CN103193870B

CN103193870B - 一种登革病毒简并疫苗及其应用

Info

Publication number: CN103193870B
Application number: CN201310140259.1A
Authority: CN
Inventors: 饶贤才; 杨杰; 胡珍; 胡晓梅; 陈炜
Original assignee: Third Military Medical University TMMU
Current assignee: Third Military Medical University TMMU
Priority date: 2013-04-22
Filing date: 2013-04-22
Publication date: 2014-10-22
Anticipated expiration: 2033-04-22
Also published as: CN103193870A

Abstract

本发明涉及一种登革病毒简并疫苗及其应用。所述登革病毒简并疫苗的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，具备包含血清型分别为1,2,3,4的登革病毒代表株进行序列比较分析后确定的抗原肽段；登革病毒包膜糖蛋白EDIII区以及与病毒毒力相关基因的中和表位；保留组成登革病毒包膜糖蛋白EDIII区基本结构的β片层及Loop环氨基酸。本发明的登革病毒简并疫苗免疫机体，可以激发机体产生体液免疫应答，能够用于预防登革病毒感染性疾病。

Description

一种登革病毒简并疫苗及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种登革病毒简并疫苗及其制备方法和应用。

背景技术

登革病毒(dengue virus,DV)是黄病毒属(Flaviviridae)有包膜的单股正链RNA病毒，以蚊虫为媒介，广泛流行于热带和亚热带地区。DV感染所致的人类登革热(classical dengue fever,DF)和登革出血热/登革休克综合征(dengue hemorrhagic fever/dengue shock syndrome,DHF/DSS)严重危害人类健康。全球有25～30亿人生活在流行区内，每年有1亿以上的人遭受感染，DHF病例约50万,死亡率5～20％，如治疗不及时可达50％。近年来，随着全球气候变暖、人口流动、生态环境恶化、蚊媒分布区域扩展等诸多原因，登革热流行的范围和频率不断增加，WHO已将DHF/DSS、肝炎、疟疾、结核列为全球流行最严重的传染病（Murgue B.2010）。我国海南、广东、广西、福建、浙江和台湾等地区也都是重点流行区域，多次发生DF，DHF/DSS的爆发流行。但时至今日，对DV感染性疾病尚无特异的治疗手段，也无安全有效的疫苗问世(Mathew A.et al.2008)。自然界存在的登革病毒有四种血清型（DV-1-4），感染其中的任何一型均可产生对此种血清型病毒的终身免疫，但不同型之间的交叉保护性免疫较为短暂，并且病毒感染产生的非中和抗体还可介导抗体依赖的感染增强现象(Antibody-dependent enhancement,ADE)，导致严重的DHF和DSS的发生（Morens DM,et al.1987）。因此，对1-4型DV的有效免疫分子展开深入研究，并从中发掘有效的治疗策略和途径，研制出可同时针对四种血清型病毒的疫苗是当前登革热控制的当务之急。

要认识DV的有效免疫分子，首先得从DV的结构入手。DV基因组（约11kb）可编码3种结构蛋白（衣壳蛋白C,基质蛋白M和包膜糖蛋白E）和7种非结构蛋白（NS1,NS2A,NS2B,NS3,NS4A,NS4B和NS5）(Leyssen P,et al.2000)。其中，糖蛋白E位于DV包膜上，是DV吸附靶细胞的重要功能蛋白(Modis Y,et al.2004)，由三个功能区构成：中心区（Domain I），二聚体形成区（Domain II）和一个受体结合区（Domain III）。DV E蛋白DⅢ区是决定病毒与受体结合的关键结构域，由E蛋白的295～392位残基构成，没有糖基化位点，但有一对二硫键（Cys302-Cys333）对维持其结构很重要，残基382-386形成一个受体结合Loop环，是DV识别和结合靶细胞上病毒受体的重要功能位点，决定着DV感染的靶细胞种类和组织嗜性(Matsui K,et al.2009)。虽然DV的受体尚未确定，但利用纯化的DV E蛋白DⅢ区（EDIII）及其抗血清可在体外阻断DV的感染(Batra G,et al.2010)，证实了E DⅢ区是DV识别靶细胞上病毒受体的功能域,且有保护功能。

古巴PCT/CU2006/000015公开了Ｅ蛋白的表面的保守区域用于预防和／或治疗由登革病毒1-4和其他黄病毒引起的感染，涉及嵌合蛋白质，其用作疫苗或用于针对登革病毒的4种血清型和其他黄病毒的预防性或治疗性治疗。但因血清型别的差异，交叉保护作用弱。

古巴PCT/CU1998/000001公开了登革病毒的前M/M蛋白的表位、合成肽，涉及5种登革2型病毒前M/M蛋白的合成肽，能激发抗四种登革病毒血清型的中和抗体。但登革病毒的preM/M蛋白有很强的非中和表位（Dejnirattisai M,et al.Science,2010）,由此引发的抗体依赖的感染增强现象（ADE）不容忽视。

印度Etemad B等（2008）和我国学者Chen S等（2007）将4种血清型登革病毒E蛋白的特定区域融合在一起，构建成4价重组蛋白疫苗，在动物水平有一定保护作用，中和滴度为1:47-1:588，对各型DV的保护力差异较大，不利于推广。

美国Bowen等（2012）公开了一种用计算机根据671株DV EDIII蛋白序列设计的物理、化学一致性EDIII蛋白结合抗体的方法，产生的抗体虽然保护范围广，但特异性较差，可能对特异流行株感染的保护效果不佳，不利于推广。

法国Sabchareon等（2012）报道的首个登革热疫苗—CYD-TDV重组减毒四价登革病毒疫苗能够对1,3和4型登革热病毒株具有免疫作用，但其整体效果并不理想，它对于在泰国最常见的2型登革热病毒株起不了任何防护作用。

综上所述，本领域急切需求安全性好，对1-4型登革病毒均具有较好保护效力的优质疫苗。

发明内容

本发明的目的在于提供一种安全、新型、免疫效果好，适于产业化生产的疫苗。该疫苗融合了血清型为1,2,3,4型登革病毒保护性抗原组分，可刺激机体产生免疫应答，可以用于预防登革病毒感染性疾病。

本发明提供的登革病毒简并疫苗，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。具体地，该氨基酸序列包含：

1）血清型分别为1,2,3,4的登革病毒代表株进行序列比较分析后确定的抗原肽段；具体地为曾在世界广泛流行的1-4型登革病毒株进行序列比较分析后确定的抗原肽段；再依据此肽段进行人工设计；

2）登革病毒包膜糖蛋白EDIII区以及与病毒毒力相关基因的中和表位；

3）组成登革病毒包膜糖蛋白EDIII区基本结构的β片层及Loop环氨基酸。

具体地，所述的EDIII区为1-4型登革病毒胞膜糖蛋白289-400位氨基酸残基之间的序列。

具体地，所述的Loop环氨基酸为2型登革病毒胞膜糖蛋白382-386位氨基酸。

本发明还提供编码上述登革病毒简并疫苗的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明还提供一种重组表达载体，其含有上述的编码上述登革病毒简并疫苗的基因。

本发明还提供一种转化体，其含有上述的重组表达载体。

本发明提供的登革病毒简并疫苗能够用于制备预防登革病毒感染性疾病的制剂，该制剂包含药学上可接收的载体；本发明提供的登革病毒简并疫苗还能够用于制备抗登革病毒的抗体。

本发明提供的上述重组表达载体能够用于制备登革病毒简并疫苗。

可预防的登革病毒病由如下四种血清型登革病毒中的至少一种引起：DV-1、DV-2、DV-3、DV-4。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1.保护效力兼具广泛性和特异性

1）以1-4型DV包膜糖蛋白EDIII序列为基础，比单一型其它的亚单位疫苗有更广泛的保护范围。

2）针对在世界广泛流行的DV毒株设计DV简并性序列，提高了疫苗的特异性和有效性。

2.保持了天然结构，提高了免疫的有效性

1）保留组成DV包膜糖蛋白EDIII区基本结构的β片层及Loop环氨基酸位点，使疫苗结构更天然。

2）设计的简并性序列包含了病毒毒力相关基因，产生的免疫血清具有更高的保护效力。

3.为成分单一的蛋白制剂，提高了疫苗的安全性。

1）本发明的登革病毒简并性序列疫苗为一种重组的蛋白质制剂，不具有复制能力，也不会引起登革病毒导致的特异性细胞病变，可以最大程度地降低疫苗使用的风险。

2)在疫苗的设计上，采用了1-4型登革病毒E蛋白中重要的中和表位肽，摒弃了非中和表位，大大降低了疫苗使用后引发的抗体依赖性增强(ADE)现象，提高了使用安全性。

4.生产成本低

1）本发明所述的登革病毒简并性序列疫苗是以在大肠杆菌表达系统中表达进行的氨基酸优化，可在大肠杆菌中表达，其成本相对于酵母系统、哺乳动物细胞表达系统低，利于成本的控制。

2）在构建了重组表达质粒后，转化靶细菌并筛选稳定的细菌克隆。在生产时，只需要培养稳定转化的细菌克隆、加入诱导剂诱导，即可产生大量的登革病毒简并性序列蛋白，经适当的纯化途径即可获得登革病毒简并性序列疫苗，缩短了疫苗生产流程，提高了疫苗的生产效率，产品生产成本降低。

所述的登革病毒简并疫苗以大肠杆菌为表达宿主而进行了密码子优化设计，可在大肠杆菌中高效表达，成本低，产率高。

为让本发明之上述和其它目的、特征和优点能更明确，下面结合具体实施实例，进一步阐明本发明。应当指出的是，这些实施实例仅用于进一步阐明本发明，而不用于限制本发明的适用范围。以下实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如黄培堂等译，分子克隆实验指南（第三版，科学出版社，2002）中所述的条件，或按试剂制造产家所建议的条件进行。

实验证明，本发明的登革病毒简并疫苗免疫机体，可以激发机体产生体液免疫应答，对登革病毒强毒株感染的乳鼠有较高的保护效果。本发明对于预防人类登革病毒的感染具有重要的现实意义。

下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。

附图说明

图1为实施例4中登革病毒简并疫苗分子Western blot鉴定示意图。

图2为实施例5中登革病毒简并疫苗分子纯化结果的SDS-PAGE示意图。

图3A至图3D显示了实施例7中登革病毒简并疫苗分子免疫小鼠血清中和病毒感染细胞的示意图。

图4为对实施例1中列举的菌株中的病毒中和表位所在的区域进行分析，采用生物信息学软件BioEdit version7.0进行序列比对。

具体实施方式

实施例1 登革病毒简并性序列疫苗分子的设计

1.序列比对

DV广泛流行于热带、亚热带地区，尤其是东南亚、非洲、中南美洲及西太平洋地区。本发明选取曾在世界流行的DV毒株，所述的DV毒株包括DV-1,DV-2,DV-3,DV-4四种血清型的代表菌株。DV-1选取西南印度洋和非洲地区流行株（GenBank登陆号DQ285558），印度尼西亚流行株（GenBank登陆号AB189121），美洲流行株（GenBank登陆号GQ868530）和中国流行株（GenBank登陆号AY376738）；DV-2选取在美国和日本流行的TR1751株(Trent,et al.1983)，非洲西部流行株（GenBank登陆号EF105386和EF105378），美洲流行株（GenBank登陆号GQ199892）和太平洋地区流行株（GenBank登陆号HM582117）；DV-3选取东南亚流行株（GenBank登陆号AY676353），太平洋地区流行株（GenBank登陆号AY744678和FJ898455），美洲流行株（GenBank登陆号FJ410176）；DV-4选取美洲流行株（GenBank登陆号AF326573），东亚、东南亚地区流行株（GenBank登陆号AY618990和FJ196850）和太平洋地区流行株（GenBank登陆号JQ650109）。以上DV流行株均选自NCBI数据库。对这些菌株中的病毒中和表位所在的区域进行分析，采用生物信息学软件BioEditversion7.0进行序列比对（见图4）。

2.设计的简并序列包含DV毒力相关的抗原分子的中和表位

1）受体结合Loop环：登革病毒包膜糖蛋白EDIII区残基382-386形成一个受体结合Loop环，是DV识别和结合靶细胞上病毒受体的重要功能位点，决定着DV感染的靶细胞种类和组织嗜性。

2）重要的中和表位残基：DV-1 EDIII区K307,L308,E309,K310,E311,V312,L387,L389,W391位残基和DV-2 EDIII区G304,K305,K307,K310,P384位残基被证实是DV中和表位。

3.设计的简并序列包含构成EDIII区基本结构-β片层的氨基酸

DV-1:TSYVMCTGSFKLEKEVAETQHGTVLVQVKYEGTDAPCKIPFSTQDEKGVT

DV-2:MSYSMCTGKFKVVKEIAETQHGTIVIRVQYEGDGSPCKIPFEIMDLEKRH

DV-3:MSYAMCLNTFVLKKEVSETQHGTILIKVEYKGEDAPCKIPFSTEDGQGKA

DV-4:MSYTMCSGKFSIDKEMAETQHGTTVVKVKYEGAGAPCKVPIEIRDVNKEK

β1 β2 β3 β4 β5a

DV-1:QNGRLITANPIVTDKEKPVNIETEPPFGESYIVVGAGEKALKLSWFKKG

DV-2:VLGRLITVNPIVTEKDSPVNIEAEPPFGDSYIIIGVEPGQLKLNWFKKG

DV-3:HNGRLITANPVVTKKEEPVNIEAEPPFGESNIVIGIGDKALKINWYKKG

DV-4：VVGRVISSTPLAENTNSVTNIELEPPFGDSYIVIGVGNSALTLHWFRKG

β5aβ5b β6 β7 β8 Loop β9

4.设计的登革病毒简并序列疫苗以大肠杆菌为表达宿主进行工程化制备，利用DNAWorks 2.4软件进行大肠杆菌使用密码子的优化设计（http://molbio.info.nih.gov/dnaworks/）。

5.最终设计的简并序列为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，采用化学合成的方法获得该序列。

实施例2 登革病毒简并疫苗重组表达质粒的构建

1.化学合成的简并序列DVIII的BamHI（TaKaRa公司）和XhoI（TaKaRa公司）双酶切

混匀后置37℃水浴反应4小时，1.2%的琼脂糖(上海生工)凝胶电泳，按Promega胶回收试剂盒说明书回收双酶切后的DVIII片段；

2.原核表达载体pET22b经BamHI（TaKaRa公司）和XhoI（TaKaRa公司）双酶切，双酶切反应体系同上，回收质粒；

混匀后置16℃水浴反应16小时，65℃10min灭活连接酶；

4.转化实验

大肠埃希菌DH5α感受态的制备参见分子克隆实验指南（第三版，科学出版社，2002），取4μl连接产物于100μl DH5α感受态细胞中，混匀，冰浴中30分钟，42℃休克90秒，置冰浴中2分钟，将混合物加入900μl LB培养基（英国Oxoid公司）中，37℃振荡培养1小时，涂布AMP(100μg/ml,西南制药)琼脂平板，37℃培养18小时，挑选AMP抗性菌落进行质粒提取（美国promega公司质粒提取试剂盒）与鉴定，含正确编码序列的重组子命名为pET22b-DVIII。

实施例3 筛选并鉴定重组细菌克隆

1.将实施例2所述的重组表达质粒pET22b-DVIII按分子克隆实验指南（第三版，科学出版社，2002）的方法转化BL21大肠杆菌感受态，具体参见实施例2中步骤4中描述的方法进行。

2.挑取10个AMP抗性克隆，用1ml LB培养基进行培养，等OD600值约为0.3-0.5时，加入0.5mM IPTG（北京赛百盛）诱导剂诱导1小时，14000转/分钟离心5分钟，收集菌体。

3.参照分子克隆实验指南的方法进行SDS-PAGE电泳（美国Bio-Rad公司），电泳后的凝胶用考马斯兰染色（瑞士Fluka公司），观察，与未诱导的菌株相比，有明确表达条带的克隆为表达阳性克隆，命名为pET22b-DVIII/BL21工程菌。

4.登革病毒简并疫苗蛋白的纯化（见实施例5）。

将包涵体溶解于8M尿素（上海生工）中，离心收集上清，分别用Ni-NTA亲和层析柱（美国Bio-Rad公司）和阳离子交换柱进行纯化，收集洗脱峰，透析至保存液中备用。

实施例4 登革病毒简并疫苗蛋白的表达与鉴定

1.复苏实施例3中获得的稳定pET22b-DVIII/BL21工程菌，扩大培养至2000 ml，待OD600值约为0.5时，加入诱导剂IPTG至终浓度为0.5mM，诱导4小时，收集培养物离心（Sigma 3T3离心机），留存细菌沉淀。

2.称取细菌湿重，用TBS300 buffer(100mM Na₂PO₄,10mM Tris-Cl,pH8.0,300mM NaCl,1MUrea)重悬，制成10%（w/v）细菌悬液。

3.在细菌悬液中加入终浓度为20μg/ml的溶菌酶(美国Sigma公司)和1mM的PMSF(蛋白酶抑制剂，美国Sigma公司)，37°C孵育30分钟，超声处理，间隙10秒，工作11秒，处理2个循环（宁波东芝超声仪）。

4.超声物经15000转/分钟离心30分钟（日立21G离心机），沉淀用含1%TritonX-100（上海生工）洗涤2次后，加入含8M尿素溶液(100mMNa₂PO₄,10mMTris-Cl,pH8.0,300mMNaCl,8MUrea,5mmimidazole,1mmβ-ME),4°C溶解过夜。

5.疫苗蛋白的鉴定

取溶解的蛋白溶液10μl,加入2×loading buffer,参见分子克隆实验指南的方法进行SDS-PAGE电泳，电转移到硝酸纤维素膜上，用小鼠抗His的抗血清（北京中杉金桥公司）作一抗，辣根过氧化物酶（HRP）标记的兔抗小鼠（北京中杉金桥公司）作二抗进行免疫印迹（Western blot）鉴定。具体请参照图1，其显示了重组表达登革病毒简并性序列疫苗的Westernblot鉴定结果，泳道1为蛋白分子量标准，泳道2为表达菌制备包涵体，泳道3为纯化的目标蛋白，箭头所示的特异性抗原印迹条带即为所需的目标蛋白。

实施例5 登革病毒简并疫苗蛋白的纯化

1.样品处理

将实施例4中8M尿素溶液（Buffer A）溶解物用15000转/分钟离心30分钟（日立21G离心机），收集上清，用0.22μm的滤器（Millipore公司）过滤，收集过滤液作为纯化样品。

2.Ni-NTA柱纯化

将样品以0.5ml/min上样于预先经Buffer A平衡好的Ni-NTA层析柱，用buffer A平衡至基线，再用Buffer B[Buffer A+20mM咪唑（上海生工）]进行冲洗，最后用Buffer C[Buffer A+150mM咪唑（上海生工）]冲洗，收集洗脱峰，经12%SDS-PAGE电泳分析目标蛋白的纯度。

3.目标蛋白透析复性

因在8M尿素中的蛋白分子处于变性状态，需要将其复性方可具有生物学活性，复性采用透析方法。即将含目标蛋白的洗脱峰依次用buffer D(100mMNa₂PO₄,10mMTris-Cl,pH8.0,300mMNaCl,4M Urea,1mmβ-ME),buffer E(100mMNa₂PO₄,10mMTris-Cl,pH8.0,300mM NaCl,2MUrea,0.1mM EDTA,0.01%TritonX-100,10%Glycerol),和buffer F(100mMNa₂PO₄,10mMTris-Cl,pH8.0,150mMNaCl,0.1mMEDTA,0.01%TritonX-100,10%Glycerol)进行透析处理，4°C透析4h后换液，最后15000转/分钟离心30分钟，上清用0.22μm的滤器过滤，收集过滤液。

4.离子交换纯化 Ni-NTA柱纯化并复性的样品仍含有少量杂质，对透析后的样品用GE Healthcare的XK16阳离子交换柱进行离子交换纯化。层析柱先用buffer I(10mM磷酸盐缓冲液，pH8.0)平衡，上样后再用bufferI冲洗，用0～1MNaCl的梯度液进行洗脱，收集洗脱峰，SDS-PAGE电泳分析目标蛋白纯度，用buffer F（见3）透析4h, 再用buffer G (100 mMNa₂PO₄,10mM Tris-Cl,pH8.0,150mM NaCl,0.1mM EDTA,0.01%TritonX-100,50%Glycerol)透析，保存于-20°C备用。参照图2，其显示了重组表达登革病毒简并性序列疫苗蛋白的纯化物经SDS-PAGE电泳分析结果，泳道1为含重组质粒的工程菌未加诱导剂诱导，泳道2为加了0.5mM IPTG诱导剂培养4h后的工程菌，泳道3为蛋白分子量标准，泳道4为Ni-NTA亲和柱纯化的洗脱峰，泳道5为离子交换洗脱峰，箭头所示的为目标蛋白。

实施例6 登革病毒简并疫苗的动物免疫

1.动物免疫

为证实登革病毒简并疫苗的免疫效能，本发明检测了登革病毒简并疫苗对BALB/c小鼠免疫后的抗体产生效价。

登革病毒简并疫苗的免疫方案：10只4周龄BALB/c小鼠，分对照组和免疫组进行实验。

在加强免疫后3天，采集小鼠血液，分离血清，加1倍体积100%无菌甘油保存于-20°C备用。

2.ELISA检测血清的免疫效价

（1）抗原包被：参照分子克隆实验指南的方法包被DVIII抗原。

（2）封闭：各包被抗原孔用含5%脱脂奶粉（上海生工）的PBS进行封闭，37°C孵育1h,洗涤（PBS-T,配方参见分子克隆实验指南）。

（3）将免疫获得的小鼠血清用PBS缓冲液作倍比稀释，依次加入每个抗原包被孔中，37°C孵育1h,PBS-T洗涤5次。

（4）加入PBS-T稀释的HRP标记的兔抗鼠抗体（北京中杉金桥公司），37°C孵育1h,PBS-T洗涤5次。

（5）加入EL-ABTS显色溶液（上海生工）显色，酶标仪（Spectra MaxM2^e）测定各孔420 nm的吸光值。

（6）效价判定：经对照组血清吸光度为对照，免疫组血清孔420nm高出2.1倍者判为阳性，结果用登革病毒简并疫苗免疫小鼠血清的效价为1:409600。

实施例7 登革病毒简并性疫苗免疫血清的中和作用

1.Vero细胞培养

复苏Vero细胞（非洲绿猴肾细胞），用含10%胎牛血清（成都哈里公司）的DMEM培养基(美国HyClone公司)参见分子克隆实验指南的方法进行细胞培养与传代。

2.将重组简并DVIII蛋白免疫血清按1:20，1:40，1:320进行稀释，分别与等体积的1型、2型登革病毒液混合（最终血清稀释度为1:40，1:80，1:640），37°C孵育30分钟，然后接种于Vero细胞单层，加含2%甲基纤维素（美国Sigma公司）的DMEM培养基，37°C，5%CO₂孵箱（HeraeusHera cell 150）中培养5-7天，观察病毒噬斑形成情况，同时设置病毒对照和空白对照。

3.计数各实验孔的病毒空斑数，按下列公式计算空斑形成抑制率

结果1:80稀释的免疫血清对DV-1的空斑形成抑制率为100%；1:640稀释的免疫血清对DV-2的空斑形成抑制率为100%。

4.将对照血清和免疫血清中和后的病毒感染Vero细胞片，3天后取片固定，用小鼠抗登革病毒血清（由实施例6中制得）作一抗，FITC标记的兔抗小鼠荧光抗体（北京中杉金桥公司）作二抗进行间接免疫荧光（IFA）染色，参见分子克隆实验指南（第三版，科学出版社，2002）的方法进行IFA染色，具体请参照图3A至图3D，其显示了IFA染色结果，图3A为用简并性序列疫苗免疫小鼠血清（1：100）对DV-1感染的中和结果，未见病毒增殖；图3B为用正常小鼠血清对DV-1感染的中和结果，病毒荧光强，病毒增殖未受影响；图3C为用简并性序列疫苗免疫小鼠血清（1：100）对DV-2感染的中和结果，未见病毒增殖；图3D为用正常小鼠血清对DV-2感染的中和结果，病毒荧光强，病毒增殖未受影响。

虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明之精神和范围内，当可作些许之更动与改进，因此本发明之保护范围当视权利要求所界定者为准。

Claims

1.一种登革病毒简并疫苗，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.一种编码权利要求1所述的登革病毒简并疫苗的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

3.一种重组表达载体，其特征在于，含有权利要求2所述的基因。

4.一种转化体，其特征在于，含有权利要求3所述的重组表达载体。

5.权利要求1所述的登革病毒简并疫苗在制备预防登革病毒感染性疾病的制剂中的应用。

6.权利要求1所述的登革病毒简并疫苗在制备抗登革病毒的抗体中的应用。

7.权利要求3所述的重组表达载体在制备登革病毒简并疫苗中的应用。