KR20180083938A - Fgf21 변이체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 인간 섬유모세포 성장 인자 21(human fibroblast growth factor 21; FGF21)의 폴리펩티드 변이체 및 이의 융합 분자와, 이들을 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 추가로 본 발명은 특히 비만, 과체중, 대사 증후군, 진성 당뇨병, 고혈당증, 이상지질혈증, 비알코올성 지방간염 (NASH) 및/또는 아테롬성 동맥경화증의 치료를 위한 의약으로서의 그의 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 인간 섬유모세포 성장 인자 21(human fibroblast growth factor 21; FGF21)의 폴리펩티드 변이체 및 이의 융합 분자와, 이들을 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 추가로 본 발명은 특히 비만, 과체중, 대사 증후군, 진성 당뇨병, 고혈당증, 이상지질혈증, 비알코올성 지방간염(non-alcoholic steatohepatitis; NASH) 및/또는 아테롬성 동맥경화증의 치료를 위한 의약으로서의 그의 용도에 관한 것이다.
섬유모세포 성장 인자(FGF)는 발달 중인 그리고 성체의 조직에서 널리 발현되는 폴리펩티드이다. FGF 패밀리는 현재 22가지의 구성원인 FGF1 내지 FGF23 (이들 중 하나는 FGF15/19로 칭해짐)으로 이루어져 있다. FGF 패밀리의 구성원은 유전자 구조 및 아미노산 서열 둘 다에 있어서 척추 동물 종간에 고도로 보존되어 있다. 서열 상동성 및 계통발생의 차이를 기반으로 하여 6개의 하위패밀리로 분류되는 18가지의 포유류 섬유모세포 성장 인자(FGF1 내지 FGF10 및 FGF16 내지 FGF23)가 있다. 하위패밀리에 할당되지 않은 넘버링된(numbered) ‘FGF’ - FGF 상동성 인자(이전에 FGF11 내지 FGF14로 공지되어 있음) - 는 FGF 패밀리와 높은 서열 동일성을 갖지만, FGF 수용체(FGFR)를 활성화시키지 않으며 따라서 일반적으로 FGF 패밀리의 구성원으로 여겨지지 않는다. 대부분의 FGF는 세포의 성장 및 분화의 국소적인 조절자로서 작용하지만, 최근의 연구는 FGF15/19, FGF21 및 FGF23을 포함하는 FGF19 하위패밀리 구성원이 내분비적 방식에 의해 중요한 대사 효과를 발휘함을 나타냈다. FGF-19 하위패밀리의 구성원은 전통적인 FGF에 의해서는 영향을 받지 않는 다양한 생리학적 과정을 조절한다. 이들 내분비 인자의 매우 다양한 대사 활성은 담즙산, 탄수화물 및 지질 대사, 및 인산염, 칼슘 및 비타민 D의 항상성의 조절을 포함한다.
FGF21은 원래 마우스 배아로부터 단리되었다. FGF21 mRNA는 간에서 가장 풍부하게, 그리고 흉선에서 더 적은 정도로 발현되었다. 인간 FGF21은 마우스 FGF21과 고도로 유사하다 (대략 81%의 아미노산 동일성). 인간 FGF 패밀리 구성원 중에서, FGF21은 FGF19와 가장 유사하다 (대략 30%의 아미노산 동일성). FGF21은 대다수의 FGF 패밀리 구성원에 있어서 전형적인 증식 및 종양 형성 효과를 나타내지 않는다.
FGF21은 비만 및 2형 진성 당뇨병의 동물 모델에서 강한 항당뇨 및 지질-강하 효과를 발휘하는, 주로 간에 의해 생성되는 대사 조절자이다. 이러한 호르몬은 체중 조절에 기여하며, 영양 실조 및 케톤체 생성 상태(ketogenic state)에 대한 반응에 연루된다 (마우스에서). FGF-21의 주요 대사 작용 부위는 지방 조직, 간 및 췌장이다. 실험 연구는 당뇨병 마우스 및 영장류에서 FGF21 투여 후 당뇨병 보상 및 이상지질혈증의 개선을 보여주었다. FGF-21은 인슐린의 존재 및 부재 하에 마우스 3T3-L1 지방세포에서 글루코스 흡수를 자극하고, ob/ob 및 db/db 마우스 및 8주령 ZDF 래트(rat)에서, 식후 및 공복 혈중 글루코스, 트리글리세리드 및 글루카곤 수준을 용량-의존적 방식으로 감소시키고 이에 따라 당뇨병 및 비만을 치료하기 위한 치료법으로서의 FGF-21의 사용의 기반을 제공하는 것으로 밝혀졌다.
비만 렙틴-결핍 ob/ob 및 렙틴 수용체-결핍 db/db 마우스 및 비만 ZDF 래트로의 FGF-21의 투여에 의해, 혈중 글루코스 및 트리글리세리드가 유의하게 저하되고, 공복 인슐린 수준이 감소되고, 경구 내당능 검사 동안 글루코스 제거가 향상되었다. FGF-21은 2주의 투여 과정에 걸쳐, 당뇨병 또는 야윈(lean) 마우스 및 래트의 음식 섭취 또는 체중/조성에 영향을 미치지 않았다. 중요하게는, 당뇨병 또는 건강한 동물에서 시험되는 임의의 용량에서 또는 트랜스제닉 마우스에서 과발현되는 경우 FGF-21이 유사 분열 촉진성(mitogenicity), 저혈당증 또는 체중 증가를 유도하지 않았다. FGF-21-과발현 트랜스제닉 마우스는 식이-유도 비만에 대하여 저항성이 있었다.
6주 동안 당뇨병 붉은 털(rhesus) 원숭이로의 FGF-21의 투여에 의해, 공복 혈장중 글루코스, 프룩토사민, 트리글리세리드, 인슐린 및 글루카곤 수준이 감소되었다. 중요하게는, 유의한 글루코스-저하 효과에도 불구하고, 연구 동안 저혈당증이 관찰되지 않았다. FGF21 투여는 또한 유의하게 LDL-콜레스테롤을 저하시키고 HDL-콜레스테롤을 증가시켰으며, 마우스와는 대조적으로, 체중을 약간, 그러나 유의하게 감소시켰다.
당뇨병, 비만, 대사 증후군 및 기타 증후의 치료에서의 치료제로서의 인간 야생형 FGF21의 사용과 연관된 문제점으로는 생체 내에서의 그의 제한된 반감기가 있다. 마우스에서 FGF21은 1시간 미만의 반감기를 가지며, 시노몰구스(cynomolgus) 원숭이 (마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis))에서는 단지 대략 2 내지 4시간의 반감기를 갖는다. 따라서, 치료제로 사용하기 위한 FGF21 단백질의 개발에서, 인간 야생형 FGF21에 비하여 개선된 약제학적 특성, 특히 프로테아제 및/또는 열적 분해에 대한 증가된 안정성 및/또는 증가된 효력/효능을 갖는 변이체에 대한 필요성이 있다. 이러한 목표를 달성하기 위하여, FGF21 변이체를 설계하여 향상된 안정성을 갖는 FGF21 폴리펩티드를 확인하였다.
제1 측면에서, 본 발명은 서열 번호 171의 아미노산 서열을 포함하는 인간 섬유모세포 성장 인자 21 (FGF21)의 변이체에 관한 것으로서,
여기서,
- Xaa55는 Q 또는 또 다른 아미노산, 예컨대 G 또는 C이며;
- Xaa147은 P 또는 C이거나, 결실되며;
- Xaa148은 G 또는 C이거나, 결실되며;
- Xaa149는 N 또는 C이거나, 결실되며;
- Xaa150은 K 또는 또 다른 아미노산, 예컨대 H이거나, 결실되며;
- Xaa151은 S이거나 결실되며;
- Xaa152는 P 또는 또 다른 아미노산, 예컨대 A 또는 L이거나, 결실되며;
- Xaa153은 H 또는 또 다른 아미노산, 예컨대 Q, Y 또는 K이거나, 결실되며;
- Xaa154는 R 또는 또 다른 아미노산, 예컨대 Q 또는 K이거나, 결실되며;
- Xaa155는 D 또는 또 다른 아미노산, 예컨대 L, K, Y, P, E, N 또는 C이거나, 결실되며;
- Xaa156은 P 또는 또 다른 아미노산, 예컨대 A 또는 K이거나, 결실되며;
- Xaa157은 A 또는 또 다른 아미노산, 예컨대 V, G 또는 S이거나, 결실되며;
- Xaa158은 P 또는 또 다른 아미노산, 예컨대 H이거나, 결실되며;
- Xaa159는 R 또는 또 다른 아미노산, 예컨대 H, K 또는 Q이거나, 결실되며;
- Xaa160은 G이거나 결실되며;
- Xaa161은 P 또는 C이거나, 결실되며;
- Xaa162는 A 또는 또 다른 아미노산, 예컨대 C 또는 Y이거나, 결실되며;
- Xaa163은 R 또는 또 다른 아미노산, 예컨대 H이거나, 결실되며;
- Xaa184는 Q이거나 결실되며;
- Xaa185는 P이거나 결실되며;
- Xaa186은 P이거나 결실되며;
- Xaa187은 D이거나 결실되며;
- Xaa188은 V이거나 결실되며;
- Xaa189는 G이거나 결실되며;
- Xaa190은 S이거나 결실되며;
- Xaa191은 S이거나 결실되며;
- Xaa192는 D이거나 결실되며;
- Xaa193은 P이거나 결실되며;
- Xaa194는 L이거나 결실되며;
- Xaa195는 S 또는 C이거나, 결실되며;
- Xaa196은 M 또는 또 다른 아미노산, 예컨대 P, V 또는 C이거나, 결실되며;
- Xaa197은 V 또는 또 다른 아미노산, 예컨대 E, D, G 또는 M이거나, 결실되며;
- Xaa198은 G 또는 또 다른 아미노산, 예컨대 E, D, R, K, Y, P 또는 V이거나, 결실되며;
- Xaa199는 P 또는 또 다른 아미노산, 예컨대 S, Q, R, T, G, F, L, D 또는 M이거나, 결실되며;
- Xaa200은 S 또는 또 다른 아미노산, 예컨대 Q, M, C, P, N 또는 H이거나, 결실되며;
- Xaa201은 Q 또는 또 다른 아미노산, 예컨대 P 또는 S이거나, 결실되며;
- Xaa202는 G 또는 또 다른 아미노산, 예컨대 T이거나, 결실되며;
- Xaa203은 R 또는 또 다른 아미노산, 예컨대 E, H 또는 C이거나, 결실되며;
- Xaa204는 S이거나 결실되며;
- Xaa205는 P이거나 결실되며;
- Xaa206은 S이거나 결실되며;
- Xaa207은 Y이거나 결실되며;
선택적으로, 서열 번호 171은 C에 의한 하기 아미노산: R47, L49, T51, A54, Q56, A59, H60, E62, I63, G67, V69, G71, A72, A73, S76, P77, E78, S79, L80, L81, Q82, L83, I91, L94, G95, V96, K97, T98, R100, L102, Q104, D107, G108, L110, G112, L114, A120, R124, D130, Y132, Q136, S137, A139, H140, L142, P143, H145, L146, L165, L167, L170, P174 중 적어도 하나의 치환을 포함하되;
단, 서열 번호 171은 성숙 인간 야생형 FGF21 (서열 번호 2)이 아니고 성숙 인간 야생형 FGF21 (서열 번호 2)과 비교하여 0, 2, 4, 6 또는 8개의 추가 시스테인을 포함하며,
선택적으로, 서열 번호 171은 돌연변이 G141S 및/또는 돌연변이 P174L을 추가로 포함한다.
일 실시 양태에서,
- Xaa147 내지 Xaa159는 결실되며, 프로테아제 저항성 펩티드 링커, 예컨대 서열 번호 161 또는 서열 번호 162의 펩티드 링커에 의해 대체되고/되거나;
- Xaa149 내지 Xaa155는 결실되며, 프로테아제 저항성 펩티드 링커, 예컨대 서열 번호 161, 서열 번호 163 또는 서열 번호 164의 펩티드 링커에 의해 대체되고/되거나;
- Xaa149 내지 Xaa159는 결실되며, 프로테아제 저항성 펩티드 링커, 예컨대 서열 번호 161 또는 서열 번호 162의 펩티드 링커에 의해 대체되고/되거나;
- Xaa149 내지 Xaa162는 결실되며, 프로테아제 저항성 펩티드 링커, 예컨대 서열 번호 163 또는 서열 번호 165의 펩티드 링커에 의해 대체되고/되거나;
- Xaa149 내지 Xaa163은 결실되며, 프로테아제 저항성 펩티드 링커, 예컨대 서열 번호 161의 펩티드 링커에 의해 대체되고/되거나;
- Xaa159 내지 Xaa163은 결실되며, 프로테아제 저항성 펩티드 링커, 예컨대 GA, GY, HH, GE 또는 HE에 의해 대체되고/되거나;
- Xaa197 내지 Xaa203은 결실되며, 프로테아제 저항성 펩티드 링커, 예컨대 서열 번호 166 또는 서열 번호 167의 펩티드 링커에 의해 대체되고/되거나;
- 프로테아제 저항성 펩티드 링커, 예컨대 서열 번호 168의 펩티드 링커가 Xaa198과 Xaa199 사이에 삽입되고/되거나;
- 서열 번호 169 또는 서열 번호 170의 아미노산 서열이 서열 번호 171의 S209 뒤에 부가된다.
일 실시 양태에서, 서열 번호 171은 성숙 인간 야생형 FGF21 (서열 번호 2)과의 서열 동일성이 적어도 90% 또는 적어도 91% 또는 적어도 92% 또는 적어도 93% 또는 적어도 94% 또는 적어도 95% 또는 적어도 96% 또는 적어도 97% 또는 적어도 98%이다.
일 실시 양태에서,
- Xaa55는 Q 또는 C이며;
- Xaa147은 P 또는 C이며;
- Xaa148은 G 또는 C이며;
- Xaa149는 N 또는 C이며;
- Xaa150은 K이며;
- Xaa151은 S이며;
- Xaa152는 P이며;
- Xaa153은 H이며;
- Xaa154는 R이며;
- Xaa155는 D 또는 C이며;
- Xaa156은 P이며;
- Xaa157은 A이며;
- Xaa158은 P이며;
- Xaa159는 R이며;
- Xaa160은 G이며;
- Xaa161은 P 또는 C이며;
- Xaa162는 A 또는 C이며;
- Xaa163은 R이며;
- Xaa184는 Q이며;
- Xaa185는 P이며;
- Xaa186은 P이며;
- Xaa187은 D이며;
- Xaa188은 V이며;
- Xaa189는 G이며;
- Xaa190은 S이며;
- Xaa191은 S이며;
- Xaa192는 D이며;
- Xaa193은 P이며;
- Xaa194는 L이며;
- Xaa195는 S 또는 C이며;
- Xaa196은 M 또는 또 다른 아미노산, 예컨대 P, V 또는 C이거나, 결실되며;
- Xaa197은 V 또는 또 다른 아미노산, 예컨대 E, D, G 또는 M이거나, 결실되며;
- Xaa198은 G 또는 또 다른 아미노산, 예컨대 E, D, R, K, Y, P 또는 V이거나, 결실되며;
- Xaa199는 P 또는 또 다른 아미노산, 예컨대 S, Q, R, T, G, F, L, D 또는 M이거나, 결실되며;
- Xaa200은 S 또는 또 다른 아미노산, 예컨대 Q, M, C, P, N 또는 H이거나, 결실되며;
- Xaa201은 Q 또는 또 다른 아미노산, 예컨대 P 또는 S이거나, 결실되며;
- Xaa202는 G 또는 또 다른 아미노산, 예컨대 T이거나, 결실되며;
- Xaa203은 R 또는 또 다른 아미노산, 예컨대 E, H 또는 C이거나, 결실되며;
- Xaa204는 S이며;
- Xaa205는 P이며;
- Xaa206은 S이며;
- Xaa207은 Y이며;
선택적으로, 서열 번호 171은 C에 의한 하기 아미노산: R47, L49, T51, A54, Q56, A59, H60, E62, I63, G67, V69, G71, A72, A73, S76, P77, E78, S79, L80, L81, Q82, L83, I91, L94, G95, V96, K97, T98, R100, L102, Q104, D107, G108, L110, G112, L114, A120, R124, D130, Y132, Q136, S137, A139, H140, L142, P143, H145, L146, L165, L167, L170, P174 중 적어도 하나의 치환을 포함한다.
일 실시 양태에서, 변이체는 서열 번호 175의 아미노산 서열을 포함하며 (여기서, 변이체는 본원에 정의된 바와 같음),
선택적으로, 서열 번호 175는 C에 의한 하기 아미노산: R47, L49, T51, A54, Q56, A59, H60, E62, I63, G67, V69, G71, A72, A73, S76, P77, E78, S79, L80, L81, Q82, L83, I91, L94, G95, V96, K97, T98, R100, L102, Q104, D107, G108, L110, G112, L114, A120, R124, D130, Y132, Q136, S137, A139, H140, L142, P143, H145, L146, L165, L167, L170, P174 중 적어도 하나의 치환을 포함하되;
단, 서열 번호 175는 성숙 인간 야생형 FGF21 (서열 번호 2)이 아니고 성숙 인간 야생형 FGF21 (서열 번호 2)과 비교하여 0, 2, 4, 6 또는 8개의 추가 시스테인을 포함하며,
선택적으로, 서열 번호 175는 돌연변이 G141S 및/또는 돌연변이 P174L을 추가로 포함한다.
일 실시 양태에서,
- Xaa55는 Q 또는 C이며;
- Xaa147은 P 또는 C이며;
- Xaa148은 G이며;
- Xaa149는 N 또는 C이며;
- Xaa155는 D 또는 C이며;
- Xaa161은 P이며;
- Xaa162는 A이며;
- Xaa195는 S이며;
- Xaa196은 M이며;
- Xaa197은 V이며;
Xaa198은 G 또는 또 다른 아미노산, 예컨대 E, D, R, K, Y, P 또는 V이거나, 결실되며;
- Xaa199는 P 또는 또 다른 아미노산, 예컨대 S, Q, R, T, G, F, L, D 또는 M이거나, 결실되며;
- Xaa200은 S이며;
- Xaa201은 Q이며;
- Xaa202는 G이며;
- Xaa203은 R이며;
선택적으로, 서열 번호 171은 C에 의한 하기 아미노산: R47, A59, H60, G71, S76, S79, D107, G108, L142, P174 중 적어도 하나의 치환을 포함한다.
일 실시 양태에서, 변이체는 서열 번호 176의 아미노산 서열을 포함하며 (여기서, 변이체는 본원에 정의된 바와 같음),
선택적으로, 서열 번호 176은 C에 의한 하기 아미노산: R47, A59, H60, G71, S76, S79, D107, G108, L142, P174 중 적어도 하나의 치환을 포함하되;
단, 서열 번호 176은 성숙 인간 야생형 FGF21 (서열 번호 2)이 아니고 성숙 인간 야생형 FGF21 (서열 번호 2)과 비교하여 0, 2, 4, 6 또는 8개의 추가 시스테인을 포함하며,
선택적으로, 서열 번호 176은 돌연변이 G141S 및/또는 돌연변이 P174L을 추가로 포함한다.
일 실시 양태에서, Xaa198은 G, R, K 또는 Y이다.
일 실시 양태에서, Xaa199는 P이거나 결실된다.
일 실시 양태에서, 서열 번호 171, 175 또는 176은 C에 의한 하기 아미노산:
- R47 및 P174;
- Xaa55 및 Xaa147;
- Xaa55 및 Xaa149;
- A59 및 G71;
- H60 및 S79;
- S76 및 S79;
- D107 및 Xaa155; 및/또는
- G108 및 L142의 치환을 포함한다.
일 실시 양태에서, 서열 번호 171, 175 또는 176은 C에 의한 하기 아미노산:
- Xaa55 및 Xaa147;
- Xaa55 및 Xaa149;
- A59 및 G71;
- S76 및 S79;
- D107 및 Xaa155; 또는
- G108 및 L142의 치환을 포함한다.
일 실시 양태에서, 서열 번호 171, 175 또는 176은 C에 의한 Xaa55 및 Xaa147의 치환을 포함한다. 또 다른 실시 양태에서, 서열 번호 171, 175 또는 176은 C에 의한 Xaa55 및 Xaa149의 치환을 포함한다.
일 실시 양태에서,
- Xaa55는 C이고, Xaa147은 C이고, Xaa149는 N이고, Xaa155는 D이고, Xaa198은 G이고, Xaa199는 결실되거나;
- Xaa55는 C이고, Xaa147은 C이고, Xaa149는 N이고, Xaa155는 D이고, Xaa198은 Y이고, Xaa199는 P이거나;
- Xaa55는 C이고, Xaa147은 P이고, Xaa149는 C이고, Xaa155는 D이고, Xaa198은 G이고, Xaa199는 결실되거나;
- Xaa55는 C이고, Xaa147은 P이고, Xaa149는 C이고, Xaa155는 D이고, Xaa198은 Y이고, Xaa199는 P이거나;
- Xaa55는 Q이고, Xaa147은 P이고, Xaa149는 N이고, Xaa155는 D이고, Xaa198은 G이고, Xaa199는 결실되거나;
- Xaa55는 Q이고, Xaa147은 P이고, Xaa149는 N이고, Xaa155는 D이고, Xaa198은 R이고, Xaa199는 P이거나;
- Xaa55는 Q이고, Xaa147은 P이고, Xaa149는 N이고, Xaa155는 D이고, Xaa198은 K이고, Xaa199는 P이거나;
- Xaa55는 Q이고, Xaa147은 P이고, Xaa149는 N이고, Xaa155는 D이고, Xaa198은 Y이고, Xaa199는 P이거나;
- Xaa55는 C이고, Xaa147은 C이고, Xaa149는 N이고, Xaa155는 D이고, Xaa198은 G이고, Xaa199는 P이거나;
- Xaa55는 C이고, Xaa147은 P이고, Xaa149는 C이고, Xaa155는 D이고, Xaa198은 G이고, Xaa199는 P이거나;
- Xaa55는 Q이고, Xaa147은 P이고, Xaa149는 N이고, Xaa155는 D이고, Xaa198은 G이고, Xaa199는 결실되거나 (여기서, 서열 번호 171, 175 또는 176은 C에 의한 A59 및 G71의 치환을 포함함);
- Xaa55는 Q이고, Xaa147은 P이고, Xaa149는 N이고, Xaa155는 D이고, Xaa198은 Y이고, Xaa199는 P이거나 (여기서, 서열 번호 171, 175 또는 176은 C에 의한 A59 및 G71의 치환을 포함함);
- Xaa55는 Q이고, Xaa147은 P이고, Xaa149는 N이고, Xaa155는 D이고, Xaa198은 G이고, Xaa199는 결실되거나 (여기서, 서열 번호 171, 175 또는 176은 C에 의한 S76 및 S79의 치환을 포함함);
- Xaa55는 Q이고, Xaa147은 P이고, Xaa149는 N이고, Xaa155는 D이고, Xaa198은 Y이고, Xaa199는 P이거나 (여기서, 서열 번호 171, 175 또는 176은 C에 의한 S76 및 S79의 치환을 포함함);
- Xaa55는 Q이고, Xaa147은 P이고, Xaa149는 N이고, Xaa155는 D이고, Xaa198은 G이고, Xaa199는 결실되거나 (여기서, 서열 번호 171, 175 또는 176은 C에 의한 G108 및 L142의 치환을 포함함);
- Xaa55는 Q이고, Xaa147은 P이고, Xaa149는 N이고, Xaa155는 D이고, Xaa198은 Y이고, Xaa199는 P이거나 (여기서, 서열 번호 171, 175 또는 176은 C에 의한 G108 및 L142의 치환을 포함함);
- Xaa55는 Q이고, Xaa147은 P이고, Xaa149는 N이고, Xaa155는 C이고, Xaa198은 G이고, Xaa199는 결실되거나 (여기서, 서열 번호 171, 175 또는 176은 C에 의한 D107의 치환을 포함함);
- Xaa55는 Q이고, Xaa147은 P이고, Xaa149는 N이고, Xaa155는 C이고, Xaa198은 Y이고, Xaa199는 P이다 (여기서, 서열 번호 171, 175 또는 176은 C에 의한 D107의 치환을 포함함).
일 실시 양태에서, 변이체는 그의 N-말단에서 적어도 하나의 추가 아미노산을 추가로 포함한다.
일 실시 양태에서, 상기 적어도 하나의 추가 아미노산은 G, A, N 및 C로 이루어진 군으로부터 선택된다.
제2 측면에서, 본 발명은 서열 번호 1 내지 3, 172, 173 및 174 중 하나에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 인간 FGF21의 변이체에 관한 것으로서,
여기서, 아미노산 서열은 하기 돌연변이:
Q55G, K150H, P152A, P152L, P152의 결실, H153Q, H153Y, H153K, H153의 결실, R154Q, R154K, D155L, D155K, D155Y, D155P, D155E, D155N, P156A, P156K, A157V, A157G, A157S, P158H, R159H, R159K, R159Q, A162Y, R163H, Q184의 결실, P185의 결실, P186의 결실, D187의 결실, V188의 결실, G189의 결실, S190의 결실, S191의 결실, D192의 결실, P193의 결실, L194의 결실, S195의 결실, M196의 결실, M196P, M196V, V197E, V197D, V197의 결실, V197G, V197M, G198E, G198D, G198R, G198K, G198Y, G198P, G198V, G198의 결실, P199S, P199Q, P199의 결실, P199R, P199T, P199G, P199F, P199L, P199D, P199M, S200Q, S200M, S200P, S200N, S200H, S200의 결실, Q201P, Q201S, Q201의 결실, G202T, G202의 결실, R203E, R203H, R203의 결실, S204의 결실, P205의 결실, S206의 결실, Y207의 결실, P147-R159가 GSGS에 의해 대체된 것 (서열 번호 161), P147-R159가 GGSGGS에 의해 대체된 것 (서열 번호 162), N149-D155가 GSGS에 의해 대체된 것 (서열 번호 161), N149-D155가 GSHSG에 의해 대체된 것 (서열 번호 163), N149-D155가 ATTS에 의해 대체된 것 (서열 번호 164), N149-R159가 GSGS에 의해 대체된 것 (서열 번호 161), N149-R159가 GGSGGS에 의해 대체된 것 (서열 번호 162), N149-A162가 GSHSG에 의해 대체된 것 (서열 번호 163), N149-A162가 GSHSGS에 의해 대체된 것 (서열 번호 165), N149-R163이 GSGS에 의해 대체된 것 (서열 번호 161), R159-R163이 GA, GY, HH, GE 또는 HE에 의해 대체된 것, V197-R203이 GHRSHLQTVF에 의해 대체된 것 (서열 번호 166), V197-R203이 GLNSMV에 의해 대체된 것 (서열 번호 167), GGGGS가 G198과 P199 사이에 삽입된 것 (서열 번호 168), PLSMVGPSQGRSPSYAS (서열 번호 169) 또는 PLSMVGSQGRSPSYAS가 S209 뒤에 부가된 것 (서열 번호 170) 중 적어도 하나를 포함하고/하거나;
아미노산 서열은 C에 의한 하기 아미노산:
R47, L49, T51, A54, Q55, Q56, A59, H60, E62, I63, G67, V69, G71, A72, A73, S76, P77, E78, S79, L80, L81, Q82, L83, I91, L94, G95, V96, K97, T98, R100, L102, Q104, D107, G108, L110, G112, L114, A120, R124, D130, Y132, Q136, S137, A139, H140, L142, P143, H145, L146, P147, G148, N149, D155, P161, A162, L165, L167, L170, P174, S195, M196, S200, R203 중 2개, 4개, 6개 또는 8개의 아미노산의 치환을 포함하며;
아미노산의 넘버링은 서열 번호 1에 따른 것이다.
일 실시 양태에서, 아미노산 서열은 하기 돌연변이:
K150H, P152A, P152L, P152의 결실, H153Q, H153Y, H153K, H153의 결실, R154Q, R154K, D155L, D155K, D155Y, D155P, D155E, D155N, P156A, P156K, A157V, A157G, A157S, P158H, R159H, R159K, R159Q, A162Y, R163H, M196의 결실, M196P, M196V, V197E, V197D, V197의 결실, V197G, V197M, G198E, G198D, G198R, G198K, G198Y, G198P, G198V, G198의 결실, P199S, P199Q, P199의 결실, P199R, P199T, P199G, P199F, P199L, P199D, P199M, S200Q, S200M, S200P, S200N, S200H, S200의 결실, Q201P, Q201S, Q201의 결실, G202T, G202의 결실, R203E, R203H, R203의 결실 중 적어도 하나를 포함하고/하거나;
아미노산 서열은 C에 의한 하기 아미노산:
R47, L49, T51, A54, Q55, Q56, A59, H60, E62, I63, G67, V69, G71, A72, A73, S76, P77, E78, S79, L80, L81, Q82, L83, I91, L94, G95, V96, K97, T98, R100, L102, Q104, D107, G108, L110, G112, L114, A120, R124, D130, Y132, Q136, S137, A139, H140, L142, P143, H145, L146, P147, G148, N149, D155, P161, A162, L165, L167, L170, P174, S195, M196, S200, R203 중 2개, 4개, 6개 또는 8개의 아미노산의 치환을 포함한다.
일 실시 양태에서, 아미노산 서열은 하기 돌연변이:
M196의 결실, M196P, M196V, V197E, V197D, V197의 결실, V197G, V197M, G198E, G198D, G198R, G198K, G198Y, G198P, G198V, G198의 결실, P199S, P199Q, P199의 결실, P199R, P199T, P199G, P199F, P199L, P199D, P199M, S200Q, S200M, S200P, S200N, S200H, S200의 결실, Q201P, Q201S, Q201의 결실, G202T, G202의 결실, R203E, R203H, R203의 결실 중 적어도 하나를 포함하고/하거나;
아미노산 서열은 C에 의한 하기 아미노산:
R47, L49, T51, A54, Q55, Q56, A59, H60, E62, I63, G67, V69, G71, A72, A73, S76, P77, E78, S79, L80, L81, Q82, L83, I91, L94, G95, V96, K97, T98, R100, L102, Q104, D107, G108, L110, G112, L114, A120, R124, D130, Y132, Q136, S137, A139, H140, L142, P143, H145, L146, P147, G148, N149, D155, P161, A162, L165, L167, L170, P174 중 2개, 4개, 6개 또는 8개의 아미노산의 치환을 포함한다.
일 실시 양태에서, 아미노산 서열은 C에 의한 하기 아미노산의 치환을 포함한다:
- R47 및 P174;
- Q55 및 P147;
- Q55 및 N149;
- A59 및 G71;
- H60 및 S79;
- S76 및 S79;
- D107 및 D155; 및/또는
- G108 및 L142.
일 실시 양태에서, 아미노산 서열은 G198R, G198K, G198Y 및 P199의 결실로 이루어진 군으로부터 선택되는 돌연변이를 포함하고/하거나;
아미노산 서열은 C에 의한 하기 아미노산의 치환을 포함한다:
- Q55 및 P147;
- Q55 및 N149;
- A59 및 G71;
- S76 및 S79;
- D107 및 D155; 또는
- G108 및 L142.
일 실시 양태에서, 아미노산 서열은 C에 의한 Q55 및 P147의 치환을 포함한다.
또 다른 실시 양태에서, 아미노산 서열은 C에 의한 Q55 및 N149의 치환을 포함한다.
일 실시 양태에서, 아미노산 서열은 서열 번호 1 내지 3, 172, 173 및 174 중 하나의 또 다른 부위에서의 적어도 하나의 추가 돌연변이 (예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 추가 돌연변이(들))를 포함한다.
일 실시 양태에서, 아미노산 서열은 서열 번호 1 내지 3, 172, 173 및 174 중 하나와의 서열 동일성이 적어도 90% 또는 적어도 91% 또는 적어도 92% 또는 적어도 93% 또는 적어도 94% 또는 적어도 95% 또는 적어도 96% 또는 적어도 97% 또는 적어도 98%이다.
제3 측면에서, 본 발명은 서열 번호 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327 및 328 중 하나에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 인간 FGF21의 변이체에 관한 것으로서, 여기서, 선택적으로, 변이체는 돌연변이 G141S 및/또는 돌연변이 P174L을 추가로 포함하며, 아미노산의 넘버링은 서열 번호 1에 따른 것이다.
일 실시 양태에서, 제1, 제2 및 제3 측면에 따른 변이체는 성숙 인간 야생형 FGF21 (서열 번호 2)과 비교하여 인간 및/또는 쥐과 혈장에서 증가된 단백질 분해 안정성을 갖는다.
일 실시 양태에서, 변이체는 성숙 인간 야생형 FGF21 (서열 번호 2)과 비교하여 증가된 열 안정성을 갖는다.
일 실시 양태에서, 변이체는 미토겐-활성화 단백질 키나아제(mitogen-activated protein kinase; MAPK) ERK1/2의 인산화를 유도한다.
일 실시 양태에서, 변이체는, 예를 들어 포유류 세포 배양물에서와 같이 세포 내 웨스턴(In-Cell Western; ICW) 분석법으로 결정할 때 100 nmol/L 이하, 또는 90 nmol/L 이하, 또는 80 nmol/L 이하, 또는 70 nmol/L 이하, 또는 60 nmol/L 이하, 또는 50 nmol/L 이하, 또는 40 nmol/L 이하, 또는 30 nmol/L 이하, 또는 20 nmol/L 이하, 또는 15 nmol/L 이하, 또는 12 nmol/L 이하, 또는 11 nmol/L 이하, 또는 10 nmol/L 이하, 또는 9 nmol/L 이하, 또는 8 nmol/L 이하, 또는 7 nmol/L 이하, 또는 6 nmol/L 이하, 또는 5 nmol/L 이하, 또는 4 nmol/L 이하, 또는 3 nmol/L 이하, 또는 2 nmol/L 이하의 EC50으로 미토겐-활성화 단백질 키나아제 (MAPK) ERK1/2의 인산화를 유도한다.
일 실시 양태에서, 변이체는 변이체의 검출 및/또는 단리를 허용하는 적어도 하나의 표지체(label) 또는 태그(tag)를 추가로 포함한다.
일 실시 양태에서, 변이체는 반감기 연장 모듈(module)에 융합되거나 콘쥬게이션된다(conjugated).
일 실시 양태에서, 반감기 연장 모듈은 중합체 (예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 히드록시에틸 전분 (HES), 히알루론산, 폴리시알산), 비구조화 (폴리-)펩티드 사슬 (예를 들어, PAS, XTEN), 엘라스틴-유사 폴리펩티드(elastin-like polypeptide; ELP), 혈청 단백질 (예를 들어, 알부민), 혈청 단백질 결합 분자 (예를 들어, 알부민 결합 단백질(albumin binding domain; ABD), 알부민 결합 지방산), 항체, 면역글로불린, 면역글로불린의 Fc 영역/도메인 및 면역글로불린 결합 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기에 정의된 바와 같은 인간 FGF21의 변이체 및 적어도 하나의 다른 활성 제약 성분을 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기에 정의된 바와 같은 융합 분자 또는 상기에 정의된 바와 같은 인간 FGF21의 변이체를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다.
일 실시 양태에서, 본 핵산 분자는 벡터 내에 포함되거나 게놈 내로 통합된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기에 정의된 바와 같은 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기에 정의된 바와 같은 인간 FGF21의 변이체 또는 상기에 정의된 바와 같은 융합 분자의 제조 방법에 관한 것으로서, 이는 상기에 정의된 바와 같은 숙주 세포를 배양하는 단계 및 상기 변이체 또는 융합 분자를 배양 배지로부터 단리하는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기에 정의된 바와 같은 인간 FGF21의 변이체 또는 상기에 정의된 바와 같은 융합 분자 또는 상기에 정의된 바와 같은 핵산 분자 또는 상기에 정의된 바와 같은 숙주 세포를 제약상 허용가능한 담체 및/또는 부형제와 함께 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
일 실시 양태에서, 제약 조성물은 적어도 하나의 기타 활성 제약 성분을 추가로 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기에 정의된 바와 같은 인간 FGF21의 변이체와 적어도 하나의 기타 활성 제약 성분의 조합물에 관한 것이다.
일 실시 양태에서, 상기에 정의된 바와 같은 융합 분자 또는 제약 조성물 또는 조합물에 포함되는 상기 적어도 하나의 기타 활성 제약 성분은 인슐린 및 인슐린 유도체, GLP-1, GLP-1 유사체 및 GLP-1 수용체 작용제, 중합체 결합된 GLP-1 및 GLP-1 유사체, 이중 GLP-1/GIP 작용제, 이중 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제, PYY3-36 또는 이의 유사체, 췌장 폴리펩티드 또는 이의 유사체, 글루카곤 수용체 작용제 또는 길항제, GIP 수용체 작용제 또는 길항제, 그렐린 길항제 또는 역작용제, 제닌 및 이의 유사체, 전술한 수용체들 (예를 들어, GLP-1 수용체, GIP 수용체, 글루카곤 수용체) 중 하나에 (특이적으로) 결합하는 펩티드, DDP-IV 억제제, SGLT-2 억제제, 이중 SGLT-2/SGLT-1 억제제, 비구아니드, 티아졸리딘디온, PPAR 작용제, PPAR 조절제, 술포닐우레아, 메글리티니드, 알파-글루코시다아제 억제제, 아밀린 및 아밀린 유사체, GPR119 작용제, GPR40 작용제, GPR120 작용제, GPR142 작용제, TGR5 작용제, AMPK 자극제, AMPK 활성제, 11-베타-HSD의 억제제, 글루코키나아제의 활성제, DGAT의 억제제, 단백질 티로신 포스파타제 1의 억제제, 글루코스-6-포스파타아제의 억제제, 프룩토스-1,6-비스포스파타아제의 억제제, 글리코겐 포스포릴라아제의 억제제, 포스포에놀 피루베이트 카르복시키나아제의 억제제, 글리코겐 신타아제 키나아제의 억제제, 피루베이트 데히드로게나아제 키나아제의 억제제, CCR-2 길항제, 글루코스 수송체-4의 조절제, 소마토스타틴 수용체 3 작용제, HMG-CoA-리덕타아제 억제제, 피브레이트, 니코틴산 및 이의 유도체, 니코틴산 수용체 1 작용제, ACAT 억제제, 콜레스테롤 흡수 억제제, 담즙산-결합 물질, IBAT 억제제, MTP 억제제, PCSK9의 조절제, LDL 수용체 상향조절제 (간 선택적 갑상선 호르몬 수용체 베타 작용제), HDL-상승 화합물, 지질 대사 조절제, PLA2 억제제, ApoA-I 증강제(enhancer), 콜레스테롤 합성 억제제, 오메가-3 지방산 및 이의 유도체, 비만의 치료를 위한 활성 물질, CB1 수용체 길항제, MCH-1 길항제, MC4 수용체 작용제 및 부분 작용제, NPY5 또는 NPY2 길항제, NPY4 작용제, 베타-3 아드레날린 수용체 작용제, 렙틴 또는 렙틴 모방체, 5HT2c 수용체 작용제, 리파아제 억제제, 혈관형성 억제제, H3 길항제, AgRP 억제제, 삼중 모노아민 섭취 억제제, MetAP2 억제제, 섬유모세포 성장 인자 수용체 4 또는 프로히비틴 표적화 펩티드-1의 생산에 대한 안티센스 올리고누클레오티드, 고혈압, 만성 심부전 또는 아테롬성 동맥 경화증에 영향을 미치게 하기 위한 약물, 안지오텐신 II 수용체 길항제, 이중 안지오텐신 수용체 차단제(ARB), 안지오텐신 전환 효소(ACE) 억제제, 안지오텐신 전환 효소 2(ACE-2) 활성제, 레닌 억제제, 프로레닌 억제제, 엔도텔린 전환 효소(ECE) 억제제, 엔도텔린 수용체 차단제, 엔도텔린 길항제, 이뇨제, 알도스테론 길항제, 알도스테론 합성효소 억제제, 알파-차단제, 알파-2 아드레날린 수용체의 길항제, 베타-차단제, 혼합된 알파-/베타-차단제, 칼슘 길항제/칼슘 채널 차단제(CBB), 이중 미네랄코르티코이드/CCB, 중추 작용성 항고혈압제, 중성 엔도펩티다아제의 억제제, 아미노펩티다아제-A 억제제, 바소펩티드(vasopeptide) 억제제, 이중 바소펩티드 억제제, 네프릴리신-ACE 억제제, 네프릴리신-ECE 억제제, 이중-작용 안지오텐신 (AT) 수용체-네프릴리신 억제제, 이중 AT1/엔도텔린-1 (ETA) 길항제, 최종 당화 산물(advanced glycation end-product) 분해제, 재조합 레날라아제, 혈압 백신, 항-RAAS 백신, AT1-백신 또는 AT2-백신, 항고혈압 반응을 갖는 유전자 다형성의 조절제, 및 혈소판 응집 억제제로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 실시 양태에서, 상기 적어도 하나의 기타 활성 제약 성분은 글루카곤-유사 펩티드-1(glucagon-like peptide-1; GLP-1) 수용체 작용제이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기에 정의된 바와 같은 인간 FGF21의 변이체 또는 상기에 정의된 바와 같은 융합 분자 또는 상기에 정의된 바와 같은 핵산 분자 또는 상기에 정의된 바와 같은 숙주 세포 또는 상기에 정의된 바와 같은 제약 조성물을 포함하는 키트에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 의약으로 사용하기 위한, 상기에 정의된 바와 같은 인간 FGF21의 변이체 또는 상기에 정의된 바와 같은 융합 분자 또는 상기에 정의된 바와 같은 핵산 분자 또는 상기에 정의된 바와 같은 숙주 세포 또는 상기에 정의된 바와 같은 제약 조성물에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 비만, 과체중, 대사 증후군, 진성 당뇨병, 고혈당증, 이상지질혈증, 비알코올성 지방간염 (NASH) 및 아테롬성 동맥경화증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환 또는 장애의 치료에서 사용하기 위한, 상기에 정의된 바와 같은 인간 FGF21의 변이체 또는 상기에 정의된 바와 같은 융합 분자 또는 상기에 정의된 바와 같은 핵산 분자 또는 상기에 정의된 바와 같은 숙주 세포 또는 상기에 정의된 바와 같은 제약 조성물에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 비만, 과체중, 대사 증후군, 진성 당뇨병, 고혈당증, 이상지질혈증, 비알코올성 지방간염 (NASH) 및 아테롬성 동맥경화증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환 또는 장애의 치료를 위한 의약의 제조에 있어서의, 상기에 정의된 바와 같은 인간 FGF21의 변이체 또는 상기에 정의된 바와 같은 융합 분자 또는 상기에 정의된 바와 같은 핵산 분자 또는 상기에 정의된 바와 같은 숙주 세포 또는 상기에 정의된 바와 같은 제약 조성물의 용도에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 비만, 과체중, 대사 증후군, 진성 당뇨병, 고혈당증, 이상지질혈증, 비알코올성 지방간염 (NASH) 및 아테롬성 동맥경화증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환 또는 장애의 치료 방법에 관한 것이며, 본 방법은 상기에 정의된 바와 같은 인간 FGF21의 변이체 또는 상기에 정의된 바와 같은 융합 분자 또는 상기에 정의된 바와 같은 핵산 분자 또는 상기에 정의된 바와 같은 숙주 세포 또는 상기에 정의된 바와 같은 제약 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일 실시 양태에서, 질환 또는 장애는 진성 당뇨병이다.
도 1은 서열 번호 3의 FGF21 및 그의 대사 산물의 질량 스펙트럼 및 디콘볼루션(deconvolution) 데이터를 나타낸다. (A) 서열 번호 3의 아미노산 [1-182]의 서열의 질량 스펙트럼 및 디콘볼루션; (B) 인간 혈장 중 (또한 래트 및 쥐과 혈장에서 발견됨) 서열 번호 3의 아미노산 [1-172]의 서열의 질량 스펙트럼 및 디콘볼루션; RT: 33.6분; C로 라벨링된 다중하전 질량(multicharged mass)은 18,429 Da까지 디콘볼루션됨; (C) 인간 혈장 중 (또한 래트 혈장에서 발견됨) 서열 번호 3의 아미노산 [132-182]의 서열의 질량 스펙트럼 및 디콘볼루션; RT: 30.4분; F로 라벨링된 다중하전 질량은 5,113.67 Da까지 디콘볼루션됨; (D) 인간 혈장 중 서열 번호 3의 아미노산 [129-182], [125-177], [126-178] 또는 [124-176]의 제안된 서열의 질량 스펙트럼 및 디콘볼루션; RT: 30.8분; E로 라벨링된 다중하전 질량은 5,379 Da까지 디콘볼루션됨; (E) 인간 혈장 중 서열 번호 3의 아미노산 [136-182]의 제안된 서열의 질량 스펙트럼 및 디콘볼루션; RT: 31.3분; B로 라벨링된 다중하전 질량은 4,732.41 Da까지 디콘볼루션됨; (F) 쥐과 혈장 중 서열 번호 3의 아미노산 [53-129] 또는 [21-98]의 제안된 서열의 질량 스펙트럼 및 디콘볼루션; RT: 32.5; A로 라벨링된 다중하전 질량은 8,564.67 Da까지 디콘볼루션됨.
도 2는 인간 혈장 중 성숙 인간 FGF21 (서열 번호 2) 및 FGF21 변이체의 안정성의 분석을 나타낸다. 상기 단백질들을 혈장에서 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하고, 잔존 FGF21의 양을 온전한 성숙 FGF21을 인식하는 ELISA를 사용하여 측정하였다. 인큐베이션 시작시의 양을 100%로 설정하였다. 데이터는 평균 + SD이다. 상응하는 서열 번호가 표 3에 예시되어 있다.
도 3은 세포 내 웨스턴을 통하여 측정할 경우 성숙 인간 FGF21 (서열 번호 2) 또는 다양한 FGF21 변이체를 이용한 자극 후 인간 FGFR1c 및 베타-클로토(beta-klotho)를 과발현하는 CHO 세포에서의 ERK1/2-인산화의 용량-반응 곡선을 나타낸다 (A 내지 W). 상응하는 서열 번호가 표 4에 예시되어 있다.
도 4는 세포 내 웨스턴을 통하여 측정할 경우 성숙 인간 FGF21 (서열 번호 2) 또는 다양한 FGF21 변이체를 이용한 자극 후 일차 인간 피하 지방 세포에서의 ERK1/2-인산화의 용량-반응 곡선을 나타낸다 (A 및 B). 상응하는 서열 번호가 표 5에 예시되어 있다.
도 5는 시차 주사 형광 측정법(differential scanning fluorimetry; DSF)을 통하여 분석할 경우의 인간 FGF21 (서열 번호 3) 및 FGF21 변이체의 열안정성의 분석을 나타낸다. 인간 FGF21 (서열 번호 3) 및 선발된 FGF21 변이체에 있어서의 서모플루오르(ThermoFluor)TM 실험으로부터의 예시적인 용융 곡선이 예시되어 있다. 25℃에서 정규화한 상대적 형광 단위가 온도 (℃)에 대하여 도시되어 있다. 상응하는 서열 번호가 표 6에 예시되어 있다.
도 6은 인간 FGF21의 계산 및 실험 모델의 구조적 상세 사항을 나타낸다. (A) FGF19 및 FGF23의 상이한 실험용 상동 구조를 기반으로 한 골격 구조로 표시된 계산 모델들의 중첩, 백색: FGF19의 구조를 기반으로 하여 바이오루미네이트(BioLuminate)로 생성된 모델 (PDB 코드 2P23); 옅은 회색: FGF19의 구조를 기반으로 하여 스위스-모델 서버(Swiss-Model server)를 사용하여 생성된 모델 (PDB 코드 1PWA); 짙은 회색: FGF19의 구조를 기반으로 하여 스위스-모델 서버를 사용하여 생성된 모델 (PDB 코드 2P23); 흑색: FGF23의 구조를 기반으로 하여 스위스-모델 서버를 사용하여 생성된 모델 (PDB 코드 2P39). 특히 잔기 150 내지 158 주위의 루프 영역 (원형으로 둘러싸임)은 근본적인 실험 데이터의 구조적 차이로 인하여 이러한 모델들에서 유의하게 상이하다. (B) FGF21 Q55C, N149C (서열 번호 158)의 X-선 결정 구조에 존재하는 분자 A (옅은 회색) 및 분자 B (짙은 회색)의 중첩 (카툰으로 나타냄). 배열(conformation)을 안정화시킴으로써 열안정성을 증가시키는 시스테인 149와 시스테인 55 사이의 엔지니어링된(engineered) 디술피드 결합이 강조되어 있다. (C) 분자 B에서의 엔지니어링된 C55-C149 디술피드 연결 주위의 2mFo-dFc 전자 밀도. 윤곽 수준(contour level)은 1σ이다. C149와 P156 사이에서는 전자 밀도가 불연속적이며, 이는 상당한 무질서를 시사하는 것이다.
도 2는 인간 혈장 중 성숙 인간 FGF21 (서열 번호 2) 및 FGF21 변이체의 안정성의 분석을 나타낸다. 상기 단백질들을 혈장에서 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하고, 잔존 FGF21의 양을 온전한 성숙 FGF21을 인식하는 ELISA를 사용하여 측정하였다. 인큐베이션 시작시의 양을 100%로 설정하였다. 데이터는 평균 + SD이다. 상응하는 서열 번호가 표 3에 예시되어 있다.
도 3은 세포 내 웨스턴을 통하여 측정할 경우 성숙 인간 FGF21 (서열 번호 2) 또는 다양한 FGF21 변이체를 이용한 자극 후 인간 FGFR1c 및 베타-클로토(beta-klotho)를 과발현하는 CHO 세포에서의 ERK1/2-인산화의 용량-반응 곡선을 나타낸다 (A 내지 W). 상응하는 서열 번호가 표 4에 예시되어 있다.
도 4는 세포 내 웨스턴을 통하여 측정할 경우 성숙 인간 FGF21 (서열 번호 2) 또는 다양한 FGF21 변이체를 이용한 자극 후 일차 인간 피하 지방 세포에서의 ERK1/2-인산화의 용량-반응 곡선을 나타낸다 (A 및 B). 상응하는 서열 번호가 표 5에 예시되어 있다.
도 5는 시차 주사 형광 측정법(differential scanning fluorimetry; DSF)을 통하여 분석할 경우의 인간 FGF21 (서열 번호 3) 및 FGF21 변이체의 열안정성의 분석을 나타낸다. 인간 FGF21 (서열 번호 3) 및 선발된 FGF21 변이체에 있어서의 서모플루오르(ThermoFluor)TM 실험으로부터의 예시적인 용융 곡선이 예시되어 있다. 25℃에서 정규화한 상대적 형광 단위가 온도 (℃)에 대하여 도시되어 있다. 상응하는 서열 번호가 표 6에 예시되어 있다.
도 6은 인간 FGF21의 계산 및 실험 모델의 구조적 상세 사항을 나타낸다. (A) FGF19 및 FGF23의 상이한 실험용 상동 구조를 기반으로 한 골격 구조로 표시된 계산 모델들의 중첩, 백색: FGF19의 구조를 기반으로 하여 바이오루미네이트(BioLuminate)로 생성된 모델 (PDB 코드 2P23); 옅은 회색: FGF19의 구조를 기반으로 하여 스위스-모델 서버(Swiss-Model server)를 사용하여 생성된 모델 (PDB 코드 1PWA); 짙은 회색: FGF19의 구조를 기반으로 하여 스위스-모델 서버를 사용하여 생성된 모델 (PDB 코드 2P23); 흑색: FGF23의 구조를 기반으로 하여 스위스-모델 서버를 사용하여 생성된 모델 (PDB 코드 2P39). 특히 잔기 150 내지 158 주위의 루프 영역 (원형으로 둘러싸임)은 근본적인 실험 데이터의 구조적 차이로 인하여 이러한 모델들에서 유의하게 상이하다. (B) FGF21 Q55C, N149C (서열 번호 158)의 X-선 결정 구조에 존재하는 분자 A (옅은 회색) 및 분자 B (짙은 회색)의 중첩 (카툰으로 나타냄). 배열(conformation)을 안정화시킴으로써 열안정성을 증가시키는 시스테인 149와 시스테인 55 사이의 엔지니어링된(engineered) 디술피드 결합이 강조되어 있다. (C) 분자 B에서의 엔지니어링된 C55-C149 디술피드 연결 주위의 2mFo-dFc 전자 밀도. 윤곽 수준(contour level)은 1σ이다. C149와 P156 사이에서는 전자 밀도가 불연속적이며, 이는 상당한 무질서를 시사하는 것이다.
본 발명은 하기에 상세히 기술되어 있지만, 본원에 기술된 특정 방법, 프로토콜 및 시약이 달라질 수 있기 때문에, 본 발명이 이들에 제한되지 않음이 이해되어야 한다. 또한, 본원에 사용된 용어는 특정 실시 양태를 기술하기 위한 목적만을 위한 것이며, 본 발명의 범주를 제한하고자 하는 것이 아니고, 본 발명의 범주는 첨부된 청구범위에 의해서만 제한됨이 이해되어야 한다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
하기에서, 본 발명의 특정 요소가 기술될 것이다. 이러한 요소들은 특정 실시 양태들과 함께 열거될 수 있지만, 이들은 임의의 방식으로, 그리고 임의의 수로 조합되어서 추가의 실시 양태들을 생성할 수 있음이 이해되어야 한다. 다양하게 기술된 실시예 및 실시 양태는 본 발명을 단지 명백하게 기술된 실시 양태에 한정시키는 것으로 해석되서는 안 된다. 이 [발명을 실시하기 위한 구체적인 내용]은 명백하게 기술된 실시 양태들을 임의의 수의 개시된 요소들과 조합시킨 실시 양태들을 뒷받침하고 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 더욱이, 본 출원에서 모든 기술된 요소들의 임의의 순열 및 조합은 맥락이 달리 표시하지 않는 한 본 출원의 설명에 의해 개시되는 것으로 간주되어야 한다.
바람직하게는, 본원에서 사용되는 용어는 일반적으로 문헌[“A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)”, H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, and H. 
Eds., Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland, (1995)]에 기술된 바와 같이 정의된다.
본 발명의 실행에서는, 달리 표시되지 않는 한, 화학, 생화학, 세포 생물학, 면역학의 통상적인 방법, 및 재조합 DNA 기술 (이는 본 분야의 문헌 (문헌[Sambrook, J. et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY])에 설명됨)이 이용될 것이다.
맥락이 달리 요구하지 않는 한, 본 명세서 및 하기의 청구범위 전체에 걸쳐 용어 “포함하다” 및 변이형, 예컨대 “포함하는” 및 “포함하고 있는”은 진술된 구성원, 정수 또는 단계, 또는 구성원, 정수 또는 단계의 군의 포함을 암시하며, 일부 실시 양태에서 임의의 다른 구성원, 정수 또는 단계, 또는 구성원, 정수 또는 단계의 군이 배제될 수도 있지만 그러한 다른 구성원, 정수 또는 단계, 또는 구성원, 정수 또는 단계의 군의 배제를 암시하는 것은 아니며, 즉, 요지는 진술된 구성원, 정수 또는 단계, 또는 구성원, 정수 또는 단계의 군을 포함하는 것에 있음이 이해될 것이다.
본 발명을 기술하는 맥락에서 (특히, 하기 청구범위의 맥락에서) 단수형 용어 및 유사한 언급(reference)은 본원에서 달리 표시되지 않거나 맥락에 의해 명확하게 반박되지 않는 한, 단수형 및 복수형 둘 다를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 본원에서 값들의 범위들의 나열은 그 범위 내에 있는 각각의 별개의 값을 개별적으로 언급하는 속기법으로서의 역할을 하는 것으로 의도된다. 본원에서 달리 표시되지 않는 한, 각각의 개별 값은 마치 이것이 본원에 개별적으로 나열되는 것처럼 본 명세서 내에 포함된다. 본원에 개시된 모든 방법은, 본원에서 달리 표시되지 않거나 맥락에 의해 달리 명확하게 반박되지 않는 한 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본원에 제공된, 임의의 그리고 모든 예, 또는 예시적인 언어 (예를 들어, “~와 같은)의 사용은 단지 본 발명을 더 잘 예시하고자 하는 것이며, 청구된 본 발명의 범주에 대한 제한을 제기하는 것이 아니다. 본 명세서에서의 언어는 본 발명의 실행에 필수적인 임의의 청구되지 않은 요소를 나타내는 것으로 해석되어서는 안 된다.
몇몇 문서는 본 명세서의 본문 전체에 걸쳐 인용된다. 각각의 본원에 인용된 문서 (모든 특허, 특허 출원, 과학 간행물, 제조업자의 사양, 설명서 등을 포함함)는, 상기 문헌이든지, 하기 문헌이든지 간에, 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 본원에서 아무것도, 종래 발명에 의한 그러한 개시 내용보다 본 발명이 선행할 자격이 없음을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “인간 섬유모세포 성장 인자 21 (FGF21)”은 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는 인간 야생형 FGF21 (“전장 인간 야생형 FGF21”로도 칭해짐), 또는 이의 천연 발생 변이체를 나타낸다. 용어 “성숙 인간 야생형 FGF21”은 천연 신호 서열 (신호 펩티드로도 칭해짐), 즉, 서열 번호 1의 아미노산 1 내지 28 (M1 내지 A28)이 결여된 인간 야생형 FGF21을 나타내며, 이는 서열 번호 2로 나타낸다. 달리 표시되지 않는 한, 본원에 개시된 FGF21 (폴리-)펩티드에서의 특정 아미노산 잔기의 넘버링은 서열 번호 1에 따른 것이다.
생물학적 물질, 예컨대 핵산 분자, (폴리-)펩티드, 숙주 세포 등과 관련하여 사용될 때 용어 “천연 발생”은 자연에서 발견되며 사람에 의해 조작된 것이 아닌 물질을 나타낸다.
일반인에게 공개된 데이터 베이스, 예컨대 The Universal Protein Resource (UniProt, uniprot.org에서 이용가능한 온라인 데이터베이스)에서, 인간 FGF21의 일부 천연 발생 변이체가 개시되어 있다. UniProtKB 등록 번호 Q9NSA1로 하기 2가지 인간 FGF21 변이체가 열거되어 있다: FGF21 G141→S (VAR_055375, 서열 번호 172) 및 FGF21 L174→P (VAR_049064). 위치 174에서의 프롤린의 출현은 류신보다 더 일반적이며, 이는 데이터 베이스, 예컨대 ExAC 브라우저 (P=73% 대 L=27%; 진유전체 집계 컨소시엄(The Exome Aggregation Consortium); exac.broadinstitute.org/variant/19-49261368-T-C에서 온라인으로 이용가능함) 및 AMP (신약개발 촉진 파트너십(Accelerating Medicines Partnership); type2diabetesgenetics.org/variantInfo/variantInfo/rs739320에서 온라인으로 이용가능함)에 따른 것이다. 따라서, P174를 갖는 인간 FGF21은 본원에서 인간 야생형 FGF21 (서열 번호 1 참조)로 칭해지며, 반면에 L174를 갖는 인간 FGF21은 본원에서 천연 발생 변이체 (서열 번호 173 참조)로서 포함된다. 위치 174에서의 돌연변이는 AMP에 따르면 2형 당뇨병 발생률에 대하여 영향을 전혀 주지 않는다. 게다가, L174의 P로의 돌연변이는 (실시예 3에 설명된) 세포 내 웨스턴을 통하여 평가할 때 FGF21의 시험관 내 활성에 대하여 영향을 전혀 주지 않는다. 위치 174에서 프롤린을 갖는 G-FGF21 (서열 번호 3)의 EC50은 위치 174에서 류신을 갖는 G-FGF21 (서열 번호 174)의 경우의 0.21 nmol/L에 대하여 0.24 nmol/L이다. FGF21 변이체 G141→S (VAR_055375, 서열 번호 172)는 매우 희귀하며, 대립유전자 빈도가 0.1% 미만이고 (exac.broadinstitute.org/variant/19-49261268-G-A에서 온라인으로 입수가능함), 이는 시험관 내에서 추가로 특성화되지 않았다.
본 발명에 따른 “인간 섬유모세포 성장 인자 21 (FGF21)의 변이체” (“FGF21 변이체” 또는 “FGF21 유사체”로도 칭해짐)는 인간 야생형 FGF21, 또는 천연 발생 인간 FGF21에서의 적어도 하나의 아미노산 잔기의 결실 및/또는 치환에 의한 이의 천연 발생 변이체 (예를 들어, 서열 번호 1 또는 2의 것) 및/또는 적어도 하나의 아미노산 잔기의 부가에 의한 이의 천연 발생 변이체의 구조로부터 정식으로 유래될 수 있는 분자 구조를 갖는 폴리펩티드이다.
일 실시 양태에서, 인간 FGF21의 변이체는 인간 FGF21의 생물학적 활성 변이체이다. 용어 “인간 FGF21의 생물학적 활성 변이체”는 인간 야생형 FGF21 폴리펩티드의 활성, 예컨대 혈중 글루코스, 인슐린, 트리글리세리드, 또는 콜레스테롤을 저하시키고/시키거나, 체중을 감소시키고/시키거나, 글루코스 내용성, 에너지 소비, 또는 인슐린 민감성을 개선시키는 능력을 보유하는 임의의 변이체를 나타낸다. 그럼에도 불구하고, 인간 야생형 FGF21 폴리펩티드에 비하여 다소 감소된 수준의 FGF21 활성을 보유하는 변이체는 인간 FGF21의 생물학적 활성 변이체인 것으로 여겨질 수 있다.
일부 실시 양태에서, 인간 야생형 FGF21 아미노산 서열 (예를 들어, 서열 번호 1 또는 2의 것)의 특정 아미노산은 도 다른 아미노산에 의해 치환될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “또 다른 아미노산”은 전형적으로, 인간 야생형 FGF21 (예를 들어, 서열 번호 1 또는 2)와 비교하여 증가된 안정성, 예를 들어 단백질 분해에 대한 안정성 및/또는 열안정성에 기여하는 아미노산과 관련된다. 이것은 예를 들어 치환 아미노산에서 또는 치환 아미노산에 근접하여 프로테아제가 절단하는 것을 방지함으로써 또는 하나 이상의 추가 디술피드 가교체의 형성에 의해 성취될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “아미노산” 또는 “아미노산 잔기”는 천연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 천연 발생 아미노산, 비천연 아미노산, 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체 (이들의 구조가 D 및 L 입체 이성질체 형태를 허용할 경우 이들 전부 그의 D 및 L 이성질체로 있음)를 나타낸다. 아미노산은 본원에서 그의 명칭, 그의 일반적으로 공지된 3문자 기호로 또는 IUPAC-IUB 생화학 명명 위원회(Biochemical Nomenclatue Commission)에 의해 권고되는 1문자 기호로 언급된다.
아미노산과 관련하여 사용될 때, 용어 “천연 발생”은 20가지의 통상적인 아미노산 (즉, 알라닌 (A), 시스테인 (C), 아스파르트산 (D), 글루탐산 (E), 페닐알라닌 (F), 글리신 (G), 히스티딘 (H), 이소류신 (I), 라이신 (K), 류신 (L), 메티오닌 (M), 아스파라긴 (N), 프롤린 (P), 글루타민 (Q), 아르기닌 (R), 세린 (S), 트레오닌 (T), 발린 (V), 트립토판 (W), 및 티로신 (Y))과, 셀레노시스테인, 피로라이신 (PYL), 및 피롤린-카르복시라이신 (PCL)을 나타낸다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “비천연 아미노산”은 임의의 유기체의 유전자 코드에서 천연적으로 코딩되지 않거나 발견되지 않는 아미노산을 나타냄을 의미한다. 이것은 예를 들어 순전히 합성인 화합물일 수 있다. 비천연 아미노산의 예는 히드록시프롤린, 감마-카르복시글루타메이트, O-포스포세린, 아제티딘카르복실산, 2-아미노아디프산, 3-아미노아디프산, 베타-알라닌, 아미노프로피온산, 2-아미노부티르산, 4-아미노부티르산, 6-아미노카프로익산, 2-아미노헵탄산, 2-아미노이소부티르산, 3-아미노이소부티르산, 2-아미노피멜산, 3차-부틸글리신, 2,4-디아미노이소부티르산, 데스모신, 2,2'-디아미노피멜산, 2,3-디아미노프로프리온산, N-에틸글리신, N-메틸글리신, N-에틸아스파라긴, 호모프롤린, 히드록시라이신, 알로-히드록시라이신, 3-히드록시프롤린, 4-히드록시프롤린, 이소데스모신, 알로-이소류신, N-메틸알라닌, N-메틸글리신, N-메틸이소류신, N-메틸펜틸글리신, N-메틸발린, 나프탈라닌, 노르발린, 노르류신, 오르니틴, D-오르니틴, D-아르기닌, p-아미노페닐알라닌, 펜틸글리신, 피페콜산 및 티오프롤린을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “아미노산 유사체”는 천연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 갖는 화합물을 나타낸다. 아미노산 유사체는 가역적으로 또는 비가역적으로 화학적으로 차단되고/되거나, C-말단 카르복시 기, N-말단 아미노 기 및/또는 측쇄 기능성 기가 화학적으로 변형된 천연 및 비천연 아미노산을 포함한다. 그러한 유사체는 메티오닌 술폭시드, 메티오닌 술폰, S-(카르복시메틸)-시스테인, S-(카르복시메틸)-시스테인 술폭시드, S-(카르복시메틸)-시스테인 술폰, 아스파르트산-(베타메틸에스테르), N-에틸글리신, 알라닌 카르복스아미드, 호모세린, 노르류신 및 메티오닌 메틸 술포늄을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “아미노산 모방체”는 아미노산의 일반 화학 구조와는 상이하지만 천연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 구조를 갖는 화합물을 나타낸다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “펩티드”는 예를 들어 펩티드 결합에 의해 공유적으로 연결된 2개 이상, 또는 3개 이상, 또는 4개 이상, 또는 6개 이상, 또는 8개 이상, 또는 9개 이상, 또는 10개 이상, 또는 13개 이상, 또는 16개 이상, 또는 21개 이상의 아미노산을 포함하는 임의의 길이의 아미노산의 중합체 형태를 나타낸다. 용어 “폴리펩티드”는 큰 펩티드, 예를 들어 100개 초과의 아미노산 잔기를 갖는 펩티드를 나타낸다. 용어 “폴리펩티드” 및 “단백질”은 본원에서 상호교환가능하게 사용된다.
일부 실시 양태에서, 변이체는 그의 N-말단에 적어도 하나의 추가 아미노산을 포함한다. 일 실시 양태에서, 상기 적어도 하나의 추가 아미노산은 프롤린을 제외한 천연 발생 아미노산, 비천연 아미노산, 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체로부터 선택된다. 일 실시 양태에서, 상기 적어도 하나의 추가 아미노산은 G, A, N 및 C로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특별한 실시 양태에서, 상기 적어도 하나의 추가 아미노산은 G이다.
일부 실시 양태에서, 본 발명에 따른 변이체의 아미노산 서열은 서열 번호 1 내지 3, 172, 173 및 174 중 하나와의 서열 동일성, 예를 들어 성숙 인간 야생형 FGF21 (서열 번호 2)과의 서열 동일성이 적어도 90% 또는 적어도 91% 또는 적어도 92% 또는 적어도 93% 또는 적어도 94% 또는 적어도 95% 또는 적어도 96% 또는 적어도 97% 또는 적어도 98%이다.
두 아미노산 서열 사이의 “서열 동일성”은 상기 서열들 사이에 동일한 아미노산의 백분율을 나타낸다. 비교를 위한 서열들의 최적 정렬은 수동으로 생성되는 것 외에, 문헌[Smith and Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482]의 국부적 상동성 알고리즘에 의해, 문헌[Neddleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443]의 국부적 상동성 알고리즘에 의해, 문헌[Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444]의 유사성 검색 방법에 의해, 또는 이러한 알고리즘을 이용하는 컴퓨터 프로그램 (위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지(Wisconsin Genetics Software Package) 내의 GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N 및 TFASTA, 미국 위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575 소재의 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group))에 의해 생성될 수 있다.
전형적으로, 본 발명의 특징을 이루는 FGF21 변이체는 전형적으로 성숙 인간 야생형 FGF21 (서열 번호 2)과 비교하여 인간 및/또는 쥐과 혈장에서 증가된 단백질 분해 안정성을 갖는다.
용어 “단백질 분해 안정성”은 프로테아제에 의해 촉매되는 단백질 분해를 견디는 (폴리-)펩티드의 능력을 나타낸다. 그러한 프로테아제의 예로는 세린 프로테아제, 트레오닌 프로테아제, 시스테인 프로테아제, 아스파르테이트 프로테아제 및/또는 글루탐산 프로테아제가 있다. 세린 프로테아제의 예로는 트립신, 키모트립신, 플라스민, 트롬빈, 그랜자임 및/또는 칼리크레인이 있다. 시스테인 프로테아제의 예로는 카텝신 K, 카스파아제 및/또는 칼파인이 있다. EC 넘버링에 따르면, 그러한 프로테아제는 예를 들어 효소 활성에 따라 세린 카르복시펩티다아제 (EC 3.4.16), 세린 엔도펩티다아제 (EC 3.4.21), 트레오닌 엔도펩티다아제 (EC 3.4.25), 시스테인 카르복시펩티다아제 (EC 3.4.18), 시스테인 엔도펩티다아제 (EC 3.4.22) 또는 아스파르테이트 엔도펩티다아제 (EC 3.4.23)로 분류된다. 용어 “단백질 분해 안정성”은 시험관 내에서의 또는 생체 내에서의 단백질 분해 안정성을 나타낼 수 있다. 주어진 (폴리-)펩티드의 단백질 분해 안정성을 측정하는 수단 및 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 일 실시 양태에서, 단백질 분해 안정성은 예를 들어 본질적으로 실시예 2에 설명된 바와 같이 샌드위치(sandwich) 면역분석법을 이용하여 측정된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “프로테아제 저항성 펩티드 링커”는 프로테아제, 예를 들어 상기에 기술된 바와 같은 프로테아제에 의해 촉매되는 단백질 분해에 대하여 낮은 감수성을 갖거나 상기 단백질 분해를 견디는 펩티드 링커를 나타낸다. 그러한 링커는 1 내지 20개 또는 1 내지 15개 또는 1 내지 12개 또는 1 내지 10개 아미노산의 길이를 가질 수 있다. 일부 실시 양태에서, 링커는 겨우 2개의 아미노산 (예를 들어, GA, GY, HH, GE 또는 HE)으로 이루어질 수 있다. 특별한 실시 양태에서, 프로테아제 저항성 펩티드 링커는 서열 번호161, 서열 번호162, 서열 번호163, 서열 번호164, 서열 번호165, 서열 번호166, 서열 번호167, 또는 서열 번호168의 펩티드 링커이다.
전형적으로, 본 발명의 특징을 이루는 FGF21 변이체는 성숙 인간 야생형 FGF21 (서열 번호 2)과 비교하여 증가된 열안정성을 갖는다.
용어 “열안정성”은 더 높은 온도, 예를 들어 40℃ 초과의 온도에서 (폴리-)펩티드가 그의 화학적 또는 물리적 구조의 비가역적 변화에 저항하는 능력을 나타낸다. 특별한 실시 양태에서, 증가된 열안정성은 변이체의 증가된 용융 온도 (TM)를 나타낸다. 주어진 (폴리-)펩티드의 열안정성을 측정하는 수단 및 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 일 실시 양태에서, 열안정성 (예를 들어, TM)은 생리학적 완충액, 예컨대 PBS에서 측정된다. 일 실시 양태에서, 열안정성 (예를 들어, TM)은 예를 들어 본질적으로 실시예 5에 설명된 바와 같이 열이동 분석법(thermal shift assay)을 이용하여 측정된다.
일 실시 양태에서, 변이체의 용융 온도 (TM)는 성숙 인간 야생형 FGF21 (서열 번호 2)과 비교하여 적어도 2℃, 적어도 4℃, 적어도 6℃, 적어도 8℃, 적어도 10℃, 적어도 12℃, 적어도 14℃, 적어도 16℃, 적어도 18℃ 또는 적어도 20℃만큼 증가된다. 일 실시 양태에서, TM은 성숙 인간 야생형 FGF21 (서열 번호 2)과 비교하여 적어도 18℃, 예를 들어, 18℃ 내지 30℃ 또는 18℃ 내지 25℃만큼 증가된다.
FGF21 변이체의 생물학적 기능 또는 활성은 대개 당업자에게 일반적으로 공지된 FGF21 활성 분석법에서 측정되고/되거나 인간 야생형 FGF21, 예를 들어, 성숙 인간 야생형 FGF21 (서열 번호 2)과 비교된다. FGF21 활성 분석법으로는 예를 들어 문헌[A. et al. (2005) J Clin Invest 115: 1627-1635]에 기술된 바와 같이 “글루코스 흡수성 분석법”이 있다. 대안적으로, 세포 분석법, 예를 들어, 자가인산화 분석법, 예컨대 세포 내 웨스턴 (ICW) 분석법을 이용하여, FGF 수용체:KLB 복합체의 FGF21 수용체를 활성화시키거나 하류 세포내 신호 전달을 자극하는 FGF21 변이체의 효능을 측정할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “세포 내 웨스턴 (ICW) 분석법”은 면역세포화학적 분석법, 더 구체적으로, 정량적 면역형광 분석법 (대개 마이크로플레이트에서 (예를 들어, 96웰 또는 384웰 포맷) 수행됨)을 나타낸다. 이것은 웨스턴 블로팅의 특이성과 ELISA의 재현성 및 처리량을 조합시킨다 (예를 들어, 문헌[Aguilar H.N. et al. (2010) PLoS ONE 5(4): e9965] 참조). 적절한 ICW 분석 시스템은 (예를 들어 미국 소재의 엘아이-씨오알 바이오사이언시즈(LI-COR Biosciences)로부터) 구매가능하다. 일 실시 양태에서, ICW 분석은 본질적으로 실시예 3 또는 실시예 4에 설명된 바와 같이 수행된다.
전형적으로, FGF21 변이체는 미토겐-활성화 단백질 키나아제 (MAPK) ERK1/2의 인산화를 유도할 것이다. 일 실시 양태에서, 변이체는 예를 들어 세포 내 웨스턴 (ICW) 분석법으로 결정되는 바와 같이 100 nmol/L 이하, 또는 90 nmol/L 이하, 또는 80 nmol/L 이하, 또는 70 nmol/L 이하, 또는 60 nmol/L 이하, 또는 50 nmol/L 이하, 또는 40 nmol/L 이하, 또는 30 nmol/L 이하, 또는 20 nmol/L 이하, 또는 15 nmol/L 이하, 또는 12 nmol/L 이하, 또는 11 nmol/L 이하, 또는 10 nmol/L 이하, 또는 9 nmol/L 이하, 또는 8 nmol/L 이하, 또는 7 nmol/L 이하, 또는 6 nmol/L 이하, 또는 5 nmol/L 이하, 또는 4 nmol/L 이하, 또는 3 nmol/L 이하, 또는 2 nmol/L 이하의 EC50으로 미토겐-활성화 단백질 키나아제 (MAPK) ERK1/2의 인산화를 유도한다.
“변이체의 검출 및/또는 단리를 허용하는 표지체 또는 태그”는 이러한 목적을 위하여 본 기술 분야에 공지된 임의의 표지체/태그를 포함함을 의미한다. 예시적인 태그는 친화성 태그, 예컨대 키틴 결합 단백질(chitin binding protein; CBP), 말토스 결합 단백질(maltose binding protein; MBP), 글루타티온-S-트랜스퍼라아제(glutathione-S-transferase; GST) 및 His-태그, 예컨대 히스티딘-풍부 서열 (예를 들어, 서열 번호 5 또는 6) 또는 폴리(His) (예를 들어, His6); 가용화 태그, 예컨대 티오레독신 (TRX) 및 폴리(NANP); 크로마토그래피 태그, 예컨대 FLAG-태그; 에피토프 태그, 예컨대 V5-태그, myc-태그 및 HA-태그; 및 형광 또는 발광 표지체 또는 태그, 예컨대 형광 단백질 (예를 들어, GFP, YFP, RFP 등), 형광 염료 및 루시퍼라아제를 포함한다.
(폴리)펩티드 표지체 또는 태그의 아미노산 서열은 변이체의 아미노산 서열 내의 임의의 위치에 도입될 수 있으며, 예를 들어 코딩된 단백질 구조 내에서의 루프의 형상을 취할 수 있거나, 또는 이것은 N-말단 또는 C-말단에 융합될 수 있다. 일 실시 양태에서, 표지체 또는 태그는 N-말단에 융합된다. 표지체 또는 태그는 변이체로부터의 표지체 또는 태그의 제거를 허용하는 절단 부위 (예를 들어, TEV 프로테아제-절단 부위)를 추가로 포함할 수 있다. 이와 유사하게, 비-펩티드성 표지체 또는 태그, 예를 들어 형광 염료가 임의의 적합한 부위에서 변이체에 콘쥬게이션될 수 있다.
본 발명의 특징을 이루는 FGF21 변이체는 N-말단 분비 신호와 같이 분자의 분비를 촉진하는 아미노산 서열을 또한 포함할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 분비 신호는 충분한 분비 경로 통과 및/또는 세포외 환경으로의 분비를 허용하는 신호 서열이다. 일부 실시 양태에서, 분비 신호 서열은 절단가능하며, 변이체로부터 제거된다. 일 실시 양태에서, 상기 신호 서열은 인간 FGF21의 천연 신호 서열과는 상이하다. 분비 신호 서열은 변이체를 생성하는 세포 또는 유기체에서 사용하기에 적합할 것이다. 일 실시 양태에서, 분비 신호 서열은 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
본 발명의 특징을 이루는 FGF21 변이체는 예를 들어 특정 세포 유형 또는 조직에 대한 선택성을 향상시키는 역할을 하는 결합 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 이것은 예를 들어 상기 세포 유형 또는 조직의 표면 상에서 발현되는 특정 항원에 결합하는 결합 도메인을 제공함으로써 성취될 수 있다.
FGF21 변이체는 또한 반감기 연장 모듈에 융합되거나 콘쥬게이션될 수 있다. “반감기”는 예를 들어 생체 내에서 분자의 활성, 양, 또는 수의 절반을 제거하는 데 필요한 시간 기간과 관련된다. 그러한 모듈은 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어, 중합체 (예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 히드록시에틸 전분 (HES), 히알루론산, 폴리시알산), 비구조화 (폴리-)펩티드 사슬, 엘라스틴-유사 폴리펩티드 (ELP), 혈청 단백질 (예를 들어, 알부민, 예컨대 인간 혈청 알부민 (HAS)), 혈청 단백질 결합 분자 (예를 들어, 알부민 결합 도메인 (ABD), 알부민 결합 지방산), 항체, 면역글로불린, 면역글로불린의 Fc 영역/도메인 및 면역글로불린 결합 도메인을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “비구조화 (폴리-)펩티드 사슬”은 고정된 3차원 구조 또는 규칙적 3차원 구조가 결여되고 전형적으로 친수성인 (폴리-)펩티드 사슬을 나타낸다. 펩티드 및 단백질의 (생체 내) 반감기를 연장시키는 비구조화 (폴리-)펩티드 사슬 (상기 (폴리-)펩티드 사슬은 펩티드 및 단백질에 융합됨)은 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어 XTEN (문헌[Schellenberger V. et al. (2009) Nat Biotechnol. 27(12): 1186-90]) 및 PAS 서열 (문헌[Schlapschy M. et al. (2013) Protein Eng Des Sel. 26(8): 489-501])을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “~에 융합된”은 특히 예를 들어 재조합 DNA 기술에 의한 유전자 융합을 나타낸다. (폴리)펩티드 반감기 연장 모듈의 아미노산 서열은 변이체의 아미노산 서열 내의 임의의 위치에 도입될 수 있으며, 예를 들어 코딩된 단백질 구조 내에서의 루프의 형상을 취할 수 있거나, 또는 이것은 N-말단 또는 C-말단에 융합될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, “용어 “~에 콘쥬게이션된”은 특히 (폴리-)펩티드와 또 다른 분자, 예를 들어 변이체와 반감기 연장 모듈 사이의 적합한 공유적 연결로 이어지는 화학적 및/또는 효소적 콘쥬게이션을 나타낸다. 그러한 콘쥬게이션은 (폴리-)펩티드의 N- 또는 C-말단 또는 특정 측쇄에서, 예를 들어, 라이신, 시스테인, 티로신 또는 비천연 아미노산 잔기에서 일어날 수 있다.
용어 “융합 분자”는 일반적으로, 2가지 이상의 특유한 분자 (예를 들어, 단백질 및/또는 펩티드)를 연결함으로써, 특히 공유적으로 연결함으로써 생성된 분자를 나타내며, 이는 원래의 분자 각각으로부터 유래된 기능적 특성을 갖는 단일 분자를 생성한다. 단백질 및/또는 펩티드의 경우, 융합 분자는 “융합 단백질”로 칭해진다. 융합 분자는 유전자 융합에 의해 (예를 들어, 재조합 DNA 기술에 의해), 또는 화학적 및/또는 효소적 콘쥬게이션에 의해 생성될 수 있다. 상기 2가지 이상의 특유한 분자는 또한 적합한 링커 분자, 예를 들어 펩티드 링커 또는 비-펩티드성 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)에 의해 연결될 수 있다. 펩티드 링커는 특정 프로테아제 절단 부위를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따르면, 융합 분자는 FGF21 변이체에 더하여 적어도 하나의 기타 활성 제약 성분을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “활성 제약 성분” (API)은 일부의 약리학적 효과를 제공하고 병태, 예를 들어 본원에 정의된 바와 같은 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하는 데 사용되는 임의의 제약적 활성 화학물질 또는 생물학적 화합물 및 이의 임의의 제약상 허용가능한 염 및 이들의 임의의 혼합물을 포함한다. 예시적인 제약상 허용가능한 염은 염산, 황산, 질산, 인산, 브롬화수소산, 말레산, 말산, 아스코르브산, 시트르산, 타르타르산, 파모익산, 라우르산, 스테아르산, 팔미트산, 올레산, 미리스트산, 라우릴황산, 나프탈린술폰산, 리놀레산, 리놀렌산 등을 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "활성 제약 성분", "활성 에이전트(active agent)", "활성 성분(active ingredient)", "활성 물질(active substance)" 및 "약물(drug)"은 동의어를 의미하며, 즉, 동일한 의미를 갖는다.
본 발명에 따르면, 활성 제약 성분은 선택적으로 다음으로부터 선택된다:
- 문헌[Rote Liste 2014]에 언급된 모든 약물, 예를 들어 문헌[Rote Liste 2014, chapter 12]에 언급된 모든 항당뇨병제(antidiabetic), 문헌[Rote Liste 2014, chapter 06]에 언급된 모든 체중-감소제(weight-reducing agent) 또는 식욕 억제제(appetite suppressant), 문헌[Rote Liste 2014, chapter 58]에 언급된 모든 지질-저하제, 문헌[Rote Liste 2014 chapter 17]에 언급된 모든 항고혈압제, 문헌[Rote Liste]에 언급된 모든 신장보호제(nephroprotective), 또는 문헌[Rote Liste 2014, chapter 36]에 언급된 모든 이뇨제;
- 인슐린 및 인슐린 유도체, 예를 들어, 인슐린 인슐린 글라진(glargine) (예를 들어 란투스(Lantus)®), 100 U/mL 초과의 농축된 인슐린 글라진, 예를 들어 270 내지 330 U/mL의 인슐린 글라진 또는 300 U/mL의 인슐린 글라진 (유럽 특허 제2387989호에 개시된 바와 같음), 인슐린 글루리신(glulisine) (예를 들어, 아피드라(Apidra)®), 인슐린 데테미르(detemir) (예를 들어, 레베미르(Levemir)®), 인슐린 리스프로(lispro) (예를 들어, 휴마로그(Humalog)®, 리프로로그(Liprolog)®), 인슐린 데글루데크(degludec) (예를 들어, 데글루데크플러스(DegludecPlus)®, 이데그리라(IdegLira) (NN9068)), 인슐린 아스파르트 및 아스파르트 제형 (예를 들어, 노보로그(NovoLog)®), 기저 인슐린 및 유사체 (예를 들어, LY2605541, LY2963016, NN1436), 페길화된 인슐린 리스프로 (예를 들어, LY-275585), 지속성 인슐린 (예를 들어, NN1436, 인슈메라(Insumera) (PE0139), AB-101, AB-102, 센슐린(Sensulin) LLC), 중간형 인슐린 (예를 들어, 휴뮬린(Humulin)®N, 노보린(Novolin)®N), 속효성 및 단기-작용성 인슐린 (예를 들어, 휴뮬린®R, 노보린®R, 린제타(Linjeta)® (비아젝트(VIAject)®), PH20 인슐린, NN1218, 힌스베트(HinsBet)®), 사전혼합된 인슐린, 술리젠(SuliXen)®, NN1045, 인슐린 플러스(plus) 심린(Symlin)®, PE-0139, ACP-002 히드로겔 인슐린, 및 경구, 흡입형, 경피 및 협측 또는 설하 인슐린 (예를 들어, 엑수베라(Exubera)®, 나슐린(Nasulin)®, 아프레자(Afrezza)®, 인슐린 트레고필(tregopil, TPM-02 인슐린, 캅슐린(Capsulin)®, 오랄-린(Oral-lyn)®, 코발아민(Cobalamin)® 경구 인슐린, ORMD-0801, 오샤디(Oshadi) 경구 인슐린, NN1953, NN1954, NN1956, 비아탭(VIAtab)®;
- 글루카곤 유사 펩티드 1 (GLP-1), GLP-1 유사체 및 GLP-1 수용체 작용제, 예를 들어 GLP-1(7-37), GLP-1(7-36)아미드, 릭시세나타이드 (예를 들어 릭수미아(Lyxumia)®), 엑세나타이드 (예를 들어 엑센딘-4, r엑센딘-4, 바이에타(Byetta)®, 바이두레온(Bydureon)®, 엑세나타이드 NexP), 엑세나타이드-LAR, 리라글루타이드 (예를 들어 빅토자(Victoza)®), 세마글루타이드, 타스포글루타이드, 알비글루타이드, 둘라글루타이드, 알부곤, 옥신토모듈린, 게니프로사이드, ACP-003, CJC-1131, CJC-1134-PC, GSK-2374697, PB-1023, TTP-054, 란글레나타이드 (HM-11260C), CM-3, GLP-1 엘리젠(Eligen), AB-201, ORMD-0901, NN9924, NN9926, NN9927, 노덱센(Nodexen), 비아도르(Viador)-GLP-1, CVX-096, ZYOG-1, ZYD-1, ZP-3022, CAM-2036, DA-3091, DA-15864, ARI-2651, ARI-2255, 엑세나타이드-XTEN (VRS-859), 엑세나타이드-XTEN + 글루카곤-XTEN (VRS-859 + AMX-808) 및 중합체-결합된 GLP-1 및 GLP-1 유사체;
- 이중 GLP-1/GIP 작용제 (예를 들어 RG-7697 (MAR-701), MAR-709, BHM081, BHM089, BHM098); 이중 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제 (예를 들어 BHM-034, OAP-189 (PF-05212389, TKS-1225), TT-401/402, ZP2929, LAPS-HMOXM25, MOD-6030);
- 이중 GLP-1/가스트린 작용제 (예를 들어 ZP-3022);
- 위장관 펩티드, 예컨대 펩티드 YY 3-36(PYY3-36) 또는 이의 유사체 및 췌장 폴리펩티드 (PP) 또는 이의 유사체;
- 글루카곤 수용체 작용제 또는 길항제, 글루코스 의존성 인슐린 분비성(insulinotropic) 폴리펩티드(GIP) 수용체 작용제 또는 길항제, 그렐린 길항제 또는 역작용제, 제닌 및 이의 유사체;
- 디펩티딜 펩티다아제-IV (DPP-4) 억제제, 예를 들어, 알로글립틴 (예를 들어, 네시나(Nesina)®, 카자노(Kazano)®), 리나글립틴 (예를 들어, 온데로(Ondero)®, 트라젠타(Trajenta)®, 트라드젠타(Tradjenta)®, 트라이엔타(Trayenta)®), 삭사글립틴 (예를 들어, 온글리자(Onglyza)®, 콤보글라이제(Komboglyze) XR®), 시타글립틴 (예를 들어, 자누비아(Januvia)®, 셀레비아(Xelevia)®, 테사벨(Tesavel)®, 자누메트(Janumet)®, 벨메티아(Velmetia)®, 주비싱크(Juvisync)®, 자누메트 XR®), 아나글립틴, 테네리글립틴 (예를 들어, 테넬리아(Tenelia)®), 트렐라글립틴, 빌다글립틴 (예를 들어, 갈부스(Galvus)®, 갈부메트(Galvumet)®), 제미글립틴, 오마리글립틴, 에보글립틴, 듀토글립틴, DA-1229, MK-3102, KM-223, KRP-104, PBL-1427, 피녹사신(Pinoxacin) 히드로클로라이드, 및 Ari-2243;
- 소듐-의존성 글루코오스 수송체 2 (SGLT-2) 억제제, 예를 들어, 카나글리플로진, 다파글리플로진, 레모글리플로진, 레모글리플로진 에타보네이트, 세르글리플로진, 엠파글리플로진, 이프라글리플로진, 토포글리플로진, 루세오글리플로진, 에르투글리플로진, EGT-0001442, LIK-066, SBM-TFC-039, 및 KGA-3235 (DSP-3235);
- SGLT-2와 SGLT-1의 이중 억제제 (예를 들어 LX-4211, LIK066).
- 회장 담즙산 수송(ileal bile acid transfer; IBAT) 억제제 (예를 들어 GSK-1614235 + GSK-2330672)와 같은 항비만약과 조합된 SGLT-1 억제제 (예를 들어 LX-2761, KGA-3235) 또는 SGLT-1 억제제;
- 비구아니드 (예를 들어 메트포르민, 부포르민, 펜포르민);
- 티아졸리딘디온 (예를 들어 피오글리타존, 로시글리타존), 글리타존 유사체 (예를 들어 로베글리타존);
- 퍼옥시좀 증식인자 활성화 수용체 (PPAR-)(알파, 감마 또는 알파/감마) 작용제 또는 조절제 (예를 들어 사로글리타자르 (예를 들어 리파글린(Lipaglyn)®), GFT-505), 또는 PPAR 감마 부분 작용제 (예를 들어 Int-131);
- 술포닐우레아 (예를 들어 톨부타미드, 글리벤클라미드, 글리메피리드, 아마릴(Amaryl)®, 글리피지드) 및 메글리티니드 (예를 들어 나테글리니드, 레파글리니드, 미티글리니드);
- 알파-글루코시아다제 억제제 (예를 들어 아카르보스, 미글리톨, 보글리보스);
- 아밀린 및 아밀린 유사체 (예를 들어 프람린티드, 심린®);
- G-단백질 커플링 수용체 119 (GPR119) 작용제 (예를 들어 GSK-1292263, PSN-821, MBX-2982, APD-597, ARRY-981, ZYG-19, DS-8500, HM-47000, YH-Chem1);
- GPR40 작용제 (예를 들어 TUG-424, P-1736, P-11187, JTT-851, GW9508, CNX-011-67, AM-1638, AM-5262);
- GPR120 작용제 및 GPR142 작용제;
- 전신성 또는 저흡수성 TGR5 (GPBAR1 = G-단백질 커플링된 담즙산 수용체 1) 작용제 (예를 들어 INT-777, XL-475, SB756050);
- 당뇨병 면역치료제, 예를 들어, 경구 C-C 케모카인 수용체 타입 2 (CCR-2) 길항제 (예를 들어, CCX-140, JNJ-41443532), 인터루킨 1 베타 (IL-1ß) 길항제 (예를 들어, AC-201), 또는 경구 단클론 항체 (MoA) (예를 들어, 메탈로자미드, VVP808, PAZ-320, P-1736, PF-05175157, PF-04937319);
- 대사 증후군 및 당뇨병의 치료를 위한 소염제, 예를 들어, 핵 인자 카파 B 억제제 (예를 들어, 트리오렉스(Triolex)®);
- 아데노신 모노포스페이트-활성화되는 단백질 키나아제 (AMPK) 자극제, 예를 들어 이메글리민(Imeglimin) (PXL-008), 데비오(Debio)-0930 (MT-63-78), R-118;
- 11-베타-히드록시스테로이드 데히드로게나아제 1 (11-베타-HSD-1)의 억제제 (예를 들어 LY2523199, BMS770767, RG-4929, BMS816336, AZD-8329, HSD-016, BI-135585);
- 글루코키나아제의 활성제 (예를 들어 PF-04991532, TTP-399 (GK1-399), GKM-001 (ADV-1002401), ARRY-403 (AMG-151), TAK-329, TMG-123, ZYGK1);
- 디아실글리세롤 O-아실트랜스퍼라아제(diacylglycerol O-acyltransferase; DGAT)의 억제제 (예를 들어 프라디가스타트(pradigastat(LCQ-908)), 단백질 티로신 포스파타아제 1의 억제제 (예를 들어 트로두스퀘민(trodusquemine)), 글루코스-6-포스파타아제의 억제제, 프룩토스-1,6-비스포스파타아제의 억제제, 글리코겐 포스포릴라아제의 억제제, 포스포에놀 피루베이트 카르복시키나아제의 억제제, 글리코겐 신타아제 키나아제의 억제제, 피루베이트 데히드로게나아제 키나아제의 억제제;
- 글루코스 수송자-4의 조절자, 소마토스타틴 수용체 3 작용제 (예를 들어 MK-4256);
- 하나 이상의 지질 저하제가 또한 병용 파트너로서 적합함. 예를 들어 3-히드록시-3-메틸글루타릴-조효소 A-리덕타아제 (HMG-CoA-리덕타아제) 억제제, 예컨? 심바스타틴 (예를 들어 조코르(Zocor)®, 이네기(Inegy)®, 심코르(Simcor)®), 아토르바스타틴 (예를 들어 소르티스(Sortis)®, 카듀엣(Caduet)®), 로수바스타틴 (예를 들어 크레스토르(Crestor)®), 프라바스타틴 (예를 들어 리포스타트(Lipostat)®, 셀리프란(Selipran)®), 플루바스타틴 (예를 들어 레스콜(Lescol)®), 피타바스타틴 (예를 들어 리바조(Livazo)®, 리발로(Livalo)®), 로바스타틴 (예를 들어 메바코르(Mevacor)®, 아드비코르(Advicor)®), 메바스타틴 (예를 들어 컴팩틴(Compactin)®), 리바스타틴, 세리바스타틴 (리포베이(Lipobay)®), 피브레이트, 예컨? 베자피브레이트 (예를 들어 세두르(Cedur)® 리타드(retard)), 시프로피브레이트 (예를 들어 하이퍼리펜(Hyperlipen)®), 페노피브레이트 (예를 들어 안타라(Antara)®, 리포펜(Lipofen)®, 리판틸(Lipanthyl)®), 겜피브로질 (예를 들어 로피드(Lopid)®, 게빌론(Gevilon)®), 에토피브레이트, 심피브레이트, 로니피브레이트, 클리노피브레이트, 클로피브리드, 니코틴산 및 이의 유도체 (예를 들어, 니아신의 서방성 제형을 포함하는 니아신), 니코틴산 수용체 1 작용제 (예를 들어 GSK-256073), PPAR-델타 작용제, 아세틸-CoA-아세틸트랜스퍼라아제 (ACAT) 억제제 (예를 들어 아바시미브(avasimibe)), 콜레스테롤 흡수 억제제 (예를 들어 에제티미브, 에제트롤(Ezetrol)®, 제티아(Zetia)®, 립트루젯(Liptruzet)®, 바이토린(Vytorin)®, S-556971), 담즙산-결합 물질 (예를 들어 콜레스티라민, 콜레세벨람), 회장 담즙산 수송 (IBAT) 억제제 (예를 들어 GSK-2330672, LUM-002), 미세소체 트리글리세리드 운반 단백질 (MTP) 억제제 (예를 들어 로미타피드 (AEGR-733), SLx-4090, 그라노타피드), 전구단백질 컨버타아제 서브틸리신/켁신 타입 9(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9; PCSK9)의 조절제 (예를 들어 알리로쿠맙 (REGN727/SAR236553), AMG-145, LGT-209, PF-04950615, MPSK3169A, LY3015014, ALD-306, ALN-PCS, BMS-962476, SPC5001, ISIS-394814, 1B20, LGT-210, 1D05, BMS-PCSK9Rx-2, SX-PCK9, RG7652), LDL 수용체 상향조절제, 예를 들어 간 선택성 갑상선 호르몬 수용체 베타 작용제 (예를 들어 에프로티롬 (KB-2115), MB07811, 소베티롬 (QRX-431), VIA-3196, ZYT1), HDL-상승 화합물, 예컨대 콜레스테릴 에스테르 전달 단백질(cholesteryl ester transfer protein; CETP) 억제제 (예를 들어 아나세트라핍 (MK0859), 달세트라핍, 에바세트라핍, JTT-302, DRL-17822, TA-8995, R-1658, LY-2484595, DS-1442), 또는 이중 CETP/PCSK9 억제제 (예를 들어 K-312), ATP-결합 카세트 (ABC1) 조절제, 지질 대사 조절제 (예를 들어 BMS-823778, TAP-301, DRL-21994, DRL-21995), 포스포리파아제 A2 (PLA2) 억제제 (예를 들어 다라플라딥, 타이리사(Tyrisa)®, 바레스플라딥, 릴라플라딥), ApoA-I 증강제 (예를 들어 RVX-208, CER-001, MDCO-216, CSL-112), 콜레스테롤 합성 억제제 (예를 들어 ETC-1002), 지질 대사 조절제 (예를 들어 BMS-823778, TAP-301, DRL-21994, DRL-21995) 및 오메가-3 지방산 및 이의 유도체 (예를 들어 이코사펜트 에틸 (AMR101), 에파노바(Epanova)®, AKR-063, NKPL-66, PRC-4016, CAT-2003);
- 브로모크립틴 (예를 들어, 사이클로세트(Cycloset)®, 팔로델(Parlodel)®), 펜테르민 및 펜테르민 제형 또는 조합물 (예를 들어, 아디펙스(Adipex)-P, 이오나민(Ionamin), 큐시미아(Qsymia)®), 벤즈페타민 (예를 들어, 디드렉스(Didrex)®), 디에틸프로피온 (예를 들어, 테누에이트(Tenuate)®), 펜디메트라진 (예를 들어, 아디포스트(Adipost)®, 본트릴(Bontril)®), 부프로피온 및 조합물 (예를 들어, 자이반(Zyban)®, 웰부트린(Wellbutrin) XL®, 콘트라브(Contrave)®, 엠파틱(Empatic)®), 시부트라민 (예를 들어, 리덕틸(Reductil)®, 메리디아(Meridia)®), 토피라마트 (예를 들어, 토파맥스(Topamax)®), 조니사미드 (예를 들어, 조네그란(Zonegran)®), 테소펜신, 오피오이드 길항제, 예컨대 날트렉손 (예를 들어, 날트렉신(Naltrexin)®, 날트렉손 + 부프로피온), 칸나비노이드 수용체 1 (CB1) 길항제 (예를 들어, TM-38837), 멜라닌-농축 호르몬 (MCH-1) 길항제(예를 들어, BMS-830216, ALB-127158(a)), MC4 수용체 작용제 및 부분 작용제 (예를 들어, AZD-2820, RM-493), 신경펩티드 Y5 (NPY5) 또는 NPY2 길항제 (예를 들어, 벨네페리트, S-234462), NPY4 작용제 (예를 들어, PP-1420), 베타-3-아드레날린 수용체 작용제, 렙틴 또는 렙틴 모방체, 5-히드록시트립타민 2c (5HT2c) 수용체의 작용제 (예를 들어, 로르카세린, 벨비크(Belviq)®), 프람린티드/메트렐렙틴, 리파아제 억제제, 예컨대 세틸리스타트 (예를 들어, 카메토르(Cametor)®), 오르리스타트 (예를 들어, 제니칼(Xenical)®, 칼로발린(Calobalin)®), 혈관형성 억제제 (예를 들어, ALS-L1023), 베타히스티딘 및 히스타민 H3 길항제 (예를 들어, HPP-404), AgRP (아구티 관련 단백질) 억제제 (예를 들어, TTP-435), 세로토닌 재흡수 억제제, 예를 들어, 플루옥세틴 (예를 들어, 플룩틴(Fluctine)®), 둘록세틴 (예를 들어, 심발타(Cymbalta)®), 이중 또는 삼중 모노아민 섭취 억제제 (도파민, 노르에피네프린 및 세로토닌 재흡수), 예컨대 세르트랄린 (예를 들어, 졸로프트(Zoloft)®), 테소펜신, 메티오닌 아미노펩티다아제 2 (MetAP2) 억제제 (예를 들어, 벨로라닙), 및 섬유모세포 성장 인자 수용체 4 (FGFR4) (예를 들어, ISIS-FGFR4Rx) 또는 프로히비틴 표적화 펩티드-1 (예를 들어, 아디포티드(Adipotide)®)의 생성에 대한 안티센스 올리고누클레오티드;
- 산화질소 공여체, AT1 길항제 또는 안지오텐신 II (AT2) 수용체 길항제, 예컨대 텔미사르탄 (예를 들어 킨잘(Kinzal)®, 미카르디스(Micardis)®), 칸데사르탄 (예를 들어 아타칸드(Atacand)®, 블로프레스(Blopress)®), 발사르탄 (예를 들어 디오반(Diovan)®, 코-디오반(Co-Diovan)®), 로사르탄 (예를 들어 코사르(Cosaar)®), 에프로사르탄 (예를 들어 테베텐(Teveten)®), 이르베사르탄 (예를 들어 아프로벨(Aprovel)®, 코아프로벨(CoAprovel)®), 올메사르탄 (예를 들어 보툼(Votum)®, 올메텍(Olmetec)®), 타소사르탄, 아질사르탄 (예를 들어 에다르비(Edarbi)®), 이중 안지오텐신 수용체 차단제 (이중 ARB), 안지오텐신 전환 효소 (ACE) 억제제, ACE-2 활성제, 레닌 억제제, 프로레닌 억제제, 엔도텔린 전환 효소 (ECE) 억제제, 엔도텔린 수용체 (ET1/ETA) 차단제, 엔도텔린 길항제, 이뇨제, 알도스테론 길항제, 알도스테론 신타아제 억제제, 알파-차단제, 알파-2 아드레날린 수용체의 길항제, 베타-차단제, 혼합 알파-/베타-차단제, 칼슘 길항제, 칼슘 채널 차단제 (CCB), 칼슘 채널 차단제 딜티아젬의 비강 제형 (예를 들어 CP-404), 이중 미네랄로코르티코이드/CCB, 중추 작용성 항고혈압제, 중성 엔도펩티다아제의 억제제, 아미노펩티다아제-A 억제제, 바소펩티드 억제제, 이중 바소펩티드 억제제, 예컨대 네프릴리신-ACE 억제제 또는 네프릴리신-ECE 억제제, 이중-작용 AT 수용체-네프릴리신 억제제, 이중 AT1/ETA 길항제, 최종 당화 산물 (AGE) 분해제, 재조합 레날라아제, 혈압 백신, 예컨대 항-RAAS (레틴-안지오텐신-알도스테론-시스템) 백신, AT1- 또는 AT2-백신, 고혈압 게놈약학을 기반으로 한 약물, 예컨대 항고혈압 반응을 갖는 유전자 다형성의 조절제, 혈소판 응집 억제제, 및 기타의 것 또는 이들의 조합물이 적합함.
“핵산 분자”는 데옥시리보핵산 (DNA) 또는 리보핵산 (RNA)이다. 핵산 분자는 단일 가닥 또는 이중 가닥이고 선형이거나 공유적으로 폐쇄되어 원을 형성하는 분자의 형태일 수 있다.
용어 “DNA”는 데옥시리보뉴클레오티드 잔기를 포함하며 전형적으로 전적으로 또는 실질적으로 데옥시리보뉴클레오티드 잔기로 구성된 분자와 관련된다. “데옥시리보뉴클레오티드”는 베타-D-리보푸라노실 기의 2’-위치에 히드록실 기가 결여된 뉴클레오티드와 관련된다. 용어 “DNA”는 단리된 DNA, 예컨대 부분적으로 또는 완전히 정제된 DNA, 본질적으로 순수한 DNA, 합성 DNA, 및 재조합적으로 생성된 DNA를 포함하며, 하나 이상의 뉴클레오티드의 부가, 결실, 치환 및/또는 변화에 의해 천연 발생 DNA와는 다른 변형 DNA를 포함한다. 그러한 변화는 DNA의 말단(들)에 또는 내부에, 예를 들어 DNA의 하나 이상의 뉴클레오티드에서의 부가와 같은 비-뉴클레오티드 물질의 부가를 포함할 수 있다. DNA 분자에서의 뉴클레오티드는 또한 비-표준 뉴클레오티드, 예컨대 비-천연 발생 뉴클레오티드 또는 화학적 합성 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 이러한 변경된 DNA는 유사체 또는 천연-발생 DNA의 유사체로 칭해질 수 있다. 뉴클레오티드와 관련하여 사용될 때, 용어 “천연 발생”은 염기인 아데닌 (A), 시토신 (C), 구아닌 (G), 티민 (T), 및 우라실 (U)을 나타낸다.
용어 “RNA”는 리보뉴클레오티드 잔기를 포함하며 전형적으로 전적으로 또는 실질적으로 리보뉴클레오티드 잔기로 구성된 분자와 관련된다. “리보뉴클레오티드”는 베타-D-리보푸라노실 기의 2’-위치에 히드록실 기를 갖는 뉴클레오티드와 관련된다. 용어 “RNA”는 단리된 RNA, 예컨대 부분적으로 또는 완전히 정제된 RNA, 본질적으로 순수한 RNA, 합성 RNA, 및 재조합적으로 생성된 RNA를 포함하며, 하나 이상의 뉴클레오티드의 부가, 결실, 치환 및/또는 변화에 의해 천연 발생 RNA와는 다른 변형 RNA를 포함한다. 그러한 변화는 RNA의 말단(들)에 또는 내부에, 예를 들어 RNA의 하나 이상의 뉴클레오티드에서의 부가와 같은 비-뉴클레오티드 물질의 부가를 포함할 수 있다. RNA 분자에서의 뉴클레오티드는 또한 비-표준 뉴클레오티드, 예컨대 비-천연 발생 뉴클레오티드 또는 화학적 합성 뉴클레오티드 또는 데옥시뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 이러한 변경된 RNA는 유사체 또는 천연-발생 RNA의 유사체로 칭해질 수 있다. 본 발명에 따르면, “RNA”는 단일 가닥 RNA 또는 이중 가닥 RNA를 나타낸다. 일 실시 양태에서, RNA는 mRNA, 예를 들어, 시험관 내에서 전사된 RNA (IVT RNA) 또는 합성 RNA이다. 또한 RNA는 예를 들어 RNA의 안정성 (예를 들어, 반감기)을 증가시키는 하나 이상의 변형에 의해 변형될 수 있다. 그러한 변형은 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어 5’-캡(cap) 또는 5’캡 유사체를 포함한다.
본 발명에 따른 핵산 분자는 벡터 내에 함유/포함될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “벡터”는 당업자에게 공지된 모든 벡터를 포함하며, 이는 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 파지 벡터, 예컨대 람다 파지, 바이러스 벡터, 예컨대 아데노바이러스 또는 바큘로바이러스 벡터, 또는 인공 염색체 벡터, 예컨대 박테리아 인공 염색체(bacterial artificial chromosome; BAC), 효모 인공 염색체(yeast artificial chromosome; YAC), 또는 P1 인공 염색체(PAC)를 포함한다. 상기 벡터는 발현 벡터와, 클로닝 벡터를 포함한다. 발현 벡터는 플라스미드와, 바이러스 벡터를 포함하며, 일반적으로, 원하는 코딩 서열 및 특정 숙주 유기체 (예를 들어, 박테리아, 효모, 식물, 곤충류, 또는 포유류)에서 또는 시험관 내 발현 시스템에서의 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 적절한 DNA 서열을 포함한다. 일반적으로 클로닝 벡터는 특정한 원하는 DNA 단편의 엔지니어링 및 증폭에 사용되며, 원하는 DNA 단편의 발현에 필요한 기능성 서열이 결여될 수 있다.
대안적으로, 본 발명에 따른 핵산 분자는 게놈, 예를 들어 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있다. 특정 핵산 분자를 게놈 내로 통합시키는 수단 및 방법은 당업자에게 공지되어 있다.
용어 “세포” 또는 “숙주 세포”는 전형적으로 온전한 세포, 즉, 효소, 소기관, 또는 유전 물질과 같은 보통의 세포내 성분을 방출하지 않았던 온전한 막을 갖는 세포와 관련된다. 온전한 세포는 전형적으로 생존가능 세포, 즉, 그의 정상적인 대사 기능을 수행할 수 있는 살아있는 세포이다. 전형적으로 상기 용어는 외인성 핵산으로 트랜스펙션되거나 형질전환될 수 있는 임의의 세포와 관련된다. 외인성 핵산으로 트랜스펙션되거나 형질전환되어 수용자에게 이전되는 세포는 전형적으로 그 수용자에서 상기 핵산을 발현할 수 있다. 용어 “세포”는 원핵 세포, 예컨대 박테리아 세포, 및 진핵 세포, 예컨대 효모 세포, 진균류 세포 또는 포유류 세포를 포함한다. 적합한 박테리아 세포는 그람(gram)-음성 박테리아 주, 예컨대 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 프로테우스(Proteus), 및 슈도모나스(Pseudomonas)의 주, 및 그람-양성 박테리아 주, 예컨대 바실루스(Bacillus), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 스타필로코커스(Staphylococcus), 및 락토코커스(Lactococcus)의 주로부터의 세포를 포함한다. 적합한 진균류 세포는 트리코데르마(Trichoderma), 뉴로스포라(Neurospora) 및 아스페르길루스(Aspergillus)의 종으로부터의 세포를 포함한다. 적합한 효모 세포는 사카로마이세스(Saccharomyces) 종 (예를 들어, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)), 쉬조사카로마이세스(Schizosaccharomyces) 종 (예를 들어, 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)), 피키아(Pichia) 종 (예를 들어, 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 및 피키아 메타놀리카(Pichia methanolica)) 및 한세눌라(Hansenula) 종으로부터의 세포를 포함한다. 적합한 포유류 세포는 예를 들어 CHO 세포, BHK 세포, HeLa 세포, COS 세포, HEK293 등을 포함한다. 일 실시 양태에서, HEK293 세포가 사용된다. 그러나, 양서류 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 및 이종성 단백질의 발현을 위하여 본 기술 분야에서 사용되는 임의의 다른 세포가 또한 사용될 수 있다. 인간, 마우스, 햄스터, 돼지, 염소 및 영장류 유래의 세포를 비롯하여 포유류 세포, 예컨대 포유류 지방 세포가 입양면역 전달(adoptive transfer)에 특히 유용하다. 세포는 다수의 조직 유형으로부터 유래될 수 있으며, 일차 세포 및 세포주, 예컨대 면역계의 세포, 특히 항원-제시 세포, 예컨대 수지상 세포 및 T 세포, 줄기 세포, 예컨대 혈액 줄기 세포 및 중간엽 줄기 세포 및 기타 세포 유형을 포함할 수 있다. 항원-제시 세포는 주조직적합성 복합체의 맥락에서 항원을 표면 상에 보여주는 세포이다. T 세포는 이 복합체를 그의 T 세포 수용체 (TCR)를 이용하여 인식할 수 있다. “세포” 또는 “숙주 세포”는 단리되거나, 조직 또는 유기체, 특히 “비-인간 유기체”의 일부일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “비-인간 유기체”는 비-인간 영장류 또는 기타 동물, 특히 포유류, 예컨대 소, 말, 돼지, 양, 염소, 개, 고양이, 토끼 또는 설치류, 예컨대 마우스, 래트, 기니피그 및 햄스터를 포함함을 의미한다.
본 발명의 특징을 이루는 제약 조성물은 전형적으로 치료적 유효량의 인간 FGF21 변이체, 선택적으로 융합 분자의 일부로서, 핵산 분자 또는 숙주 세포 (본원에 개시된 바와 같음) (본원에서 “에이전트”로도 칭해짐)를 함유하여서 원하는 반응 또는 원하는 효과를 생성한다.
본 발명에 따른 제약 조성물은 적어도 하나의 다른 활성 제약 성분, 예를 들어, 상기에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 다른 활성 제약 성분을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 제약 조성물은 전형적으로 살균 조성물이다. 제약 조성물은 대개 균일 투여 형태로 제공되며, 그 자체 공지된 방식으로 제조될 수 있다. 제약 조성물은 예를 들어 용액 또는 현탁액의 형태로 존재할 수 있다.
제약 조성물은 전부 제약상 허용가능한 하나 이상의 담체 및/또는 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “제약상 허용가능한”은 제약 조성물의 활성 약제의 작용과 상호작용하지 않는 비독성의 물질을 나타낸다.
용어 “담체”는 활성 성분이 적용을 용이하게 하거나, 증강시키거나 가능하게 하기 위하여 조합되는 천연 또는 합성 성질의 유기 또는 무기 성분을 나타낸다. 본 발명에 따르면, 용어 “담체”는 대상체에게 투여하기에 적합한 하나 이상의 상용성 고체 또는 액체 충전제, 희석제 또는 봉지화 물질을 또한 포함한다.
비경구 투여용으로 가능한 담체 물질로는 예를 들어 살균수, 링거액(Ringer’s solution), 락테이트 링거액(Lactated Ringer’s solution), 생리식염수, 정균 식염수 (예를 들어, 0.9% 벤질 알코올을 함유하는 식염수), 인산염 완충 염수 (PBS), 행크 용액(Hank’s solution), 폴리알킬렌 글리콜, 수소화 나프탈렌 및 특히 생체적합성 락티드 중합체, 락티드/글리콜리드 공중합체 또는 폴리옥시에틸렌/폴리옥시-프로필렌 공중합체가 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “부형제”는 제약 조성물에 존재할 수 있고 활성 성분이 아닌 모든 물질, 예컨대 염, 결합제 (예를 들어, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 트레할로스, 소르비톨, 만니톨), 활택제, 증점제, 표면 활성제, 방부제, 유화제, 완충 물질, 착향제, 또는 착색제를 포함하고자 한다.
제약상 허용가능한 것이 아닌 염이 제약상 허용가능한 염의 제조에 사용될 수 있으며, 본 발명에 포함된다. 이러한 종류의 제약상 허용가능한 염은 비제한적 방식으로, 하기 산으로부터 제조되는 것을 포함한다: 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산, 말레산, 아세트산, 살리실산, 시트르사느 포름산, 말론산, 숙신산 등. 제약상 허용가능한 염은 또한 알칼리 금속염 또는 알칼리 토금속염, 예컨대 나트륨염, 칼륨염 또는 칼슘염으로 제조될 수 있다. 염은 이온 강도 또는 장성을 조정하기 위하여 첨가될 수 있다.
제약 조성물에서 사용하기에 적합한 방부제는 산화방지제, 시트르산, 시트르산나트륨, 벤잘코늄 클로라이드, 클로로부탄올, 시스테인, 메티오닌, 파라벤 및 티메로살을 포함한다.
제약 조성물에서 사용하기에 적합한 완충 물질은 염 형태의 아세트산, 염 형태의 시트르산, 염 형태의 붕산 및 염 형태의 인산을 포함한다.
또한 제약 조성물은 상기에 정의된 바와 같은 하나 이상의 부형제를 선택적으로 포함하는, 적절한 희석제로 재구성되는 안정한 동결건조 생성물로 제형화될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “부분들의 키트 (짧게, 키트)”는 하나 이상의 용기 및 선택적으로 데이터 캐리어를 포함하는 제조 물품을 나타낸다. 상기 하나 이상의 용기는 상기 에이전트들 (시약들) 중 하나 이상으로 충전될 수 있다. 예를 들어 희석제, 완충제 및 추가 시약을 포함하는 추가 용기가 키트에 포함될 수 있다. 상기 데이터 캐리어는 비-전자 데이터 캐리어, 예를 들어, 그래픽 데이터 캐리어, 예컨대 정보 전단, 정보 시트, 바코드 또는 접속 코드, 또는 전자 데이터 캐리어, 예컨대 콤팩트 디스크 (CD), 디지털 다목적 디스크 (DVD), 마이크로칩 또는 또 다른 반도체-기반 전자 데이터 캐리어일 수 있다. 접속 코드는 데이터베이스, 예를 들어 인터넷 데이터베이스, 중앙 집중식 또는 분산 데이터베이스에의 접속을 허용할 수 있다. 상기 데이터 캐리어는 본 발명의 특징을 이루는 FGF21 변이체의 사용 설명서를 포함할 수 있다.
본원에 개시된 에이전트 및 조성물은 임의의 통상적인 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 예를 들어 경구 투여되거나, 폐 투여되거나, 흡입에 의해 투여되거나, 주사 또는 주입에 의한 것을 포함하여 비경구 투여될 수 있다. 일 실시 양태에서, 비경구 투여, 예를 들어 정맥내 투여, 동맥내 투여, 피하 투여, 피내 투여 또는 근육내 투여가 사용된다. 본원에 개시된 에이전트 및 조성물은 또한 지속 방출 투여를 통하여 투여될 수 있다.
비경구 투여에 적합한 제약 조성물은 대개 활성 화합물의 살균 수성 또는 비수성 제제를 포함하는데, 상기 제제는 전형적으로 수용자의 혈액에 대하여 등장성이다. 상용성 담체/용매/희석제의 예로는 살균수, 링거액, 락테이트 링거액, 생리식염수, 정균 식염수 (예를 들어, 0.9% 벤질 알코올을 함유하는 식염수), 인산염 완충 염수 (PBS) 및 행크 용액이 있다. 게다가, 대개 살균성인 고정유가 용액 또는 현탁액 매질로서 사용될 수 있다.
본원에 개시된 에이전트 및 조성물은 대개 치료적 유효량으로 투여된다. “치료적 유효량”은 전형적으로 허용가능하지 않은 부작용을 야기하지 않고서, 단독의, 또는 추가 용량과 함께, 원하는 치료적 반응 또는 원하는 치료적 효과를 성취하는 양을 나타낸다. 특정 질환 또는 특정 병태의 치료의 경우, 원하는 반응은 전형적으로 그 질환의 과정의 억제와 관련된다. 이것은 질환의 진행을 늦추는 것, 특히 질환의 진행을 방해하거나 역전시키는 것을 포함한다. 질환 또는 병태의 치료에서의 원하는 반응은 또한 상기 질환 또는 상기 병태의 발병 지연 또는 발병 예방일 수 있다. 본원에 개시된 에이전트 또는 조성물의 유효량은 치료될 병태, 질환의 중증도, 연령, 신체 상태, 크기 및 중량을 포함하는 대상체의 개별 파라미터, 치료 지속 기간, (존재할 경우) 수반되는 치료법의 유형, 특정 투여 경로 및 유사 요인에 따라 달라질 것이다. 따라서, 본원에 개시된 에이전트의 투여 용량은 다양한 그러한 파라미터에 따라 달라질 수 있다. 대상체에서의 반응이 처음 용량으로 불충분한 경우, 더 높은 용량 (또는 상이한, 더 국소화된 투여 경로에 의해 성취되는 효과적으로 더 높은 용량)이 사용될 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명의 인간 FGF21의 변이체와 적어도 하나의 다른 활성 제약 성분의 조합물을 제공한다.
일 실시 양태에서, 본 발명의 인간 FGF21의 변이체와 적어도 하나의 다른 활성 제약 성분의 조합물은 활성 제약 성분을 환자에게 별개로 투여함으로써 적용되거나 복수의 활성 제약 성분이 하나의 제약 조성물에 존재하는 병용 제품의 형태로 적용될 수 있다. 별개로 투여될 때, 투여는 동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로 일어날 수 있다. 원하는 조합된 치료적 효과의 달성을 위하여 FGF21 변이체 및 기타 활성 제약 성분(들)의 양 및 상대적인 투여 타이밍이 선택될 것이다. 조합물의 투여는 부수적으로 하기 형태로 투여하는 것일 수 있다: (1) 모든 활성 제약 성분을 포함하는 일원화 제약 조성물; 또는 (2) 활성 제약 성분 중 적어도 하나를 각각이 포함하는 별개의 제약 조성물들. 대안적으로, 조합물은 하나의 치료제가 먼저 투여되고, 나머지가 두 번째로 투여되거나 그 역으로 투여되는 순차적인 방식으로 별개로 투여될 수 있다. 그러한 순차적 투여는 시간상으로 가깝거나 시간상으로 멀 수 있다.
본 발명에 따르면, 용어 “질환 또는 장애”는 임의의 병리학적 상태 또는 건강하지 않은 상태, 특히 비만, 과체중, 대사 증후군, 진성 당뇨병, 고혈당증, 이상지질혈증, 비알코올성 지방간염 (NASH) 및/또는 아테롬성 동맥경화증을 나타낸다.
용어 “비만”은 과도한 체지방이 건강에 부정적인 영향을 줄 수 있을 정도까지 축적된 의학적 상태를 나타낸다. 인간 (성인) 대상체 면에서, 비만은 30 kg/m2 이상의 체질량 지수(body mass index; BMI) (BMI > 30 kg/m2)로 정의될 수 있다.
용어 “과체중”은 체지방량이 최선으로 건강한 것보다 더 높은 의학적 상태를 나타낸다. 인간 (성인) 대상체 면에서, 비만은 25 kg/m2 이상의 체질량 지수 (BMI) (예를 들어, 25 kg/m2 < BMI < 30 kg/m2)로 정의될 수 있다.
BMI는 성인에 있어서 과체중 및 비만을 분류하는 데 일반적으로 사용되는 신장 대비 체중의 단순 인덱스이다. 이것은 kg 단위의 사람의 체중을 미터 단위의 신장의 제곱으로 나눈 것 (kg/m2)으로 정의된다.
“대사 증후군”은 하기의 의학적 상태들 중 적어도 3가지의 클러스터링으로 정의될 수 있다: 복부 (중심성) 비만 (예를 들어, 유럽계 남성의 경우 > 94 cm의 허리 둘레 및 유럽계 여성의 경우 > 80의 허리 둘레로서 정의되며, 다른 군의 경우 민족 특이적 값을 가짐), 상승된 혈압 (예를 들어, 130/85 mmHg 이상), 상승된 공복 혈장 글루코스 (예를 들어, 100 mg/dL 이상), 높은 혈청 트리글리세리드 (예를 들어, 150 mg/dL 이상, 및 낮은 고밀도 리포단백질 (HDL) 수준 (예를 들어, 남성의 경우 40 mg/dL 미만 및 여성의 경우 50 mg/dL 미만).
“진성 당뇨병” (간단히 “당뇨병”으로도 칭해짐)은 인슐린 생성, 인슐린 작용 또는 이들 둘 다에서의 결함에서 생기는 고수준의 혈중 글루코스를 특징으로 하는 대사성 질환들의 군을 나타낸다. 일 실시 양태에서, 진성 당뇨병은 1형 진성 당뇨병, 2형 진성 당뇨병, 임신성 진성 당뇨병, 성인에서의 후기 발병형 자가면역 당뇨병(late onset autoimmune diabetes in the adult; LADA), 청소년기의 성인 발병 당뇨병(maturity onset diabetes of the young; MODY) 및 특정한 유전적 상태, 약물, 영양실조 감염 및 기타 질병에서 생기는 다른 유형의 당뇨병으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
현재의 WHO의 진성 당뇨병 진단 기준은 다음과 같다: 공복 혈장 글루코스 ≥ 7.0 mmol/l (126 mg/dL) 또는 2-h 혈장 글루코스 ≥ 11.1 mmol/l (200 mg/dL).
“1형 진성 당뇨병” (“인슐린 의존성 당뇨병(insulin-dependent diabetes; IDDM)” 또는 “소아 당뇨병”으로도 공지됨)은 인슐린의 전적인 결여에 의해 야기되는 고 혈당 수준을 특징으로 하는 병태이다. 이것은 신체 면역계가 췌장에서 인슐린 생산 베타 세포를 공격하여 이를 파괴할 때 일어난다. 그러면 췌장은 인슐린을 거의 생산하지 않거나 전혀 생산하지 않는다. 췌장의 제거 또는 질환은 또한 인슐린-생산 베타 세포의 손실을 초래할 수 있다. 1형 진성 당뇨병은 당뇨병 사례의 5% 내지 10%를 차지한다.
“2형 진성 당뇨병” (“인슐린 비의존성 당뇨병(non-insulin-dependent diabetes; NIDDM)” 또는 “성인 발병 당뇨병”으로도 공지됨)은 인슐린의 이용성에도 불구하고 과도한 글루코스가 생성되는 것을 특징으로 하는 병태이며, 순환 글루코스 수준은 부적당한 글루코스 제거 (인슐린 작용)의 결과로서 여전히 과도하게 높은 채로 있다. 2형 진성 당뇨병은 당뇨병 사례의 약 90% 내지 95%를 차지할 수 있다.
“임신성 당뇨병”은 이전에 당뇨병으로 진단되지 않은 여성이 임신 동안 (특히 임신 후기 동안) 높은 혈당 수준을 나타내는 병태이다. 임신성 당뇨병은 연구되는 집단에 따라 3 내지 10%의 임신에 영향을 준다.
“성인에서의 후기 발병형 자가면역 당뇨병 (LADA)” (“느린 발병형 제1형 당뇨병”으로도 칭해짐)은 종종 더 느린 발병 과정을 갖는, 성인에서 발생하는 1형 진성 당뇨병 형태이다.
“청소년기의 성인 발병 당뇨병 (MODY)”은 인슐린 생산을 파괴하는 상염색체 우성 유전자의 돌연변이에 의해 야기되는 유전형의 당뇨병을 나타낸다.
용어 “고혈당증”은 혈액 중의 과도한 당 (글루코스)을 나타낸다.
용어 “이상지질혈증”은 리포단백질 과다생성 (“고지혈증”) 또는 결핍 (“저지혈증”)을 포함하는 리포단백질 대사의 장애를 나타낸다. 이상지질혈증은 혈중 콜레스테롤, 저밀도 리포단백질 (LDL) 콜레스테롤 및/또는 트리글리세리드 총 농도의 상승, 및/또는 고밀도 리포단백질 (HDL) 콜레스테롤 농도의 감소로 나타날 수 있다.
비알코올성 지방간염 (NASH)은 간세포의 염증 및 감퇴와 함께, 지방 (지질 소적)의 축적을 특징으로 하는 간질환이다. 일단 정착되면, 상기 질환에는 간기능이 변경되고 간부전으로 진행할 수 있는 상태인 고위험도의 간경변이 수반된다. 그 후, NASH는 종종 간암으로 진행된다.
“아테롬성 동맥경화증”은 동맥 내강의 협착을 야기하고 섬유증 및 석회화로 진행할 수 있는, 큰 크기 및 중간 크기의 동맥의 내막에서의 경화반으로 칭해지는 불규칙 분포 지질 침적물을 특징으로 하는 혈관 질환이다. 병변은 대개 국소(focal) 병변이며, 느리게 그리고 간헐적으로 진행한다. 가끔, 경화반 파열이 일어나서 혈액 폐색을 초래하여서 폐색 원위부의 조직 유동의 방해를 초래하여서 조직사를 야기한다. 혈류 제한이 대부분의 임상 소견을 차지하며, 이는 폐색의 분포 및 중증도에 따라 달라진다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “의약”은 치료법에서, 즉, 질환 또는 장애의 치료에서 사용되는 물질/조성물을 나타낸다.
“치료하다”는 질환 또는 장애를 예방하거나 없애고/없애거나; 대상체에서 질환 또는 장애를 저지하거나 늦추고/늦추거나; 대상체에서 새로운 질환 또는 장애의 발병을 억제하거나 늦추고/늦추거나; 현재 질환 또는 장애를 갖고 있거나 이전에 질환 또는 장애를 갖고 있었던 대상체에서 증상의 빈도 또는 중증도 및/또는 재발을 감소시키고/시키거나; 대상체의 수명을 연장시키기 위하여, 즉, 증가시키기 위하여 대상체에게 화합물 또는 조성물 또는 화합물들 또는 조성물들의 조합물을 투여하는 것을 의미한다.
특히, 용어 “질환 또는 장애를 치료하는/질환 또는 장애의 치료”는 질환 또는 장애 또는 이의 증상의 발병의 치유, 지속 기간의 단축, 개선, 예방, 진행 또는 악화의 늦춤 또는 억제, 또는 예방 또는 지연을 포함한다.
용어 “대상체”는 본 발명에 따르면, 치료를 위한 대상체, 특히 질환에 걸린 대상체 (“환자”로도 칭해짐)를 의미하며, 이는 인간, 비-인간 영장류 또는 기타 동물, 특히 포유류, 예컨대 소, 말, 돼지, 양, 염소, 개, 고양이, 토끼 또는 설치류, 예컨대 마우스, 래트, 기니피그 및 햄스터를 포함한다. 일 실시 양태에서, 대상체/환자는 인간이다.
추가 참고 문헌:
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국제 공개 제2006/028714 A1호 및 미국 특허 출원 공개 제2007/0299007 A1호;
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실시예
실시예 1:
HEK293 세포 또는 에스케리키아 콜라이 (이. 콜라이)에서의 FGF21 변이체의 발현
이. 콜라이에서 또는 HEK293 세포의 일시적 트랜스펙션에 의해 FGF21 변이체를 생성하였다.
(a) HEK293 세포에서의 FGF21 변이체의 발현
FGF21 변이체의 DNA 서열을 N-말단에서 IL2 신호 서열 (서열 번호 4), 이어서 히스티딘-풍부 서열 (His-태그) 및 TEV 프로테아제-절단 서열 (서열 번호 5 또는 6)에 융합시켰다. 신호 서열은 배양 배지 내로의 원하는 단백질의 분비에 요구되었다. 원하는 단백질을 고정 금속-이온 친화성 크로마토그래피(immobilized metal-ion affinity chromatography; IMAC) (컴플리트 His-태그 정제 컬럼(cOmplete His-Tag Purification Column), 로슈(Roche))를 사용하여 배양 상청액으로부터 정제하였다. IMAC-컬럼으로부터의 용출 후, N-말단 His-태그를 TEV 프로테아제의 첨가에 의해 선택적으로 절단하였다. His-태그 절단 후, 절단 반응 용액을 고정-금속 친화성 컬럼 (IMAC-컬럼) (컴플리트 His-태그 정제 컬럼, 로슈)에 두 번째로 통과시켜 (His-태그 비함유) 유통 분획을 수집하였다. 러닝(running) 완충액으로서 인산염 완충 염수 (PBS, 깁코(Gibco))를 이용하여 겔여과 컬럼을 사용하여 단백질을 추가로 정제하였다. 원하는 단백질을 함유하는 분획을 수집하고, 풀링하고(pooled), 농축시키고, 추가 사용때까지 -80℃에서 보관하였다.
(b) 이. 콜라이에서의 FGF21 변이체의 발현
서열 번호 2의 FGF21 단백질 (성숙 인간 야생형 FGF21, 즉, 신호 서열을 포함하지 않음; FGF21 H29-S209로도 칭해짐) 및 서열 번호 3의 FGF21 단백질 (추가의 N-말단 G를 포함하는 성숙 인간 야생형 FGF21; G+FGF21 H29-S209 또는 G-FGF21 H29-S209 또는 단순히 G-FGF21로도 칭해짐)과, 서열 번호 124 내지 서열 번호 157 및 서열 번호 174의 FGF21 단백질을 이. 콜라이에서 발현시켰다. FGF21 단백질들의 DNA 서열들을 N-말단에서 히스티딘-풍부 서열 (His-태그) 및 TEV 또는 SUMO 프로테아제-절단 부위 (서열 번호 6 또는 7)에 융합시켰다. 원하는 단백질을 고정 금속-이온 친화성 크로마토그래피 (IMAC) (His 트랩(Trap) HP, 지이 헬스케어(GE Healthcare))를 이용하여 정제하고, 이어서 TEV 또는 SUMO 프로테아제의 첨가에 의해 N-말단 His-태그를 절단하였다. His-태그의 절단 후, 절단 반응 용액을 이온 교환 컬럼, 이어서 러닝 완충액으로서 인산염 완충 염수 (PBS, 깁코)를 사용한 겔여과 단계를 이용하여 정제하였다. 원하는 단백질을 함유하는 분획을 수집하고, 풀링하고, 농축시키고, 추가 사용때까지 -80℃에서 보관하였다.
실시예 2:
인간 및 쥐과 혈장에서의 FGF21 변이체의 안정성의 측정
마우스 및 래트에서의 성숙 인간 야생형 FGF21의 생체 내 약동학적 특성 (PK) 분석은 신장을 통한 신속 제거로 인하여 1시간 미만의 반감기를 보여주었다 (문헌[Kharitonenkov A. et al. (2007) Endocrinology 148(2): 774-781]; 문헌[Stein S. et al. (2009) Diabetes Care 32(1): 126-8]; 문헌[Lin Z. et al. (2011) PLoS ONE 6(4): e18398]). 게다가, FGF21은 또한 생체 내에서의 단백질 분해적 분해에 대하여 민감한 것으로 밝혀졌다. 이러한 분해는 FGF21의 치료적 잠재성에 유의한 부정적 영향을 준다 (표 1) (문헌[Hecht R. et al. (2012) PLoS ONE 7(11): e49345]; 문헌[Micanovic R. et al. (2009) J Cell Physiol. 219(2): 227-34]; 문헌[Yie J. et al. (2012) Chem Biol Drug Des. 79(4): 398-410]).
[표 1]
인간 FGF21의 대사 안정성에 관하여 더 알기 위하여, 그리고 혈액에서 단백질 분해적 분해에 의해 형성되는 대사 산물을 확인하기 위하여, 단백질을 후속적으로 설명된 바와 같이 분석하였다. 상세하게는, 15 μmol/L의 인간 야생형 FGF21 (서열 번호 3)을 시험관 내에서 인간, 마우스, 및 래트 리튬 헤파린 혈장에서 37℃에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 마지막에, 샘플을 제조업자가 설명한 절차에 따라 노르겐 세럼 디플리션 키트(Norgen Serum Depletion Kit) (캐나다 #17300 온타리오주 토롤드 소재의 노르겐 바이오텍(Norgen Biotek))를 이용하여 검사하였다. 알부민, 알파-항트립신, 트랜스페긴 및 합토글로빈을 포함하는 주요 혈청 단백질을 혈장 샘플로부터 고갈시켰다. 4에서 500 μL의 혈장 샘플을 활성화 스핀 컬럼에 적용하고, 벤치톱 마이크로원심분리기(benchtop microcentrifuge)에서 6,700 x g에서 1분 동안 원심분리하였으며, 여기서, 유통물을 버렸다. 상기 컬럼을 500 μL의 세척 완충액의 첨가에 의해 2회 세척하고, 1분 동안 원심분리하였다. 2회의 100 μL 용출 완충액의 컬럼에의 첨가 및 1분 동안의 원심분리에 의해 결합 단백질을 용출시켰다.
정확한 질량 측정부를 갖춘 포지티브 이온화 모드의, m/z 650 내지 m/z 1700의 질량 범위 내의 이온 포획 질량 분광계 (서모 피셔(Thermo-Fisher) LTQ-오비트랩(Orbitrap), 나노LC(NanoLC) 1D 울트라(Ultra), AS2 오토샘플러(Autosampler))에서의 액체 크로마토그래피-질량 분광법 (LC-MS) 실험에 의해 대사 산물을 확인하였다. 대사 산물 확인에 이용한 HPLC 조건은 다음과 같았다: 컬럼 바이닥(Vydac) MS C4 300 A, 5 μm, 150 mm x 75 μm (그레이스(Grace), 벨기에 로케렌 소재); 이동상: 용출제 A: 2% (v/v)의 아세토니트릴을 포함하는 0.1% 포름산 용액 및 용출제 B: 아세토니트릴 + 0.1% 포름산; 러닝 시간: 75분; 유량: 280 nL/분. 다중 하전 질량을 마그트란(Magtran) 소프트웨어 (종키 장(Zhongqi Zhang))에 의해 디콘볼루션시키고, 형성된 대사 산물의 단백질 서열을 GPMAW 프로그램 (덴마크 오덴세 소재의 라이트하우스 데이터(Lighthouse Data))에 의해 해명하였다.
혈장에서의 상기에 설명한 바와 같은 서열 번호 3의 FGF21의 1시간 동안의 인큐베이션에 의해 신속한 절단을 야기하였으며, 몇몇 대사 산물을 검출할 수 있었는데, 이는 표 2에 열거되어 있다. 인간 야생형 FGF21 (서열 번호 1)의 위치 29 내지 위치 199의 아미노산 서열에 상응하는 절단 생성물이 조사한 모든 종의 혈장에서 형성되었다. 이 대사 산물은 인간-FGF21-des-데카펩티드로서 기술될 수 있으며, 이는 18428.56 Da의 분자량을 갖는다. 서열 번호 3의 인간 FGF21 및 그의 절단 생성물의 질량 스펙트럼 및 디콘볼루션이 도 1에 제시되어 있다.
[표 2]
성숙 인간 야생형 FGF21 (서열 번호 2) 및 다양한 FGF21 변이체의 시험관 내에서의 안정성은 인간 또는 마우스 혈장에서 상기 단백질들을 37℃에서 최대 24시간 동안 인큐베이션하고, 샌드위치 면역분석법을 이용하여 잔존하는 온전한 전장 FGF21 단백질을 분석함으로써 분석하였다. 상세하게는, 성숙 인간 FGF21 (서열 번호 2) 또는 변이체를 혈액 샘플 (K2EDTA 혈장, 몇몇 건강한 인간 공여자들의 혼합물)에 100 ng/mL의 농도로 첨가하고, 37℃에서 최대 24시간 동안 인큐베이션하였다. 0, 1, 8, 및/또는 24시간 후, 샘플을 취하고, 2x 농축 프로테아제 억제제 (프로테아제 인히비터 칵테일 태블릿츠(Protease Inhibitor Cocktail Tablets), 로슈)의 첨가에 의해 인큐베이션을 중지시켰다. 그 후, 샘플을 추가 프로세싱때까지 -80℃로 옮겼다. 후속적으로, 잔존하는 온전한 전장 FGF21 단백질의 양을 휴먼 인택트(Human Intact) FGF21 ELISA (F2131-K01, 미국 뉴햄프셔주 나슈아 소재의 이글 바이오사이언시즈(Eagle Biosciences))를 이용하여 평가하였다. 상기 분석법에서는 판매 회사에 의해 설명되는 바와 같이 성숙 인간 FGF21의 N-말단 (aa1-7) 및 C-말단 (aa175-181) (이는 전장 인간 야생형 FGF21 (서열 번호1)의 아미노 aa29 내지 35 및 aa203 내지 209에 상응함)에 특이적으로 결합하는 2가지의 선택된 항체를 이용한 샌드위치 기술이 이용된다. 인큐베이션 시작시의 각각의 개별 샘플의 농도를 내부 기준으로 사용하고, 이후의 시점에 측정한 농도와 상관시켰다.
인간 및 쥐과 혈장에서의 안정성에 대한 테스트한 재조합 FGF21 변이체의 결과가 표 3에 요약되어 있으며, 대표적인 결과는 도 2에 예시되어 있다.
[표 3]
실시예 3:
CHO 세포에서의 인간 FGF21 수용체 효능에 대한 시험관 내 세포 분석 (세포 내 웨스턴)
성숙 인간 FGF21 (서열 번호 2) 또는 FGF21 변이체의 시험관 내에서의 세포에서의 효능을 특이적이고 고도로 민감한 세포 내 웨스턴 (ICW) 분석법을 이용하여 측정하였다. ICW 분석법은 대개 마이크로플레이트 포맷으로 수행되는 면역조직화학적 분석법이다. 인간 베타-클로토 (KLB)와 함께 인간 FGFR1c를 안정적으로 발현하는 CHO Flp-In 세포 (독일 다름스타트 소재의 인비트로겐(Invitrogen))를 세포 내 웨스턴을 사용하는 FGF-21 수용체 자가인산화 분석에 사용하였다 (문헌[Aguilar H.N. et al. (2010) PLoS ONE 5(4): e9965]). MAP 키나아제 ERK1/2의 하류 활성화 또는 수용체 자가인산화 수준을 결정하기 위하여, 웰당 2104개의 세포를 96웰 플레이트 내에 접종하고, 48시간 동안 성장시켰다. 글루타맥스(GlutaMAX)를 포함하는 무혈청 배지 햄 F-12(Ham's F-12) 뉴트리언트 믹스(Nutrient Mix) (독일 다름스타트 소재의 깁코)를 이용하여 3 내지 4시간 동안 세포에 혈청 기아를 주었다. 후속적으로, 상기 세포를 증가하는 농도의 성숙 인간 FGF21 (서열 번호 2), 지시된 FGF21 변이체, 또는 기타 펩티드 중 어느 하나로 37℃에서 5분 동안 처리하였다. 인큐베이션 후, 배지를 버리고, 세포를 3.7%의 신선하게 제조한 파라-포름알데히드에서 20분 동안 고정시켰다. 세포에 PBS 중 0.1% 트리톤(Triton)-X-100을 20분 동안 침투시켰다. 차단을 실온에서 2시간 동안 오디세이(Odyssey) 차단 완충액 (독일 바드 홈부르크 소재의 LICOR)을 이용하여 수행하였다. 일차 항체로서, 항-pFGFR Tyr653/654 (독일 프랑크푸르트 소재의 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)) 또는 항-pERK 포스포-p44/42 MAP 키나아제 Thr202/Tyr204 (셀 시그널링(Cell Signaling))를 첨가하고, 4℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 일차 항체의 인큐베이션 후, 세포를 PBS + 0.1% 트윈20(Tween20)으로 세척하였다. 이차 항-마우스 800CW 항체 (독일 바드 홈부르크 소재의 LICOR)를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 후속적으로, 세포를 PBS + 0.1% 트윈20을 사용하여 다시 세척하고, 적외선 염료 신호를 오디세이 이미저(imager) (독일 바드 홈부르크 소재의 LICOR)를 사용하여 정량화하였다. 결과를 TO-PRO3 염료 (독일 카를스루헤 소재의 인비트로겐)를 사용한 DNA의 정량화에 의해 정규화시켰다. 데이터를 임의 단위(arbitrary unit; AU)로 얻고, EC50 값을 용량-반응 곡선으로부터 얻었으며, 이는 표 4에 요약되어 있다. 도 3은 인간 FGFR1c + KLB를 과발현하는 CHO 세포를 이용한 ICW로부터의 결과를 나타낸다.
[표 4]
실시예 4:
일차 인간 지방세포를 이용한 FGF21 변이체의 시험관 내에서의 활성 측정
또한, 인간 FGF21 (서열 번호 2) 또는 FGF21 변이체의 시험관 내에서의 세포에서의 효능을 세포 내 웨스턴 (ICW) 분석법을 이용하여 인간 일차 피하 지방세포를 이용하여 측정하였다 (문헌[Aguilar H.N. et al. (2010) PLoS ONE 5(4): e9965]). 간략하게는, 2.8104개의 인간 지방 전구 세포 (독일 하이델베르그 소재의 프로모셀(PromoCell))를 96웰 플레이트의 각각의 웰 내에 접종하고, 성숙 지방세포까지 분화시켰다 (문헌[Hemmrich K. et al. (2005) Differentiation 73(1): 28-35]; 문헌[Lee M.J. (2014) Methods Enzymol. 538: 49-65]). MAP 키나아제 ERK1/2 활성화의 자극 전에, 무혈청 배지 (DMEM 1 g/l / 햄 F-10 배지 (1:1, v/v) (독일 아이덴바흐 소재의 팬-바이오텍(PAN-Biotech)), 15 mmol/L의 Hepes (pH 7.4), 33 μmol/L의 비오틴, 17 μmol/L의 판토테네이트)를 이용하여 3 내지 4시간 동안 세포에 혈청 기아를 주었다. 후속적으로, 세포를 증가하는 농도의 성숙 인간 FGF21 (서열 번호 2), 지시된 FGF21 변이체, 또는 기타 펩티드 중 어느 하나로 37℃에서 5분 동안 처리하였다. 인큐베이션 후, 배지를 버리고, 세포를 3.7%의 신선하게 제조한 파라-포름알데히드에서 20분 동안 고정시켰다. 세포에 PBS 중 0.1% 트리톤(Triton)-X-100을 20분 동안 침투시켰다. 차단을 실온에서 2시간 동안 오디세이(Odyssey) 차단 완충액 (독일 바드 홈부르크 소재의 LICOR)을 이용하여 수행하였다. 일차 항체로서, 항-pERK 포스포-p44/42 MAP 키나아제 Thr202/Tyr204 (셀 시그널링)를 첨가하고, 4℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 일차 항체의 인큐베이션 후, 세포를 PBS + 0.1% 트윈20으로 세척하였다. 이차 항-마우스 800CW 항체 (독일 바드 홈부르크 소재의 LICOR)를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 후속적으로, 세포를 PBS + 0.1% 트윈20을 사용하여 다시 세척하고, 적외선 염료 신호를 오디세이 이미저 (독일 바드 홈부르크 소재의 LICOR)를 사용하여 정량화하였다. 결과를 TO-PRO3 염료 (독일 카를스루헤 소재의 인비트로겐)를 사용한 DNA의 정량화에 의해 정규화시켰다. 데이터를 임의 단위 (AU)로 얻고, EC50 값을 도 4의 A 및 도 4의 B에 나타낸 바와 같이 용량-반응 곡선으로부터 얻었다. EC50 값이 표 5에 요약되어 있다.
[표 5]
실시예 5:
인간 FGF21 및 FGF21 변이체의 열안정성의 분석
열안정성에 대한 FGF21에서의 돌연변이의 영향을 분석하기 위하여, 안정화 리간드를 찾아내는 데 사용되는 시차 주사 형광 분석법 (DSF 또는 서모플루오르(ThermoFluor)™)에 의한 분석을 모방하여 열이동 분석법을 적용하였다 (문헌[Ahmad S. et al. (2012) Protein Science 21: 433-446]; 문헌[Shah et al. (2001) J. Biomol. Screen 6: 429-440]; 문헌[Niesen et al. (2007) Nat. Protoc. 2: 2212-21]). 이 분석법은 소수성 형광 염료, 예컨대 사이프로(Sypro)™ 오렌지(Orange) (라이프 테크놀로지즈(Life Technologies), 카탈로그 번호 S6651)가 단백질 상의 소수성 패치(patch)에 결합할 때 그의 형광을 증가시킨다는 관찰을 기반으로 한다. 그러한 소수성 패치는 가열시에 폴딩해제될 때 단백질에서 노출되어서, 형광의 증가는 폴딩 해제 정도에 대한 척도로서, 그리고 그에 따라 단백질의 열안정성의 척도로서 이용될 수 있다.
PBS (깁코) 중 단백질의 용액을 사이프로™오렌지의 160X 용액 (공급자에 의해 제공된 5000X DMSO 스톡으로부터 물에 희석됨)과 혼합함으로써 FGF21 변이체를 테스트하였다. 샘플 부피를 PBS를 이용하여 20 μl까지 조정하였다. 전형적인 조건은 최종 혼합물 중 0.8 mg/ml의 FGF21 변이체 단백질 및 8X 사이프로™오렌지를 포함하지만, 단백질 농도는 0.4 mg/ml과 1.2 mg/ml 사이에서 변할 수 있었다. 샘플을 96웰 PCR 플레이트 (바이오라드 세미-스커트(BioRad Semi-Skirt) 96 화이트(white))에 분배하고, 짧게 원심분리하여 기포를 제거하였다. 플레이트를 바이오라드 iQ5 실시간 PCR 기기 내에 넣고, 1℃/분의 램프 속도(ramp speed)에서 10℃로부터 90℃까지의 열구배를 가하였다. 여기 및 형광의 정량화를 위하여, 485 nm 및 575 nm의 파장을 위한 필터를 선택하였다. 바이오라드 iQ5 스탠다드 에디션(Standard Edition) 소프트웨어 (v. 2.0.148.60623)를 데이터 처리에 사용하였다. 온도에 대한 형광 강도의 곡선에서, 변곡점을 용융 온도 (TM)의 척도로서 선택하였다. 인간 FGF21 (서열 번호 3)을 모든 플레이트에 기준물로서 포함시켰다. 도 5는 선택된 FGF21 변이체의 대표적인 용융 곡선을 보여주고 있으며, 표 6은 인간 FGF21 (서열 번호 3)과 관련된 TM 값의 차이를 열거하고 있다.
[표 6]
실시예 6:
열안정성 변이체의 설계 및 FGF21 Q55C, N149C (서열 번호 158)의 X-선 결정 구조
공개 데이터 베이스, 예컨대 RCSB 단백질 데이터 은행 (PDB)에 FGF21의 구조가 기탁되지 않았기 때문에 인간 FGF21 (서열 번호 2)의 상이한 상동성 모델들을 SWISS-MODEL 상동성 모델링 서버 (문헌[Kiefer et al. (2009) Nucleic Acids Res. 37: D387-D392]) 또는 소프트웨어 프로그램인 바이오루미네이트(BioLuminate) (바이오루미네이트, 버전 1.0, 슈뢰딩거, 엘엘씨(
), 미국 뉴욕주 뉴욕, 2012년)를 이용하여 생성하였다. 이러한 모델은 FGF19 (문헌[Goetz et al. (2007) Mol. Cell. Biol. 27: 3417-3428; PDB 코드 2P23]; 문헌[Harmer (2004) Biochemistry 43: 629-640; PDB 코드 1PWA]) 및 FGF23 (문헌[Goetz et al. (2007) Mol. Cell. Biol. 27: 3417-3428; PDB 코드 2P39])의 공개된 결정 구조를 기반으로 한다 (도 6). 상이한 모델들을 바이오루미네이트를 이용하여 추가로 분석하여 디술피드 가교체의 도입을 위한 잠재적인 부위의 목록을 생성하였다. 발현 및 실험적 테스트를 위한 후보의 최종 선발을 위하여 소프트웨어 프로그램인 파이몰(PYMOL) (더 파이몰 몰레큘러 그래픽스 시스템(The PyMOL Molecular Graphics System), 버전 1.7 슈뢰딩거, 엘엘씨)을 이용한 모델 구조에서 잠재적인 위치를 육안으로 점검하였다.
인간 FGF21을 결정화하기 위하여, 변형 및 절두형 변이체 (인간 FGF21 S34-E176, Q55C, N149C; 서열 번호 158)를 발현시키고 정제시켰으며, 이는 상기에 설명한 바와 같았다 (실시예 1). 결정을 현적 증기 확산법에 의해 성장시켰다. 단백질을 50 mmol/L 트리스(Tris), pH 8.0, 0.5 mol/L NaCl에서 12 mg/mL까지 농축시켰다. 저장 용액(reservoir solution)은 100 mmol/L 트리스 (pH 8.5) 중 2 mol/L NH4SO4를 함유하였다. 100 nL의 단백질 용액을 100 nL의 저장 용액과 혼합하고, 20℃에서 평형시켰다. 결정이 2주 내에 나타났다. 20 내지 25% (vol/vol)의 에틸렌 글리콜이 보충된 저장 용액에 결정을 침지시킨 후 액체 질소에서 순간 냉동시킴으로써 동결보호를 성취하였다.
스위스 빌리겐 소재의 스위스 라이트 소스( Swiss Light Source; SLS)의 빔라인 PX-III에서 X-선 회절 데이터를 수집하고, XDS를 이용하여 처리하고 (문헌Kabsch W. (2010) Acta Crystallogr. D66: 125-132]) 에임리스(Aimless)를 이용하여 기준화하였으며 (문헌[Evans P.R. (2006) Acta Crystallogr. D62: 72-82]), 이는 autoProc에서 구현된 바와 같았다 (문헌[Vonrhein C. et al. (2011) Acta Crystallogr. D67: 293-302]). 결정은 공간군 P4132의 것이었으며, 대칭 단위 내에 2개의 FGF21 Q55C, N149C 분자를 포함하였다. 이 결정의 단위 셀 치수는 다음과 같았다: a = b = c = 136.7 Å. 결정을 2.97 Å의 해상도까지 회절시켰으며, Rmerge는 10.5%였다.
구조를 페이저(Phaser) 프로그램을 이용하여 분자 대체에 의해 결정하였다 (문헌[McCoy A.J. et al. (2007) J. Appl. Crystallogr. 40: 658-674]). FGF19 (단백질 데이터 은행 코드 1pwa), FGF23 (단백질 데이터 은행 코드 2p39), 및 FGF9 (단백질 데이터 은행 코드 2P39)의 결정 구조들을 중첩시키고, 대략 5 A보다 더 많이 다른 모든 루프들을 제거하였다. 생성된 앙상블(ensemble)을 탐색 모델로서 사용하였으며, 이는 명백한 해상으로 이어졌다. 페이저에서는 3개의 FGF-앙상블이 배치되었다. 그러나, 제3 앙상블의 전자 밀도는 극도로 약하였으며, 이 앙상블을 지웠다. 모델 구축을 쿠트(Coot)를 이용하여 행하였으며 (문헌[Emsley P. et al. (2010) Acta Crystallogr. D66: 486-501]) 개량을 부스터(Buster) (문헌[Bricogne G. et al. (2011) Cambridge, United Kingdom: Global Phasing Ltd.]) 및 Refmac5 (문헌[Murshudov G.N. et al. (2011) Acta Crystallogr. D67: 355-367])를 이용하여 행하였다. 최종 Rfactor는 25.5%였으며, 프리(free) Rfactor는 28.6%였다. 이러한 Rfactor들은 상대적으로 높았으며, 결정에 있어서의 특정한 양의 무질서를 나타낼 수 있다.
FGF21 Q55C, N149C (서열 번호 158)의 최종 모델에서, 분자 A는 잔기 G42 내지 K150 및 P158 내지 G169를 포함하며; 분자 B는 잔기 P36 내지 H154 및 P156-L170을 포함하였다. 상기 둘 다의 분자에서, P150과 R159 사이의 루프는 유의하게 무질서하였으며, 이는 이 영역에서의 높은 가요성을 나타내는 것이다.
그러한 고도로 가요성인 루프가 단백질의 열적 폴딩 해제의 시작점을 나타낸다는 것이 추정될 수 있다. 따라서, 디술피드 결합에 의한 이 영역의 안정화는 FGF21 변이체 H29-S209 Q55C, N149C (서열 번호 100) 또는 근처의 변이체 H29-S209 Q55C, P147C (서열 번호 99)에 대하여 평가할 경우 약 20℃의 유의한 열안정성 증가를 설명할 수 있다.
[표 7]
SEQUENCE LISTING
<110> SANOFI
<120> FGF21 variants
<130> DE2015/152PCT
<150> EP 15 306 913.3
<151> December 2, 2015
<160> 328
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 209
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Met Asp Ser Asp Glu Thr Gly Phe Glu His Ser Gly Leu Trp Val Ser
1 5 10 15
Val Leu Ala Gly Leu Leu Leu Gly Ala Cys Gln Ala His Pro Ile Pro
20 25 30
Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr
35 40 45
Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu Ile Arg
50 55 60
Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu
65 70 75 80
Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu Gly Val
85 90 95
Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly
100 105 110
Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu
115 120 125
Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu
130 135 140
His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly
145 150 155 160
Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Pro Pro Glu
165 170 175
Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp
180 185 190
Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Ala
195 200 205
Ser
<210> 2
<211> 181
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val
1 5 10 15
Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His
20 25 30
Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser
35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln
50 55 60
Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly
65 70 75 80
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg
85 90 95
Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His
100 105 110
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro
115 120 125
Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro
130 135 140
Ala Pro Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser
165 170 175
Pro Ser Tyr Ala Ser
180
<210> 3
<211> 182
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G-FGF21
<400> 3
Gly His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln
1 5 10 15
Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala
20 25 30
His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln
35 40 45
Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile
50 55 60
Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp
65 70 75 80
Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe
85 90 95
Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala
100 105 110
His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp
115 120 125
Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro
130 135 140
Pro Ala Pro Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp
145 150 155 160
Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg
165 170 175
Ser Pro Ser Tyr Ala Ser
180
<210> 4
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IL2 signal sequence
<400> 4
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Leu Ser Leu Ala
1 5 10 15
Leu Val Thr Asn Ser
20
<210> 5
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> His-tag
<400> 5
Asp Ile Gln Thr Gly Gly Ser His Ala His Gly His Gly His Ala His
1 5 10 15
Gly His Gly Gly Ser Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln
20 25
<210> 6
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> His-tag
<400> 6
Met Gly His His His His His His His His Gly Gly Gly Glu Asn Leu
1 5 10 15
Tyr Phe Gln Gly
20
<210> 7
<211> 108
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> His-tag + SUMO-tag
<400> 7
Met Gly His His His His His His Gly Ser Leu Gln Asp Ser Glu Val
1 5 10 15
Asn Gln Glu Ala Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu Thr
20 25 30
His Ile Asn Leu Lys Val Ser Asp Gly Ser Ser Glu Ile Phe Phe Lys
35 40 45
Ile Lys Lys Thr Thr Pro Leu Arg Arg Leu Met Glu Ala Phe Ala Lys
50 55 60
Arg Gln Gly Lys Glu Met Asp Ser Leu Arg Phe Leu Tyr Asp Gly Ile
65 70 75 80
Arg Ile Gln Ala Asp Gln Ala Pro Glu Asp Leu Asp Met Glu Asp Asn
85 90 95
Asp Ile Ile Glu Ala His Arg Glu Gln Ile Gly Gly
100 105
<210> 8
<211> 182
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G-FGF21 S195C, S200C
<400> 8
Gly His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln
1 5 10 15
Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala
20 25 30
His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln
35 40 45
Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile
50 55 60
Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp
65 70 75 80
Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe
85 90 95
Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala
100 105 110
His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp
115 120 125
Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro
130 135 140
Pro Ala Pro Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp
145 150 155 160
Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Cys Met Val Gly Pro Cys Gln Gly Arg
165 170 175
Ser Pro Ser Tyr Ala Ser
180
<210> 9
<211> 182
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G-FGF21 P199S, S200P
<400> 9
Gly His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln
1 5 10 15
Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala
20 25 30
His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln
35 40 45
Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile
50 55 60
Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp
65 70 75 80
Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe
85 90 95
Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala
100 105 110
His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp
115 120 125
Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro
130 135 140
Pro Ala Pro Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp
145 150 155 160
Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Ser Pro Gln Gly Arg
165 170 175
Ser Pro Ser Tyr Ala Ser
180
<210> 10
<211> 182
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G-FGF21 P199Q, Q201P
<400> 10
Gly His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln
1 5 10 15
Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala
20 25 30
His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln
35 40 45
Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile
50 55 60
Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp
65 70 75 80
Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe
85 90 95
Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala
100 105 110
His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp
115 120 125
Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro
130 135 140
Pro Ala Pro Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp
145 150 155 160
Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Gln Ser Pro Gly Arg
165 170 175
Ser Pro Ser Tyr Ala Ser
180
<210> 11
<211> 181
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G-FGF21 P199 deleted
<400> 11
Gly His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln
1 5 10 15
Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala
20 25 30
His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln
35 40 45
Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile
50 55 60
Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp
65 70 75 80
Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe
85 90 95
Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala
100 105 110
His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp
115 120 125
Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro
130 135 140
Pro Ala Pro Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp
145 150 155 160
Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Ser Gln Gly Arg Ser
165 170 175
Pro Ser Tyr Ala Ser
180
<210> 12
<211> 182
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G-FGF21 M196P, V197G, G198V, P199M
<400> 12
Gly His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln
1 5 10 15
Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala
20 25 30
His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln
35 40 45
Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile
50 55 60
Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp
65 70 75 80
Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe
85 90 95
Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala
100 105 110
His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp
115 120 125
Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro
130 135 140
Pro Ala Pro Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp
145 150 155 160
Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Pro Gly Val Met Ser Gln Gly Arg
165 170 175
Ser Pro Ser Tyr Ala Ser
180
<210> 13
<211> 182
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G-FGF21 M196V, V197M
<400> 13
Gly His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln
1 5 10 15
Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala
20 25 30
His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln
35 40 45
Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile
50 55 60
Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp
65 70 75 80
Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe
85 90 95
Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala
100 105 110
His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp
115 120 125
Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro
130 135 140
Pro Ala Pro Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp
145 150 155 160
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Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro
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<400> 145
Gly His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln
1 5 10 15
Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala
20 25 30
His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln
35 40 45
Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile
50 55 60
Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp
65 70 75 80
Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe
85 90 95
Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala
100 105 110
His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Ala Thr Thr Ser Pro Ala Pro
115 120 125
Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Pro
130 135 140
Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser
145 150 155 160
Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser
165 170 175
Tyr Ala Ser
<210> 146
<211> 179
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G-FGF21 R159-R163 deleted and replaced by GA
<400> 146
Gly His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln
1 5 10 15
Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala
20 25 30
His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln
35 40 45
Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile
50 55 60
Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp
65 70 75 80
Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe
85 90 95
Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala
100 105 110
His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp
115 120 125
Pro Ala Pro Gly Ala Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Pro
130 135 140
Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser
145 150 155 160
Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser
165 170 175
Tyr Ala Ser
<210> 147
<211> 179
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G-FGF21 R159-R163 deleted and replaced by GY
<400> 147
Gly His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln
1 5 10 15
Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala
20 25 30
His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln
35 40 45
Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile
50 55 60
Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp
65 70 75 80
Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe
85 90 95
Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala
100 105 110
His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp
115 120 125
Pro Ala Pro Gly Tyr Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Pro
130 135 140
Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser
145 150 155 160
Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser
165 170 175
Tyr Ala Ser
<210> 148
<211> 179
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G-FGF21 R159-R163 deleted and replaced by HH
<400> 148
Gly His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln
1 5 10 15
Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala
20 25 30
His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln
35 40 45
Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile
50 55 60
Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp
65 70 75 80
Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe
85 90 95
Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala
100 105 110
His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp
115 120 125
Pro Ala Pro His His Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Pro
130 135 140
Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser
145 150 155 160
Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser
165 170 175
Tyr Ala Ser
<210> 149
<211> 179
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G-FGF21 R159-R163 deleted and replaced by GE
<400> 149
Gly His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln
1 5 10 15
Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala
20 25 30
His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln
35 40 45
Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile
50 55 60
Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp
65 70 75 80
Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe
85 90 95
Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala
100 105 110
His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp
115 120 125
Pro Ala Pro Gly Glu Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Pro
130 135 140
Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser
145 150 155 160
Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser
165 170 175
Tyr Ala Ser
<210> 150
<211> 179
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G-FGF21 R159-R163 deleted and replaced by HE
<400> 150
Gly His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln
1 5 10 15
Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala
20 25 30
His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln
35 40 45
Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile
50 55 60
Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp
65 70 75 80
Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe
85 90 95
Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala
100 105 110
His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp
115 120 125
Pro Ala Pro His Glu Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Pro
130 135 140
Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser
145 150 155 160
Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser
165 170 175
Tyr Ala Ser
<210> 151
<211> 182
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G-FGF21 A162Y
<400> 151
Gly His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln
1 5 10 15
Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala
20 25 30
His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln
35 40 45
Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile
50 55 60
Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp
65 70 75 80
Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe
85 90 95
Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala
100 105 110
His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp
115 120 125
Pro Ala Pro Arg Gly Pro Tyr Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro
130 135 140
Pro Ala Pro Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp
145 150 155 160
Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg
165 170 175
Ser Pro Ser Tyr Ala Ser
180
<210> 152
<211> 182
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G-FGF21 R159H
<400> 152
Gly His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln
1 5 10 15
Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala
20 25 30
His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln
35 40 45
Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile
50 55 60
Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp
65 70 75 80
Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe
85 90 95
Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala
100 105 110
His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp
115 120 125
Pro Ala Pro His Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro
130 135 140
Pro Ala Pro Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp
145 150 155 160
Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg
165 170 175
Ser Pro Ser Tyr Ala Ser
180
<210> 153
<211> 182
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G-FGF21 S200M
<400> 153
Gly His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln
1 5 10 15
Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala
20 25 30
His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln
35 40 45
Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile
50 55 60
Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp
65 70 75 80
Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe
85 90 95
Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala
100 105 110
His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp
115 120 125
Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro
130 135 140
Pro Ala Pro Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp
145 150 155 160
Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Met Gln Gly Arg
165 170 175
Ser Pro Ser Tyr Ala Ser
180
<210> 154
<211> 182
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G-FGF21 G202T
<400> 154
Gly His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln
1 5 10 15
Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala
20 25 30
His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln
35 40 45
Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile
50 55 60
Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp
65 70 75 80
Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe
85 90 95
Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala
100 105 110
His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp
115 120 125
Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro
130 135 140
Pro Ala Pro Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp
145 150 155 160
Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Thr Arg
165 170 175
Ser Pro Ser Tyr Ala Ser
180
<210> 155
<211> 182
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G-FGF21 R203E
<400> 155
Gly His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln
1 5 10 15
Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala
20 25 30
His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln
35 40 45
Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile
50 55 60
Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp
65 70 75 80
Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe
85 90 95
Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala
100 105 110
His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp
115 120 125
Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro
130 135 140
Pro Ala Pro Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp
145 150 155 160
Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Glu
165 170 175
Ser Pro Ser Tyr Ala Ser
180
<210> 156
<211> 182
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G-FGF21 R203H
<400> 156
Gly His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln
1 5 10 15
Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala
20 25 30
His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln
35 40 45
Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile
50 55 60
Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp
65 70 75 80
Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe
85 90 95
Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala
100 105 110
His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp
115 120 125
Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro
130 135 140
Pro Ala Pro Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp
145 150 155 160
Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly His
165 170 175
Ser Pro Ser Tyr Ala Ser
180
<210> 157
<211> 180
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G-FGF21 G202-R203 deleted
<400> 157
Gly His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln
1 5 10 15
Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala
20 25 30
His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln
35 40 45
Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile
50 55 60
Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp
65 70 75 80
Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe
85 90 95
Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala
100 105 110
His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp
115 120 125
Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro
130 135 140
Pro Ala Pro Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp
145 150 155 160
Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Ser Pro
165 170 175
Ser Tyr Ala Ser
180
<210> 158
<211> 143
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FGF21 (S34-E176), Q55C, N149C
<400> 158
Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu
1 5 10 15
Tyr Thr Asp Asp Ala Cys Gln Thr Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu
20 25 30
Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu
35 40 45
Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys
50 55 60
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65 70 75 80
Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu Glu
85 90 95
Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His
100 105 110
Leu Pro Gly Cys Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro
115 120 125
Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Pro Pro Glu
130 135 140
<210> 159
<211> 199
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G-FGF21 PLSMVGPSQGRSPSYAS inserted after S209
<400> 159
Gly His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln
1 5 10 15
Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala
20 25 30
His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln
35 40 45
Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile
50 55 60
Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp
65 70 75 80
Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe
85 90 95
Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala
100 105 110
His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp
115 120 125
Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro
130 135 140
Pro Ala Pro Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp
145 150 155 160
Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg
165 170 175
Ser Pro Ser Tyr Ala Ser Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly
180 185 190
Arg Ser Pro Ser Tyr Ala Ser
195
<210> 160
<211> 198
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G-FGF21 P199 deleted, PLSMVGSQGRSPSYAS inserted after S209
<400> 160
Gly His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln
1 5 10 15
Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala
20 25 30
His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln
35 40 45
Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile
50 55 60
Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp
65 70 75 80
Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe
85 90 95
Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala
100 105 110
His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp
115 120 125
Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro
130 135 140
Pro Ala Pro Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp
145 150 155 160
Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg
165 170 175
Ser Pro Ser Tyr Ala Ser Pro Leu Ser Met Val Gly Ser Gln Gly Arg
180 185 190
Ser Pro Ser Tyr Ala Ser
195
<210> 161
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 161
Gly Ser Gly Ser
1
<210> 162
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 162
Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 163
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 163
Gly Ser His Ser Gly
1 5
<210> 164
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 164
Ala Thr Thr Ser
1
<210> 165
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 165
Gly Ser His Ser Gly Ser
1 5
<210> 166
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 166
Gly His Arg Ser His Leu Gln Thr Val Phe
1 5 10
<210> 167
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 167
Gly Leu Asn Ser Met Val
1 5
<210> 168
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 168
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 169
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> C-terminal extension
<400> 169
Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Ala
1 5 10 15
Ser
<210> 170
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> C-terminal extension
<400> 170
Pro Leu Ser Met Val Gly Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Ala Ser
1 5 10 15
<210> 171
<211> 181
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FGF21 variant, consensus sequence I
<220>
<221> misc_feature
<222> (27)..(27)
<223> Xaa (= Xaa55) is Q or another amino acid
<220>
<221> misc_feature
<222> (119)..(119)
<223> Xaa (= Xaa147) is P or C or deleted
<220>
<221> misc_feature
<222> (120)..(120)
<223> Xaa (= Xaa148) is G or C or deleted
<220>
<221> misc_feature
<222> (121)..(121)
<223> Xaa (= Xaa149) is N or C or deleted
<220>
<221> misc_feature
<222> (122)..(122)
<223> Xaa (= Xaa150) is K or another amino acid or deleted
<220>
<221> misc_feature
<222> (123)..(123)
<223> Xaa (= Xaa151) is S or deleted
<220>
<221> misc_feature
<222> (124)..(124)
<223> Xaa (= Xaa152) is P or another amino acid or deleted
<220>
<221> misc_feature
<222> (125)..(125)
<223> Xaa (= Xaa153) is H or another amino acid or deleted
<220>
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<222> (126)..(126)
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<220>
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<222> (127)..(127)
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<220>
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<222> (128)..(128)
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<220>
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<400> 171
His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val
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Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Xaa Gln Thr Glu Ala His
20 25 30
Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser
35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln
50 55 60
Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly
65 70 75 80
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg
85 90 95
Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His
100 105 110
Gly Leu Pro Leu His Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
115 120 125
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro
130 135 140
Ala Pro Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
145 150 155 160
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
165 170 175
Xaa Xaa Xaa Ala Ser
180
<210> 172
<211> 209
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 172
Met Asp Ser Asp Glu Thr Gly Phe Glu His Ser Gly Leu Trp Val Ser
1 5 10 15
Val Leu Ala Gly Leu Leu Leu Gly Ala Cys Gln Ala His Pro Ile Pro
20 25 30
Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr
35 40 45
Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu Ile Arg
50 55 60
Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu
65 70 75 80
Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu Gly Val
85 90 95
Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly
100 105 110
Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu
115 120 125
Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Ser Leu Pro Leu
130 135 140
His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly
145 150 155 160
Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Pro Pro Glu
165 170 175
Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp
180 185 190
Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Ala
195 200 205
Ser
<210> 173
<211> 209
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 173
Met Asp Ser Asp Glu Thr Gly Phe Glu His Ser Gly Leu Trp Val Ser
1 5 10 15
Val Leu Ala Gly Leu Leu Leu Gly Ala Cys Gln Ala His Pro Ile Pro
20 25 30
Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr
35 40 45
Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu Ile Arg
50 55 60
Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu
65 70 75 80
Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu Gly Val
85 90 95
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100 105 110
Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu
115 120 125
Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu
130 135 140
His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly
145 150 155 160
Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu
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Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp
180 185 190
Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Ala
195 200 205
Ser
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<211> 182
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<213> Artificial Sequence
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20 25 30
His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln
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180
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<400> 175
His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val
1 5 10 15
Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Xaa Gln Thr Glu Ala His
20 25 30
Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser
35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln
50 55 60
Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly
65 70 75 80
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg
85 90 95
Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His
100 105 110
Gly Leu Pro Leu His Leu Xaa Xaa Xaa Lys Ser Pro His Arg Xaa Pro
115 120 125
Ala Pro Arg Gly Xaa Xaa Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro
130 135 140
Ala Pro Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val
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Gly Ser Ser Asp Pro Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser
165 170 175
Pro Ser Tyr Ala Ser
180
<210> 176
<211> 181
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
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<220>
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<220>
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<223> Xaa (= Xaa198) is G or another amino acid or deleted
<220>
<221> misc_feature
<222> (171)..(171)
<223> Xaa (= Xaa199) is P or another amino acid or deleted
<400> 2
His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val
1 5 10 15
Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Xaa Gln Thr Glu Ala His
20 25 30
Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser
35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln
50 55 60
Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly
65 70 75 80
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg
85 90 95
Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His
100 105 110
Gly Leu Pro Leu His Leu Xaa Gly Xaa Lys Ser Pro His Arg Xaa Pro
115 120 125
Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro
130 135 140
Ala Pro Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Xaa Xaa Ser Gln Gly Arg Ser
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Pro Ser Tyr Ala Ser
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<213> Artificial Sequence
<220>
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1 5 10 15
Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His
20 25 30
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro
115 120 125
Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro
130 135 140
Ala Pro Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val
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Gly Ser Ser Asp Pro Leu Cys Met Val Gly Pro Cys Gln Gly Arg Ser
165 170 175
Pro Ser Tyr Ala Ser
180
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<211> 181
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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1 5 10 15
Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His
20 25 30
Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser
35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln
50 55 60
Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly
65 70 75 80
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg
85 90 95
Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His
100 105 110
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro
115 120 125
Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro
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Ala Pro Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val
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Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Ser Pro Gln Gly Arg Ser
165 170 175
Pro Ser Tyr Ala Ser
180
<210> 179
<211> 181
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 179
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20 25 30
Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser
35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln
50 55 60
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65 70 75 80
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Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His
100 105 110
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro
115 120 125
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130 135 140
Ala Pro Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Gln Ser Pro Gly Arg Ser
165 170 175
Pro Ser Tyr Ala Ser
180
<210> 180
<211> 180
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FGF21 P199 deleted
<400> 180
His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val
1 5 10 15
Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His
20 25 30
Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser
35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln
50 55 60
Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly
65 70 75 80
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100 105 110
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro
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Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro
130 135 140
Ala Pro Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Ser Gln Gly Arg Ser Pro
165 170 175
Ser Tyr Ala Ser
180
<210> 181
<211> 181
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 181
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100 105 110
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115 120 125
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Ala Pro Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Pro Gly Val Met Ser Gln Gly Arg Ser
165 170 175
Pro Ser Tyr Ala Ser
180
<210> 182
<211> 181
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FGF21 M196V, V197M
<400> 182
His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val
1 5 10 15
Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His
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Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser
35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln
50 55 60
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Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His
20 25 30
Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser
35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln
50 55 60
Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly
65 70 75 80
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg
85 90 95
Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His
100 105 110
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Ala Thr Thr Ser Pro Ala Pro Arg
115 120 125
Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Pro Pro
130 135 140
Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser
145 150 155 160
Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser Tyr
165 170 175
Ala Ser
<210> 315
<211> 178
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FGF21 R159-R163 deleted and replaced by GA
<400> 315
His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val
1 5 10 15
Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His
20 25 30
Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser
35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln
50 55 60
Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly
65 70 75 80
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg
85 90 95
Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His
100 105 110
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro
115 120 125
Ala Pro Gly Ala Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Pro Pro
130 135 140
Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser
145 150 155 160
Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser Tyr
165 170 175
Ala Ser
<210> 316
<211> 178
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FGF21 R159-R163 deleted and replaced by GY
<400> 316
His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val
1 5 10 15
Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His
20 25 30
Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser
35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln
50 55 60
Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly
65 70 75 80
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg
85 90 95
Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His
100 105 110
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro
115 120 125
Ala Pro Gly Tyr Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Pro Pro
130 135 140
Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser
145 150 155 160
Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser Tyr
165 170 175
Ala Ser
<210> 317
<211> 178
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FGF21 R159-R163 deleted and replaced by HH
<400> 317
His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val
1 5 10 15
Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His
20 25 30
Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser
35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln
50 55 60
Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly
65 70 75 80
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg
85 90 95
Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His
100 105 110
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro
115 120 125
Ala Pro His His Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Pro Pro
130 135 140
Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser
145 150 155 160
Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser Tyr
165 170 175
Ala Ser
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<211> 178
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FGF21 R159-R163 deleted and replaced by GE
<400> 318
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1 5 10 15
Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His
20 25 30
Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His
100 105 110
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro
115 120 125
Ala Pro Gly Glu Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Pro Pro
130 135 140
Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser
145 150 155 160
Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser Tyr
165 170 175
Ala Ser
<210> 319
<211> 178
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FGF21 R159-R163 deleted and replaced by HE
<400> 319
His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val
1 5 10 15
Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His
20 25 30
Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser
35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln
50 55 60
Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly
65 70 75 80
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg
85 90 95
Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His
100 105 110
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro
115 120 125
Ala Pro His Glu Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Pro Pro
130 135 140
Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser
145 150 155 160
Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser Tyr
165 170 175
Ala Ser
<210> 320
<211> 181
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FGF21 A162Y
<400> 320
His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val
1 5 10 15
Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His
20 25 30
Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser
35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln
50 55 60
Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly
65 70 75 80
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg
85 90 95
Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His
100 105 110
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro
115 120 125
Ala Pro Arg Gly Pro Tyr Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro
130 135 140
Ala Pro Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser
165 170 175
Pro Ser Tyr Ala Ser
180
<210> 321
<211> 181
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FGF21 R159H
<400> 321
His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val
1 5 10 15
Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His
20 25 30
Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser
35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln
50 55 60
Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly
65 70 75 80
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg
85 90 95
Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His
100 105 110
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro
115 120 125
Ala Pro His Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro
130 135 140
Ala Pro Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser
165 170 175
Pro Ser Tyr Ala Ser
180
<210> 322
<211> 181
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FGF21 S200M
<400> 322
His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val
1 5 10 15
Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His
20 25 30
Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser
35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln
50 55 60
Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly
65 70 75 80
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg
85 90 95
Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His
100 105 110
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro
115 120 125
Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro
130 135 140
Ala Pro Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Met Gln Gly Arg Ser
165 170 175
Pro Ser Tyr Ala Ser
180
<210> 323
<211> 181
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FGF21 G202T
<400> 323
His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val
1 5 10 15
Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His
20 25 30
Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser
35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln
50 55 60
Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly
65 70 75 80
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg
85 90 95
Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His
100 105 110
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro
115 120 125
Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro
130 135 140
Ala Pro Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Thr Arg Ser
165 170 175
Pro Ser Tyr Ala Ser
180
<210> 324
<211> 181
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FGF21 R203E
<400> 324
His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val
1 5 10 15
Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His
20 25 30
Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser
35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln
50 55 60
Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly
65 70 75 80
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg
85 90 95
Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His
100 105 110
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro
115 120 125
Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro
130 135 140
Ala Pro Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Glu Ser
165 170 175
Pro Ser Tyr Ala Ser
180
<210> 325
<211> 181
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FGF21 R203H
<400> 325
His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val
1 5 10 15
Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His
20 25 30
Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser
35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln
50 55 60
Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly
65 70 75 80
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg
85 90 95
Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His
100 105 110
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro
115 120 125
Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro
130 135 140
Ala Pro Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly His Ser
165 170 175
Pro Ser Tyr Ala Ser
180
<210> 326
<211> 179
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FGF21 G202-R203 deleted
<400> 326
His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val
1 5 10 15
Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His
20 25 30
Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser
35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln
50 55 60
Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly
65 70 75 80
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg
85 90 95
Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His
100 105 110
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro
115 120 125
Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro
130 135 140
Ala Pro Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Ser Pro Ser
165 170 175
Tyr Ala Ser
<210> 327
<211> 198
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FGF21 PLSMVGPSQGRSPSYAS (SEQ ID NO: 169) inserted after S209
<400> 327
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1 5 10 15
Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His
20 25 30
Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser
35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln
50 55 60
Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly
65 70 75 80
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg
85 90 95
Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His
100 105 110
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro
115 120 125
Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro
130 135 140
Ala Pro Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser
165 170 175
Pro Ser Tyr Ala Ser Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg
180 185 190
Ser Pro Ser Tyr Ala Ser
195
<210> 328
<211> 197
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FGF21 P199 deleted, PLSMVGSQGRSPSYAS (SEQ ID NO: 170) inserted
after S209
<400> 328
His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val
1 5 10 15
Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His
20 25 30
Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser
35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln
50 55 60
Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly
65 70 75 80
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg
85 90 95
Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His
100 105 110
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro
115 120 125
Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro
130 135 140
Ala Pro Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser
165 170 175
Pro Ser Tyr Ala Ser Pro Leu Ser Met Val Gly Ser Gln Gly Arg Ser
180 185 190
Pro Ser Tyr Ala Ser
195
Claims (32)
- 인간 섬유모세포 성장 인자 21(human fibroblast growth factor 21; FGF21)의 변이체로서, 서열 번호 171의 아미노산 서열을 포함하고,
여기서,
- Xaa55는 Q 또는 C이며;
- Xaa147은 P 또는 C이며;
- Xaa148은 G 또는 C이며;
- Xaa149는 N 또는 C이며;
- Xaa150은 K이며;
- Xaa151은 S이며;
- Xaa152는 P이며;
- Xaa153은 H이며;
- Xaa154는 R이며;
- Xaa155는 D 또는 C이며;
- Xaa156은 P이며;
- Xaa157은 A이며;
- Xaa158은 P이며;
- Xaa159는 R이며;
- Xaa160은 G이며;
- Xaa161은 P 또는 C이며;
- Xaa162는 A 또는 C이며;
- Xaa163은 R이며;
- Xaa184는 Q이며;
- Xaa185는 P이며;
- Xaa186은 P이며;
- Xaa187은 D이며;
- Xaa188은 V이며;
- Xaa189는 G이며;
- Xaa190은 S이며;
- Xaa191은 S이며;
- Xaa192는 D이며;
- Xaa193은 P이며;
- Xaa194는 L이며;
- Xaa195는 S 또는 C이며;
- Xaa196은 M이거나 P, V 또는 C 등의 또 다른 아미노산이거나, 또는 결실되며;
- Xaa197은 V이거나 E, D, G 또는 M 등의 또 다른 아미노산이거나, 또는 결실되며;
- Xaa198은 G이거나 E, D, R, K, Y, P 또는 V 등의 또 다른 아미노산이거나, 또는 결실되며;
- Xaa199는 P이거나 S, Q, R, T, G, F, L, D 또는 M 등의 또 다른 아미노산이거나, 또는 결실되며;
- Xaa200은 S이거나 Q, M, C, P, N 또는 H 등의 또 다른 아미노산이거나, 또는 결실되며;
- Xaa201은 Q이거나 P 또는 S 등의 또 다른 아미노산이거나, 또는 결실되며;
- Xaa202는 G이거나 T 등의 또 다른 아미노산이거나, 또는 결실되며;
- Xaa203은 R이거나 E, H 또는 C 등의 또 다른 아미노산이거나, 또는 결실되며;
- Xaa204는 S이며;
- Xaa205는 P이며;
- Xaa206은 S이며;
- Xaa207은 Y이며;
- 선택적으로, 서열 번호 171은 C에 의한 하기 아미노산: R47, L49, T51, A54, Q56, A59, H60, E62, I63, G67, V69, G71, A72, A73, S76, P77, E78, S79, L80, L81, Q82, L83, I91, L94, G95, V96, K97, T98, R100, L102, Q104, D107, G108, L110, G112, L114, A120, R124, D130, Y132, Q136, S137, A139, H140, L142, P143, H145, L146, L165, L167, L170, P174 중 적어도 하나의 치환을 포함하되;
단, 서열 번호 171은 성숙 인간 야생형 FGF21 (서열 번호 2)이 아니고 성숙 인간 야생형 FGF21 (서열 번호 2)과 비교하여 0, 2, 4, 6 또는 8개의 추가 시스테인을 포함하며,
선택적으로, 서열 번호 171은 돌연변이 G141S 및/또는 돌연변이 P174L을 추가로 포함하는, 변이체. - 제1항에 있어서, 서열 번호 175의 아미노산 서열을 포함하는 변이체.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,
- Xaa197 내지 Xaa203은 결실되며, 서열 번호 166 및 서열 번호 167로부터 선택되는 것 등의 프로테아제 저항성 펩티드 링커에 의해 대체되고/되거나;
- 서열 번호 168 등의 프로테아제 저항성 펩티드 링커가 Xaa198과 Xaa199 사이에 삽입되고/되거나;
- 서열 번호 169 또는 서열 번호 170의 아미노산 서열이 서열 번호 171의 S209 뒤에 부가된 변이체. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 171은 성숙 인간 야생형 FGF21 (서열 번호 2)과의 서열 동일성이 90% 이상 또는 91% 이상 또는 92% 이상 또는 93% 이상 또는 94% 이상 또는 95% 이상 또는 96% 이상 또는 97% 이상 또는 98%인 변이체.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
- Xaa55는 Q 또는 C이며;
- Xaa147은 P 또는 C이며;
- Xaa148은 G이며;
- Xaa149는 N 또는 C이며;
- Xaa155는 D 또는 C이며;
- Xaa161은 P이며;
- Xaa162는 A이며;
- Xaa195는 S이며;
- Xaa196은 M이며;
- Xaa197은 V이며;
- Xaa198은 G이거나 E, D, R, K, Y, P 또는 V 등의 또 다른 아미노산이거나, 또는 결실되며;
- Xaa199는 P이거나 S, Q, R, T, G, F, L, D 또는 M 등의 또 다른 아미노산이거나, 또는 결실되며;
- Xaa200은 S이며;
- Xaa201은 Q이며;
- Xaa202는 G이며;
- Xaa203은 R이며;
선택적으로, 서열 번호 171은 C에 의한 하기 아미노산: R47, A59, H60, G71, S76, S79, D107, G108, L142, P174 중 적어도 하나의 치환을 포함하는 변이체. - 제5항에 있어서, 서열 번호 176의 아미노산 서열을 포함하는 변이체.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 171은 C에 의한 하기 아미노산의 치환을 포함하는 변이체:
- Xaa55 및 Xaa149;
- R47 및 P174;
- Xaa55 및 Xaa147;
- A59 및 G71;
- H60 및 S79;
- S76 및 S79;
- D107 및 Xaa155; 및/또는
- G108 및 L142. - 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
- Xaa55는 C이고, Xaa147은 C이고, Xaa149는 N이고, Xaa155는 D이고, Xaa198은 G이고, Xaa199는 결실되거나;
- Xaa55는 C이고, Xaa147은 C이고, Xaa149는 N이고, Xaa155는 D이고, Xaa198은 Y이고, Xaa199는 P이거나;
- Xaa55는 C이고, Xaa147은 P이고, Xaa149는 C이고, Xaa155는 D이고, Xaa198은 G이고, Xaa199는 결실되거나;
- Xaa55는 C이고, Xaa147은 P이고, Xaa149는 C이고, Xaa155는 D이고, Xaa198은 Y이고, Xaa199는 P이거나;
- Xaa55는 Q이고, Xaa147은 P이고, Xaa149는 N이고, Xaa155는 D이고, Xaa198은 G이고, Xaa199는 결실되거나;
- Xaa55는 Q이고, Xaa147은 P이고, Xaa149는 N이고, Xaa155는 D이고, Xaa198은 R이고, Xaa199는 P이거나;
- Xaa55는 Q이고, Xaa147은 P이고, Xaa149는 N이고, Xaa155는 D이고, Xaa198은 K이고, Xaa199는 P이거나;
- Xaa55는 Q이고, Xaa147은 P이고, Xaa149는 N이고, Xaa155는 D이고, Xaa198은 Y이고, Xaa199는 P이거나;
- Xaa55는 C이고, Xaa147은 C이고, Xaa149는 N이고, Xaa155는 D이고, Xaa198은 G이고, Xaa199는 P이거나;
- Xaa55는 C이고, Xaa147은 P이고, Xaa149는 C이고, Xaa155는 D이고, Xaa198은 G이고, Xaa199는 P이거나;
- Xaa55는 Q이고, Xaa147은 P이고, Xaa149는 N이고, Xaa155는 D이고, Xaa198은 G이고, Xaa199는 결실되거나 (여기서, 서열 번호 171은 C에 의한 A59 및 G71의 치환을 포함함);
- Xaa55는 Q이고, Xaa147은 P이고, Xaa149는 N이고, Xaa155는 D이고, Xaa198은 Y이고, Xaa199는 P이거나 (여기서, 서열 번호 171은 C에 의한 A59 및 G71의 치환을 포함함);
- Xaa55는 Q이고, Xaa147은 P이고, Xaa149는 N이고, Xaa155는 D이고, Xaa198은 G이고, Xaa199는 결실되거나 (여기서, 서열 번호 171은 C에 의한 S76 및 S79의 치환을 포함함);
- Xaa55는 Q이고, Xaa147은 P이고, Xaa149는 N이고, Xaa155는 D이고, Xaa198은 Y이고, Xaa199는 P이거나 (여기서, 서열 번호 171은 C에 의한 S76 및 S79의 치환을 포함함);
- Xaa55는 Q이고, Xaa147은 P이고, Xaa149는 N이고, Xaa155는 D이고, Xaa198은 G이고, Xaa199는 결실되거나 (여기서, 서열 번호 171은 C에 의한 G108 및 L142의 치환을 포함함);
- Xaa55는 Q이고, Xaa147은 P이고, Xaa149는 N이고, Xaa155는 D이고, Xaa198은 Y이고, Xaa199는 P이거나 (여기서, 서열 번호 171은 C에 의한 G108 및 L142의 치환을 포함함);
- Xaa55는 Q이고, Xaa147은 P이고, Xaa149는 N이고, Xaa155는 C이고, Xaa198은 G이고, Xaa199는 결실되거나 (여기서, 서열 번호 171은 C에 의한 D107의 치환을 포함함); 또는
- Xaa55는 Q이고, Xaa147은 P이고, Xaa149는 N이고, Xaa155는 C이고, Xaa198은 Y이고, Xaa199는 P (여기서, 서열 번호 171은 C에 의한 D107의 치환을 포함함)인 변이체. - 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, N-말단에 하나 이상의 추가 아미노산을 추가로 포함하는 변이체.
- 제9항에 있어서, 상기 하나 이상의 추가 아미노산은 G, A, N 및 C로 이루어진 군으로부터 선택되는 변이체.
- 서열 번호 269, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 61, 62, 63, 64, 69, 70, 71, 72, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159 160, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 230, 231, 232, 233, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 268, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 322, 323, 324, 325, 326, 327 및 328 중 하나에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지며, 선택적으로, 돌연변이 G141S 및/또는 돌연변이 P174L을 추가로 포함하고, 아미노산의 넘버링(numbering)은 서열 번호 1에 따른 것인 인간 FGF21의 변이체.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 성숙 인간 야생형 FGF21 (서열 번호 2)과 비교하여 인간 및/또는 쥐과 혈장에서 증가된 단백질 분해 안정성을 갖는 변이체.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 성숙 인간 야생형 FGF21 (서열 번호 2)과 비교하여 증가된 열안정성을 갖는 변이체.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 미토겐-활성화 단백질 키나아제(mitogen-activated protein kinase; MAPK) ERK1/2의 인산화를 유도하는 변이체.
- 제14항에 있어서, 예를 들어 세포 내 웨스턴(In-Cell Western; ICW) 분석법으로 결정할 경우 100 nmol/L 이하, 또는 90 nmol/L 이하, 또는 80 nmol/L 이하, 또는 70 nmol/L 이하, 또는 60 nmol/L 이하, 또는 50 nmol/L 이하, 또는 40 nmol/L 이하, 또는 30 nmol/L 이하, 또는 20 nmol/L 이하, 또는 15 nmol/L 이하, 또는 12 nmol/L 이하, 또는 11 nmol/L 이하, 또는 10 nmol/L 이하, 또는 9 nmol/L 이하, 또는 8 nmol/L 이하, 또는 7 nmol/L 이하, 또는 6 nmol/L 이하, 또는 5 nmol/L 이하, 또는 4 nmol/L 이하, 또는 3 nmol/L 이하, 또는 2 nmol/L 이하의 EC50으로 미토겐-활성화 단백질 키나아제 (MAPK) ERK1/2의 인산화를 유도하는 변이체.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 변이체의 검출 및/또는 단리를 허용하는 하나 이상의 표지체 또는 태그를 추가로 포함하는 변이체.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 반감기 연장 모듈에 융합되거나 콘쥬게이션된(conjugated) 변이체.
- 제17항에 있어서, 반감기 연장 모듈은 중합체 (예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 히드록시에틸 전분 (HES), 히알루론산, 폴리시알산), 비구조화 (폴리-)펩티드 사슬 (예를 들어, PAS, XTEN), 엘라스틴-유사 폴리펩티드(elastin-like polypeptide; ELP), 혈청 단백질 (예를 들어, 알부민), 혈청 단백질 결합 분자 (예를 들어, 알부민 결합 단백질(albumin binding domain; ABD), 알부민 결합 지방산), 항체, 면역글로불린, 면역글로불린의 Fc 영역/도메인 및 면역글로불린 결합 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 변이체.
- 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 인간 FGF21의 변이체 및 하나 이상의 기타 활성 제약 성분을 포함하는 융합 분자.
- 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 인간 FGF21의 변이체 또는 제19항에 따른 융합 분자를 코딩하는 핵산 분자.
- 제20항에 있어서, 벡터 내에 포함되거나 게놈 내로 통합된 핵산 분자.
- 제20항 또는 제21항에 따른 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포.
- 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 인간 FGF21의 변이체 또는 제19항에 따른 융합 분자를 제조하는 방법으로서, 제22항에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계 및 변이체 또는 융합 분자를 배양 배지로부터 단리하는 단계를 포함하는 방법.
- 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 인간 FGF21의 변이체 또는 제19항에 따른 융합 분자 또는 제20항 또는 제21항에 따른 핵산 분자 또는 제22항에 따른 숙주 세포를 제약상 허용가능한 담체 및/또는 부형제와 함께 포함하는 제약 조성물.
- 제24항에 있어서, 하나 이상의 기타 활성 제약 성분을 추가로 포함하는 제약 조성물.
- 상기 하나 이상의 기타 활성 제약 성분은 인슐린 및 인슐린 유도체, GLP-1, GLP-1 유사체 및 GLP-1 수용체 작용제, 중합체 결합된 GLP-1 및 GLP-1 유사체, 이중 GLP-1/GIP 작용제, 이중 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제, PYY3-36 또는 이의 유사체, 췌장 폴리펩티드 또는 이의 유사체, 글루카곤 수용체 작용제 또는 길항제, GIP 수용체 작용제 또는 길항제, 그렐린 길항제 또는 역작용제, 제닌 및 이의 유사체, DDP-IV 억제제, SGLT-2 억제제, 이중 SGLT-2/SGLT-1 억제제, 비구아니드, 티아졸리딘디온, PPAR 작용제, PPAR 조절제, 술포닐우레아, 메글리티니드, 알파-글루코시다아제 억제제, 아밀린 및 아밀린 유사체, GPR119 작용제, GPR40 작용제, GPR120 작용제, GPR142 작용제, TGR5 작용제, AMPK 자극제, AMPK 활성제, 11-베타-HSD의 억제제, 글루코키나아제의 활성제, DGAT의 억제제, 단백질 티로신 포스파타제 1의 억제제, 글루코스-6-포스파타아제의 억제제, 프룩토스-1,6-비스포스파타아제의 억제제, 글리코겐 포스포릴라아제의 억제제, 포스포에놀 피루베이트 카르복시키나아제의 억제제, 글리코겐 신타아제 키나아제의 억제제, 피루베이트 데히드로게나아제 키나아제의 억제제, CCR-2 길항제, 글루코스 수송체-4의 조절제, 소마토스타틴 수용체 3 작용제, HMG-CoA-리덕타아제 억제제, 피브레이트, 니코틴산 및 이의 유도체, 니코틴산 수용체 1 작용제, ACAT 억제제, 콜레스테롤 흡수 억제제, 담즙산-결합 물질, IBAT 억제제, MTP 억제제, PCSK9의 조절제, LDL 수용체 상향조절제 (간 선택적 갑상선 호르몬 수용체 베타 작용제), HDL-상승 화합물, 지질 대사 조절제, PLA2 억제제, ApoA-I 증강제(enhancer), 콜레스테롤 합성 억제제, 오메가-3 지방산 및 이의 유도체, 비만의 치료를 위한 활성 물질, CB1 수용체 길항제, MCH-1 길항제, MC4 수용체 작용제 및 부분 작용제, NPY5 또는 NPY2 길항제, NPY4 작용제, 베타-3 아드레날린 수용체 작용제, 렙틴 또는 렙틴 모방체, 5HT2c 수용체 작용제, 리파아제 억제제, 혈관형성 억제제, H3 길항제, AgRP 억제제, 삼중 모노아민 섭취 억제제, MetAP2 억제제, 섬유모세포 성장 인자 수용체 4 또는 프로히비틴 표적화 펩티드-1의 생산에 대한 안티센스 올리고누클레오티드, 고혈압, 만성 심부전 또는 아테롬성 동맥 경화증에 영향을 미치게 하기 위한 약물, 안지오텐신 II 수용체 길항제, 이중 안지오텐신 수용체 차단제(ARB), 안지오텐신 전환 효소(ACE) 억제제, 안지오텐신 전환 효소 2(ACE-2) 활성제, 레닌 억제제, 프로레닌 억제제, 엔도텔린 전환 효소(ECE) 억제제, 엔도텔린 수용체 차단제, 엔도텔린 길항제, 이뇨제, 알도스테론 길항제, 알도스테론 합성효소 억제제, 알파-차단제, 알파-2 아드레날린 수용체의 길항제, 베타-차단제, 혼합된 알파-/베타-차단제, 칼슘 길항제/칼슘 채널 차단제(CBB), 이중 미네랄코르티코이드/CCB, 중추 작용성 항고혈압제, 중성 엔도펩티다아제의 억제제, 아미노펩티다아제-A 억제제, 바소펩티드(vasopeptide) 억제제, 이중 바소펩티드 억제제, 네프릴리신-ACE 억제제, 네프릴리신-ECE 억제제, 이중-작용 안지오텐신 (AT) 수용체-네프릴리신 억제제, 이중 AT1/엔도텔린-1 (ETA) 길항제, 최종 당화 산물(advanced glycation end-product) 분해제, 재조합 레날라아제, 혈압 백신, 항-RAAS 백신, AT1-백신 또는 AT2-백신, 항고혈압 반응을 갖는 유전자 다형성의 조절제, 및 혈소판 응집 억제제로 이루어진 군으로부터 선택되는, 제19항에 따른 융합 분자 또는 제25항에 따른 제약 조성물.
- 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 인간 FGF21의 변이체 또는 제19항 또는 제26항에 따른 융합 분자 또는 제20항 또는 제21항에 따른 핵산 분자 또는 제22항에 따른 숙주 세포 또는 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 제약 조성물을 포함하는 키트.
- 의약으로 사용하기 위한, 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 인간 FGF21의 변이체 또는 제19항 또는 제26항에 따른 융합 분자 또는 제20항 또는 제21항에 따른 핵산 분자 또는 제22항에 따른 숙주 세포 또는 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 제약 조성물.
- 비만, 과체중, 대사 증후군, 진성 당뇨병, 고혈당증, 이상지질혈증, 비알코올성 지방간염 (NASH) 및 아테롬성 동맥경화증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환 또는 장애의 치료에 사용하기 위한, 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 인간 FGF21의 변이체 또는 제19항 또는 제26항에 따른 융합 분자 또는 제20항 또는 제21항에 따른 핵산 분자 또는 제22항에 따른 숙주 세포 또는 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 제약 조성물.
- 비만, 과체중, 대사 증후군, 진성 당뇨병, 고혈당증, 이상지질혈증, 비알코올성 지방간염 (NASH) 및 아테롬성 동맥경화증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환 또는 장애의 치료를 위한 의약의 제조에 있어서의, 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 인간 FGF21의 변이체 또는 제19항 또는 제26항에 따른 융합 분자 또는 제20항 또는 제21항에 따른 핵산 분자 또는 제22항에 따른 숙주 세포 또는 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 제약 조성물의 용도.
- 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 인간 FGF21의 변이체 또는 제19항 또는 제26항에 따른 융합 분자 또는 제20항 또는 제21항에 따른 핵산 분자 또는 제22항에 따른 숙주 세포 또는 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 제약 조성물을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 비만, 과체중, 대사 증후군, 진성 당뇨병, 고혈당증, 이상지질혈증, 비알코올성 지방간염 (NASH) 및 아테롬성 동맥경화증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환 또는 장애를 치료하는 방법.
- 질환 또는 장애는 진성 당뇨병인, 제29항에 따른 사용을 위한 변이체 또는 융합 분자 또는 핵산 분자 또는 숙주 세포 또는 제약 조성물 또는 제30항에 따른 용도 또는 제31항에 따른 방법.
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