CN107074968B - 疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种重组多肽，包括与HBsAg的N端连接的每一种登革病毒血清型DENV‑1、DENV‑2、DENV‑3和DENV‑4的EDIII结构域。

Description

疫苗
技术领域
本发明涉及一种重组登革亚单位疫苗，针对所有4种登革血清型DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4。本发明还涉及一种基于VLP的重组登革四价候选疫苗，包括乙型肝炎病毒的表面抗原(HBsAg)和四价EDIII-T分子。本发明还涉及一种生产基于VLP(virus likeparticle)的重组登革四价候选疫苗的方法。
背景技术
由四种抗原性不同的登革病毒(DENVs)引起的登革疾病在世界上150多个国家是一个严重的健康问题，尤其是在像印度这样高度流行的国家。近年来，这种疾病呈上升趋势，由于缺乏有效的疫苗或抗病毒疗法，已成为全球公共卫生的威胁。登革疾病是全球医疗保健系统的一个挑战，特别是在疾病爆发时，为了控制传病媒介每年需要耗费数百万美元。一种高效、安全且具有成本效益的疫苗可以解决受登革病毒影响的国家的负担。尽管在过去三十年里付出了很多努力开发一种用于限制该疾病传播的预防疫苗，但是到目前为止，市场上仍未有得到许可的疫苗。世界各地的研究小组/公司正在努力开发一种针对登革病毒所有血清型的有效四价疫苗。早期开发的大多数疫苗都是基于活减毒嵌合病毒，其中一些疫苗目前正在临床试验。然而，由于病毒干扰等限制，研究重点已经转移到亚单位疫苗，特别是利用登革病毒包膜蛋白E的第三结构域。目前已经报道许多利用该结构域的专利/出版物。
虽然基于活黄病毒的登革疫苗已经进入第三期临床试验，但是已经报道了因为病毒干扰引起的问题。病毒干扰大概是因为这四种疫苗病毒株的复制能力和免疫原性的差异引起的。
非复制性亚单位病毒具有克服与活病毒疫苗有关的病毒干扰风险的潜能[Swaminathan,Khanna,Ν.(2009),登革：生物学研究进展及转化研究现状，现代分子医学9:152-173]。目前正在探索使用重组DNA和蛋白质为基础的亚单位疫苗的几种方法。这样的重组亚单位疫苗大多数聚焦于重要的包膜蛋白E。大量证据还表明这种E蛋白的疫苗性能大多数与第三结构域(EDIII)有关。
已经证实DENV包膜蛋白第三结构域(EDIII)负责宿主细胞受体识别和中和抗体生成[Swaminathan,Khanna,Ν.(2009).登革：生物学研究进展及转化研究现状，现代分子医学9:152-173；Guzman,M.G.Hermida,L.,Bernardo,L.,Ramirez,R.,Guillen,G.(2010).作为登革疫苗靶点的包膜蛋白第二结构域]。此外，已经报道EDIII具有非常低的诱导交叉反应性抗体的内在潜能[Simmons,Μ.,Nelson,W.M.,Wu,S.J.,Hayes,C.G.(1998).针对小鼠登革2型病毒感染的重组登革包膜蛋白B结构域融合蛋白的保护效力评价；美国热带医学与卫生杂志58:655-662；Simmons,Μ.,Murphy,G.S.,Hayes,C.G.(2001).简讯：接种四价登革重组蛋白亚单位疫苗的小鼠的抗体反应，美国热带医学与卫生杂志65:159-161]。这些属性使EDIII成为优秀的候选疫苗。作为潜在登革疫苗抗原的四价蛋白形式的EDIII的功效已经被下述发明家证实[Etemad,B.,Batra,G.,Rout,R.,Dahiya,S.,Khanam,S.,Swaminathan,S.,Khanna,Ν.(2008)]。
已经报道许多利用登革病毒包膜蛋白E第三结构域的专利/出版物，即：
Suzarte，E.，Gil，L.，Valdés，I.，Marcos，E.，Lazo，L.，Izquierdo，A.，......&Hermida，L.(2015)，国际免疫学，dxv011公开了一种结合四种来源于登革病毒的聚集第三结构域-衣壳蛋白的新型四价配方，诱导小鼠和猴子的功能性免疫反应。该文献公开了基于两种不同的病毒区域，即衣壳蛋白和包膜蛋白的第三结构域，针对登革病毒的候选疫苗，其中采用DIIIC蛋白的四价配方。作为与寡脱氧核苷酸结合的聚集体存在的，上述来源于登革2型病毒的新型嵌合蛋白(第三结构域-衣壳(DIIIC-2))诱导了抗病毒和中和抗体，细胞免疫反应并赋予小鼠和猴子有效的防护。已经获得并适当地表征了其余的构建体。基于这些证据，目前的工作致力于评估单价和四价配方的每一种血清型的嵌合蛋白DIIIC在小鼠中的免疫反应。这些发明家证实了每一种蛋白在体液免疫和细胞免疫方面的免疫原性，并且没有对形成上述配方Tetra DIIIC的混合物产生抗原竞争。因此，根据测定的小鼠脑炎模型中的有限病毒载量衡量赋予的有效防护。同时还在非人灵长类动物中进行了上述四价配方的评估。结果表明，在这种动物模型中上述配方诱导了具有IFN-γ-分泌和细胞毒性能力的中和抗体和记忆细胞介导的免疫反应，无论采用何种免疫途径。DIIIC蛋白的四价配方构建了一种有希望针对登革病毒的候选疫苗。
Zuest，R.，Valdes，I.，Skibinski，D.，Lin，Y.，Toh，Y.X.，Chan，K.，......&Fink，K.(2015)，Vaccine 33(12)，1474-1482公开了由登革血清型1-4(Tetra DIIIC)的E蛋白第三结构域和衣壳蛋白组成的重组融合蛋白的四价配方的免疫原性，以赋予针对登革病毒的免疫力。E蛋白第三结构域是有效的中和抗体的表位，而衣壳蛋白含有T细胞表位。除结合B和T细胞表位外，Tetra DIIIC因为其聚集体形式和双组份辅助剂还具有高免疫原性。已有的评估单价DIIIC配方的研究探讨了小鼠Tetra DIIIC的T细胞和抗体反应的质量和广度。Tetra DIIIC诱导了针对所有四种DENV血清型的Thl型反应并且登革特异性抗体主要是IgG1、IgG2a和中和抗体，而中和抗体的诱导取决于IFN信号通路。重要的是，DIIIC疫苗方法中的Thl和IgG1/IgG2a类似于一种有效的天然抗登革反应。
Izquierdo，A.，Garcia，A.，Lazo，L.，Gil，L.，Marcos，E.，Alvarez，M.，&Guzmdn，M.G.(2014)，病毒学文献，159(10)，2597-2604公开了一种含有第三结构域-P64k和第三结构域-衣壳蛋白混合物的四价登革疫苗诱导小鼠保护性反应。这篇文献公开了含有与来自Neisseria meningitidis的P64k蛋白融合的登革病毒(1、3、4型)的包膜蛋白第三结构域和登革病毒2型(D2)的第三结构域的候选疫苗被发现具有免疫原性。含有与来自Neisseriameningitidis的P64k蛋白融合的登革病毒包膜蛋白的第三结构域和与这种血清型的衣壳蛋白融合的登革病毒2型(D2)的第三结构域的重组融合蛋白具有免疫原性，并且评价了接种这种四价配方的小鼠所具有的抗致命挑战的保护能力。
被认为是登革最有效方案的减毒活疫苗(LAVs)掩饰了这种期望。从最先进的候选LAV的疗效试验获得的最新数据显示30％的整体疗效，没有针对DENV-2的疗效。这就需要认真探索替代的方法来开发登革疫苗。基于VLP的四价登革候选疫苗“DSV4”是基于HBsAg的VLP，展示相对于DENV的四种血清型的所有四种EDIII。
最初，印度专利号261749公开了一种四价第三结构域蛋白(rTDIII)，一种通过五甘氨酸连接肽相互连接的单一嵌合多肽，包含登革病毒的所有四种血清型，登革-1、2、3、4，的第三结构域，为在大肠杆菌中表达进行密码子优化。
另一个印度专利申请号1259/DEL/2007中公开了一种基于包膜蛋白第三结构域的四价重组蛋白，具有和不具有诱导抗每一种登革病毒血清型DEN-1、DEN-2、DEN-3和DEN-4的保护性免疫反应的分泌信号肽，所述蛋白被多聚核苷酸序列密码子编码，所述密码子为在真核表达系统中表达进行优化。
疟疾候选疫苗RTS，S的成功很好地说明了乙型肝炎表面抗原(HBsAg)作为外源表位存在和展示平台的能力。为了增加EDIII-T的免疫原性，发明家探索了HBsAg可否很好地为其展示。因此，EDIII-T在与HBsAg融合时在P.pastoris载体的HBsAg的四种表达盒背景中被克隆(图1A)。这种DSV4的设计类似于RTS，S的设计(同族专利：WO9310152A1、MX9206574A、EP0614465A1等)，展示了HBsAg VLPs的疟疾表位。
本发明的新颖性在于EDIII-T和HBsAg的构建体和在载体中HBsAg的四种表达盒背景。因此，可以认为这种EDIII-T和HBsAg的设计(即“DSV4”)是新颖的。本发明的创造性在于EDIII-T和HBsAg的融合通过提供存在平台和组装成VLPs的共表达的HBsAg蛋白增加表达蛋白的免疫原性。单一重组四价结构域(EDIII-T)在与HBsAg融合时克隆并且与HBsAg共表达形成DSV4病毒样颗粒(VLPs)。亚单位四价疫苗DSV4生成DENV血清型特异性中和抗体，并且有效预防登革的四种血清型中的每一种。
与现有的疫苗相比，本发明具有以下优点。
目前处于3期试验的赛诺菲(Sanofi)减毒活疫苗需要在12个月(第0、6和12月)内接种三次，以诱导针对所有四种血清型的平衡的中性抗体反应，葛兰素史克(Glaxo SmithKline，处于1期实验)的给药方案是间隔28天2剂，塔克达(Takeda，完成2期实验)的接种方法是间隔三个月接种2剂。因此，根据初步的数据，目前的疫苗接种方案将会比处于试验中的赛诺菲疫苗花费更短的时间。此外，目前的疫苗作为一种单一的重组蛋白包括所有四种DENV血清型的EDIII-T和HBsAg，而包括赛诺菲减毒活疫苗在内的试验阶段的所有其他候选疫苗则是包括与这四种血清型对应的四种候选疫苗的混合物。
此外，重组EDIII-T和HBsAg的融合不仅会导致VLPs的生成和重组免疫原性蛋白和乙型肝炎表面抗体的共表达，还会对伴随登革出现的乙型肝炎提供保护/免疫。这可能导致双疫苗的发展，同时对登革的所有血清型和乙型肝炎提供免疫。
发明目的
本发明的一个重要目的是提供一种针对所有四种血清型DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4的登革亚单位疫苗。
本发明的另一个目的是提供一种基于VLP的重组登革四价候选疫苗“DSV4”。
本发明的另一个目的是提供一种基于VLP的重组登革四价候选疫苗“DSV4”，其生成针对登革四种血清型，DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4，中的每一种的DENV血清型特异性中和抗体。
本发明的另一个目的是提供一种生产基于VLP的重组登革四价候选疫苗的方法。
本发明的另一个目的是提供一种针对登革病毒所有四种血清型的有效、安全的疫苗接种方法。
发明内容
第一方面，本发明提供一种重组多肽，包括与HBsAg的N端连接的每一种登革病毒血清型DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4的EDIII结构域。
另一方面，本发明提供编码重组蛋白的核酸序列，所述重组蛋白包括与HBsAg的N端连接的登革病毒血清型DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4的EDIII结构域。
另一方面，本发明提供一种被本发明中的核酸转化或转染的宿主细胞，其中所述宿主细胞表达HBsAg。
另一方面，本发明提供一种包含本发明中的重组多肽的生物纳米颗粒。
另一方面，本发明提供一种生产包含本发明中的重组多肽的生物纳米颗粒的方法，所述方法包括在适宜的条件下培养本发明中的宿主细胞和回收表达的重组蛋白或生物纳米颗粒。
另一方面，本发明提供一种疫苗，包含本发明中的重组多肽。
另一方面，本发明提供一种疫苗，包含本发明中的生物纳米颗粒。
另一方面，本发明提供一种治疗或预防登革病毒的方法，包括向对象给药本发明中的重组多肽、本发明中的生物纳米颗粒或本发明中的疫苗。
另一方面，本发明提供本发明中的重组多肽、本发明中的生物纳米颗粒或本发明中的疫苗用于治疗或预防登革病毒。
附图说明
图1：(A)DSV4的设计：包含与四种DENV对应的四种EDIII并通过六甘氨酸连接肽连接的EDIII-T与HBsAg(S)基因融合，编码为EDIII-T-HBsAg，其在运载HBsAg的四种表达盒的载体中克隆。重组质粒利用Bgl II线性化并且电穿孔至P.pastoris细胞，以获得共表达EDIII-T-HBsAg和HBsAg的克隆体。
(B)甲醇诱导：通过甲醇诱导制备选择的克隆体的未诱导(U)和诱导(I)生物量，并利用银染色和蛋白质印迹法分析其表达。银染色的凝胶显示，诱导的样品里EDIII-T-HBsAg(～72kDa)和HBsAg(～25kDa)都有表达。利用EDIII特异性mAb的蛋白质印迹法检测EDIII-T-HBsAg，利用HBsAg特异性mAb的蛋白质印迹法检测EDIII-T-HBsAg和HBsAg。
(C)DSV4的纯化：来自诱导生物量的纯化DSV4的三个样品。
图2：(A)DSV4的凝胶过滤层析：凝胶过滤层析时DSV4在空隙体积洗脱。通过银染色分析空隙体积的蛋白质显示EDIII-T-HBsAg和HBsAg同时存在。
(B)氯化铯(CsCl)超速离心法：通过超速离心，EDIII-T-HBsAg和HBsAg在CsCl柱共迁移。
(C)DSV4 VLPs的电子显微镜视图：在电子显微镜下观察到的负染色的25-35nm大小的DSV4 VLPs。
图3：(A)EDIII序列源：每种DENV血清型的基因型，由此衍生出对应EDIII aa序列。
(B)DSV4抗血清的酶联免疫吸附(ELISA)的反应性：汇集的抗HBsAg、EDIlI-1、EDIII-2、EDIII-3和EDIII-4的DSV4抗血清的反应性。紫色曲线代表未接种DSV4的血清的反应性。
(C)DSV4生成平衡的中和效价：基于FACS的针对每一种血清型特异性基因型的DSV4抗血清的中和效价。
(D)具有混合血清的基因型中和广度。
图4：(a)DENV-1的包膜蛋白第三结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:l)和编码核酸(SEQ ID NO:5)；
(b)DENV-2的包膜蛋白第三结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)和编码核酸(SEQID NO:6)；
(c)DENV-3的包膜蛋白第三结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)和编码核酸(SEQID NO:7)；
(d)DENV-4的包膜蛋白第三结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:4)和编码核酸(SEQID NO:8)；
(e)HBsAg的N端的氨基酸序列(SEQ ID NO:9)和编码核酸(SEQ ID NO:10)；
(f)本发明中的重组多肽的氨基酸序列，包括与HBsAg的N端连接的DENV-1、2、3和4的EDIII’S(SEQ ID NO:11)和编码核酸(SEQ ID NO:12)，其中斜体的核酸和氨基酸序列是六甘氨酸连接肽，下划线的核酸和氨基酸序列来自KpnI限制位点的翻译。从N端到C端，EDIII’S依次为DENV-1、DENV-3、DENV-4和DENV-2。
具体实施方式
本发明提供一种针对登革病毒的所有四种血清型DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4血清型的登革亚单位疫苗。上述亚单位疫苗包括包含四价EDIII-T和HBsAg的重组蛋白。本发明还涉及一种亚单位疫苗，包含基于VLP的四价候选疫苗，用于预防DENV的所有四种血清型引起的登革疾病。
一方面，本发明提供一种编码重组蛋白的核酸序列，上述重组蛋白包括与HBsAg的N端在框内连接的登革病毒血清型DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4的EDIII结构域。上述核苷酸序列编码每一种登革病毒血清型DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4的EDIII结构域，并且以任意顺序与HBsAg的N端连接。
较优地，上述核酸序列编码每一种登革病毒血清型DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4的EDIII结构域，其氨基酸序列分别为SEQ ID NO:1、2、3和4。较优地，上述编码每一种登革病毒血清型DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4的EDIII结构域的核酸序列分别是SEQID NO:5、6、7和8。
较优地，上述核酸序列编码HBsAg，其氨基酸序列为SEQ ID NO:9。较优地，上述编码HBsAg的核酸序列是SEQ ID NO:10。
在其中一个实施例中，上述核酸序列包括与SEQ ID NO:10的N端在框内连接的每一种核苷酸序列SEQ ID NO:5、6、7和8。核苷酸序列SEQ ID NO:5、6、7和8可以以任意顺序与SEQ ID NO:10的N端连接。
较优地，上述核酸序列编码连接每一种登革病毒血清型DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4的EDIII结构域的连接肽。较优地，上述核酸编码柔性连接肽，最优选是六甘氨酸连接肽。较优地，上述核酸序列编码连接HBsAg的N端和登革病毒血清型DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4的EDIII结构域的连接肽。较优地，上述核酸编码柔性连接肽，最优选是六甘氨酸连接肽。
较优地，上述核酸序列编码氨基酸序列为SEQ ID NO:11的重组多肽。较优地，上述编码重组多肽的核酸序列是SEQ ID NO:12。
在其中一个实施例中，上述核酸序列为在酵母--优选P.pastoris--中表达进行密码子优化。在其中一个实施例中，上述核酸是表达载体。
另一方面，本发明涉及一种被本发明中的核酸转化或转染的宿主细胞，其中所述宿主细胞表达HBsAg。在其中一个实施例中，上述宿主细胞被编码HBsAg的核酸序列转化或转染。较优地，上述宿主细胞被表达HBsAg的1、2、3、4或更多的核酸序列转化或转染。在其中一个实施例中，上述宿主细胞是酵母。优选地，上述宿主细胞是P.pastoris。
另一方面，本发明提供一种重组多肽，包括与HBsAg的N端连接的每一种登革病毒血清型DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4的EDIII结构域。编码每一种登革病毒血清型DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4的EDIII结构域的氨基酸序列可以以任意顺序与HBsAg的N端连接。较优地，登革病毒血清型DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4的EDIII结构域依次融合，从N端到C端顺序为DENV-1、DENV-3、DENV-4和DENV-2。
较优地，上述每一种登革病毒血清型DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4的EDIII结构域的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:1、2、3和4。较优地，上述HBsAg的N端的多肽序列为SEQID NO:9。较优地，上述重组多肽包含与SEQ ID NO:9的N端连接的氨基酸序列SEQ ID NO:1、2、3和4中的每一种。氨基酸序列SEQ ID NO:1、2、3和4可以以任意顺序与SEQ ID NO:9的N端连接。较优地，上述重组多肽依次包含氨基酸序列SEQ ID NO:1、2、3和4，从N端到C端顺序为SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:2。
较优地，上述每一种登革病毒血清型DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4的EDIII结构域通过连接肽连接，优选柔性连接肽，最优选是六甘氨酸连接肽。较优地，EDIII结构域通过连接肽与HBsAg的N端连接，优选柔性连接肽，最优选是六甘氨酸连接肽。
一方面，上述重组多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:11。
本发明中的转化或转染的宿主细胞合成本发明中的HBsAg和重组多肽。发明人发现这两种多肽自发组装成生物纳米颗粒。一方面，本发明包括包含HBsAg和本发明中的重组多肽的生物纳米颗粒。
一方面，本发明提供一种制备重组多肽或生物纳米颗粒的方法，所述方法包括在适宜的条件下培养本发明中的宿主细胞，和回收表达的重组蛋白或生物纳米颗粒。
一方面，本发明涉及一种疫苗，包含本发明中的重组多肽或生物纳米颗粒。较优地，上述疫苗在药学上可接受的载体或合适的稀释剂中含有本发明中的重组多肽或生物纳米颗粒。
一方面，本发明提供一种治疗或预防登革病毒的方法，包括向对象给药本发明中的重组蛋白、生物纳米颗粒或疫苗。在其中一个实施例中，上述登革病毒是血清型DENV-1、DENV-2、DENV-3或DENV-4。
已经开发出基于EDIII的四价分子，EDIII-T，其包含通过柔性甘氨酰基连接在一起的所有四种EDIIIs，如图1A所示。EDIII-T在Pichia pastoris中表达，纯化，并且发现其在小鼠体内具有免疫原性。在印度专利号261749中公开了这种EDIII-T分子的构建。
在专利申请号WO 93/10152中通过疟疾候选疫苗RTS，S的成功很好地说明了乙型肝炎表面抗原(HBsAg)作为外源表位存在和展示平台的能力。
本发明探索了HBsAg增加EDIII-T的免疫原性的可能性。因此，EDIII-T在与HBsAg融合时在P.pastoris载体的HBsAg的四种表达盒背景中被克隆，如图1A所示。这种EDIII-T和HBsAg的设计被定义为“DSV4”，类似于专利申请号WO9310152中的RTS，S的设计，展示了HBsAg VLPs上的疟疾表位。
重组质粒电穿孔至P.pastoris，并且通过克隆体的甲醇诱导筛选同时表达EDIII-T-HBsAg和HBsAg蛋白的克隆体。如图1B所示，在共表达这两种蛋白的阳性克隆体中选择一个进行进一步研究。诱导生物量裂解，提取与膜有关的蛋白并通过300kDa的膜进行渗滤。这一步骤允许大尺寸蛋白的富集，所述大尺寸蛋白被认为是这两种共表达的蛋白组装成DSV4VLPs。通过苯基600M树脂纯化滞留物至高纯度，如图1C所示。
通过凝胶过滤(如图2A所示)、氯化铯超速离心(如图2B所示)和电子显微镜(如图2C所示)评估共表达的蛋白组装成VLPs的能力。观察到DSV4的这两种蛋白组分在凝胶过滤时同时在空隙体积洗脱(如图2A所示)，在氯化铯超速离心时共迁移(如图2B所示)。在电子显微镜下观察到这两种蛋白组分组装成25-35nm VLPs，如图2C所示。
通过充分表征的三明治ELISA形式的mAbs识别关键的EDIII表位，以评估DSV4VLPs中所有四种DENV的EDIII的构象完整性。
通过对BALB/c小鼠接种评估这些VLPs发起针对四种DENV血清型的强免疫反应的能力，如图3所示。接种纯化的DSV4 VLPs(20μg/500μg铝胶形式的铝/100μl PBS)，一组六个BALB/c小鼠在0天、30天和90天腹腔内给药。在100天时采取末端血，通过ELISA分析抗DSV4反应。汇集来自阳性反应体的血清，并表征抗所有五种组分，即EDIII-1、EDIII-2、EDIII-3、EDIII-4和HBsAg，的抗体存在。观察到抗所有五种组分的强免疫反应。这对确定抗登革反应是否可以中和四种DENVs是必不可少的。因此，通过基于FACS的检测评估汇集的血清的中和能力，观察到DSV4-抗血清的确可以中和所有四种DENVs(图3C)。图3A示出了DSV4的设计以及获得对应EDIII aa序列的菌株。图3C示出了抗四种DENVs(特异性菌株)的DSV4-抗血清的中和效价，以及DENV-3的两种附加基因型菌株。显然，用于中和测试的DENV-2、-3和-4基因型不同于获得EDIII序列的基因型，并且没有负面影响DSV4抗血清的中和能力，表明产生的免疫反应强度高。此外，针对不同基因型的总反应也似乎是平衡的，突出DSV4作为可能的登革疫苗的候选资格，如图3D所示。DSV4似乎对评估的不同辅助剂的可比程度有效(图3D)。
本发明将参考下述实施例进行说明，下述实施例仅仅用于说明和论证本发明。这些具体的实施例不应被解释为对本发明专利范围的限制。
实施例1：构建基于VLP的重组登革四价候选疫苗
EDIII-T在与HBsAg融合时在P.pastoris载体的HBsAg的四种表达盒背景下被克隆，如图1A所示。这种EDIII-T和HBsAg的设计被定义为“DSV4”。重组质粒电穿孔至P.pastoris，并且通过克隆体的甲醇诱导筛选同时表达EDIII-T-HBsAg和HBsAg蛋白的克隆体。
实施例2：表征登革四价候选疫苗-DSV4
如图1B所示，在共表达这两种蛋白的阳性克隆体中选择一个进行进一步研究。诱导生物量裂解，提取与膜有关的蛋白并通过300kDa的膜进行渗滤。这一步骤允许大尺寸蛋白的富集，所述大尺寸蛋白被认为是这两种共表达的蛋白组装成DSV4 VLPs。通过苯基600M树脂纯化滞留物至高纯度，如图1C所示。
实施例3：VLPs的鉴定和表征
通过凝胶过滤(如图2A所示)、氯化铯超速离心(如图2B所示)和电子显微镜(如图2C所示)评估共表达的蛋白组装成VLPs的能力。观察到DSV4的这两种蛋白组分在凝胶过滤时同时在空隙体积洗脱(如图2A所示)，在氯化铯超速离心时共迁移(如图2B所示)。在电子显微镜下观察到这两种蛋白组分组装成25-35nm VLPs，如图2C所示。
实施例4：通过mAbs评价DSV4 VLPs中所有四种DENVs的构象完整性
通过充分表征的三明治ELISA形式的mAbs识别关键的EDIII表位，从而评估DSV4VLPs中所有四种DENVs的EDIII的构象完整性。登革特异性mAbs在微量滴定井中被披覆，添加DSV4 VLPs。通过过氧化物酶标记的抗HBsAg Hepnostika显示结合的VLPs。这些mAbs中的大部分针对EDIII的A链和侧脊区，被认为是产生强中和免疫反应所必不可少的。表1示出了21个登革mAbs(EDIII和非-EDIII特异性mAbs)的ELISA反应性，结果表明所有四种DENVs的EDIII表位在DSV4 VLPs上是完整的。
表1：EDIII特异性mAbs列表，其识别区域和“DSV4”VLPs的反应性(以ELISA OD表示)
Figure BDA0001236044330000121
实施例5：用纯化DSV4 VLPs接种小鼠
通过对BALB/c小鼠接种，评估这些VLPs发起针对四种DENV血清型的强免疫反应的能力，如图3所示。接种纯化的DSV4 VLPs(20μg/500μg铝胶形式的铝/100μl PBS)，一组六个BALB/c小鼠在0天、30天和90天腹腔内给药。在100天时采取末端血，通过ELISA分析抗DSV4反应。汇集来自阳性反应体的血清，并表征抗所有五种组分，即EDIII-1、EDIII-2、EDIII-3、EDIII-4和HBsAg，的抗体存在，如图3B所示，并且进一步测定不同辅助剂生成的DSV4抗血清的基因型中和幅度，如图3D所示。
免疫反应
观察到抗所有五种组分，即EDIII-1、EDIII-2、EDIII-3、EDIII-4和HBsAg，的强免疫反应。这对确定抗登革反应是否可以中和四种DENVs是必不可少的。因此，通过基于FACS的检测评估汇集的血清的中和能力，观察到DSV4-抗血清的确可以中和所有四种DENVs，如图3C所示，图3C示出了抗四种WHO参考菌株DENVs和DENV-3的两种附加基因型菌株的DSV4-抗血清的中和效价。显然，用于中和测试的DENV-2、-3和-4基因型不同于获得EDIII序列的基因型，并且没有负面影响DSV4抗血清的中和能力，表明产生的免疫反应强度高。此外，针对不同基因型的总反应也似乎是平衡的，突出DSV4作为可能的登革疫苗的候选资格。下表2示出了EDIII-3-MBP的FNT在后缺失诱发血清型特异性中和Abs。
表2：EDIII-3-MBP的FNT在后缺失诱发血清型特异性中和Abs
Figure BDA0001236044330000131
本发明还包括以下具体方面：
第一方面，一种基于VLP的重组登革四价候选疫苗，包括四价EDIII-T分子和乙型肝炎病毒的表面抗原(HBsAg)。
第二方面，一种基于VLP的重组登革四价候选疫苗，指定是DSV4。
第三方面，一种基于VLP的重组登革四价候选疫苗，DSV4，其中四价EDIII分子包括DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4的EDIII。
第四方面，如上述第二方面所述的基于VLP的重组登革四价候选疫苗，其中DSV4生成针对DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4的DENV基因型特异性中和抗体。
第五方面，一种生产基于VLP的重组登革四价候选疫苗的方法，包括以下步骤：
i)在运载HBsAg的四种表达盒的重组构建体中与HBsAg融合时克隆EDIII-T；
ii)重组质粒电穿孔至Pichia pastoris细胞，获得同时表达EDIII-T-HBsAg和HBsAg的克隆体；
iii)筛选同时表达EDIII-T-HBsAg和HBsAg的克隆体；
iv)通过银染色和蛋白质印迹法分析EDIII-T-HBsAg和HBsAg蛋白的表达；
v)诱导生物量的裂解；
vi)提取与膜有关的蛋白并进行渗滤；
vii)DSV4的纯化。
第六方面，如上述第五方面所述的方法，步骤iii)中的筛选通过克隆体的甲醇诱导完成。
第七方面，一种登革亚单位疫苗，包括如上述第一方面所述的基于VLP的重组登革四价候选疫苗。
第八方面，如上述第七方面所述的登革亚单位疫苗，其中所述疫苗针对登革病毒的DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4血清型有活性。
第九方面，如上述第八方面所述的登革亚单位疫苗，其中所述疫苗可以腹腔内给药或肌内注射给药。
第十方面，一种基于VLP的重组登革四价候选疫苗用于登革亚单位候选疫苗中，包括四价EDIII-T分子和乙型肝炎病毒的表面抗原(HBsAg)。
序列表
<110> 国际基因工程与生物技术中心
<120> 疫苗
<130> P226303WO
<140> PCT/IB 15/056352
<141> 2015-08-21
<150> IN 2478/DEL/2014
<151> 2014-09-01
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 104
<212> PRT
<213> 登革病毒型1
<400> 1
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1 5 10 15
Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Val Leu Val Gln Val Lys Tyr Glu Gly
20 25 30
Thr Asp Ala Pro Cys Lys Ile Pro Phe Ser Ser Gln Asp Glu Lys Gly
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Tyr Ile Val Val Gly Ala Gly Glu Lys Ala Leu Lys Leu Ser Trp Phe
85 90 95
Lys Lys Gly Ser Ser Ile Gly Lys
100
<210> 2
<211> 104
<212> PRT
<213> 登革病毒型2
<400> 2
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1 5 10 15
Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Ile Val Ile Arg Val Gln Tyr Glu Gly
20 25 30
Asp Gly Ser Pro Cys Lys Thr Pro Phe Glu Ile Met Asp Leu Glu Lys
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Arg His Val Leu Gly Arg Leu Thr Thr Val Asn Pro Ile Val Thr Glu
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Tyr Ile Ile Ile Gly Val Glu Pro Gly Gln Leu Lys Leu Asp Trp Phe
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100
<210> 3
<211> 104
<212> PRT
<213> 登革病毒型3
<400> 3
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Ser Glu Thr Gln His Gly Thr Ile Leu Ile Lys Val Glu Tyr Lys Gly
20 25 30
Glu Asp Ala Pro Cys Lys Ile Pro Phe Ser Thr Glu Asp Gly Gln Gly
35 40 45
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65 70 75 80
Asn Ile Val Ile Gly Ile Gly Asp Lys Ala Leu Lys Ile Asn Trp Tyr
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Arg Lys Gly Ser Ser Ile Gly Lys
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<211> 103
<212> PRT
<213> 登革病毒型4
<400> 4
Met Ser Tyr Thr Met Cys Ser Gly Lys Phe Ser Ile Asp Lys Glu Met
1 5 10 15
Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Thr Val Val Lys Val Lys Tyr Glu Gly
20 25 30
Ala Gly Ala Pro Cys Lys Val Pro Ile Glu Ile Arg Asp Val Asn Lys
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<210> 5
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<212> DNA
<213> 登革病毒型1
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atcgttaccg acaaggagaa acccgtgaat atcgaggccg agcctccttt cggcgaaagt 240
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tctattggaa aa 312
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<212> DNA
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atgagttact ccatgtgcac cgggaaattc aaagtagtta aagagattgc cgagactcag 60
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tacatcatta tcggagttga acctggtcag cttaagttag attggttcaa gaagggctcc 300
tcaataggtc ag 312
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atgagttacg ccatgtgtct gaatacgttt gtgcttaaga aagaggtttc tgaaacgcaa 60
cacggaacca ttcttatcaa ggtggaatac aagggtgagg acgctccatg caagatccca 120
ttttctaccg aagatgggca gggtaaagct cataatggta gactgattac tgctaatcct 180
gttgtaacaa agaaggaaga gccagtcaac atcgaggcag aacctccctt tggcgaatca 240
aacatagtca tagggatagg tgacaaggca ctaaagatta actggtatcg taagggttca 300
tctattggca ag 312
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<213> 登革病毒型4
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catggtacaa ccgtcgttaa agtaaagtat gaaggagctg gtgcaccctg taaggtgcct 120
attgaaattc gagatgttaa caaagagaag gttgtcggga gaatcatttc ccctactcca 180
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attggtaaa 309
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<211> 226
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒
<400> 9
Met Glu Asn Ile Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln
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Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu
20 25 30
Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ser Pro Val Cys
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Leu Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser
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Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe
65 70 75 80
Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val
85 90 95
Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly
100 105 110
Ser Thr Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala
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Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Lys
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Tyr Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu
165 170 175
Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu
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Ser Ala Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Ser Ile
195 200 205
Val Ser Pro Phe Ile Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val
210 215 220
Tyr Ile
225
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<212> DNA
<213> 乙型肝炎病毒
<400> 10
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<210> 11
<211> 667
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 本发明中的重组多肽
<400> 11
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Gly Arg Ile Ile Ser Pro Thr Pro Phe Ala Glu Asn Thr Asn Ser Val
275 280 285
Thr Asn Ile Glu Leu Glu Arg Pro Leu Asp Ser Tyr Ile Val Ile Gly
290 295 300
Val Gly Asp Ser Ala Leu Thr Leu His Trp Phe Arg Lys Gly Ser Ser
305 310 315 320
Ile Gly Lys Gly Gly Gly Gly Gly Gly Met Ser Tyr Ser Met Cys Thr
325 330 335
Gly Lys Phe Lys Val Val Lys Glu Ile Ala Glu Thr Gln His Gly Thr
340 345 350
Ile Val Ile Arg Val Gln Tyr Glu Gly Asp Gly Ser Pro Cys Lys Thr
355 360 365
Pro Phe Glu Ile Met Asp Leu Glu Lys Arg His Val Leu Gly Arg Leu
370 375 380
Thr Thr Val Asn Pro Ile Val Thr Glu Lys Asp Ser Pro Val Asn Ile
385 390 395 400
Glu Ala Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Ile Ile Gly Val Glu
405 410 415
Pro Gly Gln Leu Lys Leu Asp Trp Phe Lys Lys Gly Ser Ser Ile Gly
420 425 430
Gln Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Thr Met Glu Asn Ile Thr Ser Gly
435 440 445
Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr
450 455 460
Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu
465 470 475 480
Asn Phe Leu Gly Gly Ser Pro Val Cys Leu Gly Gln Asn Ser Gln Ser
485 490 495
Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly
500 505 510
Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu
515 520 525
Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met
530 535 540
Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly Ser Thr Thr Thr Ser Thr Gly
545 550 555 560
Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln Gly Asn Ser Met Phe Pro
565 570 575
Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Thr Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro
580 585 590
Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Lys Tyr Leu Trp Glu Trp Ala Ser
595 600 605
Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe
610 615 620
Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Ala Ile Trp Met Met Trp
625 630 635 640
Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Ser Ile Val Ser Pro Phe Ile Pro Leu
645 650 655
Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val Tyr Ile
660 665
<210> 12
<211> 2004
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 本发明中的重组多肽的核酸序列
<400> 12
atgtcttacg tcatgtgcac tggttctttc aaattggaga aggaggtagc tgaaactcaa 60
catggcactg tcttagttca agttaagtac gaaggaacag atgccccatg caaaatcccc 120
ttctcctccc aagatgaaaa gggtgtcact caaaatggta gattgataac agctaaccca 180
atcgttaccg acaaggagaa acccgtgaat atcgaggccg agcctccttt cggcgaaagt 240
tacatagtag ttggagccgg agaaaaagca ctgaaattgt cttggttcaa aaagggttcc 300
tctattggaa aaggcggtgg tggtggcgga atgagttacg ccatgtgtct gaatacgttt 360
gtgcttaaga aagaggtttc tgaaacgcaa cacggaacca ttcttatcaa ggtggaatac 420
aagggtgagg acgctccatg caagatccca ttttctaccg aagatgggca gggtaaagct 480
cataatggta gactgattac tgctaatcct gttgtaacaa agaaggaaga gccagtcaac 540
atcgaggcag aacctccctt tggcgaatca aacatagtca tagggatagg tgacaaggca 600
ctaaagatta actggtatcg taagggttca tctattggca agggtggggg aggaggagga 660
atgtcttata cgatgtgttc aggcaagttc tctattgaca aagagatggc tgaaacacaa 720
catggtacaa ccgtcgttaa agtaaagtat gaaggagctg gtgcaccctg taaggtgcct 780
attgaaattc gagatgttaa caaagagaag gttgtcggga gaatcatttc ccctactcca 840
tttgctgaga atactaattc agtcactaac atagaactag aacgtccatt ggactcatac 900
atcgtaattg gtgtgggaga ttcagcactt actttacact ggtttagaaa aggaagtagt 960
attggtaaag gtggcggagg tggtggtatg agttactcca tgtgcaccgg gaaattcaaa 1020
gtagttaaag agattgccga gactcagcac ggtacaatcg ttattcgagt gcaatatgaa 1080
ggtgatggaa gtccatgtaa gaccccattt gagataatgg acttggaaaa gaggcacgtt 1140
ctagggaggt tgaccactgt taacccaatt gtgacagaga aagattctcc agtgaatatc 1200
gaagctgaac caccttttgg tgattcttac atcattatcg gagttgaacc tggtcagctt 1260
aagttagatt ggttcaagaa gggctcctca ataggtcagg gaggtggggg tggaggaggt 1320
accatggaaa acatcacttc cggtttcttg ggtcctttgt tggtcttgca ggctggattc 1380
ttcttgttga ctagaatctt gactatccca cagtctttgg actcttggtg gacttccttg 1440
aacttcttgg gtggttcccc agtttgtttg ggtcaaaact cccaatctcc aacttctaac 1500
cactccccaa cttcatgtcc accaatctgt ccaggttaca gatggatgtg tttgagaaga 1560
ttcatcattt tcttgttcat cttgttgttg tgtttgatct tcttgttggt tttgttggac 1620
taccagggta tgttgccagt ttgtccattg attccaggtt ccactactac ttccactggt 1680
ccatgtaaga cttgtactac tccagctcag ggtaactcta tgttcccatc ctgttgttgt 1740
actaagccaa ctgacggtaa ctgtacttgt atcccaattc cttcctcttg ggctttcgct 1800
aagtacttgt gggaatgggc ttctgttaga ttctcctggt tgtccttgtt ggttccattc 1860
gttcagtggt tcgttggttt gtctcctact gtttggttgt ccgctatctg gatgatgtgg 1920
tactggggtc caagcttgta ctctatcgtt tccccattca tccctttgtt gccaatcttc 1980
ttctgtttgt gggtttacat ctag 2004

Claims (8)

1.一种重组多肽，包括与HBsAg的N端连接的每一种登革病毒血清型DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4的EDIII结构域，其中登革病毒血清型DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4的EDIII结构域依序融合，从N端到C端顺序为DENV-1、DENV-3、DENV-4和DENV-2的EDIII结构域，其中每一种登革病毒血清型DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4的EDIII结构域的氨基酸序列分别为SEQ ID NO: 1、2、3和4，其中，所述重组多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO: 11。
2.一种编码如权利要求1所述的重组多肽的核酸。
3.一种被如权利要求2所述的核酸转化或转染的宿主细胞，其中所述宿主细胞表达HBsAg。
4.一种包含如权利要求1所述的重组多肽的生物纳米颗粒。
5.一种生产包含如权利要求1所述的重组多肽的生物纳米颗粒的方法，所述方法包括在适宜的条件下培养如权利要求3所述的宿主细胞，和回收表达的重组多肽或生物纳米颗粒。
6.一种疫苗，包含如权利要求1所述的重组多肽。
7.一种疫苗，包含如权利要求4所述的生物纳米颗粒。
8.如权利要求1所述的重组多肽、如权利要求4所述的生物纳米颗粒或如权利要求6或7所述的疫苗用于制备用于预防登革病毒感染病的药物的用途。
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