KR20180099918A - 동종이합체 단백질 구조물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 T 세포 면역반응과 B 세포 면역반응 모두를 격발시킬 수 있는, 백시바디라 칭해지는 인간 항체-기반 분자와 같은, 재조합 융합 단백질에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이들 특이적인 융합 단백질을 이용하여 암 또는 감염성 질환을 치료하는 방법에 관한 것이기도 하다.

Description

동종이합체 단백질 구조물{HOMODIMERIC PROTEIN CONSTRUCTS}
본 발명은 T 세포 면역반응과 B 세포 면역반응 모두를 격발시킬 수 있는, 백시바디라 칭해지는 인간 항체-기반 분자와 같은, 신규 재조합 융합 단백질에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이들 특이적인 융합 단백질을 이용하여 암 또는 감염성 질환, 예컨대 다발성 골수종 또는 인플루엔자를 치료하는 방법에 관한 것이기도 하다.
DNA 예방접종은 면역반응을 유도하는 기술적으로 간단한 방법이다. 그러나, 소형 동물에 대하여 거두어왔던 성공사례가 임상 시도에서는 아직까지 재현되고 있지 않다. DNA 백신의 효능을 증강시키기 위한 몇가지 전략이 현재 시도되고 있다.
단백질 항원을 항원-제시 세포 (APC)에 표적화시키면 T-세포 및 B-세포 반응을 증강시킬 수 있다. 재조합 면역글로불린 (Ig) 분자들은 이 목적에 아주 적합하다. 예를 들어, 짧은 항원 에피토프는 Ig 불변 영역 중의 β-가닥들 사이의 루프를 대체할 수 있는 한편, APC 상의 표면 분자에 특이적인 가변(V) 영역을 재조합 Ig에 장착시킴으로써 표적화된 항원 전달이 가능하다. 그러나, 이러한 전략은 동정되지 않은 에피토프를 함유하는 보다 크기가 큰 항원에 대하여는 알맞지 않을 뿐만 아니라, 짧은 T 세포 에피토프를 갖는 재조합 Ig 분자들은 입체형태적 에피토프에 대하여는 항체를 유도하지 못한다. 이러한 한계를 극복하기 위하여, 입체형태적 에피토프를 유지하면서 크기가 적어도 약 550 아미노산인 감염성 또는 종양 항원을 발현하는, 표적화된 Ig-기반 동종이합체 DNA 백신(백시바디:백시바디)이 만들어졌다.
케모카인(C-C 모티프) 리간드 3 (CCL3)은 사람에 있어서는 CCL3 유전자에 의해 코딩되는 단백질이다. 대식세포 염증 단백질-1α (MIP-1α: Macrophage inflammatory protein-1α)라고도 알려져 있는 CCL3는 다형핵 백혈구의 모집 및 활성화에 있어서 급성 염증 상태와 관련이 있는 CC 케모카인 패밀리에 속하는 사이노카인이다. 마우스 CCL3는 69 아미노산의 성숙한 케모카인을 코딩하는 단일 카피 유전자인 반면, 인간의 상동체는 복제 및 변이되어, 2개의 비-형질대립 변이체인 LD78α(CCL3) 및 LD78α(CCL3-L1)을 생성하며, 이들 두가지 모두 마우스 CCL3에 대하여 74%의 상동성을 나타낸다.
DNA 백신은 효과 박약으로 인해, 아직까지 사람에 대해 사용되도록 승인되지 못하고 있다. 또한, 여러 감염성 질환에 사용가능한 효과적인 백신은 없다. 특히, 어떠한 치료적 DNA 암 백신도 인체용으로 승인된 바 없다.
WO 2004/076489는 T 세포 면역반응과 B 세포 면역반응을 모두 격발시킬 수 있는, 백시바디라 칭해지는 재조합 인간 항체-기반 분자에 관한 것이다.
US20070298051은 포유동물에서 면역원에 대한 면역반응을 증강시키기 위한MIP-1-알파의 사용에 관한 것이다.
EP920522는 사이토카인 또는 케모카인을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 cDNA 표적 산물을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 벡터 백신에 관한 것이다.
Fredriksen AB 등의 문헌 (Mol Ther 2006;13:776-85)은 종양 항원을 항원-제시 세포에 표적화시키는 DNA 백신에 관한 것이다.
Fredriksen AB 및 Bogen B의 문헌 (Blood 2007;110: 1797-805)은 마우스 케모카인-이디오타입 융합 DNA 백신에 관한 것이다.
본 발명의 구체예의 한가지 목적은 예컨대 골수종 세포로부터 유도된 이디오타입 항원과 같이, 심지어 약한 항원에 대하여도 효과적인 면역반응을 격발시킬 수 있는, 융합 단백질을 제공하는 데 있다.
또한 본 발명의 구체예의 또 다른 목적은 예컨대 골수종 세포로부터 유도된 이디오타입 항원과 같이, 심지어 약한 항원에 대하여도 효과적인 면역반응을 격발하는 융합 단백질을 코딩하는, DNA 폴리뉴클레오타이드와 같은 폴리뉴클레오타이드를 제공하는 데 있다. 이들 폴리뉴클레오타이드들은 질병 특이적이거나 질병과 관련된 항원에 의해 특징지어지는 암 또는 감염성 질환에 대한 면역촉진 조성물 또는 백신으로서 사용될 수 있다.
발명의 개요
본 발명자(들)은 인간 케모카인 LD78β가 전장 길이이건 그의 절단형 버젼이건, 항원 에피토프를 APC의 표면으로 표적화시키는 표적화 단위(targeting units)로서 사용하기에 적합하다는 것을 발견하였다. 케모카인 또는 그의 절단형 버젼은 APC 표면 상의 케모카인 수용체에 대하여 동종이합체 단백질(homdimeric protein) 구조물의 형태로 결합함으로 해서 이들 동일한 케모카인들이 결합하여 보다 효과적인 표적화 및 시그널링을 용이하게 해준다. 이 동종이합체 구조물은 2개의 동일한 항원 에피토프를 APC에 전달하고 이번에는 APC가 이들을 T 세포에 제시하게 해준다. 비교적 큰 크기의 동종이합체 단백질 구조물의 경우에도, 세포들은 온전한 분자들을 생산 및 배출할 수 있다.
따라서, 첫번째 측면에서, 본 발명은 2개의 동일한 아미노산 사슬들로 된 동종이합체 단백질에 관한 것으로서, 상기 각 아미노산 사슬은, SEQ ID NO:1의 아미노산 서열 5-70과 적어도 80%의 서열 성동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 표적화 단위 및 항원 단위를 포함하여 이루어지며, 여기서 상기 표적화 단위와 항원 단위는 이합체화 모티프(dimerization motif)를 통해 연결되어 있는 것이다.
두번째 측면에서, 본 발명은 2개의 동일한 아미노산 사슬들로 된 동종이합체 단백질에 관한 것으로서, 상기 각 아미노산 사슬은, SEQ ID NO:1의 아미노산 서열 3-70을 포함하는 표적화 단위 및 항원 단위를 포함하여 이루어지며, 여기서 상기 표적화 단위와 항원 단위는 이합체화 모티프를 통해 연결되어 있는 것이다.
세번째 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 동종이합체 단백질을 형성할 수 있는 단량체 단백질(monomeric protein)을 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 의약으로서 사용하기 위한, 본 발명에 따른 동종이합체 단백질에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 의약으로서 사용하기 위한, 본 발명에 따른 동종이합체 단백질을 형성할 수 있는 단량체 단백질을 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 동종이합체를 포함하는 의약 조성물에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 동종이합체 단백질을 형성할 수 있는 단량체 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 의약 조성물에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 동종이합체 단백질을 형성할 수 있는 단량체 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 :
a) 본 발명에 따른 핵산 분자를 세포 집단 내로 형질감염(transfecting)시키는 단계;
b) 상기 세포 집단을 배양하는 단계;
c) 상기 세포 집단으로부터 발현된 동종이합체 단백질을 수집 및 정제하는 단계
를 포함하여 이루어지는, 본 발명에 따른 동종이합체 단백질의 제조 방법에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 동종이합체 단백질 또는 본 발명에 따른 동종이합체 단백질을 형성할 수 있는 단량체 단백질을 코딩하는 핵산 분자의 면역학적 유효량을 포함하여 이루어지는 암 또는 감염성 질환에 대한 백신에 관한 것으로서, 여기서 상기 백신은 T-세포 면역반응 및 B-세포 면역반응의 두가지 모두를 격발할 수 있는 것이고 여기서 상기 동종이합체 단백질은 상기 암 또는 감염성 질환과 관련된 항원 단위를 함유하는 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 동종이합체 단백질 또는 본 발명에 따른 동종이합체 단백질을 형성할 수 있는 단량체 단백질을 코딩하는 핵산 분자의 면역학적 유효량을 포함하여 이루어지는 면역조절(immunomdulating) 또는 면역자극(immunostimulating) 조성물에 관한 것으로서, 여기서 상기 면역조절 또는 면역자극 조성물은 T-세포 면역반응 및 B-세포 면역반응의 두 가지 모두를 격발할 수 있는 것이고 여기서 상기 동종이합체 단백질은 상기 암 또는 감염성 질환과 관련된 항원 단위를 함유하는 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 동종이합체 단백질 또는 본 발명에 따른 동종이합체 단백질을 형성할 수 있는 단량체 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하여 이루어지는, 환자에 있어서 암 또는 감염성 질환을 치료하는 방법에 관한 것으로서, 여기서 상기 동종이합체 단백질은 상기 암 또는 감염성 질환과 관련된 항원 단위를 함유하는 것이다.
발명의 상세한 설명
DNA 백신의 효능은 증가될 필요가 있다. 마우스에 있어서 한가지 유망한 전략은 케모카인 수용체를 경유하여 항원을 항원-제시 세포(APC)에 표적화시키는 융합 단백질을 인코딩하는 DNA를 구축하는 것이다. 이 전략은 대형 동물과 사람에게도 개선된 DNA 백신을 제공할 수 있도록 확장시키는 것이 중요하다. 본 발명에 따라, 인간 MIP-1α 케모카인을 서로 다른 여러 가지 항원 단위에 융합시킬 수 있다. 이 융합 단백질은 각각 표적화 단위와 항원 단위의 기능적 활성과 입체배열적 정확성을 견지한다. 융합 단백질은 클로닝된 인간 CD4+ T 세포의 반응을 향상시킬 수 있다. 뿐만 아니라, LD78β 융합 단백질은 마우스 케모카인 수용체에 결합하므로, 인간 DNA 백신을 마우스에서 시험할 수 있다. 본 발명에 따른 LD78β DNA 융합 백신은 플라스미드 주사 및 피부 전기천공(electroporation)에 이어서 마우스에서 개선된 T 세포 및 항체 반응을 유도하였다. CD8+ T 세포 반응이 특히 증강되는데, 이는 효과적인 크로스-프라이밍을 나타내는 것이다. 본 발명자들은 LD78β의 2 아미노산 NH2-절단형(절단형) 버젼이 시험관내에서 전장 LD78β에 비해 마우스 세포에 훨씬 더 잘 결합한다는 것을 입증하였다. 놀랍게도 LD78 β의 전장 버젼은 생체내 마우스 모델에서 더 우수한 효과를 나타내었다. LD78β-백신 단백질은 본 발명의 발명자들에 의해 레수스 마카크(히말라야 원숭이: Rhesus macaque) CCR5에 결합하는 것으로 밝혀짐에 따라, 비인간 영장류에 있어서 표적화된 DNA 면역을 위한 단계를 세팅할 수 있었다.
본 발명에 따른 백시바디는 각 사슬이 Ig 힌지와 CH3에 직접 결합된 표적화 단위로 이루어진 것으로서, 이들의 조합(combination)에 의해 공유적인 동종이합체화(covalent homodimerizatin)가 유도된 것인, 재조합 Ig-기반 동종이합체 백신일 수 있다 (도 1A).
마우스 CCL3는 69 아미노산의 성숙한 케모카인을 인코딩하는 단일 카피 유전자인 반면, 인간의 상동체는 복제 및 변이되어 2개의 비대립형질 변이체인 LD78α (CCL3) 및 LD78β (CCL3-L1)가 생성되는데, 이들 두가지 모두는 마우스 CCL3에 대해 74%의 상동성을 나타낸다. 이들 2 변이체들은 96%의 상동성을 공유하며, 2 위치가 S인지 또는 P인지, 그리고 39 위치 및 47 위치에서 G와 S가 맞바뀌었다는 점에서 서로 다르다.
본 발명에 따라, 인간 CCL3 변이체 및 여러가지 서로 다른 항원 단위들을 구축하여 기능성 단백질로서 발현시킬 수 있다. 특히, 본 발명은 융합 백신에 LD78β 및 그의 천연 이소형을 이용함으로써 항원-제시 세포로의 항원 전달을 표적화하기 위한 것이다.
본 발명에 따른 백시바디는 백신(면역자극 조성물)의 면역원성을 향상시키는 것을 목적으로 한다. 본 발명에는 전문적인 항원-제시 세포 상의 LD78β 수용체로 항원 전달을 표적화시키는 융합 단백질을 코딩하는 DNA 백신도 포함된다.
본 발명의 발명자들은 LD78β 또는 그의 NH2-절단형 버젼이 구비된 백시바디들이 비표적화된 대조군 백시바디들에 비해, 시험관내에서 쥐 또는 레수스 마카크 또는 인간 CCR1 및/또는 CCR5 (LD78β에 대한 수용체)를 발현하는 세포에 결합하여 시험관내에서 항원 전달을 개시할 뿐 아니라 DNA 주입 및 전기천공에 이어서 생체내에서 증가된 체액성 및 세포성 면역 반응을 나타낸다는 것을 발견하였다.
본 발명에 따른 재조합 단백질은 다발성 골수종을 비롯하여 감염 질환이나 여러 종류의 암을 치료하는데 유용한 인간 항체-유사 분자일 수 있다. 이 분자들은 또한 백시바디(Vaccibodies)라 칭해지며, APC에 결합하여 T 세포 면역반응과 B 세포 면역반응을 두가지 모두 격발시킬 수 있다. 뿐만 아니라, 백시바디는 APC에 2가적으로 결합하여 강력한 면역 반응의 보다 효율적인 유도를 촉진한다. 백시바디는 APC 상의 표면 분자에 대해 특이성을 갖는 표적화 단위 및 힌지 영역 및 Cγ3 도메인과 같은 이합체화 모티프를 통해 상기 표적화 단위와 연결된 항원 단위로 구성되며, 여기서 항원 단위는 COOH-말단 또는 NH2-말단이다. 본 발명은 또한 이 재조합 단백질을 코딩하는 DNA 서열, 이들 DNA 서열을 포함하는 발현 벡터, 상기 발현 벡터를 포함하는 세포주, 백시바디 DNA, 백시바디 RNA, 또는 백시바디 단백질에 의한 우선적인 면역에 의한 포유동물 치료법, 및 마지막으로 상기 분자들을 함유하는 약물 및 키트에 관한 것이다.
본 발명에 따른 단백질에 있어서 이합체화 모티프는 힌지 영역과 면역글로불린 도메인(예컨대 Cγ3 도메인), 예컨대 카르복시말단 C 도메인 (CH3 도메인), 또는 상기 C 도메인에 실질적으로 상동적인 서열을 포함하도록 구축될 수 있다. 힌지 영역은 Ig 유도된 것일 수 있고 예컨대 디설파이드 브릿지(들)과 같은 내부사슬 공유 결합(들)의 형성을 통해 이합체화하는데 기여할 수 있다. 이에 더해, 이것은 도메인들 간에 유연한 스페이서로서 기능하여, 2개의 표적 부위들을 서로 다른 여러가지 거리에서 발현되는 APC 상의 2개의 표적 분자에 동시적으로 결합시킬 수 있다. 면역글로불린 도메인은 예컨대 소수성 상호반응과 같은 비공유적 상호반응을 통한 동종이합체화에 기여한다. 바람직한 구체예에서 CH3 도메인은 IgG로부터 유도된다. 이 이합체화 모티프들은 다른 다합체화(multimerizatin) 모이어티들 (예컨대 다른 Ig 이소형/서브클래스로부터)과 교환될 수 있다. 좋기로는, 이합체화 모티프는 인간 IgG와 같이, 천연 인간 단백질로부터 유도되는 것이 바람직하다.
이합체화 모티프는 항원 단위 및 표적화 단위와 관련하여 어떠한 방향성이든 다 가질 수 있다. 일 구체예에서 항원 단위는 이합체화 모티프의 COOH-말단부에 있고, 표적화 단위는 이합체화 모티프의 N-말단에 있다. 또 다른 구체예에서, 항원 단위는 이합체화 모티프의 N-말단에 있고, 표적화 단위는 이합체화 모티프의 COOH-말단부에 있다.
본 발명에 참조 병합된 국제출원 WO 2004/076489에는 본 발명에 사용될 수 있는 핵산 서열과 벡터들이 개시되어 있다.
본 발명에 따른 단백질은 어떠한 기원의 어떠한 폴리펩타이드에 대해서든 면역반응을 유도하는데 적합할 수 있다. 특이적인 에피토프를 포함하는 충분한 길이의 여하한 항원 서열을 본 발명에 따른 단백질에서 항원 단위로 사용할 수 있다. 이러한 항원 단위의 최소 길이는 약 9 아미노산 길이일 수 있다. 따라서 몇몇 구체예에서, 항원 단위는 그 항원 단위를 인코딩하는 핵산 서열 중 적어도 약 27 뉴클레오타이드에 상응하는 적어도 약 9개의 아미노산의 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 항원 서열은 암 단백질 또는 감염성 물질로부터 유도될 수 있다. 이러한 암 서열의 예로는 텔로머라제, 더욱 구체적으로 hTERT, 티로시나제, TRP-1/ TRP-2 흑색종 항원, 전립선 특이 항원 및 이디오타입을 들 수 있다. 감염성 물질은 세균, 예컨대 결핵균 및 블루셀라병으로부터의 OMP31, 또는 바이러스 기원, 더욱 구체적으로 HIV에 유래하는 서열, 예컨대 gp120 유래 서열, HSV-2로부터의 당단백질 D, 및 인플루엔자 바이러스 항원, 예컨대 헤마글루티닌, 뉴클레오단백질 및 M2일 수 있다. 백시바디 포맷 내로 이러한 서열이 삽입되면 면역 반응의 양팔 모두가 활성화될 수도 있다. 별법으로, 항원 단위는 항체 또는 그의 단편, 예컨대 골수종 또는 림프종 세포에 의해 생산된 모노클로날 Ig로부터 유도된 C-말단 scFv일 수 있으며, 이들은 B 세포 림프종 또는 다발성 골수종을 앓는 환자에 있어서 골수종/림프종 M 성분이라 칭해지기도 한다. 이러한 scFv는 이디오타입 항원을 나타낸다.
한가지 특정 구체예에서, 본 발명에 설명된 실시예에서도 사용되는 바와 같이, 본 발명에 따른 단백질의 항원 단위는 BALB/c 형질세포종 MOPC315.4로부터 유래하는 골수종 단백질 M315의 scFv이다. M315의 λ2315 경쇄는 CDR3 로프에서 3가지로 정의된 체세포 돌연변이를 일으키며 잘 정의된 시스템에서 모델 이디오타입 T 세포 에피토프로서 기능한다(Bogen, Malissen 등 1986; Bogen 및 Lambris 1989).
백시바디 단백질, 백시바디 DNA, 또는 백시바디 RNA에 의한 면역화 (후자의 2가지는 근육내 또는 피내 주사에 의해 수행되며 후속적으로 전기천공을 실시할 수도 있고 실시하지 않을 수도 있음) 모두도 가능성 있는 방법들이다.
본 발명에 따른 단백질의 표적화 단위는 케모카인 수용체에 대한 결합을 통해 그 단백질을 APC에 표적화시킨다.
본 발명에 따른 단백질은 유전적으로 조립되어, NS0 세포, 293E 세포, CHO 세포 또는 COS-7 세포와 같은 적절한 숙주 세포 내로 DNA가 형질감염될 수 있다. 형질감염체(Transfectants)는 재조합 단백질을 생산 및 분비한다.
본 발명은 본 발명에 따른 전술한 재조합 기반 단백질, DNA/RNA 서열, 또는 발현 벡터를 포함하는 의약품에 관한 것이다. 이러한 의약품은 또한 적절하다면, 약학적으로 상용가능한 담체를 부가적으로 포함한다. 이러한 의약품의 적절한 담체 및 포뮬레이션은 당업자에게 잘 알려져 있다. 적절한 담체는 인산염-완충된 흔한 염 용액, 물, 에멀젼, 예컨대 유/수 에멀젼, 보습제, 멸균 용액 등이다. 의약품은 경구 또는 비경구적으로 투여될 수 있다. 비경구 투여법은 국소, 동맥내, 근육내, 피하, 척수내, 경막내, 뇌실/심실내, 정맥내, 복강내 또는 비내 투여일 수 있다. 적절한 투여량은 주치의에 의해 결정되며 다른 인자들, 예컨대 환자의 연령, 성별 및 체중, 투여 종류 등에 따라서 달라질 수 있다. 또한, 본 발명은 본 발명의 분자를 인코딩하는 핵산 또는 그의 축퇴성(degenerative) 변이체의 면역학적 유효량을 포함하는 암 또는 감염성 질환에 대한 백신 조성물 또는 면역자극 조성물에 관한 것으로, 여기서 상기 조성물은 T-세포 면역반응과 B-세포 면역반응의 두가지 모두를 격발시킬 수 있는 것이다. 본 발명은 또한 진단, 의료 또는 과학적 목적으로 백시바디 DNA, RNA, 또는 단백질을 포함하는 키트에 관한 것이기도 하다.
본 발명은 또한 본 발명의 분자를 포함하는 벡터를 세포 집단 내로 형질감염시키는 단계; 세포 집단을 배양하는 단계; 상기 세포 집단으로부터 발현된 재조합 단백질을 수집하는 단계; 및 발현된 단백질을 정제하는 단계를 포함하여 이루어지는, 본 발명의 재조합 분자를 제조하는 방법에 관한 것이기도 하다.
전술한 뉴클레오타이드 서열은 예컨대 특이적 프로모터의 조절 하에, 유전자 치료에 적합한 벡터 내로 삽입되어, 세포 내로 도입되는 것이 바람직하다. 바람직한 일 구체예에서, 상기 DNA 서열을 포함하는 벡터는 바이러스, 예컨대 아데노바이러스, 백시니아 바이러스 또는 아데노-관련 바이러스이다. 레트로바이러스가 특히 바람직하다. 적절한 레트로바이러스의 예로는 예컨ㄷMoMuLV 또는 HaMuSV를 들 수 있다. 유전자 치료의 목적상, 본 발명에 따른 DNA/RNA 서열은 또한콜로이드 분산물 형태로 표적 세포에 전달될 수도 있다. 여기에는 예컨대 리포좀 또는 리포플렉스가 포함된다.
본 발명은 또한 폴리펩타이드 또는 본 발명에 정의된 아미노산 서열(들)과 일정한 서열 동일성 또는 서열 상동성을 갖는 폴리펩타이드 또는 본 발명에 정의된 특이적인 특성을 갖는 폴리펩타이드 내의 도메인 또는 모티프의 사용을 포괄한다. 본 발명은 특히, SEQ ID NO: 1과 어느 정도의 서열 동일성을 갖는 펩타이드 또는 그의 상동체(homologues)를 포괄한다. 본 발명에서 "상동체"라 함은 주제의 아미노산 서열 또는 주제의 뉴클레오타이드 서열과 서열 동일성을 갖는 물질을 의미하며, 상기 주제의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 1인 것이 바람직하다.
한가지 측면에서, 상동성 아미노산 서열 및/또는 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 1의 폴리펩타이드의 기능적 활성을 유지하고/유지하거나 그 활성을 증대시키는 폴리펩타이드를 제공 및/또는 인코딩하여야 한다.
본 발명의 문맥 상, 상동성 서열은 주제의 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%과 동일할 수 있는 아미노산 서열을 포함하는 것으로 고려된다. 일반적으로, 상동체는 주제의 아미노산 서열과 동일한 활성 부위 등을 포함할 것이다. 비록 상동성은 유사성(즉 유사한 화학적 특성/기능을 갖는 아미노산 잔기들)의 관점에서 고려될 수도 있으나, 본 발명의 문백상 상동성은 좋기로는 서열 동일성 측면의 상동성을 의미하는 것이다.
서열 동일성 비교는 육안으로 수행할 수도 있고, 보다 일반적으로는 용이하게 입수가능한 서열비교 프로그램의 도움을 받아 수행할 수도 있다. 이러한 시판되는 컴퓨터 프로그램은 2 이상의 서열들 간에 차이점(들)을 유도했을 수 있는 진화 과정을 가장 잘 반영하는 2 이상의 서열들을 정렬시키는 복잡한 비교 알고리듬을 이용한다. 따라서, 이들 알고리듬들은 동일 또는 유사한 아미노산들의 정렬은 보상해주고, 갭의 삽입, 갭의 연장 및 비유사 아미노산들의 정렬에는 벌점을 주는 스코어링 시스템을 이용하여 작동한다. 비교 알고리듬의 이러한 스코어링 시스템은 다음을 포함한다:
i) 갭이 삽입될 때마다 벌점을 배당하기 (갭 벌점),
ii) 기존의 갭이 다른 위치까지 연장될 때마다 벌점을 배당하기 (연장 벌점)
iii) 동일 아미노산이 정렬될 경우 높은 점수를 배당하기, 및
iv) 동일하지 않은 아미노산의 정렬시에는 여러가지 점수를 배당하기.
대부분의 정렬 프로그램에서는 갭 벌점을 조절할 수 있다. 그러나, 서열 비교에 이러한 소프트웨어를 사용할 때는 디폴트 값을 이용하는 것이 바람직하다.
동일하지 않은 아미노산들의 정렬에 주어지는 점수는 치환 매트릭스라고도 칭해지는 스코어링 매트릭스에 따라 배당된다. 이러한 치환 매트릭스에서 제공되는 점수는 진화과정에서 하나의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환될 가능성은 가변적이고 치환될 아미노산의 물리적/화학적 특성에 따라 달라진다는 사실을 반영한 것이다. 예를 들어, 극성 아미노산이 다른 극성 아미노산으로 치환될 가능성은 소수성 아미노산으로 치환될 가능성에 비해 더 높다. 따라서, 스코어링 매트릭스는 동일한 아미노산들에는 최고점을, 동일하지는 않지만 유사한 아미노산들에 대해서는 그보다 낮은 점수를, 그리고 동일하지도, 유사하지도 않은 아미노산 들에 대하여는 더더욱 낮은 점수를 배당하게 된다. 가장 흔히 이용되는 스코어링 매트릭스로른 PAM 매트릭스 (Dayhoff 등 (1978), Jones 등 (1992)), BLOSUM 매트릭스(Henikoff 및 Henikoff (1992)) 및 Gonnet 매트릭스(Gonnet 등 (1992))을 들 수 있다.
이러한 정렬을 수행하는데 적합한 컴퓨터 프로그램의 비제한적인 예로는Vector NTI (Invitrogen Corp.) 및 ClustalV, ClustalW 및 ClustalW2 프로그램 (Higgins DG & Sharp PM (1988), Higgins 등 (1992), Thompson 등 (1994), Larkin 등 (2007)을 들 수 있다. 여러가지 정렬 도구들을 www.expasy.org에 있는 ExPASy Proteomics 서버로부터 선택할 수 있다. 서열 정렬을 수행할 수 있는 또 다른 소프트웨어의 예는 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)인데, 이것은 National Center for Biotechnology Information의 웹페이지로부터 입수가능하며, 현재http://www.ncbi.nlm.nih.gov/에서 찾아볼 수 있는데, 이것은 Altschul 등 (1990) J. Mol. Biol. 215; 403-410에 의해 최초로 설명되었다.
일단 소프트웨어가 정렬을 수행하면, % 유사성(% similarity) 및 % 서열 동일성(% sequence identity)을 구할 수 있다. 소프트웨어는 일반적으로 이 작업도 서열 비교의 일부로서 수행하며 결과를 수치로 제시해준다.
일 구체예에서, 서열 정렬을 수행하는데 ClustalW 소프트웨어를 사용하는 것이 바람직하다. 좋기로는, ClustalW를 이용한 정렬은 쌍별 정렬(pairwise alignment)을 위해 다음과 같은 변수들을 이용하여 수행되는 것이 바람직하다:
Figure pat00001
ClustalW2는 European Bioinformatics Institute가 제공하는 EMBL-EBI 웹페이지 www.ebi.ac.uk의 예컨대 툴(tool) - 서열분석(sequence analysis) -에 의해 인터넷 상으로 이용가능하다. 현재, ClustalW2 툴의 정확한 주소는 www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2이다.
또 다른 구체예로, 서열 정렬을 수행하기 위해 Vector NTI (Invitrogen)에서 프로그램 Align X를 사용하는 것이 바람직하다. 일 구체예에서, Exp10는 디폴트 셋팅과 함께 사용될 수 있다:
갭 오프닝 벌점: 10
갭 연장 벌점: 0.05
갭 분리 벌점 범위: 8
스코어 매트릭스: blosum62mt2
따라서, 본 발명은 또한 본 발명에 정의된 단백질, 폴리펩타이드, 모티프 또는 도메인의 모든 아미노산 서열의 변이체, 상동체 및 유도체, 특히 SEQ ID NO: 1의 그것들을 사용하는 것도 포괄한다.
상기 서열, 특히 SEQ ID NO: 1의 변이체, 상동체 및 유도체의 서열들 역시도 아미노산 잔기의 결실, 삽입 또는 치환을 포함할 수 있으며 이로 인해 사일런트 변화가 일어나고 기능적으로 동등한 물질이 결과될 수 있다. 물질의 2차 결합 활성이 유지되는 한, 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및 또는 양쪽성의 유사성에 기초해서 고의적으로 아미노산 치환을 만들 수 있다. 예를 들어, 음하전된 아미노산에는 아스파르트산 및 글루탐산이 포함되고; 양하전된 아미노산에는 라이신 및 아르기닌이 포함되며; 유사한 친수성 값을 갖는 하전되지 않은 극성 헤드기가 있는 아미노산으로는 류신, 이소류신, 발린, 글라이신, 알라닌, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 쓰레오닌, 페닐알라닌 및 티로신을 들 수 있다.
본 발명은 또한 예컨대 염기성은 염기성으로, 산성은 산성으로, 극성은 극성으로 등과 같이, 유사한 것들끼리 치환되는 것인 보존적 치환(기존의 아미노산 잔기를 다른 잔기로 맞교환하는 것을 의미하기 위해 본 발명에서는 치환(substitution) 및 대체(replacement)라는 용어를 모두 사용한다) 역시도 포괄한다. 한 부류의 잔기에서 다른 부류의 잔기로, 또는 별법으로, 오르니틴(이하 Z라 표시함), 디아미노부티르산 오르니틴 (이하 B라 표시함), 노르류신 오르니틴 (이하 O라 표시함), 피릴알라닌, 티에닐알라닌, 나프틸알라닌 및 페닐글라이신과 같은 비자연적인 아미노산의 도입을 포함하는 비보존적 치환 역시도 일어날 수 있다.
예컨대 염기성 아미노산 (아르기닌, 라이신 및 히스티딘), 산성 아미노산 (글루탐산 및 아스파르트산), 지방족 아미노산(알라닌, 발린, 류신, 이소류신), 극성 아미노산(글루타민, 아스파라긴, 세린, 쓰레오닌), 방향족 아미노산(페닐알라닌, 트립토판 및 티로신), 히드록실 아미노산(세린, 쓰레오닌), 대형 아미노산(페닐알라닌 및 트립토판) 및 소형 아미노산(글라이신, 알라닌) 그룹들 내에서 보존적 치환이 일어날 수 있다.
비자연적인 아미노산에 의한 치환의 예로는: 알파* 및 알파-이치환된* 아미노산, N-알킬 아미노산*, 락트산*, 트리플루오로티로신*과 같은 천연 아미노산의 할라이드 유도체, p-Cl-페닐알라닌*, p-Br-페닐알라닌*, p-I-페닐알라닌*, L-알릴-글라이신*, β-알라닌*, L-α-아미노 부티르산*, L-γ-아미노 부티르산*, L-α-아미노 이소부티르산*, L-ε-아미노 카프로산,#, 7-아미노 헵탄산*, L-메티오닌 설폰#*, L-노르류신*, L-노르발린*, p-니트로-L-페닐알라닌*, L-히드록시프롤린#, L-티오프롤린*, 4-메틸-Phe*, 펜타메틸-Phe*와 같은 페닐알라닌(Phe)의 메틸 유도체, L-Phe (4-아미노)#, L-Tyr (메틸)*, L-Phe (4-이소프로필)*, L-Tic (1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-3-카르복실산)*, L-디아미노프로피온산 # 및 L-Phe (4-벤질)*을 들 수 있다. * 표시는 유도체의 소수 특성을 가리키기 위하여, (상동적 또는 비보존적 치환과 관련한) 전술한 목적을 위해 사용된 것인 반면, # 표시는 유도체의 친수 특성을 나타내기 위해 사용된 것이고, #*는 양쪽성 특성을 나타내기 위해 사용된 표시이다.
변이체 아미노산 서열은 글라이신 또는 β-알라닌 잔기와 같은 아미노산 스페이서에 더해서 메틸, 에틸 또는 프로필기와 같은 알킬기를 비롯한 서열의 2 아미노산 잔기들 사이에 삽입될 수 있는 적절한 스페이서기를 포함할 수 있다. 또 다른 형태의 변이로는, 당업자들에게 익히 알려져 있는 바와 같이, 펩토이드 형태의 1 이상의 아미노산 잔기들의 존재를 들 수 있다. 사안을 명확히 하기 위해, 본 발명에서 "펩토이드 형태 (peptoid form)"이라 함은 α-탄소 치환기가 α-탄소가 아닌, 그 잔기의 질소 원자 상에 존재하는 아미노산 잔기 변이체를 가리킨다. 펩타이드를 펩토이드 형태로 제조하는 방법은 예컨대 문헌 [Simon RJ 등 (1992), Horwell DC. (1995)]에 알려져 있다.
일 구체예에서, 본 발명에 따른 동종이합체 단백질에 사용되는 표적화 단위 변이체는 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열 5-70을 가지며 적어도 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 78%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 변이체이다.
한가지 측면에서, 본 발명에서 사용되는 단백질 또는 서열은 정제된 형태이다. "정제된"이라는 용어는 주어진 성분이 고농도로 존재함을 의미한다. 성분은 조성물 내에 존재하는 주활성 성분인 것이 바람직하다.
"변이체(variant)" 또는 "변이체들(variants)"은 단백질, 폴리펩타이드, 단위, 모티프, 도메인 또는 핵산을 가리킨다. "변이체"라는 용어는 "돌연변이체(mutant)"라는 용어와 호환적으로 사용될 수 있다. 변이체는 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열 각각의 1 이상의 위치에서 삽입, 치환, 변위, 절단, 및/또는 역전을 포함한다. "폴리펩타이드 변이체", "폴리펩타이드", "변이체" 및 "효소 변이체"라는 용어는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열로부터 변형된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드/단백질을 의미한다. 폴리펩타이드 변이체는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 5-70과 소정의 백분율, 예컨대, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
"핵산 변이체"는 본 발명에 제시된 뉴클레오타이드 서열과 혼성화할 수 있는 서열과 상보적인 서열들을 포함할 수 있다. 예를 들어, 어떤 변이체 서열은 스트린젠트 조건(stringent conditions), 예컨대, 50℃ 및 0.2X SSC (1X SSC = 0.15 M NaCl, 0.015　M 구연산나트륨, pH 7.0)의 조건 하에서, 본 발명에 설명된 뉴클레오타이드 서열과 혼성화할 수 있는 서열에 상보적이다. 보다 구체적으로, 변이체라는 용어는 예컨대, 65℃ 및 0.1X SSC와 같은 고스트린젠트 조건 하에서, 본 발명에 설명된 뉴클레오타이드 서열과 혼성화할 수 있는 서열에 상보적인 서열들을 포괄한다. 핵산 변이체의 융점(Tm)은 야생형 핵산의 Tm보다 약 1, 2, 또는 3℃ 낮다. 핵산 변이체는 SEQ ID NO: 1을 인코딩하는 핵산 또는 본 발명에 따른 동종이합체 단백질을 형성할 수 있는 단량체 단백질을 인코딩하는 핵산과 예컨대, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
본 발명에서 "동종이합체 단백질"이라는 용어는 수소결합, 이온(하전된) 상호반응, 실질적인 공유 디설파이드 결합 또는 이들 상호반응들의 조합에 의해, 함께 단량체 또는 이합체 단백질을 형성할 수 있는, 아미노산 또는 서브유닛의 2개의 개별적인 가닥들을 포함하는 단백질을 가리킨다.
본 발명에서 "이합체화 모티프(dimerization motif)"라는 용어는 힌지 영역 및 이합체화에 기여할 수 있는 임의의 제2 도메인을 포함하는 표적화 단위와 항원 단위 사이의 아미노산 서열을 가리킨다. 이 제2 도메인은 면역글로불린 도메인일 수 있고, 임의로 힌지 영역과 제2 영역은 링커를 통해 연결된다. 따라서, 이합체화 모티프는 항원 단위와 표적화 단위를 연결하는 역할을 할 뿐만 아니라, 2개의 단량체 단백질들을 본 발명에 따른 동종이합체 단백질이 되도록 이합체화시키는 것을 용이하게 해주는 힌지 영역도 함유한다.
본 발명에서 "표적화 단위(targeting unit)"라는 용어는 CD4+ T 세포에 대한 MHC 클래스 II-제한된 제시를 위해 또는 MHC 클래스 I 제한에 의해 CD8+ T 세포로 크로스 제시를 제공하기 위하여 마우스 또는 인간 APC에 단백질을 그의 항원과 함께 전달하는 단위를 가리킨다.
본 발명에서 "항원 단위(antigenic unit)"라는 용어는 항체 또는 T 세포 상의 표면 수용체와 같은 면역계의 다른 성분에 의해 특이적으로 인식될 있는 펩타이드와 같은 모든 분자를 일컫는다. 이 정의에는 항체의 이디오타입 면역원과 같은, 면역반응을 유도할 수 있는 면역원도 포함된다. "에피토프" 또는 "항원 에피토프"라는 용어는 항원 단위 내의 짧은 펩타이드 서열에 의해 제공되는 분자 표면과 같은 독특한 분자 표면을 가리킨다. 몇몇 구체예에서 항원 단위는 2 이상의 항원 에피토프를 포함한다.
"힌지 영역(hinge region)"이라 함은 사슬간 공유결합(들), 예컨대 디설파이드 브릿지(들)의 형성을 통하는 것과 같이, 이합체화를 용이하게 해주는 동종이합체 단백질의 펩타이드 서열을 가리킨다. 힌지 영역은 Ig, 예컨대 IgG3의 힌지 엑손 h1+h4과 같이 Ig로부터 유도될 수 있다.
본 발명에서 "면역자극 조성물"이라 함은 예컨대 림프구 기능, 특히 T 세포 활성화와 같은 T 세포 기능을 활성화 또는 억제함으로써, 면역계를 활성화시킬 수 있는 치료용 조성물을 가리킨다.
본 발명의 특정 구체예
몇몇 구체예에서 항원 단위는 암과 연관되거나 암에 특이적인 항원이다.
"암과 연관된 항원(cancer associated antigen)"이라는 용어는 특정 암에 대하여 반드시 특이적이어야 할 필요는 없으며, 이 암의 암 세포 표면에서 과발현되는 항원을 모두 지칭한다. 이 용어는 "암 항원"이라는 용어와 호환적으로 사용될 수 있다.
몇몇 구체예에서, 항원 단위는 항원 scFv이다. 몇몇 구체예에서는, (G4S)3 링커와 같은 링커가 항원 scFv 내의 VH와 VL을 연결한다. 몇몇 구체예에서는, 항원 scFv가 골수종 또는 림프종 세포에 의해 생산되는 모노클로날 Ig로부터 유도된다.
몇몇 구체예에서 항원 단위는 텔로머라제 또는 그의 기능성 부분이다. 몇몇 구체예에서 텔로머라제는 hTERT이다.
몇몇 구체예에서, 항원 단위는 흑색종 항원이다. 몇몇 구체예에서, 흑색종 항원은 티로시나제, TRP-1, 또는 TRP-2이다.
몇몇 구체예에서, 항원 단위는 전립선 암 항원이다. 몇몇 구체예에서, 전립선 암 항원은 PSA이다.
몇몇 구체예에서, 항원 단위는 자궁경부암 항원이다. 몇몇 구체예에서, 자궁경부암 항원은 인간 유두종 바이러스 E1, E2, E4, E6, 및 E7으로 이루어진 리스트로부터 선택된다.
몇몇 구체예에서, 항원 단위는 세균으로부터 유래된다.
몇몇 구체예에서, 세균으로부터 유래된 항원 단위는 결핵 항원이다.
몇몇 구체예에서, 세균으로부터 유래된 항원 단위는 브루셀라병 항원이다.
몇몇 구체예에서, 항원 단위는 바이러스로부터 유래한다.
몇몇 구체예에서, 바이러스로부터 유래된 항원 단위는 HIV로부터 유래한다. 몇몇 구체예에서, HIV로부터 유래된 항원 단위는 gp120 또는 Gag로부터 유래된다.
몇몇 구체예에서, 항원 단위는 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA), 뉴클레오단백질, 및 M2 항원; 헤르페스 심플렉스 2 항원 당단백질 D; 및 예컨대, E1, E2, E6, E7, L1 및 L2로 이루어진 리스트로부터 선택된 것과 같은 인간 유두종 바이러스 항원으로 이루어진 리스트로부터 선택된다.
몇몇 구체예에서, 이합체화 모티프는 힌지 영역과 임의의 또 다른 도메인, 즉 링커를 통해 임의로 연결된 면역글로불린 도메인과 같이 이합체화를 용이하게 해 주는 다른 도메인을 포함하여 이루어진다.
몇몇 구체예에서, 힌지 영역은 Ig, 예컨대 IgG3으로부터 유도된다.
몇몇 구체예에서, 힌지 영역은 1, 2 또는 수개의 공유결합을 형성하는 능력을 갖는다. 몇몇 구체예에서, 공유결합은 디설파이드 브릿지이다.
몇몇 구체예에서, 이합체화 모티프의 면역글로불린 도메인은 카르복시말단 C 도메인, 또는 상기 C 도메인에 실질적으로 상동적인 서열이다. 몇몇 구체예에서, 카르복시말단 C 도메인은 IgG로부터 유래한 것이다.
몇몇 구체예에서, 이합체화 모티프의 면역글로불린 도메인은 동종이합체화하는 능력을 갖는다.
몇몇 구체예에서, 이합체화 모티프의 면역글로불린 도메인은 비공유적 상호반응을 통해 동종이합체화하는 능력을 갖는다. 몇몇 구체예에서, 비공유적 상호반응은 소수성 상호반응이다.
몇몇 구체예에서, 이합체화 도메인은 CH2 도메인을 포함하지 않는다.
몇몇 구체예에서, 이합체화 모티프는 인간 IgG3의 CH3 도메인에 링커를 통해 연결된 힌지 엑손 h1 및 h4로 이루어진다.
몇몇 구체예에서, 힌지 영역을 면역글로불린 도메인과 같이 이합체화를 용이하게 해주는 다른 도메인에 연결시켜주는 링커는 G3S2G3SG 링커이다.
몇몇 구체예에서, 항원 단위와 이합체화 모티프는 GLSGL 링커와 같은 링커를 통해 연결된다.
몇몇 구체예에서, 표적화 단위는 SEQ ID NO:1의 아미노산 3-70을 포함한다.
몇몇 구체예에서, 표적화 단위는 SEQ ID NO:1의 아미노산 5-70으로 이루어진다.
몇몇 구체예에서, 표적화 단위는 SEQ ID NO:1의 아미노산 3-70으로 이루어진다.
몇몇 구체예에서, 표적화 단위는 SEQ ID NO:1의 아미노산 1-70으로 이루어진다.
몇몇 구체예에서, 동종이합체 단백질은 SEQ ID NO:1의 아미노산 1-70을 포함하지 않는다.
몇몇 구체예에서, 표적화 단위는 SEQ ID NO:2의 아미노산 3-70을 포함한다.
몇몇 구체예에서, 표적화 단위는 SEQ ID NO:2의 아미노산 5-70으로 이루어진다.
몇몇 구체예에서, 표적화 단위는 SEQ ID NO:2의 아미노산 3-70으로 이루어진다.
몇몇 구체예에서, 표적화 단위는 SEQ ID NO:2의 아미노산 1-70으로 이루어진다.
몇몇 구체예에서, 동종이합체 단백질은 SEQ ID NO:2의 아미노산 1-70을 포함하지 않는다.
몇몇 구체예에서, 표적화 단위는 예컨대 68, 67, 또는 66 아미노산과 같이 68개 이하의 아미노산으로 이루어진다.
몇몇 구체예에서, 표적화 단위는 표적화 단위의 위치 1 및 위치 2에서 아미노산 서열 AP를 함유하지 않는다.
몇몇 구체예에서, 동종이합체 단백질은 제2 동종이합체 단백질에 비해 증가된 친화도를 갖는 제1 동종이합체 단백질인데, 여기서 상기 제2 동종이합체 단백질은 SEQ ID NO:2의 아미노산 1-70으로 구성된 표적화 단위를 갖는다는 점에 있어서만 제1 동종이합체 단백질과 차이가 있으며; 상기 증가된 친화도는 CCR1, CCR3 및 CCR5로부터 선택된 케모카인 수용체에 대한 것이다. 몇몇 구체예에서, 본 발명에 따른 핵산 분자는 벡터에 의해 포함된다.
몇몇 구체예에서, 본 발명에 따른 핵산 분자는 환자에 있어서 동종이합체 단백질의 생산을 유도하도록, 환자에게 투여되도록 조성된다.
몇몇 구체예에서, 본 발명에 따른 백신 또는 면역자극 조성물은 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 아쥬반트를 포함한다.
몇몇 구체예에서, 본 발명에 따른 백신 또는 면역자극 조성물 또는 의약 조성물에 의해 치료되는 암은 다발성 골수종 또는 림프종, 악성 흑색종, HPV 유도된 암, 전립선암, 유방암, 폐암, 난소암 및/또는 간암이다.
몇몇 구체예에서, 본 발명에 따른 백신 또는 면역자극 조성물 또는 의약 조성물에 의해 치료되는 감염성 질환은 인플루엔자, 헤르페스, CMV, HPV, HBV, 브루셀라병, HIV, HSV-2 및 결핵이다.
번호를 붙인 본 발명의 구체예들:
1. 2개의 동일한 아미노산 사슬로 된 동종이합체 단백질로서, 상기 각 아미노산 사슬은 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열 5-70과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 표적화 단위; 및 항원 단위를 포함하는 것이고, 상기 표적화 단위와 항원 단위는 이합체화 모티프를 통하여 연결된 것인, 2개의 동일한 아미노산 사슬로 된 동종이합체 단백질.
2. 구체예 1에 있어서, 항원 단위는 항원 scFv인 것인 동종이합체 단백질.
3. 구체예 1 또는 2에 있어서, (G4S)3 링커와 같은 링커가 항원 scFv 내의 VH와 VL을 연결하는 것인 동종이합체 단백질.
4. 구체예 1-3 중 어느 하나에 있어서, 항원 scFv는 골수종 또는 림프종 세포에 의해 생산된 모노클로날 Ig로부터 유도된 것인 동종이합체 단백질.
5. 구체예 1에 있어서, 항원 단위는 텔로머라제 또는 그의 기능성 부분인 것인 동종이합체 단백질.
6. 구체예 5에 있어서, 상기 텔로머라제는 hTERT인 것인 동종이합체 단백질.
7. 구체예 1에 있어서, 항원 단위는 세균으로부터 유래된 것인 동종이합체 단백질.
8. 구체예 7에 있어서, 세균으로부터 유래된 항원 단위는 결핵 항원 및 블루셀라병 항원으로부터 선택되는 것인 동종이합체 단백질.
9. 구체예 1에 있어서, 항원 단위는 바이러스로부터 유래된 것인 동종이합체 단백질.
10. 구체예 9에 있어서, 바이러스로부터 유래된 항원 단위는 HIV로부터 유래된 것인 동종이합체 단백질.
11. 구체예 10에 있어서, HIV로부터 유래된 항원 단위는 gp120 또는 Gag으로부터 유래된 것인 동종이합체 단백질.
12. 구체예 9에 있어서, 항원 단위는 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 (HA), 뉴클레오단백질, 및 M2 항원; 및 헤르페스 심플렉스 2 항원 당단백질 D로 이루어진 리스트로부터 선택된 것인 동종이합체 단백질.
13. 구체예 1에 있어서, 항원 단위는 암과 연관된 항원 또는 암 특이 항원인 것인 동종이합체 단백질.
14. 구체예 13에 있어서, 암 항원 단위는 흑색종 항원, 예컨대 흑색종 항원 티로시나제, TRP-1 또는 TRP2인 것인 동종이합체 단백질.
15. 구체예 13에 있어서, 암 항원 단위는 전립선암 항원 PSA와 같은 전립선암 항원인 것인 동종이합체 단백질.
16. 구체예 13에 있어서, 암 항원 단위는 E1, E2, E4, E6, E7, L1 및 L2로 구성된 자궁경부암 항원과 같은 자궁경부암 항원인 것인 동종이합체 단백질.
17. 구체예 1-16 중 어느 하나에 있어서, 이합체화 모티프는 힌지 영역 및, 임의로 이에 링커를 통해 연결된, 면역글로불린 도메인과 같이 이합체화를 용이하게 해주는 임의의 다른 도메인을 포함하는 것인 동종이합체 단백질.
18. 구체예 17에 있어서, 힌지 영역은 IgG3과 같은 IgG로부터 유래된 것인 동종이합체 단백질.
19. 구체예 17-18 중 어느 하나에 있어서, 힌지 영역은 1, 2 또는 수개의 공유결합을 형성하는 능력이 있는 것인 동종이합체 단백질.
20. 구체예 17-19 중 어느 하나에 있어서, 공유결합은 디설파이드 브릿지인 것인 동종이합체 단백질.
21. 구체예 17-20 중 어느 하나에 있어서, 이합체화 모티프의 면역글로불린 도메인은 카르복시말단 C 도메인이거나 또는 상기 C 도메인에 실질적으로 상동성인 서열인 것인 동종이합체 단백질.
22. 구체예 21에 있어서, 카르복시말단 C 도메인은 IgG로부터 유래하는 것인 동종이합체 단백질.
23. 구체예 17-22 중 어느 하나에 있어서, 이합체화 모티프의 면역글로불린 도메인은 동종이합체화하는 능력이 있는 것인 동종이합체 단백질.
24. 구체예 17-23 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역글로불린 도메인은 비공유 상호반응을 경유하여 동종이합체화하는 능력이 있는 것인 동종이합체 단백질.
25. 구체예 24에 있어서, 상기 비공유 상호반응은 소수성 상호반응인 것인 동종이합체 단백질.
26. 구체예 1-25 중 어느 하나에 있어서, 상기 이합체화 도메인은 CH2 도메인을 포함하지 않는 것인 동종이합체 단백질.
27. 구체예 1-26 중 어느 하나에 있어서, 이합체화 모티프는 인간 IgG3의 CH3 도메인에 링커를 통해 연결된 힌지 엑손 h1 및 h4로 구성된 것인 동종이합체 단백질.
28. 구체예 17-27 중 어느 하나에 있어서, 상기 링커는 G3S2G3SG 링커인 ㄱ거것인 동종이합체 단백질.
29. 구체예 1-28 중 어느 하나에 있어서, 상기 항원 단위 및 이합체화 모티프는 GLSGL 링커와 같은 링커를 통해 연결된 것인 동종이합체 단백질.
30. 구체예 1-29 중 어느 하나에 있어서, 상기 표적화 단위는 SEQ ID NO:1의 아미노산 3-70을 포함하는 것인 동종이합체 단백질.
31. 구체예 1-29 중 어느 하나에 있어서, 상기 표적화 단위는 SEQ ID NO:1의 아미노산 5-70으로 구성된 것인 동종이합체 단백질.
32. 구체예 1-29 중 어느 하나에 있어서, 상기 표적화 단위는 SEQ ID NO:1의 아미노산 3-70으로 구성된 것인 동종이합체 단백질.
33. 구체예 1-30 중 어느 하나에 있어서, 상기 표적화 단위는 SEQ ID NO:1의 아미노산 1-70으로 구성된 것인 동종이합체 단백질.
34. 구체예 1-29 중 어느 하나에 있어서, 상기 상기 동종이합체 단백질은 SEQ ID NO:1의 아미노산 1-70을 포함하지 않는 것인 동종이합체 단백질.
35. 구체예 1-29 중 어느 하나에 있어서, 상기 표적화 단위는 SEQ ID NO:2의 아미노산 3-70을 포함하는 것인 동종이합체 단백질.
36. 구체예 1-29 중 어느 하나에 있어서, 상기 표적화 단위는 SEQ ID NO:2의 아미노산 5-70으로 구성된 것인 동종이합체 단백질.
37. 구체예 1-29 중 어느 하나에 있어서, 상기 표적화 단위는 SEQ ID NO:2의 아미노산 3-70으로 구성된 것인 동종이합체 단백질.
38. 구체예 1-29 중 어느 하나에 있어서, 상기 표적화 단위는 SEQ ID NO:2의 아미노산 1-70을 포함하는 것인 동종이합체 단백질.
39. 구체예 1-29 중 어느 하나에 있어서, 상기 동종이합체 단백질은 SEQ ID NO:2의 아미노산 1-70을 포함하지 않는 것인 동종이합체 단백질.
40. 구체예 1-32, 35-37 중 어느 하나에 있어서, 상기 표적화 단위는 68, 67 또는 66개 아미노산과 같이 68개 이하의 아미노산으로 구성된 것인 동종이합체 단백질.
41. 구체예 1-30, 35 중 어느 하나에 있어서, 상기 표적화 단위는 표적화 단위의 위치 1 및 위치 2의 아미노산 서열 AP를 함유하지 않는 것인 동종이합체 단백질.
42. 구체예 1-41 중 어느 하나에 있어서, 상기 동종이합체 단백질은 동일한 동종이합체 단백질에 대한 친화도에 비해, CCR1, CCR3 및 CCR5로부터 선택된 어느 하나의 케모카인 수용체에 대해 증가된 친화도를 갖는 것이며, 여기서 표적화 단위는 SEQ ID NO:2의 아미노산 1-70으로 구성된 것인 동종이합체 단백질.
43. 구체예 1-42 중 어느 하나에 따른 동종이합체 단백질을 형성할 수 있는 단량체 단백질을 인코딩하는 핵산 분자.
44. 구체예 43에 있어서, 벡터에 의해 포함되는 것인 핵산 분자.
45. 구체예 43 또는 44에 있어서, 환자에게 투여되어 상기 환자에서 동종이합체 단백질의 생성을 유도하도록 조성되는 것인 핵산 분자.
46. 의약으로서 사용되기 위한 구체예 1-42 중 어느 하나에 따른 동종이합체 단백질 또는 구체예 43 또는 44에 따른 핵산 분자.
47. 구체예 1-42 중 어느 하나에 따른 동종이합체 단백질 또는 구체예 43 또는 44에 따른 핵산 분자를 포함하는 의약 조성물.
48. 구체예 43 또는 44에 따른 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포.
49. a) 구체예 43 또는 44에 따른 핵산 분자를 세포 집단 내로 형질감염시키는 단계;
b) 상기 세포 집단을 배양하는 단계;
c) 상기 세포 집단으로부터 발현된 동종이합체 단백질을 수집 및 정제하는 단계
를 포함하여 이루어지는 것인, 구체예 1-42 중 어느 하나에 따른 동종이합체 단백질의 제조 방법.
50. 구체예 1-42 중 어느 하나에 따른 동종이합체 단백질 또는 동종이합체 단백질을 형성할 수 있는 단량체 단백질을 코딩하는 구체예 43 또는 44에 따른 핵산 분자의 면역학적 유효량을 포함하는 암 또는 감염성 질환에 대한 백신으로서, 상기 백신은 T 세포 면역반응과 B 세포 면역반응의 두가지 모두를 격발시킬 수 있는 것이고, 상기 동종이합체 단백질은 상기 암 또는 감염성 질환에 특이적인 항원 단위를 함유하는 것인, 암 또는 감염성 질환에 대한 백신.
51. 구체예 50에 있어서, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 아쥬반트를 더 포함하는 것인 백신.
52. 구체예 50 또는 51에 있어서, 상기 암은 다발성 골수종 또는 림프종, 악성 흑색종, HPV 유래된 암, 전립선암, 유방암, 폐암, 난소암 및/또는 간암인 것인 백신.
53. 구체예 50 또는 51에 있어서, 상기 감염성 질환은 결핵, 인플루엔자, 헤르페스, CMV, HPV, HBV, HIV, 브루셀라병, 및/또는 HSV-2로 이루어진 리스트로부터 선택되는 것인 백신.
54. 환자에 있어서 암 또는 감염성 질환의 치료 방법으로서, 상기 방법은 치료를 필요로 하는 환자에게 구체예 1-42 중 어느 하나에 따른 동종이합체 단백질, 또는 동종이합체 단백질을 형성할 수 있는 단량체 단백질을 인코딩하는 구체예 43 또는 44에 따른 핵산 분자를 투여하는 것을 포함하여 이루어지며, 상기 동종이합체 단백질은 상기 암 또는 감염성 질환에 특이적인 항원 단위를 함유하는 것인 환자에 있어서 암 또는 감염성 질환의 치료 방법.
도 1. 본 연구에 사용된 융합 백신. (A) 동종이합체 케모카인-항원 융합 단백질 (백시바디)의 개략적 구조. 표적화 단위(targeting unit), 이합체화 단위(dimerization unit) 및 항원 단위(antigenic unit)를 다양한 단위에서 발현되는 모이어티와 같이 나타내었다. 모든 구조물에서, 이합체화 단위 및 힌지(hinge)는 인간 IgG3으로부터 유도된 것이다. G3S2G3SG 링커가 힌지 엑손 h1+h4을 CH3 도메인에 연결시킨다. GLSGL 링커는 CH3와 항원 단위를 연결하는 반면, (G4S)3 링커는 VH 와 VL를 항원 단위에서 연결한다. (B) 인간 CCL3 이소형의 NH2 말단 서열 (아미노산 1-12) 및 그의 점 돌연변이 대조군(C11S, 굵은 문자로 표시됨). 슬래쉬 표시는 결실을 나타낸다. (C) C11S 점 돌연변이는 케모카인 구조 (우측)에서 S-S 브릿지를 추정적으로 파괴한다.
도 2. ELISA 및 웨스턴 블랏에 의한 LD78β-발현 백시바디의 특징화. 제5일에 수집된 일시적으로 형질감염된 293E 세포의 상등액을 백시바디 분자의 서로 다른 성분들에 특이적인 mAbs를 이용함으로써 ELISA로 테스트하였다. (A), 표적화 단위가 표시된 scFv315 인코딩 백시바디를 DNP-BSA 코트(scFv315에 결합한다)에 대한 결합에 의해 평가하고 바이오티닐화 HP6017 (CH3 이합체화 모티프에 결합한다)으로 검출하고, (B), 표적화 단위가 표시된, CκCκ-인코딩 백시바디를 187.1 mAb (마우스 Cκ에 결합한다) 코트에 대한 결합에 의해 평가하고, 바이오티닐화 187.1 mAb로 검출하였으며, (C), 표적화 단위가 표시된 HA-인코딩 백시바디를 MCA878-G (항CH3 이합체화 모티프)에 대한 결합에 의해 평가하고 바이오티닐화 항HA mAb H36-4-52로 검출하였으며 (D), 비환원 조건 하에서 바이오티닐화 HP6017로 프로브된 백시바디를 웨스턴 블랏. 왼쪽에서 오른쪽 방향으로, (LD78βFv315)2, (LD78βC11SFv315)2 및 (LD78β-2Fv315)2.
도 3. LD78β 백시바디 단백질은 인간 세포 상의 케모카인 수용체에 결합한다. 25 ㎍/mL의 표시된 동종이합체 백시바디 단백질을, 인간 CCR5 (A, B), 또는 인간 CCR1 (C, D)에 의해 안정하게 형질감염된 HEK 293 세포와 혼합하였다. 결합된 백시바디 단백질을 scFv315 항원 단위에 특이적인 바이오티닐화 Ab2.1-4 mAb, 및 이어서 PE-스트렙트아비딘으로 검출하였다. 진한 선: (LD78βFv315)2 (A, C) 및 (LD78β2Fv315)2 (B, D) 백시바디. (A)에서 점선: (LD78배터(C11S)Fv315)2. 음영 처리된 히스토그램: 바이오티닐화 Ab2.1-4 mAb 및 PE-스트렙트아비딘 단독.
도 4. LD78β 백시바디 단백질은 마우스 케모카인 수용체에 결합하여 쥐 세포의 화학주성(chemotaxis)을 유도한다. C11S 변이체 (음영처리된 히스토그램)는 아니지만, (LD78βFv315)2 백시바디 (색칠되지 않은 히스토그램)는 CD11b+ BALB/c 비장세포 (A)에 결합하며 림프구의 Esb/MP 세포 (B)에 대해 화학주성 활성을 나타낸다.
도 5. LD78β 표적화 단위를 갖는 백시바디는 CD4+ T 세포에 대한 MHC 클래스 II-제한형 제시를 위해 마우스 (A) 및 인간 (B) APC에 항원을 효과적으로 전달한다. (A) 항원 단위로서 scFv315를 갖는 다양한 양의 정제된 백시바디들을 방사능조사된 (8 gy) BALB/c 비장세포와 함께 혼합한 다음, TCR 트랜스제닉 마우스로부터의 Id(λ2315 )-특이적인 Th2 T 세포를 첨가하였다. 48 시간 후 배양체를 3H 티미딘과 함께 24 시간 동안 펄스시켰다. (B) 일시적으로 형질감염된 293E 세포들로부터 의 다양한 양의 마우스 Cκ-함유 백시바디 상등액 (CκCκ의 몰 농도(M)로서 표시함)을 DR4*01 PBMC와 함께 혼합한 다음, 이어서 이들에 방사선조사하고 마우스 Cκ-특이 T18 T 세포와 혼합하였다. 48 시간 후 플레이트를 24시간 동안 3H 티미딘으로 펄스시켰다.
도 6. LD78βFv315 백시바디 DNA로 면역된 마우스에 있어서의 항Id315 면역 반응. 마우스들을 DNA를 내피 투여함으로써 면역시키고 그 직후 주사 부위를 전기천공하였다. 백시바디의 종류와 대조군을 표시하였다. 3주 후에 수득된 혈청을 M315 골수종 단백질에 결합하는 항Id IgG1 (A) 또는 IgG2a (B) 항체에 대하여 검사하였다. 한 그룹 당 평균적으로 최대 7마리가 도시된다. p 값은 제4주째의 LD78β vs LD78β(C11S) (*), 및 LD78β vs (FvNIP)2 백시바디 (**)를 나타낸다.
도 7. LD78β-백시바딩 의한 CD4+ 및 CD8+ 인플루엔자 헤마글루티닌-특이적인 T 세포 반응의 유도. 마우스들(n=3)을 DNA로 내피 투여하여 면역화시킨 후 주사 부위에 전기천공을 실시하였다 (Dermavax, Cytopulse, USA). 백시바디의 종류와 대조군을 표시하였다. 마우스들을 3주 후에 희생시키고 각각의 비장세포 현탁액을 표시된 MHC 클래스 II- 클ㄹ스 I-제한된 합성 HA 펩타이드 또는 무관한 펩타이드와 함께 ELISPOT 분석에 사용하였다. IFNγ 반응을 평가하였다. p 값은 LD78β vs LD78βC11S 및 LD78β vs 0.9% NaCl (*), 및 LD78βC11S vs 0.9% NaCl (**)를 나타낸다.
도 8. LD78β 백시바디는 레수스 마카크(rhesus macaque) CCR5에 결합한다. 25 ㎍/mL의 백시바디 단백질을 레수스 마카크 CCR5로 안정하게 형질감염된 HEK 293과 혼합하였다. 결합된 백시바디 단백질들을 scFv315 항원 단위에 특이적인 바이오티닐화 Ab2.1-4 mAb에 의해 검출한 다음 PE-스트렙트아비딘에 의해 검출하였다. 진한 선은 (A)에서 백시바디 (LD78βFv315)2 및 (B)에서 (LD78β2Fv315)2를 나타낸다. (A)에서 점선은 (LD78β(C11S)Fv315)2 백시바디를 나타낸다. A와 B 모두에서 음영처리된 히스토그램은 바이오티닐화 Ab2.1-4 mAb 및 PE-스트렙트아비딘 단독을 나타낸다.
도 9. 인플루엔자에 의한 치명적 챌린지에 대한 보호. Balb/c 마우스들을 전기천공(DermaVax)와 병용하여 25 ㎍ DNA로 1회 내피 면역화시킨 다음 14일 후에 (n= 6/그룹) 치사량의 PR8 인플루엔자 바이러스 (H1N1)로 챌린지하였다.
실시예 1
마우스 및 세포주
BALB/c 마우스들을 Taconic (Ry, Denmark)으로부터 구입하였다. Id(λ2315)-특이적인 T-세포 수용체 (TCR) 트랜스제닉 마우스는 문헌 [Bogen B 등 Eur J Immunol 1992 Mar;22(3):703-9 및 Snodgrass HR 등 Eur J Immunol 1992 Aug;22(8):2169-72)]에 설명된 바 있다. TCR은 I-Ed 클래스 II 분자 상에 제시된, IgA MOPC315 마우스 형질세포종에 의해 생산되는 λ2315 경쇄의 아미노산 91-101을 인식한다. 이 연구는 국립동물실험위원회(노르웨이, 오슬로)에 의해 승인되었다. MOPC 315.4 (IgA, λ2315) , HEK 293 및 HEK 293E 세포를 ATCC로부터 입수하였다. hCCR5 및 hCCR1에 의해 안정하게 형질감염된 HEK 293을 각각 Mario Mellado (Madrid, Spain) 및 Zack Howard (Frederick, MD)로부터 제공받았다. 레수스 마카크(GenBank AF005660)에 의해 안정하게 형질감염된 HEK 293은 Pfizer Inc. (Groton, CT)로부터 입수하였다. 쥐의 림프종 Esb/MP 세포는 Jo Van Damme (Leuven, Belgium)으로부터 제공받았다.
인간 MIP1a/CCL3의 클로닝 (LD78α 또는 LD78β-인코딩 백시바디)
성숙한 LD78α 및 LD78β를 인코딩하는 유전자들 (각각 GenBank NM_002983 및 NG_004113)을 건강한 공여자로부터의 CD14가 풍부한 골수 유래 단핵구로부터 증폭시켰다. 정방향 프라이머 (BsmI 제한 부위, 이탤릭체)는 다음과 같았고:
LD78α:GGTGTGCATTCCGCATCACTTGCTGCTGAC (SEQ ID NO:3);
LD78β: GGTGTGCATTCCGCACCACTTGCTGCTGAC (SEQ ID NO:4);
역방향 프라이머 (BsiWI 제한부위, 이탤릭체)는 다음과 같았다:
GACGTACGACTCACCTGCAACTCAGCTCCAGGTC (SEQ ID NO:5). 68 아미노산 길이 (3-70) LD78β-2를 다음의 정방향 프라이머 (BsmI 제한 부위, 이탤릭체)를 이용하여 클로닝하였다:
GGTGTGCATTCCCTTGCTGCTGACACGCC (SEQ ID NO:6).
위치 11에서 C 잔기 대신 S 잔기를 갖는 점 돌연변이된 LD78α 및 LD78β가 다음의 프라이머들을 이용하는 퀵 체인지 PCR에 의해 생성되었다: 정방향 CCGACCGCCTCCTGCTTCAG (SEQ ID NO:7) 및 역방향 CTGAAGCAGGAGGCGGTCGG (SEQ ID NO:8). 증폭된 케모카인 유전자를 BsmI/BsiWI 제한 부위를 이용하여, 백시바디 구조물 IlhFpLNOH2 (Fredriksen AB 등 Mol Ther 2006 Apr;13(4):776-85 참조)의 표적화 카세트 내로 삽입하였다. 결과적인 백시바디 구조물은 hCCL3-유도된 표적화 단위 및 IgG3의 CH3 도메인과 인간 힌지 엑손 h1 및 h4로 이루어진 동종이합체화 모티프를 통해 연결된 항원 단위로서 VH-VL 방향으로 MOPC315 scFv를 갖는 동종이합체 단백질을 코딩하였다.
전술한 백시바디 중의 항원 단위(scFv315)는 쥐의 페어형 Cκ도메인 (Tunheim G 등 Vaccine 2007 Jun 11;25(24):4723-34) 또는 H1N1 A/Puerto Rico/8/34 (Mt. Sinai) (G. Groedeland, manuscript in preparation)로부터의 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 (HA)와 교환되었다.
백신 단백질 제조 평가
일시적으로 형질감염된 293E 세포의 상등액을 이어지는 ELISA에서 검사하였다. scFv315 백시바디: 코트로서 DNP-BSA (M315에 결합한다) 및 검출을 위해 바이오티닐화 모노클로날 HP6017 (항CH3 이합체화 모티프); HA 백시바디: 코트로서 MCA878G (항CH3 이합체화 모티프) 및 검출을 위해 항HA 바이오티닐화 mAB H36-4-52; 마우스 CκCκ백시바디: 코트로서 187.1 mAb (마우스 Cκ에 결합한다) 및 검출을 위해 바이오티닐화 187.1.
백시바디 단백질의 제조, 정제, 정량 및 단백질 유전정보( proteomic ) 특징화
항원 단위로서 scFv315를 갖는 백시바디 단백질을 DNP (M315에 의해 결합됨) 세파로스 컬럼 상에서 안정하게 형질감염된 NS0 세포의 상등액으로부터 친화성 정제하였다. 정제된 단백질을 4-20% Tris-글라이신 겔 상에 로딩하였다. 막 전달에 이어서, 단백질을 바이오티닐화 HP6017 또는 Ab2-1.4 (M315에 결합한다) mAbs 및 이어서 스트렙트아비딘 HRP로 검출하였다. 백시바디 단백질들을, 표품으로서 각각 BSA와 mCCL3 백시바디 (Fredriksen AB 등 Mol Ther 2006 Apr;13(4):776-85 참조)를 이용하여 Bradford 및 ELISA에 의해 정량하였다. Fv315가 있는 LD78β 및 LD78β-2 백시바디에 대응하는 단백질 밴드들을 쿠마씨-염색된 폴리아크릴아미드 겔로부터 절제하여 전술한 바와 같이 트립틱 인-겔(in-gel) 절단하였다.
인간 및 쥐의 CCR5 및 CCR1에 대한 결합
0.2 내지 25 ㎍/mL 농도 범위의 백시바디 단백질을 이용하여 친(親) 또는 안정하게 형질감염된 HEK 293 세포 또는 BALB/c 비장세포 (CD11b+ CD3- 세포 상에서 FSC/SSC에 의해 게이트화됨)를 염색하였다. 결합된 백시바디 단백질들을 바이오티닐화 HP6017 (hIgG3의 CH3에 결합한다) 또는 Ab2-1.4 (M315에 결합한다) mAbs 및 이어서 스트렙트아미딘 PE로 검출하였다. 세포들을 FACScalibur 상에서 분석하였다.
화학주성 분석
전술한 바와 같이 24-웰 트랜스웰 플레이트 (Corning)을 이용하여 시험관내 세포 이동 (cell migration)을 평가하였다. 각각 8 ㎛ 또는 5 ㎛ 크기의 포어 폴리카보네이트막을 HEK 293 세포 및 Esb/MP에 대하여 사용하였다. 재조합 케모카인을 Peprotech으로부터 구하였다. 결과(2벌 샘플의 평균 + SE)를 화학주성 지수(chemotactic index)로서 나타내었으며, 여기서 화학주성 지수는 자발적인 세포 이동(즉, 배지만 있을 경우)에 비해 화학주성 인자 존재 시의 이동 세포 수가 몇배 증가하였는지로 정의된다.
T 세포 자극 분석
BALB/c 비장세포를 방사선 조사하고(8 Gy), TCR-트랜스제닉 마우스로부터 유도된 시험관내 극성화된 Id315-특이적 Th2 세포를 첨가하기 전에 20 내지 0.04 ㎍/mL의 농도 범위로 scFv315를 함유하는 백시바디 단백질과 혼합하였다. 양성 대조군으로서 λ2315의 서열 89-107에 대응하는 Id 펩타이드를 사용하였다.
3종의 서로 다른 DR4*01 건강한 공여자로부터의 인간 PBMC를, 항원 단위로서 마우스 CκCκ를 갖는 백시바디 단백질을 함유하는 일시적으로 형질감염된 293E 세포로부터의 상등액과 혼합한 다음 방사선 조사하고(20 Gy) 및 DR4*01에 의해 제시된 쥐의 Cκ의 아미노산 40-48을 인식하는 T18T 세포 클론을 첨가하였다. 48 시간 후 플레이트를 3H-티미딘으로 24시간 동안 펄스시킨 다음 수확하였다.
마우스 면역
백시바디 DNA를 Endofree-mega 플라스미드 정제 시스템(Qiagen)을 이용하여 정제하였다. 0.9% 멸균 중의 0.5 mg/mL 백시바디 DNA 25 ㎕ 용액을 마우스의 등 아래쪽 양방 모두에 피내 주사한 다음, Dermavax (Cytopulse, Sweden)를 이용하여 전기천공하였다. 그룹 당 3 내지 7 마리의 마우스가 포함되었다
항Id315 항체 측정
일회 면역화 후 마우스들을 3주일, 4주일 및 6주일간 채혈하였다. 코트로서 골수종 단백질 M315 (IgA, λ2)를 이용하여 마우스 혈청 중의 항Id315 Abs를, 바이오티닐화 항마우스 IgG1a 또는 항마우스 IgG2aa (BD Pharmingen)로 검출하였다. 종말점 적정가(endpoint titers)를 구하였다.
Elispot 분석
밀리포어 멀티스크린 플레이트(Millipore, Billerca, MA, USA)를 항마우스 IFNγ(AN18) (12㎍/ml)로 코팅한 다음 10% FCS를 함유하는 RPMI-1640(Invitrogen, NY, USA)으로 2시간 블로킹하였다. HA-함유 백시바디 또는 NaCl을 이용하여 3주 먼저 DNA-예방접종한 마우스들로부터 단세포 비장세포를 개별적으로 준비한 다음, 다음, 즉, ProImmune (Oxford, UK) : SVSSFERFEIPK (아미노산 107-119, I-Ed-restricted), HNTNGVTAACSHEG (아미노산 126-138, I-Ad-제한됨) 또는 IYSTVASSL (아미노산 633-641, Kd 제한됨) 중 어느 하나의 HA-유도된 펩타이드와 함RP 106, 5x105 및 2.5x105 세포/웰로 밤새 인큐베이션시켰다. 플레이트들을 PBS로 세척하고 부착된 세포들을 탈이온수에 5분간 인큐베이션한 다음 바이오티닐화 항마우스 IFNα(1㎍/ml) (XMG1.2, Pharmingen) 및 스트렙트아비딘 알칼라인 포스파타제 컨쥬게이트(1:3000) (GE Healthcare, Little Chalfont Buckinghamshire, UK)과 함RP 인큐베이션시킴으로써 용해(lysed)시켰다. IFNγ-생산 세포들을 BCIP/NBT 키트 (Zymed Laboratories Inc, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 검출하고, Zeiss Axioplan 2 조영 시스템(objective: Epiplan-Neofluar 5x, 442320) 상에서 Zeiss의 KS EliSpot 버젼 4.3.56을 이용하여 계수하였다.
백시바디-HA 구조물을 갖는 마우스의 예방접종
마우스들을 마취하여 제모한 다음 양쪽 등 아래쪽 각각에 25㎕ DNA (0,5mg/ml)를 피내 경로로 예방접종한 직후 피부 전기천공 (DermaVax/CytoPulse)하였다. 14일 후, 마우스들을 히프놈/도르미쿰으로 마취한 다음 20㎕ 인플루엔자 (A/Puerto Rico/8/34 (Mt. Sinai) 바이러스 (5xLD50)로 챌린지하였다. 챌린지 후, 마우스들의 무게를 재고 임상적 징후를 면밀히 모니터링하였다.
인간 CCL3-기반 백시바디의 구축 및 발현
도 1A에 도시된 바와 같이 다양한 hCCL3-기반 표적화 단위, 인간 Ig-유도된 동종이합체 단위 및 다양한 항원 단위를 갖는 동종이합체 백시바디를 구축하였다. 사용된 LD78α, LD78β, LD78β-2의 NH2 말단 아미노산 서열과 케모카인 구조 LD78β(C11S)에 대한 C11S 점 돌연변이의 추정 효과를 도 1B 및 1C에 각각 도시하였다. 계속해서 낮은 수준으로 발현된 LD78β-2 백시바디를 제외하고 모든 백시바디들이 일시적으로 형질감염된 293E 세포에 의해 필적할만한 수준으로 발현되었다(도 2 A-C).
항원 단위로서 scFv315를 갖는 백시바디 단백질의 일관성(integrity)을 SDS-PAGE로 테스트하였는데, 여기서 막 블라팅 후, 약 110 kDa의 단일 밴드가 관찰되었고, 이것은 적절한 mAbs로 염색될 수 있었다 (도 2 D 및 다른 구조물에 대하여는 데이터를 도시하지 않음). 돌연변이된 (C11S) 백시바디의 크기가 증가된 것으로 보였는데 이는 아마도 S-S 결합의 폐기로 인한 스트로크 반경의 증가에 기인하는 것으로 여겨진다 (도 1C). 환원 조건 하에서, 예상된 바와 같이, 단량체에 대응하는 약 55 kDA의 단일 밴드가 관찰되었다(데이터 도시하지 않음).
배양 배지 중 NS0 세포 또는 소태아 혈청이 CD26 활성을 가질 수 있고 이로 인해 LD78β의 후번역 변형이 일어날 수 있기 때문에 LD78β 백시바디 단백질의 NH2 말단 아미노산 서열을 더 확인하였다. MALDI-TOF 질량 분광광도측정에 의한 LD78βIhF 및 LD78β-2IhF 백시바디 단백질의 트립틱 절단물의 분석 결과, 각각 N-말단 펩타이드 APLAADTPTACCFSYTSR (SEQ ID NO:9) 및 LAADTPTACCFSYTSR (SEQ ID NO:10)에 대응하는, m/z 1988.89 및 m/z 1820.78에서만 시그널이 나타났다 (데이터 도시하지 않음). 따라서, 안정하게 형질감염된 NS0 세포로부터 순수한 전장LD78β 또는 NH2-절단형 LD78β-2 백시바디가 발현 및 정제될 수 있다.
LD78β 백시바디 및 NH 2 -절단형 버젼은 인간 및 쥐의 케모카인 수용체와 결합한다
개체간의 CCR5 발현 다양성을 고려하여, PBMC 보다는 hCCR5로 안정하게 형질감염된 HEK 293을 이용하여 기능성 연구를 수행하였다. LD78β 및 LD78β-2 백시바디 (그러나 이들에 대응하는 점 돌연변이체는 아님)들이 hCCR5-형질감염된 HEK 293 세포에 결합하였다 (도 3 A, B 및 데이터 도시하지 않음). NH2-절단형 LD78β-2 백시바디는 전장 LD78β 백시바디 보다 더 강한 결합력을 나타내었다. 점 돌연변이된 LD78β (C11S) 백시바디는 hCCR5-형질감염된 세포에 결합하지 않았다 (도 3A). LD78β-2 백시바디 (그러나 LD78β 백시바디는 아님)는 hCCR1-발현 HEK 293 (도 3 C, D 및 데이터 도시하지 않음)에도 결합하였는데, 이것은 이전의 보고와도 일치하는 결과였다. 형질감염되지 않은 친(親) HEK 293 세포들은 염색되지 않았다 (도시하지 않음).
LD78β 백시바디 (그러나, 대응하는 그의 점 돌연변이체는 아님)는 CD11b+ BALB/c 비장세포 (도 4 A)에 결합하여, Esb/MP 세포의 화학주성을 유도함으로 해서 (도 4 B), 마우스에 있어서 LD78β-발현 백시바디를 테스트할 근거를 제시해준다.
케모카인 수용체를 경유하여 항원을 APC로 전달하면 시험관내 마우스 및 인간 시스템에서 T 세포 반응이 향상된다
scFv315 항원 단위를 발현하는 LD78β 백시바디와 혼합된 BALB/c 비장세포는 TCR 트랜스제닉 마우스로부터 Id315-특이적 Th2 세포의 증식을 유도하였다 (도 5 A). C11S 돌연변이가 도입된 비슷한 백시바디들은 T 세포 자극 능력이 ~100배 감소하였다. CDR3 돌연변이가 포함된 Id 펩타이드와 LD78β 백시바디의 동몰 농도를 비교하자, 항원 제시를 위한 APC 로딩시 백시바디가 상기 펩타이드에 비해 최대 30배까지 더 효과적인 것으로 밝혀졌다 (도시하지 않음).
인간 T 세포 반응을 살펴보기 위해, 모델 항원으로서 쥐의 CκCκ를 발현하는 LD78β 백시바디를 공여자의 PBMCs 및 DR4*01 맥락에서 쥐의 Cκ의 아미노산 40-48을 인식하는 클로닝된 T18 CD4+ T 세포와 혼합하였다. 야생형 LD78β와 점 돌연변이된 LD78β 사이의 차이점은 마우스 시스템에서의 경우보다는 덜 현저하였다(도 5 B). 뿐만 아니라, 표적화된 항원 전달과 관련해서 표적화되지 않은 NIP-특이적인 백시바디에 비해 LD78β가 더 우수한 것으로 입증되었다 (도 5B). LD78β-2 백시바디가 LD78β 백시바디 보다 더 우수한 효능을 나타내었다는 점이 중요하다. 3명의 서로 다른 공여자를 이용한 경우에도 유사한 결과가 얻어졌다 (나타내지 않음).
scFv 315 를 함유하는 LD78β 백시바디에 의해 마우스에서 개선된 항Id 체액성 반응이 유도되었다
M315 골수종 단백질의 VH + VL Id는 매우 약한 자가 항원이므로, 실상 항Id 항체를 검출하기 위해서는 완전 및 불완전 프로인드 아쥬반트를 이용한 다중 면역화를 포함하는 집중적인 면역화 계획이 요구된다. 따라서 본 발명자들은 LD78βscFv315 백시바디 DNA가 내피 주사되고 전기천공이 실시된 마우스들이 항Id 항체를 생성하였는지 검사하였다. LD78β-인코딩 백시바디로 면역된 마우스들에 있어서 항Id315 IgG1 (도 6A) 및 IgG2a (도 6B) 반응이 검출되었으며, 이는 LD78β 백시바디에서 scFv315의 입체배열적 일체성이 유지되었음을 입증하는 것이다(도 6). IgG1 반응을 기록하였다. C11S 점 돌연변이된 백시바디가 투여된 마우스에서는 IgG1 반응이 유의적으로 더 낮은 정도로 기록된 반면, IgG2a에 있어서의 차이는 유의적이지 않았다. 또한, 표적화되지 않은 대조군 백시바디(항NIP)로 면역화된 마우스에 있어서는 IgG1 및 IgG2a 양자 모두에 대해, 통계적으로 유의적인 보다 낮은 Ab 반응이 관찰되었다. 이러한 결과는 전반적으로, 표적화된 항원 전달이 약한 자가 항원 종양 항원에 대한 항체 반응을 향상시킴을 시사하는 것이다.
백시바디 투여 후 마우스에 있어서 인플루엔자 헤마글루티닌 -특이적인 CD4+ 및 CD8+ T-세포 반응의 유도
헤마글루티닌(HA)이 표적 항원 역할을 하는 인플루엔자 모델에서 CD8+ T 세포 반응의 유도를 연구하였다. 균주 A/Puerto Rico/8/34 (Mt.Sinai) (H1N1)로부터의 HA는 BALB/c 마우스 (H-2d)가 응답하는 3종의 에피토프를 발현하는 것으로 알려져 있다. 이들 중 2가지는 각각 MHC 클래스 II-제한된, 즉 I-Ed에 의해 제한된 SVSSFERFEIPK (SEQ ID NO:11) (아미노산 107-119) 및 I-Ad에 의해 제한된HNTNGVTAACSHEG (SEQ ID NO:12) (아미노산 126-138)이다. 세번째 에피토프인 IYSTVASSL (SEQ ID NO:13) (아미노산 633-641)은 MHC 클래스 I-제한된 (Kd)이다. 단일 내피 LD78β 백시바디 DNA 면역화 및 전기천공 후, 클래스 I 에피토프에 대하여 유의적으로 증가된 IFNγ, 표적화된 vs. 비표적화된(C11S) 백시바디 및 모의 면역화(NaCl)에 대하여 관찰되었다 (도 7A). 클래스 II 에피토프에 대한 반응은 약간 상승하였지만 표적화 효과는 유의적이지 않았다 (오직 하나의 면역화만이 이 실험에서 전달되었다) (도 7A).
LD78β 백시바디는 레수스 마카크 CCR5에 결합한다
CCR5는 원숭이를 포함하는 여러 종들 사이에서 보존된다. 인간 및 마카크 CCR5 유전자는 매우 밀접한 아미노산 상동성(98%)을 갖는다. 인간과 마찬가지로, 마카크는 2가지 CCL3 이소형을 갖는다. LD78β 및 LD78β-2 백시바디는 투여량 의존 형식으로 레수스 마카크 CCR5-발현 HEK 293 세포에 결합한 반면, C11S 점 돌연변이된 LD78β는 동일 세포에 결합하지 않았다 (도 8, 및 데이터 나타내지 않음). 이 결과는 인간에 사용하도록 의도된 LD78β 및 LD78β-2가 있는 백시바디가 전술한 바와 같이 마우스에서 테스트될 수 있을 뿐만 아니라, 인간에 대한 적용에 앞서서 레수스 마카크에 대해서도 테스트될 수 있음을 가리키는 것이다.
LD78β - HA 백시바디는 인플루엔자로부터 마우스를 보호하지만 LD78β -2- HA백시바디는 그렇지 못하다
도 9에 도시된 바와 같이, 마우스들을 LD78 β의 2가지 형태, 즉, LD78β 또는 LD78β-2 중 어느 한가지로 예방접종하였다. LD78β의 전장 버젼은 인플루엔자 감염으로부터 마우스를 보호하는 관점에서 더 우수한 효과를 나타내었다.
서열:
LD78β (SEQ ID NO:1): APLAADTPTACCFSYTSRQIPQNFIADYFETSSQCSKPSVIFLTKRGRQVCADPSEEWVQKYVSDLELSA
LD78α (SEQ ID NO:2): ASLAADTPTACCFSYTSRQIPQNFIADYFETSSQCSKPGVIFLTKRSRQVCADPSEEWVQKYVSDLELSA
SEQUENCE LISTING <110> Vaccibody AS <120> HOMODIMERIC PROTEIN CONSTRUCTS <130> 18314PCT00 <160> 13 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 70 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ala Pro Leu Ala Ala Asp Thr Pro Thr Ala Cys Cys Phe Ser Tyr Thr 1 5 10 15 Ser Arg Gln Ile Pro Gln Asn Phe Ile Ala Asp Tyr Phe Glu Thr Ser 20 25 30 Ser Gln Cys Ser Lys Pro Ser Val Ile Phe Leu Thr Lys Arg Gly Arg 35 40 45 Gln Val Cys Ala Asp Pro Ser Glu Glu Trp Val Gln Lys Tyr Val Ser 50 55 60 Asp Leu Glu Leu Ser Ala 65 70 <210> 2 <211> 70 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ala Ser Leu Ala Ala Asp Thr Pro Thr Ala Cys Cys Phe Ser Tyr Thr 1 5 10 15 Ser Arg Gln Ile Pro Gln Asn Phe Ile Ala Asp Tyr Phe Glu Thr Ser 20 25 30 Ser Gln Cys Ser Lys Pro Gly Val Ile Phe Leu Thr Lys Arg Ser Arg 35 40 45 Gln Val Cys Ala Asp Pro Ser Glu Glu Trp Val Gln Lys Tyr Val Ser 50 55 60 Asp Leu Glu Leu Ser Ala 65 70 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA primer <400> 3 ggtgtgcatt ccgcatcact tgctgctgac 30 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA primer <400> 4 ggtgtgcatt ccgcaccact tgctgctgac 30 <210> 5 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA primer <400> 5 gacgtacgac tcacctgcaa ctcagctcca ggtc 34 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA primer <400> 6 ggtgtgcatt cccttgctgc tgacacgcc 29 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA primer <400> 7 ccgaccgcct cctgcttcag 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA primer <400> 8 ctgaagcagg aggcggtcgg 20 <210> 9 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Ala Pro Leu Ala Ala Asp Thr Pro Thr Ala Cys Cys Phe Ser Tyr Thr 1 5 10 15 Ser Arg <210> 10 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Leu Ala Ala Asp Thr Pro Thr Ala Cys Cys Phe Ser Tyr Thr Ser Arg 1 5 10 15 <210> 11 <211> 12 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 11 Ser Val Ser Ser Phe Glu Arg Phe Glu Ile Pro Lys 1 5 10 <210> 12 <211> 14 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 12 His Asn Thr Asn Gly Val Thr Ala Ala Cys Ser His Glu Gly 1 5 10 <210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 13 Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu 1 5

Claims (27)

  1. 2개의 아미노산 사슬을 포함하는 이합체 단백질을 형성할 수 있는 아미노산 사슬을 코딩하는 핵산 분자로서,
    상기 각 아미노산 사슬은 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열 5-70과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 표적화 유닛; 및 항원성 유닛을 포함하는 것이고,
    상기 표적화 유닛과 항원성 유닛은 이합체화 모티프를 통하여 연결된 것이며,
    개체에 투여시, 상기 핵산 분자는 CD8+ T 세포 반응에 대한 면역 반응 유도가 가능한, 핵산 분자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 표적화 유닛은 SEQ ID NO:1의 아미노산 3-70을 포함하는 것인 핵산 분자.
  3. 제1항에 있어서, 상기 표적화 유닛은 SEQ ID NO:1의 아미노산 5-70으로 구성된 것인 핵산 분자.
  4. 제1항에 있어서, 상기 표적화 유닛은 SEQ ID NO:1의 아미노산 3-70으로 구성된 것인 핵산 분자.
  5. 제1항에 있어서, 상기 표적화 유닛은 SEQ ID NO:1의 아미노산 1-70으로 구성된 것인 핵산 분자.
  6. 제1항에 있어서, 이합체화 모티프는 힌지 영역 및, 임의로 링커를 통해 연결된, 이합체화를 용이하게 해주는 임의의 다른 도메인을 포함하는 것인 핵산 분자.
  7. 제6항에 있어서, 힌지 영역은 Ig로부터 유래된 것인 핵산 분자.
  8. 제6항에 있어서, 이합체화 모티프는 면역글로불린 도메인을 포함하고, 상기 면역글로불린 도메인은 카르복시말단 C 도메인인 것인 핵산 분자.
  9. 제1항에 있어서, 상기 항원성 유닛 및 이합체화 모티프는 링커를 통해 연결된 것인 핵산 분자.
  10. 제1항에 있어서, 상기 표적화 유닛은 SEQ ID NO:2의 아미노산 3-70을 포함하는 것인 핵산 분자.
  11. 제1항에 있어서, 상기 표적화 유닛은 SEQ ID NO:2의 아미노산 5-70으로 구성된 것인 핵산 분자.
  12. 제1항에 있어서, 상기 표적화 유닛은 SEQ ID NO:2의 아미노산 3-70으로 구성된 것인 핵산 분자.
  13. 제1항에 있어서, 상기 표적화 유닛은 SEQ ID NO:2의 아미노산 1-70으로 구성된 것인 핵산 분자 .
  14. 제1항에 있어서, 상기 표적화 유닛 각각은 68개 이하의 아미노산으로 구성된 것인 핵산 분자.
  15. 제1항에 있어서, 상기 표적화 유닛은 표적화 유닛의 위치 1 및 위치 2의 아미노산 서열 AP를 함유하지 않는 것인 핵산 분자.
  16. 제1항에 있어서, 벡터에 의해 포함된 것인 핵산 분자.
  17. 제1항에 있어서, 환자에게 투여되어 상기 환자에서 이합체 단백질의 생성을 유도하도록 조성되는 것인 핵산 분자.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 있어서, 백신으로서 사용되기 위한 핵산 분자.
  19. 2개의 아미노산 사슬을 포함하는 이합체 단백질로서,
    상기 각 아미노산 사슬은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 5-70에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 표적화 유닛 및 항원성 유닛을 포함하는 것이고,
    상기 표적화 유닛과 항원성 유닛은 이합체화 모티프를 통하여 연결되며, 상기 이합체 단백질은 제1항 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되는 것이고,
    개체에서 발현시, 상기 이합체 단백질은 CD8+ T 세포 반응에 대한 면역 반응 유도가 가능한, 이합체 단백질.
  20. 제19항에 있어서, 의약으로서 사용되기 위한 것인 이합체 단백질.
  21. 암 또는 감염 질환의 예방 또는 치료를 위한 제1항 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 기재된 핵산 분자를 포함하는 의약 조성물.
  22. 2개의 아미노산 사슬을 포함하는 이합체 단백질을 형성할 수 있는 아미노산 사슬을 코딩하는, 제1항 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 기재된 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포로서,
    상기 각 아미노산 사슬은 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열 5-70과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 표적화 유닛 및 항원성 유닛을 포함하는 것이고,
    상기 표적화 유닛과 항원성 유닛은 이합체화 모티프를 통하여 연결된 것이며,
    상기 이합체 단백질은 백신으로서 적합한 것이고,
    개체에서 발현시, 상기 이합체 단백질은 CD8+ T 세포 반응에 대한 면역 반응 유도가 가능한, 숙주 세포.
  23. a) 제1항에 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 기재된 핵산 분자를 세포 집단에 형질감염시키는 단계;
    b) 상기 세포 집단을 배양하는 단계;
    c) 상기 세포 집단으로부터 발현된 동종이합체 단백질을 수집 및 정제하는 단계
    를 포함하는,
    이합체 단백질의 제조 방법.
  24. 제1항 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 기재된 핵산 분자의 면역학적 유효량을 포함하는 암 또는 감염 질환에 대한 백신으로서,
    상기 백신은 T 세포 면역반응과 B 세포 면역반응의 두가지 모두를 격발시킬 수 있는 것이고,
    개체에 투여시, 상기 백신은 CD8+ T 세포 반응에 대한 면역 반응 유도가 가능한 것이고,
    상기 이합체 단백질은 상기 암 또는 감염성 질환에 특이적인 항원성 유닛을 함유하는 것인, 암 또는 감염 질환에 대한 백신.
  25. 제24항에 있어서, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 아쥬반트를 더 포함하는 것인 백신.
  26. 제24항에 있어서, 상기 암은 다발성 골수종 또는 림프종, 악성 흑색종, HPV 유래된 암, 전립선암, 유방암, 폐암, 난소암 및/또는 간암인 것인 백신.
  27. 제24항에 있어서, 상기 감염 질환은 결핵, 인플루엔자, 헤르페스, CMV, HPV, HBV, HIV, 브루셀라병, 및/또는 HSV-2로 이루어진 리스트로부터 선택되는 것인 백신.
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Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK1599504T3 (da) * 2003-02-25 2015-03-09 Vaccibody As Modificeret antistof
KR20130087517A (ko) 2010-06-25 2013-08-06 백시바디 에이에스 동종이합체 단백질 구조물
BR112014015016B1 (pt) * 2011-12-21 2023-10-03 Nykode Therapeutics ASA Proteína homodimérica de duas cadeias de aminoácidos idênticas,cadeia de aminoácido, molécula de ácido nucléico, composição farmacêutica,célula hospedeira, método de preparação de uma proteína homodimérica, método de preparação de uma vacina e vacina
EP3400004A1 (en) * 2016-01-08 2018-11-14 Vaccibody AS Therapeutic anticancer neoepitope vaccine
KR102682118B1 (ko) * 2016-04-29 2024-07-08 주식회사유한양행 Ccl3 변이체를 포함하는 융합 단백질 및 이의 용도
EA201990578A1 (ru) 2016-09-23 2019-10-31 Связывающие молекулы, которые модулируют биологическую активность, проявляемую клеткой
EP3678699A1 (en) 2017-09-07 2020-07-15 University Of Oslo Vaccine molecules
EP4132959A1 (en) * 2020-04-07 2023-02-15 Evaxion Biotech A/S Neoepitope immunotherapy with apc targeting unit
MX2022013661A (es) 2020-05-01 2022-11-30 Nykode Therapeutics ASA Vacuna y uso de la misma en la profilaxis y terapia de betacoronavirus.
EP4181949A1 (en) * 2020-07-14 2023-05-24 Evaxion Biotech A/S Apc targeting units for immunotherapy
MX2023011355A (es) 2021-03-26 2023-11-24 Nykode Therapeutics ASA Combinacion terapeutica para tratar el cancer.
EP4333881A1 (en) 2021-05-03 2024-03-13 Nykode Therapeutics ASA Immunogenic constructs and vaccines for use in the prophylactic and therapeutic treatment of infectious diseases
MX2023013309A (es) 2021-05-10 2024-02-14 Nykode Therapeutics ASA Coexpresion de construcciones y compuestos inmunoestimuladores.
WO2022238432A2 (en) 2021-05-10 2022-11-17 Nykode Therapeutics ASA Co-expression of constructs and immunoinhibitory compounds
WO2022238395A1 (en) 2021-05-10 2022-11-17 Nykode Therapeutics ASA Tolerance-inducing constructs and compositions and their use for the treatment of immune disorders
MX2023013311A (es) 2021-05-10 2024-02-06 Nykode Therapeutics ASA Construcciones y composiciones inductoras de tolerancia y su uso para el tratamiento de trastornos inmunologicos.
WO2022238363A1 (en) 2021-05-10 2022-11-17 Nykode Therapeutics ASA Immunogenic constructs and vaccines for use in the prophylactic and therapeutic treatment of infectious diseases
KR20240110821A (ko) 2021-11-03 2024-07-16 니코데 테라퓨틱스 에이에스에이 SARS-CoV-2로 인한 질병의 예방적 및 치료적 처치에 사용하기 위한 면역원성 작제물 및 백신
WO2024092025A1 (en) 2022-10-25 2024-05-02 Nykode Therapeutics ASA Constructs and their use
WO2024100196A1 (en) 2022-11-09 2024-05-16 Nykode Therapeutics ASA Co-expression of constructs and polypeptides

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004076489A1 (en) * 2003-02-25 2004-09-10 Medinnova As Modified antibody

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5646016A (en) * 1991-02-06 1997-07-08 Genetics Institute, Inc. Peptide and protein fusions to thioredoxin, thioredoxin-like molecules, and modified thioredoxin-like molecules
US5270181A (en) * 1991-02-06 1993-12-14 Genetics Institute, Inc. Peptide and protein fusions to thioredoxin and thioredoxin-like molecules
AU5361794A (en) 1992-10-14 1994-05-09 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Enhancement of b cell lymphoma tumor resistance using idiotype/cytokine conjugates
DE69725857T2 (de) 1996-08-14 2004-07-29 The Government of the United States of America, as represented by the Secretary National Institute of Health, Office of Technology Transfer Vektor für polynukleotidimpfstoffe
GB9820014D0 (en) 1998-09-14 1998-11-04 Cancer Res Campaign Tech Receptor antagonists and uses thereof
US7250495B2 (en) 2001-06-20 2007-07-31 Genentech, Inc. PRO20044 polypeptides
CA2453441C (en) 2001-07-13 2011-10-18 Nanocarrier Co., Ltd. Lyophilizing composition of drug-encapsulating polymer micelle and method for preparation thereof
US20050069549A1 (en) 2002-01-14 2005-03-31 William Herman Targeted ligands
CN1617888A (zh) 2002-01-18 2005-05-18 伊诺维奥埃斯 用于肌内给药的双特异性抗体dna的构建
EP1461359B1 (fr) 2002-01-18 2007-03-21 Pierre Fabre Medicament Anticorps anti-igf-ir et leurs applications
GB0222953D0 (en) * 2002-10-03 2002-11-13 Glaxo Group Ltd Novel Compounds
WO2004099389A2 (en) * 2003-03-24 2004-11-18 The Scripps Research Institute Dna vaccines against tumor growth and methods of use thereof
US20070298051A1 (en) 2003-11-19 2007-12-27 Beth Israel Deaconess Medical Center Adjuvants Of Immune Response
ES2546069T3 (es) * 2005-09-07 2015-09-18 Amgen Fremont Inc. Anticuerpos monoclonales humanos para quinasa-1 de tipo receptor de activina (ALK-1)
US20090010948A1 (en) * 2006-12-15 2009-01-08 The University Of Hong Kong Anti-tumor vaccines delivered by dendritic cells devoid of interleukin-10
EP2097529A4 (en) * 2006-12-29 2010-03-24 Osprey Pharmaceuticals Usa Inc METHOD FOR SELECTION AND PRODUCTION OF MODIFIED TOXINS, MODIFIED TOXINE CONJUGATES AND USES THEREOF
US20110263835A1 (en) 2008-10-07 2011-10-27 The Regents Of The University Of California Recombinant nell protein production
KR20130087517A (ko) 2010-06-25 2013-08-06 백시바디 에이에스 동종이합체 단백질 구조물

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004076489A1 (en) * 2003-02-25 2004-09-10 Medinnova As Modified antibody

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Blood, Vol. 110, No. 6, Pages 1797-1805(공개일: 2007. 9. 15.)* *
Retrovirology, Vol. 6, Suppl. 3, P359(공개일: 2009. 10. 22.)* *

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Publication number Publication date
US11479605B2 (en) 2022-10-25
KR102044948B1 (ko) 2019-11-14
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US20200239568A1 (en) 2020-07-30
EP2585107B1 (en) 2018-10-24
CA2803058A1 (en) 2011-12-29
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