CN110312798A - 用于基因组修饰的稳定剂 - Google Patents

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Abstract

本公开大体上涉及对细胞进行基因修饰的组合物和方法。特别地，本公开涉及用于基因组改变(例如位点特异性核酸酶)的稳定剂，和用于非遗传编码改变修饰(例如DNA甲基化)的稳定剂。稳定化方法包括在适当温度下储存试剂、转化为干燥形式以及化学修饰。

Description

用于基因组修饰的稳定剂
技术领域
本公开大体上涉及对细胞进行基因修饰的组合物和方法。特别地，本公开涉及用于基因组改变(例如位点特异性核酸酶)的稳定剂，和用于非遗传编码改变修饰(例如DNA甲基化)的稳定剂。稳定化方法包括在适当温度下储存试剂，转化为干燥形式以及化学修饰。
背景技术
已经研发出许多基因组相互作用系统，如设计师锌指、类转录激活因子效应物(TALs)、CRISPRs以及归巢大范围核酸酶。这些系统存在的一个问题是，其需要识别变化的靶位点和设计特异性针对那些位点的试剂，这往往费力且耗时。在一个方面中，本发明可以有效地设计、制备和使用基因组相互作用试剂。
发明内容
本公开部分地涉及用于核酸分子修饰的组合物和方法。对于修饰基因组的有效系统和技术存在着切实的需求。本发明解决了这种需求且提供了相关优势。
在一些方面中，本发明包括制备一种或多种(例如一种、两种、三种、四种、五种、六种等)稳定的基因改变剂的方法和通过这些方法制备的稳定的基因改变剂。在一些情况下，这些方法包括(a)在溶剂中制备一种或多种基因改变剂，和(b)去除(a)中80％以上的所述溶剂。此外，所述溶剂可以是水性的、有机的(例如一种或多种醇)或者是水性溶剂和一种或多种有机溶剂的混合物。所述溶剂可以通过任何数量的方法去除，包括冷冻干燥、喷雾干燥、喷雾冷冻干燥、超临界流体干燥或真空离心。在一些情况下，介于80％至99.5％之间(例如约80％至约95％、约80％至约90％、约85％至约95％、约85％至约99％、约90％至约99％、约90％至约98％、约90％至约97％、约90％至约96％、约93％至约99％等)的所述溶剂可以从一种或多种基因改变剂中去除。
在一些情况下，所述一种或多种基因改变剂中的至少一种可以是选自由以下组成的群组的一种或多种试剂：(a)TAL效应物-核酸酶融合蛋白、(b)编码TAL效应物-核酸酶融合蛋白的核酸分子、(c)锌指-核酸酶融合蛋白、(d)编码锌指-核酸酶融合蛋白的核酸分子、(e)Cas9蛋白、(f)编码Cas9蛋白的核酸分子、(g)向导RNA以及(h)编码向导RNA的核酸分子。
在一些情况下，单独的基因改变剂被放置在多孔板的两孔或更多孔内。此外，单独的基因改变剂在溶剂中溶解的同时可以被添加到所述多孔板的孔内。同样地，部分或全部溶剂可以从单独的基因改变剂中去除，而单独的基因改变剂在所述多孔板的孔内。
一个或多个供体核酸分子(例如供体DNA)可以与所述基因改变剂共混合。例如，可以在将不同的插入物引入到特定染色体位点的情况下制备细胞。因此，本发明包括在其中将不同核酸片段引入到特定位点的细胞库在一些情况下，供体核酸分子的数量可以是约2至约10,000(例如约5至约10,000、约20至约10,000、约50至约10,000、约90至约10,000、约200至约10,000、约400至约10,000、约800至约10,000、约2,000至约10,000、约2至约10,000、约100至约1,000、约200至约3,000、约150至约1,500等)。
在一个集合中的基因改变剂的数量可能有较大地变化，可以是约2至约10,000(例如约5至约10,000、约20至约10,000、约50至约10,000、约90至约10,000、约200至约10,000、约400至约10,000、约800至约10,000、约2,000至约10,000、约2至约10,000、约100至约1,000、约200至约3,000、约150至约1,500等)。这样的基因改变剂可以放置在一个或多个多孔板的不同孔内。在许多情况下，这样单独的基因改变剂会结合到相同有机体的基因组的不同核苷酸序列上。
在一些情况下，与基因改变剂接触的溶剂(例如水剂)可以包含选自由以下组成的群组的一种或多种组分：(a)一种或多种缓冲液、(b)一种或多种蛋白酶抑制剂、(c)一种或多种核酸酶抑制剂、(d)一种或多种盐、(e)一种或多种碳水化合物、(f)一种或多种转染剂、(g)一种或多种多聚胺以及(h)一种或多种培养基。在特定情况下，所述碳水化合物是下列的一种或多种：蔗糖、海藻糖、乳糖或环糊精。
此外，在去除水之前，溶剂(例如水剂)的pH值可以是介于4和11之间(如约4至约7、约4至约6.5、约4至约8、约6.5至约11、约6.5至约10、约7至约11、约7至约10等)。
本发明还包括用于储存一种或多种基因改变剂的方法和通过这种方法制备的储存基因改变剂。在一些情况下，这些方法包括(a)在水溶液中制备一种或多种基因改变剂、(b)从所述(a)中制备的水剂中去除多于90％的水以及(c)在储存30天之后基因改变功能活性仍大于75％的条件下放置一种或多种基因改变剂。在特定情况下，储存至少30(例如至少30、至少60、至少90、至少120等)天后，基因改变功能活性仍大于75％(如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％等)。
此外，所述一种或多种基因改变剂中的一种以上可以被储存在同一个储存容器中(例如多孔板)。单独的储存基因改变剂可以结合到相同有机体的基因组的不同核苷酸序列上。另外，所述一种或多种基因改变剂可以储存在-70℃、-20℃、4℃，或在20℃和30℃之间(例如约-70℃至约30℃、约-22℃至约30℃、约2℃至约30℃、约-4℃至约30℃、约-10℃至约30℃、约-15℃至约30℃、约-22℃至约10℃等)。
本发明还包括包含一种或多种稳定的基因改变剂的组合物。这些组合物包含一种或多种基因改变剂，其中所述基因改变剂的含湿量小于10％(w/w)(例如约0.3％至约7％、约0.5％至约8％、约0.5％至约5％、约0.2％至约4％、约0.2％至约3％等)。
此外，本发明的组合物可以包含选自由以下一种或多种基因改变剂组成的群组的至少一种：(a)TAL效应物-核酸酶融合蛋白、(b)编码TAL效应物-核酸酶融合蛋白的核酸分子、(c)锌指-核酸酶融合蛋白、(d)编码锌指-核酸酶融合蛋白的核酸分子、(e)Cas9蛋白、(f)编码Cas9蛋白的核酸分子、(g)向导RNA以及(h)编码向导RNA的核酸分子。如上所述，一个或多个供体核酸分子(例如供体DNA)可以与所述基因改变剂共混合。
附图说明
为了更加全面地了解本文中所公开的原理和其优点，现结合附图并参考以下说明，其中：
图1是本发明的一些方面的代表性图。该图展示了用于单组分(例如锌指和TAL系统)和多组分基因改变系统(例如CRISPR系统，如Cas9和Cpf1系统)的试剂的示例。用于所述代表性单组份系统的试剂可以是DNA、mRNA以及蛋白质。可以将这些中的任意一种或多种引入到细胞中以进行基因组改变。用于所述代表性多组份系统的试剂可以是DNA、RNA和/或蛋白质。可以将这些中的一种或两种引入到细胞中以进行基因组改变。DNA和mRNA试剂作为前体进入细胞，然后转化为功能性RNA(例如gRNA)和蛋白质(例如Cas9、Cpf1、锌指核酸酶或TAL核酸酶)。
图2绘示了在本发明的一个方面中使用的示例性板的形式。所述板包括6×8孔阵列，其中每个孔由数字和字母组合标识。孔A，1和孔A，6不包含基因改变剂，因此它们是对照孔。
图3是代表性的天然存在的TAL蛋白模块结构的示意图。该蛋白由氨基末端(N)、包括由椭圆指示的可变数量的34个氨基酸重复序列组成的中心阵列(在确定碱基偏好的12和13位具有高变残基)以及包括核定位信号(NLS)和转录激活子(AD)结构域的羰基末端(C)组成。
图4是向导RNA分子(104个核苷酸)的示意图，其绘示了结合到Cas9蛋白和靶基因组座的所述向导RNA。发夹区域1由经核苷酸GAAA连接的互补性crRNA和tracrRNA区域杂交形成。发夹区域2由tracrRNA的3'部分中的互补区域形成。
图5绘示了使用DNA寡核苷酸模板合成向导RNA的工作流程。编码DNA模板的向导RNA使用装配PCR产生。该组装反应中的组分包括1)靶特异性DNA寡核苷酸(编码crRNA区域)、2)对用于体外转录的细菌启动子(此处为T7启动子)具有特异性的DNA寡核苷酸，以及3)编码tracrRNA区域的重叠PCR产物。在热循环仪中，使用DNA聚合酶(此处为高保真度Taq DNA聚合酶)进行填补反应，随后进行PCR扩增以产生全长编码模板的gRNA。PCR组装之后，在37℃下，使用用于非编码RNA合成的体外转录试剂(此处为MEGASHORTSCRIPTTM T7试剂盒)转录所述得到的DNA模板以产生靶特异性gRNA。合成之后，使用基于柱或磁珠的方法纯化所述得到的gRNA。纯化的体外转录向导RNA即可准备在宿主系统或感兴趣的细胞系中与Cas9蛋白共转染或进行mRNA递送。
图6是示意图，其绘示了使用CRISPR系统的基于切割的核酸切割策略的示意图。在所述图的顶端部分中，两条线代表双链核酸。两个切割位点由位点1和位点2指示出。这些位点位于实线或虚线框内，其指示与所述CRISPR/Cas9复合物相互作用的所述核酸区域。所述图的下端部分绘示了在两条链中产生两个紧密定位的切割位点的切割作用。
图7绘示了IVT向导RNA在U2OS-Cas9细胞系中经干燥和冷冻干燥重组后的切割效率标记为CPFS1T2的孔中无向导RNA。
具体实施方式
定义：
如本文中所用，术语“核酸改变”是指对基于基因编码或非编码的核酸修饰的改变或变化。基因编码改变涉及核酸分子的核苷酸序列变化。基于非编码的核酸改变是指核酸修饰，例如不涉及核苷酸序列改变的甲基化和会导致基因表达改变的修饰(例如组蛋白乙酰化、启动子激活、启动子阻遏等)。因此，当涉及DNA的转录时，功能性TAL-VP16融合蛋白会导致基于非编码的核酸改变。
如本文中所用，术语“基因改变剂”是指具有一种或多种核酸编改变活性或包含具有一种或多种基因改变活性的复合物的成分的组合物。示例性的基因改变剂是包含功能性锌指-FokI融合蛋白、功能性TAL-VP16融合蛋白以及具有将Cas9蛋白引导至靶核酸分子特定核苷酸区域的能力的gRNA分子。
如本文中所用，术语“稳定的基因改变剂”指可储存一段时间且功能活性损失最小的试剂。与此定义相关的参数在本文中阐述。
如本文中所用，术语“CRISPR系统”是指CRISPR蛋白和核酸的集合，当其结合时将导致至少一种CRISPR相关联的活性(例如双链DNA的靶基因座特异性双链切割)。
如本文中所用，术语“CRISPR复合物”是指彼此结合而形成具有功能活性的聚集物的CRISPR蛋白和核酸(例如RNA)。CRISPR复合物的一个实例是结合到对靶基因座具有特异性的向导RNA上的的野生型Cas9(有时称为Csn1)蛋白。
如本文中所用，“CRISPR蛋白”是指包含核酸(例如RNA)结合域核酸和效应物结构域(例如Cas9，如酿脓链球菌Cas9(Streptococcus pyogenes Cas9))的蛋白质。所述核酸结合域与第一核酸分子相互作用，所述第一核酸分子具有能够与所需靶核酸(例如向导RNA)杂交的区域或者允许与具有能够与所需靶核酸(例如crRNA)杂交的区域的第二核酸结合。CRISPR蛋白质还能够包含核酸酶结构域(即，脱氧核糖核酸酶或核糖核酸酶结构域)、其它的DNA结合域、解旋酶结构域、蛋白质-蛋白质相互作用结构域、二聚化结构域以及其它结构域。
CRISPR蛋白还指形成结合上述第一核酸分子的复合物的蛋白质。因此，一种CRISPR蛋白质可以结合到，例如向导RNA上且另一种蛋白质可以具有核酸内切酶活性。这些都被认为是CRISPR蛋白质，因为它们作为复合物的一部分发挥作用，其功能与单一蛋白质，如CAS9相同。
在许多情况下，CRISPR蛋白还含有允许使其输送到核的核定位信号(NLS)。
如本文中所用，术语“转录调节序列”是指核酸分子以任何结构或几何形状包含的核苷酸的功能性伸展，其作用是调节(1)一个或多个结构基因(例如两个、三个、四个、五个、七个、十个等)转录成信使RNA或(2)一个或多个基因转录为未翻译的RNA。转录调节序列的实例包括，但不限于启动子、增强子、抑制子等。
如本文中所用，术语“启动子”是转录调节序列的一个实例，确切地说是核酸，所述核酸通常被描述为位于起始密码子或编码未翻译RNA的核酸附近的基因5'区域。相邻核酸片段的转录起始于启动子区域。抑制性启动子的转录速率响应于抑制剂而降低。诱导性启动子的转录速率响应于诱导剂而升高。组成型启动子的转录速率未特别规定，然而其在一般代谢条件的影响下可以变化。
如本文中所用，术语“载体”是指为插入物提供有益的生物学或生物化学性质的核酸分子(例如DNA)。实例包括质粒、噬菌体、自主复制序列(ARS)、着丝粒以及能够在体外或在宿主细胞中复制或被复制或能够将所期望的核酸区段传送到宿主细胞内的期望位置的其它序列。载体可以具有一个或多个限制性核酸内切酶识别位点(例如两个、三个、四个、五个、七个、十个等)，序列可以在所述识别位点以可确定的方式被切割而不会损失载体的基本生物学功能，并且可以将核酸片段剪接到所述识别位点中以便实现其复制和克隆。
如本文中所用，术语“核酸靶向能力”是指分子或分子复合物根据序列特异性识别核酸和/或与核酸结合的能力。
如本文中所用，术语“靶基因座”是指核酸分子内供基因改变剂相互作用(例如结合和切割)的位点。当所述基因改变剂被设计为切割双链核酸时，所述靶基因座是由CRISPR复合物识别的所述切割位点和周围区域。当所述基因改变剂被设计为切割接近的双链核酸以产生双链断裂时，围绕和包括断裂点的区域称为靶基因座。
综述：
本发明部分地涉及用于所述基因组改变的组合物和方法。特别地，本发明涉及稳定试剂和用于生产和使用这种试剂的方法。稳定性可能是由储存条件(例如，温度、湿度等)或储存的试剂的化学特性(例如，化学修饰的核苷酸、缓冲液、还原剂的存在等)造成的。
为了说明，使用图1所示的示意图，可以准备两大类基因改变剂：单组分和多组分。单组份基因改变剂是指属于基因改变功能性组分或编码基因改变功能性组分的试剂。因此，单组份系统代表性地包括DNA、RNA或蛋白质。当所述试剂是DNA时，该DNA通常被引入到细胞内，在所述DNA在其中被转录形成mRNA。然后，mRNA作为基因改变功能性组分被翻译而产生蛋白质(例如锌指蛋白或TAL蛋白)。
多组分系统需要多于一种组分以提供基因改变活性。该类型系统的一个实例是基于Cas9的CRISPR系统。诸如此类的系统需要蛋白质组分(例如Cas9蛋白)和至少一种核酸组分(例如gRNA)用于基因改变活性。所述蛋白质组分可以作为蛋白质被引入到细胞内或由被引入到细胞中的mRNA或DNA编码。此外，gRNA或编码gRNA的DNA可以被引入到表达多组分系统中的一种或多种蛋白质组分的细胞内。
在大多数情况下，所述目标将是将(1)一种或多种功能性基因编辑剂、(2)编码基因编辑剂的一个或多个核酸分子或者(3)一种或多种准备形成基因改变复合物的基因改变剂和一个或多个编码其它基因改变剂的核酸分子的组合引入细胞内。
特别地，本发明涉及被设计为与其它核酸分子相互作用的蛋白质和核酸分子的组合。在一些情况下，本发明涉及蛋白质/核酸复合物，其中所述核酸组分具有与靶核酸分子互补的序列。在这些系统中，复合的核酸和把核酸分子之间的序列互补性用于将所述复合物与所述靶核酸结合。一旦发生此情况，则与复合物有关的功能活性可以用于修饰所述靶核酸分子。
非化学稳定性
非化学稳定性是指不涉及基因改变剂中功能性组分(例如TAL蛋白、gRNA等)的化学修饰的稳定化方法。
多种非化学稳定化方法可用于实施本发明。这些方法包括(a)温度、(b)pH值、(c)离子强度、(d)与其他化合物的络合、(e)抑制会降解蛋白质和核酸的酶的试剂的使用(例如核酸酶抑制剂、蛋白酶抑制剂等)，以及(f)冷冻干燥。
在一些方面中，本发明涉及组合物和制备包含基因改变剂的干燥或冷冻干燥组合物的方法仅含有少量溶剂(例如水)的试剂通常被期望经受较少的生物反应，因此预期其即使在室温下也相对稳定。
尽管许多种方法可以用来去除样品中的水(例如在真空或部分真空条件下离心)，也可以根据本领域已知的方法进行冷冻干燥。在许多情况下，溶剂将通过冷冻干燥去除。冷冻干燥方案的一个实例如下：(1)在5分钟内梯度温度从+20℃下降到-40℃，(2)-40℃保持3小时，(3)在30分钟内梯度温度从-40℃上升到-10℃，(4)-10℃保持4小时，(5)在15分钟内梯度温度从-10℃上升到+10℃，(6)+10℃保持2小时，(7)在15分钟内梯度温度从+10℃上升到+30℃，(8)+30℃保持4至8小时。
在许多情况下，甘油和去垢剂不存在于某些干燥方法的基因改变剂中。例如，虽然甘油可以存在于上文所述冷冻干燥方法中，但其不是优选的。
脱水或干燥可用于稳定基因改变剂。代表性地，基因改变剂中超过80％是水。去除大部分的水能够导致稳定化。例如，代表性地，冷冻干燥法可以将溶液的含湿量降低至0.3％和8％之间。因此，本发明包括含湿量为约0.1％至约10％、约0.5％至约10％、约1％至10％、约0.1％至约7％、约0.1％至约5％、约0.5％至约5％、约0.5％至约4％、约0.3％至约6％、约0.3％至约4％、约0.3％至约3％等的基因改变剂。
干燥基因改变剂的一个优点是其提高了在环境温度下的稳定性。因此，在一个方面中，本发明提供了稳定基因改变剂的方法和由这些方法产生的组合物。
在一些实施例中，在去除溶剂之前的制剂中，纤维二糖可以作为稳定剂以50mM和500mM之间的浓度存在。使用纤维二糖的优点之一是其对冷冻干燥法和生物分子(例如核酸和蛋白质)的保存来说都是一种有效的稳定剂，而已知技术的稳定剂通常用于其中一个或另一个目的。同样在许多情况下，在去除溶剂之前存在诸如KCl或MgCl2的盐。
还可以采用许多方法来抑制蛋白质的降解。一种是使用一种或多种蛋白酶抑制剂(例如苯基甲基磺酰氟、亮抑酶肽等)。
还可以采用许多方法来抑制包括RNA分子在内的核酸分子的降解。一种是使用一种或多种RNA酶抑制剂。许多商业化可用的RNA酶抑制剂是可用的，包括SUPERASEIN TM RNA酶抑制剂(目录号AM2694)，RNASEOUTTM(目录号10777-019)以及ANTI-RNase(目录号AM2690)，所有这些均可从赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific)公司获得。
来自病毒的衣壳蛋白也可用于稳定核酸分子。这些病毒可以是DNA病毒或RNA病毒。例如，当试图稳定gRNA分子时，可以使用来自诸如冠状病毒、SARS病毒、脊髓灰质炎病毒、鼻病毒和/或甲型肝炎病毒的单链RNA病毒的衣壳蛋白。
此外，gRNA可以通过与Cas9蛋白的络合来稳定。因此，本发明包括包含核酸/蛋白复合物的稳定的基因改变剂。此外，可以从这样的复合物中去除溶剂。
化学/碱稳定性：
化学稳定性是指涉及基因改变剂功能性组分(例如TAL蛋白、gRNA等)的化学修饰的稳定化方法。
用于实施本发明的核酸分子可以是化学修饰的。化学修饰可以用于多种目的。例如，化学修饰可以用于在储存期间稳定核酸分子(例如RNA分子)和/或增加其细胞内半衰期。此外，对于功能性RNA分子(例如gRNA分子)，发夹可以以稳定其结构的方式被改变。这可以通过选择促进发夹形成的碱基(例如G/C含量)来完成。
化学修饰可以是任意数量的化学基团和位置。特定的化学修饰的适用性可以随RNA分子的类型和化学集团内RNA分子的位置而变化。
化学修饰可以是碱基或碱基间的结合。示例性化学修饰可以包括硫代修饰、2'-O-甲基化修饰、2'-O-丙基化修饰、2'-O-乙基化修饰、2'-氟代修饰和/或这些修饰的组合。也可使用修饰的糖类。修饰的糖类包括D-核糖、二脱氧核苷酸、2'-O-烷基(包括2'-O-甲基和2'-O-乙基)、即2'-烷氧基、2'-氨基、2'-S-烷基、2'-卤代(包括2'-氟代)、2'-甲氧基乙氧基、2'-烯丙基氧基(-OCH2CH＝CH2)、2'-炔丙基酯、2'-丙基、乙炔基、乙烯基、丙烯基以及氰基等。
其它的可用于实施本发明的化学修饰还可以在Hendel等人《自然生物技术(Nature Biotech)》doi:10.1038/nbt.3290(2015)和Radhar等人《国家科学院学报(Proc.Nat'l.Acad.Sci.)》(美国)doi/10.1073/pnas.1520883112(2015)中找到。
化学修饰还包括磷酸二酯类似物，如硫代磷酸酯、硫代磷酸酯和P乙烷氧基磷酸二酯、P-乙氧基磷酸二酯、P-烷氧基磷酸酯、甲基膦酸酯和含键的非磷(例如缩醛和酰胺)。
假尿苷是尿苷的C-糖苷异构体，在RNA中发现的超过一百种不同修饰的核苷中，其是最普遍的。假尿苷由被称作假尿苷合酶的酶形成，其在称为假尿苷酰化的过程中在转录后于RNA中异构化特定尿苷残基。建议对假尿苷提供辐射防护。RNA分子可以通过在5'和/或3'末端处或其附近的一个或多个位置加入假尿苷和/或2'-O甲基化修饰以稳定。
化学修饰可以将储存期限和/或细胞内各处的半衰期提高1.2至20倍(例如约1.5至约20、约2至约20、约1.5至约20、约1.5至约20、约1.5至约20、约1.5至约20、约1.5至约20、约1.5至约20等)。
化学修饰可以位于核酸分子的一个末端、两个末端和/或内部。在许多情况下，化学修饰将被定位以抑制核酸外切酶对核酸分子的消化。在一些格式中，从一至十个(例如约一至约九个、约一至约六个、约一至约五个、约一至约四个、约一至约三个、约一至约两个等)5'和/或3'末端碱基将被化学修饰。在更多的特定格式中，所述化学修饰是硫代磷酸酯修饰或2'-O-甲基修饰或这些修饰的组合。
化学修饰在数量上可以是从一到二十个(例如约一到十五个、约两到十五个、约三到十五个、约三到十个、约三到八个、约两到五个等)修饰，例如碱基修饰、连接修饰和/或糖修饰。
许多核酸外切酶是渐进的，从这种意义上来说他们仍然附着在其底物上并且在解离之前进行多轮催化。RNA分子的终端可能存在不同的基团以防止降解。作为实例，合成的RNA通常具有5'羟基。由体外转录产生的RNA通常具有5'三磷酸基团。天然RNA通常有5'单磷酸基团。本发明包括具有一个或多个se 5'基团以及其他5'基团的稳定的RNA分子。作为实例，5'三磷酸基团可通过使用RNA5'焦磷酸水解酶转化为单磷酸基团。此外，5'单磷酸基团可用于提高RNA稳定性。
许多其他的方法可用于稳定核酸分子。例如，可以将一串多聚G添加到核酸分子的3'-端以抑制降解。特别地，多聚G区域可以存在于在mRNA3'-末端发现的多聚A区域，导致RNA分子的细胞内半衰期增加。
另一种提高RNA分子(例如gRNA分子)稳定性的方法是提供这些分子作为稳定的环或发夹。这些环的修饰的一个实例是那些含有C/G富集区域的环。与具有A/T碱基的核酸片段形成的环相比，这些碱基之间的三个氢键增加环的稳定性。RNA分子的稳定性还可以通过环的添加而提高，例如由四对C/G碱基组成的四环。环也可以作为一个或两个末端被稳定或引入。在gRNA的情况下，环可以被引入到5'末端。本发明因此包括包含发夹区域的核酸分子，其中60％至100％(例如约65％至约100％、约70％至约100％、约75％至约100％、约80％至约100％、约75％至约90％等)的碱基对是C/G对。此外，这些发夹区域可能包含约4个至约20个碱基对(例如约5至约20个碱基对、约6至约20个碱基对、约7至约20个碱基对、约5至约15个碱基对、约6至约14个碱基对等)。
在一些情况下，可以改变自然驻留发夹存在的数量以增强核酸分子的稳定性。天然的Tracr分子形成三个发夹。最后的发夹在3'末端具有3至5个其它的碱基。Tracr分子和其他RNA分子(例如gRNA分子)可以通过去除末端碱基中的一些或全部来稳定。这被认为抑制了核酸酶的启动。此外，天然驻留发夹的截断可以通过改变溶剂暴露而导致稳定的RNA分子。
RNA分子也可以通过引入形成三重和/或四重结构的区域而形成，特别是在3'末端处或附近。
交叉连接基团(例如光活化基团)可以被添加到gRNA(例如在3'末端处或附近)以允许与Cas9蛋白的交叉连接。这允许形成稳定的gRNA/Cas9复合物，其中被认为gRNA受蛋白质保护免于降解。
示例性基因改变剂：
三种不同的基因改变系统实例是基于锌指的系统、基于TAL效应物的系统、基于CRISPR的系统(例如基于Cas9的系统和基于CPF1的系统)。每种操作由不同的原理指导且使用不同的功能分子。这些系统分成两个组(1)基于蛋白质的系统(例如锌指和TAL效应物)和(2)基于核酸/蛋白质复合物的系统(例如CRISPRs)。
A.基于锌指的系统
锌指核酸酶(ZFNs)和大范围核酸酶是基因组工程工具的例子。ZFNs是包含锌指DNA结合结构域和核酸酶结构域的嵌合蛋白。核酸酶结构域的一个实例是来自IIS型限制性内切酶FokI(Kim,YG；Cha,J.,Chandrasegaran,S.《杂交限制性酶：锌指融合到Fok I切割结构域(Hybrid restriction enzymes:zinc finger fusions to Fok I cleavagedomain)》《美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.)》1996年2月6日；93(3):1156-60)的通常由5至7个碱基对的连接序列分离的非特异性切割结构域。通常需要一对FokI切割结构域以允许域的二聚化和非回文靶序列从相反的链切割。单个Cys2His2 ZFNs的DNA结合结构域通常包含3至6个独立的锌指重复序列，并且其每个可以识别9至18个碱基对。
与ZNFs有关的问题是脱靶切割的可能性，其这可能导致供体DNA的随机整合或导致染色体的重排，甚至细胞死亡，这仍然引起人们对高等生物适用性的担忧(《使用寡脱氧核苷酸的锌指核酸酶诱导基因修复：需要和不需要的靶基因座修饰(Zinc-fingerNuclease-induced Gene Repair With Oligodeoxynucleotides:Wanted and UnwantedTarget Locus Modifications)》《分子疗法(Molecular Therapy)》卷18，第4期,743-753(2010))。
B.基于TAL效应物的系统
类转录激活因子(TAL)效应物代表一类由植物病原菌在植物细胞感染时通过其III型分泌系统分泌的DNA结合蛋白质，如黄单胞菌和绿僵菌。天然TAL效应物已被明确地证明与植物启动子序列结合从而调节基因表达和激活效应物特异性宿主基因，以促进细菌繁殖(P.等人《通过辣椒Bs3抗性基因的启动子介导的植物病原识别(Plant pathogenrecognition mediated by promoter activation of the pepper Bs3resistancegene)》《科学(Science)》318,645-648(2007)；Boch,J.和Bonas,U.《黄单胞菌AvrBs3家族Ⅲ型效应物：发现和功能(Xanthomonas AvrBs3 family-type III effectors:discoveryand function.)》《植物病理学年报(annual review of phytopathology)》48,419-436(2010)；Kay,S.Bonas,U.等人《细菌效应器作为植物转录因子并诱导细胞大小调节器(Abacterial effector acts as a plant transcription factor and induces a cellsize regulator.)》《科学(Science)》318,648-651(2007)；Kay,S.和Bonas,U.《黄单胞菌III型效应器如何操纵寄主植物(How Xanthomonas type III effectors manipulate thehost plant.)》《微生物学研究现状(Curr.Opin.Microbiol.)》12,37-43(2009))。天然TAL效应器一般由中心重复结构域和羧基末端核定位信号序列(NLS)以及转录激活域(AD)组成。所述中心重复结构域通常由1.5至33.5个氨基酸重复序列的可变量组成，所述氨基酸重复序列通常长度为33至35个残基，除了通常较短的称为半重复序列的羧基末端重复序列。所述重复序列大多数是相同的，但是在某些高变残基上有所不同。TAL效应物的DNA识别特异性由通常在每个重复序列的12和13位处的高变残基，即所谓的重复可变双残基(RVD)介导，其中每个RVD在给定的DNA序列中靶向特定的核苷酸。因此，TAL蛋白的重复序列顺序倾向于与给定的DNA序列的确定的核苷酸线性顺序相同。一些天然存在的TAL效应物的基础RVD编码已经被确定，从而允许预测需要与给定的DNA序列结合的序列重复顺序(Boch,J.等人《打破TAL III型效应分子DNA结合特异性的编码(Breaking the code of DNA bindingspecificity of TAL-type III effectors)》《科学(Science)》326,1509-1512(2009)；Moscou,M.J.和Bogdanove,A.J.简单密码借由TAL效应物控制DNA识别(Asimple ciphergoverns DNArecognition by TAL effectors)《科学(Science)》326,1501(2009))。此外，已经表明，以新的重复组合产生的TAL效应物结合到该编码预测的靶序列上。已经表明，靶DNA序列通常以5'胸腺嘧啶碱基开始，由TAL蛋白识别。
TAL模块结构允许DNA结合结构域与效应分子如核酸酶结合。特别地，TAL效应物核酸酶允许已知的新基因组工程工具的开发。
C.基于CRISPR的系统
基因改变剂可以基于CRISPR系统。术语“CRISPR”是应用于三种类型的系统和系统亚型的通用术语。一般来说，术语CRISPR是指编码CRISPR系统组分(例如编码的crRNAs)的重复区域。已经鉴别出各自具有不同特征的三种类型的CRISPR系统(参见表1)。
虽然本发明具有多个方面和与其有关的变化形式，但是II型CRISPR/Cas9系统已经选作参考点用作本文解释。
在某些方面，本发明提供稳定的crRNAs、tracrRNAs和/或向导RNAs(gRNAs)，以及这些RNA分子的集合。
图4绘示了与II型CRISPR系统有关的组分和分子的相互作用。在这种情况下，以Cas9介导的酿脓链球菌系统为例说明。gRNA示于图4，其与靶DNA(杂交区域1)和tracrRNA(杂交区域2)均杂交。在这个系统中，这两种RNA分子用于将Cas9蛋白质以允许切割靶DNA的方式引到靶DNA序列上。靶DNA在两个位点被切割以形成双链链断裂。
图5绘示了本发明的示例性工作流程。图5中的示意图绘示了经设计以产生DNA分子的寡核苷酸，其中向导RNA编码区可操作地连接到T7启动子。在此工作流程中，单独使用寡核苷酸或与双链DNA结合使用，通过PCR产生DNA分子，所述DNA分子编码可操作地连接到适于体外转录的启动子的向导RNA。然后对DNA分子进行体外转录以产生向导RNA。然后可以通过例如柱提纯或基于珠粒的方法来“净化”向导RNA。然后通过如下：例如，(1)直接引入进细胞中，或(2)与一种或多种CRISPR蛋白质络合之后引入进细胞中使向导RNA适合使用。当这些哺乳细胞细胞包含T7RNA聚合酶时，可操作地连接到T7启动子的核酸可以在所述哺乳细胞细胞中转录(Lieber等人，《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》，17:8485–8493(1989))当然，在真核细胞中起作用的其它启动子(例如CMV启动子、U6启动子、H1启动子等)还可以用于向导RNA的细胞内产生。H1启动子的长度是，例如约300个碱基对。所述T7启动子的一个优点是其尺寸小(20个碱基对)。
使用化学合成和体外转录RNA的一个优点是可以将化学修饰的碱基引入到所述RNA分子内。
也可以使用干燥或冷冻干燥的基因改变复合物。许多剂型可以应用于干燥或冷冻干燥的基因改变剂，所述基因改变剂已被允许形成复合物。在许多情况下，可以使用CRISPR系统剂形成复合物。
干燥或冷冻干燥的基因改变剂复合物可以通过在细胞(例如U2OS细胞、HEK293细胞等)中引入所述复合物来测试和/或使用。此外，复合物还可以以1X至5X浓度在其中制备或以多孔形式放入其中。对于Cas9mRNA形式，可以使用RNAiMAX或其同等物。对于Cas9蛋白形式，CRISPRMAX或其同等物可以应用于基于脂质纳米粒的转染。
为了说明，Cas9/gRNA作为示例性条件在以下列出。
形式1：无转染剂或Cas9。将1至5μg gRNA加入到多孔板的孔中。将所述板和内容物真空干燥，然后在不同温度下储存。在使用之前，gRNA被重新悬浮到适当的浓度。将稳定表达Cas9的细胞或以Cas9和适当转染剂共转染的细胞加入到孔中。在一些方面中，一种或多种(例如两种)TAL蛋白、编码一种或多种(例如两种)TAL蛋白的TAL mRNA或编码一种或多种TAL蛋白的DNA可以被加入到孔中，而不是与gRNA协同使用或使用gRNA。
形式2：混合20ng IVT产生的gRNA(20ng/μl)和100ng Cas9mRNA(100ng/μl)形成复合物并加入到多孔板的孔中。将所述板和内容物真空干燥，然后在不同温度下储存。在转染之前，将所述样品在无RNA酶和DNA酶的水或OPTI-MEMTM培养基中重新悬浮。重悬干燥样品后，将RNAiMAX/OPTI-MEMTM混合物(每孔使用0.6μlRNAiMAX和4.4μl OPTI-MEMTM制备)加入到所述gRNA-Cas9复合物中，然后应用于15,000至20,000细胞/孔。在一些方面中，一种或多种(例如两种)TAL蛋白、编码一种或多种(例如两种)TAL蛋白的TAL mRNA或编码一种或多种TAL蛋白的DNA可以被加入到所述孔中，而不是与gRNA协同使用或使用gRNA。
形式3：IVT gRNA(20ng/μl时为20ng/孔)和Cas9mRNA(100ng/μl时为100ng/孔)与RNAiMAX(0.6μl/孔)预先复合，然后真空干燥。干燥的预制复合样品在OPTI-MEMTM中重新悬浮并用于转染。在一些方面中，一种或多种(例如两种)TAL蛋白、编码一种或多种(例如两种)TAL蛋白的TAL mRNA或编码一种或多种TAL蛋白的DNA可以被加入到所述孔中，而不是与gRNA协同使用或使用gRNA。
形式4：IVT产生的gRNA(20ng/孔)和Cas9mRNA(100ng/孔)与RNAiMAX(或其同等物)和OPTI-MEMTM(4.4μl/孔)预先复合。将所述混合物真空干燥。在使用之前，将样品在OPTI-MEMTM和/或水中重新悬浮，然后以96孔形式应用于细胞。在一些方面中，一种或多种(例如两种)TAL蛋白、编码一种或多种(例如两种)TAL蛋白的TAL mRNA或编码一种或多种TAL蛋白的DNA可以被加入到所述孔中，而不是与gRNA协同使用或使用gRNA。
形式5：IVT产生的gRNA与RNAiMAX或MESSENGERMAXTM(含或不含OPTI-MEMTM)预先复合。这种形式可以与稳定表达Cas9的细胞系共同使用。所用组分的数量与上述形式相同或相似。在一些方面中，一种或多种(例如两种)TAL蛋白、编码一种或多种(例如两种)TAL蛋白的TAL mRNA或编码一种或多种TAL蛋白的DNA可以被加入到所述孔中，而不是与gRNA协同使用或使用gRNA。
形式6：具有供体DNA(例如单链DNA)的形式1至4。在一些方面中，一种或多种(例如两种)TAL蛋白、编码一种或多种(例如两种)TAL蛋白的TAL mRNA或编码一种或多种TAL蛋白的DNA可以被加入到所述孔中，而不是gRNA协同使用或使用gRNA。
基因改变活性：
本发明的试剂可以具有任何数量的活性。例如，所述试剂可以包含具有一个或多个异源结构域(例如一个、两个、三个、四个、五个等)的融合蛋白。融合蛋白可以包含任何其它的蛋白质序列，和任选地存在于任意两个域之间的连接序列。可以是融合蛋白组分的蛋白质结构域的实例包括，但不限于表位标签、报告基因序列以及具有一个或多个以下活性的一个或多个结构域：甲基化酶活性、去甲基化酶活性、转录激活性、转录抑制活性、转录释放因子活性、组蛋白修饰活性(例如乙酰化活性、脱乙酰化活性、磷酸化活性、去磷酸化活性、甲基化活性、去甲基化活性等)。RNA切割活性以及核酸结合活性。
特别地，本文中部分地提供基因改变剂，其包含至少一种核定位信号、至少一种具有功能活性的结构域(例如核酸酶、甲基化酶等)以及至少一种与靶基因座相互作用的结构域或至少一种与核酸分子相互作用的结构域，所述核酸分子与靶基因座相互作用。
基因改变剂还可以用于活化或抑制转录。例如，无核酸酶活性的“死亡的”Cas9(即dCas9)蛋白可以用于非编码改变目的。dCas9-转录激活因子融合蛋白(例如dCas9-VP64)可以与向导RNA共同用于激活靶基因座相关联核酸的转录。类似地，dCas9抑制因子融合物(例如dCas9-KRAB转录抑制因子)可以用于抑制靶基因座相关联核酸的转录。如上文所提及的转录活化和抑制论述于，例如Kearns等人，《Cas9效应物介导调节人类多能干细胞的转录和分化(Cas9effector-mediated regulation of transcription and differentiation inhuman pluripotent stem cells)》，《发育(Development)》，141:219-223(2014)。
本发明因此包括用于制备和使用供活化和抑制转录使用的基因改变剂的组合物和方法。
图6绘示了形成靶基因座的两个紧密相关联的位点的选择。每个位点(位点1和位点2)结合具有切割活性的基因改变剂。这样做的一个目的是使核酸切割脱靶最小化。
图6中举例说明的两个位点的位置彼此充分接近，以使含有切口的双链核酸断裂。虽然此距离会随着因素(如区域中的AT/CG含量)而变化，但是切口位点通常在彼此间的200个碱基对内(例如约1至约200个、约10至约200个、约25至约200个、约40至约200个、约50至约200个、约60至约200个、约1至约100个、约10至约100个、约20至约100个、约30至约100个、约40至约100个、约50至约100个、约1至约60个、约10至约60个、约20至约60个、约30至约60个、约40至约60个、约1至约35个、约5至约35个、约10至约35个、约20至约35个、约25至约35个、约1至约25个、约10至约25个、约15至约25个、约2至约15个、约5至约15个等碱基对)。
切割活性可以通过多种方法实现。例如，当所述基因改变剂是Cas9时，Cas9蛋白质具有两个域，称为RuvC和HNH，其切割双链核酸的不同链。可以改变Cas9蛋白质以使一个域或另一个域失活。其结果是，需要两种Cas9蛋白质切割靶基因座以使双链断裂发生。例如，来自酿脓链球菌的Cas9的RuvC催化域中发生的天冬氨酸被丙胺酸取代(D10A)使得Cas9从切割双链的核酸酶转化为切个单链的切割酶。使Cas9成为切割酶的突变的其它实例包括H840A、N854A以及N863A。
具有切割酶活性的CRISPR蛋白质(例如Cas9)可以与分别靶向DNA靶的正义链和反义链的向导序列(例如两个向导序列)组合使用。
利用切割酶活性在核酸中产生双链断裂的另一种方式是使用连接到异源核酸酶结构域的缺乏核酸酶活性的CRISPR蛋白质。这种蛋白质的一个实例是连接到FokI结构域的突变型Cas9，称为dCas9。FokI结构域需要发生二聚化才能获得核酸酶活性。因此，在此类情况下，使用CRISPR RNA分子使两种dCas9-FokI融合蛋白充分紧密地接近，以产生核酸酶活性，从而形成双链切割。这种类型的方法陈述于Tsai等人，《二聚合CRISPR RNA-引导的FokI核酸酶用于高度特异性基因组编辑(Dimeric CRISPR RNA-guided FokI nucleases forhighly specific genome editing)》，《自然生物技术(Nature Biotech)》，32:569-576(2014)和Guilinger等人，《无催化活性Cas9与FokI核酸酶的融合改善基因组修饰特异性(Fusion of catalytically inactive Cas9 to FokI nuclease improves thespecificity of genome modification)》，《自然生物技术(Nature Biotech)》，32:577-582(2014)。
另一种使核酸脱靶切割最小化的方法是通过使用核酸酶，所述核酸酶在二聚化之前无活性。此类核酸的一个实例是FokI。锌指蛋白和TAL效应物蛋白已经被设计成结合核酸分子上的不同位点以允许所述FokI结构域二聚化，从而导致核酸酶活性的重组。
本发明因此包括识别核酸分子上多于一个基因座的基因改变剂。在许多情况下，识别位点之间的距离与参考图6中提到的所述切割位点处于相同的范围内。
功能活性可以通过任何数量的方法测量。例如，基于诱导表达或抑制表达的活性可以通过评估转录和/或翻译的增加或减少来测量。
当功能活性与所述DNA(例如细胞内DNA)的切割有关时，那么许多商业化产品可以用于核酸切割的检测。一个这样的产品是基因组切割检测试剂盒(目录号A24372)，来自赛默飞科技(Thermo Fisher Scientific)。另外的分析也可以在美国专利申请第14/879,872(2015年10月9日)号题为“CRISPR寡核苷酸与基因编辑(CRISPROligonucleotides and Gene Editing)”的专利中找到，其全部公开内容通过引用整体并入本文。
试剂混合物和形式：
许多不具有直接基因改变活性的组合物可以包括在试混合物中。一组这样的组合物是转染剂。这些可以作为实验方案的一部分微量添加到基因改变剂中。
适用于本发明的转染剂包括促进RNA、DNA以及蛋白质引入到细胞中的转染剂。示例性转染剂包括TurboFect转染剂(赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific))、Pro-Ject试剂(赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific))、TRANSPASSTM P蛋白质转染剂(新英格兰生物实验室(New England Biolabs))、CHARIOTTM蛋白质递送剂(Active Motif)、PROTEOJUICETM蛋白质转染剂(EMD密理博(EMD Millipore))、293FECTINTM、LIPOFECTAMINETM2000、LIPOFECTAMINETM 3000(赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific))；LIPOFECTAMINETM(赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific))、LIPOFECTINTM(赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific))、LIPOFECTAMINETM CRISPRMAXTM(赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific))、DMRIE-C、CELLFECTINTM(赛默飞世尔科技(Thermo FisherScientific))；OLIGOFECTAMINETM(赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific))、LIPOFECTACETM、FUGENETM(罗氏(Roche)，瑞士巴塞尔(Basel,Switzerland))、FUGENETM HD(罗氏(Roche))、TRANSFECTAMTM(Transfectam，普洛麦格(Promega)，(威斯康星州麦迪逊(Madison,Wis.))、TFX-10TM(普洛麦格(Promega))、TFX-20TM(普洛麦格(Promega))、TFX-50TM(普洛麦格(Promega))、TRANSFECTINTM(伯乐(BioRad)，加利福尼亚州大力神(Hercules,Calif.))、SILENTFECTTM(伯乐(BioRad))、EffecteneTM(凯杰(Qiagen)，加利福尼亚州瓦伦西亚(Valencia,Calif.))、DC-chol(阿凡提极性脂类(Avanti PolarLipids))、GENEPORTERTM(基因治疗系统(Gene Therapy Systems)，加利福尼亚州圣地亚哥(San Diego,Calif.))、DHARMAFECT 1TM(达马康(Dharmacon)，科罗拉多州拉斐特(Lafayette,Colo.))、DHARMAFECT 2TM(达马康(Dharmacon))、DHARMAFECT 3TM(达马康(Dharmacon))、DHARMAFECT 4TM(达马康(Dharmacon))、ESCORTTM III(西格玛(Sigma)，密苏里州圣路易斯(St.Louis,Mo.))以及ESCORTTM IV(西格玛Sigma化学公司(Sigma ChemicalCo.))。
基因改变剂可以设置为一种形式，以使其中基因改变活性需要最小添加。在一个示例性形式中，供体核酸、ZNF–FokI融合蛋白对以及转染剂在96孔板的孔中冷冻干燥。将培养基中的细胞添加到具有冻干基因改变剂的孔和其他不含基因改变剂(对照孔)的孔中。随后，在两个样品上测量靶基因座同源重组的效率。
在一些情况下，所述基因改变剂将包含gRNA，且与所述gRNA接触的细胞将表达Cas9蛋白。由细胞摄取的gRNA随后与细胞内表达的Cas9蛋白相关联以重组基因改变活性。在适当的条件下，在细胞与gRNA接触之前、同时或之后，这些细胞可以与供体核酸接触。
本发明进一步包括对各个靶点具有特异性的基因改变剂的集合。例如，本发明包括对特定类型细胞(例如人类细胞)内的靶点具有特异性的基因改变剂的集合。细胞的此类集合中的成员可以根据这些特定类型细胞的序列信息产生。作为一个实例，一种此类集合可以使用特定类型细胞的全基因组序列产生。基因组序列数据可用于产生对人类基因组内的每个基因的编码区具有特异性的基因改变剂的文库。
crRNA分子的集合或文库或本发明可以包括多种多样的单个分子，如约5至约100,000种(例如约50至约100,000种、约200至约100,000种、约500至约100,000种、约800至约100,000种、约1,000至约100,000种、约2,000约100,000种、约4,000至约100,000种、约5,000至约100,000种、约50至约50,000种、约100至约50,000种、约500至约50,00 0种、约1,000至约50,000种、约2,000至约50,000种、约4,000至约50,000种、约50至约10,000种、约100至约10,000种、约200至约10,000种、约500至约10,000种、约1,000至约10,000种、约2,000至约10,000种、约4,000至约10,000种、约50至约5,000种、约100至约5,000种、约500至约5,000种、约1,000至约5,000种、约50至约2,000种、约100至约2,000种、约500至约2,000种等)。
另外，用于实施本发明的基因改变剂可以多种形式储存。例如，RNA分子可以储存于管(例如1.5ml微量离心管)中或板(例如96孔、384孔或1536孔板)的孔中。一个示例性形式展示于图2中。在这个图中，A，1孔和A，6孔是对照孔，不含有基因改变剂。其他的孔含有干燥的基因改变剂，其可以与，例如含有细胞的培养基重组。此外，每个孔含有对不同靶基因座具有结合特异性的基因改变剂。
载体组分和细胞：
多种功能性核酸组分(例如启动子、多聚A信号、复制起点、筛选标记等)可以用于实施本发明。使用时，用于实施本发明的功能性核酸组分的选择将根据使用性质和系统特性(例如细胞内、细胞外、体外转录、成对的体外转录/翻译等)而出现极大变化。
启动子选择取决于许多种因素，如所用细胞或系统的表达产物和类型。例如，非mRNA分子经常使用RNA聚合酶I或III启动子生成。mRNA通常使用RNA聚合酶II启动子转录。然而存在例外。一种是microRNA表达系统，其中microRNA可以使用RNA聚合酶II启动子(例如CMV启动子)由DNA转录。虽然RNA聚合酶II启动子不具有“突出的”的中止和起始点，但microRNA倾向于通过5'和3'末端的去除而被处理。因此，除去末端的“额外”RNA片段。mRNA(例如Cas9mRNA)通常通过RNA聚合酶II启动子产生。
特异性启动子的选择随具体应用而变化。举例来说，体外转录和体外转录/翻译系统往往使用T7、T3以及SP6启动子。当期望细胞内表达时，使用的启动子通常设计成在所使用细胞内有效地发挥功能。举例来说，所述CMV启动子是在哺乳动物细胞内使用的强启动子。杂交Hsp70A-Rbc S2启动子是在真核藻类(如莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii))中发挥良好功能的组成型启动子。(参见产品手册“衣藻属蛋白质表达试剂盒(Chlamydomonas Protein Expression Kit)”，目录号A24244，B.0版，购自生命技术公司(Life Technologies Corp.)，加利福尼亚州卡尔斯巴德(Carlsbad,CA))。可以用于实施本发明的其它启动子包括AOX1、GAP、花椰菜花叶病毒35S、pGC1、EF1α以及Hsp70启动子。
表达载体中的DNA片段可操作地连接到适当的表达控制序列(启动子)上以指导RNA合成。合适的真核启动子包括CMV即刻早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、逆转录病毒LTR的启动子，如劳斯氏肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus，RSV)的启动子，以及金属硫蛋白启动子，如鼠金属硫蛋白-I启动子。适用于本发明使用的示例性启动子来自III型RNA聚合酶III启动子类别。另外，启动子可以选自由U6和H1启动子组成的群组。U6和H1启动子均是III型RNA聚合酶III启动子类别的成员。
RNA聚合酶III启动子适用于通过本发明方法所产生的核酸分子进行体内转录。举例来说，如图5所示产生的线性DNA分子可以引入到细胞中并且通过例如天然驻留的细胞内转录过程转录。
本发明的组合物和方法中的启动子还可以具有诱导性，原因是可以“开启”或“关闭”表达。举例来说，使用所述U6启动子的四环素可调节系统可以用于控制siRNA的产生。表达载体可以含有或可以不含有供翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。载体还可以包括适用于增强表达的序列。
适用于本发明的细胞包括各种各样的原核和真核细胞。在许多情况下，一种或多种CRISPR系统组分天然地与细胞不相关(即，对于细胞来说是外源的)。
可以用于实施本发明的代表性细胞包括(但不限于)细菌细胞、酵母细胞、植物细胞和动物细胞。示例性细菌细胞包括埃希氏杆菌种(Escherichia spp.)细胞(具体地说，大肠杆菌(E.coli)细胞且最具体地说，大肠杆菌菌株DH10B、Stbl2、DH5α、DB3、DB3.1)、芽孢杆菌种(Bacillus spp.)细胞(具体地说，枯草杆菌(B.subtilis)和巨大芽孢杆菌(B.megaterium)细胞)、链霉菌种(Streptomyces spp.)细胞、欧文菌种(Erwinia spp.)细胞、克雷伯氏菌种(Klebsiella spp.)细胞、沙雷氏菌种(Serratia spp.)细胞(具体地说，粘质沙雷氏菌(S.marcessans))、假单胞菌种(Pseudomonas spp.)细胞(具体地说，绿脓杆菌(P.aeruginosa)细胞)以及沙门氏菌种(Salmonella spp.)细胞(具体地说，鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)和伤寒沙门氏菌(S.typhi)细胞)。示例性动物细胞包括昆虫细胞(最具体地说，黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)细胞、草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)Sf9和Sf21细胞以及粉夜蛾属(Trichoplusa)High-5细胞)、线虫细胞(具体地说，秀丽隐杆线虫(C.elegans)细胞)、禽鸟细胞、两栖动物细胞(具体地说，爪蟾(Xenopuslaevis)细胞)、象爬虫细胞以及哺乳动物细胞(更具体地说，NIH3T3、CHO、COS、VERO、BHKCHO-K1、BHK-21、HeLa、COS-7、HEK 293、HEK 293T、HT1080、PC12、MDCK、C2C12、Jurkat、NIH3T3、K-562、TF-1、P19以及人类胚胎干细胞，如克隆H9(美国，威斯康星州麦迪逊(Wicell,Madison,Wis.,USA)))。示例性酵母细胞包括酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)细胞和甲醇酵母(Pichia pastoris)细胞。这些和其它细胞是商购可得的，例如从赛默飞世尔科技(Thermo-Fisher Scientific，马萨诸塞州沃尔瑟姆(Waltham,MA))、美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection)以及农业研究菌种保藏中心(Agricultural Research Culture Collection)(伊利诺伊州皮奥瑞亚，北部地区研究实验室(NRRL；Peoria,Illinois))购得。示例性的植物细胞包括如来源于大麦、小麦、稻米、大豆、马铃薯、芥菜属以及烟草(例如普通烟草(Nicotiana tabacum)SR1)的细胞。
实例
实例1：干燥试剂的制备
喷雾干燥：向导RNA的干燥剂型是由向导RNA、1,2-二棕榈酰-Sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、蔗糖以及白蛋白(按重量计，20:40:20:20)制备的。将含有15mg siRNA、15mg白蛋白以及15mg蔗糖(总体积7.5ml)的水溶液与17.5ml含30mg DPPC的乙醇混合。在将溶液合并之前，将它们以磁力搅拌棒混合。将水溶液加入到有机溶液后，用磁力搅拌棒在室温下将合并的溶液混合约6分钟，随后对溶液进行喷雾干燥。喷雾干燥的条件是T入口＝95℃，T出口＝55℃，雾化/干燥气体流速为600升/小时。
实例2：干燥试剂的制备
将RNA储存缓冲液(1mM柠檬酸钠pH 6.4)中的20μl体外转录向导RNA原料(每孔0.5μg至1μg)以96孔板形式冷冻干燥，并保持在-20℃。在转染为U2OS Cas9细胞之前，将干燥后的gRNA简单离心，然后在20μl无DNA酶/RNA酶的水中重新悬浮。在转染之前，使用QUANT-ITTMRNA BR分析试剂盒测量RNA浓度。在转染前一天，以10,000个/孔的细胞密度将细胞以96孔板形式接种。在转染的当天，不转染的对照除外，针对每孔，将20ng gRNA加入到5μl培养基中，然后加入包含1.5μl of LIPOFECTAMINETM RNAiMAX的5μl Opti-MEM。在室温下孵育所得到的转染混合物10分钟，然后加入到细胞中。将含有经转染细胞的培养板在5％CO2培养箱中于37℃下培养48小时。基因座特异性插入缺失形成的百分比是通过基因组切割检测试剂盒(赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific)，目录号A24372)检测的。使用Alpha成像仪(伯乐(Bio-Rad))的内置软件定量色带强度。图7绘示了六个不同基因获得的切割效率结果。在BTK基因的情况下，测试了两个不同的基因组座。对于每一个被测试的样品，将使用赋形剂或不使用赋形剂的干燥后的样品与RNA储存缓冲液中未冻干的IVT gRNA进行比较。
尽管出于清楚了解的目的，前述实施例已在某种程度上详细地加以描述，但本领域的技术人员通过阅读本公开将清楚，可以在形式和细节上进行各种变化而这些变化不脱离本文中所揭露的实施例的真实范围。例如，可以将上述所有技术、设备、系统和方法以各种组合形式进行使用。
本发明的示例性主题进一步由以下条款表示：
条款1.一种用于制备一种或多种稳定基因改变剂的方法，所述方法包括：
(a)在溶剂中制备一种或多种基因改变剂，和
(b)去除(a)中大于80％的所述溶剂。
条款2.根据条款1所述的方法，其中所述溶剂是水、一种或多种醇或水和一种或多种醇的混合物。
条款3.根据前述条款中任一项所述的方法，其中一种或多种基因改变剂中的至少一种是选自由以下组成的群组的一种或多种试剂：
(a)TAL效应物-核酸酶融合蛋白、
(b)编码TAL效应物-核酸酶融合蛋白的核酸分子、
(c)锌指-核酸酶融合蛋白、
(d)编码锌指-核酸酶融合蛋白的核酸分子、
(e)Cas9蛋白、
(f)编码Cas9蛋白的核酸分子、
(g)向导RNA以及
(h)编码向导RNA的核酸分子。
条款4.根据条款2所述的方法，其中所述水通过冷冻干燥、喷雾干燥、喷雾冷冻干燥、超临界流体干燥或真空离心去除。
条款5.根据前述条款中任一项所述的方法，其中在水溶液中从所述一种或多种基因改变剂中去除所述溶剂的80％至99.5％。
条款6.根据前述条款中任一项所述的方法，其中单独的基因改变剂被放置在多孔板的两个或更多个孔中。
条款7.根据条款6所述的方法，其中将所述单独的基因改变剂加入到所述多孔板的孔中的所述溶剂内。
条款8.根据条款6和7所述的方法，其中将所述水性溶剂的一些或全部从所述单独的基因改变剂中去除，而所述单独的基因改变剂在所述多孔板的孔中。
条款9.根据条款6所述的方法，其中50至100种单独的基因改变剂被放置在所述多孔板的不同孔中。
条款10.根据条款6至9所述的方法，其中所述单独的基因改变剂结合到同一个有机体的所述基因组的不同核苷酸序列上。
条款11.根据前述条款中任一项所述的方法，其中所述水性溶液包含选自由以下组成的群组的一种或多种组分：
(a)一种或多种缓冲液、
(b)一种或多种蛋白酶抑制剂、
(c)一种或多种核酸酶抑制剂、
(d)一种或多种盐、
(e)一种或多种碳水化合物、
(f)一种或多种转染剂、
(g)一种或多种多聚胺以及
(h)一种或多种培养基。
条款12.根据条款11所述的方法，其中所述碳水化合物是以下的一种或多种：蔗糖、海藻糖、乳糖或环糊精。
条款13.根据前述条款中任一项所述的方法，其中去除所述水之前，所述水性溶液的pH值介于4至约11之间。
条款14.一种用于储存一种或多种基因改变剂的方法，所述方法包括：
(a)在水性溶液中制备一种或多种基因改变剂，
(b)从(a)中制备的所述水性溶液中去除多于90％的水，以及
(c)在储存30天之后基因改变功能活性仍大于75％的条件下放置一种或多种基因改变剂。
条款15.根据条款14所述的方法，其中所述一种或多种基因改变剂中的至少一种的基因改变功能活性在储存至少30天之后仍大于90％。
条款16.根据条款14或15所述的方法，其中所述一种或多种基因改变剂中的至少一种的基因改变功能活性在储存120天之后仍大于90％。
条款17.根据条款14、15或16所述的方法，其中所述一种或多种基因改变剂中的多于一种被储存在相同的储存容器中。
条款18.根据条款17所述的方法，其中所述储存容器是多孔板。
条款19.根据条款17所述的方法，其中所述单独的基因改变剂结合到同一个有机体的所述基因组的不同核苷酸序列上。
条款20.根据条款14、15、16、17、18或19所述的方法，其中所述一种或多种基因改变剂在-20℃、4℃或20℃和30℃之间下储存。
条款21.一种包括一种或多种稳定基因改变剂的组合物，所述组合物包括一种或多种基因改变剂，其中所述基因改变剂的含湿量小于10％(w/w)。
条款22.根据条款21所述的组合物，其中所述含湿量为约0.2％至约8％。
条款23.根据条款21或22所述的组合物，其中所述一种或多种基因改变剂中的至少一种是选自由以下组成的群组的一种或多种试剂：
(a)TAL效应物-核酸酶融合蛋白、
(b)编码TAL效应物-核酸酶融合蛋白的核酸分子、
(c)锌指-核酸酶融合蛋白
(d)编码锌指-核酸酶融合蛋白的核酸分子、
(e)Cas9蛋白
(f)编码Cas9蛋白的核酸分子、
(g)向导RNA以及
(h)编码向导RNA的核酸分子。
条款24.根据条款21、22或23所述的组合物，其中所述稳定剂包含选自由以下组成的群组的一种或多种组分：
(a)一种或多种缓冲液、
(b)一种或多种蛋白酶抑制剂、
(c)一种或多种核酸酶抑制剂、
(d)一种或多种盐、
(e)一种或多种碳水化合物、
(f)一种或多种转染剂、
(g)一种或多种多聚胺、
(h)一种或多种培养基。
条款25.根据条款21、22、23或24所述的组合物，其中50至100种单独的稳定基因改变剂被放置在多孔板的不同孔中。

Claims (25)

1.一种用于制备一种或多种稳定基因改变剂的方法，所述方法包括：
(a)在溶剂中制备一种或多种基因改变剂，和
(b)去除(a)中多于80％的所述溶剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述溶剂是水、一种或多种醇或水和一种或多种醇的混合物。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种基因改变剂中的至少一种是选自由以下组成的群组的一种或多种试剂：
(a)TAL效应物-核酸酶融合蛋白、
(b)编码TAL效应物-核酸酶融合蛋白的核酸分子、
(c)锌指-核酸酶融合蛋白、
(d)编码锌指-核酸酶融合蛋白的核酸分子、
(e)Cas9蛋白、
(f)编码Cas9蛋白的核酸分子、
(g)向导RNA以及
(h)编码向导RNA的核酸分子。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述水通过冷冻干燥、喷雾干燥、喷雾冷冻干燥、超临界流体干燥或真空离心去除。
5.根据权利要求1所述的方法，其中在水性溶液中从所述一种或多种基因改变剂中去除所述溶剂的80％至99.5％。
6.根据权利要求1所述的方法，其中单独的基因改变剂放置于多孔板的两个或更多个孔中。
7.根据权利要求6所述的方法，其中将所述单独的基因改变剂加入到所述多孔板的孔中的所述溶剂内。
8.根据权利要求7所述的方法，其中将所述水性溶剂的一些或全部从所述单独的基因改变剂中去除，而所述单独的基因改变剂在所述多孔板的孔中。
9.根据权利要求6所述的方法，其中50至100种单独的基因改变剂被放置在所述多孔板的不同孔中。
10.根据权利要求6所述的方法，其中所述单独的基因改变剂结合到同一个有机体的所述基因组的不同核苷酸序列上。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述水性溶液包含选自由以下组成的群组的一种或多种组分：
(a)一种或多种缓冲液、
(b)一种或多种蛋白酶抑制剂、
(c)一种或多种核酸酶抑制剂
(d)一种或多种盐、
(e)一种或多种碳水化合物、
(f)一种或多种转染剂、
(g)一种或多种多聚胺以及
(h)一种或多种培养基。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述碳水化合物是以下的一种或多种：蔗糖、海藻糖、乳糖或环糊精。
13.根据权利要求1所述的方法，其中去除所述水之前，所述水性溶液的pH值介于4至约11之间。
14.一种用于储存一种或多种基因改变剂的方法，所述方法包括：
(a)在水性溶液中制备一种或多种基因改变剂，
(b)从(a)中制备的所述水性溶液中去除多于90％的水，以及
(c)在储存30天之后基因改变功能活性仍大于75％的条件下放置一种或多种基因改变剂。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述一种或多种基因改变剂中的至少一种的基因改变功能活性在储存至少30天后仍大于90％。
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述一种或多种基因改变剂中的至少一种的基因改变功能活性在储存120天后仍大于90％。
17.根据权利要求14所述的方法，其中所述一种或多种基因改变剂中的多于一种被储存在相同的储存容器中。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述储存容器是多孔板。
19.根据权利要求17所述的方法，其中单独的基因改变剂结合到同一个有机体的所述基因组的不同核苷酸序列上。
20.根据权利要求14所述方法，其中所述一种或多种基因改变剂在-20℃、4℃或20℃和30℃之间下储存。
21.一种包括一种或多种稳定基因改变剂的组合物，所述组合物包括一种或多种基因改变剂，其中所述基因改变剂的含湿量小于10％(w/w)。
22.根据权利要求21所述的组合物，其中所述含湿量为约0.2％至约8％。
23.根据权利要求21所述的组合物，其中所述一种或多种基因改变剂的至少一种是选自由以下组成的群组的一种或多种试剂：
(a)TAL效应物-核酸酶融合蛋白、
(b)编码TAL效应物-核酸酶融合蛋白的核酸分子、
(c)锌指-核酸酶融合蛋白、
(d)编码锌指-核酸酶融合蛋白的核酸分子、
(e)Cas9蛋白、
(f)编码Cas9蛋白的核酸分子、
(g)向导RNA以及
(h)编码向导RNA的核酸分子。
24.根据权利要求21所述的组合物，其中所述稳定剂包含选自由以下组成的群组的一种或多种组分：
(a)一种或多种缓冲液、
(b)一种或多种蛋白酶抑制剂、
(c)一种或多种核酸酶抑制剂
(d)一种或多种盐、
(e)一种或多种碳水化合物、
(f)一种或多种转染剂、
(g)一种或多种多聚胺以及
(h)一种或多种培养基。
25.根据权利要求21所述的组合物，其中50至100种单独的稳定基因改变剂被放置在多孔板的不同孔中。
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