KR102300922B1 - 유산균 발효 황기 추출물을 포함하는 항산화용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 유산균 발효 황기 추출물을 포함하는 항산화용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 유산균 및 유산균 발효 황기 추출물은 뛰어난 항산화 효과를 발휘하여 산화스트레스 관련 질환 및 염증 관련 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 이용할 수 있다.

Description

유산균 발효 황기 추출물을 포함하는 항산화용 조성물 {Anti-oxidant composition with lactic acid bacteria fermented Astragalus extract}
본 발명은 유산균 발효 황기 추출물을 포함하는 항산화용 조성물에 관한 것이다.
염증은 신체의 외부 신체적 상해 또는 미생물의 생체 내 감염으로부터 신체를 보호하기 위한 비특이적 방어 작용이다. 이원자 자유 라디칼인 산화질소(nitric oxide; NO)는 염증반응의 대표적인 지표이다. 산화질소는 생체 내 산화질소 합성효소(nitric oxide synthase; NOS)에 의해 L- 아르기닌(L-arginine)으로부터 생성된 고반응성의 자유 라디칼이다 [Lee et al., 1999]. 산화질소는 생리적 현상, 혈압 조절 및 신경 전달 물질로서 작용하며, 혈전 면역 기능으로 작용하는 것으로 알려져 있다 [Lee et al., 2000; Seo et al., 2001].
그러나 산화질소가 필요 이상으로 생성되면 염증반응을 일으키고 면역계의 조직 파괴 및 이상을 나타낸다. 산화질소는 염증반응을 위한 매개체이며, 시간이 지남에 따라 아질산염(nitrite; NO2), 질산염(nitrate; NO3)과 같은 안정한 화합물로 존재하는 것으로 알려져 있는데, 여기서 퍼옥시나이트라이트 음이온 (ONOO-)은 염증성이며, 세포 내 독소를 유발하고, 이는 조직 손상의 원인이 된다 [Szabo et al., 1996].
또한, 신체의 과도한 활성산소(Reactive oxygen species: ROS)는 산화 스트레스를 유발하고 염증 질환, 패혈증, 암, 노화, 피부 노화, 근감소증, 자가 면역 질환, 폐질환 (천식, 만성 기관지염), 신장질환 (신장염, 만성 심부전), 관절질환 (류마티즘, 관절염), 뇌질환 (알츠하이머, 파킨슨병, 기억감퇴, 우울증, 뇌졸증), 눈질환 (백내장, 망막질환), 심혈관질환(동맥경화, 고혈압, 허혈, 심근증, 심정지), 태아이상 (임신중독증, 자궁내성장저하), 신경퇴행성 질환을 비롯한 수 많은 질병을 촉진한다고 알려졌다.
한편, 프로바이오틱(probiotics) 균주에 의한 식물 기반 발효는 식품의 영양, 풍미 및 향기를 개선하고, 사료의 첨가물 또는 보조제로서 성능을 향상시키는 방법으로, 과학 연구자와 농업 산업의 관심을 끌었다 [Gupta and Abu-Ghannam, 2012]. 프로바이오틱스는 숙주에 유익한 영향을 미치는 것으로 잘 알려져 있어, 생균제와 식물 자원의 발효는 그들의 유익한 특성을 상승적으로 증폭시킬 수 있을 것으로 기대된다. 이에, 본 발명은 프로바이오틱 균주에 의한 식물 기반 발효식품의 항산화 효과를 확인함으로써 본 발명을 완성할 수 있었다.
한국등록특허 제10-1806720호(2017.12.01.)에는, 락토바실러스 플란타룸으로 발효시킨 황기 뿌리 배양액의 리스테리아 항균 조성물에 관하여 개시되어 있다. 한국공개특허 제10-2019-0128409호(2019.11.18)에는, 맥문동, 오미자 및 황기를 이용하여 발효한 음료 및 그의 제조방법에 관하여 개시되어 있다. 한국등록특허 제10-1918266호(2018.11.23)에는, 활성 단백질의 추출방법에 관하여 개시되어 있다.
본 발명은 프로바이오틱 균주에 의한 식물 기반 발효식품인, 유산균 발효 황기 추출물의 항산화 효과를 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 하나의 목적은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) MG5145(KCTC 14067BP)로 발효된 황기 추출물을 포함하는 항산화용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) MG5145(KCTC 14067BP)로 발효된 황기 추출물을 포함하는 항산화용 건강 보조 식품을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) MG5145(KCTC 14067BP)로 발효된 황기 추출물을 포함하는 산화스트레스 관련 질환 또는 염증 관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명은 항산화능을 보유한 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) MG5145(KCTC 14067BP)를 제공한다.
한편, 본 발명은 a) 건조된 황기(Astragalus membranaceus; AM)에 물을 가하고, 50~70℃에서 추출하여 황기추출물을 제조하는 단계; 및 b) 상기 단계 a)에서 제조한 황기추출물에 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) MG5145(KCTC 14067BP)를 접종하여 발효시키는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 유산균 발효 황기 추출물의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 유산균 발효 황기 추출물의 제조방법에 있어, 상기 유산균 발효 황기 추출물은, 바람직하게 항산화 활성을 가지는 것이 좋다.
본 발명의 유산균 발효 황기 추출물의 제조방법에 있어, 상기 유산균 발효 황기 추출물은, 바람직하게 iNOS 또는 COX-2의 발현을 억제하는 것이 좋다.
한편, 본 발명은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) MG5145(KCTC 14067BP)로 발효된 황기 추출물을 포함하는 항산화용 식품 조성물을 제공한다.
한편, 본 발명은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) MG5145(KCTC 14067BP)로 발효된 황기 추출물을 포함하는 항산화용 건강 보조 식품을 제공한다.
한편, 본 발명은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) MG5145(KCTC 14067BP)로 발효된 황기 추출물을 포함하는 항산화용 화장료 조성물을 제공한다.
한편, 본 발명은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) MG5145(KCTC 14067BP)로 발효된 황기 추출물을 포함하는 산화스트레스 관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학 조성물에 있어, 상기 산화스트레스 관련 질환은, 일 예로 지질대사질환, 동맥경화증, 심부전증, 고혈압성 심장질환, 부정맥, 심근경색증, 협심증, 심혈관 질환, 뇌졸중, 치매 또는 노화일 수 있다.
한편, 본 발명은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) MG5145(KCTC 14067BP)로 발효된 황기 추출물을 포함하는 염증 관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학 조성물에 있어, 상기 염증 관련 질환은, 일 예로 류마티스성 관절염, 퇴행성 관절염, 급성 통증, 관절통, 천식, 신경병적통증, 수술 후 통증, 편두통, 신경병증, 신경손상, 과민성 장 증후군, 내독소에 의한 쇼크 또는 염증성 장 질환일 수 있다.
본 발명의 유산균 및 유산균 발효 황기 추출물은 뛰어난 항산화 효과를 발휘하여 산화스트레스 관련 질환 및 염증 관련 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 이용할 수 있다.
도 1은 본 발명 유산균 발효 황기 추출물의 항산화 효과를 확인한 결과이다.
도 2는 본 발명 유산균 발효 황기 추출물의 세포 생존율을 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명 유산균 발효 황기 추출물의 전 염증 인자에 대한 항산화 활성을 확인한 결과이다((A) iNOS 발현량, (B) COX-2 발현량, (C) NF-ΚB 발현량).
도 4는 고성능액체크로마토그래피 (HPLC) 분석을 이용한 본 발명 유산균 발효 황기 추출물의 아스트라갈로사이드(Astragaloside) IV 함량을 비교한 결과이다. ((A) 제조예 1의 황기 추출물, (B) 실시예 1의 'AM-LP MG5145 (C) 실시예 1의 'AM-LP MG5276')
본 발명은 항산화능을 보유한 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) MG5145(KCTC 14067BP)를 제공한다. 하기 실시예에서는 본 발명 균주의 항산화 효과를 확인할 수 있었다.
한편, 본 발명은 a) 건조된 황기(Astragalus membranaceus; AM)에 물을 가하고, 50~70℃에서 추출하여 황기추출물을 제조하는 단계; 및 b) 상기 단계 a)에서 제조한 황기추출물에 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) MG5145(KCTC 14067BP)를 접종하여 발효시키는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 유산균 발효 황기 추출물의 제조방법을 제공한다.
황기는 Astragalus membranaceus (AM) Bunge ( Leguminosae )의 마른 뿌리이며, 수세기 동안 생명 에너지를 강화하고 표면 저항을 강화하며, 고름의 배출 및 새로운 조직의 성장을 촉진하는 중요한 약으로 사용되어 왔다. 황기는 아스트라칼로사이드(astragaloside), 포르모노네틴(formononetin), 칼리코신(calycosin), (3R)7,2'-dihydroxy-5',6'-dimethoxy-isofalvon-7-O-β-D-glucoside, β-시토스테롤(sitosterol), 팔미트산(palmatic acid), 루페논(lupenone), 다우코스테롤(daucosterol) 및 (+)-피니톨(pinitol)을 포함하는 다양한 유효성분을 포함하고 있다. 특히, 플라보노이드(flavonoid)는 항산화, 면역 조절 및 항암 활성과 같은 다양한 생물학적 효과로 인해 황기의 가장 유효한 성분 중 하나로 확립되었다.
본 발명의 유산균 발효 황기 추출물의 제조방법에 있어, 상기 유산균 발효 황기 추출물은, 바람직하게 항산화 활성을 가지는 것이 좋다. 이때, 상기 유산균 발효 황기 추출물은, 바람직하게 iNOS 또는 COX-2의 발현을 억제하는 것이 좋다.
하기 실시예에 의하면, 제조예 1의 황기 추출물이 LPS에 의한 염증 유발 매개체 생성에 억제 효과를 보였지만, 실시예 1의 'AM-LP MG5145' 및 'AM-LP MG5276'에서 NO를 합성하는 iNOS, COX-2와 같은 염증 유발 매개체의 생성을 더욱 효과적으로 억제함으로써, 강력한 항산화 활성을 발휘하였다.
한편, 본 발명은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) MG5145(KCTC 14067BP)로 발효된 황기 추출물을 포함하는 항산화용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 항산화용 식품 조성물에 있어, 상기 추출물은 바람직하게 항산화용 식품 조성물 대비 0.00001~50 중량% 포함되는 것이 좋다. 0.00001 중량% 미만일 경우에는 그 효과가 미비하고, 50 중량%를 초과하는 경우에는 사용량 대비 효과 증가가 미미하여 비경제적이다.
본 발명의 항산화용 식품 조성물은 일 예로 육류, 곡류, 카페인 음료, 일반음료, 초콜릿, 빵류, 스낵류, 과자류, 사탕, 피자, 젤리, 면류, 껌류, 유제품류, 아이스크림류, 알코올성 음료, 술, 비타민 복합제 및 그 밖의 건강보조식품류 중 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
한편, 본 발명은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) MG5145(KCTC 14067BP)로 발효된 황기 추출물을 포함하는 항산화용 건강 보조 식품을 제공한다.
상기 "건강기능식품"이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
본 발명의 식품 조성물은 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예들 들어, 비타민 A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, 니아신(niacin), 비오틴(biotin), 폴레이트(folate), 판토텐산(panthotenic acid) 등을 포함할 수 있다. 또한, 아연(Zn), 철(Fe), 칼슘(Ca), 크롬(Cr), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 구리(Cu) 등의 미네랄을 포함할 수 있다. 또한, 라이신, 트립토판, 시스테인, 발린 등의 아미노산을 포함할 수 있다. 또한, 방부제(소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 디히드로초산나트륨 등), 살균제(표백분과 고도 표백분, 차아염소산나트륨 등), 산화방지제(부틸히드록시아니졸(BHA), 부틸히드록시톨루엔(BHT) 등), 착색제(타르색소 등), 발색제(아질산 나트륨, 아초산 나트륨 등), 표백제(아황산나트륨), 조미료(MSG 글루타민산나트륨 등), 감미료(둘신, 사이클레메이트, 사카린, 나트륨 등), 향료(바닐린, 락톤류 등), 팽창제(명반, D-주석산수소칼륨 등), 강화제, 유화제, 증점제(호료), 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물(food additives)을 첨가할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 이를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물에 있어서, 상기 유효성분의 함량은 특별히 제한되지 않으며, 투여 대상의 상태, 구체적인 병증의 종류, 진행 정도 등에 따라 다양하게 변경될 수 있다. 필요한 경우, 식품의 전체 함량으로도 포함될 수 있다.
한편, 본 발명은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) MG5145(KCTC 14067BP)로 발효된 황기 추출물을 포함하는 항산화용 화장료 조성물을 제공한다.
한편, 본 발명에 있어, 상기 유효성분은, 바람직하게 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.00001~30.0중량%가 함유되는 것이 좋다. 더욱 바람직하게는 화장료 조성물 전체 중량에 대해서 0.01~10중량% 함유되는 것이 좋다. 상기 추출물의 함량이 0.00001중량% 미만인 경우에는 피부 항산화 효과가 나타나지 않고, 30.0중량% 초과할 경우 함유량 증가에 따른 뚜렷한 효과가 증가하지 않는다.
한편, 본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서 본 발명의 화장료 조성물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.
본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 팩, 마사지크림 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 계면활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물이 비누, 계면활성제 함유 클렌징 제형 또는 계면활성제 비함유 클렌징 제형일 경우, 피부에 도포한 후 닦아내거나 떼거나 물로 씻어낼 수도 있다. 구체적인 예로서, 상기 비누는 액상비누, 가루비누, 고형비누 및 오일비누이며, 상기 계면활성제 함유 클렌징 제형은 클렌징 폼, 클렌징 워터, 클렌징 수건 및 클렌징 팩이며, 상기 계면활성제 비 함유 클렌징 제형은 클렌징크림, 클렌징 로션, 클렌징 워터 및 클렌징 겔이며, 이에 한정되는 것은 아니다.
한편, 본 발명은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) MG5145(KCTC 14067BP)로 발효된 황기 추출물을 포함하는 산화스트레스 관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 이때, 상기 산화스트레스 관련 질환은, 일 예로 지질대사질환, 동맥경화증, 심부전증, 고혈압성 심장질환, 부정맥, 심근경색증, 협심증, 심혈관 질환, 뇌졸중, 치매 또는 노화일 수 있다.
한편, 본 발명은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) MG5145(KCTC 14067BP)로 발효된 황기 추출물을 포함하는 염증 관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 이때, 상기 염증 관련 질환은, 일 예로 류마티스성 관절염, 퇴행성 관절염, 급성 통증, 관절통, 천식, 신경병적통증, 수술 후 통증, 편두통, 신경병증, 신경손상, 과민성 장 증후군 또는 내독소에 의한 쇼크 또는 염증성 장 질환일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "예방"이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 산화스트레스 관련 질환 또는 염증 관련 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "치료"란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 산화스트레스 관련 질환 또는 염증 관련 질환에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 상기 약학 조성물을 포함하는 조성물은 상기 성분에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 본 발명의 약학 조성물 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용될 수 있는 담체의 종류는 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 상기 담체의 비제한적인 예로는, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사 용액, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 말토덱스트린, 글리세롤, 에탄올 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 필요한 경우, 부형제, 희석제, 항산화제, 완충액 또는 정균제 등 기타 약학적으로 허용 가능한 첨가제들을 첨가하여 사용할 수 있으며, 충진제, 증량제, 습윤제, 붕해제, 분산제, 계면 활성제, 결합제 또는 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 사용할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물에 있어서, 유효성분은 약학적 조성물의 전체의 중량을 기준으로 0.00001중량％ 내지 99.99중량％로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 0.1중량% 내지 90중량%, 보다 바람직하게는 0.1중량% 내지 70중량%, 더욱 바람직하게는 0.1중량% 내지 50중량%로 포함될 수 있으나, 이에 한정되지 않으며 투여 대상의 상태, 구체적인 병증의 종류, 진행 정도 등에 따라 다양하게 변경될 수 있다. 필요한 경우, 약학적 조성물의 전체 함량으로도 포함될 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 약학적 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 투여 또는 비경구 투여를 위한 적합하고 다양한 제형으로 제제화되어 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물을 이용한 경구 투여용 제제의 비제한적인 예로는, 트로키제(troches), 로젠지(lozenge), 정제, 수용성 현탁액, 유성 현탁액, 조제 분말, 과립, 에멀젼, 하드 캡슐, 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제 등을 들 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물을 경구 투여용으로 제제화하기 위하여, 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴 등과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트 등과 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분 등과 같은 붕해제; 스테아르산 마그네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴 푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌 글리콜 왁스 등과 같은 윤활유 등을 사용할 수 있으며, 감미제, 방향제, 시럽제 등도 사용할 수 있다. 나아가 캡슐제의 경우에는 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체 등을 추가로 사용할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물을 이용한 비경구용 제제의 비제한적인 예로는, 주사액, 좌제, 호흡기 흡입용 분말, 스프레이용 에어로졸제, 연고, 도포용 파우더, 오일, 크림 등을 들 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물을 비경구 투여용으로 제제화하기 위하여, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결 건조 제제, 외용제 등을 사용할 수 있으며, 상기 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물을 주사액으로 제제화하는 경우, 본 발명의 약학적 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고 이를 앰플(ampoule) 또는 바이알(vial)의 단위 투여용으로 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물을 에어로졸제로 제제화하는 경우, 수분산된 농축물 또는 습윤 분말이 분산되도록 추진제 등이 첨가제와 함께 배합할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물을 연고, 크림, 도포용 파우더, 오일, 피부 외용제 등으로 제제화하는 경우에는, 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화 아연 등을 담체로 사용하여 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 약학적 유효량, 유효 투여량은 약학적 조성물의 제제화 방법, 투여 방식, 투여 시간 및/또는 투여 경로 등에 의해 다양해질 수 있으며, 약학적 조성물의 투여로 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 투여 대상이 되는 개체의 종류, 연령, 체중, 일반적인 건강 상태, 질병의 증세나 정도, 성별, 식이, 배설, 해당 개체에 동시 또는 이시에 함께 사용되는 약물 기타 조성물의 성분 등을 비롯한 여러 인자 및 의약 분야에서 잘 알려진 유사 인자에 따라 다양해질 수 있으며, 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약학적 조성물의 일일 투여량은 약 0.01 내지 1000mg/kg이고, 바람직하게는 0.1 내지 100mg/kg이며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여는 하루에 1회 투여될 수 있고, 수회에 나누어 투여될 수도 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양으로 투여할 수 있으며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여 경로 및 투여 방식은 각각 독립적일 수 있으며, 목적하는 해당 부위에 상기 약학적 조성물이 도달할 수 있는 한, 특별한 제한 없이 임의의 투여 경로 및 투여 방식에 따를 수 있다. 상기 약학적 조성물은 경구 투여 또는 비경구 투여 방식으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 비경구 투여 방법으로는, 정맥 내 투여, 복강 내 투여, 근육 내 투여, 경피 투여 또는 피하 투여 등을 이용할 수 있으며, 상기 조성물을 질환 부위에 도포하거나 분무, 흡입하는 방법 또한 이용할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 약학적 조성물은 산화스트레스 관련 질병 또는 염증 관련 질병을 예방, 개선 또는 치료하기 위하여 추가적으로 호르몬 치료, 약물 치료 등의 다양한 방법들과 병용하여 사용될 수 있다.
이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예 또는 실험예를 통해 더욱 상세히 설명하기로 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예 및 실험예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
[ 제조예 1: 황기 추출물의 제조]
건조된 황기(Astragalus membranaceus; AM) 100g에 2L의 물을 가하고, 60℃에서 15시간 동안 추출 후 2회 감압여과하여 추출물을 제조하였다. 황기는 충북 약초영농조합법인(제천시)에서 구입하였다.
[실시예 1: 유산균 발효 황기 추출물의 제조에 이용된 균주의 선택]
상기 제조예 1에서 제조된 황기 추출물에 다양한 발효식품으로부터 38종의 락토바실러스 플란타룸 균주를 분리하였고, 이를 하기 표 1에 나타내었다. 분리한 균주 중 우수한 항산화능을 가진 균주를 선별하기 위하여, 배양배지 30㎖에 제조예 1에서 제조한 40%(v/v)의 황기 추출물 20㎖를 첨가한 후, 121℃의 조건에서 20분 동안 멸균하였다. 이후, 전배양하여 활성화된 2%(w/v)의 균주를 각각 접종한 후, 15시간 동안 배양하였다.
발효식품 분리균주 발효식품 분리균주
발효유 MG5141 김치 MG5247
발효유 MG5142 김치 MG5248
발효유 MG5143 김치 MG5249
발효유 MG5144 김치 MG5251
발효유 MG5145 된장 MG5254
발효유 MG5155 된장 MG5255
발효유 MG5182 발효유 MG5260
발효유 MG5185 어패류 MG5270
발효유 MG5186 발효유 MG5276
발효유 MG5187 발효유 MG5281
발효유 MG5188 발효유 MG5283
발효유 MG5194 김치 MG5287
발효유 MG5198 김치 MG5289
발효유 MG5201 발효유 MG5302
발효유 MG5202 발효유 MG5307
발효유 MG5203 발효유 MG5308
발효유 MG5204 발효유 MG5309
발효유 MG5211 어패류 MG5324
김치 MG5243 어패류 MG5330
상기 표 1에 기재된 유산균이 황기 추출물의 항산화 효과 증진에 미치는 영향을 평가하기 위하여, 실시예 1에서 제조한 유산균 발효 황기 추출물을 96-웰 플레이트에서 2:3의 비율로 0.2mM의 DPPH와 혼합하였다. 이후, 혼합물을 어두운 곳에서 30분 동안 반응시켰다. 흡광도는 517nm에서 측정하였고, 에탄올을 대조군으로 이용하였으며, 음성대조군으로 아스코르브산(Ascorbic acid)을 이용하였고, 양성대조군으로 락토바실러스 람노서스(Lactobacilus rhamnosus) GG를 이용하였다. 그 결과를 하기 표 2 및 도 1에 나타내었다.
DPPH 라디칼 소거 활성은 다음 식을 사용하여 계산되었다 [Ak and Gulcin, 2008] : DPPH 라디칼 소거능 (%) = [1 - (OD517 샘플 / OD517 대조군)] × 100
Group Radical scavenging activity (%) Group Radical scavenging activity (%)
제조예 1의 황기 추출물 51 ± 0.0014
Ascorbic acid 85 ± 0.0092 Lactobacilus rhamnosus GG 66 ± 0.0014
Fermented by L. plantarum Radical scavenging activity (%) Fermented by L. plantarum Radical scavenging activity (%)
MG5141 65 ± 0.0014 MG5247 55 ± 0.0028
MG5142 61 ± 0.0014 MG5248 56 ± 0.0007
MG5143 54 ± 0.0021 MG5249 62 ± 0.0014
MG5144 49 ± 0.0035 MG5251 64 ± 0.0014
MG5145 72 ± 0.0007 MG5254 53 ± 0.0042
MG5155 68 ± 0.0001 MG5255 56 ± 0.0042
MG5182 61 ± 0.0042 MG5260 57 ± 0.0085
MG5185 66 ± 0.0028 MG5270 62 ± 0.0064
MG5186 54 ± 0.0148 MG5276 70 ± 0.0021
MG5187 60 ± 0.0071 MG5281 62 ± 0.0035
MG5188 61 ± 0.0127 MG5283 66 ± 0.0042
MG5194 60 ± 0.0021 MG5287 61 ± 0.0085
MG5198 64 ± 0.0064 MG5289 63 ± 0.0049
MG5201 56 ± 0.0028 MG5302 64 ± 0.0028
MG5202 60 ± 0.0078 MG5307 67 ± 0.0007
MG5203 60 ± 0.0049 MG5308 64 ± 0.0078
MG5204 59 ± 0.0064 MG5309 61 ± 0.0035
MG5211 62 ± 0.0057 MG5324 67 ± 0.0028
MG5243 63 ± 0.0057 MG5330 61 ± 0.0078
표 2 및 도 1에 나타난바와 같이, 실시예 1의 유산균 발효 황기 추출물의 항산화 활성은 49% 내지 72%의 범위였다. 이는, 제조예 1의 황기 추출물(51%)에 접종되는 유산균 종류에 따라 항산화 효과가 증진되는 정도가 상이함을 보여주는 결과이다.
따라서, 표 2 및 도 1의 결과를 토대로, 양성대조군에 비하여 효과가 우수하게 나타난 균주인 락토바실러스 플란타룸 MG5145, 락토바실러스 플란타룸 MG5155 및 락토바실러스 플란타룸 MG5276을 선별하고, 이를 한국생명공학연구원에 기탁하여 2019년 12월 11일자로 각각 수탁번호: KCTC14067BP, KCTC14068BP, KCTC14069BP를 부여받았으며, 하기 실험에 이용하였다.
[실험예 1: 본 발명 유산균 발효 황기 추출물의 항산화 효과 평가]
하기 실험에서는 실시예 1에서 제조된 유산균 발효 황기 추출물 중 가장 항산화 효과가 높았던 락토바실러스 플란타룸 MG5145 발효 황기 추출물을 'AM-LP MG5145'이라 지칭하고, 락토바실러스 플란타룸 MG5276 발효 황기 추출물을 'AM-LP MG5276'이라 지칭하며, 락토바실러스 플란타룸 AM-LP MG5155 발효 황기 추출물을 'AM-LP MG5155'이라 지칭하기로 한다.
한편, 본 실험에서는 본 발명 유산균 발효 황기 추출물의 LPS-유도 세포 생존력을 평가하기 위하여, 대식세포인 RAW 264.7 세포를 완전히 가습된 공기 중에서 5% CO2, 37℃에서 성장시키고, 3일마다 계대 배양 하였다. 배양배지는 10% FBS(fetal bovine serum; Welgene, Gyeongsan-si, Korea), 100unit/㎖의 페니실린(penicillin) 및 100㎍/㎖의 스트렙토마이신(streotimycin; Gibco, Ottawa, Welgene, Gyeongsan-si, Korea)를 첨가한 DMEM 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium; Gibco, Grand Island, NY, USA)를 이용하였다.
1.1 세포 생존력 평가
본 발명 유산균 발효 황기 추출물의 세포독성을 평가하기 위하여, Cell counting kit-8 (CCK-8, Dogen, Korea)을 이용하였다. 상기에서 배양한 RAW 264.7 세포를 2.0Х105 cells/well의 밀도로 24웰-플레이트에 씨딩(seeding)하고, 하룻동안 안정시켰다. 이후, 배지를 제거하고, FBS를 첨가하지 않은 DMEM에 염증 유발인자인 LPS 500㎍/㎖와 실시예 1의 'AM-LP MG5145', 'AM-LP MG5276' 및 'AM-LP MG5155'를 각각 동시처리하여 37℃에서 24시간 동안 처리하였다. 그 후, DMEM:EZ-Cytox를 10:1의 비율로 희석한 용액 500㎕를 각각의 웰에 가하고, 37℃에서 30분 동안 반응시킨 후, 450㎚에서 흡광도를 측정하여 세포수를 계수하였다.
도 2에 나타난 바와 같이, 제조예 1의 황기 추출물 및 실시예 1의 'AM-LP MG5145' 및 'AM-LP MG5276'에서 세포독성을 나타내지 않았다. 그러나 'AM-LP MG5155'는 세포독성이 나타나, 하기 실험은 세포독성이 없고, 항산화능이 우수한 'AM-LP MG5145' 및 'AM-LP MG5276'만을 이용하여 실험을 수행하였다.
1.2 전 염증 인자에 대한 면역 활성 분석
실시예 1에서 가장 항산화 효과가 높게 나타난 유산균 발효 황기 추출물인 AM-LP MG5145(373.1±13.923%) 및 AM-LP MG5276(368.7±12.298%)의 면역 활성을 확인하기 위하여, 5.0×105 cells/well의 밀도로 6웰-플레이트에 씨딩(seeding)하고, 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 이후, 500㎍/㎖ LPS와 함께 동량의 제조예 1의 황기 추출물, 실시예 1의 'AM-LP MG5145' 및 'AM-LP MG5276'를 각각 처리한 후 6시간 뒤, 상등액을 제거한 후, TRIzol 시약(Invitrogen, USA)으로 총 RNA를 추출하였다. 추출된 총 RNA(1.5㎍)를 Revertra Ace Kit (Toyobo, Japan)로 역전사하여 cDNA를 합성하였다. 그 후, 합성된 cDNA를 real-time PCR (Applied Biosystems, Foster City, USA)로 iNOS, COX-2 및 NF-κB의 발현을 분석하였다.
도 3의 (A)에 나타난 바와 같이, 제조예 1의 황기 추출물(AM), 실시예 1의 'AM-LP MG5145' 및 'AM-LP MG5276'은 LPS처리에 의하여 NO가 유도된 RAW264.7 세포에서 NO를 합성하는 iNOS의 mRNA 발현 수준을 강하게 억제시킴으로써 항산화 활성을 나타내었다.
도 3의 (B)에 나타난 바와 같이, 실시예 1의 'AM-LP MG5145' 및 'AM-LP MG5276'은 COX-2의 mRNA 발현을 현저하게 감소시켰다. 이러한 결과는 본 발명 유산균 발효 황기 조성물이 iNOS 및 COX-2의 유전자 발현을 억제하여 NO 생성을 억제함을 의미하는 것이다.
또한, NO 생성, iNOS 및 COX-2의 전사는 NF-kB의 활성화를 통해 가능한데, 예상대로 도 3의 (C)에 나타낸 바와 같이, 제조예 1의 황기 추출물, 실시예 1의 'AM-LP MG5145' 및 'AM-LP MG5276'이 NF-kB의 mRNA 발현을 억제함을 확인할 수 있었다.
1.3 HPLC 분석
Shannon et al.의 방법에 따른 고성능액체크로마토그래피 (HPLC) 분석을 이용하여, 제조예 1의 황기 추출물, 실시예 1의 'AM-LP MG5145' 및 'AM-LP MG5276'의 아스트라갈로사이드(Astragaloside) IV 함량을 분석하였다. 샘플은 Luna Column(4.6×150㎜, Sum, phenyl-hexyl)으로 분리하였다. 이동상[아세토니트릴/물 (20/80, v/v) 및 아세토니트릴/물 (80/20, v/v)]을 헬륨으로 살포하고 선형 구배 용출액으로 펌핑하였다(0-2분: 0→10A; 2-15분: 10→40A; 15-20분: 40→100A; 20-25분: 100→100A; 25-30분: 100→0A). 이동상의 유속은 1㎖/min이고, 주입부피는 10㎕로 설정하였으며, UV 검출기 온도는 30℃로 설정하여 수행하였다.
도 4에 나타난 바와 같이, 실시예 1의 'AM-LP MG5145' 및 'AM-LP MG5276'의 아스트라갈로사이드(Astragaloside) IV 함량은, 제조예 1의 황기 추출물과 비교하여, 'AM-LP MG5145'에서 479.86%, 'AM-LP MG5276'에서 477.79%로 크게 증가하였다. 아스트라갈로사이드(Astragaloside) IV는 항염, 항암 효과를 가짐이 알려져 있어, 이러한 결과는 본 발명 유산균 황기 발효 추출물이 증진된 항염효과를 가짐을 의미한다.
이상의 결과를 종합하여보면, 제조예 1의 황기 추출물이 LPS에 의한 염증 유발 매개체 생성에 억제 효과를 보였지만, 실시예 1의 'AM-LP MG5145' 및 'AM-LP MG5276'에서 NO 및 이들의 합성 효소인 iNOS, COX-2와 같은 염증 유발 매개체의 생성을 더욱 효과적으로 억제함으로써, 강력한 항산화 활성을 발휘하였다.
이러한 결과는, 락토바실러스 MG5145 및 MG5276에 의한 발효로 항산화 활성이 현저히 향상되었음을 확인할 수 있는 결과이며, 본 발명의 유산균 발효 추출물이 항염, 항산화 효과를 토대로 산화스트레스 관련 질환 또는 염증 관련 질환 예방 또는 치료에 사용할 수 있음을 알 수 있다.
한국생명공학연구원 KCTC14067BP 20191211

Claims (11)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. a) 건조된 황기(Astragalus membranaceus; AM)에 물을 가하고, 50~70℃에서 추출하여 황기추출물을 제조하는 단계; 및
    b) 상기 단계 a)에서 제조한 황기 추출물에 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) MG5145(KCTC 14067BP)를 접종하여 발효시키는 단계;를 포함하는 제조방법에 의해 제조된 유산균 발효 황기 추출물을 포함하는 항산화용 식품 조성물.
  6. a) 건조된 황기(Astragalus membranaceus; AM)에 물을 가하고, 50~70℃에서 추출하여 황기추출물을 제조하는 단계; 및
    b) 상기 단계 a)에서 제조한 황기 추출물에 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) MG5145(KCTC 14067BP)를 접종하여 발효시키는 단계;를 포함하는 제조방법에 의해 제조된 유산균 발효 황기 추출물을 포함하는 항산화용 건강 보조 식품.
  7. a) 건조된 황기(Astragalus membranaceus; AM)에 물을 가하고, 50~70℃에서 추출하여 황기추출물을 제조하는 단계; 및
    b) 상기 단계 a)에서 제조한 황기 추출물에 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) MG5145(KCTC 14067BP)를 접종하여 발효시키는 단계;를 포함하는 제조방법에 의해 제조된 유산균 발효 황기 추출물을 포함하는 항산화용 화장료 조성물.
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