로부터 예상되는 바와 같이, 네이키드 DNA에 의해 생성된 항체의 낮은 농도로 인한 것일 수 있다.

본 발명의 하이퍼글리코실화된 엑소도메인 단백질에 의한 실시예 5의 결과(융합 루프 항체에 의한 인식 또는 융합 루프 항체의 생성의 결핍)와 조합된 실시예 6의 결과(중화 항체의 생성)는 이들 단백질이 특히 감염의 항체-의존성 증강에 연루된 융합 루프 항체의 생성없이, 뎅기 또는 지카 바이러스(또는 조합하여 두 바이러스 모두)에 대한 방어적 백신의 기초를 형성할 수 있다는 것을 강하게 시사한다.

실시예 8 (도 8) 회복기 뎅기 또는 지카 혈청과 고정된 지카 및 뎅기 야생형(WT) 및 하이퍼글리코실화된(HX) 엑소도메인 단백질의 반응

혈청 인큐베이션 동안 10 ㎍/ml의 농도에서 경쟁 마우스 모노클로날 플라비바이러스 융합 루프 항체 4G2(항-뎅기-혈청형-2 모노클로날 항체)의 존재(회색 막대, 각각의 쌍의 우측) 및 부재(흑색 막대, 각각의 쌍의 좌측)하에 래빗 항-His-태그 모노클로날 항체에 의한 포획에 의해 고체상에 배향된 고정된 지카 및 뎅기 야생형(WT) 및 하이퍼글리코실화된(HX) 엑소도메인 단백질과 뎅기 회복기 혈청 중 항체의 ELISA 반응성(도 8, 상부 패널). 인간 혈청을 1/1000의 일정한 농도에서 시험하였다.

경쟁 마우스 모노클로날 플라비바이러스 융합 루프 항체 4G2의 존재(회색 막대) 및 부재(흑색 막대)하에 고정된 지카 및 뎅기 야생형(WT) 및 하이퍼글리코실화된(HX) 엑소도메인 단백질과 지카 회복기 혈청 중 항체의 ELISA 반응성(도 8, 하부 패널). 조건 및 표지는 상부 패널에서와 동일하였다. 에러 바는 표준 오차였다.

결과는 다음을 나타내었다:

1) 본 발명의 HX 지카 항원은 회복기 뎅기 혈청에 의한 WT 지카 엑소도메인의 오프-표적 인식에 민감하지 않다.

2) 뎅기 혈청에 의한 WT 지카 엑소도메인(알토)의 오프-표적 인식은 VLP에 대해 80% 억제를 일으키는 농도(10마이크로그램/ml)의 용액상에서 4G2(항-융합 루프 모노클로날 항체)에 의해 폐지되기 때문에, 융합-루프 지정 현상이다. (이 경우 고체상에서 항원은 VLP가 아닌 엑소도메인이다).

3) '지카' 회복기 혈청은 3개의 지카 엑소도메인 중 어느 것도 인식하지 못하지만, 그것은 WT 뎅기 2 및 WT 뎅기 4를 강하게 인식한다. 실시예 6에서, 본 발명의 HX 지카 항원 및 알토의 지카 엑소도메인은 형태-의존성 항-지카 중화 항체와의 반응을 나타낸다. 이것은 이러한 특정 지카 혈청(지카 플라크 중화 및 지카 NS1 항체에 대해 양성)이 또 다른 플라비바이러스에 또한 노출된 대상체로부터의 것임을 입증한다. (뎅기 회복기 혈청과 달리) 지카 회복기 혈청은 융합-루프-클로킹된 엑소도메인을 인식하지 않기 때문에, 이러한 기타 다른 플라비바이러스가 뎅기가 아니라는 결론을 내릴 수 있다.

4) 인간 지카 회복기 혈청에 의한 WT 뎅기-2 및 뎅기-4 엑소도메인의 오프-표적 인식은 본 발명의 HX-클로킹된 뎅기 엑소도메인에서는 보여지지 않는다. 이것은 그것이 융합 루프 지정이고, 본 발명에 따라 글리칸-클로킹된 단백질을 사용하지 않는 기타 다른 플라비바이러스 진단 시험에서 위양성을 나타낼 것이라는 것을 시사한다.

5) 인간 지카 회복기 혈청에 의한 WT 뎅기-2 및 뎅기-4 엑소도메인의 오프-표적 인식은 4G2에 의해 완전히 차단되며, 이것은 그것이 융합 루프 지정 현상임을 나타낸다.

6) 뎅기 회복기 혈청은 WT 2 및 4를 무차별적으로 인식하지만, 4의 세트 중에서 d2 엑소도메인을 분명히 선호한다. 이것은 본 발명의 융합 루프 항원이 융합 루프의 글리칸 클로킹으로 인하여 (그의 야생형 등가물 형태와 비교하여) 우수한 선택성을 가져서 뎅기 혈청형들을 구별한다는 것을 입증한다.

서열 목록 자유 텍스트

<참고문헌>

Claims (38)

1. 자연 플라비바이러스 E-단백질 융합 루프 서열에 존재하지 않는 N-연결 글리칸에 대한 적어도 하나의 글리코실화 부위를 포함하며, 여기서 적어도 하나의 글리코실화 부위는 N-연결 글리코실화 세쿠온(Asn-X-Ser/Thr)이고, 세쿠온의 Asn(N) 잔기는 자연 플라비바이러스 E-단백질 융합 루프 아미노산 서열의 위치 98 내지 110(DRGWGNGCGLFGK) 중 어느 하나를 점유하고, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산 잔기이고, Ser/Thr은 세린 또는 트레오닌 잔기를 나타내는 것인 플라비바이러스 E-단백질 융합 루프의 단리된 재조합 유사체.
2. 제1항에 있어서, 자연 플라비바이러스 E-단백질 융합 루프 서열에 존재하지 않는 2개의 글리코실화 부위를 포함하는 플라비바이러스 E-단백질 융합 루프의 단리된 재조합 유사체.
3. 제1항 또는 제2항의 플라비바이러스 E-단백질 융합 루프의 유사체를 포함하는 플라비바이러스 E-단백질의 단리된 재조합 유사체.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 추가의 글리칸이 부착된 유사체.
5. 제4항에 있어서, 상기 적어도 하나의 추가의 글리칸은 N-연결 글리칸인 유사체.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 DNA 또는 RNA 서열의 발현의 생성물인 유사체.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 세쿠온의 Asn(N) 잔기가 위치 98 내지 101 및/또는 106 내지 110 중 어느 하나를 점유하도록 N-연결 글리코실화 세쿠온(Asn-X-Ser/Thr)을 포함하는 유사체.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, X는 다음의 13개의 아미노산 잔기 Gly, His, Asn, Gln, Tyr, Val, Ala, Met, Ile, Lys, Arg, Thr 또는 Ser 중 어느 하나인 유사체.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플라비바이러스 E-단백질은 뎅기 바이러스 E-단백질이고, 세쿠온의 Asn(N) 잔기는 플라비바이러스 E-단백질 융합 루프의 아미노산 서열의 위치 101, 108 또는 101과 108 둘 다를 점유하거나, 또는 플라비바이러스 E-단백질은 지카 E-단백질이고, 세쿠온의 Asn(N) 잔기는 플라비바이러스 E-단백질 융합 루프의 아미노산 서열의 위치 100을 점유하는 것인 유사체.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플라비바이러스는 뎅기 바이러스이고, 유사체 플라비바이러스 E-단백질 융합 루프 98 내지 110의 아미노산 서열은 DRGNGSGCGLNGS, DRGNGSGCGLFGK 및 DRGWGNGCGLNGS로부터 선택되는 것인 유사체.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플라비바이러스는 지카 바이러스이고, 유사체 플라비바이러스 E-단백질 융합 루프 98 내지 110의 아미노산 서열은 DRNHTNGCGLFGK인 유사체.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 플라비바이러스 E-단백질 융합 루프의 유사체를 인코딩하는 서열을 포함하는 단리된 재조합 DNA 또는 RNA 서열.
13. 제12항에 있어서, 플라스미드 또는 선형 DNA-기반 백신인 단리된 재조합 DNA 서열.
14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 포유동물 프로모터의 제어하에 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 플라비바이러스 E-단백질의 유사체를 인코딩하는 단리된 재조합 DNA 서열.
15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 DNA 또는 RNA 서열을 포함하는 숙주 세포.
16. 제12항에 따른 DNA 서열 또는 제13항 또는 제14항에 따른 플라스미드 또는 선형 DNA-기반 백신 면역원을 포함하는 진핵 숙주 세포.
17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 유사체를 발현할 수 있는 숙주 세포.
18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 유사체를 발현 및 글리코실화할 수 있는 숙주 세포.
19. 유사체의 발현에 적합한 조건에서 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 숙주 세포를 배양하고, 유사체를 단리시키는 것을 포함하는, 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 유사체의 제조 방법.
20. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 유사체 및 희석제를 포함하는 조성물.
21. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 유사체를 제약학적으로 허용가능한 희석제, 아쥬반트 및/또는 담체와 함께 포함하는, 조성물로 접종된 대상체에서 면역 반응을 유도할 수 있는 면역원성 (백신) 조성물.
22. 제20항 또는 제21항에 있어서, DEN-1의 유사체, DEN-2의 유사체, DEN-3의 유사체, DEN-4의 유사체 및 지카의 유사체로부터 선택되는 하나 이상의 플라비바이러스 유사체를 포함하는 조성물.
23. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 4개의 뎅기 바이러스 혈청형 DEN-1, DEN-2, DEN-3 및 DEN-4를 나타내는 4개의 뎅기 유사체를 포함하는 조성물.
24. 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 지카 바이러스 유사체를 포함하는 조성물.
25. 제20항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 4개의 뎅기 혈청형 DEN-1, DEN-2, DEN-3 및 DEN-4를 나타내는 4개의 뎅기 유사체 및 지카 바이러스 유사체를 포함하는 조성물.
26. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 유사체에 특이적으로 결합할 수 있는 결합 분자.
27. 제26항에 있어서, 상기 결합 분자는 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 유사체에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 그의 단편, 도메인 항체, 단백질 스캐폴드, 또는 앱타머인 결합 분자.
28. 약제로서 사용하기 위한 제1항 내지 제11항, 제20항 내지 제25항 및 제26항 내지 제27항 중 어느 한 항에 기재된 유사체, 조성물 또는 결합 분자.
29. 제백신으로서 사용하기 위한 제1항 내지 제11항, 제20항 내지 제25항 및 제26항 내지 제27항 중 어느 한 항에 기재된 유사체, 조성물 또는 결합 분자.
30. 플라비바이러스 감염의 예방적 또는 치료적 처리에 사용하기 위한 또는 플라비바이러스 감염의 예방적 또는 치료적 처리를 위한 약제의 제조를 위한 제1항 내지 제11항, 제20항 내지 제25항 및 제26항 내지 제27항 중 어느 한 항에 기재된 유사체, 조성물 또는 결합 분자.
31. 제1항 내지 제11항 및 제20항 내지 제25항 및 제26항 내지 제27항 중 어느 한 항의 유사체, 조성물 또는 결합 분자를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 플라비바이러스에 의한 감염에 대한 대상체의 보호 방법.
32. 진단제로서 사용하기 위한 제1항 내지 제11항, 제20항 내지 제25항 및 제26항 내지 제27항 중 어느 한 항에 기재된 유사체, 조성물 또는 결합 분자.
33. 제1항 내지 제11항 및 제20항 내지 제25항 및 제26항 내지 제27항 중 어느 한 항의 유사체, 조성물 또는 결합 분자 및 상기 단리된 유사체 또는 결합 분자를 함유하는 면역학적 (항원-항체) 복합체를 검출할 수 있는 시약을 포함하는 진단 키트.
34. 제33항에 있어서, 하나 이상의 대조군 표준물 및/또는 시험편 희석제 및/또는 세척 완충제를 더 포함하는 진단 테스트 키트.
35. 제33항 또는 제34항에 있어서, 상기 유사체 및/또는 결합 분자는 고체 지지체 상에 고정된 것인 진단 테스트 키트.
36. 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고체 지지체는 마이크로플레이트 웰인 진단 테스트 키트.
37. 제33항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단리된 유사체 또는 결합 분자를 함유하는 면역학적 복합체는 ELISA에 의해 검출되는 것인 진단 테스트 키트.
38. 제33항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단리된 유사체 또는 결합 분자를 함유하는 상기 면역학적 복합체는 측면 유동에 의해 검출되는 것인 진단 테스트 키트.

Images