KR20180064269A

KR20180064269A - 활성 단백질의 추출방법

Info

Publication number: KR20180064269A
Application number: KR1020170105898A
Authority: KR
Inventors: 염교선; 방원정; 김해연; 김영부
Original assignee: 주식회사 아이피어리스
Priority date: 2016-12-02
Filing date: 2017-08-22
Publication date: 2018-06-14
Also published as: KR101918266B1

Abstract

본 발명은 항산화 활성, 멜라닌 억제활성, 티로시나제 억제 활성, 콜라겐 합성능 등 피부에 유효한 활성을 갖는 단백질을 추출하는 방법에 관한 것으로, 식물 소재를 탈이온수로 추출한 후, 에탄올을 사용하여 침전시키고 락토바실러스(Lactobacillus) 속 유산균으로 발효시키는 것을 특징으로 한다.

Description

활성 단백질의 추출방법{The Extracting Method of Active Protein}

본 발명은 피부에 유효한 활성 단백질의 신규 추출방법, 그리고 그 추출방법에 의해 얻어진 활성 단백질에 관한 것이다.

단백질은 아미노산(amino acid)이라고 하는 비교적 단순한 분자들이 연결되어 만들어진 복잡한 분자로, 대체적으로 분자량이 매우 큰 편이다. 단백질을 이루고 있는 아미노산에는 약 20종류가 있는데, 이 아미노산들이 화학결합을 통해 서로 연결되어 폴리펩티드(polypeptide)를 만든다. 이때 아미노산들의 결합을 펩티드 결합이라 하며, 이러한 펩티드 결합이 여러(poly-) 개 존재한다는 뜻에서 폴리펩티드라 부른다. 넓은 의미에서 단백질도 폴리펩티드라 할 수 있으며, 일반적으로는 분자량이 비교적 작으면 폴리펩티드라 하고, 분자량이 매우 크면 단백질이라고 한다.

최근에는 미용 효과를 달성하기 위해 단백질 또는 펩티드를 화장품의 소재로 이용하는 기술이 연구되고 있다. 그런데 현재까지 알려진 단백질 화장품은 주로 거미줄, 실크, 누에, 난황, 난백 등과 같이 단백질 함량이 높은 동물성 소재를 원료로 하고 있을 뿐, 단백질 함량이 낮은 식물성 소재를 중심으로 한 연구는 매우 미흡한 실정이다.

식물 소재를 용매추출 등의 일반적인 방법을 이용하여 추출한 경우, 수득된 일반 추출물에는 탄수화물, 당, 단백질 등 여러 가지 성분들이 복합으로 구성되어 있어 최종 단백질 원료로써 사용하기에는 부적합한 경우가 매우 많았으며, 침전물이 발생하거나 변색, 변취 또는 낮은 활성으로 고농도로 사용해야 하는 경우가 있었다. 또한, 활성을 가지는 단백질을 함유하는 소재의 경우에도 다른 구성 성분들로 인해 뚜렷한 활성을 나타내기 어렵기도 하였다. 따라서 식물 소재로부터 활성 단백질을 적절하게 분리한다면 화장품 재료로서 높은 가치가 있겠다.

KR 1020130100415 A KR 10-0606499 B KR 10-2015-0123473 A

본 발명은 단백질 함량이 낮은 식물 소재로부터 단백질을 고수율로 추출할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 단백질 함량이 낮은 식물 소재로부터 피부미백효과 또는 주름개선효과를 가지는 활성 단백질을 고수율로 수득할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 식물 소재로부터 얻어진 단백질 침전물 또는 단백질 침전 발효물을 이용하여 피부미백효과 또는 주름개선효과가 매우 우수한 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 기술적 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 식물의 뿌리, 줄기, 잎, 꽃 및 열매로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 식물 소재를 탈이온수로 추출한 후 에탄올로 침전시켜 단백질 추출량을 증대시키는 것을 특징으로 하는 활성 단백질의 추출방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 에탄올 침전 후, 락토바실러스(Lactobacillus) 속 유산균으로 발효시키는 과정을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 활성 단백질의 추출방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 에탄올 침전시, 30%(v/v)~99%(v/v) 에탄올 수용액을 혼합하여 10~120분간 침전시키는 것을 특징으로 하는 활성 단백질의 추출방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 식물이 오미자, 금은화, 진피, 사상자, 황금, 황기, 칡, 더덕, 둥글레, 오가피, 대추, 도라지, 계피, 감초, 인삼, 강낭콩, 녹두, 백태, 서목태, 대두, 팥, 동부, 완두, 렌틸콩, 병아리콩, 땅콩으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 활성 단백질의 추출방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 피부미백효과 및 피부주름개선효과가 있는 활성 단백질의 추출량이 증대되는 것을 특징으로 하는 활성 단백질의 추출방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 락토바실러스(Lactobacillus) 속 유산균이 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus) 및 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 활성 단백질의 추출방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 식물의 뿌리, 줄기, 잎, 꽃 및 열매로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 식물 소재를 탈이온수로 추출한 후 에탄올로 침전시켜 얻어진 단백질 침전물을 함유하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 단백질 침전물이 에탄올 침전 후 락토바실러스(Lactobacillus helveticus)속 유산균으로 발효시킨 단백질 침전 발효물인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 피부미백용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 피부주름개선용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 락토바실러스(Lactobacillus) 속 유산균이 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus) 및 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.

이하에서는 본 발명의 활성 단백질의 추출방법 및 화장료 조성물에 대하여 자세히 설명한다.

본 발명은 식물의 뿌리, 줄기, 잎, 꽃 및 열매로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 식물 소재를 원료로 하여 단백질 침전물을 수득하는데, 구체적으로 식물 소재를 탈이온수로 추출한 후 에탄올로 침전시킴에 따라 단백질 추출량을 증대시킬 수 있다. 즉, 본 발명의 활성 단백질을 추출하는 방법은 식물 소재로부터 탈이온수로 단백질을 용해시킨 후, 에탄올로 침전시켜 분리하는 것을 특징으로 한다.

단백질은 침전법을 이용하여 얻을 수 있는데, 이는 유기용매 추출 후 유기 용매를 제거하는 과정이 생략 가능하고, 단백질을 제외한 모든 성분들을 제거할 수 있으며 공정이 간단하다는 장점이 있다. 단백질 침전법에는 황산암모늄을 이용한 염석, 에탄올 침전, 폴리에틸렌글리콜을 이용한 침전법 등이 있는데, 본 발명은 식물 소재를 탈이온수로 추출한 후 에탄올 침전을 거침에 따라, 단백질 추출량을 증대시킬 수 있으며, 황산암모늄이나 폴리에틸렌글리콜을 이용한 경우에 비하여 단백질 추출량이 훨씬 높으며, 피부미백효과 또는 주름개선효과도 매우 높다.

구체적으로, 본 발명은 식물 소재를 탈이온수로 추출한 후 에탄올로 단백질을 침전시켰는데, 이는 유기용매에 의한 유전상수(dielectric constant) 감소에 기인한 방법으로 수용액에 에탄올을 첨가하면 단백질 표면 수용액 층이 에탄올 분자로 치환되고 단백질 용해도가 감소하게 되고, 물보다 낮은 유전상수 값을 갖는 에탄올에 의해 단백질 분자가 정전기력 수와 강도가 증가하게 된다. 이에 본 발명은 식물 소재를 탈이온수로 추출한 후 에탄올로 침전시킴에 따라 단백질 추출량을 증대시킬 수 있다.

바람직하게는, 식물 소재와 탈이온수를 혼합하여 추출한 후, 30%(v/v)~99%(v/v) 에탄올 수용액을 혼합하여 10~120분간 방치시킨 후 원심분리시켜 단백질 침전물을 얻을 수 있다. 더욱 바람직하게는 50%(v/v)~99%(v/v) 에탄올 수용액을 혼합하여 10~60분간 방치시킨 후 원심분리시켜 단백질 침전물을 얻을 수 있고, 더욱 바람직하게는 67%(v/v)~99%(v/v) 에탄올 수용액을 혼합하여 20~50분간 방치시킨 후 원심분리시켜 단백질 침전물을 얻을 수 있다.

한편, 본 발명은 상기의 방법으로 얻어진 단백질 침전물을 유산균으로 발효시키는 과정을 더욱 포함하는 것을 특징으로 한다. 구체적으로, 본 발명은 에탄올 침전 후, 락토바실러스(Lactobacillus) 속 유산균으로 발효시키는 과정을 더욱 포함할 수 있다. 본 발명의 단백질 침전물을 락토바실러스(Lactobacillus)속 유산균으로 발효시키게 되면 피부미백효과와 주름개선효과가 더욱 높아진 단백질 침전 발효물이 수득된다. 이때, 바람직하게 락토바실러스(Lactobacillus)속 유산균으로 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) 등을 사용할 수 있다.

한편, 본 발명에서 사용되는 식물 소재로는 특별히 한정되지 않으며, 식물의 뿌리, 줄기, 잎, 꽃 및 열매로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 오미자, 금은화, 진피, 사상자, 황금, 황기, 칡, 더덕, 둥글레, 오가피, 대추, 도라지, 계피, 감초, 인삼 등의 한약재, 강낭콩, 녹두, 백태, 서목태, 대두, 팥, 동부, 완두, 렌틸콩, 병아리콩, 땅콩 등의 콩과식물에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 방법으로 수득된 단백질 침전물 또는 단백질 침전 발효물은 항산화 활성, 멜라닌 억제율, 티로시나아제 저해활성과 콜라겐 합성능이 높아 화장품 원료로 유용하게 이용될 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 화장료 조성물은 식물의 뿌리, 줄기, 잎, 꽃 및 열매로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 식물 소재를 탈이온수로 추출한 후 에탄올로 침전시켜 얻어진 단백질 침전물 또는 상기 단백질 침전물을 락토바실러스(Lactobacillus)속 유산균으로 발효시킨 단백질 침전 발효물을 유효성분으로 함유할 수 있다. 이때, 락토바실러스(Lactobacillus)속 유산균으로 바람직하게는 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에서 단백질 침전물 또는 단백질 침전 발효물은 특정의 범위에 한정하는 것은 아니나, 바람직하게는 화장료 조성물 총중량에 대해 0.0001 ~ 30중량% 함유되는 것이 좋은데, 0.0001중량% 미만으로 첨가하는 경우에는 그 효과를 기대하기 힘들고, 30중량%를 초과하여 첨가되는 경우에는 뚜렷한 효능 효과의 상승이 보이지 않는다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물은 상기의 단백질 침전물 또는 단백질 침전 발효물 외에 본 발명이 목적으로 하는 주 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 바람직하게는 주효과에 상승효과를 줄 수 있는 다른 성분 등을 함유하는 것도 무방하다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물은 화장 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제 예컨대 친수성 또는 친유성 겔화제, 친수성 또는 친유성 활성제, 보존제, 항산화제, 용매, 방향제, 충전제, 차단제, 안료, 흡취제, 염료 등을 함유할 수 있다. 이들 다양한 보조제의 양은 당해 분야에서 통상적으로 사용되는 양이며, 예컨대 조성물 총중량에 대해 0.0001 내지 30중량%이다. 다만, 어떠한 경우라도 보조제 및 그 비율은 본 발명에 따른 화장료 조성물의 바람직한 성질에 악영향을 미치지 않도록 선택될 것이다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물의 제형은 특정의 종류에 한정되는 것은 아니나, 일예로 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 에센스, 수중유(O/W)형 및 유중수(W/O)형으로 이루어진 기초화장료 제형과 수중유형 및 유중수형 메이크업베이스, 파운데이션, 스킨커버, 립스틱, 립그로스, 페이스파우더, 투웨이케익, 아이새도, 치크칼라 및 아이브로우 펜슬류로 이루어진 색조화장료 제형 중에서 선택되는 어느 하나의 외관을 가질 수 있다. 또한, 이는 선택적으로 에어로졸 형태로 피부에 적용될 수도 있고, 고체 형태 예컨대, 스틱의 형태일 수도 있다. 이는 피부용 케어 제품 및/또는 메이크업 제품으로서 사용될 수도 있다.

이와 같이 제조된 본 발명의 화장료 조성물은 항산화 효과가 우수하며, 피부 미백효과와 주름개선효과가 우수하다.

본 발명은 단백질 함량이 낮은 식물 소재로부터 단백질을 고수율로 추출할 수 있으며, 특히, 항산화활성, 멜라닌 억제율, 티로시나아제 저해활성, 콜라겐 합성능이 높아 피부미백효과 또는 주름개선효과를 가지는 활성 단백질을 고수율로 수득할 수 있다.

또한, 본 발명은 식물 소재를 탈이온수로 추출한 후 에탄올 침전을 거쳐 피부미백효과나 주름개선효과가 우수한 단백질 침전물을 다량 수득할 수 있으며, 수득된 다량의 단백질 침전물을 락토바실러스(Lactobacillus) 속 유산균으로 발효시키면 항산화 효과, 피부미백효과 또는 주름개선효과를 더욱 증진시킬 수 있다.

또한, 본 발명의 방법으로 수득된 단백질 침전물 또는 단백질 침전 발효물은 우수한 항산화 활성, 멜라닌 억제율, 티로시나아제 저해활성, 콜라겐 합성능을 나타내며, 안정도가 탁월하고, 일반 탈이온수 추출시 발생되는 침전물과 변색의 단점을 보완할 수 있다.

도 1은 본 발명의 실시예 1, 2와 비교예 1, 2의 세포 독성을 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 실시예 1, 2와 비교예 1, 2의 단백질 함량을 나타낸 드래프이다.
도 3은 본 발명의 실시예 1, 2와 비교예 1, 2의 SOD 유사활성을 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 실시예 1, 2와 비교예 1, 2의 멜라닌 함량을 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 실시예 1, 2와 비교예 1 내지 6의 티로시나제 억제 활성을 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 실시예 1, 2, 2-1, 2-2와 비교예 1, 2, 2-1, 2-2의 티로시나아제 억제활성을 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 실시예 3 내지 6과 비교예 7 내지 10의 단백질 함량을 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명의 실시예 3, 5, 6과 비교예 7, 9, 10의 DPPH 소거능을 나타낸 그래프이다.
도 9는 본 발명의 실시예 7 내지 10과 비교예 11 내지 14의 SOD 유사활성을 나타낸 그래프이다.
도 10은 본 발명의 실시예 9, 10과 비교예 13, 14의 콜라겐 합성능을 나타낸 그래프이다.
도 11는 본 발명의 실시예 7 내지 10과 비교예 11 내지 14의 엘라스타아제 저해능을 나타낸 그래프이다.
도 12는 본 발명의 실시예 7, 8과 비교예 11, 12의 멜라닌 함량을 나타낸 그래프이다.
도 13은 본 실험예 14의 에탄올 농도와 침전시간에 따른 단백질 함량을 나타내는 그래프이다(강낭콩).
도 14는 본 실험예 14의 에탄올 농도와 침전시간에 따른 단백질 함량을 나타내는 그래프이다(백태).
도 15는 본 실험예 16의 에탄올 농도와 침전시간에 따른 콜라겐 합성능을 나타내는 그래프이다(강낭콩).
도 16은 본 실험예 16의 에탄올 농도와 침전시간에 따른 콜라겐 합성능을 나타내는 그래프이다(백태).
도 17은 본 실험예 17의 발효 균주에 따른 DPPH 소거능을 나타낸 그래프이다(백태).
도 18은 본 실험예 17의 발효 균주에 따른 콜라겐 합성능을 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명의 구성을 하기 실시예를 통해 구체적으로 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.

< 식물 소재로 오미자를 이용한 경우 >

실시예 1 : 오미자 단백질 침전물의 제조

분쇄한 오미자와 탈이온수를 1:10 중량비로 혼합하여 4℃에서 24시간 추출시켰다. 여과액과 95% 에탄올을 1:1(총량이 100 mL 이하일 경우는 1:5) 비율로 혼합하여 4℃에서 30분 방치시킨 후 원심분리시켜(15,000 rpm, 4℃, 10분) 단백질 시료를 얻었다. 시료는 탈이온수에 1% 농도로 용해시키고 멸균하였다.

실시예 2 : 오미자 단백질 침전 발효물의 제조

분쇄한 오미자와 탈이온수를 1:10 중량비로 혼합하여 4℃에서 24시간 추출시켰다. 여과액과 95% 에탄올을 1:1(총량이 100 mL이하일 경우는 1:5) 비율로 혼합하여 4℃에서 30분 방치시킨 후 원심분리시켜(15,000 rpm, 4℃, 10분) 단백질 시료를 얻었다. 시료는 탈이온수에 1% 농도로 용해시키고 멸균하였다. 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) ATCC 15009가 OD₆₀₀에서 0.4값을 가지는 배양액을 시료 부피의 10~20% 접종하여 37℃에서 48 ~ 72시간 배양하였다. 초기 pH는 5.6 ~ 6.0으로 맞추어 발효시키고 최종 pH가 4.5가 되면 발효를 종료하였다. 원심분리(15,000 rpm, 4℃, 10분)로 1차 여과하고 0.2 ㎛ 필터로 2차 여과시켜 동결건조시켰다.

실시예 2-1 : 오미자 단백질 침전 발효물의 제조

락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) ATCC 15009 대신 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus) ATCC 4536으로 배양한 것을 제외하고는 실시예 2와 동일하게 제조하였다.

실시예 2-2 : 오미자 단백질 침전 발효물의 제조

락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) ATCC 15009 대신 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) ATCC 10241로 배양한 것을 제외하고는 실시예 2와 동일하게 제조하였다.

비교예 1 : 오미자 탈이온수 추출물의 제조

분쇄한 오미자와 탈이온수를 1:10 중량비로 혼합하여 4℃에서 24시간 추출시켰다. 동결건조하고 탈이온수에 1% 농도로 용해시키고 멸균하였다.

비교예 2 : 오미자 탈이온수 추출 발효물의 제조

분쇄한 오미자와 탈이온수를 1:10 중량비로 혼합하여 4℃에서 24시간 추출시켰다. 동결건조하고 탈이온수에 1% 농도로 용해시키고 멸균하였다. 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus)ATCC 15009가 OD₆₀₀에서 0.4값을 가지는 배양액을 시료 부피의 10~20% 접종하여 37℃에서 48 ~ 72시간 배양하였다. 초기 pH는 5.6 ~ 6.0으로 맞추어 발효시키고 최종 pH가 4.5가 되면 발효를 종료하였다. 원심분리(15,000 rpm, 4℃, 10분)로 1차 여과하고 0.2 μM 필터로 2차 여과시켜 동결 건조시켰다.

비교예 2-1 : 오미자 탈이온수 추출 발효물의 제조

락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) ATCC 15009 대신 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus) ATCC 4536으로 배양한 것을 제외하고는 비교예 2와 동일하게 제조하였다.

비교예 2-2 : 오미자 탈이온수 추출 발효물의 제조

락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) ATCC 15009 대신 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) ATCC 10241로 배양한 것을 제외하고는 비교예 2와 동일하게 제조하였다.

비교예 3 : 오미자 단백질 침전물의 제조

에탄올 대신 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 침전시키는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 제조하였다.

비교예 4 : 오미자 단백질 침전 발효물의 제조

에탄올 대신 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 침전시키는 것을 제외하고는 실시예 2와 동일하게 제조하였다.

비교예 5 : 오미자 단백질 침전물의 제조

에탄올 대신 황산 암모늄을 이용하여 침전시키는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 제조하였다.

비교예 6 : 오미자 단백질 침전 발효물의 제조

에탄올 대신 황산 암모늄을 이용하여 침전시키는 것을 제외하고는 실시예 2와 동일하게 제조하였다.

실험예 1 : 세포독성 측정

본 실험에서는 실시예 1, 2와 비교예 1, 2에 대하여 세포독성을 측정하였는데, B16F10 세포를 3-(4,5-dimethyltjiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT)로 염색시켜 세포의 생존율을 측정하였다.

B16F10 세포를 well 당 4×10³ cells이 되도록 배지에 부유시켜 96-well plate에 분주한 후 24시간 배양하였다. 시료를 0, 100, 500, 1000㎍/ml로 처리하고 72시간 배양하였다. 5mg/mL MTT를 4시간 동안 처리한 후 ELISA reader로 570nm에서 흡광도를 측정하였으며, 그 결과는 도 1에 도시하였다(좌측부터 비교예 1; 비교예 2; 실시예 1; 실시예 2).

도 1에 의하면, 모든 시료에서 세포 독성이 나타나지 않았으며, 단백질침전-비발효에서 생존율이 상대적으로 약간 낮은 편이지만 발효 후 개선되었음을 볼 수 있었다.

실험예 2 : 단백질 함량 측정

본 실험에서는 실시예 1, 2와 비교예 1, 2에 대하여 Lowry-folin 정량법으로 단백질 함량을 측정하였다.

우선, 실시예 1, 2, 비교예 1, 2의 시료와 BSA 표준용액을 총 100㎕가 되도록 1.5~2ml 시험관에 첨가하였다. 이때, 표준용액의 부피는 0, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100㎕로 하여 표준곡선을 측정할 수 있게 하였다. 이후, Lowry stock reagent를 각 시험관에 1000㎕씩 첨가하고 30분간 실온에서 인큐베이션하였다. Folin's solution을 각 시험관에 100㎕씩 첨가하고 실온에서 30분간 인큐베이션하였다. 750nm에서 흡광도를 측정한 후, 단백질 농도를 계산하였으며, 그 결과는 도 2에 나타내었다(좌측부터 비교예 1; 실시예 1; 비교예 2; 실시예 2).

도 2에 의하면, 단백질 침전 시료는 일반추출 시료에 비하여 단백질 함량이 높음을 알 수 있었다. 또한, 단백질 침전 시료를 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus)로 발효시키면 단백질 함량이 더욱 높아짐을 알 수 있었다.

실험예 3 : SOD 유사활성 측정

본 실험에서는 실시예 1, 2와 비교예 1, 2에 대하여 SOD 유사활성을 측정하였는데, 활성산소(Reactive Oxygen Species) 소거활성 (SOD activity)은 크산틴 옥시다아제 (Xanthine oxidase) 효소반응에 의한 활성 산소발생계를 이용하여 활성 산소에 의한 NBT (Nitrobluetetrazolium)의 산화에 의한 흡광도 변화를 측정하여 평가하였다.

0.05mM Na₂CO₃ (Yakuri Pure Chemicals Co., Ltd, Japan) 1.2mL, 3mM xanthine (Sigma, USA) 0.05mL, 3mM EDTA (Sigma, USA) 0.05mL, BSA (Sigma, USA) 0.05mL, 0.75mM NBT (Sigma, USA) 0.05mL, 각 시료 0.05mL를 넣고 잘 혼합한 후 25℃에서 10분간 정치시켰다. 크산틴 옥시다아제 (Sigma, USA) 0.05mL를 넣고 25℃에서 20분간 반응시킨 후에 6mM CuCl₂ (Daejung Chemicals & Metals Co., LTD, Korea) 0.05mL를 넣어 반응을 정지시키고 ELISA reader (Plus 384, Molecular Device, USA)로 560nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군은 시료 대신 정제수를 넣었으며, 크산틴 옥시다아제 대신에 정제수를 넣어 색 보정 값을 얻었다. 소거율은 아래 식과 동일하게 계산하였으며, 그 결과는 도 3에 도시하였다(좌측부터 비교예 1; 실시예 1; 비교예 2; 실시예 2).

[활성산소 소거율]

활성산소 소거율 (%) = (대조군의 흡광도-시험군의 흡광도) / 대조군의 흡광도 × 100

도 3에 의하면, 일반추출 시료보다 단백질침전 시료에서 SOD 유사활성이 높음을 알 수 있었다. 또한, 단백질 침전시료를 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus)로 발효시키면 SOD 유사활성이 더욱 높아짐을 알 수 있었다.

실험예 4 : 멜라닌 함량의 측정

본 실험에서는 실시예 1, 2와 비교예 1, 2의 처리에 따른 세포 내 멜라인 함량을 측정하였는데, 세포배양시 세포 내의 멜라닌 생성량을 공시료액과 비교하는 시험법을 이용하였다.

B16F10 세포를 well 당 5×10³cells이 되도록 배지에 부유시켜 96-well plate에 분주한 후 5% CO₂가 주입되는 37℃ 배양기에서 배양하였다. 24시간 후 배지를 제거하고 0, 500, 1000㎍/ml의 농도로 시료를 처리하였다. 시료 처리 3일 후, 세포를 PBS로 세척하고, trypsin-EDTA로 처리하여 세포를 회수하였다. 회수된 세포를 570 ×g에서 5분간 원심 분리하여 pellet을 얻은 후 10% DMSO가 함유된 1 N NaOH를 넣고 녹였다(37℃, 2시간). ELISA reader로 475nm에서 측정하였다. 표준물질은 melanin(Sigma)을 사용하였다. 그 결과는 도 4에 도시하였다(좌측부터 비교예 1; 비교예 2; 실시예 1; 실시예 2; 알부틴).

도 4에 의하면, 일반추출보다 단백질침전 시료에서 멜라닌 억제율이 높게 나타나며, 단백질 침전시료를 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus)로 발효시키면 멜라닌 억제율이 더욱 높아짐을 알 수 있었다. 특히, 단백질침전-발효 시료는 알부틴과도 유사한 정도로 멜라닌을 억제함을 알 수 있었다.

실험예 5 : 티로시나아제 저해활성의 측정

본 실험에서는 실시예 1, 2와 비교예 1 내지 6에 대하여 티로시나아제 저해활성을 측정하였다.

L-tyrosine 500 μL, 0.1M potassium phosphate buffer 500 μL에 시료 450 μL를 넣었다(공시료는 시료 대신 0.1M potassium phosphate buffer를 넣었다). 37℃에서 20분간 반응시킨 후, Tyrosinase 50 μL를 첨가하고 37℃에서 10분간 반응시키고, 얼음물에 3분간 냉침시켜 반응을 정지시켰다. UV spectrometer 480nm에서 흡광도를 측정한 후, 아래 식으로 티로시나아제 저해율을 계산하였으며, 그 결과는 도 5에 나타내었다(좌측부터 비교예 1; 비교예 2; 실시예 1; 실시예 2; 비교예 3; 비교예 4; 비교예 5; 비교예 6).

[티로시나아제 저해율]

저해율(%)=[1 -(시험군의 흡광도-블랭크의 흡광도)/대조군의 흡광도] × 100

도 5에 의하면, 일반추출에 비하여 단백질 침전 시료에서 티로시아나제 저해활성이 높게 나타났으며, PEG 침전법, 황산암모늄침전법을 사용한 경우에 비하여 에탄올 침전법을 사용한 경우 티로시나아제 저해활성이 훨씬 높아짐을 알 수 있었다. 또한, 단백질 침전 시료를 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus)로 발효시키면 티로시나아제 저해활성이 더욱 높아짐을 알 수 있었다.

실험예 6 : 티로시나아제 저해활성의 측정

본 실험에서는 실시예 1, 2, 2-1, 2-2와 비교예 1, 2, 2-1, 2-2에 대하여 티로시나아제 저해활성을 측정하였다.

L-tyrosine 500 μL, 0.1M potassium phosphate buffer 500 μL에 시료 450 μL를 넣었다(공시료는 시료 대신 0.1M potassium phosphate buffer를 넣었다). 37℃에서 20분간 반응시킨 후, Tyrosinase 50 μL를 첨가하고 37℃에서 10분간 반응시키고, 얼음물에 3분간 냉침시켜 반응을 정지시켰다. UV spectrometer 480nm에서 흡광도를 측정한 후, 아래 식으로 티로시나아제 저해율을 계산하였으며, 그 결과는 도 6에 나타내었다(좌측부터 비교예 1; 비교예 2-1; 비교예 2; 비교예 2-2; 실시예 1; 실시예 2-1; 실시예 2; 실시예 2-2).

[티로시나아제 저해율]

도 6에 의하면, 단백질 침전 시료를 락토바실러스(Lactobacillus helveticus) 속 유산균으로 발효시키면 티로시나아제 저해활성이 더욱 높아짐을 알 수 있었다. 또한, 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus) 및 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) 모두 티로시나아제 저해율을 증가시키는 효과가 우수함을 알 수 있었다.

이상 종합하면, 단백질 함량이 높지 않은 식물 소재라도 탈이온수로 추출한 후 에탄올 침전을 거치면 식물 소재로부터 단백질을 다량 추출해낼 수 있고, 수득된 단백질 침전물은 항산화 활성이 높아 피부주름개선 등의 항노화 효과를 가지며 피부미백효과도 가짐을 알 수 있었다. 또한, 식물 소재로부터 수득된 단백질 침전물을 락토바실러스(Lactobacillus) 속 유산균으로 발효시키면 단백질 추출량이 더욱 증진되고, 항산화 활성, 피부주름개선 등의 항노화 효과, 피부미백효과가 더욱 높아짐을 알 수 있었다.

< 식물 소재로 금은화, 진피, 사상자, 황금을 이용한 경우 >

실시예 3 내지 6 : 금은화, 진피, 사상자, 황금 단백질 침전 발효물의 제조

분쇄한 금은화, 진피, 사상자, 황금에 대하여 각각 탈이온수를 1:10 중량비로 혼합하여 4℃에서 24시간 추출시켰다. 여과액과 95% 에탄올을 1:1(총량이 100 mL이하일 경우는 1:5) 비율로 혼합하여 4℃에서 30분 방치시킨 후 원심분리시켜(15,000 rpm, 4℃, 10분) 단백질 시료를 얻었다. 시료는 탈이온수에 1% 농도로 용해시키고 멸균하였다. 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) ATCC 15009가 OD₆₀₀에서 0.4값을 가지는 배양액을 시료 부피의 10~20% 접종하여 37℃에서 48 ~ 72시간 배양하였다. 초기 pH는 5.6 ~ 6.0으로 맞추어 발효시키고 최종 pH가 4.5가 되면 발효를 종료하였다. 원심분리(15,000 rpm, 4℃, 10분)로 1차 여과하고 0.2 ㎛ 필터로 2차 여과시켜 동결건조시켰다.

비교예 7 내지 10 : 금은화, 진피, 사상자, 황금 탈이온수 추출 발효물의 제조

분쇄한 금은화, 진피, 사상자, 황금에 대하여 각각 탈이온수를 1:10 중량비로 혼합하여 4℃에서 24시간 추출시켰다. 동결건조하고 탈이온수에 1% 농도로 용해시키고 멸균하였다. 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus)ATCC 15009가 OD₆₀₀에서 0.4값을 가지는 배양액을 시료 부피의 10~20% 접종하여 37℃에서 48 ~ 72시간 배양하였다. 초기 pH는 5.6 ~ 6.0으로 맞추어 발효시키고 최종 pH가 4.5가 되면 발효를 종료하였다. 원심분리(15,000 rpm, 4℃, 10분)로 1차 여과하고 0.2 μM 필터로 2차 여과시켜 동결 건조시켰다.

실험예 7 : 단백질 함량 측정

본 실험에서는 실시예 3 내지 6과 비교예 7 내지 10에 대하여 Lowry-folin 정량법으로 단백질 함량을 측정하였다.

우선, 실시예 3 내지 6과 비교예 7 내지 10의 시료와 BSA 표준용액을 총 100㎕가 되도록 1.5~2ml 시험관에 첨가하였다. 이때, 표준용액의 부피는 0, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100㎕로 하여 표준곡선을 측정할 수 있게 하였다. 이후, Lowry stock reagent를 각 시험관에 1000㎕씩 첨가하고 30분간 실온에서 인큐베이션하였다. Folin's solution을 각 시험관에 100㎕씩 첨가하고 실온에서 30분간 인큐베이션하였다. 750nm에서 흡광도를 측정한 후, 단백질 농도를 계산하였으며, 그 결과는 도 7에 나타내었다(좌측부터 비교예 7, 실시예 3; 비교예 8; 실시예 4; 비교예 9; 실시예 5; 비교예 10; 실시예 6).

도 7에 의하면, 금은화, 진피, 사상자, 황금의 경우에도 단백질 침전 발효물은 일반 추출 발효물에 비하여 단백질 함량이 훨씬 높아짐을 알 수 있었다.

실험예 8 : 항산화 활성의 비교

본 실험에서는 실시예 3, 5, 6과 비교예 7, 9, 10에 대하여 DPPH 라디칼 소거능을 측정하여 비교하여 보았다.

DPPH법은 DPPH(2,2-Di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl free radical)라는 유리기를 사용하여 환원력에 의한 자유라디칼 소거활성을 측정하는 방법으로, 피검물질에 의해 DPPH가 환원되어 흡광도가 감소하는 정도를 공시험액의 흡광도와 비교하여 파장 560nm에서 자유라디칼 소거율을 측정하였으며, 측정방법은 하기와 같다. 얻어진 시료를 96-웰 프레이트에 넣은 후, 여기에 100 uM 메탄올용액으로 제조된 DPPH를 첨가하여 용액의 총 부피가 200 ㎕가 되도록 한 후, 이것을 37℃에서 30분간 방치한 후 560 nm에서 흡광도(St)를 측정하였다. 자유라디칼 소거활성(%)은 아래의 식으로 산출하였다.

[DPPH 자유라디칼 소거능]

자유라디칼 소거활성(%)=(1- B/A) × 100

A: 단백질 침전 발효물을 처리하지 않은 대조군 웰의 흡광도

B: 단백질 침전 발효물을 처리한 실험군 웰의 흡광도

그 결과는 도 8에 나타내었다(좌측부터 비교예 7, 실시예 3; 비교예 9; 실시예 5; 비교예 10; 실시예 6).

도 8에 의하면, 금은화, 사상자, 황금의 경우에도 단백질 침전 발효물은 일반추출 발효물에 비하여 DPPH 소거능이 높아 항산화 효능이 높음을 알 수 있었다.

< 식물소재로 강낭콩 , 녹두, 백태, 서목태를 이용한 경우 >

실시예 7 내지 10 : 강낭콩 , 녹두, 백태, 서목태 단백질 침전 발효물의 제조

분쇄한 강낭콩, 녹두, 백태, 서목태에 대하여 각각 탈이온수를 1:10 중량비로 혼합하여 4℃에서 24시간 추출시켰다. 여과액과 95% 에탄올을 1:1(총량이 100 mL이하일 경우는 1:5) 비율로 혼합하여 4℃에서 30분 방치시킨 후 원심분리시켜(15,000 rpm, 4℃, 10분) 단백질 시료를 얻었다. 시료는 탈이온수에 1% 농도로 용해시키고 멸균하였다. 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) ATCC 15009가 OD₆₀₀에서 0.4값을 가지는 배양액을 시료 부피의 10~20% 접종하여 37℃에서 48 ~ 72시간 배양하였다. 초기 pH는 5.6 ~ 6.0으로 맞추어 발효시키고 최종 pH가 4.5가 되면 발효를 종료하였다. 원심분리(15,000 rpm, 4℃, 10분)로 1차 여과하고 0.2 ㎛ 필터로 2차 여과시켜 동결건조시켰다.

비교예 11 내지 14 : 강낭콩 , 녹두, 백태, 서목태 탈이온수 추출 발효물의 제조

분쇄한 강낭콩, 녹두, 백태, 서목태에 대하여 각각 탈이온수를 1:10 중량비로 혼합하여 4℃에서 24시간 추출시켰다. 동결건조하고 탈이온수에 1% 농도로 용해시키고 멸균하였다. 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus)ATCC 15009가 OD₆₀₀에서 0.4값을 가지는 배양액을 시료 부피의 10~20% 접종하여 37℃에서 48 ~ 72시간 배양하였다. 초기 pH는 5.6 ~ 6.0으로 맞추어 발효시키고 최종 pH가 4.5가 되면 발효를 종료하였다. 원심분리(15,000 rpm, 4℃, 10분)로 1차 여과하고 0.2 μM 필터로 2차 여과시켜 동결 건조시켰다.

실험예 9 : SOD 유사활성 측정

본 실험에서는 실시예 7 내지 10과 비교예 11 내지 14에 대하여 실험예 3과 동일한 방식으로 SOD 유사활성을 측정하였다.

0.05mM Na₂CO₃ (Yakuri Pure Chemicals Co., Ltd, Japan) 1.2mL, 3mM xanthine (Sigma, USA) 0.05mL, 3mM EDTA (Sigma, USA) 0.05mL, BSA (Sigma, USA) 0.05mL, 0.75mM NBT (Sigma, USA) 0.05mL, 각 시료 0.05mL를 넣고 잘 혼합한 후 25℃에서 10분간 정치시켰다. 크산틴 옥시다아제 (Sigma, USA) 0.05mL를 넣고 25℃에서 20분간 반응시킨 후에 6mM CuCl₂ (Daejung Chemicals & Metals Co., LTD, Korea) 0.05mL를 넣어 반응을 정지시키고 ELISA reader (Plus 384, Molecular Device, USA)로 560nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군은 시료 대신 정제수를 넣었으며, 크산틴 옥시다아제 대신에 정제수를 넣어 색 보정 값을 얻었다. 소거율은 아래 식과 동일하게 계산하였으며, 그 결과는 도 9에 도시하였다(좌측부터 비교예 11; 실시예 7; 비교예 12; 실시예 8; 비교예 13; 실시예 9; 비교예 14; 실시예 10)

[활성산소 소거율]

도 9에 의하면, 일반추출 발효시료보다 단백질침전 발효 시료에서 SOD 유사활성이 훨씬 높음을 알 수 있었다.

실험예 10 : 콜라겐 합성능 측정

본 실험에서는 실시예 9, 10과 비교예 13, 14에 대하여 콜라겐 합성능을 측정하였다.

6-well(2ml)에 4 x 10⁵의 섬유아세포를 넣고 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 배지를 제거하고 1xPBS (증류수(pH 7.4)에서 0.05% 트윈20을 함유한 1x PBS)로 세척하였다. 시험시료(FBS-free)를 처리하고 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 세포 상등액을 수확하고 Lowry 또는 Bradford 분석법으로 단백질 양을 측정하였다. 시료를 96-well에 코팅하고(100㎍), STD 콜라겐 용액을 96-well에 코팅하고(0, 20, 40, 80, 160, 320 ng/ml) 4℃에서 오버나이트하였다. 1x PBST로 3번 세척한 후, 차단 버퍼 (100μL; 1%BSA를 함유한 1x PBST)로 37도에서 30분간 차단하였다. 1x PBST로 3번 세척한 후, 100 μL의 단일클론 토끼 항 콜라겐 (1 : 10000) 용액을 넣고 37℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 1x PBST로 3번 세척한 후, 100 μL의 항 토끼 IgG HRP (1 : 1000) 용액을 넣고 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션하였다. 1x PBST로 3번 세척한 후, 100 μL의 기질(TMB) 용액을 넣고 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 100 μL의 2M H₂SO₄에 의해 반응을 중지한 후, 450 nm에서 흡광도를 검출하고 콜라겐 합성능을 계산하였다. 콜라겐 합성능은 표준콜라겐에 의해 시료의 콜라겐 양이 자동으로 정량되며, 이를 %로 구한 값으로 분석한다.

[콜라겐 합성능]

콜라겐 합성능(%) = 시험군의 흡광도 / 대조군의 흡광도 × 100

그 결과는 도 10에 나타내었다(좌측부터 비교예 13; 실시예 9; 비교예 14; 실시예 10).

도 10에 의하면, 일반추출 발효시료보다 단백질침전 발효 시료에서 콜라겐 합성능이 훨씬 높음을 알 수 있었다.

실험예 11 : 엘라스타아제 저해활성 측정

본 실험에서는 실시예 7 내지 10과 비교예 11 내지 14에 대하여 엘라스타아제 저해활성을 측정하였다.

Elastase 용액을 96-well에 100μg씩 넣은 후(μL), 0.2 Tris-HCl(pH 8.0)을 넣고(88 μL), 실시예 7 내지 10, 비교예 11 내지 14의 시료를 각각 10 μL씩 넣었다. 그 후, STANA를 2 μL씩 넣은 후, 37℃에서 90분간 incubation한 후, 405nm에서 흡광도를 측정한 후, 엘라스타아제 저해율을 계산하였으며, 그 결과는 도 11에 나타내었다(좌측부터 비교예 11; 실시예 7; 비교예 12; 실시예 8; 비교예 13; 실시예 9; 비교예 14; 실시예 10).

[엘라스타아제 저해율]

엘라스타아제 저해율(%) = (1-시험군의 흡관도/대조군의 흡광도) × 100

도 11에 의하면, 일반추출 발효시료보다 단백질침전 발효 시료에서 엘라스타아제 저해활성이 훨씬 높음을 알 수 있었다.

실험예 12 : 티로시나아제 저해활성의 측정

본 실험에서는 실시예 7 내지 10과 비교예 11 내지 14에 대하여 티로시나아제 저해활성을 측정하였다.

L-tyrosine 500 μL, 0.1M potassium phosphate buffer 500 μL에 시료 450 μL를 넣었다(공시료는 시료 대신 0.1M potassium phosphate buffer를 넣었다). 37℃에서 20분간 반응시킨 후, Tyrosinase 50 μL를 첨가하고 37℃에서 10분간 반응시키고, 얼음물에 3분간 냉침시켜 반응을 정지시켰다. UV spectrometer 480nm에서 흡광도를 측정한 후, 아래 식으로 티로시나아제 저해율을 계산하였으며, 그 결과는 표 1에 나타내었다.

[티로시나아제 저해율]

	티로시나아제 저해활성(% of ctr)	티로시나아제 활성(% of ctr)
실시예 7	3.02837323273279	96.9716267672672
실시예 8	2.88504807041048	97.1149519295895
실시예 9	5.93348543413677	94.0665145658632
실시예 10	2.14019330224514	97.8598066977549
비교예 11	-12.4504195606953	112.450419560695
비교예 12	-9.94264673954393	109.942646739544
비교예 13	-12.3739323098848	112.373932309885
비교예 14	-17.0331830572447	117.033183057245

상기 표 1에 의하면, 단백질침전 발효시료에서는 티로시나아제 저해활성효과를 나타내었으나, 오히려 일반추출 발효시료에서는 티로시나아제 저해활성을 보이지 않음을 알 수 있었다.

실험예 13 : 멜라닌 함량의 측정

본 실험에서는 실시예 7, 8과 비교예 11, 12의 처리에 따른 세포 내 멜라인 함량을 측정하였는데, 세포배양시 세포 내의 멜라닌 생성량을 공시료액과 비교하는 시험법을 이용하였다.

B16F10 세포를 well 당 5×10³cells이 되도록 배지에 부유시켜 96-well plate에 분주한 후 5% CO₂가 주입되는 37℃ 배양기에서 배양하였다. 24시간 후 배지를 제거하고 0, 500, 1000㎍/ml의 농도로 시료를 처리하였다. 시료 처리 3일 후, 세포를 PBS로 세척하고, trypsin-EDTA로 처리하여 세포를 회수하였다. 회수된 세포를 570 ×g에서 5분간 원심 분리하여 pellet을 얻은 후 10% DMSO가 함유된 1 N NaOH를 넣고 녹였다(37℃, 2시간). ELISA reader로 475nm에서 측정하였다. 표준물질은 melanin(Sigma)을 사용하였다. 그 결과는 도 12에 도시하였다(좌측부터 비교예 11; 비교예 12; 실시예 7; 실시예 8).

도 12에 의하면, 일반추출 발효시료보다 단백질침전 발효시료에서 멜라닌 함량이 낮게 나타나며, 이에 단백질침전 발효시료는 일반추출 발효시료보다 멜라닌 억제율이 높음을 알 수 있었다.

실험예 14 : 에탄올 농도와 침전 시간에 따른 단백질 추출 양의 비교

본 실험에서는 에탄올 농도와 침전시간에 따라 단백질 추출 양을 측정하여 비교하여 보았다.

분쇄한 강낭콩, 백태에 대하여 각각 탈이온수를 1:10 중량비로 혼합하여 4℃에서 24시간 추출시켰다. 여과액과 에탄올을 1:1(총량이 100 mL이하일 경우는 1:5) 비율로 혼합하여 4℃에서 방치시킨 후 원심분리시켜(15,000 rpm, 4℃, 10분) 단백질 시료를 얻었다. 시료는 탈이온수에 1% 농도로 용해시키고 멸균하였다. 이때, 에탄올 농도와 침전시간은 아래 표 2와 같이 설정하였다.

	에탄올 농도	침전 시간
1	30% 에탄올	30분
2	50% 에탄올	30분
3	95% 에탄올	10분
4	95% 에탄올	20분
5	95% 에탄올	30분
6	95% 에탄올	1시간

락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) ATCC 15009가 OD₆₀₀에서 0.4값을 가지는 배양액을 시료 부피의 10~20% 접종하여 37℃에서 48 ~ 72시간 배양하였다. 초기 pH는 5.6 ~ 6.0으로 맞추어 발효시키고 최종 pH가 4.5가 되면 발효를 종료하였다. 원심분리(15,000 rpm, 4℃, 10분)로 1차 여과하고 0.2 ㎛ 필터로 2차 여과시켜 동결건조시켜 단백질침전 발효물을 각각 제조하였다.

제조된 단백질침전 발효물에 대하여 실험예 2와 동일한 방식으로 Lowry-folin 정량법으로 단백질 함량을 정량하였으며, 그 결과는 도 13, 14에 나타내었다.

도 13, 14에 의하면, 에탄올 수용액의 농도가 높아질수록 대체로 단백질 함량이 높아지며, 에탄올 침전시간이 길어질수록 대체로 단백질 함량이 높아짐을 알 수 있었다. 특히, 95%(v/v) 에탄올 수용액에서 단백질 함량이 높음을 알 수 있었다.

실험예 15 : 에탄올 농도와 침전 시간에 따른 콜라겐 합성능의 비교

본 실험에서는 에탄올 농도와 침전시간에 따라 콜라겐 합성능을 측정하여 비교하여 보았다.

분쇄한 강낭콩, 백태에 대하여 각각 탈이온수를 1:10 중량비로 혼합하여 4℃에서 24시간 추출시켰다. 여과액과 에탄올을 1:1(총량이 100 mL이하일 경우는 1:5) 비율로 혼합하여 4℃에서 방치시킨 후 원심분리시켜(15,000 rpm, 4℃, 10분) 단백질 시료를 얻었다. 시료는 탈이온수에 1% 농도로 용해시키고 멸균하였다. 이때, 에탄올 농도와 침전시간은 하기 표 3과 같이 설정하였다.

제조된 단백질침전 발효물에 대하여 실험예 9과 동일한 방식으로 콜라겐 합성능을 측정하였으며, 그 결과는 도 15, 16에 나타내었다.

도 15, 16에 의하면, 에탄올 수용액의 농도가 높아질수록 콜라겐 합성능이 높아짐을 알 수 있었다. 또한, 에탄올 침전시간이 길어질수록 콜라겐 합성능이 높아짐을 알 수 있었다. 특히, 95%(v/v) 에탄올 수용액에서 콜라겐 합성능이 우수함을 알 수 있었다.

실험예 16 : 에탄올 농도와 침전 시간에 따른 멜라닌 함량의 비교

본 실험에서는 에탄올 농도와 침전시간에 따라 멜라닌 함량을 측정하여 비교하여 보았다.

분쇄한 강낭콩에 대하여 탈이온수를 1:10 중량비로 혼합하여 4℃에서 24시간 추출시켰다. 여과액과 에탄올을 1:1(총량이 100 mL이하일 경우는 1:5) 비율로 혼합하여 4℃에서 방치시킨 후 원심분리시켜(15,000 rpm, 4℃, 10분) 단백질 시료를 얻었다. 시료는 탈이온수에 1% 농도로 용해시키고 멸균하였다. 이때, 에탄올 농도와 침전시간은 하기 표 4과 같이 설정하였다.

제조된 단백질침전 발효물에 대하여 실험예 4과 동일한 방식으로 멜라닌 함량을 측정하였으며, 그 결과는 하기 표 5에 나타내었다.

	시료	멜라닌 양(대조군 대비 %)
	대조군	100
1	30% 에탄올/30분	41
2	50% 에탄올/30분	73
3	95% 에탄올/10분	26
4	95% 에탄올/20분	22
5	95% 에탄올/30분	27
6	95% 에탄올/1시간	14

상기 표 5에 의하면, 95%(v/v) 에탄올 수용액에서 멜라닌 억제율이 매우 우수함을 알 수 있었다.

실험예 16 : 발효균주별 항산화 활성의 비교

본 실험에서는 발효균주에 따라 실험예 8과 동일한 방식으로 DPPH 라디칼 소거능을 측정하여 비교하여 보았다.

분쇄한 백태에 대하여 각각 탈이온수를 1:10 중량비로 혼합하여 4℃에서 24시간 추출시켰다. 여과액과 95% 에탄올을 1:1(총량이 100 mL이하일 경우는 1:5) 비율로 혼합하여 4℃에서 30분 방치시킨 후 원심분리시켜(15,000 rpm, 4℃, 10분) 단백질 시료를 얻었다. 시료는 탈이온수에 1% 농도로 용해시키고 멸균하였다. 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) ATCC 15009, 비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum) ATCC 15697이 OD₆₀₀에서 0.4값을 가지는 배양액을 각각 시료 부피의 10~20% 접종하여 37℃에서 48 ~ 72시간 배양하였다. 초기 pH는 5.6 ~ 6.0으로 맞추어 발효시키고 최종 pH가 4.5가 되면 발효를 종료하였다. 원심분리(15,000 rpm, 4℃, 10분)로 1차 여과하고 0.2 ㎛ 필터로 2차 여과시켜 동결건조시켰으며, 얻어진 시료에 대하여 실험예 8과 동일한 방식으로 DPPH 법을 이용하여 자유라디칼 소거능을 측정하였다.

그 결과는 도 17에 나타내었는데, 이에 의하면, 단백질 시료를 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus)로 발효시키는 경우 DPPH 라디칼 소거능이 높아지나, 비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum)으로 발효시키면 오히려 DPPH 라디칼 소거능이 떨어짐을 알 수 있었다.

실험예 17 : 발효균주별 콜라겐 합성능 비교

본 실험에서는 발효균주에 따라 실험예 10과 동일한 방식으로 콜라겐 합성능을 측정하여 비교하여 보았다.

분쇄한 백태에 대하여 각각 탈이온수를 1:10 중량비로 혼합하여 4℃에서 24시간 추출시켰다. 여과액과 95% 에탄올을 1:1(총량이 100 mL이하일 경우는 1:5) 비율로 혼합하여 4℃에서 30분 방치시킨 후 원심분리시켜(15,000 rpm, 4℃, 10분) 단백질 시료를 얻었다. 시료는 탈이온수에 1% 농도로 용해시키고 멸균하였다. 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) ATCC 15009, 사카로미세스 세레비시아(Sacchromyces cerevisiae) ATCC 7754, 비피도박테리움 아돌레스센티스(Bifidobacterium adolescentis) ATCC 15703, 비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum) ATCC 15697이 OD₆₀₀에서 0.4값을 가지는 배양액을 각각 시료 부피의 10~20% 접종하여 37℃에서 48 ~ 72시간 배양하였다. 초기 pH는 5.6 ~ 6.0으로 맞추어 발효시키고 최종 pH가 4.5가 되면 발효를 종료하였다. 원심분리(15,000 rpm, 4℃, 10분)로 1차 여과하고 0.2 ㎛ 필터로 2차 여과시켜 동결건조시켰다. 얻어진 시료에 대하여 실험예 10과 동일한 방식으로 콜라겐 합성능을 측정하였으며, 그 결과는 도 18에 나타내었다.

도 18에 의하면, 단백질 시료를 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus)로 발효시키는 경우 콜라겐 합성능이 높아지나, 사카로미세스 세레비시아(Sacchromyces cerevisiae), 비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum)으로 발효시키면 오히려 콜라겐 합성능이 저해되고, 비피도박테리움 아돌레스센티스(Bifidobacterium adolescentis)으로 발효시키면 콜라겐 합성능에 변화가 없음을 알 수 있었다.

이상 종합하면, 단백질 함량이 높지 않은 식물이라도 탈이온수로 추출하고 에탄올 침전을 거친 후 락토바실러스(Lactobacillus) 속 유산균으로 발효시키면 식물 소재로부터 단백질을 다량 추출해낼 수 있으며, 수득된 단백질 침전 발효물은 항산화 활성, 멜라닌 억제율, 티로시나아제 저해활성, 콜라겐 합성능이 우수하여 주름개선효과, 피부미백효과를 가지는 화장료 원료로 유용하게 이용될 수 있음을 알 수 있었다.

Claims

식물의 뿌리, 줄기, 잎, 꽃 및 열매로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 식물 소재를 탈이온수로 추출한 후 에탄올로 침전시켜 단백질 추출량을 증대시키는 것을 특징으로 하는 활성 단백질의 추출방법.
제1항에 있어서,
에탄올 침전 후, 락토바실러스(Lactobacillus) 속 유산균으로 발효시키는 과정을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 활성 단백질의 추출방법.
제1항 또는 제2항에 있어서,
에탄올 침전시, 30%(v/v)~99%(v/v) 에탄올 수용액을 혼합하여 10~120분간 침전시키는 것을 특징으로 하는 활성 단백질의 추출방법.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 식물은 오미자, 금은화, 진피, 사상자, 황금, 황기, 칡, 더덕, 둥글레, 오가피, 대추, 도라지, 계피, 감초, 인삼, 강낭콩, 녹두, 백태, 서목태, 대두, 팥, 동부, 완두, 렌틸콩, 병아리콩, 땅콩으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 활성 단백질의 추출방법.
제1항 또는 제2항에 있어서,
피부미백효과 및 피부주름개선효과가 있는 단백질의 추출량이 증대되는 것을 특징으로 하는 활성 단백질의 추출방법.
제2항에 있어서,
상기 락토바실러스(Lactobacillus) 속 유산균은 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus) 및 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 활성 단백질의 추출방법.
식물의 뿌리, 줄기, 잎, 꽃 및 열매로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 식물 소재를 탈이온수로 추출한 후 에탄올로 침전시켜 얻어진 단백질 침전물을 함유하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제7항에 있어서,
상기 단백질 침전물은,
에탄올 침전 후 락토바실러스(Lactobacillus)속 유산균으로 발효시킨 단백질 침전 발효물인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제7항 또는 제8항에 있어서,
피부미백용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제7항 또는 제8항에 있어서,
피부주름개선용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제8항에 있어서,
상기 락토바실러스(Lactobacillus) 속 유산균은 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus) 및 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.