KR20180083178A

KR20180083178A - 자궁샘근증 진단용 마커 조성물 및 이를 포함하는 진단키트

Info

Publication number: KR20180083178A
Application number: KR1020170005413A
Authority: KR
Inventors: 김태희; 김준모; 김미진; 김예솔; 박유진; 이해혁; 정수호
Original assignee: 순천향대학교 산학협력단
Priority date: 2017-01-12
Filing date: 2017-01-12
Publication date: 2018-07-20
Also published as: KR101898907B1

Abstract

본 발명의 자궁샘근증 진단용 마커 조성물은 GPR30(G-protein coupled receptor 30) 단백질을 검출하는 제제 또는 GPR30 mRNA을 검출하는 제제를 포함한다. 상기 조성물 등을 활용하면 생물학적 시료 내의 GPR30 수준을 확인하여 자궁샘근증의 진단을 위한 정보로 활용할 수 있고, 정상 자궁과의 구별뿐만 아니라 특히 임상적으로 그 구별이 어려운 자궁근종과의 구별도 가능하도록 한다.

Description

자궁샘근증 진단용 마커 조성물 및 이를 포함하는 진단키트{COMPOSITION FOR DIAGNOSING ADENOMYOSIS AND DIAGNOSTIC KIT FOR ADENOMYOSIS CONTAINING THE SAME}

본 발명은 자궁샘근증 진단용 마커 조성물, 이를 포함하는 진단키트 등에 관한 것이다.

자궁평활근종과 자궁샘근증은 가임기 여성 연령대에서 발생하는 가장 흔한 부인과 질환이다. 자궁평활근종은 평활근세포가 단일클론성(monoclonal)으로 증식하여 형성된 자궁 근층의 양성 종양이다. 반면 자궁샘근증은 자궁 근층으로 자궁내막층이 침범하여 전반적으로 자궁이 커지는 양성 질환이며, 조직학적으로 이소성의 비신생물의 자궁내막샘과 실질이 비후성의 근층에 둘러싸여있다.

자궁평활근종과 자궁샘근증 두 질환 모두 폐경 전 여성에서 자궁적출술이 필요할 수 있어 산부인과 영역에서 중요한 질환에 해당된다. 자궁평활근종은 무증상이 가장 흔하지만, 증상이 있다면 비정상적 자궁출혈과, 만성 골반통, 빈뇨 등의 비뇨기계 증상 등을 보일 수 있다. 자궁샘근증에서는 환자의 약 50%에서 나타나는 월경과다와 30%에서 나타나는 월경통이 대표적인 증상이다. 두 질환은 같이 동반되어 발생하는 경우도 많기 때문에 두 질환을 증상으로 구분하기는 매우 어렵다.

출원번호: 10-2008-7026231, 자궁내막 증식에 대한 바이오마커

Bosn J Basic Med Sci. 2016;16(1):39-45, G-protein-coupled estrogen receptor-30 gene polymorphisms are associated with uterine leiomyoma risk.

본 발명의 목적은 자궁샘근증 진단용 마커 조성물, 이를 포함하는 진단키트 등을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 자궁샘근증 진단용 마커 조성물은 GPR30(G-protein coupled receptor 30) 단백질을 검출하는 제제 또는 GPR30 mRNA을 검출하는 제제를 포함한다.

상기 GPR30 단백질을 검출하는 제제는 GPR30 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함할 수 있다.

상기 GPR30 mRNA을 검출하는 제제는 GPR30 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하거나, GPR30 mRNA가 역전사된 cDNA에 특이적으로 결합하는 프러이머 또는 프로브를 포함할 수 있다.

상기 마커 조성물은 GPR30(G-protein coupled receptor 30) 단백질을 검출하는 제제 및 GPR30 mRNA을 검출하는 제제를 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 일 실시예에 따른 자궁샘근증 진단용 키트는 GPR30(G-protein coupled receptor 30) 단백질을 검출하는 제제를 포함한다.

본 발명의 또 다른 일 실시예에 따른 자궁샘근증 치료제의 스크리닝 방법은, 자궁샘근증 스크리닝용 세포주를 함유하는 스크리닝용 세포를 배양하는 제1단계; 상기 스크리닝용 세포에 약물을 처리하여 처리군을 준비하는 제2단계; 및 상기 스크리닝용 세포의 GPR30(Anti-G-protein coupled receptor 30) 단백질 발현 수준을 상기 약물을 처리하지 않은 대조군의 GPR30 단백질 발현 수준과 비교하여, GPR30 단백질 발현을 증가시키는 약물을 스크리닝하는 제3단계;를 포함한다.

상기 스크리닝 방법은, 상기 제3단계에서 GPR30 mRNA 수준을 비교하는 과정을 더 포함할 수 있다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명에서 용어, ‘진단’은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 자궁샘근증 발병 여부를 확인하는 것이다.

본 발명에서 용어, ‘자궁샘근증(자궁선근증, adenomyosis)'은 자궁 근층으로 자궁내막층이 침범하여 전반적으로 자궁이 커지는 양성 질환을, '자궁근종(자궁평활근종, leiomyoma, myoma uteri)’은 평활근세포가 단일클론성(monoclonal)으로 증식하여 형성된 자궁 근층의 양성 종양을 의미한다.

본 발명에서 용어, ‘진단용 (바이오) 마커, 진단하기 위한 (바이오) 마커 또는 진단 마커’는 자궁샘근증을 정상 자궁 또는 자궁근종과 구분하여 진단할 수 있는 것으로, 정상 세포에 비하여 자궁샘근증을 가진 세포에서 증가 또는 감소 양상을 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예: mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등의 수준을 정상 세포와 구분할 수 있거나 그 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 마커 또는 이에 포함되는 조성물을 의미한다.

본 발명에서 용어 ‘생물학적 시료’는 자궁샘근증 발병에 의해 자궁샘근증 마커의 유전자 발현 수준에 차이가 나타나는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 생리혈 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 발명자들은, 두 자궁 질환인 자궁근종과 자궁샘근증의 발병에 GPR30의 발현될 것이라는 가설을 세우고 휴먼 샘플을 이용한 실험을 진행하던 중, 자궁근종이나 정상자궁조직과 다르게, 자궁샘근증 조직에서는 GPR30의 발현이 감소한다는 점을 확인하고, 이를 이용하면 자궁샘근증 진단을 위한 정보 제공 또는 자궁샘근증 치료 물질 스크리닝 방법 등에 활용할 수 있다는 점을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 자궁샘근증 진단용 마커 조성물은 GPR30(G-protein coupled receptor 30) 단백질을 검출하는 제제 또는 GPR30 mRNA을 검출하는 제제를 포함하여 자궁샘근증 발생을 예측 또는 진단하기 위한 정보를 제공한다.

상기 단백질을 검출하는 제제는, 자궁 조직 또는 자궁 유래 생물학적 시료에 포함된 GPR30 단백질을 검출하는 제제일 수 있다.

상기 GPR30 단백질(G-protein coupled receptor 30 protein, Homo sapiens, 375 aa, 염기서열: mdvtsqargv glemypgtaq paapnttspe lnlshpllgt alangtgels ehqqyviglf lsclytiflf pigfvgnili lvvnisfrek mtipdlyfin lavadlilva dslievfnlh eryydiavlc tfmslflqvn myssvffltw msfdryiala ramrcslfrt khharlscgl iwmasvsatl vpftavhlqh tdeacfcfad vrevqwlevt lgfivpfaii glcyslivrv lvrahrhrgl rprrqkalrm ilavvlvffv cwlpenvfis vhllqrtqpg aapckqsfrh ahpltghivn laafsnscln pliysflget frdklrlyie qktnlpalnr fchaalkavi pdsteqsdvr fssav)을 검출하는 제제는, 생물학적 시료 중의 상기 단백질의 양을 확인하는 방법 중 하나로, 바람직하게 상기 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 포함하여 상기 단백질의 발현양을 확인할 수 있다. 즉, 상기 단백질을 검출하는 제제는, 예를 들어 GPR30 단백질과 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다.

상기 항체란, 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미하고, 본 발명의 목적상, 항체는 마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다.

상기한 바와 같이 자궁샘근증 조직에서 GPR30 단백질 발현에 대해 규명되었으므로, 이를 이용하여 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다. 다클론 항체는 상기한 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다. 시판하는 항체로는, ab39742(Rabbit polyclonal to G-protein coupled receptor 30, Cambridge, UK), ab188790(Rabbit polyclonal to G-protein coupled receptor 30 - Extracellular domain), ab118512(Goat polyclonal to G-protein coupled receptor 30), ab154069(Rabbit polyclonal to G-protein coupled receptor 30 - N-terminal), ab188951(Rabbit polyclonal to G-protein coupled receptor 30 - C-terminal), ab188607(Rabbit polyclonal to G-protein coupled receptor 30), ab137479(Rabbit polyclonal to G-protein coupled receptor 30), ab150638(Rabbit polyclonal to G-protein coupled receptor 30 - Extracellular domain) 등이 적용될 수 있다.

상기 단백질을 검출하기 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, 엘라이자(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역분석(Immunoassay), 면역화학염색분석(Immunohistochemistry Assay), 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 단백질칩(protein chip) 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.

상기 mRNA을 검출하는 제제는, GPR30 발현에 관여하는 mRNA 또는 이의 cDNA를 정량적으로 검출할 수 있는 제제일 수 있고, 예를 들어 상기 GPR30 mRNA에 대한 프라이머 또는 프로브를 이용하여 측정할 수 있다.

분석방법으로는 예를 들어, 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Realtime RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 및 DNA 칩으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 이용한 방식이 사용될 수 있다.

상기 단백질을 검출하는 제제는, 생물학적 시료의 GPR30 단백질 발현 감소를 검출하는 것이 적용될 수 있고, 상기 생물학적 시료는 자궁샘근증이 발생이 예상되거나 의심되는 자궁조직을 포함하는 검체일 수 있다.

상기 마커 조성물을 적용하는 생물학적 시료는 자궁조직일 수 있고, 구체적으로 자궁근층조직, 또는 자궁샘조직을 포함하는 자궁 조직일 수 있으며, 이러한 자궁 조직을 포함하는 시료라면 적용될 수 있다.

상기 마커 조성물은 GPR30(G-protein coupled receptor 30) 단백질을 검출하는 제제 및 GPR30 mRNA을 검출하는 제제를 모두 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 일 실시예에 따른 자궁샘근증 진단용 키트는 GPR30(G-protein coupled receptor 30) 단백질을 검출하는 제제를 포함하는 마커 조성물을 포함하여 자궁샘근증 진단에 활용되는 정보를 제공한다. 예를 들어, 자궁샘근증이 발생이 예상되거나 의심되는 자궁조직을 포함하는 검체로부터 생물학적 시료로부터 GPR30 단백질 검출 제제를 포함하는 조성물을 활용해 시료 내의 GPR30 단백 발현 정도를 확인하여 자궁샘근증 진단을 위한 정보를 제공할 수 있다. 특히, 상기 키트는 정상 자궁조직과의 구별뿐만 아니라 임상적으로 그 구분이 까다로운 자궁근종, 특히 자궁평활근종과의 효과적인 구별 진단을 위한 정보를 제공할 수 있다.

상기 키트는 면역분석키트(Immunoassay)일 수 있다.

본 발명의 다른 일 실시예에 따른 자궁샘근증 진단용 키트는 GPR30(G-protein coupled receptor 30) mRNA를 검출하는 제제를 포함하는 마커 조성물을 포함하여 자궁샘근증 진단에 활용되는 정보를 제공한다. 예를 들어, 자궁샘근증이 발생이 예상되거나 의심되는 자궁조직을 포함하는 검체로부터 생물학적 시료로부터 GPR30 mRNA를 추출하고 이를 검출하는 제제를 포함하는 조성물을 활용해 시료 내의 GPR30 mRNA 발현 정도(mRNA 를 역전사한 시료를 활용하는 경우에는 cDNA와 cDNA를 검출하는 제제를 적용함)를 확인하여 자궁샘근증 진단을 위한 정보를 제공할 수 있다. 특히, 상기 키트는 정상 자궁조직과의 구별뿐만 아니라 임상적으로 그 구분이 까다로운 자궁근종, 특히 자궁평활근종과의 효과적인 구별 진단을 위한 정보를 제공할 수 있다.

상기 키트는 DNA 칩일 수 있다.

본 발명이 또 다른 일 실시예에 따른 자궁샘근증 치료제의 스크리닝 방법은, 자궁샘근증 스크리닝용 세포주를 함유하는 스크리닝용 세포를 배양하는 제1단계; 상기 스크리닝용 세포에 약물을 처리하여 처리군을 준비하는 제2단계; 및 상기 스크리닝용 세포의 GPR30(G-protein coupled receptor 30) 단백질 발현 수준을 상기 약물을 처리하지 않은 대조군의 GPR30 단백질 발현 수준과 비교하여, GPR30 단백질 발현을 증가시키는 약물을 스크리닝하는 제3단계;를 포함한다.

상기 제3단계의 비교는 정상 자궁세포의 GPR30 단백질 발현 수준 또는 대조군의 GPR30 단백질 발현 수준과 상기 스크리닝용 세포의 GPR30 단백질 발현 수준을 비교하는 과정을 포함할 수 있다.

또한 상기 제3단계의 비교는 처리군의 GPR30 mRNA 수준과 정상 자궁세포의 GPR30 단백질 발현 수준 또는 대조군의 GPR30 mRNA 수준을 비교하는 과정을 포함할 수 있다.

상기 스크리닝용 세포는 자궁 세포 유래 세포 또는 세포주일 수 있다.

상기 스크리닝용 세포는 자궁 세포 유래 자궁샘근증 세포주일 수 있다.

상기 스크리닝용 세포는 자궁샘근증 발병 또는 GPR30 단백질 발현 억제 처리가 된 자궁 세포 또는 자궁세포 유래 세포주일 수 있다.

상기 스크리닝 방법은 자궁근종과 구별하여 자궁샘근증에 활성을 가지는 물질인지 여부를 확인할 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 실시예에 따른 구별 진단을 위한 정보 제공 방법은, 위에서 설명한 조성물 또는 키트를 활용하여 자궁샘근증 진단에 필요한 정보를 제공하거나, 자궁샘근증과 자궁근종의 구별 진단에 활용되는 정보를 제공한다.

본 발명의 자궁샘근증 진단용 마커 조성물, 이를 포함하는 진단키트 등은 자궁샘근증을 효과적으로 구분할 수 있는 마커 조성물 등을 제공하며, 정상자궁조직과의 구별뿐만 아니라, 특히 임상적으로 그 구분이 어려운 자궁평활근종(자궁근종)과 자궁샘근증을 효과적으로 구별할 수 있다. 또한, 본 발명의 자궁샘근증 치료제의 스크리닝 방법은, GPR30 단백질 발현을 증가시키는지 여부를 확인하여 자궁샘근증 치료제로 활용가능성이 있는 약물을 효과적으로 스크리닝 할 수 있다.

도 1은 본 발명의 실시예에서 IHC(immunohistochemistry) 방법으로 각 조직에서 GPR30의 발현 정도를 확인한 실험 결과를 보여주는 사진[A. 정상자궁 조직(human normal uterus, HN), B. 자궁근종 조직(human leiomyoma, HL), C.자궁샘근증 조직(human adenomyosis, HA)]
도 2는 도 1의 결과를 H score를 활용하여 정량화하여 나타낸 그래프(*는 p < 0.05을 의미함)
도 3은 본 발명의 실시예에서 진행한 Western blot 결과를 보여주는 그래프(A. Western blot 결과, B. A의 결과를 정량화한 그래프)
도 4는 본 발명의 실시예에서 진행한 GPR30 RNA levels에 대한 RT-PCR(Reverse transcriptase polymerase chain reaction) 결과.

이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 첨부한 도면을 참고로 하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 이하에서 %의 표시가 문맥상 중량%인지 부피%인지 불명확한 경우에는 중량%를 의미한다.

1. 실험 방법

(1) 샘플의 준비(Human tissue study)

대한민국 부천시 소재 순천향대학교병원에 내원하여 자궁근종, 자궁샘근증으로 자궁절제술을 시행 받은 환자로부터 채취한 정상 자궁, 자궁근종, 자궁샘근증의 3 가지 조직을 대상으로 이하 실험을 진행하였다. 이때, 정상 자궁근 조직은 자궁샘근증에서는 분리가 불가능하며, 자궁근종을 가진 적출물에서 정상 자궁근조직을 함께 분리하여 적용하였다. 이 실험은 순천향대학교 부천병원 윤리위원회의 승인 하에 환자의 동의를 받아 진행되었다. 각 조직의 샘플은 아래 기준으로 대상 여부가 결정되었다.

포함기준(Inclusion criteria)

가. 폐경 전 여성으로서 자궁근종의 추정 진단 하에 자궁절제술을 시행 받았으며 조직학적으로 확진이 된 경우

나. 폐경 전 여성으로서 자궁샘근증의 추정 진단 하에 자궁절제술을 시행 받았으며 조직학적으로 확진이 된 경우

다. 가 또는 나의 조건에서 검사 및 연구에 동의하는 경우

불포함기준(Exclusion criteria)

가. 악성 질환으로 수술 받는 경우

나. 과거 1 년 이내에 호르몬 치료를 받았거나 현재 호르몬 치료를 받는 경우

다. 수술 시 질 내 염증이 심한 경우

라. 자궁절제술시 산모인 경우

마. Inclusion criteria의 가와 나 항목이 복합적으로 작용하는 경우

바. 정상적인 동의 및 검사의 진행을 할 수 없는 경우

위의 조건에 따라서 선택된 환자 샘플들은, 키, 몸무게, 체질량지수(BMI, ㎏/m²), 나이, 과거 질병력, 가족력, 기존의 투여 약 병력, 현재 투여 중인 약물 평가는 의무 기록을 이용하여 조사하고 분류하여 이하 실험에 적용하였다.

(2) 조직의 처리

자궁근종으로 자궁절제 수술 시 얻어지는 정상 부위의 자궁조직을 대조군으로 하여 비교하였다. 수술과정에서 적출된 자궁에서 자궁근종, 자궁샘근증의 조직을 1 cm³ 절제하여 파라핀 블록 제작한 후 이후 실험에 적용하였다. 파라핀 블록의 제작 방법은 통상의 방법을 적용했다.

(3) 면역조직화학염색( immunohistochemistry ) 방법

면역조직화학 염색 전에는 통상적인 hematoxylin & eosin 방법으로 조직을 염색하여 조직의 소견을 확인하였다.

선택된 환자의 파라핀 포매조직을 4 내지 5 μm 두께로 박절하고, xylene으로 5 분간 3 회 탈파라핀 과정을 거친 후 무수 알코올, 90 %, 75 % 및 50 % 에탄올에 각각 2 분씩 처리하여 함수시켰다. 이후 조직 절편 내의 내인성 과산화 효소의 활성을 억제하기 위해 0.3 % hydrogen peroxide-methanol에 10 분간 처리한 후 증류수로 세척한 다음, 50 mM Tris 완충용액 (TBS, pH 7.5)으로 수세 후 비특이성 반응을 제거하기 위해 30 분간 염소혈청으로 처리하고, 여분의 용액을 제거하였다.

일차항체는 Anti-G-protein coupled receptor 30 antibody (ab39742; Cambridge, UK)를 사용하였고, 일차항체를 각각 실온에서 2 시간 작용시켰다. 일차항체 반응 후 TBS로 5 분간 3 회 수세한 다음 biotin이 부착된 이차항체(1:300, Zymed Co.)에 20 분간 작용 후, 통상적인 avidin-biotin complex법으로 염색하였다. 발색제는 AEC를 사용하고 Mayer's hematoxylin으로 대조 염색 하였다.

결과 판정은 면역조직화학법에 의한 G-protein coupled receptor 30 antibody 단백의 결과 판정은 병리과 의사에 의하여 광학현미경 (Olympus BX50) 200 배 시야로 확인하여 질의 각 층의 염색 결과를 관찰하도록 하였으며, 핵에 진하게 갈색으로 염색된 세포의 수를 세어, 백분율로 표시한 뒤 10 % 미만인 경우를 음성, 10 % 이상 염색이 된 경우를 양성으로 판정하며, 질의 각 층별, 즉 점막, 점막하, 기질, 평활근 및 혈관 내피에서의 발현을 관찰하였다.

관찰 결과는 h-score로 수치화하여 정리하였으며, H-score는 발현 된 면적에 점수를 주는 방법으로 아예 발현이 되지 않은 경우에는 0점, 1 내지 9% 의 발현면적은 1점, 10 내지 19%의 면적은 2점, 20% 이상의 면적인 경우에는 3점을 주는 방식으로 적용하였다.

(4) 웨스턴 블로팅 (Western blotting) 방법

선택된 조직에서 단백질을 lysis buffer(50 mM N-2-hydroxyethylpiperazine-N0-2-ethanesulfonic acid [pH 7.4], 150 mM NaCl, 10% glycerol, 1% Triton X-100, 1.5 mM MgCl₂-6H₂O, 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid, 100 mM NaF, 10 mM sodium pyrophosphate, protease inhibitors, 1 mM Na₃VO₄, 10 mg/mL leupeptin, 10 mg/mL aprotinin, 4 mM phenylmethylsulfony fluoride)를 사용하여 추출하였다.

단백질의 농도는 detergent-compatible protein assay (Bio-Rad Laboratories)를 사용하여 분석하였다.

Sample을 10 % Tris-HCl Ready Gels (Bio-Rad) 로 sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel을 사용하여 전기영동시켜 분리하고 Hybond electrochemiluminescent nitrocellulose (Amersham Pharmacia Biotech) 막에 전기적으로 blot시켰다. 동량의 단백질이 loading된 것을 확인하기 위해 β actin 항체를 추가로 반응시켰다.

5 % 탈지 분유를 TBS-T buffer (0.05% Tween-20 in PBS, pH 7.4)에 첨가하여 막을 1 시간 동안 미리 세척하여 비특이적 단백의 결합을 방지하였다. 면역반응성인 G-protein coupled receptor 30 antibody의 발현을 위하여 막을 Anti-G-protein coupled receptor 30 antibody (ab39742; Cambridge, UK)에 1:1,000으로 4 ℃에서 하루 밤 동안 반응시켰다. TBS-T buffer로 30 분간 수세한 후 이차 항체로 anti-rabbit antibody를 사용하여 1:3,000으로 1 시간 동안 반응시켰다. TBS-T buffer로 2 회 수세한 후 30 분간 rocking shaker에서 수세하였다. 이어서, ECL 용액을 사용하여 develop시키고, β actin을 사용하여 각 band의 발현을 표준화하였다.

각 실험을 3 회 반복하여 결과를 확인한다. Densitometry를 사용하여 OD(optic density) 값을 구하여 그 결과를 나타냈다.

(5) PCR (Polymerase Chain Reaction) 방법에 의한 mRNA 분석

total RNA를 TRIzol Reagent manual을 이용하여 추출하였다.

cDNA 합성을 위한 역전사는 cDNA Synthesis Protocol (SensiFAST cDNA Synthesis Kit)을 사용하여 제조사의 지침대로 GPER primer를 이용하여 시행한다(프라이머 서열은 표 1 참조).

Total RNA 1ug과 5×TransAmp Buffer 4ul, Reverse Transcriptase 1ul, DNase/RNase free-water 를 첨가하여 총 20ul 로 만들고, 역전사 반응은 PCR 기기에서 25 ℃에서 10 분, 42 ℃에서 15 분간 반응시키고 역전사 효소의 불활성화를 위해 85℃에서 5 분간 반응시켜 진행하였다.

RT-PCR은 Rotor Gene Q (Qiagen)을 사용하여 시행하였으며, PCR 반응액은 Maxime RT-PCR Premix kit을 이용하여 제조사의 지침대로 분석을 시행하였다. Primer, cDNA, 멸균 증류수를 첨가하여 총 20 uL가 되게 하여, 94℃에서 5 분 반응시킨 후 94℃에서 30초, 57℃ 30초, 72℃ 30초씩 35 회 반응시키는 조건으로 증폭하였다. 증폭이 끝난 PCR 산물은 Agarose gel에 loading 하여 band size 및 발현을 확인하였다. 내부표준물질로 GAPDH을 적용했다.

Gene name	5`-Froward primer sequence-3`	3`-Reverse primer sequence- 5`
GPR3	5'-TGGGGACCTCTCTFAACATC-3'	5'-GCAGGAAGAGGGACATGAAG-3'

* 통계분석

이하의 데이터들은 마이크로소프트 2007 오피스 엑셀 프로그램을 이용하여 기록되고 SPSS(Statistical Package for the Social Sciences) 12.0 버전(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 통계 분석되었다. 불연속변수(discrete variables)은 2 test 또는 Fisher’s exact test를 이용해 분석했다. p <0.05를 통계적 유의성을 의미하는 것으로 취급했다.

2. 실험 결과

(1) 환자의 임상정보

선택된 환자 샘플과 관련해, 환자의 임상정보들은 아래와 같다.

(mean±SE)	정상자궁(Normal)	자궁근종(Leiomyoma)	자궁샘근증(Adenomyosis)
나이(year)	43.0±2.0	43.9±2.1	44.3±3.2
키(height)	154.0±2.4	154.7±2.1	153.2±0.5
체중(kg)	50.0±3.3	56.2±4.1	70.6±9.5
BMI(kg/m²)	21.0±1.3	23.5±1.7	30.0±4.0

(2) 면역조직화학염색( immunohistochemistry , IHC) 결과

IHC 실험결과를 도 1(조직 절편을 GPR30 antibody로 염색 후 광학현미경으로 관찰 한 결과) 및 도 2(H score 결과)에 나타내었다. IHC 실험 결과, 정상 자궁 조직(human normal uterus tissue, HN)에 비해 자궁근종(human leiomyoma tissue, HL), 자궁샘근증(human adenomyosis tissue, HA)에서 gpr30의 발현이 유의하게 증가하는 것을 확인 할 수 있었다(p<0.05).

(3) 웨스턴 블로팅 (Western blotting) 결과

웨스턴 블로팅 결과를 도 3에 나타냈다. 도 3을 참고하면, 정상자궁조직에 비해 자궁근종 조직에서 GPR30(G-protein coupled estrogen receptor 30)의 발현이 증가하는 것으로 보였지만 유의한 결과는 아니었다. 하지만, 정상자궁근에 비해 자궁샘근증 조직에서는 GPR30 단백 발현이 감소하는 것으로 확인되었다..

(4) PCR (Polymerase Chain Reaction) 결과

GPR30 RNA level을 RT-PCR(Reverse transcriptase polymerase chain reaction) 분석법으로 분석한 결과를 도 4에 나타냈다. 도 4를 참고하면, 위의 웨스턴 블로팅 결과와 마찬가지로 정상자궁근에 비해 자궁샘근증 조직에서 GPR30 mRNA 수준이 감소하는 것으로 확인되었다.

이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.

* 위의 실험은 한미약품 - hanmi Pharm Co. LTD 의 지원을 부분적으로 받아 진행되었습니다.

Claims

GPR30(G-protein coupled receptor 30) 단백질을 검출하는 제제 또는 GPR30 mRNA을 검출하는 제제를 포함하는, 자궁샘근증 진단용 마커 조성물.
제1항에 있어서,
상기 GPR30 단백질을 검출하는 제제는 GPR30 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하고,
상기 GPR30 mRNA을 검출하는 제제는 GPR30 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하거나, GPR30 mRNA가 역전사된 cDNA에 특이적으로 결합하는 프러이머 또는 프로브를 포함하는, 자궁샘근증 진단용 마커 조성물.
제1항에 있어서,
상기 마커 조성물은 GPR30(G-protein coupled receptor 30) 단백질을 검출하는 제제 및 GPR30 mRNA을 검출하는 제제를 포함하는, 자궁샘근증 진단용 마커 조성물.
GPR30(G-protein coupled receptor 30) 단백질을 검출하는 제제를 포함하는 자궁샘근증 진단용 키트.
자궁샘근증 스크리닝용 세포주를 함유하는 스크리닝용 세포를 배양하는 제1단계;
상기 스크리닝용 세포에 약물을 처리하여 처리군을 준비하는 제2단계; 및
상기 스크리닝용 세포의 GPR30(G-protein coupled receptor 30) 단백질 발현 수준을 상기 약물을 처리하지 않은 대조군의 GPR30 단백질 발현 수준과 비교하여, GPR30 단백질 발현을 증가시키는 약물을 스크리닝하는 제3단계;를 포함하는 자궁샘근증 치료제의 스크리닝 방법.
제5항에 있어서,
상기 제3단계에서 GPR30 mRNA 수준을 비교하는 과정을 더 포함하는, 스크리닝 방법.