KR20180098475A

KR20180098475A - 줄기세포 유래 나노소포체 및 이를 포함하는 발모 및 육모 촉진용 조성물

Info

Publication number: KR20180098475A
Application number: KR1020180023180A
Authority: KR
Inventors: 김홍중; 구본준; 김종근; 하태경
Original assignee: (주)인핸스드바이오
Priority date: 2017-02-24
Filing date: 2018-02-26
Publication date: 2018-09-04
Also published as: WO2018155979A1

Abstract

본 발명은 줄기세포 유래 미세소포체 및 이를 포함하는 발모촉진용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 (a) 줄기세포 배양액과 발모 촉진용 성분을 등장액에 현탁시키는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 용액에서 세포를 분해하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 용액을 원심분리(ultracentrifuge)하여 나노소포체를 수득하는 단계를 포함하는 방법으로 제조된, 줄기세포 유래 나노소포체를 유효성분으로 포함하는 탈모 예방 또는 발모 촉진용 화장료 조성물 및 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 방법은 탈모 방지 및 발모 촉진 효과를 통해 탈모 증상을 치료 또는 개선하는 효과가 있으며, 이를 통해, 발모 촉진 효과를 나타내는 화장품과 치료제를 제조하는 데에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

줄기세포 유래 나노소포체 및 이를 포함하는 발모 및 육모 촉진용 조성물{Nanovesicle derived from stem cell and composition of promoting hair growth and restoration comprising the same}

본 발명은 줄기세포 유래 나노소포체 및 이를 포함하는 발모 및 육모 촉진용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 a) 줄기세포를 필터에 통과시키는 단계; b) 상기 a) 단계에서 필터를 통과한 세포용액을 원심분리(ultracentrifuge)하여 나노소포체를 수득하는 단계; c) 상기 b) 단계에서 수득한 나노소포체에서 균일한 크기의 나노소포체를 분리 정제하는 단계; 및 d) 상기 c) 단계에서 분리 정제한 나노소포체에 발모 촉진용 성분을 봉입하는 단계를 포함하는 방법으로 제조된, 줄기세포 유래 나노소포체를 유효성분으로 포함하는 탈모 예방 또는 발모 및 육모 촉진용 화장료 조성물 및 약학적 조성물에 관한 것이다.

중간엽 줄기세포는 자기재생능력(self-renewal)과 줄기세포능(stemness maintenance)을 유지하면서 다양한 간엽 조직으로 분화할 수 있는 능력 (plasticity)을 가진 세포로, 손상 조직을 증식시키고 조직 재생을 위한 물질을 합성하는 것으로 밝혀졌다.

또한 중간엽 줄기세포는 면역 체계의 일부를 억제함으로써 면역 조절능력을 보이는데, T 및 B 림프구의 활성 및 증식을 억제하고, NK cell의 활성을 막으며 CTL-mediated lysis를 피하고, 수지상 세포(dendritic cell)나 대식세포(macrophage)가 분비하는 물질들을 조율하는 능력이 있어, 동종이식(allo-transplantation)이나 이종이식 (xeno-transplantation)에 사용이 가능한 것으로 알려져 있다.

중간엽 줄기세포는 1966년 Friedenstein 등에 의해 골수에 존재함이 처음 밝혀진 이후 연골세포, 골세포, 근육 세포로의 분화가 가능하다는 사실이 확인되었으며, 최근에는 다양한 손상 조직 및 세포의 재생 효능에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다. 또한 현재 중간엽 줄기세포는 골수 외에 지방조직, 탯줄혈액(umbilicalcord blood), 활막(synovial membrane), 활액(synovial fluid), 골막(periosteum), 진피(dermis), 골조직(trabecular bone), 근육 등에서 추출이 가능하며, 각각은 비슷한 표현형 (phenotype)을 가지고 있으나 증식 및 분화 잠재력에 있어는 다양한 차이를 보이고 있다.

최근 미국에서는 탈모 환자의 지방 유래 줄기세포를 추출하여, 두피에 직접 주사하는 방식의 탈모 치료가 이루어지는 등, 중간엽 줄기세포가 발모에 효과가 있다는 것이 알려졌다.

한편, 탈모는 자연적인 과정을 통해 발생하거나, 암과 같은 증상들을 경감시키기 위해 고안된 특정 치료 약물의 사용으로 인한 부작용으로 발생한다. 특히 나이 들면서 발생하는 남성과 여성에 나타나는 두피 탈모가 특징인 안드로겐성 탈모증(AGA)(즉, 남성형 탈모증 및 여성형 탈모증)이 일반적이다. 또는 미시적 염증성으로 보통 복원이 가능하고 국부적 탈모증이라고 지칭되는 원형 탈모증(AA), 및 화학요법 또는 방사선 치료와 관련한 탈모증(즉, 2차 탈모증)이 포함된다.

이러한 탈모를 해결하기 위해 일반적으로는 약물 요법을 사용한다. 비타민 및 호르몬과 같은 다양한 약물이 시도되고 있으며, 미국 특허 제3,461,461호 및 제4,596,812호에 기재된 상품명 "미녹시딜(Minoxidil)"로 시판 중인 모발 성장제를 주로 사용하고 있다.

모발 성장 촉진 또는 탈모 방지제로서 시판되는 제품이 모발에 주는 효과는 모발 성장기 유도 효과, 모발 성장기 연장 효과, 5α-리덕타제 저해 효과, 혈행 촉진 효과, 살균 효과, 비듬 방지 효과, 보습 효과, 항산화 효과 등이 있으나, 이러한 기존의 제제에서 탈모 방지, 모발 성장 촉진 효과는 충분하지 않다. 또한, 이러한 제품들은 두피에 사용할 경우에 발모 촉진용 성분이 체내에 효과적으로 전달되지 않아, 탈모 방지나 모발 성장 촉진 효과가 충분하게 나타나지 않는다.

이에 본 발명자들은 체내에 보다 효과적으로 약물을 전달하는 방법을 연구한 결과, 줄기세포로부터 나노소포체를 분리하고, 이를 이용하여 치료 물질 또는 기능성 물질을 효과적으로 전달할 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은

a) 줄기세포를 필터에 통과시키는 단계;

b) 상기 a) 단계에서 필터를 통과한 세포용액을 원심분리(ultracentrifuge)하여 나노소포체를 수득하는 단계;

c) 상기 b) 단계에서 수득한 나노소포체에서 균일한 크기의 나노소포체를 분리 정제하는 단계; 및

d) 상기 c) 단계에서 분리 정제한 나노소포체에 발모 촉진용 성분을 봉입하는 단계를 포함하는 방법으로 제조된, 줄기세포 유래 나노소포체를 유효성분으로 포함하는 탈모 예방 또는 발모 및 육모 촉진용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은

a) 줄기세포를 필터에 통과시키는 단계;

d) 상기 c) 단계에서 분리 정제한 나노소포체에 발모 촉진용 성분을 봉입하는 단계를 포함하는 방법으로 제조된, 줄기세포 유래 나노소포체를 유효성분으로 포함하는 탈모 예방 또는 발모 및 육모 촉진용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

a) 줄기세포를 필터에 통과시키는 단계;

d) 상기 c) 단계에서 분리 정제한 나노소포체에 발모 촉진용 성분을 봉입하는 단계를 포함하는 방법으로 제조된, 줄기세포 유래 나노소포체를 유효성분으로 포함하는 탈모 예방 또는 발모 및 육모 촉진용 화장료 조성물을 제공한다.

다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

a) 줄기세포를 필터에 통과시키는 단계;

d) 상기 c) 단계에서 분리 정제한 나노소포체에 발모 촉진용 성분을 봉입하는 단계를 포함하는 방법으로 제조된, 줄기세포 유래 나노소포체를 유효성분으로 포함하는 탈모 예방 또는 발모 및 육모 촉진용 약학적 조성물을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은

a) 줄기세포를 필터에 통과시키는 단계;

각 단계에 대하여 상세히 설명한다.

상기 (a) 단계는 줄기세포를 필터에 통과시키는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 일실시예에서 무혈청 배지에서 배양한 줄기세포를 10㎛ 크기의 필터에 줄기세포를 3회 이상 통과시킨다.

본 발명의 ‘줄기세포’는 증식(자기-재생) 및 분화(가소성)할 수 있는 능력을 갖는 어떠한 미분화 세포 또는 부분적 미분화 세포를 포함한다. 이러한 줄기세포는 발생 과정 중 종점(endpoint) 단계의 세포인 특정 세포 리니지(lineage)의 성숙세포를 대체한다. 또한, 줄기세포는 무제한 자기-재생능 및 전분화능 가소성을 갖는 줄기세포 및, 다분화능 또는 단분화능 가소성을 갖는 전구세포를 포함한다.

본 발명에서 상기 줄기세포는 중간엽줄기세포인 것을 특징으로 하며, 바람직하게는 뇌, 간, 폐, 제대혈, 태아혈, 신장, 지방 조직, 태반, 양막 또는 골수에서 유래한 중간엽줄기세포일 수 있다.

본 발명에서 ‘중간엽줄기세포(Mesenchymal Stem Cells; MSCs)’는 흔히 중간엽기질세포(mesenchymal stromal cells)라고 불리기도 하며, 다능성 미분화 세포를 의미한다. 중간엽줄기세포는 자기-재생 및 중배엽 리니지(lineage) 및 내배엽 및 외배엽과 같은 다른 배아 리니지로 분화할 수 있는 능력을 갖는 줄기세포의 비균질 파퓰레이션을 갖는다. 중간엽줄기세포는 골모세포(osteoblast), 연골모세포(chondroblast), 지방세포(adipocyte)등을 포함하는 다양한 형태의 세포로 분화할 수 있다. 또한, 중간엽줄기세포는 배아줄기세포(Embryonic stem cells; ESCs), 유도만능줄기세포(induced Pluripotent Stem Cells; iPSCs) 및 다른 조직 특이적인 줄기세포와 비교하여, 조직 재생, 혈액 생성 보조(hematopoietic support)및 면역조절(immunomodulation)을 포함하는 다방면의 우수한 이용가능성, 낮은 윤리적 문제 및 면역원성을 갖기 때문에, 재생의학의 임상적용을 위한 이상적인 후보이다. 중간엽줄기세포는 뇌, 간, 폐, 태아혈, 제대혈, 신장, 지방 조직 및 태반으로부터 분리할 수 있다. 바람직하게는 인간 골수로부터 분리한 것일 수 있다.

상기 b) 단계는 상기 필터를 통과한 세포용액을 원심분리(ultracentrifuge)하여 나노소포체를 수득하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일실시예에서, 줄기세포를 PBS에 현탁하여, 10㎛ 사이즈의 필터와 5㎛ 폴리카보네이트 필터에 통과시킨 후, 초원심분리를 실시한 다음, 나노소포체를 수득하였다(실시예 2-1 및 도 1 참조). 그 다음 동적 광산란 입도 분석기를 이용하여 수득한 나노소포체의 크기를 관찰하였고, TEM 현미경을 이용하여 나노소포체의 특성을 관찰한 결과, 나노소포체가 25 내지 100㎛의 크기를 가지며, 구형이고 인지질 이중층으로 이루어진 것을 확인하였다(실시예 2-2, 도 2a 및 도 2b 참조).

상기 (c) 단계는 상기 (b) 단계에서 수득한 나노소포체에서 균일한 크기의 나노소포체를 분리 정제하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 ‘나노소포체(nanovesicle)’는 나노단위 크기를 갖는 소낭 구조를 의미하며, 지질 단일층으로 둘러싸여 있다는 측면에서 지질 이중층으로된 나노리포좀(nanoliposome)과 구별되고, 유래되는 세포의 세포막 성분으로 이루어진 지질이중막에 의해 나노베시클 내부와 외부가 분리된 구조를 가지며 세포의 세포막 지질, 세포막 단백질, 핵산 및 세포 성분 등을 가지고 있다. 이는 인위적으로 합성하기 어려운 생체물질을 효과적으로 담아 막 단백질을 통해 특정한 조직으로 전달할 수 있고, 세포 간의 mRNA, miRNA 및 단백질의 운송을 매개하고 세포 내외의 신호전달 및 상호작용에 중요한 역할을 한다. 또한 나노소포체는 유래한 세포, 세포의 수, 세포의 크기 및 항원의 구성에 따라 이종개체군(Heterogeneous population)을 나타낸다. 보다 바람직하게는 50 내지 200nm의 크기를 갖는 나노소포체일 수 있다.

본 발명의 일실시예에서 나노소포체를 분리 정제하기 위하여, 50% 옵티프렙과 10% 옵티프렙을 첨가한 다음 초원심분리하는 방법인 밀도 구배 방법을 이용하여 나노소포체를 분리하였고, 핵 물질을 제거하여 일정한 품질을 가지는 나노소포체를 분리 정제하였다(실시예 2-3 참조).

상기 d) 단계는 상기 c) 단계에서 분리 정제한 나노소포체에 발모 촉진용 성분을 봉입하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서 ‘탈모’는 두피로부터 모발이 탈락하는 현상 또는 모발이 성기거나 가늘어지는 상태를 의미하며, ‘육모 촉진’은 새로운 모발의 생성 촉진뿐만 아니라 기존 모발이 건강하게 자라도록 하는 것을 의미하고 당업계에서 이용되는 또 다른 용어 양모 또는 발모 촉진과 동일한 의미를 가진다.

본 발명에서 ‘발모 촉진용 성분’은 인슐린유사성장인자(Insulin like growth factor, IGF-1), 섬유아세포성장인자(β-fibroblast growth factor, β-FGF), 티모신 β4(thymosin β4), 비오틴(Biotin) 및 비타민 C인 것을 특징으로 한다.

상기 ‘인슐린유사성장인자(Insulin like growth factor, IGF-1)’는 인슐린과 비슷한 구조를 가진 호르몬의 일종으로, DHT(Dihydrotestosterone)로 인해 생성되는 모낭 성장촉진 인자이다. 소아 성장에 중요한 역할을 하며, 성인에서도 계속 작용하여 신체 유지 효과를 나타낸다.

상기 ‘섬유아세포성장인자(β-fibroblast growth factor, β-FGF)’는 섬유아세포를 자극하여 강한 증식성을 유도하는 성장인자로서, 뇌하수체, 뇌, 신장, 부신, 태반, 골기질, 연골, 내피세포, 섬유아세포 등에 널리 분포한다. 이는 진피에 위치하는 섬유아세포를 자극하여 손상된 조직의 복구와 콜라겐 합성을 촉진시켜 두피를 건강하게 하며, 탈모를 예방하는 효과가 있다고 알려져 있다.

상기 ‘티모신 β4(thymosin β4)’는 4.9 kDa 크기의 생체 내 단백질로서, 세포 이동을 조절하여 세포 이동을 촉진시키는 역할을 하며, 이로 인해 혈관내피세포의 이동, 상처치유에 관여하는 세포들의 이동, 모발 근원세포, 그리고 암세포의 이동 등을 촉진시켜 혈관형성, 상처치유, 모발성장, 암전이 등에 관여하는 단백질이다.

상기 ‘비오틴(Biotin)’은 동식물의 생육에 필요한 비타민B복합체의 일종으로 탈모치료 및 예방에 도움이 되는 모발영양제로 알려져 있으며, 케라틴 단백질을 만드는 조효소 기증이 있어 모발을 건강하게 만드는 효과가 있다.

상기 ‘비타민 C’는 모근파괴 물질을 억제해 탈모를 방지하는 효과가 있으며, 콜라겐 합성을 촉진하여 얇은 모발을 굵어지게 하는 효과가 있다.

본 발명에서 나노소포체에 발모 촉진용 성분을 봉입하는 것은 공지된 봉입 기술을 이용할 수 있으나, 바람직하게는 삼투압을 이용하는 방법, 초음파분쇄방법, 전기영동방법을 이용할 수 있으며, 가장 바람직하게는 초음파분쇄방법을 이용하여 발모 촉진용 성분을 봉입할 수 있다. 본 발명에서의 봉입은 나노소포체의 구조, 크기와 같은 물리적 성질을 실질적으로 유지하면서 목적하는 약물이 나노소포체 내로 봉입되는 것을 의미한다.

본 발명의 일실시예에서는 상기 c) 단계에서 분리 정제된 나노소포체의 구조 또는 크기와 같은 물리적 특성을 유지하며, 보다 효율적으로 발모 촉진용 성분을 봉입하기 위하여, 발모 촉진용 성분 용액에 분리 정제된 나노소포체를 넣고, 37℃의 배양기에서 2시간 동안 배양하는 방법, 초음파분쇄(sonication)하는 방법(40kHz, 40℃, 1시간), 전기영동 방법(200V)을 각각 실시한 다음, 각 용액의 봉입율을 측정하여 비교하였다. 그 결과, 초음파분쇄방법으로 발모 촉진용 성분을 봉입하였을 때, 나노소포체의 물리적 성질이 가장 효과적으로 유지되며, 가장 많은 양의 발모물질이 봉입 가능하다는 것을 확인하였다(실시예 3 참조).

본 발명에서 화장료는 헤어토닉, 헤어로션, 헤어크림, 헤어스프레이, 헤어무스, 헤어젤, 헤어컨디셔너, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어팩, 헤어트리트먼트, 눈썹발모제, 속눈썹발모제, 속눈썹영양제, 애완동물용 샴푸 또는 애완동물용 린스인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형은 특별히 제한되지 않으며, 목적하는 바에 따라 적절히 선택할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 화장료 조성물은 피부외용연고, 유연화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 팩, 에멀젼, 오일젤 등의 제형으로 제조될 수 있다. 이때, 상기 피부외용연고는 본 발명의 약재 추출물 이외에, 바셀린, 폴리옥시에틸렌올레일에테르 포스페이트 등을 함유할 수 있으며, 유연화장수는 본 발명의 약재 추출물 이외에 다가알콜류 (프로필렌글리콜, 글리세린 등) 및 계면활성제 (폴리에틸렌올레일에테르, 폴리옥시에틸렌, 경화 피마자유 등) 등을 포함할 수 있다. 또한, 영양화장수 및 영양크림은 본 발명의 약재 추출물 이외에 오일류(스쿠알렌, 바셀린, 옥틸도데칸올 등) 및 왁스 성분 (스테아릴알콜, 밀납 등)을 포함할 수 있으며, 에센스는 본 발명의 조성물 이외에 글리세린, 프로필렌글리콜 등 다가 알콜류를 포함할 수 있다. 마사지 크림은 본 발명의 조성물 이외에 유동 파라핀, 바셀린, 이소노닐이소노나노에이트 등의 오일을 포함할 수 있으며, 팩 또는 일반유화형 화장료는 본 발명의 약재 추출물 이외에 카올린, 탈크, 산화아연, 이산화티탄 등의 안료가 포함된 워시-오프 (wash-off) 팩의 형태로 제조할 수 있다. 또한, 본 발명의 화장료 조성물은 각각의 제형에 상기 기재한 성분들 이외에도 일반 피부화장료에 배합되는 물, 유분, 계면활성제, 보습제, 저급 알코올, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 또는 향료 등을 필요에 따라 적절히 배합하여 사용할 수 있다.

또한 본 발명은

a) 줄기세포를 필터에 통과시키는 단계;

본 발명에 따른 약학적 조성물은 줄기세포 유래 나노소포체를 단독으로 함유하거나 약학적으로 허용되는 담체와 함께 적합한 형태로 제형화 될 수 있으며, 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다. 상기에서 '약학적으로 허용되는'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 조성물을 말한다.

약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 아울러, 펩티드 제제에 대한 경구투여용으로 사용되는 다양한 약물전달물질을 포함할 수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코오스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸-또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현택제 등을 추가로 포함할 수 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack PublishingCompany, Easton, PA, 1995).

본 발명의 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다.

경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의 정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 19th ed., Mack PublishingCompany, Easton, PA,1995)에 기재되어 있다.

본 발명의 조성물의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 바람직하게 본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 전체 용량은 1일당 환자 체중 1㎏ 당 약 0.01㎍ 내지 10,000mg, 가장 바람직하게는 0.1㎍ 내지 500mg일 수 있다. 그러나 상기 약학적 조성물의 용량은 제제화 방법, 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 본 발명의 조성물의 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.

본 발명의 일실시예에서 마우스의 등 부분의 턱을 제거한 다음 3그룹으로 나누어 각 그룹에 PBS, 미녹시딜 3% 또는 줄기세포 유래 나노소포체 용액을 각각 5ml씩, 하루에 1번, 2주 동안 도포하며 발모 효과를 관찰한 결과, 본 발명에서 제조한 줄기세포 유래 나노소포체 용액을 도포한 그룹의 경우에 발모 효과가 가장 좋은 것을 확인하였다(실시예 4 및 도 3 참조).

따라서, 본 발명은 줄기세포에서 유래된 나노소포체를 포함하는 발모 및 육모 촉진용 조성물을 제공한다. 본 발명의 방법은 탈모 방지. 발모 및 육모 촉진 효과를 통해 탈모 증상을 치료 또는 개선하는 효과가 있으며, 이를 통해, 발모 및 육모 촉진 효과를 나타내는 화장품과 치료제를 제조하는 데에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 중간엽 줄기세포 유래 나노소포체를 제조하는 방법을 도식도로 나타낸 것이다.
도 2a는 중간엽 줄기세포를 필터에 통과시킨 다음, 초원심분리 하여 획득한 나노소포체의 크기 분포를 그래프로 나타낸 것이다.
도 2b는 TEM 현미경을 이용하여 중간엽 줄기세포 유래 나노소포체의 형태를 관찰한 것을 나타낸 것이다.
도 3은 마우스에 발모 성분을 함유한 줄기세포 유래 나노소포체를 도포하여 발모 효능을 확인한 것을 나타낸 것이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

줄기세포 무혈청 배양방법

줄기세포의 무혈청 배양에 사용되고 있는 배양액 중 최적화된 배양액 및 배양조건을 확립하기 위하여 다음과 같이 실험을 실시하였다.

먼저 초기 세포조건을 동일하게 하기 위하여, 동결된 세포를 DMEM/FBS 배양 배지를 이용하여 5% CO₂ 조건하에서 80% confluency에 도달할 때까지 배양한 다음, 각각 StemPro, MesenCult, Xmedia, NutriStem,MSCGM-CD를 10ml씩 첨가하며, 각 배지의 protocol을 참조하여 해당 배지에 맞는 coating reagent로 사용전 미리 코팅해 놓은 T75 플라스크(flask)로 seeding하였다.

passage 5에 도달하였을 때, 일부 세포를 취하여 Flow cytometry 및 분화시험(골, 연골, 지방)에 사용하였다. flow cytometry 실험을 통하여 CD 마커를 확인하였고, 양성 마커 3종(CD44, CD73, CD90)과 음성 마커 2종(CD34, CD45)의 발현율을 측정하였다. 그 다음 Alizarin RED 염색법으로 골분화를 확인하였고, Alcian blue 염색법으로 연골분화를 확인하였고, Oil red O 염색법으로 지방분화를 확인하여 전체적으로 염색이 나타나는 것을 확인하였다. passage 10에 도달하였을 때, 상기와 동일하게 일부 세포를 취하여 Flow cytometry 및 분화시험(골, 연골, 지방)을 실시하였다.

그 다음 각 passage 마다 획득한 세포수를 바탕으로 PDT(Population doubling time)을 측정하여 일정하게 가장 낮은 PDT 값을 유지한 배지를 확인하였고, 각 passage 별로 세포 생존능을 확인하여 80% 이상을 유지하는지 확인하였다.

상기 각각의 PDT, 세포 생존능, Flow cytometry 및 분화시험 결과를 검토하여 Xmedia(Xcell therapeutics)를 이용하여 10⁶cells/ml의 세포를 플라스크에서 배양하고, 10L 생물 반응기(bioreactor)의 배양 조건을 설정하였다.

<실시예 2>

줄기세포를 이용한 나노소포체 제조 방법

<2-1> 줄기세포 유래 나노소포체 제조

확보된 동결세포를 T75 플라스크에 분주하여, Xmedia (Xcell therapeutics) 10ml을 첨가한 다음, 5% CO₂ 조건하에서 80% confluency에 도달할 때까지 배양하였다. 그 다음 Trypsin/EDTA를 이용하여 세포를 탈착시킨 후, 3X10⁵개의 세포를 새로운 Xmedia가 포함된 T75 플라스크에 배양하였다.

세포에서 나노소포체를 분리하기 위하여, 특수 제작된 원심분리용 병(bottle)의 필터지지대에 10㎛ 사이즈의 구멍을 갖는 필터를 넣은 다음 본체와 조립한 뒤 알코올과 PBS로 세척하였다.

그 다음 배양된 줄기세포 5x10⁷ cells/ml를 1ml PBS(phosphate bufferedsaline) 용액에 현탁(resuspension)하였다. 상기 현탁액을 본체에 주입한 다음, 1,3000g로 1분 45초 동안 초원심분리를 실시하였고, 동일한 조건으로 3회 반복하였다. 2차적으로 필터지지대에 5㎛ 사이즈의 구멍을 갖는 폴리카보네이트 필터를 넣고 상기와 같이 알코올과 PBS로 세척한 다음 세포를 다시 본체에 넣고, 1,3000g로 1분 45초 동안 3회 반복하여 초원심분리를 실시하였다. 이를 도 1에 나타내었다.

<2-2> 나노소포체의 사이즈 및 특성 분석

상기 실시예 2-1에서 제조한 나노소포체의 사이즈를 측정하고 특성을 분석하기 위하여 다음과 같이 실험을 실시하였다.

상기 실시예 2-1에서 수득한 나노소포체에 포함된 단백질을 5㎍/ml 농도로 1ml PBS에 희석한 다음, 큐벳(cuvette)에 넣은 다음 동적 광산란 입도 분석기(Marvern Zetasizer Nano)로 분석하였다.

그 결과 도 2a에 나타난 바와 같이, 나노소포체의 크기는 25 내지 100nm인 것을 확인하였고, 평균 크기는 약 50nm인 것을 확인할 수 있었다.

또한, 상기 실시예 2-1에서 수득한 나노소포체의 특성을 분석하기 위해, PBS에 현탁시킨 나노소포체 용액을 글로우-방전 탄소-코팅 구리 그리드(glow-discharged carbon-coated copper grid)에 3분간 흡착시켰다. 그 다음 그리드를 증류수로 세척한 다음 2% 우라닐아세테이트(uranylacetate)로 1분 동안 염색시켰다. TEM 현미경인 JEM101(Jeol, Japan) 투과전자현미경을 이용하여 나노소포체를 관찰하였다.

그 결과 도 2b에 나타난 바와 같이, 줄기세포 유래 나노소포체는 인지질 이중층으로 이루어진 것을 확인할 수 있었고, 대체로 구형을 이루고 있는 것을 확인할 수 있었다.

이를 통해, 본 발명의 줄기세포 유래 나노소포체는 구형이고, 인지질 이중층으로 이루어져 있으며, 평균 50nm의 크기를 갖는 것을 확인할 수 있었다.

<2-3> 나노소포체 분리 및 정제 방법

상기 실시예 2-1에서 분리한 나노소포체에는 소포체 외의 다른 물질이 혼합되어 있으므로 다음과 같은 방법으로 나노소포체를 분리 정제하였다.

먼저 상기 실시예와 동일하게 알코올과 PBS로 세척한 5㎛ 폴리카보네이트 필터에 세포 현탁액을 통과시킨다. 그 다음 2.2ml 초원심분리 튜브(ultracentrifugetube)에 각각 50% 옵티프렙(OptoPrep) 400㎕, 10% 옵티프렙 600㎕ 및 필터를 통과시킨 현탁액 1ml을 넣고, 100,000g에서 1시간 동안 초원심분리를 실시하였다. 원심분리 후에 50% 옵티프렙과 10% 옵티프렙 사이의 층에서 나노소포체를 수득하였다.

이를 통해, 90% 이상의 핵 물질을 제거함으로서 일정한 품질을 갖는 나노소포체를 분리 정제하였다.

<실시예 3>

나노소포체에 발모 효능 물질 봉입 방법

기존에 발모 효능이 입증되어 있는 성장인자(growth factor), 비타민(vitamin) 및 무기성분 중 나노소포체에 캡슐화(encapsulation)한 제형을 선별하기 위하여 다음과 같이 실험을 실시하였다.

먼저 나노소포체에 투여할 발모 성분으로 IGF-1, β-FGF, Thymosin β4, Biotin, 비타민 C를 선별하였다. 50 내지 200nm 크기의 나노소포체 1mg/ml을 PBS에 분주한 다음, 1) 37℃의 배양기에서 2시간 동안 배양(incubation), 2) ultrasonic bath(40kHz, 40℃)에서 1시간 동안 초음파분해(sonication), 3) 전기영동(200V) 3가지 공정을 시행하였다.

상기 3가지 공정을 통해, 나노소포체에 발모 효능 물질을 봉입하는 방식별로 봉입율을 평가한 결과, 초음파분해(sonication)법을 이용하여 발모 효능 물질인 IGF-1, β-FGF, biotin, 비타민 C를 나노소포체에 봉입하였을 때, 10㎍ 나노소포체(단백질) 당 3~6㎍의 발모물질이 봉입 가능하다는 것을 확인하였다.

<실시예 4>

발모 효능 물질을 봉입한 나노소포체의 발모 효과

상기 실시예 3에서 제조한 줄기세포 유래 나노소포체의 발모 효과를 확인하기 위하여 다음과 같이 실험을 실시하였다.

C57BL/6 마우스를 구입하여, 25℃, 습도 40% 사육조건에서 1주일간의 적응기를 갖고, 7주령이 되는 주에 실험을 실시하였다. 마우스를 에테르가 들어있는 데시케이터에 넣고 1분간 마취시킨 후, 마우스의 등부분을 제모기를 이용하여 털을 제거한 다음 3그룹으로 분류하였다. 1일 후 등 부위에 상처가 없는 마우스에 PBS, 3% 미녹시딜, 줄기세포 유래 나노소포체 용액을 각각 도포하였다. 각 시료는 2주 동안 하루에 1번 5ml씩 도포하였고, 3일 후, 7일 후, 14일 후에 마우스 등의 발모 변화를 관찰하였다. 대조군으로는 PBS를 사용하였으며, 기존에 탈모 치료에 사용되는 미녹시딜을 사용하여 효과를 비교하였다.

그 결과 도 3에 나타난 바와 같이, PBS를 도포한 경우보다 미녹시딜과 줄기세포 유래 나노소포체 용액을 도포한 경우에 발모 효과가 더 좋은 것으로 나타났으며, 미녹시딜을 도포한 경우보다 줄기세포 유래 나노소포체 용액을 도포한 경우에 발모 효과가 현저하게 좋은 것으로 나타났다.

이를 통해, 본 발명의 발모 촉진 성분이 봉입된 줄기세포 유래 나노소포체가 발모 촉진 및 탈모 치료에 현저한 효과를 나타낸다는 것을 확인할 수 있었다.

이상 살펴본 바와 같이 본 발명의 방법은 탈모 방지, 발모 및 육모 촉진 효과를 통해 탈모 증상을 치료 또는 개선하는 효과가 있으며, 이를 통해, 발모 및 육모 촉진 효과를 나타내는 화장품과 치료제를 제조하는 데에 유용하게 이용될 수 있다.

Claims

a) 줄기세포를 필터에 통과시키는 단계;
b) 상기 a) 단계에서 필터를 통과한 세포용액을 원심분리(ultracentrifuge)하여 나노소포체를 수득하는 단계;
c) 상기 b) 단계에서 수득한 나노소포체에서 균일한 크기의 나노소포체를 분리 정제하는 단계; 및
d) 상기 c) 단계에서 분리 정제한 나노소포체에 발모 촉진용 성분을 봉입하는 단계를 포함하는 방법으로 제조된, 줄기세포 유래 나노소포체를 유효성분으로 포함하는 탈모 예방 또는 발모 및 육모 촉진용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 줄기세포는 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 줄기세포는 뇌, 간, 폐, 제대혈, 태아혈, 신장, 지방 조직, 태반, 양막 및 골수로 이루어진 군에서 선택된 하나의 기관으로부터 유래한 중간엽줄기세포인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 a) 단계는 10㎛ 크기의 필터에 3회 이상 통과시키는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 b) 단계의 나노소포체의 크기는 50 내지 200nm인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 c) 단계의 발모 촉진용 성분은 인슐린유사성장인자(Insulin like growth factor, IGF-1), 섬유아세포성장인자(β-fibroblast growth factor, β-FGF), 티모신 β4(thymosin β4), 비오틴(Biotin) 및 비타민 C로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 화장료는 헤어토닉, 헤어로션, 헤어크림, 헤어스프레이, 헤어무스, 헤어젤, 헤어컨디셔너, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어팩, 헤어트리트먼트, 눈썹발모제, 속눈썹발모제, 속눈썹영양제, 애완동물용 샴푸 또는 애완동물용 린스인 화장료 조성물.
a) 줄기세포를 필터에 통과시키는 단계;
b) 상기 a) 단계에서 필터를 통과한 세포용액을 원심분리(ultracentrifuge)하여 나노소포체를 수득하는 단계;
c) 상기 b) 단계에서 수득한 나노소포체에서 균일한 크기의 나노소포체를 분리 정제하는 단계; 및
d) 상기 c) 단계에서 분리 정제한 나노소포체에 발모 촉진용 성분을 봉입하는 단계를 포함하는 방법으로 제조된, 줄기세포 유래 나노소포체를 유효성분으로 포함하는 탈모 예방 또는 발모 및 육모 촉진용 약학적 조성물.