WO2022145465A1 - 新規ガイド核酸機構による遺伝子機能制御 - Google Patents

新規ガイド核酸機構による遺伝子機能制御 Download PDF

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WO2022145465A1
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argonaute
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敬二 西田
仁志 光延
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国立大学法人神戸大学
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    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales

Definitions

  • the present disclosure relates to a site-specific modification method of a DNA molecule that enables manipulation of gene function.
  • the CRISPR system possessed by bacteria and archaea has attracted attention as a DNA sequence recognition mechanism using guide nucleic acids, and has been applied as a genome editing technology.
  • the CRISPR system utilizes small RNAs (guide RNAs) that are complementary to DNA sequences that invade bacteria to facilitate targeting and degradation of targeted foreign DNA.
  • Argonaute proteins derived from bacteria can recognize DNA sequences using guide RNA.
  • This Argonaute protein is a guide RNA-dependent RNA target molecule responsible for RNAi in eukaryotes, and the present disclosure utilizes this Argonaute protein as a novel genome editing mechanism and is a site of a DNA molecule that enables manipulation of gene function. A specific modification method is provided.
  • the present disclosure provides: (Item 1) It is a method for manipulating gene function by acting site-specifically on a target DNA molecule. A step of providing a complex containing an Argonaute protein, a guide RNA, and an additional sequence, and A method comprising contacting a target DNA molecule with the complex, wherein the guide RNA is designed to direct the complex to a region of the target DNA molecule containing a site of interest. (Item 2) The method according to the above item, wherein the Argonaute protein has an activity of targeting DNA. (Item 3) The method according to any one of the above items, wherein the Argonaute protein has an activity of targeting DNA at a physiological temperature.
  • (Item 4) The method according to any one of the above items, wherein the Argonaute protein is derived from a prokaryote.
  • (Item 5) The method according to any one of the above items, wherein the Argonaute protein is derived from a bacterium.
  • (Item 6) The method according to any one of the above items, wherein the Argonaute protein is RsAgo derived from Rhodobactor.
  • (Item 7) The method according to any one of the above items, wherein the complex is formed in vitro.
  • (Item 8) The method according to any one of the above items, wherein the complex is formed in vitro and the target DNA molecule is present in vivo.
  • (Item A1) A method for regulating the expression of a target DNA molecule, A step of providing a complex containing an Argonaute protein, a guide RNA, and an additional sequence, and The step of dissociating at least a part of the double-stranded DNA sequence in the target DNA molecule, The guide RNA comprises contacting the complex with at least a partially dissociated double-stranded DNA sequence, the guide RNA in a region containing the double-stranded DNA sequence at least partially dissociated.
  • a method designed to guide (Item A2) The method according to any one of the above items, wherein the Argonaute protein has an activity of targeting DNA.
  • (Item A3) The method according to any one of the above items, wherein the Argonaute protein has an activity of targeting DNA at a physiological temperature.
  • (Item A4) The method according to any one of the above items, wherein the Argonaute protein is derived from a prokaryote.
  • (Item A5) The method according to any one of the above items, wherein the Argonaute protein is derived from a bacterium.
  • the Argonaute protein is RsAgo derived from Rhodobactor.
  • (Item A7) The method according to any one of the above items, wherein the complex is formed in vitro.
  • (Item A8) The method according to any one of the above items, wherein the complex is formed in vitro and the target DNA molecule is present in vivo.
  • (Item B1) Argonaute-guide RNA complex, Argonaute protein and A guide RNA complex comprising a synthesized guide RNA polynucleotide, wherein the guide sequence is designed such that the Argonaute-guide RNA complex points to a target DNA molecule having a target proximity motif sequence.
  • (Item B2) The complex according to any one of the above items, wherein the Argonaute protein has an activity of targeting DNA.
  • (Item B3) The complex according to any one of the above items, wherein the Argonaute protein has an activity of targeting DNA at a physiological temperature.
  • (Item B4) The complex according to any one of the above items, wherein the Argonaute protein is derived from a prokaryote.
  • (Item B5) The complex according to any one of the above items, wherein the Argonaute protein is derived from a bacterium.
  • (Item B6) The complex according to any one of the above items, wherein the Argonaute protein is RsAgo derived from Rhodobactor.
  • (Item C1) An Argonaute-guide RNA complex for site-specific action of target DNA molecules to manipulate gene function.
  • the guide sequence is designed such that the Argonaute-guide RNA complex points to a target DNA molecule having a target proximity motif sequence, and the complex is directed to the target molecule.
  • An Argonaute-guide RNA complex that acts site-specificly on the target DNA molecule by binding to manipulate gene function.
  • (Item C4) The complex according to any one of the above items, wherein the Argonaute protein is derived from a prokaryote.
  • (Item C5) The complex according to any one of the above items, wherein the Argonaute protein is derived from a bacterium.
  • (Item C6) The complex according to any one of the above items, wherein the Argonaute protein is RsAgo derived from Rhodobactor.
  • the complex according to any one of the above items, wherein the manipulation of the gene function comprises controlling gene expression, modifying the gene sequence, and / or both.
  • (Item C8) The complex according to any one of the above items, wherein the manipulation of the gene function comprises regulation of gene expression.
  • (Item C9) The complex according to any one of the above items, wherein the manipulation of the gene function comprises a gene sequence modification.
  • (Item D1) An Argonaute-guide RNA complex for regulating the expression of target DNA molecules. Argonaute protein and Including the synthesized guide RNA polynucleotide, the guide sequence is designed such that the Argonaute-guide RNA complex points to a target DNA molecule having a target proximity motif sequence, and the complex is directed to the target molecule. An Argonaute-guide RNA complex whose expression of the target DNA molecule is regulated by binding.
  • (Item D2) The complex according to any one of the above items, wherein the Argonaute protein has an activity of targeting DNA.
  • (Item D3) The complex according to any one of the above items, wherein the Argonaute protein has an activity of targeting DNA at a physiological temperature.
  • (Item D4) The complex according to any one of the above items, wherein the Argonaute protein is derived from a prokaryote.
  • (Item D5) The complex according to any one of the above items, wherein the Argonaute protein is derived from a bacterium.
  • the Argonaute protein is RsAgo derived from Rhodobactor.
  • (Item E1) A system or kit for manipulating gene function by acting site-specifically on a target DNA molecule.
  • a system or kit comprising a target DNA molecule with means or reagents for contacting the complex and the guide RNA being designed to direct the complex to a region of interest in the target DNA molecule. ..
  • the Argonaute protein has an activity of targeting DNA at a physiological temperature.
  • the system or kit according to any one of the above items, wherein the Argonaute protein is of prokaryotic origin.
  • (Item E5) The system or kit according to any one of the above items, wherein the Argonaute protein is of bacterial origin.
  • (Item E6) The system or kit according to any one of the above items, wherein the Argonaute protein is RsAgo derived from Rhodobactor.
  • (Item E7) The system or kit according to any one of the above items, comprising means for forming the complex in vitro.
  • (Item F1) A system or kit for regulating the expression of a target DNA molecule, With two or more complexes, including Argonaute proteins, guide RNAs and additional sequences, or two or more of them.
  • the double-stranded DNA sequence, which is at least partially dissociated comprises means or reagents for contacting the complex, and the guide RNA comprises the complex, which is at least partially dissociated.
  • a system or kit designed to guide you to the area. (Item F2) The system or kit according to any one of the above items, wherein the Argonaute protein has an activity of targeting DNA.
  • (Item F3) The system or kit according to any one of the above items, wherein the Argonaute protein has an activity of targeting DNA at a physiological temperature.
  • (Item F4) The system or kit according to any one of the above items, wherein the Argonaute protein is of prokaryotic origin.
  • (Item F5) The system or kit according to any one of the above items, wherein the Argonaute protein is of bacterial origin.
  • (Item F6) The system or kit according to any one of the above items, wherein the Argonaute protein is RsAgo derived from Rhodobactor.
  • (Item F7) The system or kit according to any one of the above items, further comprising means for forming the complex in vitro.
  • (Item F8) The system or kit according to any one of the above items, further comprising means for forming the complex in vitro, wherein the target DNA molecule is present in vivo.
  • (Item G1) The use of an Argonaute-guide RNA complex for site-specific action of a target DNA molecule to manipulate gene function, wherein the Argonaute-guide RNA complex is used.
  • Argonaute protein and Including the synthesized guide RNA polynucleotide, the guide sequence is designed such that the Argonaute-guide RNA complex points to a target DNA molecule having a target proximity motif sequence, and the complex is directed to the target molecule.
  • Use where binding acts site-specificly on the target DNA molecule to manipulate gene function.
  • (Item G2) The use according to any one of the above items, wherein the Argonaute protein has an activity of targeting DNA.
  • (Item G3) The use according to any one of the above items, wherein the Argonaute protein has an activity of targeting DNA at a physiological temperature.
  • (Item G4) The use according to any one of the above items, wherein the Argonaute protein is of prokaryotic origin.
  • (Item G5) The use according to any one of the above items, wherein the Argonaute protein is of bacterial origin.
  • (Item G6) The use according to any one of the above items, wherein the Argonaute protein is RsAgo derived from Rhodobactor.
  • (Item G7) The use according to any one of the above items, wherein the manipulation of the gene function comprises controlling gene expression, modifying the gene sequence, and / or both.
  • (Item G8) The compound use according to any one of the above items, wherein the manipulation of the gene function includes the regulation of gene expression.
  • (Item G9) The use according to any one of the above items, wherein the manipulation of the gene function comprises a gene sequence modification.
  • (Item H1) The use of an Argonaute-guide RNA complex to regulate the expression of a target DNA molecule, wherein the Argonaute-guide RNA complex is used.
  • the guide sequence is designed such that the Argonaute-guide RNA complex points to a target DNA molecule having a target proximity motif sequence, and the complex is directed to the target molecule.
  • Use where binding regulates the expression of the target DNA molecule.
  • the Argonaute protein has an activity of targeting DNA.
  • the Argonaute protein has an activity of targeting DNA at a physiological temperature.
  • the Argonaute protein is of prokaryotic origin.
  • the Argonaute protein-guide RNA complex disclosed in the present disclosure can specifically regulate gene expression in a target-specific manner, and can also localize effectors that act on DNA, such as via an aptamer added to the guide RNA. Therefore, it can be expected to be applied to various genome editing.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the fusion of an aptamer to the Argonaute protein-guide RNA complex of the present disclosure.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing purification of recombinant RsAgo protein.
  • FIG. 3 is a schematic diagram showing a confirmation test of nucleic acid binding ability.
  • FIG. 4 shows the test results of the nucleic acid binding ability of the RsAgo protein.
  • FIG. 5 shows the test results of the binding affinity of the RsAgo protein to the target sequence.
  • FIG. 6 shows the sequence-dependent test results of binding of the RsAgo protein to the target sequence.
  • FIG. 7 is a schematic diagram showing guide RNA-aptamer synthesis by In vitro translation.
  • FIG. 8 is a diagram showing the results of synthesis of guide RNA to which an aptamer is added.
  • FIG. 9 is a diagram showing the binding result of the guide RNA-aptamer to the target sequence.
  • FIG. 10 shows the results showing sequence-specific DNA binding by RNA with RsAgo and aptamer added.
  • FIG. 11 is a diagram showing the result of binding of the RsAgo protein to the partial single-stranded region.
  • FIG. 12 is a result showing specific binding to a single-stranded DNA containing a target sequence of RsAgo protein.
  • FIG. 13 is a diagram showing the results of action of the RsAgo protein on the gene expression region.
  • the "Argonaute protein” is a constituent protein of RISC (RNA-induced silencing complex), which is a central structure in RNA silencing via small RNA. It binds to a single-stranded RNA that acts as a guide to form RISC, and this complex catalyzes the cleavage of mRNA with a sequence complementary to the single-stranded RNA bound to Argonaute. It is an essential regulator of gene expression in plants and animals.
  • Ago is composed of four domains (N domain, PAZ domain, MID domain, PIWI domain) and two linkers (L1 linker and L2 linker), and has a molecular weight of about 100 kDa.
  • RNAs such as siRNA and miRNA are usually biosynthesized as double-stranded RNA and bind to Ago as double-stranded RNA.
  • one strand (passenger strand) of the double-stranded RNA strand is torn off in Ago, mature RISC in which only the other strand (guide strand) is incorporated into Ago is formed.
  • the RISC thus formed uses the sequence complementarity of the guide strand to find a specific target mRNA, which causes destabilization by suppressing translation or shortening the poly A strand (miRNA pathway).
  • RNAi pathway cleave target mRNA
  • any Ago is included.
  • UniProt's Entry PS50822 https://prosite.expasy.org/PS50822
  • Rhodobacter sphereeroides ATCC 17025 GenBank: ABP72561.1, https://www.uniprot). .org / uniprot / Q9UKV8
  • guide RNA refers to an RNA molecule containing a sequence complementary to a target and a motif sequence necessary for forming a complex with an effector protein or a structure therefor.
  • the guide RNA is an RNA that induces the Argonaute protein to specifically target the DNA sequence, and has a function of binding to the Argonaute protein of the present disclosure and guiding the protein to the target DNA.
  • the "target proximity motif sequence” refers to a sequence that is present in a target double-stranded polynucleotide and is recognizable by the Argonaute protein and / or the Argonaute protein-guide RNA complex.
  • the length and base sequence of the target proximity motif sequence differ depending on the bacterial species from which the Argonaute protein is derived. For example, in the case of RsAgo derived from Rhodobacter sphaeroides, it is sufficient to have only T on the 5'side as the target proximity motif sequence.
  • the term "endonuclease” means an enzyme that cleaves the middle of a nucleotide chain.
  • the Argonaute protein of the present disclosure has endonuclease activity, it has an enzymatic activity that is induced by a guide RNA and cleaves a DNA strand.
  • “manipulation of gene function” includes cleavage, modification, and / or modification of a DNA sequence and suppression, control, and / or regulation of expression of a gene consisting of the DNA sequence. ..
  • protein means a polymer of amino acid residues, and is used interchangeably with “polypeptide” and “peptide”.
  • one or more amino acids means an amino acid polymer, which is a chemically analog or modified derivative of a naturally occurring corresponding amino acid.
  • DNA sequence means a nucleotide sequence of any length, which may be a deoxyribonucleotide or a ribonucleotide, and may be linear, circular, or branched. It is a chain or a double chain.
  • N means any one base selected from the group consisting of adenine, cytosine, thymine and guanine
  • A means adenine
  • G means guanine
  • C means guanine.
  • Cytosine, "T” means thymine
  • R means a base having a purine skeleton (adenine or guanine)
  • Y means a base having a pyrimidine skeleton (cytosine or thymine).
  • polynucleotide means a deoxyribonucleotide or ribonucleotide polymer that is linear or cyclic and is in either single-stranded or double-stranded form, with respect to the length of the polymer. It is not interpreted as a limitation. It also includes known analogs of natural nucleotides as well as nucleotides (eg, phosphorothioate skeletons) that are modified in at least one of the base, sugar and phosphate moieties. In general, analogs of a particular nucleotide have the same base pairing specificity, for example, analogs of A base pair with T.
  • an "additional sequence” is any sequence that can be added to a guide RNA, allowing the guide RNA to specifically bind to a particular molecule and / or a catalyst. It is meant to have activity.
  • the additional sequence includes any nucleic acid aptamer.
  • a method for manipulating gene function by acting site-specifically on a target DNA molecule the step of providing a complex containing an Argonaut protein, a guide RNA, and an additional sequence, and a target.
  • a method comprising contacting a DNA molecule with the complex, wherein the guide RNA is designed to direct the complex to a region of the target DNA molecule containing a site of interest.
  • the method of the present disclosure is useful as a genome editing technique.
  • the CRISPR system is mainly used, but in the CRISPR system, about 20 RNA molecules following the PAM sequence of about 2 to 5 bases that define the target specificity are targeted. Due to the limitation of being used for, there will be gene loci for which target design is impossible. In addition, if there is a similar sequence near the target cleavage sequence, the similar sequence may be truncated. Furthermore, in the genome editing technology using the CRISPR system, those that have been put into practical use have a relatively large molecular weight, and there are still problems in intracellular delivery and immunogenicity.
  • Some bacterial Argonaute proteins can recognize DNA sequences using guide RNA.
  • this bacterium-derived Argonaute protein can be utilized as a novel genome editing mechanism.
  • the Argonaute protein (Ago) used in the present disclosure may be derived from any organism as long as it has RNA-induced DNA targeting activity, and is derived from a prokaryote. May be. It is preferable that the Argonaute protein is derived from a bacterium.
  • Argonaute protein MpAgo derived from Marinitoga piezophila, TpAgo derived from Thermotoga profunda, RsAgo derived from Rhodobacter sphaeroides, and the like can be used.
  • Argonaute MpAgo derived from Marinitoga piezophila, TpAgo derived from Thermotoga profunda, RsAgo derived from Rhodobacter sphaeroides, and the like.
  • Argonaute MpAgo derived from Marinitoga piezophila
  • RsAgo derived from Rhodobacter sphaeroides and the like.
  • ⁇ Argonaute Mesorhizobium sp ⁇ Bradyrhizobium centrolobii ⁇ Calothrix desertica PCC 7102 ⁇ Planctomycetes bacterium Mal33 ⁇ Elusimicrobia bacterium RBG_16_66_12 ⁇ Dehalococco
  • the Argonaute protein has a molecular weight of about 100 kDa, and can be significantly smaller than the 160 kDa of CRISPR-Cas9 of Streptococcus pyogenes widely used in conventional genome editing technology.
  • the guide RNA that binds to the Argonaute protein also becomes smaller because it does not have a Scaffold structural sequence or the like.
  • the sequence that can be the target of the Argonaut protein-guide RNA complex of the present disclosure need only have T on the 5'side as the target proximity motif sequence, and is required for target recognition in the standard Streptococcus pyogenes CRISPR-Cas9. The constraint is smaller than that of GG, which is a simple PAM sequence.
  • a complex of the Argonaute protein and the guide RNA can be formed extracellularly or in vitro.
  • the target DNA molecule is present in vivo and the Argonaute protein-guide RNA complex formed extracellularly or in vitro binds in vivo.
  • an additional sequence can be further bound to the guide RNA to form an effector such as an enzyme site that acts on the target DNA.
  • the additional sequence may be any sequence as long as it can specifically bind to a specific molecule, and examples thereof include sequences and structures recognized by aptamers, ribozymes, and RNA-binding proteins. Can be done.
  • as the aptamer MS2 aptamer, PP7, TAR and the like can be used.
  • the complex of Argonaute protein and aptamer fusion guide RNA can specifically bind to the target DNA sequence.
  • the Argonaute protein can have DNA-targeting activity, preferably DNA-targeting activity at physiological temperatures.
  • the complex of the Argonaute protein of the present disclosure and a guide RNA can regulate the expression of the gene by inducing and targeting the gene expression in a closed double-stranded DNA. ..
  • the expression of the gene of interest can be improved or activated.
  • the Argonaute-guide RNA complex of the present disclosure can specifically bind to the double-stranded DNA that has induced gene expression and suppress the gene expression.
  • the guide RNA so that it binds to the strand opposite the transcription template of the target gene, the expression of the target gene can be suppressed.
  • the guide RNA may be any RNA that directs the Argonaute protein to specifically target the DNA sequence, preferably the Argonaute-guide RNA complex at the site of interest in the target DNA molecule. Designed to guide to areas containing. The guide RNA recognizes the target DNA having only T on the 5'side as the target proximity motif sequence and binds to its complementary sequence. In one embodiment, the guide RNA has a sequence complementary to the target DNA at its 5'end and binds to the target DNA via the complementary sequence to make the Argonaute protein of the present disclosure into the target DNA. Guide.
  • the DNA when the Argonaute protein functions as a DNA endonuclease, the DNA can be cleaved at the site where the target DNA is present, for example, the function of the target DNA can be specifically lost.
  • Guide RNA is designed and prepared based on the sequence information of the target DNA to be cleaved or modified. Specific examples thereof include sequences as used in the examples.
  • the Argonaute protein-guide RNA complex of the present disclosure can be provided as a complex containing an Argonaute protein, a guide RNA, and an additional sequence.
  • Any sequence such as an aptamer can be prepared to form a complex extracellularly or intracellularly.
  • the step of contacting the Argonaute protein-guide RNA complex with the target DNA molecule is such that the Argonaute protein-guide RNA complex of the present disclosure is expressed on the DNA containing the target sequence, for example, gene expression.
  • the Argonaute protein-guide RNA complex of the present disclosure can thus control its gene expression by binding to the DNA containing the target sequence during gene expression.
  • a method for regulating the expression of a target DNA molecule the step of providing a complex comprising an Argonaute protein, a guide RNA and an additional sequence, and a double-stranded DNA in the target DNA molecule.
  • the guide RNA comprises a step of dissociating at least a part of the sequence and a step of contacting the complex with a double-stranded DNA sequence at least partially dissociated, wherein the guide RNA dissociates at least a part of the complex.
  • a method is provided that is designed to direct to a region containing the double-stranded DNA sequence.
  • the step of dissociating at least a part of a double-stranded DNA sequence in a target DNA molecule includes, for example, partially dissociating the double-stranded DNA by gene expression or the like.
  • the step of contacting an Argonaute protein-guide RNA complex with a double-stranded DNA sequence that is at least partially dissociated dissociates at least a partially dissociated Argonaute protein-guide RNA complex.
  • This includes binding the double-stranded DNA sequence to a partially dissociated state due to, for example, gene expression.
  • the Argonaute protein-guide RNA complex of the present disclosure can thus control its gene expression by binding to the DNA containing the target sequence during gene expression.
  • the complex with the Argonaute protein and the guide RNA of the present disclosure can be obtained by various methods, but preferably can be obtained by the method described in this example. In other embodiments, the complex with the Argonaute protein or guide RNA of the present disclosure can be obtained by any method as long as it exerts the actions and effects shown herein.
  • the Argonaute protein-guide RNA complex of the present disclosure targets a site in which the double-stranded structure is dissociated by gene expression or DNA replication in a target cell, and the gene containing the target site is targeted. By suppressing the expression of, the cell function can be changed and the gene function analysis can be performed.
  • the Argonaute protein-guide RNA complex of the present disclosure targets a sequence possessed only by a specific cell group in a heterogeneous cell population in order to target only a specific cell group. Gene function can be controlled.
  • the Argonaute protein-guide RNA complex of the present disclosure can also cause an increase in target site-specific gene expression by binding to a transcription factor via an aptamer or the like.
  • the DNA of the target sequence and its surroundings is modified by binding the Argonaute protein-guide RNA complex of the present disclosure to a nuclease, recombinase, deaminase, glycosyllase, etc. via an aptamer or the like. Can be done.
  • a chromatin modifying factor such as a methylating enzyme, a demethylase, or a histone acetylase, the chromatin modification state in and around the target sequence can be changed.
  • the present disclosure provides a method of modifying the target site of double-stranded DNA (eg, chromosomal DNA, mitochondrial DNA, chloroplast DNA; hereinafter collectively referred to as "genomic DNA”). do.
  • the method comprises contacting the Argonaute protein with the guide RNA complex with the double-stranded DNA.
  • modification of double-stranded DNA means that one nucleotide (eg, dA, dC, dG or dT) or nucleotide sequence on the DNA strand is replaced with another nucleotide or nucleotide sequence, or It means that another nucleotide or nucleotide sequence is inserted between one nucleotide on the DNA strand.
  • the double-stranded DNA to be modified is not particularly limited, but is preferably genomic DNA.
  • the term "donor DNA” means a DNA containing a foreign insertion sequence, and the donor DNA usually has two regions upstream and downstream of the target site, which are adjacent to the target site (hereinafter, “adjacent”). It contains two types of sequences (hereinafter also referred to as “homology arms”) that are homologous to the sequences of "regions"). When distinguishing each homology arm, it may be distinguished by "5'homology arm” and “3'homology arm”. Further, the "target site” of the double-stranded DNA means a region to be replaced by an insertion sequence contained in the donor DNA, or an interval between nucleotides into which the insertion sequence is to be inserted, and the target site. Does not include the adjacent sequence.
  • sequence homologous to the adjacent region of the target site is not only a sequence that is completely identical, but is preferably 80% or more (eg, 85) with respect to the sequence that is completely identical as long as homologous recombination can occur in the cell. % Or more, 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more) may be a sequence having the same identity.
  • the donor DNA may be linear (eg, synthetic double-stranded DNA), circular (eg, plasmid DNA), or single-stranded DNA (eg, single-stranded oligodeoxynucleotide). (SsODN)) or double-stranded DNA.
  • the donor DNA can be appropriately designed depending on the base length of the insertion sequence, the homologous recombination activity of the host cell, and the like. For example, if the insertion sequence has a length of 100 bases or less, ssODN or synthetic double-stranded DNA is usually used, and if it is longer than that, synthetic double-stranded DNA or plasmid DNA is usually used.
  • the length of the donor DNA is also not particularly limited, and can be appropriately designed depending on the length of the insertion sequence and the like.
  • the length of the inserted sequence is not particularly limited, and is usually in the range of 1 base length to tens of thousands of bases (for example, in the case of ssODN, 100 bases or less (eg, 70 bases or less, 50 bases or less)). It can be appropriately designed according to the purpose.
  • the length of each homology arm is also not particularly limited, and when the donor DNA is ssODN, one having a length of 10 to 150 bases is usually used, and when the donor DNA is a synthetic double-stranded DNA, it is usually 10 to.
  • the donor DNA is a plasmid DNA
  • a DNA having a length of 5,000 bases is usually used, and a DNA having a length of 100 to 5,000 bases, preferably 500 bases to 1,000 bases is preferably used.
  • donor DNAs refer to publicly known documents (eg, Ochiai H, Int J Mol Sci, 16: 21128-21137 (2015), Hockemeyer D et al., Nat Biotefchnol, 27: 851-857 (2009)). Can be designed.
  • the "nucleic acid sequence recognition module” means a molecule or molecular complex having the ability to specifically recognize and bind to a specific nucleotide sequence (that is, a target nucleotide sequence) on a DNA strand.
  • a specific nucleotide sequence that is, a target nucleotide sequence
  • the Argonaute protein linked to the module is transferred to the site targeted by the double-stranded DNA Argonaute protein or the like (that is, the target nucleotide sequence and the nucleotides in the vicinity thereof). Allows for specific action.
  • the target site can be modified by introducing a complex of Argonaute protein and a nucleic acid sequence recognition module and donor DNA into cells.
  • nucleobase modifying enzyme complex is a nucleobase conversion reaction or nucleobase debasement to which a specific nucleotide sequence recognition ability is imparted, which comprises a complex in which the above nucleic acid sequence recognition module and an Argonaute protein are linked. It means a molecular complex having a catalytic function of a reaction.
  • the “complex” includes not only those composed of a plurality of molecules but also those having a nucleic acid sequence recognition module and an Argonaute protein in a single molecule, such as a fusion protein.
  • the origin of the Argonaute protein is not particularly limited, and for example, MpAgo derived from Marinitoga pizophila, TpAgo derived from Thermotoga profunda, RsAgo derived from Rhodobacter sphaeroides, and the like can be used.
  • Argonaute protein used in the present disclosure Argonaute protein derived from Mesorhizobium sp, Bradyrhizobium centrolobii, Calothrix desertica PCC 7102, Planctomycetes bacterium Mal33, Elusimicrobia bacterium RBG_16_66_12, Dehalococcoides cart, etc. can be used.
  • families containing homologues of these Argonaute proteins can also be used.
  • an oligo DNA primer is synthesized based on the cDNA sequence information of the enzyme to be used, and the enzyme is used. It can be cloned by using the total RNA or mRNA fraction prepared from the producing cells as a template and amplifying it by the RT-PCR method.
  • the DNA encoding the Argonaute protein is based on the cDNA sequence registered in the NCBI database (Rhodobacter sphaeroides ATCC 17025, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/ABP72561.1).
  • Appropriate primers can be designed for upstream and downstream of CDS and cloned from mRNA by the RT-PCR method.
  • the donor DNA can also be cloned in the same manner as described above based on the sequence information of the target site and the like.
  • Expression vectors include E. coli-derived viruses (eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13); Bacteriophage-derived plasmids (eg, pUB110, pTP5, pC194); Yeast-derived plasmids (eg, pSH19, pSH15); Insect cell expression.
  • Plasmids eg pFast-Bac
  • animal cell expression plasmids eg pA1-11, pXT1, pRc / CMV, pRc / RSV, pcDNAI / Neo
  • bacteriophage such as ⁇ phage
  • insect virus vectors such as baculovirus (eg) Examples: BmNPV, AcNPV); animal virus vectors such as retrovirus, vaccinia virus, adenovirus and the like are used.
  • the promoter may be any promoter as long as it is suitable for the host used for gene expression. Since the conventional method involving DSB may significantly reduce the viability of the host cell due to toxicity, it is desirable to increase the number of cells by the start of induction using an inducible promoter, but the nucleic acid modification of the present disclosure is made. Since sufficient cell proliferation can be obtained even if the enzyme complex is expressed, the constituent promoter can be used without limitation.
  • SR ⁇ promoter when the host is an animal cell, SR ⁇ promoter, SV40 promoter, LTR promoter, CMV (cytomegalovirus) promoter, RSV (Rous sarcoma virus) promoter, MoMuLV (Morony mouse leukemia virus) LTR, HSV-TK (herpes simplex virus). Virus thymidin kinase) promoter and the like are used.
  • CMV cytomegalovirus
  • RSV Raster sarcoma virus
  • MoMuLV MoMorony mouse leukemia virus
  • HSV-TK herpes simplex virus
  • Virus thymidin kinase thymidin kinase
  • a trp promoter When the host is Escherichia coli, a trp promoter, a lac promoter, a recA promoter, a ⁇ PL promoter, a lpp promoter, a T7 promoter and the like are preferable.
  • the SPO1 promoter, SPO2 promoter, penP promoter and the like are preferable.
  • Gal1 / 10 promoter When the host is yeast, Gal1 / 10 promoter, PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter and the like are preferable.
  • a polyhedrin promoter When the host is an insect cell, a polyhedrin promoter, a P10 promoter, or the like is preferable.
  • the CaMV35S promoter When the host is a plant cell, the CaMV35S promoter, CaMV19S promoter, NOS promoter and the like are preferable.
  • a vector containing an enhancer, a splicing signal, a terminator, a poly A addition signal, a drug resistance gene, a selection marker such as an auxotrophic complementary gene, an origin of replication, or the like is used, if desired. Can be done.
  • RNA encoding the nucleic acid sequence recognition module and / or the Argonaute protein or the like can be obtained by using, for example, a vector encoding the DNA encoding the nucleic acid sequence recognition module and / or the Argonaute protein or the like described above as a template in an in vitro transcription system known per se. It can be prepared by transcribing to mRNA.
  • an expression vector containing a nucleic acid sequence recognition module and / or a DNA encoding an Argonaute protein or the like into a host cell and culturing the host cell, a complex of the nucleic acid sequence recognition module and the Argonaute protein or the like can be obtained in the cell. Can be expressed.
  • Escherichia spp. for example, Escherichia spp., Bacillus spp., Yeast, insect cells, insects, animal cells and the like are used.
  • Escherichia spp. are Escherichia coli K12 / DH1 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60, 160 (1968)], Escherichia coli JM103 [Nucleic Acids Research, 9,309 ( 1981)], Escherichia coli JA221 [Journal of Molecular Biology, 120, 517 (1978)], Escherichia coli HB101 [Journal of Molecular Biology, 41, 459 (1969)], Escherichia coli C600 [Genetics, 39, 440] (1954)] etc. are used.
  • Bacillus genus for example, Bacillus subtilis MI114 [Gene, 24, 255 (1983)], Bacillus subtilis 207-21 [Journal of Biochemistry, 95, 87 (1984)] and the like are used.
  • yeast examples include Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R-, NA87-11A, DKD - 5D, 20B-12, Schizosaccharomyces pombe NCYC1913, NCYC2036, Pichia pastoris. KM71 etc. are used.
  • insect cells for example, when the virus is AcNPV, Spodoptera frugiperda cells (Sf cells), MG1 cells derived from the middle intestine of Trichoplusia ni, and High Five TM cells derived from eggs of Trichoplusia ni. , Cells derived from Mamestra brassicae, cells derived from Estigmena acrea, etc. are used.
  • Sf cells for example, Sf9 cells (ATCC CRL1711), Sf21 cells [above, In Vivo, 13, 213-217 (1977)] and the like are used.
  • insects for example, silk moth larvae, Drosophila, crickets, etc. are used [Nature, 315, 592 (1985)].
  • animal cells examples include monkey COS-7 cells, monkey Vero cells, Chinese hamster ovary (CHO) cells, dhfr gene-deficient CHO cells, mouse L cells, mouse AtT-20 cells, mouse myeloma cells, rat GH3 cells, and humans.
  • Fetal kidney-derived cells eg, HEK293 cells
  • human liver cancer-derived cells eg, HepG2
  • cell lines such as human FL cells
  • pluripotent stem cells such as human and other mammalian iPS cells and ES cells
  • various Primary cultured cells prepared from tissue are used.
  • zebrafish embryos, Xenopus oocytes and the like can also be used.
  • the plant cells were prepared from various plants (for example, grains such as rice, wheat and corn, commercial crops such as tomato, cucumber and eggplant, garden plants such as carnation and Vietnamese ginkgo, experimental plants such as tobacco and white indigo plant). Suspended cultured cells, callus, protoplasts, leaf sections, root sections, etc. are used.
  • the introduction of the expression vector depends on the type of host, known methods (for example, lysoteam method, competent method, PEG method, CaCl2 coprecipitation method, electroporation method, microinjection method, particle gun method, lipofection method, etc. It can be carried out according to the Agrobacterium method, etc.).
  • Donor DNA can also be introduced into cells by a similar method. When the expression vector and the donor DNA are introduced as different molecules, the expression vector and the donor DNA may be introduced at the same time or at different timings.
  • Escherichia coli can be transformed according to the method described in, for example, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972) or Gene, 17, 107 (1982).
  • the Bacillus genus can be vector-introduced according to the method described in, for example, Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979).
  • the vector can be introduced according to the method described in Methods in Enzymology, 194, 182-187 (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978).
  • Insect cells and insects can be vector-introduced according to the method described in, for example, Bio / Technology, 6, 47-55 (1988).
  • Animal cells can be vector-introduced according to the method described in, for example, Cell Engineering Supplement 8 New Cell Engineering Experiment Protocol, 263-267 (1995) (published by Shujunsha), Virology, 52, 456 (1973).
  • Culturing of cells into which the vector and donor DNA have been introduced can be carried out according to a known method according to the type of host.
  • a liquid medium is preferable as the medium used for culturing.
  • the medium preferably contains a carbon source, a nitrogen source, an inorganic substance and the like necessary for the growth of the transformant.
  • the carbon source for example, glucose, dextrin, soluble starch, sucrose, etc .
  • the nitrogen source for example, ammonium salts, nitrates, corn steep liquor, peptone, casein, meat extract, soybean meal, etc.
  • Inorganic or organic substances such as potato extracts; examples of the inorganic substances include calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, magnesium chloride and the like, respectively.
  • yeast extract, vitamins, growth promoting factors and the like may be added to the medium.
  • the pH of the medium is preferably about 5 to about 8.
  • E. coli As a medium for culturing E. coli, for example, an M9 medium containing glucose and casamino acid [Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972] is preferable. If necessary, a drug such as 3 ⁇ -indrill acrylic acid may be added to the medium to allow the promoter to work efficiently. Culturing of E. coli is usually carried out at about 15 to about 43 ° C. If necessary, ventilation or stirring may be performed.
  • Culture of Bacillus spp. Is usually carried out at about 30 to about 40 ° C. If necessary, ventilation or stirring may be performed.
  • a medium for culturing yeast for example, Burkholder's minimum medium [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4505 (1980)] or SD medium containing 0.5% casamino acid [ Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5330 (1984)] and the like.
  • the pH of the medium is preferably about 5 to about 8.
  • Culturing is usually carried out at about 20 ° C to about 35 ° C. If necessary, aeration or stirring may be performed.
  • a medium for culturing insect cells or insects for example, Grace's Insect Medium [Nature, 195, 788 (1962)] to which an additive such as deactivated 10% bovine serum is appropriately added is used.
  • the pH of the medium is preferably from about 6.2 to about 6.4.
  • Culturing is usually carried out at about 27 ° C. Ventilation and agitation may be performed as needed.
  • the minimum essential medium (MEM) (Science, 122, 501 (1952)] containing about 5 to about 20% fetal bovine serum, Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) [ Virology, 8,396 (1959)], RPMI 1640 medium [The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)], 199 medium [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)], etc.
  • the pH of the medium is preferably about 6 to about 8.
  • Culturing is usually carried out at about 30 ° C to about 40 ° C. Ventilation and agitation may be performed as needed.
  • MS medium As the medium for culturing plant cells, MS medium, LS medium, B5 medium and the like are used.
  • the pH of the medium is preferably about 5 to about 8.
  • Culturing is usually carried out at about 20 ° C to about 30 ° C. Ventilation and agitation may be performed as needed.
  • a complex of a nucleic acid sequence recognition module and an Argonaute protein or the like, that is, a nucleic acid modifying enzyme complex can be expressed intracellularly.
  • RNA encoding a nucleic acid sequence recognition module and / or Argonaute protein or the like into a host cell can be performed by a microinjection method, a lipofection method, or the like. RNA introduction can be repeated once or multiple times (eg, 2-5 times) at appropriate intervals.
  • the nucleic acid sequence recognition module of the present disclosure using an Argonaute protein is provided as a complex of an Argonaute protein, a gRNA-ap, and a BP-Effector.
  • the BP effector protein used in the present disclosure is not particularly limited as long as it can form a complex with a guide RNA and change the expression and function of the target gene, but is preferably nuclease, recombinase, deaminase, glycosyllase, and methylation. Enzymes, demethylases, histone acetylases, etc.
  • the DNA encoding the BP effector protein (including the mutant, the same applies hereinafter) can be cloned from the cell producing the enzyme by the same method as described above. It can be obtained by introducing a mutation to convert one amino acid with another.
  • the DNA encoding the BP effector protein is used in combination with the chemical synthesis, the PCR method, or the Gibson Assembly method by the same method as described above for the DNA encoding the nucleic acid sequence recognition module and the DNA encoding the Argonaute protein. It can also be constructed as DNA with codon usage suitable for expression in host cells.
  • the obtained BP effector protein and / or nucleic acid modifying enzyme can be inserted downstream of the promoter of the same expression vector as described above, depending on the target cell.
  • the length of the targeting sequence is not particularly limited as long as it can specifically bind to the target nucleotide sequence, but is, for example, 15 to 30 nucleotides, preferably 18 to 25 nucleotides.
  • the DNA encoding the guide RNA can also be inserted into the same expression vector as above, but as a promoter, the transcription initiation site is T (U as RNA), or the 5'end is U by processing. Is preferable.
  • the DNA encoding the guide RNA is a sequence complementary to the target strand of the target nucleotide sequence, and the oligo RNA sequence is designed so that the 5'end is phosphorylated U, and a DNA / RNA synthesizer is used. Can be used to chemically synthesize.
  • the DNA or RNA encoding the Argonaute protein or the like, the guide RNA or the DNA encoding the guide RNA or the DNA encoding the guide RNA can be introduced into the host cell by the same method as described above, depending on the host.
  • a common Argonaute protein or the like can be used.
  • an expression vector containing a DNA encoding the nucleic acid-modifying enzyme complex is introduced into the host cell as described above, but mutations are efficiently introduced. In order to do so, it is desirable that the expression of the nucleic acid modifying enzyme complex is maintained at a certain level or higher for a certain period of time or longer. From this point of view, although it is certain that the expression vector is integrated into the host genome, sustained expression of the nucleic acid modifying enzyme complex increases the risk of off-target cleavage, so that modification of the target site is successfully achieved. After that, it is preferable to remove it promptly. Examples of means for removing the DNA integrated into the host genome include a method using a Cre-loxP system, a FLP-FRT system, a method using a transposon, and the like.
  • off-targeting is performed by transiently expressing the nucleic acid modifying enzyme complex of the present disclosure in the host cell for a period required for the nucleic acid reaction to occur at a desired time and the modification of the target site to be fixed. Editing of the host genome can be efficiently realized while avoiding the risk of cleavage.
  • Those skilled in the art can appropriately determine a suitable expression induction period based on the culture conditions and the like used.
  • the expression induction period of the nucleic acid encoding the nucleic acid modifying enzyme complex of the present disclosure is extended beyond the above-mentioned "period required for the modification of the target site to be fixed" as long as it does not cause side effects in the host cell. May be good.
  • a construct containing a nucleic acid encoding the nucleic acid-modifying enzyme complex in a form in which the expression period can be controlled examples thereof include a method of preparing (expression vector) and introducing it into a host.
  • Specific examples of the "form in which the expression period can be controlled” include those in which the nucleic acid encoding the nucleic acid modifying enzyme complex of the present disclosure is placed under the control of an inducible regulatory region.
  • the "inducible regulatory region” is not particularly limited, and examples thereof include an operon between a temperature-sensitive (ts) mutant repressor and an operator controlled by the repressor.
  • ts mutant repressor examples include, but are not limited to, ts variants of the cI repressor derived from ⁇ phage.
  • ⁇ phage cI repressor ts
  • it binds to the operator at 30 ° C or lower (eg, 28 ° C) and suppresses downstream gene expression, but at a high temperature of 37 ° C or higher (eg, 42 ° C), the operator. Gene expression is induced to dissociate from. Therefore, host cells into which a nucleic acid encoding a nucleic acid-modifying enzyme complex has been introduced are usually cultured at 30 ° C. or lower, and at an appropriate time, the temperature is raised to 37 ° C.
  • the temperature is quickly returned to 30 ° C or lower to minimize the period during which the expression of the target gene is suppressed, and when targeting an essential gene for the host cell.
  • it can be edited efficiently while suppressing side effects.
  • the nucleic acid-modifying enzyme is loaded by mounting the temperature-sensitive variant of the protein required for autonomous replication of the vector into a vector containing DNA encoding the nucleic acid-modifying enzyme complex of the present disclosure. After the expression of the complex, autonomous replication is not possible promptly, and the vector spontaneously sheds with cell division.
  • a temperature-sensitive mutant protein include, but are not limited to, a temperature-sensitive mutant of Rep101 ori, which is necessary for replication of pSC101 ori.
  • Rep101 ori acts on pSC101 ori at 30 ° C or lower (eg, 28 ° C) to enable autonomous replication of the plasmid, but loses its function at 37 ° C or higher (eg, 42 ° C), and the plasmid becomes Autonomous replication becomes impossible. Therefore, when used in combination with the cI repressor (ts) of the above ⁇ phage, transient expression of the nucleic acid modifying enzyme complex of the present disclosure and plasmid removal can be performed simultaneously.
  • the DNA encoding the nucleic acid modifying enzyme complex of the present disclosure is controlled by an inducible promoter (eg, lac promoter (induced by IPTG), cspA promoter (induced by cold shock), araBAD promoter (induced by arabinose), etc.).
  • an inducible promoter eg, lac promoter (induced by IPTG), cspA promoter (induced by cold shock), araBAD promoter (induced by arabinose), etc.
  • the nucleic acid-modifying enzyme complex is introduced into the host cell, and the inducer is added (or removed from the medium) to the medium at an appropriate time to induce the expression of the nucleic acid-modifying enzyme complex, and the nucleic acid-modifying enzyme complex is cultured for a certain period of time to carry out a nucleic acid-modifying reaction.
  • Transient expression of the nucleic acid modifying enzyme complex can be achieved after the mutation is introduced into the target gene.
  • the Argonaute-guide RNA complex comprises an Argonaute protein and a synthesized guide RNA polynucleotide, wherein the guide sequence is a target proximity motif sequence of the Argonaute-guide RNA complex.
  • Argonaute-guided RNA complexes designed to direct a target DNA molecule having it are provided.
  • the Argonaute-guide RNA complex for site-specific action of a target DNA molecule to manipulate gene function, comprising an Argonaute protein and a synthesized guide RNA polynucleotide, said.
  • the guide sequence is designed so that the Argonaute-guide RNA complex points to a target DNA molecule having a target proximity motif sequence, and the complex binds to the target molecule to be site-specific to the target DNA molecule.
  • Argonaute-guided RNA complexes are provided that act on and manipulate gene function.
  • an Argonaute-guide RNA complex for regulating the expression of a target DNA molecule, comprising an Argonaute protein and a synthesized guide RNA polynucleotide, wherein the guide sequence is an Argonaute-guide RNA.
  • Argonaute-guide RNA complex in which the complex is designed to direct a target DNA molecule having a target proximity motif sequence, and the expression of the target DNA molecule is regulated by the complex binding to the target molecule. The body is provided.
  • the Argonaute-guide RNA complex of the present disclosure may be provided with the complex formed in vitro, or a gene sequence such that the vector DNA expresses each element of the complex. Can also be provided operably arranged to form a complex in vivo from the vector DNA.
  • a system or kit for site-specific action of a target DNA molecule to manipulate gene function comprising an Argonaute protein, a guide RNA and an additional sequence, or two or more of them.
  • the guide RNA comprises two or more complexes and means or reagents for contacting the target DNA molecule with the complex so that the guide RNA directs the complex to a region of the target DNA molecule containing the site of interest.
  • a system or kit designed for is provided.
  • a system or kit for regulating the expression of a target DNA molecule comprising two or more complexes comprising an Argonaute protein, a guide RNA and an additional sequence, or two or more of these, and the target DNA.
  • the guide RNA comprises a means or reagent for dissociating at least a portion of a double-stranded DNA sequence in a molecule and a means or reagent for contacting the complex with a double-stranded DNA sequence at least partially dissociated.
  • Systems or kits are provided that are designed to direct the complex to a region containing the double-stranded DNA sequence that is at least partially dissociated.
  • the kit of the present disclosure is usually divided into two or more compartments and each element to be provided (eg, a vector, a nucleic acid construct, a cell into which the nucleic acid of interest has been transgenic, a reagent, etc. Signs, instructions, etc.) can be provided.
  • the kit of the present disclosure may be provided with each element as a separate kit, in which case the complex of the present disclosure is derived from vector DNA or the like designed to be appropriately expressed in cells. It can be formed in vivo or in vitro.
  • the system of the present disclosure forms the complex of the present disclosure in vivo or in vitro to regulate the expression of the target DNA molecule and / or site-specifically target the target DNA molecule. It is not particularly limited as long as it is provided with the means or reagents necessary for acting and manipulating the gene function.
  • gene synthesis and fragment synthesis services such as GeneArt, GenScript, Integrated DNA Technologies (IDT) can also be used, and other, for example, Gait. , M. J. (1985). Organicleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Gait, M. Gait. J. (1990). Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Eckstein, F.I. (1991). Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL Press; Adams, R.M. L. Et al. (1992). The Biochemistry of the Nucleic Acids, Chapman &Hall; Shabarova, Z. Et al. (1994).
  • IDT Integrated DNA Technologies
  • Example 1 Preparation of recombinant RsAgo protein
  • the recombinant RsAgo protein was designed as shown in FIG. 2 and purified by the following procedure. Plasmid: pT7SU_RsAgo (SEQ ID NO: 1) Strine: Rosetta2 (DE3) pLysS
  • Rosetta2 (DE3) pLysS was transformed with pT7SU_RsAgo by a heat shock method, then seeded on Kan50 + Cm34 plates and incubated overnight at 37 ° C.
  • Protein purification was performed using the AKTA purifier. The conditions were as follows. HiTrap TALON_crude 1ml Column binding buffer: 50 mM Na-phos, pH 8.0; 500 mM NaCl; 5% glycerol Elution buffer: 50 mM Na-phos, pH 8.0; 500 mM NaCl; 5% glycerol, 500 mM Imidazole Elution: 2-100% B Granant 30ml Fractions were recovered based on the UV280 nm signal and purified proteins were confirmed by SDS-PAGE.
  • Example 2 Confirmation of EMSA nucleic acid binding ability
  • the nucleic acid binding ability of the RsAgo protein obtained in Example 1 was confirmed by the following procedure (FIG. 3).
  • nucleic acid (oligo) The following nucleic acids were used to be bound. 3'-FAM-labeled synthetic RNA (18nt) 5'-UUACAACCUACUACCUCG- [FAM] (SEQ ID NO: 2) 5'-FAM-labeled synthetic DNA (18nt) 5'-[FAM]-CGAGGTAGTAGGTTGTAA (SEQ ID NO: 3)
  • Reaction buffer 20 mM HEPES-KOH, pH7.5; 200 mM NaCl; 5 mM MgCl2 was used as the reaction buffer.
  • RNA phosphorylation 3'-FAM-labeled synthetic RNA was phosphorylated by the following procedure. Takara T4 Polynucleotide kinase and ATP were mixed and reacted at 37 ° C. for 1 hour for phosphorylation. This was purified using the QIAGEN Nucleotide removal kit.
  • Example 3 Confirmation of EMSA nucleic acid binding ability
  • Example 3 Confirmation of EMSA nucleic acid binding ability
  • Synthetic oligo DNA The following nucleic acids were used to be bound (SEQ ID NOS: 5 to 8 in order from the top). • Those with complementary sequences (20, 30, and 40 nt) -Non-complementary sequence (42nt)
  • Example 4 Synthesis of gRNA-aptamer by In vitro translation
  • the aptamer was fused to the guide RNA by In vitro translation as shown in FIG. 7 (for sequences, SEQ ID NOs: 9 to 12 in order from the top of FIG. 7).
  • (1) Template plasmid A pHMk047_pT7_HH-hm014-MS2 template was used as the template plasmid (SEQ ID NO: 16). It was digested and linearized by SmaI, and linear DNA was introduced as a template according to the protocol of the Promega Ribomax Large scale RNA production system (T7) kit and reacted at 37 ° C. for 2 hours.
  • T7 Promega Ribomax Large scale RNA production system
  • the template DNA was digested with DNase I (at 37 ° C. for 15 minutes) and purified with the ZYMO research RNA clean and concentrator kit.
  • (2) Hammerhead self-cleaving Purified RNA and 10xT4 ligase buffer (NEB) were mixed and incubated at room temperature (25 ° C.) for 30 minutes.
  • (4) Results As shown in FIG. 8, it was confirmed that the guide RNA to which an aptamer was added could be generated (for sequences, SEQ ID NOs: 13 to 14 in order from the top of FIG. 8).
  • Example 5 Binding to target sequence by gRNA-aptamer
  • gRNA-aptamer obtained in Example 4 binding to the target sequence of RsAgo was confirmed (FIG. 9).
  • sequence-specific DNA binding by RNA to which RsAgo and aptamer were added could be confirmed (for sequences, SEQ ID NOs: 5 to 8 in order from the top of FIG. 10).
  • Target DNA The following DNA was used as the target DNA (SEQ ID NOS: 17 to 20 in order from the top). ⁇ Partially containing a single chain ⁇ Completely double-stranded
  • EMSA Purified protein final 500 nM
  • labeled guide RNA final 100 nM
  • Target DNA was added to this (final 100 to 1000 nM). After adding sucrose to this mixture, tripartite complex formation was observed on a 6% TBE polyacrylamide gel.
  • Example 7 Confirmation of EMSA nucleic acid binding ability
  • a target DNA containing a partial single strand on the 5'side of the target sequence and a target DNA A target DNA containing a partial single strand was prepared on the 3'side of the target sequence, and the nucleic acid binding ability was confirmed.
  • Purified protein Purified RsAgo protein was prepared and used.
  • EMSA Purified protein final 500 nM
  • labeled guide RNA final 100 nM
  • Target DNA was added to this (final 100 to 1000 nM). After adding sucrose to this mixture, tripartite complex formation was observed on a 6% TBE polyacrylamide gel.
  • reaction buffer 80 mM HEPES-KOH, pH7.5; 24 mM MgCl2; 2 mM spermidine; 40 mM DTT was used.
  • EMSA Purified protein final 100 nM
  • guide RNA final 4 ⁇ M
  • a PCR product target DNA
  • T7 RNA pol mix Promega # P1300
  • rNTPs final 1 mM
  • the method of this disclosure enables artificial manipulation of gene functions in all living organisms such as animals, plants, and microorganisms, it can be expected to have a wide range of applications such as medical applications, development of agricultural products, and modification of industrial microorganisms.
  • SEQ ID NO: 1 Template plasmid used in Example 1
  • SEQ ID NOs: 2-3 Synthetic RNA or synthetic DNA used in Example 1.
  • SEQ ID NO: 4 Synthetic RNA used in Example 3
  • SEQ ID NOs: 5-8 Synthetic oligo DNA used in Example 3
  • SEQ ID NOs: 9-12 Synthetic DNA used in Example 7
  • SEQ ID NOs: 13-14 Guide RNA aptamer used in Example 4
  • SEQ ID NO: 15 Synthetic RNA used in Example 6.
  • SEQ ID NO: 16 Template plasmid used in Example 4
  • SEQ ID NOs: 21-24 Target DNA used in Example 7
  • SEQ ID NOs: 25-26 Guide RNA aptamer used in Example 8
  • SEQ ID NO: 27 Template plasmid used in Example 8
  • SEQ ID NO: 28 PCR product of Example 8

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Abstract

本開示は、遺伝子機能の操作を可能とするＤＮＡ分子の部位特異的な改変方法を提供する。　本開示によれば、標的ＤＮＡ分子を部位特異的に作用して遺伝子機能を操作するための方法であって、Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質とガイドＲＮＡと付加配列とを含む複合体を提供する工程と、標的ＤＮＡ分子に、該複合体を接触させる工程とを含み、該ガイドＲＮＡが、該複合体を標的ＤＮＡ分子中の目的の部位を含む領域に誘導するように設計される、方法が提供される。

Description

新規ガイド核酸機構による遺伝子機能制御
　本開示は、遺伝子機能の操作を可能とするＤＮＡ分子の部位特異的な改変方法に関する。
　近年、ガイド核酸によるＤＮＡ配列認識機構として、細菌および古細菌がもつＣＲＩＳＰＲシステムが注目を集めており、ゲノム編集技術として応用化されている。ＣＲＩＳＰＲシステムは、細菌に侵入するＤＮＡ配列に対して相補性を有する低分子のＲＮＡ（ガイドＲＮＡ）を利用して、標的となる外来ＤＮＡに対してターゲティングと分解を促す。
　他方で、一部のバクテリア由来のＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質の中にはガイドＲＮＡを用いてＤＮＡ配列を認識できるものがあることが知られている。このＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質は真核生物においてＲＮＡｉを担う、ガイドＲＮＡ依存性のＲＮＡ標的分子であり、本開示はこのＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質を新規ゲノム編集機構として利用し、遺伝子機能の操作を可能とするＤＮＡ分子の部位特異的な改変方法を提供する。
　したがって、本開示は以下を提供する。
（項目１）
　標的ＤＮＡ分子を部位特異的に作用して遺伝子機能を操作するための方法であって、
　Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質とガイドＲＮＡと付加配列とを含む複合体を提供する工程と、
　標的ＤＮＡ分子に、該複合体を接触させる工程と
を含み、該ガイドＲＮＡが、該複合体を標的ＤＮＡ分子中の目的の部位を含む領域に誘導するように設計される、方法。
（項目２）
　前記Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質がＤＮＡを標的とする活性を有する、上記項目に記載の方法。
（項目３）
　前記Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質が生理的な温度においてＤＮＡを標的とする活性を有する、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目４）
　前記Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質が原核生物由来のものである、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目５）
　前記Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質が細菌由来のものである、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
　前記Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質がＲｈｏｄｏｂａｃｔｏｒ由来のＲｓＡｇｏである、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
　前記複合体は、生体外で形成される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
　前記複合体は、生体外で形成され、前記標的ＤＮＡ分子は生体内に存在する、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
　前記Ａｒｇｏｎａｕｔｅ－ガイドＲＮＡ複合体が標的近接モチーフ配列を有する標的ＤＮＡ分子を指向するように設計される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
前記遺伝子機能の操作は、遺伝子発現制御、遺伝子配列改変および／またはその両方を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
前記遺伝子機能の操作は、遺伝子発現制御を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
前記遺伝子機能の操作は、遺伝子配列改変を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ１）
　標的ＤＮＡ分子の発現を調節するための方法であって、
　Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質とガイドＲＮＡと付加配列とを含む複合体を提供する工程と、
　標的ＤＮＡ分子における二本鎖ＤＮＡ配列の少なくとも一部を解離させる工程と、
　少なくとも一部が解離した二本鎖ＤＮＡ配列に、該複合体を接触させる工程と
を含み、該ガイドＲＮＡが、該複合体を、少なくとも一部が解離した該二本鎖ＤＮＡ配列を含む領域に誘導するように設計される、方法。
（項目Ａ２）
　前記Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質がＤＮＡを標的とする活性を有する、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ３）
　前記Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質が生理的な温度においてＤＮＡを標的とする活性を有する、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ４）
　前記Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質が原核生物由来のものである、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ５）
　前記Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質が細菌由来のものである、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ６）
　前記Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質がＲｈｏｄｏｂａｃｔｏｒ由来のＲｓＡｇｏである、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ７）
　前記複合体は、生体外で形成される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ８）
　前記複合体は、生体外で形成され、前記標的ＤＮＡ分子は生体内に存在する、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｂ１）
　Ａｒｇｏｎａｕｔｅ－ガイドＲＮＡ複合体であって、
　Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質と、
　合成されたガイドＲＮＡポリヌクレオチドと
を含み、前記ガイド配列は、Ａｒｇｏｎａｕｔｅ－ガイドＲＮＡ複合体が標的近接モチーフ配列を有する標的ＤＮＡ分子を指向するように設計されている、Ａｒｇｏｎａｕｔｅ－ガイドＲＮＡ複合体。
（項目Ｂ２）
　前記Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質がＤＮＡを標的とする活性を有する、上記項目のいずれか一項に記載の複合体。
（項目Ｂ３）
　前記Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質が生理的な温度においてＤＮＡを標的とする活性を有する、上記項目のいずれか一項に記載の複合体。
（項目Ｂ４）
　前記Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質が原核生物由来のものである、上記項目のいずれか一項に記載の複合体。
（項目Ｂ５）
　前記Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質が細菌由来のものである、上記項目のいずれか一項に記載の複合体。
（項目Ｂ６）
　前記Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質がＲｈｏｄｏｂａｃｔｏｒ由来のＲｓＡｇｏである、上記項目のいずれか一項に記載の複合体。
（項目Ｃ１）
　標的ＤＮＡ分子を部位特異的に作用して遺伝子機能を操作するためのＡｒｇｏｎａｕｔｅ－ガイドＲＮＡ複合体であって、
　Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質と、
　合成されたガイドＲＮＡポリヌクレオチドと
を含み、前記ガイド配列は、Ａｒｇｏｎａｕｔｅ－ガイドＲＮＡ複合体が標的近接モチーフ配列を有する標的ＤＮＡ分子を指向するように設計されており、該複合体が該標的分子に結合することで該標的ＤＮＡ分子に部位特異的に作用して遺伝子機能が操作される、Ａｒｇｏｎａｕｔｅ－ガイドＲＮＡ複合体。
（項目Ｃ２）
　前記Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質がＤＮＡを標的とする活性を有する、上記項目のいずれか一項に記載の複合体。
（項目Ｃ３）
　前記Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質が生理的な温度においてＤＮＡを標的とする活性を有する、上記項目のいずれか一項に記載の複合体。
（項目Ｃ４）
　前記Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質が原核生物由来のものである、上記項目のいずれか一項に記載の複合体。
（項目Ｃ５）
　前記Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質が細菌由来のものである、上記項目のいずれか一項に記載の複合体。
（項目Ｃ６）
　前記Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質がＲｈｏｄｏｂａｃｔｏｒ由来のＲｓＡｇｏである、上記項目のいずれか一項に記載の複合体。
（項目Ｃ７）
　前記遺伝子機能の操作は、遺伝子発現制御、遺伝子配列改変、および／またはその両方を含む、上記項目のいずれか一項に記載の複合体。
（項目Ｃ８）
　前記遺伝子機能の操作は、遺伝子発現制御を含む、上記項目のいずれか一項に記載の複合体。
（項目Ｃ９）
　前記遺伝子機能の操作は、遺伝子配列改変を含む、上記項目のいずれか一項に記載の複合体。
（項目Ｄ１）
　標的ＤＮＡ分子の発現を調節するためのＡｒｇｏｎａｕｔｅ－ガイドＲＮＡ複合体であって、
　Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質と、
　合成されたガイドＲＮＡポリヌクレオチドと
を含み、前記ガイド配列は、Ａｒｇｏｎａｕｔｅ－ガイドＲＮＡ複合体が標的近接モチーフ配列を有する標的ＤＮＡ分子を指向するように設計されており、該複合体が該標的分子に結合することで該標的ＤＮＡ分子の発現が調節される、Ａｒｇｏｎａｕｔｅ－ガイドＲＮＡ複合体。
（項目Ｄ２）
　前記Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質がＤＮＡを標的とする活性を有する、上記項目のいずれか一項に記載の複合体。
（項目Ｄ３）
　前記Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質が生理的な温度においてＤＮＡを標的とする活性を有する、上記項目のいずれか一項に記載の複合体。
（項目Ｄ４）
　前記Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質が原核生物由来のものである、上記項目のいずれか一項に記載の複合体。
（項目Ｄ５）
　前記Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質が細菌由来のものである、上記項目のいずれか一項に記載の複合体。
（項目Ｄ６）
　前記Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質がＲｈｏｄｏｂａｃｔｏｒ由来のＲｓＡｇｏである、上記項目のいずれか一項に記載の複合体。
（項目Ｅ１）
　標的ＤＮＡ分子を部位特異的に作用して遺伝子機能を操作するためのシステムまたはキットであって、
　Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質、ガイドＲＮＡおよび付加配列、またはこれらのうち２以上を含む２以上の複合体と、
　標的ＤＮＡ分子に、該複合体を接触させる手段または試薬と
を含み、該ガイドＲＮＡが、該複合体を標的ＤＮＡ分子中の目的の部位を含む領域に誘導するように設計される、システムまたはキット。
（項目Ｅ２）
　前記Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質がＤＮＡを標的とする活性を有する、上記項目のいずれか一項に記載のシステムまたはキット。
（項目Ｅ３）
　前記Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質が生理的な温度においてＤＮＡを標的とする活性を有する、上記項目のいずれか一項に記載のシステムまたはキット。
（項目Ｅ４）
　前記Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質が原核生物由来のものである、上記項目のいずれか一項に記載のシステムまたはキット。
（項目Ｅ５）
　前記Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質が細菌由来のものである、上記項目のいずれか一項に記載のシステムまたはキット。
（項目Ｅ６）
　前記Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質がＲｈｏｄｏｂａｃｔｏｒ由来のＲｓＡｇｏである、上記項目のいずれか一項に記載のシステムまたはキット。
（項目Ｅ７）
　前記複合体を、生体外で形成するための手段を含む、上記項目のいずれか一項に記載のシステムまたはキット。
（項目Ｅ８）
　前記複合体を、生体外で形成するための手段を含み、前記標的ＤＮＡ分子は生体内に存在する、上記項目のいずれか一項に記載のシステムまたはキット。
（項目Ｅ９）
　前記Ａｒｇｏｎａｕｔｅ－ガイドＲＮＡ複合体が標的近接モチーフ配列を有する標的ＤＮＡ分子を指向するように設計される、上記項目のいずれか一項に記載のシステムまたはキット。
（項目Ｅ１０）
　前記遺伝子機能の操作は、遺伝子発現制御、遺伝子配列改変および／またはその両方を含む、上記項目のいずれか一項に記載のシステムまたはキット。
（項目Ｅ１１）
　前記遺伝子機能の操作は、遺伝子発現制御を含む、上記項目のいずれか一項に記載のシステムまたはキット。
（項目Ｅ１２）
　前記遺伝子機能の操作は、遺伝子配列改変を含む、上記項目のいずれか一項に記載のシステムまたはキット。
（項目Ｆ１）
　標的ＤＮＡ分子の発現を調節するためのシステムまたはキットであって、
　Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質、ガイドＲＮＡおよび付加配列、またはこれらのうち２以上を含む２以上の複合体と、
　標的ＤＮＡ分子における二本鎖ＤＮＡ配列の少なくとも一部を解離させる手段または試薬と、
　少なくとも一部が解離した二本鎖ＤＮＡ配列に、該複合体を接触させる手段または試薬と
を含み、該ガイドＲＮＡが、該複合体を、少なくとも一部が解離した該二本鎖ＤＮＡ配列を含む領域に誘導するように設計される、システムまたはキット。
（項目Ｆ２）
　前記Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質がＤＮＡを標的とする活性を有する、上記項目のいずれか一項に記載のシステムまたはキット。
（項目Ｆ３）
　前記Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質が生理的な温度においてＤＮＡを標的とする活性を有する、上記項目のいずれか一項に記載のシステムまたはキット。
（項目Ｆ４）
　前記Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質が原核生物由来のものである、上記項目のいずれか一項に記載のシステムまたはキット。
（項目Ｆ５）
　前記Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質が細菌由来のものである、上記項目のいずれか一項に記載のシステムまたはキット。
（項目Ｆ６）
　前記Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質がＲｈｏｄｏｂａｃｔｏｒ由来のＲｓＡｇｏである、上記項目のいずれか一項に記載のシステムまたはキット。
（項目Ｆ７）
　前記複合体を、生体外で形成する手段をさらに含む、上記項目のいずれか一項に記載のシステムまたはキット。
（項目Ｆ８）
　前記複合体を、生体外で形成する手段をさらに含み、前記標的ＤＮＡ分子は生体内に存在する、上記項目のいずれか一項に記載のシステムまたはキット。
（項目Ｇ１）
　標的ＤＮＡ分子を部位特異的に作用して遺伝子機能を操作するための、Ａｒｇｏｎａｕｔｅ－ガイドＲＮＡ複合体の使用であって、前記Ａｒｇｏｎａｕｔｅ－ガイドＲＮＡ複合体が、
　Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質と、
　合成されたガイドＲＮＡポリヌクレオチドと
を含み、前記ガイド配列は、Ａｒｇｏｎａｕｔｅ－ガイドＲＮＡ複合体が標的近接モチーフ配列を有する標的ＤＮＡ分子を指向するように設計されており、該複合体が該標的分子に結合することで該標的ＤＮＡ分子に部位特異的に作用して遺伝子機能が操作される、使用。
（項目Ｇ２）
　前記Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質がＤＮＡを標的とする活性を有する、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目Ｇ３）
　前記Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質が生理的な温度においてＤＮＡを標的とする活性を有する、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目Ｇ４）
　前記Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質が原核生物由来のものである、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目Ｇ５）
　前記Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質が細菌由来のものである、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目Ｇ６）
　前記Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質がＲｈｏｄｏｂａｃｔｏｒ由来のＲｓＡｇｏである、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目Ｇ７）
　前記遺伝子機能の操作は、遺伝子発現制御、遺伝子配列改変、および／またはその両方を含む、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目Ｇ８）
　前記遺伝子機能の操作は、遺伝子発現制御を含む、上記項目のいずれか一項に記載の複使用。
（項目Ｇ９）
　前記遺伝子機能の操作は、遺伝子配列改変を含む、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目Ｈ１）
　標的ＤＮＡ分子の発現を調節するための、Ａｒｇｏｎａｕｔｅ－ガイドＲＮＡ複合体の使用であって、前記Ａｒｇｏｎａｕｔｅ－ガイドＲＮＡ複合体が、
　Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質と、
　合成されたガイドＲＮＡポリヌクレオチドと
を含み、前記ガイド配列は、Ａｒｇｏｎａｕｔｅ－ガイドＲＮＡ複合体が標的近接モチーフ配列を有する標的ＤＮＡ分子を指向するように設計されており、該複合体が該標的分子に結合することで該標的ＤＮＡ分子の発現が調節される、使用。
（項目Ｈ２）
　前記Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質がＤＮＡを標的とする活性を有する、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目Ｈ３）
　前記Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質が生理的な温度においてＤＮＡを標的とする活性を有する、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目Ｈ４）
　前記Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質が原核生物由来のものである、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目Ｈ５）
　前記Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質が細菌由来のものである、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目Ｈ６）
　前記Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質がＲｈｏｄｏｂａｃｔｏｒ由来のＲｓＡｇｏである、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
　本開示において、上記の１つまたは複数の特徴は、明示された組み合わせに加え、さらに組み合わせて提供され得ることが意図される。なお、本開示のさらなる実施形態および利点は、必要に応じて以下の詳細な説明を読んで理解すれば、当業者に認識される。
　なお、上記した以外の本開示の特徴及び顕著な作用・効果は、以下の発明の実施形態の項及び図面を参照することで、当業者にとって明確となる。
　本開示の方法により、従来のＣＲＩＳＰＲシステムよりも分子サイズが小さく、かつ標的配列に対する制約も少ない新たな遺伝子改変技術を提供することができる。また本開示のＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質－ガイドＲＮＡ複合体は遺伝子発現を標的特異的に調節することができ、またガイドＲＮＡに付加したアプタマーを介するなどしてＤＮＡに作用するエフェクターの局在化も可能であるため、様々なゲノム編集への応用が期待できる。
図１は、本開示のＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質－ガイドＲＮＡ複合体へのアプタマーの融合を示す模式図である。 図２は、リコンビナントRsAgoタンパク質の精製を示す模式図である。 図３は、核酸結合能の確認試験を示す模式図である。 図４は、ＲｓＡｇｏタンパク質の核酸結合能の試験結果である。 図５は、ＲｓＡｇｏタンパク質の標的配列への結合親和性の試験結果である。 図６は、ＲｓＡｇｏタンパク質の標的配列への結合の配列依存性の試験結果である。 図７は、Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎによるガイドＲＮＡ－アプタマー合成を示す模式図である。 図８は、アプタマーを付加したガイドＲＮＡの合成結果を示す図である。 図９は、ガイドＲＮＡ－アプタマーによる標的配列との結合結果を示す図である。 図１０は、ＲｓＡｇｏとアプタマーを付加したＲＮＡによる配列特異的なＤＮＡ結合を示す結果である。 図１１は、ＲｓＡｇｏタンパク質の部分的一本鎖領域への結合結果を示す図である。 図１２は、ＲｓＡｇｏタンパク質の標的配列を含む一本鎖ＤＮＡへの特異的な結合性を示す結果である。 図１３は、ＲｓＡｇｏタンパク質の遺伝子発現領域への作用結果を示す図である。
　以下、本開示を最良の形態を示しながら説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本開示の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
　以下に本明細書において特に使用される用語の定義および／または基本的技術内容を適宜説明する。
　本明細書において、「約」とは、後に続く数値の±１０％を意味する。
　本明細書において、「Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質」（Ａｇｏ）とは、小分子ＲＮＡを介したＲＮＡサイレンシングにおいて中心的な構造となるＲＩＳＣ（ＲＮＡ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ　ｃｏｍｐｌｅｘ）の構成タンパク質である。ガイドとして働く一本鎖ＲＮＡに結合してＲＩＳＣを形成し、この複合体が、Ａｒｇｏｎａｕｔｅに結合した一本鎖ＲＮＡと相補的な配列のｍＲＮＡの切断を触媒する。植物や動物での遺伝子発現に必須の調節因子である。Ａｇｏは４つのドメイン（Ｎドメイン、ＰＡＺドメイン、ＭＩＤドメイン、ＰＩＷＩドメイン）と２つのリンカー（Ｌ１リンカーとＬ２リンカー）から構成され、分子量は約１００ｋＤａである。ｓｉＲＮＡやｍｉＲＮＡなどのｓｍａｌｌ　ＲＮＡは、通常二本鎖ＲＮＡとして生合成され、二本鎖のままＡｇｏに結合する。Ａｇｏの中で二本鎖ＲＮＡ鎖の片方の鎖（パッセンジャー鎖）が引きはがされることにより、もう片方の鎖（ガイド鎖）のみがＡｇｏに取り込まれた成熟体ＲＩＳＣが形成される。こうして形成されたＲＩＳＣは、ガイド鎖の配列相補性を利用して特異的な標的ｍＲＮＡをみつけ出し、翻訳の抑制やポリＡ鎖の短縮による不安定化をひき起こす（ｍｉＲＮＡ経路）。また、Ａｇｏファミリーに属するタンパク質のなかには「スライサー」とよばれるエンドヌクレアーゼ活性をもつものがあり、こうしたＡｇｏは標的ｍＲＮＡを切断することもできる（ＲＮＡｉ経路）。本明細書においては、いずれのＡｇｏも含まれる。代表的なＡｇｏとしては、例えば、ＰｒｏｓｉｔｅのＥｎｔｒｙ　ＰＳ50822（https://prosite.expasy.org/PS50822）を挙げることができ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ　ＡＴＣＣ　１７０２５（GenBank:　ABP72561.1、https://www.uniprot.org/uniprot/Q9UKV8）を好ましく使用することができる。
　本明細書において、「ガイドＲＮＡ」とは、標的に相補的な配列とエフェクタータンパク質との複合体形成に必要なモチーフ配列またはそのための構造とを含むＲＮＡ分子をいう。ガイドＲＮＡは、Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質がＤＮＡ配列を特異的に標的とするように導くＲＮＡであって、本開示のＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質と結合して、該タンパク質を標的ＤＮＡに導く機能を有する。
　本明細書において、「標的近接モチーフ配列」とは、標的二本鎖ポリヌクレオチド中に存在し、Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質及び／またはＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質－ガイドＲＮＡ複合体により認識可能な配列を指す。標的近接モチーフ配列の長さや塩基配列はＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質の由来となる細菌種によって異なり、例えばＲｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ由来のＲｓＡｇｏの場合には標的近接モチーフ配列として５’側にＴのみを持っていればよい。
　本明細書において、「エンドヌクレアーゼ」とは、ヌクレオチド鎖の途中を切断する酵素を意味する。例えば、本開示のＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質がエンドヌクレアーゼ活性を有する場合には、ガイドＲＮＡにより誘導され、ＤＮＡ鎖を切断する酵素活性を有する。
　本明細書において、「遺伝子機能の操作」とは、ＤＮＡ配列の切断、改変、及び／または修飾や、そのＤＮＡ配列からなる遺伝子の発現を抑制し、制御し、及び／または調節することを含む。
　本明細書において、「タンパク質」とはアミノ酸残基のポリマーを意味し、「ポリペプチド」や「ペプチド」と互換的に使用される。また、１つまたは複数のアミノ酸が、天然に存在する対応アミノ酸の化学的類似体、又は修飾誘導体である、アミノ酸ポリマーを意味する。
　本明細書中において、「ＤＮＡ配列」とは、任意の長さのヌクレオチド配列を意味しており、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドであり、線状、環状、または分岐状であってもよく、一本鎖または二本鎖である。
　なお、本明細書において、「Ｎ」は、アデニン、シトシン、チミン及びグアニンからなる群から選択された任意の１塩基を意味し、「Ａ」はアデニン、「Ｇ」はグアニン、「Ｃ」はシトシン、「Ｔ」はチミン、「Ｒ」はプリン骨格を有する塩基（アデニン又はグアニン）、「Ｙ」はピリミジン骨格を有する塩基（シトシン又はチミン）を意味する。
　本明細書において、「ポリヌクレオチド」とは、線状または環状配座であり、一本鎖または二本鎖形態のいずれかである、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを意味し、ポリマーの長さに関して制限するものとして解釈されるものではない。また、天然ヌクレオチドの公知の類似体、並びに塩基部分、糖部分及びリン酸部分のうち少なくとも一つの部分において修飾されるヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート骨格）を包含する。一般に、特定ヌクレオチドの類似体は、同一の塩基対合特異性を有し、例えば、Ａの類似体は、Ｔと塩基対合する。
　本明細書において、「付加配列」とは、ガイドＲＮＡに付加させることができる任意の配列であって、ガイドＲＮＡを特定の分子と特異的に結合することができるようにしたり、及び／または触媒活性を持たせたりするためのものをいう。例えば、付加配列としては、任意の核酸アプタマーが含まれる。
　（好ましい実施形態）
　以下に本開示の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本開示のよりよい理解のために提供されるものであり、本開示の範囲は以下の記載に限定されるべきでない。したがって、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本開示の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。また、本開示の以下の実施形態は単独でも使用されあるいはそれらを組み合わせて使用することができる。
　本開示の一局面において、標的ＤＮＡ分子を部位特異的に作用して遺伝子機能を操作するための方法であって、Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質とガイドＲＮＡと付加配列とを含む複合体を提供する工程と、標的ＤＮＡ分子に、該複合体を接触させる工程とを含み、該ガイドＲＮＡが、該複合体を標的ＤＮＡ分子中の目的の部位を含む領域に誘導するように設計される、方法が提供される。本開示の方法は、ゲノム編集技術として有用である。
　従来のゲノム編集技術においてはＣＲＩＳＰＲシステムが主に用いられているが、ＣＲＩＳＰＲシステムでは、標的特異性を規定する２塩基から５塩基程度のＰＡＭ配列の前後に続く約２０塩基のＲＮＡ分子が標的ターゲティングに利用されるという制限があるため、標的デザインが不可能な遺伝子座が存在することになる。また目的の切断配列の近くに類似の配列があると、その類似の配列をも切断してしまうことがあった。さらに、ＣＲＩＳＰＲシステムを用いたゲノム編集技術では、実用化されているものは比較的分子量が大きく細胞内へのデリバリーや免疫原性において課題が残されている。
　そこでこれらの問題点を有しない新たな標的化システムおよび新たなＲＮＡ誘導性エンドヌクレアーゼの開発が望まれている。バクテリア由来のＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質の中にはガイドＲＮＡを用いてＤＮＡ配列を認識できるものが存在する。本開示の一実施形態において、このバクテリア由来のＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質を新規ゲノム編集機構として利用することできる。
　一実施形態において、本開示において用いられるＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質（Ａｇｏ）は、ＲＮＡ誘導型のＤＮＡ標的活性を備えているものであればどのような生物由来のものであってもよく、原核生物由来のものであってもよい。好ましくはＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質が細菌由来のものであり、例えばＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質として、Ｍａｒｉｎｉｔｏｇａ　ｐｉｅｚｏｐｈｉｌａ由来のＭｐＡｇｏ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ　ｐｒｏｆｕｎｄａ由来のＴｐＡｇｏ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ由来のＲｓＡｇｏなどを用いることができる。他の実施形態において、本開示において用いられるＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質としては、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｓｐ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｃｅｎｔｒｏｌｏｂｉｉ、Ｃａｌｏｔｈｒｉｘ　ｄｅｓｅｒｔｉｃａ　ＰＣＣ　７１０２、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｍａｌ３３、Ｅｌｕｓｉｍｉｃｒｏｂｉａ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ＲＢＧ＿１６＿６６＿１２、Ｄｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ　ｍｃｃａｒｔｙｉなどに由来するＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質を用いることができる。また他の実施形態において、これらのＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質のホモログを含むファミリーを用いることもできる。
　Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質は分子量として１００ｋＤａ程度であり、従来のゲノム編集技術に広く用いられているＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９の１６０ｋＤａと比べると大幅に小さくすることができる。またＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質に結合するガイドＲＮＡもＳｃａｆｆｏｌｄ構造配列などを持たないため小さくなる。また本開示のＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質－ガイドＲＮＡ複合体の標的となり得る配列は、標的近接モチーフ配列として５’側にＴのみを持っていればよく、標準的なＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９において標的認識として必要なＰＡＭ配列であるＧＧよりも小さい制約で済むこととなる。
　本開示の一実施形態において、Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質に細胞内におけるガイドＲＮＡの選択性を保持させるため、細胞外または生体外においてＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質とガイドＲＮＡとの複合体を形成することができる。一実施形態において、標的ＤＮＡ分子は生体内に存在し、細胞外または生体外において形成されたＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質－ガイドＲＮＡ複合体が生体内において結合する。また他の実施形態において、ガイドＲＮＡにさらに付加配列を結合させることで標的ＤＮＡに作用させる酵素部位などのエフェクターを結合できる形状にすることもできる。付加配列としては、特定の分子と特異的に結合することができるものであればどのような配列であってもよく、例えばアプタマー、リボザイム、ＲＮＡ結合性タンパク質が認識する配列や構造などを挙げることができる。また本開示の一実施形態において、アプタマーとしては、ＭＳ２アプタマー、ＰＰ７、ＴＡＲなどを用いることができる。
　本開示の一実施形態において、Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質とアプタマー融合ガイドＲＮＡとの複合体は、標的ＤＮＡ配列に特異的に結合することができる。一実施形態において、Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質は、ＤＮＡを標的とする活性を有し、好ましくは生理的な温度においてＤＮＡを標的とする活性を有することができる。
　また他の実施形態において、本開示のＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質とガイドＲＮＡとの複合体は、閉じた２本鎖ＤＮＡにおいて遺伝子発現を誘導しながら標的化することで、その遺伝子の発現を調節することができる。例えば、本開示のＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質とガイドＲＮＡとの複合体に、融合タンパク質やアプタマーなどを介して転写因子を結合させることによって、対象の遺伝子の発現を向上させ、または活性化させることができる。好ましくは、本開示のＡｒｇｏｎａｕｔｅ－ガイドＲＮＡ複合体は、遺伝子発現を誘導させた二本鎖ＤＮＡに特異的に結合して、その遺伝子発現を抑制することができる。例えば、標的遺伝子の転写の鋳型とは反対側の鎖に結合するようにガイドＲＮＡを設計することにより、標的遺伝子の発現を抑制することができる。
　本開示の一実施形態において、ガイドＲＮＡは、Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質がＤＮＡ配列を特異的に標的とするように導くＲＮＡであればよく、好ましくはＡｒｇｏｎａｕｔｅ－ガイドＲＮＡ複合体を標的ＤＮＡ分子中の目的の部位を含む領域に誘導するように設計される。ガイドＲＮＡは標的近接モチーフ配列として５’側にＴのみを持っている標的ＤＮＡを認識し、その相補的配列に結合する。一実施形態において、ガイドＲＮＡは、その５’末端に標的ＤＮＡに相補的な配列を有し、該相補的な配列を介して標的ＤＮＡに結合することにより、本開示のＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質を標的ＤＮＡに導く。一実施形態において、Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質がＤＮＡエンドヌクレアーゼとして機能する場合には、標的ＤＮＡが存在する部位でＤＮＡを切断し、例えば、標的ＤＮＡの機能を特異的に喪失させることができる。ガイドＲＮＡは、切断あるいは修飾すべき標的ＤＮＡの配列情報に基づき設計され調製される。具体的には実施例で用いられるような配列が挙げられる。
　本開示の一実施形態において、本開示のＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質－ガイドＲＮＡ複合体は、Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質とガイドＲＮＡと付加配列とを含む複合体として提供することができる。例えば、一実施形態において、Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質およびそれを発現させるＤＮＡまたはｍＲＮＡと、５’末端がリン酸化されたＵで始まる任意の標的配列を含むガイドＲＮＡと、このガイドＲＮＡの３’側に付加させるアプタマー等の任意の配列とを準備し、細胞外または細胞内において複合体を形成させることができる。
　本開示の一実施形態において、標的ＤＮＡ分子にＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質－ガイドＲＮＡ複合体を接触させる工程は、本開示のＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質－ガイドＲＮＡ複合体を、標的配列を含むＤＮＡに対して、例えば遺伝子発現などによって部分的に二本鎖ＤＮＡが解離した状態とすることで結合させることを含む。本開示の一実施形態において、このようにして遺伝子発現の際に本開示のＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質－ガイドＲＮＡ複合体が、標的配列を含むＤＮＡに結合することにより、その遺伝子発現を制御することができる。
　本開示の他の局面において、標的ＤＮＡ分子の発現を調節するための方法であって、Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質とガイドＲＮＡと付加配列とを含む複合体を提供する工程と、標的ＤＮＡ分子における二本鎖ＤＮＡ配列の少なくとも一部を解離させる工程と、少なくとも一部が解離した二本鎖ＤＮＡ配列に、該複合体を接触させる工程とを含み、該ガイドＲＮＡが、該複合体を、少なくとも一部が解離した該二本鎖ＤＮＡ配列を含む領域に誘導するように設計される、方法が提供される。
　本開示の一実施形態において、標的ＤＮＡ分子における二本鎖ＤＮＡ配列の少なくとも一部を解離させる工程は、例えば、遺伝子発現などによって部分的に二本鎖ＤＮＡを解離した状態とさせることを含む。
　本開示の一実施形態において、少なくとも一部が解離した二本鎖ＤＮＡ配列にＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質－ガイドＲＮＡ複合体を接触させる工程は、本開示のＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質－ガイドＲＮＡ複合体を、少なくとも一部が解離した二本鎖ＤＮＡ配列に対して、例えば遺伝子発現などによって部分的に二本鎖ＤＮＡが解離した状態とすることで結合させることを含む。本開示の一実施形態において、このようにして遺伝子発現の際に本開示のＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質－ガイドＲＮＡ複合体が、標的配列を含むＤＮＡに結合することにより、その遺伝子発現を制御することができる。
　本開示の一実施形態において、本開示のＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質やガイドＲＮＡとの複合体は、種々の方法で取得することができるが、好ましくは本実施例に記載される手法で取得することができる。他の実施形態において、本開示のＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質やガイドＲＮＡとの複合体は、本明細書に示される作用や効果を奏する限り、どのような手法によっても得ることができる。
　本開示の一実施形態において、本開示のＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質－ガイドＲＮＡ複合体は、対象とする細胞において、遺伝子発現あるいはＤＮＡ複製によって二本鎖構造が解離する部位を標的とし、その標的部位を含む遺伝子の発現を抑制的に制御することにより、細胞機能を変化させたり、遺伝子機能解析を行うことができる。また他の実施形態においては、本開示のＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質－ガイドＲＮＡ複合体は、ヘテロな細胞集団において、特定の細胞群のみを対象とすべく、その一部の細胞群のみが有する配列を標的として遺伝子機能を制御することができる。
　さらに他の実施形態において、本開示のＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質－ガイドＲＮＡ複合体は、アプタマーなどを介して転写制御因子と結合させることにより、標的部位特異的な遺伝子発現の上昇も引き起こすことが可能である。
　ゲノム編集用途としては、本開示のＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質－ガイドＲＮＡ複合体に、アプタマーなどを介して、ヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、デアミナーゼ、またはグリコシラーゼなどを結合させることにより、標的配列及びその周辺のＤＮＡを改変することができる。また同様に、メチル化酵素、脱メチル化酵素、またはヒストンアセチル化酵素などのクロマチン修飾因子を結合させることにより、標的配列及びその周辺のクロマチン修飾状態を変化させることができる。
　別の局面において、本開示は、二本鎖ＤＮＡ（例えば、染色体ＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、葉緑体ＤＮＡ；以下、これらを包括して「ゲノムＤＮＡ」ともいう）の標的部位を改変する方法を提供する。当該方法は、Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質とガイドＲＮＡ複合体を該二本鎖ＤＮＡと接触させる工程を含むことを特徴とする。
　本開示において、二本鎖ＤＮＡの「改変」とは、ＤＮＡ鎖上のあるヌクレオチド（例えば、ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ又はｄＴ）又はヌクレオチド配列が、他のヌクレオチド又はヌクレオチド配列に置換されること、あるいはＤＮＡ鎖上のあるヌクレオチド間に他のヌクレオチドもしくはヌクレオチド配列が挿入されることを意味する。ここで、改変される二本鎖ＤＮＡは特に制限されないが、好ましくはゲノムＤＮＡである。
　本開示において「ドナーＤＮＡ」とは、外来の挿入配列を含むＤＮＡを意味し、ドナーＤＮＡには通常、標的部位に隣接する、標的部位の上流側及び下流側２か所の領域（以下「隣接領域」ともいう）の配列と相同な２種類の配列（以下「ホモロジーアーム」ともいう）を含む。各ホモロジーアームを区別する場合には、「５’ホモロジーアーム」と「３’ホモロジーアーム」とで区別することがある。また、二本鎖ＤＮＡの「標的部位」とは、ドナーＤＮＡに含まれる挿入配列で置換されることとなる領域、あるいは該挿入配列が挿入されることとなるヌクレオチド間を意味し、該標的部位には、前記隣接配列は含まれない。
　標的部位の隣接領域と相同な配列とは、完全に同一な配列だけでなく、細胞内で相同組換えが起こり得る限り、完全に同一な配列に対して、好ましくは８０％以上（例：８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の同一性を有する配列であってもよい。
　ドナーＤＮＡは、直鎖状（例：合成二本鎖ＤＮＡ）であってもよく、環状（例：プラスミドＤＮＡ）であってもよく、また、一本鎖ＤＮＡ（例：一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ））であってもよく、二本鎖ＤＮＡであってもよい。ドナーＤＮＡは、挿入配列の塩基長や、宿主細胞の相同組換え活性等により、適宜設計することができる。例えば、挿入配列として１００塩基長以下の場合、通常はｓｓＯＤＮ又は合成二本鎖ＤＮＡが用いられ、それより長い場合、通常は合成二本鎖ＤＮＡ又はプラスミドＤＮＡが用いられる。ドナーＤＮＡの長さも特に制限はなく、挿入配列の長さなどにより適宜設計することができる。挿入配列の長さは、特に制限はなく、通常は１塩基長～数万塩基長の範囲（例えば、ｓｓＯＤＮの場合には、１００塩基長以下（例：７０塩基以下、５０塩基以下））で目的に応じて適宜設計することができる。また、各ホモロジーアームの長さも特に制限はなく、ドナーＤＮＡがｓｓＯＤＮの場合、通常は１０塩基長～１５０塩基長のものが用いられ、ドナーＤＮＡが合成二本鎖ＤＮＡの場合、通常は１０～５０００塩基長のものが用いられ、ドナーＤＮＡがプラスミドＤＮＡの場合、通常は１００塩基長～５０００塩基長、好ましくは５００塩基長～１０００塩基長のものが用いられる。これらのドナーＤＮＡは、公知文献（例：Ochiai　H,　Int　J　Mol　Sci,　16:21128-21137　(2015)、Hockemeyer　D　et　al.,　Nat　Biotefchnol,　27:851-857　(2009)）を参酌して設計することができる。
　本開示において「核酸配列認識モジュール」とは、ＤＮＡ鎖上の特定のヌクレオチド配列（即ち、標的ヌクレオチド配列）を特異的に認識して結合する能力を有する分子又は分子複合体を意味する。核酸配列認識モジュールが標的ヌクレオチド配列に結合することにより、該モジュールに連結されたＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質が、二本鎖ＤＮＡのＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質等が標的とする部位（即ち、標的ヌクレオチド配列及びその近傍のヌクレオチド）に特異的に作用することを可能にする。
　後述の実施例に示す通り、Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質と、核酸配列認識モジュールとの複合体及びドナーＤＮＡを細胞に導入することで、標的部位が改変できることを実証している。
　本開示において「核酸改変酵素複合体」とは、上記核酸配列認識モジュールとＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質とが連結された複合体を含んでなる、特定のヌクレオチド配列認識能が付与された核酸塩基変換反応又は脱塩基反応の触媒機能を有する分子複合体を意味する。ここで「複合体」は複数の分子で構成されるものだけでなく、融合タンパク質のように、核酸配列認識モジュールとＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質等とを単一の分子内に有するものも包含される。
　Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質の由来は特に制限されないが、例えば、Marinitoga　piezophila由来のＭｐＡｇｏ、Thermotoga　profunda由来のＴｐＡｇｏ、Rhodobacter　sphaeroides由来のＲｓＡｇｏなどを用いることができる。他の実施形態において、本開示において用いられるＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質としては、Mesorhizobium　sp、Bradyrhizobium　centrolobii、Calothrix　desertica　PCC　7102、Planctomycetes　bacterium　Mal33、Elusimicrobia　bacterium　RBG_16_66_12、Dehalococcoides　mccartyiなどに由来するＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質を用いることができる。また他の実施形態において、これらのＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質のホモログを含むファミリーを用いることもできる。
　Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質等をコードするＤＮＡ（即ち、Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質をコードするＤＮＡ又はＤＮＡグリコシラーゼをコードするＤＮＡ）も、同様に、使用する酵素のｃＤＮＡ配列情報をもとにオリゴＤＮＡプライマーを合成し、当該酵素を産生する細胞より調製した全ＲＮＡもしくはｍＲＮＡ画分を鋳型として用い、ＲＴ－ＰＣＲ法によって増幅することにより、クローニングすることができる。例えば、Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質をコードするＤＮＡは、ＮＣＢＩデータベースに登録されているｃＤＮＡ配列（Rhodobacter　sphaeroides　ATCC　17025、　https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/ABP72561.1）をもとに、ＣＤＳの上流及び下流に対して適当なプライマーを設計し、ｍＲＮＡからＲＴ－ＰＣＲ法によりクローニングできる。また、ドナーＤＮＡも、標的部位の配列情報等に基づき、上記と同様にクローニングできる。
　あるいは標的とする宿主細胞におけるコドン頻度や、ｍＲＮＡ配列構造などを考慮して遺伝子発現に最適化した配列を遺伝子人工合成により取得することも可能である。
　発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）；枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）；酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）；昆虫細胞発現プラスミド（例：ｐＦａｓｔ－Ｂａｃ）；動物細胞発現プラスミド（例：ｐＡ１－１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏ）；λファージなどのバクテリオファージ；バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクター（例：ＢｍＮＰＶ、ＡｃＮＰＶ）；レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルスなどの動物ウイルスベクターなどが用いられる。
　プロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。ＤＳＢを伴う従来法では毒性のために宿主細胞の生存率が著しく低下する場合があるので、誘導プロモーターを使用して誘導開始までに細胞数を増やしておくことが望ましいが、本開示の核酸改変酵素複合体を発現させても十分な細胞増殖が得られるので、構成プロモーターも制限なく使用することができる。
　例えば、宿主が動物細胞である場合、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶ（モロニーマウス白血病ウイルス）ＬＴＲ、ＨＳＶ－ＴＫ（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）プロモーターなどが用いられる。なかでも、ＣＭＶプロモーター、ＳＲαプロモーターなどが好ましい。
　宿主が大腸菌である場合、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーターなどが好ましい。
　宿主がバチルス属菌である場合、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなどが好ましい。
　宿主が酵母である場合、Ｇａｌ１／１０プロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。
　宿主が昆虫細胞である場合、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。
　宿主が植物細胞である場合、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ＣａＭＶ１９Ｓプロモーター、ＮＯＳプロモーターなどが好ましい。
　発現ベクターとしては、上記の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ターミネーター、ポリＡ付加シグナル、薬剤耐性遺伝子、栄養要求性相補遺伝子等の選択マーカー、複製起点などを含有しているものを用いることができる。
　核酸配列認識モジュール及び／又はＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質等をコードするＲＮＡは、例えば、上記した核酸配列認識モジュール及び／又はＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質等をコードするＤＮＡをコードするベクターを鋳型として、自体公知のインビトロ転写系にてｍＲＮＡに転写することにより調製することができる。
　核酸配列認識モジュール及び／又はＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質等をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを宿主細胞に導入し、当該宿主細胞を培養することによって、核酸配列認識モジュールとＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質等との複合体を細胞内で発現させることができる。
　宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。
　エシェリヒア属菌としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia　coli）K12・DH1〔Proc.　Natl.　Acad.　Sci.　USA，60，160　(1968)〕，エシェリヒア・コリJM103〔Nucleic　Acids　Research，9，309　(1981)〕，エシェリヒア・コリJA221〔Journal　of　Molecular　Biology，120，517　(1978)〕，エシェリヒア・コリHB101〔Journal　of　Molecular　Biology，41，459　(1969)〕，エシェリヒア・コリC600〔Genetics，39，440　(1954)〕などが用いられる。
　バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サブチルス（Bacillus　subtilis）MI114〔Gene，24，255　(1983)〕，バチルス・サブチルス207-21〔Journal　of　Biochemistry，95，　87　(1984)〕などが用いられる。
　酵母としては、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces　cerevisiae）AH22，AH22R-，NA87-11A，DKD-5D，20B-12、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces　pombe）NCYC1913，NCYC2036，ピキア・パストリス（Pichia　pastoris）KM71などが用いられる。
　昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがAcNPVの場合、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodoptera　frugiperda　cell；Sf細胞）、Trichoplusia　niの中腸由来のMG1細胞、Trichoplusia　niの卵由来のHigh　FiveTM細胞、Mamestra　brassicae由来の細胞、Estigmena　acrea由来の細胞などが用いられる。ウイルスがBmNPVの場合、昆虫細胞としては、蚕由来株化細胞（Bombyx　mori　N　細胞；BmN細胞）などが用いられる。該Sf細胞としては、例えば、Sf9細胞（ATCC　CRL1711）、Sf21細胞〔以上、In　Vivo,　13,　213-217　(1977)〕などが用いられる。
　昆虫としては、例えば、カイコの幼虫、ショウジョウバエ、コオロギなどが用いられる〔Nature，315，592　(1985)〕。
　動物細胞としては、例えば、サルＣＯＳ－７細胞、サルＶｅｒｏ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ｄｈｆｒ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞、マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ－２０細胞、マウスミエローマ細胞，ラットＧＨ３細胞、ヒト胎児腎臓由来細胞（例：ＨＥＫ２９３細胞）、ヒト肝癌由来細胞（例：ＨｅｐＧ２）、ヒトＦＬ細胞などの細胞株、ヒト及び他の哺乳動物のｉＰＳ細胞やＥＳ細胞などの多能性幹細胞、種々の組織から調製した初代培養細胞が用いられる。さらには、ゼブラフィッシュ胚、アフリカツメガエル卵母細胞なども用いることができる。
　植物細胞としては、種々の植物（例えば、イネ、コムギ、トウモロコシ等の穀物、トマト、キュウリ、ナス等の商品作物、カーネーション、トルコギキョウ等の園芸植物、タバコ、シロイヌナズナ等の実験植物など）から調製した懸濁培養細胞、カルス、プロトプラスト、葉切片、根切片などが用いられる。
　発現ベクターの導入は、宿主の種類に応じ、公知の方法（例えば、リゾチーム法、コンピテント法、ＰＥＧ法、ＣａＣｌ２共沈殿法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、リポフェクション法、アグロバクテリウム法など）に従って実施することができる。ドナーＤＮＡも、同様の方法により細胞に導入することができる。発現ベクターとドナーＤＮＡを異なる分子として導入する場合、発現ベクターとドナーＤＮＡの導入は、同時に行ってもよく、異なるタイミングで行ってもよい。
　大腸菌は、例えば、Proc.　Natl.　Acad.　Sci.　USA，69，2110　(1972)やGene，17，107　(1982)などに記載の方法に従って形質転換することができる。
　バチルス属菌は、例えば、Molecular　＆　General　Genetics，168，111　(1979)などに記載の方法に従ってベクター導入することができる。
　酵母は、例えば、Methods　in　Enzymology，194，182-187　(1991)、Proc.　Natl.　Acad.　Sci.　USA，75，1929　(1978)などに記載の方法に従ってベクターを導入することができる。
　昆虫細胞および昆虫は、例えば、Bio/Technology,6，47-55　(1988)などに記載の方法に従ってベクター導入することができる。
　動物細胞は、例えば、細胞工学別冊８新細胞工学実験プロトコール，263-267　(1995)（秀潤社発行）、Virology，52，456　(1973)に記載の方法に従ってベクター導入することができる。
　ベクター及びドナーＤＮＡを導入した細胞の培養は、宿主の種類に応じ、公知の方法に従って実施することができる。
　例えば、大腸菌またはバチルス属菌を培養する場合、培養に使用される培地としては液体培地が好ましい。また、培地は、形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物などを含有することが好ましい。ここで、炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖などが；窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質が；無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどがそれぞれ挙げられる。また、培地には、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは、好ましくは約５～約８である。
　大腸菌を培養する場合の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔Journal　of　Experiments　in　Molecular　Genetics,　431-433,　Cold　Spring　Harbor　Laboratory,　New　York　1972〕が好ましい。必要により、プロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β－インドリルアクリル酸のような薬剤を培地に添加してもよい。大腸菌の培養は、通常約１５～約４３℃で行なわれる。必要により、通気や撹拌を行ってもよい。
　バチルス属菌の培養は、通常約３０～約４０℃で行なわれる。必要により、通気や撹拌を行ってもよい。
　酵母を培養する場合の培地としては、例えば、バークホールダー（Burkholder）最小培地〔Proc.　Natl.　Acad.　Sci.　USA，77，4505　(1980)〕や０．５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Proc.　Natl.　Acad.　Sci.　USA，81，5330　(1984)〕などが挙げられる。培地のｐＨは、好ましくは約５～約８である。培養は、通常約２０℃～約３５℃で行なわれる。必要に応じて、通気や撹拌を行ってもよい。
　昆虫細胞または昆虫を培養する場合の培地としては、例えばGrace's　Insect　Medium〔Nature，195，788　(1962)〕に非働化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは、好ましくは約６．２～約６．４である。培養は、通常約２７℃で行なわれる。必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。
　動物細胞を培養する場合の培地としては、例えば、約５～約２０％の胎児ウシ血清を含む最小必須培地（MEM）〔Science，122，501　(1952)〕，ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）〔Virology，8，396　(1959)〕，RPMI　1640培地〔The　Journal　of　the　American　Medical　Association，199，519　(1967)〕，199培地〔Proceeding　of　the　Society　for　the　Biological　Medicine，73，1　(1950)〕などが用いられる。培地のｐＨは、好ましくは約６～約８である。培養は、通常約３０℃～約４０℃で行なわれる。必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。
　植物細胞を培養する培地としては、ＭＳ培地、ＬＳ培地、Ｂ５培地などが用いられる。培地のｐＨは好ましくは約５～約８である。培養は、通常約２０℃～約３０℃で行なわれる。必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。
　以上のようにして、核酸配列認識モジュールとＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質等との複合体、即ち核酸改変酵素複合体を細胞内で発現させることができる。
　核酸配列認識モジュール及び／又はＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質等をコードするＲＮＡの宿主細胞への導入は、マイクロインジェクション法、リポフェクション法等により行うことができる。ＲＮＡ導入は１回もしくは適当な間隔をおいて複数回（例えば、２～５回）繰り返して行うことができる。
　Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質を用いた本開示の核酸配列認識モジュールは、Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質とｇＲＮＡ－ａｐとＢＰ－Ｅｆｆｅｃｔｏｒとの複合体として提供される。
　本開示で使用されるＢＰエフェクタータンパク質は、ガイドＲＮＡと複合体を形成して、目的遺伝子の発現および機能を変化させ得る限り特に制限はないが、好ましくはヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、デアミナーゼ、グリコシラーゼ、メチル化酵素、脱メチル化酵素、ヒストンアセチル化酵素などである。
　ＢＰエフェクタータンパク質（変異体を含む、以下同様）をコードするＤＮＡは、上記したのと同様の方法により、該酵素を産生する細胞からクローニングすることができる。あるアミノ酸を他のアミノ酸で変換するように変異を導入することにより、取得することができる。
　あるいはＢＰエフェクタータンパク質をコードするＤＮＡは、核酸配列認識モジュールをコードするＤＮＡやＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質をコードするＤＮＡについて上記したのと同様の方法により、化学合成又はＰＣＲ法もしくはＧｉｂｓｏｎ　Ａｓｓｅｍｂｌｙ法との組み合わせで、用いる宿主細胞での発現に適したコドン使用を有するＤＮＡとして構築することもできる。
　得られたＢＰエフェクタータンパク質及び／又は核酸改変酵素は、標的細胞に応じて、上記と同様の発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することができる。
　ターゲッティング配列の長さは、標的ヌクレオチド配列に対して特異的に結合し得る限り特に制限はないが、例えば１５～３０ヌクレオチド、好ましくは１８～２５ヌクレオチドである。
　ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡも、上記と同様の発現ベクターに挿入することができるが、プロモーターとしては、転写開始点がＴ（ＲＮＡとしてはＵ）となるか、プロセッシングにより、５’末端がＵとなるものが好ましい。
　ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡは、標的ヌクレオチド配列の標的鎖に対して相補的な配列であり、５’末端がリン酸化されたＵとなるようにオリゴＲＮＡ配列を設計し、ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機を用いて、化学的に合成することができる。
　Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質等をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ、ガイドＲＮＡ若しくはそれをコードするＤＮＡは、宿主に応じて、上記と同様の方法により宿主細胞に導入することができる。
　本開示の方法では、異なる位置の複数の標的ヌクレオチド配列を用いて標的部位を改変することも可能である。従って、本開示の一実施態様においては、異なる標的ヌクレオチド配列とそれぞれ特異的に結合するガイドＲＮＡとＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質とが、核酸改変酵素複合体を形成する。ここでＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質等は共通のものを使用することができる。
　本開示の核酸改変酵素複合体を宿主細胞内で発現させるためには、上述のように該核酸改変酵素複合体をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを宿主細胞に導入するが、効率よく変異を導入するためには、一定期間以上、一定レベル以上の核酸改変酵素複合体の発現が維持されるのが望ましい。かかる観点からは、該発現ベクターが宿主ゲノムに組み込まれることが確実であるが、核酸改変酵素複合体の持続的発現はオフターゲット切断のリスクを増大させるので、首尾よく標的部位の改変が達成された後は、速やかに除去されることが好ましい。宿主ゲノムに組み込まれたＤＮＡを除去するための手段としては、Ｃｒｅ－ｌｏｘＰ系やＦＬＰ－ＦＲＴ系を用いる方法やトランスポゾンを用いる方法等が挙げられる。
　あるいは、所望の時期に核酸反応が起こり、標的部位の改変が固定されるのに必要な期間だけ、一過的に本開示の核酸改変酵素複合体を宿主細胞内で発現させることにより、オフターゲット切断のリスクを回避しつつ宿主ゲノムの編集を効率よく実現することができる。当業者は、使用する培養条件等に基づいて、好適な発現誘導期間を適宜決定することができる。本開示の核酸改変酵素複合体をコードする核酸の発現誘導期間は、宿主細胞に副作用を生じさせない範囲で、上記「標的部位の改変が固定されるのに必要な期間」を超えて延長されてもよい。
　本開示の核酸改変酵素複合体を、所望の時期に所望の期間、一過的に発現させる手段としては、該核酸改変酵素複合体をコードする核酸を、発現期間を制御可能な形態で含むコンストラクト（発現ベクター）を作製し、宿主内に導入する方法が挙げられる。「発現期間を制御可能な形態」としては、具体的には、本開示の核酸改変酵素複合体をコードする核酸を、誘導性の調節領域の制御下においたものが挙げられる。「誘導性の調節領域」は特に制限されないが、例えば、温度感受性（ｔｓ）変異リプレッサーとこれに制御されるオペレーターとのオペロンが挙げられる。ｔｓ変異リプレッサーとしては、例えばλファージ由来のｃＩリプレッサーのｔｓ変異体が挙げられるが、これに限定されない。λファージｃＩリプレッサー（ｔｓ）の場合、３０℃以下（例、２８℃）ではオペレーターに結合して下流の遺伝子発現を抑制しているが、３７℃以上（例、４２℃）の高温ではオペレーターから解離するために、遺伝子発現が誘導される。従って、核酸改変酵素複合体をコードする核酸を導入した宿主細胞を、通常は３０℃以下で培養し、適切な時期に温度を３７℃以上に上げて一定期間培養して、相同組換えを行わせ、標的遺伝子に変異が導入された後は、速やかに３０℃以下に戻すことにより、標的遺伝子の発現が抑制される期間を最短にすることができ、宿主細胞にとって必須遺伝子を標的化する場合でも、副作用を押さえつつ効率よく編集することができる。
　温度感受性変異を利用する場合、例えば、ベクターの自律複製に必要なタンパク質の温度感受性変異体を、本開示の核酸改変酵素複合体をコードするＤＮＡを含むベクターに搭載することにより、該核酸改変酵素複合体の発現後、速やかに自律複製が出来なくなり、細胞分裂に伴って該ベクターは自然に脱落する。このような温度感受性変異タンパク質としては、ｐＳＣ１０１　ｏｒｉの複製に必要なＲｅｐ１０１　ｏｒｉの温度感受性変異体が挙げられるが、これに限定されない。Ｒｅｐ１０１　ｏｒｉ　（ｔｓ）は３０℃以下（例、２８℃）では、ｐＳＣ１０１　ｏｒｉに作用してプラスミドの自律複製を可能にするが、３７℃以上（例、４２℃）になると機能を失い、プラスミドは自律複製できなくなる。従って、上記λファージのｃＩリプレッサー（ｔｓ）と併用することで、本開示の核酸改変酵素複合体の一過的発現と、プラスミド除去とを、同時に行うことができる。
　また、本開示の核酸改変酵素複合体をコードするＤＮＡを、誘導プロモーター（例：ｌａｃプロモーター（ＩＰＴＧで誘導）、ｃｓｐＡプロモーター（コールドショックで誘導）、ａｒａＢＡＤプロモーター（アラビノースで誘導）等）の制御下において宿主細胞内に導入し、適切な時期に培地に誘導物質を添加（又は培地から除去）して該核酸改変酵素複合体の発現を誘導し、一定期間培養して、核酸改変反応を行わせ、標的遺伝子に変異が導入された後核酸改変酵素複合体の一過的発現を実現することができる。
　本開示の他の局面において、Ａｒｇｏｎａｕｔｅ－ガイドＲＮＡ複合体であって、Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質と、合成されたガイドＲＮＡポリヌクレオチドとを含み、前記ガイド配列は、Ａｒｇｏｎａｕｔｅ－ガイドＲＮＡ複合体が標的近接モチーフ配列を有する標的ＤＮＡ分子を指向するように設計されている、Ａｒｇｏｎａｕｔｅ－ガイドＲＮＡ複合体が提供される。
　また他の局面において、標的ＤＮＡ分子を部位特異的に作用して遺伝子機能を操作するためのＡｒｇｏｎａｕｔｅ－ガイドＲＮＡ複合体であって、Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質と、合成されたガイドＲＮＡポリヌクレオチドとを含み、前記ガイド配列は、Ａｒｇｏｎａｕｔｅ－ガイドＲＮＡ複合体が標的近接モチーフ配列を有する標的ＤＮＡ分子を指向するように設計されており、該複合体が該標的分子に結合することで該標的ＤＮＡ分子に部位特異的に作用して遺伝子機能が操作される、Ａｒｇｏｎａｕｔｅ－ガイドＲＮＡ複合体が提供される。
　さらに他の局面において、標的ＤＮＡ分子の発現を調節するためのＡｒｇｏｎａｕｔｅ－ガイドＲＮＡ複合体であって、Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質と、合成されたガイドＲＮＡポリヌクレオチドとを含み、前記ガイド配列は、Ａｒｇｏｎａｕｔｅ－ガイドＲＮＡ複合体が標的近接モチーフ配列を有する標的ＤＮＡ分子を指向するように設計されており、該複合体が該標的分子に結合することで該標的ＤＮＡ分子の発現が調節される、Ａｒｇｏｎａｕｔｅ－ガイドＲＮＡ複合体が提供される。
　一実施形態において、本開示のＡｒｇｏｎａｕｔｅ－ガイドＲＮＡ複合体は、複合体が生体外で形成された状態で提供されてもよく、またはベクターＤＮＡに該複合体の各要素を発現するような遺伝子配列を作動可能に配置し、そのベクターＤＮＡから生体内において複合体を形成するようにして提供されることもできる。
　本開示の他の局面において、標的ＤＮＡ分子を部位特異的に作用して遺伝子機能を操作するためのシステムまたはキットであって、Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質、ガイドＲＮＡおよび付加配列、またはこれらのうち２以上を含む、２以上の複合体と、標的ＤＮＡ分子に、該複合体を接触させる手段または試薬とを含み、該ガイドＲＮＡが、該複合体を標的ＤＮＡ分子中の目的の部位を含む領域に誘導するように設計される、システムまたはキットが提供される。
　また他の局面において、標的ＤＮＡ分子の発現を調節するためのシステムまたはキットであって、Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質、ガイドＲＮＡおよび付加配列、またはこれらのうち２以上を含む、２以上の複合体と、標的ＤＮＡ分子における二本鎖ＤＮＡ配列の少なくとも一部を解離させる手段または試薬と、少なくとも一部が解離した二本鎖ＤＮＡ配列に、該複合体を接触させる手段または試薬とを含み、該ガイドＲＮＡが、該複合体を、少なくとも一部が解離した該二本鎖ＤＮＡ配列を含む領域に誘導するように設計される、システムまたはキットが提供される。
　本開示の一実施形態において、本開示のキットは、通常２つ以上の区画に分けて、提供されるべき各要素（例えば、ベクター、核酸コンストラクト、目的の核酸を遺伝子導入された細胞、試薬、標識、説明書など）が提供されることができる。また一実施形態において、本開示のキットは、各要素が別々のキットとして提供されることもでき、その場合、本開示の複合体は細胞内で適切に発現するよう設計されたベクターＤＮＡなどから生体内または生体外において形成されることができる。
　本開示の一実施形態において、本開示のシステムは、本開示の複合体を生体内または生体外において形成させて、標的ＤＮＡ分子の発現を調節し、及び／または標的ＤＮＡ分子を部位特異的に作用して遺伝子機能を操作できるようにするために必要な手段または試薬を備えるものであれば特に限られない。
　（一般技術）
　本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．（１９８９）．　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ　Ｅｄ．（２００１）；　Ａｕｓｕｂｅｌ，　Ｆ．Ｍ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂ．　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；　Ａｕｓｕｂｅｌ，　Ｆ．Ｍ．（１９８９）．　Ｓｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：　Ａ　Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂ．　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；　Ｉｎｎｉｓ，　Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：　Ａ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ；　Ａｕｓｕｂｅｌ，　Ｆ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：　Ａ　Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂ．　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；　Ａｕｓｕｂｅｌ，　Ｆ．Ｍ．　（１９９５）．Ｓｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：　Ａ　Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂ．　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；　Ｉｎｎｉｓ，　Ｍ．Ａ．　ｅｔ　ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ　Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ；　Ａｕｓｕｂｅｌ，　Ｆ．Ｍ．（１９９９）．Ｓｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：　Ａ　Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｗｉｌｅｙ，　ａｎｄ　ａｎｎｕａｌ　ｕｐｄａｔｅｓ；　Ｓｎｉｎｓｋｙ，　Ｊ．Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．（１９９９）．　ＰＣＲ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｆｏｒ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
　人工的に合成した遺伝子を作製するためのＤＮＡ合成技術および核酸化学については、例えばＧｅｎｅＡｒｔ、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　ＤＮＡ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）などの遺伝子合成やフラグメント合成サービスを用いることもでき、その他、例えば、Ｇａｉｔ，　Ｍ．Ｊ．（１９８５）．　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ；　Ｇａｉｔ，　Ｍ．Ｊ．（１９９０）．　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ；　Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，　Ｆ．（１９９１）．　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ａｎｄ　Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ；　Ａｄａｍｓ，　Ｒ．Ｌ．　ｅｔ　ａｌ．（１９９２）．　Ｔｈｅ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ，　Ｃｈａｐｍａｎ　＆　Ｈａｌｌ；　Ｓｈａｂａｒｏｖａ，　Ｚ．　ｅｔ　ａｌ．（１９９４）．Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ，　Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；　Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，　Ｇ．Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．（１９９６）．　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　ｉｎ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ；　Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，　Ｇ．Ｔ．（Ｉ９９６）．　Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
　本明細書において「または」は、文章中に列挙されている事項の「少なくとも１つ以上」を採用できるときに使用される。「もしくは」も同様である。本明細書において「２つの値」の「範囲内」と明記した場合、その範囲には２つの値自体も含む。
　本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
　以上、本開示を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本開示を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本開示を限定する目的で提供したのではない。従って、本開示の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
（実施例１：リコンビナントＲｓＡｇｏタンパク質の作製）
　図１に示すようにｇＲＮＡにアプタマーを融合することでＲｓＡｇｏ複合体が標的配列を認識できるかどうか確認するため、図２のようにリコンビナントＲｓＡｇｏタンパク質を設計し、以下の手順で精製した。
Ｐｌａｓｍｉｄ：　ｐＴ７ＳＵ＿ＲｓＡｇｏ（配列番号１）
Ｓｔｒａｉｎ：　Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）　ｐＬｙｓＳ
（１）形質転換
　まずＲｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）　ｐＬｙｓＳをｐＴ７ＳＵ＿ＲｓＡｇｏでヒートショック法により形質転換後、Ｋａｎ５０＋Ｃｍ３４プレートに播種し、３７℃で一晩インキュベートした。
（２）タンパク質精製
　得られた形質転換体をＬＢ（Ｋａｎ＋Ｃｍ）＋１％ｇｌｕｃｏｓｅ（２０ｍｌ）で３０℃で一晩培養した。ＬＢ（Ｋａｎ＋Ｃｍ）＋１％ｇｌｕｃｏｓｅ　０．９Ｌにｏ／ｎ培養液を１０ｍｌ播種し、３７℃でＯＤ６００　１．０まで培養した。これにＩＰＴＧを最終濃度０．５ｍＭとなるように加え、２５℃で一晩培養した（～２１ｈｒ）。
（３）細胞抽出液調整
　遠心操作により菌体を回収した。その菌体を約４０ｍｌのＬｙｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ　Ｎａ－ｐｈｏｓ，　ｐＨ８．０；　１００ｍＭ　ＮａＣｌ；　１０％　ｇｌｙｃｅｒｏｌ；　Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｃｏｃｋｔａｉｌ　（Ｒｏｃｈｅ））で懸濁した。これにＤＮａｓｅＩ（ｆｉｎａｌ　４ｕｎｉｔｓ／ｍｌ），　ＭｇＣｌ２（ｆｉｎａｌ　２ｍＭ）、およびｌｙｓｏｚｙｍｅ（ｆｉｎａｌ
　２ｍｇ／ｍｌ）を添加し、懸濁液２０ｍｌを２０ｍｌのｌｙｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒと混合して希釈した。液体窒素で凍結後、氷水で融解した。以上の操作を５回繰り返し、菌体を破砕した。
　１２４ｋ×ｇで４℃で１時間超遠心し、上清を回収した。その後、塩濃度を５００ｍＭに調整し、０．４５μｍフィルターで清澄化した。
（４）タンパク質精製
　AKTA　purifierを用いてタンパク質精製を行った。条件は以下のとおりとした。
HiTrap　TALON_crude　1ml　カラム
結合バッファー:　50mM　Na-phos,　pH　8.0;　500　mM　NaCl;　5%　glycerol
溶出バッファー:　50mM　Na-phos,　pH　8.0;　500　mM　NaCl;　5%　glycerol,　500mM　Imidazole
溶出：2-100%　B　グラジェント　30ml
　ＵＶ２８０ｎｍシグナルをもとにフラクションを回収し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで精製タンパク質を確認した。
（５）タグ除去
　回収したフラクションに精製したＵｌｐ１　ｐｒｏｔｅａｓｅを添加し、氷上で一晩インキュベートした。その後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによってタグの切断を確認した。
（６）タンパク質精製
　脱塩カラム(HiTrap　Desalting　5ml)でimidazoleを除去した。その後、再度HiTrap　TALON　crudeカラムに通して、素通り画分を回収した。この画分を硫安沈殿により濃縮し、8/3x　Storage　buffer　(54mM　Tris-Cl,　pH7.5;　1334mM　NaCl;　14mM　2-mercaptoethanol)　で懸濁した。
　この懸濁物をAmicon　15(MWCO　10k)で濃縮し、1xStorage　buffer　(20mM　Tris-Cl,　pH7.5;　500mM　NaCl;　5mM　2-mercaptoehanol;　50%　glycerol)で透析してリコンビナントＲｓＡｇｏタンパク質とした。
（実施例２：ＥＭＳＡ　核酸結合能の確認）
　実施例１で得られたＲｓＡｇｏタンパク質の核酸結合能を以下の手順で確認した（図３）。
（１）精製タンパク質
　精製ＲｓＡｇｏタンパク質の希釈系列を作製して用いた。
（２）核酸（オリゴ）
　結合させる核酸としては以下のものを用いた。
3’-FAM標識合成RNA(18nt)　　　5’-UUACAACCUACUACCUCG-[FAM]（配列番号２）
5’-FAM標識合成DNA(18nt)　　　5’-[FAM]-CGAGGTAGTAGGTTGTAA（配列番号３）
（３）反応バッファー
　反応バッファーとして、20mM　HEPES-KOH,　pH7.5;　200mM　NaCl;　5mM　MgCl2を用いた。
（４）EMSA
　上記の反応バッファー存在化で精製タンパク質と合成オリゴヌクレオチドを混合し、２５℃で２０分間インキュベートした。この混合物にスクロースを添加した後、６％ＴＢＥポリアクリルアミドゲルにて複合体形成を観察した。Ｂｌｕｅ　ｌｉｇｈｔ　ＬＥＤによって検出した。
（５）ＲＮＡのリン酸化
　3’-FAM標識合成RNAを以下の手順でリン酸化した。
　Takara　T4　Polynucleotide　kinaseとＡＴＰを混合し、３７℃で１時間反応させてリン酸化した。これをQIAGEN　Nucleotide　removal　kitを用いて精製した。
（６）結果
　図４に示すとおり、ＲｓＡｇｏはｓｓＲＮＡ（１８ｍｅｒ）とｓｓＤＮＡ（１８ｍｅｒ）に結合することがわかった。また図５の結果からは、ＲｓＡｇｏは５’－Ｐ　ｓｓＲＮＡへの親和性が高いこともわかった。
（実施例３：ＥＭＳＡ　核酸結合能の確認）
　さらに、実施例１で得られたＲｓＡｇｏタンパク質の標的配列の配列依存性を確認するため、相補的配列と非相補的配列へのそれぞれの核酸結合能を確認した。
（１）精製タンパク質
　精製ＲｓＡｇｏタンパク質の希釈系列を作製して用いた。
（２）核酸（リン酸化）
　リン酸化核酸としては以下のものを用いた。
3’-FAM標識合成RNA(18nt)　　　5’-UUACAACCUACUACCUCG-[FAM]（配列番号４）
（３）合成オリゴDNA
　結合させる核酸としては以下のものを用いた（上から順に配列番号５～８）。
・相補的配列を有するもの（２０、３０、および４０ｎｔ）
・非相補的配列なもの（４２ｎｔ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
（４）反応バッファー
　反応バッファーとして、20　mM　HEPES-KOH,　pH　7.5;　200　mM　NaCl;　5　mM　MgCl2を用いた。
（５）EMSA
　上記の反応バッファー存在化で精製タンパク質(final　200nM)と標識ＲＮＡ(final　200nM)とを混合し、２５℃で１５分間インキュベートして複合体を形成させた。これに合成オリゴＤＮＡを添加(final　１μＭまたは１０μＭ)した。この混合物にスクロースを添加した後、６％ＴＢＥポリアクリルアミドゲルにて三者複合体形成を観察した。Ｂｌｕｅ　ｌｉｇｈｔ　ＬＥＤによって検出した。
（６）タンパク質の検出
　泳動後のアクリルアミドゲルをＣＢＢ染色して、タンパク質を検出した。
（７）結果
　図６に示すとおり、ＲｓＡｇｏはｇＲＮＡ配列依存的にｓｓＤＮＡに結合することがわかった。
（実施例４：Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎによるｇＲＮＡ－ａｐｔａｍｅｒの合成）
　本実施例では、図７のようにして、Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎによってガイドＲＮＡにアプタマーを融合させた（配列について、図７の上から順に配列番号９～１２）。
（１）鋳型プラスミド
　鋳型プラスミドとしてはpHMk047_pT7_HH-hm014-MS2　templateを用いた（配列番号１６）。ＳｍａＩによって消化して直鎖化し、Promega　Ribomax　Large　scale　RNA　production　system(T7)kitのプロトコルに従い、直鎖ＤＮＡを鋳型として導入し、３７℃で２時間反応させた。ＤＮａｓｅＩで鋳型ＤＮＡを消化し（３７℃で１５分間）、ZYMO　research　RNA　clean　and　concentrator　kitで精製した。
（２）Hammerhead　自己切断
　精製ＲＮＡと10xT4　ligase　buffer　(NEB)を混合し、室温（２５℃）で３０分間インキュベートした。
（３）リン酸化
　T4　Polynucleotide　kinase　(NEB)を添加し、３７℃で３０分間、続いて６５℃で２０分間反応させてリン酸化した。これをQIAGEN　Nucleotide　removal　kit　を用いて精製した。
（４）結果
　図８に示すとおり、アプタマーを付加したガイドＲＮＡが生成できたことが確認できた（配列について、図８の上から順に配列番号１３～１４）。
（実施例５：ｇＲＮＡ－アプタマーによる標的配列との結合）
　実施例４で得られたｇＲＮＡ－アプタマーを用いて、ＲｓＡｇｏの標的配列との結合を確認した（図９）。
　図１０に示すとおり、ＲｓＡｇｏとアプタマーを付加したＲＮＡによる配列特異的なＤＮＡ結合を確認できた（配列について、図１０の上から順に配列番号５～８）。
（実施例６：ＥＭＳＡ　核酸結合能の確認）
　本実施例では、ＲｓＡｇｏが標的ＤＮＡと結合する場合に、二本鎖の標的ＤＮＡに結合できるかどうかを確認するため、部分的に一本鎖を含む標的ＤＮＡと完全な二本鎖の標的ＤＮＡを準備し、以下の手順で核酸結合能を確認した。
（１）精製タンパク質
　精製ＲｓＡｇｏタンパク質を作製して用いた。
（２）ガイドＲＮＡ（リン酸化）
　リン酸化ガイドＲＮＡとしては、以下のものを用いた。
3’-FAM標識合成RNA(18nt)　　　5’-UUACAACCUACUACCUCG-[FAM]（配列番号１５）
（３）標的ＤＮＡ
　標的ＤＮＡとしては以下のものを用いた（上から順に配列番号１７～２０）。
・部分的に一本鎖を含むもの
・完全な二本鎖のもの
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
（４）反応バッファー
　反応バッファーとして、20mM　HEPES-KOH,　pH7.5;　200　mM　NaCl;　5　mM　MgCl2を用いた。
（５）EMSA
　上記の反応バッファー存在化で精製タンパク質(final　500nM)と標識ガイドＲＮＡ(final　100nM)を混合し、２５℃で１５分間インキュベートして複合体を形成させた。これに標的ＤＮＡを添加(final　１００～１０００ｎＭ)した。この混合物にスクロースを添加した後、６％ＴＢＥポリアクリルアミドゲルにて三者複合体形成を観察した。
（６）結果
　図１１に示すとおり、ＲｓＡｇｏは二本鎖ＤＮＡに自力では結合できず、部分的一本鎖領域が結合に必要であることがわかった。
（実施例７：ＥＭＳＡ　核酸結合能の確認）
　続いて、ＲｓＡｇｏが標的ＤＮＡに結合する場合に、どのような状態の一本鎖領域が必要となるのかを確認するため、標的配列の５’側に部分的一本鎖を含む標的ＤＮＡと、標的配列の３’側に部分的一本鎖を含む標的ＤＮＡとを準備し、核酸結合能を確認した。
（１）精製タンパク質
　精製ＲｓＡｇｏタンパク質を作製して用いた。
（２）ガイドＲＮＡ（リン酸化）
　リン酸化ガイドＲＮＡとしては、以下のものを用いた。
3’-FAM標識　合成RNA(18nt)　　　5’-UUACAACCUACUACCUCG-[FAM]（配列番号１５）
（３）標的ＤＮＡ
　標的ＤＮＡとしては以下のものを用いた（上から順に配列番号２１～２４）。
・標的配列の５’側に部分的一本鎖を含むもの
・標的配列の３’側に部分的一本鎖を含むもの
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
（４）反応バッファー
　反応バッファーとして、20mM　HEPES-KOH,pH　7.5;　200mM　NaCl;　5mM　MgCl2を用いた。
（５）EMSA
　上記の反応バッファー存在化で精製タンパク質(final　500nM)と標識ガイドＲＮＡ(final　100nM)を混合し、２５℃で１５分間インキュベートして複合体を形成させた。これに標的ＤＮＡを添加（ｆｉｎａｌ　１００～１０００ｎＭ）した。この混合物にスクロースを添加した後、６％ＴＢＥポリアクリルアミドゲルにて三者複合体形成を観察した。
（６）結果
　図１２に示したとおり、リコンビナントタンパク質として精製されたＲｓＡｇｏと、５’末端がリン酸化されたＵで始まる任意の標的配列に続いてＭＳ２アプタマーが付加されたガイドＲＮＡとを用いてＩｎ　ｖｉｔｒｏにおいて形成された複合体が、標的配列を含む一本鎖ＤＮＡないし部分的に一本鎖になった２本鎖ＤＮＡへの特異的な結合性が認められた。またＲｓＡｇｏはゲノム上の二本鎖ＤＮＡの特にｇＲＮＡの５’－側に相補的な領域を開くことができれば標的ＤＮＡと結合できることがわかった。
（実施例８：ＥＭＳＡ　核酸結合能の確認）
　ＲｓＡｇｏが標的ＤＮＡとの結合において、部分的に一本鎖領域が必要となることがわかったため、次に、ＲｓＡｇｏを遺伝子発現領域に作用させて、遺伝子発現を調節できるかどうかを確認した（図１３）。
（１）精製タンパク質
　精製ＲｓＡｇｏタンパク質を作製して用いた。
（２）ガイドＲＮＡ（リン酸化）
　リン酸化ガイドＲＮＡとしては、以下のものを用いた（上から順に配列番号２５～２６）。
3’-FAM標識　in　vitro合成gRNAアプタマー
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004

（３）標的ＤＮＡ（Ｔ７　ｐｏｌ　ｔｅｍｐｌａｔｅ）調整
　ｐＨＭｋ０１６を鋳型として、Ｔ７プロモーターを含む領域（３１０ｂｐ）をＰＣＲによって増幅した（鋳型について配列番号２７、ＰＣＲ産物について配列番号２８）。この増幅産物をFastGene　Gel/PCR　Extraction　Kit（日本ジェネティクス）によって精製した。
（４）反応バッファー
　反応バッファーとして、80mM　HEPES-KOH,　pH7.5;　24mM　MgCl2;　2mM　spermidine;　40mM　DTTを用いた。
（５）EMSA
　上記の反応バッファー存在化で精製タンパク質(final　100nM)とガイドＲＮＡ(final　４μＭ）を混合し、２５℃で１５分間インキュベートして複合体を形成させた。これにＰＣＲ産物（標的ＤＮＡ）を添加し、続いて　T7　RNA　pol　mix　(Promega　#P1300)およびrNTPs　(final　1mM)を添加した。この混合物を３７℃で２０分間反応させた。この混合物にスクロースを添加した後、１．５％アガロースゲルで電気泳動し、ＳＹＢＲ　Ｇｏｌｄで染色させた。
（６）結果
　図１３に示すとおり、完全に閉じた２本鎖ＤＮＡにおいては、Ｔ７システムを用いて遺伝子発現誘導を行うと、転写に伴って開いたＤＮＡに入り込んで結合し、さらにその遺伝子発現に干渉して正常なｍＲＮＡ合成を阻害することを確認できた。その効果は特に転写の鋳型とは反対側の鎖へと結合するようにするとより顕著であった。
　（注記）
　以上のように、本開示の好ましい実施形態を用いて本開示を例示してきたが、本開示は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願及び他の文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。本願は、日本国特許庁に２０２０年１２月２９日に出願された特願２０２０－２１９８３３に対して優先権主張をするものであり、その内容はその全体があたかも本願の内容を構成するのと同様に参考として援用される。
　本開示の方法によって、動物、植物、微生物などあらゆる生物において遺伝子機能の人工的な操作が可能になるため、医療応用や農作物の開発、産業微生物の改変など幅広い応用が期待できる。
配列番号１：実施例１で用いた鋳型プラスミド
配列番号２～３：実施例１で用いた合成ＲＮＡまたは合成ＤＮＡ
配列番号４：実施例３で用いた合成ＲＮＡ
配列番号５～８：実施例３で用いた合成オリゴＤＮＡ
配列番号９～１２：実施例７で用いた合成ＤＮＡ
配列番号１３～１４：実施例４で用いたガイドＲＮＡアプタマー
配列番号１５：実施例６で用いた合成ＲＮＡ
配列番号１６：実施例４で用いた鋳型プラスミド
配列番号１７～２０：実施例６で用いた標的ＤＮＡ
配列番号２１～２４：実施例７で用いた標的ＤＮＡ
配列番号２５～２６：実施例８で用いたガイドＲＮＡアプタマー
配列番号２７：実施例８で用いた鋳型プラスミド
配列番号２８：実施例８のＰＣＲ産物

Claims (61)

  1. 　標的ＤＮＡ分子を部位特異的に作用して遺伝子機能を操作するための方法であって、
    　Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質とガイドＲＮＡと付加配列とを含む複合体を提供する工程と、
    　標的ＤＮＡ分子に、該複合体を接触させる工程と
    を含み、該ガイドＲＮＡが、該複合体を標的ＤＮＡ分子中の目的の部位を含む領域に誘導するように設計される、方法。
  2. 　前記Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質がＤＮＡを標的とする活性を有する、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質が生理的な温度においてＤＮＡを標的とする活性を有する、請求項１または２に記載の方法。
  4. 　前記Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質が原核生物由来のものである、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 　前記Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質が細菌由来のものである、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 　前記Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質がＲｈｏｄｏｂａｃｔｏｒ由来のＲｓＡｇｏである、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 　前記複合体は、生体外で形成される、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 　前記複合体は、生体外で形成され、前記標的ＤＮＡ分子は生体内に存在する、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 　前記Ａｒｇｏｎａｕｔｅ－ガイドＲＮＡ複合体が標的近接モチーフ配列を有する標的ＤＮＡ分子を指向するように設計される、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記遺伝子機能の操作は、遺伝子発現制御、遺伝子配列改変および／またはその両方を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記遺伝子機能の操作は、遺伝子発現制御を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記遺伝子機能の操作は、遺伝子配列改変を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  13. 　標的ＤＮＡ分子の発現を調節するための方法であって、
    　Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質とガイドＲＮＡと付加配列とを含む複合体を提供する工程と、
    　標的ＤＮＡ分子における二本鎖ＤＮＡ配列の少なくとも一部を解離させる工程と、
    　少なくとも一部が解離した二本鎖ＤＮＡ配列に、該複合体を接触させる工程と
    を含み、該ガイドＲＮＡが、該複合体を、少なくとも一部が解離した該二本鎖ＤＮＡ配列を含む領域に誘導するように設計される、方法。
  14. 　前記Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質がＤＮＡを標的とする活性を有する、請求項１３に記載の方法。
  15. 　前記Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質が生理的な温度においてＤＮＡを標的とする活性を有する、請求項１３または１４に記載の方法。
  16. 　前記Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質が原核生物由来のものである、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 　前記Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質が細菌由来のものである、請求項１３～１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 　前記Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質がＲｈｏｄｏｂａｃｔｏｒ由来のＲｓＡｇｏである、請求項１３～１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 　前記複合体は、生体外で形成される、請求項１３～１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 　前記複合体は、生体外で形成され、前記標的ＤＮＡ分子は生体内に存在する、請求項１３～１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 　Ａｒｇｏｎａｕｔｅ－ガイドＲＮＡ複合体であって、
    　Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質と、
    　合成されたガイドＲＮＡポリヌクレオチドと
    を含み、前記ガイド配列は、Ａｒｇｏｎａｕｔｅ－ガイドＲＮＡ複合体が標的近接モチーフ配列を有する標的ＤＮＡ分子を指向するように設計されている、Ａｒｇｏｎａｕｔｅ－ガイドＲＮＡ複合体。
  22. 　前記Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質がＤＮＡを標的とする活性を有する、請求項２１に記載の複合体。
  23. 　前記Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質が生理的な温度においてＤＮＡを標的とする活性を有する、請求項２１または２２に記載の複合体。
  24. 　前記Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質が原核生物由来のものである、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の複合体。
  25. 　前記Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質が細菌由来のものである、請求項２１～２４のいずれか一項に記載の複合体。
  26. 　前記Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質がＲｈｏｄｏｂａｃｔｏｒ由来のＲｓＡｇｏである、請求項２１～２５のいずれか一項に記載の複合体。
  27. 　標的ＤＮＡ分子を部位特異的に作用して遺伝子機能を操作するためのＡｒｇｏｎａｕｔｅ－ガイドＲＮＡ複合体であって、
    　Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質と、
    　合成されたガイドＲＮＡポリヌクレオチドと
    を含み、前記ガイド配列は、Ａｒｇｏｎａｕｔｅ－ガイドＲＮＡ複合体が標的近接モチーフ配列を有する標的ＤＮＡ分子を指向するように設計されており、該複合体が該標的分子に結合することで該標的ＤＮＡ分子に部位特異的に作用して遺伝子機能が操作される、Ａｒｇｏｎａｕｔｅ－ガイドＲＮＡ複合体。
  28. 　前記Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質がＤＮＡを標的とする活性を有する、請求項２７に記載の複合体。
  29. 　前記Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質が生理的な温度においてＤＮＡを標的とする活性を有する、請求項２７または２８に記載の複合体。
  30. 　前記Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質が原核生物由来のものである、請求項２７～２９のいずれか一項に記載の複合体。
  31. 　前記Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質が細菌由来のものである、請求項２７～３０のいずれか一項に記載の複合体。
  32. 　前記Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質がＲｈｏｄｏｂａｃｔｏｒ由来のＲｓＡｇｏである、請求項２７～３１のいずれか一項に記載の複合体。
  33. 　前記遺伝子機能の操作は、遺伝子発現制御、遺伝子配列改変、および／またはその両方を含む、請求項２７～３２のいずれか一項に記載の複合体。
  34. 　前記遺伝子機能の操作は、遺伝子発現制御を含む、請求項２７～３２のいずれか一項に記載の複合体。
  35. 　前記遺伝子機能の操作は、遺伝子配列改変を含む、請求項２７～３２のいずれか一項に記載の複合体。
  36. 　標的ＤＮＡ分子の発現を調節するためのＡｒｇｏｎａｕｔｅ－ガイドＲＮＡ複合体であって、
    　Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質と、
    　合成されたガイドＲＮＡポリヌクレオチドと
    を含み、前記ガイド配列は、Ａｒｇｏｎａｕｔｅ－ガイドＲＮＡ複合体が標的近接モチーフ配列を有する標的ＤＮＡ分子を指向するように設計されており、該複合体が該標的分子に結合することで該標的ＤＮＡ分子の発現が調節される、Ａｒｇｏｎａｕｔｅ－ガイドＲＮＡ複合体。
  37. 　前記Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質がＤＮＡを標的とする活性を有する、請求項３６に記載の複合体。
  38. 　前記Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質が生理的な温度においてＤＮＡを標的とする活性を有する、請求項３６または３７に記載の複合体。
  39. 　前記Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質が原核生物由来のものである、請求項３６～３８のいずれか一項に記載の複合体。
  40. 　前記Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質が細菌由来のものである、請求項３６～３９のいずれか一項に記載の複合体。
  41. 　前記Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質がＲｈｏｄｏｂａｃｔｏｒ由来のＲｓＡｇｏである、請求項３６～４０のいずれか一項に記載の複合体。
  42. 　標的ＤＮＡ分子を部位特異的に作用して遺伝子機能を操作するためのシステムまたはキットであって、
    　Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質、ガイドＲＮＡおよび付加配列、またはこれらのうち２以上を含む２以上の複合体と、
    　標的ＤＮＡ分子に、該複合体を接触させる手段または試薬と
    を含み、該ガイドＲＮＡが、該複合体を標的ＤＮＡ分子中の目的の部位を含む領域に誘導するように設計される、システムまたはキット。
  43. 　前記Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質がＤＮＡを標的とする活性を有する、請求項４２に記載のシステムまたはキット。
  44. 　前記Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質が生理的な温度においてＤＮＡを標的とする活性を有する、請求項４２または４３に記載のシステムまたはキット。
  45. 　前記Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質が原核生物由来のものである、請求項４２～４４のいずれか一項に記載のシステムまたはキット。
  46. 　前記Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質が細菌由来のものである、請求項４２～４５のいずれか一項に記載のシステムまたはキット。
  47. 　前記Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質がＲｈｏｄｏｂａｃｔｏｒ由来のＲｓＡｇｏである、請求項４２～４６のいずれか一項に記載のシステムまたはキット。
  48. 　前記複合体を、生体外で形成するための手段を含む、請求項４２～４７のいずれか一項に記載のシステムまたはキット。
  49. 　前記複合体を、生体外で形成するための手段を含み、前記標的ＤＮＡ分子は生体内に存在する、請求項４２～４８のいずれか一項に記載のシステムまたはキット。
  50. 　前記Ａｒｇｏｎａｕｔｅ－ガイドＲＮＡ複合体が標的近接モチーフ配列を有する標的ＤＮＡ分子を指向するように設計される、請求項４２～４９のいずれか一項に記載のシステムまたはキット。
  51. 　前記遺伝子機能の操作は、遺伝子発現制御、遺伝子配列改変および／またはその両方を含む、請求項４２～５０のいずれか一項に記載のシステムまたはキット。
  52. 　前記遺伝子機能の操作は、遺伝子発現制御を含む、請求項４２～５０のいずれか一項に記載のシステムまたはキット。
  53. 　前記遺伝子機能の操作は、遺伝子配列改変を含む、請求項４２～５０のいずれか一項に記載のシステムまたはキット。
  54. 　標的ＤＮＡ分子の発現を調節するためのシステムまたはキットであって、
    　Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質、ガイドＲＮＡおよび付加配列、またはこれらのうち２以上を含む２以上の複合体と、
    　標的ＤＮＡ分子における二本鎖ＤＮＡ配列の少なくとも一部を解離させる手段または試薬と、
    　少なくとも一部が解離した二本鎖ＤＮＡ配列に、該複合体を接触させる手段または試薬と
    を含み、該ガイドＲＮＡが、該複合体を、少なくとも一部が解離した該二本鎖ＤＮＡ配列を含む領域に誘導するように設計される、システムまたはキット。
  55. 　前記Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質がＤＮＡを標的とする活性を有する、請求項５４に記載のシステムまたはキット。
  56. 　前記Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質が生理的な温度においてＤＮＡを標的とする活性を有する、請求項５４または５５に記載のシステムまたはキット。
  57. 　前記Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質が原核生物由来のものである、請求項５４～５６のいずれか一項に記載のシステムまたはキット。
  58. 　前記Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質が細菌由来のものである、請求項５４～５７のいずれか一項に記載のシステムまたはキット。
  59. 　前記Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質がＲｈｏｄｏｂａｃｔｏｒ由来のＲｓＡｇｏである、請求項５４～５８のいずれか一項に記載のシステムまたはキット。
  60. 　前記複合体を、生体外で形成する手段をさらに含む、請求項５４～５９のいずれか一項に記載のシステムまたはキット。
  61. 　前記複合体を、生体外で形成する手段をさらに含み、前記標的ＤＮＡ分子は生体内に存在する、請求項５４～６０のいずれか一項に記載のシステムまたはキット。
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