KR20180083394A - 게놈 변형을 위한 안정화된 시약 - Google Patents
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Abstract
본 개시내용은 일반적으로 세포의 유전적 변형을 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 특히, 본 개시내용은 게놈 변경을 위한 안정화된 시약(예를 들어, 부위 특이적 뉴클레아제), 및 비유전적 코드 변경 변형(예를 들어, DNA 메틸화)을 위한 안정화된 시약에 관한 것이다. 안정화 방법은 적합한 온도에서의 시약의 저장, 건조 형태로의 전환 및 화학적 변형을 포함한다.
Description
기술분야
본 개시내용은 일반적으로 세포의 유전적 변형을 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 특히, 본 개시내용은 게놈 변경을 위한 안정화된 시약(예를 들어, 부위 특이적 뉴클레아제), 및 비유전적 코드 변경 변형(예를 들어, DNA 메틸화)을 위한 안정화된 시약에 관한 것이다. 안정화 방법은 적합한 온도에서의 시약의 저장, 건조 형태로의 전환 및 화학적 변형을 포함한다.
다수의 게놈 상호작용 시스템, 예컨대 디자이너 아연 핑거, 전사 활성자 유사 효과기(transcription activator-like effector: TAL), CRISPR 및 호밍 메가뉴클레아제가 개발되었다. 이 시스템에 의한 하나의 논쟁은 이것이 변경을 위한 표적 부위의 식별 및 이 부위에 특이적인 시약의 설계 둘 다에 필요하다는 것이고, 이것은 대개 고되고 시간 소모적이다. 일 양태에서, 본 발명은 게놈 상호작용 시약의 효율적인 설계, 제조 및 사용을 허용한다.
본 개시내용은, 부분적으로, 핵산 분자의 변형을 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 게놈을 변경시키기 위한 효율적인 시스템 및 기법에 대한 실질적인 수요가 존재한다. 본 발명은 이 수요를 해결하고, 관련 이점을 제공한다.
몇몇 양태에서, 본 발명은 1개 이상(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 등)의 안정화된 유전자 변경 시약(stabilized gene altering reagent)을 제조하는 방법, 및 이러한 방법에 의해 제조된 안정화된 유전자 변경 시약을 포함한다. 몇몇 경우에, 이 방법은 (a) 용매 중에 1종 이상의 유전자 변경 시약을 제조하는 단계 및 (b) (a)의 용매의 80% 초과분을 제거하는 단계를 포함한다. 추가로, 용매는 수성 유기 용매(예를 들어, 1종 이상의 알코올) 또는 수성 용매와 1종 이상의 유기 용매의 혼합물일 수 있다. 용매는 동결건조(lyophilization), 분무 건조, 분무 냉동 건조(spray freeze drying), 초임계 유체 건조 또는 진공 원심분리를 포함하는 임의의 수의 수단에 의해 제거될 수 있다. 몇몇 경우에, 용매의 80% 내지 99.5%(예를 들어, 약 80% 내지 약 95%, 약 80% 내지 약 90%, 약 85% 내지 약 95%, 약 85% 내지 약 99%, 약 90% 내지 약 99%, 약 90% 내지 약 98%, 약 90% 내지 약 97%, 약 90% 내지 약 96%, 약 93% 내지 약 99% 등)가 1종 이상의 유전자 변경 시약으로부터 제거될 수 있다.
몇몇 경우에, 1종 이상의 유전자 변경 시약 중 적어도 하나는 (a) TAL 효과기-뉴클레아제 융합 단백질, (b) TAL 효과기-뉴클레아제 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자, (c) 아연 핑거-뉴클레아제 융합 단백질, (d) 아연 핑거-뉴클레아제 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자, (e) Cas9 단백질, (f) Cas9 단백질을 코딩하는 핵산 분자, (g) 가이드 RNA 및 (h) 가이드 RNA를 코딩하는 핵산 분자로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 시약일 수 있다.
몇몇 경우에, 개별 유전자 변경 시약은 다중웰 플레이트의 2개 이상의 웰에 배치된다. 추가로, 개별 유전자 변경 시약은 용매 중에 가용화된 채 다중웰 플레이트의 웰에 첨가될 수 있다. 또한, 용매 중 일부 또는 전부는 개별 유전자 변경 시약으로부터 제거될 수 있는 한편, 개별 유전자 변경 시약은 다중웰 플레이트의 웰에 있다.
1종 이상의 도너 핵산 분자(예를 들어, 도너 DNA)는 유전자 변경 시약과 동시 혼합될 수 있다. 예를 들어, 상이한 인서트가 특정한 염색체 유전좌위로 도입된 세포를 제조할 수 있다. 따라서, 본 발명은 상이한 핵산 분절이 특정한 유전좌위에서 도입되는 세포의 "라이브러리"를 포함한다. 몇몇 경우에, 도너 핵산 분자의 수는 약 2개 내지 약 10,000개(예를 들어, 약 5개 내지 약 10,000개, 약 20개 내지 약 10,000개, 약 50개 내지 약 10,000개, 약 90개 내지 약 10,000개, 약 200개 내지 약 10,000개, 약 400개 내지 약 10,000개, 약 800개 내지 약 10,000개, 약 2,000개 내지 약 10,000개, 약 2개 내지 약 10,000개, 약 100개 내지 약 1,000개, 약 200개 내지 약 3,000개, 약 150개 내지 약 1,500개 등)일 수 있다.
수집에 존재하는 유전자 변경 시약의 수는 크게 변할 수 있고, 약 2개 내지 약 10,000개(예를 들어, 약 5개 내지 약 10,000개, 약 20개 내지 약 10,000개, 약 50개 내지 약 10,000개, 약 90개 내지 약 10,000개, 약 200개 내지 약 10,000개, 약 400개 내지 약 10,000개, 약 800개 내지 약 10,000개, 약 2,000개 내지 약 10,000개, 약 2개 내지 약 10,000개, 약 100개 내지 약 1,000개, 약 200개 내지 약 3,000개, 약 150개 내지 약 1,500개 등)일 수 있다. 이러한 유전자 변경 시약은 하나 이상의 다중웰 플레이트의 상이한 웰에 배치될 수 있다. 많은 경우에, 이러한 개별 유전자 변경 시약은 동일한 유기체의 게놈의 상이한 뉴클레오타이드 서열에 결합할 것이다.
몇몇 경우에, 유전자 변경 시약과 접촉하는 용매(예를 들어, 수용액)는 (a) 1종 이상의 완충제, (b) 1종 이상의 프로테아제 저해제, (c) 1종 이상의 뉴클레아제 저해제, (d) 1종 이상의 염, (e) 1종 이상의 탄수화물, (f) 1종 이상의 형질감염 시약, (g) 1종 이상의 폴리아민 및 (h) 1종 이상의 배양 배지로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 성분을 함유할 수 있다. 특정한 경우에, 탄수화물은 수크로스, 트레할로스, 락토수크로스 또는 사이클로덱스트린 중 1종 이상이다.
추가로, 물의 제거 전의 용매(예를 들어, 수용액)의 pH는 4 내지 11(예를 들어, 약 4 내지 약 7, 약 4 내지 약 6.5, 약 4 내지 약 8, 약 6.5 내지 약 11, 약 6.5 내지 약 10, 약 7 내지 약 11, 약 7 내지 약 10 등)일 수 있다.
본 발명은 1종 이상의 유전자 변경 시약을 저장하는 방법, 및 이러한 방법에 의해 저장된 유전자 변경 시약을 추가로 포함한다. 몇몇 경우에, 이 방법은 (a) 수용액 중에 1종 이상의 유전자 변경 시약을 제조하는 단계, (b) (a)에서 제조된 수용액으로부터 90% 초과의 물을 제거하는 단계, 및 (c) 75% 초과의 유전자 변경 기능 활성도(gene altering functional activity)가 30일 저장 후 유지되는 조건 하에 1종 이상의 유전자 변경 시약을 놓는 단계를 포함한다. 특정한 경우에, 유전자 변경 기능 활성도의 75% 초과(예를 들어, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 등)는 적어도 30일 저장(예를 들어, 적어도 30일, 적어도 60일, 적어도 90일, 적어도 120일 등) 후 유지된다.
추가로, 1종 이상의 유전자 변경 시약 중 하나 초과는 동일한 저장 용기(예를 들어, 다중웰 플레이트)에서 저장될 수 있다. 개별적으로 저장된 유전자 변경 시약은 동일한 유기체의 게놈의 상이한 뉴클레오타이드 서열에 결합할 수 있다. 추가로, 1종 이상의 유전자 변경 시약은 -70℃, -20℃, 4℃ 또는 20℃ 내지 30℃(예를 들어, 약 -70℃ 내지 약 30℃, 약 -22℃ 내지 약 30℃, 약 2℃ 내지 약 30℃, 약 -4℃ 내지 약 30℃, 약 -10℃ 내지 약 30℃, 약 -15℃ 내지 약 30℃, 약 -22℃ 내지 약 10℃ 등)에서 저장될 수 있다.
본 발명은 1종 이상의 안정화된 유전자 변경 시약을 포함하는 조성물을 추가로 포함한다. 이러한 조성물은 1종 이상의 유전자 변경 시약을 포함하고, 유전자 변경 시약의 수분 함량은 10%(w/w) 미만(예를 들어, 약 0.3% 내지 약 7%, 약 0.5% 내지 약 8%, 약 0.5% 내지 약 5%, 약 0.2% 내지 약 4%, 약 0.2% 내지 약 3% 등)이다.
추가로, 본 발명의 조성물은 (a) TAL 효과기-뉴클레아제 융합 단백질, (b) TAL 효과기-뉴클레아제 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자, (c) 아연 핑거-뉴클레아제 융합 단백질, (d) 아연 핑거-뉴클레아제 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자, (e) Cas9 단백질, (f) Cas9 단백질을 코딩하는 핵산 분자, (g) 가이드 RNA 및 (h) 가이드 RNA를 코딩하는 핵산 분자로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 유전자 변경 시약 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. 상기 기재된 바대로, 1종 이상의 도너 핵산 분자(예를 들어, 도너 DNA)는 유전자 변경 시약과 동시 혼합될 수 있다.
본 명세서에 개시된 원칙 및 이점의 더 완전한 이해를 위해, 동반된 도면과 함께 취해진 하기 설명을 이제 참조하고, 여기서
도 1은 본 발명의 몇몇 양태의 대표적인 다이어그램이다. 이 다이어그램은 단일 성분에 대한 시약(예를 들어, 아연 핑거 및 TAL 시스템) 및 다성분 유전자 변경 시스템(예를 들어, CRISPR 시스템, 예컨대 Cas9 및 Cpf1 시스템)의 예를 보여준다. 대표적인 단일 성분 시스템에 대한 시약은 DNA, mRNA 및 단백질일 수 있다. 이들 중 임의의 하나 이상은 게놈 변경을 위해 세포로 도입될 수 있다. 대표적인 다성분 시스템에 대한 시약은 DNA, RNA, 및/또는 단백질일 수 있다. 이들 중 하나 또는 둘 다는 게놈 변경을 위해 세포로 도입될 수 있다. DNA 및 mRNA 시약은 이들이 기능적 RNA(예를 들어, gRNA) 또는 단백질(예를 들어, Cas9, Cpf1, 아연 핑거 뉴클레아제 또는 Tal 뉴클레아제)로 전환되는 전구체로서 세포에 진입한다.
도 2는 본 발명의 일 양태에서 사용하기 위한 예시적인 플레이트 포맷을 보여준다. 플레이트는 웰의 6x8 어레이를 함유하고, 각각의 웰은 숫자 및 철자 조합에 의해 확인된다. 웰 A,1 및 A,6은 유전자 변경 시약을 함유하지 않고, 이에 따라 대조군 웰이다.
도 3은 대표적인 천연 발생 TAL 단백질의 모듈식 구조의 도식적 도면이다. 이 단백질은 아미노 말단 끝(N), 염기 우선성을 결정하는 12번 및 13번 위치에서의 초가변 잔기를 가지는 타원형으로 표시된 34개 아미노산 반복의 가변적인 수를 포함하는 중앙 어레이 및 핵 국재화 신호(nuclear localization signal: NLS) 및 전사 활성자(AD) 도메인을 포함하는 카복실 말단 끝(C)으로 이루어진다.
도 4는, Cas9 단백질 및 표적 게놈 유전좌위 둘 다에 결합된 가이드 RNA를 보여주는, 가이드 RNA 분자(104개의 뉴클레오타이드)의 도식이다. 헤어핀 영역 1은 뉴클레오타이드 GAAA에 의해 연결된 상보성 crRNA 및 tracrRNA 영역의 혼성화에 의해 형성된다. 헤어핀 영역 2는 tracrRNA의 3' 부분에서의 상보성 영역에 의해 형성된다.
도 5는 DNA 올리고 주형을 사용하여 가이드 RNA를 합성하기 위한 워크플로우를 보여준다. 가이드 RNA 코딩 DNA 주형은 어셈블리 PCR을 이용하여 생성된다. 이 어셈블리 반응의 성분은 1) (crRNA 영역을 코딩하는) 표적 특이적 DNA 올리고, 2) 시험관내 전사에 사용된 박테리아 프로모터(이 경우에 T7 프로모터)에 특이적인 DNA 올리고 및 3) tracrRNA 영역을 코딩하는 중첩하는 PCR 생성물을 포함한다. 전장 gRNA 코딩 주형을 생성하도록 DNA 중합효소 효소(이 경우에 고 충실도 PHUSION(등록상표) Taq DNA 중합효소)를 사용하여 유전자증폭기(Thermo cycler)에서 반응에서의 충전, 이어서 PCR 증폭을 수행한다. PCR 어셈블리 후, 비코딩 RNA 합성(이 경우에 MEGSHORTSCRIPT(상표명) T7 키트)에 대한 시험관내 전사 시약을 사용하여 표적 특이적 gRNA를 생성하도록 생성된 DNA 주형은 37℃에서 전사된다. 합성 후, 칼럼 또는 자기 비드 기반 방법을 이용하여 생성된 gRNA를 정제한다. 정제된 시험관내 전사된 가이드 RNA는 관심 있는 숙주 시스템 또는 세포주에서의 Cas9 단백질 또는 mRNA 전달에 의해 동시형질감염에 준비된다.
도 6은 CRISPR 시스템을 사용한 니킹(nicking) 기반 핵산 절단 전략을 보여주는 도식이다. 도면의 상부 부분에서, 2개의 선은 이중 가닥 핵산을 나타낸다. 2개의 닉 부위(nick site)는 부위 1 및 부위 2로 표시된다. 이 부위는 CRISPR/Cas9 복합체와 상호작용하는 핵산의 영역을 나타내는 실선 또는 파선 박스 내에 위치한다. 도면의 하부 부분은 가닥 둘 다에서 2개의 가깝게 위치한 닉을 생성시키는 니킹 작용을 보여준다.
도 7은 건조 및 동결건조의 재구성 시 U2OS-Cas9 세포주에서의 IVT 가이드 RNA의 절단 효율을 보여준다. 가이드 RNA는 CPFS1 T2로 표지된 웰에 없다.
도 1은 본 발명의 몇몇 양태의 대표적인 다이어그램이다. 이 다이어그램은 단일 성분에 대한 시약(예를 들어, 아연 핑거 및 TAL 시스템) 및 다성분 유전자 변경 시스템(예를 들어, CRISPR 시스템, 예컨대 Cas9 및 Cpf1 시스템)의 예를 보여준다. 대표적인 단일 성분 시스템에 대한 시약은 DNA, mRNA 및 단백질일 수 있다. 이들 중 임의의 하나 이상은 게놈 변경을 위해 세포로 도입될 수 있다. 대표적인 다성분 시스템에 대한 시약은 DNA, RNA, 및/또는 단백질일 수 있다. 이들 중 하나 또는 둘 다는 게놈 변경을 위해 세포로 도입될 수 있다. DNA 및 mRNA 시약은 이들이 기능적 RNA(예를 들어, gRNA) 또는 단백질(예를 들어, Cas9, Cpf1, 아연 핑거 뉴클레아제 또는 Tal 뉴클레아제)로 전환되는 전구체로서 세포에 진입한다.
도 2는 본 발명의 일 양태에서 사용하기 위한 예시적인 플레이트 포맷을 보여준다. 플레이트는 웰의 6x8 어레이를 함유하고, 각각의 웰은 숫자 및 철자 조합에 의해 확인된다. 웰 A,1 및 A,6은 유전자 변경 시약을 함유하지 않고, 이에 따라 대조군 웰이다.
도 3은 대표적인 천연 발생 TAL 단백질의 모듈식 구조의 도식적 도면이다. 이 단백질은 아미노 말단 끝(N), 염기 우선성을 결정하는 12번 및 13번 위치에서의 초가변 잔기를 가지는 타원형으로 표시된 34개 아미노산 반복의 가변적인 수를 포함하는 중앙 어레이 및 핵 국재화 신호(nuclear localization signal: NLS) 및 전사 활성자(AD) 도메인을 포함하는 카복실 말단 끝(C)으로 이루어진다.
도 4는, Cas9 단백질 및 표적 게놈 유전좌위 둘 다에 결합된 가이드 RNA를 보여주는, 가이드 RNA 분자(104개의 뉴클레오타이드)의 도식이다. 헤어핀 영역 1은 뉴클레오타이드 GAAA에 의해 연결된 상보성 crRNA 및 tracrRNA 영역의 혼성화에 의해 형성된다. 헤어핀 영역 2는 tracrRNA의 3' 부분에서의 상보성 영역에 의해 형성된다.
도 5는 DNA 올리고 주형을 사용하여 가이드 RNA를 합성하기 위한 워크플로우를 보여준다. 가이드 RNA 코딩 DNA 주형은 어셈블리 PCR을 이용하여 생성된다. 이 어셈블리 반응의 성분은 1) (crRNA 영역을 코딩하는) 표적 특이적 DNA 올리고, 2) 시험관내 전사에 사용된 박테리아 프로모터(이 경우에 T7 프로모터)에 특이적인 DNA 올리고 및 3) tracrRNA 영역을 코딩하는 중첩하는 PCR 생성물을 포함한다. 전장 gRNA 코딩 주형을 생성하도록 DNA 중합효소 효소(이 경우에 고 충실도 PHUSION(등록상표) Taq DNA 중합효소)를 사용하여 유전자증폭기(Thermo cycler)에서 반응에서의 충전, 이어서 PCR 증폭을 수행한다. PCR 어셈블리 후, 비코딩 RNA 합성(이 경우에 MEGSHORTSCRIPT(상표명) T7 키트)에 대한 시험관내 전사 시약을 사용하여 표적 특이적 gRNA를 생성하도록 생성된 DNA 주형은 37℃에서 전사된다. 합성 후, 칼럼 또는 자기 비드 기반 방법을 이용하여 생성된 gRNA를 정제한다. 정제된 시험관내 전사된 가이드 RNA는 관심 있는 숙주 시스템 또는 세포주에서의 Cas9 단백질 또는 mRNA 전달에 의해 동시형질감염에 준비된다.
도 6은 CRISPR 시스템을 사용한 니킹(nicking) 기반 핵산 절단 전략을 보여주는 도식이다. 도면의 상부 부분에서, 2개의 선은 이중 가닥 핵산을 나타낸다. 2개의 닉 부위(nick site)는 부위 1 및 부위 2로 표시된다. 이 부위는 CRISPR/Cas9 복합체와 상호작용하는 핵산의 영역을 나타내는 실선 또는 파선 박스 내에 위치한다. 도면의 하부 부분은 가닥 둘 다에서 2개의 가깝게 위치한 닉을 생성시키는 니킹 작용을 보여준다.
도 7은 건조 및 동결건조의 재구성 시 U2OS-Cas9 세포주에서의 IVT 가이드 RNA의 절단 효율을 보여준다. 가이드 RNA는 CPFS1 T2로 표지된 웰에 없다.
정의:
본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "핵산 변경"은 유전적 코드 또는 비-코드 기반 핵산 변형에 대한 변경 또는 변화를 의미한다. 유전적 코드 변경은 핵산 분자의 뉴클레오타이드 서열 변화를 의미한다. 비-코드 기반 핵산 변경은 핵산 변형, 예컨대 뉴클레오타이드 서열 변경을 수반하지 않는 메틸화, 및 유전자 발현의 변경을 발생시키는 변형(예를 들어, 히스톤 아세틸화, 프로모터 활성화, 프로모터 억제 등)을 의미한다. 따라서, 기능적 TAL-VP16 융합 단백질은 DNA의 전사에 관여될 때 비-코드 기반 핵산 변경을 발생시킬 것이다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "유전자 변경 시약"은 하나 이상의 핵산 변경 활성을 가지거나, 하나 이상의 핵산 변경 활성을 가지는 복합체의 성분을 함유하는 조성물을 의미한다. 예시적인 유전자 변경 시약은 기능적 아연 핑거-FokI 융합 단백질, 기능적 TAL-VP16 융합 단백질 및 표적 핵산 분자의 특이적 뉴클레오타이드 영역인 Cas9 단백질을 지시할 수 있는 gRNA 분자를 함유하는 시약이다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "안정화된 유전자 변경 시약"은 기능적 활성의 최소 손실로 시간의 기간 동안 저장될 수 있는 시약을 의미한다. 이 정의와 관련된 매개변수는 본 명세서에 기재되어 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "CRISPR 시스템"은, 조합될 때, 적어도 CRISPR 연관된 활성(예를 들어, 이중 가닥 DNA의 표적 유전좌위 특이적, 이중 가닥 절단)을 발생시키는 CRISPR 단백질 및 핵산의 수집품을 의미한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "CRISPR 복합체"는 기능적 활성을 가지는 응집체를 형성하도록 서로와 회합하는 CRISPR 단백질 및 핵산(예를 들어, RNA)을 의미한다. CRISPR 복합체의 예는 표적 유전좌위에 특이적인 가이드 RNA에 결합된 야생형 Cas9(때때로 Csn1이라 칭함) 단백질이다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "CRISPR 단백질"은 핵산(예를 들어, RNA) 결합 도메인 핵산 및 효과기 도메인(예를 들어, Cas9, 예컨대 스트렙토코커스 파이오게네스(Streptococcus pyogenes) Cas9)을 포함하는 단백질을 의미한다. 핵산 결합 도메인은 원하는 표적 핵산(예를 들어, 가이드 RNA)에 혼성화할 수 있는 영역을 가지는 제1 핵산 분자와 상호작용하거나, 원하는 표적 핵산(예를 들어, crRNA)에 혼성화할 수 있는 영역을 가지는 제2 핵산과의 회합을 허용한다. CRISPR 단백질은 뉴클레아제 도메인(즉, DNase 또는 RNase 도메인), 추가 DNA 결합 도메인, 헬리카제 도메인, 단백질-단백질 상호작용 도메인, 이합체화 도메인, 및 다른 도메인을 또한 포함할 수 있다.
CRISPR 단백질은 또한 상기에 언급된 제1 핵산 분자에 결합하는 복합체를 형성하는 단백질을 의미한다. 따라서, 하나의 CRISPR 단백질은 예를 들어 가이드 RNA에 결합할 수 있고, 또 다른 단백질은 엔도뉴클레아제 활성을 가질 수 있다. 이들은 모두 CRISPR 단백질인 것으로 생각되는데, 왜냐하면 이들이 단일 단백질, 예컨대 Cas9와 동일한 기능을 수행하는 복합체의 일부로서 작용하기 때문이다.
많은 경우에, CRISPR 단백질은 이것이 핵으로 운반되게 하는 핵 국재화 신호(NLS)를 함유할 것이다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "전사 조절 서열"은 (1) 메신저 RNA로의 1개 이상(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 7개, 10개 등)의 구조적 유전자의 전사 또는 (2) 비번역된 RNA로의 하나 이상의 유전자의 전사를 조절하도록 작용하는, 임의의 구성 또는 기하구조의, 핵산 분자에 함유된, 뉴클레오타이드의 기능적 스트레치를 의미한다. 전사 조절 서열의 예는 프로모터, 인핸서, 리프레서 등을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "프로모터"는 전사 조절 서열의 예이고, 구체적으로 출발 코돈에 근접하게 위치한 유전자의 5' 영역으로 일반적으로 기재된 핵산 또는 비번역된 RNA를 코딩하는 핵산이다. 인접한 핵산 분절의 전사는 프로모터 영역에서 개시된다. 억제성 프로모터의 전사 속도는 억제제에 반응하여 감소한다. 유도성 프로모터의 전사 속도는 유도제에 반응하여 증가한다. 구성적 프로모터의 전사 속도는 일반 대사 조건의 영향 하에 변할 수 있으므로 구체적으로 조절되지 않는다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "벡터"는 인서트에 유용한 생물학적 또는 생화학적 특성을 제공하는 핵산 분자(예를 들어, DNA)를 의미한다. 예는 플라스미드, 파지, 자가 복제 서열(autonomously replicating sequence: ARS), 동원체, 및 시험관내 또는 숙주 세포에서 복제할 수 있거나 복제될 수 있거나, 숙주 세포 내의 원하는 위치로 원하는 핵산 분절을 운반하는 다른 서열을 포함한다. 벡터는, 벡터의 본질적인 생물학적 기능의 소실 없이 서열이 결정 가능한 방식으로 절단될 수 있고, 복제 및 클로닝을 일으키도록 핵산 단편이 스플라이싱될 수 있는, 1개 이상(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 7개, 10개 등)의 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위를 가질 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "핵산 표적화 역량은" 서열 특이적 방식으로 핵산을 인식하고/하거나 이와 회합하는 분자 또는 분자의 복합체의 능력을 의미한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "표적 유전좌위"는 유전자 변경 시약 상호작용(예를 들어, 결합 및 절단)을 위한 핵산 분자 내의 부위를 의미한다. 유전자 변경 시약이 이중 가닥 핵산을 절단하도록 설계될 때, 표적 유전좌위는 CRISPR 복합체가 인식하는 절단 부위 및 둘러싸는 영역이다. 유전자 변경 시약이 이중 가닥 파괴를 생성하도록 가깝게 근접한 이중 가닥 핵산을 니킹하도록 설계될 때, 파괴 점을 둘러싸고 포함하는 영역은 표적 유전좌위라 칭해진다.
개관:
본 발명은, 부분적으로, 게놈 변경을 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 이러한 시약을 제조하고 사용하기 위한 안정화된 시약 및 방법에 관한 것이다. 안정화는 저장 조건(예를 들어, 온도, 습도 등) 또는 저장되는 시약(예를 들어, 화학적으로 변형된 뉴클레오타이드, 완충제, 환원제의 존재 등)의 화학 특징으로부터 생길 수 있다.
예시의 목적을 위해 도 1에 기재된 도식적 표시를 이용하여, 유전자 변경 시약의 2개의 광범위한 카테고리를 제조할 수 있다: 단일 성분 및 다성분. 단일 성분 유전자 변경 시약은 유전자 변경 기능적 성분이거나, 유전자 변경 기능적 성분을 코딩하는 시약을 의미한다. 따라서, 단일 성분 시스템은 통상적으로 DNA, RNA 또는 단백질을 포함할 것이다. 시약이 DNA일 때, 이 DNA는 통상적으로 세포로 도입될 것이고, 여기서 이것은 전사되어 mRNA를 형성한다. 이후, mRNA는 번역되어 유전자 변경 기능적 성분으로서의 단백질(예를 들어, 아연 핑거 단백질 또는 TAL 단백질)을 생성한다.
다성분 시스템은 유전자 변경 활성을 위한 1개 초과의 성분을 요한다. 이 유형의 시스템의 하나의 예는 Cas9 기반 CRISPR 시스템이다. 이것과 같은 시스템은 유전자 변경 활성을 위한 단백질 성분(예를 들어, Cas9 단백질) 및 적어도 1개의 핵산 성분(예를 들어, gRNA)을 요한다. 단백질 성분은 단백질로서 세포로 도입되거나, 세포로 도입되는 mRNA 또는 DNA에 의해 코딩될 수 있다. 추가로, gRNA 또는 DNA 코딩 gRNA는 다성분 시스템의 1종 이상의 단백질 성분을 발현하는 세포로 도입될 수 있다.
대부분의 경우에, 목표는 (1) 1종 이상의 기능적 유전자 편집 시약, (2) 유전자 편집 시약을 코딩하는 1종 이상의 핵산 분자, 또는 (3) 유전자 변경 복합체 및 추가 유전자 변경 시약을 코딩하는 1종 이상의 핵산 분자를 형성하도록 준비된 1종 이상의 유전자 변경 시약의 조합을 세포로 도입하는 것일 것이다.
특히, 본 발명은 다른 핵산 분자와 상호작용하도록 설계된 단백질 및 핵산 분자의 조합을 의미한다. 몇몇 경우에, 본 발명은 핵산 분자를 표적화하도록 핵산 성분이 서열 상보성을 가지는 단백질/핵산 복합체를 의미한다. 이 시스템에서, 복합체화된 핵산과 표적 핵산 분자 사이의 서열 상보성은 복합체가 표적 핵산과 회합이 되게 하도록 이용된다. 이것이 발생하면, 복합체와 연관된 기능적 활성은 표적 핵산 분자를 변형시키도록 이용될 수 있다.
비화학적 안정화:
비화학적 안정화는 유전자 변경 시약(예를 들어, TAL 단백질, gRNA 등)의 기능적 성분의 화학적 변형을 수반하지 않는 안정화 수단을 의미한다.
비화학적 안정화의 다수의 수단은 본 발명의 실행에서 사용될 수 있다. 이러한 수단은 (a) 온도, (b) pH, (c) 이온 농도, (d) 다른 화합물과의 복합체화, (e) 단백질 및 핵산(예를 들어, 뉴클레아제, 저해제, 프로테아제 저해제 등)을 분해하는 효소를 저해하는 물질의 존재 및 (f) 건조를 포함한다.
몇몇 양태에서, 본 발명은 유전자 변경 시약을 함유하는 완전 건조 또는 동결건조된 조성물을 제조하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 오직 적은 양의 용매(예를 들어, 물)를 함유하는 시약은 일반적으로 아주 적은 생물학적 반응을 겪는 것으로 예상되고, 이에 따라 심지어 실온에서 비교적 안정한 것으로 예상된다.
다수의 방법이 샘플로부터 물을 제거하도록 이용되지만(예를 들어, 진공 또는 부분 진공 조건 하에 원심분리), 동결건조는 당해 분야에 공지된 방법에 따라 수행될 수 있다. 많은 경우에, 용매는 동결건조에 의해 제거될 것이다. 동결건조를 위한 프로토콜의 예는 (1) 5분에 +20℃로부터 -40℃로의 구배 온도 감소, (2) 3시간 동안 -40℃, (3) 30분에 -40℃로부터 -10℃로의 구배 온도 증가, (4) 4시간 동안 -10℃, (5) 15분에 -10℃로부터 +10℃로의 구배 온도 증가, (6) 2시간 동안 +10℃, (7) 15분분에 +10℃로부터 +30C℃로의 구배 온도 증가 및 (8) 4-8시간 동안 +30℃이다.
많은 경우에, 글라이세롤 및 세제는 소정의 건조 방법을 위한 유전자 변경 시약에 존재하지 않을 것이다. 예를 들어, 글라이세롤이 상기 언급된 동결건조 방법에 존재할 수 있지만, 이것은 바람직하지 않다.
완전 건조 또는 건조는 유전자 변경 시약을 안정화시키기 위해 이용될 수 있다. 통상적으로, 80% 초과의 유전자 변경 시약은 물이다. 이 물의 실질적인 부분의 제거는 안정화를 발생시킬 수 있다. 동결건조는 예를 들어 통상적으로 0.3% 내지 8%의 백분율로 용액의 수분 함량을 낮춘다. 따라서, 본 발명은 수분 함량이 약 0.1% 내지 약 10%, 약 0.5% 내지 약 10%, 약 1% 내지 약 10%, 약 0.1% 내지 약 7%, 약 0.1% 내지 약 5%, 약 0.5% 내지 약 5%, 약 0.5% 내지 약 4%, 약 0.3% 내지 약 6%, 약 0.3% 내지 약 4%, 약 0.3% 내지 약 3% 등인 유전자 변경 시약을 포함한다.
유전자 변경 시약을 건조시키는 것의 하나의 이점은 이것이 상온에서의 안정성을 증가시킨다는 것이다. 따라서, 일 양태에서, 본 발명은 유전자 변경 시약을 안정화시키는 방법, 및 이러한 방법에 의해 생성된 조성물을 제공한다.
몇몇 실시형태에서, 셀로비오스는 용매 제거 전에 제제 중에 50mM 내지 500mM의 농도로 안정화제로서 존재할 수 있다. 셀로비오스의 사용의 이점 중 하나는 이것이 생물학적 분자(예를 들어, 핵산 및 단백질)의 동결건조 및 보존 둘 다에 대한 효과적인 안정화제인 한편, 공지된 분야의 안정화제는 하나 또는 다른 목적을 위해 일반적으로 사용된다는 것이다. 또한, 많은 경우에, 염, 예컨대 KCl 또는 MgCl2는 용매 제거 전에 존재할 것이다.
다수의 수단은 또한 단백질의 분해를 저해하기 위해 이용될 수 있다. 하나는 1종 이상의 프로테아제 저해제(예를 들어, 페닐메틸설포닐 플루오라이드, 류펩틴 등)의 존재이다.
다수의 수단은 또한 RNA 분자를 포함하는 핵산 분자의 분해를 저해하기 위해 이용될 수 있다. 하나는 1종 이상의 RNase 저해제의 존재이다. SUPERase In(상표명) RNase Inhibitor(카탈로그 AM2694호), RNaseOUT(상표명)(카탈로그 10777-019호), 및 ANTI-RNase(카탈로그 AM2690호)(이들 모두 써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific.)으로부터 구입 가능)를 포함하는, 다수의 상업적으로 구입 가능한 RNase 저해제가 구입 가능하다.
바이러스로부터의 캡시드 단백질은 또한 핵산 분자를 안정화시키도록 사용될 수 있다. 이 바이러스는 DNA 바이러스 또는 RNA 바이러스일 수 있다. 예로서, gRNA 분자를 안정화시키고자 추구할 때, 단일 가닥 RNA 바이러스, 예컨대 코로나바이러스, SARS 바이러스, 폴리오바이러스, 리노바이러스, 및/또는 A형 간염 바이러스로부터의 캡시드 단백질을 사용할 수 있다.
추가로, gRNA는 Cas9 단백질과의 복합체화에 의해 안정화될 수 있다. 따라서, 본 발명은 핵산/단백질 복합체를 함유하는 안정화된 유전자 변경 시약을 포함한다. 추가로, 이러한 복합체는 이로부터 제거된 용매를 가질 수 있다.
화학적/BASE 안정화:
화학적 안정화는 유전자 변경 시약(예를 들어, TAL 단백질, gRNA 등)의 기능적 성분의 화학적 변형을 수반하는 안정화 수단을 의미한다.
본 발명의 실행에서 사용된 핵산 분자는 화학적으로 변형될 수 있다. 화학적 변형은 다수의 목적을 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, 화학적 변형은 저장 동안 핵산 분자(예를 들어, RNA 분자)를 안정화시키고/시키거나, 이의 세포내 반감기를 증가시키도록 이용될 수 있다. 추가로, 기능적 RNA 분자(예를 들어, gRNA 분자)와 관련하여, 헤어핀은 이의 구조를 안정화시키는 방식으로 변경될 수 있다. 이는 헤어핀의 형성을 증대시키는 염기의 선택(예를 들어, G/C 함량)에 의해 수행될 수 있다.
화학적 변형은 임의의 수의 화학적 기 및 위치일 수 있다. 특정한 화학적 변형의 적합성은 RNA 분자의 유형 및 화학적 기의 RNA 분자 내의 위치에 따라 변할 것이다.
화학적 변형은 염기 또는 염기간 연결일 수 있다. 예시적인 화학적 변형은 포스포로티오에이트 변형, 2'-O-메틸 변형, 2'-O-프로필 변형, 2'-O-에틸 변형, 2'-플루오로 변형, 및/또는 이러한 변형의 조합을 포함할 수 있다. 변형 당을 또한 사용할 수 있다. 변형 당은 D-리보스, 다이데옥시뉴클레오타이드, 2'-O-알킬(2'-O-메틸 및 2'-O-에틸 포함), 즉 2'-알콕시, 2'-아미노, 2'-S-알킬, 2'-할로(2'-플루오로 포함), 2'-메톡시에톡시, 2'-알릴옥시(-OCH2CH=CH2), 2'-프로파길, 2'-프로필, 에티닐, 에테닐, 프로페닐 및 사이아노 등을 포함한다.
본 발명의 실행에서 사용될 수 있는 추가 화학적 변형은 문헌[Hendel et al., Nature Biotech. doi:10.1038/nbt.3290 (2015) 및 Radhar et al., Proc . Nat'l. Acad . Sci . (USA) doi/10.1073/pnas.1520883112 (2015)]에서 발견될 수 있다.
화학적 변형은 또한 포스포다이에스터 유사체, 예컨대 포스포로티오에이트, 포스포로다이티오에이트, 및 P-에틸옥시포스포다이에스터, P-에톡시포스포다이에스터, P-알킬옥시포스포트라이에스터, 메틸포스포네이트 및 인 비함유 연결(예를 들어, 아세탈 및 아마이드)을 포함한다.
슈도유리딘은 유리딘의 C-글라이코사이드 이성질체이고, RNA에서 발견되는 100개 초과의 상이한 변형된 뉴클레오사이드 중에서, 이것은 가장 흔하다. 슈도유리딘은, 슈도유리딜화라 칭하는 공정에서 RNA에서의 특정한 유리딘 잔기를 전사 후 이합체화하는, 슈도유리딘 생성효소라 칭하는 효소에 의해 형성된다. 슈도유리딘은 방사선으로부터 보호를 제공하는 것으로 제안된다. RNA 분자는 5' 및/또는 3' 말단에서의 또는 그 근처에서의 1개 이상의 위치에서 슈도유리딘의 첨가 및/또는 2'-O-메틸 변형에 의해 안정화될 수 있다.
화학적 변형은 1.2배 내지 20배 사이(예를 들어, 약 1.5 내지 약 20, 약 2 내지 약 20, 약 1.5 내지 약 20, 약 1.5 내지 약 20, 약 1.5 내지 약 20, 약 1.5 내지 약 20, 약 1.5 내지 약 20, 약 1.5 내지 약 20 등)의 저장 수명 및/또는 세포내 반감기의 증가일 수 있다.
화학적 변형은 핵산 분자에서 일 말단에, 말단 둘 다에 및/또는 내부에 위치할 수 있다. 많은 경우에, 화학적 변형은 엑소뉴클레아제에 의한 핵산 분자의 분해를 저해하도록 위치할 것이다. 몇몇 포맷에서, 1개 내지 10개(예를 들어, 약 1개 내지 약 9개, 약 1개 내지 약 6개, 약 1개 내지 약 5개, 약 1개 내지 약 4개, 약 1개 내지 약 3개, 약 1개 내지 약 2개 등)의 말단 5' 및/또는 3' 염기는 화학적으로 변형될 것이다. 더 특정한 포맷에서, 화학적 변형은 포스포로티오에이트 변형 또는 2'-O-메틸 변형 또는 이들 변형의 조합일 것이다.
화학적 변형은 1개 내지 20개(예를 들어, 약 1개 내지 약 15개, 약 2개 내지 약 15개, 약 3개 내지 약 15개, 약 3개 내지 약 10개, 약 3개 내지 약 8개, 약 2개 내지 약 5개 등)의 수의 변형, 예컨대 염기 변형, 링커 변형 및/또는 당 변형으로 존재할 수 있다.
많은 엑소뉴클레아제는 이것이 이의 기질에 부착된 채 남아 있고 해리 전에 다수의 회차의 촉매작용을 수행한다는 의미에서 전진적이다. RNA 분자의 말단은 분해를 방지하도록 상이한 기를 가질 수 있다. 예로서, 합성 RNA는 통상적으로 5' 하이드록실기를 가진다. 시험관내 전사에 의해 제조된 RNA는 통상적으로 5' 트라이포스페이트기를 가진다. 천연 RNA는 통상적으로 5' 모노포스페이트기를 가진다. 본 발명은 5' 기 중 하나 이상, 및 다른 5' 기를 가지는 안정화된 RNA 분자를 포함한다. 예로서, 5' 트라이포스페이트기는 RNA 5' 피로포스포하이드롤라제를 사용함으로써 모노포스페이트기로 전환될 수 있다. 추가로, 5' 모노포스페이트기는 RNA 안정성을 개선하도록 사용될 수 있다.
다수의 추가 수단은 핵산 분자를 안정화시키도록 이용될 수 있다. 예를 들어, polyG의 스트링은 분해를 저해하도록 핵산 분자의 3' 말단에 첨가될 수 있다. 특히, polyG 영역은 mRNA의 3' 말단에서 발견되는 polyA 영역 대신에 존재할 수 있어서, RNA 분자에서의 세포내 반감기를 증가시킨다.
RNA 분자(예를 들어, gRNA 분자)의 안정성을 개선하기 위한 또 다른 방식은 안정화된 풀 또는 헤어핀으로서 이 분자를 제공하는 것이다. 이러한 루프의 변형의 일 예는 C/G 농후 영역을 함유하는 것이다. 이 염기 사이의 3개의 수소 결합은 A/T 염기를 가지는 핵산 분절로부터 형성된 루프와 비교하여 루프 안정성을 증가시킨다. 분자의 안정성은 또한 루프, 예컨대 C/G 염기의 4개의 쌍으로 이루어진 테트라루프(tetraloop)의 첨가에 의해 증가할 수 있다. 루프는 또한 말단 중 하나 또는 둘 다로서 안정화되거나 도입될 수 있다. gRNA의 경우에, 루프는 5' 말단에서 도입될 수 있다. 본 발명은 따라서 60% 내지 100%(예를 들어, 약 65% 내지 약 100%, 약 70% 내지 약 100%, 약 75% 내지 약 100%, 약 80% 내지 약 100%, 약 75% 내지 약 90% 등)의 쌍 지은 염기가 C/G 쌍인 헤어핀 영역을 함유하는 핵산 분자를 포함한다. 추가로, 이 헤어핀 영역은 약 4개 내지 약 20개의 쌍 지은 염기(예를 들어, 약 5개 내지 약 20개의 쌍 지은 염기, 약 6개 내지 약 20개의 쌍 지은 염기, 약 7개 내지 약 20개의 쌍 지은 염기, 약 5개 내지 약 15개의 쌍 지은 염기, 약 6개 내지 약 14개의 쌍 지은 염기 등)를 함유할 수 있다.
몇몇 경우에, 존재하는 천연 거주 헤어핀의 수는 핵산 분자의 안정성을 증대시키도록 변할 수 있다. 천연 tracr 분자는 3개의 헤어핀을 형성한다. 최종 헤어핀은 3' 말단에서 추가 3개 내지 5개의 염기를 가진다. tracr 분자, 및 다른 RNA 분자(예를 들어, gRNA 분자)는 이 말단 염기의 일부 또는 전부를 제거함으로써 안정화될 수 있다. 이것은 뉴클레아제 개시를 저해하는 것으로 생각된다. 추가로, 천연 거주 헤어핀의 절두는 용매 노출을 변화시킴으로써 안정화된 RNA 분자를 발생시킬 수 있다.
RNA 분자는 또한 특히 3' 말단에서 또는 그 근처에서 삼중나선 및/또는 사중나선 구조를 형성하는 영역의 도입을 통해 형성될 수 있다.
가교결합 기(예를 들어, 광 활성화 가능한 기)는 Cas9 단백질에 가교결합을 허용하는 gRNA(예를 들어, 3' 말단에서 또는 그 근처에서)에 첨가될 수 있다. 이것은 안정한 gRNA/Cas9 복합체의 형성을 허용하고, 여기서 gRNA는 단백질에 의한 분해로부터 보호되는 것으로 생각된다.
예시적인 유전자 변경 시약:
유전자 변경 시스템의 3개의 상이한 예는 아연 핑거 기반 시스템, TAL 효과기 기반 시스템, CRISPR 기반 시스템(예를 들어, Cas9 기반 시스템 및 CPF1 기반 시스템)이다. 각각은 상이한 원칙에 의해 운영하고, 상이한 기능적 분자를 사용한다. 이 시스템은 (1) 단백질 기반 시스템(예를 들어, 아연 핑거 및 TAL 효과기) 및 (2) 핵산/단백질 복합체화 기반 시스템(예를 들어, CRISPRs)의 2개의 그룹으로 나누어진다.
A. 아연 핑거 기반 시스템
아연 핑거 뉴클레아제(ZFN) 및 메가뉴클레아제는 게놈 조작 도구의 예이다. ZFN은 아연 핑거 DNA-결합 도메인 및 뉴클레아제 도메인으로 이루어진 키메라 단백질이다. 뉴클레아제 도메인의 일 예는, 통상적으로 5개 내지 7개의 염기 쌍의 링커 서열에 의해 분리된, 타입 IIS 제한 엔도뉴클레아제 FokI로부터의 비특이적 절단 도메인이다(Kim, YG; Cha, J., Chandrasegaran, S. Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to Fok I cleavage domain Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996 Feb. 6;93(3):1156-60). 한 쌍의 FokI 절단 도메인은 일반적으로 도메인의 이합체화 및 반대의 가닥으로부터의 비회문성 표적 서열의 절단을 허용하기에 필요하다. 개별적인 Cys2His2 ZFN의 DNA-결합 도메인은 통상적으로 3개 내지 6개의 개별적인 아연 핑거 반복을 함유하고, 각각 9개 내지 18개의 염기 쌍을 인식할 수 있다.
ZNF와 연관된 하나의 문제점은 도너 DNA의 랜덤 통합을 발생시키고, 염색체 재배열 또는 심지어 고등의 유기체에서의 적용 가능성에 대한 우려를 여전히 일으키는 세포사를 발생시킬 수 있는, 오프-타깃 절단의 가능성이다(Zinc-finger Nuclease-induced Gene Repair With Oligodeoxynucleotides: Wanted and Unwanted Target Locus Modifications Molecular Therapy vol. 18 no.4, 743-753 (2010)).
B.
TAL
효과기
기반 시스템
전사 활성자 유사(TAL) 효과기는 식물 세포의 감염 시 이의 III형 분비 시스템을 통해 잔토모나스(Xanthomonas) 및 랄스토니아(Ralstonia)와 같은 종의 식물 병원성 박테리아에 의해 분비된 DNA 결합 단백질의 클래스를 나타낸다. 천연 TAL 효과기는 식물 프로모터 서열에 결합하여서 유전자 발현을 조정하고 효과기 특이적 숙주 유전자를 활성화하여 박테리아 전파를 촉진하는 것으로 나타났다(Romer, P., et al., Plant pathogen recognition mediated by promoter activation of the pepper Bs3 resistance gene. Science 318, 645-648 (2007); Boch, J. & Bonas, U. Xanthomonas AvrBs3 family-type III effectors: discovery and function. Annu. Rev. Phytopathol. 48, 419-436 (2010); Kay, S., et al. U. A bacterial effector acts as a plant transcription factor and induces a cell size regulator. Science 318, 648-651 (2007); Kay, S. & Bonas, U. How Xanthomonas type III effectors manipulate the host plant. Curr. Opin. Microbiol. 12, 37-43 (2009)). 천연 TAL 효과기는 일반적으로 중앙 반복 도메인 및 카복실 말단 핵 국재화 신호 서열(NLS) 및 전사 활성화 도메인(AD)을 특징으로 한다. 중앙 반복 도메인은 통상적으로, 반복-절반이라 말해지는 일반적으로 더 짧은 카복실 말단 반복을 제외하고, 보통 33개 내지 35개의 잔기의 길이인 1.5개 내지 33.5개의 아미노산 반복의 가변적인 양으로 이루어진다. 반복은 거의 동일하지만, 소정의 초가변 잔기가 다르다. TAL 효과기의 DNA 인식 특이성은 통상적으로 각각의 반복, 소위 반복 가변 이잔기(repeat variable diresidue: RVD)의 12번 및 13번 위치에서의 초가변 잔기에 의해 매개되고, 여기서 각각의 RVD는 소정의 DNA 서열에서 특정한 뉴클레오타이드를 표적화한다. 따라서, TAL 단백질에서의 반복의 순차적 순서는 소정의 DNA 서열에서의 뉴클레오타이드의 한정된 선형 차수와 상관되는 경향이 있다. 몇몇 천연 발생 TAL 효과기의 기초하는 RVD 코드가 확인되어서, 소정의 DNA 서열에 결합하는 데 필요한 순차적인 반복 순서의 예측을 허용한다(Boch, J. et al. Breaking the code of DNA binding specificity of TAL-type III effectors. Science 326, 1509-1512 (2009); Moscou, M.J. & Bogdanove, A.J. A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors. Science 326, 1501 (2009)). 추가로, 새로운 반복 조합에 의해 생성된 TAL 효과기는 이 코드에 의해 예측된 표적 서열에 결합하는 것으로 나타났다. 표적 DNA 서열이 일반적으로 TAL 단백질에 의해 인식되는 5' 타이민 염기에 시작하는 것으로 나타났다.
TAL의 모듈식 구조는 DNA 결합 도메인과 효과기 분자, 예컨대 뉴클레아제의 조합을 허용한다. 특히, TAL 효과기 뉴클레아제는 공지된 새로운 게놈 조작 도구의 개발을 허용한다.
C. CRISPR 기반 시스템
유전자 변경 시약은 CRISPR 시스템에 기초할 수 있다. 용어 "CRISPR"은 3개의 유형의 시스템 및 시스템 하위유형에 적용하는 일반 용어이다. 일반적으로, 용어 CRISPR은 CRISPR 시스템 성분을 코딩하는 반복적 영역(예를 들어, 코딩된 crRNA)을 의미한다. 각각 상이한 특징을 가지는 3개의 유형의 CRISPR 시스템(표 1 참조)이 확인되었다.
본 발명이 다수의 양태 및 이와 연관된 변경을 가지지만, II형 CRISPR/Cas9 시스템은 본 명세서에서의 설명에 대한 기준점으로서 선택된다.
소정의 양태에서, 본 발명은 안정화된 crRNA, tracrRNA, 및/또는 가이드 RNA(gRNA), 및 이러한 RNA 분자의 수집품을 제공한다.
도 4는 II형 CRISPR 시스템과 연관된 성분 및 분자 상호작용을 보여준다. 이 경우에, Cas9 매개된 스트렙토코커스 파이오게네스 시스템이 예시되어 있다. 표적 DNA(혼성화 영역 1) 및 tracrRNA(혼성화 영역 2) 둘 다에 혼성화하는 gRNA가 도 4에 도시되어 있다. 이 시스템에서, 이 2개의 RNA 분자는 표적 DNA의 절단을 허용하는 방식으로 Cas9 단백질이 표적 DNA 서열이 되게 작용한다. 표적 DNA는 2개의 부위에서 절단되어, 이중 가닥 파괴를 형성한다.
도 5는 본 발명의 예시적인 워크플로우이다. 도 5에서의 도식은 가이드 RNA 코딩 영역이 T7 프로모터에 작동 가능하게 연결된 DNA 분자를 생성하도록 설계된 올리고뉴클레오타이드를 보여준다. 이 워크플로우에서, 단독의 또는 이중 가닥 DNA와 조합된, DNA 올리고뉴클레오타이드는 PCR을 통해 시험관내 전사에 적합한 프로모터에 작동 가능하게 연결된 가이드 RNA를 코딩하는 DNA 분자를 생성하도록 사용된다. 이후, DNA 분자는 시험관내 전사되어서, 가이드 RNA를 생성한다. 이후, 가이드 RNA는 예를 들어 칼럼 정제 또는 비드 기반 방법에 의해 "청소"될 수 있다. 이후, 가이드 RNA는 예로서 (1) 세포로의 직접 도입 또는 (2) 하나 이상의 CRISPR 단백질과 복합체화된 후 세포로의 도입에 의해 사용하기에 적합하다. 이 세포가 T7 RNA 중합효소를 함유할 때, T7 프로모터에 작동 가능하게 연결된 핵산은 포유류 세포에서 전사될 수 있다(Lieber et al., Nucleic Acids Res., 17: 8485-8493 (1989)). 물론, 진핵생물 세포에서의 기능적인 다른 프로모터(예를 들어, CMV 프로모터, U6 프로모터, H1 프로모터 등)는 가이드 RNA의 세포내 생성에 또한 사용될 수 있다. H1 프로모터는 예를 들어 약 300개의 염기 쌍 길이이다. T7 프로모터의 하나의 이점은 이의 작은 크기(20개의 염기 쌍)이다.
화학적으로 합성되고 시험관내 전사된 RNA를 사용하는 것의 하나의 이점은 화학적으로 변형된 염기가 RNA 분자로 도입될 수 있다는 것이다.
건조된 또는 동결건조된 유전자 변경 복합체를 또한 사용할 수 있다. 다수의 제제는 복합체를 형성하도록 허용된 건조된 또는 동결건조된 유전자 변경 시약에 사용될 수 있다. 많은 경우에, 복합체는 CRISPR 시스템 시약을 사용하여 형성될 수 있다.
건조된 또는 동결건조된 유전자 변경 시약 복합체를 세포(예를 들어, U2OS 세포, HEK293 세포 등)에서의 이러한 복합체의 도입에 의해 시험하고/하거나 사용할 수 있다. 추가로, 복합체는 1X 내지 5X 양으로 다중웰 포맷에서 제조되거나 이에 위치할 수 있다. Cas9 mRNA 포맷을 위해, LIPOFECTAMINE(리포펙타민)(등록상표) RNAiMAX 또는 균등물을 사용할 수 있다. Cas9 단백질 포맷을 위해, CRISPRMAX 또는 균등물을 지질 나노입자 기반 형질감염에 사용될 수 있다.
Cas9/gRNA는 예시의 목적을 위해 하기 이용된 예시적인 조건이다.
포맷 1: 형질감염 시약 또는 Cas9 없음. 1 내지 5㎍의 gRNA를 다중웰 플레이트의 웰에 첨가한다. 플레이트 및 내용물을 진공 건조시키고, 이후 상이한 온도에서 저장한다. 사용 전에, gRNA를 적절한 농도로 재현탁시킨다. Cas9 발현 안정한 세포 또는 Cas9 및 적합한 형질감염 시약에 의해 동시형질감염된 세포를 웰에 첨가한다. 몇몇 양태에서, 1개 이상(예를 들어, 2개)의 TAL 단백질, 1개 이상(예를 들어, 2개)의 TAL 단백질을 코딩하는 mRNA 또는 1개 이상(예를 들어, 2개)의 TAL 단백질을 코딩하는 DNA를 대신에 gRNA와 함께 또는 이것 대신에 웰에 첨가할 수 있다.
포맷 2: 20ng의 IVT 생성된 gRNA(20ng/㎕) 및 100ng의 Cas9mRNA(100ng/㎕)를 혼합하여 복합체를 형성하고, 다중웰 플레이트의 웰에 첨가한다. 플레이트 및 내용물을 진공 건조시키고, 이후 상이한 온도에서 저장한다. 형질감염 전에, 샘플을 RNAse 및 DNAse 비함유 물 또는 Opti-MEM(상표명) 배양 배지 중에 재현탁시킨다. 건조된 샘플의 재현탁 후, (웰마다 0.6㎕의 리포펙타민(등록상표) RNAiMAX 및 4.4㎕의 Opti-MEM(상표명)을 사용하여 제조된) 리포펙타민(등록상표) RNAiMAX/ Opti-MEM(상표명) 혼합물을 gRNA-Cas9 복합체에 첨가하고, 이후 15,000개 내지 20,000개의 세포/웰에 적용한다. 몇몇 양태에서, 1개 이상(예를 들어, 2개)의 TAL 단백질, 1개 이상(예를 들어, 2개)의 TAL 단백질을 코딩하는 mRNA 또는 1개 이상(예를 들어, 2개)의 TAL 단백질을 코딩하는 DNA를 대신에 gRNA와 함께 또는 이것 대신에 웰에 첨가한다.
포맷 3: IVT gRNA(20ng/㎕에서의 20ng/웰) 및 Cas9 mRNA(100ng/㎕에서의 100ng/웰)를 리포펙타민(등록상표) RNAiMAX(0.6㎕/웰)에 의해 예비 복합체화하고 진공 건조시킨다. 건조된 예비 복합체화 샘플을 Opti-MEM(상표명) 중에 재현탁시키고, 형질감염에 사용한다. 몇몇 양태에서, 1개 이상(예를 들어, 2개)의 TAL 단백질, 1개 이상(예를 들어, 2개)의 TAL 단백질을 코딩하는 mRNA 또는 1개 이상(예를 들어, 2개)의 TAL 단백질을 코딩하는 DNA를 대신에 gRNA와 함께 또는 이것 대신에 웰에 첨가할 수 있다.
포맷 4: IVT 생성된 gRNA(20ng/웰) 및 Cas9 mRNA(100ng/웰)를 리포펙타민(등록상표) RNAiMAX(또는 균등물) 및 Opti-MEM(상표명)(웰당 4.4㎕)과 예비 복합체화한다. 혼합물을 진공 건조시킨다. 사용 전에, 샘플을 Opti-MEM(상표명) 및/또는 물 중에 재현탁시키고, 96웰 포맷에서 세포에 적용한다. 몇몇 양태에서, 1개 이상(예를 들어, 2개)의 TAL 단백질, 1개 이상(예를 들어, 2개)의 TAL 단백질을 코딩하는 mRNA 또는 1개 이상(예를 들어, 2개)의 TAL 단백질을 코딩하는 DNA를 대신에 gRNA와 함께 또는 이것 대신에 웰에 첨가할 수 있다.
포맷 5: IVT 생성된 gRNA를 리포펙타민(등록상표) RNAiMAX 또는 리포펙타민(등록상표) MessengerMAX(상표명)(Opti-MEM(상표명)과 함께 또는 이것 없이)와 예비 복합체화한다. 이 포맷은 안정한 Cas9 발현 세포주와 사용될 수 있다. 사용된 성분의 양은 상기 기재된 포맷과 동일하거나 유사하다. 몇몇 양태에서, 1개 이상(예를 들어, 2개)의 TAL 단백질, 1개 이상(예를 들어, 2개)의 TAL 단백질을 코딩하는 mRNA 또는 1개 이상(예를 들어, 2개)의 TAL 단백질을 코딩하는 DNA를 대신에 gRNA와 함께 또는 이것 대신에 웰에 첨가할 수 있다.
포맷 6: 도너 DNA(예를 들어, 단일 가닥 DNA)를 가지는 포맷 1-4. 몇몇 양태에서, 1개 이상(예를 들어, 2개)의 TAL 단백질, 1개 이상(예를 들어, 2개)의 TAL 단백질을 코딩하는 mRNA 또는 1개 이상(예를 들어, 2개)의 TAL 단백질을 코딩하는 DNA를 대신에 gRNA와 함께 또는 이것 대신에 웰에 첨가할 수 있다.
유전자 변경 활성:
본 발명의 시약은 임의의 수의 활성을 가질 수 있다. 예를 들어, 시약은 1개 이상(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 등)의 비상동성 도메인을 가지는 융합 단백질을 포함할 수 있다. 융합 단백질은 임의의 추가 단백질 서열, 및 임의로 임의의 2개의 도메인 사이의 링커 서열을 포함할 수 있다. 융합 단백질 성분일 수 있는 단백질 도메인의 예는, 제한 없이, 에피토프 태그, 리포터 유전자 서열, 및 하기 활성 중 하나 이상을 가지는 하나 이상의 도메인을 포함한다: 메틸라제 활성, 탈메틸라제 활성, 전사 활성화 활성, 전사 억제 활성, 전사 방출 인자 활성, 히스톤 변형 활성(예를 들어, 아세틸화 활성, 탈아세틸화 활성, 포스포릴화 활성, 탈포스포릴화 활성, 메틸화 활성, 탈메틸화 활성 등), RNA 절단 활성 및 핵산 결합 활성.
특히, 부분적으로, 적어도 하나의 핵 국재화 신호, 기능적 활성을 가지는 적어도 하나의 도메인(예를 들어, 뉴클레아제, 메틸라제 등), 및 표적 유전좌위와 상호작용하는 적어도 하나의 도메인 또는 표적 유전좌위와 상호작용하는 핵산 분자와 상호작용하는 적어도 하나의 도메인을 포함하는 유전자 변경 시약이 본 명세서에 제공된다.
유전자 변경 시약은 전사를 활성화하거나 억제하도록 사용될 수 있다. 예를 들어, 뉴클레아제 활성이 없는 "죽은" Cas9(즉, dCas9) 단백질은 비코드 변경 목적에 사용될 수 있다. dCas9-전사 활성자 융합 단백질(예를 들어, dCas9-VP64)은 표적 유전좌위와 연관된 핵산의 전사를 활성화하도록 가이드 RNA와 함께 사용될 수 있다. 유사하게, dCas9-리프레서 융합(예를 들어, dCas9-KRAB 전사 리프레서)은 표적 유전좌위와 연관된 핵산의 전사를 억제하도록 사용될 수 있다. 예컨대, 상기 언급된 전사 활성화 및 억제는 예를 들어 문헌[Kearns et al., Cas9 effector-mediated regulation of transcription and differentiation in human pluripotent stem cells, Development, 141:219-223 (2014)]에 기재되어 있다.
본 발명은 따라서 전사의 활성화 및 억제를 위한 유전자 변경 시약의 제조 및 사용을 위한 조성물 및 방법을 포함한다.
도 6은 표적 유전좌위를 형성하는 2개의 가깝게 연관된 부위의 선택을 보여준다. 각각의 부위(부위 1 및 부위 2)는 니킹 활성을 가지는 유전자 변경 시약에 결합한다. 이것의 하나의 목적은 핵산의 "오프 타깃" 절단을 최소화하는 것이다.
도 6에 예시된 2개의 부위는 일반적으로 이중 가닥 핵산이 닉 파괴를 함유하도록 서로에 충분히 가깝게 위치할 것이다. 이 거리가 영역의 AT/CG 함량과 같은 인자에 따라 변할 것이지만, 닉 부위는 일반적으로 서로의 200개의 염기 쌍(예를 들어, 약 1개 내지 약 200개, 약 10개 내지 약 200개, 약 25개 내지 약 200개, 약 40개 내지 약 200개, 약 50개 내지 약 200개, 약 60개 내지 약 200개, 약 1개 내지 약 100개, 약 10개 내지 약 100개, 약 20개 내지 약 100개, 약 30개 내지 약 100개, 약 40개 내지 약 100개, 약 50개 내지 약 100개, 약 1개 내지 약 60개, 약 10개 내지 약 60개, 약 20개 내지 약 60개, 약 30개 내지 약 60개, 약 40개 내지 약 60개, 약 1개 내지 약 35개, 약 5개 내지 약 35개, 약 10개 내지 약 35개, 약 20개 내지 약 35개, 약 25개 내지 약 35개, 약 1개 내지 약 25개, 약 10개 내지 약 25개, 약 15개 내지 약 25개, 약 2개 내지 약 15개, 약 5개 내지 약 15개 등의 염기 쌍) 내에 있을 것이다.
니킹 활성은 다수의 방식으로 달성될 수 있다. 예를 들어, 유전자 변경 시약이 Cas9일 때, Cas9 단백질은 이중 가닥 핵산의 상이한 가닥을 니킹하는 RuvC 및 HNH라 칭하는 2개의 도메인을 가진다. Cas9 단백질은 하나의 도메인 또는 다른 도메인을 불활성화하도록 변경될 수 있다. 결과는 이중 가닥 파괴가 일어나게 하도록 표적 유전좌위를 니킹하는 데에 2개의 Cas9 단백질이 필요하다는 것이다. 예를 들어, 에스. 파이오게네스로부터의 Cas9의 RuvC 촉매 도메인에서의 알라닌으로의 아스파르테이트의 치환(D10A)은 가닥 둘 다를 절단하는 뉴클레아제로부터의 Cas9를 (단일 가닥을 절단하는) 니카제로 전환한다. Cas9가 니카제가 되게 하는 돌연변이의 다른 예는 H840A, N854A 및 N863A를 포함한다.
니카제 활성을 가지는 CRISPR 단백질(예를 들어, Cas9)은 DNA 표적의 센스 및 안티센스 가닥을 각각 표적화하는 가이드 서열(예를 들어, 2개의 가이드 서열)과 조합되어 사용될 수 있다.
니카제 활성을 이용하여 핵산에서 이중 가닥 파괴를 생성하기 위한 또 다른 방식은 비상동성 뉴클레아제 도메인에 연결된 뉴클레아제 활성이 부족한 CRISPR 단백질을 사용하는 것에 의한다. 이것의 하나의 예는 FokI 도메인에 연결된 dCas9라 불리는 Cas9의 돌연변이된 형태이다. FokI 도메인은 뉴클레아제 활성의 이합체화를 요한다. 따라서, 이러한 경우에, CRISPR RNA 분자는, 이중 가닥 절단의 형성을 발생시키는, 뉴클레아제 활성을 생성하도록, 2개의 dCas9-FokI 융합 단백질이 충분히 가까운 근접성에 있도록 사용된다. 이 유형의 방법은 문헌[Tsai et al., "Dimeric CRISPR RNA-guided FokI nucleases for highly specific genome editing," Nature Biotech., 32:569-576 (2014) 및 Guilinger et al., "Fusion of catalytically inactive Cas9 to FokI nuclease improves the specificity of genome modification," Nature Biotech., 32:577-582 (2014)]에 기재되어 있다.
핵산의 "오프-타깃" 절단을 최소화하기 위한 또 다른 방식은 이것이 이합체화할 때까지 불활성인 뉴클레아제의 사용을 거치는 것이다. 이러한 뉴클레아제의 하나의 예는 FokI이다. 아연 핑거 단백질 및 TAL 효과기 단백질은 핵산 분자에서의 상이한 부위에 결합하여서, FokI 도메인이 이합체화하여서, 뉴클레아제 활성의 재구성을 발생시키도록 설계된다.
본 발명은 따라서 핵산 분자에서의 하나 초과의 유전좌위를 인식하는 유전자 변경 시약을 포함한다. 많은 경우에, 인식 부위 사이의 거리는 도 6을 참조하여 언급된 닉 부위와 동일한 범위에 있을 것이다.
기능적 활성은 임의의 다수의 방식으로 측정될 수 있다. 예를 들어, 발현의 유도 또는 억제에 기초한 활성은 전사 및/또는 번역의 증가 또는 감소를 평가함으로써 측정될 수 있다.
기능적 활성이 DNA(예를 들어, 세포내 DNA)의 절단과 관련될 때, 다수의 상업적 제품은 핵산 절단의 검출을 위해 구입 가능하다. 하나의 이러한 제품은 써모 피셔 사이언티픽으로부터 구입 가능한 GeneArt(등록상표) Genomic Cleavage Detection Kit(카탈로그 A24372호)이다. 추가 검정은 발명의 명칭이 "CRISPR Oligonucleotides and Gene Editing"인 2015년 10월 9일자에 출원된 미국 특허 출원 제14/879,872호(이의 전체 개시내용은 본 명세서에 참고로 포함됨)에서 발견될 수 있다.
시약 혼합물 및 포맷:
직접적인 유전자 변경 활성을 가지지 않는 다수의 화합물은 시약 혼합물에 포함될 수 있다. 화합물의 하나의 이러한 세트는 형질감염 시약이다. 이것은 실험 프로토콜의 일부로서 유전자 변경 시약에 대한 최소 첨가를 위해 포함될 수 있다.
본 발명과 사용하기에 적합한 형질감염제는 세포로의 RNA, DNA 및 단백질의 도입을 촉진하는 형질감염제를 포함한다. 예시적인 형질감염 시약은 TurboFect Transfection Reagent(써모 피셔 사이언티픽), Pro-Ject Reagent(써모 피셔 사이언티픽), TRANsPAss(상표명) P Protein Transfection Reagent(New England Biolabs), Chariot(상표명) Protein Delivery Reagent(Active Motif), PROTEOJUICE(상표명) Protein Transfection Reagent(EMD Millipore), 293FECTIN(상표명), 리포펙타민(상표명) 2000, 리포펙타민(상표명) 3000(써모 피셔 사이언티픽), 리포펙타민(상표명)(써모 피셔 사이언티픽), 리포펙틴(Lipofectin)(상표명)(써모 피셔 사이언티픽), 리포펙타민(상표명) CRISPRMAX(상표명)(써모 피셔 사이언티픽), DMRIE-C, CELLFECTIN(상표명)(써모 피셔 사이언티픽), 올리고펙타민(OLIGOFECTAMINE)(상표명)(써모 피셔 사이언티픽), LIPOFECTACE(상표명), FuGENE(상표명)(Roche(스위스 바젤)), FuGENE(상표명) HD(Roche), TRANSFECTAM(상표명)(Transfectam, 프로메가(Promega)(위스콘신주 매디슨)), Tfx-10(상표명)(프로메가), Tfx-20(상표명)(프로메가), Tfx-50(상표명)(프로메가), TRANSFECTIN(상표명)(BioRad(캘리포니아주 헤르큘레스)), SILENTFECT(상표명)(Bio-Rad), Effectene(상표명)(Qiagen(캘리포니아주 발렌시아)), DC-chol(Avanti Polar Lipids), GENEPORTER(상표명)(Gene Therapy Systems(캘리포니아주 샌 디에고)), DHARMAFECT 1(상표명)(Dharmacon(콜로라도주 라파예트)), DHARMAFECT 2(상표명)(Dharmacon), DHARMAFECT 3(상표명)(Dharmacon), DHARMAFECT 4(상표명)(Dharmacon), EscoRT(상표명) III(Sigma(미주리주 세인트 루이스)) 및 EscoRT(상표명) IV(Sigma Chemical Co.)를 포함한다.
유전자 변경 시약은 포맷에서 설정될 수 있어서, 최소 첨가는 유전자 변경 활성에 필요하다. 하나의 예시적인 포맷에서, 도너 핵산, 한 쌍의 ZNF-FokI 융합 단백질 및 형질감염 시약은 96웰 플레이트의 웰에서 동결건조된다. 배양 배지 중의 세포는 동결건조된 유전자 변경 시약을 가지는 웰 및 유전자 변경 시약을 함유하지 않는 또 다른 웰(대조군 웰)에 첨가된다. 표적 유전좌위에서의 상동성 재조합의 효율은 샘플 둘 다에 대해 차후 측정된다.
몇몇 경우에, 유전자 변경 시약은 gRNA를 함유할 것이고, Cas9 단백질은 gRNA와 접촉하는 세포에 의해 발현될 것이다. 이후, 세포가 채워진 gRNA는 세포내로 발현된 Cas9 단백질과 회합하여 유전자 변경 활성을 재구성할 것이다. 적절한 경우, 이 세포는 세포가 gRNA와 접촉하기 전에, 접촉과 동시에 또는 접촉한 후에 도너 핵산과 접촉할 수 있다.
본 발명은 개별 표적 부위에 대한 특이성을 가지는 유전자 변경 시약의 수집품을 추가로 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 특정한 유형의 세포(예를 들어, 인간 세포) 내의 표적 부위에 대한 특이성을 가지는 유전자 변경 시약의 수집을 포함한다. 세포의 이러한 수집의 구성원은 세포의 이 특정한 유형에 대한 서열 정보에 기초하여 생성될 수 있다. 예로서, 하나의 이러한 수집품은 세포의 특정한 유형의 완전한 게놈 서열을 사용하여 생성될 수 있다. 게놈 서열 데이터는 인간 게놈 내의 각각의 유전자의 코딩 영역에 대한 특이성을 가지는 유전자 변경 시약의 라이브러리를 생성하도록 이용될 수 있다.
본 발명의 crRNA 분자의 수집품 또는 라이브러리는 매우 다양한 개별 분자, 예컨대 약 5개 내지 약 100,000개(예를 들어, 약 50개 내지 약 100,000개, 약 200개 내지 약 100,000개, 약 500개 내지 약 100,000개, 약 800개 내지 약 100,000개, 약 1,000개 내지 약 100,000개, 약 2,000개 내지 약 100,000개, 약 4,000개 내지 약 100,000개, 약 5,000개 내지 약 100,000개, 약 50개 내지 약 50,000개, 약 100개 내지 약 50,000개, 약 500개 내지 약 50,000개, 약 1,000개 내지 약 50,000개, 약 2,000개 내지 약 50,000개, 약 4,000개 내지 약 50,000개, 약 50개 내지 약 10,000개, 약 100개 내지 약 10,000개, 약 200개 내지 약 10,000개, 약 500개 내지 약 10,000개, 약 1,000개 내지 약 10,000개, 약 2,000개 내지 약 10,000개, 약 4,000개 내지 약 10,000개, 약 50개 내지 약 5,000개, 약 100개 내지 약 5,000개, 약 500개 내지 약 5,000개, 약 1,000개 내지 약 5,000개, 약 50개 내지 약 2,000개, 약 100개 내지 약 2,000개, 약 500개 내지 약 2,000개 등)를 포함할 수 있다.
본 발명의 실행에서 사용된 유전자 변경 시약은 다수의 상이한 포맷에서 저장될 수 있다. 예를 들어, RNA 분자는 관(예를 들어, 1.5㎖의 마이크로원심분리기 관) 또는 플레이트(예를 들어, 96웰, 384웰 또는 1536웰 플레이트)의 웰에 저장될 수 있다. 하나의 예시적인 포맷은 도 2에 도시되어 있다. 이 도면에서, 웰 A,1 및 A,6은 대조군 웰이고, 유전자 변경 시약을 함유하지 않는다. 다른 웰은 예를 들어 세포를 함유하는 배양 배지에 의해 재구성될 수 있는 건조된 유전자 변경 시약을 함유한다. 추가로, 각각의 웰은 상이한 표적 유전좌위에 대한 결합 특이성을 가지는 유전자 변경 시약을 함유할 수 있다.
벡터 성분 및 세포:
다수의 기능적 핵산 성분(예를 들어, 프로모터, polyA 신호, 복제 기원, 선택 가능한 마커 등)은 본 발명의 실행에서 사용될 수 있다. 본 발명의 실행에서 사용된 기능적 핵산 성분의 선택은, 사용될 때, 시스템의 사용 및 세부사항(예를 들어, 세포내, 세포외, 시험관내 전사, 커플링된 시험관내 전사/번역 등)의 성질에 따라 크게 변할 것이다.
프로모터 선택은 다수의 인자, 예컨대 발현 생성물 및 사용된 세포 또는 시스템의 유형에 따라 달라진다. 예를 들어, 비-mRNA 분자는 대개 RNA 중합효소 I 또는 III 프로모터를 사용하여 제조된다. mRNA는 일반적으로 RNA 중합효소 II 프로모터를 사용하여 전사된다. 그러나, 예외가 있다. 하나는 마이크로RNA가 RNA 중합효소 II 프로모터(예를 들어, CMV 프로모터)를 사용하여 DNA로부터 전사될 수 있는 마이크로RNA 발현 시스템이다. RNA 중합효소 II 프로모터는 "날카로운" 중단 및 시작점을 갖지 않지만, 마이크로RNA는 5' 및 3' 말단의 제거에 의해 가공처리되는 경향이 있다. 따라서, 말단에서의 "추가의" RNA 분절은 제거된다. mRNA(예를 들어, cas9 mRNA)는 보통 RNA 중합효소 II 프로모터를 통해 제조된다.
특정한 프로모터의 선택은 특정한 분야에 따라 변한다. 예를 들어, T7, T3 및 SP6 프로모터는 대개 시험관내 전사 및 시험관내 전사/번역 시스템에 사용된다. 원하는 바대로 세포내 발현 때, 사용된 프로모터 또는 프로모터들은 일반적으로 사용된 세포 내에 효율적으로 작용하도록 설계될 것이다. CMV 프로모터는 예를 들어 포유류 세포 내에 사용하기 위한 강한 프로모터이다. 하이브리드 Hsp70A-Rbc S2 프로모터는 진핵생물 조류, 예컨대 클라마이도모나스 레인하르디티(Chlamydomonas reinhardtii)에서 우수하게 작용하는 구성적 프로모터이다. (제품 매뉴얼 "GeneArt(등록상표) Chlamydomonas Protein Expression Kit", 카탈로그 A24244호, 버전 B.0(Life Technologies Corp.(캘리포니아주 칼스바드)) 참조). 본 발명의 실행에서 사용될 수 있는 추가 프로모터는 AOX1, GAP, 꽃양배추 모자이크 바이러스 35S, pGC1, EF1α 및 Hsp70 프로모터를 포함한다.
발현 벡터에서의 DNA 분절은 RNA 합성을 지시하도록 적절한 발현 제어 서열(들)(프로모터)에 작동 가능하게 연결된다. 적합한 진핵생물 프로모터는 CMV 즉시 초기 프로모터, HSV 타이미딘 키나제 프로모터, 초기 및 후기 SV40 프로모터, 레트로바이러스 LTR의 프로모터, 예컨대 라우스 육종 바이러스(Rous Sarcoma Virus: RSV)의 것 및 메탈로티오네인 프로모터, 예컨대 마우스 메탈로티오네인-I 프로모터를 포함한다. 본 발명과 사용하기에 적합한 예시적인 프로모터는 RNA 중합효소 III 프로모터의 III형 클래스 유래이다. 추가로, 프로모터는 U6 및 H1 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. U6 및 H1 프로모터는 둘 다 RNA 중합효소 III 프로모터의 III형 클래스의 구성원이다.
RNA 중합효소 III 프로모터는 본 발명의 방법에 의해 제조된 핵산 분자의 생체내 전사에 적합하다. 예를 들어, 도 5에 도시된 바대로 제조된 선형 DNA 분자는 세포로 도입되고, 예를 들어 자연 거주 세포내 전사 과정에 의해 전사될 수 있다.
본 발명의 조성물 및 방법에서의 프로모터는 또한 발현이 "온" 또는 "오프" 턴이 될 수 있다는 점에서 유도성일 수 있다. 예를 들어, U6 프로모터를 사용하는 테트라사이클린 조절 가능한 시스템은 siRNA의 생성을 제어하도록 사용될 수 있다. 발현 벡터는 번역 개시 및 전사 종결을 위한 리보솜 결합 부위를 함유하거나 함유하지 않을 수 있다. 벡터는 또한 발현을 증폭시키기에 적절한 서열을 포함할 수 있다.
본 발명과 사용하기에 적합한 세포는 매우 다양한 원핵생물 및 진핵생물 세포를 포함한다. 많은 경우에, 하나 이상의 CRISPR 시스템 성분은 세포와 천연에서 연관되지 않을 것이다(즉, 세포에 외인성일 것이다).
본 발명의 실행에서 사용될 수 있는 대표적인 세포는 박테리아 세포, 효모 세포, 식물 세포 및 동물 세포를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 예시적인 박테리아 세포는 에스체리치아 종 세포(특히 이. 콜라이(E. coli) 세포 및 가장 특히 이. 콜라이 균주 DH10B, Stbl2, DH5α, DB3, DB3.1), 바실러스 종(Bacillus spp.) 세포(특히 비. 서브틸리스(B. subtilis) 및 비. 메가테리움(B. megaterium) 세포), 스트렙토마이세스 종(Streptomyces spp.) 세포, 에르비니아 종(Erwinia spp.) 세포, 클레브시엘라 종(Klebsiella spp.) 세포, 세라티아 종(Serratia spp.) 세포(특히 에스. 마르세산스(S. marcessans) 세포), 슈도모나스 종(Pseudomonas spp.) 세포(특히 피. 아에루기노사(P. aeruginosa) 세포) 및 살모넬라 종(Salmonella spp.) 세포(특히 에스. 티피무리움(S. typhimurium) 및 에스. 티피(S. typhi) 세포)를 포함한다. 예시적인 동물 세포는 곤충 세포(가장 특히 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster) 세포, 스포돕테라 프루지페르다(Spodoptera frugiperda) Sf9 및 Sf21 세포 및 트리초풀사 하이-파이브(Trichoplusa High-Five) 세포), 선충 세포(특히 씨. 엘레간스(C. elegans) 세포), 조류 세포, 양서류 세포(특히 제노푸스 라에비스(Xenopus laevis) 세포), 파충류 세포 및 포유류 세포(더 특히 NIH3T3, CHO, COS, VERO, BHK CHO-K1, BHK-21, HeLa, COS-7, HEK 293, HEK 293T, HT1080, PC12, MDCK, C2C12, Jurkat, NIH3T3, K-562, TF-1, P19 및 인간 배아 줄기 세포 유사 클론 H9(Wicell(미국 위스콘신주 매디슨)))를 포함한다. 예시적인 효모 세포는 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae) 세포 및 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 세포를 포함한다. 이들 및 다른 세포는 예를 들어 Thermo-Fisher Scientific(매사추세츠주 월섬), 미국 균주 협회(American Type Culture Collection) 및 농업 조사 균주 협회(Agricultural Research Culture Collection)(NRRL(일리노이주 피오리아))로부터 상업적으로 구입 가능하다. 예시적인 식물 세포는 보리, 밀, 쌀, 대두, 감자, 아라비돕시스(arabidopsis) 및 담배(예를 들어, 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum) SR1)로부터 유래한 것과 같은 세포를 포함한다.
실시예
실시예
1: 건조된 시약의 제조
분무 건조: 가이드 RNA, 1,2-다이팔미토일-sn-글라이세로-3-포스포콜린(DPPC), 수크로스 및 알부민(중량 기준 20:40:20:20)으로부터 가이드 RNA의 건조 제제를 제조하였다. 15㎎의 siRNA, 15㎎의 알부민 및 15㎎의 수크로스를 함유하는 수용액(총 용적 7.5㎖)을 30㎎의 DPPC를 함유하는 17.5㎖의 에탄올과 혼합하였다. 용액을 배합하기 전에, 이것을 자기 교반 막대에 의해 혼합하였다. 수용액을 유기 용액에 첨가한 후, 배합된 용액을 실온에서 약 6분 동안 자기 교반 막대에 의해 혼합한 후, 용액을 분무 건조시켰다. 분무 건조에 대한 조건은 Tinlet=95℃, Toutlet=55℃이고, 분무화/건조 가스 유속은 600ℓ/시간이다.
실시예 2: 건조된 시약의 제조
RNA 저장 완충제(1mM 시트르산나트륨(pH 6.4)) 중의 20㎕의 시험관내 전사된 가이드 RNA 스톡(웰당 0.5㎍ 내지 1㎍)을 96웰 플레이트 포맷에서 동결건조시키고, -20℃에서 저장하였다. U2OS Cas9 안정한 세포로 형질감염 전에, 건조된 gRNA를 간단히 원심분리하고, 20㎕의 DNAse/RNAse 비함유 물 중에 재현탁시켰다. RNA 농도를 Quant-iT(상표명) RNA BR 검정 키트를 사용하여 형질감염 전에 측정하였다. 형질감염 전 1일에, 10,000개의 세포를 96웰 플레이트 포맷에서 웰마다 시딩하였다. 각각의 웰에 대한 형질감염의 일자에, 비형질감염된 대조군을 제외하고, 20ng의 gRNA를 5㎕의 Opti-MEM(등록상표) 배지에 첨가한 후, 1.5㎕의 리포펙타민(상표명) RNAiMAX를 함유하는 5㎕의 Opti-MEM을 첨가하였다. 생성된 형질감염 혼합물을 실온에서 10분 동안 항온처리하고, 이후 세포에 첨가하였다. 형질감염된 세포를 함유하는 플레이트를 5% CO2 항온처리기에서 37℃에서 48시간 동안 항온처리하였다. GeneArt(등록상표) Genomic Cleavage Detection Kit(써모 피셔 사이언티픽, 카탈로그 번호 A24372)에 의해 유전좌위 특이적 인델 형성의 백분율을 측정하였다. Alpha Imager(Bio-Rad)에서 빌트인 소프트웨어를 이용하여 밴드 강도를 정량화하였다. 도 7은 6개의 상이한 유전자에 대해 얻어진 절단 효율 결과를 보여준다. BTK 유전자의 경우에, 2개의 상이한 게놈 유전좌위를 시험하였다. 시험된 각각의 샘플에 대해, 부형제와 함께 또는 부형제 없이 건조된 샘플을 RNA 저장 완충제 중의 비동결건조된 IVT gRNA와 비교하였다.
상기 실시형태가 명확성 및 이해의 목적을 위해 약간 자세히 기재되어 있지만, 본 개시내용을 읽는 것으로부터 본 명세서에 개시된 실시형태의 진정한 범위로부터 벗어나지 않고 형태 및 세부사항의 다양한 변경이 이루어질 수 있다는 것이 당해 분야의 숙련자에게 명확할 것이다. 예를 들어, 상기 기재된 모든 기법, 장치, 시스템 및 방법은 다양한 조합으로 사용될 수 있다.
본 발명의 예시적인 대상은 하기 조항으로 표시된다:
조항 1. 1종 이상의 안정화된 유전자 변경 시약을 제조하는 방법으로서,
(a) 용매 중에 1종 이상의 유전자 변경 시약을 제조하는 단계, 및
(b) (a)의 용매의 80% 초과분을 제거하는 단계를 포함하는, 방법.
조항 2. 조항 1에 있어서, 용매는 물, 1종 이상의 알코올 또는 물과 1종 이상의 알코올의 혼합물인, 방법.
조항 3. 이전의 조항 중 어느 하나에 있어서, 1종 이상의 유전자 변경 시약 중 적어도 하나는
(a) TAL 효과기-뉴클레아제 융합 단백질,
(b) TAL 효과기-뉴클레아제 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자,
(c) 아연 핑거-뉴클레아제 융합 단백질,
(d) 아연 핑거-뉴클레아제 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자,
(e) Cas9 단백질,
(f) Cas9 단백질을 코딩하는 핵산 분자,
(g) 가이드 RNA, 및
(h) 가이드 RNA를 코딩하는 핵산 분자
로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 시약인, 방법.
조항 4. 조항 2에 있어서, 물은 동결건조, 분무 건조, 분무 냉동 건조, 초임계 유체 건조 또는 진공 원심분리에 의해 제거되는, 방법.
조항 5. 이전의 조항 중 어느 하나에 있어서, 수용액 중의 1종 이상의 유전자 변경 시약으로부터 용매의 80% 내지 99.5%가 제거된, 방법.
조항 6. 이전의 조항 중 어느 하나에 있어서, 개별 유전자 변경 시약은 다중웰 플레이트의 2개 이상의 웰에 배치되는, 방법.
조항 7. 조항 6에 있어서, 개별 유전자 변경 시약은 용매 중의 다중웰 플레이트의 웰에 첨가되는, 방법.
조항 8. 조항 6 내지 7에 있어서, 수성 용매 중 일부 또는 전부는 개별 유전자 변경 시약으로부터 제거되는 한편, 개별 유전자 변경 시약은 다중웰 플레이트의 웰에 있는, 방법.
조항 9. 조항 6에 있어서, 50종 내지 100종의 개별 유전자 변경 시약이 다중웰 플레이트의 상이한 웰에 배치되는, 방법.
조항 10. 조항 6 내지 9에 있어서, 개별 유전자 변경 시약은 동일한 유기체의 게놈의 상이한 뉴클레오타이드 서열에 결합하는, 방법.
조항 11. 이전의 조항 중 어느 하나에 있어서, 수용액은
(a) 1종 이상의 완충제,
(b) 1종 이상의 프로테아제 저해제,
(c) 1종 이상의 뉴클레아제 저해제,
(d) 1종 이상의 염,
(e) 1종 이상의 탄수화물,
(f) 1종 이상의 형질감염 시약,
(g) 1종 이상의 폴리아민, 및
(h) 1종 이상의 배양 배지
로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 성분을 함유하는, 방법.
조항 12. 조항 11에 있어서, 탄수화물은 수크로스, 트레할로스, 락토수크로스 또는 사이클로덱스트린 중 1종 이상인, 방법.
조항 13. 이전의 조항 중 어느 하나에 있어서, 물의 제거 전의 수용액의 pH는 4 내지 약 11인, 방법.
조항 14. 1종 이상의 유전자 변경 시약을 저장하는 방법으로서,
(a) 수용액 중에 1종 이상의 유전자 변경 시약을 제조하는 단계,
(b) (a)에서 제조된 수용액으로부터 90% 초과의 물을 제거하는 단계, 및
(c) 75% 초과의 유전자 변경 기능 활성도가 30일 저장 후 유지되는 조건 하에 1종 이상의 유전자 변경 시약을 놓는 단계를 포함하는, 방법.
조항 15. 조항 14에 있어서, 적어도 하나 또는 1종 이상의 유전자 변경 시약의 90% 초과의 유전자 변경 기능 활성도는 적어도 30일 저장 후 유지되는, 방법.
조항 16. 조항 14 또는 15에 있어서, 적어도 하나 또는 1종 이상의 유전자 변경 시약의 90% 초과의 유전자 변경 기능 활성도는 저장의 120일 후 유지되는, 방법.
조항 17. 조항 14, 15 또는 16에 있어서, 1종 이상의 유전자 변경 시약 중 하나 초과는 동일한 저장 용기에서 저장되는, 방법.
조항 18. 조항 17에 있어서, 저장 용기는 다중웰 플레이트인, 방법.
조항 19. 조항 17에 있어서, 개별 유전자 변경 시약은 동일한 유기체의 게놈의 상이한 뉴클레오타이드 서열에 결합하는, 방법.
조항 20. 조항 14, 15, 16, 17, 18 또는 19에 있어서, 1종 이상의 유전자 변경 시약은 -20℃, 4℃ 또는 20℃ 내지 30℃에서 저장되는, 방법.
조항 21. 1종 이상의 안정화된 유전자 변경 시약을 포함하는 조성물로서, 조성물은 1종 이상의 유전자 변경 시약을 포함하고, 유전자 변경 시약의 수분 함량은 10%(w/w) 미만인, 조성물.
조항 22. 조항 21에 있어서, 수분 함량은 약 0.2% 내지 약 8%인, 조성물.
조항 23. 조항 21 또는 22에 있어서, 1종 이상의 유전자 변경 시약 중 적어도 하나는
(a) TAL 효과기-뉴클레아제 융합 단백질,
(b) TAL 효과기-뉴클레아제 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자,
(c) 아연 핑거-뉴클레아제 융합 단백질,
(d) 아연 핑거-뉴클레아제 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자,
(e) Cas9 단백질,
(f) Cas9 단백질을 코딩하는 핵산 분자,
(g) 가이드 RNA, 및
(h) 가이드 RNA을 코딩하는 핵산 분자
로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 시약인, 조성물.
조항 24. 조항 21, 22 또는 23에 있어서, 안정화된 시약은
(a) 1종 이상의 완충제,
(b) 1종 이상의 프로테아제 저해제,
(c) 1종 이상의 뉴클레아제 저해제,
(d) 1종 이상의 염,
(e) 1종 이상의 탄수화물,
(f) 1종 이상의 형질감염 시약,
(g) 1종 이상의 폴리아민, 및
(h) 1종 이상의 배양 배지
로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 성분을 함유하는, 조성물.
조항 25. 조항 21, 22, 23 또는 24에 있어서, 50종 내지 100종의 개별 안정화된 유전자 변경 시약은 다중웰 플레이트의 상이한 웰에 배치된, 조성물.
SEQUENCE LISTING
<110> LIFE TECHNOLOGIES CORPORATION
<120> STABILIZED REAGENTS FOR GENOME MODIFICATION
<130> WO2017/087842
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<170> PatentIn version 3.5
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<211> 34
<212> PRT
<213> Xanthomonas sp.
<400> 1
Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys
1 5 10 15
Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala
20 25 30
His Gly
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide"
<400> 2
ccatcatatg cataccgaaa tgc 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide"
<220>
<221> modified_base
<222> (21)..(21)
<223> a, c, t, g, unknown or other
<400> 3
gcatttcggt atgcatatga ngg 23
<210> 4
<211> 104
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide"
<400> 4
gcauuucggu augcauauga augaguuuua gagcuagaaa uagcaaguua aaauaaggcu 60
aguccguuau caacuugaaa aaguggcacc gagucggugc uuuu 104
Claims (25)
1종 이상의 안정화된 유전자 변경 시약(stabilized gene altering reagent)을 제조하는 방법으로서,
(a) 용매 중에 1종 이상의 유전자 변경 시약을 제조하는 단계, 및
(b) (a)의 상기 용매의 80% 초과분을 제거하는 단계를 포함하는, 1종 이상의 안정화된 유전자 변경 시약을 제조하는 방법.
(a) 용매 중에 1종 이상의 유전자 변경 시약을 제조하는 단계, 및
(b) (a)의 상기 용매의 80% 초과분을 제거하는 단계를 포함하는, 1종 이상의 안정화된 유전자 변경 시약을 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 용매는 물, 1종 이상의 알코올 또는 물과 1종 이상의 알코올의 혼합물인, 1종 이상의 안정화된 유전자 변경 시약을 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 1종 이상의 유전자 변경 시약 중 적어도 하나는,
(a) TAL 효과기-뉴클레아제 융합 단백질,
(b) TAL 효과기-뉴클레아제 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자,
(c) 아연 핑거-뉴클레아제 융합 단백질,
(d) 아연 핑거-뉴클레아제 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자,
(e) Cas9 단백질,
(f) Cas9 단백질을 코딩하는 핵산 분자,
(g) 가이드 RNA 및
(h) 가이드 RNA를 코딩하는 핵산 분자
로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 시약인, 1종 이상의 안정화된 유전자 변경 시약을 제조하는 방법.
(a) TAL 효과기-뉴클레아제 융합 단백질,
(b) TAL 효과기-뉴클레아제 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자,
(c) 아연 핑거-뉴클레아제 융합 단백질,
(d) 아연 핑거-뉴클레아제 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자,
(e) Cas9 단백질,
(f) Cas9 단백질을 코딩하는 핵산 분자,
(g) 가이드 RNA 및
(h) 가이드 RNA를 코딩하는 핵산 분자
로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 시약인, 1종 이상의 안정화된 유전자 변경 시약을 제조하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 물은 동결건조(lyophilization), 분무 건조, 분무 냉동 건조(spray freeze drying), 초임계 유체 건조 또는 진공 원심분리에 의해 제거되는, 1종 이상의 안정화된 유전자 변경 시약을 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 수용액 중의 상기 1종 이상의 유전자 변경 시약으로부터 상기 용매의 80% 내지 99.5%가 제거된, 1종 이상의 안정화된 유전자 변경 시약을 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 개별 유전자 변경 시약이 다중웰 플레이트의 2개 이상의 웰에 배치되는, 1종 이상의 안정화된 유전자 변경 시약을 제조하는 방법.
제6항에 있어서, 상기 개별 유전자 변경 시약은 상기 용매 중의 다중웰 플레이트의 웰에 첨가되는, 1종 이상의 안정화된 유전자 변경 시약을 제조하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 수성 용매 중 일부 또는 전부는 상기 개별 유전자 변경 시약으로부터 제거되는 한편, 상기 개별 유전자 변경 시약은 상기 다중웰 플레이트의 웰에 있는, 1종 이상의 안정화된 유전자 변경 시약을 제조하는 방법.
제6항에 있어서, 50종 내지 100종의 개별 유전자 변경 시약이 상기 다중웰 플레이트의 상이한 웰에 배치되는, 1종 이상의 안정화된 유전자 변경 시약을 제조하는 방법.
제6항에 있어서, 상기 개별 유전자 변경 시약은 동일한 유기체의 게놈의 상이한 뉴클레오타이드 서열에 결합하는, 1종 이상의 안정화된 유전자 변경 시약을 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 수용액은,
(a) 1종 이상의 완충제,
(b) 1종 이상의 프로테아제 저해제,
(c) 1종 이상의 뉴클레아제 저해제,
(d) 1종 이상의 염,
(e) 1종 이상의 탄수화물,
(f) 1종 이상의 형질감염 시약,
(g) 1종 이상의 폴리아민, 및
(h) 1종 이상의 배양 배지
로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 성분을 함유하는, 1종 이상의 안정화된 유전자 변경 시약을 제조하는 방법.
(a) 1종 이상의 완충제,
(b) 1종 이상의 프로테아제 저해제,
(c) 1종 이상의 뉴클레아제 저해제,
(d) 1종 이상의 염,
(e) 1종 이상의 탄수화물,
(f) 1종 이상의 형질감염 시약,
(g) 1종 이상의 폴리아민, 및
(h) 1종 이상의 배양 배지
로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 성분을 함유하는, 1종 이상의 안정화된 유전자 변경 시약을 제조하는 방법.
제11항에 있어서, 상기 탄수화물은 수크로스, 트레할로스, 락토수크로스 또는 사이클로덱스트린 중 1종 이상인, 1종 이상의 안정화된 유전자 변경 시약을 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 물의 제거 전의 상기 수용액의 pH는 4 내지 약 11인, 1종 이상의 안정화된 유전자 변경 시약을 제조하는 방법.
1종 이상의 유전자 변경 시약을 저장하는 방법으로서,
(a) 수용액 중에 1종 이상의 유전자 변경 시약을 제조하는 단계,
(b) (a)에서 제조된 수용액으로부터 90% 초과의 물을 제거하는 단계, 및
(c) 75% 초과의 유전자 변경 기능 활성도(gene altering functional activity)가 30일 저장 후 유지되는 조건 하에 1종 이상의 유전자 변경 시약을 놓는 단계를 포함하는, 1종 이상의 유전자 변경 시약을 저장하는 방법.
(a) 수용액 중에 1종 이상의 유전자 변경 시약을 제조하는 단계,
(b) (a)에서 제조된 수용액으로부터 90% 초과의 물을 제거하는 단계, 및
(c) 75% 초과의 유전자 변경 기능 활성도(gene altering functional activity)가 30일 저장 후 유지되는 조건 하에 1종 이상의 유전자 변경 시약을 놓는 단계를 포함하는, 1종 이상의 유전자 변경 시약을 저장하는 방법.
제14항에 있어서, 적어도 하나 또는 상기 1종 이상의 유전자 변경 시약의 90% 초과의 유전자 변경 기능 활성도가 적어도 30일 저장 후 유지되는, 1종 이상의 유전자 변경 시약을 저장하는 방법.
제14항에 있어서, 적어도 하나 또는 상기 1종 이상의 유전자 변경 시약의 90% 초과의 유전자 변경 기능 활성도가 저장의 120일 후 유지되는, 1종 이상의 유전자 변경 시약을 저장하는 방법.
제14항에 있어서, 상기 1종 이상의 유전자 변경 시약 중 하나 초과는 동일한 저장 용기에서 저장되는, 1종 이상의 유전자 변경 시약을 저장하는 방법.
제17항에 있어서, 상기 저장 용기는 다중웰 플레이트인, 1종 이상의 유전자 변경 시약을 저장하는 방법.
제17항에 있어서, 상기 개별 유전자 변경 시약은 동일한 유기체의 게놈의 상이한 뉴클레오타이드 서열에 결합하는, 1종 이상의 유전자 변경 시약을 저장하는 방법.
제14항에 있어서, 상기 1종 이상의 유전자 변경 시약은 -20℃, 4℃ 또는 20℃ 내지 30℃에서 저장되는, 1종 이상의 유전자 변경 시약을 저장하는 방법.
1종 이상의 안정화된 유전자 변경 시약을 포함하는 조성물로서,
1종 이상의 유전자 변경 시약을 포함하되,
상기 유전자 변경 시약의 수분 함량은 10%(w/w) 미만인, 조성물.
1종 이상의 유전자 변경 시약을 포함하되,
상기 유전자 변경 시약의 수분 함량은 10%(w/w) 미만인, 조성물.
제21항에 있어서, 상기 수분 함량은 약 0.2% 내지 약 8%인, 조성물.
제21항에 있어서, 상기 1종 이상의 유전자 변경 시약 중 적어도 하나는,
(a) TAL 효과기-뉴클레아제 융합 단백질,
(b) TAL 효과기-뉴클레아제 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자,
(c) 아연 핑거-뉴클레아제 융합 단백질,
(d) 아연 핑거-뉴클레아제 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자,
(e) Cas9 단백질,
(f) Cas9 단백질을 코딩하는 핵산 분자,
(g) 가이드 RNA, 및
(h) 가이드 RNA을 코딩하는 핵산 분자
로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 시약인, 조성물.
(a) TAL 효과기-뉴클레아제 융합 단백질,
(b) TAL 효과기-뉴클레아제 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자,
(c) 아연 핑거-뉴클레아제 융합 단백질,
(d) 아연 핑거-뉴클레아제 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자,
(e) Cas9 단백질,
(f) Cas9 단백질을 코딩하는 핵산 분자,
(g) 가이드 RNA, 및
(h) 가이드 RNA을 코딩하는 핵산 분자
로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 시약인, 조성물.
제21항에 있어서, 상기 안정화된 시약은,
(a) 1종 이상의 완충제,
(b) 1종 이상의 프로테아제 저해제,
(c) 1종 이상의 뉴클레아제 저해제,
(d) 1종 이상의 염,
(e) 1종 이상의 탄수화물,
(f) 1종 이상의 형질감염 시약,
(g) 1종 이상의 폴리아민, 및
(h) 1종 이상의 배양 배지
로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 성분을 함유하는, 조성물.
(a) 1종 이상의 완충제,
(b) 1종 이상의 프로테아제 저해제,
(c) 1종 이상의 뉴클레아제 저해제,
(d) 1종 이상의 염,
(e) 1종 이상의 탄수화물,
(f) 1종 이상의 형질감염 시약,
(g) 1종 이상의 폴리아민, 및
(h) 1종 이상의 배양 배지
로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 성분을 함유하는, 조성물.
제21항에 있어서, 50종 내지 100종의 개별 안정화된 유전자 변경 시약이 다중웰 플레이트의 상이한 웰에 배치된, 조성물.
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