JP6983653B2 - ワクチン - Google Patents

Description

本発明は、デング熱の全４種類の血清型−ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３、ＤＥＮＶ−４に対する組み換えデングサブユニットワクチンに関する。本発明は、四価ＥＤＩＩＩ−Ｔ分子およびＢ型肝炎ウイルスの表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を含む組み換えＶＬＰに基づくデング四価ワクチン候補にも関する。本発明は、組み換えＶＬＰ（ウイルス様粒子）に基づくデング四価ワクチン候補の生成のための工程にも関する。

４種類の抗原的に別個のデングウイルス（ＤＥＮＶ）により引き起こされるデング疾患は、世界の１５０を超える国において、特にインドのような非常に流行している国において、重大な健康上の懸念である。この疾患は、この１０年間、増加の一途を辿っており、有効なワクチンまたは抗ウイルス療法がないため、世界規模の公衆衛生学的な脅威となってきた。デング疾患は、特に大流行中は医療システムにとって世界規模の難題であり、媒介動物の駆除のために毎年数百万ドルが費やされている。費用効率が高い、効率的で安全なワクチンがあれば、デングウイルスが蔓延国に課す負担を解決し得る。疾患の拡大を制限するための予防的なワクチンを開発するための過去３０年間にわたる集中的な取り組みにもかかわらず、市場に認可されたワクチンは未だに存在しない。世界中の研究グループ／会社が、デングウイルスの全血清型に対する有効な四価ワクチンを開発するために努力を重ねている。以前の開発ワクチンの殆どが生、弱毒化キメラウイルスに基づくものであり、これらのうち一部は現在臨床治験中である。しかし、ウイルス干渉などの制限ゆえに、研究の焦点は、特にデングウイルスの外被（Ｅ）タンパク質のドメインＩＩＩを使用したサブユニットワクチンに移ってきている。このドメインを利用する多くの特許／刊行物も報告されている。

生フラビウイルスに基づくデングワクチンが第ＩＩＩ相臨床試験に入っているものの、ウイルス干渉ゆえの問題が報告されている。ウイルス干渉は、おそらく４種類のワクチンウイルス株の複製能および免疫原性の相違ゆえに生じる。

非複製サブユニットワクチンは、生ウイルスワクチンと関連するウイルス干渉のリスクを克服する可能性を有する［Ｓｗａｍｉｎａｔｈａｎ，Ｋｈａｎｎａ，Ｎ．（２００９），Ｄｅｎｇｕｅ：Ｒｅｃｅｎｔ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔａｔｕｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．９：１５２−１７３］。組み換えＤＮＡおよびタンパク質に基づくサブユニットワクチンを使用したいくつかのアプローチが研究されている。このような組み換えサブユニットワクチンの殆どは、主要外被（Ｅ）タンパク質に焦点を当てている。多くの証拠から、Ｅタンパク質のワクチン特性の多くがドメインＩＩＩ（ＥＤＩＩＩ）と関連していることがさらに示されている。

ＤＥＮＶ外被ドメインＩＩＩ（ＥＤＩＩＩ）は、宿主細胞受容体の認識および中和抗体の作製に関与することが示されている［Ｓｗａｍｉｎａｔｈａｎ，Ｋｈａｎｎａ，Ｎ．（２００９）．Ｄｅｎｇｕｅ：Ｒｅｃｅｎｔ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔａｔｕｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．９：１５２−１７３；Ｇｕｚｍａｎ，Ｍ．Ｇ Ｈｅｒｍｉｄａ，Ｌ．，Ｂｅｒｎａｒｄｏ，Ｌ，Ｒａｍｉｒｅｚ，Ｒ．，Ｇｕｉｌｌｅｎ，Ｇ．（２０１０）．Ｄｏｍａｉｎ ＩＩ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓ ａ ｄｅｎｇｕｅ ｖａｃｃｉｎｅ ｔａｒｇｅｔ］。さらに、ＥＤＩＩＩは、交差反応性抗体を誘導するための本来備わっている可能性がごく僅かしかないことが報告されている［Ｓｉｍｍｏｎｓ，Ｍ．，Ｎｅｌｓｏｎ，Ｗ．Ｍ．，Ｗｕ，Ｓ．Ｊ．，Ｈａｙｅｓ，Ｃ．Ｇ．（１９９８）．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｄｅｎｇｕｅ ｅｎｖｅｌｏｐｅ Ｂ ｄｏｍａｉｎ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｇａｉｎｓｔ ｄｅｎｇｕｅ ２ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｍｉｃｅ；Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．５８：６５５−６６２；Ｓｉｍｍｏｎｓ，Ｍ．，Ｍｕｒｐｈｙ，Ｇ．Ｓ．，Ｈａｙｅｓ，Ｃ．Ｇ．（２００１）．Ｓｈｏｒｔ ｒｅｐｏｒｔ：ａｎｔｉ−ｂｏｄｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｏｆ ｍｉｃｅ ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｔｅｔｒａｖａｌｅｎｔ ｄｅｎｇｕｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｕｂｕｎｉｔ ｖａｃｃｉｎｅ，Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．６５：１５９−１６１］。これらの性状により、ＥＤＩＩＩは優れたワクチン候補となる。四価タンパク質の形態の潜在的なデングワクチン抗原としてのＥＤＩＩＩの有効性は、発明者らにより既に裏付けられている［Ｅｔｅｍａｄ，Ｂ．，Ｂａｔｒａ，Ｇ，Ｒａｕｔ，Ｒ．，Ｄａｈｉｙａ，Ｓ．，Ｋｈａｎａｍ，Ｓ．，Ｓｗａｍｉｎａｔｈａｎ，Ｓ．，Ｋｈａｎｎａ，Ｎ．（２００８）］。

デングウイルスの外被（Ｅ）タンパク質のドメインＩＩＩを開拓する多くの特許／刊行物、すなわち
Ｓｕｚａｒｔｅ，Ｅ．，Ｇｉｌ，Ｌ，Ｖａｌｄｅｓ，Ｉ．，Ｍａｒｃｏｓ，Ｅ．，Ｌａｚｏ，Ｌ．，Ｉｚｑｕｉｅｒｄｏ，Ａ．，．．．＆ Ｈｅｒｍｉｄａ，Ｌ．（２０１５），Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙが報告されており、ｄｘｖ０１１は、デングウイルスからの４個の凝集したドメインＩＩＩキャプシドタンパク質を組み合わせた新規の四価処方物が、マウスおよびサルにおいて機能的免疫反応を誘導することを開示する。この参考文献は、２つの異なるウイルス領域、外被タンパク質のドメインＩＩＩおよびキャプシドタンパク質に基づく、デングウイルスに対するワクチン候補を教示し、ここではこのＤＩＩＩＣタンパク質の四価処方物が使用された。デング−２ウイルスからの新規キメラタンパク質（ドメインＩＩＩ−キャプシド（ＤＩＩＩＣ−２））は、オリゴデオキシヌクレオチドを組み込む凝集体として提示される場合、抗ウイルスおよび中和抗体、細胞性免疫反応を誘導し、マウスおよびサルに対する顕著な防御を付与した。残りのコンストラクトが既に得られ、的確に特性評価された。これらの証拠に基づき、本研究は、一価および四価処方物としての、各血清型のキメラタンパク質ＤＩＩＩＣのマウスでの免疫反応を評価することを目的とした。本発明者らは、処方物テトラＤＩＩＩＣを形成する混合物での抗原競合なしで、液性および細胞介在性免疫に関して各タンパク質の免疫原性を明らかにした。したがって、マウス脳炎モデルにおける限定的ウイルス負荷により測定されるように、顕著な防御が可能になった。非ヒト霊長類における四価処方物の評価も行った。この動物モデルにおいて、使用される免疫付与経路にかかわらず、この処方物が、中和抗体およびＩＦＮ−γ分泌および細胞傷害能を伴うメモリー細胞介在性の免疫反応を誘導したことが明らかになった。ＤＩＩＩＣタンパク質の四価処方物は、デングウイルスに対する有望なワクチン候補を構成する。

Ｚｕｅｓｔ，Ｒ，Ｖａｌｄｅｓ，Ｉ．，Ｓｋｉｂｉｎｓｋｉ，Ｄ．，Ｌｉｎ，Ｙ．，Ｔｏｈ，Ｙ．Ｘ．，Ｃｈａｎ，Ｋ．，．．．＆ Ｆｉｎｋ，Ｋ．（２０１５），Ｖａｃｃｉｎｅ ３３（１２），１４７４−１４８２は、デングウイルスに対する免疫を付与するための、デング血清型１〜４（テトラＤＩＩＩＣ）のＥドメインＩＩＩおよびキャプシドタンパク質からなる組み換え融合タンパク質の四価処方物の免疫原性を開示する。キャプシドタンパク質がＴ細胞エピトープを含有する一方で、ＥドメインＩＩＩは、効率的な中和抗体に対するエピトープである。ＢおよびＴ細胞エピトープを組み合わせることに加えて、テトラＤＩＩＩＣは、その凝集体型および２成分アジュバントゆえに非常に免疫原性が高い。一価ＤＩＩＩＣ処方物を評価する先行研究後、マウスにおけるテトラＤＩＩＩＣのＴ細胞および抗体反応の質および幅に取り組んだ。テトラＤＩＩＩＣは、全４種類のＤＥＮＶ血清型に対してＴｈ１型反応を誘導し、デング特異的な抗体は主にＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａおよび中和であり、一方で中和抗体の誘導はＩＦＮシグナル伝達に依存した。重要なこととして、ＤＩＩＩＣワクチンアプローチのＴｈ１およびＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａプロファイルは効率的な天然の抗デング反応と同様である。

Ｉｚｑｕｉｅｒｄｏ，Ａ．，Ｇａｒｃｉａ，Ａ．，Ｌａｚｏ，Ｌ．，Ｇｉｌ，Ｌ．，Ｍａｒｃｏｓ，Ｅ．，Ａｌｖａｒｅｚ，Ｍ．，およびＧｕｚｍａｎ，Ｍ．Ｇ．（２０１４），Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１５９（１０），２５９７−２６０４は、ドメインＩＩＩ−Ｐ６４ｋおよびドメインＩＩＩ−キャプシドタンパク質の混合物を含有する四価デングワクチンがマウスにおいて防御反応を誘導することを開示する。この参考文献は、ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）からのＰ６４ｋタンパク質に融合されたデングウイルス（１、３および４型）外被タンパク質のドメインＩＩＩおよび２型デングウイルス（Ｄ２）のドメインＩＩＩを含有するワクチン候補が免疫原性であることが分かったことを教示する。ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）からのＰ６４ｋタンパク質に融合されたデングウイルス外被タンパク質のドメインＩＩＩおよびこの血清型のキャプシドタンパク質に融合された２型（Ｄ２）デングウイルスのドメインＩＩＩを含有する組み換え融合タンパク質は免疫原性であり、この四価処方物で免疫付与したマウスにおいて、致死的曝露に対するマウスでの付与された防御性を評価した。

デング熱に対して最も有効なアプローチと考えられる弱毒生ワクチン（ＬＡＶ）は、この期待を裏切った。最先端のＬＡＶ候補の有効性試験からの最新データから、３０％の全体的な有効性が示され、ＤＥＮＶ−２については有効性がなかった。これにより、デングワクチンを開発するための代替的なアプローチの本格的な探索が必要になった。ＶＬＰに基づくデング四価ワクチン候補、「ＤＳＶ^４」は、開発されるＤＥＮＶの４種類の血清型に対応する全４種類のＥＤＩＩＩを提示するＨＢｓＡｇに基づくＶＬＰである。

最初に、インド国特許第２６１７４９号明細書で開示されるように、ペンタグリシンリンカーを通じて互いに連結される、デングウイルスの全４種類の血清型、デング−１、２、３および４のドメインＩＩＩを含む単一のキメラポリペプチドである、四価ドメインＩＩＩタンパク質（ｒＴＤＩＩＩ）が、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）での発現についてコドン最適化された。

別のインド国特許出願第１２５９／ＤＥＬ／２００７号明細書は、デングウイルスの４種類の血清型、ＤＥＮ−１、ＤＥＮ−２、ＤＥＮ−３およびＤＥＮ−４のそれぞれに対して防御免疫反応を誘発する分泌性シグナルペプチドがあるかまたはない、組み換え外被ドメイン−ＩＩＩに基づく四価タンパク質を開示しているが、このタンパク質は、真核発現系での発現に対してコドン最適化されたポリヌクレオチド配列によりコードされる。

Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）が外来エピトープの提示および表示のためのプラットフォームとなる能力は、マラリアワクチン候補ＲＴＳ，Ｓの成功によってよく例証される。ＥＤＩＩＩ−Ｔの免疫原性を向上させるために、発明者らは、ＨＢｓＡｇがその表示に対してよく働き得るか否かを調べた。したがって、ＨＢｓＡｇとの融合物において、およびＰ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ベクターにおけるＨＢｓＡｇの４個の発現カセットの基礎環境で、ＥＤＩＩＩ−Ｔをクローニングした（図１Ａ）。このＤＳＶ^４の設計は、ＲＴＳ，Ｓと同様であり（対応特許：国際公開第９３１０１５２号パンフレット、メキシコ国特許第９２０６５７４号明細書、欧州特許第０６１４４６５号明細書など）、これはＨＢｓＡｇ ＶＬＰ上でマラリアエピトープを提示する。

本発明の新規性は、ＨＢｓＡｇを伴う、ベクターにおけるＨＢｓＡｇの４個の発現カセットの基礎環境におけるＥＤＩＩＩ−Ｔのコンストラクトにある。したがって、このＥＤＩＩＩ−ＴおよびＨＢｓＡｇの設計（「ＤＳＶ^４」と呼ばれる。）は新規とみなされ得る。本発明の発明性は、提示のためおよびＶＬＰになるように組み立てるための同時発現ＨＢｓＡｇタンパク質のためのプラットフォームとして働くことにより発現タンパク質の免疫原性を向上させるためのＨＢｓＡｇとのＥＤＩＩＩ−Ｔの融合にある。ＤＳＶ^４ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を形成させるために、ＨＢｓＡｇとの融合において、単一組み換え四価ドメイン（ＥＤＩＩＩ−Ｔ）をクローニングし、ＨＢｓＡｇと同時発現させる。サブユニット四価ワクチンＤＳＶ^４は、ＤＥＮＶ血清型特異的な中和抗体を生成させ、デング熱の４種類の血清型のそれぞれに対して有効である。

本発明は、既存の提案されているワクチンを上回る次の長所を有する／有すると予想される。

現在第３相試験下のＳａｎｏｆｉ弱毒生ワクチンは、全４種類の血清型に対する均衡のとれた中和抗体を誘発するために、１２カ月の長期間の投与スケジュールにわたり３回の免疫付与を必要とし（０、６および１２）、一方でＧｌａｘｏ Ｓｍｉｔｈ Ｋｌｉｎｅ（第１相試験中）は、２８日あけて２回投与するタイプの投与スケジュールを目指しており、武田薬品工業（第２相試験完了）では僅か３か月あけて２回投与するという免疫付与計画である。したがって、予備データにより、本発明のワクチンの免疫付与スケジュールは、試験中のＳａｎｏｆｉのワクチンよりも短くなろう。さらに、本発明のワクチンは、単一組み換えタンパク質として全４種類のＤＥＮＶ血清型のＥＤＩＩＩ−ＴおよびＨＢｓＡｇを含み、一方で、Ｓａｎｏｆｉの弱毒生ウイルスワクチンを含む治験中の他の全てのワクチン候補は、４種類の血清型に対応する４種類の候補の混合物である。

さらに、ＨＢｓＡｇとの組み換えＥＤＩＩＩ−Ｔの融合の結果、ＶＬＰの形成および組み換え免疫原性タンパク質およびＢ型肝炎表面抗原の同時発現が起こるだけでなく、デング熱とともにＢ型肝炎に対する防御／免疫付与を提供し得る。これは、二重ワクチンの開発につながり得、デング熱ならびにＢ型肝炎の全ての血清型に対する同時免疫付与がもたらされる。

インド国特許第２６１７４９号明細書 インド国特許出願第１２５９／ＤＥＬ／２００７号明細書 国際公開第９３１０１５２号パンフレット メキシコ国特許第９２０６５７４号明細書 欧州特許第０６１４４６５号明細書

Ｓｗａｍｉｎａｔｈａｎ，Ｋｈａｎｎａ，Ｎ．（２００９），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．９：１５２−１７３ Ｇｕｚｍａｎ，Ｍ．Ｇ Ｈｅｒｍｉｄａ，Ｌ．，Ｂｅｒｎａｒｄｏ，Ｌ，Ｒａｍｉｒｅｚ，Ｒ．，Ｇｕｉｌｌｅｎ，Ｇ．（２０１０） Ｓｉｍｍｏｎｓ，Ｍ．，Ｎｅｌｓｏｎ，Ｗ．Ｍ．，Ｗｕ，Ｓ．Ｊ．，Ｈａｙｅｓ，Ｃ．Ｇ．（１９９８）．Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．５８：６５５−６６２ Ｓｉｍｍｏｎｓ，Ｍ．，Ｍｕｒｐｈｙ，Ｇ．Ｓ．，Ｈａｙｅｓ，Ｃ．Ｇ．（２００１）．Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．６５：１５９−１６１ Ｅｔｅｍａｄ，Ｂ．，Ｂａｔｒａ，Ｇ，Ｒａｕｔ，Ｒ．，Ｄａｈｉｙａ，Ｓ．，Ｋｈａｎａｍ，Ｓ．，Ｓｗａｍｉｎａｔｈａｎ，Ｓ．，Ｋｈａｎｎａ，Ｎ．（２００８） Ｓｕｚａｒｔｅ，Ｅ．，Ｇｉｌ，Ｌ，Ｖａｌｄｅｓ，Ｉ．，Ｍａｒｃｏｓ，Ｅ．，Ｌａｚｏ，Ｌ．，Ｉｚｑｕｉｅｒｄｏ，Ａ．，．．．＆ Ｈｅｒｍｉｄａ，Ｌ．（２０１５），Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｚｕｅｓｔ，Ｒ，Ｖａｌｄｅｓ，Ｉ．，Ｓｋｉｂｉｎｓｋｉ，Ｄ．，Ｌｉｎ，Ｙ．，Ｔｏｈ，Ｙ．Ｘ．，Ｃｈａｎ，Ｋ．，．．．＆Ｆｉｎｋ，Ｋ．（２０１５），Ｖａｃｃｉｎｅ ３３（１２），１４７４−１４８２ Ｉｚｑｕｉｅｒｄｏ，Ａ．，Ｇａｒｃｉａ，Ａ．，Ｌａｚｏ，Ｌ．，Ｇｉｌ，Ｌ．，Ｍａｒｃｏｓ，Ｅ．，Ａｌｖａｒｅｚ，Ｍ．，＆Ｇｕｚｍａｎ，Ｍ．Ｇ．（２０１４），Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１５９（１０），２５９７−２６０４

本発明の重要な目的は、全４種類の血清型−ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３、ＤＥＮＶ−４に対するデングサブユニットワクチンを提供することである。

本発明の別の目的は、組み換えＶＬＰに基づくデング四価ワクチン候補、ＤＳＶ４を提供することである。

本発明のまた別の目的は、デング熱の４種類の血清型、ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３およびＤＥＮＶ−４のそれぞれに対してＤＥＮＶ血清型特異的な中和抗体を生成する組み換えＶＬＰに基づくデング四価ワクチン候補、ＤＳＶ４を提供することである。

本発明のさらなる別の目的は、組み換えＶＬＰに基づくデング四価ワクチン候補の作製のための過程を提供することである。

本発明のさらなる目的は、デングウイルスの全４種類の血清型に対して効率的なおよび安全なワクチン接種アプローチを提供することである。

第一の態様において、本発明は、ＨＢｓＡｇのＮ末端に連結されるデングウイルス血清型ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３およびＤＥＮＶ−４のそれぞれのＥＤＩＩＩドメインを含む組み換えポリペプチドを提供する。

さらなる態様において、本発明は、ＨＢｓＡｇのＮ末端に連結されるデングウイルス血清型ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３およびＤＥＮＶ−４のＥＤＩＩＩドメインを含む組み換えタンパク質をコードする核酸配列を提供する。

さらなる態様において、本発明は、本発明の核酸を用いて形質転換または遺伝子移入され、ＨＢｓＡｇを発現する宿主細胞を提供する。

さらなる態様において、本発明は、本発明の組み換えポリペプチドを含むバイオナノ粒子を提供する。

さらなる態様において、本発明は、適切な条件下で本発明の宿主細胞を培養し、発現される組み換えタンパク質またはバイオナノ粒子を回収することを含む、本発明の組み換えポリペプチドを含むバイオナノ粒子を作製する方法を提供する。

さらなる態様において、本発明は、本発明の組み換えポリペプチドを含むワクチンを提供する。

さらなる態様において、本発明は、本発明のバイオナノ粒子を含むワクチンを提供する。

さらなる態様において、本発明は、本発明の組み換えポリペプチド、本発明のバイオナノ粒子または本発明のワクチンを対象に投与することを含む、デングウイルスを処置または予防する方法を提供する。

さらなる態様において、本発明は、デングウイルスを処置または予防することにおける使用のための、本発明の組み換えポリペプチド、本発明のバイオナノ粒子または本発明のワクチンを提供する。

ＤＳＶ^４の設計：ＥＤＩＩＩ−Ｔ−ＨＢｓＡｇをコードさせるために、ヘキサグリシルリンカーを通じて連結される４種類のＤＥＮＶに対応する４種類のＥＤＩＩＩからなるＥＤＩＩＩ−Ｔを遺伝子操作によりＨＢｓＡｇ（Ｓ）と融合させ、ＨＢｓＡｇの４個の発現カセットを保有するベクターにおいてこれをクローニングした。組み換えプラスミドをＢｇｌＩＩで直線化し、電気穿孔法によりＰ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞に送り込み、ＥＤＩＩＩ−Ｔ−ＨＢｓＡｇおよびＨＢｓＡｇを同時発現するクローンを得た。 メタノール誘導：選択したクローンの非誘導（Ｕ）および誘導（Ｉ）バイオマスをメタノール誘導によって調製し、銀染色およびウエスタンブロッティングにより発現について分析した。銀染色したゲルは、誘導試料におけるＥＤＩＩＩ−Ｔ−ＨＢｓＡｇ（約７２ｋＤａ）およびＨＢｓＡｇ（約２５ｋＤａ）の両方の発現を示す。ＥＤＩＩＩ特異的なｍＡｂを用いたウエスタンブロットにより、ＥＤＩＩＩ−Ｔ−ＨＢｓＡｇが検出され、ＨＢｓＡｇ特異的なｍＡｂを用いて、ＥＤＩＩＩ−Ｔ−ＨＢｓＡｇおよびＨＢｓＡｇの両方が検出される。 ＤＳＶ^４の精製：誘導バイオマスからの精製ＤＳＶ^４の３回の調製（ｐｒｅｐ）。 ＤＳＶ^４のゲルろ過クロマトグラフィー：ＤＳＶ^４は、ゲルろ過クロマトグラフィーに供した場合、ボイド容量で溶出した。銀染色によるボイド容量中のタンパク質の分析から、ＥＤＩＩＩ−Ｔ−ＨＢｓＡｇおよびＨＢｓＡｇの両方の存在が示される。 ＣｓＣｌ超遠心：ＣｓＣｌカラム上での超遠心におけるＥＤＩＩＩ−Ｔ−ＨＢｓＡｇおよびＨＢｓＡｇの共遊走。 ＤＳＶ^４ＶＬＰの電子顕微鏡像：電子顕微鏡下でネガティブ染色で観察される場合の２５〜３５ｎｍのサイズのＤＳＶ^４ＶＬＰ。 ＥＤＩＩＩ配列のソース：対応するＥＤＩＩＩ ａａ配列が派生した各ＤＥＮＶ血清型の遺伝子型。 ＤＳＶ^４抗血清のＥＬＩＳＡ反応性：ＨＢｓＡｇ、ＥＤＩＩＩ−１、ＥＤＩＩＩ−２、ＥＤＩＩＩ−３およびＥＤＩＩＩ−４に対するプールされたＤＳＶ^４抗血清の反応性。紫色の曲線は、ＤＳＶ^４に対する非免疫付与血清の反応性に相当する。 ＤＳＶ^４は、均衡のとれた中和力価を生じさせる：各血清型の（１または複数の）指定される遺伝子型に対するＤＳＶ^４抗血清のＦＡＣＳに基づく中和力価。 プールされた血清での遺伝子型中和幅。 ＤＥＮＶ−１の外被ドメインＩＩＩのアミノ酸配列（配列番号１）およびコード核酸（配列番号５）、 ＤＥＮＶ−２の外被ドメインＩＩＩのアミノ酸配列（配列番号２）およびコード核酸（配列番号６）、 ＤＥＮＶ−３の外被ドメインＩＩＩのアミノ酸配列（配列番号３）およびコード核酸（配列番号７）、 ＤＥＮＶ−４の外被ドメインＩＩＩのアミノ酸配列（配列番号４）およびコード核酸（配列番号８）、 ＨＢｓＡｇのＮ末端のアミノ酸配列（配列番号９）およびコード核酸（配列番号１０）、 ＨＢｓＡｇのＮ末端に連結されるＤＥＮＶ−１、２、３および４からのＥＤＩＩＩを含む本発明の組み換えポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号１１）およびコード核酸（配列番号１２）、斜字体の核酸およびアミノ酸配列はヘキサグリシンリンカーであり、下線を付した核酸およびアミノ酸配列はＫｐｎＩ制限部位の翻訳に由来する。ＥＤＩＩＩは連続してＮ末端からＣ末端に、ＤＮＶ−１、ＤＮＶ−３、ＤＮＶ−４およびＤＮＶ−２の順序である。

本発明は、デングウイルスの全４種類の血清型−ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３およびＤＥＮＶ−４血清型に対するデングサブユニットワクチンを提供する。サブユニットワクチンは、四価ＥＤＩＩＩ−ＴおよびＨＢｓＡｇを含む組み換えタンパク質を含む。本発明はまた、ＤＥＮＶの全４種類の血清型に対するデング疾患の予防のためのＶＬＰに基づく四価ワクチン候補を含むサブユニットワクチンにも関する。

ある態様において、本発明は、ＨＢｓＡｇのＮ末端にインフレームで連結されるデングウイルス血清型ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３およびＤＥＮＶ−４のＥＤＩＩＩドメインを含む組み換えタンパク質をコードする核酸配列を提供する。デングウイルス血清型ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３およびＤＥＮＶ−４のＥＤＩＩＩドメインのそれぞれをコードするヌクレオチド配列は、あらゆる順序でＨＢｓＡｇのＮ末端と連結され得る。

好ましくは、本核酸配列は、それぞれ配列番号１、２、３および４のアミノ酸配列を有するデングウイルス血清型ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３およびＤＥＮＶ−４のそれぞれのＥＤＩＩＩドメインをコードする。好ましくは、デングウイルス血清型ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３およびＤＥＮＶ−４のＥＤＩＩＩドメインのそれぞれをコードする核酸配列は、それぞれ配列番号５、６、７および８である。

好ましくは、本核酸配列は、配列番号９のアミノ酸配列を有するＨＢｓＡｇをコードする。好ましくは、ＨＢｓＡｇをコードする核酸配列は配列番号１０である。

ある実施形態において、核酸配列は、配列番号１０のＮ末端とインフレームで連結される配列番号５、６、７および８のヌクレオチド配列のそれぞれを含む。ヌクレオチド配列、配列番号５、６、７および８は、あらゆる順序で配列番号１０のＮ末端と連結され得る。

好ましくは、本核酸配列は、デングウイルス血清型ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３およびＤＥＮＶ−４のＥＤＩＩＩドメインのそれぞれを連結するリンカーをコードする。好ましくは、この核酸は、可動性リンカー、最も好ましくはヘキサグリシンリンカーをコードする。好ましくは、本核酸配列は、ＨＢｓＡｇのＮ末端にデングウイルス血清型ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３およびＤＥＮＶ−４のＥＤＩＩＩドメインを連結するリンカーをコードする。好ましくは、この核酸は、可動性リンカー、最も好ましくはヘキサグリシンリンカーをコードする。

好ましくは、本核酸配列は、配列番号１１のアミノ酸配列を有する組み換えポリペプチドをコードする。好ましくは、組み換えポリペプチドをコード核酸配列は、配列番号１２の核酸配列である。

ある実施形態において、本核酸配列は、酵母での発現に対して、好ましくはＰ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）での発現に対して最適化されたコドンである。ある実施形態において、本核酸は発現ベクターである。

ある態様において、本発明は、本発明の核酸を用いて形質転換または遺伝子移入され、ＨＢｓＡｇを発現する宿主細胞に関する。ある実施形態において、宿主細胞は、ＨＢｓＡｇをコードする核酸配列を用いて形質転換されるかまたは遺伝子移入される。好ましくは、宿主細胞は、ＨＢｓＡｇを発現する１、２、３、４個またはそれ以上の核酸配列を用いて形質転換されるかまたは遺伝子移入される。ある実施形態において、宿主細胞は酵母である。最も好ましくは、宿主細胞はＰ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）である。

ある態様において、本発明は、ＨＢｓＡｇのＮ末端に連結されるデングウイルス血清型ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３およびＤＥＮＶ−４のそれぞれのＥＤＩＩＩドメインを含む組み換えポリペプチドを提供する。デングウイルス血清型ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３およびＤＥＮＶ−４のＥＤＩＩＩドメインのそれぞれをコードするアミノ酸配列は、あらゆる順序でＨＢｓＡｇのＮ末端と連結され得る。好ましくは、デングウイルス血清型ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３およびＤＥＮＶ−４のＥＤＩＩＩドメインは、連続してＮ末端からＣ末端に、配列ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−３、ＤＥＮＶ−４およびＤＥＮＶ−２で融合される。

好ましくは、デングウイルス血清型ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３およびＤＥＮＶ−４のそれぞれのＥＤＩＩＩドメインのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１、２、３および４である。好ましくは、ＨＢｓＡｇのＮ末端は、配列番号９のポリペプチド配列を有する。好ましくは、組み換えポリペプチドは、配列番号９のＮ末端に連結されるアミノ酸配列、配列番号１、２、３および４のそれぞれを含む。アミノ酸配列、配列番号１、２、３および４は、あらゆる順序で配列番号９のＮ末端と連結され得る。好ましくは、組み換えポリペプチドは、連続的にＮ末端からＣ末端に、配列、配列番号１、配列番号３、配列番号４および配列番号２で、アミノ酸配列、配列番号１、２、３および４を含む。

好ましくは、デングウイルス血清型ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３およびＤＥＮＶ−４のそれぞれのＥＤＩＩＩドメインは、リンカーにより、好ましくは可動性リンカー、最も好ましくはヘキサグリシンリンカーにより連結される。好ましくは、ＥＤＩＩＩドメインは、リンカーにより、好ましくは可動性リンカー、最も好ましくはヘキサグリシンリンカーによりＨＢｓＡｇのＮ末端に連結される。

ある態様において、組み換えポリペプチドは、配列番号１１のアミノ酸配列を有する。

本発明の形質転換または遺伝子移入宿主細胞は、ＨＢｓＡｇおよび本発明の組み換えポリペプチドの両方を合成する。発明者らは、これらの２つのポリペプチドが自発的に共集合してバイオナノ粒子となることを示した。ある態様において、本発明は、ＨＢｓＡｇおよび本発明の本発明の組み換えポリペプチドを含むバイオナノ粒子を含む。

ある態様において、本発明は、適切な条件下で本発明の宿主細胞を培養し、発現された組み換えタンパク質またはバイオナノ粒子を回収することを含む、組み換えタンパク質またはバイオナノ粒子を調製する方法を提供する。

ある態様において、本発明は、本発明の組み換えポリペプチドまたはバイオナノ粒子を含むワクチンに関する。好ましくは、本ワクチンは、医薬的に許容可能な担体または適切な希釈剤中で本発明の組み換えポリペプチドまたはバイオナノ粒子を含む。

ある態様において、本発明は、本発明の組み換えタンパク質、バイオナノ粒子またはワクチンを対象に投与することを含む、デングウイルスを処置または予防する方法を提供する。ある実施形態において、デングウイルスは、血清型ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３またはＤＥＮＶ−４である。

図１Ａで示されるような可動性グリシルリンカーを通じて一緒に連結された全４種類のＥＤＩＩＩを含有するように設計された、四価ＥＤＩＩＩに基づく分子、ＥＤＩＩＩ−Ｔが開発された。ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）においてＥＤＩＩＩ−Ｔを発現させ、精製し、マウスにおいて免疫原性であることが分かった。ＥＤＩＩＩ−Ｔ分子の構築は、インド国特許第２６１７４９号明細書で提供される。

Ｂ型肝炎ウイルスの表面抗原（ＨＢｓＡｇ）が外来エピトープの提示および表示のためのプラットフォームとなる能力は、国際公開第９３／１０１５２号パンフレットで、マラリアワクチン候補ＲＴＳ，Ｓの成功によりよく例証される。

本発明は、ＨＢｓＡｇが、ＥＤＩＩＩ−Ｔの免疫原性を向上させるために働き得るか否かの可能性を探る。したがって、図１Ａで示されるように、ＨＢｓＡｇとの融合において、およびＰ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ベクターにおけるＨＢｓＡｇの４個の発現カセットの基礎環境で、ＥＤＩＩＩ−Ｔをクローニングした。このＥＤＩＩＩ−ＴおよびＨＢｓＡｇの構造は「ＤＳＶ^４」と呼ばれ、ＨＢｓＡｇ ＶＬＰ上でマラリアエピトープを提示する、国際公開第９３１０１５２号パンフレットのＲＴＳ，Ｓのものと同等である。

Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）において電気穿孔法により組み換えプラスミドを送り込み、クローンのメタノール誘導により、ＥＤＩＩＩ−Ｔ−ＨＢｓＡｇおよびＨＢｓＡｇタンパク質の同時発現についてコロニーをスクリーニングした。図１Ｂで示されるようにこの２種類のタンパク質を同時発現する陽性クローンのうち１個をさらなる実験のために選択した。誘導バイオマスを溶解させ、膜に結合するタンパク質を抽出し、３００ｋＤａ膜を通じた透析に供した。この段階は、２つの同時発現タンパク質が集合してＤＳＶ^４ ＶＬＰになることを考慮して、大きいサイズのタンパク質の濃縮を可能にするように設計した。図１Ｃで示されるように高純度でフェニル６００Ｍ樹脂を通じて残余分を精製した。

図２Ａで示されるようなゲルろ過、図２Ｂで示されるようなＣｓＣｌ超遠心および図２Ｃで示されるような電子顕微鏡を通じて、同時発現タンパク質が集合してＶＬＰになる能力を評価した。ＤＳＶ^４のタンパク質構成要素の両方が図２Ａで示されるようにゲルろ過中にボイド容量中で一緒に溶出され、図２Ｂで示されるようにＣｓＣｌ超遠心中に共遊走したことが観察された。電子顕微鏡下で可視化した場合、これらは、図２Ｃで示されるように、集合して２５〜３５ｎｍのＶＬＰとなることが観察された。

サンドイッチＥＬＩＳＡ方式において特徴がよく分かっているｍＡｂによる重大な意味があるＥＤＩＩＩエピトープの認識を通じて、ＤＳＶ^４ ＶＬＰにおける全４種類のＤＥＮＶのＥＤＩＩＩの立体構造的な整合性（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）を評価した。

図３で示されるように、ＢＡＬＢ／ｃマウスでの免疫付与によって、これらのＶＬＰがこの４種類のＤＥＮＶ血清型に対して強い免疫反応を開始させる可能性を評価した。第０、３０および９０日に６匹のＢＡＬＢ／ｃマウスの群において腹腔内に精製ＤＳＶ^４ ＶＬＰで免疫付与を行った（ＰＢＳ中アルハイドロゲル／１００μＬとして２０μｇ／５００μｇ Ａｌ）。第１００日に終了時血液（Ｔｅｒｍｉｎａｌ ｂｌｅｅｄ）を採取し、ＥＬＩＳＡによってＤＳＶ^４に対する反応について分析した。陽性反応者からの血清をプールし、全てのその５つの構成要素、すなわちＥＤＩＩＩ−１、ＥＤＩＩＩ−２、ＥＤＩＩＩ−３、ＥＤＩＩＩ−４およびＨＢｓＡｇに対する抗体の反応について特性評価した（図３Ｂ）。これらの全てに対して強い免疫反応が生じたことが観察された。抗デング反応が４つのＤＥＮＶを中和可能であったか否かを判定することは必須であった。したがって、ＦＡＣＳに基づくアッセイを通じて、プールした血清をその中和能について評価し、実際にＤＳＶ^４−抗血清は、全４種類のＤＥＮＶを中和可能であったことが観察された（図３Ｃ）。図３Ａは、ＤＳＶ^４の設計および対応するＥＤＩＩＩａａ配列が得られた株を図示する。図３Ｃは、（指定される株の）４種類のＤＥＮＶおよびＤＥＮＶ−３の２つのさらなる遺伝子型の株に対するＤＳＶ^４−抗血清の中和力価を説明する。中和アッセイで使用されるＤＥＮＶ−２、−３および−４遺伝子型は、ＥＤＩＩＩ配列が得られた遺伝子型とは異なり、これがＤＳＶ^４抗血清の中和の可能性に悪影響を与えなかったことが明らかであり、このことから、生じた免疫反応の強度が高いことが示される。さらに、様々な遺伝子型に対する全体的な反応も均衡がとれていると思われ、図３Ｄで示されるように有望なデングワクチンとしてＤＳＶ^４が候補に上がる。ＤＳＶ４は、評価される様々なアジュバントを用いて同等な程度まで有効であると思われる（図３Ｄ）。

本発明を次の実施例に関して説明するが、これらの実施例は、本発明を単に説明し、明らかにするために含まれる。これらの具体例は、何ら、本発明の範囲を制限するものとして解釈されるべきものではない。

［実施例１］：組み換えＶＬＰに基づくデング四価ワクチン候補の構築
図１Ａで示されるように、ＨＢｓＡｇとの融合において、およびＰ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ベクターにおけるＨＢｓＡｇの４個の発現カセットの基礎環境で、ＥＤＩＩＩ−Ｔをクローニングした。このＥＤＩＩＩ−ＴおよびＨＢｓＡｇの構造は「ＤＳＶ^４」と称するＰ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）において電気穿孔法により組み換えプラスミドを送り込み、クローンのメタノール誘導により、ＥＤＩＩＩ−Ｔ−ＨＢｓＡｇおよびＨＢｓＡｇタンパク質の同時発現についてコロニーをスクリーニングした。

［実施例２］：デング四価ワクチン候補−ＤＳＶ^４の特性評価
図１Ｂで示されるようにこの２種類のタンパク質を同時発現する陽性クローンのうち１個をさらなる実験のために選択した。誘導バイオマスを溶解させ、膜に結合するタンパク質を抽出し、３００ｋＤａ膜を通じた透析に供した。この段階は、２つの同時発現タンパク質が集合してＤＳＶ^４ ＶＬＰになることを考慮して、大きいサイズのタンパク質の濃縮を可能にするように設計した。図１Ｃで示されるように高純度でフェニル６００Ｍ樹脂を通じて残余分を精製した。

［実施例３］：ＶＬＰの同定および特性評価
図２Ａで示されるようなゲルろ過、図２Ｂで示されるようなＣｓＣｌ超遠心および図２Ｃで示されるような電子顕微鏡を通じて、同時発現タンパク質が集合してＶＬＰになる能力を評価した。ＤＳＶ^４のタンパク質構成要素の両方が図２Ａで示されるようにゲルろ過中にボイド容量中で一緒に溶出され、図２Ｂで示されるようにＣｓＣｌ超遠心中に共遊走したことが観察された。電子顕微鏡下で可視化した場合、これらは、図２Ｃで示されるように、集合して２５〜３５ｎｍのＶＬＰとなることが観察された。

［実施例４］：ｍＡｂによるＤＳＶ^４ ＶＬＰにおける全４種類のＤＥＮＶの立体構造的な整合性（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）の評価
サンドイッチＥＬＩＳＡ方式において、特徴がよく分かっているｍＡｂによる重大な意味があるＥＤＩＩＩエピトープの認識を通じて、ＤＳＶ^４ ＶＬＰにおける全４種類のＤＥＮＶのＥＤＩＩＩの立体構造的な整合性（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）を評価した。デング特異的なｍＡｂでマイクロタイターウェルをコーティングし、ＤＳＶ^４ ＶＬＰを添加した。ペルオキシダーゼ標識抗ＨＢｓＡｇヘプノスティカ（Ｈｅｐｎｏｓｔｉｋａ）を通じて、結合したＶＬＰが明らかになった。これらのｍＡｂの殆どは、強い中和免疫反応を生じさせるのに必須であると考えられる、ＥＤＩＩＩのＡ鎖および外側隆線領域（ｌａｔｅｒａｌ ｒｉｄｇｅ ｒｅｇｉｏｎ）に対するものであった。２１種類のデング熱ｍＡｂ（ＥＤＩＩＩおよび非ＥＤＩＩＩ特異的なｍＡｂ）によるＤＳＶ^４のＥＬＩＳＡ反応性を表１で説明し、この結果から、全４種類のＤＥＮＶのＥＤＩＩＩエピトープがＤＳＶ^４ ＶＬＰにおいてインタクトであることが示される。

［実施例５］：精製ＤＳＶ^４ ＶＬＰによるマウスの免疫付与
図３で示されるように、ＢＡＬＢ／ｃマウスでの免疫付与によって、これらのＶＬＰがこの４種類のＤＥＮＶ血清型に対して強い免疫反応を開始させる可能性を評価した。第０、３０および９０日に６匹のＢＡＬＢ／ｃマウスの群において腹腔内に精製ＤＳＶ^４ＶＬＰで免疫付与を行った（ＰＢＳ中アルハイドロゲル／１００μＬとして２０μｇ／５００μｇ Ａｌ）。第１００日に終了時血液（Ｔｅｒｍｉｎａｌ ｂｌｅｅｄ）を採取し、ＥＬＩＳＡによってＤＳＶ^４に対する反応について分析した。陽性反応者からの血清をプールし、図３Ｂで示されるように、全てのその５つの構成要素、すなわちＥＤＩＩＩ−１、ＥＤＩＩＩ−２、ＥＤＩＩＩ−３、ＥＤＩＩＩ−４およびＨＢｓＡｇに対する抗体の存在について特性評価し、図３Ｄで示されるように、様々なアジュバントとともに生じたＤＳＶ^４抗血清のさらなる遺伝子型中和幅を決定した。

免疫反応
これらの５つの構成要素、すなわちＥＤＩＩＩ−１、ＥＤＩＩＩ−２、ＥＤＩＩＩ−３、ＥＤＩＩＩ−４およびＨＢｓＡｇの全てに対して強い免疫反応が生じたことが観察された。抗デング反応が４つのＤＥＮＶを中和可能であったか否かを判定することは必須であった。したがって、ＦＡＣＳに基づくアッセイを通じてその中和能についてプールした血清を評価し、実際にＤＳＶ^４抗血清は、４種類のＷＨＯ参考株ＤＥＮＶおよびＤＥＮＶ−３の２つのさらなる遺伝子型の株に対してＤＳＶ^４−抗血清の中和力価を説明する図３Ｃで示されるように、全４種類のＤＥＮＶを中和可能であったことが観察された。中和アッセイで使用されるＤＥＮＶ−２、−３および−４遺伝子型は、ＥＤＩＩＩ配列が得られた遺伝子型とは異なり、これがＤＳＶ^４抗血清の中和の可能性に悪影響を与えなかったことが明らかであり、このことから、生じた免疫反応の強度が高いことが示される。さらに、様々な血清型に対する全体的な反応も均衡がとれていると思われ、有望なデングワクチンとしてＤＳＶ^４が候補に挙がる。以下の表２は、血清型特異的な中和Ａｂを誘発するＥＤＩＩＩ−３−ＭＢＰにおけるＦＮＴ枯渇後（ｐｏｓｔ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）を説明する。

本発明はまた、次の具体的な態様も含む：
態様１．四価ＥＤＩＩＩ−Ｔ分子およびＢ型肝炎ウイルスの表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を含む組み換えＶＬＰに基づくデング四価ワクチン候補。

態様２．ＤＳＶ^４と呼ばれる組み換えＶＬＰに基づくデング四価ワクチン候補。

態様３．四価ＥＤＩＩＩ分子がＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３およびＤＥＮＶ−４のＥＤＩＩＩを含む、組み換えＶＬＰに基づくデング四価ワクチン候補、ＤＳＶ^４。

態様４．ＤＳＶ^４が、ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３およびＤＥＮＶ−４に対してＤＥＮＶ血清型特異的な中和抗体を生じさせる、本発明の態様２に記載されるような組み換えＶＬＰに基づくデング四価ワクチン候補。

態様５．請求項１に記載のような組み換えＶＬＰに基づくデング四価ワクチン候補の作製のための過程は、次の段階を含む：
ｉ）ＨＢｓＡｇの４個の発現カセットを保有する組み換えコンストラクト中でのＨＢｓＡｇとの融合におけるＥＤＩＩＩ−Ｔのクローニング、
ｉｉ）ＥＤＩＩＩ−Ｔ−ＨＢｓＡｇおよびＨＢｓＡｇを同時発現するクローンを得るための、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞への組み換えプラスミドの電気穿孔法。

ｉｉｉ）ＥＤＩＩＩ−Ｔ−ＨＢｓＡｇおよびＨＢｓＡｇタンパク質の同時発現に対するスクリーニング、
ｉｖ）銀染色およびウエスタンブロッティングによりＥＤＩＩＩ−Ｔ−ＨＢｓＡｇおよびＨＢｓＡｇタンパク質の発現を分析すること、
ｖ）誘導されるバイオマスの溶解、
ｖｉ）膜に結合するタンパク質の抽出および透析に供すること、
ｖｉｉ）ＤＳＶ^４の精製。

態様６．段階（ｉｉｉ）のスクリーニングがクローンのメタノール誘導により行われる、態様５に記載のような過程。

態様７．態様１に記載のような組み換えＶＬＰに基づくデング四価ワクチン候補を含む、デングサブユニットワクチン。

態様８．デングウイルスのＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３およびＤＥＮＶ−４血清型に対して活性がある、態様７に記載のようなデングサブユニットワクチン。

態様９．腹腔内にまたは筋肉内に投与され得る、態様８に記載のようなデングサブユニットワクチン。

態様１０．四価ＥＤＩＩＩ−Ｔ分子およびＢ型肝炎ウイルスの表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を含むデングサブユニットワクチン候補としての使用のための組み換えＶＬＰに基づくデング四価ワクチン候補。

Claims (12)

1. ウイルス様粒子であって、
   ａ）組み換えポリペプチド、および
   ｂ）４ユニットのＨＢｓＡｇポリペプチドを含み、
   該組み換えポリペプチドがＨＢｓＡｇのＮ末端に連結されるデングウイルス血清型ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３およびＤＥＮＶ−４のそれぞれのＥＤＩＩＩドメインを含み、前記ＥＤＩＩＩドメインは連続してＮ末端からＣ末端に配列ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−３、ＤＥＮＶ−４およびＤＥＮＶ−２で融合され、デングウイルス血清型ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３およびＤＥＮＶ−４のそれぞれのＥＤＩＩＩドメインのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１、２、３及び４である、前記ウイルス様粒子。
2. ａ）ＨＢｓＡｇのＮ末端に連結されるデングウイルス血清型ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３およびＤＥＮＶ−４のＥＤＩＩＩドメインを含む組み換えポリペプチド、および
   ｂ）４ユニットのＨＢｓＡｇポリペプチド
   をコードするポリヌクレオチドであって、発現された核酸の前記ＥＤＩＩＩドメインは連続してＮ末端からＣ末端に配列ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−３、ＤＥＮＶ−４およびＤＥＮＶ−２で融合され、デングウイルス血清型ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３およびＤＥＮＶ−４のそれぞれのＥＤＩＩＩドメインのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１、２、３及び４である、前記ポリヌクレオチド。
3. 請求項２のポリヌクレオチドを含むように請求項２に記載のポリヌクレオチドを用いて形質転換または遺伝子移入され、ＨＢｓＡｇを発現する、宿主細胞。
4. ａ）ＨＢｓＡｇのＮ末端に連結されるデングウイルス血清型ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３およびＤＥＮＶ−４のそれぞれのＥＤＩＩＩドメインを含む組み換えポリペプチド、および
   ｂ）４ユニットのＨＢｓＡｇポリペプチド
   を含む、バイオナノ粒子であって、前記ＥＤＩＩＩドメインは連続してＮ末端からＣ末端に配列ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−３、ＤＥＮＶ−４およびＤＥＮＶ−２で融合され、デングウイルス血清型ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３およびＤＥＮＶ−４のそれぞれのＥＤＩＩＩドメインのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１、２、３及び４である、前記バイオナノ粒子。
5. バイオナノ粒子を作製する方法であって、適切な条件下で請求項３に記載の宿主細胞を培養する段階と、発現される組み換えタンパク質を回収する段階とを含み、前記ＥＤＩＩＩドメインは連続してＮ末端からＣ末端に配列ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−３、ＤＥＮＶ−４およびＤＥＮＶ−２で融合され、デングウイルス血清型ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３およびＤＥＮＶ−４のそれぞれのＥＤＩＩＩドメインのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１、２、３及び４である、前記方法。
6. ａ）組み換えポリペプチド、および
   ｂ）４ユニットのＨＢｓＡｇポリペプチド
   を含むワクチンであって、該組み換えポリペプチドがＨＢｓＡｇのＮ末端に連結されるデングウイルス血清型ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３およびＤＥＮＶ−４のそれぞれのＥＤＩＩＩドメインを含み、前記ＥＤＩＩＩドメインは連続してＮ末端からＣ末端に配列ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−３、ＤＥＮＶ−４およびＤＥＮＶ−２で融合され、デングウイルス血清型ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３およびＤＥＮＶ−４のそれぞれのＥＤＩＩＩドメインのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１、２、３及び４である、前記ワクチン。
7. 請求項４に記載のバイオナノ粒子を含む、ワクチン。
8. ａ）組み換えポリペプチド、および
   ｂ）４ユニットのＨＢｓＡｇポリペプチド
   を含む、デングウイルスを処置または予防するためのワクチンであって、該組み換えポリペプチドがＨＢｓＡｇのＮ末端に連結されるデングウイルス血清型ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３およびＤＥＮＶ−４のそれぞれのＥＤＩＩＩドメインを含み、前記ＥＤＩＩＩドメインは連続してＮ末端からＣ末端に配列ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−３、ＤＥＮＶ−４およびＤＥＮＶ−２で融合され、デングウイルス血清型ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３およびＤＥＮＶ−４のそれぞれのＥＤＩＩＩドメインのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１、２、３及び４である、前記ワクチン。
9. デングウイルス感染を処置または予防することにおける使用のための、請求項１に記載のウイルス様粒子、請求項４に記載のバイオナノ粒子または請求項６もしくは請求項７に記載のワクチン。
10. ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む四価デングワクチンであって、該ウイルス様粒子が、
    ａ）下記式のとおりＨＢｓＡｇポリペプチドのＮ末端に連結されるデングウイルス血清型ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３およびＤＥＮＶ−４のそれぞれのＥＤＩＩＩドメインを含む組み換えポリペプチド
    

    

    
    ［式中、点線はリンカーであり、デングウイルス血清型ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３およびＤＥＮＶ−４のそれぞれのＥＤＩＩＩドメインのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１、２、３及び４である］、および
    ｂ）４ユニットのＨＢｓＡｇポリペプチド
    を含む、前記ワクチン。
11. ４つのデングウイルス血清型ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３およびＤＥＮＶ−４のそれぞれに対する中和抗体力価の誘導において使用するための請求項６または７のいずれかに記載のワクチン。
12. デングウイルス感染の治療または予防における使用のための請求項６または７のいずれかに記載のワクチン。

Images